特表 2022-550884 スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ペプチドおよび使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-05

(54)【発明の名称】スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ペプチドおよび使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/085 20060101AFI20221128BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221128BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20221128BHJP

   A61K 31/739 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221128BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20221128BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221128BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20221128BHJP

【ＦＩ】

A61K39/085

A61K45/00 ZNA

A61K39/39

A61K31/739

A61P37/04

A61P43/00 121

A61P31/04

A61K31/7088

A61K48/00

C12N15/31

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K14/195

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022520611

(86)(22)【出願日】2020-10-02

(85)【翻訳文提出日】2022-05-19

(86)【国際出願番号】 US2020054047

(87)【国際公開番号】W WO2021067785

(87)【国際公開日】2021-04-08

(31)【優先権主張番号】62/909,473

(32)【優先日】2019-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/909,458

(32)【優先日】2019-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516257833

【氏名又は名称】ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー

【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ Ｂ．Ｖ．

(71)【出願人】

【識別番号】399019892

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＣＡＧＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(72)【発明者】

【氏名】プールマン，ジャン テュニス

(72)【発明者】

【氏名】シュニーウィンド，オラフ

(72)【発明者】

【氏名】ミシャカス，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】サン，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ホワン クン

(72)【発明者】

【氏名】シ，ミャオミャオ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，シンハイ

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデス，ジェフリー エー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA53Y

4B065AB01

4B065BC03

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084MA02

4C084MA05

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA13

4C085CC07

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF14

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB35

4C086ZC75

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA11

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含み、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有する、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む免疫原性組成物が本明細書において提供される。
【選択図】図１Ａ～１Ｅ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含むＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに
（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、
（ｉ）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、
（ｉｉ）突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または
（ｉｉｉ）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し、
その結果、真核細胞の表面にポアを形成する前記突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて前記突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、
突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド
を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、Ｆｃ結合を妨害する少なくとも１つのアミノ酸置換およびＶ_Ｈ３結合を妨害する少なくとも第２のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｄドメインを含み、かつ配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸９位または１０位において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、請求項３に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインをさらに含む、請求項３または４に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインを含み、かつ配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

各ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインが、配列番号５８のアミノ酸９位および１０位に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、請求項５または６に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記アミノ酸置換が、グルタミン残基についてのリシン残基である、請求項４～７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含み、かつ前記少なくとも１つのドメインが、（ｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン中の９位および１０位に対応するグルタミン残基についてのリシン置換および（ｉｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン中の３３位に対応するグルタミン酸置換を有し、前記ポリペプチドが、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋することも好塩基球を活性化させることもない、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン中の９位および１０位に対応する各ＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のグルタミン残基についてのリシン置換ならびにＳｐＡ Ｄドメインの３６位および３７位に対応する各ＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のアスパラギン酸残基についてのアラニン置換を含むＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対する低減されたＫ_Ａ結合親和性を有する、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、請求項１０または１１に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン中のアミノ酸３６位および３７位に対応する前記ＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインのいずれかにおける置換を有しない、請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記ＳｐＡバリアントポリペプチド中の置換が（ｉ）および（ｉｉ）のみである、請求項９～１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１～１４のいずれか１つのアミノ酸３４２～３５１位に対応するアミノ酸残基および配列番号１５～２８のいずれか１つのアミノ酸３１５～３２４位におけるアミノ酸残基の欠失を含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

前記突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号２９～５３のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、配列番号１６の３１５～３２４位に対応するアミノ酸残基の欠失を有する突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド；および配列番号５３のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢポリペプチドを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

アジュバントをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項20】

前記アジュバントがサポニンを含む、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

前記サポニンがＱＳ２１である、請求項２０に記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

前記アジュバントがＴＬＲ４アゴニストを含む、請求項１９に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

前記ＴＬＲ４アゴニストが、リピドＡまたはそのアナログもしくは誘導体である、請求項２２に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

前記ＴＬＲ４アゴニストが、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＧＬＡ、ＳＬＡ、Ｅ６０２０、ＰＥＴ－リピドＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ、ＯＮＯ４００７、またはＯＭ－１７４を含む、請求項２２または２３に記載の免疫原性組成物。

【請求項25】

前記ＴＬＲ４アゴニストがＧＬＡである、請求項２４に記載の免疫原性組成物。

【請求項26】

ＣＰ５、ＣＰ８、Ｅａｐ、Ｅｂｈ、Ｅｍｐ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＡＢ（融合物）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、Ｃｏａ、Ｈｌａ、ｍＨｌａ、ＭｎｔＣ、ｒＴＳＳＴ－１、ｒＴＳＳＴ－１ｖ、ＴＳＳＴ－１、ＳａｓＦ、ｖＷｂｐ、ｖＷｈビトロネクチン結合性タンパク質、Ａａａ、Ａａｐ、Ａｎｔ、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Ｃａｎ、コラーゲン結合性タンパク質、Ｃｓａ１Ａ、ＥＦＢ、エラスチン結合性タンパク質、ＥＰＢ、ＦｂｐＡ、フィブリノーゲン結合性タンパク質、フィブロネクチン結合性タンパク質、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＤ２、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＧｅｈＤ、ＨａｒＡ、ＨＢＰ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ラミニン受容体、リパーゼＧｅｈＤ、ＭＡＰ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＭＨＣ ＩＩアナログ、ＭＲＰＩＩ、ＮＰａｓｅ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＥＡ外毒素、ＳＥＢ外毒素、ｍＳＥＢ、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合性タンパク質、ＳｓａＡ、ＳＳＰ－１、ＳＳＰ－２、Ｓｐａ５、ＳｐＡＫＫＡＡ、ＳｐＡｋＲ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１、ＰＶＬ、ＬｕｋＥＤおよびＨｌｇからなる群から選択される少なくとも１つのスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体Ｌｕｋ Ａポリペプチド、突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の単離された核酸。

【請求項28】

請求項２７に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項29】

請求項２８に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。

【請求項30】

それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症を治療または予防する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、請求項２７に記載の１つもしくは複数の単離された核酸、請求項２８に記載のベクター、または請求項２９に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。

【請求項31】

それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、請求項２７に記載の１つもしくは複数の単離された核酸、請求項２８に記載のベクター、または請求項２９に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。

【請求項32】

それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌を脱定着させまたはその定着もしくは再定着を予防する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の請求項１～２６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、請求項２７に記載の１つもしくは複数の単離された核酸、請求項２８に記載のベクター、または請求項２９に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月２日に出願された米国仮出願第６２／９０９，４５８号；および２０１９年１０月２日に出願された米国仮出願第６２／９０９，４７３号に対する優先権を主張する。各開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、概しては、免疫学、微生物学、およびバイオテクノロジーの分野に関する。より特には、免疫応答を生成するためのペプチドの分野および使用に関する。特に、本発明は、スタフィロコッカス（Staphylococcus）ペプチドの使用ならびに免疫応答を誘導するためおよび／またはスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症を治療もしくは予防するためにそれを使用する方法に関する。

【0003】

電子的に提出された配列表の参照
本出願は、「００４８５２．１５０ＷＯ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名および２０２０年９月２２日の作成日と共に２１１ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表は本明細書の部分であり、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、皮膚および軟組織感染症において見出される最も一般的な病原体であり、外科的創傷における主な病原体でもある。Ｓ．アウレウス（S.aureus）はまた、血流感染症の主因である。手術部位感染症（ＳＳＩ）は外科的切開の帰結であり、手術後１５日～３年、より典型的には、手術後３０日の間、またはインプラントが置かれた場合には１年以内に発生する傾向がある。米国において、Ｓ．アウレウス（S.aureus）は、ＳＳＩの１４％、および血流感染症の１４％を含めて、すべての院内感染症の１１％の原因となる（Kallen et al., JAMA 304(6):641-7 (2010); Johnson et al., J. Antimicrob. Chemother. 67(4):802-9 (2012); Laupland et al., Clin. Microbiol. Infect. 19(5):465-71 (2013);およびMonaco et al., Current Topics Microbiol. Immunol. 409:21-56 (2017)）。

【0005】

多くの場合に、菌血症は、１または複数の膿瘍を起源とするＳＳＩの帰結である。急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症（Acute bacterial skin and skin structure infections；ＡＢＳＳＳＩ）もまた菌血症に繋がり得る。先進諸国において、Ｓ．アウレウス（S.aureus）関連菌血症（ＳＡＢ）の集団罹患率は年間１００，０００人当たり１０～３０の範囲内である（Johnson et al., Antimicrob. Chemother. 67(4):802-9 (2012)）。年齢はＳＡＢ罹患率の非常に強力な決定因子のようである。人生の最初の１年における高い率に続いて、若年成人期を通じた低い罹患率、および年齢が高くなるにつれて罹患率は徐々に上昇する。例えば、ＳＡＢの罹患率は７０歳より上の対象の間で年間１００，０００人当たり＞１００であるが、それはより若い人々において著しくより低い（Laupland et al., Clin. Microbiol. Infect. 19(5):465-71 (2013)）。留意すべきことには、高齢者の間の菌血症は高い死亡率と関連付けられる。メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（S.aureus）（ＭＲＳＡ）への感染症は、高齢者においてメチシリン感受性Ｓ．アウレウス（S.aureus）への感染症よりも悪い予後をもたらす。それゆえ、総死亡率およびＳＡＢに直接的に帰せられる死亡率の両方は、高齢患者において２倍より高い可能性がある（Kaasch et al., J. Infection 68(3):242-51 (2014)）。ＢＳＩの原因因子としてのＭＲＳＡの重要性は、市中において病院環境と同様に高いが、ＭＳＳＡは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染症の罹患率における全体的な上昇に大きく寄与する市中発生ＢＳＩの原因として重要性を得つつある（Kaasch et al., J. Infection 68(3):242-51 (2014)）。それゆえ、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方は、重篤なＳＳＩおよびＳＡＢ疾患の重要な寄与因子である。

【0006】

スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症は典型的には抗生物質で治療され、ペニシリンが選択される薬物であり、バンコマイシンがメチシリン耐性分離株のために使用される。抗生物質に対する広域耐性を呈するスタフィロコッカス（Staphylococcal）株のパーセンテージが増加しており、有効な抗微生物療法に対する脅威となっている。追加的に、バンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）株の最近の出現から、有効な療法が利用可能でないＭＲＳＡ株が出現および拡大し始めている懸念が生じている。

【0007】

スタフィロコッカス（Staphylococcal）感染症の治療における抗生物質の代替となるアプローチは、受動免疫療法におけるスタフィロコッカス（Staphylococcal）抗原に対する抗体の使用である。この受動免疫療法の例は、ポリクローナル抗血清の投与（国際公開第２０００／０１５２３８号パンフレット；国際公開第２０００／０１２１３２号パンフレット）の他に、リポタイコ酸に対するモノクローナル抗体での治療（国際公開第１９９８／０５７９９４号パンフレット）を伴う。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

スタフィロコッカス（Staphylococcus）またはスタフィロコッカス（Staphylococcus）株により産生されるエキソプロテインを標的化した第１世代のワクチンの成功は限られており、そのため、スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症の治療および／または予防のための追加の組成物を開発する必要性が依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）は、多数の免疫回避機構を開発しており、細菌が宿主内で生存することを可能にする様々な病原性因子を分泌する。抗体媒介性オプソニン化貪食作用に関与する病原性因子の不活性化および中和は、スタフィロコッカス（staphylococcal）感染性疾患を制御する中枢的な免疫機構である。

【0010】

表面タンパク質であるスタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡ（ＳｐＡ）は、少なくとも２つの機能を示す１つの鍵となる病原性因子である。第１に、細菌表面上の細胞壁にアンカリングされたＳｐＡは、ＩｇＧのＦｃγドメインに結合し、抗体のエフェクター機能を不能にする。抗体は「上下反対」（upside down）に非特異的に結合し、それにより、宿主免疫細胞によるオプソニン化貪食作用性殺傷（ＯＰＫ）からスタフィロコッカス（staphylococci）は保護され、適切なクリアランスが予防される。第２に、ＳｐＡは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）の定着および感染の間の保護免疫の発生を予防する鍵となる免疫逃避決定因子として役立つ。定着および侵襲性疾患の間に、放出されたＳｐＡは、ＶＨ３クローン性Ｂ細胞受容体を架橋し、スタフィロコッカス（staphylococcal）決定因子を抗原として認識できない、Ｓ．アウレウス（S.aureus）に特異的でない抗体の分泌のトリガーとなる。このＢ細胞スーパー抗原活性（すなわち、放出されたＳｐＡのＶＨ３結合活性）は、定着または侵襲性疾患の間のＳ．アウレウス（S.aureus）に対する保護免疫の発生を予防する原因となる。その免疫グロブリン結合活性を喪失したワクチン抗原としてのＳｐＡバリアントの使用は、（１）Ｆｃγを介してＩｇＧに結合するその能力を中和し、（２）ＶＨ３イディオタイプ重鎖を介してＩｇＧに結合し、抗スタフィロコッカス（staphylococcal）免疫が発生することを可能にするその能力を中和し、かつ（３）表面に結合したＳｐＡを介してオプソニン化貪食作用性クリアランスを誘導するＳｐＡ特異的抗体を誘導する。

【0011】

スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンＬｕｋＡＢは、異なる作用モードを有する別の病原性因子である。ＬｕｋＡＢは、食細胞への結合で、ポアに集合し、膜に挿入され、宿主細胞を溶解する、分泌される毒素である。これは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）が好中球からの攻撃を回避し、宿主によるクリアランスを回避することを可能とする。ＬｕｋＡＢトキソイドでの免疫化により誘導される抗体はＬｕｋＡＢ毒素活性を中和して、Ｓ．アウレウス（S.aureus）をクリアランスできる生存食細胞を結果としてもたらす。

【0012】

２つの抗原ＳｐＡおよびＬｕｋＡＢを含有するワクチンは、したがって、２つのＳ．アウレウス（S.aureus）病原性因子を中和してＳ．アウレウス（S.aureus）の２つの独立した鍵となる回避機構を予防する抗体を誘導し、抗体媒介性オプソニン化貪食作用が有効となることを可能とする。

【0013】

本発明の組合せワクチンでのワクチン接種後に、ＳｐＡバリアントポリペプチドおよび突然変異体ＬｕｋＡＢポリペプチドの両方に対して生成されたワクチン抗体（すなわち、ワクチン接種後に誘発された抗体）は、二重の機序に起因して相乗的な保護および効率的なＳ．アウレウス（S.aureus）殺傷を提供することが本明細書において見出された。一方では、ＳｐＡ分子の中和は、ＶＨ３へのＳｐＡ結合を妨害することにより抗体の上下反対の結合（ＩｇＧ Ｆｃ結合）を予防し、Ｂ細胞調節異常を予防した。他方では、ＬｕｋＡＢ毒素の中和は、ＬｕｋＡＢによる食細胞の溶解を予防し、したがって、ヒト好中球が機能的で、オプソニン化貪食作用によりＳ．アウレウス（S.aureus）を排除できるままであることを可能とした。抗体は各々の標的に結合し、食細胞は殺傷が可能であったので、抗体応答は生産的であり、すなわち、ＳｐＡおよびＬｕｋＡＢの両方を中和する明確かつ相加的な相乗効果があった。

【0014】

（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含むＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、（ｉ）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、（ｉｉ）突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し、その結果、真核細胞の表面にポアを形成する突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む免疫原性組成物が本明細書において提供される。

【0015】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、Ｆｃ結合を妨害する少なくとも１つのアミノ酸置換およびＶ_Ｈ３結合を妨害する少なくとも第２のアミノ酸置換を有する。

【0016】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｄドメインを含み、かつ配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、例えば、配列番号５８のアミノ酸９位または１０位において１つまたは複数のアミノ酸置換を有することができる。

【0017】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインをさらに含む。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、例えば、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインを含み、かつ配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。ある特定の実施形態では、各ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインは、配列番号５８のアミノ酸９位および１０位に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。アミノ酸置換は、グルタミン残基についてのリシン残基である。

【0018】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含み、かつ前記ドメインが、（ｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン中の９位および１０位に対応する少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインの各々におけるグルタミン残基についてのリシン置換、ならびに（ｉｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン中の３３位に対応する少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインの各々におけるグルタミン酸置換を有し、ポリペプチドが、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋することも好塩基球を活性化させることもないＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、（１）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、（２）突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、および／または（３）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含み、（１）、（２）、および／または（３）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し；その結果、真核細胞の表面にポアを形成する突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡドメインＤは配列番号５８を含む。

【0019】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｄドメイン中の９位および１０位に対応する各ＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のグルタミン残基についてのリシン置換、ならびにＳｐＡ Ｄドメインの３６位および３７位に対応する各ＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のアスパラギン酸残基についてのアラニン置換を含むＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対する低減されたＫ_Ａ結合親和性を有する。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、例えば、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有することができる。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、例えば、１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有することができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡ_ＫＫＡＡは配列番号５４を含む。

【0020】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｄドメイン中のアミノ酸３６位および３７位に対応するＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインのいずれかにおける置換を有しない。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチド中の置換は（ｉ）および（ｉｉ）のみである。

【0021】

ある特定の実施形態では、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドは、例えば、配列番号１～１４のいずれか１つのアミノ酸３４２～３５１位に対応するアミノ酸残基および配列番号１５～２８のいずれか１つのアミノ酸３１５～３２４位におけるアミノ酸残基の欠失を含むことができる。

【0022】

ある特定の実施形態では、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号２９～５３のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0023】

ある特定の実施形態では、突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドは、配列番号１６の３１５～３２４位に対応するアミノ酸残基の欠失を有する突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド；および配列番号５３のアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドを含む。

【0024】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。アジュバントは、例えば、サポニン、例えば、ＱＳ２１を含むことができる。アジュバントは、例えば、ＴＬＲ４アゴニストを含むことができ、例えば、ＴＬＲ４アゴニストは、リピドＡまたはそのアナログもしくは誘導体である。ＴＬＲ４アゴニストは、例えば、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＧＬＡ、ＳＬＡ、Ｅ６０２０、ＰＥＴ－リピドＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ、ＯＮＯ４００７、またはＯＭ－１７４を含むことができる。ＴＬＲ４アゴニストは、例えば、ＧＬＡであることができる。

【0025】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＰ５、ＣＰ８、Ｅａｐ、Ｅｂｈ、Ｅｍｐ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＡＢ（融合物）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、Ｃｏａ、Ｈｌａ、ｍＨｌａ、ＭｎｔＣ、ｒＴＳＳＴ－１、ｒＴＳＳＴ－１ｖ、ＴＳＳＴ－１、ＳａｓＦ、ｖＷｂｐ、ｖＷｈビトロネクチン結合性タンパク質、Ａａａ、Ａａｐ、Ａｎｔ、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Ｃａｎ、コラーゲン結合性タンパク質、Ｃｓａ１Ａ、ＥＦＢ、エラスチン結合性タンパク質、ＥＰＢ、ＦｂｐＡ、フィブリノーゲン結合性タンパク質、フィブロネクチン結合性タンパク質、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＤ２、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＧｅｈＤ、ＨａｒＡ、ＨＢＰ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ラミニン受容体、リパーゼＧｅｈＤ、ＭＡＰ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＭＨＣ ＩＩアナログ、ＭＲＰＩＩ、ＮＰａｓｅ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＥＡ外毒素、ＳＥＢ外毒素、ｍＳＥＢ、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合性タンパク質、ＳｓａＡ、ＳＳＰ－１、ＳＳＰ－２、Ｓｐａ５、ＳｐＡＫＫＡＡ、ＳｐＡｋＲ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１、ＰＶＬ、ＬｕｋＥＤおよびＨｌｇからなる群から選択される少なくとも１つのスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原またはその免疫原性断片をさらに含む。

【0026】

本発明のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体Ｌｕｋ Ａポリペプチド、突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の単離された核酸もまた提供される。本発明の単離された核酸を含むベクターもまた提供される。本発明のベクターを含む、単離された宿主細胞もまた提供される。

【0027】

それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法もまた提供される。方法は、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することを含む。免疫原性組成物は、例えば、アジュバントをさらに含むことができる。

【0028】

それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症を治療または予防する方法もまた提供される。方法は、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することを含む。方法はまた、本開示の組成物を投与することにより、対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌を脱定着させまたはその定着もしくは再定着を予防する方法および対象においてスタフィロコッカス（staphylococcus）細菌に対する免疫応答を誘発する方法を含む。免疫原性組成物は、例えば、アジュバントをさらに含むことができる。スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）感染症としてさらに定義することができる。一部の実施形態では、スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症はメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）感染症である。

【0029】

方法、組成物、およびポリペプチドの実施形態を含めて、ある特定の実施形態では、スタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌は、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のＷＵ１またはＪＳＮＺ株を含むことができる。一部の実施形態では、スタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌はＳＴ８８分離株を含む。他の例では、Ｓ．アウレウス（S.aureus）分離株は、配列型（ＳＴ）５、ＳＴ８、ＳＴ２２、ＳＴ３０、ＳＴ４５、ＳＴ３９８、ならびにヒトおよび動物侵襲性障害と関連付けられるそれらの各々のＳ．アウレウス（S.aureus）クローナルコンプレックス（ＣＣ）に属してもよい。

【0030】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の対象または患者、例えばヒト患者は、小児患者である。小児患者は、１８歳未満として定義される患者である。一部の実施形態では、患者は、少なくともまたは最高で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、もしくは９０歳（またはこれらから導出可能な任意の範囲）である。一部の実施形態では、小児患者は２歳またはそれ未満である。一部の実施形態では、小児患者は１歳未満である。一部の実施形態では、小児患者は６か月齢未満である。一部の実施形態では、小児患者は２か月齢またはそれ未満である。一部の実施形態では、ヒト患者は６５歳またはそれより高齢である。一部の実施形態では、ヒト患者は医療従事者である。一部の実施形態では、患者は、外科的処置を受ける患者である。

【0031】

ある特定の実施形態では、患者は、４回の用量で組成物の単離されたポリペプチドを投与され、かつ用量間の間隔は少なくとも４週である。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、４回の用量でまたは正確に４回の用量で与えられる。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドまたは組成物は、少なくとも、最大で、または正確に１、２、３、４、５、６、７、または８回の用量で与えられる。一部の実施形態では、第１の用量は、６～８週齢時に投与される。一部の実施形態では、４つすべての用量は、２歳時またはその前に投与される。一部の実施形態では、ポリペプチドまたは組成物は、２、４、６、および１２～１５か月齢時に４用量のシリーズとして投与される。用量１は、６週齢時もの早期に与えられてもよい。投薬間の間隔は約４～８週であってもよい。一部の実施形態では、第４の用量は、約１２～１５か月齢時、かつ第３の用量の少なくとも２か月後に投与される。

【0032】

さらなる態様は、組成物を製造する方法であって、本開示のＳｐＡバリアントポリペプチドおよび本開示の突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを医薬組成物中に混合することを含む方法に関する。

【0033】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、第２の療法と組み合わせて投与される。第２の療法は、例えば、少なくとも１つの抗生物質であることができる。少なくとも１つの抗生物質は、例えば、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。

【0034】

前述の要約、ならびに本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読めばもっとよく理解される。しかし、出願は、図に示される正確な実施形態に限定されないことは理解するべきである。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A-1E】スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ＳＴ８８単離菌ＷＵ１、マウス病原菌 （図１Ａ）ヒト臨床単離菌である、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１およびＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ由来のvwb遺伝子産物のドメイン構造および配列相同性。そのシグナルペプチド（Ｓ）、Ｄ１およびＤ２ドメイン（宿主プロトロンビンの結合および活性化を担当する）、リンカー（白色箱）ならびにＣ末端フィブリノーゲン結合ドメイン（Ｃ）についてｖＷｂｐのパーセトアミノ酸（ａ．ａ．）同一性が表示されている。（図１Ｂ）Ｎｅｗｍａｎ株（ＷＴ、野生型）ならびにそのΔｃｏａ、Δｖｗｂ、Δｃｏａ－ｖｗｂ、およびΔｃｌｆＡバリアント、ＷＵ１株、ＪＳＮＺ株、ＵＳＡ３００ ＬＡＣ株およびそのΔｖｗｂバリアントというＳ．アウレウス（S.aureus）全培養試料の免疫ブロットを、ポリクローナルウサギ抗体を使用してｖＷｂｐ（αｖＷｂｐ）、Ｃｏａ （αＣｏａ）、Ｈｌａ（αＨｌａ）、およびＣｌｆＡ（αＣｌｆＡ）の産生について分析した。（図１Ｃ）ｖＷｂｐ－Ｃドメインに対するポリクローナル抗体は、ＪＳＮＺ株およびＷＵ１株からｖＷｂｐ対立遺伝子バリアントならびにＵＳＡ３００ ＬＡＣ株からｖＷｂｐを同定する。（図１Ｄ～１Ｅ）ヒト（図１Ｄ）またはマウス（図１Ｅ）血漿中のＳｙｔｏ－９染色Ｓ．アウレウス（S.aureus）株の凝集は顕微画像の１２視野での凝集細菌の平均サイズおよび平均の標準偏差として測定し、統計学的有意性はＳｉｄａｋ多重比較試験を用いた二元配置分散分析を使用してＷＴとのペアワイズ比較で評価した。****、ｐ＜０．０００１。

【図2A-2B】Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１はＣ５７ＢＬ／６マウスの上咽頭に持続的に定着する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵの示されたＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１またはＰＢＳ対照を鼻腔内に接種され、毎週咽喉を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。それぞれのドットはマウス１頭当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。

【図3A-3B】スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１発現はＣ５７ＢＬ／６マウスの持続的定着に必要である。（図３Ａ）ｓｐａ発現用のプラスミド（ｐｓｐａ）なしでのおよびありでのＵＳＡ３００ ＬＡＣ株、Ｎｅｗｍａｎ株、ＷＵ１株、ＷＵ１のΔｓｐａバリアント由来のＳ．アウレウス（S.aureus）溶菌液の免疫ブロットをＳｐＡ－（αＳｐＡ）およびソルターゼＡ特異的抗体（αＳｒｔＡ）で探索した。（図３Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１またはそのΔｓｐａバリアントを鼻腔内に接種され、１週間間隔で動物の中咽頭を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。それぞれのドットはマウス１頭当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。細菌定着データセットは二元配置分散分析およびＳｉｄａｋ多重比較試験を用いて解析し、動物の２群間の統計学的有意差（^＊＊＊ｐ＝０．０００３；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）はアステリスクにより示されている。

【図4】ＳｐＡ_ＫＫＡＡを有するＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化はＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の脱定着を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＦＡまたはＣＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの精製組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで免疫化され、１１日後ＩＦＡまたはＩＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで追加免疫された。定着実験の０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を鼻腔内に接種された。１週間間隔で動物の中咽頭を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。それぞれのドットはマウス１頭当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。細菌定着データセットは二元配置分散分析およびＳｉｄａｋ多重比較試験を用いて解析し、動物の２群間の統計学的有意差（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）はアステリスクにより示されている。

【図5】ＳｐＡ_ＫＫＡＡを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化はＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の脱定着を促進する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＦＡまたはＣＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの精製組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで免疫化され、１１日後ＩＦＡまたはＩＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで追加免疫された。定着実験の０日目、ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を鼻腔内に接種された。１週間間隔で動物の中咽頭を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。それぞれのドットはマウス１頭当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。細菌定着データセットは二元配置分散分析およびＳｉｄａｋ多重比較試験を用いて解析し、動物群間の統計学的有意差（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）はアステリスクにより示されている。

【図6】ＳｐＡ_ＫＫＡＡを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は上咽頭からのＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺ排除を促進する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＦＡまたはＣＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの精製組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで免疫化され、１１日後ＩＦＡまたはＩＦＡ中のＰＢＳモックで乳化された５０μｇの組換えＳｐＡ_ＫＫＡＡで追加免疫された。定着実験の０日目、ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺを鼻腔内に接種された。１週間間隔で動物の中咽頭を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。それぞれのドットはマウス１頭当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。細菌定着データセットは二元配置分散分析およびＳｉｄａｋ多重比較試験を用いて解析し、動物の２群間の統計学的有意差（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）はアステリスクにより示されている。

【図7A-7C】改良されたＳｐＡワクチン 図７Ａ：ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_{ＫＫＡＡ／Ａ}、およびＳｐＡ_{ＫＫＡＡ／Ｆ}バリアントの描写。図７Ｂ：ヒトＩｇＧへのバリアントの結合親和性。図７Ｃ：ヒトＩｇＥへのバリアントの結合親和性。

【図8A】結合アッセイ 図８Ａ：ＳｐＡバリアントのウェスタンブロット。図８Ｂ：示された分子へのバリアントのＥＬＩＳＡ。

【図8B】（上記の通り。）

【図9A-9B】プロテインＡはマウスのＳ．アウレウス（S.aureus）持続的鼻腔定着に必要である。

【図10】プロテインＡアミノ酸配列アライメント 濃灰色：ヒトＦｃγ断片と相互作用するアミノ酸；薄灰色：ヒトＦａｂ断片と相互作用するアミノ酸；アステリスクはヒトＦｃγとＦａｂ断片の両方と相互作用するアミノ酸を指している。赤色：ヒトＦｃγ断片と相互作用するアミノ酸

【図11】Ｚドメイン（ＳｐＡ Ｂドメイン中のＧ２９Ａ）はＦ（ａｂ）２断片に結合できないことを示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析。

【図12A】Ｇ２９を標的にする新しいＳｐＡ^＊バリアント。

【図12B】（上記の通り。）

【図13】Ｇ２９を標的にする新しいＳｐＡ^＊バリアント。

【図14】Ｇ２９を標的にする新しいＳｐＡ^＊バリアント。

【図15】Ｇ２９を標的にする新しいＳｐＡ^＊バリアント。

【図16】実施例２でさらに記載されるバジルヒスタミン放出アッセイの描写。

【図17A-17B】スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡ（ＳｐＡ）。（図１７Ａ）ＳｐＡ前駆体（シグナルペプチダーゼにより切断されるＮ末端シグナルペプチド、５種の免疫グロブリン結合ドメイン（ＩｇＢＤ。Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃと名付けられる）、領域Ｘｒと名付けられた細胞壁にまたがるドメイン、ペプチドグリカン結合用のＬｙｓＭドメイン、およびソルターゼＡにより切断されるＣ末端ＬＰＸＴＧソーティングシグナルを有する）の、細菌表面に提示される細胞壁ＳｐＡの、および細胞壁エンベロープから遊離されて宿主組織中に放出される放出ＳｐＡ分子の一次構造を図示する図。（図１７Ｂ）ＳｐＡの分泌およびソルターゼＡ媒介細胞壁アンカーならびにＳ．アウレウス（S.aureus）によるペプチドグリカン連結ＳｐＡの放出。

【図18A-18B】ヒトＩｇＧのＦｃγドメインへのＳｐＡの結合は、抗体のエフェクター機能（Ｆｃおよび補体受容体の結合）および貪食細胞によるＳ．アウレウス（S.aureus）オプソニン作用殺傷をブロックする。スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡの免疫回避特質。（図１８Ａ）Ｓ．アウレウス（S.aureus）の表面の細胞壁アンカーＳｐＡはヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）のＦｃγに結合し、細菌のオプソニン作用殺傷の引き金を引く抗体のエフェクター機能をブロックする。（図１８Ｂ）ヒトＩｇＧの一次構造、その抗原結合パラトープ（紫色）エフェクター（Ｃ１ｑ、ＦｃγＲｓ、ＦｃＲｎ）およびＳｐＡ結合部位を図示する図。

【図19A-19B】スタフィロコッカスプロテインＡの免疫回避特質。（図１９Ａ）Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染の間のＳｐＡの免疫回避機能。Ｓ．アウレウス（S.aureus）の表面の細胞壁アンカーＳｐＡはヒトＩｇＧのＦｃγに結合し、細菌のオプソニン作用殺傷の引き金を引く抗体のエフェクター機能をブロックする。放出されたＳｐＡは、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（Ｂ細胞受容体）のＶ_Ｈ３イディオタイプバリアント重鎖に架橋して、Ｂ細胞増殖、クラススイッチ、体細胞突然変異およびＳｐＡにより架橋されることができるがＳ．アウレウス（S.aureus）抗原を認識しないＶ_Ｈ３イディオタイプ抗体の分泌を活性化し、それによってＳ．アウレウス（S.aureus）に対する適応免疫応答の発生および保護免疫の確立をブロックする。（図１９Ｂ）Ｖ_Ｈ３イディオタイプＢ細胞受容体（ＩｇＭ）へのＳｐＡ結合および架橋ならびにＣＤ７９ＡＢシグナル伝達の活性化を図示する図である。

【図20A-20B】組換えＳｐＡ、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_ＡＡ、およびＳｐＡ_ＫＫＡＡの免疫グロブリン結合ドメイン（ＩｇＢＤ）。（図２０Ａ）大腸菌（E.coli）の細胞質からのＮｉ－ＮＴＡ上での親和性クロマトグラフィーによる精製用のＮ末端ポリヒスチジンタグを有する組換えＳｐＡのＩｇＢＤの一次構造を図示する図である。ＩｇＢＤ－Ｅドメインのアミノ酸配列は下に表示されている。それぞれのＩｇＢＤ（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）についての３つのαヘリックスの位置が示されている。ＳｐＡ_ＫＫおよびＳｐＡ_ＫＫＡＡはＱ^９，１０Ｋにアミノ酸置換（Ｇｌｎ^９，１０Ｌｙｓ）を有する。ＳｐＡ_ＫＫおよびＳｐＡ_ＫＫＡＡはＤ^{３６，３７}Ａにアミノ酸置換（Ａｓｐ^{３６，３７}Ｌｙｓ）を有する。番号付けはＢ－ＩｇＢＤでのアミノ酸の位置を指す。（図２０Ｂ）ＳｐＡの５つのＩｇＢＤのアミノ酸配列アライメント。保存されたアミノ酸はピリオド（.）により示されている。アライメント中のギャプはダッシュ（－）により示されている。非保存的アミノ酸は一文字コードで列挙されている。Grailleら(138)により報告されているように、ＩｇＧ Ｆｃγ結合に関与しているＳｐＡ残基は赤色で強調されている。Ｖ_Ｈ３重鎖結合を担当するＳｐＡ残基は緑色で強調されている。ピンク色の残基（Ｑ^３２）はＦｃγとＶ_Ｈ３結合の両方に寄与している。

【図21A-21B】ＳｐＡ関連Ｖ_Ｈ３架橋活性およびアナフィラキシー。（図２１Ａ）ヒト活性化ＦｃγおよびＦｃε受容体ならびにそのＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧおよびＩｇＥリガンドの構造を図示する図。（図２１Ｂ）好塩基球またはマスト細胞上でそれぞれＦｃγＲおよびＦｃεＲ受容体に結合するＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧまたはＩｇＥがＳｐＡ架橋されると、ヒスタミンの、炎症性メディエーターのならびにアナフィラキシー反応、血管拡張およびショックを促進するサイトカインの放出の引き金が引かれる。（図２１Ｂ）に描かれてはいないが、マスト細胞と好塩基球の両方がＦｃγＲおよびＦｃεＲ受容体を発現し、ＦｃγＲに結合しているＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧのＳｐＡ架橋にまたはＦｃεＲ受容体に結合しているＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＥのＳｐＡ架橋に応答し、ヒスタミン、炎症促進性メディエーターおよびサイトカインを放出する。

