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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】ｃｉｒｃＲＮＡを検出する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221128BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20221128BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20221128BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221128BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12Q1/6883 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520825
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(85)【翻訳文提出日】2022-06-03
(86)【国際出願番号】 US2020054123
(87)【国際公開番号】W WO2021067850
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,316
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】597025806
【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】クルチャガ，カルロ
(72)【発明者】
【氏名】デュベ，アンバー
(72)【発明者】
【氏名】イバネス，ラウラ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX01
(57)【要約】
本開示は、対象の生物学的試料中のｃｉｒｃＲＮＡを検出または測定する方法に関する。特に、本開示は、対象におけるアルツハイマー病などの神経疾患、神経変性疾患、または神経病理学的疾患を診断するための方法を対象とし、前記対象の生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡレベルを決定する工程を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるアルツハイマー病を検出するための方法であって、ａ）対象から得られた生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
ｂ）少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、所定の参照レベルと比較することであって、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、それぞれの参照値を上回るか、またはこれを下回る場合、対象が、ＡＤを発症する危険性がある無症状性個体であると決定されること
を含む方法。
【請求項2】
アルツハイマー病（ＡＤ）を発症する危険性がある無症状性対象を検出するための方法であって、ａ）対象から得られた生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
ｂ）少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、所定の参照レベルと比較することであって、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、それぞれの参照値を上回るか、またはこれを下回る場合、対象が、ＡＤを発症する危険性がある無症状性個体であると決定されること
を含む方法。
【請求項3】
対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）または認知症への転換の危険性が増大している対象として診断する方法であって、ａ）対象から得られた生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
ｂ）少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、所定の参照レベルと比較することであって、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、それぞれの参照値を上回るか、またはこれを下回る場合、対象が、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）または認知症への転換の危険性が増大している対象であると決定されること
を含む方法。
【請求項4】
対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する認知症を有する対象として診断する方法であって、ａ）対象から得られた生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
ｂ）少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、所定の参照レベルと比較することであって、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、それぞれの参照値を上回るか、またはこれを下回る場合、対象が、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する認知症を有する対象であると決定されること
を含む方法。
【請求項5】
対象におけるＡＤ疾患の進行をモニタリングする方法であって、ａ）対象についての第１の生物学的試料を得、後の時点において、対象についての第２の生物学的試料を得ること；
ｂ）第１の生物学的試料中および第２の生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
ｃ）第２の生物学的試料からの、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、第１の生物学的試料からのｃｉｒｃＲＮＡと比較することであって、第２の試料からの、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、第１の試料からの、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを上回るか、またはこれを下回る場合、対象で、疾患の進行が増大していると決定されること
を含む方法。
【請求項6】
少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１を測定することが、試料を、配列番号１および２のプライマー対と接触させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＮＭ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、およびｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡを測定することが、生物学的試料を、配列番号１～２、配列番号３～４、配列番号５～６、配列番号７～８、配列番号９～１０、配列番号１１～１２、配列番号１３～１４、配列番号１６～１５、配列番号１７～１８、および配列番号１９～２０から選択されるプライマー対と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＡＤＧＲＢ３、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
対象が、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６が、参照値と比べて増大しており、かつ／またはｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６のうちの１つまたは複数が、参照値と比べて減少している場合に、疾患状態または疾患重症度を伴うと分類される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＡＤを有するか、またはＡＤを有することが疑われる対象を処置する方法であって、対象において、ａ）対象から得られた生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを測定すること；
ｂ）少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、所定の参照レベルと比較すること；および
ｃ）対象へと、医薬組成物を投与して、工程ａ）において測定された、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現を是正するか、または安定化させること
を含む方法。
【請求項13】
少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＮＭ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、およびｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡが、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＡＤＧＲＢ３、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
医薬組成物が、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ-メチルＤ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤、ガンマ-セクレターゼ阻害剤、ベータ-セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、セロトニン受容体６アンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動性免疫療法、能動性ワクチン、タウタンパク質凝集阻害剤、抗炎症性薬剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ-１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断剤、ＣＢ１エンドカンナビノイド受容体パーシャルアゴニストおよび／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体パーシャルアゴニスト、β-２アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５-ＨＴ２Ａインバースアゴニスト、アルファ-２ｃアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、５-ＨＴ １Ａ受容体アゴニストおよび５-ＨＴ １Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、ＰＰＡＲ-ガンマアゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、カルシウムチャネル遮断剤、降圧剤、スタチン、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
従来の直鎖状ｍＲＮＡ解析を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
生物学的試料が、体液、血液、脳組織、ＣＳＦ、または血漿である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において組み込まれる、２０１９年１０月２日に出願された、米国特許仮出願第６２／９０９，３１６号の利益を主張する。
本出願は、参照によりその全体において組み込まれる、２０１９年１０月２日に出願された、米国特許仮出願第６２／９０９，３１６号の利益を主張する。
【0002】
技術分野
本開示は、一般に、対象の生物学的試料中の、環状ＲＮＡの検出のための方法に関する。
本開示は、一般に、対象の生物学的試料中の、環状ＲＮＡの検出のための方法に関する。
【0003】
配列表について言及
本出願は、ＥＦＳ-Ｗｅｂを介して、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２０年９月２９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、「６６７５９５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられており、３．８６ＫＢのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ-Ｗｅｂを介して、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２０年９月２９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、「６６７５９５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられており、３．８６ＫＢのサイズである。
【背景技術】
【0004】
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）とは、転写物の３’末端が、５’末端と、共有結合的にスプライシングされ、これにより、連続ループを形成するバックスプライシングイベントから生じるＲＮＡのクラスである。ＲＮＡシーケンシングが、広範になされるようになるにつれて、真核生物にわたり、数千に及ぶｃｉｒｃＲＮＡが同定されている。これらの研究は、ｃｉｒｃＲＮＡが、神経系において高度に発現され、シナプスにおいてエンリッチされていることを見出した。脳内において、ｃｉｒｃＲＮＡの発現は、直鎖状転写物の発現から独立に生じる場合があり、遺伝子の、最も高度に発現されるアイソフォームでありうる。脳内のｃｉｒｃＲＮＡはまた、発生時にも調節され、ニューロンの興奮に応答しても調節される。老化マウスおよびハエの脳において、ｃｉｒｃＲＮＡは、おそらく、エクソヌクレアーゼに対する耐性を付与する遊離ヒドロキシル末端を欠くために、蓄積される。ｃｉｒｃＲＮＡ生物学に関しては、多くが未知にとどまる；例えば、ｃｉｒｃＲＮＡが、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において翻訳されうることが裏付けられたのは、ごく近年である。したがって、ｃｉｒｃＲＮＡについて、はるかによく確立された役割は、機能の喪失をもたらす隔離を介する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の調節である。
【0005】
アルツハイマー病（ＡＤ）とは、世界中において、数百万人に影響を与える、進行性、神経変性の障害であり、認知症の、最も一般的な原因である。ＡＤは、神経病理学的に、劇的な認知機能障害を結果としてもたらす、アミロイドベータプラークおよびタウ封入体の蓄積の他、広範なニューロンの萎縮により特徴づけられる。残念ながら、現在のところ、ＡＤに有効な、予防的治療、緩和的治療、または治癒的治療は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、当技術分野において、神経変性障害の処置時およびケア時の意思決定過程において、医師および患者を誘導するのに、迅速で、実践的かつ信頼できる検査が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の多様な態様の中には、対象の生物学的試料中または体液中のｃｉｒｃＲＮＡを検出または測定する方法の提示がある。したがって、略述すると、本開示は、対象の体液中の、神経疾患、神経変性疾患、または神経病理学的疾患と関連するｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程を対象とする。
【0008】
本開示の態様は、環状ＲＮＡの示差的発現（ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥ）を測定する方法を提示する。一部の実施形態において、方法は、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程を含む。一部の実施形態において、トランスクリプトームワイドの解析は、特異的な転写物レベルの定量、および疾患状態を予測する、一連のカスタムのアルゴリズムおよび方法を含む解析を含む。
【0009】
一部の実施形態において、方法は、判定法およびフィルタリング法を使用して、バックスプライスジャンクションを同定する工程；ならびに／またはバックスプライスジャンクションを、バックスプライスジャンクションについてアノテーションされた、元の直鎖状遺伝子またはコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡへとコラプシングする工程を含む。
【0010】
一部の実施形態において、方法は、元の直鎖状遺伝子についてのアノテーションを伴わないバックスプライスを除外する工程を含む。一部の実施形態において、方法は、生物学的試料中のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを決定するステップ；および／または統計学的解析を実施して、未知の神経病態を有する対象と、対照との間の、発現レベルの定量的変化を決定する工程を含む。一部の実施形態において、方法は、生物学的試料から、ｒＲＮＡを枯渇させる工程を含む。
【0011】
一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥの測定値が、対照と比較して減少していれば、対象は、神経疾患または神経変性疾患を伴うと診断される。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥの測定値が、対照と比較して減少していれば、対象の疾患重症度は、悪化している。
【0012】
一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥの測定値が、対照と比較して増大していれば、対象は、神経疾患または神経変性疾患を伴うと診断される。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥの測定値が、対照と比較して増大していれば、対象の疾患重症度は、悪化している。
【0013】
一部の実施形態において、方法は、対象における神経病理学的疾患の重症度を決定する工程を含む。一部の実施形態において、対象は、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する。一部の実施形態において、生物学的試料は、体液、血液、脳組織、ＣＳＦ、または血漿である。一部の実施形態において、対象は、臨床的認知症を有さない。一部の実施形態において、対象は、症状性である。一部の実施形態において、対象は、前症状性または無症状性である。
【0014】
一部の実施形態において、方法は、疾患重症度に基づき、対象を層別化する工程を含む。一部の実施形態において、方法は、疾患の進行または疾患重症度をモニタリングする工程を含む。一部の実施形態において、対象は、神経疾患または神経変性疾患を有する。一部の実施形態において、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症、パーキンソン病型認知症、およびレビー小体認知症から選択される。
【0015】
一部の実施形態において、神経変性疾患は、ＡＤ、臨床的認知症、または神経病理学的疾患から選択される。一部の実施形態において、プライマー対は、とりわけ、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、およびｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１のうちの１つまたは複数のバックスプライスジャンクションを増幅するために使用される。
【0016】
一部の実施形態において、検出されるｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１である。一部の実施形態において、プライマー対は、配列番号１～２０からなる群から選択される。一部の実施形態において、対照は、神経変性疾患または神経病理学的（ｎｅｕｒｏｌｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ）疾患を伴わない対象に由来する生物学的試料である。
【0017】
本開示の別の態様は、神経疾患、神経変性疾患、または神経病理学的疾患と関連するｃｉｒｃＲＮＡを同定する方法を提示する。
【0018】
一部の実施形態において、方法は、神経疾患、神経変性疾患、または神経病理学的疾患を有することが知られている対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料からｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；および／またはｃｉｒｃＲＮＡを、疾患状態と相関させる工程を含む。
【0019】
本開示の別の態様は、疾患状態と関連するｃｉｒｃＲＮＡを同定する方法であって、疾患状態を伴う対象に由来する生物学的試料のＲＮＡ配列を含む発見（疾患状態）データセットを生成するか、またはこれが用意されている工程；対象に由来する生物学的試料のＲＮＡ配列を含む再現データセットを生成するか、またはこれが用意されている工程；疾患状態の形質または表現型を同定する工程；発見データセット内および／もしくは再現データセット内の形質または表現型を処理する工程；発見データセットおよび／もしくは再現データセットを処理およびアライメントする工程；発見データセット内および／もしくは再現データセット内のｃｉｒｃＲＮＡを規定するバックスプライスを判定する工程；アノテーションされたバックスプライスをフィルタリングおよびコラプシングして、発見データセット内および／もしくは再現データセット内の高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡを同定する工程；発見データセット内および／もしくは再現データセット内の直鎖状転写物を判定する工程；転写物完全性数を測定する工程；ならびに／または示差的発現および高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡカウントと、疾患の形質もしくは表現型との相関を解析する工程を含む方法を提示する。
【0020】
一部の実施形態において、方法は、従来の直鎖状ｍＲＮＡ解析を含む。本開示の別の態様は、前出の方法のうちのいずれかを実施することが可能なデバイスを含むシステムを提示する。
【0021】
ある態様において、本開示は、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）または認知症への転換の危険性が増大している対象として診断する方法を包含する。方法は、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程を含む。
【0022】
別の態様において、本開示は、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する認知症を有する対象として診断する方法を包含する。方法は、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程を含む。
【0023】
別の態様において、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状の発生の後において、対象を病期分類する方法を包含する。方法は、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程を含む。
【0024】
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法を包含する。方法は、（ａ）生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程；ならびに（ｂ）測定されたｃｉｒｃＲＮＡのＤＥおよび／またはｃｉｒｃＲＮＡの発現署名が、対照参照値と比べて、前症状性または症状性のＡＤを指し示す場合に、医薬組成物を、対象へと投与する工程を含む。
【0025】
別の態様において、本開示は、対象を、臨床試験へと登録するための方法を包含する。方法は、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；生物学的試料から、ｃｉｒｃＲＮＡを抽出する工程；トランスクリプトームワイドの解析を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程；および／または測定されたｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現（ＤＥ）を決定する工程；ならびに測定されたｃｉｒｃＲＮＡのＤＥおよび／またはｃｉｒｃＲＮＡの発現署名が、対照参照値と比べて、前症状性または症状性のＡＤを指し示す場合に、対象を、臨床試験へと登録する工程を含む。
【0026】
他の目的および特色は、部分的に明らかであり、本明細書の以下において、部分的に指摘されるであろう。
【0027】
本出願のファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を伴う本特許出願公開のコピーは、その旨を依頼し、必要な費用を支払えば、特許庁により支給される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】図１は、大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤ形質と関連することを示す。各円形マンハッタンプロットは、発見（頭頂葉皮質）データセットおよび再現［下前頭回（ＢＭ４４）］データセットによるｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ関連結果についてのメタ解析からの結果を提示する。円形プロットの、最も外側から、最も内側の順に、ＡＤ形質は、ＣＤＲ、Ｂｒａａｋスコア、およびＡＤ症例／対照状態（ＡＤ症例）を含む。研究ワイドの有意性閾値は、０．０５のＦＤＲに基づき、赤色の破線により描示される。この閾値を超えたｃｉｒｃＲＮＡは、星印により表示される。３つのプロット全てを通って伸びる直線は、複数のＡＤ形質：点線（２つの形質）；実線（３つの形質）と有意に関連するｃｉｒｃＲＮＡを同定する。
【図2】図２は、大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、ＡＤの臨床重症度と符合することを示す。Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉データセット内の２つのＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡである、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１およびｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃについての、ライブラリーサイズ、正規化された示差的発現、共変量補正カウントのボックスプロットが提示される。ＰｒｅＳｙｍｐＡＤ（ＣＤＲ≦０．５）である。ボックスプロットの要素：中心線（中央値）、ボックス（第１四分位数～第３四分位数）、ウィスカー（四分位数±１．５×四分位数間範囲）、ドット（ウィスカーから外れることにより規定される異常値点）である。ＡＵ：任意単位である。
【図3】図３は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数または推定ニューロン比率と比較された、臨床的認知症尺度の変動の観察について、より多くを解明することを示す。メタ解析において、２つの公知の寄与因子：ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数（ＡＤについての、最も一般的な遺伝危険性因子）および推定ニューロン比率と比較して最も有意な、上位１０のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡにより説明される、ＣＤＲの変動百分率である。Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ： ＰＣｔｘ：頭頂葉発見データセット（ｎＣＤＲ＝９６）；ＭＳＢＢ ＢＭ４４：下前頭回再現データセット（ｎＣＤＲ＝１９５）である。
【図4】図４は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤ関連遺伝子と共発現することを示す。ＭＳＢＢ ＢＭ４４データセット内における、スピアマン相関ベースのネットワーク共発現モジュールである、ｃ１＿４６である（ＣＤＲとのモジュール関連：Ｐ＝１．５２×１０-７）（ｎ＝１９５）。ＣＤＲとのモジュール関連は、モジュール固有値遺伝子および示差的発現の共変量による多変量線形回帰から決定した。モジュール固有値遺伝子の、ＣＤＲとの関連の有意性は、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。
【図5】図５は、異なる大脳皮質ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内において判定された、高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡの重複について描示するベン図である。Ｐａｒｉｅｔａｌ：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ／ＤＩＡＮ頭頂葉皮質、データセット（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝１７０）；ＢＭ１０：ＭＳＢＢブロードマン１０野データセット（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝２６５）；ＢＭ２２：ＭＳＢＢ：ブロードマン２２野データセット（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝２６４）；ＢＭ３６：ＭＳＢＢ：ブロードマン３６野データセット（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝２６７）；ＢＭ４４：ＭＳＢＢ：ブロードマン４４野データセット（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝２３０）である。
【図6】図６は、確定ＡＤについての神経病理学的診断（ＡＤ＿ｃａｓｅ）、認知症の臨床尺度（ＣＤＲ）、およびタウ神経原線維変化（ｔａｕ ｔａｎｇｌｅ）病理についての神経病理学的尺度-Ｂｒａａｋスコア（Ｂｒａａｋ）の間の不完全な相関を裏付ける、ピアソン相関プロットを示す。Ｐａｒｉｅｔａｌ：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉皮質発見データセット（ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）；ＢＭ１０：ＭＳＢＢ：ブロードマン１０野再現データセット（ｎＣＤＲ＝２１８、ｎＢｒａａｋ＝２０９、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４６、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝１０８）；ＢＭ２２：ＭＳＢＢ：ブロードマン２２野再現データセット（ｎＣＤＲ＝２０２、ｎＢｒａａｋ＝１９５、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３８、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９７）；ＢＭ３６：ＭＳＢＢ：ブロードマン３６野再現データセット（ｎＣＤＲ＝１８７、ｎＢｒａａｋ＝１７７、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４１、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９１）；ＢＭ４４：ＭＳＢＢ：ブロードマン４４野再現データセット（ｎＣＤＲ＝１９５、ｎＢｒａａｋ＝１８８、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９）である。
【図7】図７は、ＲＮＡ-ｓｅｑカウントおよび効果の方向についての、定量的ＰＣＲによる検証を示す。同じ個体についての、ＲＮＡ-ｓｅｑから導出されたカウントと対比した、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ発見データセットの１３例のＲＮＡ試料についての、ＧＡＰＤＨ正規化デルタＣｔ値である（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３、ｎＰｒｅＳｙｍｐＡＤ＝３、ｎＡＤ＝７）。発現レベルが高度のｃｉｒｃＲＮＡ転写物は、発現が低度のｃｉｒｃＲＮＡ転写物より早急にサイクル閾値（Ｃｔ）に到達し、結果として、低値のデルタＣｔ値を有するので、負の相関が予期される。網掛け領域は、線形モデルからの予測についての、９５％の信頼性水準間隔を表す。Ｃｏｒｒ：両側ｔ検定により決定される有意性を伴う、ピアソン相関推定値である。ボックスプロットの要素：中心線（中央値）、ボックス（第１四分位数～第３四分位数）、ウィスカー（四分位数±１．５×四分位数間範囲）、ドット（ウィスカーから外れることにより規定される異常値点）である。
【図8】図８は、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複が、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉発見データセット内の異なるＡＤ形質と、有意に関連することを示す。全てのｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率閾値未満の有意性において、ＡＤ形質と有意に関連した。ＣＤＲ：ＡＤ重症度についての臨床的尺度である、臨床的認知症尺度；Ｂｒａａｋ：ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度である、Ｂｒａａｋスコアである。標本サイズ：ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３である。
【図9】図９は、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複が、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉発見データセットおよびＭＳＢＢ ＢＭ４４再現データセットについてのメタ解析における、異なるＡＤ形質と有意に関連することを示す。全てのｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率閾値未満の有意性において、ＡＤ形質と有意に関連した。ＣＤＲ：ＡＤ重症度についての臨床的尺度である、臨床的認知症尺度；Ｂｒａａｋ：タウ神経原線維変化の数を測定する、ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度である、Ｂｒａａｋスコアである。発見、頭頂葉標本サイズ：ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３；再現、ＢＭ４４標本サイズ：ｎＣＤＲ＝１９５、ｎＢｒａａｋ＝１８８、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９である。
【図10】図１０は、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複が、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉発見データセットおよび４つの大脳皮質領域全てのＭＳＢＢ再現データセットについてのメタ解析における、異なるＡＤ形質と有意に関連することを示す。臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）、Ｂｒａａｋスコア、およびＡＤ症例／対照状態。ＰＣｔｘ：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉皮質発見データセット（ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）；ＢＭ１０：ＭＳＢＢブロードマン１０野再現データセット（ｎＣＤＲ＝２１８、ｎＢｒａａｋ＝２０９、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４６、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝１０８）；ＢＭ２２：ＭＳＢＢ：ブロードマン２２野再現データセット（ｎＣＤＲ＝２０２、ｎＢｒａａｋ＝１９５、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３８、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９７）；ＢＭ３６：ＭＳＢＢ：ブロードマン３６野再現データセット（ｎＣＤＲ＝１８７、ｎＢｒａａｋ＝１７７、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４１、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９１）；ＢＭ４４：ＭＳＢＢ：ブロードマン４４野再現データセット（ｎＣＤＲ＝１９５、ｎＢｒａａｋ＝１８８、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９）である。
【図11】図１１は、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複が、４つの大脳皮質領域のＭＳＢＢ再現データセット内において、アミロイドプラークの平均数、ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度と有意に関連することを示す。全てのｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率閾値において、プラークの平均数と有意に関連した。ＢＭ１０：ＭＳＢＢブロードマン１０野再現データセット（ｎＰｌａｑｕｅＭｅａｎ＝２１８）；ＢＭ２２：ＭＳＢＢブロードマン２２野再現データセット（ｎＰｌａｑｕｅＭｅａｎ＝２０２）；ＢＭ３６：ＭＳＢＢブロードマン３６野再現データセット（ｎＰｌａｑｕｅＭｅａｎ＝１８７）；ＢＭ４４：ＭＳＢＢブロードマン４４野再現データセット（ｎＰｌａｑｕｅＭｅａｎ＝１９５）である。
【図12】図１２は、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複が、Ｂｒａａｋスコア補正ＡＤと対比したＡＤＡＤ、および対照（ＣＯ）と対比したＡＤＡＤと有意に関連することを示す。ＡＤ＊対ＡＤＡＤ解析を、Ｂｒａａｋスコアにより測定される、神経病理学的重症度について補正した。全てのｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率閾値において、有意に関連した。標本サイズ：ＡＤＡＤ対ＣＯ（ｎＡＤＡＤ＝１７、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３）；ＡＤＡＤ対ＡＤ＊（Ｂｒａａｋスコアが入手可能な試料：ｎＡＤＡＤ＝１７、ｎＡＤ＝７３）である。
【図13】図１３は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数または推定ニューロン比率と比較された、Ｂｒａａｋスコアの変動の観察について、より多くを説明することを示す。メタ解析において、公知の寄与因子：ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数（ＡＤについての、最も一般的な遺伝危険性因子）および推定ニューロン比率と比較して最も有意な、上位１０のＢｒａａｋ関連ｃｉｒｃＲＮＡにより説明される、Ｂｒａａｋスコア（Ｂｒａａｋ）の変動パーセントである。Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ ＰＣｔｘ（頭頂葉発見データセット）（ｎＢｒａａｋ＝８６）；ＭＳＢＢ ＢＭ４４（下前頭回再現データセット）（ｎＢｒａａｋ＝１８８）である。
【図14】図１４は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤ症例状態を予測するロジスティックモデルの感度および特異度を改善することを示す。ベースの集団遺伝学モデル（ｇｅｎｅｔｉｃ-ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｏｄｅｌ）は、示差的発現の共変量（死後間隔、転写物完全性数、死亡年齢、バッチ、性別、遺伝系統）の他、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数を含む。ｃｉｒｃモデルは、メタ解析において、ＣＤＲと有意に関連する、上位１０の最多ｃｉｒｃＲＮＡについての正規化カウントを含む。Ｃｉｒｃ＋Ｂａｓｅモデルは、既存の２つのモデルを、一体に組み合わせた。ＰＣｔｘ：頭頂葉発見データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）；ＢＭ１０：ブロードマン１０野再現データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４６、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝１０８）；ＢＭ２２：ブロードマン２２野再現データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３８、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９７）；ＢＭ３６：ブロードマン３６野再現データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４１、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝９１）；ＢＭ４４：ブロードマン４４野再現データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９）である。