【図22】マウスにおけるＳｐＡワクチン候補のアナフィラキシー活性。μＭＴマウス（ｎ＝５）は耳での皮内注射によりＶＨ３ ＩｇＧで感作された。候補ワクチン抗原またはＰＢＳ対照を２４時間後に静脈内に注射し、続いてエバンスブルー注射を行った。色素の血管外漏出は、３０分後耳組織からの抽出に続いて、６２０ｎｍでの吸光光度測定により定量化した。データは３つの独立した実験から得られた。ボンフェローニ多重比較検定を用いた一元配置分散分析をデータの統計分析のために実施した。記号：ｎｓ、有意ではない；^＊，Ｐ＜０．０５；^＊＊，Ｐ＜０．０１；^＊＊＊，Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図23A-23B】マスト細胞の脱顆粒。培養ヒトマスト細胞（ＬＡＤ２）はＶＨ３ ＩｇＥを用いて一晩感作し、洗浄し、未処置のままにする（ＰＢＳ）または陽性対照としてＳｐＡにもしくは試験物ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、もしくはＳｐＡ－ＫＲに１時間曝露した。β－ヘキソサミニターゼおよびヒスチジンレベルは細胞ペレットで、ならびに上澄みで測定した。β－ヘキソサミニターゼの百分率（図２３Ａ）およびヒスタミン（図２３Ｂ）放出の量が示されている。ボンフェローニ多重比較検定を用いた一元配置分散分析をデータの統計分析のために実施した。記号：ｎｓ、有意ではない；^＊，Ｐ＜０．０５；^＊＊，Ｐ＜０．０１；^＊＊＊，Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図24A-24C】ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}もしくはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}での免疫化は進行性の脱定着を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝１０）は１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を鼻腔内に接種された。（図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｄ）マウスは毎週咽喉を綿棒で拭き取って細菌負荷を数え上げた。（図２４Ｃ、２４Ｅ）糞便試料は接種に続いて毎週収集して細菌負荷を数え上げた。パネル（図２４Ａ）では、動物はアジュバント－ＰＢＳまたはアジュバント－ＳｐＡ_ＫＫＡＡで免疫された。パネル（図２４Ｂ～２４Ｃ）では、動物はアジュバント－ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはアジュバント－ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}で免疫され、同じコホートの動物は咽喉（図２４Ｂ）および糞便試料（図２４Ｃ）で細菌負荷についてモニターされた。パネル（図２４Ｄ～２４Ｅ）では、動物はアジュバント－ＰＢＳまたはアジュバント－ＳｐＡ_ＫＫＡＡもしくはアジュバント－ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}もしくはアジュバント－ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}で免疫され、同じコホートの動物は咽喉（図２４Ｄ）および糞便試料（図２４Ｅ）で細菌負荷についてモニターされた。それぞれの四角形は、咽喉スワブによるミリリットル当たりのまたは糞便１グラム当たりのＣＦＵの数を示している。所与の日のそれぞれの動物群についての中央値および標準偏差は、水平線およびエラーバーにより示されている。データはＳｉｄａｋ多重比較試験を用いた二元配置分散分析で試験した（^＊ｐ＜０．０５）。パネル（図２４Ｄ～２４Ｅ）では、それぞれのデータ群（１～８のそれぞれ）は、それぞれモック、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}からのデータを表している。パネル２４Ｂおよび２４Ｃでは、２つの群間で統計的有意差は認められなかった。

【図24D-24E】（上記の通り。）

【図25A-25C】血流感染のマウスモデルでのＳｐＡワクチン候補の防御活性。生後３週間のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１５）をＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}またはＰＢＳ対照で免疫した。モックまたは追加免疫は１１日目に起きた。２０日目、マウスを出血させて、ワクチン候補に対する血清最大半量抗体価を評価し、ｙ軸にＳｐＡ^＊として示している。３本のバーのそれぞれの群は左から右に向かってＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}を表している（図２５Ａ）。２１日目、マウスは右目の眼窩周囲静脈洞中に５×１０^６ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）をチャレンジされた。チャレンジ１５日後、動物は安楽死させて腎臓でのスタフィロコッカス負荷を数え上げ（図２４Ｂ）、膿瘍病変を数え上げた（図２４Ｃ）。ボンフェローニ多重比較検定を用いた一元配置分散分析をデータの統計分析のために実施した。記号：ｎｓ、有意ではない；^＊，Ｐ＜０．０５；^＊＊，Ｐ＜０．０１；^＊＊＊，Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図26A-26C】ＳｐＡワクチン候補とＳｐＡ中和モノクローナル抗体３Ｆ６の間の相互作用。３Ｆ６抗体、ＨＥＫ２９３ Ｆ細胞由来の組換えｒＭＡｂ ３Ｆ６（図２６Ａ、ｒＭＡｂ ３Ｆ６）またはマウスハイブリドーマモノクローナル抗体（図２６Ｂ、ｈＭＡｂ ３Ｆ６）は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}またはＰＢＳ対照で被覆された酵素結合免疫吸着アッセイプレートにわたって段階希釈された。（図２６Ｃ）ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算された会合定数。

【図27】ミニブタの免疫化、チャレンジおよびサンプリングスケジュール。オスゲッティンゲンミニブタ（１群当たり３頭のブタ）は３週間の間隔で３回の離れた時期に筋肉内に免疫された。ワクチン接種に続いて、ブタは臨床的に関連するＳ．アウレウス（S.aureus）株（ＣＣ３９８またはＣＣ８ ＵＳＡ３００）をチャレンジされた。血液試料は、それぞれのワクチン接種に先立っておよび感染期間中は一定の間隔で採取された。血液および血清分析を実施して、血清免疫グロブリン量および機能を評価した。感染後８日目、ブタは安楽死させ、手術部位および内臓での細菌負荷を決定した。図２７は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験計画の概観を示している。ブタは－６３、－４２、および－２１日目に出血させて免疫し、０日目に出血させて感染させ、＋１、＋２、および＋３日目に出血させ、＋８日目に安楽死させて剖検した。

【図28A-28D】ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊での免疫化によりミニブタにおいて特異的なＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ抗体が産生される。ミニブタは３回の離れた時期に１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド、５０μｇのＳｐＡ^＊、または１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド＋５０μｇのＳｐＡ^＊の混合物で免疫された。それぞれの群での抗原は、動物１頭およびワクチン接種１回当たり２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントを投与された。対照群は２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントのみをワクチン接種された。血清試料は、野生型ＬｕｋＡＢ（図２８Ａおよび２８Ｃ）に対しておよびＳｐＡ^＊（図２８Ｂおよび２８Ｄ）に対してＩｇＧについて評価された。それぞれのドットは、－６３日目（免疫前血清）、－４２日目（最初の免疫化の３週間後）、－２１日目（第２の免疫化の３週間後）、０日目（第３の免疫化の３週間後、チャレンジに先立って）および＋８日目（剖検時）の個々の動物のＥＣ_５０力価を表す。バーはそれぞれの群についての幾何平均ＥＣ_５０力価を示す。図２８Ａ：研究１で測定された抗ＬｕｋＡＢ抗体応答（チャレンジ株ＣＣ３９８）；図２８Ｂ：研究１で測定された抗ＳｐＡ^＊抗体応答（チャレンジ株ＣＣ３９８）；図２８Ｃ：研究２で測定された抗ＬｕｋＡＢ抗体応答（チャレンジ株ＵＳＡ３００）；図２８Ｄ：研究２で測定された抗ＳｐＡ^＊抗体応答（チャレンジ株ＵＳＡ３００）。

【図29A-29B】ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊での免疫化によりＬｕｋＡＢ毒素の活性を中和する抗体が産生された。ミニブタは３回の離れた時期に１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド、５０μｇのＳｐＡ^＊、または１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド＋５０μｇのＳｐＡ^＊の混合物で免疫された。それぞれの群での抗原は、動物１頭およびワクチン接種１回当たり２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントを投与された。対照群は２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントのみをワクチン接種された。血清試料は、ＬｕｋＡＢ毒素の中和について評価された。それぞれのドットは、－６３日目（免疫前血清）、－２１日目（第２の免疫化の３週間後）、０日目（第３の免疫化の３週間後、チャレンジに先立って）および＋８日目（剖検時）の個々の動物のＩＣ_５０力価を表す。バーはそれぞれの群についての幾何平均力価を示す。図２９Ａ：研究１でのＬｕｋＡＢ毒素中和（チャレンジ株ＣＣ３９８）；図２９Ｂ：研究２でのＬｕｋＡＢ毒素中和（チャレンジ株ＵＳＡ３００）。

【図30A-30D】ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊での免疫化によりミニブタの手術部位および脾臓でのコロニー形成単位（ｃｆｕ）が減少した。ミニブタは３回の離れた時期に１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド、５０μｇのＳｐＡ^＊、または１００μｇのＬｕｋＡＢトキソイド＋５０μｇのＳｐＡ^＊の混合物で免疫された。それぞれの群での抗原は、動物１頭およびワクチン接種１回当たり２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントを投与された。対照群は２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１アジュバントのみをワクチン接種された。第３の免疫化の３週間後、動物は手術部位感染モデルにおいてＳ．アウレウス（S.aureus）ＣＣ３９８株（研究１）またはＣＣ８ ＵＳＡ３００株（研究２）をチャレンジされた。感染後８日目、動物を安楽死させ手術部位および臓器を剖検した。細菌負荷はスパイラルプレーティング続いてｃｆｕ計数により決定した。それぞれのドットは、個々の動物の筋肉および脾臓中のｃｆｕのｌｏｇ_１０値を表す。線はそれぞれの群の幾何平均を示す。点線は検出限界を示している。図３０Ａ：全筋肉中のｃｆｕ、研究１（チャレンジ株ＣＣ３９８）；図３０Ｂ：脾臓中のｃｆｕ、研究１（チャレンジ株ＣＣ３９８）；図３０Ｃ：全筋肉中のｃｆｕ、研究２（チャレンジ株ＵＳＡ３００）；図３０Ｄ：脾臓中のｃｆｕ、研究２（チャレンジ株ＵＳＡ３００）。

【発明を実施するための形態】

【0036】

発明の詳細な説明
様々な刊行物、論文および特許が背景技術においておよび本明細書の全体を通じて参照または記載され、これらの参考文献の各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、法令、資料、デバイス、または論文などの議論は、本発明のための文脈を提供する目的のためである。そのような議論は、これらの事項のいずれかまたはすべてが、開示またはクレームされる任意の発明に関して先行技術の部分を形成することの承認ではない。

【0037】

他に定義されなければ、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が関する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。あるいは、本明細書において使用されるある特定の用語は、本明細書に記載される通りの意味を有する。

【0038】

本明細書および添付の請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数への言及を含むことが留意されなければならない。

【0039】

他に記載されなければ、本明細書に記載の任意の数値、例えば濃度または濃度範囲は、すべての事例において「約」という用語により修飾されるものと理解される。そのため、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書において使用される場合、数値範囲の使用は、文脈が他に明確に指し示さなければ、すべての可能な部分的範囲、そのような範囲内の整数および値の分数を含めて、その範囲内のすべての個々の数値を明示的に含む。

【0040】

他に指し示されなければ、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、シリーズのあらゆる要素を指すことが理解される。当業者は、本明細書に記載の発明の特有の実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を使用して確認することができる。そのような均等物は本発明に包含されることが意図される。

【0041】

本明細書において使用される場合、「含む」（comprises）、「含む」（comprising）、「含む」（includes）、「含む」（including）、「有する」（has）、「有する」（having）、「含有する」（contains）もしくは「含有する」（containing）という用語、またはこれらの任意の他のバリエーションは、記載される整数または整数の群を包含するが任意の他の整数も整数の群も除外しないことを含意すると理解され、非排他的またはオープンエンドであることが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、方法（process）、方法（method）、物品、または装置は、それらの要素のみに必ずしも限定されず、明示的に列記されない、またはそのような組成物、混合物、方法（process）、方法（method）、物品、もしくは装置に本来備わっている他の要素を含むことができる。さらに、反することが明示的に記載されなければ、「または」は、排他的なまたはではなく、包含的なまたはを指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つにより満たされる：Ａは真である（または存在する）かつＢは偽である（または存在しない）、Ａは偽である（または存在しない）かつＢは真である（または存在する）、およびＡおよびＢの両方は真である（または存在する）。

【0042】

本明細書において使用される場合、複数の記載される要素の間の接続語「および／または」は、個々のオプションおよび組み合わせたオプションの両方を包含するとして理解される。例えば、２つの要素が「および／または」により接続されている場合、第１のオプションは、第２の要素を伴わない第１の要素の該当性を指す。第２のオプションは、第１の要素を伴わない第２の要素の該当性を指す。第３のオプションは、一緒に第１および第２の要素の該当性を指す。これらのオプションのいずれか１つが意味内に入り、したがって本明細書において使用される「および／または」という用語の要件を満たすことが理解される。オプションのうちの１つより多くの同時的な該当性もまた、意味内に入り、したがって「および／または」という用語の要件を満たすことが理解される。

【0043】

本明細書において使用される場合、「からなる」（consists of）という用語、またはバリエーション、例えば「からなる」（consist of）または「からなる」（consisting of）は、本明細書および請求項の全体を通じて使用される場合、任意の記載される整数または整数の群を包含するが、追加の整数も整数の群も、指定される方法、構造、または組成物に追加され得ないことを指し示す。

【0044】

本明細書において使用される場合、「から本質的になる」（consists essentially of）という用語、またはバリエーション、例えば「から本質的になる」（consist essentially of）または「から本質的になる」（consisting essentially of）は、本明細書および請求項の全体を通じて使用される場合、任意の記載される整数または整数の群を包含し、かつ指定される方法、構造または組成物の基本的または新規の特性を実質的に変更しない任意の記載される整数または整数の群を任意選択で包含することを指し示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照。

【0045】

本明細書において使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。「哺乳動物」という用語は、本明細書において使用される場合、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるがこれらに限定されない。

【0046】

好ましい発明の構成要素の寸法または特徴を指す場合に本明細書において使用される、「約」、「おおよそ」、「一般に」、「実質的に」という用語、および同様の用語は、記載される寸法／特徴は、厳密な境界またはパラメーターではなく、当業者に理解されるような、機能的に同じまたは類似したそれらからの軽微なバリエーションを除外しないことを指し示すこともまた理解されるべきである。最低でも、数値的パラメーターを含むそのような言及は、当該技術分野において受容される数学的なおよび産業上の原則（例えば、丸め、測定または他の体系的誤差、製造ばらつきなど）を使用して最下位桁を変更しないバリエーションを含む。

【0047】

２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列（例えば、スタフィロコッカス（Staphylococcus）ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、ＳｐＡポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド）の文脈における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目視検査により測定されるように、比較され、最大一致のためにアライメントされた場合に、同じである、または指定されるパーセンテージの同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。

【0048】

配列比較のために、典型的には、１つの配列は参照配列として働き、それに対して試験配列は比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合には部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比べた試験配列の配列同一性パーセントを算出する。

【0049】

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、または目視検査により実行することができる（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照）。

【0050】

配列同一性および配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされた場合にマッチするまたは何らかの正値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al、上掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは次に、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方の方向に伸長される。

【0051】

累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基のペアのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列について、累積スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大の達成された値から量Ｘだけ低下した場合；１つもしくは複数の負スコア残基アライメントに起因して、累積スコアが０またはそれ未満になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照）。

【0052】

配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析を行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小和確率が約０．１より低い、より好ましくは約０．０１より低い、最も好ましくは約０．００１より低い場合に、核酸は参照配列に類似していると考えられる。

【0053】

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。そのため、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0054】

本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸分子」、「ヌクレオチド」または「核酸」と同義に言及され、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであることができる。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるがこれらに限定されない。追加的に、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基、例えばイノシンが挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことができ、そのため、「ポリヌクレオチド」は、天然に典型的に見出されるような、化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態の他に、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、相対的に短い核酸鎖を包含し、これは多くの場合にオリゴヌクレオチドと称される。

【0055】

本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、例えば、遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞中での発現のために、例えば制限酵素処理およびライゲーションにより、所望の配列を挿入することができる、任意の数の核酸を指す。核酸ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、ウイルスゲノム、自己増幅性ＲＮＡ、レプリコンが挙げられるがこれらに限定されない。

【0056】

本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、任意の種類の細胞、例えば、初代細胞、培養状態の細胞、または細胞系からの細胞であることができる。１つの実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトまたは形質導入される細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、そのようなトランスフェクトまたは形質導入された細胞の子孫または潜在的な子孫である。細胞の子孫は、親細胞と同一であってもよく、または、例えば、後の世代において起こり得る突然変異もしくは環境上の影響もしくは宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みに起因して、同一でなくてもよい。

【0057】

「発現」という用語は、本明細書において使用される場合、遺伝子産物の生合成を指す。該用語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。該用語はまた、１つまたは複数のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳を包含し、すべての天然に存在する転写後および翻訳後修飾をさらに包含する。発現されたポリペプチドは、宿主細胞の細胞質内、細胞外環境、例えば細胞培養の増殖培地中にあることができ、または細胞膜にアンカリングされ得る。

【0058】

本明細書において使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、アミノ酸を含む分子を指すことができ、当業者によりタンパク質として認識され得る。アミノ酸残基のための従来の１文字または３文字表記が本明細書において使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すことができる。ポリマーは、直鎖状または分枝状であることができ、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸を差し挟まれていてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、該修飾は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他のマニピュレーションもしくは修飾、例えば標識化成分とのコンジュゲーションである。例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の他に、当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドもまた、定義内に含まれる。

【0059】

本明細書に記載のペプチド配列は通常の慣習に従って記述され、ペプチドのＮ末端領域は左、Ｃ末端領域は右にある。アミノ酸の異性体形態が公知であるが、他に明示的に指し示されなければ、それは表されるアミノ酸のＬ型である。

【0060】

「単離された」という用語は、起源となるそれらの供給源の細胞材料、細菌材料、ウイルス材料、もしくは培養培地（組換えＤＮＡ技術により製造される場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成される場合）のいずれも実質的に含まない核酸またはポリペプチドを指すことができる。さらに、単離されたポリペプチドは、単離されたポリペプチドとして対象に投与することができるポリペプチドを指し、換言すれば、ポリペプチドは、それがカラムに接着されているまたはゲル中に包埋されている場合、「単離された」とは単純に考えられないことがある。さらに、「単離された核酸断片」または「単離されたペプチド」は、天然には断片として存在しないかつ／または典型的には機能的な状態にない、核酸またはタンパク質断片である。

【0061】

本明細書において使用される場合、「免疫応答」またはそれと同等の「免疫学的応答」という語句は、レシピエント対象における、本開示のタンパク質、ペプチド、炭水化物、またはポリペプチドに対して向けられた、液性（抗体媒介性）、細胞性（抗原特異的Ｔ細胞もしくはそれらの分泌生成物により媒介される）または液性および細胞性の両方の応答の発生を指す。そのような応答は、免疫原の投与により誘導される能動応答、または抗体、抗体含有材料、もしくはプライムされたＴ細胞の投与により誘導される受動応答であることができる。細胞性免疫応答は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合したポリペプチドエピトープを提示して、抗原特異的ＣＤ４（＋）Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることにより誘発される。応答はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状膠細胞、小膠細胞、好酸球、または先天免疫の他の構成要素の活性化を伴うことができる。本明細書において使用される場合、「能動免疫」は、抗原の投与により対象に付与される任意の免疫を指す。

【0062】

ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＳｐＡポリペプチドならびにこれらをコードするポリヌクレオチド

【0063】

本発明の組合せワクチンでのワクチン接種後に、ＳｐＡバリアントポリペプチドおよび突然変異体ＬｕｋＡＢポリペプチドの両方に対して生成されたワクチン抗体（すなわち、ワクチン接種後に誘発された抗体）は、二重の機序に起因して相乗的な保護および効率的なＳ．アウレウス（S.aureus）殺傷を提供することが本明細書において見出された。一方では、ＳｐＡ分子の中和は、Ｖ_Ｈ３へのＳｐＡ結合を妨害することにより抗体の上下反対の結合（ＩｇＧ Ｆｃ結合）を予防し、Ｂ細胞調節異常を予防した。他方では、ＬｕｋＡＢ毒素の中和は、ＬｕｋＡＢによる食細胞の溶解を予防し、したがって、ヒト好中球が機能的で、オプソニン化貪食作用によりＳ．アウレウス（S.aureus）を排除できるままであることを可能とした。抗体は各々の標的に結合し、食細胞は殺傷が可能であったので、抗体応答は生産的であり、すなわち、ＳｐＡおよびＬｕｋＡＢの両方を中和する明確かつ相加的な相乗効果があった。

【0064】

一般的な態様では、本発明は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、（ｉ）ＬｕｋＡポリペプチド、（ｉｉ）ＬｕｋＢポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含み、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド中に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有する、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せは、真核細胞の表面にポアを形成するＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力を妨害し、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べてＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性を低減させる。スタフィロコッカス（Staphylococcus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含み、その結果、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃおよび／またはＶ_Ｈ３に結合する能力が妨害されており、野生型ＳｐＡポリペプチドまたは他のＳｐＡバリアントポリペプチド、例えばＳｐＡ_ＫＫＡＡポリペプチドと比較して、低減された毒性を有するＳｐＡバリアントポリペプチドが結果としてもたらされる。

【0065】

スタフィロコッカス（Staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド：ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド

【0066】

一般的な態様では、本発明は、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む免疫原性組成物に関する。突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、（ｉ）ＬｕｋＡポリペプチド、（ｉｉ）ＬｕｋＢポリペプチド；および／または（ｉｉｉ）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含むことができる。ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドは、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド中に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せは、ＬｕｋＡＢプロトマー／プロトマー境界面領域、ＬｕｋＡＢ二量体／二量体境界面領域、ＬｕｋＢ膜結合性クレフト領域、ＬｕｋＢポア形成領域、またはこれらの任意の組合せ中にあり、その結果、二量体を形成する、オリゴマー化する、真核細胞の表面上にポアを形成する、またはこれらの任意の組合せを行う、ロイコシジンサブユニットの能力は妨害される。妨害は、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドの毒性における低減を引き起こすことができる。

【0067】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せは、対応する野生型ロイコシジンサブユニットポリペプチドと比べて突然変異体ロイコシジンサブユニットポリペプチドの免疫原性を著しく低減させない。ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）サブユニットポリペプチドは、免疫原性であり、野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドの作用を中和できる抗体を含むことができる免疫応答を誘発する。ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）は、免疫原性であることができ、対応する野生型ロイコシジンサブユニットポリペプチドと比べて野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）サブユニットポリペプチドの作用をより有効に中和することができる抗体を誘発する。

【0068】

「スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド」、「スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニット」、「ＬｕｋＡサブユニット」、「ＬｕｋＡポリペプチド」、「ＬｕｋＢサブユニット」、「ＬｕｋＢポリペプチド」、および「ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド」などの用語は、本明細書において使用される場合、成熟または全長スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニット（例えば、ＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢ）、ならびに成熟または全長スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニット（例えば、ＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢ）の断片、バリアントまたは誘導体、ならびに成熟もしくは全長スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニット（例えば、ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢ）または成熟もしくは全長スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニット（例えば、ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢ）の１つもしくは複数の断片を含むキメラおよび融合ポリペプチドを包含する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるような突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、対応する野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドと比べて毒性が低減されており、かつ／または対応する野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドと比べて免疫原性が著しく低減されていない。

【0069】

ポア形成毒素、例えば、単一成分アルファ溶血素ならびに二成分溶血素およびロイコトキシンは、スタフィロコッカス（staphylococcal）免疫逃避において重要な役割を果たす。これらの毒素は、免疫細胞を殺傷し、組織破壊を引き起こし、それにより、感染の最初のステージの間に宿主を弱めることならびに細菌の播種および転移性増殖を促進することができる。ＬｕｋＡおよびＬｕｋＢサブユニットを含む二成分毒素ＬｕｋＡＢは、二量体として分泌され、次に細胞の表面上で八量体化してポアを形成するという点で独特である。対照的に、例えば、２つのＰＶＬ成分、ＬｕｋＳ－ＰＶおよびＬｕｋＦ－ＰＶは、別々に分泌され、ＬｕｋＳ－ＰＶのその受容体への結合およびＬｕｋＦ－ＰＶのＬｕｋＳ－ＰＶへのその後の結合でポア形成性八量体複合体を形成する（Miles et al., Protein Sci. 11(4):894-902 (2002); Pedelacq et al., Int. J. Med. Microbiol. 290(4-5):395-401 (2000)）。ＰＶＬの標的としては、例えば、多形核好中球（ＰＭＮ）、単球、およびマクロファージを挙げることができる。

【0070】

以下の他の二成分毒素が特徴付けられている：γ溶血素のためのＳ成分ＨｌｇＡおよびＨｌｇＣおよびＦ成分ＨｌｇＢ；ＬｕｋＳ－ＰＶ、ＬｕｋＦ－ＰＶ、ＬｕｋＥ（Ｓ）およびＬｕｋＤ（Ｆ）；ならびにＬｕｋＭ（Ｓ）およびＬｕｋＦ－ＰＶ様（Ｆ）（国際公開第２０１１／１１２５７０号パンフレット）。それらの近い類似性に起因して、これらのＳ成分は、Ｆ成分と組み合わさり、異なる標的特異性を有する活性毒素を形成することができる（Ferreras et al., Biochim Biophys Acta 1414(1-2):108-26 (1998); Prevost et al., Infect. Immun. 63(10):4121-9 (1995)）。γ溶血素は強い溶血性であり、ＰＶＬよりも９０％低い白血球毒性であるが、ＰＶＬは非溶血性である。しかしながら、ＬｕｋＦ－ＰＶとペア形成したＨｌｇＡまたはＨｌｇＣは白血球毒性活性を促進する（Prevost et al., Infect. Immun. 63(10):4121-9 (1995)）。ＰＶＬおよび他のロイコトキシンは好中球を溶解し、Ｈｌｇは溶血性であり（Kaneko et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(5):981-1003 (2004)）、好中球を溶解することも報告された（Malachowa et al., PLoS One 6(4):e18617 (2011)）。ＰＶＬサブユニットはファージ由来であるが、Ｈｌｇタンパク質はＨｌｇ座位に由来し、臨床分離株の９９％において見出される（Kaneko et al.、上掲）。Ｈｌｇサブユニットは血液中でのＳ．アウレウス（S.aureus）増殖の間に上方調節され（Malachowa et al.、上掲）、Ｈｌｇは、血液中でのＳ．アウレウス（S.aureus）の生存に関与することが示された（Malachowa et al., Virulence 2(6) (2011)）。突然変異体ＵＳＡ ３００ Δ－ｈｌｇＡＢＣは、マウス菌血症モデルにおいて死亡を引き起こす低減された能力を有する（Malachowa et al., PLoS One 6(4):e18617 (2011)）。ＬｕｋＥＤ毒素はマウスにおける血流感染症のために不可欠である（Alonzo et al., Mol. Microbiol. 83(2):423-35 (2012)）。ＬｕｋＡＢは、ＰＶＬと協同してＰＭＮ溶解を増強することが記載されている（Ventura et al., PLoS One 5(7):e11634 (2010)；該文献においてＬｕｋＡＢはＬｕｋＧＨと称されている）。

【0071】

５つの異なるロイコトキシン：ロイコシジンγ溶血素（ＨｌｇＡＢおよびＨｌｇＣＢ）、ロイコシジンＥ／Ｄ（ＬｕｋＥＤ）、パントン－バリンロイコシジン（Panton-Valine leucocidin；ＰＶＬ）、ならびにロイコシジンＡ／Ｂ（ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＧＨとしても公知）の間の配列類似性は６０％～８０％であり、他に対して３０～４０％のみの類似性であるＬｕｋＡＢは例外である。すべてのロイコシジンは多形核細胞を標的化して殺傷することができるが、それらはその効力において異なる。ＬｕｋＡＢは、好中球を含めて、ヒトＰＭＮの殺傷において極めて有効である。ＬｕｋＡＢは、ＬｕｋＡＢによるヒトＰＭＮの特異的結合および殺傷の原因となる、インテグリンαＭ／β２受容体のヒトＣＤ１１ｂサブユニットのＩドメインに特異的に結合するヘテロ二量体として分泌されるため、他のロイコトキシンとは異なる（http://www.pnas.org/content/110/26/10794.full.pdf）。ワクチン誘導性抗体によるこれらの毒素の中和、特にＬｕｋＡＢの中和は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染の間の好中球の殺傷を強く低減させ、それにより、病原体をクリアランスする宿主免疫系の能力を保存すると考えられる。

【0072】

ＬｕｋＥＤ

【0073】

ＬｕｋＥＤはコアＳ．アウレウス（S.aureus）ゲノムの構成要素ではないが、それは、侵襲性感染症と関連付けられる主な系列内で保存されている。種特異的な方式で活性を示すＬｕｋＡＢおよびＰＶＬとは異なり、ＬｕｋＥＤは、マウス、ウサギ、およびヒト白血球に対する同等の毒性を含めて、種にわたる広い活性を示す。ＬｕｋＥＤは、マクロファージ、Ｔ細胞、および樹状細胞を含めて、受容体ＣＣＲ５を発現する細胞、ならびに、一次好中球、単球、ナチュラルキラー細胞、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブセットを含めて、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２を発現する細胞に対して溶解活性を示す（Spaan et al., 2017 Nat Rev Microbiol 15: 435-47）。これらの活性は、免疫系の先天アームおよび適応アームの両方の逃避に寄与して疾患進行を促す。感染症の動物モデルにおいて、ＬｕｋＥＤは、炎症促進性応答を誘発し、かつ浸潤性好中球の殺傷を通じて肝臓および腎臓中での複製に寄与する。ＬｕｋＥＤはまた、ＤＡＲＣ（ダフィー抗原ケモカイン受容体）依存性の方式で赤血球に結合して、鉄の獲得を通じて溶血、ヘモグロビンの放出およびＳ．アウレウス（S.aureus）増殖の促進を結果としてもたらす（Spaan et al., 2015 Cell Host Microbe 18: 363-70）。

【0074】

Ｈｌａ

【0075】

アルファ溶血素（アルファ毒素、Ｈｌａ）は、直接的な毒性ならびに赤血球および他の細胞の溶解ならびに免疫調節を含めて、複数の活性を通じて病理発生および致死的な感染症に寄与する。Ｈｌａは、ＡＤＡＭ１０受容体に結合する可溶性の単量体タンパク質として分泌され、二成分β－ＰＦＴ、例えばＬｕｋＡＢおよびＬｕｋＥＤのものに構造的に非常に類似した七量体バレルポア複合体に集合する。赤血球に加えて、高濃度においてＨｌａは、マクロファージおよび単球を含めて、ＡＤＡＭ１０を発現する多数の他の細胞種を溶解することができる。Ｈｌａにより媒介される細胞溶解は、毒素濃度およびＡＤＡＭ１０発現のレベルの両方に依存性である。Ｓ．アウレウス（S.aureus）病原性におけるＨｌａの役割は、敗血症、肺炎、皮膚感染症およびその他を含めて、多数の動物モデルにおいてよく確立されている（Berube and Bubeck Wardenburg, 2013 Toxins 5: 1140-66）。Ｈｌａは、ヒト感染の間に発現され、免疫原性であり、抗Ｈｌａ抗体のより高い力価は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）敗血症の低減されたリスクと関連付けられる（Adhikari et al., 2012 J Infect Dis 206: 915-23）。追加的に、Ｈｌａ発現のレベルの上昇を示すＳ．アウレウス（S.aureus）分離株は、侵襲性疾患と関連付けられる。Ｓ．アウレウス（S.aureus）病原性におけるその役割に起因して、Ｈｌａは、ワクチン抗原として大規模に研究されてきた。活性のポア複合体を形成できない弱毒化突然変異体、Ｈｌａ_Ｈ３５Ｌは、いくつかのマウス感染症モデルにおいて保護有効性を実証した（Bubeck Wardenburg and Schneewind, 2008 J Exp Med 205: 287-94）。Ｎ末端６２残基（Adhikari et al., 2016 Vaccine 34: 6402-7）またはステムドメインの欠失（Fiaschi et al., 2016 Vaccine 23: 442-450）に由来するＨｌａ抗原もまた免疫原性であり、保護免疫応答を誘発した。

【0076】

本明細書に記載される「ＬｕｋＡポリペプチド」は、スタフィロコッカス（staphylococcal）生物（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））にとってネイティブなポリペプチドであり、ヒト食細胞を特異的に標的化して結合する（しかし、内皮細胞、またはマウス細胞に対してはそうではない）。ＬｕｋＡポリペプチドが食細胞の膜に結合すると、ＬｕｋＡは、スタフィロコッカス（staphylococcal）Ｆ－サブユニットロイコシジン（例えば、本明細書に開示されるような、ＬｕｋＦ－ＰＶＬ、ＬｕｋＤおよびＨｌｇＢ、およびＬｕｋＢ）とオリゴマー化する。オリゴマー化で、ポリペプチドは膜貫通ポアを形成する（総称的にＬｕｋＡ活性と称される）。

【0077】

ＬｕｋＡポリペプチドは、典型的には、３５１個のアミノ酸残基を含む。アミノ末端の２７個のアミノ酸残基はネイティブな分泌／シグナル配列を表し、そのため、ＬｕｋＡの成熟した、分泌される形態はアミノ酸残基２８～３５１により表され、「ＬｕｋＡ（_{２８～３５１}）」または「成熟ＬｕｋＡ」と称され得る。これに対応して、ＬｕｋＡの未熟な形態は本明細書において「ＬｕｋＡ（_{１～３５１}）」と称され得る。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の異なる株から単離された未熟なＬｕｋＡポリペプチドの例としては、配列番号２～１４のＬｕｋＡポリペプチドが挙げられる。配列番号１は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１４０３３７号パンフレットに開示されるように、配列番号２～１４のアライメントに基づくコンセンサスＬｕｋＡポリペプチド配列を提供する。分泌／シグナル配列を欠失した、配列番号１～１４の未熟なＬｕｋＡポリペプチドに対応する成熟ＬｕｋＡポリペプチドの例としては、それぞれ配列番号１５～２８が挙げられる。

【0078】

本明細書に記載される「ＬｕｋＢポリペプチド」は、スタフィロコッカス（staphylococcal）生物（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））にとってネイティブなポリペプチドであり、Ｆ－サブユニットロイコシジン（例えば、ＬｕｋＦ－ＰＶＬ、ＬｕｋＤおよびＨｌｇＢ）の活性プロファイルを呈する。ＬｕｋＢポリペプチドは、ヒト食細胞に結合したスタフィロコッカス（staphylococcal）Ｓ－サブユニットロイコシジン（例えば、本明細書に開示されるような、ＬｕｋＳ－ＰＶＬ、ＬｕｋＥおよびＨｌｇＣ、およびＬｕｋＡ）と特異的にオリゴマー化する。オリゴマー化で、それは食細胞において膜貫通ポアを形成する（総称的にＬｕｋＢ活性と称される）。

【0079】

ＬｕｋＢポリペプチドは、典型的には、３３９個のアミノ酸残基を含む。アミノ末端（Ｎ末端）２９アミノ酸残基は分泌／シグナル配列を表し、そのため、ＬｕｋＢの成熟した、分泌される形態はアミノ酸残基３０～３３９により表され、「ＬｕｋＢ（_{３０～３３９}）」または「成熟ＬｕｋＢ」と称され得る。これに対応して、ＬｕｋＢの未熟な形態は本明細書において「ＬｕｋＢ（_{１～３３９}）」と称され得る。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の異なる株から単離された未熟なＬｕｋＢポリペプチドの例としては、配列番号３０～４１のＬｕｋＢポリペプチドが挙げられる。配列番号２９は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１４０３３７号パンフレットに開示されるように、配列番号３０～４１のアライメントに基づくコンセンサスＬｕｋＢポリペプチド配列を提供する。分泌／シグナル配列を欠失した、配列番号２９、３０、および３２～４１の未熟なＬｕｋＢポリペプチドに対応する成熟ＬｕｋＢポリペプチドの例としては、それぞれ配列番号４２～５３が挙げられる。