【図15】図１５は、アーチファクトのジャンクションを除外し、高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡカウントのセットを生成する、バックスプライスジャンクションのフィルタリングを示す。Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ頭頂葉発見データセット内にスパイクインされた直鎖状ＥＲＣＣ ＲＮＡ内において検出されるバックスプライスジャンクション（ｎＳａｍｐｌｅｓ＝１７０）は、アーチファクトである。２つのレベルのフィルタリングについて描示される。最小数の試料フィルターは、組入れのためには、どのくらいの数の、異なる試料の特定のバックスプライスが観察されなければならないのかを指し示す。最小環状ＲＮＡ対直鎖状ＲＮＡ比（Ｃｉｒｃ：Ｌｉｎｅａｒ）によるフィルターは、直鎖状ＲＮＡと比較して、環状として分類されるリードの最小百分率を指し示し、組入れのためには、バックスプライスが裏付けられなければならない。点および直線の重複の観察における明確さのために、グラフの点および直線は、ジッターにより描示される。
【図16】図１６は、示差的に発現されたｃｉｒｃＲＮＡを示す。１６Ａ（１Ａ）：下前頭回データセット内の、神経病理学的に確認された対照、対、神経病理学的に確認されたＡＤにおけるｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現である。合計１１８のｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５のＦＤＲにおいて、有意である。注：ｘ軸は、発現のｌｏｇ２による倍数変化を描示する。１６Ｂ（１Ｂ）：下前頭回データセット内の、臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）に基づく、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現である。合計１５４のｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５のＦＤＲにおいて、有意である。注：ｘ軸は、ＣＤＲ １単位当たりの発現のｌｏｇ２倍の変化（範囲：０～３）を描示する。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本開示は、少なくとも部分的に、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）が、神経変性疾患などの疾患についての、非侵襲的バイオマーカーとして使用されうることの発見に基づく。本明細書において概括され、実施例において例示される通り、本出願者らは、ＣＳＦ中および全血中などの生物学的試料中に存在するｃｉｒｃＲＮＡが、示差的に発現され、対象における疾患を指し示すのに有用であることの証拠を提示する。神経病理学的に確認されたＡＤ症例および対照に由来する脳組織内の、環状ＲＮＡの、ロバストかつ再現可能な示差的発現（ＤＥ）が同定された。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤと極めて有意に関連するので、脳組織内の、わずか１０のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのカウントを使用する予測モデルは、高度の特異度および感度（ＡＵＣ：０．８８）をもたらした。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥは、臨床的ＡＤ重症度および病理学的ＡＤ重症度のいずれとも有意に関連することが観察された。前症状性脳内の、対照脳と比較して名目上有意なｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥ（ＡＤ病理の証拠であるが、臨床的認知症の証拠ではない）、およびＡＤＡＤを伴う個体に由来する脳内の、より重度のＤＥが同定されたことは、これと符合する。ＡＤ関連遺伝子の、ＡＤ ｃｉｒｃＲＮＡとの共発現は、ネットワーク解析を介して、病原性の役割を示唆するので、ＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡを、直接的に、または間接的に安定化させるか、または転じる治療用組成物は、ＡＤを処置する方法において有用である。併せて、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を、ＡＤと関連付ける、一連の証拠を提示する。したがって、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥを定量して、アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害または認知症の発生までの時間を予測し、処置の決定を誘導し、臨床試験のための対象を選択し、ある特定の治療介入の臨床的有効性を査定する方法の使用を包含する。本発明の他の態様および反復については、下記において、より完全に記載される。
【0030】
Ｉ．定義
本発明が、よりたやすく理解されうるように、まず、ある特定の用語が規定される。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用される、全ての技術用語および科学的用語は、本発明の実施形態が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施において、不要の実験を伴わずに、本明細書において記載される方法および材料と類似するか、これらに対して改変されているか、またはこれらと同等の、多くの方法および材料が使用されうるが、本明細書において、好ましい材料および方法が記載される。本発明の実施形態についての記載、およびこれらの主張において、下記に明示される定義に従う、以下の用語が使用されるであろう。
本発明が、よりたやすく理解されうるように、まず、ある特定の用語が規定される。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書において使用される、全ての技術用語および科学的用語は、本発明の実施形態が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施形態の実施において、不要の実験を伴わずに、本明細書において記載される方法および材料と類似するか、これらに対して改変されているか、またはこれらと同等の、多くの方法および材料が使用されうるが、本明細書において、好ましい材料および方法が記載される。本発明の実施形態についての記載、およびこれらの主張において、下記に明示される定義に従う、以下の用語が使用されるであろう。
【0031】
本明細書において使用される、「約」という用語は、例えば、質量、容量、時間、距離、および量を含むがこれらに限定されない、任意の定量可能な変数に関する、典型的な測定法および測定器具を介して生じうる数量の変動を指す。さらに、現実の世界において使用される、固体および液体の操作手順を踏まえると、組成物を作製するか、または方法を実行するのに使用される、製造法、供給源、または成分の純度などの差違を介する可能性が高い、ある特定の不慮の誤差および変動が生じる。「約」という用語はまた、最大において±５％でありうるが、また、±４％、３％、２％、１％などでもありうる、これらの変動も包含する。「約」という用語により修飾される場合であれ、そうでない場合であれ、主張は、数量と同等の数量を含む。
【0032】
本開示またはその好ましい態様（複数可）の要素を導入する場合における、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「その」、および「前記」という冠詞は、要素のうちの１つまたは複数が存在することを意味することが意図される。「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「～を有すること」という用語は、包含的であることが意図され、列挙された要素以外の、さらなる要素が存在しうることを意味する。
【0033】
「～を測定すること」もしくは「測定」、または、代替的に、「～を検出すること」もしくは「検出」とは、臨床試料中または対象由来試料中に与えられる物質の存在、非存在、数量、または量（有効量でありうる）を決定することを意味し、このような物質の定性的濃度レベルもしくは定量的濃度レベルの導出、または対象の臨床パラメータの値もしくは類別を、他の形において決定することを含む。
【0034】
本明細書において、「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、互換的に使用され、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）であれ、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）であれ、本明細書において記載される方法に適する、任意の動物またはその細胞を指す。ある特定の非限定的実施形態において、患者、対象、または個体は、ヒトである。
【0035】
本明細書において使用される、「プラットフォーム」または「技術」とは、本開示に従い、署名、例えば、遺伝子発現レベルを測定するのに使用されうる装置（例えば、測定器および関連部分、コンピュータ、本明細書において教示される、１つまたは複数のデータベースを含む、コンピュータ読み取り型メディア、試薬など）を指す。プラットフォームの例は、アレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、マルチプレックス型ＰＣＲプラットフォームおよび／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、核酸シーケンシングプラットフォーム、ハイブリダイゼーション検出器プラットフォームおよびマルチシグナルコード型（例えば、蛍光）検出器プラットフォームなど、核酸質量分析プラットフォーム、磁気共鳴プラットフォーム、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【0036】
一部の実施形態において、プラットフォームは、遺伝子発現レベルを、半定量的に測定する、すなわち、個別の発現または絶対発現を測定するのではなく、発現レベルが、推定値として、かつ／または互いと、もしくは指定された、１つもしくは複数のマーカー（例えば、別の「標準」遺伝子または「参照」遺伝子の発現）と比べて測定されるように構成される。
【0037】
一部の実施形態において、半定量的測定は、指定されたｍＲＮＡを指し示すシグナルが検出されるまで、ＰＣＲサイクルを実施し、検出が、署名内の遺伝子の推定発現レベルまたは相対発現レベルを提示するまで、必要とされる数のＰＣＲサイクルを使用することを介する、「リアルタイムＰＣＲ」を含む。
【0038】
リアルタイムＰＣＲプラットフォームは、例えば、試料が、マルチプレックス逆転写に続き、リアルタイムＰＣＲが実施されるウェルの集合を伴うアレイカード上において、リアルタイムＰＣＲを受ける、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）を含む。リアルタイムＰＣＲプラットフォームはまた、細胞が溶解され、ＤＮＡ／ＲＮＡが抽出され、リアルタイムＰＣＲが実施され、結果が検出される、例えば、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ Ｉｄｙｌｌａ（商標）ｓａｍｐｌｅ-ｔｏ-ｒｅｓｕｌｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙも含む。リアルタイムＰＣＲプラットフォームはまた、例えば、ＣｙＴＯＦ解析も含む：ＣｙＴＯＦ（Ｆｌｕｄｉｇｍ）は、重金属へとコンジュゲートされ、同時に、単一の細胞上にある、最大において４０のマーカーを検出することが可能な、近年導入されたマスサイトメーターである。
【0039】
磁気共鳴プラットフォームは、例えば、分子標的が、精製の必要を伴わずに、生物学的試料中において同定されうる、Ｔ２ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｔ２ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ［Ｔ２ ＭＲ（登録商標）］技術を含む。
【0040】
「アレイ」、「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」および「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏ ａｒｒａｙ）」という用語は、互換的であり、基質上に提示されるヌクレオチド配列のコレクションの配置を指す。本明細書において提示される方法において、任意の種類のアレイが活用されうる。例えば、アレイは、スライドガラスなどの固体基質（固相アレイ）上のアレイの場合もあり、ニトロセルロース膜などの半固体基質上のアレイの場合もある。アレイはまた、ビーズ上、すなわち、ビーズアレイ上にも提示されうる。これらのビーズは、典型的に、顕微鏡的であり、例えば、ポリスチレンから作製されうる。アレイはまた、例えば、特に、金から作製されうるが、また、銀、パラジウム、または白金から作製されうる、ナノ粒子上にも提示されうる。例えば、金ナノ粒子プローブ技術を使用する、Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを参照されたい。磁性ナノ粒子もまた、使用されうる。他の例は、核磁気共鳴マイクロコイルを含む。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの任意の並替え配列［例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）などのヌクレオチド類似体］でありうる。一部の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡではなく、スプライシングされたＲＮＡ分子種または成熟ＲＮＡ分子種の遺伝子発現を検出するように、エクソン／イントロン境界をまたぐ。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子に由来する部分配列、プライマー、全遺伝子配列、非コード配列、コード配列、公開された配列、公知の配列、または新規の配列でもありうる。アレイは、加えて、タンパク質または代謝物に特異的に結合する、抗体、ペプチド、タンパク質、組織、細胞、化学物質、炭水化物など、他の化合物も含みうる。
【0041】
アレイプラットフォームは、例えば、上記において言及された、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マイクロアレイプラットフォームを含む。
【0042】
ハイブリダイゼーション／マルチシグナルコード検出器プラットフォームは、例えば、標的特異的プローブ（例えば、目的の遺伝子発現転写物に対応する）へと接合された色分け型バーコードのハイブリダイゼーションが検出される、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）技術；およびマイクロスフェアビーズが、色分け型であり、検出のための標的特異的（例えば、遺伝子発現転写物）プローブによりコーティングされる、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）技術；およびマイクロビーズが、光ファイバーバンドルまたは平板状シリカスライドへとアセンブルされ、検出のための標的特異的（例えば、遺伝子発現転写物）プローブによりコーティングされる、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｂｅａｄアレイを含む。
【0043】
核酸質量分析プラットフォームは、例えば、質量プロファイルを使用して、増幅されたＤＮＡを検出するのに、ＤＮＡ質量分析が使用される、Ｉｂｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｌｅｘ-ＩＤ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｏｒを含む。
【0044】
サーマルサイクラープラットフォームは、例えば、非プロセシング試料から、核酸を抽出および精製し、ネステッドマルチプレックスＰＣＲを実施する、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）マルチプレックスＰＣＲシステム；マイクロ流体チップを使用する、液滴ベースのＰＣＲプラットフォームである、ＲａｉｎＤｒｏｐディジタルＰＣＲシステム；ならびにＧｅｎＭａｒｋ ｅＳｅｎｓｏｒシステムまたはｅＰｌｅｘシステムを含む。
【0045】
「遺伝子素材」という用語は、生物の細胞の核内またはミトコンドリア内に、遺伝情報を保存するのに使用される素材を指す。遺伝子素材の例は、二本鎖および一本鎖の、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡを含むがこれらに限定されない。
【0046】
「複数の核酸オリゴマー」という用語は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある、２つまたはこれを超える核酸オリゴマーを指す。
【0047】
範囲：本開示を通して、本発明の多様な態様は、範囲フォーマットにより提示されうる。範囲フォーマットによる記載は、簡便さおよび簡潔さだけのためのものであり、本発明の範囲に対する、柔軟性を欠いた限定と見なされるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲についての記載は、具体的に開示された、全ての可能な部分範囲の他、この範囲内の個別の数値を有すると考えられるものとする。例えば、１～６など、範囲についての記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、具体的に開示された部分範囲の他、この範囲内の個別の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有すると考えられるものとする。これは、範囲の幅に関わらず当てはまる。
【0048】
「Ａβアミロイドーシス」は、脳内のＡβ沈着の証拠として、臨床的に規定される。本明細書において、Ａβアミロイドーシスを有することが臨床的に決定された対象が、「アミロイド陽性」と称されるのに対し、本明細書において、Ａβアミロイドーシスを有さないことが臨床的に決定された対象は、「アミロイド陰性」と称される。Ａβアミロイドーシスは、現行の技法により検出可能となる前に存在する可能性が高い。しかしながら、当技術分野において、Ａβアミロイドーシスについて受容された指標が存在する。本開示の時点において、Ａβアミロイドーシスは、典型的に、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒ、または当技術分野において公知の他のイメージング法）または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２の減少もしくはＣＳＦ Ａβ４２／４０比の減少により同定される。ＭＣＢＰ（ｍｅａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）スコアが＞０．１８である、［１１Ｃ］ＰＩＢ-ＰＥＴイメージングは、免疫沈降／質量分析（ＩＰ／ＭＳ）による、約１ｎｇ／ｍｌの脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２濃度と同様に、Ａβアミロイドーシスの指標である。当技術分野において公知である、これらの値または他の値などの値は、Ａβアミロイドーシスを臨床的に確認するのに、単独において使用される場合もあり、組み合わせて使用される場合もある。例えば、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004；Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3)；Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453；またはJohnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013を参照されたい。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、症状性の場合もあり、症状性でない場合もあり、症状性対象は、Ａβアミロイドーシスと関連する疾患についての臨床的基準を満たす場合もあり、満たさない場合もある。Ａβアミロイドーシスと関連する症状の非限定例は、認知機能障害、行動の変容、言語機能の異常、情緒調節異常、発作、認知症、および神経系の構造または機能の障害を含みうる。Ａβアミロイドーシスと関連する疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管炎、レビー小体認知症、および封入体筋炎を含むがこれらに限定されない。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、Ａβアミロイドーシスと関連する疾患を発症する危険性が増大している。
【0049】
「Ａβアミロイドーシスの臨床徴候」とは、当技術分野において公知のＡβ沈着についての尺度を指す。Ａβアミロイドーシスの臨床徴候は、アミロイドイメージング（例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒ、または当技術分野において公知の他のイメージング法）または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２の減少もしくはＡβ４２／４０比の減少により同定されるＡβ沈着を含みうるがこれらに限定されない。例えば、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004およびFagan AM et al. Ann Neurol 59(3) 2006を参照されたい。Ａβアミロイドーシスの臨床徴候はまた、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第１４／３６６，８３１号、同第１４／５２３，１４８号、および同第１４／７４７，４５３号に記載されている、Ａβ代謝の尺度、特に、単独における、または他のＡβ変異体（例えば、Ａβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、および／または全Ａβ）の代謝の尺度と比較した、Ａβ４２代謝の尺度も含みうる。さらなる方法は、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Albert et al. Alzheimer’s & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179；McKhann et al., Alzheimer’s & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269；およびSperling et al. Alzheimer’s & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292において記載されている。重要なことは、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を伴う対象が、Ａβ沈着と関連する症状を有する場合もあり、有さない場合もあることである。しかし、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を伴う対象は、Ａβアミロイドーシスと関連する疾患を発症する危険性が増大している。
【0050】
「アミロイドイメージングのための候補者」とは、医師により、アミロイドイメージングが臨床的に認可されうる個体として同定された対象を指す。非限定例として述べると、アミロイドイメージングのための候補者は、１つもしくは複数のＡβアミロイドーシスの臨床徴候、１つもしくは複数のＡβプラーク関連症状、１つもしくは複数のＣＡＡ関連症状、またはこれらの組合せを伴う対象でありうる。非限定例として述べると、アミロイドイメージングのための候補者は、Ａβアミロイドーシスに対する遺伝的素因を伴う対象でありうる。医師は、その臨床ケアを方向付けるように、このような対象のために、アミロイドイメージングを推奨しうる。別の非限定例として述べると、アミロイドイメージングのための候補者は、Ａβアミロイドーシスと関連する疾患についての臨床試験における、潜在的な参加者（対照の対象または被験対象）でありうる。
【0051】
「Ａβプラーク関連症状」または「ＣＡＡ関連症状」とは、それぞれ、アミロイド原線維と呼ばれる、規則的に秩序づけられた原線維性凝集物から構成される、アミロイドプラークの形成またはＣＡＡにより引き起こされるか、またはこれらと関連する、任意の症状を指す。例示的なＡβプラーク関連症状は、神経変性、認知機能障害、記憶機能障害、行動の変容、情緒調節異常、発作、神経系の構造または機能の障害、およびアルツハイマー病またはＣＡＡの発症または増悪の危険性の増大を含みうるがこれらに限定されない。神経変性は、ニューロンの構造の変化（毒性タンパク質、タンパク質凝集物などの細胞内蓄積などの分子的変化、および軸索または樹状突起の形状または長さの変化、髄鞘組成の変化、髄鞘の喪失など、マクロレベルの変化を含む）、ニューロンの機能の変化、ニューロンの機能の喪失、ニューロンの死、またはこれらの任意の組合せを含みうる。認知機能障害は、記憶、注意、集中、言語、抽象的思考、創造性、実行機能、計画、および構成に関する困難を含みうるがこれらに限定されない。行動の変容は、身体的攻撃性または言語的攻撃性、衝動性、抑制の低下、無気力、方向付けの低下、性格の変化、アルコール、タバコ、または薬物の乱用、および他の中毒関連行動を含みうるがこれらに限定されない。情緒調節異常は、抑うつ状態、不安、躁状態、過敏性、および情緒失禁を含みうるがこれらに限定されない。発作は、全身性強直-間代発作、複合部分的発作、および非てんかん性、心因性発作を含みうるがこれらに限定されない。神経系の構造または機能の障害は、水頭症、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ、睡眠障害、精神病、平衡および協調運動の機能障害を含みうるがこれらに限定されない。これは、単不全まひ、片側不全まひ、四肢不全まひ、運動失調、バリスムス、および振戦などの運動機能障害を含みうる。これはまた、嗅覚、触覚、味覚、視覚、および聴覚を含む、感覚の喪失または機能不全も含みうる。さらに、これは、腸および膀胱の機能不全、性機能不全、血圧調節異常、および温度調節異常などの自律神経系機能障害を含みうる。最後に、これは、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチン、ならびに他の多数のホルモンおよび調節因子の欠損および調節異常など、視床下部および下垂体の機能不全に帰せられうる、ホルモン機能障害を含みうる。
【0052】
本明細書において使用される、「対象」という用語とは、哺乳動物、好ましくは、ヒトを指す。哺乳動物は、ヒト、霊長動物、家畜、齧歯動物、およびペットを含むがこれらに限定されない。対象は、医療ケアまたは医療処置を待機しつつある場合もあり、医療ケア下または医療処置下にある場合もあり、医療ケアまたは医療処置を施されている場合もある。
【0053】
本明細書において使用される、「健常対照群」、「正常群」、または「健常」対象に由来する試料という用語は、医師により、定性的検査結果または定量的検査結果に基づき、Ａβアミロイドーシス、またはＡβアミロイドーシスと関連する臨床的疾患（アルツハイマー病を含むがこれらに限定されない）を患っていないと診断される対象、または対象群を意味する。「正常」対象は、通例、査定される個体とほぼ同じ年齢であり、同じ年齢の対象、および５～１０歳の範囲内の対象を含むがこれらに限定されない。
【0054】
本明細書において使用される、「血液試料」という用語とは、血液、好ましくは末梢（または循環）血液に由来する生物学的試料を指す。血液試料は、全血液、血漿、または血清でありうるが、典型的に、血漿が好ましい。
【0055】
「平均値から有意に隔たる」とは、平均値を、少なくとも１標準偏差、好ましくは、少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは、少なくとも１．５標準偏差、またはなおより好ましくは、少なくとも２標準偏差上回るか、またはこれを下回る値を指す。
【0056】
ＩＩ．方法
本開示の一態様は、対象の疾患を診断するための方法であって、前記対象の生物学的試料（例えば、体液）中の１つまたは複数の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の存在または非存在を決定する工程であって、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの存在または非存在が、疾患を指し示す工程を含む方法を包含する。好ましくは、前記疾患は、体液の疾患ではない。ある特定のｃｉｒｃＲＮＡは、罹患対象の試料中に、健常対象に由来する試料と比較して、異なるレベルにおいて存在する場合もあり、対象の疾患重症度に基づき、異なるレベルにおいて存在する場合もある。したがって、本開示は、参照レベルと比較した場合に、ｃｉｒｃＲＮＡの「存在」もしくは「非存在」決定する工程、および／または前記１つもしくは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程を包含する。したがって、本開示は、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患を指し示す工程を提示する。よって、本発明はまた、対象の疾患または対象の疾患重症度を診断するための方法であって、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患または疾患重症度を指し示す工程を含む方法にも関する。
本開示の一態様は、対象の疾患を診断するための方法であって、前記対象の生物学的試料（例えば、体液）中の１つまたは複数の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の存在または非存在を決定する工程であって、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの存在または非存在が、疾患を指し示す工程を含む方法を包含する。好ましくは、前記疾患は、体液の疾患ではない。ある特定のｃｉｒｃＲＮＡは、罹患対象の試料中に、健常対象に由来する試料と比較して、異なるレベルにおいて存在する場合もあり、対象の疾患重症度に基づき、異なるレベルにおいて存在する場合もある。したがって、本開示は、参照レベルと比較した場合に、ｃｉｒｃＲＮＡの「存在」もしくは「非存在」決定する工程、および／または前記１つもしくは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程を包含する。したがって、本開示は、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患を指し示す工程を提示する。よって、本発明はまた、対象の疾患または対象の疾患重症度を診断するための方法であって、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患または疾患重症度を指し示す工程を含む方法にも関する。
【0057】
本発明の実施形態において、方法は、対象におけるアルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ）型認知症、およびレビー小体認知症などの神経変性疾患を診断するための方法である。一部の実施形態において、対象は、ＭＣＩまたは認知症の診断を有する。一部の実施形態において、対象は、神経変性疾患の臨床徴候を有さない。
【0058】
本明細書において開示される方法は、一般に、生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程を含む。本明細書において使用される、「生物学的試料」という用語は、対象から単離された生物学的素材を意味する。所望のｃｉｒｃＲＮＡを検出するために適する、任意の生物学的素材を含有する任意の生物学的試料が適し、対象から得られた細胞性材料および／または非細胞性材料を含みうる。非限定例は、血液、血漿、血清、尿、および組織を含む。試料は、患者に由来する試料である、「臨床試料」であることが多い。典型的臨床試料は、滑液、痰、血液、尿、血漿、血清、汗、粘液、唾液、リンパ液、気管支吸引物、腹水、脳脊髄液、および胸水などの体液試料、ならびに血球［例えば、白血球（ｗｈｉｔｅ ｃｅｌｌｓ）］、組織生検もしくは微細針生検試料、および膿瘍、またはこれらに由来する細胞などの組織試料を含むがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取された、凍結切片またはホルマリン固定切片などの組織切片も含みうる。一部の実施形態において、生物学的試料は、ＣＳＦ、血液、または脳組織から選択される。
【0059】
「試料」はまた、増幅反応の生成物など、生化学反応または化学反応に由来する試料でもありうる。液体試料は、本開示における使用の前に、１つまたは複数の前処理にかけられうる。このような前処理は、希釈、濾過、遠心分離、濃度、沈降、沈殿、または透析を含むがこれらに限定されない。前処理はまた、例えば、試料を安定化させるために、化学物質または生化学物質の、溶液への添加も含むことが可能であり、核酸、特に、ｃｉｒｃＲＮＡを含有した。このような化学物質または生化学物質の添加は、酸、塩基、緩衝液、塩、溶媒、反応性色素、界面活性物質、乳化剤、またはＥＤＴＡのようなキレート剤を含む。試料は、例えば、採取され、このような物質と直接的に混合されうる。一実施形態において、試料は、全血液試料である。全血液試料は、好ましくは、希釈、濾過、遠心分離、濃度、沈降、沈殿、または透析により前処理されない。しかし、解析の開始まで、試料を安定化させるために、物質が試料へと添加されることが好ましい。この文脈における「安定化」とは、決定されるｃｉｒｃＲＮＡの分解の防止を意味する。この文脈における、好ましい安定化剤は、ＥＤＴＡ、例えば、Ｋ２ＥＤＴＡ、ＲＮアーゼ阻害剤、アルコール、例えば、エタノールおよびイソプロパノール、タンパク質を塩析するのに使用される薬剤（ＲＮＡｌａｔｅｒなど）である。一態様において、試料は、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）を除外するように処理される。当技術分野において、ｒＲＮＡ試料を枯渇させる技法、例えば、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ技術が公知である。
【0060】
当業者により理解される通り、生物学的試料を回収する方法は、生物学的試料の性質、および実施される解析の種類に応じて変動する場合があり、変動するであろう。生物学的試料を回収するのに、当技術分野において一般に公知である、様々な方法のうちのいずれかが活用されうる。一般的に言うと、方法は、本開示に従い、ｃｉｒｃＲＮＡが、正確に検出され、量が測定されうるように、好ましくは、試料の完全性を維持する。
【0061】
一部の実施形態において、単一の試料は、試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡを検出するように、対象から得られる。代替的に、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡは、時間経過にわたり、対象から得られる試料中において検出されうる。このように、１つを超える試料は、時間経過にわたり、対象から回収されうる。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６例、またはこれを超える例数の試料は、時間経過にわたり、対象から回収されうる。一部の実施形態において、２、３、４、５、または６例の試料は、時間経過にわたり、対象から回収される。他の実施形態において、６、７、８、９、または１０例の試料は、時間経過にわたり、対象から回収される。さらに他の実施形態において、１０、１１、１２、１３、または１４例の試料は、時間経過にわたり、対象から回収される。他の実施形態において、１４、１５、１６例、またはこれを超える例数の試料は、時間経過にわたり、対象から回収される。
【0062】
１つを超える試料が、時間経過にわたり、対象から回収される場合、試料は、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間、またはこれを超える時間ごとに回収されうる。一部の実施形態において、試料は、０．５、１、２、３、または４時間ごとに回収される。他の実施形態において、試料は、４、５、６、または７時間ごとに回収される。さらに他の実施形態において、試料は、７、８、９、または１０時間ごとに回収される。他の実施形態において、試料は、１０、１１、１２時間、またはこれを超える時間ごとに回収される。加えて、試料は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超える日数ごとに回収されうる。一部の実施形態において、試料は、約６日間ごとに回収される。一部の実施形態において、試料は、１、２、３、４、または５日間ごとに回収される。他の実施形態において、試料は、５、６、７、８、または９日間ごとに回収される。さらに他の実施形態において、試料は、９、１０、１１、１２、またはこれを超える日数ごとに回収される。
【0063】
一部の実施形態において、試料は、１つまたは複数の核酸を含む。本明細書において、「核酸」という用語は、その最広義において使用され、全ての可能な供給源に由来し、全ての長さ、および二本鎖、一本鎖、環状、直鎖状、または分枝状など、全ての構成における、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。対象に由来する単量体ヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、ウイルス性核酸および細菌性核酸の他、ゲノムＤＮＡおよび非ゲノムＤＮＡならびにＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、プロセシング形態および非プロセシング形態にあるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、異種核内ＲＮＡ（ｈｎ-ＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の他、他の全ての想定可能な核酸など、全てのサブユニットおよびサブタイプもまた含まれる。しかし、最も好ましい実施形態において、試料は、ｃｉｒｃＲＮＡを含む。本開示との関連におけるｃｉｒｃＲＮＡの「存在」または「非存在」とは、ｃｉｒｃＲＮＡが、それぞれ、ある特定の閾値を上回るレベルにおいて、またはある特定の閾値を下回るレベルにおいて存在することを意味する。閾値が、「０」である場合、これは、「存在」とは、試料中の、ｃｉｒｃＲＮＡの実際の存在であり、「非存在」とは、実際の非存在であることを意味するであろう。しかし、本開示との関連における「存在」はまた、それぞれのｃｉｒｃＲＮＡが、閾値、例えば、対照において決定されるレベルを上回るレベルにおいて存在することも意味する場合があり、したがって、この文脈における「非存在」とは、ｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、ある特定の閾値以下であることを意味する。よって、本開示の方法は、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベル決定する工程、およびこれを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程を含むことが好ましい。一実施形態において、決定工程は、（ｉ）前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；および（ｉｉ）決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患を指し示す工程を含む。言い換えると、本開示は、対象の疾患を診断するための方法であって、（ｉ）前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを決定する工程；および（ｉｉ）決定されたレベルを、前記１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの参照レベルと比較する工程であって、決定されたレベルと、参照レベルとの間において異なるレベルが、疾患を指し示す工程を含む方法に関する。
【0064】
「参照レベル」という用語は、ｃｉｒｃＲＮＡの「存在」または「非存在」の間の区別を可能とするために、決定されたレベルが比較されるレベルに関する。参照レベルは、実際の診断（ｄｉａｇｎｏｓｅ）を下す推定工程のための決定因子であるレベルを含む。好ましい実施形態における参照レベルは、健常対象、すなわち、診断される疾患を有さない対象、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有さない対象、または健常対象の集団における、それぞれのｃｉｒｃＲＮＡのレベルに関する。当業者は、本出願の開示と共に、一般的な統計学的方法を使用して、適した対照レベルを決定する位置にある。