【0080】

本明細書においてＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、およびＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが参照される。ＬｕｋＡはＬｕｋＨとも称され得ること、およびＬｕｋＢはＬｕｋＧとも称され得ることを当業者は理解する。例えば、米国特許第８，４３１，６８７号明細書（ＬｕｋＡＢ）；Badarau et al., JBC 290(1):142-56 (2015)（ＬｕｋＧＨ）；およびBadarau et al., MABS 9(7):1347-60 (2016)（ＬｕｋＧＨ）を参照。

【0081】

ＬｕｋＡおよびＬｕｋＢポリペプチドは、１つまたは複数の追加のアミノ酸挿入、置換、および／または欠失を含むことができ、例えば、配列番号１～２８および／または配列番号２９～５３内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用してサイレントな変更を結果としてもたらすことができる、類似した極性の別のアミノ酸で置換することができる。類似した極性のアミノ酸でのアミノ酸の変更は、野生型ＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢポリペプチドと同じ基本的な特性を有するＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢポリペプチドを結果としてもたらし得る。

【0082】

ある特定の実施形態では、ＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢの不活性化または解毒の目的のために、非保存的な変更がＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢポリペプチドに対して為され得る。ある特定の実施形態では、ＬｕｋＡポリペプチドは、配列番号１～１４のアミノ酸残基３４２～３５１位において欠失を含むことができる（これらの位置に９アミノ酸を含有するため、アミノ酸残基３４２～３５０位において欠失を含むことができる、配列番号４～６を除く）。アミノ酸残基３４２～３５１位における欠失は、配列番号１５～２８のアミノ酸残基３１５～３２４位において起こる（これらの位置に９アミノ酸を含有するため、アミノ酸残基３１５～３２３位において欠失を含むことができる、配列番号１８～２０を除く）。解毒されたＬｕｋＡおよび／またはＬｕｋＢは、本明細書に開示される免疫原性組成物において使用され得る。

【0083】

ある特定の実施形態では、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｕｋＡポリペプチドが本明細書において提供される。

【0084】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ＬｕｋＡポリペプチド中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せは、ＬｕｋＡＢプロトマー／プロトマー境界面領域、二量体／二量体境界面領域、またはこれらの任意の組合せ中の保存された残基におけるものである。二量体を形成する、オリゴマー化する、真核細胞の表面上にポアを形成する、またはこれらの任意の組合せを行う、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドの能力は、例えば、妨害され得る。対応する野生型ＬｕｋＡポリペプチドと比べた突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドの毒性は、例えば、低減され得る。対応する野生型ＬｕｋＡポリペプチドおよび／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べた突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドおよび／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの免疫原性は、例えば、著しく低減され得ない。１つまたは複数の突然変異を含むＬｕｋＡポリペプチドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２３２０１４号パンフレットに記載されている。

【0085】

ある特定の実施形態では、ＬｕｋＡＢ二量体の不活性化または解毒の目的のために、成熟ＬｕｋＡポリペプチドの３２３位におけるグルタミン酸残基の置換が為され得る。ある特定の実施形態では、ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの不活性化または解毒の目的のために、成熟ＬｕｋＡポリペプチドの３２３位におけるグルタミン酸残基のアラニン残基での置換、すなわち、Ｅ３２３Ａ置換が為され得る（DuMont et al., Infect. Immun. (2014)）。

【0086】

ある特定の実施形態では、配列番号２９～５３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｕｋＢポリペプチドが本明細書において提供される。

【0087】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、ＬｕｋＢポリペプチド中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の置換、欠失、挿入、またはこれらの組合せは、ＬｕｋＡＢプロトマー／プロトマー境界面領域、二量体／二量体境界面領域、ＬｕｋＢ膜結合性クレフト領域、ＬｕｋＢポア形成領域、またはこれらの任意の組合せ中の保存された残基におけるものである。二量体を形成する、オリゴマー化する、真核細胞の表面上にポアを形成する、またはこれらの任意の組合せを行う、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドの能力は、例えば、妨害され得る。対応する野生型ＬｕｋＢポリペプチドと比べた突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドの毒性は、例えば、低減され得る。対応する野生型ＬｕｋＢポリペプチドおよび／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べた突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドおよび／またはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの免疫原性は、例えば、著しく低減され得ない。１つまたは複数の突然変異を含むＬｕｋＢポリペプチドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２３２０１４号パンフレットに記載されている。

【0088】

ある特定の実施形態では、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列および配列番号２９～５３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが本明細書において提供される。

【0089】

ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、ＬｕｋＡＢプロトマー／プロトマー境界面領域中に突然変異を含む。突然変異は、例えば、不完全な、より大きいロイコシジン八量体環の形成；毒素の溶血性／白血球毒性活性の低減もしくは消失；またはこれらの任意の組合せを結果としてもたらすことができる。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号１５のアミノ酸Ｒ４９に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号１５のアミノ酸Ｌ６１に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｄ４９に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；またはこれらの組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｒ４９に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換はグルタミン酸（Ｅ）である。ＬｕｋＡポリペプチド中の置換は、配列番号１５のＬｕｋＡ Ｒ４９および配列番号４２のＬｕｋＢ Ｄ４９の間の塩橋を妨害することができる。ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｌ６１に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、またはアルギニン（Ｒ）置換である。ＬｕｋＡポリペプチド中の置換は、ＬｕｋＡＢプロトマー／プロトマー境界面内に見出される疎水性ポケットを妨害することができる。ある特定の実施形態では、配列番号４２のアミノ酸Ｄ４９に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換は、アラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）置換である。ＬｕｋＢポリペプチド中の置換は、配列番号４２のＬｕｋＢ Ｄ４９および配列番号１５のＬｕｋＡ Ｒ４９の間の塩橋を妨害することができる。

【0090】

ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、ＬｕｋＡＢ二量体／二量体境界面領域中に突然変異を含む。突然変異は、例えば、ＬｕｋＡＢ二量体形成を妨害することができ、真核細胞の表面上でのＬｕｋＡＢオリゴマー化を妨害することができ、またはこれらの組合せを行うことができる。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号１５のアミノ酸Ｄ３９に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号１５のアミノ酸Ｄ７５に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号１５のアミノ酸Ｋ１３８に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号１５のアミノ酸Ｄ１９７に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｋ１２に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｋ１９に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｒ２３に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｋ５８に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｅ１１２に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｋ２１８に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；またはこれらの任意の組合せを含むことができる。

【0091】

ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｄ３９に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換は、アラニン（Ａ）またはアルギニン（Ｒ）置換である。Ｄ３９における配列番号１５の置換は、配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ３９および配列番号４２のＬｕｋＢ Ｋ５８の間の塩橋を妨害することができる。

【0092】

ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｄ７５に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。Ｄ７５における配列番号１５の置換は、配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ７５および配列番号４２のＬｕｋＢ Ｒ２３の間の塩橋を妨害することができる。

【0093】

ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｋ１３８に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。Ｋ１３８における配列番号１５の置換は、配列番号１５のＬｕｋＡ Ｋ１３８および配列番号４２のＬｕｋＢ Ｅ１１２の間の塩橋を妨害することができる。

【0094】

ある特定の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸Ｄ１９７に対応するＬｕｋＡポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）置換である。Ｄ１９７における配列番号１５の置換は、配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ１９７および配列番号４２のＬｕｋＢ Ｋ２１８の間の塩橋を妨害することができる。

【0095】

ある特定の実施形態では、配列番号４２のＫ１２に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＫ１９に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＲ２３に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）またはグルタミン酸（Ｅ）置換である。ある特定の実施形態では、ＬｕｋＢポリペプチドは、配列番号４２のＫ１２、Ｋ１９、およびＲ２３に対応する三重突然変異を含むことができる。配列番号４２のＫ１２、Ｋ１９、および／またはＲ２３における置換は、少なくとも配列番号４２のＬｕｋＢ Ｒ２３および配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ７５の間の塩橋を妨害することができる。

【0096】

ある特定の実施形態では、配列番号４２のＫ５８に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）またはグルタミン酸（Ｅ）置換である。Ｋ５８における配列番号４２の置換は、配列番号４２のＬｕｋＢ Ｋ５８および配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ３９の間の塩橋を妨害することができる。

【0097】

ある特定の実施形態では、配列番号４２のＥ１１２に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。Ｅ１１２における配列番号４２の置換は、配列番号４２のＬｕｋＢ Ｅ１１２および配列番号１５のＬｕｋＡ Ｋ１３８の間の塩橋を妨害することができる。

【0098】

ある特定の実施形態では、配列番号４２のＫ２１８に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。Ｋ２１８における配列番号４２の置換は、配列番号４２のＬｕｋＢ Ｋ２１８および配列番号１５のＬｕｋＡ Ｄ１９７の間の塩橋を妨害することができる。

【0099】

ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、ＬｕｋＢ膜結合性クレフト領域中に突然変異を含む。突然変異は、例えば、真核細胞の脂質二重層の極性ヘッド基とのＬｕｋＢサブユニットの相互作用を妨害することができる。ある特定の実施形態では、突然変異は、配列番号４２のアミノ酸Ｈ１８０に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のアミノ酸Ｅ１９７に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；配列番号４２のＲ２０３に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換；またはこれらの任意の組合せを含むことができる。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＨ１８０に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換であり；配列番号４２のＥ１９７に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換であり；かつ配列番号４２のＲ２０３に対応するＬｕｋＢポリペプチド中の置換はアラニン（Ａ）置換である。

【0100】

ある特定の実施形態では、突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは、ＬｕｋＢポア形成領域中に突然変異を含む。突然変異は、例えば、真核細胞の表面上に形成されたＬｕｋＡＢポアの細胞質側エッジを妨げ、それによりポア形成を妨げることができる。ある特定の実施形態では、ポア形成領域中の突然変異は、配列番号４２のアミノ酸Ｆ１２５～Ｔ１３３の欠失を含み、ある特定の態様では、配列番号４２のＤ１２４に対応するアミノ酸の後の１、２、３、４、または５個のグリシン（Ｇ）残基の挿入をさらに含む。

【0101】

ある特定の実施形態では、ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドは、（ａ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＤ４９Ｋアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｂ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｃ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ｅアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｄ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＥ１１２Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｅ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２０３Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｆ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ２１８Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｇ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ１２Ａ／Ｋ１９Ａ／Ｒ２３Ａ三重アミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｈ）配列番号１５に対応するＬ６１Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２のＬｕｋＢ－ＨｌｇＢポリペプチド；（ｉ）配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＥ１１２Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｊ）配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ１２Ａ／Ｋ１９Ａ／Ｒ２３Ａ三重アミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｋ）配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ１２Ａ／Ｋ１９Ａ／Ｒ２３Ａ三重アミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｌ）配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ｅアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｍ）配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ２１８Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｎ）配列番号１５に対応するＤ３９Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＥ１１２Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｏ）配列番号１５に対応するＤ３９Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ｅアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｐ）配列番号１５に対応するＤ３９Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ２１８Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｑ）配列番号１５に対応するＤ３９Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ１２Ａ／Ｋ１９Ａ／Ｒ２３Ａ三重アミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｒ）配列番号１５に対応するＤ３９Ｒアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ１２Ａ／Ｋ１９Ａ／Ｒ２３Ａ三重アミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｓ）配列番号１５に対応するＤ１９７Ｋアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；（ｔ）配列番号１５に対応するＤ１９７Ｋアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ｅアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチド；または（ｕ）配列番号１５に対応するＫ１３８Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＫ２１８Ａアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチドを含む。

【0102】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（すなわち、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の単離された核酸に関する。単離された核酸は、ＳｐＡバリアントポリペプチド、ならびに、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて突然変異体ロイコシジンサブユニットの毒性を低減させる、本明細書に記載されるような１つまたは複数の突然変異を有することを除いて、野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡサブユニット、野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢサブユニット、または野生型スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体を含む、からなる、またはから本質的になる、単離された突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドをコードすることができる。ある特定の態様では、置換、欠失、またはこれらの組合せは、対応する野生型ロイコシジンサブユニットまたは二量体と比べて、突然変異体ＬｕｋＡサブユニット、突然変異体ＬｕｋＢサブユニット、または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体の免疫原性を著しく低減させない。タンパク質のコーディング配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変更（例えば、置き換え、欠失、挿入など）され得ることが当業者に理解される。よって、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変更できることが当業者により理解されるであろう。

【0103】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（すなわち、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の単離された核酸を含むベクターに関する。本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、自己複製性ＲＮＡ、またはレプリコンを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、例えばプラスミドである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合性エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含むことができる。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。核酸を細胞に送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において公知であり、細胞中での抗体またはその抗原結合性断片の製造のために本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術または人工的な遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。そのような技術は、本開示を考慮して当業者に周知である。

【0104】

発現ベクターが選択されたら、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドは、プロモーターの下流、例えば、ポリリンカー領域中にクローニングすることができる。ベクターで適切な細菌株が形質転換され、標準的な技術を使用してＤＮＡが調製される。ポリペプチドの配向性およびＤＮＡ配列の他に、ベクター中に含まれる他のエレメントは、制限酵素マッピング、ＤＮＡ配列解析、および／またはＰＣＲ分析を使用して確認される。正確なベクターを宿す細菌細胞を細胞バンクとして貯蔵することができる。

【0105】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（すなわち、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の単離された核酸を含む宿主細胞に関する。本開示を考慮して当業者に公知の任意の宿主細胞を、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の組換え発現のために使用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１もしくはＢＬ２１細胞（例えば、ｓｃＦｖもしくはＦａｂ抗体の発現用）、ＣＨＯ－ＤＧ４４もしくはＣＨＯ－Ｋ１細胞またはＨＥＫ２９３細胞（例えば、全長ＩｇＧ抗体の発現用）である。特定の実施形態によれば、従来の方法、例えば化学的トランスフェクション、熱ショック、またはエレクトロポレーションにより、組換え発現ベクターで宿主細胞が形質転換され、組換え発現ベクターは宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれ、その結果、組換え核酸は有効に発現される。

【0106】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（すなわち、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を製造する方法であって、ＳｐＡバリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞を、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを製造するための条件下で培養すること、ならびに細胞または細胞培養物（例えば、上清）からＳｐＡバリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドを回収することを含む方法に関する。発現されたＳｐＡバリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（すなわち、突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）は、当該技術分野において公知の従来技術に従っておよび本明細書に記載されるように細胞から採取し、精製することができる。突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの製造方法は当該技術分野において公知である。例えば、DuMont et al., Infection and Immunity 82(3):1268-76 (2014); Kailasan et al., Toxins 11(6):339 (2019)を参照。

【0107】

スタフィロコッカス（staphylococcal）プロテインＡ（ＳｐＡ）

【0108】

「プロテインＡ」および「ＳｐＡ」は、本明細書において使用される場合、交換可能に使用され、感染された宿主の先天および適応免疫応答からの細菌逃避を提供するように機能する、Ｓ．アウレウス（S.aureus）の細胞壁アンカー表面タンパク質を指すことができる。プロテインＡは、免疫グロブリンにそれらのＦｃ部分において結合することができ、Ｂ細胞増殖およびアポトーシスの適切な刺激においてＢ細胞受容体のＶＨ３ドメインと相互作用することができ、フォンウィルブランド因子Ａ１ドメインに結合して細胞内凝固を活性化させることができ、ＴＮＦ受容体－１に結合してスタフィロコッカス（staphylococcal）性肺炎の病理発生に寄与することもできる。

【0109】

すべてのＳ．アウレウス（S.aureus）株は、プロテインＡの構造遺伝子（ｓｐａ）を発現し（Jensen (1958); Said-Salim et al., (2003)）、これはよく特徴付けられた病原性因子であり、その細胞壁アンカー表面タンパク質産物（ＳｐＡ）は、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣと呼称される５つの高度に相同の免疫グロブリン結合性ドメインを包含する（Sjodahl, (1977)）。免疫グロブリンドメインは、アミノ酸レベルで約８０％の同一性を示し、５６～６１残基の長さであり、タンデムリピートとして編成されている（Uhlen et al., (1984)）。免疫グロブリン結合性ドメインの各々はアンチパラレルα－ヘリックスから構成され、これらは３つのヘリックスバンドルに集合し、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメイン（Deisenhofer, (1981); Deisenhofer et al., (1978)）、ＩｇＭのＶＨ３重鎖（Ｆａｂ）（Graille et al., (2000)）、そのＡ１ドメインにおいてフォンウィルブランド因子（O’Seaghdha et al., (2006)）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）受容体１（ＴＮＦＲ１）（Gomez et al., (2006)）に結合する。

【0110】

ＳｐＡは、ＩｇＧのＦｃ成分への結合を通じてスタフィロコッカス（staphylococci）の好中球ファゴサイトーシスを妨害する（Jensen, (1958); Uhlen et al., (1984)）。追加的に、ＳｐＡは、フォンウィルブランド因子Ａ１ドメインへの結合を介して血管内凝固を活性化させることができる（Hartleib et al., (2000)）。血漿タンパク質、例えばフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンは、スタフィロコッカス（staphylococci）（ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢ）ならびに血小板インテグリンＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの間のブリッジとして作用し（O’Brien et al., (2002)）、これはｖＷＦ Ａ１とのＳｐＡの会合を通じて補足される活性であり、スタフィロコッカス（staphylococci）がＧＰＩｂ－α血小板受容体を介して血小板を捕捉することを可能とする（Foster, (2005); O’Seaghdha et al., (2006)）。ＳｐＡはまたＴＮＦＲ１に結合し、この相互作用は、スタフィロコッカス（staphylococcal）性肺炎の病理発生に寄与する（Gomez et al., (2004)）。ＳｐＡは、ＴＲＡＦ２、ｐ３８／ｃ－Ｊｕｎキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、およびＲｅｌ転写因子ＮＦ－κＢのＴＮＦＲ１媒介性活性化を通じて炎症促進性シグナル伝達を活性化させる。ＳｐＡの結合はＴＮＦＲ１シェディングをさらに誘導し、これは、ＴＮＦ変換酵素（ＴＡＣＥ）を要求するらしい活性である（Gomez et al., (2007)）。開示される活性の各々は、５つのＩｇＧ結合性ドメインを通じて媒介され、プロテインＡおよびヒトＩｇＧ１の間の相互作用に対する要求により最初に定義された、同じアミノ酸置換により撹乱され得る（Cedergren et al., (1993)）。

【0111】

ＳｐＡはまた、ＶＨ３保有ＩｇＭのＦａｂ領域、Ｂ細胞受容体を捕捉することによりＢ細胞スーパー抗原として機能する（Gomez et al., (2007); Goodyear et al., (2003); Goodyear and Silverman (2004); Roben et al., (1995)）。静脈内チャレンジ後に、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＳｐＡ突然変異は、臓器組織中でのスタフィロコッカス（staphylococcal）負荷における低減、および膿瘍を形成する能力の劇的な減少を示す。野生型Ｓ．アウレウス（S.aureus）の感染の間に、膿瘍が４８時間以内に形成され、多形核白血球（ＰＭＮ）の流入により最初に特徴付けられる、ヘマトキシリン－エオシン染色された薄片化腎臓組織の光顕微鏡観察により検出可能である。感染の５日目に、膿瘍は、サイズを増加させ、スタフィロコッカス（staphylococci）の中心集団を囲い込み、これは好酸球性の非晶性材料およびＰＭＮの大きいカフの層により取り囲まれる。病理組織学は、膿瘍病変の中心におけるスタフィロコッカス（staphylococcal）病巣に近接したＰＭＮの大量の壊死の他に、健常な食細胞のマントルを明らかにした。健常な腎臓組織を感染病変から分離する好酸球性仮性被膜に境界を接する、膿瘍病変の末梢における壊死したＰＭＮの縁もまた観察された。ＳｐＡを欠いたスタフィロコッカス（staphylococcal）バリアントは、膿瘍の病理組織学的特徴を確立できず、感染の間にクリアランスされる。

【0112】

本明細書に開示される場合、「プロテインＡバリアント」、「ＳｐＡバリアント」、「プロテインＡバリアントポリペプチド」、および「ＳｐＡバリアントポリペプチド」という用語は、ＦｃおよびＶＨ３への結合を妨害する少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＳｐＡ ＩｇＧドメインを含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドとしては、バリアントＤドメインの他に、非毒性であり、かつスタフィロコッカス（staphylococcus）細菌プロテインＡおよび／またはそれを発現する細菌に対する免疫応答を刺激するそのバリアントおよび断片が挙げられる。

【0113】

免疫グロブリンにもはや結合できず、それにより、ＳｐＡポリペプチドと関連付けられる毒性を排除するように機能する、ＳｐＡバリアントポリペプチドが本明細書に記載される。ＳｐＡバリアントポリペプチドは非毒性であり、液性免疫応答を刺激して、スタフィロコッカス（staphylococcal）感染症および疾患から保護する。

【0114】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、バリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメインを含む全長ＳｐＡバリアントである。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号６０または６１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0115】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは全長ＳｐＡポリペプチドの断片を含む。ＳｐＡバリアントポリペプチド断片は、１、２、３、４、５、またはより多くのＩｇＧ結合性ドメインを含むことができる。ＩｇＧ結合性ドメインは、例えば、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメインであることができる。

【0116】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＡドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＢドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＣドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＤドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、またはより多くのバリアントＥドメインを含む。

【0117】

バリアントＡドメインは、例えば、配列番号５５のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＢドメインは、例えば、配列番号５６のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＣドメインは、例えば、配列番号５７のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＤドメインは、例えば、配列番号５８のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＥドメインは、例えば、配列番号５９のアミノ酸配列を含むことができる。

【0118】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、バリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含むことができ、これらは、それぞれ配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0119】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸７位、８位、３４位、および／または３５位において置換を含むバリアントＡドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸７位、８位、３４位、および／または３５位において置換を含むバリアントＢドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸７位、８位、３４位、および／または３５位において置換を含むバリアントＣドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸９位、１０位、３６位、および／または３７位において置換を含むバリアントＤドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５９のアミノ酸６位、７位、３３位、および／または３４位において置換を含むバリアントＥドメインを含むことができる。バリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメイン中のアミノ酸置換は国際公開第２０１１／００５３４１号パンフレットに記載されている。

【0120】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡドメインＤのＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＳｐＡバリアントポリペプチドのＩｇＧ Ｆｃへの結合を妨害しまたは減少させることができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡドメインＤのＶ_Ｈ３結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置において１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｖ_Ｈ３への結合を妨害しまたは減少させることができる。

【0121】

ある特定の実施形態では、配列番号５８のＳｐＡ ＤドメインのＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメインのアミノ酸残基Ｆ５、Ｑ９、Ｑ１０、Ｓ１１、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｎ２８、Ｉ３１、および／またはＫ３５は、ＩｇＧ Ｆｃへの結合が低減または排除されるように改変または置換される。

【0122】

ある特定の実施形態では、配列番号５８のＳｐＡ ＤドメインのＶ_Ｈ３結合性サブドメインのアミノ酸残基Ｑ２６、Ｇ２９、Ｆ３０、Ｓ３３、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｑ４０、Ｎ４３、および／またはＥ４７は、Ｖ_Ｈ３への結合が低減または排除されるように改変または置換される。

【0123】

対応する改変をＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥに組み込むことができる。対応する位置は、ＳｐＡドメインＤをＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥとアライメントして、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥとのＳｐＡドメインＤからの対応する残基を決定することにより定義される。

【0124】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、（ａ）ＳｐＡドメインＤのＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換；ならびに（ｂ）ＳｐＡドメインＤのＶ_Ｈ３結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＳｐＡバリアントポリペプチドが宿主生物において低減または排除された毒性を有するようにＳｐＡバリアントポリペプチドのＩｇＧ ＦｃおよびＶ_Ｈ３への結合を低減させる。

【0125】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くのバリアントＤドメインを含む。バリアントＤドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはより多くのアミノ酸残基の置換または改変を含むことができる。アミノ酸残基の置換または改変は、例えば、ＳｐＡドメインＤ（配列番号５８）のＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメインのアミノ酸残基Ｆ５、Ｑ９、Ｑ１０、Ｓ１１、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｎ２８、Ｉ３１、および／もしくはＫ３５ならびに／またはＳｐＡドメインＤ（配列番号５８）のＶ_Ｈ３結合性サブドメインのアミノ酸残基Ｑ２６、Ｇ２９、Ｆ３０、Ｓ３３、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｑ４０、Ｎ４３、および／もしくはＥ４７において存在することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸残基の置換または改変は、配列番号５８のアミノ酸残基Ｑ９およびＱ１０におけるものである。ある特定の実施形態では、アミノ酸残基の置換または改変は、配列番号５８のアミノ酸残基Ｄ３６およびＤ３７におけるものである。バリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメイン中のアミノ酸置換は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／００５３４１号パンフレットに記載されている。

【0126】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号７２の少なくともｎ個の連続するアミノ酸の断片を含み、ｎは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、もしくは少なくとも４２５個のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７２のカルボキシ（Ｃ）末端からの１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、もしくは３５個のアミノ酸）の欠失および／またはアミノ（Ｎ）末端からの１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、もしくは３５個のアミノ酸）の欠失を含むことができる。ある特定の実施形態では、最後の３５個のＣ末端アミノ酸が欠失される。ある特定の実施形態では、最初の３６個のＮ末端アミノ酸が欠失される。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７２のアミノ酸３７～３２５を含む。

【0127】

ある特定の実施形態では、Ｎ末端からＣ末端へと並べられた５つすべてのＳｐＡ Ｉｇ結合性ドメインを含むＳｐＡバリアントポリペプチドは、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、およびＣドメインを順番に含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメインのうちの１、２、３、または４個を含む。天然のドメインのうちの１、２、３、または４個が欠失された実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡがＢ細胞スーパー抗原として機能する場合に起こり得る過度のＢ細胞拡大増殖およびアポトーシスを予防することができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドはＳｐＡ Ａドメインのみを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドはＳｐＡ Ｂドメインのみを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドはＳｐＡ Ｃドメインのみを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドはＳｐＡ Ｄドメインのみを含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドはＳｐＡ Ｅドメインのみを含む。

【0128】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７２と比べた１１個のジペプチド配列リピート（例えば、ＱＱジペプチドリピートおよび／またはＤＤジペプチドリピート）のうちの少なくとも１つの突然変異を含む。例として、ＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号７３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸７位および８位、３４位および３５位、６０位および６１位、６８位および６９位、９５位および９６位、１２６位および１２７位、１５３位および１５４位、１８４位および１８５位、２１１位および２１２位、２４２位および２４３位、ならびに２６９位および２７０位におけるＸＸジペプチドリピートは、免疫グロブリンに対するＳｐＡバリアントポリペプチドの親和性を低減させるように突然変異され得る。Ｇｌｎ－Ｇｌｎ（ＱＱ）ジペプチドについての有用なジペプチド置換としては、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＫＫ）、Ａｒｇ－Ａｒｇ（ＲＲ）、Ａｒｇ－Ｌｙｓ（ＲＫ）、Ｌｙｓ－Ａｒｇ（ＫＲ）、Ａｌａ－Ａｌａ（ＡＡ）、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ（ＳＳ）、Ｓｅｒ－Ｔｈｒ（ＳＴ）、およびＴｈｒ－Ｔｈｒ（ＴＴ）ジペプチドを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくは、ＱＱジペプチドはＫＲジペプチドで置換される。Ａｓｐ－Ａｓｐ（ＤＤ）ジペプチドについての有用なジペプチド置換としては、Ａｌａ－Ａｌａ（ＡＡ）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＫＫ）、Ａｒｇ－Ａｒｇ（ＲＲ）、Ｌｙｓ－Ａｒｇ（ＫＲ）、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ（ＨＨ）、およびＶａｌ－Ｖａｌ（ＶＶ）ジペプチドを挙げることができるがこれらに限定されない。ジペプチド置換は、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ部分およびＶ_Ｈ３含有ヒトＢ細胞受容体のＦａｂ部分に対するＳｐＡバリアントポリペプチドの親和性を減少させることができる。

【0129】

そのため、ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＸＸジペプチドの１つまたは複数、好ましくは１１個すべてが、配列番号７２の対応するジペプチドとは異なるアミノ酸で置換された、配列番号７８を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、６０位および６１位におけるアミノ酸ダブレットがそれぞれＬｙｓおよびＡｒｇ（ＫおよびＲ）である、配列番号７９を含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号８０または配列番号８１を含む。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７５を含み、配列番号７５の好ましい例は、配列番号７６または配列番号７７（配列番号７７は、Ｎ末端メチオニンを有する配列番号７６である）である。

【0130】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドのＮ末端は、配列番号７２の最初の３６アミノ酸の欠失を含むことができ、Ｃ末端は、配列番号７２の最後の３５アミノ酸の欠失を含むことができる。配列番号７２の３６アミノ酸のＮ末端欠失および配列番号７２の３５アミノ酸のＣ末端欠失を含むＳｐＡバリアントポリペプチドは、第５のＩｇ結合性ドメイン（すなわち、配列番号７２のＬｙｓ－３２７の下流）の欠失をさらに含むことができる。このＳｐＡバリアントは、ＸＸジペプチドが、配列番号７２における対応するジペプチド配列とは異なるアミノ酸で置換され得る、配列番号７３のアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号７４を含む。

【0131】

上述のある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、および／またはＥドメインのうちの１、２、３、または４個を含むことができ、例えば、ＳｐＡ Ｅドメインのみを含み、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣのいずれも含まないものであり得る。そのため、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号８３の少なくとも１つのアミノ酸における置換を含むバリアントＳｐＡ Ｅドメインを含むことができる。置換は、例えば、配列番号８３のアミノ酸６０位および６１位にあることができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、または配列番号８２を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、または配列番号８２を含むことができる。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４４６５３号パンフレットに記載されている。

【0132】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号８４のアミノ酸４３Ｑ、４４Ｑ、９６Ｑ、９７Ｑ、１６２Ｑ、１６３Ｑ、２２０Ｑ、２２１Ｑ、２７８Ｑ、および２７９Ｑにおいてアミノ酸置換を含む。配列番号８４のアミノ酸４３Ｑ、４４Ｑ、９６Ｑ、９７Ｑ、１６２Ｑ、１６３Ｑ、２２０Ｑ、２２１Ｑ、２７８Ｑ、および２７９Ｑにおけるアミノ酸置換は、例えば、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）置換であることができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号８４のアミノ酸７０Ｄ、７１Ｄ、１３１Ｄ、１３２Ｄ、１８９Ｄ、１９０Ｄ、２４７Ｄ、２４８Ｄ、３０５Ｄ、および３０６Ｄにおいてアミノ酸置換を含む。配列番号８４のアミノ酸７０Ｄ、７１Ｄ、１３１Ｄ、１３２Ｄ、１８９Ｄ、１９０Ｄ、２４７Ｄ、２４８Ｄ、３０５Ｄ、および３０６Ｄにおけるアミノ酸置換は、例えば、アラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）置換であることができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、および配列番号８８から選択することができる。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０３０４５６６号明細書に記載されている。

【0133】

ある特定の実施形態では、バリアントＡドメインは、例えば、配列番号６２または６７のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＢドメインは、例えば、配列番号６３または６８のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＣドメインは、例えば、配列番号６４または６９のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＤドメインは、例えば、配列番号６６または７１のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＥドメインは、例えば、配列番号６５または７０のアミノ酸配列を含むことができる。

【0134】

好ましい実施形態では、バリアントＡドメインは、例えば、配列番号６２のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＢドメインは、例えば、配列番号６３のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＣドメインは、例えば、配列番号６４のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＤドメインは、例えば、配列番号６６のアミノ酸配列を含むことができる。バリアントＥドメインは、例えば、配列番号６５のアミノ酸配列を含むことができる。

【0135】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、バリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含むことができ、これらは、それぞれ配列番号６２または６７、配列番号６３または６８、配列番号６４または６９、配列番号６６または７１、および配列番号６５または７０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0136】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸９位、１０位、および／または３３位において置換を含むバリアントＤドメインを含むことができる。

【0137】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、（ｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の９位および１０位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるグルタミンアミノ酸残基についてのリシン置換；ならびに（ｉｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３３位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるセリンアミノ酸残基についてのグルタミン酸置換を含む。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋しない、かつ／または好塩基球を活性化させない。検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋しない、かつ／または好塩基球を活性化させないことにより、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ヒト患者に対して著しい安全性もしくは毒性の懸念を課さず、ヒト患者においてアナフィラキシーショックの著しいリスクも課さない。

【0138】

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性は、ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の９位および１０位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるグルタミン残基についてのリシン置換ならびにＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のアスパラギン酸についてのアラニン置換からなるＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、低減されている。ドメインＤ中の９位および１０位に対応するドメインＡ～Ｅの各々におけるグルタミン残基についてのリシン置換ならびにドメインＤの３６位および３７位に対応するドメインＡ～Ｅにおけるアスパラギン酸についてのアラニン置換からなるＳｐＡバリアントポリペプチドは比較用として使用され、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと命名される。ＳｐＡ_ＫＫＡＡバリアントポリペプチドは配列番号５４のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３倍もしくはより高い倍数またはこれらの間の任意の値だけ低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００％もしくはより高い％またはこれらの間の任意の値だけ低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、約１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、約３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、もしくは０．１×１０^５Ｍ^－１またはこれらの間の任意の値よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインのいずれかにおける置換を有しない。ある特定の実施形態では、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号６６または７１を含む。ある特定の実施形態では、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号６０または６１を含む。好ましい実施形態では、本発明のＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号６０を含む。

【0139】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、（ｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の９位および１０位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるグルタミンアミノ酸残基についてのリシン置換；ならびに（ｉｉ）ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３３位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるセリンアミノ酸残基についてのスレオニン置換を含む。ＳｐＡバリアントポリペプチドは、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋しない、かつ／または好塩基球を活性化させない。検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋しない、かつ／または好塩基球を活性化させないことにより、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ヒト患者に対して著しい安全性もしくは毒性の懸念を課さず、ヒト患者においてアナフィラキシーショックの著しいリスクも課さない。

【0140】

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性は、ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の９位および１０位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインの各々におけるグルタミン残基についてのリシン置換ならびにＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のアスパラギン酸についてのアラニン置換からなるＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、低減されている。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３倍もしくはより高い倍数またはこれらの間の任意の値だけ低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００％もしくはより高い％またはこれらの間の任意の値だけ低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、約１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、約３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、もしくは０．１×１０^５Ｍ^－１またはこれらの間の任意の値よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応するＳｐＡ Ａ～Ｅドメインのいずれかにおける置換を有しない。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは配列番号６０を含む。

【0141】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡドメインＤのＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＳｐＡバリアントポリペプチドのＩｇＧ Ｆｃへの結合を妨害しまたは減少させることができる。ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、ＳｐＡドメインＤのＶ_Ｈ３結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置において１つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｖ_Ｈ３への結合を妨害しまたは減少させることができる。

【0142】

対応する改変をＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥに組み込むことができる。対応する位置は、ＳｐＡドメインＤをＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥとアライメントして、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、および／またはＥとのＳｐＡドメインＤからの対応する残基を決定することにより定義される。

【0143】

ある特定の実施形態では、ＳｐＡバリアントポリペプチドは、（ａ）ＳｐＡドメインＤのＩｇＧ Ｆｃ結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換；ならびに（ｂ）ＳｐＡドメインＤのＶ_Ｈ３結合性サブドメイン中、または他のＩｇＧドメイン中の対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＳｐＡバリアントポリペプチドが宿主生物において低減または排除された毒性を有するようにＳｐＡバリアントポリペプチドのＩｇＧ ＦｃおよびＶ_Ｈ３への結合を低減させる。