【0065】
ｃｉｒｃＲＮＡについての「参照レベル」はまた、特定の疾患状態または疾患重症度の非存在を指し示す、ｃｉｒｃＲＮＡのレベルも意味しうる。一部の実施形態において、対象におけるｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、参照ｃｉｒｃＲＮＡのレベルを上回る場合、これは、疾患状態の存在、または疾患重症度の悪化を指し示す。一部の実施形態において、対象におけるｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、参照ｃｉｒｃＲＮＡのレベルを上回る場合、これは、特定の疾患状態の欠如、または疾患重症度の欠如を指し示す。一部の実施形態において、対象におけるｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、参照ｃｉｒｃＲＮＡのレベルを下回る場合、これは、特定の疾患状態の存在、または疾患重症度の悪化を指し示す。一部の実施形態において、対象におけるｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、参照ｃｉｒｃＲＮＡのレベルを下回る場合、これは、特定の疾患状態の欠如、または疾患重症度の欠如を指し示す。一部の実施形態において、対象におけるｃｉｒｃＲＮＡのレベルが、参照ｃｉｒｃＲＮＡのレベルの範囲内にある場合、これは、特定の疾患状態または重症度を指し示す。
【0066】
ｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルと共に使用される場合における、本明細書において使用される「～を指し示す」という用語は、ｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルが、代替的な生物学的状態（例えば、無症状性、前症状性、ＭＣＩ、認知症）または対照における発現レベルと比較して、上方調節されるか、または下方調節されるか、変更されるか、または変化することを意味する。
【0067】
ある特定の実施形態において、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの量を、生物学的試料中において増大していると分類するには、生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの、参照値と比較した量は、少なくとも１倍増大している。例えば、試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの、参照値と比較した量は、少なくとも１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１００００倍増大している。
【0068】
ある特定の実施形態において、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの量を、生物学的試料中において減少していると分類するには、生物学的試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの、参照値と比較した量は、１分の１以下に減少している。例えば、試料中の、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの、参照値と比較した量は、１分の１、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、または少なくとも１００００倍以下に減少している。
【0069】
別の実施形態において、宿主解析物の量の増大または減少は、ｐ値を使用して測定される。例えば、ｐ値を使用する場合、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｐ値が、０．１未満、好ましくは０．０５未満、より好ましくは０．０１未満、なおより好ましくは０．００５未満、最も好ましくは０．００１未満である場合に、生物学的試料と、参照値との間において示差的に発現されるｃｉｒｃＲＮＡとして同定される。
【0070】
１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルは、当業者に周知の、多数の方式において解析されうる。例えば、得られた各アッセイ結果は、「正常」もしくは「対照」値、または特定の疾患もしくは転帰を指し示す値と比較されうる。特定の診断／予後診断は、診断的「閾値」と称される場合もあり、予後診断的「閾値」と称される場合もある、このような値との、各アッセイ結果の比較に依存しうる。ある特定の実施形態において、１つまたは複数の診断的指標または予後診断的指標についてのアッセイは、アッセイにおける、ｃｉｒｃＲＮＡの存在または非存在だけにより、状態または疾患と相関させられる。例えば、アッセイは、陽性シグナルが、目的の特定の閾値レベルを上回る場合に限り生じ、このレベルを下回る場合に、アッセイは、バックグラウンドを上回るシグナルを提示しないようにデザインされうる。
【0071】
診断検査および／または予後診断検査の感度および特異度は、検査の解析「品質」に依存するだけではなく、また、何が異常結果を構成するのか、すなわち、どのような場合に、レベルが、対照レベルと異なると考えられうるのかについての定義にも依存する。実際、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線は、典型的に、変数の値を、「正常」（すなわち、卵巣がんを有さない、見かけ上健常の個体）集団および「疾患」集団におけるその相対頻度と対比してプロットすることにより計算される。任意の特定のマーカーについて、疾患を伴う対象についてのマーカーレベルの分布と、疾患を伴わない対象についてのマーカーレベルの分布とは、重複する可能性が高いであろう。このような条件下において、検査は、正常を、疾患から、１００％の精度により、絶対的に識別するわけではなく、重複部分は、検査が、正常を、疾患から識別しえない部分を指し示す。それを下回る場合、検査結果が異常であると考えられ、それを上回る場合、検査結果が正常であると考えられる閾値が選択される。ＲＯＣ曲線下の面積は、感知された測定値が、状態の正確な同定を可能とする確率についての尺度である。ＲＯＣ曲線は、検査結果が、必ずしも、正確な数を与えない場合であってもなお使用されうる。結果をランク付けできる限りにおいて、ＲＯＣ曲線を創出することができる。例えば、「疾患」試料についての検査結果は、程度（例えば、１＝低、２＝正常、および３＝高）に従いランクづけされうる。このランクづけは、「正常」集団または「対照」集団における結果と相関させられる場合があり、ＲＯＣ曲線が創出されうる。これらの方法は、当技術分野において周知である。例えば、Hartley et al. 1982. Radiology 143: 29-36を参照されたい。好ましくは、閾値は、約０．５を超え、より好ましくは、約０．７を超え、なおより好ましくは、約０．８を超え、なおより好ましくは、約０．８５を超え、最も好ましくは、約０．９を超えるＲＯＣ曲線下面積をもたらすように選択される。この文脈における「約」という用語は、所与の測定値から±５％を指す。
【0072】
ＲＯＣ曲線の水平軸は、偽陽性率と共に増大する、（１-特異度）を表す。曲線の垂直軸は、真陽性率と共に増大する感度を表す。したがって、選択される、特定のカットオフについて、（１-特異度）の値が決定され、対応する感度が得られうる。ＲＯＣ曲線下の面積は、測定されたマーカーレベルが、疾患または状態の正確な同定を可能とする確率についての尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下の面積は、検査の有効性を決定するのに使用されうる。他の実施形態において、危険性を予測するか、または疾患を診断する検査の能力の尺度として、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、またはハザード比が使用される。陽性尤度比の場合、１の値は、「罹患」群および「対照」群のいずれの対象においても、陽性結果が生じる可能性が同等であることを指し示し；１を超える値は、罹患群において、陽性結果が生じる可能性が高いことを指し示し；１未満の値は、対照群において、陽性結果が生じる可能性が高いことを指し示す。陰性尤度比の場合、１の値は、「罹患」群および「対照」群のいずれの対象においても、陰性結果が生じる可能性が同等であることを指し示し；１を超える値は、被験群において、陰性結果が生じる可能性が高いことを指し示し；１未満の値は、対照群において、陰性結果が生じる可能性が高いことを指し示す。
【0073】
オッズ比の場合、１の値は、「罹患」群および「対照」群のいずれの対象においても、陽性結果が生じる可能性が同等であることを指し示し；１を超える値は、罹患群において、陽性結果が生じる可能性が高いことを指し示し；１未満の値は、対照群において、陽性結果が生じる可能性が高いことを指し示す。
【0074】
ハザード比の場合、１の値は、「罹患」群および「対照」群のいずれにおいても、エンドポイント（例えば、死）の相対的危険性が同等であることを指し示し；１を超える値は、罹患群において、危険性が大きいことを指し示し；１未満の値は、対照群において、危険性が大きいことを指し示す。
【0075】
当業者は、診断的指標または予後診断的指標の、診断または将来の臨床的転帰の予後診断的危険性との関連づけが、統計学的解析であることを理解するであろう。例えば、Ｘより低レベルのマーカーレベルは、患者が、統計学的有意性の水準により決定される通り、レベルがＸ以上である患者より、有害転帰を被る可能性が高いことを伝えうる。別のマーカーについて、Ｘより高レベルのマーカーレベルは、患者が、統計学的有意性の水準により決定される通り、レベルがＸ以下である患者より、有害転帰を被る可能性が高いことを伝えうる。加えて、ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は、患者の予後診断を反映することが可能であり、マーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度と関連しうる。統計学的有意性は、２つ以上の集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を決定することにより決定されることが多い。例えば、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983を参照されたい。本発明の好ましい信頼区間が、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、および９９．９９％であるのに対し、好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。疾患の診断に適する閾値レベルは、ｃｉｒｃＲＮＡのある特定の組合せについて決定されうる。これは、例えば、患者の参照集団を、それらのｃｉｒｃＲＮＡのレベルに従い、ある特定の分位数、例えば、四分位数、五分位数へと、なおまたは適切な百分位数に従い群分けすることによりなされうる。ある特定の百分位数を上回る分位数または群、およびこれを下回る分位数または群の各々について、ハザード比は、有害転帰、すなわち、「疾患」または「アルツハイマー病」についての危険性を、ある特定の疾患を有する患者と、ある特定の疾患を有さない患者との間において比較して計算されうる。このような状況において、１を上回るハザード比（ＨＲ）は、患者について、有害転帰の高度の危険性を指し示す。１を下回るＨＲは、患者の群における、ある特定の処置の有益な効果を指し示す。１近傍（例えば、±０．１）のＨＲは、患者の特定の群について、危険性の上昇を指し示さない。ある特定の分位数の患者の間のＨＲの、互いとの比較、および患者の全集団のＨＲとの比較により、危険性が上昇する患者、および投薬から利益を得る患者の分位数同定し、これにより、本発明に従う対象を層別化することが可能である。ある場合には、ｃｉｒｃＲＮＡのレベルが「参照レベル」と異なる（例えば、第５五分位数の）患者に、疾患の存在が影響しないのに対し、他の場合には、レベルが対照レベルと同様である（例えば、第１五分位数の）患者は、影響を受けるであろう。しかし、上記の説明およびその一般的な知見により、当業者は、疾患、例えば、神経変性疾患を有する患者の群を、アルツハイマー病を有する患者の群として同定することが可能である。例示的に述べると、付属の実施例において、アルツハイマー病について、ｃｉｒｃＲＮＡのレベルの一部の組合せが一覧される。本発明についての別の実施形態において、診断は、マーカーペプチドの患者の個別のレベルを、健常集団のある特定の百分位数［例えば、第９７．５百分位数（レベルの上昇が疾患を指し示す場合）または第２．５百分位数（レベルの低下が疾患を指し示す場合）］と関連づけることにより決定される。
【0076】
カプラン-マイヤー推定子は、患者の転帰または危険性（例えば、診断、再発、進行または罹患状態）の評価または予測のために使用されうる。
【0077】
本発明の文脈における「同等」レベルとは、レベルが、±１０％を超えず、好ましくは±５％を超えず、より好ましくは±２％を超えずに異なることを意味する。本発明の文脈における、レベルの「低下」または「上昇」とは、レベルが、１０％を超え、好ましくは１５％を超え、好ましくは２０％を超えて異なることを意味する。
【0078】
「環状ＲＮＡ」（ｃｉｒｃＲＮＡ）については、既に記載されている。当業者は、検出されたＲＮＡが、環状ＲＮＡであるのかどうかを決定することが可能である。特に、ｃｉｒｃＲＮＡは、遊離３’末端または遊離５’末端を含有しない、すなわち、核酸の全体が環状化されている。ｃｉｒｃＲＮＡは、好ましくは、環状化された一本鎖ＲＮＡ分子である。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡをコードするゲノム配列に関して、不連続配列を結果としてもたらす、５’側から３’側へのスプライシングイベントの結果である。これは、ゲノムの文脈において、第１の配列は、第２の配列の５’側（上流）に存在するが、ｃｉｒｃＲＮＡ上において、その５’末端における前記第１の配列が、前記第２の配列の３’末端へと連結され、これにより、閉環することを意味する。この配置の帰結は、前記第１の配列の５’末端が、前記第２の配列の３’末端へと連結されるジャンクションにおいて、ゲノムの文脈においても、通常転写されるＲＮＡ内、例えば、ｍＲＮＡ内においても存在しない、固有の配列が構築されることである。したがって、本開示に従うｃｉｒｃＲＮＡは、頭尾配置にあるバックスプライスジャンクションを含有することが好ましい。当業者は、通例のｍＲＮＡ転写物が、尾頭配置にあるエクソン間ジャンクションを含有する、すなわち、ゲノムの文脈において上流にある、エクソンの３’末端（尾部）が、ゲノムの文脈において下流にある、エクソンの５’末端（頭部）へと連結されることを認識するであろう。本明細書において、実際のジャンクション、すなわち、１つのエクソンが、他のエクソンへと連結される点はまた、「切断点」とも称される。好ましい実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡの存在もしくは非存在、またはｃｉｒｃＲＮＡのレベルは、バックスプライスジャンクションの検出により決定される。一部の実施形態において、本明細書において開示される方法は、試料を、以下のバックスプライスジャンクションを検出するようにデザインされた以下のプライマー対：ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１［フォワード：５’-ＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡ-３’（配列番号１）；リバース：５’-ＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＡ-３’（配列番号２）］、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２［フォワード：５’-ＧＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡ-３’（配列番号３）；リバース：５’-ＧＧＣＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＴ-３’（配列番号４）］、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１［フォワード：５’-ＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡ-３’（配列番号５）；リバース：５’-ＴＡＧＣＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴ-３’（配列番号６）］、ｃｉｒｃＩＣＡ１［フォワード：５’-ＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ-３’（配列番号７）；リバース：５’-ＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡ-３’（配列番号８）］、ｃｉｒｃＦＭＮ１［フォワード：５’-ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣ-３’（配列番号９）；リバース：５’-ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧ-３’（配列番号１０）］；ｃｉｒｃＤＯＣＫ１［フォワード：５’-ＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣ-３’（配列番号１１）；リバース：５’-ＧＧＣＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＴ-３’（配列番号１２）］、ｃｉｒｃＲＴＮ４［フォワード：５’-ＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣ-３’（配列番号１３）；リバース：５’-ＣＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧ-３’（配列番号１４）］、ｃｉｒｃＳＴ１８［フォワード：５’-ＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧ-３’（配列番号１５）；リバース：５’-ＡＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧ-３’（配列番号１６）］、ｃｉｒｃＩＡＴＲＮＬ１［フォワード：５’-ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＧ-３’（配列番号１７）；リバース：５’-ＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡ-３’（配列番号１８）］、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１［フォワード：５’-ＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡ-３’（配列番号１９）；リバース：５’-ＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＡ-３’（配列番号２０）］のうちの１つまたは複数と接触させることにより、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡを検出する工程を含む。一部の実施形態において、方法は、配列番号１～２０のヌクレオチド配列を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなるプライマーの使用を含む。
【0079】
環状ＲＮＡの検出についてはまた、特に、ｃｉｒｃＲＮＡの検出およびアノテーションに関して、参照により本明細書に組み込まれる、Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013; 495(7441):333-338においても、既に記載されている。多くの哺乳動物のｃｉｒｃＲＮＡの生合成は、フランキングイントロン内の相補性配列［Ashwal-Fluss R, Meyer M, Pamudurti NR, et al. circRNA Biogenesis Competes with Pre-mRNA Splicing. MOLCEL. 2014; 1-12; Rybak-Wolf A, Stottmeister C, Glazar P, et al. Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed. MOLCEL. 2015;1- 17; Zhang X-O, Wang H-B, Zhang Y, et al. Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization. Cell. 2014; Liang D, Wilusz JE. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes and Development. 2014; Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, et al. The RNA Binding Protein Quaking Regulates Formation of circRNAs. Cell. 2015;160(6): 1 125-1 134; and Ivanov A, Memczak S, Wyler E, et al. Analysis of Intron Sequences Reveals Hallmarks of Circular RNA Biogenesis in Animals. CellReports. 2015;10(2): 170- 177を参照されたい］に依存する。よって、一実施形態において、頭尾配置にあるエクソン間ジャンクションのエクソン（すなわち、エクソン間ジャンクションを形成するエクソン）の上流および下流にあり、ゲノム的関連において、これらと直接隣接する、２つのイントロンは、相補性配列、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは５００ヌクレオチド、より好ましくは１０００ヌクレオチドの、相補性配列の連なりを含有することが多い。ｃｉｒｃＲＮＡの検出のために、原則として、試料のＲＮＡは、逆転写およびライブラリー調製の後においてシーケンシングされる。その後、配列は、頭尾配置にあるエクソン間ジャンクション、すなわち、バックスプライスジャンクションの存在について解析される。例えば、シーケンシングされたＲＮＡは、一般的なマッピングプログラムおよびマッピングソフトウェア、例えば、ｂｏｗｔｉｅ２［ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．０；Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012; 9(4):357-359を参照されたい］を使用して、参照ゲノムへとマッピングされうる。ヒト参照ゲノムは、当業者に公知であり、ヒト参照ゲノムである、ｈｇｌ９［２００９年２月、ＧＲＣｈ３７；ＵＣＳＣゲノムブラウザーからダウンロード可能である；Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, et al. The human genome browser at UCSC. Genome Research. 2002; 12(6):996-1006を参照されたい］を含む。ｃｉｒｃＲＮＡの、血中の検出は、全ＲＮＡ試料の前処理を伴わずに可能であるが、特に、ＲＮＡシーケンシング法を使用する場合、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、好ましくは、ｒＲＮＡの大部分を枯渇させて、ｃｉｒｃＲＮＡ検出の感度を増大させることが好ましい。この目的のために、試料中のｒＲＮＡ含量は、全ＲＮＡ含量に照らして、２０％未満、好ましくは、１０％未満、より好ましくは、２％未満へと枯渇されるものとする。ｒＲＮＡの枯渇は、当技術分野において公知の通りに実施されうる、例えば、市販のキット（例えば、Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ、Ｔｈｅｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または酵素的方法［Xian Adiconis et al. Comprehensive comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low input samples Nat Methods. 2013 Jul; 10(7): 10.1038/nmeth.2483］により容易とされうる。さらに、好ましい実施形態において、トリミングを伴わない（末端-末端モードの）アライメントにより、ゲノムへと連続的にマッピングされるＲＮＡ配列は、無視される。ゲノムへと連続的にマッピングされないリードが、好ましくは、ｃｉｒｃＲＮＡ候補物質の検出に使用される。配列に由来する末端配列（アンカー）、例えば、２０ｎｔ以上の配列が抽出され、独立に、ゲノムに照らしてリアライメントされうる。このアライメントから、配列は、全ｃｉｒｃＲＮＡ配列がカバレッジされる、すなわち、アライメントされるまで拡張されうる。アンカーの連続的なアライメントが、直鎖状スプライシングイベントを指し示すのに対し、逆配向性のアライメントは、ｃｉｒｃＲＮＡ内において観察される、頭尾スプライシングを指し示す。
【0080】
本発明に従うｃｉｒｃＲＮＡは、異なる技法を使用して検出されうる。本明細書において概括される通り、バックスプライス配置は、ｃｉｒｃＲＮＡに固有である。よって、これらの検出が好ましい。核酸の検出法は、一般に、当業者に公知であり、プローブハイブリダイゼーションベースの方法、核酸の増幅ベースの方法、および核酸シーケンシング、またはこれらの組合せを含む。よって、好ましい実施形態において、本発明のｃｉｒｃＲＮＡは、プローブハイブリダイゼーションベースの方法、核酸の増幅ベースの方法、および核酸シーケンシングからなる群から選択される方法を使用して検出される。
【0081】
プローブハイブリダイゼーションベースの方法は、相補鎖と特異的にハイブリダイズする核酸の特色を利用する。この目的のために、ｃｉｒｃＲＮＡの頭尾配置にあるエクソン間ジャンクション、すなわち、エクソン間ジャンクションをまたぐ配列、好ましくは、エクソン間ジャンクションの１０ｎｔ上流～１０ｎｔ下流に広がる領域、好ましくは、エクソン間ジャンクションの２０ｎｔ上流～２０ｎｔ下流にわたる領域、またはエクソン間ジャンクションをまたぐ、なお大きな領域と特異的にハイブリダイズする核酸プローブが利用されうる。当業者は、ｃｉｒｃＲＮＡのそれぞれの配列と特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブの他、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡが、ｃＤＮＡへと、既に逆転写されており、かつ／または増幅されている場合、その逆相補体配列と特異的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブも使用されうることを認識するであろう。
【0082】
ハイブリダイゼーションはまた、２つの核酸配列の間の相同性の尺度としても使用されうる。本発明に従う頭尾配置にあるエクソン間ジャンクションに、特異的にハイブリダイズする核酸配列は、標準的ハイブリダイゼーション法に従うハイブリダイゼーションプローブとして使用されうる。プローブの、被験供給源（例えば、全血液などの体液、または体液試料から増幅された核酸）に由来するＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、被験供給源中の、関連するｃｉｒｃＲＮＡの存在についての指標である。
【0083】
ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991において見出されうる。好ましくは、特異的ハイブリダイゼーションとは、厳密な条件下におけるハイブリダイゼーションを指す。「厳密な条件」は、４５℃における、６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションに続く、６５℃における、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄と同等の条件；またはブロッティング法のための、市販のハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、ＵＬＴＲＡＨｙｂ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および６５℃におけるアレイベースの検出法のための５倍濃度のＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中のハイブリダイゼーションと同等の条件として規定される。本発明の手段および方法は、好ましくは、核酸プローブの使用を含む。本発明に従う核酸プローブは、特異的核酸配列と実質的に相補性である、オリゴヌクレオチド、核酸、またはこれらの断片であり、「実質的に相補性」とは、厳密な条件下において、特異的核酸配列とハイブリダイズする能力を指す。
【0084】
当業者は、試料中の核酸レベルを決定し、それらを対照レベルと比較する手段および方法について承知している。このような方法は、本発明に従う標識化核酸プローブを利用しうる。「標識」は、本明細書の下記においてさらに規定される、蛍光活性標識または酵素活性標識を含む。このような方法は、リアルタイムＰＣＲ法およびＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、ナノストリングなどのマイクロアレイ法を含む。
【0085】
ｃｉｒｃＲＮＡまたはそれらのレベルの決定はまた、シーケンシング法を使用しても検出されうる。当業者は、本発明との関連において、シーケンシング法を使用することが可能である。シーケンシング法は、マクサム-ギルバートシーケンシング、サンガーシーケンシング（ｄｄＮＴＰを使用する鎖終結法）、およびＭＰＳＳ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの次世代シーケンシング法、ポロニーシーケンシング、４５４製のパイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、またはイオントレント半導体シーケンシングもしくは単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含むがこれらに限定されない。
【0086】
ｃｉｒｃＲＮＡおよびそれぞれのレベルの検出／決定はまた、単独における核酸増幅法を利用する場合もあり、シーケンシング法および／またはハイブリダイゼーション法と組み合わせた核酸増幅法を利用する場合もある。核酸の増幅は、検出の前に、目的の配列を増幅するのに使用されうる。しかし、核酸の増幅はまた、例えば、リアルタイムＰＣＲ法により、核酸を定量するためにも使用されうる。このような方法は、一般に、当業者に公知である。核酸増幅法は、例えば、ローリングサークル増幅［Liu, et al., “Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases,” J. Am. Chem. Soc. 1 18:1587-1594 (1996)における方法など］、等温増幅［Walker, et al., “Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique,” Nucleic Acids Res. 20(7): 1691-6 (1992)における方法など］、リガーゼ鎖反応［Landegren, et al., “A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,” Science 241 : 1077-1080, 1988；またはWiedmann, et al., “Ligase Chain Reaction (LCR)- Overview and Applications,” PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1994) pp. S51-S64における方法など］を含む。核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介型増幅（ＴＭＡ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、ＱＰ増幅を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の、多様な核酸増幅法のうちのいずれかにより達せられうる。ｃｉｒｃＲＮＡの増幅は、このようにして作製されたｃＤＮＡの増幅を後続させてもよい、ＲＮＡの、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写により開始しうることがたやすく理解されるであろう。
【0087】
ｃｉｒｃＲＮＡの存在またはレベルの決定の前に、ｃｉｒｃＲＮＡ以外のＲＮＡ（ｎｏｎ ｃｉｒｃＲＮＡ）を低減するまたは減少させることが所望されうる。この目的のために、ＲＮＡ分解剤が、試料および／またはその全単離核酸、例えば、全ＲＮＡへと添加されうるが、この場合、前記ＲＮＡ分解剤は、ｃｉｒｃＲＮＡを分解しないか、またはｃｉｒｃＲＮＡを、直鎖状ＲＮＡと比較して、低速に限り分解する。１つのこのような薬剤は、ＲＮアーゼＲである。ＲＮアーゼＲは、特に、細菌内のノンストップｍＲＮＡ（ｎｏｎ ｓｔｏｐ ｍＲＮＡ）の選択的ｍＲＮＡ分解に関与することが示されている［Cheng; Deutscher, MP et al. (2005). “An important role for RNase R in mRNA decay”. Molecular Cell 17(2):313- 318；およびVenkataraman, K; Guja, KE; Garcia-Diaz, M; arzai, AW (2014). “Non-stop mRNA decay: a special attribute of trans-translation mediated ribosome rescue.”; Frontiers in microbiology 5:93. Suzuki HI, Zuo Y, Wang J, Zhang MQ, Malhotra A, Mayeda A; Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre- mRNA splicing; Nucleic Acids Res. 2006 May 8;34(8):e63を参照されたい］ＲＮアーゼＩＩと近縁の３-５’エクソリボヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＲは、他の多くの生物において、相同体を有する。別の大型のタンパク質の一部が、ＲＮアーゼＲと、極めて類似するドメインを有する場合、これは、ＲＮアーゼＲドメインと呼ばれる。よって、好ましい実施形態において、試料は、全ＲＮＡ調製物から、直鎖状ＲＮＡアイソフォームを枯渇させ、これにより、検出感度を増大させる、ｃｉｒｃＲＮＡの決定の前に、ＲＮアーゼＲにより処理される。本明細書において概括される通り、単一のｃｉｒｃＲＮＡによる診断値または予後診断値は、信頼できる結果を伴う診断または予後診断を可能とするために、十分ではない場合がある。このような場合、試料中の、１つを超えるｃｉｒｃＲＮＡの存在またはレベルを決定することが所望されうるが、これらを、それぞれの対照レベルと比較してもよい。当業者は、これらの１つを超えるｃｉｒｃＲＮＡが、所定のｃｉｒｃＲＮＡのパネルから選び出されうることを認識するであろう。このようなパネルは、通例、信頼できる診断または予後診断を可能とするのに最小数のｃｉｒｃＲＮＡを含む。パネルのｃｉｒｃＲＮＡの数は、所望の信頼性、および／または例えば、単独において決定される場合に、組み入れられるｃｉｒｃＲＮＡによる予後診断値もしくは診断値に応じて変動しうる。よって、好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、ｃｉｒｃＲＮＡのパネルから、１つを超えるｃｉｒｃＲＮＡ、例えば、それぞれ、それらの存在もしくは非存在またはレベルを決定する。
【0088】
所望されるものを得るためのパネルは、必要に従い選び出されうる。特に、当業者は、ある特定のパネルの診断的有意性および／または予後診断的有意性について検証するために、本明細書において概括される統計学法を適用しうる。本明細書において、本発明者らは、神経変性疾患について、妥当な程度の確実性を与える、ある特定のｃｉｒｃＲＮＡのパネルの開発を示した。当業者は、ｃｉｒｃＲＮＡのパネルを開発するために、一般的な統計学法を適用しうる。このような統計学法は、クラスター分析（例えば、階層的クラスター化またはｋ-ｍｅａｎｓ法によるクラスター化）、主成分分析、または因子分析を含む。
【0089】
原則として、統計学的方法は、罹患対象の試料中および健常／正常対象の試料中において、異なる存在および／またはレベルを呈する、ｃｉｒｃＲＮＡまたはｃｉｒｃＲＮＡのパネルの同定を目的とする。概括される通り、パネルは、好ましくは、１つを超え、すなわち、複数のｃｉｒｃＲＮＡのパネルである。本発明の好ましい実施形態において、前記パネルは、疾患を有する患者の体液試料中、および疾患を有さない患者の体液試料中において、異なるレベルにおいて存在すると同定されている、複数のｃｉｒｃＲＮＡを含む。ｃｉｒｃＲＮＡのパネルは、好ましくは、主成分分析またはクラスター化により同定されている。「主成分分析」（ＰＣＡ）（やはり、本明細書において使用され、例示される）は、罹患対象と、健常対象との間において異なる因子についての解析に関する。ＰＣＡは、当業者に公知［Pearson K., “On lines and planes of closest fit to systems of points in space”, The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science 2.1 1 559-572 (1901)；およびHotelling H., “Analysis of a complex of statistical variables into principal components” Journal of educational psychology 24.6 417 (1933)を参照されたい］である。主成分分析のために選び出されるｃｉｒｃＲＮＡは、健常対象および／または罹患対象の試料中において、既に決定されたｃｉｒｃＲＮＡでありうる。さらなる解析のためのｃｉｒｃＲＮＡについて検討するために、好ましい実施形態において、試料のうちの１つにおいて、生リードカウントのばらつきを安定化させる変換の後において、少なくとも６．７の発現値を有するｃｉｒｃＲＮＡだけが、閾値として組み込まれうる。ＰＣＡは、「Ｒ」プログラム化言語［R Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0］による標準的な「統計学」パッケージのｐｒｃｏｍｐ関数を使用する解析に組み入れられるｃｉｒｃＲＮＡに対して実施されうる。選び出されるｃｉｒｃＲＮＡ、疾患、および他の因子に応じて、重みは変動しうる。しかし、当業者は、予測絶対値が最大となるｃｉｒｃＲＮＡを得るために、目的の主成分、すなわち、疾患／健常状態に関して、最大の重みを伴うｃｉｒｃＲＮＡが選び出されることを認識するであろう。ＰＣＡは、データセット内の変動量を可視化し、測定するのに使用される。数学的に、ＰＣＡとは、何らかのデータの射影による最大の変動が、主成分１（ＰＣ１）と呼ばれる第１の座標などの上に存在するように、データを、新規の座標系へと変換する、直交線形変換である。前出において言及された、重みの計算値とは、各環状ＲＮＡの、この特異的射影に対する距離を表す。したがって、この絶対値が大きいほど、この射影についての関連性は大きい。
【0090】
「階層的クラスター化」（本明細書においてまた、「クラスター化」とも称される）は、当技術分野において公知の［Murtagh, F and Conteras, P “Methods of hierarchical clustering” arXiv preprint arXiv: 1105.0121 (2011)において総説されている］通りに実施されうる。試料は、ｌｏｇ２変換により正規化されたｃｉｒｃＲＮＡ発現プロファイル［ｌｏｇ２（ｎｉ＋１）］においてクラスター化されうる。階層的な凝集クラスター化は、完全連結法により実施されてもよく、スピアマンランク相関（１-｛ｃｏｒｒ［ｌｏｇ（ｎ；＋１）］｝）を、距離計量としてさらに使用することにより実施されてもよい。「クラスター分析の目標は、同じクラスターへと割り当てられた観察の間の、対をなす相違が、異なるクラスターにおける相違より小さくなるように、観察（この場合のｃｉｒｃＲＮＡ発現）を、群（「クラスター」）へと分割することである」［Friedman J, Hastie T, and Tibshiriani R, “The elements of statistical learning”, Vol. 1. Soringer, Berlin: Springer series in statistics (2001)を参照されたい］。ここにおいて、相違についての尺度は、スピアマンランク相関として規定される。階層的クラスター化の視覚化および完全な記載は、系統樹によりもたらされる。
【0091】