【0144】

追加のスタフィロコッカス（Staphylococcus）ペプチド

【0145】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／または突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を含む免疫原性組成物は、ＣＰ５、ＣＰ８、Ｅａｐ、Ｅｂｈ、Ｅｍｐ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＡＢ（融合物）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、Ｃｏａ、Ｈｌａ（例えば、Ｈ３５突然変異体、またはＨ３５Ｌ／Ｈ４８Ｌ）、ｍＨｌａ、ＭｎｔＣ、ｒＴＳＳＴ－１、ｒＴＳＳＴ－１ｖ、ＳａｓＦ、ｖＷｂｐ、およびｖＷｈからなる群から選択される少なくとも１つまたは複数のスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原またはその免疫原性断片をさらに含む。免疫原性組成物に含めることができる追加のスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原としては、ビトロネクチン結合性タンパク質（国際公開第２００１／６０８５２号パンフレット）、Ａａａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＣ８０８３７）、Ａａｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＪ２４９４８７）、Ａｎｔ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿３７２５１８）、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Ｃａｎ、コラーゲン結合性タンパク質（米国特許第６，２８８，２１４号明細書）、Ｃｓａ１Ａ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、エラスチン結合性タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＰＢ、ＦｂｐＡ、フィブリノーゲン結合性タンパク質（米国特許第６，００８，３４１号明細書）、フィブロネクチン結合性タンパク質（米国特許第５，８４０，８４６号明細書）、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＤ２、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＧｅｈＤ（米国特許出願公開第２００２／０１６９２８８号明細書）、ＨａｒＡ、ＨＢＰ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ラミニン受容体、リパーゼＧｅｈＤ、ＭＡＰ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＭＨＣ ＩＩアナログ（米国特許第５，６４８，２４０号明細書）、ＭＲＰＩＩ、ＮＰａｓｅ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＦ（国際公開第２０００／１２６８９号パンフレット）、ＳｄｒＧ（国際公開第２０００／１２６８９号パンフレット）、ＳｄｒＨ（国際公開第２０００／１２６８９号パンフレット）、ＳＥＡ外毒素（国際公開第２０００／０２５２３号パンフレット）、ＳＥＢ外毒素（国際公開第２０００／０２５２３号パンフレット）、ｍＳＥＢ、ＳｉｔＣおよびＮｉ ＡＢＣトランスポーター、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合性タンパク質（米国特許第５，８０１，２３４号明細書）、ＳｓａＡ、ＳＳＰ－１、ＳＳＰ－２、Ｓｐａ５（米国特許出願公開第２０１６／０３０４５６６号明細書）、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ（国際公開第２０１１／００５３４１号パンフレット、国際公開第２０１５／１４４６５３号パンフレット、国際公開第２０１５／１４４６９１号パンフレット）、ＳｐＡｋＲ（国際公開第２０１５／１４４６５３号パンフレット）、Ｓｔａ００６、ならびに／またはＳｔａ０１１を挙げることができるがこれらに限定されない。

【0146】

免疫原性組成物に含めることができる追加のスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原としては、突然変異体ＬｕｋＳ－ＰＶサブユニット、ＬｕｋＦ－ＰＶサブユニット、突然変異体ガンマ溶血素Ａ、突然変異体ガンマ溶血素Ｂ、突然変異体ガンマ溶血素（Ｈｌｇ）、パントン－バレンタインロイコシジン（ＰＶＬ）、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＥＤ二量体またはこれらの任意の組合せを挙げることができるがこれらに限定されない。

【0147】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）の病原性莢膜を持つ株は、莢膜多糖体５型（ＣＰ５）または８型（ＣＰ８）を有する（O’Riordan and Lee, Clin. Microbiol. Rev. 17(1):218-34 (2004) PMID: 14726462）。スタフィロコッカス（staphylococcal）ＣＰベースのワクチンは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）のオプソニン化貪食作用性殺傷（ＯＰＫ）を促進する抗体を誘発し（Karakawa et al., Infect. Immun. 56(5):1090-5 (1988) PMID: 3356460）、免疫化は、スタフィロコッカス（staphylococcal）菌血症、致死性、乳腺炎、骨髄炎、および心内膜炎から実験動物を保護することが示された（Cheng et al., Human Vaccines & Immunother. 13(7):1609-14 (2017); Kuipers et al., Micro. 162(7):1185-94 (2016)）。ＣＰ５およびＣＰ８は、高度に類似した三糖のリピートから構成され、これらの三糖は、それらの単糖の間の連結およびＯ－アセチル化においてのみ異なる。ＣＰ５およびＣＰ８に対する免疫応答は、血清型特異的であると考えられる。しかしながら、ＣＰ８誘導性の抗体はＣＰ５株に対して交差反応性であり得る一方、ＣＰ５誘導性の抗体は血清型特異的であることが示唆されている（Park et al., Infect. Immun. 82(12):5049-55 (2014) PMID: 25245803）。莢膜多糖体は、Ｔ非依存性免疫原であり、弱い免疫原性である。莢膜多糖体の免疫原性を向上させるために、キャリアタンパク質に化学的または酵素的に共有結合的に連結（または高親和性非共有連結を介して連結）させて、人工的な糖タンパク質または複合糖質を作ることが必要である（Fattom et al., Infect. Immun. 61(3):1023-32 (1993) PMID: 8432585）。コンジュゲーションの手段により、莢膜多糖体およびキャリアタンパク質、以下に限定されないが例えばＣＲＭ１９７からなる複合糖質が形成される。ＣＲＭ１９７は、グリシンについてのグルタミン酸の単一のアミノ酸置換を有する、ジフテリア毒素の非毒性突然変異体である。ＣＲＭ１９７は、十分に定義されたタンパク質であり、多糖およびハプテンのためのキャリアとして機能して、それらを免疫原性にする。それは、疾患、例えば髄膜炎および肺炎球菌細菌感染症に対する多数の承認されたコンジュゲートワクチンにおいてキャリアタンパク質として利用されている。ＣＰ５およびＣＰ８は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）バイオマスからネイティブな抗原として製造することができ、または化学的に合成することができる。ＣＲＭ１９７以外に他のキャリアタンパク質を使用することができる。ＣＲＭ１９７の例は、限定的であるとは考えられない。

【0148】

追加のスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／または突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）と並行して投与することができる。スタフィロコッカス（staphylococcal）抗原は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／または突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）と共に同じ免疫原性組成物中で投与することができる。

【0149】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＳｐＡバリアントポリペプチドおよび／または突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドは異種アミノ酸配列をさらに含む。異種アミノ酸配列は、例えば、Ｈｉｓタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合性ドメイン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルモジュリン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合性タンパク質、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）セルロース結合性ドメイン、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド、Ｓタグ、Ｔ７タグ、異種アミノ酸配列のその断片、および前記異種アミノ酸配列のうちの２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択されるペプチドをコードすることができる。ある特定の実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫原、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、異種アミノ酸配列のその断片、および前記異種アミノ酸配列のうちの２つまたはそれより多くの組合せをコードする。

【0150】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／または突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の単離された核酸に関する。タンパク質のコーディング配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変化（例えば、置き換え、欠失、挿入など）させることができることが当業者により理解される。よって、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく変更できることが当業者により理解されるであろう。

【0151】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の単離された核酸を含むベクターに関する。「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞中での発現のために、例えば制限酵素処理およびライゲーションにより、所望の配列を挿入することができる、任意の数の核酸を指す。核酸ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、およびウイルスゲノムが挙げられるがこれらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞中での複製が可能であり、かつ決定可能な様式でベクターを切断でき、かつ宿主細胞中で複製する能力を新たな組換えベクターが保持するように所望のＤＮＡ配列をライゲーションできる、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位によりさらに特徴付けられる、ベクターである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増加する際に多くの回数で、または宿主が有糸分裂により複製する前に宿主当たり単一の回数だけ、起こり得る。ファージの場合、複製は、溶菌期（lytic phase）の間に能動的にまたは溶原期（lysogenic phase）の間に受動的に起こり得る。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞中で自律複製することができる。他のベクターは、宿主細胞への導入で宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。

【0152】

本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターを使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクター、例えばプラスミドである。ベクターは、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合性エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、および複製起点を含むことができる。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。核酸を細胞に送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において公知であり、細胞中での融合ペプチドの製造のために本明細書において使用することができる。従来のクローニング技術または人工的な遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態による組換え発現ベクターを生成することができる。

【0153】

発現ベクターが選択されたら、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドは、プロモーターの下流、例えば、ポリリンカー領域中にクローニングすることができる。ベクターで適切な細菌株が形質転換され、標準的な技術を使用してＤＮＡが調製される。ポリペプチドの配向性およびＤＮＡ配列の他に、ベクター中に含まれる他のエレメントは、制限酵素マッピング、ＤＮＡ配列解析、および／またはＰＣＲ分析を使用して確認される。正確なベクターを宿す細菌細胞を細胞バンクとして貯蔵することができる。

【0154】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／もしくは突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つもしくは複数の単離された核酸または本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに／もしくは突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／もしくはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞に関する。本開示を考慮して当業者に公知の任意の宿主細胞を、本発明の突然変異体ポリペプチドの組換え発現のために使用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１もしくはＢＬ２１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４もしくはＣＨＯ－Ｋ１細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。特定の実施形態によれば、従来の方法、例えば化学的トランスフェクション、熱ショック、またはエレクトロポレーションにより、組換え発現ベクターで宿主細胞が形質転換され、そこでそれは宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれ、その結果、組換え核酸は有効に発現される。

【0155】

宿主細胞は、本開示のベクターを用いて遺伝子操作（感染、形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）される。そのため、本発明の１つの態様は、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞を対象とする。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換体を選択し、またはポリヌクレオチドを増幅するために、適宜改変された従来の栄養培地中で培養することができる。培養条件、例えば温度およびｐＨなどは、発現のために選択される宿主細胞と共に以前より使用されるものであり、当業者に明らかである。「トランスフェクト」という用語は、本明細書において使用される場合、真核細胞が、プラスミドの形態のＤＮＡが挙げられるがこれに限定されない単離されたＤＮＡを許容してそれをゲノム中に組み込むように誘導される、任意の手順を指す。「形質転換」という用語は、本明細書において使用される場合、細菌細胞が、プラスミドの形態のＤＮＡが挙げられるがこれに限定されない単離されたＤＮＡを許容してそれをゲノム中に組み込むように誘導される、任意の手順を指す。

【0156】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を製造する方法であって、Ｓ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞を、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンポリペプチドを製造するための条件下で培養すること、ならびに細胞または細胞培養物（例えば、上清）からポリペプチドを回収することを含む方法に関する。発現されたポリペプチドは、当該技術分野において公知の従来技術に従っておよび本明細書に記載されるように、細胞から採取され、かつ精製され得る。

【0157】

免疫原性組成物

【0158】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）ならびに薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物に関する。「免疫原性組成物」という用語は、対象において免疫応答を誘発するために使用することができる抗原、例えば、微生物またはその構成要素を含む任意の医薬組成物に関する。本発明の単離されたＳ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび単離された突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）ならびにそれらを含む組成物もまた、本明細書において言及される治療応用のための医薬の製造において有用である。

【0159】

本明細書において使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、マイクロスフェア、リポソーム被包、または薬学的製剤における使用のための当該技術分野において周知の他の材料を指す。担体、賦形剤または希釈剤の特徴は、特定の応用のための投与の経路に依存することが理解されるであろう。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明による組成物の有効性にも本発明による組成物の生物学的活性にも干渉しない、非毒性の材料を指す。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、ポリペプチド医薬組成物における使用のために好適な任意の薬学的に許容される担体を本発明において使用することができる。

【0160】

薬学的に許容される担体を用いる薬学的に活性の成分の製剤化は、当該技術分野において公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 21st edition (2005)、および任意のその後の版)にある。追加の成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定化剤、およびキレート剤が挙げられる。１つまたは複数の薬学的に許容される担体を本発明の医薬組成物の製剤化において使用することができる。

【0161】

本発明の１つの実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、およびゲルなどを含むことができる。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、または少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。

【0162】

１つの実施形態では、医薬組成物は、例えば、注射デバイス（例えば、シリンジまたは注入ポンプ）を介して注射することができる、注射剤として製剤化することができる。注射は、例えば、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、硝子体内に、または静脈内に送達することができる。

【0163】

別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま、または使用の前に医師もしくは患者が溶媒、および／もしくは希釈剤を加えて、使用することができるフリーズドライまたはスプレー乾燥組成物である。固体投薬形態としては、錠剤、例えば圧縮錠剤、および／またはコーティング錠剤、ならびにカプセル（例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サシェ剤、糖衣錠、粉末、顆粒、ロゼンジ、または復元用の粉末の形態であることができる。

【0164】

投薬形態は、即時放出性であってもよく、その場合、それらは水溶性もしくは分散性の担体を含むことができ、またはそれらは遅延放出性、持続放出性、もしくは修飾放出性であることができ、その場合、それらは、胃腸管中または皮膚下で投薬形態の溶解の速度を調節する水不溶性ポリマーを含むことができる。

【0165】

他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内に、頬内に、舌下に、または皮内に送達することができる。

【0166】

水性製剤中のｐＨはｐＨ３～ｐＨ１０であることができる。本発明の１つの実施形態では、製剤のｐＨは約７．０～約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０～約７．０である。

【0167】

アジュバント

【0168】

本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、本発明の組成物と組み合わせてまたはその部分として投与された場合に、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド、および／またはＳｐＡバリアントポリペプチドに対する免疫応答を増大、増強および／またはブーストするが、アジュバント化合物が単独で投与された場合に、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド、および／またはＳｐＡバリアントポリペプチドに対する免疫応答を生成しない、化合物を指す。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、ならびに抗原提示細胞の刺激を含めて、いくつかの機序により免疫応答を増強することができる。

【0169】

本発明の組合せワクチン（例えば、ＬｕｋＡポリペプチド、ＬｕｋＢポリペプチド、ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド、ＳｐＡバリアントポリペプチド、および／またはそれをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、もしくはウイルスベクターを含む免疫原性組成物）は、アジュバントを含む、またはアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、免疫原性組成物の前に、随伴的にまたは後に投与することができる。

【0170】

アジュバントの特有の例としては、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および酸化アルミニウム；ミョウバンを含むナノ粒子またはナノアルム製剤を含む）、リン酸カルシウム（例えばMasson JD et al, 2017, Expert Rev Vaccines 16: 289-299）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－デ－Ｏアシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２１１号明細書、欧州特許第ＥＰ０９７１７３９号明細書、欧州特許第１１９４１６６号明細書、米国特許第６４９１９１９号明細書を参照）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３およびＡＳ０４（すべてＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、ＡＳ０４について欧州特許第１１２６８７６号明細書、米国特許第７３５７９３６、ＡＳ０２について欧州特許第０６７１９４８号明細書、欧州特許第０７６１２３１号明細書、米国特許第５７５０１１０号明細書を参照）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第２００７／１０９８１２号パンフレットを参照）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第２００７／１０９８１３号パンフレットを参照）、デルタ－イヌリン（例えばPetrovsky N and PD Cooper, 2015, Vaccine 33: 5920-5926）、ＳＴＩＮＧ活性化合成環状ジヌクレオチド（例えば米国特許出願公開第２０１５００５６２２４号明細書）、レシチンおよびカルボマーホモポリマー（例えば米国特許第６６７６９５８号明細書）、およびサポニンの組合せ、例えばＱｕｉｌ ＡおよびＱＳ２１（例えばZhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113)を参照）、任意選択でＱＳ７と組み合わせたもの（Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)を参照；米国特許第５，０５７，５４０号明細書）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、アジュバントはフロイントアジュバント（完全または不完全）である。ある特定の実施形態では、アジュバントは、Ｑｕｉｌ－Ａ、例えばＢｒｅｎｎｔａｇ（現在はＣｒｏｄａ）またはＩｎｖｉｖｏｇｅｎから商業的に得られ得るものを含む。ＱｕｉｌＡは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の木からのサポニンの水で抽出可能な画分を含有する。これらのサポニンは、共通のトリテルペノイド骨格構造を有する、トリテルペノイドサポニンの群に属する。サポニンは、Ｔ依存性の他にＴ非依存性の抗原に対する強いアジュバント応答の他に、強い細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球応答を誘導し、かつ粘膜抗原に対する応答を増強することが公知である。それらはまた、コレステロールおよびリン脂質と組み合わせて、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）を形成することができ、ＱｕｉｌＡアジュバントは、異なる起源からの広範な抗原に対する抗体媒介性および細胞媒介性の両方の免疫応答を活性化させることができる。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０１、例えばＡＳ０１_Ｂである。ＡＳ０１は、ＭＰＬ（３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）、ＱＳ２１（キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）、画分２１）、およびリポソームを含有するアジュバントシステムである。ある特定の実施形態では、ＡＳ０１は、商業的に入手可能（ＧＳＫ）であり、または参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９６／３３７３９号パンフレットに記載されるように製造することができる。ある特定のアジュバントはエマルションを含み、エマルションは、２つの非混和性の流体、例えば油および水の混合物であり、該流体のうちの１つは、小さい液滴として他方の内側に懸濁され、表面活性剤により安定化される。水中油エマルションは、油の小さい小滴を取り囲む、連続相を形成する水を有し、油中水エマルションは、連続相を形成する油を有する。ある特定の水中油エマルションはスクアレン（代謝可能な油）を含む。ある特定のアジュバントはブロックコポリマーを含み、ブロックコポリマーは、２つのモノマーがクラスター化して一緒になって、繰返し単位のブロックを形成する場合に形成されるコポリマーである。ブロックコポリマー、スクアレンおよび微粒子安定化剤を含む油中水エマルションの例はＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）であり、これはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に得ることができる。任意選択で、エマルションは、さらなる免疫刺激性成分、例えばＴＬＲ４アゴニストと組み合わせることができ、またはそれを含むことができる。ある特定のアジュバントは水中油エマルション（例えばスクアレンまたはピーナッツ油）であり、これはＭＦ５９（例えば欧州特許第０３９９８４３号明細書、米国特許第６２９９８８４号明細書、米国特許第６４５１３２５号明細書を参照）およびＡＳ０３においても使用され、任意選択で免疫刺激剤、例えばモノホスホリルリピドＡおよび／またはＱＳ２１、例えばＡＳ０２におけるようなものと組み合わせられる（Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91を参照）。アジュバントのさらなる例は、免疫刺激剤、例えばＭＰＬおよびＱＳ２１、例えばＡＳ０１ＥおよびＡＳ０１Ｂにおけるようなものを含有するリポソームである（例えば米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号明細書）。アジュバントの他の例は、ＣｐＧ（Bioworld Today, Nov. 15, 1998）ならびにイミダゾキノリン（例えばイミキモドおよびＲ８４８）である。例えば、Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608を参照。本発明によるある特定の好ましい実施形態では、アジュバントはＴｈ１アジュバントである。

【0171】

ある特定の好ましい実施形態では、アジュバントは、サポニン、好ましくはキラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）から得られるサポニンの水で抽出可能な画分を含む。ある特定の実施形態では、アジュバントはＱＳ－２１を含む。

【0172】

ある特定の好ましい実施形態では、アジュバントはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含有する。ＴＬＲ４アゴニストは当該技術分野において周知であり、例えばIreton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807を参照。ある特定の好ましい実施形態では、アジュバントは、リピドＡ、またはそのアナログもしくは誘導体を含むＴＬＲ４アゴニストである。

【0173】

アジュバント、好ましくはＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントは、様々なやり方で、例えば、アジュバント中の免疫調節分子のためおよび／または免疫原のための様々な送達システムを表す、エマルション、例えば油中水（ｗ／ｏ）エマルションまたは水中油（ｏ／ｗ）エマルション（例はＭＦ５９、ＡＳ０３である）、安定（ナノ）エマルション（ＳＥ）、脂質懸濁液、リポソーム、（ポリマー）ナノ粒子、ビロソーム、ミョウバン吸着、および水性製剤（ＡＦ）などにおいて、製剤化されてもよい（例えばReed et al, 2013、上掲; Alving CR et al, 2012, Curr Opin Immunol 24: 310-315を参照）。

【0174】

免疫賦活性ＴＬＲ４アゴニストは、任意選択で、他の免疫調節成分、例えばサポニン（例えばＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ２１、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、Ｉｓｃｏｍｓ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘなど）、アルミニウム塩、および他のＴＬＲ用の活性化剤（例えばイミダゾキノリン、フラジェリン、ｄｓＲＮＡアナログ、ＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧなど）などと組み合わされてもよい（例えばReed et al, 2013、上掲を参照）。

【0175】

本明細書において使用される場合、「リピドＡ」という用語は、グルコサミンを含み、かつケトシド結合を通じてＬＰＳ分子の内部コア中のケト－デオキシオクツロソネートに連結され、グラム陰性細菌の外膜の外葉中にＬＰＳ分子をアンカリングする、ＬＰＳ分子の疎水性脂質部分を指す。ＬＰＳの合成およびリピドＡ構造の概要について、例えば、Raetz, 1993, J. Bacteriology 175:5745-5753, Raetz CR and C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem 71: 635-700；米国特許第５，５９３，９６９号明細書および米国特許第５，１９１，０７２号明細書を参照。リピドＡは、本明細書において使用される場合、天然に存在するリピドＡ、その混合物、アナログ、誘導体および前駆体を含む。該用語は、単糖、例えば、リピドＸと称されるリピドＡの前駆体；二糖リピドＡ；ヘプタ－アシルリピドＡ；ヘキサ－アシルリピドＡ；ペンタ－アシルリピドＡ；テトラ－アシルリピドＡ、例えば、リピドＩＶＡと称されるリピドＡのテトラ－アシル前駆体；脱リン酸化リピドＡ；モノホスホリルリピドＡ；ジホスホリルリピドＡ、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）およびロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）からのリピドＡを含む。いくつかの免疫活性化リピドＡ構造は６つのアシル鎖を含有する。グルコサミン糖に直接的に取り付けられた４つの一次アシル鎖は、通常１０～１６炭素の長さの３－ヒドロキシアシル鎖である。２つの追加のアシル鎖は、多くの場合に、一次アシル鎖の３－ヒドロキシ基に取り付けられる。例として、Ｅ．コリ（E. coli）リピドＡは、典型的には、糖に取り付けられた４つのＣ１４ ３－ヒドロキシアシル鎖ならびに一次アシル鎖の３－ヒドロキシ基のそれぞれ２’位および３’位に取り付けられた１つのＣ１２および１つのＣ１４を有する。

【0176】

本明細書において使用される場合、「リピドＡアナログまたは誘導体」という用語は、リピドＡの構造および免疫学的活性に似ているが、必ずしも天然に存在しない分子を指す。リピドＡアナログまたは誘導体は、例えば、短縮もしくは縮合されるように、および／またはそれらのグルコサミン残基が別のアミン糖残基、例えばガラクトサミン残基で置換されるように、還元末端におけるグルコサミン－１－ホスフェートの代わりに２－デオキシ－２－アミノグルコネートを含有するように、４’位においてリン酸部分の代わりにガラクツロン酸部分を有するように、修飾することができる。リピドＡアナログまたは誘導体は、細菌から単離されたリピドＡから、例えば、化学的誘導体化により、調製することができ、または、例えば、好ましいリピドＡの構造を最初に決定し、そのアナログもしくは誘導体を合成することにより、化学的に合成することができる。リピドＡアナログまたは誘導体はまた、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして有用である（例えばGregg KA et al, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17を参照）。

【0177】

例えば、リピドＡアナログまたは誘導体は、例えば、アルカリ処理による、野生型リピドＡ分子の脱アシル化により得ることができる。リピドＡアナログまたは誘導体は、例えば、細菌から単離されたリピドＡから調製することができる。そのような分子はまた、化学的に合成され得る。リピドＡアナログまたは誘導体の別の例は、リピドＡ生合成および／またはリピドＡ修飾に関与する酵素中に突然変異、または該酵素の欠失もしくは挿入を宿す細菌細胞から単離されたリピドＡ分子である。

【0178】

ＭＰＬおよび３Ｄ－ＭＰＬは、リピドＡ毒性を減弱するように修飾されたリピドＡアナログまたは誘導体である。リピドＡ、ＭＰＬおよび３Ｄ－ＭＰＬは、長い脂肪酸鎖が取り付けられる糖骨格を有し、骨格は、グリコシド連結中の２つの６炭素糖、および４位におけるホスホリル部分を含有する。典型的には、５～８個の長鎖脂肪酸（通常１２～１４個の炭素原子）が糖骨格に取り付けられる。天然供給源の誘導体化に起因して、ＭＰＬまたは３Ｄ－ＭＰＬは、種々の脂肪酸長と共に、多数の脂肪酸置換パターンの複合物または混合物、例えばヘプタ－アシル、ヘキサ－アシル、ペンタ－アシルなどとして存在することができる。これは、本明細書に記載の他のリピドＡアナログまたは誘導体の一部についても当てはまるが、合成リピドＡバリアントもまた定義されて、均質であることができる。ＭＰＬおよびその製造は、例えば、米国特許第４，４３６，７２７号明細書に記載されている。３Ｄ－ＭＰＬは、例えば、米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載されており、３位の還元末端グルコサミンにエステル連結された３－ヒドロキシミリスチン酸アシル残基の選択的な除去によりＭＰＬとは異なる（例えば、米国特許第４，９１２，０９４号明細書の１欄におけるＭＰＬの構造と６欄における３Ｄ－ＭＰＬの構造を比較されたい）。当該技術分野において、多くの場合に、時にＭＰＬと称されるが３Ｄ－ＭＰＬが使用される（例えば、Ireton GC and SG Reed, 2013、上掲の表１における第１の構造は、ＭＰＬ（登録商標）としてこの構造を参照するが、実際には３Ｄ－ＭＰＬの構造を描写する）。

【0179】

本発明によるリピドＡ（アナログ、誘導体）の例としては、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９（例えば欧州特許第１３８５５４１号明細書）、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ（グリコピラノシル脂質アジュバント、合成二糖糖脂質；例えば米国特許出願公開第２０１００３１０６０２号明細書、米国特許第８７２２０６４号明細書）、ＳＬＡ（例えば、ヒトワクチン用にＴＬＲ４リガンドを最適化するための構造－機能アプローチを記載する、Carter D et al, 2016, Clin. Transl. Immunology. 5: e108 (doi:10.1038/cti.2016.63)）、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖；その構造はＧＬＡと同じである）、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ（３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ）（ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、および３Ｄ（６Ａ）ＰＨＡＤは合成リピドＡバリアントである；例えば、これらの分子の構造も提供する、avantilipids.com/divisions/adjuvantsを参照）、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０－６３－６）、ＯＮＯ４００７、ならびにＯＭ－１７４などが挙げられる。３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ／ＰＨＡＤ、Ｅ６０２０、ＯＮＯ４００７、およびＯＭ－１７４の例示的な化学構造について、例えば、Ireton GC and SG Reed, 2013、上掲の表１を参照。ＳＬＡの構造について、例えば、Reed SG et al, 2016, Curr. Opin. Immunol. 41:85-90のFig 1を参照。ある特定の好ましい実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントは、３Ｄ－ＭＰＬ、ＧＬＡ、またはＳＬＡから選択されるリピドＡアナログまたは誘導体を含む。ある特定の実施形態では、リピドＡアナログまたは誘導体は、リポソーム中に製剤化される。

【0180】

リピドＡアナログまたは誘導体を含む例示的なアジュバントとしては、ＧＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、ＱＳ２１、リポソームとして製剤化される脂質）、ＳＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、ＱＳ２１、脂質、リポソームとして製剤化）、ＧＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、スクアレン油／水エマルション）、ＳＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、スクアレン油／水エマルション）、ＳＬＡ－Ｎａｎｏａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－Ｎａｎｏａｌｕｍ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ＳＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、水性懸濁液）、ＧＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、水性懸濁液，）、ＳＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ならびにＡＳ０１（ＭＰＬ、ＱＳ２１、リポソーム）、ＡＳ０２（ＭＰＬ、ＱＳ２１、油／水エマルション）、ＡＳ２５（ＭＰＬ、油／水エマルション）、ＡＳ０４（ＭＰＬ、アルミニウム塩）、およびＡＳ１５（ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧ、リポソーム）を含めて、いくつかのＧＳＫ ＡＳｘｘシリーズのアジュバントが挙げられる。例えば、国際公開第２００８／１５３５４１号パンフレット；国際公開第２０１０／１４１８６１号パンフレット；国際公開第２０１３／１１９８５６号パンフレット；国際公開第２０１９／０５１１４９号パンフレット；国際公開第２０１３／１１９８５６号パンフレット；国際公開第２００６／１１６４２３号パンフレット；米国特許第４，９８７，２３７号明細書；米国特許第４，４３６，７２７号明細書；米国特許第４，８７７，６１１号明細書；米国特許第４，８６６，０３４号明細書；米国特許第４，９１２，０９４号明細書；米国特許第４，９８７，２３７号明細書；米国特許第５，１９１，０７２号明細書；米国特許第５，５９３，９６９号明細書；米国特許第６，７５９，２４１号明細書；米国特許第９，０１７，６９８号明細書；米国特許第９，１４９，５２１号明細書；米国特許第９，１４９，５２２号明細書；米国特許第９，４１５，０９７号明細書；米国特許第９，４１５，１０１号明細書；米国特許第９，５０４，７４３号明細書；Reed G, et al., 2013、上掲、Johnson et al., 1999, J Med Chem, 42:4640-4649、およびUlrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524を参照。

【0181】

非糖脂質分子もまたＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして使用されてもよく、これは例えば合成分子、例えばＮｅｏｓｅｐｔｉｎ－３、または天然分子、例えばＬｅＩＦである。例えばReed SG et al, 2016、上掲を参照。

【0182】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を含む免疫原性組成物を製造する方法であって、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を薬学的に許容される担体と合わせて医薬組成物を得ることを含む方法に関する。

【0183】

免疫原性組成物の評価

【0184】

スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を含む免疫原性組成物が本明細書において提供される。

【0185】

本明細書に開示される免疫原性組成物の免疫原性を評価するために様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が使用される。例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）細胞、問題とする抗原に対する特異的な抗体を含有する熱不活性化された血清、および外因性補体供給源の混合物を一緒にインキュベートすることによりｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニンアッセイが実行される。オプソニン化貪食作用は、新たに単離された多形核細胞（ＰＭＮ）または分化したエフェクター細胞、例えばＨＬ６０および抗体／補体／スタフィロコッカス（staphylococcal）混合物のインキュベーションの間に進行する。抗体および補体でコートされた細菌細胞はオプソニン化貪食作用で殺傷される。オプソニン化貪食作用から回収された生存している細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）が、アッセイ混合物をプレーティングすることにより決定される。アッセイ対照に対する比較により決定される、５０％の細菌殺傷を与える最高希釈の逆数として力価が報告される。

【0186】

細胞全体ＥＬＩＳＡアッセイもまた、抗原のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原性および表面露出を評価するために使用され、該アッセイでは、関心対象の細菌株（Ｓ．アウレウス（S.aureus））をプレート、例えば９６ウェルプレートにコーティングし、免疫化動物からの試験血清を細菌細胞と反応させる。試験抗原に対して特異的な任意の抗体が、抗原の表面露出エピトープと反応性である場合、それは当業者に公知の標準的な方法により検出することができる。

【0187】

所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を実証した任意の抗原は次にｉｎ ｖｉｖｏ動物チャレンジモデルにおいて試験される。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、当業者に公知の免疫化の方法および経路（例えば、鼻腔内、非経口、経口、直腸、膣、経皮、腹腔内、静脈内、皮下など）により動物（例えば、マウス）の免疫化において使用される。スタフィロコッカス（staphylococcal）抗原を含む免疫原性組成物での免疫化後に、動物は、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種でチャレンジされ、スタフィロコッカス（staphylococcal）感染症に対する抵抗性をアッセイされる。

【0188】

スタフィロコッカス（staphylococcal）感染症の動物モデル

【0189】

いくつかのスタフィロコッカス（staphylococcal）チャレンジモデルが表１に列記される。

【0190】

【表1】

【0191】

マウス敗血症モデル（受動的または能動的）

【0192】

受動免疫化モデル：腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫ＩｇＧまたはモノクローナル抗体を用いてマウスを受動的に免疫化する。その後、マウスを２４時間後に致死用量のＳ．アウレウス（S.aureus）でチャレンジする。細菌チャレンジを静脈内（ｉ．ｖ．）またはｉ．ｐ．に投与して、任意の生存が細菌との抗体の特異的なｉｎ ｖｉｖｏ相互作用に帰せられ得ることを確実にする。非免疫化対照マウスの約２０％の致死性敗血症を達成するために要求される用量となるように細菌チャレンジ用量を決定する。生存研究の統計的評価をカプラン－マイヤー分析により実行することができる。

【0193】

能動免疫化モデル：このモデルにおいて、０、３、および６週時（または他の類似した適切な間隔のワクチン接種スケジュール）に腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）に標的抗原を用いてマウス（例えば、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス）を能動的に免疫化した後に、８週目に静脈内経路によりＳ．アウレウス（S.aureus）でチャレンジする。１０～１４日の期間にかけて対照群における約２０％の生存を達成するように細菌チャレンジ用量を軟正する。生存研究の統計的評価をカプラン－マイヤー分析により実行することができる。

【0194】

感染性心内膜炎モデル（受動的または能動的）

【0195】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）により引き起こされる感染性心内膜炎（ＩＥ）の受動免疫化モデルは、ＣｌｆＡは保護免疫を誘導できることを示すために以前に使用されている（Vernachio et al., Antimicro. Agents & Chemo 50:511-8 (2006)）。このモデルにおいて、ウサギまたはラットを使用して、中心静脈カテーテル、菌血症、および遠位臓器への血行性播種を含む臨床的な感染症がシミュレートされる。無菌大動脈弁疣腫を有するカテーテル処理したウサギまたはラットに、標的抗原に特異的なモノクローナルポリクローナル抗体の単回または複数回静脈注射を投与する。その後に、ｉ．ｖ．でＳ．アウレウス（S.aureus）またはＳ．エピデルミディス（S. epidermidis）株を用いて動物をチャレンジする。チャレンジ後に、心臓、心臓疣腫、および追加の組織（例えば、腎臓）、および血液を採取し、培養する。心臓組織、腎臓、および血液におけるスタフィロコッカス（staphylococcal）感染の頻度を次に測定する。

【0196】

感染性心内膜炎モデルはまた、ウサギおよびラットの両方における能動免疫化研究のために適合されている。筋肉内または皮下に標的抗原を用いてウサギまたはラットを免疫化し、２週後に静脈内経路を介してＳ．アウレウス（S.aureus）でチャレンジする。

【0197】

腎盂腎炎モデル

【0198】

腎盂腎炎モデルにおいて、０、３、および６週目（または他の適切な間隔の免疫化スケジュール）に標的抗原でマウスを免疫化する。その後に、ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．でＳ．アウレウス（S.aureus）ＰＦＥＳＡ０２６６を用いて動物をチャレンジする。４８時間後に、腎臓を採取し、細菌ＣＦＵをカウントする。

【0199】

腎膿瘍モデル

【0200】

マウスを免疫化（能動的、用量間に２週で３回；受動的、感染の２４時間前、ｉ．ｐ．）し、次にＳ．アウレウス（S.aureus）を全身的に感染させる（ｉ．ｖ．またはｒ．ｏ．（後眼窩））。感染の４～７日後にマウスを安楽死させ、半定性的スコアリングシステムを使用して腎臓をスコア付けして、腎損傷（変色）のおおよそのパーセンテージに加えて病変の数を評価する。腎臓を次に細菌負荷について評価する。