本明細書において開示される通り、本開示の方法において有用な、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡは、各々についてのＲＮＡ配列が公知であり、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＥｎｔｒｅｚ ｇｅｎｅなどの公開データベースにおいて公表されている、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＡＤＧＲＢ３、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１、ｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６、ｃｉｒｃＶＣＡＮ、ｃｉｒｃＣＤＹＬ、ｃｉｒｃＣＵＬ５、ｃｉｒｃＳＯＢＰ、ｃｉｒｃＤＧＫＢ、ｃｉｒｃＡＤＡＲＢ１、ｃｉｒｃＭＶＢ１２Ｂ、ｃｉｒｃＮＤＳＴ３、ｃｉｒｃＮＥＢＬ、ｃｉｒｃＲＩＭＳ１、ｃｉｒｃＮＥＬＬ１、ｃｉｒｃＳＰＰＬ３、ｃｉｒｃＺＮＦ９１、ｃｉｒｃＰＡＮ３、ｃｉｒｃＵＢＡＰ２、ｃｉｒｃＬＩＮＣ００８６９、ｃｉｒｃＡＣ０１１９９５．１、ｃｉｒｃＦＴＯ、ｃｉｒｃＤＯＣＫ４、ｃｉｒｃＲＰ１－７３Ａ１４．１、ｃｉｒｃＨＮＲＮＰＭ、ｃｉｒｃＳＴ６ＧＡＬ２、ｃｉｒｃＱＫＩ、ｃｉｒｃＶＡＰＢ、ｃｉｒｃＳＬＣ３９Ａ１０、ｃｉｒｃＣＳＭＤ３、ｃｉｒｃＤＯＣＫ５、ｃｉｒｃＰＲＥＸ１、ｃｉｒｃＺＣ３Ｈ６、ｃｉｒｃＣ１６ｏｒｆ６２、ｃｉｒｃＲＰ５－１１１５Ａ１５．２、ｃｉｒｃＵＮＣ１３Ｃ、ｃｉｒｃＨＰ１ＢＰ３、ｃｉｒｃＵＢＥ３Ａ、ｃｉｒｃＳＬＣ８Ａ３、ｃｉｒｃＢＡＺ２Ｂ、ｃｉｒｃＳＬＣ８Ａ１、ｃｉｒｃＭＡＮ１Ａ２、ｃｉｒｃＣＯＬ４Ａ５、ｃｉｒｃＺＢＥＤ３－ＡＳ１、ｃｉｒｃＲＥＰＳ１、ｃｉｒｃＰＤＥ８Ａ、ｃｉｒｃＲＮＡ５ＳＰ８８、ｃｉｒｃＡＧＴＰＢＰ１、ｃｉｒｃＴＯＰ１、ｃｉｒｃＬ３ＭＢＴＬ４、ｃｉｒｃＲＰ１１－４０６Ａ９．２、ｃｉｒｃＭＥＩＳ３、ｃｉｒｃＢＰＴＦ、ｃｉｒｃＤＧＫＨ、ｃｉｒｃＰＲＯＳＣ、ｃｉｒｃＥＧＬＮ３、ｃｉｒｃＦＡＮＣＢ、ｃｉｒｃＳＬＣ３０Ａ７、ｃｉｒｃＵＲＩ１、ｃｉｒｃＲＥＰＳ２、ｃｉｒｃＲＰ１１－１０２３Ｌ１７．１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ１、ｃｉｒｃＴＡＳＰ１、ｃｉｒｃＡＴＰ８Ａ１、ｃｉｒｃＳＶ２Ｂ、ｃｉｒｃＵＳＰ５４、ｃｉｒｃＥＤＩＬ３、ｃｉｒｃＬＲＲＣ４９、ｃｉｒｃＰＳＥＮ１、ｃｉｒｃＡＭＤ１、ｃｉｒｃＬＹ８６－ＡＳ１、ｃｉｒｃＢＭＰＥＲ、ｃｉｒｃＰＴＫ２、ｃｉｒｃＡＲＨＧＥＦ２６、ｃｉｒｃＣＣＤＣ６６、ｃｉｒｃＡＰ３Ｂ１、ｃｉｒｃＡＴＧ４Ｃ、ｃｉｒｃＣＣＳＥＲ１、ｃｉｒｃＫＤＭ８、ｃｉｒｃＲＳＲＣ１、ｃｉｒｃＫＣＮＨ８、ｃｉｒｃＲＡＰＧＥＦ５、ｃｉｒｃＲＨＢＤＤ１、ｃｉｒｃＧＲＨＰＲ、ｃｉｒｃＺＮＦ４３０、ｃｉｒｃＨＡＴ１、ｃｉｒｃＳＬＣＯ１Ａ２、ｃｉｒｃＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ｃｉｒｃＣＡＤＰＳ、ｃｉｒｃＦＯＸＮ２、ｃｉｒｃＣＥＰ８５Ｌ、ｃｉｒｃＲＢＢＰ８、ｃｉｒｃＺＮＦ１４８、ｃｉｒｃＮＯＬ４、ｃｉｒｃＫＬＨＤＣ１、ｃｉｒｃＰＨＩＰ、ｃｉｒｃＳＰＡＳＴ、ｃｉｒｃＦＲＹＬ、ｃｉｒｃＮＲＣＡＭ、ｃｉｒｃＭＡＰＫ４、ｃｉｒｃＰＥＸ５Ｌ－ＡＳ１、ｃｉｒｃＳＬＣ４Ａ１０、ｃｉｒｃＤＹＮＣ１Ｈ１、ｃｉｒｃＬＰＸＮ、ｃｉｒｃＰＣＮＸ２、ｃｉｒｃＶＲＫ２、ｃｉｒｃＦＣＨＯ２、ｃｉｒｃＣ１０ｏｒｆ９０、ｃｉｒｃＫＨＤＲＢＳ３、ｃｉｒｃＬＺＩＣ、ｃｉｒｃＭＢＴＤ１、ｃｉｒｃＳＦＭＢＴ２、ｃｉｒｃＤＥＫ、ｃｉｒｃＳＬＣ４５Ａ４、ｃｉｒｃＲＮＦ１９Ｂ、ｃｉｒｃＲＮＦ１０、ｃｉｒｃＮＦＫＢ１、ｃｉｒｃＣＤＣ１４Ｂ、ｃｉｒｃＥＬＫ４、ｃｉｒｃＰＬＤ１、ｃｉｒｃＤＮＡＪＣ３、ｃｉｒｃＦＧＦ１４、ｃｉｒｃＳＨ３ＧＬ３、ｃｉｒｃＴＭＥＭ１３２Ｄ、ｃｉｒｃＬＲＢＡ、ｃｉｒｃＡＲＰＰ２１、ｃｉｒｃＡＡＧＡＢ、ｃｉｒｃＳＳＸ２ＩＰ、ｃｉｒｃＦＢＸＬ１７、ｃｉｒｃＡＰＰＬ１、ｃｉｒｃＵＢＸＮ２Ａ、ｃｉｒｃＧＲＩＮ２Ｂ、ｃｉｒｃＡＵＴＳ２、ｃｉｒｃＭＢＯＡＴ２、ｃｉｒｃＰＧＡＰ１、ｃｉｒｃＣＡＤＰＳ２、ｃｉｒｃＳＥＮＰ６、ｃｉｒｃＳＩＲＴ５、ｃｉｒｃＡＳＸＬ１、ｃｉｒｃＴＲＡＰＰＣ１２、ｃｉｒｃＡＴＥ１、ｃｉｒｃＲＩＭＳ２、ｃｉｒｃＳＯＲＢＳ１、ｃｉｒｃＭＡＭＬ２、ｃｉｒｃＩＱＣＫ、ｃｉｒｃＭＴＵＳ１、ｃｉｒｃＰＴＰＮ１３、ｃｉｒｃＦＢＸＯ７、ｃｉｒｃＴＥＲＦ２、ｃｉｒｃＭＥＤ１３、ｃｉｒｃＬＲＲＣ７、ｃｉｒｃＫＬＨＬ８、ｃｉｒｃＨＤＡＣ９、ｃｉｒｃＬＩＦＲ、ｃｉｒｃＥＭＬ２、ｃｉｒｃＦＥＲ、ｃｉｒｃＣＵＸ１、ｃｉｒｃＬＭＴＫ２、ｃｉｒｃＡＴＸＮ７、ｃｉｒｃＥＰ３００、ｃｉｒｃＴＢＣ１Ｄ１２、ｃｉｒｃＷＤＲ４９ ｃｉｒｃＥＬＭＯＤ３、ｃｉｒｃＣ１ｏｒｆ２７、ｃｉｒｃＮＲＸＮ１、ｃｉｒｃＲＥＸＯ４、ｃｉｒｃＦＳＩＰ１、ｃｉｒｃＳＴＸＢＰ５Ｌ、ｃｉｒｃＮＡＲＳ２、ｃｉｒｃＲＮＦ１３、ｃｉｒｃＦＡＭ２０８Ａ、ｃｉｒｃＨＩＰＫ３、ｃｉｒｃＡＲＨＧＡＰ３２、ｃｉｒｃＣ２ＣＤ５、ｃｉｒｃＫＩＡＡ０３６８、ｃｉｒｃＣＨＤ９、ｃｉｒｃＲＩＣＴＯＲ、ｃｉｒｃＥＲＩ３、ｃｉｒｃＡＲＨＧＡＰ１２、ｃｉｒｃＤＥＮＮＤ１Ａ、ｃｉｒｃＭＡＲＣＨ６、ｃｉｒｃＲＨＯＢＴＢ３、ｃｉｒｃＸＹＬＴ１、ｃｉｒｃＰＲＵＮＥ２、ｃｉｒｃＰＰＰ４Ｒ１、ｃｉｒｃＡＡＳＳ、ｃｉｒｃＫＣＮＭＡ１、ｃｉｒｃＧＰＳＭ２、ｃｉｒｃＧＲＭ８、ｃｉｒｃＰＸＫ、ｃｉｒｃＡＴＰ６Ｖ１Ｈ、ｃｉｒｃＵＢＥ２Ｄ２、ｃｉｒｃＡＮＡＰＣ２、ｃｉｒｃＭＤＧＡ２、ｃｉｒｃＶＰＳ３７Ｃ、ｃｉｒｃＮＦＡＳＣ、ｃｉｒｃＰＴＰＲＲ、ｃｉｒｃＨＤＡＣ５、ｃｉｒｃＵＳＰ３１、ｃｉｒｃＧＡＢ１、ｃｉｒｃＡＮＫＩＢ１、ｃｉｒｃＰＴＰＲＮ２、ｃｉｒｃＡＰ０００３０４．１２、ｃｉｒｃＰＬＰＰＲ５、ｃｉｒｃＰＲＫＡＲ１Ｂ、ｃｉｒｃＨＮＲＮＰＣ、ｃｉｒｃＫＩＦ６、ｃｉｒｃＵＳＰ３０、ｃｉｒｃＣＴＮＮＡ３、ｃｉｒｃＭＫＬＮ１、ｃｉｒｃＥＭＬ６、ｃｉｒｃＳＣＬＴ１、ｃｉｒｃＦＡＭ１２０Ａ、ｃｉｒｃＺＮＦ３６５、ｃｉｒｃＺＮＦ６０９、ｃｉｒｃＡＴＭ、ｃｉｒｃＡＲＨＧＡＰ５、ｃｉｒｃＩＱＧＡＰ１、ｃｉｒｃＢＡＲＤ１、ｃｉｒｃＮＳＤ１、ｃｉｒｃＲＮＦ１６９、ｃｉｒｃＨＭＢＯＸ１、ｃｉｒｃＦＣＨＳＤ２、ｃｉｒｃＲＰＳ６ＫＡ５、ｃｉｒｃＴＡＲＢＰ１、ｃｉｒｃＯＸＣＴ１、ｃｉｒｃＢＩＲＣ６、ｃｉｒｃＦＧＤ４、ｃｉｒｃＮＰＡＳ３、ｃｉｒｃＣＲＥＢＲＦ、ｃｉｒｃＥＩＦ４Ｇ３、ｃｉｒｃＧＬＩＳ２、ｃｉｒｃＤＵＴＰ７、ｃｉｒｃＣＮＯＴ２、ｃｉｒｃＶＷＡ３Ａ、ｃｉｒｃＯＳＢＰＬ１Ａ、ｃｉｒｃＡＲＦＧＥＦ２、ｃｉｒｃＣＡＳＰ８ＡＰ２、ｃｉｒｃＲＰ１１－１９１Ｌ９．４、ｃｉｒｃＳＵＺ１２、ｃｉｒｃＴＵＳＣ３、ｃｉｒｃＦＡＭ１３５Ａ、ｃｉｒｃＺＮＦ２９２、ｃｉｒｃＤＤＩ２、ｃｉｒｃＰＳＭＢ１、ｃｉｒｃＥＸＯＣ６Ｂ、ｃｉｒｃＮＯＸ４、ｃｉｒｃＰＤＥ８Ａ、ｃｉｒｃＳＯＳ２、ｃｉｒｃＲＥＲＥ、ｃｉｒｃＲＧＳ７、ｃｉｒｃＣＬＩＰ４、ｃｉｒｃＲＥＬＬ１、ｃｉｒｃＳＮＴＧ１、ｃｉｒｃＣＮＴＮＡＰ５、ｃｉｒｃＺＮＦ６５２、ｃｉｒｃＨＩＰＫ３、ｃｉｒｃＤＭＤ、ｃｉｒｃＢＢＸ、ｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１、ｃｉｒｃＲＢＭ３９、ｃｉｒｃＡＲＡＰ２、ｃｉｒｃＺＣ３Ｈ１３、ｃｉｒｃＣＳＭＤ１、ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ６、ｃｉｒｃＳＡＭＤ４Ａ、ｃｉｒｃＣＡＰ２、ｃｉｒｃＡＴＸＮ１０、ｃｉｒｃＡＲＨＧＡＰ２６、ｃｉｒｃＲＰ１１－２２３Ｐ１１．３、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＮＳＤ１、ｃｉｒｃＧＰＢＰ１Ｌ１、ｃｉｒｃＮＥＵＲＬ１、ｃｉｒｃＳＳＨ２、ｃｉｒｃＥＭＢを含むがこれらに限定されない。
【0092】
本明細書において開示される、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡは、対象から得られた生物学的試料中において、参照値と比べて、示差的に発現されるものとして同定される、特徴的プロファイルを包含する。例えば、下記の実施例を参照されたい。多様な実施形態において、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルの決定は、アミロイドプラークの存在、非存在を決定するアッセイ、精密Ｘ線アッセイ、および診断アッセイなどの診断アッセイにより補充されうる。
【0093】
一部の実施形態において、方法は、少なくとも１つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０つのｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも３９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４２のｃｉｒｃＲＮＡ、または少なくとも４３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも４９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも５９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも６９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも７９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも８９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも９９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１００のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１０９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１０のｃｉｒｃＲＮＡの少なくとも１１１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１１９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１２９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１３９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１４９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１５９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１６９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１７９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１８９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９０のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９１のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９２のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９３のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９４のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９５のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９６のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９７のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９８のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも１９９のｃｉｒｃＲＮＡ、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを決定する工程を含みうる。
【0094】
本発明者らは、神経変性疾患、特に、アルツハイマー病について、上記において概括された方法について例示した。本発明との関連における神経変性疾患は、神経変性と関連する疾患として理解されるものとする。神経変性は、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性喪失を意味する。ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病を含む、多くの神経変性疾患は、神経変性過程の結果として生じる。今日、細胞内レベルにおいて、これらの疾患を互いと関連づける、多くの類似性が存在する。異なる神経変性障害の間には、非定型のタンパク質アセンブリー（タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集）の他、細胞死の誘導を含む、多くの相似性が見られる。神経変性は、分子レベル～全身レベルの範囲にわたる、多くの異なるレベルの神経回路において見出されうる。よって、好ましい実施形態において、本発明の疾患は、好ましくは、アルツハイマー病、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびハンチントン病の群から選択される、神経変性疾患である。特に好ましい実施形態において、疾患は、アルツハイマー病である。アルツハイマー病は、脳内における、異常にフォールディングしたアミロイドベータタンパク質およびタウタンパク質のプラークの蓄積を引き起こす、タンパク質ミスフォールディング疾患（プロテオパチー）として同定されている。プラークは、アミロイドベータ（Ａβ）呼ばれる、３９～４３アミノ酸の長さの小型ペプチドから構成される。Ａβは、大型のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来する断片である。ＡＰＰは、ニューロンの膜を貫通する、膜貫通タンパク質である。ＡＰＰは、ニューロンの増殖、生存、および損傷後修復に極めて重要である。アルツハイマー病においては、タンパク質分解過程における未知の酵素が、ＡＰＰを、小型の断片へと分割する。これらの断片のうちの１つは、アミロイドベータの原線維をもたらし、次いで、老人斑としての公知の稠密な形態において、ニューロンの外部に沈着する集塊を形成する。ＡＤはまた、タウタンパク質の異常凝集に起因するタウオパシーとも考えられる。ＡＤにおいて、タウは、化学変化を受け、過剰リン酸化し、次いで、他のスレッドと対合し、神経原線維変化をもたらし、ニューロンの輸送系を解体する。患者は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＮＣＤＳ）およびＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＲＤＡ；現在は、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとして公知である）、ＮＩＮＣＤＳ-ＡＤＲＤＡ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、１９８４年、２００７年全面改訂［McKhann G, Drachman D, Folstein M, et al. Clinical Diagnosis of Alzheimer’s disease: Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the Auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s disease. Neurology. 1984;34(7):939-44；およびDubois B, Feldman HH, Jacova C, et al. Research Criteria for the Diagnosis of Alzheimer’s disease: Revising the NINCDS-ADRDA Criteria. Lancet Neurology. 2007;6(8):734-469を参照されたい］により設定された基準に従い、アルツハイマー病を有すると分類される。これらの基準は、認知機能障害の存在および認知症症候群の疑いが、アルツハイマー病の可能性または推定についての臨床診断のための神経心理学的検査により確認されることを要求する。確定診断のためには、脳組織についての顕微鏡検査を含む、組織病理学的確認が要求される。診断基準と確定組織病理学確認との間において、良好な統計学的信頼性および妥当性が示されている［Blacker D, Albert MS, Bassett SS, et al. Reliability and validity of NINCDS-ADRDA criteria for Alzheimer’s disease. The National Institute of Mental Health Genetics Initiative. Archives of Neurology. 1994;51(12):1198-204を参照されたい］。ＡＤにおいて、８つの認知ドメイン（記憶力、言語技能、知覚能力、注意能力、構成能力、見当識、問題解決能力、および機能的能力）が、最も一般に機能障害を受ける。これらのドメインは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎにより公表されている、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ-ＩＶ-ＴＲ）において一覧されているＮＥＮＣＤＳ-ＡＤＲＤＡ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｃｒｉｔｅｒｉａと同等である。
【0095】
本開示の別の態様は、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害への転換の危険性が高い、前症状性対象または無症状性対象または対象として診断し、適宜、ＡＤに起因するＭＣＩの発生までの年数との関係において、対象を病期分類または分類する方法を包含する。前症状性または無症状性とは、ＡＤの危険性があるか、またはＡＤについてのマーカーを有するが、認知機能障害の徴候を示さない対象を指す。アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知機能障害（ＭＣＩ）とは、ＡＤの、症状性の前認知症期を指す。この認知機能障害の程度は、年齢に正常ではないので、年齢関連記憶機能障害および年齢関連認知低下などの概念構築は該当しない。ＡＤに起因するＭＣＩは、臨床診断であり、ＡＤに起因するＭＣＩの診断のための臨床基準は、当技術分野において公知である。例えば、Albert et al. Alzheimer’s & Dementia, 2011, 7(3): 270-279を参照されたい。認知検査は、対象について、認知機能障害の程度を、客観的に評価するために最適である。ＭＣＩを伴う対象についての認知検査におけるスコアは、典型的に、文化的に適切な規範的データ［すなわち、入手可能な場合、機能障害領域（複数可）についての規範的データ］における、それらの年齢および教育をマッチさせた同等者についての平均値を、１～１．５標準偏差下回る。ＭＣＩの指定は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ（ＣＤＲ）スケールにおける、０．５の全般評定により裏付けられることが多い。ＣＤＲとは、認知症の症状の重症度を定量するのに使用される数値スケールである。他の適切な認知検査は、当技術分野において公知である。当技術分野において、認知機能障害の重症度について評価するのに適する検査は存在するが、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩの発生の数年前に、高度の信頼性により同定する検査が必要とされている。
【0096】
一実施形態において、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の危険性が高い対象として診断する方法は、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程；測定されたｃｉｒｃＲＮＡ発現レベルが、参照値から隔たる場合に、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の危険性が高い対象として診断する工程を含みうる。別の実施形態において、対象を、無症状性ＡＤ対象として診断する方法は、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程；測定されたｃｉｒｃＲＮＡ発現レベルが、参照値から隔たる場合に、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の危険性が高い対象として診断する工程を含みうる。「無症状性対象」とは、ＡＤの徴候または症状を示さない対象を指す。しかし、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または行動の変化など）を呈しうるが、軽度認知機能障害の臨床診断に十分な認知機能障害または身体機能障害を示さない場合がある。さらなる実施形態において、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを保有しうる。代替的な実施形態において、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を保有しない場合がある。特異的家系を有さないアルツハイマー病は、散発性アルツハイマー病と称される。
【0097】
本開示の別の態様は、対象のアルツハイマー病の病期を診断する方法を包含する。多様な実施形態において、「ＡＤの病期」は、ＡＤに起因するＭＣＩの発生から経過した時間の長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月間など）として規定されうる。ＡＤの臨床診断のための基準が存在するが、臨床状況においては、所与の対象について、症状発生のタイミングが未知であるか、またはＭＣＩまたはＡＤについて、疑問の余地のある診断がなされることが一般的である。このように、当技術分野において、対象のＡＤの病期を客観的に診断する検査結果が必要とされている。
【0098】
一実施形態において、対象のＡＤの重症度を診断する方法は、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程；測定されたｃｉｒｃＲＮＡ発現レベルが、健常対象（複数可）の参照値から隔たるか、または疾患重症度が同様である対象による参照値と同じである、または同様である場合に、対象におけるＡＤの重症度を分類する工程を含みうる。別の態様において、本開示は、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する認知症を有する対象であると診断する方法であって、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程；測定されたｃｉｒｃＲＮＡ発現レベルが、健常対象（複数可）の参照値から隔たるか、または認知症を伴う対象（複数可）による参照値と同様である場合に、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する認知症を有する対象として診断する工程を含む方法を包含する。
【0099】
別の態様において、本開示は、対象を、臨床試験へと登録するための方法であって、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程を含む方法を包含する。
【0100】
一態様において、上記の方法の各々は、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＩＡＴＲＮＬ１、およびｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１から選択される、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを検出する工程を含みうる。
【0101】
別の態様において、上記の方法の各々は、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＡＤＧＲＢ３、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６から選択される、１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを検出する工程を含みうる。
【0102】
一部の実施形態において、対象は、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４、ｃｉｒｃＣＤＲ１－ＡＳ、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＴＴＬＬ７、ｃｉｒｃＦＡＮＣＬ、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃ、ｃｉｒｃＷＤＲ７８、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＰＩＣＡＬＭ、ｃｉｒｃＲＮＡＳＥＨ２Ｂ、ｃｉｒｃＰＨＣ３、ｃｉｒｃＬＰＡＲ１、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ２、ｃｉｒｃＹＹ１ＡＰ１およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６が、参照値と比べて増大しており、かつ／またはｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＥＰＢ４１Ｌ５、ｃｉｒｃＤＧＫＩ、ｃｉｒｃＫＡＴＮＡＬ２、ｃｉｒｃＰＬＥＫＨＭ３、ｃｉｒｃＰＤＥ４Ｂ、ｃｉｒｃＦＡＴ３、ｃｉｒｃＭＬＩＰ、ｃｉｒｃＳＰＨＫＡＰ、およびｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６のうちの１つまたは複数が、参照値と比べて減少している場合に、疾患状態または疾患重症度を伴うと分類される。
【0103】
ＩＩＩ．処置
本開示の別の態様は、それを必要とする対象を処置するための方法である。本明細書において使用される、「～を処置する」、「～を処置すること」、または「処置」という用語は、トレーニングを受け、有資格の専業者による、それを必要とする対象への、医療ケアの提供を指す。医療ケアは、診断検査、治療的処置、および／または予防的措置もしくは防止的措置でありうる。治療的処置および予防的処置の目的は、所望されない生理学的変化または疾患／障害を防止するか、または緩徐化する（軽快させる）ことである。治療的処置または予防的処置の、有益な臨床結果または所望の臨床結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予期される生存と比較した、生存の延長も意味しうる。処置を必要とする対象は、疾患、状態、もしくは障害を既に伴う対象の他、疾患、状態、もしくは障害を有する傾向がある対象または疾患、状態、もしくは障害が防止されるべき対象を含む。一部の実施形態において、処置を受ける対象は、無症状性である。本明細書において使用される、「無症状性対象」とは、ＡＤの徴候または症状を示さない対象を指す。他の実施形態において、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または行動の変化など）を呈しうるが、アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害または認知症の臨床診断に十分な認知機能障害または身体機能障害を示さない場合がある。「アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害」という語句については、上記において規定された。症状性対象または無症状性対象は、Ａβアミロイドーシスを有しうるが、Ａβアミロイドーシスについての予備知識は、処置に必須ではない。さらなる実施形態において、対象は、ＡＤを有する対象として診断されうる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを保有しうる。代替的な実施形態において、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を保有しない場合がある。
本開示の別の態様は、それを必要とする対象を処置するための方法である。本明細書において使用される、「～を処置する」、「～を処置すること」、または「処置」という用語は、トレーニングを受け、有資格の専業者による、それを必要とする対象への、医療ケアの提供を指す。医療ケアは、診断検査、治療的処置、および／または予防的措置もしくは防止的措置でありうる。治療的処置および予防的処置の目的は、所望されない生理学的変化または疾患／障害を防止するか、または緩徐化する（軽快させる）ことである。治療的処置または予防的処置の、有益な臨床結果または所望の臨床結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予期される生存と比較した、生存の延長も意味しうる。処置を必要とする対象は、疾患、状態、もしくは障害を既に伴う対象の他、疾患、状態、もしくは障害を有する傾向がある対象または疾患、状態、もしくは障害が防止されるべき対象を含む。一部の実施形態において、処置を受ける対象は、無症状性である。本明細書において使用される、「無症状性対象」とは、ＡＤの徴候または症状を示さない対象を指す。他の実施形態において、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば、記憶喪失、物の置き忘れ、気分または行動の変化など）を呈しうるが、アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害または認知症の臨床診断に十分な認知機能障害または身体機能障害を示さない場合がある。「アルツハイマー病に起因する軽度認知機能障害」という語句については、上記において規定された。症状性対象または無症状性対象は、Ａβアミロイドーシスを有しうるが、Ａβアミロイドーシスについての予備知識は、処置に必須ではない。さらなる実施形態において、対象は、ＡＤを有する対象として診断されうる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいて、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを保有しうる。代替的な実施形態において、対象は、優性遺伝性のアルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を保有しない場合がある。
【0104】
一実施形態において、上記において記載された対象を処置するための方法は、対象に由来する生物学的試料を用意するか、またはこれが用意されている工程；試料中の１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを検出する工程；１つまたは複数のｃｉｒｃＲＮＡのレベルを、参照値と比較する工程；ｃｉｒｃＲＮＡレベル（複数可）が、参照値から隔たる場合に、医薬組成物を、対象へと投与する工程を含みうる。一部の実施形態において、医薬組成物は、ｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルを、直接的に、または間接的に（ｉｎｄｉｒｅｃｔ）安定化させるか、または是正し、一部の実施形態において、参照値を上回るか、またはこれを下回る変化の程度は、対象を処置するための基準として使用されうる。
【0105】
多くのイメージング剤および治療剤が、ＡβアミロイドーシスまたはＡＤを発症する危険性がある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパシーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象、標的特異的な病態生理的変化のために想定されるか、またはこれらにより使用される。例えば、Ａβターゲティング療法は、一般に、Ａβの産生を減少させるか、Ａβの凝集をアンタゴナイズするか、または脳内Ａβのクリアランスを増大させるようにデザインされ；タウターゲティング療法は、一般に、タウのリン酸化パターンを変更するか、タウの凝集をアンタゴナイズするか、またはＮＦＴのクリアランスを増大させるようにデザインされ；様々な治療は、ＣＮＳ炎症または脳インスリン抵抗性を低減するようにデザインされるなどである。
【0106】
ある特定の態様において、治療有効量の医薬組成物が、対象へと投与されうる。投与は、末梢投与法（すなわち、中枢神経系への投与によらない）または中枢神経系への局所投与法を含む、標準的な効果的技法を使用して実施される。末梢投与は、経口投与、吸入投与、静脈内投与、腹腔内投与、関節内投与、皮下投与、肺内投与、経皮投与、筋内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、または坐剤投与を含むがこれらに限定されない。局所投与は、腰椎カテーテル、脳室内カテーテル、もしくは実質内カテーテルを介して、または外科的植込み型制御放出製剤の使用を含むがこれらに限定されない。投与経路は、処置される疾患または状態により指定されうる。
【0107】
選択される投与方式に適切となるように、効果的な投与のための医薬組成物が慎重にデザインされ、必要に応じて、適合性の分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤など、薬学的に許容される賦形剤が使用される。参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, latest editionは、医療従事者に一般に公知の製剤法についての総覧を提示している。
【0108】
上記の実施形態の各々において、医薬組成物は、イメージング剤を含みうる。イメージング剤の非限定例は、機能的なイメージング剤［例えば、フルオロデオキシグルコースなど）および分子的イメージング剤（例えば、ＰＩＢ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ）、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモール、放射性核種標識化抗体など］を含む。
【0109】
代替的に、医薬組成物は、有効医薬成分を含みうる。有効医薬成分の非限定例は、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ-メチルＤ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤（例えば、選択的セロトニン再取込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニン、およびノルエピネフリン再取込み阻害剤、三環系抗うつ剤など）、ガンマ-セクレターゼ阻害剤、ベータ-セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（その抗原結合性断片、変異体、または誘導体を含む）、抗タウ抗体（その抗原結合性断片、変異体、または誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助剤（例えば、リチウム水、リポ酸を伴うオメガ-３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニスタイン、レスベラトロール、クルクミン、およびブドウ種子抽出物など）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、能動ワクチン（例えば、ＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えば、ＴＲｘ０２３７、メチルチオニウム塩化物など）、血糖コントロールを改善する治療（例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチド、ピオグリタゾンなど）、抗炎症性薬剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ-１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断剤、ＣＢ１エンドカンナビノイド受容体パーシャルアゴニストおよび／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体パーシャルアゴニスト、β-２アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５-ＨＴ２Ａインバースアゴニスト、アルファ-２ｃアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、５-ＨＴ １Ａ受容体アゴニストおよび５-ＨＴ １Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養因子、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体調節因子、ＰＰＡＲ-ガンマアゴニスト、微小管タンパク質調節因子、カルシウムチャネル遮断剤、降圧剤、スタチン、およびこれらの任意の組合せを含む。
【0110】
一部の実施形態において、最小用量が投与され、用量は、用量制限毒性の非存在下において漸増される。治療有効用量の決定および調整の他、このような調整を、いつ、どのようにして行うのかについての査定は、医薬技術分野の当業者に公知である。
【0111】
投与頻度は、症状を効果的に処置するのに必要な限りにおいて、毎日、または毎週１回、２回、３回、もしくはこれを超える頻度、または毎月でありうる。疾患自体および処置の持続期間に対する、処置の実施のタイミングは、症例を取り巻く状況により決定されるであろう。救急医療担当者により投与される、損傷部位における処置など、処置は即時に始まりうるであろう。処置は、病院自体または診察室自体において始まる場合もあり、後の時点において、退院の後に、または外来診察室における診察の後に始まる場合もある。処置の持続期間は、単回ベースにおいて実施される単回投与から、生涯にわたる治療的処置コースの範囲にわたりうるであろう。
【0112】
典型的な投与量レベルは、標準的な臨床技法を使用して、決定および最適化される場合があり、投与方式に依存するであろう。
【0113】
対象は、齧歯動物、ヒト、家畜、愛玩動物、または動物園動物でありうる。一実施形態において、対象は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、モルモットなどでありうる。別の実施形態において、対象は、家畜でありうる。適切な家畜の非限定例は、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびアルパカを含みうる。さらに別の実施形態において、対象は、愛玩動物でありうる。愛玩動物の非限定例は、イヌ、ネコ、ウサギ、および鳥類などのペットを含みうる。さらに別の実施形態において、対象は、動物園動物でありうる。本明細書において使用される、「動物園動物」とは、動物園において見出されうる動物を指す。このような動物は、非ヒト霊長動物、大型ネコ、オオカミ、およびクマを含みうる。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。
【0114】
加えて、それを必要とする対象は、咽頭炎を患うか、これを患うことが疑われるか、またはこの危険性がある対象でありうる。
【0115】
ＩＶ．キット
キットもまた提供される。このようなキットは、本明細書において記載される薬剤または組成物と、ある特定の実施形態において、投与のための指示書とを含みうる。このようなキットは、本明細書において記載される方法の実施を容易としうる。キットとして供給される場合、組成物の異なる構成要素は、個別の容器内にパッケージングされ、使用の直前に混合されうる。構成要素は、システム、アッセイ、プライマー、またはソフトウェアを含むがこれらに限定されない。このような成分のパッケージングは、所望の場合、組成物を含有する、１つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたはディスペンサーデバイスにより、個別に提供されうる。パックは、例えば、ブリスターパックなど、金属製またはプラスチック製のフォイルを含みうる。このような成分の個別のパッケージングはまた、ある特定の場合に、成分の活性を失わずに、長期にわたる保管も可能としうる。
キットもまた提供される。このようなキットは、本明細書において記載される薬剤または組成物と、ある特定の実施形態において、投与のための指示書とを含みうる。このようなキットは、本明細書において記載される方法の実施を容易としうる。キットとして供給される場合、組成物の異なる構成要素は、個別の容器内にパッケージングされ、使用の直前に混合されうる。構成要素は、システム、アッセイ、プライマー、またはソフトウェアを含むがこれらに限定されない。このような成分のパッケージングは、所望の場合、組成物を含有する、１つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたはディスペンサーデバイスにより、個別に提供されうる。パックは、例えば、ブリスターパックなど、金属製またはプラスチック製のフォイルを含みうる。このような成分の個別のパッケージングはまた、ある特定の場合に、成分の活性を失わずに、長期にわたる保管も可能としうる。
【0116】
キットはまた、例えば、別個にパッケージングされた凍結乾燥有効成分へと添加される、滅菌水または生理食塩液など、別個の容器内の試薬も含みうる。例えば、密封型ガラス製アンプルは、凍結乾燥成分、および別個のアンプル内に、その各々が窒素などの中性非反応性ガス下においてパッケージングされ滅菌水、滅菌生理食塩液とを含有しうる。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、または典型的に、試薬を保持するのに利用される、他の任意の材料など、任意の適する材料からなりうる。適切な容器の他の例は、アンプルと類似の物質から作製されたボトル、およびアルミニウムまたは合金などのフォイルにより内張りされた内部からなりうる被覆を含む。他の容器は、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどを含む。皮下注射針により穿刺されうる止栓を有するボトルなど、容器は、滅菌アクセスポートを有しうる。他の容器は、除去すると、成分が混ざることを可能とする、たやすく除去可能な膜により分離された、２つのコンパートメントを有しうる。除去可能膜は、ガラス製、プラスチック、ゴムなどでありうる。
【0117】
ある特定の実施形態において、キットは、指示書材料と共に提供されうる。指示書は、紙または他の基板上に印刷される場合もあり、かつ／または電子的読取りメディアまたはビデオとして供給される場合もある。詳細な指示書は、キットと物理的に随伴せず、ユーザーが、キットの製造元または販売元により指定されたインターネットのウェブサイトへと誘導される場合もある。
【0118】
本明細書において記載される対照試料または参照試料は、健常対象に由来する試料の場合もあり、無作為化対象群に由来する試料の場合もある。参照値は、健常対象または健常対象の群から既に得られた、対照試料または参照試料の代わりに使用されうる。対照試料または参照試料はまた、既知量の検出可能な化合物を伴う試料またはスパイク試料でもありうる。
【0119】
本発明の方法およびアルゴリズムは、コントローラー内またはプロセッサー内に格納されうる。さらに、本発明の方法およびアルゴリズムは、コンピュータ実装法として実施される場合もあり、１つまたは複数のこのようなコンピュータ実装法を実施するための方法として実施される場合もあり、また、コンピュータプログラムまたは他のマシン読取り型命令（本明細書における「コンピュータプログラム」）を含有する、有形または非一時的なコンピュータ読取り型記憶メディアの形態において実施される場合もあり、ここにおいて、コンピュータプログラムが、コンピュータまたは他のプロセッサー（本明細書における「コンピュータ」）へとロードされ、かつ／またはコンピュータにより実行される場合、コンピュータは、１つまたは複数の方法を実施するための装置となる。このようなコンピュータプログラムを含有するための記憶メディアは、例えば、フロッピーディスクおよびディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）-ＲＯＭ（書き込み可能な場合であれ、そうでない場合であれ）、ディジタルＤＶＤディスク、ＲＡＭメモリおよびＲＯＭメモリ、コンピュータハードドライブおよびバックアップドライブ、外付けハードドライブ、「サム」ドライブ、およびコンピュータにより読み取り可能な、他の任意の記憶メディアを含む。１つまたは複数の方法はまた、例えば、記憶メディアに保存されるのであれ、電導体、光ファイバー、または他の光導体などの伝送媒体を介して、または電磁放射線により伝送されるのであれ、コンピュータプログラムの形態において実施される場合もあり、ここにおいて、コンピュータプログラムが、コンピュータへとロードされ、かつ／またはコンピュータにより実行される場合、コンピュータは、１つまたは複数の方法を実施するための装置となる。１つまたは複数の方法は、汎用マイクロプロセッサー、または１つもしくは複数のプロセスを実施するように特定して構成された、ディジタルプロセッサー上において実装されうる。汎用マイクロプロセッサーが利用される場合は、コンピュータプログラムコードが、特定的論理回路配置を創出するように、マイクロプロセッサーの回路を構成する。コンピュータにより読み取り可能な記憶メディアは、コンピュータ自体により、またはコンピュータに、その演算を制御するための命令を与えるための、コンピュータ命令を読み取る、別のマシンにより読み取り可能なメディアを含む。このようなマシンは、例えば、上記において言及された記憶メディアを読み取るためのマシンを含みうる。
【0120】
一般的技法
本開示の実施は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学についての従来の技法を利用するであろう。このような技法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)などの文献において完全に記載されている。
本開示の実施は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学についての従来の技法を利用するであろう。このような技法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)などの文献において完全に記載されている。
【0121】
さらなる詳細化なしに述べると、当業者は、上記の記載に基づき、本発明を完全に利用しうると考えられる。したがって、以下の具体的実施形態は、本開示の残余の部分に対して、例示的なものと見なされるべきであり、いかなる形であれ、限定的なものと見なされるべきではない。本明細書において引用される、全ての刊行物は、本明細書において言及される目的または対象物のために、参照により組み込まれる。
【0122】
本発明の範囲から逸脱しない限り、上記において記載された材料および方法においては、多様な変化がなされうるので、上記の記載および下記において示される実施例に含有される、全ての対象物は、例示的な意味において解釈されるものとし、限定的な意味においては解釈されないものとすることが意図される。
【実施例】
【0123】
以下の実施例は、本開示の多様な実施形態を裏付けるように組み入れられる。当業者により、後続の実施例において開示される技法は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らにより発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい方式を構成すると考えられうることが理解されるものとする。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的実施形態において、多くの変化がなされる場合があるが、なおかつ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、同じ結果または同様の結果を得うることを理解されたい。
［実施例１］
［実施例１］
【0124】
アルツハイマー病脳内の、大脳皮質環状ＲＮＡ発現についてのアトラスは、臨床的関連および病理学的関連を裏付ける
転写調節は、ヒト神経系の複雑性の根底をなし、その誤調節は、疾患に寄与しうる［Lee, T.I., et al., Cell 152, 1237-1251 (2013)］。実際、直鎖状トランスクリプトームに焦点を当てた、いくつかの研究は、ＡＤ状態と関連する共発現ネットワーク、およびスプライシングの変化を同定している［Zhang, B. et al., Cell 153, 707-720 (2013); Karch C.M. Et al., PloS One &, e50976 (2012); Raj, T. et al., Nat. Genet. 50, 1584 (2018); Vereijen, J. et al., Trends Genet. TIG 34, 434-447 (2018)］。本実施例は、ＡＤ関連環状トランスクリプトームに対する洞察を提示する。頭頂葉皮質のＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-ｓｅｑ）データを、Ｋｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）のアルツハイマー病（ＡＤ）を伴う個体およびアルツハイマー病を伴わない個体（ＡＤ；ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３；ｎＡＤ＝８３）から作成した。このＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット、および独立の［Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（ＭＳＢＢ）］ＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットを使用して、大脳皮質環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の発現を、ＡＤの文脈において定量した。ｃｉｒｃＲＮＡ発現と、ＡＤ診断、臨床的認知症重症度、および神経病理学的重症度との間において、有意な関連を同定した。大半のｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連は、コグネイトの直鎖状メッセンジャーＲＮＡ発現の変化、または推定脳細胞型比率に依存しないことが裏付けられた。前症状性ＡＤおよび常染色体優性ＡＤにおいて早期に生じる、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化についての証拠が提示される。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、公知のＡＤ遺伝子と共に、共発現されたこともまた、観察された。最後に、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡにおいて、ＡＤ遺伝子をターゲティングすることが予測される、ｍｉＲＮＡに対する潜在的なマイクロＲＮＡ結合性部位を同定した。まとめると、これらの結果は、非直鎖状ＲＮＡを解析することの重要性を強調し、ＡＤの発症機序における、ｃｉｒｃＲＮＡの潜在的な役割について探索する、将来の研究を裏付ける。
転写調節は、ヒト神経系の複雑性の根底をなし、その誤調節は、疾患に寄与しうる［Lee, T.I., et al., Cell 152, 1237-1251 (2013)］。実際、直鎖状トランスクリプトームに焦点を当てた、いくつかの研究は、ＡＤ状態と関連する共発現ネットワーク、およびスプライシングの変化を同定している［Zhang, B. et al., Cell 153, 707-720 (2013); Karch C.M. Et al., PloS One &, e50976 (2012); Raj, T. et al., Nat. Genet. 50, 1584 (2018); Vereijen, J. et al., Trends Genet. TIG 34, 434-447 (2018)］。本実施例は、ＡＤ関連環状トランスクリプトームに対する洞察を提示する。頭頂葉皮質のＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-ｓｅｑ）データを、Ｋｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）のアルツハイマー病（ＡＤ）を伴う個体およびアルツハイマー病を伴わない個体（ＡＤ；ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３；ｎＡＤ＝８３）から作成した。このＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット、および独立の［Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（ＭＳＢＢ）］ＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットを使用して、大脳皮質環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の発現を、ＡＤの文脈において定量した。ｃｉｒｃＲＮＡ発現と、ＡＤ診断、臨床的認知症重症度、および神経病理学的重症度との間において、有意な関連を同定した。大半のｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連は、コグネイトの直鎖状メッセンジャーＲＮＡ発現の変化、または推定脳細胞型比率に依存しないことが裏付けられた。前症状性ＡＤおよび常染色体優性ＡＤにおいて早期に生じる、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化についての証拠が提示される。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、公知のＡＤ遺伝子と共に、共発現されたこともまた、観察された。最後に、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡにおいて、ＡＤ遺伝子をターゲティングすることが予測される、ｍｉＲＮＡに対する潜在的なマイクロＲＮＡ結合性部位を同定した。まとめると、これらの結果は、非直鎖状ＲＮＡを解析することの重要性を強調し、ＡＤの発症機序における、ｃｉｒｃＲＮＡの潜在的な役割について探索する、将来の研究を裏付ける。
【0125】
方法
コードの利用可能性：関連するコマンドフラグを含む、全てのソフトウェアが、本実施例のために、どのように使用されてきたのか、解析のために使用される方法およびコードに、どのように組み入れられるのかについての記載は、参照により本明細書に組み込まれる、Dube, U., Del-Aguila, J.L., Li, Z. et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci 22, 1903-1912 (2019)において提示されている。
コードの利用可能性：関連するコマンドフラグを含む、全てのソフトウェアが、本実施例のために、どのように使用されてきたのか、解析のために使用される方法およびコードに、どのように組み入れられるのかについての記載は、参照により本明細書に組み込まれる、Dube, U., Del-Aguila, J.L., Li, Z. et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci 22, 1903-1912 (2019)において提示されている。
【0126】
ＲＮＡシーケンシング
発見（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）データセットおよび常染色体優性ＡＤ（ＤＩＡＮ）データセット：１５１ヌクレオチド（ｎｔ）のペアドエンドｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-ｓｅｑ）データは、凍結脳頭頂葉皮質組織から作成した。凍結脳組織は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおける、プロスペクティブＫｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ研究、またはＤｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＡＮ）研究における参加者により提供された。全ての参加者は、脳の提供および神経病理学的解析に同意した。まず、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴを使用して、凍結大脳皮質組織を破壊し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、この破壊された組織から、ＲＮＡを精製した。ＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上において、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙを使用して計算した。抽出されたＲＮＡはまた、Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）上において、Ｑｕａｎｔ-ｉＴ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を使用しても定量した。ライブラリー構築の前に、Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ）［Pine, P.S. et al., BMC Biotechnol. 16, 54 (2016)］ＲＮＡ Ｓｐｉｋｅ-Ｉｎ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を導入した。ｒＲＮＡ枯渇ｃＤＮＡライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ-Ｚｅｒｏ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して調製し、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓの、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおける、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００上においてシーケンシングした。全ての試料は、シーケンシングの前に、シーケンシングプールへと無作為に割り当て、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として、ＲＮＡの抽出およびシーケンシングライブラリーの調製を実施した。個体１例当たりの生シーケンシングリードの平均数は、５８，０９４，６８３であった；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Umber, D., et al., Nat. Neurosci. 22(110); 1903-1912 (2019), Supplemental Table 6を参照されたい。
発見（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）データセットおよび常染色体優性ＡＤ（ＤＩＡＮ）データセット：１５１ヌクレオチド（ｎｔ）のペアドエンドｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-ｓｅｑ）データは、凍結脳頭頂葉皮質組織から作成した。凍結脳組織は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおける、プロスペクティブＫｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）Ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ研究、またはＤｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＡＮ）研究における参加者により提供された。全ての参加者は、脳の提供および神経病理学的解析に同意した。まず、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＬＴを使用して、凍結大脳皮質組織を破壊し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、この破壊された組織から、ＲＮＡを精製した。ＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）上において、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ Ａｓｓａｙを使用して計算した。抽出されたＲＮＡはまた、Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）上において、Ｑｕａｎｔ-ｉＴ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を使用しても定量した。ライブラリー構築の前に、Ｅｘｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ）［Pine, P.S. et al., BMC Biotechnol. 16, 54 (2016)］ＲＮＡ Ｓｐｉｋｅ-Ｉｎ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を導入した。ｒＲＮＡ枯渇ｃＤＮＡライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ-Ｚｅｒｏ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して調製し、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓの、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおける、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００上においてシーケンシングした。全ての試料は、シーケンシングの前に、シーケンシングプールへと無作為に割り当て、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として、ＲＮＡの抽出およびシーケンシングライブラリーの調製を実施した。個体１例当たりの生シーケンシングリードの平均数は、５８，０９４，６８３であった；例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Umber, D., et al., Nat. Neurosci. 22(110); 1903-1912 (2019), Supplemental Table 6を参照されたい。
【0127】
再現データセット（ＭＳＢＢ）：Ｓｙｎａｐｓｅポータルから公開されているＲＮＡ-ｓｅｑデータ（ｓｙｎ３１５７７４３；２０１８年５月アクセス）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ ｆｏｒ ＡＤ：Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（ＭＳＢＢ）データセットからダウンロードした。略述すると、このデータセットは、３０１例の個体に由来する、４つの異なる大脳皮質領域：前頭極［ブロードマン１０野（ＢＭ１０）］組織、上側頭回（ＢＭ２２）組織、海馬傍回（ＢＭ３６）組織、および下前頭回（ＢＭ４４）組織に由来するＲＮＡをシーケンシングすることにより作成した。ｒＲＮＡは、Ｒｉｂｏ-Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して枯渇させた。シーケンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖ２を使用して調製した。これらのライブラリーから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）［Wang, M. et al., Sci Data 5, 180185 (2018)］を介して、ｒＲＮＡ枯渇、１０１ｎｔ、シングルエンド、および非ディレクショナルのＲＮＡ-ｓｅｑデータを作成した。個体１例当たりの生シーケンシングリードの平均数は、３５，０６２，５１４であった。
【0128】
アルツハイマー病の形質：本実施例において、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）の示差的発現、およびこの発現の、アルツハイマー病（ＡＤ）症例／対照状態、常染色体優性アルツハイマー病（ＡＤＡＤ）症例／対照状態、および２つの定量的ＡＤ形質：満期／死亡時における臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）およびＢｒａａｋスコアとの相関を、ヒト大脳皮質組織内において探索した。
【0129】
症例／対照状態は、ＣＥＲＡＤ基準［Pamudurti, N.R. et al., Mol. Cell 66, 9-21.e7 (2017)］および／またはハチャトゥリアン基準（Panda, A.c. et al., Nucleic Acids Res. Doi:10.1093/nar/gkx297に従い、研究参加者の脳についての死後における神経病理学的解析により決定した。ＡＤＡＤ状態は、確立された病原性突然変異を同定する［Cheng, J. et al., Bioinforma. Oxf. Engl. 32, 1094-1096 (2016)］、ＡＰＰ遺伝子、ＰＳＥＮ１遺伝子、およびＰＳＥＮ２遺伝子の生前シーケンシングを介して決定した。ＣＤＲとは、０（認知症が見られない）～３（重度認知症）の範囲を伴う、認知機能障害についての臨床的尺度である［Rossetti, H.C. et al., Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 24, 138-142 (2010)］。Ｂｒａａｋスコアとは、脳を通した、タウ神経原線維変化の数および分布により決定される、ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度である［Li, Y. et al., Cell Res. 25, 981-984 (2015)］。Ｂｒａａｋスコアは、０（非存在：最悪の場合においても、偶発性のタウ神経原線維変化）～６（重度：大脳新皮質領域内における、広範なタウ神経原線維変化）の範囲にわたる。重要なことは、利用可能な神経病理学的診断は、「神経突起斑」または「老人斑」の存在を要求する基準に基づくため、タウ神経原線維変化を伴うが、プラークを伴わない個体は、対照として考えられるままでありうることである。前症状性ＡＤまたは前臨床的ＡＤを伴う個体に由来する、ＡＤ脳のサブセットを同定した。これらの個体は、臨床的に重要な認知症を有さなかった（臨床的認知症尺度≦０．５：最悪の場合においても、極めて軽度の認知症）が、それらの脳は、ＡＤ性神経病理学的変化の証拠を有した。最後に、ＭＳＢＢデータセットは、さらなる、ＡＤ性の、定量的な、神経病理学的形質、平均値アミロイドプラーク数を含んだ。
【0130】
表現型の処理
発見データセット：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣである。ＰＬＩＮＫ ｖ．１．９ソフトウェアを介する主成分分析［Chang, C.C. et al., GigaScience 4, 7 (2015)］、および既に作成されているＧｅｎｏｍｅ-ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ（ＧＷＡＳ）データを使用して、遺伝系統共変量を生成した。略述すると、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ研究参加者に由来する、遺伝子マイクロアレイデータを、平均値対立遺伝子頻度＞が５％であり、遺伝子型率が＞９５％である変異体だけを含むようにフィルタリングされ、連鎖不均衡にない変異体だけを含むようにプルーニングされた、ＨａｐＭａｐ参照パネル［Gibbs, R.A. et al., Nature 426, 789-796 (2003)］と融合し、--ｐｃａコマンドを使用した。最初の２つの主成分を使用して、下流における解析のための遺伝系統を表した。示差的発現解析、相関解析、およびメタ解析は、全ての示差的発現解析共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ３２中央値、ＲＮＡ品質の尺度、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統共変量）が入手可能な個体により提供された頭頂葉皮質由来試料だけを使用して行った。
発見データセット：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣである。ＰＬＩＮＫ ｖ．１．９ソフトウェアを介する主成分分析［Chang, C.C. et al., GigaScience 4, 7 (2015)］、および既に作成されているＧｅｎｏｍｅ-ｗｉｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ（ＧＷＡＳ）データを使用して、遺伝系統共変量を生成した。略述すると、Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ研究参加者に由来する、遺伝子マイクロアレイデータを、平均値対立遺伝子頻度＞が５％であり、遺伝子型率が＞９５％である変異体だけを含むようにフィルタリングされ、連鎖不均衡にない変異体だけを含むようにプルーニングされた、ＨａｐＭａｐ参照パネル［Gibbs, R.A. et al., Nature 426, 789-796 (2003)］と融合し、--ｐｃａコマンドを使用した。最初の２つの主成分を使用して、下流における解析のための遺伝系統を表した。示差的発現解析、相関解析、およびメタ解析は、全ての示差的発現解析共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ３２中央値、ＲＮＡ品質の尺度、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統共変量）が入手可能な個体により提供された頭頂葉皮質由来試料だけを使用して行った。
【0131】
神経病理学的に、対照と分類されたが、軽度の認知症または認知症の増悪を有する（ＣＤＲ≦１）個体、すなわち、認知症罹患対照に由来する試料は、それらの認知症が、非ＡＤ性病因を有することが予期されるために除外した。
【0132】
４例の試料は、最初の２つのトランスクリプトーム主成分により測定される、それらの環状トランスクリプトームプロファイルが、他の頭頂葉領域試料の分布と比較して、異常値であったため除外した。
【0133】
再現データセット：ＭＳＢＢ：さらなるデータは、Ｓｙｎａｐｓｅポータル（アクセス：２０１８年５月）の、臨床的表現型およびＲＮＡ-ｓｅｑの共変量（ｓｙｎ１２１７８０４５）、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）データ（ｓｙｎ１０９０１６００）、ならびに品質管理リマッピングデータ（ｓｙｎ１２１７８０４７）を含む、ＭＳＢＢ再現データセットからダウンロードした。これらのデータは、以下の通りに加工した：
・「９０＋」として掲載されたＡＯＤを、「９０」として割り当て直して、変数を定量変数とした；
・発見データセットスケールに合致するように、ＰＭＩを、分単位から、時間単位に補正した；
・ＳＮＰ ｒｓ４２９３５８に基づき、ＷＧＳデータを使用して、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数を推定した。臨床共変量ファイルにおいて提示される非欠失ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数と、これについての推定数との間に、高度の一致が見られることを確認した後において、対立遺伝子についての推定数を、下流における全ての解析に使用して、これらのデータを伴う個体の数を増大させた；
・発見データセットと同様に、ＰＬＩＮＫ ｖ．１．９ソフトウェアを介する主成分分析を介して、ＭＳＢＢ ＷＧＳデータから、遺伝系統共変量を生成した；
・元のシーケンシング試行に由来する情報を使用して、欠失するバッチ情報およびＲＩＮ情報を、リシーケンシングされたファイルへと割り当て、一般バーコードに基づき、２つのファイルをマッチさせた；
・元のシーケンシング試料と、リシーケンシング試料との間において、マッピングリードの数が大きいＲＮＡ-ｓｅｑデータを選択した；
・品質管理リマッピングデータ（ｓｙｎ１２１７８０４７）ファイルに提示された情報に基づき、個体および割り当て直された試料のスワップＩＤを除外した。
・それらの認知症は、ＡＤ以外の病因を有すると予期されうるため、神経病理学的に、対照として分類されたが、軽度以上の認知症（ＣＤＲ≦１）有する個体、すなわち、認知症罹患対照に由来する試料は除外した；
・最初の２つのトランスクリプトーム主成分により測定される、それらの環状トランスクリプトームプロファイルが、この同じ大脳皮質領域に由来する、他の試料の分布と比較して異常値であったため、５例の試料を除外した；
・示差的発現解析、相関解析、およびメタ解析は、全ての示差的発現解析共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統共変量）についての情報が入手可能な個体に由来するデータだけを使用して行った。
・「９０＋」として掲載されたＡＯＤを、「９０」として割り当て直して、変数を定量変数とした；
・発見データセットスケールに合致するように、ＰＭＩを、分単位から、時間単位に補正した；
・ＳＮＰ ｒｓ４２９３５８に基づき、ＷＧＳデータを使用して、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数を推定した。臨床共変量ファイルにおいて提示される非欠失ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数と、これについての推定数との間に、高度の一致が見られることを確認した後において、対立遺伝子についての推定数を、下流における全ての解析に使用して、これらのデータを伴う個体の数を増大させた；
・発見データセットと同様に、ＰＬＩＮＫ ｖ．１．９ソフトウェアを介する主成分分析を介して、ＭＳＢＢ ＷＧＳデータから、遺伝系統共変量を生成した；
・元のシーケンシング試行に由来する情報を使用して、欠失するバッチ情報およびＲＩＮ情報を、リシーケンシングされたファイルへと割り当て、一般バーコードに基づき、２つのファイルをマッチさせた；
・元のシーケンシング試料と、リシーケンシング試料との間において、マッピングリードの数が大きいＲＮＡ-ｓｅｑデータを選択した；
・品質管理リマッピングデータ（ｓｙｎ１２１７８０４７）ファイルに提示された情報に基づき、個体および割り当て直された試料のスワップＩＤを除外した。
・それらの認知症は、ＡＤ以外の病因を有すると予期されうるため、神経病理学的に、対照として分類されたが、軽度以上の認知症（ＣＤＲ≦１）有する個体、すなわち、認知症罹患対照に由来する試料は除外した；
・最初の２つのトランスクリプトーム主成分により測定される、それらの環状トランスクリプトームプロファイルが、この同じ大脳皮質領域に由来する、他の試料の分布と比較して異常値であったため、５例の試料を除外した；
・示差的発現解析、相関解析、およびメタ解析は、全ての示差的発現解析共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統共変量）についての情報が入手可能な個体に由来するデータだけを使用して行った。
【0134】
ＲＮＡ-ｓｅｑデータの加工およびアライメント：検出力を増大させるために、下流における解析のための組入れ基準を満たす試料に由来するＲＮＡ-ｓｅｑだけではなく、各データセット中の、全ての入手可能な試料に由来するＲＮＡ-ｓｅｑデータを加工し、アライメントした。全てのＲＮＡ-ｓｅｑデータの加工およびアライメントを、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として実施した。
【0135】
ＳＴＡＲ ｖ．２．５．３ａ［Dobin A. et al., Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 15-21 (2013)］を、ｃｉｒｃＲＮＡ判定ソフトウェアである、ＤＣＣのドキュメンテーションにより示唆されるキメラアライメントモードおよびパラメータ［Cheng, J. et al., Bioinforma. Oxf. Engl. 32, 1094-1096 (2016)］において使用して、発見ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットからの生シーケンシングリードを、ヒト参照ゲノムである、ＧＲＣｈ３８の一次アセンブリーに照らしてアライメントした。まず、ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ．２６［Harrow, J. et al., Genome Res. 22, 1760-1774 (2012)］総合遺伝子アノテーションを使用して、１５０の突出を伴うスプライスジャンクションについてのデータベース（--ｓｊｄｂＯｖｅｒｈａｎｇ１５０）により、アライメントインデックスを調製した。次いで、以下のパラメータ：
・ｏｕｔＳＪｆｉｌｔｅｒＯｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５ １５ １５ １５
・ａｌｉｇｎＳＪｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
・ａｌｉｇｎＳＪＤＢｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
・ｓｅｅｄＳｅａｒｃｈＳｔａｒｔＬｍａｘ ３０
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ ２０
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎ １
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎ １
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ ２
・ｃｈｉｍＳｅｇｍｅｎｔＭｉｎ １５
・ｃｈｉｍＳｃｏｒｅＭｉｎ １５
・ｃｈｉｍＳｃｏｒｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ １０
・ｃｈｉｍＪｕｎｃｔｉｏｎＯｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
を使用して、試料１例当たり合計３つずつのアライメントのために、ペアの各片割れを、個別に、かつ、一体にアライメントした。
再現ＭＳＢＢ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットは、アライメントされているが、マッピングされていないファイルとして提供されているので、アライメントの前に、さらなる加工を要求した。各試料についての、アライメントされているが、マッピングされていないファイルを、Ｓｙｎａｐｓｅウェブポータル（ｓｙｎ３１５７７４３）からダウンロードした後において、Ｐｉｃａｒｄツールの関数である、ＲｅｖｅｒｔＳａｍ、ＦａｓｔｑＴｏＳａｍ、およびＭｅｒｇｅＳａｍＦｉｌｅｓを使用して、生の、アライメントされていないファイルを作成した。ＳＴＡＲ ｖ．２．５．３ａを使用して、上記と同様であるが、１０１-ｎｔのリードに適するアライメントインデックス（--ｓｊｄｂＯｖｅｒｈａｎｇ １００）により、データのシングルエンド性のために、試料１例当たり１回に限り、作成されたこれらのファイルをアライメントした。全てのアライメントのために、ジェネリックのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列に基づき、任意のアダプター配列を、リードからソフトクリップした。
・ｏｕｔＳＪｆｉｌｔｅｒＯｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５ １５ １５ １５
・ａｌｉｇｎＳＪｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
・ａｌｉｇｎＳＪＤＢｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
・ｓｅｅｄＳｅａｒｃｈＳｔａｒｔＬｍａｘ ３０
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ ２０
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎ １
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎ １
・ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ ２
・ｃｈｉｍＳｅｇｍｅｎｔＭｉｎ １５
・ｃｈｉｍＳｃｏｒｅＭｉｎ １５
・ｃｈｉｍＳｃｏｒｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎ １０
・ｃｈｉｍＪｕｎｃｔｉｏｎＯｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ １５
を使用して、試料１例当たり合計３つずつのアライメントのために、ペアの各片割れを、個別に、かつ、一体にアライメントした。
再現ＭＳＢＢ ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットは、アライメントされているが、マッピングされていないファイルとして提供されているので、アライメントの前に、さらなる加工を要求した。各試料についての、アライメントされているが、マッピングされていないファイルを、Ｓｙｎａｐｓｅウェブポータル（ｓｙｎ３１５７７４３）からダウンロードした後において、Ｐｉｃａｒｄツールの関数である、ＲｅｖｅｒｔＳａｍ、ＦａｓｔｑＴｏＳａｍ、およびＭｅｒｇｅＳａｍＦｉｌｅｓを使用して、生の、アライメントされていないファイルを作成した。ＳＴＡＲ ｖ．２．５．３ａを使用して、上記と同様であるが、１０１-ｎｔのリードに適するアライメントインデックス（--ｓｊｄｂＯｖｅｒｈａｎｇ １００）により、データのシングルエンド性のために、試料１例当たり１回に限り、作成されたこれらのファイルをアライメントした。全てのアライメントのために、ジェネリックのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列に基づき、任意のアダプター配列を、リードからソフトクリップした。
【0136】
ｃｉｒｃＲＮＡを規定するバックスプライスの判定：ＤＣＣ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．０．４．４［Cheng, J. et al., Bioinforma. Oxf. Engl. 32, 1094-1096 (2016)］を使用して、ＳＴＡＲによるアライメント時に同定された、キメラジャンクションに由来する、ｃｉｒｃＲＮＡを規定するバックスプライスを検出、アノテーション、定量、フィルタリング、および判定した。さらなるフィルタリングは、ＤＣＣソフトウェアによるドキュメンテーションにおいて推奨されている（ｒｅｃｃｏｍｅｎｄｅｄ）通りに実施した：それらが、ゲノムの反復領域（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ：ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ表およびＳｉｍｐｌｅ Ｒｅｐｅａｔｓ表において規定されている）に位置するか、複数の遺伝子アノテーションにわたるか、またはミトコンドリア内染色体へとマッピングされる場合は、バックスプライスジャンクションを除外した。ペアドエンドデータを解析する場合、ＤＣＣソフトウェアは、感度を改善するように、両方の片割れにおいて同定されたキメラジャンクションを、個別に、かつ、併せて考慮に入れる。