【0201】

外科的創傷感染症モデル

【0202】

マウスを免疫化（能動的、用量間に２週で３回；受動的、感染の２４時間前、ｉ．ｐ．）する。ワクチンの最後の用量の２週後に動物を麻酔し、大腿を剃毛し、消毒する。皮膚および筋肉層（大腿骨の深さまで）に切開を作る。５ｕｌのＳ．アウレウス（S.aureus）をピペットで創傷に移し、次に筋肉を４－０シルク縫合糸で閉じ、皮膚をオートクリップで閉じる。３日後に、マウスを安楽死させ、手術部位の筋肉を除去し、細菌負荷について計数する。

【0203】

ミニブタ深部外科的創傷感染症モデル

【0204】

ブタは、ヒト臨床細菌性疾患におけるワクチンについての優れたトランスレーショナルモデルであると考えられる（Gerdts et al., ILAR Journal 56 (1): 53-62 (2015)）。ブタは、嚢胞性線維症（Meyerholz, Theriogenology 86 (1):427-432 (2016)）、性感染疾患（Kaser et al., Infection, Genetics and Evolution (2017)）、百日咳（Elahi et al., Trends in Microbiology 15 (10) (2007)）、骨髄炎（Jensen et al., In Vivo 29: 555-560 (2015), Elvang et al., In Vivo 24: 257-264 (2010)）、および皮膚感染症（Klein et al., Biofouling 34 (2): 226-236 (2018)）を研究するために使用されている。ブタ免疫系は、マウスの＜１０％と比較して＞８０％ヒトに類似している（Dawson et al., BMC Genomics 14:332 (2013)）。高いパーセンテージの循環性好中球、類似したｔｏｌｌ様受容体および樹状細胞は、ブタおよびヒトの両方が共通で有する免疫系属性の一部である（Meurens et al., Trends in Microbiology 20 (1): 50-57 (2012)）。追加的に、ブタは、ヒト臓器系、すなわち、皮膚および皮膚構造と類似性を共有する（Summerfield et al., Mol Immunol 66: 1-21 (2015)）。これらの類似性によりブタは、スタフィロコッカス（staphylococcal）疾患の研究およびヒトへのトランスレーションのための優れたモデルとなる。

【0205】

使用方法

【0206】

別の一般的な態様では、本発明は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法に関する。方法は、それを必要とする対象に本発明の免疫原性組成物を投与することを含む。

【0207】

別の一般的な態様では、本発明は、それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症を治療または予防する方法に関する。方法は、それを必要とする対象に本発明の免疫原性組成物を投与することを含む。

【0208】

本発明の実施形態によれば、免疫原性組成物は、治療有効量のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）を含む。本明細書において使用される場合、「治療有効量」という用語は、対象において所望の生物学的または医学的応答を誘発する、活性成分（ingredient）または成分（component）の量を指す。治療有効量は、記載される目的に関して、経験的におよびルーチンの方式で決定することができる。

【0209】

本明細書において使用される場合、「治療または予防免疫を必要とする対象」は、指定される時間的期間にかけてスタフィロコッカス（Staphylococcus）関連症状を治療すること、すなわち、予防し、治癒し、減速させ、またはその重症度を低減させることが望まれる対象を指す。本明細書において使用される場合、「免疫応答を必要とする対象」は、任意のＬｕｋＡＢおよび／またはＳｐＡ発現スタフィロコッカス（Staphylococcus）株に対する免疫応答が所望される対象を指す。

【0210】

スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）に関して本明細書において使用される場合、治療有効量は、それを必要とする対象において免疫応答をモジュレートする、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドならびに突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド（例えば、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡポリペプチド、スタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＢポリペプチド、および／またはスタフィロコッカス（staphylococcal）ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド）の量を意味する。

【0211】

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。

【0212】

特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１、２、３、４、またはより多くを達成するために十分な、療法の量を指す：（ｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態もしくはそれと関連付けられる症状の重症度を低減もしくは軽快させること；（ｉｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状の持続期間を低減させること；（ｉｉｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状の進行を予防すること；（ｉｖ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状の退縮を引き起こすこと；（ｖ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状の発生もしくは開始を予防すること；（ｖｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状の再発を予防すること；（ｖｉｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状を有する対象の入院を低減させること；（ｖｉｉｉ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状を有する対象の入院の長さを低減させること；（ｉｘ）治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状を有する対象の生存を増加させること；（ｘｉ）対象において治療されるべき疾患、障害もしくは状態、もしくはそれと関連付けられる症状を阻害しもしくは低減させること；ならびに／または（ｘｉｉ）別の療法の予防もしくは治療効果を増強しもしくは向上させること。

【0213】

治療有効量または投薬量は、様々な要因、例えば治療されるべき疾患、障害または状態、投与の手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるのか、それとも動物であるのか、投与される他の医薬品、および処置が予防的であるのか、それとも治療的であるのかに従って変動することができる。治療投薬量は、安全性および有効性を最適化するために最適に滴定される。

【0214】

特定の実施形態によれば、本明細書に記載の組成物は、対象への投与の意図される経路のために好適となるように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与のために好適となるように製剤化することができる。

【0215】

本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語はすべて、スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症に関する少なくとも１つの測定可能な身体パラメーターの軽快または好転を指すことが意図され、これは対象において必ずしも認識可能でないが、対象において認識可能なものであることができる。「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語はまた、疾患、障害、または状態の退縮を引き起こすこと、その進行を予防すること、またはその進行を少なくとも減速させることを指すことができる。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態と関連付けられる１つまたは複数の症状、例えば発熱、悪寒、水疱、せつ、発疹、皮膚潮紅、および膿瘍の軽減、発生もしくは開始の予防、またはその持続期間における低減を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態の再発の予防を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾患、障害、または状態を有する対象の生存における増加を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、対象における疾患、障害、または状態の排除を指す。

【0216】

特定の実施形態によれば、それを必要とする対象におけるスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症の治療および／または予防において使用される組成物が提供される。スタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症の治療および／または予防のために、組成物は、少なくとも１つの抗生物質が挙げられるがこれに限定されない別の治療と組み合わせて使用することができる。少なくとも１つの抗生物質は、例えば、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。

【0217】

本明細書において使用される場合、対象への２つまたはそれより多くの療法の投与の文脈における「組合せで」（組み合わせて）という用語は、１つより多くの療法の使用を指す。「組合せで」（組み合わせて）という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の療法（例えば、本明細書に記載の組成物）は、対象への第２の療法の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、もしくは１２週前）、それと随伴的、またはその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、もしくは１２週後）に投与することができる。

【0218】

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態もまた提供する。

【0219】

実施形態１：
（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含むＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに
（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、
（ｉ）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、
（ｉｉ）突然変異体ＬｕｋＢポリペプチド、および／または
（ｉｉｉ）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し、
その結果、真核細胞の表面にポアを形成する前記突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて前記突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、
突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド
を含む免疫原性組成物。

【0220】

実施形態２：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、Ｆｃ結合を妨害する少なくとも１つのアミノ酸置換およびＶ_Ｈ３結合を妨害する少なくとも第２のアミノ酸置換を有する、実施形態１の免疫原性組成物。

【0221】

実施形態３：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｄドメインを含み、かつ配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１または２の免疫原性組成物。

【0222】

実施形態４：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸９位または１０位において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、実施形態３の免疫原性組成物。

【0223】

実施形態５：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインをさらに含む、実施形態３または４の免疫原性組成物。

【0224】

実施形態６：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインを含み、かつ配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態５の免疫原性組成物。

【0225】

実施形態７：各ＳｐＡ Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインが、配列番号５８のアミノ酸９位および１０位に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、実施形態５または６の免疫原性組成物。

【0226】

実施形態８：前記アミノ酸置換が、グルタミン残基についてのリシン残基である、実施形態４～７のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0227】

実施形態９：各ＳｐＡ Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインが、配列番号５８のアミノ酸３６位および３７位に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を有する、実施形態５～８のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0228】

実施形態１０：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号７２、配列番号７７、配列番号８２、または配列番号８８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１の免疫原性組成物。

【0229】

実施形態１１：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含み、かつ前記少なくとも１つのドメインが、（ｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の９位および１０位に対応するグルタミン残基についてのリシン置換ならびに（ｉｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の３３位に対応するグルタミン酸置換を有する、実施形態１～４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0230】

実施形態１２：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋することも好塩基球を活性化させることもない、実施形態１１の免疫原性組成物。

【0231】

実施形態１３：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の９位および１０位に対応する各ＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメイン中のグルタミン残基についてのリシン置換ならびに前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応する各ＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメイン中のアスパラギン酸残基についてのアラニン置換を含むＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対する低減されたＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１１または１２の免疫原性組成物。

【0232】

実施形態１４：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１～１３のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0233】

実施形態１５：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１～１４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0234】

実施形態１６：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン中のアミノ酸３６位および３７位に対応する前記ＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインのいずれかにおける置換を有しない、実施形態１～１５のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0235】

実施形態１７：前記ＳｐＡバリアントポリペプチド中の置換が（ｉ）および（ｉｉ）のみである、実施形態１１～１６のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0236】

実施形態１８：
（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、
前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインを含み、かつ前記ドメインが、（ｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の９位および１０位に対応する前記少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメイン中のグルタミン残基についてのリシン置換および（ｉｉ）前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の３３位に対応する前記少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメイン中のスレオニン置換を有し、前記ポリペプチドが、陰性対照と比べて、検出可能に血液中のＩｇＧおよびＩｇＥを架橋することも好塩基球を活性化させることもない、
ＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに
（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、
（１）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、
（２）突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、および／または
（３）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド
を含み、（１）、（２）、および／または（３）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し、
その結果、真核細胞の表面にポアを形成する前記突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて前記突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、
突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド
を含む免疫原性組成物。

【0237】

実施形態１９：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）中の９位および１０位に対応する各ＳｐＡ Ａ～Ｅドメイン中のグルタミン残基についてのリシン置換ならびに前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応する各ＳｐＡ～Ｅドメイン中のアスパラギン酸残基についてのアラニン置換を含むＳｐＡバリアントポリペプチド（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ）と比較して、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対する低減されたＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１８の免疫原性組成物。

【0238】

実施形態２０：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比較して２分の１以下に低減された、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１８または１９の免疫原性組成物。

【0239】

実施形態２１：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、１×１０^５Ｍ^－１よりも低い、ヒトＩｇＧからのＶ_Ｈ３に対するＫ_Ａ結合親和性を有する、実施形態１８～２０のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0240】

実施形態２２：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、前記ＳｐＡ Ｄドメイン中のアミノ酸３６位および３７位に対応する前記ＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥドメインのいずれかにおける置換を有しない、実施形態１８～２１のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0241】

実施形態２３：前記ＳｐＡバリアントポリペプチド中の置換が（ｉ）および（ｉｉ）のみである、実施形態１８～２２のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0242】

実施形態２４：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが配列番号６６または配列番号７１を含む、実施形態１～５または１８～２２のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0243】

実施形態２５：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが配列番号６６を含む、実施形態１～５または１８～２２のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0244】

実施形態２６：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが配列番号６０を含む、実施形態１～５または１８～２２のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0245】

実施形態２７：配列番号６１を含む、実施形態１８～２３のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0246】

実施形態２８：
（ａ）スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドであって、
前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、少なくとも１つのＳｐＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含み、かつ前記ドメインが、（ｉ）ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の９位および１０位に対応するグルタミン残基についてのリシン置換、および（ｉｉ）ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の２９位および／または３３位に対応する少なくとも１つの他のアミノ酸置換を有し、前記ＳｐＡバリアントが、１．０×１０^－４Ｍよりも高い、ヒトＩｇＧからのＶＨ３に対するＫ_Ｄ結合親和性、および／または１．０×１０^－６Ｍよりも高い、ヒトＩｇＥからのＶＨ３に対するＫ_Ｄ結合親和性を有する、
ＳｐＡバリアントポリペプチド；ならびに
（ｂ）突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、
（１）突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、
（２）突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、および／または
（３）突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチド
を含み、（１）、（２）、および／または（３）が、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、またはこれらの組合せを有し、
その結果、真核細胞の表面にポアを形成する前記突然変異体ＬｕｋＡ、ＬｕｋＢ、および／またはＬｕｋＡＢポリペプチドの能力が妨害され、それにより、対応する野生型ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたはＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドと比べて前記突然変異体ＬｕｋＡおよび／もしくはＬｕｋＢポリペプチドまたは前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドの毒性が低減されている、
突然変異体スタフィロコッカス（staphylococcal）ロイコシジンサブユニットポリペプチド
を含む免疫原性組成物。

【0247】

実施形態２９：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の２９位に対応するアミノ酸置換を含む、実施形態２８の免疫原性組成物。

【0248】

実施形態３０：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３３位に対応するアミノ酸置換を含む、実施形態２８の免疫原性組成物。

【0249】

実施形態３１：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の２９位および３３位に対応するアミノ酸置換を含む、実施形態２９の免疫原性組成物。

【0250】

実施形態３２：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位の１つまたは両方に対応するアミノ酸置換を含む、実施形態２８～３１のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0251】

実施形態３３：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥの各々における前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位の両方に対応するアミノ酸置換を含む、実施形態３２の免疫原性組成物。

【0252】

実施形態３４：前記ＳｐＡ Ｄドメイン（配列番号５８）の３６位および３７位に対応する前記アミノ酸置換が、アスパラギン酸残基についてのアラニン残基である、実施形態３２または３３の免疫原性組成物。

【0253】

実施形態３５：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一のバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態２８～３４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0254】

実施形態３６：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一のバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３５の免疫原性組成物。

【0255】

実施形態３７：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３６の免疫原性組成物。

【0256】

実施形態３８：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、９位、１０位、２９位、３３位、３６位、および／または３７位に対応するものを除いて、配列番号５８においていかなるアミノ酸置換も含まないバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３７の免疫原性組成物。

【0257】

実施形態３９：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、および２９位に対応するアミノ酸置換置のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0258】

実施形態４０：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、および３３位に対応するアミノ酸置換のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0259】

実施形態４１：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、２９位、および３３位に対応するアミノ酸置換のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0260】

実施形態４２：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、２９位、３６位、および３７位に対応するアミノ酸置換のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0261】

実施形態４３：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、３３位、３６位、および３７位に対応するアミノ酸置換のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0262】

実施形態４４：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、配列番号５８の９位、１０位、２９位、３３位、３６位、および３７位に対応するアミノ酸置換のみからなるバリアントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥドメインを含む、実施形態３８の免疫原性組成物。

【0263】

実施形態４５：配列番号５８の２９位に対応するアミノ酸の前記置換が、アラニン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン、セリン、スレオニン、またはグルタミンである、実施形態２９～４４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0264】

実施形態４６：配列番号５８の２９位に対応するアミノ酸の前記置換が、アラニン、フェニルアラニン、またはアルギニンである、実施形態４５の免疫原性組成物。

【0265】

実施形態４７：配列番号５８の３３位に対応するアミノ酸の前記置換が、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、リシン、またはグルタミンである、実施形態３０～４４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0266】

実施形態４８：配列番号５８の３３位に対応するアミノ酸の前記置換が、フェニルアラニン、グルタミン酸、またはグルタミンである、実施形態２９～４４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0267】

実施形態４９：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが、１．０×１０^－２Ｍよりも高い、ＶＨ３に対するＫ_Ｄ結合親和性を有する、実施形態２８～４８のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0268】

実施形態５０：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが配列番号６０または配列番号６１のアミノ酸配列を含む、実施形態４９の免疫原性組成物。

【0269】

実施形態５１：前記ＳｐＡバリアントポリペプチドが配列番号７２～８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１、１８、または２８の免疫原性組成物。

【0270】

実施形態５２：前記突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～５１のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0271】

実施形態５３：前記突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドが、配列番号１～１４のいずれか１つのアミノ酸３４２～３５１位に対応するアミノ酸残基および配列番号１５～２８のいずれか１つのアミノ酸３１５～３２４位におけるアミノ酸残基の欠失を含む、実施形態５２の免疫原性組成物。

【0272】

実施形態５４：前記突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドが、配列番号２９～５３のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～５３のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0273】

実施形態５５：前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、配列番号１～２８のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド；および配列番号２９～５３のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドを含む、実施形態１～５４のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0274】

実施形態５６：前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、配列番号１６の３１５～３２４位に対応するアミノ酸残基の欠失を有するＬｕｋＡポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド；および配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドを含む、実施形態１～５５のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0275】

実施形態５７：前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、配列番号１６の３１５～３２４位に対応するアミノ酸残基の欠失を有する突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド；および配列番号５３のアミノ酸配列を含む突然変異体ＬｕｋＢポリペプチドを含む、実施形態１～５６のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0276】

実施形態５８：前記突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドが、配列番号１５に対応するＤ３９Ａアミノ酸置換を有する突然変異体ＬｕｋＡポリペプチドおよび配列番号４２に対応するＲ２３Ｅアミノ酸置換を有するＬｕｋＢポリペプチドを含む、実施形態１～５７のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0277】

実施形態５９：アジュバントをさらに含む、実施形態１～５８のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0278】

実施形態６０：前記アジュバントがサポニンを含む、実施形態５９の免疫原性組成物。

【0279】

実施形態６１：前記サポニンがＱＳ２１である、実施形態６０の免疫原性組成物。

【0280】

実施形態６２：前記アジュバントがＴＬＲ４アゴニストを含む、実施形態６１の免疫原性組成物。

【0281】

実施形態６３：前記ＴＬＲ４アゴニストが、リピドＡまたはそのアナログもしくは誘導体である、実施形態６２の免疫原性組成物。

【0282】

実施形態６４：前記ＴＬＲ４アゴニストが、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＧＬＡ、ＳＬＡ、Ｅ６０２０、ＰＥＴ－リピドＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ、ＯＮＯ４００７、またはＯＭ－１７４を含む、実施形態６３の免疫原性組成物。

【0283】

実施形態６５：前記ＴＬＲ４アゴニストがＧＬＡを含む、実施形態６２の免疫原性組成物。

【0284】

実施形態６６：前記アジュバントが、ＭＰＬ、ＱＳ２１、およびリポソームを含む、実施形態５９の免疫原性組成物。

【0285】

実施形態６７：前記アジュバントが、水中油エマルション、例えばＭＦ５９またはＡＳ０３中に製剤化されている、実施形態５９または６２の免疫原性組成物。

【0286】

実施形態６８：前記アジュバントが、スクアレンを含む水中油エマルション中に製剤化されている、実施形態５９、６２、または６５の免疫原性組成物。

【0287】

実施形態６９：前記アジュバントがＱＳ２１およびリポソームをさらに含む、実施形態６５の免疫原性組成物。

【0288】

実施形態７０：前記アジュバントがＧＬＡ－ＳＥを含む、実施形態５９の免疫原性組成物。

【0289】

実施形態７１：前記アジュバントがＧＬＡ－ＳＬＱを含む、実施形態５９の免疫原性組成物。

【0290】

実施形態７２：ＣＰ５、ＣＰ８、Ｅａｐ、Ｅｂｈ、Ｅｍｐ、ＥｓａＢ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＡＢ（融合物）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、Ｃｏａ、Ｈｌａ、ｍＨｌａ、ＭｎｔＣ、ｒＴＳＳＴ－１、ｒＴＳＳＴ－１ｖ、ＴＳＳＴ－１、ＳａｓＦ、ｖＷｂｐ、ｖＷｈビトロネクチン結合性タンパク質、Ａａａ、Ａａｐ、Ａｎｔ、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、自己溶菌酵素アミダーゼ、Ｃａｎ、コラーゲン結合性タンパク質、Ｃｓａ１Ａ、ＥＦＢ、エラスチン結合性タンパク質、ＥＰＢ、ＦｂｐＡ、フィブリノーゲン結合性タンパク質、フィブロネクチン結合性タンパク質、ＦｈｕＤ、ＦｈｕＤ２、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＧｅｈＤ、ＨａｒＡ、ＨＢＰ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ラミニン受容体、リパーゼＧｅｈＤ、ＭＡＰ、Ｍｇ２＋トランスポーター、ＭＨＣ ＩＩアナログ、ＭＲＰＩＩ、ＮＰａｓｅ、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＥＡ外毒素、ＳＥＢ外毒素、ｍＳＥＢ、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合性タンパク質、ＳｓａＡ、ＳＳＰ－１、ＳＳＰ－２、Ｓｐａ５、ＳｐＡＫＫＡＡ、ＳｐＡｋＲ、Ｓｔａ００６、Ｓｔａ０１１、ＰＶＬ、ＬｕｋＥＤおよびＨｌｇからなる群から選択される少なくとも１つのスタフィロコッカス（staphylococcal）抗原またはその免疫原性断片をさらに含む、実施形態１～７１のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0291】

実施形態７３：Ｈｌａ、スタフィロコッカス（staphylococcal）抗原をさらに含む、実施形態１～７２のいずれか１つの免疫原性組成物。

【0292】

実施形態７４：実施形態１～７３のいずれか１つのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）プロテインＡ（ＳｐＡ）バリアントポリペプチドおよび突然変異体Ｌｕｋ Ａポリペプチド、突然変異体Ｌｕｋ Ｂポリペプチド、または突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の単離された核酸。

【0293】

実施形態７５：実施形態７４の単離された核酸を含むベクター。

【0294】

実施形態７６：実施形態７５のベクターを含む、単離された宿主細胞。

【0295】

実施形態７７：それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）感染症を治療または予防する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の実施形態１～７３のいずれか１つの免疫原性組成物、実施形態７４の１つもしくは複数の単離された核酸、実施形態７５のベクター、または実施形態７６の宿主細胞を投与することを含む方法。

【0296】

実施形態７８：それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の実施形態１～７３のいずれか１つの免疫原性組成物、実施形態７４の１つもしくは複数の単離された核酸、実施形態７５のベクター、または実施形態７６の宿主細胞を投与することを含む方法。

【0297】

実施形態７９：それを必要とする対象においてスタフィロコッカス（Staphylococcus）細菌を脱定着させまたはその定着もしくは再定着を予防する方法であって、前記それを必要とする対象に有効量の実施形態１～７３のいずれか１つの免疫原性組成物、実施形態７４の１つもしくは複数の単離された核酸、実施形態７５のベクター、または実施形態７６の宿主細胞を投与することを含む方法。

【実施例】

【0298】

[実施例１]
スタフィロコッカスプロテインＡはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）を有するマウスの持続的定着に寄与する
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は人口の約３分の１の上咽頭に持続的に定着し、それによって市中感染および院内感染を促進する。抗生物質は、感染のリスクが増大する個人の脱定着用に現在使用されている。しかし、抗生物質の有効性は再定着および薬物耐性株の選択により制限される。鼻腔定着するとスタフィロコッカス表面抗原に対してＩｇＧ応答の引き金を引くが、これらの抗体はそれに続く定着または疾患を予防できない。本実施例は、マウスの上咽頭に持続的に定着する多座配列タイプＳＴ８８単離菌であるＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を記載する。スタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）は上咽頭においてＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の持続性に必要であることがここで報告されている。野生型Ｓ．アウレウス（S.aureus）が定着した動物と比べると、Δｓｐａバリアントが定着したマウスはスタフィロコッカス定着決定因子に対して増加したＩｇＧ応答を開始する。Ｂ細胞受容体に架橋し抗体応答を転換させることができない非毒素産生性ＳｐＡバリアントを有するマウスの免疫化は、定着するＳ．アウレウス（S.aureus）に対してＩｇＧ応答を促進し病原体持続性を減らすプロテインＡ中和抗体を誘発する。

【0299】

結果
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ＷＵ１。
オスＣ５７ＢＬ／６マウスの包皮腺感染症の突発が動物育種コロニーで観察された。オスおよびメスＣ７５ＢＬ／６Ｊマウスの包皮腺腺炎（ＰＧＡ）からおよび上咽頭から試料を収集し、マンニット食塩寒天培地（ＭＳＡ）およびベアードパーカー寒天培地（ＢＰＡ）上での増殖により分析した。多座配列タイピングおよびｓｐａジェノタイピングにより、動物にはＳ．アウレウス（S.aureus）ＳＴ８８ｓｐａジェノタイプｔ１８６が定着していることが明らかにされ、この細菌はオスマウスにおいてＰＧＡの原因でもあった。ｓｐａジェノタイプｔ１８６を有するＳ．アウレウス（S.aureus）ＣＣ８８は合衆国で実験マウス由来の安定的に定着する単離菌として以前報告されていた（３７）。他のｓｐａジェノタイプは、ｔ３２５、ｔ４４８、ｔ６９０、ｔ７５５、ｔ７８６、ｔ２０８５、ｔ２８１５、ｔ５５６２、ｔ１１２８５およびｔ１２３４１を含む（３７）。ニュージーランドＪＳＮＺ単離菌ははっきりと異なるｓｐａジェノタイプｔ７２９を有する（３７）。にもかかわらず、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺとＷＵ１の両方が８型莢膜多糖体遺伝子を共有し、ｍｅｃＡ遺伝子ならびに可動遺伝要素（ＭＧＥ）コードＴ細胞スーパー抗原を欠く（３７）。さらに、ヒト特異的免疫回避クラスター１（ＩＥＣ１）遺伝子ｓａｋ（スタフィロキナーゼ）、ｃｈｐ（ＣＨＩＰＳ、Ｓ．アウレウス（S.aureus）の走化性阻害タンパク質）およびｓｃｎ（ＳＣＩＮ－Ａ、スタフィロコッカス補体抑制因子Ａ）を発現するｈｌｂ変換ファージはＷＵ１のゲノムには存在せず、無傷のα溶血素コード遺伝子（ｈｌｂ）をもたらす（３８）。注目すべきことに、ＷＵ１コードＩＥＣ２は、ｓｃｎホモログｓｃｂ／ｓｃｃ（ＳＣＩＮ－Ｂ／－Ｃ）をｈｌａ（αヘモリシン）およびｓｓｌ１２－１４（スタフィロコッカススーパー抗原様１２－１４）と共に有する（３９）。マウスに安定的に定着する他のＣＣ８８単離菌（３７）と違って、ＷＵ１のゲノムはｂｌａＺ遺伝子を有する。ソルターゼアンカー表面タンパク質をコードする遺伝子について分析すると、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１がＣｌｆＢ、ＩｓｄＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、およびＳａｓＧを含む鼻腔定着に以前関連していた決定因子の遺伝子を有することが観察された（表２）。

【0300】

【表2】

【0301】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）膿瘍形成は、フィブリンを有する細菌凝集の決定因子と関連していた（４０、４１）。凝集は、宿主プロトロンビンを活性化してフィブリノーゲンをフィブリンに変換する２種のＳ．アウレウス（S.aureus）分泌産物：コアグラーゼ（Ｃｏａ）およびフォンウィルブランド因子結合タンパク質（ｖＷｂｐ）を必要とする（４０）。クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）はフィブリノーゲンに結合して、スタフィロコッカスをコアグラーゼ産生フィブリン原線維で被覆し、それによって宿主貪食細胞によるＳ．アウレウス（S.aureus）取込みおよび殺傷を妨害する（４１、４２）。ｃｌｆＡ遺伝子はＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１およびＪＳＮＺでは同一であるが、マウスを用いた研究所チャレンジ実験用にルーチンで使用されるＣＣ８ヒト臨床単離菌である、Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ由来のｃｌｆＡとは対立遺伝子特異的違いを示している（表２）（４３）。しかし、ｃｌｆＡでの観察される違いはクレード特異的である。なぜならば、その違いはヒト宿主からまたはマウス宿主から単離されたＣＣ８８株で見い出せるからである（データは示さず）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１、ＪＳＮＺおよびＮｅｗｍａｎのｃｏａ遺伝子産物は実質的に同一である（表２）。これとは対照的に、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１およびＪＳＮＺのｖｗｂ遺伝子の産物は、プロトロンビン結合Ｄ１およびＤ２ドメインに最大の配列多様性を有するＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎとは有意に異なり（図１Ａ）、Ｎｅｗｍａｎ ｖＷｂｐに対して産生されたポリクローナル抗体によって認識されなかった（図１Ｂ）。２種のＣＣ８８株から分泌されたｖＷｂｐを、ＵＳＡ３００株由来のｖＷｂｐの保存されたＣ末端ドメインに対して産生された血清は認識することができた（図１Ｃ）。大量のＣｏａを分泌しヒトおよびマウス血漿を急速に凝集させるＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎとは対照的に、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１およびＪＳＮＺが分泌するＣｏａは少なく、Ｎｅｗｍａｎ株と比べてヒト血漿よりもマウス血漿のほうを容易に凝集させる（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎのコアグラーゼ活性はｃｏａおよびｖｗｂ発現に依存している。なぜならば、対応するΔｃｏａ、ΔｖｗｂおよびΔｃｏａΔｖｗｂ突然変異体はマウスおよびヒト血漿では凝集欠損を示したからである（図１Ｄ、１Ｅ）。まとめると、これらのデータにより、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１およびＪＳＮＺでのｖｗｂ遺伝子のＳＴ８８対立遺伝子がマウス血漿中で効率的なプロトロンビン媒介凝固およびフィブリン凝集を促進することがあり、これがＰＧＡなどの侵襲性疾患の病因を支持する可能性があることが示唆される。

【0302】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１はマウスの上咽頭に持続的に定着する
Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１をマウスに定着するその能力について分析するため、メスＣ５７ＢＬ／６動物のコホート（ｎ＝１０）を、咽喉スワブおよび糞便材料をＢＰＡ上に広げることにより分析した。ＢＰＡ上での細菌増殖を欠く無処置マウスは麻酔をかけ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１×１０^８のＣＦＵ Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の１０μｌの懸濁液を右鼻腔中にピペットで移して接種した。動物は、１週間間隔で、すなわち、接種に続く７、１４、２１、２８、３５および４２日に中咽頭を綿棒で拭き取ることにより定着について分析した。スワブをＢＰＡ上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートし、数え上げた（図２Ａ）。前もっての抗生物質処理または抗生物質選択なしでさえ、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１は実験動物に定着し、負荷は４２日間にわたりスワブ当たり１．２～２．９ ｌｏｇ_１０ＣＦＵの範囲であった（図２Ａ）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１での持続的定着を確認するため、４２日後に得られたコロニーはＭＬＳＴおよびｓｐａジェノタイピングにより分析した。データによれば、マウスはまだＳＴ８８ ｓｐａ ｔ１８６が定着していることが示されており、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１がＣ５７ＢＬ／６マウスの上咽頭に持続的に定着することを示していた。対照として、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着動物と同じ動物施設室および同じケージ棚で維持された別々のケージ中のＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物のコホートのモックＰＢＳ接種では上咽頭のスタフィロコッカス定着はもたらされなかった（図２Ａ）。マウス由来の４２日糞便試料はＰＢＳにホモジナイズし、ＣＦＵ数え上げのためにマンニット食塩寒天培地（ＭＳＡ）上に蒔いた（図２Ｂ）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着マウスの糞便試料は５．１～７．３ ｌｏｇ_１０ ＣＦＵ／糞便ｇを有し、消化（ＧＩ）管もＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株が定着していることを示していた。対照として、モック（ＰＢＳ）接種マウスはその糞便試料中にＳ．アウレウス（S.aureus）を有していなかった（図２Ｂ）。

【0303】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着はマウスでの血清ＩｇＧ応答の引き金を引く。以前の研究ではＳ．アウレウス（S.aureus）抗原マトリックスを生み出し、このマトリックスは２５種の保存され分泌されたタンパク質を含む。２５種の組換え親和性タグ付きタンパク質のそれぞれが精製され膜フィルター上に固定された（４４）。定着中の宿主免疫応答を測定するため、無処置またはＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着動物は接種１５日後に出血させ、血清ＩｇＧ応答をＳ．アウレウス（S.aureus）抗原マトリックスと一緒のインキュベーションにより分析した。ＩｇＧ結合は、ＩＲＤｙｅ ６８０コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて検出し、赤外イメージングにより定量化した。この実験は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着により、ソルターゼアンカー表面タンパク質ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＩｓｄＡ、およびＩｓｄＢに対してならびにＳ．アウレウス（S.aureus）の細胞サイズおよびペプチドグリカン合成決定因子である巨大細胞外マトリックス結合タンパク質（Ｅｂｈ）に対する血清ＩｇＧが増加することを実証した（４５）（表３）。

【0304】

【表3】

【0305】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１は持続的定着にはスタフィロコッカスプロテインＡを必要とする。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ ＳｐＡに類似して、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１のｓｐａ遺伝子産物は５つのＩｇＢＤを含み、２７８残基ドメイン内に単一のアミノ酸置換を有する。免疫ブロッティング実験により、Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ株およびＷＵ１株が類似する量のＳｐＡを産生することが明らかになった（図３Ａ）。対立遺伝子組み換えを使用して、発明者らは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１のΔｓｐａ突然変異体を生み出した。免疫ブロッティングにより測定した場合、ＳｐＡ産生はΔｓｐａ突然変異体では消失し、この欠損は野生型ｓｐａのプラスミドによる発現（ｐＳｐＡ）により回復された（図３Ａ）。ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）に対する抗体を用いた免疫ブロッティングは負荷対照として使用された（図３Ａ）。マウスの右鼻腔中に接種させ、７日目に中咽頭スワブにより定着について分析すると、Δｓｐａ突然変異体は最初は野生型ＷＵ１株に類似する方法でＣ５７ＢＬ／６Ｊ動物に定着した（図３Ｂ）。しかし、後の時点では、特に３５日目および４２日目、Δｓｐａ突然変異体が定着した動物は野生型ＷＵ１株よりも少なかった（図３Ｂ）。細菌増殖の間、Ｓ．アウレウス（S.aureus）はペプチドグリカン断片に連結したＳｐＡを周囲の環境に放出する（４６）。静脈内Ｓ．アウレウス（S.aureus）チャレンジのマウスモデルでは、放出されたＳｐＡがＢ細胞増殖ならびにＶＨ３イディオタイプＩｇＭおよびＩｇＧ分子の増強された分泌を活性化する（３３）。しかし、増えたＶＨ３イディオタイプＩｇＧはスタフィロコッカス抗原を認識しない（３３）。このＢ細胞スーパー抗原活性の分子基礎は、ＶＨ３イディオタイプＢ細胞受容体のＳｐＡ媒介架橋に基づいており、これによりＣＤ４ Ｔヘルパー細胞およびＲＩＰＫ２キナーゼ依存様式でＢ細胞増殖の引き金を引く（３３、４７）。Δｓｐａ突然変異体スタフィロコッカスが感染した動物はＶＨ３イディオタイプ免疫グロブリン増殖を欠き、病原体特異的ＩｇＧの量の増加を示し、それによって引き続いてのＳ．アウレウス（S.aureus）感染に対して保護的である免疫応答の引き金を引く（４８）。次に、ＷＵ１のΔｓｐａ突然変異体での定着は変化した血清ＩｇＧ応答と関連しているのかどうかと考えられた。１５日間定着していた動物由来の血清は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）抗原マトリックスの成分に結合するＩｇＧについて分析された（表３）。この実験により、引き続いて脱定着した動物ではＣｌｆＢ、ＩｓｄＡおよびＳａｓＧに対する抗体の増加が明らかになったが、Δｓｐａ突然変異体が定着したままの動物では増加は明らかにならなかった（表３）。まとめると、これらのデータは、Δｓｐａ突然変異体スタフィロコッカスを用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの上咽頭定着が、キーとなる定着決定因子に対するＩｇＧ応答の増加と関連していることを示唆しており、この増加は上咽頭からのΔｓｐａ突然変異体Ｓ．アウレウス（S.aureus）の除去を促進すると思われる。