【0137】
発見データセットのために、以下のパラメータ：
-Ｄ -Ｒ ＧＲＣｈ３８＿Ｒｅｐｅａｔｓ＿ｓｉｍｐｌｅＲｅｐｅａｔｓ＿ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｇｔｆ -ａｎ ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ２６．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆ -Ｐｉ -Ｆ -Ｍ -Ｎｒ １ １ -ｆｇ -Ｇ -Ａ ＧＲＣｈ３８．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ
を使用して、ＤＣＣを、ペアドエンドのディレクショナルモードにおいて実行した。
-Ｄ -Ｒ ＧＲＣｈ３８＿Ｒｅｐｅａｔｓ＿ｓｉｍｐｌｅＲｅｐｅａｔｓ＿ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｇｔｆ -ａｎ ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ２６．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆ -Ｐｉ -Ｆ -Ｍ -Ｎｒ １ １ -ｆｇ -Ｇ -Ａ ＧＲＣｈ３８．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ
を使用して、ＤＣＣを、ペアドエンドのディレクショナルモードにおいて実行した。
【0138】
再現データセットのために、以下のパラメータ：
-Ｄ -Ｎ -Ｒ ＧＲＣｈ３８＿Ｒｅｐｅａｔｓ＿ｓｉｍｐｌｅＲｅｐｅａｔｓ＿ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｇｔｆ -ａｎ ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ２６．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆ -Ｆ -Ｍ -Ｎｒ １ １ -ｆｇ -Ｇ -Ａ ＧＲＣｈ３８．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ
により、ＤＣＣを、シングルエンドの非ディレクショナルモードにおいて実行した。
-Ｄ -Ｎ -Ｒ ＧＲＣｈ３８＿Ｒｅｐｅａｔｓ＿ｓｉｍｐｌｅＲｅｐｅａｔｓ＿ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｇｔｆ -ａｎ ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ２６．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆ -Ｆ -Ｍ -Ｎｒ １ １ -ｆｇ -Ｇ -Ａ ＧＲＣｈ３８．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａ
により、ＤＣＣを、シングルエンドの非ディレクショナルモードにおいて実行した。
【0139】
バックスプライスはまた、さらなるソフトウェアパッケージである、ｃｉｒｃＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ［参照により本明細書に組み込まれる、Barrett, S. P. et al., Development 143, 1838-1847 (2016)］を使用しても判定した。ＤＣＣソフトウェアにより判定されたカウントと、ｃｉｒｃＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒソフトウェアにより判定されたカウントとの間において、０．９９の平均ピアソン相関が見られた。ＤＣＣと同様に、ｃｉｒｃＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒは、ＳＴＡＲを介して同定された、キメラジャンクションに由来するバックスプライスを判定するが、ＲＮＡ-ｓｅｑデータの種類について補正するパラメータを有さない。この限界のために、ＤＣＣにより判定されたバックスプライスを、下流における解析のために保持した。バックスプライスの判定は、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として実施した。
【0140】
高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡを同定するための、アノテーションされたバックスプライスのフィルタリングおよびコラプシング：ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡ-ｓｅｑデータ内において、バックスプライスを、キメラジャンクションと重複するリードから判定することにより検出される。このようなジャンクションは、ライブラリー調製時に、鋳型スイッチング過程を介して、アーチファクトを形成しうる［Tang, C. et al., bioRxiv 259556 (2018) doi:10.1101/259556］。これらのアーチファクトのジャンクションは、ランダムに形成されるので、これらが観察される多数の試料により判定されたバックスプライスのフィルタリング、ならびに各バックスプライスジャンクションにおける、キメラアライメントリードと対比した、最小の直鎖状アライメントリード比（ｃｉｒｃ：直鎖比）は、バックスプライスの高信頼性セットの選択を可能とする。試料数およびｃｉｒｃ：直鎖比についてのフィルタリング閾値を、経験的に決定するために、スパイクインされた直鎖状ＥＲＣＣ［Pine, P. S. et al., BMC Biotechnol. 16, 54 (2016)］ＲＮＡ内において同定されるアーチファクトのバックスプライスを、発見データセットから判定した。これらのスパイクインＲＮＡは、直鎖状であるので、ＥＲＣＣ配列内において同定されるバックスプライスは、ライブラリー調製時に、アーチファクトをもたらすことが予期される。前述と同様に、発見データセットと同じパラメータにより、ＳＴＡＲ ｖ．２．５．３ａを使用して、生のシーケンシングリードをアライメントするが、ヒト参照ゲノムファイルではなく、ＥＲＣＣ９２のｆａｓｔａファイルおよびｇｔｆファイル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＤＣＣはまた、アーチファクトのジャンクションを同定するように、ヒトゲノムアノテーションについてのフィルタリングを伴わない、ディレクショナルのペアドエンドモードにおいても使用された。予期される通り、ＥＲＣＣスパイクインＲＮＡ内において、アーチファクトのバックスプライスを検出することが可能であった（図１５）。これらのデータに基づき、最小のｃｉｒｃ：直鎖比が０．１である、少なくとも３例の試料中において観察される、高度に保存的な閾値を、下流における解析への、バックスプライスの組入れのために選択した。
【0141】
発見頭頂葉皮質データセット内において、この判定法およびフィルタリング法を使用して同定されたバックスプライスジャンクションの大半（７，４５０中５，０９０）は、健常頭頂葉皮質組織についての独立の解析において、異なる判定アルゴリズムを使用して、既に同定されていた［Glazar, P. et al., RNA (2014) doi:10.1261/rna.043687.113］。高信頼性バックスプライスジャンクションを同定した後において、これらの各々を、下流の示差的発現解析および相関解析のために、アノテーションされた、その元の直鎖状遺伝子／コグネイトの直鎖状ｍＲＮＡへとコラプシングした。元の直鎖状遺伝子についてのアノテーションを伴わないバックスプライスは除外した。ＭＳＢＢ再現データセットにおけるｃｉｒｃＲＮＡの判定（非ディレクショナルのＲＮＡ-ｓｅｑデータに由来する）のために、元の鎖および直鎖状遺伝子についてのアノテーションを、ディレクショナルの頭頂葉データセットについてのアノテーションに合致するように更新したが、バックスプライスの判定が、同じ染色体、開始位置、および終結位置を有する場合に限った。
【0142】
全体において、発見データセット内において、合計３，５４７の、十分な裏付けのあるｃｉｒｃＲＮＡを判定し、大規模再現データセット内において、４，３３０を判定した。十分な裏付けのある、３，１４６のｃｉｒｃＲＮＡが、発見データセットおよび再現データセットのいずれにも共通した。各データセット内において判定された、ｃｉｒｃＲＮＡの間の重複は、ベン図ツールを使用して視覚化した（図５）。全てのｃｉｒｃＲＮＡの同定は、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として実施した。
【0143】
直鎖状転写物の判定：Ｓａｌｍｏｎソフトウェアｖ．０．８．２［Patro, R. et al., Nat. Methods 14, 417-419 (2017)］を、ｑｕａｓｉ-ｍａｐｐｉｎｇベースのアライメントモードにおいて使用して、直鎖状転写物を判定した。略述すると、ヒト参照ゲノムである、ＧＲＣｈ３８の一次アセンブリー、およびＧＥＮＣＯＤＥ ｖ．２６［Harrow, J. et al., Genome Res. 22, 1760-1774 (2012)］総合遺伝子アノテーションを使用して、ｑｕａｓｉ-ｍａｐｐｉｎｇインデックスを生成した。次いで、デフォルトのＳａｌｍｏｎパイプラインパラメータを使用して、発見データセットおよび再現データセットのいずれについても、生の、アライメントされていないＲＮＡ-ｓｅｑファイルから、直鎖状転写物の発現を定量した。全ての直鎖状転写物の判定は、神経病理学的症例／対照状態に対して盲検として実施した。
【0144】
転写物完全性数の測定：ＴＩＮは、ＲＮＡ-ｓｅｑデータに由来する、ＲＮＡ品質についての尺度であり、ｍＲＮＡの分解を直接測定する［Wang, L. et al., BMC Bioinformatics 17, 58 (2016)］。各試料についてのＴＩＮスコア中央値は、複数の、独立の、ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内において、ＲＩＮ（ｍＲＮＡの完全性について一般に使用される尺度であり、ｒＲＮＡの量に基づく）とのロバストな一致を有することが裏付けられている。ＲＳｅＱＣ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．２．６．４［Wang, L. et al., Bioinformatics 28, 2184-2185 (2012)］を使用して、各試料内において、ＴＩＮを計算して、示差的発現解析および相関解析のための、一貫した品質管理共変量をもたらした。略述すると、発見データセット内および再現データセット内の各試料についてのＴＩＮ中央値は、ＳＴＡＲによりアライメントされたＲＮＡ-ｓｅｑカバレッジに基づき、ＧＥＮＣＯＤＥ ｖ．２６に従う、代表的な（「基本的」転写物としてアノテーションされる）タンパク質コード転写物アノテーションについて計算した。
【0145】
示差的発現解析および相関解析：ＤＥＳｅｑ２ ｖ．１．１８．１の、家族についての、負の二項ロジスティック回帰、および統計学的両側ワルド検定の性能［参照により本明細書に組み込まれる、Love, M. I. et al., Genome Biol. 15, 550 (2014)］を使用して、高信頼性の大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡカウントのセットと、ＡＤ形質との間の、示差的発現解析および相関解析を実施した。本研究の解析法は、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現についての既存の解析［You, X. et al., Nat Neurosci. 18, 603-610 (2015); Rybak-wolf, A. et al., Mol. Cell 58, 870-885 (2015)］に従う。一般に、示差的発現解析は、ＲＮＡ発現のバックグラウンド分布が、試料間において同等であることを仮定し、観察される差違は、補正可能な技術的差違（シーケンシング深度／ライブラリーサイズまたはＲＮＡ品質など）もしくは補正可能な生物学的差違（性別またはＡＯＤなど）に帰せられうるか、または、最終的に、目的の生物学的形質（疾患状態または重症度など）に起因する。ＤＥＳｅｑ２解析法は、これらの因子の全てを考慮に入れる。ロジスティック回帰およびワルド検定を実施する前に、各試料についてのｃｉｒｃＲＮＡカウントを、同じ大脳皮質領域に由来する全ての試料からの、ｃｉｒｃＲＮＡカウントを使用して推定される、シーケンシング深度／ライブラリーサイズから導出されるサイズ因子に基づき正規化した。この正規化の後、探索下にある特定のＡＤ形質について、完全な情報（示差的発現の共変量データを含む）が入手可能な試料だけを含むように、試料をサブセット化した。例えば、Ｂｒａａｋスコアは、発見データセット内の参加者９６例中、８６例だけについて入手可能であったので、発見ｃｉｒｃＲＮＡ-Ｂｒａａｋスコア間相関解析のための標本サイズは、８６であった。これらのサブセットによる、全ての示差的発現および相関解析は、一般に、遺伝子データに由来する、最初の２つの主成分により表される、以下の共変量：ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統について補正した。重要なことは、発見解析を、欧州の遺伝系統を有する個体だけ制限すること、すなわち、６例の黒人個体（５例のＡＤ症例および１例の対照）の除外が、一貫した結果（元の発見頭頂葉解析と対比した、欧州系統に限定した発見頭頂葉解析における、ＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡについての効果量ピアソン相関：０．９４）をもたらしたことである。ＡＤＡＤ試料を含む解析においては、ＡＯＤについての補正を行わなかった。ＡＤＡＤが、早期に発症し［Bateman, R. J. et al., Alzheimers Res. Ther. 3, 1 (2011)］、ＡＤＡＤ脳が、対照参加者およびＡＤ参加者のいずれと比較しても、ＡＯＤが若齢である個体により提供されることは、ＡＯＤを、状態と共線性にする。加えて、ＡＤＡＤ試料について、遺伝系統共変量を計算するＧＷＡＳデータは、入手できないので、ＡＤＡＤ試料を含む全ての解析において、自己報告の人種データにより、遺伝系統共変量を代置した。組み入れられる全ての示差的発現共変量について、完全な情報が入手可能な試料だけを含むように、解析を限定した。統計学的有意性についての、０．０５のＦＤＲ閾値を設定し、非補正Ｐ値を記録する。ＤＥＳｅｑ２ソフトウェアは、統計学的解析の前に、発現が低度のｃｉｒｃＲＮＡに、自動的にフィルターをかける。
【0146】
発見データセットおよびＡＤＡＤデータセットにおいて、この手法を使用して、ＡＤと対照との間において有意に示差的に発現する大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡ、およびＡＤＡＤと対照との間において有意に示差的に発現する大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡについて探索した。本実施例はまた、ＡＤＡＤとＡＤとの間において有意に示差的に発現する大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡについても探索し、Ｂｒａａｋスコアにより測定される神経病理学的重症度について補正した。ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアと有意に相関する大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡを、これらのＡＤ形質についてのデータが入手可能な発見データセット試料においてもまた探索した。これらの知見を再現するために、同様の解析を、ＭＳＢＢデータセット内において実施した。ＢＭ４４を、一次再現データセットとして選択したが、全ての大脳皮質領域内において個別に、解析を実施した。本実施例は、確定ＡＤと対照状態との間における、有意な示差的大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡの発現、ＣＤＲと大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡ発現との有意な相関、およびＢｒａａｋスコアと大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡ発現との有意な相関について探索した。最後に、解析を実施して、ＭＳＢＢデータセット内において、ｃｉｒｃＲＮＡと、プラークの平均数との間の有意な相関について探索した。品質管理計量と、探索下にある特定のＡＤ形質との間の共線性に起因する、無効な統計学的モデルを例外として、ＴＩＮ中央値またはＲＩＮ品質管理計量の代置は、同様の示差的発現および相関結果もたらした。例えば、ＲＩＮにより、ＴＩＮを代置した後において得られる、３１の発見解析ＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡについての効果量ピアソン相関は、０．９９である（Ｐ＝５．４３×１０-２６）。
【0147】
定量的ＰＣＲを介する、ＲＮＡ-ｓｅｑカウントの検証および効果の方向付け：ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１［フォワード：５’-ＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡ-３’（配列番号１）；リバース：５’-ＡＡＧＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＡ-３’（配列番号２）］、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２［フォワード：５’-ＧＡＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡ-３’（配列番号３）；リバース：５’-ＧＧＣＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＴ-３’（配列番号４）］、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１［フォワード：５’-ＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡ-３’（配列番号５）；リバース：５’-ＴＡＧＣＡＡＡＣＧＣＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴ-３’（配列番号６）］、ｃｉｒｃＩＣＡ１［フォワード：５’-ＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ-３’（配列番号７）；リバース：５’-ＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡ-３’（配列番号８）］、ｃｉｒｃＦＭＮ１［フォワード：５’-ＧＧＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣ-３’（配列番号９）；リバース：５’-ＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧ-３’（配列番号１０）］；ｃｉｒｃＤＯＣＫ１［フォワード：５’-ＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣ-３’（配列番号１１）；リバース：５’-ＧＧＣＣＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＴＡＴ-３’（配列番号１２）］、ｃｉｒｃＲＴＮ４［フォワード：５’-ＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＣ-３’（配列番号１３）；リバース：５’-ＣＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧ-３’（配列番号１４）］、ｃｉｒｃＳＴ１８［フォワード：５’-ＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧ-３’（配列番号１５）；リバース：５’-ＡＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧ-３’（配列番号１６）］、ｃｉｒｃＩＡＴＲＮＬ１［フォワード：５’-ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＧ-３’（配列番号１７）；リバース：５’-ＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡ-３’（配列番号１８）］、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１［フォワード：５’-ＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡ-３’（配列番号１９）；リバース：５’-ＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＡ-３’（配列番号２０）］；ＤＣＣソフトウェアにより提供されるｇｅｔｃｉｒｃｆａｓｔａ．ｐｙスクリプトを介して抽出されるｃｉｒｃＲＮＡのｆａｓｔａ配列に基づくｃｉｒｃＲＮＡ転写物のバックスプライスジャンクションを検出するように、多様なプライマーをデザインした。多様なプライマーは、外側を向き（典型的なプライマーが、内側を向くのに対して）、結果として、これらのプライマーは、転写物の環状化を介して形成されるバックスプライスジャンクションの文脈だけにおいて、または、より稀には、タンデムエクソン重複を含有する転写物の文脈だけにおいて、ＰＣＲ産物を産生する。これらのプライマーは、コンピュータ上のＰＣＲを介して、多様であることが確認されており、これらの多様なプライマーの増幅効率は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に適することが経験的に確認された。１３例の頭頂葉皮質由来ＲＮＡ試料を、発見研究における個体（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３、ｎＰｒｅＳｙｍｐＡＤ＝３、ｎＡＤ＝７）から選択して、ＧＡＰＤＨ正規化発現値を生成し、次いで、同じ個体に由来するＲＮＡ-ｓｅｑ導出カウントと相関させた。製造元によりを推奨されるプロトコール従い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、相補性ＤＮＡを、ＲＮＡ試料から作出した。このｃＤＮＡと共に、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ上において使用して、ｑＰＣＲ実験を実施した。相対発現は、標準的ΔΔＣｔ法に従い計算した。略述すると、Ｃｔについての三連の読取りを、各プライマー対について平均し、平均直鎖状ＧＡＰＤＨ Ｃｔを、平均ｃｉｒｃＲＮＡ Ｃｔから差し引いて、ΔＣｔを計算した。さらに、各プライマーについての平均対照（ｎ＝３）ΔＣｔを、ΔＣｔ値から差し引くことにより、各ｃｉｒｃＲＮＡについてのΔΔＣｔを計算した。最後に、以下の式：相対発現＝２-ΔΔＣｔを使用して、相対発現を生成した。
【0148】
メタ解析および重複の計算：ｍｅｔａ-ＲＮＡ-ｓｅｑ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．０．２を使用して、大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現、ならびに相関の発見結果および再現結果についてのメタ解析を実施した。データセット間の標本サイズの差違のために、インバース／シュタウファー法を使用して、再現結果および発見結果の両方に共通するｃｉｒｃＲＮＡのＰ値を組み合わせるように選出しを行った。前述と同様に、０．０５の統計学的有意性閾値およびＦＤＲ閾値を設定し、未補正のＰ値を提示した。ＣＭｐｌｏｔ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．３．３．１を使用して、メタ解析の結果を視覚化した。
【0149】
ＶｅｎｎＤｉａｇｒａｍ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．６．２０を使用して、メタ解析結果の間の重複を視覚化し、片側Ｐ値を報告する、ＳｕｐｅｒＥｘａｃｔＴｅｓｔ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．０．０を使用して、重複の有意性を計算した。
【0150】
回帰ベースの解析を介する、環状ＲＮＡ-ＡＤ間関連の、コグネイト直鎖状ＲＮＡ-ＡＤ間関連、または推定脳細胞型比率のＡＤ関連変化と対比した独立性：環状ＲＮＡ-ＡＤ間関連の、それらのコグネイト直鎖状ｍＲＮＡ-ＡＤ間関連と対比した独立性を裏付けるために、ＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡ、およびそれらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡについてのライブラリーサイズ正規化カウントを、ＣＤＲを予測する、同じ回帰モデルに組み入れた。回帰モデルはまた、示差的発現の共変量：ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統も含んだ。ｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルが、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡ発現レベルより低度であるという事実、およびｃｉｒｃＲＮＡをカバリングする、大半のＲＮＡ-ｓｅｑリードは、バックスプライスを含まない（これにより、コグネイト直鎖状ｍＲＮＡのカウントを高騰させる）という事実を踏まえると、ｃｉｒｃＲＮＡは、組合わせ回帰モデルにおいて、有意な（Ｐ＜０．０５）関連を保持する場合、ＣＤＲとの独立の関連を裏付けると考えられた。これらの回帰分析を、発見データセットおよび再現データセットのいずれにおけるＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡについても実施し、固定効果メタ解析を使用して、結果を組み合わせた。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡにより説明されるＣＤＲの変動の比率を、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡと対比して計算し、変動の平均比率を、提示される２つのデータセットにおいて説明した。１４８の、メタ解析におけるＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡのうちの中２つは、コグネイトの直鎖状ＲＮＡを有さず、これらの解析から除外した。
【0151】
同様の回帰ベースの手法を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連の、推定脳細胞型比率のＡＤ関連変化からの独立性を裏付けた。ＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡの、ライブラリーサイズ正規化カウント、ならびにニューロン、希突起膠細胞、および小膠細胞の、コンピュータによりデコンボリューションされた推定比率を、ＣＤＲを予測する、同じ回帰モデルに組み入れた。多重共線性を回避するために、また、星状細胞推定比率と、ニューロン推定比率とは、強く逆相関もするため、デコンボリューション推定星状細胞比率は組み入れなかった。これらの組合せモデルにおいて、有意な（Ｐ＜０．０５）関連を保持したＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡを、独立であると考えた。発見データセットおよび再現データセットのいずれにおいても、１４８のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡの全てについて、これらの回帰分析を実施し、固定効果メタ解析を使用して、結果を組み合わせた。
【0152】
前症状性ＡＤについてのブートストラップ相関係数解析：発見データセットおよび再現データセットに、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤ［すなわち、ＡＤの神経病理学的証拠であるが、最悪の場合においても、極めて軽度の認知症（ＣＤＲ≦０．５）である］を伴う少数の個体を組み入れた。ＰｒｅＳｙｍｐＡＤ脳内の発現の変化が、ＳｙｍｐＡＤにおいて観察される変化［すなわち、対照と比較した、ＡＤおよび認知症の神経病理学的証拠（ＣＤＲ≧１）］と同様であるのかどうかについて探索した。
【0153】
上記において記載した、同じ方法を使用して、大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現解析を、まず、ＳｙｍｐＡＤと、対照との間において実施し、次いで、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤと、対照との間において実施した。次いで、低度の発現のために、ＤＥＳｅｑ２による自動的なフィルタリングがかからなかった、全てのｃｉｒｃＲＮＡについて、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤ解析において観察されるｌｏｇ２（倍数変化）（ｌｏｇ２ＦＣ：効果量）と、ＳｙｍｐＡＤ解析において観察されるｌｏｇ２ＦＣとの相関を計算した。対照脳と対比したＳｙｍｐＡＤ脳における示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡが、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤにおける発現の変化と、同様の発現の変化を裏付ける場合、これらのｃｉｒｃＲＮＡについてのｌｏｇ２ＦＣ値の間の相関は、非有意なバックグラウンドｃｉｒｃＲＮＡによる相関より強いことが予期されるであろう。１０，０００通りのブートストラップシミュレーションを実施して、２つのｌｏｇ２ＦＣについての相関係数（一方は、ＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡについての相関係数であり、他方は、非有意なバックグラウンドｃｉｒｃＲＮＡについての相関係数である）についてのバイアス補正９５％信頼区間およびバイアス促進９５％信頼区間同定することにより、これについて調べた。片側コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、有意に関連する分布について生成したＰ値は、バックグラウンド分布より高度であった。この解析を、発見データセット、および再現データセット内の全ての大脳皮質領域において実施して、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤの皮質領域における、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化の差違について評価した。ｂｏｏｔ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．３-２０を使用して、ブートストラップ相関係数および信頼区間を生成した。
【0154】
ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）解析：ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡの予測能力について査定するために、ＡＤ症例状態を予測するロジスティック回帰モデルを、発見データセットおよび再現ＭＳＢＢデータセットの両方において計算した。各データセットを、確定ＡＤ症例および対照だけを含むようにサブセット化し、３つのモデルについて計算した。第１のモデル（ｂａｓｅ）は、共変量として、以下：ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、遺伝系統、およびＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数を含んだ。第２のモデル（ｃｉｒｃ）は、メタ解析による、上位１０の最も有意なＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡを含んだ。第３のモデル（ｂａｓｅ＋ｃｉｒｃ）は、最初の２つのモデルの変数を組み合わせた。Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｐＲＯＣ ｖ．１．１２．１を使用して、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線および曲線下面積を計算した。
【0155】
相対重要性解析：ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数（ＡＤについての、最も一般的な遺伝危険性因子）および推定ニューロン比率は、ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアなど、観察される定量的ＡＤ形質の変動に寄与することが公知である。ｒｅｌａｉｍｐｏ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．２．２．３を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の、これらの公知の寄与因子と比較した相対的重要性について評価した。これを行うために、まず、上位１０の最も有意なＡＤ形質関連ｃｉｒｃＲＮＡの、ライブラリーサイズ正規化カウントを、示差的発現解析において使用される、同じ共変量：ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統について補正した。次いで、これらの正規化補正カウントを、まず、個別に組み入れ、次いで、ＣＤＲ、Ｂｒａａｋスコア、またはプラークの平均数を予測する、同じ線形回帰モデル（再現ＭＳＢＢデータセットに限り利用可能である）において、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数および推定ニューロン比率と併せて、多変量モデルに組み入れた。ｒｅｌａｉｍｐｏパッケージのｌｍｇ法を使用して、モデル変数の各々の、予測される定量的ＡＤ形質の変動への相対寄与について評価した。したがって、上位１０の、メタ解析において最も有意なｃｉｒｃＲＮＡの各々の寄与を、個別に、かつ、同じモデルに併せて組み入れて、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数および推定ニューロン比率と比較した。発見データセット、および４つの大脳皮質領域全ての再現データセットの両方において、これらの解析を行い、各領域特異的メタ解析から、上位１０の、メタ解析において最も有意なｃｉｒｃＲＮＡを選択した。
【0156】
ネットワーク共発現解析：それらが共に共発現される直鎖状転写物に基づき、ｃｉｒｃＲＮＡの生物学的関連性および病理学的関連性を推定する、ｃｉｒｃＲＮＡ／タンパク質コード直鎖状転写物共発現ネットワークを、ＡＤ試料および対照試料から生成した。まず、同じ試料からの、ライブラリーサイズにより正規化した、ｃｉｒｃＲＮＡカウントおよび直鎖状転写物カウントを、示差的発現解析の共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ中央値、ＡＯＤ、バッチ、性別、および遺伝系統）について補正した。ネットワーク生成の目的のために、ｃｉｒｃＲＮＡは、全てを組み入れたが、最も可変的なタンパク質コード直鎖状転写物は、上位の１０，０００だけを組み入れて、演算負荷を軽減した。ＭＥＧＥＮＡ（ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ｅｍｂｅｄｄｅｄ-ｇｅｎｅ ｃｏ-ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｖ．１．３．６）を使用するスピアマン相関に基づき、これらの組合せカウントから、遺伝子共発現ネットワークを計算した。略述すると、この方法は、ＰＭＦＧ（ｐｌａｎａｒ ｍａｘｉｍａｌｌｙ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｇｒａｐｈ）法を利用して、コンパクトな遺伝子発現ネットワーク同定し、旧来のＷＧＣＮＡ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ）法との高モジュール保存性を有し、これより多くのモジュール同定することが独立に裏付けられている。重要なことは、この方法が、可能な場合、より大規模な親モジュール内に存在する、サブモジュールにより、階層ネットワークを同定することである。このように、同じ直鎖状転写物またはｃｉｒｃＲＮＡは、複数のモジュールへと割り当てられうる。モジュールを同定した後、ＷＧＣＮＡ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．６３を使用して、各モジュールの固有値遺伝子を計算した。モジュールと、ＣＤＲとの有意な関連を同定するために、示差的発現の共変量について補正して、モジュール固有値遺伝子と、ＣＤＲとの間において、両側Ｐ値生成回帰分析を実施した。モジュール固有値遺伝子の、ＣＤＲとの関連の有意性は、両側スチューデントｔ検定を使用して決定した。直鎖状転写物モジュールメンバーを抽出し、タンパク質コード遺伝子を、バックグラウンド遺伝子リストとする、ＦＵＭＡソフトウェアによる超幾何片側試験を介して、これらを加工することにより、有意な遺伝子エンリッチメントと、経路との関連を、各モジュールについて同定した。最後に、ｉｇｒａｐｈ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．２．１を使用して、ネットワークを視覚化した。
【0157】
マイクロＲＮＡ結合性部位の予測：ＤＣＣソフトウェアにより提供されるｇｅｔｃｉｒｃｆａｓｔａ．ｐｙスクリプトを使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ配列についてのｆａｓｔａファイルを生成した。本研究は、２０１８年３月公開のＴａｒｇｅｔＳｃａｎ７０データベースにより提供されたｔａｒｇｅｔｓｃａｎ＿７０．ｐｌスクリプトを使用して、これらのｃｉｒｃＲＮＡ配列内のｍｉＲＮＡ結合性部位を予測した。同じｃｉｒｃＲＮＡの複数のアイソフォームが、同じｍｉＲＮＡに対して、異なる数の結合性部位を有することが予測される場合、遺伝子レベルにおいて存在することが予測される、最大数の結合性部位を選択した。２０１８年３月公開のＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎデータベースを使用して、予測されるｍｉＲＮＡ調節の標的を同定した。
【0158】
統計学的解析：両側ワルド検定による、家族についての、負の二項ロジスティック回帰を実施して、有意性を決定するのに、ＤＥＳｅｑ２ ｖ．１．１８．１を使用することについて、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現を調べた。ピアソン相関を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定された有意性と共に使用することについて、ｃｉｒｃＲＮＡの関連効果量相関を調べた。線形回帰分析を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定された有意性と共に使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連の、コグネイト直鎖状ｍＲＮＡのＡＤ関連変化、または推定脳細胞型比率の変化からの独立性について調べた。ＳｕｐｅｒＥｘａｃｔＴｅｓｔ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１．０．０を使用して、示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡの異なるセットの間における重複の有意性について、片側Ｐ値を計算した。ＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡの間のブートストラップ効果量相関分布が、バックグラウンド分布を超えるのかどうかは、片側コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して計算した。ｃｉｒｃＲＮＡおよび他の寄与因子により説明される定量的ＡＤ形質の変動の比率は、線形回帰に続き、ｒｅｌａｉｍｐｏ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．２．２．３を使用する相対重要性解析を使用して計算した。ＭＥＧＥＮＡ ｖ．１．３．６を使用するスピアマン相関に基づき、ｃｉｒｃＲＮＡ／直鎖状ｍＲＮＡ共発現ネットワークモジュールを生成した。モジュール固有値遺伝子を計算し、線形回帰を、両側スチューデントｔ検定を使用して決定された有意性と共に使用して、それらのＣＤＲとの関連を決定した。ＡＤ関連経路についての、共発現モジュールのエンリッチメントは、ＦＵＭＡソフトウェアを使用して実施される片側超幾何検定を使用して決定した。パラメトリック検定のために、データ分布が正規分布であると仮定したが、これについての正式な検定は行わなかった。全ての統計学的解析は、Ｒ統計学ソフトウェアを使用して行った。