【0306】

プロテインA中和抗体はＳ．アウレウス（S.aureus）の持続的定着に影響を及ぼす。
野生型プロテインＡでマウスを免疫化しても、その５種のＩｇＢＤに結合しＩｇＧ分子のＦｃγドメインまたはＶＨ３イディオタイプ免疫グロブリンの可変重鎖に結合するその５種のＩｇＢＤの能力を中和するＩｇＧ血清抗体を誘発しない（４４）。ＳｐＡ_ＫＫＡＡは、Ｆｃγ結合を消失させＶＨ３イディオタイプ免疫グロブリンとの会合も減少させるＳｐＡの５種のＩｇＢＤ全体を通じて２０のアミノ酸置換を有するバリアントである（４４）。にもかかわらず、ＳｐＡ_ＫＫＡＡは、プロテインＡの全αヘリックス含量および抗原構造を保持する。その結果、アジュバントＳｐＡ_ＫＫＡＡでのマウスの免疫化は高力価プロテインＡ中和ＩｇＧを誘発する（４４）。これらの抗体は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染の間プロテインＡの抗オプソニンおよびＢ細胞スーパー抗原活性をブロックし、スタフィロコッカス抗原に対してＩｇＧ応答を広く増強し保護免疫の発生を促進する（４４）。プロテインＡ中和抗体がＳ．アウレウス（S.aureus）定着に影響を及ぼすのかどうかを試験するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをアジュバントＳｐＡ_ＫＫＡＡでまたはアジュバント単独で免疫した。モック免疫動物と比べて、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ処置動物は高力価プロテインＡ中和抗体を誘発した（表４）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を接種されると、モックとＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫動物の両方が最初は類似する方法で定着された。なぜならば、中咽喉スワブにより、接種に続く７日目および１４日目では平均定着負荷に有意差はないことが明らかにされたからであった（図４）。しかし、２１日目に開始して、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫マウスのほうがモック免疫動物よりも頻繁に脱定着された（図４）。血清ＩｇＧ応答について調べ、無処置マウスと比べると、モック処置動物でのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着はＣｌｆＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳａｓＤおよびＳａｓＦに対する抗体応答をもたらした（表４）。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着を維持した動物では、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫化はＣｌｆＡ、Ｃｏａ、ｖＷＢＰ、およびＨｌａに対する抗体応答をもたらした（表４）。ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比べると、引き続いて脱定着した動物はＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、フィブロネクチン結合プロテインＡ（ＦｎＢＰＡ）およびＢ（ＦｎＢＰＢ）、ＩｓｄＢ、Ｃｏａ、ならびにＳａｓＧに対する血清ＩｇＧの上昇を示した（表４）。全体でこれらのデータは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種が、Ｓ．アウレウス（S.aureus）が定着していたマウスで血清ＩｇＧ応答の増強を誘発することを示している。さらに、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチンは、既知の定着因子（ＣｌｆＢ、ＩｓｄＡおよびＳａｓＧ）を含む、多くの異なるスタフィロコッカス抗原に対する抗体を誘導した。全体では、定着するスタフィロコッカスに対するこれらのＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン誘導ＩｇＧ応答は、上咽頭の脱定着を促進すると思われる。

【0307】

【表4】

【0308】

ＢＡＬＢ／ｃマウスのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着 Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１定着がＣ５７ＢＬ／６マウスに限定されたかどうかを試験するため、発明者らは無処置ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホート（ｎ＝２０）の右鼻腔中に１×１０^８ＣＦＵ Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１を接種し、スワブ培養物で上咽頭定着を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに類似して、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１はＢＡＬＢ／ｃマウスに持続的に定着した（図５）。ＳｐＡ_ＫＫＡＡを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１での最初の定着に影響を与えなかった。しかし、モック免疫動物と比べた場合、ＳｐＡ_ＫＫＡＡを用いたワクチン接種はＢＡＬＢ／ｃマウスの脱定着を促進した（図５）。

【0309】

ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチンはＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺでのマウス定着に影響を及ぼす。
次に、プロテインＡ中和抗体がＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺでのマウス定着にも影響を及ぼすのかどうかと考えられた。Ｎｅｗｍａｎ株およびＷＵ１株と違って、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺのｓｐａ遺伝子産物は４種のＩｇＢＤのみを含む（３７）。以前の研究では、ヒト上咽頭のＳ．アウレウス（S.aureus）定着と一般的に関連している５種のＩｇＢＤと比べた場合、４種のＩｇＢＤを有するＳｐＡバリアントがＢ細胞スーパー抗原活性の減少と関連していることが実証されていた（３３）。麻酔をかけられたマウスの右鼻腔中に接種された場合、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺは４２日間にわたってＢＡＬＢ／ｃマウスの上咽頭に効果的に定着した（図６）。ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種はＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺでの最初の定着に影響を及ぼさなかった。しかし、モック免疫マウスと比べた場合、血清中和プロテインＡ抗体を有するＢＡＬＢ／ｃマウスは２１日目に開始してＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺをより頻繁に脱定着した（図６）。全体では、これらのデータにより、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺもマウスの持続的定着にプロテインＡ媒介Ｂ細胞スーパー抗原活性を必要とすることが示唆される。

【0310】

材料および方法
培地および細菌増殖条件。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）株は、トリプトンソイブロス（ＴＳＢ）でまたはトリプトンソイ寒天培地（ＴＳＡ）上、３７℃で増殖された。マウス上咽頭定着を調べる実験では、咽喉スワブ試料は指示通りにベアードパーカー寒天上、３７℃で増殖させた。Ｓ．アウレウス（S.aureus）消化管定着を調べる実験では、糞便試料は示された通りにマンニット食塩培地上、３７℃で増殖させた。大腸菌（Escherichia coli）株ＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）はルリアブロス（ＬＢ）培地または寒天において３７℃で増殖させた。アンピシリン（大腸菌では１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（Ｓ．アウレウス（S.aureus）では１０μｇ／ｍｌ）をプラスミド選択用に使用した。

【0311】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）ジェノタイピング。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）単離菌ＷＵ１は、発明者ら所有の動物施設のマウスの上咽頭および包皮腺膿瘍病変から得た。マウスＳ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺ株はＤｒ．Ｓｉｏｕｘｓｉｅ Ｗｉｌｅｓにより提供された（３６）。スタフィロコッカスゲノムＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて単離した。ｓｐａジェノタイピングおよび多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）は以前記載されたとおりに実施した（８５）。手短に言えば、ｓｐａタイピングでは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株のゲノムＤＮＡは、プライマー１０９５Ｆ（５’ＡＧＡＣＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＴＧＡＧＣ３’）（配列番号８９）および１５１７Ｒ（５’ＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＣＴＧ３’）（配列番号９０）を用いてＰＣＲ増幅した（８６）。ＰＣＲ産物は、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製し、プライマー１０９５Ｆおよび１５１７Ｒを用いて配列決定し、Ｒｉｄｏｍソフトウェアを用いて分析した。ＭＬＳＴタイピングでは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株のゲノムＤＮＡは、プライマーａｒｃ－ｕｐ（５’ＴＴＧＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣ３’）（配列番号９１）、ａｒｃ－ｄｎ（５’ＡＧＧＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧ３’）（配列番号９２）、ａｒｏ－ｕｐ（５’ＡＴＣＧＧＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣ３’）（配列番号９３）、ａｒｃ－ｄｎ（５’ＧＧＴＧＴＴＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣ３’）（配列番号９４）、ｇｌｐ－ｕｐ（５’ＣＴＡＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣ３’）（配列番号９５）、ｇｌｐ－ｄｎ（５’ＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＣ３’）（配列番号９６）、ｇｍｋ－ｕｐ（５’ＡＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＧＧＡＣＣＡＴＣ３’）（配列番号９７）、ｇｍｋ－ｄｎ（５’ＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＴＡＡＴＣＧＴＡ３’）（配列番号９８）、ｐｔａ－ｕｐ（５’ＧＴＴＡＡＡＡＴＣＧＴＡＴＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧ３’）（配列番号９９）、ｐｔａ－ｄｎ（５’ＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡ３’）（配列番号１００）、ｔｐｉ－ｕｐ（５’ＴＣＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡ３’）（配列番号１０１）、ｔｐｉ－ｄｎ（５’ＴＴＴＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＡＣ３’）（配列番号１０２）、ｙｑｉ－ｕｐ（５’ＣＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＣ３’）（配列番号１０３）およびｙｑｉ－ｄｎ（５‘ＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣ３’）（配列番号１０４）を用いてＰＣＲ増幅した（例えば、saureus.mlst.net/misc/info.asp参照）。ＰＣＲ産物は、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製し、ＰＣＲ増幅し、配列決定し、オンラインソフトウェア（例えば、saures.mlst.net/参照）を用いて分析した。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＪＳＮＺ株についての全ゲノム配列ファイルはＤｒ．Ｓｉｌｖａ Ｈｏｌｔｆｒｅｔｅｒにより提供された。Ｔｒｕｓｅｑ ＤＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製イルミナＭｉＳｅｑシーケンシング（Truseq DNA-seq library preparation Illumina MiSeq sequencing）は、アルゴンヌ国立研究所で環境試料調製およびシーケンシング施設（Environmental Sample Preparation and Sequencing Facility）によりＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１のゲノムＤＮＡを用いて実施された。配列はＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用して分析された。

【0312】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）突然変異体。
プラスミドｐＫＯＲ１を用いた対立遺伝子組み換えを使用してＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１のｓｐａ遺伝子を欠失させた（８７）。Δｓｐａ突然変異体を構築するため、ｓｐａ遺伝子の上流および下流の２種の１－ｋｂ ＤＮＡ断片を、プライマーｅｘｔ１ ｅｘｔ１Ｆ（５’ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧ３’）（配列番号１０５）、ｅｘｔ１Ｒ（５’ＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＧＡＡＴＴＡＴＧＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣ３’）（配列番号１０６)、ｅｘｔ２Ｆ（５’ＣＧＴＣＧＣＧＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＡＣＧＡＴＡＧＡＴＡＴＣ３’）（配列番号１０７)、およびｅｘｔ２Ｒ（５’ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＡＡＣＧＡＡＣＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣ３’）（配列番号１０８）を用いてＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の染色体から増幅させた。２つの隣接する領域を引き続くＰＣＲで１つに融合させ、最終ＰＣＲ産物をＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＫＯＲ１中にクローニングした。得られたプラスミドは連続的に大腸菌（E.coli）ＤＨ５α、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＲＮ４２２０株、および最後にＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株中に移し、温度を４０℃に変え、プラスミドの複製をブロックし染色体中へのその挿入を促進した（８７）。３０℃での増殖を使用して対立遺伝子置換を促進した。ｓｐａ遺伝子中の突然変異は、ＰＣＲ増幅産物のＤＮＡシーケンシングにより確認した。

【0313】

凝集アッセイ。
凝集アッセイは以前記載された通りに実施した（８８）。手短に言えば、Ｓ．アウレウス（S.aureus）株の一晩培養物を新鮮なＴＳＢに１対１００で希釈し、３７℃で６時間増殖させた。１ｍｌの培養物由来の細菌（ＯＤ_６００４．０に正規化した）をＳＹＴＯ９（１対５００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に１５分間インキュベートし、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁した。細菌は、グラス顕微鏡スライド上でクエン酸処理ヒト血漿またはマウス血漿と１対１で混合し、３０分間インキュベートした。試料を検分し、画像は２０×対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用するＩＸ８１生細胞全反射照明蛍光顕微鏡上で捕えた。それぞれの試料について少なくとも１０画像が得られた。それぞれの画像中の凝集複合体の面積を測定しＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。

【0314】

免疫ブロッティング。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）株の一晩培養物を新鮮なＴＳＢ（プラスミドの存在下でクロラムフェニコールと一緒に）に１対１００で希釈し、３７℃でＯＤ_６０００．５～１．０まで増殖させた。１ｍｌの培養物由来の細胞を遠心分離し、ＰＢＳに懸濁し、２０μｇ／ｍｌのリゾスタフィン（ＡＭＢＩ）と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。全細胞可溶化物中のタンパク質は１０％のトリクロロ酢酸および１０μｇのデオキシコール酸で沈殿させ、氷冷アセトンで洗浄し、風乾し、１００μｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および１００μｌのＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液［１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、０．２％のブロモフェノールブルー、２００ｍＭのジチオスレイトール］に懸濁し、１０分間煮沸した。タンパク質は１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜に電気泳動転写した。ＰＶＤＦ膜は、Ｔｒｉｓ緩衝液生理食塩水中５％牛乳とＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）［２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０］でブロックした。マウス抗ＣｌｆＡ ２Ａ１２．１２モノクローナル抗体（１対２，０００希釈）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１対１０，０００希釈）を使用してＣｌｆＡを検出した。ウサギ抗Ｃｏａポリクローナル抗体（１対１，０００希釈）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（１対１０，０００希釈）を使用してＣｏａを検出した。それぞれＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ由来の完全長ｖＷｂｐまたはｖＷｂｐのＣ末端ドメインを認識する２種の異なるウサギ抗ｖＷｂｐポリクローナル抗体（１対１，０００希釈）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（１対１０，０００希釈）を使用してｖＷｂｐを検出した。ＴＢＳＴ中ＨＲＰコンジュゲートヒトＩｇＭ（１対１０，０００希釈）を使用してＳｐＡを検出した。ウサギ抗ＳｒｔＡポリクローナル抗体（１対１０，０００希釈）およびＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（１対１０，０００希釈）を使用してＳｒｔＡを検出した。抗体染色膜はＴＢＳＴで洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ高性能化学発光フィルム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に現像した。

【0315】

組換えタンパク質の精製。
ＨｉｓタグＳｐＡ_ＫＫＡＡの発現用のｐＥＴ１５ｂ＋プラスミド、ならびに２４のスタフィロコッカス抗原（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＧ、ＳａｓＩ、ＳａｓＫ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＳＣＩＮ、Ｅａｐ、Ｅｆｂ、Ｈｌａ、Ｃｏａ、ｖＷｂｐ、およびＥｂｈ）を有する大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）を一晩増殖させ、新鮮な培地に１対１００で希釈し、３７℃で約０．５のＯＤ_６００まで増殖させた。培養物は１ｍＭのイソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシドで誘導し、さらに３時間増殖させた。細胞はペレット状にして、カラム緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、フレンチプレスセルを用いて１４，０００ｌｂ／ｉｎ^２で破壊した。可溶化物から、超遠心分離により４０，０００×ｇで膜および不溶性成分を取り除いた。透明可溶化液はＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにかけられ、タンパク質は連続して高くなる濃度のイミダゾール（１００から５００ｍＭ）を含有するカラム緩衝液に溶出させた。溶出液はＰＢＳを用いて透析し、タンパク質純度は、クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確かめた。タンパク質濃度はビシンコニン酸アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。

【0316】

マウス上咽頭定着。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株およびそのΔｓｐａ突然変異体の一晩培養物を新鮮なＴＳＢ中に１対１００で希釈し、３７℃で２時間増殖させた。細胞は遠心分離し、ＰＢＳに洗浄して懸濁した。生後７週間のメスＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢ６．１２９Ｓ２－Ｉｇｈｍ^{ｔｍ１Ｃｇｎ}／Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ／ｍｌのケタミンおよび２０ｍｇ／ｍｌのキシラジンで腹腔内注射により麻酔をかけた。１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）（１０μｌ体積中）をそれぞれのマウスの右鼻孔内にピペットで移した。接種に続く７、１４、２１、２８、３５、および４２日目にマウスの中咽頭を綿棒で拭き取り、スワブ試料をベアードパーカー寒天培地に広げ、細菌数え上げのためにインキュベートした。接種に続く１５日目、マウスを眼窩周囲静脈穿刺により出血させて、スタフィロコッカス抗原マトリックスを使用する抗体応答分析用の血清を得た。接種に続く４２日目、糞便試料を収集し、ＰＢＳにホモジナイズした。ホモジネートをマンニット食塩寒天培地に蒔き、細菌数え上げのためにインキュベートした。すべてのマウス実験は、シカゴ大学の施設内バイオセーフティー委員会（ＩＢＣ）および施設内動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の実験プロトコル審査および承認に続いて施設内ガイドラインに従って実施した。動物実験はデータの再現性を保証するため少なくとも1回は繰り返された。

【0317】

能動免疫化。
生後４週間のマウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ）に乳化した５０μｇのＳｐＡ_ＫＫＡＡで皮下注射により免疫し、最初の免疫化の１１日後に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に乳化した５０μｇの同じ抗原で追加免疫した。２１日目、免疫マウスは眼窩周囲静脈穿刺により出血させて、ＥＬＩＳＡ用の血清を得た。２４日目、マウスに１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株またはＪＳＮＺ株を鼻腔内に接種し、上咽頭定着についてモニターした。

【0318】

スタフィロコッカス抗原マトリックス。
ニトロセルロース膜に２μｇの親和性精製スタフィロコッカス抗原をブロットした。膜は５％の脱顆粒牛乳でブロックし、希釈マウス血清（１対１０，０００希釈）およびＩＲＤｙｅ ６８０コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＬＩ－ＣＯＲ）と一緒にインキュベートした。シグナル強度はＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システム（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して定量化した。

【0319】

統計分析。
Ｓｉｄａｋ多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた二元配置分散分析を実施して、上咽頭定着、ＥＬＩＳＡ、および抗原マトリックスデータの統計的有意性を分析した。

【0320】

[実施例２]
スタフィロコッカスプロテインＡバリアント
以下のアッセイを使用すれば、本明細書に記載されるＳｐＡバリアントを本開示の方法および組成物におけるその有効性について評価することができる。

【0321】

アッセイ
マウス膿瘍、マウス致死感染、およびマウス肺炎モデルにおけるワクチン防御。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染性疾患の研究のために３種の動物モデルを確立した。これらのモデルをここで使用すれば、プロテインＡ特異的抗体の産生を介して提供される保護免疫のレベルを調べることができる。

【0322】

マウス膿瘍 ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後２４日メス、群当たり８～１０マウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、精製されたタンパク質の後脚への筋肉内注射により免疫することができる(Chang et al., 2003; Schneewind et al., 1992)。精製されたＳｐＡおよび／またはＳｐＡバリアントは、０日目（完全フロイントアジュバントと１対１で乳化した）および１１日目（不完全フロイントアジュバントと１対１で乳化した）に投与することができる。血液試料は０、１１、および２０日目に眼窩後出血により引き出すことができる。血清は、バリアントの特定の結合活性に対するＩｇＧ力価についてＥＬＩＳＡにより調べることができる。免疫動物は、２１日目に１００μｌのＳ．アウレウス（S.aureus）ＮｅｗｍａｎまたはＳ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００懸濁液（１×１０^７ｃｆｕ）の眼窩後注射によりチャレンジすることができる。このために、Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎの一晩培養物は新鮮なトリプシンソイブロス中に１対１００で希釈し、３７℃で３時間増殖させることができる。スタフィロコッカスは遠心分離し、２回洗浄し、ＰＢＳに希釈して０．４のＡ_６００を生じることができる（１ｍｌ当たり１×１０^８ｃｆｕ）。希釈度は、寒天板およびコロニー形成により実験的に確かめられる。マウスは、体重１ｋｇ当たり８０～１２０ｍｇのケタミンおよび３～６ｍｇのキシラジンの腹腔内注射により麻酔をかけ、眼窩後注射により感染させることができる。チャレンジに続く５日目または１５日目に、マウスは圧縮ＣＯ_２吸入により安楽死させることができる。腎臓を摘出し１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００にホモジナイズすることができる。アリコートを希釈し、ｃｆｕの３通りの決定のために寒天培地上に蒔くことができる。組織学では、腎臓組織は１０％ホルマリン中室温で２４時間インキュベートすることができる。組織はパラフィンに包埋し、薄切片に切り分け、ヘマトキシリンエオジン染色し、顕微鏡により調べることができる。

【0323】

マウス致死感染 ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後２４日メス、群当たり８～１０マウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、精製されたＳｐＡまたはＳｐＡバリアントの後脚への筋肉内注射により免疫することができる。ワクチンは、０日目（完全フロイントアジュバントと１対１で乳化した）および１１日目（不完全フロイントアジュバントと１対１で乳化した）に投与することができる。血液試料は０、１１、および２０日目に眼窩後出血により引き出すことができる。血清は、バリアントの特定の結合活性に対するＩｇＧ力価についてＥＬＩＳＡにより調べられる。免疫動物は、２１日目に１００μｌのＳ．アウレウス（S.aureus）ＮｅｗｍａｎまたはＳ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００懸濁液（１５×１０^７ｃｆｕ）の眼窩後注射によりチャレンジすることができる。このために、Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎの一晩培養物は新鮮なトリプシンソイブロス中に１対１００で希釈し、３７℃で３時間増殖させることができる。スタフィロコッカスは遠心分離し、２回洗浄し、ＰＢＳに希釈して０．４のＡ_６００を生じて（１ｍｌ当たり１×１０^８ｃｆｕ）濃縮することができる。希釈度は、寒天板およびコロニー形成により実験的に確かめられる。マウスは、体重１ｋｇ当たり８０～１２０ｍｇのケタミンおよび３～６ｍｇのキシラジンの腹腔内注射により麻酔をかけることができる。免疫動物は、２１日目に２×１０^１０ｃｆｕのＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎまたは３～１０×１０^９ｃｆｕの臨床Ｓ．アウレウス（S.aureus）単離菌の腹腔内注射によりチャレンジすることができる。動物は１４日間モニターすることができ、致死性疾患は記録することができる。

【0324】

マウス肺炎モデル Ｓ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎ株またはＵＳＡ３００（ＬＡＣ）株は、トリプシンソイブロス／寒天において３７℃でＯＤ_６６００．５まで増殖させることができる。５０ｍｌの培養物アリコートは、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、死亡率研究用に７５０μｌのＰＢＳ（３０μｌ体積当たり３～４×１０^８ＣＦＵ）、または細菌負荷および組織病理学実験用に１，２５０μｌのＰＢＳ（３０μｌ体積当たり２×１０^８ＣＦＵ）に懸濁することができる。肺感染では、生後７週間のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に３０μｌのＳ．アウレウス（S.aureus）懸濁液の左鼻孔内への接種前に麻酔をかけることができる。動物は、回復のため仰臥位でケージ内に置き１４日間観察することができる。能動免疫では、生後４週間のマウスは、０日目に筋肉内経路でＣＦＡ中２０μｇのＳｐＡバリアント、続いて１０日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中２０μｇのバリアントを用いた追加免疫を受けることができる。動物は２１日目にＳ．アウレウス（S.aureus）でチャレンジすることができる。免疫化前および２０日目に血清を収集して特定の抗体産生を評価することができる。受動免疫研究では、生後７週間のマウスは、チャレンジ２４時間前に腹腔内注射により、１００μｌのＮＲＳ（正常ウサギ血清）またはＳｐＡバリアント特異的ウサギ抗血清を受けることができる。肺炎の病理学的相関を評価するため、感染動物は両肺の摘出前に強制的ＣＯ_２吸引により死亡させることができる。右肺は、肺細菌負荷の数え上げのためにホモジナイズすることができる。左肺は、１％のホルマリン中に置き、パラフィン包埋し、薄切片に切り分け、ヘマトキシリンエオジンで染色し、顕微鏡により分析することができる。

【0325】

ウサギ抗体 精製ＳｐＡバリアントは、ウサギ抗血清の産生のために免疫源として使用することができる。タンパク質は、０日目の注射用にＣＦＡで乳化させ、続いて２１日目および４２日目のＩＦＡで乳化したタンパク質を用いた追加免疫注射することができる。ウサギ抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定できる。精製された抗体は、ＳｐＡバリアントセファロース上でのウサギ血清の親和性クロマトグラフィーにより入手可能である。溶出した抗体の濃度は、Ａ_２８０での吸光度により測定することができ、特定の抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定可能である。

【0326】

ＳｐＡバリアントを用いた能動免疫化 ワクチン有効性を判定するため、動物は精製されたＳｐＡバリアントを用いて能動免疫することができる。対照として、動物にアジュバント単独で免疫することができる。プロテインＡ製剤に対する抗体力価は、抗原としてＳｐＡバリアントを使用して決定できる。上記の感染性疾患モデルを使用して、細菌負荷（マウス膿瘍および肺炎）、スタフィロコッカス疾患の組織病理学的証拠（マウス膿瘍および肺炎）および致死性疾患からの保護（マウス致死性チャレンジおよび肺炎）のいかなる減少も測定可能である。

【0327】

ＳｐＡバリアントに対して産生された親和性精製ウサギポリクローナル抗体を用いた受動免疫化。プロテインＡ特異的ウサギ抗体の保護免疫を判定するため、マウスを精製ＳｐＡバリアント由来ウサギ抗体で受動免疫する。これらの抗体製剤の両方は、固定ＳｐＡバリアントを使用して親和性クロマトグラフィーにより精製する。対照として、動物は、ｒＶ１０抗体（スタフィロコッカス感染症の予後になんの影響も及ぼさない疫病保護抗原）で受動免疫する。すべてのプロテインＡ製剤に対する抗体力価は、抗原としてＳｐＡバリアントを使用して決定される。上記の感染性疾患モデルを使用して、細菌負荷（マウス膿瘍および肺炎）、スタフィロコッカス疾患の組織病理学的証拠（マウス膿瘍および肺炎）および致死性疾患からの保護（マウス致死性チャレンジおよび肺炎）の減少を測定可能である。

【0328】

細菌株および増殖。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）Ｎｅｗｍａｎ株およびＵＳＡ３００株は、３７℃でトリプトファンソイブロス（ＴＳＢ）において増殖させることができる。大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株は３７℃で１００μｇｍｌ^－１アンピシリンを含むルリアベルターニ（ＬＢ）ブロスにおいて増殖させることができる。

【0329】

ウサギ抗体。ＳｐＡバリアントは標準組換え技法または合成プロトコルに従って作製することができ、精製された抗原はＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させることができる。抗原マトリックスは、４℃で１０～２０ｍｌのウサギ血清の親和性クロマトグラフィー用に使用することができる。荷電マトリックスは５０カラム体積のＰＢＳで洗浄し、抗体は溶出緩衝液（１Ｍのグリシン、ｐＨ２．５、０．５ＭのＮａＣｌ）で溶出させ、直ちに１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和することができる。精製された抗体は４℃で一晩ＰＢＳに対して透析することができる。

【0330】

Ｆ（ａｂ）_２断片。親和性精製抗体は３７℃で３０分間、３ｍｇのペプシンと混合することができる。反応は１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５でクエンチすることができ、Ｆ（ａｂ）_２断片は、特定の抗原コンジュゲートＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラムを用いて親和性精製することができる。精製された抗体は４℃で一晩ＰＢＳに対して透析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に負荷し、クーマシーブルー染色で可視化することができる。

【0331】

能動および受動免疫化。ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後３週間、メス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、筋肉内注射により完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）に乳化した５０μｇのタンパク質で免疫することができる。追加免疫では、タンパク質を不完全フロイントアジュバントに乳化し、最初の免疫化の１１日後に注射することができる。免疫化に続く２０日目に、５頭のマウスは出血させて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による特定の抗体力価用の血清を得ることができる。

【0332】

ＰＢＳ中親和性精製抗体を、Ｓ．アウレウス（S.aureus）を用いたチャレンジの２４時間前に、実験動物の体重１ｋｇ当たり５ｍｇの濃度でＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週間、メス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の腹膜腔中に注射することができる。動物血液は眼窩周囲静脈穿刺により収集できる。血液細胞は、ヘパリン処置したマイクロヘマトクリット毛管（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて取り出すことができ、Ｚゲル血清分離マイクロチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用すれば、抗原特異的抗体を収集しＥＬＩＳＡにより抗原特異的抗体力価を測定することができる。

【0333】

マウス腎膿瘍。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＮｅｗｍａｎまたはＵＳＡ３００（ＬＡＣ）の一晩培養物は新鮮なＴＳＢ中に１対１００で希釈し、３７℃で２時間増殖させることができる。スタフィロコッカスは沈降させ、洗浄してＰＢＳに０．４のＯＤ_６００（約１×１０^８ＣＦＵ ｍｌ^－１）で懸濁させることができる。接種物は、試料アリコートをＴＳＡ上に広げ形成されたコロニーを数え上げることにより定量化できる。ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週間、メス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ ｍｌ^－１のケタミンおよび２０ｍｇ ｍｌ^－１のキシラジンの腹腔内注射により麻酔をかけることができる。マウスに、１×１０^７ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）Ｎｅｗｍａｎまたは５×１０^６ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００を眼窩後注射により感染させることができる。チャレンジに続く４日目、マウスはＣＯ_２吸入により死亡させることができる。両腎臓を摘出することができ、一臓器中のスタフィロコッカス負荷は、ＰＢＳ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で腎組織をホモジナイズすることにより分析できる。ホモジネートの段階希釈液をＴＳＡ上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートした。残りの臓器は組織病理学により調べることができる。手短に言えば、腎臓は、室温で２４時間１０％ホルマリンに固定できる。組織はパラフィンに包埋し、薄切片に切り分け、ヘマトキシリンエオジンで染色し、光学顕微鏡により視診して膿瘍病変を数え上げることができる。すべてのマウス実験は、シカゴ大学の施設内バイオセーフティー委員会（ＩＢＣ）および施設内動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の実験プロトコル審査および承認に続いて施設内ガイドラインに従って実施できる。

【0334】

プロテインＡ結合。ヒトＩｇＧ結合では、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性カラムは、カラム緩衝液中２００μｇの精製タンパク質（ＳｐＡバリアント）を前充填することができる。洗浄後、２００μｇのヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）をカラム上に充填することができる。タンパク質試料は洗浄液および溶出液から収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、続いてクーマシーブルー染色することができる。精製されたタンパク質（ＳｐＡバリアント）は、４℃で一晩、０．１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中１μｇ ｍｌ^－１濃度で、ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）上に被覆させることができる。次に、プレートは５％全乳でブロックし、続いて段階希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートヒトＩｇＧ、ＦｃまたはＦ（ａｂ）_２断片と一緒に１時間インキュベートすることができる。プレートは洗浄し、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ試薬（ＢＤ）を使用して現像することができる。反応は１Ｍのリン酸でクエンチすることができ、Ａ_４５０読取り値を使用して最大半量力価およびパーセント結合を計算した。

【0335】

フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）結合アッセイ。精製したタンパク質（ＳｐＡバリアント）は上記の通りに被覆しブロックすることができる。プレートは、ヒトｖＷＦと一緒に１μｇ ｍｌ^－１濃度で２時間インキュベートし、次に洗浄してヒトＩｇＧでもう１時間ブロックすることができる。洗浄後、プレートは、ヒトｖＷＦに対する、段階希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と一緒に１時間インキュベートすることができる。プレートは洗浄し、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ試薬（ＢＤ）を使用して現像することができる。反応は１Ｍのリン酸でクエンチすることができ、Ａ_４５０読取り値を使用して最大半量力価およびパーセント結合を計算することができる。阻害アッセイでは、プレートを、リガンド結合アッセイに先立って、ＳｐＡバリアントに特異的である親和性精製Ｆ（ａｂ）_２断片と一緒に１０μｇ ｍｌ^－１濃度で１時間インキュベートすることができる。

【0336】

脾細胞アポトーシス。親和性精製タンパク質（１５０μｇのＳｐＡバリアント）はＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週間、メス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の腹膜腔中に注射することができる。注射４時間後、動物はＣＯ_２吸入により死亡させた。その脾臓を摘出しホモジナイズすることができる。細胞片は細胞漉し器を使用して除去し、懸濁細胞はＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５ＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に移して赤血球を溶解することができる。白血球は遠心分離により沈降させ、ＰＢＳに懸濁し、氷上暗所で１時間、１対２５０希釈Ｒ－ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することができる。細胞は１％ＦＢＳで洗浄し、４℃で一晩４％ホルマリンに固定することができる。次の日、細胞はＰＢＳに希釈し、フローサイトメトリーにより分析することができる。残りの臓器は組織病理学について調べることができる。手短に言えば、脾臓は室温で２４時間１０％ホルマリンに固定することができる。組織はパラフィンに包埋し、薄切片に切り分け、アポトーシス検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色し、光学顕微鏡で視診することができる。

【0337】

抗体定量化。血清は、健康なヒトボランティアまたはＳ．アウレウス（S.aureus）ＮｅｗｍａｎもしくはＵＳＡ３００で３０日間感染されているもしくは上記の通りＳｐＡバリアントで免疫されているＢＡＬＢ／ｃマウスから収集することができる。ヒト／マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＳｐＡバリアント、およびＣＲＭ_１９７はニトロセルロース膜上にブロットすることができる。膜は５％全乳でブロックし、続いてヒトまたはマウス血清と一緒にインキュベートすることができる。ＩＲＤｙｅ ７００ＤＸコンジュゲート親和性精製抗ヒト／マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用すれば、Ｏｄｙｓｓｅｙ（商標）赤外線撮像装置（Ｌｉ－ｃｏｒ）を使用してシグナル強度を定量化できる。ヒトボランティア由来の血液を用いた実験は、シカゴ大学の施設内審査委員会（ＩＲＢ）の規制監督下で審査され、承認され実施されたプロトコルを含んでいた。

【0338】

統計分析。両側スチューデントｔ検定を実施すれば、腎膿瘍、ＥＬＩＳＡ、およびＢ細胞スーパー抗原データの統計的有意性を分析できる。

【0339】

これらのアッセイを使用して、本明細書に記載されるバリアント（例えば、図１２～１５に示されるバリアント）を試験することができる。ＳＰＲ分析などのさらなるアッセイを実施すれば、ＳｐＡ、ＳｐＡ／ＫＫＡＡならびにＳｐＡ／ＫＫＡＡ／Ｆ（ＳｐＡ^＊３１）対照と比べて、ヒトＶＨ３－ＩｇＧおよびヒトＶＨ３－ＩｇＥとの新しいＳｐＡバリアントの結合親和性を決定することができる。製造可能性（大腸菌（E.coli）細胞ペースト１グラム当たりの精製ＳｐＡ^＊バリアントの収量）も試験することができる。ＣＤスペクトル測定を実施すれば、ＳｐＡおよびＳｐＡ／ＫＫＡＡと比べてα－ヘリックス含量を調べることができる。可変的な温度（１～７日間で４、２５および３７℃）での精製および貯蔵の間のタンパク質安定性も決定することができる。

【0340】

薬物安全性および有効性を試験するため、バジルヒスタミン放出アッセイを実施してもよい（図１６）。この試験は当技術分野では公知である（例えば、Kowal, K. et al., 2005. Allergy and Asthma Proc. Vol. 26, No. 6参照）。手短に言えば、ヒト血清および/または好塩基球を３７℃で６０分間インキュベートすることができる。ヒスタミン放出は、刺激を受けた細胞（ＳｐＡバリアントの添加により）および無刺激細胞から測定可能であり、その結果は、ヒスタミン放出として全ヒスタミン含量の百分率で表すことができる。一部の態様では、ヒスタミン放出＞１６．５％は児童でも成人患者でも陽性の検査結果である。