【0159】
データの入手可能性：Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣデータセット：ＮＧ０００８３である。ＡＤＡＤ試料に由来するシーケンシング情報は保護されており、アクセスのためには、ＤＩＡＮによるさらなる認証を要求する。Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ再現データセット：ｓｙｎ３１５９４３８である。
【0160】
結果
（ｉ）研究デザイン
研究デザインは、神経病理学的に確認されたＡＤ症例組織［Mirra S. S. et al., Neurology 41, 479-486 (1991); Khachaturian, Z. S., Arch. Neurol. 42, 1097-1105 (1985)］および対照脳組織に由来する、２つの独立のＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内のｃｉｒｃＲＮＡカウントの判定および定量を含んだ。発見データセット内において、１５０ヌクレオチド（ｎｔ）、ペアドエンドの、リボソーム（ｒ）ＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータを、９６例の個体（１３例の対照例および８３例のＡＤ症例）により提供された凍結頭頂葉皮質組織から生成した。これらの個体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＫｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣにおいて評価され、それらの人口学情報、臨床重症度情報、および神経病理学情報を記録された。再現のために、独立の、公表されている、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ-Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ＭＳＢＢデータセット（ｓｙｎ３１５７７４３）［Wang M. et al., Sci Data 5, 180185 (2018)］を利用した。略述すると、ＭＳＢＢデータセットは、下前頭回組織［ブロードマン（ＢＭ）４４野］の１９５例の試料（４０例の対照、ならびに８９例の確定ＡＤ症例、３１例の推定ＡＤ症例、および３５例の可能ＡＤ症例）に由来する１００ｎｔ、シングルエンドの、ｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータの他、３つのさらなる大脳皮質領域［前頭極（ＢＭ１０）、上側頭回（ＢＭ２２）および海馬傍回（ＢＭ３６）］に由来するデータを含む。ＭＳＢＢデータセット内の全ての個体についての、人口学情報、臨床重症度情報、および神経病理学情報は、大脳皮質領域ごとに分けられた。
（ｉ）研究デザイン
研究デザインは、神経病理学的に確認されたＡＤ症例組織［Mirra S. S. et al., Neurology 41, 479-486 (1991); Khachaturian, Z. S., Arch. Neurol. 42, 1097-1105 (1985)］および対照脳組織に由来する、２つの独立のＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内のｃｉｒｃＲＮＡカウントの判定および定量を含んだ。発見データセット内において、１５０ヌクレオチド（ｎｔ）、ペアドエンドの、リボソーム（ｒ）ＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータを、９６例の個体（１３例の対照例および８３例のＡＤ症例）により提供された凍結頭頂葉皮質組織から生成した。これらの個体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＫｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣにおいて評価され、それらの人口学情報、臨床重症度情報、および神経病理学情報を記録された。再現のために、独立の、公表されている、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ-Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ＭＳＢＢデータセット（ｓｙｎ３１５７７４３）［Wang M. et al., Sci Data 5, 180185 (2018)］を利用した。略述すると、ＭＳＢＢデータセットは、下前頭回組織［ブロードマン（ＢＭ）４４野］の１９５例の試料（４０例の対照、ならびに８９例の確定ＡＤ症例、３１例の推定ＡＤ症例、および３５例の可能ＡＤ症例）に由来する１００ｎｔ、シングルエンドの、ｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータの他、３つのさらなる大脳皮質領域［前頭極（ＢＭ１０）、上側頭回（ＢＭ２２）および海馬傍回（ＢＭ３６）］に由来するデータを含む。ＭＳＢＢデータセット内の全ての個体についての、人口学情報、臨床重症度情報、および神経病理学情報は、大脳皮質領域ごとに分けられた。
【0161】
ＳＴＡＲソフトウェア［参照により本明細書に組み込まれる、Dobin, A. et al., Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 15-21 (2013)］を、キメラリード検出モードにおいて使用して、両方のＲＮＡ-ｓｅｑデータセットに由来するリードを、ＧＥＮコードによりアノテーションされたヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８）に照らしてアライメントした。バックスプライスジャンクションを同定するように、ＤＣＣソフトウェアを使用して、キメラリードを、さらにプロセシングし、フィルタリングした。最後に、バックスプライスジャンクションカウントを、それらの元の直鎖状遺伝子上にコラプシングして、下流における解析のための、高信頼性のｃｉｒｃＲＮＡカウントのセットを生成した（方法を参照されたい）。このパイプラインを使用して、発見データセット（Ｋｎｉｇｈｔ ＡＤＲＣ）内の、３，５４７のｃｉｒｃＲＮＡ、および再現データセット（ＭＳＢＢ）の４つの領域内の、平均３，９２４のｃｉｒｃＲＮＡを判定した。最大の重複は、この領域内において判定されたｃｉｒｃＲＮＡと、頭頂葉データセット内において判定されたｃｉｒｃＲＮＡとの間において観察されたため、再現解析は、主に、ＢＭ４４由来データに焦点を当てた（図５）。他のＭＳＢＢ大脳皮質領域内の解析も、同様の結果をもたらした。
【0162】
ＤＥＳｅｑ２ソフトウェア［Love, M. I. et al., Genome Biol. 15, 550 (2014)］を使用して、神経病理学的ＡＤ症例／対照状態の他、定量的ＡＤ形質：満期／死亡時におけるＢｒａａｋスコアおよび臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）との相関についての、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現解析を実施した。Ｂｒａａｋスコアとは、脳全体における、タウ神経原線維変化の数および分布により決定される、ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度である。Ｂｒａａｋスコアは、０（非存在：最悪の場合においても、偶発性のタウ神経原線維変化）～６（重度：大脳新皮質領域内における、広範なタウ神経原線維変化）の範囲にわたる。ＣＤＲは、０（認知症が見られない）～３（重度認知症）の範囲を伴う、認知機能障害についての臨床的尺度である。これらの定量的尺度は、ＡＤの根底をなす病理学的機構の異なる側面を捕捉し、この結果として、互いと、またはＡＤ症例状態と、完全には相関しない（図６）。したがって、各形質を、個別に解析し、順序尺度を、連続変数としてモデル化した。全ての解析は、遺伝子データに由来する、最初の２つの主成分により表される、死後間隔（ＰＭＩ）、転写物完全性数中央値（ＴＩＮ）により測定されるＲＮＡ品質、死亡時における年齢（ＡＯＤ）、バッチ、性別、および遺伝系統について補正した（方法を参照されたい）。ｃｉｒｃＲＮＡ解析を、前症状性ＡＤおよび常染色体優性ＡＤへと拡張して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、実質的な症状発生の前に生じたのかどうか、およびこれらの変化が、散発性ＡＤに限定されたのかどうかについて探索した。最後に、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡのＡＤ関連性、および潜在的な疾患影響機構について、相対的重要性解析、ネットワーク共発現解析、およびｍｉＲＮＡ結合性部位予測解析を介して探索した。
【0163】
（ｉｉ）ＡＤについての示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡを同定する発見解析
環状トランスクリプトームワイドの発見解析（ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）において、３１のｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）を超え、ＣＤＲと有意に相関した。最も有意に相関したｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１であった［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．２８；Ｐ＝８．２２×１０-１２］。ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳ［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：０．１７；Ｐ＝３．１８×１０-２］は、ＣＤＲと、名目的に相関するだけであったが、既存の報告［Lukiw, W. J. et al., Front Genet. 4, (2013)］と対照的に、その発現は、認知症重症度の悪化と共に上方調節されることが観察された。
環状トランスクリプトームワイドの発見解析（ｎＣＤＲ＝９６、ｎＢｒａａｋ＝８６、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）において、３１のｃｉｒｃＲＮＡは、０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）を超え、ＣＤＲと有意に相関した。最も有意に相関したｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１であった［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．２８；Ｐ＝８．２２×１０-１２］。ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳ［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：０．１７；Ｐ＝３．１８×１０-２］は、ＣＤＲと、名目的に相関するだけであったが、既存の報告［Lukiw, W. J. et al., Front Genet. 4, (2013)］と対照的に、その発現は、認知症重症度の悪化と共に上方調節されることが観察された。
【0164】
他の２つの相補性ＡＤ形質：Ｂｒａａｋスコア（ＦＤＲを超える、９つのｃｉｒｃＲＮＡ）および神経病理学的ＡＤ対対照状態（ＦＤＲを超える、９つのｃｉｒｃＲＮＡ）と有意に関連するｃｉｒｃＲＮＡもまた同定した。これらの解析は、全ての被験ＡＤ形質にわたり一貫して関連した、ＡＤ形質特異的関連およびｃｉｒｃＲＮＡの両方をもたらした。３つのｃｉｒｃＲＮＡは、３つの形質全てについてのＦＤＲ補正を超えた。例えば、ＣＤＲとの関連に加えて、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１はまた、Ｂｒａａｋスコア（Ｐ＝１．１９×１０-７）およびＡＤ対対照状態（Ｐ＝２．７６×１０-６）とも有意に関連した。一般に、１つのＡＤ形質と関連するｃｉｒｃＲＮＡはまた、残る２つの形質とも、少なくとも名目的に関連した（Ｐ＜０．０５）。発見データセットの１３例のＲＮＡ試料（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝３、ｎＰｒｅＳｙｍｐＡＤ＝３、ｎＡＤ＝７）について、直交的な定量的ＰＣＲ法を使用して、ＲＮＡ-ｓｅｑ知見を、５つのｃｉｒｃＲＮＡについて検証した。５つのｃｉｒｃＲＮＡ転写物についてのＲＮＡ-ｓｅｑ導出カウントと、ＧＡＰＤＨ正規化ΔＣｔ値との間の強い相関を裏付けた（絶対相関中央値：０．６４；図７）。重要なことは、一貫した効果方向もまた観察され、これにより、ＲＮＡ-ｓｅｑの結果が検証される（図７）ことである。併せて、頭頂葉皮質発見データセット解析において、少なくとも１つのＡＤ形質と有意に関連する、３７のｃｉｒｃＲＮＡを同定した（図８）。
【0165】
（ｉｉｉ）独立のＡＤデータセットを使用する、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現の再現およびメタ解析
再現解析を、ＭＳＢＢ ＢＭ４４データセット内において実施した（ｎＣＤＲ＝１９５、ｎＢｒａａｋ＝１８８、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９）。発見解析において同定された３１のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡのうちの２７は、再現解析においても同様に、最小限において、名目的なＰ値、同じ効果の方向、および同等の効果量により、ＣＤＲと相関した（効果量ピアソン相関：０．９７、Ｐ＝１．６９×１０-１７）。例えば、認知症重症度の悪化を伴う、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１発現の減少［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．１３；Ｐ＝２．２７×１０-９］が再現された。発見結果および再現結果についてのメタ解析は、ＦＤＲ補正の後におけるＣＤＲと有意に相関する、合計１４８のｃｉｒｃＲＮＡを明らかにし、とりわけ、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（Ｐ＝２．２１×１０-１８）およびｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳ（Ｐ＝２．８３×１０-８）を含む３３は、５×１０-６の厳密な遺伝子ベースのボンフェローニ多重検定補正を超えた（表１）。
再現解析を、ＭＳＢＢ ＢＭ４４データセット内において実施した（ｎＣＤＲ＝１９５、ｎＢｒａａｋ＝１８８、ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９）。発見解析において同定された３１のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡのうちの２７は、再現解析においても同様に、最小限において、名目的なＰ値、同じ効果の方向、および同等の効果量により、ＣＤＲと相関した（効果量ピアソン相関：０．９７、Ｐ＝１．６９×１０-１７）。例えば、認知症重症度の悪化を伴う、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１発現の減少［ＣＤＲ単位当たりのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．１３；Ｐ＝２．２７×１０-９］が再現された。発見結果および再現結果についてのメタ解析は、ＦＤＲ補正の後におけるＣＤＲと有意に相関する、合計１４８のｃｉｒｃＲＮＡを明らかにし、とりわけ、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（Ｐ＝２．２１×１０-１８）およびｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳ（Ｐ＝２．８３×１０-８）を含む３３は、５×１０-６の厳密な遺伝子ベースのボンフェローニ多重検定補正を超えた（表１）。
【0166】
【表1】
【0167】
同様に、発見データセット内のＢｒａａｋスコアと相関した、９つのｃｉｒｃＲＮＡのうち５つが、ＭＳＢＢデータセット内でも再現された（効果量ピアソン相関＝０．９９；Ｐ＝９．２９×１０-６）。合計３３のｃｉｒｃＲＮＡは、メタ解析におけるＦＤＲ補正の後における、Ｂｒａａｋスコアと有意に関連した。最後に、９つのｃｉｒｃＲＮＡのうち５つは、ＭＳＢＢデータセット内において再現されるＡＤ症例／対照状態と関連し（効果量ピアソン相関＝０．９９；Ｐ＝６．１２×１０-５）、７５のｃｉｒｃＲＮＡは、メタ解析におけるＦＤＲ補正の後における、ＡＤ症例／対照状態と関連した。
【0168】
全体において、メタ解析における、少なくとも１つのＡＤ形質と有意に関連する、１６４のｃｉｒｃＲＮＡを同定した（図１）。ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１およびｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃを含む、これらのｃｉｒｃＲＮＡのうちの２８は、３つの被験形質全てと有意に関連した（図９）。９つの形質間ｃｉｒｃＲＮＡ関連は、５×１０-６の遺伝子ベースの厳密な閾値を超えるＰ値を有した（表１）。併せて、これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化と、ＡＤ形質との間の、一貫し、再現可能であり、高度に有意な関連を裏付ける。
【0169】
（ｉｖ）ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡ内のＡＤ関連変化および推定脳細胞型比率からの独立性を裏付ける
ｃｉｒＲＮＡおよびそれらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡは、独立の発現［You, X. et al., Nat. Neurosci. 18, 603-610 (2015)］を示しうるが、ゲノムの由来および生合成機構の共有を踏まえると、ある程度のレベルの相関が予期される。ｃｉｒｃＲＮＡ転写物をカバリングする、大半のＲＮＡ-ｓｅｑリードは、ｃｉｒｃＲＮＡを規定するバックスプライスジャンクションを含有せず、したがって、ｃｉｒｃＲＮＡ転写物ではなく、直鎖状ｍＲＮＡに由来するリードとして、不正確にカウントされるため、この相関はまた、技術的バイアスも受ける［Rybak-Wolf, A. et al., Mol. Cell 58, 870-885 (2015)］。例えば、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳの直鎖状形態は、歴史的に検出不能であったほどの低レベルにおいて発現される［Piwecka, M. Et al., Science 357, eaam8526; Barrett, S. P. et al., PLoS Genet. 13 e1007114 (2017)］。しかし、本実施例の直鎖状ｍＲＮＡの定量において、豊富な「直鎖状」ＣＤＲ１-ＡＳカウントが観察されたことは、公知の技術的バイアスと符合する。比較的希少なｃｉｒｃＲＮＡを、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡと同じ回帰モデルに併せて組み入れる場合に、このアーチファクトは、ｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連を、帰無とするようなバイアスをかけることが予期される。しかしながら、回帰ベースの手法を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現のＣＤＲ関連変化の大半は、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡのＣＤＲ関連変化から独立であることが裏付けられた。
ｃｉｒＲＮＡおよびそれらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡは、独立の発現［You, X. et al., Nat. Neurosci. 18, 603-610 (2015)］を示しうるが、ゲノムの由来および生合成機構の共有を踏まえると、ある程度のレベルの相関が予期される。ｃｉｒｃＲＮＡ転写物をカバリングする、大半のＲＮＡ-ｓｅｑリードは、ｃｉｒｃＲＮＡを規定するバックスプライスジャンクションを含有せず、したがって、ｃｉｒｃＲＮＡ転写物ではなく、直鎖状ｍＲＮＡに由来するリードとして、不正確にカウントされるため、この相関はまた、技術的バイアスも受ける［Rybak-Wolf, A. et al., Mol. Cell 58, 870-885 (2015)］。例えば、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳの直鎖状形態は、歴史的に検出不能であったほどの低レベルにおいて発現される［Piwecka, M. Et al., Science 357, eaam8526; Barrett, S. P. et al., PLoS Genet. 13 e1007114 (2017)］。しかし、本実施例の直鎖状ｍＲＮＡの定量において、豊富な「直鎖状」ＣＤＲ１-ＡＳカウントが観察されたことは、公知の技術的バイアスと符合する。比較的希少なｃｉｒｃＲＮＡを、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡと同じ回帰モデルに併せて組み入れる場合に、このアーチファクトは、ｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連を、帰無とするようなバイアスをかけることが予期される。しかしながら、回帰ベースの手法を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現のＣＤＲ関連変化の大半は、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡのＣＤＲ関連変化から独立であることが裏付けられた。
【0170】
発見および再現、直鎖状およびｃｉｒｃＲＮＡを組み合わせた、回帰結果についてのメタ解析において、１４６のｃｉｒｃＲＮＡのうちの１０９が、ＣＤＲとの有意な関連（Ｐ＜０．０５）［例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（Ｐ＝３．１１×１０-６）またはｃｉｒｃＤＯＣＫ１（Ｐ＝１．６５×１０-５）］を保持することが観察されたことは、独立の関連を裏付ける。加えて、６２のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡの関連Ｐ値は、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡの関連Ｐ値より小さく、７８のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、それらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡと比較して、同等以上のＣＤＲの変動を説明した。別個の解析において、同様の回帰ベースの手法を利用して、同様に、ＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡの大半（１４８のうちの１０６）［例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（Ｐ＝８．１５×１０-１３）またはｃｉｒｃＤＯＣＫ１（Ｐ＝１．０３×１０-５）］が、ニューロンおよび他の脳細胞型の推定比率のＡＤ関連変化［Li, Z. et al., Genome Med. 10, 43 (2018)］から独立であることを裏付けた。まとめると、これらの結果は、ＡＤ-ｃｉｒｃＲＮＡ関連の大部分が、直鎖状ｍＲＮＡにおけるＡＤ関連変化、または推定脳細胞型比率のＡＤ関連変化に依存しないことを裏付ける。
【0171】
（ｖ）ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、大脳皮質領域にわたり一貫する
ＭＳＢＢデータセットはまた、３つのさらなる大脳皮質領域：ＢＭ１０、ＢＭ２２、およびＢＭ３６に由来するＲＮＡ-ｓｅｑデータも含む。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、皮質にわたり一貫するのかどうかを決定するために、環状トランスクリプトームワイドの解析を、これらのさらなるデータセット内において実施した。前述と同様に、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアとの相関の他、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＡＤ症例／対照状態との関連について探索した。さらなる大脳皮質領域：ＢＭ１０、ＢＭ２２、およびＢＭ３６の各々について、１つずつの頭頂葉発見結果を伴う、３セットのメタ解析を実施した。次いで、これらの結果を、ＢＭ４４についてのメタ解析結果と比較して、これらの大脳皮質領域にわたり一貫した、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を同定した。
ＭＳＢＢデータセットはまた、３つのさらなる大脳皮質領域：ＢＭ１０、ＢＭ２２、およびＢＭ３６に由来するＲＮＡ-ｓｅｑデータも含む。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、皮質にわたり一貫するのかどうかを決定するために、環状トランスクリプトームワイドの解析を、これらのさらなるデータセット内において実施した。前述と同様に、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアとの相関の他、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＡＤ症例／対照状態との関連について探索した。さらなる大脳皮質領域：ＢＭ１０、ＢＭ２２、およびＢＭ３６の各々について、１つずつの頭頂葉発見結果を伴う、３セットのメタ解析を実施した。次いで、これらの結果を、ＢＭ４４についてのメタ解析結果と比較して、これらの大脳皮質領域にわたり一貫した、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を同定した。
【0172】
本実施例は、４つのメタ解析全てにおいて、ＣＤＲと有意に関連し、同等の効果量および同じ効果方向を伴う、２３のｃｉｒｃＲＮＡを同定した（重複のＰ＝１．６０×１０-９４；図１０）。同様に、４つのメタ解析全てにおいて、Ｂｒａａｋスコアと有意に関連し、一貫した効果方向を伴う、１４のｃｉｒｃＲＮＡ（重複のＰ＝１．３８×１０-７０；図１０）、およびＡＤ症例状態と有意に関連し、一貫した効果方向を伴う、５つのｃｉｒｃＲＮＡ（重複のＰ＝３．９０×１０-２６；図１０）を同定した。３つのｃｉｒｃＲＮＡである、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、およびｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１は、４つのメタ解析全てにおいて、３つのＡＤ形質全てと有意に関連した。１１のｃｉｒｃＲＮＡ：ｃｉｒｃＤＧＫＢ、ｃｉｒｃＤＮＡＪＣ６、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＥＲＢＩＮ、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＭＡＰ７、ｃｉｒｃＳＬＡＩＮ１、およびｃｉｒｃＳＴ１８は、４つのメタ解析全てにおいて、２つの定量的ＡＤ形質と関連した。
【0173】
ＭＳＢＢデータセットは、神経病理学的重症度についてのさらなる尺度である、アミロイドプラークの平均数を含む。ｃｉｒｃＲＮＡの、プラークの平均数との相関についての結果は、全てのＭＳＢＢ大脳皮質領域内の、他のＡＤ形質と符合した（補足結果）。まとめると、これらの結果は、一部のｃｉｒｃＲＮＡにおける発現変化が、ＡＤの文脈において、大脳皮質領域にわたり一貫した現象であることを示唆する。
【0174】
（ｖｉ）前症状性ＡＤにおける、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現を裏付ける証拠
本実施例は、少数（ｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙ＝６およびｎＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＝１８）の、前症状性ＡＤを伴う個体の早期における、ＡＤと関連する、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化［すなわち、ＡＤの神経病理学的証拠であるが、最悪の場合においても、極めて軽度の認知症（ＣＤＲ≦０．５）である］について探索した。
本実施例は、少数（ｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙ＝６およびｎＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＝１８）の、前症状性ＡＤを伴う個体の早期における、ＡＤと関連する、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化［すなわち、ＡＤの神経病理学的証拠であるが、最悪の場合においても、極めて軽度の認知症（ＣＤＲ≦０．５）である］について探索した。
【0175】
第１のｃｉｒｃＲＮＡの発現を、各データセット内個別に、前症状性ＡＤ（ＰｒｅＳｙｍｐＡＤ）と、対照（対照ｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙ＝１３、対照ｎＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ＝４０）との間において比較したが、有意なｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現は、検出されなかった。しかしながら、ＡＤ神経病態（ＳｙｍｐＡＤ）を伴う症状性（ＣＤＲ≧１）個体と、対照との間における、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現を、ＢＭ４４データセット（ｎＳｙｍｐＡＤ＝１３７）において同定するが、小規模の頭頂葉データセット（ｎＳｙｍｐＡＤ＝７７）においては同定しない相補性解析において観察される効果の方向および大きさと符合する効果の方向および大きさ［ｌｏｇ２（倍数変化）］を伴う、いくつかの名目的関連が同定された。
【0176】
これらの結果は、ＰｒｅＳｙｍｐＡＤにおいて、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が生じることを示唆したが、トランスクリプトームワイドベースにおいてこれを検出するには、個体数が少なすぎた。この仮説が正しいとすれば、名目的なＰｒｅＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡと、有意なＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡとの効果量相関は、バックグラウンドの、非ＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡと比較された場合の効果量相関より強いであろう。したがって、効果量間のピアソン相関について、ブートストラップ信頼区間を生成した。
【0177】
ＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡについてのブートストラップ効果量相関係数分布は、頭頂葉発見データセット［７１３のバックグラウンドｃｉｒｃＲＮＡ：効果量相関＝０．２１（０．１４，０．２９）と対比した、１４のＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ：効果量相関＝０．６７（０．４３，０．９０）、Ｐ＜２．２×１０-１６；図２］およびＢＭ４４再現データセット［１，５４４のバックグラウンドｃｉｒｃＲＮＡ：効果量相関＝０．３６（０．３１，０．４１）と対比した、１００のＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ：効果量相関＝０．７８（０．６８，０．８５）、Ｐ＜２．２×１０-１６］のいずれにおいても、バックグラウンド分布より有意に高度であることが観察された。
【0178】
これらの解析を、ＭＳＢＢデータセットのうちの、他の３つの大脳皮質領域へと拡張したところ、前症状性である、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化について、同様の証拠が見られることもまた観察された（Ｐ＜２．２×１０-１６）。ＳｙｍｐＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ効果量相関の分布幅は、大脳皮質領域ごとに、皮質内において観察される、ＡＤ病理の時空的進行を想起させる順に：ＢＭ４４～ＢＭ３６＜ＢＭ２２＜頭頂葉皮質＜ＢＭ１０の通りに変動した。まとめると、これらの結果は、実質的なＡＤ症状の前における、複数の大脳皮質領域内の、早期における、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を裏付ける。
【0179】
（ｖｉｉ）ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、常染色体優性ＡＤを伴う個体における度合いが大きい
常染色体優性ＡＤ（ＡＤＡＤ）は、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、またはＰＳＥＮ２における病原性突然変異により引き起こされるＡＤの早期発生形態である。Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＡＮ）研究に登録された、ＡＤＡＤを伴う個体により提供された、２１例の脳による、頭頂葉皮質由来ＲＮＡ-ｓｅｑデータを使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、ＡＤＡＤの文脈においてもまた生じるのかどうかについて探索した。ＡＤＡＤ参加者の人口統計学データ、臨床データ、および神経病理学データを記録した。ＡＤＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータを、発見ＲＮＡ-ｓｅｑデータと同時に生成し、ｃｉｒｃＲＮＡを、いずれのデータセットにおいても、同時に判定し、フィルタリングした。
常染色体優性ＡＤ（ＡＤＡＤ）は、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、またはＰＳＥＮ２における病原性突然変異により引き起こされるＡＤの早期発生形態である。Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＡＮ）研究に登録された、ＡＤＡＤを伴う個体により提供された、２１例の脳による、頭頂葉皮質由来ＲＮＡ-ｓｅｑデータを使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、ＡＤＡＤの文脈においてもまた生じるのかどうかについて探索した。ＡＤＡＤ参加者の人口統計学データ、臨床データ、および神経病理学データを記録した。ＡＤＡＤ ＲＮＡ-ｓｅｑデータを、発見ＲＮＡ-ｓｅｑデータと同時に生成し、ｃｉｒｃＲＮＡを、いずれのデータセットにおいても、同時に判定し、フィルタリングした。
【0180】
ＡＤＡＤデータセット（ｎ＝２１）と、発見データセット対照（ｎ＝１３）との間の、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現についての、環状トランスクリプトームワイドの解析において、ＦＤＲ閾値下において有意に関連する、２３６のＡＤＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡを同定した。これらは、発見解析において同定された、ほぼ全ての（８／９）ＡＤ症例／対照状態関連ｃｉｒｃＲＮＡを含み、一貫した効果方向を伴った（図１２）。しかし、効果の大きさは、ＡＤＡＤ対対照解析の方が大きかった（例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１：対照と対比したＡＤのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．６４；対照と対比したＡＤＡＤのｌｏｇ２（倍数変化）：-０．９５）。
【0181】
効果量の増大が、ＡＤＡＤ脳における病理学的重症度の悪化に起因するのかどうかについて探索するために、Ｂｒａａｋスコアにより補正された、ｃｉｒｃＲＮＡの示差的発現解析を、ＡＤＡＤと、発見データセットのＡＤとの間において実施した（Ｂｒａａｋスコアが入手可能な試料：ｎＡＤＡＤ＝１７、ｎＡＤ＝７３）。この解析は、７７の有意な示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡを同定し、これらのうちの５９を、ＡＤＡＤ対対照解析において同定した（図１２）。前述と同様に、これらの５９の示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡは、一貫した効果方向を有し、大半（５９のうちの５６）は、対照対ＡＤ対ＡＤＡＤを比較した場合に、効果の大きさを増大させた。併せて、これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、ＡＤＡＤの文脈においてもまた生じ、神経病理学的重症度について補正してもなお、大きさの増大の度合いが著しいことを裏付ける。
【0182】
（ｖｉｉｉ）ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤ定量的尺度の変動について、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数または推定ニューロン比率より多くを説明する
相対重要性解析を実施して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の、定量的ＡＤ形質の変動への寄与：２つの公知の寄与因子［ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数（ＡＰＯＥ４）（ＡＤについての、最も一般的な遺伝危険性因子）および推定ニューロン比率（ＥｓｔＮｅｕｒｏｎ）］と比較した、ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアについて評価した。
相対重要性解析を実施して、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の、定量的ＡＤ形質の変動への寄与：２つの公知の寄与因子［ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数（ＡＰＯＥ４）（ＡＤについての、最も一般的な遺伝危険性因子）および推定ニューロン比率（ＥｓｔＮｅｕｒｏｎ）］と比較した、ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコアについて評価した。
【0183】
上位１０の、メタ解析において有意なＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡを、変動説明解析の比率について選択した。発見データセット（ｎＣＤＲ＝９６）内において、これらのｃｉｒｃＲＮＡ（ＡＰＯＥ４およびＥｓｔＮｅｕｒｏｎと同じ多変量モデルに組み入れられた）は、観察されたＣＤＲの変動のうちの、合計３１．１％を説明した（図３）。同じｃｉｒｃＲＮＡについての、ＢＭ４４再現データセット（ｎＣＤＲ＝１９５）の結果も符合し、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＣＤＲの変動のうちの、合計２３．８％について説明した（図３）。発見データセットおよび再現データセットのいずれにおいても、一部のｃｉｒｃＲＮＡは個別に、また上位１０のｃｉｒｃＲＮＡを合わせても、ＡＰＯＥ４およびＥｓｔＮｅｕｒｏｎと比較して、ＣＤＲの変動のうちのより多くについて説明することが観察された（図３）。同じパターンは、ｃｉｒｃＲＮＡの、Ｂｒａａｋスコアの変動の観察への相対寄与について評価する場合に観察され（図１３）、また、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＣＤＲの変動、Ｂｒａａｋスコア、およびプラークの平均数への寄与について、他のＭＳＢＢ組織を解析する場合（補足結果）にも観察された。最後に、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＰＯＥ４およびＥｓｔＮｅｕｒｏｎより、ＡＤＡＤを伴う個体における、Ｂｒａａｋスコアの変動のうちの多くについて説明することもまた観察された（補足結果）。
【0184】
変動解析の比率に加えて、メタ解析において最も有意な、同じ１０のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡのＡＤ予測能力を、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数および示差的発現の共変量を含む、ベースラインモデルのＡＤ予測能力ともまた比較した。ｃｉｒｃＲＮＡは、単独において、ベースラインの遺伝学／人口学モデルと比較して、同等以上の予測値をもたらし、ベースラインの遺伝学／人口学データと組み合せた場合、予測能力をなお改善することが見出されたことは、相対重要性解析と符合した（図１４）。併せて、これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡの発現は、定量的ＡＤ形質と強く関連し、これらのＡＤ重症度の測定値の変動に顕著に寄与することを裏付ける。