【0341】

[実施例３]
安全性が改善されたＳＰＡワクチンバリアント
結果
ＳｐＡワクチン候補のＧｌｙ^２９でのアミノ酸置換
発明者らは、ヒトＩｇＧと、ＳｐＡ_ＫＫ、すなわち、ＳｐＡとＦｃγの間の相互作用を破壊するアミノ酸置換Ｇｌｎ^９，１０Ｌｙｓも有する５種のＩｇＢＤ（ＥＤＡＢＣ）との間の親和性の最大の減少を引き起こすＳｐＡ－ＩｇＢＤのＧｌｙ^２９位でのアミノ酸置換を実験的に特定しようと努めた（４８）。この目標に向けて、発明者らは、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ付きＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｇ２９Ｘ}をコードし、Ｘが遺伝コードにより提供される１９の天然のアミノ酸（グリシンを除く）のうちのいずれか１つである、１９の異なるプラスミドを構築した。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｇ２９Ｘ}タンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂上の親和性クロマトグラフィーにより精製し、溶出させ、透析し、ＢＣＡアッセイにより濃度を決定し、等濃度（２５０ｎＭ）でＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＨＴＧｃｈｉｐに結合させた。それぞれのチップは、段階希釈のヒトＩｇＧまたはＰＢＳ対照と一緒に表面プラズモン共鳴実験にかけた。ヒトＩｇＧとチップ上に充填されたＳｐＡワクチン候補の会合は記録され、データはそれぞれのタンパク質について会合定数を導き出すように変換された（表５）。対照として、発明者らは、ヒトＩｇＧに対する野生型ＳｐＡ（Ｋ_Ａ １．０８１×１０^８Ｍ^－１）およびＳｐＡ_ＫＫＡＡ（Ｋ_Ａ ５．０２２×１０^５Ｍ^－１）の会合定数を定量化した。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｇ２９Ｘ}タンパク質では、Ｇｌｙ^２９での４種のアミノ酸置換は会合定数の有意な増加を引き起こし、Ｇｌｙ^２９Ｓｅｒ（Ｋ_Ａ ９．３９８×１０^５Ｍ^－１）、Ｇｌｙ^２９Ｌｙｓ（Ｋ_Ａ ９．７３８×１０^５Ｍ^－１）、Ｇｌｙ^２９Ｉｌｅ（Ｋ_Ａ １０．０７０×１０^５Ｍ^－１）、およびＧｌｙ^２９Ａｌａ（Ｋ_Ａ １１．３１０×１０^５Ｍ^－１）、これらのバリアントがヒトＩｇＧのＶ_Ｈ３－バリアント重鎖にＳｐＡ_ＫＫＡＡよりも堅固に結合したことを示唆している（表５）。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｇ２９Ａ}についての知見は発明者らには驚きであった。市販の抗体精製（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（商標））用のＺＺＺＺ構築物中のＧｌｙ^２９Ａｌａ置換はＶ_Ｈ３－ＩｇＧへの結合を減少させ（１５０）、ＳｐＡ－ＩｇＢＤ内のＧｌｎ^９，１０Ｌｙｓという状況でのＧｌｙ^２９ＡｌａはＶ_Ｈ３－ＩｇＧに対する親和性の適度の増加を促進する可能性がある。ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比べた場合、Ｇｌｙ^２９での１０のアミノ酸置換、Ｇｌｙ^２９Ｔｈｒ、Ｇｌｙ^２９Ｌｅｕ、Ｇｌｙ^２９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ^２９Ｐｒｏ、Ｇｌｙ^２９Ｐｈｅ、Ｇｌｙ^２９Ｍｅｔ、Ｇｌｙ^２９Ｖａｌ、Ｇｌｙ^２９Ｔｒｐ、Ｇｌｙ^２９Ａｓｐ、Ｇｌｙ^２９Ａｒｇ、Ｇｌｙ^２９Ａｓｎ、およびＧｌｙ^２９Ｔｙｒでの会合定数に有意差を引き起こさなかった（表５）。Ｇｌｙ^２９での別の３つのアミノ酸置換は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比べた場合、ヒトＩｇＧに対する会合定数、Ｇｌｙ^２９Ｈｉｓ（Ｋ_ａ １．４３５×１０^５Ｍ^－１）、Ｇｌｙ^２９Ｃｙｓ（Ｋ_ａ １．７４３×１０^５Ｍ^－１）、およびＧｌｙ^２９Ｇｌｎ（Ｋ_ａ ２．０５７×１０^５Ｍ^－１）を減らした（表４）。このように、Ｇｌｙ^２９でのアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧへのＳｐＡ－ＩｇＢＤの結合に普遍的な効果を発揮しない。Ｇｌｙ^２９での一部のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧとＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｇ２９Ｘ}の間の親和性を増加し、他のアミノ酸置換は中性である（有意な効果を発揮しない）または親和性を減少させる。

【0342】

ＳｐＡワクチン候補のＳｅｒ３３でのアミノ酸置換
ヒトＩｇＧとＳｐＡ_ＫＫの間の親和性の最大の減少を引き起こすＳｐＡ－ＩｇＢＤのＳｅｒ^３３位でのアミノ酸置換を特定するため、発明者らは、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ付きＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｘ}をコードし、Ｘが遺伝コードにより提供される１９の天然のアミノ酸（セリンを除く）のうちのいずれか１つである、１９の異なるプラスミドを構築した。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｘ}タンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂上の親和性クロマトグラフィーにより精製し、溶出させ、透析し、ＢＣＡアッセイにより濃度を決定し、等濃度（２５０ｎＭ）でＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＨＴＧｃｈｉｐに結合させた。それぞれのチップは、段階希釈のヒトＩｇＧまたはＰＢＳ対照と一緒に表面プラズモン共鳴実験にかけた。ヒトＩｇＧとチップ上に充填されたＳｐＡワクチン候補の会合は記録され、データはそれぞれのタンパク質について会合定数を導き出すように変換された（表５）。Ｓｅｒ^３３での２つのアミノ酸置換はヒトＩｇＧに対する親和性の増加を引き起こし、Ｓｅｒ^３３Ｇｌｙ（Ｋ_Ａ １１．１８０×１０^５Ｍ^－１）およびＳｅｒ^３３Ａｌａ（Ｋ_Ａ １０．５４０×１０^５Ｍ^－１）、これらのバリアントがヒトＩｇＧに対してＳｐＡ_ＫＫＡＡよりも大きな親和性を見せる（おそらく、Ｖ_Ｈ３－バリアント重鎖に対する親和性の増加のせいで）ことを示している（表６）。Ｓｅｒ^３３Ｔｙｒ、Ｓｅｒ^３３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ^３３Ｔｒｐ、Ｓｅｒ^３３Ｖａｌ、Ｓｅｒ^３３Ｈｉｓ、Ｓｅｒ^３３Ａｓｎ、Ｓｅｒ^３３Ｍｅｔ、Ｓｅｒ^３３Ａｒｇ、Ｓｅｒ^３３Ａｓｐ、Ｓｅｒ^３３Ｐｈｅ、Ｓｅｒ^３３Ｇｌｎ、Ｓｅｒ^３３Ｐｒｏ、Ｓｅｒ^３３ＣｙｓおよびＳｅｒ^３３Ｌｙｓでの、Ｓｅｒ^３３での１４のアミノ酸置換は会合定数に有意差を引き起こさなかった（表５）。Ｓｅｒ^３３での３つのアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧおよびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｘ}に対する親和性を減少させた、Ｓｅｒ^３３Ｔｈｒ（Ｋ_Ａ ０．３８６×１０^５Ｍ^－１）、Ｓｅｒ^３３Ｇｌｕ（Ｋ_Ａ ０．４９６×１０^５Ｍ^－１）、およびＳｅｒ^３３Ｉｌｅ（Ｋ_Ａ １．８４０×１０^５Ｍ^－１）（表６）。このように、Ｓｅｒ^３３での一部のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧとＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｘ}の間の親和性を増加し、他のアミノ酸置換は中性である（有意な効果を発揮しない）またはヒトＩｇＧとの会合を減少させる。ＩｇＧ間の親和性を減少させるアミノ酸置換のうち、Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３Ｔｈｒが会合定数の最大の減少を見せる（表５）。

【0343】

ＳｐＡワクチン候補においてＧｌｙ２９、Ｓｅｒ３３およびＡｓｐ３６、３７でアミノ酸置換を組み合わせる
Ｓｅｒ^３３での単一アミノ酸置換と比べた場合、ＩｇＢＤのＧｌｙ^２９位、Ｓｅｒ^３３位およびＡｓｐ^{３６、３７}位でのアミノ酸置換の組合せはヒトＩｇＧに対するさらなる親和性減少を引き起こすのだろうか、または複数の置換は２つのタンパク質間の親和性も増加することができる逆説的効果を発揮するのだろうか。この疑問に取り組むため、発明者らは、Ｓｅｒ^３３にアミノ酸置換を有する３種のタンパク質、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３E}（減少した親和性）、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３F}（影響を受けない親和性）、およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Q}（影響を受けない親和性）とＧｌｙ^２９および／またはＡｓｐ^{３６、３７}に追加のアミノ酸置換を有するタンパク質の会合定数を比較した（表６）。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３E}（Ｋ_Ａ ０．４９６×１０^５Ｍ^－１）では、加えられた置換Ｇｌｙ^２９Ａｌａ（Ｋ_Ａ １．２６５×１０^５Ｍ^－１）、Ｇｌｙ^２９Ｐｈｅ（Ｋ_Ａ １．５７５×１０^５Ｍ^－１）、Ａｓｐ^{３６、３７}Ａｌａ（Ｋ_Ａ ０．５６８×１０^５Ｍ^－１）、Ｇｌｙ^２９Ａｌａ／Ａｓｐ^{３６、３７}Ａｌａ（Ｋ_Ａ １．８９２×１０^５Ｍ^－１）、またはＧｌｙ^２９Ａｒｇ（Ｋ_Ａ ４．８４０×１０^５Ｍ^－１）で追加の効果は観察されなかった。しかし、Ａｓｐ^{３６、３７}ＡｌａとＧｌｙ^２９Ｐｈｅ（Ｋ_Ａ １４．８５０×１０^５Ｍ^－１）またはＧｌｙ^２９Ａｒｇ（Ｋ_Ａ １０．２４０×１０^５Ｍ^－１）の組合せは、ヒトＩｇＧに対するＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３E}の親和性を増やした（表７）。会合定数がＳｐＡ_ＫＫＡＡの会合定数とは有意差がないＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３F}（Ｋ_Ａ ３．９０２×１０^５Ｍ^－１）について分析すると、発明者らは類似の効果を観察した。Ａｓｐ^{３６、３７}ＡｌａがヒトＩｇＧに対する親ワクチンの親和性をここで再び増やしたＧｌｙ^２９Ｐｈｅ（ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｑ／Ｄ３６，３７Ａ／Ｇｌｙ２９Ｆ} Ｋ_Ａ １２．４７０×１０^５Ｍ^－１）のいずれかと組み合わされた場合を除いて、置換のどれもヒトＩｇＧに対するＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３F}の親和性を変更しなかった（表７）。このように、ＳｐＡ－ＩｇＢＤのＧｌｙ^２９、Ｓｅｒ^３３およびＡｓｐ^{３６、３７}でのアミノ酸置換を組み合わせてもヒトＩｇＧに対する親和性を予想通りに減少しない。それぞれの場合で、組換えＳｐＡワクチン候補の親和性は実験的に判定する必要がある。

【0344】

ＳｐＡ－ＫＲは、ＩｇＢＤのＥドメインに２つの追加のアミノ酸置換を有するＳｐＡ_ＫＫＡＡのバリアントであり、このドメインは、アミノ酸配列ＡＤＡＱＱＮを有する６つの残基Ｎ末端伸長を有している（国際公開第２０１５／１４４６５３号）。発明者ら、Ｆａｂｉｏ Ｂａｇｎｏｌｉ、Ｌｕｉｇｉ ＦｉａｓｃｈｉおよびＭａｒｉａ Ｓｃａｒｓｅｌｌｉ（Ｇｌａｘｏ－ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＩＮＣ．）は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡのＥドメインのヘキサペプチド伸長での２つのグルタミン（ＱＱ）残基が、これらの残基が免疫グロブリンにどこで結合するか、すなわち、ＦｃγまたはＶ_Ｈ３重鎖を特定しないし、そのような結合についての実験照明を提供せずにヒトＩｇＧに対する追加の結合部位を占める可能性があると推測した。ヒトＩｇＧへのその親和性について分析すると、ＳｐＡ－ＫＲの会合定数（Ｋ_Ａ ５．４６４×１０^５Ｍ^－１）はＳｐＡ_ＫＫＡＡの会合定数と有意差はなく、ＳｐＡ－ＫＲがＶ_Ｈ３－ＩｇＧに対して架橋活性も見せる可能性があることを示唆している（表７）。ＳｐＡ_ＲＲＶＶは、欧州特許出願公開第３１０１０２７号（ＯＬＹＭＶＡＸ ＩＮＣ．）に記載されているＳｐＡワクチンバリアントである。ＳｐＡ_ＫＫＡＡに類似して、ＳｐＡ_ＲＲＶＶはＳｐＡの５つのＩｇＢＤのそれぞれのＧｌｎ^９，１０およびＡｓｐ^{３６，３７}にアミノ酸置換を有するが、置換ではＧｌｎ^９，１０をアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）で、Ａｓｐ^{３６，３７}をバリン（ＶａｌまたはＶ）で置き換える。ヒトＩｇＧへのその親和性について分析すると、ＳｐＡ_ＲＲＶＶの会合定数（Ｋ_Ａ ５．６０９×１０^５Ｍ^－１）はＳｐＡ_ＫＫＡＡの会合定数に類似しており、ＳｐＡ_ＲＲＶＶがＶ_Ｈ３－ＩｇＧに対して架橋活性も見せる可能性があることを示唆している（表７）。

【0345】

ヒトＩｇＧのＶＨ３イディオタイプおよびＦａｂ断片に対するＳｐＡワクチンバリアントの架橋活性
ＳｐＡワクチンの臨床開発のための重要な安全性問題は、好塩基球およびマスト細胞の表面上でＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＥおよびＩｇＧとの架橋活性を欠くことであり、そうでなければこれはヒスタミン放出およびアナフィラキシーの引き金を引く（１４０、１４２、１４５）。ＳｐＡワクチン候補のＶ_Ｈ３架橋活性を定量化するため、発明者らは、パパインで切断された精製ヒトＩｇＧ（５４％のＶ_Ｈ３イディオタイプバリアント重鎖）およびＳｐＡ_ＫＫ上での親和性クロマトグラフィーを使用して精製されたＶ_Ｈ３クローンＦａｂ断片を使用した（７５）（表８）。ＳｐＡおよびそのバリアントを用いて親和性測定のために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して調べると、野生型プロテインＡ（ＳｐＡ）のＩｇＢＤは強力な架橋活性を見せた（Ｋ_Ａ １．４４×１０^７Ｍ^－１、表８）。Ｖ_Ｈ３－Ｆａｂに対する親和性は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ（Ｋ_Ａ ８．２７×１０^４Ｍ^－１）、およびＳｐＡ－ＫＲ（Ｋ_Ａ ６．４２×１０^４Ｍ^－１、）では減少したが、両バリアントはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}（Ｋ_Ａ ４１．２４Ｍ^－１）およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}（Ｋ_Ａ ４３．５５Ｍ^－１）と比べた場合、有意な架橋活性を保持した（表８）。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、ＰＢＳ対照（すなわち、リガンドが添加されない場合に得られる値）に類似する結合特性を見せた。このように、アミノ酸置換Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３Ｔｈｒは、それぞれワクチン候補ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}でＶ_Ｈ３－ＩｇＥおよびＶ_Ｈ３－ＩｇＧ架橋活性をなくしてしまう。

【0346】

ＳｐＡワクチンバリアントのＦｃγ結合活性
Deisenhoferは、ヒトＦｃγに結合しているＳｐＡ Ｂドメイン（ＩｇＢＤ－Ｂ）の結晶構造を解析し、２つの分子間の境界面を特定した（１５４）。４つの水素結合がＳｐＡ（Ｂドメイン番号付け、図２０Ｂ）とＦｃγの間の相互作用、Ｇｌｎ^９（ＩｇＧ Ｓｅｒ^２５４）、Ｇｌｎ^１０（ＩｇＧ Ｇｌｎ^３１１）、Ａｓｎ^１１（ＩｇＧ Ａｓｎ^４３４）およびＴｙｒ^１４（ＩｇＧ Ｌｅｕ^４３２）を促進する（５４）。これらのＢドメイン残基は５つのＩｇＢＤすべてにおいて保存されており（図２０）、Ｆｃγ結合の普遍的な機構を暗示している（４３）。以前の研究では、ＩｇＢＤ－ＤでのまたはＳｐＡの５つのＩｇＢＤすべてでのＧｌｎ^９，１０Ｌｙｓ置換が、ヒト、マウスおよびモルモットＩｇＧ ＦｃγへのＳｐＡ_ｋｋ（ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ}）結合を減らすことが明らかにされた（７６、４３）。新たに操作により作製されたＳｐＡワクチンバリアントＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}はその５つのＩｇＢＤにＧｌｎ^９，１０Ｌｙｓアミノ酸置換を保持するので、発明者らは、これらのバリアントがヒトＦｃγへの結合で有意な欠損も見せるはずであると推測した。この推測を確かめるため、発明者らは、パパインで切断された精製ヒトＩｇＧおよびこうして得られた精製されたＦｃγ断片を使用した（表９）。ＳｐＡおよびそのバリアントを用いた親和性測定に生体層干渉計（ＢＬＩ）を使用して調べた場合、野生型プロテインＡのＩｇＢＤはＦｃγに対して高親和性を見せた（Ｋ_Ａ ５．１７×１０^７Ｍ^－１）。Ｆｃγ結合活性は、それぞれＳｐＡ_ＫＫＡＡ（Ｋ_Ａ ３２．６８Ｍ^－１）、ＳｐＡ－ＫＲ（Ｋ_Ａ ３９．１２Ｍ^－１）、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}（Ｋ_Ａ ３２．６８Ｍ^－１）およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}（Ｋ_Ａ ３９．９１Ｍ^－１）に対しては消失した。このように、Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３Ｔｈｒ置換は、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}のヘリックス１でのＦｃγ結合に対するＧｌｎ^９，１０Ｌｙｓの効果を乱さない（表９）。

【0347】

ＳｐＡワクチン候補のアナフィラキシー活性についてのマウスモデル
臨床および実験研究によれば、血管透過性亢進はアナフィラキシーの顕著な特徴であることが明らかになっている（１５５、１５６）。活性化されたマスト細胞または好塩基球は、ヒスタミンおよび血小板活性化因子を含む血管作動性媒体を放出し、この媒体が血管拡張および内皮バリア崩壊を引き起こすことにより血管透過性亢進のアナフィラキシー応答を誘導する（１５６）。これらのイベントはアナフィラキシー血管透過性亢進のマウスモデルにおいて、２μｇのヒトＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧの皮内注射を経て２４時間前に刺激を与えた実験部位（耳組織）で静脈内投与色素、エバンスブルーの血管外漏出として測定可能である（１５７）。耳組織へのエバンスブルーの血管漏出は引き続いて５頭の動物のコホートにおいて定量化され（ｎｇ色素／ｍｇ組織）、平均と標準偏差（ＳＤ）が計算され、データは統計的有意差について解析される。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿は、Ｖ_Ｈ３イディオタイプバリアント重鎖を有する免疫グロブリンを５～１０％だけ含有する（４８）。この理由で、マウスは、モルモット（２０～３０％のＶ_Ｈ３イディオタイプバリアント重鎖）とは違って、ＳｐＡ誘導アナフィラキシーショックに抵抗性である（１４０）。したがって、発明者らは、その研究用にμＭＴマウスを選んだ。この動物は機能的なＩｇＭ Ｂ細胞受容体を欠き、プレＢ細胞段階でＢ細胞発生を止め、血漿ＩｇＧを産生することができない（１５８）。μＭＴマウスは、耳組織中への２μｇのヒトＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧの皮内注射のためのレシピエントとして使用した。２４時間後、２００μｇのＳｐＡ、ＳｐＡワクチンバリアントまたは緩衝液対照（ＰＢＳ）をマウスの静脈内に注射した。ＳｐＡ処置の５分後、２％のエバンスブルー液をマウスの静脈内に注射して、耳組織での血管透過性を評価した。３０分後、動物は安楽死させ、耳組織を切除し、乾燥させて、色素の分光測光定量用にホルムアミドで抽出した。ＰＢＳ対照［３４．７３（±）８．４７４ｎｇエバンスブルー／ｍｇ耳組織］と比べて、ＳｐＡ処置はアナフィラキシー血管透過性亢進を引き起こし、１２４．９ｎｇ／ｍｇ（±２６．５４ｎｇ／ｍｇ）エバンスブルーを放出した（ＰＢＳ対ＳｐＡ、Ｐ＜０．０００１）（図２２）。ヒトＶ_Ｈ３－ＩｇＧの皮内注射により前処置された動物コホートでは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡの静脈内投与も血管透過性亢進を引き起こした［７０．３１ｎｇ／ｍｇ（±２３．０４ｎｇ／ｍｇ）；ＰＢＳ対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０１］が、野生型ＳｐＡよりもレベルは低かった（ＳｐＡ対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０００１）（図２２）。これとは対照的に、２００μｇのＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}［３８．５７ｎｇ／ｍｇ（±１５．０７ｎｇ／ｍｇ）；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}対ＰＢＳ、有意ではなかった］またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}［４１．４３ｎｇ／ｍｇ（±１３．１５ｎｇ／ｍｇ）；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}対ＰＢＳ、有意ではなかった］の静脈内投与は、μＭＴマウスでＶ_Ｈ３イディオタイプヒトＩｇＧで処置された部位では血管透過性亢進を誘発しなかった（図２２）。比較として、ＳｐＡ－ＫＲワクチン候補は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡのアナフィラキシー血管透過性亢進に類似するアナフィラキシー血管透過性亢進を誘発した（図２２）。このように、マスト細胞および好塩基球上の活性化ＦｃεＲＩまたは他のエフェクター細胞上のＦｃγＲに結合しているＶ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧに架橋することにより血管透過性亢進の引き金を引くＳｐＡおよびＳｐＡ_ＫＫＡＡとは違って、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、Ｖ_Ｈ３イディオタイプＩｇＧに架橋してμＭＴマウスのＶ_Ｈ３イディオタイプヒトＩｇＧで前処置された部位でアナフィラキシー反応を促進することはできない。

【0348】

Ｖ_Ｈ３－ＩｇＥのＳｐＡワクチン候補架橋
好塩基球およびマスト細胞はアナフィラキシー応答の２つの主要なエフェクター細胞であり、そのFcεＲＩ表面受容体上にＩｇＥが抗原媒介架橋すると炎症促進性メディエーターを分泌する。ＳｐＡを大量にまたは可溶性精製ＳｐＡを発現するＳ．アウレウス（S.aureus）Ｃｏｗａｎ Ｉ株は好塩基球を活性化してヒスタミン放出を誘導することができる。この刺激効果は、プロテインＡのＦａｂ結合活性に依存している（１４５）。好塩基球の表面に結合している循環ＩｇＥまたはＩｇＧとのＳｐＡワクチン候補の潜在的架橋効果を研究するため、ＰＢＳに精製されたワクチンバリアントを３０分間ＥＤＴＡで抗凝固剤処置した新たに引き出したヒト血液に添加した。野生型ＳｐＡは陽性対照として使用した。ＰＢＳは陰性対照として使用した。細胞は、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ２０３ｃ、抗ＨＬＡ－ＤＲ（樹状細胞および単球の除去）および抗ＣＤ６３で染色した。好塩基球は、ＳＳＣ^ｌｏｗＣＤ２０３ｃ^＋／ＣＤ１２３^＋／ＨＬＡ－ＤＲ^－細胞についてゲート開閉することにより同定した。ＣＤ１２３好塩基球活性化は、ＣＤ６３の割合として表され、陰性および陽性対照について補正された。ＰＢＳ対照（４．３９％活性化好塩基球）と比べると、ＳｐＡまたはＳｐＡ_ＫＫＡＡ処置は、ＣＤ６３＋活性化好塩基球集団の有意な増加、それぞれ３２．０５％（ＰＢＳ対ＳｐＡ、Ｐ＜０．０００１）および１０．６６％（ＰＢＳ対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０１）を引き起こした（表１０）。ＳｐＡ_ＫＫＡＡとは対照的に、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}［５．３８％；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０５］またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}［４．５７％；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０１］は、好塩基球を活性化できず、ＰＢＳ対照に類似するふるまいをした（表１０）。このアッセイでは、ＳｐＡ－ＫＲ［８．１５％］およびＳｐＡ_ＲＲＶＶ［１０．１６％］ワクチン候補は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡに類似する好塩基球活性化を示した。このように、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、血液中の循環ＩｇＥに架橋できず、高親和性受容体ＦｃεＲＩに結合することにより好塩基球を感作できない。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}と違って、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ－ＫＲおよびＳｐＡ_ＲＲＶＶワクチン候補は、望ましくない全身的アナフィラキシー反応を開始するＩｇＥ架橋に対する有意な活性を保持する。

【0349】

マスト細胞機能応答は、抗原トリガードβ－ヘキソサミニダーゼおよびヒスタミン放出により測定された。ヒトマスト細胞系ＬＡＤ２はこのアッセイのために使用された。マスト細胞（２×１０^５細胞／ｍｌ）は、ＳｐＡワクチンバリアント（１０μｇ）を用いた３０分間の刺激に先立って１００ｎｇ／ｍｌのＶ_Ｈ３ ＩｇＥと一緒の一晩インキュベーションに続いて感作され、β－ヘキソサミニダーゼ放出（図２３Ａ）またはヒスタミン放出（図２３Ｂ）が測定された。野生型ＳｐＡと一緒のインキュベーションはβ－ヘキソサミニダーゼ放出の約３５％を誘導した。ＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ－ＫＲワクチンは、それぞれβ－ヘキソサミニダーゼ放出の１０．３２％および９．８７％を引き起こし、有意差はなかった（ＳｐＡ－ＫＲ対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、有意ではなかった）。これらの減少は、ＳｐＡ野生型と比べた場合は有意であった（ＳｐＡ対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０００１；ＳｐＡ対ＳｐＡ－ＫＲ、Ｐ＜０．０００１）。それにもかかわらず、ＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ－ＫＲワクチンは、陰性対照レベルよりも上のβ－ヘキソサミニダーゼ放出活性を保持する（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０００１；ＳｐＡ－ＫＲ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０００１）（図２３Ａ）。比較では、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}［６．４６％；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０１］およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}［４．４３％；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}対ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、Ｐ＜０．０００１］が引き起こしたβ－ヘキソサミニダーゼ放出は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡと比べた場合、有意に少なかった。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、ＰＢＳ対照に類似するβ－ヘキソサミニダーゼ放出を見せた（図２３Ａ）。

【0350】

ヒスタミン放出を評価した場合、類似する結果を得た（図２３Ｂ）。ＳｐＡは最も高いレベルのヒスタミン放出を刺激し、ＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ－ＫＲワクチンは、ＰＢＳ対照レベルよりも上のヒスタミン放出活性を保持し、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}の両方は陰性対照ＰＢＳに似た振る舞いをした［ＳｐＡ対ＰＢＳ、またはＳｐＡ_ＫＫＡＡ、またはＳｐＡ－ＫＲ、またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、Ｐ＜０．０００１；ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ－ＫＲまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、有意ではなかった；ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}またはＰＢＳ、Ｐ＜０．０５；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}対ＳｐＡ－ＫＲ、Ｐ＜０．０１］。

【0351】

結論として、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、Ｖ_Ｈ３イディオタイプＩｇＥで感作したマスト細胞を活性化する能力を失っており、ヒト臨床試験に適した安全性プロファイルを有するワクチン候補を表す。

【0352】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）定着モデルにおけるＳｐＡワクチン候補の免疫原性および有効性
アジュバント単独（モック）で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスのコホートと比べると、ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}を用いた免疫化はＳｐＡ中和抗体を産生した（図２５Ａ）。予想通り、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫化は、鼻腔内定着の２１日後に開始して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの上咽頭および消化管からのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の脱定着を誘導した（図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ）。さらに、脱定着マウスでは、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫化は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）脱定着と関連がある病原菌特異的ＩｇＧ（抗ＣｌｆＢ、抗ＩｓｄＡ、抗ＩｓｄＢ、および抗ＳａｓＧを含む）抗体の増加と関連があった［（１０２）およびデータは示さず］。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化に続いて類似する結果が観察された。モック対照と比べると、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}ワクチン接種は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種と類似してＣ５７ＢＬ／６マウスの上咽頭および消化管からのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１の脱定着を促進した（図２４Ｂ、２４Ｃ）。脱定着したマウスでは、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}ワクチン接種は、病原菌特異的ＩｇＧ（抗ＣｌｆＢ、抗ＩｓｄＡ、抗ＩｓｄＢ、抗ＳａｓＧを含む、データは示さず）の増加と関連があった。ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫動物と比べると、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}ワクチン接種は、類似するレベルのＳ．アウレウス（S.aureus）脱定着を誘発し、２種のワクチンがマウス定着モデルでは類似する保護効率を見せることを示唆している。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}ワクチン接種は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}ワクチン接種に類似するレベルのＳ．アウレウス（S.aureus）脱定着を誘発した（データは示さず）。動物のコホートが、ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}と同じ日に免疫された場合、おおよそ５０％の動物が上咽頭および消化管で脱定着し、アジュバント単独（モック）を受けた動物はすべて定着したままであった（図２４Ｄ、２４Ｅ）。このデータは、３種の候補ワクチンすべてがＳ．アウレウス（S.aureus）の定着モデルでは類似した機能をすることをさらに実証している。

【0353】

Ｓ．アウレウス（S.aureus）血流感染のマウスモデルでのＳｐＡワクチン候補の有効性
以前の研究により、ＳｐＡ_ＫＫＡＡを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化が、静脈内ＭＲＳＡ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ血流チャレンジおよび腎組織における膿瘍病変のその後の形成から動物を保護するＳｐＡ特異的抗体を誘発することが実証された（４３）。モック（アジュバント単独）免疫マウスと比べて、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}での免疫化は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡに対する、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}に対するまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}に対する有意に高い力価抗体を誘発した（図２５Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫化により誘導されるＳｐＡ特異的抗体力価は、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}について分析されるよりもＳｐＡ_ＫＫＡＡについてＥＬＩＳＡにより分析される場合のほうが有意に高かった（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、Ｐ＜０．０００１；ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、Ｐ＜０．０００１）。類似する方法で、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}免疫化により誘導されるＳｐＡ特異的抗体力価は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}について分析されるよりもＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}についてＥＬＩＳＡにより分析される場合のほうが有意に高く（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}、Ｐ＜０．００１；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、Ｐ＜０．０５）、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}免疫化により誘導されるＳｐＡ特異的抗体力価は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡまたはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}について分析されるよりもＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}についてＥＬＩＳＡにより分析される場合のほうが有意に高かった（ＳｐＡ_ＫＫＡＡ対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、Ｐ＜０．０５；ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}対ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}、Ｐ＜０．０５）（図２５Ａ）。これらの結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでのＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}ワクチン接種により産生される抗体のエピトープのすべてではないが一部は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種により産生される抗体のエピトープとは異なっており、逆の場合も同じであることを示唆している。以前報告されたように（４３）、モック免疫マウスと比べて、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでのＭＲＳＡ ＵＳＡ３００ ＬＡＣの細菌負荷および膿瘍病変の数を減らした（図２５Ｂ、Ｐ＜０．０００１）。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}ワクチン接種は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン接種と比べて、ＭＲＳＡ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ血流感染に対する類似する保護を生じた。モック免疫動物と比べて、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの細菌負荷および膿瘍病変の数を減らした（図２５Ｃ、Ｐ＜０．０００１）。このように、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}ワクチン接種は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチン候補について以前報告されたように、マウスにおけるＭＲＳＡ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ血流感染および関連する膿瘍形成に対する類似する保護を誘発する（４３）。

【0354】

ＳｐＡ中和モノクローナル抗体３Ｆ６へのＳｐＡワクチン候補の結合
マウスハイブリドーマモノクローナル抗体（ｈＭＡｂ）３Ｆ６（ＩｇＧ２ａ）は、ＳｐＡ_ＫＫＡＡ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を使用して産生した（８４）。ｈＭＡｂ ３Ｆ６の遺伝子はシーケンシングし、ＨＥＫ２９３ Ｆ細胞からの組換えｒＭＡｂ ３Ｆ６の精製用の発現ベクター中にクローニングした（１４６）。ｈＭＡｂ３Ｆ６とｒＭＡｂ ３Ｆ６の両方が、５種のＳｐＡ ＩｇＢＤ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣ）のそれぞれの三重らせん折り畳みに結合し、ヒトＩｇＧまたはＩｇＭに結合するその能力を中和する（８４、１４６）。ｈＭＡｂ３Ｆ６またはｒＭＡｂ ３Ｆ６の５ｍｇ／ｋｇの用量での静脈内投与は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）血流感染関連腎膿瘍形成および細菌複製（細菌負荷）からＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する（８４、１４６）。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｒＭＡｂ ３Ｆ６（５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与すると、前定着動物の上咽頭および消化管からのＳ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１脱定着を誘導する（１４６）。ここで発明者らは、モノクローナル抗体が導き出されてきた同族抗原であるＳｐＡ_ＫＫＡＡに類似する親和性で、ｒＭＡｂ ３Ｆ６がＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}に結合するのかどうかを問うた（８４）。ｒＭＡｂ ３Ｆ６のリガンドおよび段階希釈物の固定濃度でＥＬＩＳＡにより測定した場合、発明者らは、ＳｐＡワクチン候補への結合についてのＳｐＡ_ＫＫＡＡ（Ｋ_ａ １．５１×１０^１０Ｍ^－１）、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}（Ｋ_ａ １．４２×１０^１０Ｍ^－１）およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}（Ｋ_ａ １．３４×１０^１０Ｍ^－１）の親和定数を引き出した（図２６）。これらのデータは、アミノ酸置換Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３ＴｈｒがＳｐＡ中和ｒＭＡｂ ３Ｆ６の結合に影響を与えないことを示唆している。さらに、アミノ酸置換Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３Ｔｈｒは、ｒＭＡｂ ３Ｆ６の結合により定義される保護的ＳｐＡエピトープを破壊しない。

【0355】

考察
発明者らは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ワクチン候補であるＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ－ＫＲが、ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ）_２断片をリガンドとして使用した場合、Ｖ_Ｈ３イディオタイプ免疫グロブリンへの有意な結合を保持することをここで明らかにしている。Ｖ_Ｈ３－ＩｇＧで被覆されたヒトマスト細胞（ＬＡＤ２細胞）を用いて分析した場合、β－ヘキソサミニダーゼおよびヒスタミンの放出により測定すると、ＳｐＡ_ＫＫＡＡおよびＳｐＡ－ＫＲはＶ_Ｈ３－Ｉｇ架橋の引き金を引く（１４５）。アナフィラキシー血管透過性亢進のマウスモデルでは、そのようなヒスタミン放出の生物学的効果は、μＭＴマウスにおけるＶ_Ｈ３－ＩｇＧ投与の解剖学的部位でエバンスブルー色素血管外漏出として測定可能であった。まとめると、これらの知見は、ヒトにおけるアナフィラキシー反応の潜在的活性化因子としてのＳｐＡワクチン候補の安全性についての懸念をもたらす。

【0356】

ＳｐＡワクチンへの懸念に取り組むため、発明者らは、改善された安全性プロファイルを有する２種の新たな抗原、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}を操作により作製した。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}は、Ｖ_Ｈ３イディオタイプ免疫グロブリンに対する親和性を欠き、Ｖ_Ｈ３－ＩｇＥ被覆ヒトマスト細胞からのヒスタミン放出に対して減少した活性を示すまたは活性を全く示さず、μＭＴマウスにおけるＶ_Ｈ３－ＩｇＧ注射への応答でエバンスブルー色素血管外漏出を促進しない。ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化すると、ＳｐＡ_ＫＫＡＡに類似するレベルのＳｐＡ特異的ＩｇＧ応答を誘発した。マウスモデルでワクチン有効性について分析すると、ＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}またはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}でのワクチン接種は、Ｓ．アウレウス（S.aureus）定着または侵襲性血流感染に対してＳｐＡ_ＫＫＡＡワクチンに類似するレベルの保護を与えた（４３）。さらに、アミノ酸置換Ｓｅｒ^３３ＧｌｕおよびＳｅｒ^３３Ｔｈｒは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）定着－および侵襲性疾患保護モノクローナル抗体３Ｆ６により定義される保護的ＩｇＢＤエピトープを乱さない（８４、１４６）。これらの知見に基づいて、発明者らは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）ワクチン候補であるＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}およびＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}が、Ｓ．アウレウス（S.aureus）定着および侵襲性疾患に対する臨床安全性および有効性試験用の臨床グレードワクチンとしての開発に適している可能性があると仮定している。

【0357】

材料および方法
細菌株および増殖条件。Ｓ．アウレウス（S.aureus）株ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）およびＷＵ１は３７℃でトリプシンソイブロス（ＴＳＢ）またはトリプシンソイ寒天（ＴＳＡ）において増殖させた。大腸菌（Escherichia coli）株ＤＨ５αおよびＢＬ２ｌ（ＤＥ３）は、組換えタンパク質の産生のために１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭのイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を有する溶原性ブロス（ＬＢ）培地において３７℃で増殖させた。

【0358】

ＳｐＡバリアントの構築。ＳｐＡバリアントのコード配列はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃにより合成された。配列およびプラスミドｐＥＴ１５ｂ＋は、それぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化した。次に、２つの消化された産物はライゲートされて大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α中に形質転換され、Ｎ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ付き組換えタンパク質を発現するクローンを生み出した。候補クローンはＤＮＡシーケンシングにより確かめられた。適切なプラスミドは、ＳｐＡバリアント候補の産生のために大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換された。

【0359】

タンパク質の精製。アンピシリンおよびＩＰＴＧを補充されたＬＢで６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００）２．０まで増殖させた大腸菌（E.coli）の培養物（２リットル）を遠心分離した（１０，０００×ｇで１０分間）。沈殿した細胞は緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に懸濁し、得られた懸濁液は１４，０００ｌｂ／ｉｎ^２のフレンチプレス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で溶解した。壊れていない細胞は遠心分離（５，０００×ｇで１５分間）により取り除き、粗溶菌液は超遠心分離（４℃、１００，０００×ｇで１時間）にかけた。可溶性組換えタンパク質は、緩衝液Ａで前平衡化された１ｍｌの充填容積を有するＮｉ－ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）上で重力流動によりクロマトグラフィーにかけた。カラムは、２０総容積の緩衝液Ａ、１０ｍＭのイミダゾールを含有する２０総容積の緩衝液Ａで洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールを含有する６ｍｌの緩衝液Ａで溶出させた。溶出画分のアリコートは等容積の試料緩衝液と混合し、１５％のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で分離させた。組換えタンパク質はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、その濃度はビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。動物での免疫化研究ではおよび細胞系と一緒のインキュベーションでは、組換えタンパク質調製物は、エンドトキシン除去スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）にかけて汚染ＬＰＳを除去した。試料純度は、トキシンセンサーＴＭ発色性ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて試験した。

【0360】

抗体の精製。ＶＨ３ ＩｇＧを精製するため、全ヒト血液を使用して調製したヒト血漿（２０ｍｌ）をプロテインＧ樹脂上の親和性クロマトグラフィー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）にかけて、ヒトＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡを取り除く。プロテインＧ樹脂から溶出した免疫グロブリンは、第２の親和性クロマトグラフィー、ＶＨ３ ＩｇＧについて濃縮するＳｐＡ_ｋｋ結合樹脂にかけた［ＳｐＡ_ｋｋはＩｇＧのＦｃγドメインに結合できない（４８）］。プロテインＧ樹脂およびＳｐＡ_ｋｋ結合樹脂は、２０カラム容積のＰＢＳおよび０．１ＭのグリシンｐＨ３．０で溶出させた結合タンパク質で洗浄し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和し、ＰＢＳに対して一晩透析した。ＶＨ３ ＩｇＥ精製では、ヒト細胞系ＨＥＫ２９３ＦをｐＶＩＴＲＯ１－トラスツズマブ－ＩｇＥ－κの一過性発現のために使用した。細胞は、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（５，０００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地で増殖させた。ＰＥＩを使用してｐＶＩＴＲＯ１－トラスツズマブ－ＩｇＥ－κをトランスフェクトした細胞は、５％ＣＯ_２雰囲気において３７℃でインキュベートした。ＩｇＥの安定な発現のため、細胞はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で７日間培養し、１２０００×ｇで２０分間収穫した。上澄みは、２ｍｌのプロテインＬ樹脂（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）上で精製した。樹脂は２０カラム容積のＰＢＳおよび０．１ＭのグリシンｐＨ３．０で溶出させた結合ＶＨ３ ＩｇＥで洗浄し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和し、ＰＢＳに対して一晩透析した。

【0361】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。表５、６、７および９に示されるＳＰＲ実験は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＨＴＧチップを用いてＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６上で実施した。泳動用緩衝液は０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を有するＰＢＳである。センサーチップ表面は、それぞれ２ｍＭの硫酸ニッケルで活性化し、３００ｍＭのＥＤＴＡで再生した。５００ｎＭの試験物（ＳｐＡ野生型およびバリアント）は流量２５μｌ／分で固定した。野生型ＳｐＡとの相互作用を測定するため、リガンド（精製免疫グロブリン）を５００、４００、３００、２００および１００ｎＭの濃度で使用した。ＳｐＡバリアントとの相互作用を測定するため、リガンドは４、３、２、１および０．５μＭの濃度で使用した。会合および解離速度は、３０μｌ／分の連続流量で測定し、二状態反応モデルを使用して分析した。会合定数は３つの独立した実験から決定した。

【0362】

バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）。表９に示されるＢＬＩ実験は、ＢＬＩｔｚバイオレイヤー干渉法を使用して実施した。試験候補（２５～５０ｎＭ）は、Ｎｉ－ＮＴＡセンサー上に１２０秒間固定した。センサーはＰＢＳで８０秒間平衡化し、２０、１５、１０、および０μＭの濃度でリガンドを含有する溶液中に１２０秒間浸漬し（会合段階）、続いてＰＢＳ中に１２０秒間浸漬した（解離段階）。データは、ＢＬＩデータ収集ソフトウェア９．０（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）を使用して取得し、データ解析ソフトウェア９．０．０．１４（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）を使用して解析した。報告された会合値は曲線フィットモデルから計算した。

【0363】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐ）に、精製した抗原を用いて、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中１μｇ／ｍｌで（試験血清中の抗体力価を測定するため）または０．５μｇ／ｍｌで（３Ｆ６抗体との相互作用を測定するため）４℃で一晩被覆した。ウェルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウスまたはヒトＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とのインキュベーションに先立って試験血清または３Ｆ６抗体でブロックし、インキュベートした。すべてのプレートは、マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体特異的（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートし、ＯｐｔＥＩＡ試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して現像した。最大半量力価はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。会合定数は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでの非線形回帰（曲線フィット）モデルから計算した。すべての実験は３通り実施して、平均および平均値の標準偏差を計算し、再現性のために繰り返した。

【0364】

μＭＴマウスでのアナフィラキシー応答。μＭＴ突然変異を有するマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、シカゴ大学で飼育した。群当たり５頭の生後６週間メスマウスのコホートは、Ｖ_Ｈ３ ＩｇＧ（２０μｌのＰＢＳ中２μｇ）の耳への皮内注射により感作し、２４時間後、ケタミン－キシラジン（１００ｍｇ～２０ｍｇ／ｋｇ）での麻酔下で右目の眼窩周囲静脈洞中にＰＢＳ、ＳｐＡまたはそのバリアント（１００μｌのＰＢＳ中２００μｇ）を静脈内注射した。試験物での５分間刺激に続いて、動物は左目の眼窩周囲静脈洞中に２％エバンスブルーを１００μｌ静脈内注射した。動物は死亡させ、耳を解体して、乾燥させ６５℃で２４時間ホルムアミド中に抽出した。耳組織でのエバンスブルーの血管外漏出（血管透過性）は、６２０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量化した。

【0365】

ヒト好塩基球活性化実験。血液（１０ｍｌ）は健康なドナーから入手し、直ちに１ｍｌのＥＤＴＡ ０．１Ｍ、ｐＨ７．５と混合した。ＳｐＡ野生型またはワクチン候補バリアント（１μｇ）またはＰＢＳを１ｍｌのＥＤＴＡ血液アリコートに添加し、試料は３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。試料アリコートは、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で処置し、遠心分離し（３５０×ｇ）、上澄みは破棄した。ペレット状の細胞は冷ＰＢＳで洗浄し、室温暗所での１０分間の抗ＣＤ１２３－ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ－ＤＡ－ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ６３－ＰＥ、および抗ＣＤ２０３ｃ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）での染色のために５％のＦＢＳを有するＰＢＳに再懸濁した。染色された試料はすべてＢＤ ＬＳＲＩＩ３－８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。全好塩基球数は、ＳＳＣｌｏｗ／ＣＤ２０３ｃ＋／ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ－ＤＲ細胞からゲート開閉することから得て、活性化された好塩基球はＣＤ６３＋ＣＤ２０３ｃ＋プールから選択された。実験は３通り実施し、異なる健康なドナーを使用して少なくとも３回繰り返した。

【0366】

マスト細胞脱顆粒。ヒトマスト細胞（ＬＡＤ２）［ＮＩＡＩＤのＤｒ．Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍにより快く提供された］は、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で一晩２×１０^５細胞を１００ｎｇのＶＨ３ ＩｇＥと一緒にインキュベートすることにより感作された。細胞は収穫され、０．０４％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄して、遊離のＩｇＥを取り除いた。細胞は同じ緩衝液に２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、βヘキソサミニダーゼおよびヒスタミン放出についてアッセイする前３０分間ＳｐＡまたは試験物で刺激した。細胞は沈降させ、使用済みの培地は新しいチューブに移し、ペレット状の細胞は０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で溶解した。使用済みの培地中のβヘキソサミニダーゼ活性、およびＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶解細胞は、発色性基質ｐＮＡＧ（Ｓｉｇｍａから入手したｐ－ニトロフェニル－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド、ｐＨ４．５で最終濃度３．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し９０分間おくことにより測定した。反応は、０．４ＭのグリシンｐＨ１０．７の添加によりクエンチし、λ＝４０５ｎｍでの吸光度を記録した。結果は、総量（使用済み培地＋ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶解細胞）に対する使用済みの培地中に放出されたβヘキソサミニダーゼの百分率として表された。実験は３通り実施し、少なくとも３回繰り返した。ヒスタミンはＥｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＳｐｉＢｉｏ Ｂｅｒｔｉｎ Ｐｈａｒｍａ）を使用して測定した。手短に言えば、マイクロタイタープレートのウェルをマウス抗ヒスタミン抗体で被覆し、実験抽出物と混合したトレーサー（ヒスタミンに連結されたアセチルコリンエステラーゼ）と一緒に２４時間インキュベートした。プレートは洗浄し、エルマン試薬（アセチルコリンエステラーゼ基質）をウェルに添加した。生成物形成は、４１２ｎｍでの吸光度を記録することにより検出した。４１２ｎｍでの吸光度はウェルに結合しているトレーサーの量に比例しており、実験抽出物中に存在するヒスタミンの量に反比例する。すべての試料は２通り実施した。

【0367】

マウスの能動免疫化。動物ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（生後３週間、メスマウス、群当たり１５動物）は、ＰＢＳ、または５対２対３の抗原対ＣＦＡ対ＩＦＡに乳化された５０μｇの精製無エンドトキシンタンパク質ＳｐＡ_ＫＫＡＡもしくはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}もしくはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}で免疫し、最初の免疫化の１１日後に１対１の抗原対ＩＦＡに乳化された５０μｇのタンパク質で追加免疫した。２０日目に、マウスは出血させ血清を収穫して、ＥＬＩＳＡによりワクチン候補に対する抗体力価を評価した。２１日目に、マウスは上咽頭定着のために接種するまたは細菌の静脈内注射により感染させた。

【0368】

マウス上咽頭定着。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＷＵ１株の一晩培養物を新鮮なＴＳＢに1対１００で希釈し、上記の通り３７℃で２時間増殖させた（１０２）。細胞は遠心分離し、洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。群当たり１０頭の免疫メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、ケタミン－キシラジン（１００ｍｇ～２０ｍｇ／ｋｇ）での腹腔内注射により麻酔をかけ、１×１０^８ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）（１０μｌ容積中）をピペットでそれぞれのマウスの右鼻腔中に移した。接種に続いて毎週の間隔で、マウスの中咽頭を綿棒で採取し、糞便試料は収集してＰＢＳ中でホモジナイズした。スワブ試料および糞便試料のホモジネートは、細菌数え上げのためにマンニット食塩寒天培地（ＭＳＡ）上に広げた。実験終了時、マウスは眼窩周囲静脈穿刺により出血させて、記載の通りスタフィロコッカス抗原マトリックスを使用して抗体応答分析用の血清を得た（４３）。手短に言えば、ニトロセルロース膜に２μｇの親和性精製スタフィロコッカス抗原をブロットした。膜は５％の脱顆粒牛乳でブロックし、希釈マウス血清（１対１０，０００希釈）およびＩＲＤｙｅ ６８０コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉ－ＣＯｒ）と一緒にインキュベートした。シグナル強度はＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像システム（Ｌｉ－ＣＯｒ）を使用して定量化した。動物実験はすべて２通り実施した。Ｓｉｄａｋ多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施して上咽頭および糞便定着、ＥＬＩＳＡおよび抗原マトリックスデータの統計的有意性を分析した。

【0369】

マウス腎膿瘍モデル。Ｓ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）の一晩培養物を新鮮なＴＳＢに1対１００で希釈し、３７℃で２時間増殖させた。スタフィロコッカス細胞は沈降させ、洗浄し、ＰＢＳに懸濁した。接種材料は、試料アリコートをＴＳＡ上に広げ、インキュベーションすると形成されたコロニーを数え上げることにより定量化した。ＰＢＳ中で調製された無エンドトキシンタンパク質ＳｐＡ_ＫＫＡＡもしくはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｅ}もしくはＳｐＡ_{Ｑ９，１０Ｋ／Ｓ３３Ｔ}で免疫したまたはモック免疫した（ＰＢＳ対照）１５頭のＢＡＬＢ／ｃマウスの群は麻酔をかけられ、５×１０^６ＣＦＵのＳ．アウレウス（S.aureus）ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）を右目の眼窩周囲静脈洞中に接種された。チャレンジに続く１５日目、マウスはＣＯ_２吸入により死亡させた。両腎臓を摘出し、１つの臓器中のスタフィロコッカス負荷は、腎組織をＰＢＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００でホモジナイズすることにより分析した。ホモジネートの段階希釈物をＴＳＡ上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートした。残りの臓器は組織病理学により調べた。手短に言えば、腎臓は室温で２４時間１０％のホルマリン中で固定した。組織はパラフィンに包埋し、薄切片に切り分け、ヘマトキシリンエオジンで染色し、光顕微鏡で視診して膿瘍病変を数え上げた。動物実験はすべて２通り実施され、統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍのｔ検定（およびノンパラメトリック検定）を用いて計算された。

【0370】

倫理声明。ヒトボランティア由来の血液を用いた実験は、シカゴ大学の施設内審査委員会（ＩＲＢ）により審査され、承認され、および監督されたプロトコルを用いて実施した。マウス実験はすべて、シカゴ大学の施設内バイオセーフティー委員会（ＩＢＣ）および施設内動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）による実験プロトコル審査および承認に続いて施設内ガンドラインに従って実施した。

【0371】

統計分析。図２２、２３、２５、および表５～１０では、ポストテスト（ボンフェローニまたはダネット多重比較検定）を用いた一元配置分散分析を使用して、複数の群の平均間の統計的有意性を導き出した。図２４では、Ｓｉｄａｋ多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施してマウス定着およびスタフィロコッカス抗原マトリックスデータの統計的有意性を分析した。すべてのデータは、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）により解析し、０．０５未満のＰ値は有意であると見なした。

【0372】

【表5】

【0373】

【表6】

【0374】

【表7】

【0375】

【表8】

【0376】

【表9】

【0377】

【表10】

【0378】

[実施例４]
手術創ミニブタ感染モデルを利用するＳｐＡバリアントポリペプチドおよびＬｕｋＡＢ二量体ポリペプチドを含む免疫原性組成物に起因する免疫応答。
実験の目標は、ＳｐＡバリアント抗原と突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体の組合せがゲッチンゲンミニブタでのＳ．アウレウス（S.aureus）手術創感染モデルで保護を与えるかどうかを評価することである。試験したＳｐａバリアント抗原（Ｓｐａ^＊）は配列番号６０のアミノ酸配列を有していた。試験した突然変異体ＬｕｋＡＢ二量体は、配列番号１６の３１５～３２４位に対応するアミノ酸残基の欠失がある突然変異体ＬｕｋＡポリペプチド、および配列番号５３のアミノ酸配列を含むＬｕｋＢポリペプチドを含む。

【0379】

ミニブタモデルを使用して、ワクチン候補の免疫原性（抗原特異的ＩｇＧの産生に関して）および有効性を評価する。ミニブタは、その免疫系ならびに臓器および皮膚構造が大部分ヒトの免疫系ならびに臓器および皮膚構造に類似しているので、感染性疾患研究に広く使用されてきた（１～５）。モデルでは、Ｓ．アウレウス（S.aureus）細菌での創傷の感染後、局所的感染が手術部位の筋肉および皮膚の層全体に発症し、他の内臓への播種も見られ、疾患の進行はヒトでの疾患の進行に高度に類似している。

【0380】

ＬｕｋＡＢは、ヒトＰＭＮに対して見られるミニブタ多形核好中球（ＰＭＮ）に類似する毒性を示すが、これは、毒素の標的の種特異性に起因するマウスまたはウサギＰＭＮに対する高度に減少した毒性とは対照的である。さらに、ブタがスタフィロコッカス種を頻繁に有するせいで、ミニブタはスタフィロコッカス抗原（ＬｕｋＡＢおよび他のＳ．アウレウス（S.aureus）タンパク質を含む）に対して高レベルの前から存在する抗体を持つことが多く、成人に類似しており大半の実験室齧歯類とは対照的である。したがって、このモデルは、特にＬｕｋＡＢおよびＳｐａバリアントを含有するワクチンに対して、以前利用可能であった齧歯類モデルよりも信頼できるヒトでの潜在的ワクチン保護の指標である可能性がある。

【0381】

Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
オスゲッチンゲンミニブタ（群当たり３頭のブタ）を、図２７に示されるスケジュールおよび以下の群に従って３週間の間隔で３回の離れた時期に筋肉内免疫した。
・ＬｕｋＡＢ（１００μｇ）＋アジュバント
・ＳｐＡバリアント（５０μｇ）＋アジュバント
・ＬｕｋＡＢ（１００μｇ）＋ＳｐＡバリアント（５０μｇ）＋アジュバント
・アジュバント単独

【0382】

ワクチンは、動物１頭当たりヒト用量の半分（動物１頭当たり２５μｇのＭＰＬ、および２５μｇのＱＳ－２１）を与えるためにＡＳ０１ｂアジュバントと一緒に処方した。

【0383】

ワクチン接種に続いて、ブタは臨床的に関連するＳ．アウレウス（S.aureus）株でチャレンジされた。感染後＋８日目、ブタは安楽死させ、手術部位（皮膚および筋肉）および内臓での細菌負荷を決定した。

【0384】

図２７に示すように、血液試料は、研究の開始に先立ってならびにワクチン接種および感染時期の間、等間隔を置いて採取した。血液および血清分析を実施して、血清免疫グロブリン量および機能ならびに感染および炎症のバイオマーカーの濃度を評価した。体温も、ワクチン反応原性および感染の読み出し情報としてルーチンにモニターした。

【0385】

研究の一次エンドポイントは、ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡバリアントをワクチン接種した動物における手術部位／臓器での細菌負荷（ＣＦＵ）の減少であった。単にＬｕｋＡＢ、ＳｐＡ、またはアジュバントだけを用いたワクチン接種は対照として使用される。

【0386】

結果
ミニブタでの２つの別々のｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施した。免疫スケジュールおよび免疫化群は、それぞれ図２７に示されるおよびセクション「Ｉｎ ｖｉｖｏ実験」に記載されるように、両研究で同一であった。一研究では、クローナルコンプレックス（ＣＣ）３８９に属するＳ．アウレウス（S.aureus）株を感染株として使用した。第２の研究では、ＣＣ８（ＵＳＡ３００）に属するＳ．アウレウス（S.aureus）株を感染株として使用した。株の特徴は表１１に記載されている。

【0387】

【表11】

【0388】

ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊に対して誘導される抗体応答
上記のミニブタの群は、ＬｕｋＡＢ（１００μｇ）＋アジュバント、またはＳｐＡ^＊（５０μｇ）＋アジュバント、またはＬｕｋＡＢ（１００μｇ）およびＳｐＡ^＊（５０μｇ）＋アジュバントの組合せを３回の時期に３週間離して免疫した。動物の対照群はアジュバントのみで免疫した。動物は３番目の免疫化の３週間後にＳ．アウレウス（S.aureus）を用いてチャレンジした。血液試料は、それぞれの免疫化前に、チャレンジ前に、およびチャレンジ後８日目まで等間隔を置いて採取し（図２７）、ＥＬＩＳＡによりＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊に対する抗体応答について分析した。チャレンジ後の試料採取の間隔が短かったせいで、チャレンジ後８日目の結果のみが図２８に示されている。アジュバントのみで免疫した動物では、低レベルの抗ＬｕｋＡＢ ＩｇＧ抗体が測定可能であり、ＬｕｋＡＢに対して前から存在する抗体の存在を示していた（図２８ＡおよびＣ）。ＳｐＡ^＊＋アジュバントでの免疫化は、抗ＬｕｋＡＢ抗体のアジュバント対照群に類似する幾何平均力価をもたらした（図２８）。ＬｕｋＡＢ＋アジュバントまたはＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントでのミニブタの免疫化は、３種（０日目）の免疫化後の両研究でのアジュバント対照群と比べて高い幾何平均抗ＬｕｋＡＢ ＩｇＧ力価をもたらした（図２８、研究１，０日目の幾何平均（ＧｅｏＭｅａｎ）力価：ＬｕｋＡＢ＋アジュバント：２２２；ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバント：３０８；アジュバント群：３２、Ｐ＞０．０５；研究２、０日目のＧｅｏＭｅａｎ力価：ＬｕｋＡＢ＋アジュバント：１２７１；ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバント：１６７１；アジュバント群：１５９、Ｐ＝０．０１８１およびＰ＝０．０１０３、それぞれ対アジュバント群）。これらの結果は、ＬｕｋＡＢ含有ワクチンでの免疫化がミニブタにおいてＬｕｋＡＢ特異的ＩｇＧ抗体の産生を誘導したことを示している。抗ＬｕｋＡＢ抗体のレベルは、ＬｕｋＡＢ＋アジュバントまたはＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントでワクチン接種した動物の場合と類似していた。これは、ＳｐＡ^＊の追加がＬｕｋＡＢに対する応答に干渉しなかったことを示している。

【0389】

アジュバントのみまたはＬｕｋＡＢ＋アジュバントで免疫したミニブタは、いかなる時点でもＳｐＡ^＊に対する測定可能な抗体はなかった。ＳｐＡ^＊＋アジュバントまたはＳｐＡ^＊＋ＬｕｋＡＢ＋アジュバントは、３種の免疫化後抗ＳｐＡ^＊ ＩｇＧの有意な増加を誘導した（研究１：ＳｐＡ^＊＋アジュバント群でのＧｅｏＭｅａｎ ＩｇＧ：２１７およびＳｐＡ^＊＋ＬｕｋＡＢ＋アジュバント群でのＧｅｏＭｅａｎ ＩｇＧ：２６８；研究２：ＳｐＡ^＊＋アジュバント群でのＧｅｏＭｅａｎ ＩｇＧ：１００およびＳｐＡ^＊＋ＬｕｋＡＢ＋アジュバント群でのＧｅｏＭｅａｎ ＩｇＧ：７１）。これらの結果は、ＳｐＡ^＊＋アジュバントおよびＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントワクチンによるＳｐＡ^＊特異的抗体の誘導を示している。抗ＳｐＡ^＊抗体のレベルは、ＳｐＡ^＊＋アジュバントまたはＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントで免疫した動物の場合と類似していた。これは、ＬｕｋＡＢの追加によるＳｐＡ^＊への応答に干渉がなかったことを示している。

【0390】

ＬｕｋＡＢ毒素の細胞障害活性の中和
ＬｕｋＡＢは好中球上の受容体に結合する毒素であり、そこでＬｕｋＡＢは膜にポアを形成し、その結果細胞は溶解する。試験ワクチンにより誘導される抗体の機能性を評価するため、ＴＨＰ－１細胞のＬｕｋＡＢ毒素誘導溶解を阻害するワクチン接種されたミニブタ由来の血清の能力を測定した。アッセイでの野生型ＬｕｋＡＢ毒素はクローナルコンプレックスＣＣ８由来であり、これはワクチンで使用されるＬｕｋＡＢクローナルコンプレックス（ＬｕｋＡＢ ＣＣ８デルタ１０Ｃ）に相同である。アジュバントのみでワクチン接種したミニブタでは、バックグラウンドＩＣ_５０力価が検出可能であった（研究１：０日目ＧｅｏＭｅａｎＩＣ_５０＝９５；研究２：０日目ＧｅｏＭｅａｎＩＣ_５０＝３６３）。ＬｕｋＡＢ＋アジュバントまたはＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントでワクチン接種した動物では、３種の免疫化後有意に高いＧｅｏＭｅａｎＩＣ_５０力価が測定された（３種の免疫化後チャレンジ前のＧｅｏＭｅａｎＩＣ_５０力価：研究１：ＬｕｋＡＢ＋アジュバント：１４７５；ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバント：１６４３ Ｐ＞０．０１２およびＰ＝０．０１対アジュバント群；研究２：ＬｕｋＡＢ＋アジュバント：１９３１；ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバント：１７１７；それぞれＰ＝０．００２２および０．００３２対アジュバント群）。図２９Ａおよび２９Ｂに示されるこれらの結果は、ワクチン中のＬｕｋＡＢが、ＬｕｋＡＢ毒素の細胞障害活性をブロックする機能的な抗体を誘導することを示している。

【0391】

ミニブタ手術創感染モデルでの有効性
ワクチンの有効性を試験するため、３種の免疫化およびＳ．アウレウス（S.aureus）を用いたチャレンジ後、筋肉および脾臓中のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数を決定した。２種の異なるチャレンジ株を２つの研究で使用し、１つはクローナルコンプレックスＣＣ３９８に属し、第２はクローナルコンプレックスＣＣ８由来のＵＳＡ３００株であった。アジュバントのみの免疫化では、ＣＣ３９８株を用いたチャレンジ後全筋肉中に高レベルのｃｆｕがもたらされた（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝６．０５）。ＬｕｋＡＢ＋アジュバント（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝３．２５、Ｐ＝０．００３６）、ＳｐＡ^＊＋アジュバント（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝３．２２、Ｐ＝０．００３）またはＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントの組合せ（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝２．６６、Ｐ＝０．００１２）での免疫化は、アジュバント群と比べて筋肉中でｃｆｕは有意に減少した（図３０Ａ）。脾臓でも、アジュバントのみで免疫された対照群では高レベルのｃｆｕが観察された（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／脾臓ｇ＝２．２６）。ＬｕｋＡＢ＋アジュバントおよびＳｐＡ^＊＋アジュバントでの免疫化は、脾臓においてｃｆｕの減少をもたらした（それぞれＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／脾臓ｇ＝０．２９および０．７８、Ｐ＞０．０５）。動物をＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントの組合せで免疫した場合、脾臓において定量化の下限までのｃｆｕの有意な減少が検出された（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／脾臓ｇ＝０．２、Ｐ＝０．０４２４）（図３０Ｂ）。結果は、試験ワクチンがミニブタ手術部位感染モデルにおいて有効であることを示している。ワクチンは脾臓のような臓器への細菌の蔓延も減らし、そこではＬｕｋＡＢとＳｐＡ^＊の組合せは単一抗原と比べて優れた保護を示した。

【0392】

ミニブタをアジュバントのみで免疫した場合、ＵＳＡ３００株でのチャレンジ後全筋肉中で非常に多数のｃｆｕが検出された（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝５．４８）。アジュバント群と比べて筋肉中のｃｆｕの減少は、ＬｕｋＡＢ＋アジュバント（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝３．３７、Ｐ＞０．０５）およびＳｐＡ^＊＋アジュバント（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝２．８４）での免疫化後に観察された。動物をＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントの組合せで免疫化した場合、アジュバント群と比べて筋肉中のｃｆｕの有意な減少が検出され（ＧｅｏＭｅａｎ ｌｏｇ_１０ ｃｆｕ／筋肉ｇ＝１．８６、Ｐ＝０．０１９８）、ＬｕｋＡＢとＳｐＡ^＊の組合せが単一抗原と比べてＵＳＡ３００株に対して優れた保護を示すことが示唆される（図３０Ｃ）。脾臓では、一般的に、群間で有意差のない低レベルのＣＣ８ ＵＳＡ３００株が検出された（図３０Ｄ）。まとめると、手術創感染モデルデータは、ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊を含むワクチン組合せが、２種の臨床的に関連する株、ＳＴ３９８およびＣＣ８ ＵＳＡ３００でのチャレンジに対してミニブタの筋肉において有意な保護を提供したことを示している。

【0393】

材料および方法
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定されるＬｕｋＡＢおよびＳｐＡに対する抗体応答 ＬｕｋＡＢに対するＩｇＧ抗体レベルを測定するため、９６ウェルマキシソーププレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌのＬｕｋＡＢ ＣＣ８で被覆し、２～８℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０での洗浄後、２．５％の脱脂乳でプレートをブロックし、洗浄し、１対１００で開始して希釈緩衝液（１×ＰＢＳ中２．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳）で調製した血清の段階３倍希釈液をウェルに添加した。プレートは室温で１時間インキュベートし、洗浄し、１対２０，０００に希釈した抗ブタＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。室温での１時間のインキュベーション後、プレートはＴＭＢ基質（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で現像した。反応は１Ｍの硫酸を添加することにより停止させた。吸光度は４５０ｎｍで読み取り、ＥＣ_５０値はＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｖ８．４．２の４－ＰＬ（４パラメータロジスティック回帰分析）カーブフィッティングを使用して計算した。

【0394】

ＳｐＡに対する抗体を測定するため、９６ウェルマキシソーププレートをＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌ ＳｐＡ^＊で被覆し、２～８℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、ブロッキング緩衝液中１対４０，０００希釈の抗ブタＩｇＧ－ＨＲＰであった。その他のステップは、抗ＬｕｋＡＢ抗体応答の測定について上に記載される通りであった。ダネット多重比較検定を用いた一元配置分散分析を実施して、ワクチン群対アジュバント群の幾何平均間の統計的有意性を試験した。

【0395】

ＬｕｋＡＢ毒素中和アッセイ。Ｃｙｔｏ－Ｔｏｘ－Ｏｎｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、損傷した膜を有する細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定した。ＴＨＰ－１細胞は遠心分離し、ＲＰＭＩで２×１０^６細胞／ｍＬの密度まで再懸濁した。５０μＬの細胞を、血清の段階３倍希釈液を含有する９６ウェル培養プレートに添加した。ＬｕｋＡＢ毒素ＣＣ８を最終濃度４０ｎｇ／ｍＬまで試験ウェルに添加した。溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を溶解コントロールウェルに添加した。プレートは５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で２時間インキュベートした。プレートは遠心分離し、２５μＬの上澄みを新たなプレートに移し、２５μＬのＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。プレートは室温で１５分間インキュベートし、停止液（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加した。プレートは、５６０の励起波長および５ｎｍの帯域幅ならびに５９０の発光波長および１０ｎｍの帯域幅を有するモノクロのＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ ２読取機で読み取った。ゲインは１２０～１３０で設定されている。ダネット多重比較検定を用いた一元配置分散分析を実施して、ワクチン群対アジュバント群の幾何平均間の統計的有意性を試験した。

【0396】

ミニブタ手術創感染方法 生後５～８カ月オスゲッティンゲンミニブタ（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｏｓｅ、ＮＹ）は群飼いし、１２時間明／暗サイクルに維持して水は自由に飲ませた。手術の朝、絶食させたミニブタを鎮静させ、挿管し、手術の期間はイソフルラン麻酔下に置いた。手術は左大腿で実施し、それにより筋層を露出させ、５ｍｍのブレードレストロカール（Ｅｎｄｏｐａｔｈ（登録商標）Ｘｃｅｌ、Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｅｎｄｏ－Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｇｕａｙｎａｂｏ、Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ）を大腿部の深部まで進めた。２０μｌの接種材料（おおよそ６ ｌｏｇ_１０ＣＦＵ／Ｓ．アウレウス（S.aureus）ｍｌ）を、トロカールを通して６インチＭＩＬＡクモ膜下穿刺針（Ｍｉｌａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｆｌｏｒｅｎｃｅ、ＫＹ）により創傷内（大腿部の上部）に注射し、その後トロカールは除去した。筋肉は単一の絹縫合糸で閉じ、皮膚は吸収性ＰＤＳ縫合糸で閉じた。鎮静状態にある間の８日後、ミニブタはバルビツレートで安楽死させた。死亡が確認された後、臓器は微生物学のために別々に処理された。試料は、ビーズ粉砕機Ｅｌｉｔｅ（Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｋｅｎｎｅｓａｗ、ＧＡ、ＵＳＡ）を使用して、生理食塩水中でホモジナイズし、希釈して、Ａｕｔｏｐｌａｔｅ５０００スパイラルプレート（Ｓｐｉｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してＴＳＡ上に蒔いた。プレートは３７℃で１８～２４時間インキュベートし、次に、ＱＣｏｕｎｔコロニーカウンター（Ｓｐｉｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で読み取った。

【0397】

ダネット多重比較検定を用いた一元配置分散分析を実施して、複数の群の幾何平均間の統計的有意性を試験した。すべての動物研究は、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ施設内動物管理および使用委員会により審査されて承認され、ＡＡＡＬＡＣ認定施設に収容された。

【0398】

結論 抗原ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊をアジュバントと一緒に含有するワクチン組成物は、ミニブタ手術創感染モデルにおいてＬｕｋＡＢおよびＳｐＡ^＊に対するＩｇＧの産生を誘導することが本明細書で明らかにされた。抗ＬｕｋＡＢ ＩｇＧ抗体の増加は、ＬｕｋＡＢ毒素の細胞障害活性の中和の増加と関連しており、これは誘導されたＩｇＧ抗体が機能的であることを示すものである。ワクチン組成物の有効性を試験するため、ミニブタ手術創感染モデルにおいて細菌負荷を減らすワクチンの能力は、２種の遺伝的に異なり臨床的に関連するＳ．アウレウス（S.aureus）株を使用して判定した。ＬｕｋＡＢ＋ＳｐＡ^＊＋アジュバントワクチン組成物でのミニブタの免疫化により、両試験株でのチャレンジ後筋肉中のコロニー形成単位の数が有意に減少した。ワクチン組成物は、脾臓でも試験株のチャレンジでｃｆｕの有意な減少ももたらした。したがって、ＬｕｋＡＢおよびＳｐＡトキソイド突然変異体ならびにアジュバントを含有するＳ．アウレウス（S.aureus）ワクチン候補は、ミニブタ手術部位感染モデルにおいて深在性Ｓ．アウレウス（S.aureus）感染および播種からの効果的な保護をもたらした。

【0399】

上に記載する実施形態には、その広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることは当業者であれば認識する。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないことが理解されるが、本発明は本記載により定義される本発明の精神および範囲内の改変を包含することが意図されている。

【0400】

参考文献
以下の参考文献は、それが例となる手続き上の詳細または本明細書で示される詳細を補う他の詳細を提供する程度まで、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

【0401】

【表12-1】

【0402】

【表12-2】

【0403】

【表12-3】

【図1A-1E】

【図2A-2B】

【図3A-3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A-7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A-9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A-17B】

【図18A-18B】

【図19A-19B】

【図20A-20B】

【図21A-21B】

【図22】

【図23A-23B】

【図24A-24C】

【図24D-24E】

【図25A-25C】

【図26A-26C】

【図27】

【図28A-28D】

【図29A-29B】

【図30A-30D】

【配列表】

2022550884000001.app

【国際調査報告】