【0185】
（ｉｘ）示差的発現ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤ関連遺伝子およびＡＤ関連経路と共発現する
ｃｉｒｃＲＮＡの、直鎖状転写物との共発現についての解析は、ｃｉｒｃＲＮＡの生物学的関連性および病理学的関連性を推定する機会をもたらす。ＭＥＧＥＮＡソフトウェアを使用するスピアマン相関に基づき、頭頂葉発見データセットの他、ＭＳＢＢデータセットのうちの、大脳皮質領域の各々：ＢＭ１０、ＢＭ２２、ＢＭ３６、およびＢＭ４４においてにおいて、共発現ネットワークを計算した。さらなる計算は、これらのネットワークの固有値遺伝子と、ＣＤＲとの相関から行なわれた。
ｃｉｒｃＲＮＡの、直鎖状転写物との共発現についての解析は、ｃｉｒｃＲＮＡの生物学的関連性および病理学的関連性を推定する機会をもたらす。ＭＥＧＥＮＡソフトウェアを使用するスピアマン相関に基づき、頭頂葉発見データセットの他、ＭＳＢＢデータセットのうちの、大脳皮質領域の各々：ＢＭ１０、ＢＭ２２、ＢＭ３６、およびＢＭ４４においてにおいて、共発現ネットワークを計算した。さらなる計算は、これらのネットワークの固有値遺伝子と、ＣＤＲとの相関から行なわれた。
【0186】
頭頂葉データセット内において、ＣＤＲと有意に相関し、少なくとも１つのＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡを含有する、４９の階層的共発現モジュールを同定した。同様に、ＭＳＢＢ ＢＭ４４データセット内において、ＣＤＲと有意に相関し、少なくとも１つのＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡを含有する、２０の階層的共発現モジュールを同定した。ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１は、頭頂葉データセット内の、モジュールｃ１＿１６（ＣＤＲとのモジュール相関：Ｐ＝５．９４×１０-４）において発現した。このモジュールは、ＡＤ経路［ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、１５６の遺伝子のうちの６６、補正Ｐ＝１．０７×１０-１５］および酸化的リン酸化関連遺伝子（ＫＥＧＧ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、１１５の遺伝子のうちの５８、補正Ｐ＝２．７６×１０-１８）について有意にエンリッチされる直鎖状転写物を含んだ。同様に、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡである、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃは、ＢＭ４４データセットモジュールｃ１＿４６において、ＡＤ遺伝子である、ＡＰＰおよびＳＮＣＡと共発現した（ＣＤＲとのモジュール相関：Ｐ＝１．５２×１０-７；図４）。
【0187】
ＭＳＢＢデータセットのうちの、他の大脳皮質領域内のＭＥＧＥＮＡ結果は、ＡＤ関連遺伝子およびＡＤ関連経路と共発現するＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡと符合した。例えば、ＢＭ２２モジュールｃ１＿１４において、いくつかのＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡと共に共発現するＡＰＰを観察した（ＣＤＲとのモジュール相関：Ｐ＝２．３９×１０-６）。併せて、これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡについて、ＡＤにおける重要な役割を示唆する。
【0188】
（ｘ）ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤ関連経路およびＡＤ関連遺伝子を、潜在的に調節する、ｍｉＲＮＡに対する結合性部位を含有する
ｃｉｒｃＲＮＡ発現の機能的帰結は、活発な研究領域である。近年の研究は、ｃｉｒｃＲＮＡが、転写を調節することが可能であり［Li, X. et al., Mol. Cell 71, 428-442 (2018)］、翻訳さえもされうる［Legnini, I. et al., Mol. Cell 66, 22-37.e9 (2017)］ことを裏付けているが、それらの最もよく特徴づけられた機能は、隔離を介するｍｉＲＮＡの調節にある［参照により本明細書に組み込まれる、Legnini, I. et al., Mol. Cell 66, 22-37.e9 (2017)；Hansen, T. B. et al., Nature 495, 384-388 (2013)］。例えば、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳは、ｍｉＲ-７に対する、７０を超える結合性部位を含有し、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳの発現の低減は、ｍｉＲ-７の標的ｍＲＮＡの下方調節を結果としてもたらす。しかし、ｃｉｒｃＲＮＡ上の、単一のｍｉＲＮＡ結合性部位であってもなお、ｍｉＲＮＡの機能を調節するのに十分であると考えられる［Bai, Y. et al., J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 38, 32-50 (2018)］。
ｃｉｒｃＲＮＡ発現の機能的帰結は、活発な研究領域である。近年の研究は、ｃｉｒｃＲＮＡが、転写を調節することが可能であり［Li, X. et al., Mol. Cell 71, 428-442 (2018)］、翻訳さえもされうる［Legnini, I. et al., Mol. Cell 66, 22-37.e9 (2017)］ことを裏付けているが、それらの最もよく特徴づけられた機能は、隔離を介するｍｉＲＮＡの調節にある［参照により本明細書に組み込まれる、Legnini, I. et al., Mol. Cell 66, 22-37.e9 (2017)；Hansen, T. B. et al., Nature 495, 384-388 (2013)］。例えば、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳは、ｍｉＲ-７に対する、７０を超える結合性部位を含有し、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳの発現の低減は、ｍｉＲ-７の標的ｍＲＮＡの下方調節を結果としてもたらす。しかし、ｃｉｒｃＲＮＡ上の、単一のｍｉＲＮＡ結合性部位であってもなお、ｍｉＲＮＡの機能を調節するのに十分であると考えられる［Bai, Y. et al., J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 38, 32-50 (2018)］。
【0189】
ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡにより潜在的に調節されるｍｉＲＮＡを同定するために、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ７０ソフトウェアを使用して、ｃｉｒｃＲＮＡ配列内の、ｍｉＲＮＡ結合性部位を予測した。７０を超えるｍｉＲ-７の予測結合性部位についての、既に報告されている知見が、ｃｉｒｃＣＤＲ１-ＡＳ配列内において再現され、他のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ内の、いくつかの興味深いｍｉＲＮＡに対する結合性部位もまた予測された。ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１は、それらの発現の増大が神経膠腫細胞内のアポトーシスを誘発する、ｍｉＲ-１３６に対する１８の予測結合性部位を含有した。ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１は、ＡＤ関連遺伝子である、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２をターゲティングすることが予測されるｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ-６５１に対する５つの予測結合性部位を含有した［参照により本明細書に組み込まれる、Agarwal, V. et al., eLife 4, e05005 (2015)］。最後に、ＡＤ関連遺伝子である、ＡＰＰおよびＳＮＣＡと共発現することが同定された（図４）ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃは、ＡＰＰおよびＳＮＣＡをターゲティングすることが予測されるｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ-１０５に対する２つの予測結合性部位を含有する。これらのバイオインフォマティクスの結果は、一部のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡの調節を介して、機能的効果を及ぼしうることを示唆する。
【0190】
（ｘｉ）補足結果
ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、推定細胞型比率の、ＡＤ関連変化からの独立性を裏付ける。ＡＤ病理は、コンピュータによるデコンボリューション法を使用して、ＲＮＡ-ｓｅｑデータ内において推定されうる、脳細胞型比率の劇的な変化を結果としてもたらす。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、脳細胞型比率の、ＡＤ関連変化から独立であることを裏付けるために、示差的発現の共変量、ライブラリーサイズにより正規化されたｃｉｒｃＲＮＡカウント、およびコンピュータによりデコンボリューションされた脳細胞型比率の推定値を含むモデルにより、回帰分析を実施した。頭頂葉発見データセット内および再現ＢＭ４４データセット内において、メタ解析において有意な１４８のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡ全てについて、これらの回帰分析を実施した。これらの結果の固定効果についてのメタ解析は、Dube, U., Del-Aguila, J.L., Li, Z. et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci 22, 1903-1912 (2019) Supplementary Table 17において提示されている。本発明者らは、脳細胞型比率推定値と同じモデル内に組み入れられた場合に、有意な関連（ｐ値＜０．０５、補足表１７）を保持する、１０６のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡ、例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（メタｐ値：８．１５×１０-１３）およびｃｉｒｃＤＯＣＫ１（メタｐ値：１．０３×１０-５）を同定する。これらの結果は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡの大部分と、ＣＤＲとの関連が、推定細胞型比率のＣＤＲ関連変化から独立であることを裏付ける。
ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、推定細胞型比率の、ＡＤ関連変化からの独立性を裏付ける。ＡＤ病理は、コンピュータによるデコンボリューション法を使用して、ＲＮＡ-ｓｅｑデータ内において推定されうる、脳細胞型比率の劇的な変化を結果としてもたらす。ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、脳細胞型比率の、ＡＤ関連変化から独立であることを裏付けるために、示差的発現の共変量、ライブラリーサイズにより正規化されたｃｉｒｃＲＮＡカウント、およびコンピュータによりデコンボリューションされた脳細胞型比率の推定値を含むモデルにより、回帰分析を実施した。頭頂葉発見データセット内および再現ＢＭ４４データセット内において、メタ解析において有意な１４８のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡ全てについて、これらの回帰分析を実施した。これらの結果の固定効果についてのメタ解析は、Dube, U., Del-Aguila, J.L., Li, Z. et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci 22, 1903-1912 (2019) Supplementary Table 17において提示されている。本発明者らは、脳細胞型比率推定値と同じモデル内に組み入れられた場合に、有意な関連（ｐ値＜０．０５、補足表１７）を保持する、１０６のＣＤＲ関連ｃｉｒｃＲＮＡ、例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（メタｐ値：８．１５×１０-１３）およびｃｉｒｃＤＯＣＫ１（メタｐ値：１．０３×１０-５）を同定する。これらの結果は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡの大部分と、ＣＤＲとの関連が、推定細胞型比率のＣＤＲ関連変化から独立であることを裏付ける。
【0191】
ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、ＡＤの神経病理学的定量的形質：アミロイドプラークの平均数と相関する：ＭＳＢＢデータセットは、ＡＤのさらなる神経病理学的定量的形質：アミロイドプラークベータの平均数を含む。プラークの平均数と有意に相関する、９５のｃｉｒｃＲＮＡ、例えば、データセットのＢＭ４４サブセット（ｎＰｌａｑｕｅＭｅａｎ＝１９５）内のｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１（プラークの平均数１単位当たりｌｏｇ２倍の変化：-０．０２；ｐ値：４．７０×１０-７）を同定した（Dube, 2019）。同様に、ＭＳＢＢデータセット内の、他の大脳皮質領域内においても、プラークの平均数と相関するｃｉｒｃＲＮＡを同定した（Dube, 2019）。まとめると、１２のｃｉｒｃＲＮＡは、４つの大脳皮質領域全てにおいて、アミロイドプラークの平均数と、有意に相関した（図１１）。
【0192】
有意に関連したｃｉｒｃＲＮＡは、アミロイドプラークの平均数の変動について、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数または推定ニューロン比率より多くを説明する。プラークの平均数と有意に関連すると同定されたｃｉｒｃＲＮＡが、公知の寄与因子：ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数および推定ニューロン比率（ＥｓｔＮｅｕｒｏｎ）と比較して、プラークの平均数の変動の多くを説明するのかどうかについて探索した。
【0193】
上位１０の最も有意なＰｌａｑｕｅＭｅａｎ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、累積的に、ＡＰＯＥ４およびＥｓｔＮｅｕｒｏｎと比較して、ＭＳＢＢデータセット内の、４つの大脳皮質領域全て（Dube, 2019）にわたり、観察されるアミロイドプラークの平均数の変動の多くを説明したことは、他の２つの定量的ＡＤ形質（ＣＤＲおよびＢｒａａｋスコア）による本発明者らの結果と符合した。
【0194】
有意に関連したｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤＡＤを伴う個体における、Ｂｒａａｋスコアの変動について、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数または推定ニューロン比率より多くを説明する。また、ＡＤ症例状態と対比して、Ｂｒａａｋスコア補正ＡＤＡＤと有意に関連すると同定されたｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤＡＤを伴う個体（ｎＡＤＡＤ ｗｉｔｈ Ｂｒａａｋ＝１７）において、公知の寄与因子：ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数および推定ニューロン比率（ＥｓｔＮｅｕｒｏｎ）と比較して、Ｂｒａａｋスコアの変動の多くを説明するのかどうかも探索した。上位１０の、最も有意な、Ｂｒａａｋスコア補正ＡＤＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＰＯＥ４およびＥｓｔＮｅｕｒｏｎと比較して、累積的に、Ｂｒａａｋスコアの変動についての観察の多く（Dube, 2019）を説明したことは、発見データセット内および再現データセット内のＢｒａａｋスコアについての、本発明者らの結果と符合した。
【0195】
ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤ症例状態を予測するロジスティックモデルの感度および特異度を改善する。ｃｉｒｃＲＮＡ発現と、ＡＤ形質とのロバストな関連を踏まえ、ｃｉｒｃＲＮＡの組入れが、ＡＤ症例状態を予測するロジスティックモデルの感度および特異度を改善するのかどうかについて探索した（図１４）。本発明者らのベースである、人口学-遺伝学モデルは、示差的発現の共変量（ＰＭＩ、ＴＩＮ、ＡＯＤ、バッチ、性別、遺伝系統）の他、ＡＰＯＥ４の対立遺伝子の数を組み入れ、発見データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３、ＡＵＣベース：０．９０）および再現データセット（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＤｅｆｉｎｉｔｅ ＡＤ＝８９、ＡＵＣベース：０．８４）のいずれにおいても、良好な予測値［ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線下面積（ＡＵＣ）により測定される］をもたらした。興味深いことに、メタ解析において、ＣＤＲと有意に関連する、上位１０の最多ｃｉｒｃＲＮＡについての正規化カウントだけを組み入れたモデルは、発見データセット（ＡＵＣｃｉｒｃ：０．９７）および再現データセット（ＡＵＣｃｉｒｃ：０．８８）のいずれにおいても、より良好な予測値をもたらした。最後に、モデルの組合せは、発見データセット（ＡＵＣベース＋ｃｉｒｃ：１．００）および再現データセット（ＡＵＣベース＋ｃｉｒｃ：０．９８）のいずれにおいても、最良の予測能力をもたらした。他のＭＳＢＢ大脳皮質領域についても、ｃｉｒｃＲＮＡ発現情報の付加により、同様の結果が観察され、予測能力を、ベースの人口学-遺伝学モデルを上回って増大させた（図１４）。これらの結果は、大脳皮質ｃｉｒｃＲＮＡ発現が、ＡＤ症例状態を高度に予測することを指し示す。
【0196】
本明細書において示されないデータおよびデータ表は、参照によりその全体において組み込まれる、Dube, U., Del-Aguila, J.L., Li, Z. et al. An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat Neurosci 22, 1903-1912 (2019)（Dube, 2019）において見出されうる。
【0197】
考察
転写調節は、ヒト神経系の複雑性の根底をなし、その誤調節は、疾患に寄与しうる［Lee, T.I., et al., Cell 152, 1237-1251 (2013)］。実際、直鎖状トランスクリプトームに焦点を当てた、いくつかの研究は、ＡＤ症例状態と関連する共発現ネットワーク、およびスプライシングの変化を同定している。本実施例において、ＡＤ関連環状トランスクリプトームに対する洞察が提示される。
転写調節は、ヒト神経系の複雑性の根底をなし、その誤調節は、疾患に寄与しうる［Lee, T.I., et al., Cell 152, 1237-1251 (2013)］。実際、直鎖状トランスクリプトームに焦点を当てた、いくつかの研究は、ＡＤ症例状態と関連する共発現ネットワーク、およびスプライシングの変化を同定している。本実施例において、ＡＤ関連環状トランスクリプトームに対する洞察が提示される。
【0198】
２つの、大規模な、独立の、脳由来ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットを使用して、特異的ｃｉｒｃＲＮＡの変化が、ＡＤにおいて、再現可能な現象であることが確立された。ｃｉｒｃＲＮＡの発現レベルが、ＡＤ重症度についての神経病理学的尺度および臨床的尺度のいずれとも、有意に相関することが裏付けられたことは、疾患における重要な役割を示唆する（表１）。この役割は、前症状性ＡＤの早期における、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化についての証拠により、さらに裏付けられた。ＡＤの根底をなす病理学的過程は、実質的な症状発生の何十年も前に始まる、十分に特徴づけられた時空的進行に従う。したがって、皮質にわたり、ＡＤ病理について公知の時空的進行と符合する順序において生じる変化として観察される、前症状性期における、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化は、相関するだけではなく、疾患に直接寄与しうる。ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化の大きさが、神経病理学的重症度について補正した後においてもなお、遺伝的に駆動されるＡＤＡＤを伴う個体において、散発性ＡＤを伴う個体と比較して大きかったという、本実施例の知見はまた、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、疾患と相関しているだけであるという議論に対する反証でもある。重要な役割は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤ原因経路の一部であることが公知の遺伝子と共発現することを裏付ける、ネットワーク解析によってもさらに裏付けられる。
【0199】
本実施例は、メタ解析において、１６４のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡを同定し、ネットワーク共発現解析およびｍｉＲＮＡ結合性部位予測解析を実施して、生物学的文脈を付与し、関連結果の解釈を容易とした。例えば、３つのＡＤ形質全てと有意に関連するｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１が、ＡＤおよび酸化的リン酸化に関与する直鎖状遺伝子と共に共発現されたことは、おそらく、脳の代謝低下における、このｃｉｒｃＲＮＡの役割が、ＡＤと関連することを示唆する。脳代謝低下はまた、ＰＳＥＮ１突然変異駆動性ＡＤＡＤにおいても裏付けられており、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１は、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２をターゲティングすることが予測されるｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ-６５１に対する、複数の予測結合性部位を含有する。同様に、ｃｉｒｃＣＯＲＯ１Ｃは、ＡＤ関連遺伝子である、ＡＰＰおよびＳＮＣＡと共に共発現しているとして同定され、その配列は、複数のｍｉＲ-１０５結合性部位を含有することが予測された。ｍｉＲ-１０５は、ＡＰＰおよびＳＮＣＡのいずれもターゲティングすることが予測されることは、観察される共発現が、このｍｉＲＮＡにより媒介されうることを示唆する。重要なことは、このＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡおよび他のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ調節を介して、機能的な効果を及ぼすとすれば、微細なｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化が、下流の遺伝子発現に対して、大きな影響を及ぼしうることである。
【0200】
本実施例における、高信頼性ｃｉｒｃＲＮＡ発現の同定は、バックスプライスジャンクションを判定し、厳密にフィルタリングするために十分なリードを生成するのに要求される、高深度のシーケンシングおよび多数の試料により、技術的に限界づけられる。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡは、現在のところ一般的でない、ｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内だけにおいて、効率的に判定されうる。本実施例の結果は、さらなる、ＡＤ脳および対照脳による、ｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータセットの生成を支援する。
【0201】
感度解析は、ｃｉｒｃＲＮＡ-ＡＤ間関連の大半が、ＡＤと関連する、コグネイトの直鎖状ｍＲＮＡまたは推定細胞型比率変化に依存しないこと［固有の技術的相関（直鎖状）または生物学的相関（細胞型比率）にもかかわらず］を裏付ける。しかしながら、直鎖状-環状間の技術的相関は、ＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡおよびそれらのコグネイトの直鎖状ｍＲＮＡの両方を含む、共発現モジュールの解釈を限界づける。加えて、一部のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、それらのＡＤ-直鎖状ｍＲＮＡ間関連から独立ではない可能性があるが、ｃｉｒｃＲＮＡの生物学的機能は異なるので、これらのＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡは、やはり、病理学的に関連しうる。最後に、本実施例は、ｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤとの関連を駆動していると考えられる、一部のＡＤ関連ｃｉｒｃＲＮＡ-コグネイト直鎖状ｍＲＮＡ対を同定した。この知見は、他のｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内のその可能性について探索するように、ｃｉｒｃＲＮＡ解析が、従来の直鎖状ｍＲＮＡについての示差的発現解析と並行して行われうることを示唆する。
【0202】
本実施例において、ｃｉｒｃＲＮＡ発現は、人口学データまたはＡＰＯＥ４危険性因子データの非存在下においてであってもなお、ＡＤ症例状態についての強い予測能力をもたらすことが観察された。脳脊髄液および血漿などの体液中における、ｃｉｒｃＲＮＡの相対的安定性［Maass, P.G. et al., J. Mol. Med. 1-11 (2017) doi:10.1007/s00109-017-1582-9］およびエクソソーム内のそれらのエンリッチメントと合わせて、この観察は、ｃｉｒｃＲＮＡが、前症状性ＡＤおよび症状性ＡＤ、ならびに他の神経変性疾患についての末梢バイオマーカーとして使用されることを示唆する。
［実施例２］
［実施例２］
【0203】
アルツハイマー病についての非侵襲性（血液ベースの）バイオマーカーとしての環状ＲＮＡ
以下の実施例は、神経病理学的に確認されたＡＤ症例および対照に由来する脳組織内の、環状ＲＮＡの、ロバストかつ再現可能な示差的発現（ＤＥ）の同定について記載する。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤと極めて有意に関連するので、脳組織内の、わずか１０のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのカウントを使用する予測モデルは、高度の特異度および感度（ＡＵＣ：０．８８）をもたらした。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥがまた、臨床的ＡＤ重症度および病理学的ＡＤ重症度のいずれとも有意に関連することが観察された。対照脳、およびＡＤＡＤを伴う個体に由来する脳内の、より重度のＤＥと比較して、前症状性脳内の名目上有意なｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥが、ＡＤ病理の証拠を示したが、臨床的認知症の証拠は示さなかったこともまた観察されたことは、これと符合する。ＡＤ関連遺伝子の、ＡＤ ｃｉｒｃＲＮＡとの共発現が、ネットワーク解析を介して観察された。併せて、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を、ＡＤと関連付ける、一連の証拠を提示する。
以下の実施例は、神経病理学的に確認されたＡＤ症例および対照に由来する脳組織内の、環状ＲＮＡの、ロバストかつ再現可能な示差的発現（ＤＥ）の同定について記載する。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤと極めて有意に関連するので、脳組織内の、わずか１０のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのカウントを使用する予測モデルは、高度の特異度および感度（ＡＵＣ：０．８８）をもたらした。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥがまた、臨床的ＡＤ重症度および病理学的ＡＤ重症度のいずれとも有意に関連することが観察された。対照脳、およびＡＤＡＤを伴う個体に由来する脳内の、より重度のＤＥと比較して、前症状性脳内の名目上有意なｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥが、ＡＤ病理の証拠を示したが、臨床的認知症の証拠は示さなかったこともまた観察されたことは、これと符合する。ＡＤ関連遺伝子の、ＡＤ ｃｉｒｃＲＮＡとの共発現が、ネットワーク解析を介して観察された。併せて、本開示は、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を、ＡＤと関連付ける、一連の証拠を提示する。
【0204】
アルツハイマー病（ＡＤ）の根底をなす病理学的過程は、認知症状発生の何十年も前に始まる。したがって、疾患修飾療法または神経保護療法が、ＡＤの発生を遅延させうるか、なおまたはこれを防止しうる期間は、長期にわたる。Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、このような治療の社会的利益および経済的利益は、数十億ドルに上ると推定している。現在のところ、ＡＤのための疾患修飾療法または神経保護療法を同定するための研究努力は、臨床試験への登録のために、危険性集団を同定するための現行の方法により限界づけられている。Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＡＮ）により先駆的に開発された、１つの有望な手法は、ＡＤ［常染色体優性ＡＤ（ＡＤＡＤ）］について公知のメンデル遺伝子内の病原性突然変異を伴う、希少な家族集団に焦点を当てている。このような突然変異を伴う個体は、遺伝的に危険性があり、散発性ＡＤを伴う個体より早期にＡＤを発症する。このような個体はまた、散発性ＡＤと比較して、より重度の神経病態も裏付ける。したがって、希少なＡＤＡＤ集団内において同定される、任意の治療候補者は、散発性ＡＤを伴う、ＡＤ集団のうちの９９％には、一般化可能ではない可能性がある。加えて、この集団内において、研究されうる治療の数は、メンデル型ＡＤ突然変異を伴う家族の数が、比較的少数であることにより限界づけられる。ＡＤのための疾患修飾療法または神経保護療法に対して増大する社会的必要に取り組むために、前症状性の散発性ＡＤを伴う個体同定し、症状性の散発性ＡＤを正確に診断し、病期分類する、経済的に実現可能なスクリーニング法が開発されなければならない。
【0205】
前症状性ＡＤについてスクリーニングするための、現行の方法は、ＣＳＦベースのバイオマーカー研究またはＰＥＴベースのアミロイドイメージング研究に依拠する。これらの方法は、前症状性ＡＤの同定に成功しているが、専門的な医療ケア提供者および侵襲的手順［ＣＳＦを回収するための腰椎穿刺またはＰＥＴイメージングのための放射性トレーサーの注射］を要求し、高価である。まとめると、これらの方法の危険性および費用が、前症状性ＡＤを同定する、集団ベースのスクリーニングのための、それらの使用を妨げてきた可能性が高い。スクリーニングのための、より実現可能な方法は、血液ベースの検査であろう。このような検査は、一次医療状況において一般に回収される血液と共に、医療ケアの日常的部分である。血液は、細胞の健常および病理についての、比較的非侵襲的な読取りをもたらすことを可能とする、細胞由来の代謝物、核酸、エクソソーム、および他の成分を含有する。特に、血中核酸は、資源が制限された状況下にあってもなお、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの手法を使用する、ヒト免疫不全ウイルスのような感染性疾患の、高感度かつ高特異度の検出のために利用されている。次世代シーケンシングベースの手法もまた、血中核酸を測定するのに使用されうるが、その現行の費用は、集団スクリーニングにおける使用のために、法外である可能性が高い。しかしながら、シーケンシングベースの手法を使用して、目的の形質について高感度かつ高特異度の核酸パネルが同定されたら、比較的廉価なＰＣＲベースの方法により、たやすくアッセイされうる。
【0206】
直鎖状無細胞核酸は、血中エクソヌクレアーゼによる定常的な分解にさらされている。これに対し、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、遊離ヒドロキシル末端を有さず、比較的安定である。ｃｉｒｃＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡの３’末端が、５’末端と、共有結合的にスプライシングされ、これにより、連続ループを形成するバックスプライシングから形成される。ＲＮＡシーケンシングデータ内におけるバックスプライスジャンクションの検出、またはＰＣＲによるこの検出は、全ての臓器系における、ｃｉｒｃＲＮＡのプロファイリングを可能とした。これらの研究は、ｃｉｒｃＲＮＡが、神経系において最もエンリッチされ、シナプス内において特に高度に発現されることを見出した。神経系におけるｃｉｒｃＲＮＡの発現は、宿主遺伝子の発現から独立に生じ、発生時に、かつ、ニューロンの興奮に応答して調節されることが観察された。したがって、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の測定は、ニューロンおよびシナプスの健常への洞察をもたらす潜在的可能性を有する。ｃｉｒｃＲＮＡ生物学に関しては、なお多くのことが未知のままである；例えば、ｃｉｒｃＲＮＡが、インビボにおいて翻訳されうることは、近年裏付けられたに過ぎない。しかしながら、血中において検出されるｃｉｒｃＲＮＡは、がん、脳卒中、および多発性硬化症において、バイオマーカーとしての有用性を有することが見出されているが、ＡＤについてのバイオマーカーとしては、いまだ探索されていない。
【0207】
神経病理学的に確認されたＡＤ症例および対照に由来する脳組織内の、環状ＲＮＡの、ロバストかつ再現可能な示差的発現（ＤＥ）が同定された。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤと極めて有意に関連するので、脳組織内の、わずか１０のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのカウントを使用する予測モデルは、高度の特異度および感度（ＡＵＣ：０．８８）をもたらした。加えて、本発明者らは、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥがまた、臨床的ＡＤ重症度および病理学的ＡＤ重症度のいずれとも有意に関連することを観察した。本発明者らがまた、前症状性脳内の、対照脳と比較して名目上有意なｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥ（ＡＤ病理の証拠であるが、臨床的認知症の証拠ではない）、およびＡＤＡＤを伴う個体に由来する脳内の、より重度のＤＥも観察したことは、これと符合する。本発明者らはまた、ネットワーク解析を介して、ＡＤ関連遺伝子の、ＡＤ ｃｉｒｃＲＮＡとの共発現も観察した。併せて、本発明者らは、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化を、ＡＤと関連付ける、一連の証拠を有する。
【0208】
本発明者らが同定した、ＡＤ ＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡの一部は、ヒト血漿試料中において検出されることが報告されている。したがって、ｃｉｒｃＲＮＡレベルの、ＡＤ病理媒介型変化が、前症状性個体であってもなお、血漿中において検出可能であることが示唆される。本実施例は、疾患重症度に基づく、ＡＤの正確な診断および患者の層別化のための、たやすくアッセイ可能であり、比較的廉価な、血液ベースのバイオマーカーとしての血漿ｃｉｒｃＲＮＡについて探索する。この結果は、症状性ＡＤおよび前症状性ＡＤのための、経済的に実現可能なスクリーニング検査の開発をもたらす。
【0209】
血液ベースのｃｉｒｃＲＮＡバイオマーカーは、診断および層別化を越えて、広く適用可能である。ＡＤについての、質量分析ベースの血漿検査の近年の報告に対し、血液ベースのｃｉｒｃＲＮＡバイオマーカーは、潜在的なＡＤ標的、例えば、アミロイドベータまたはタウの測定に依拠しないため、コンパニオン診断法となる潜在的可能性を有する。加えて、本発明者らの脳ベースの予備解析において、本発明者らが裏付けた通り、ｃｉｒｃＲＮＡ発現は、臨床的重症度および病理学的重症度の両方を追跡し、これにより、血液ベースのｃｉｒｃＲＮＡバイオマーカーが、疾患の進行をモニタリングするのに使用される潜在的可能性をもたらす。最後に、血液ベースのｃｉｒｃＲＮＡバイオマーカーはまた、シナプスおよび神経系の病理を伴う他の疾患、例えば、前頭側頭型認知症、パーキンソン病型認知症、およびレビー小体認知症へも潜在的に適用される可能性がある。
【0210】
頭頂葉皮質ｃｉｒｃＲＮＡデータ（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝１３、ｎＡＤ＝８３）を使用して、本発明者らは、ｃｉｒｃＲＮＡ ＤＥについての、トランスクリプトームワイドの解析を行った。この解析を介して、本発明者らは、９つの、有意なＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１；ｐ値：２．８×１０-６）を同定した。これらのシグナルのうちの過半は、本発明者らが、１１８のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡ（例えば、ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１；ｐ値：１．２×１０-５；ｃｉｒｃＣＯＲＯ１ｃ；ｐ値：１．２×１０-４）を同定した、下前頭回組織についての、大型であり、独立である、公開のＲＮＡ-ｓｅｑデータセットについての、本発明者らの解析（ｎｃｏｎｔｒｏｌ＝４０、ｎＡＤ＝８９）において再現された。興味深いことに、いずれのデータセットにおいても、ｃｉｒｃＲＮＡ発現は、Ｂｒａａｋスコアにより測定される、ＡＤの神経病理学的重症度とより有意に関連した（例えば、頭頂葉：ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１；ｐ値：１．７×１０-７）。
【0211】
ＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡの変化は、ＡＤ病理を伴う非認知症罹患個体（前症状性症例）において観察される。本発明者らは、下前頭回ＲＮＡ-ｓｅｑデータセット内の、１８例の前症状性ＡＤ症例を利用して、ＡＤ過程の早期における、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の変化について評価した。この小さな標本サイズは、トランスクリプトームワイドのＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡを検出する検出力を制限するが、本発明者らは、既に言及された１１８のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのうちの２４が、名目上、前症状性ＡＤと、対照との間のＤＥであること（例えば、ｃｉｒｃＳＴ１８；ｐ値：１．３×１０-４）を観察した。
【0212】
ｃｉｒｃＲＮＡは、ＡＤ症例／対照状態を予測する。１０のＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡ（ｃｉｒｃＨＯＭＥＲ１、ｃｉｒｃＤＯＣＫ１、ｃｉｒｃＫＣＮＮ２、ｃｉｒｃＭＡＮ２Ａ１、ｃｉｒｃＳＴ１８、ｃｉｒｃＡＴＲＮＬ１、ｃｉｒｃＥＸＯＳＣ１、ｃｉｒｃＦＭＮ１、ｃｉｒｃＩＣＡ１、ｃｉｒｃＲＴＮ４）を、ロジスティック回帰モデルにおいて使用して、下前頭回データ中の、４０例の神経病理学的に確認された対照と、８９例の神経病理学的に確認された確定ＡＤ症例との間において、ＡＤ症例状態を予測し、ＲＯＣを計算した。ＲＯＣ値およびＡＵＣ値を、下記に提示する。
【0213】
本実施例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ヒト血漿試料において、検出可能であることが見出される。本出願者らが、上記において記載されたｃｉｒｃＲＮＡに由来する、血中のｃｉｒｃＲＮＡレベルを見出し、これらのｃｉｒｃＲＮＡが、ＡＤ症例と対照の間で、予期される方向に示差的に発現され、その方向は脳の研究で観察されたのと同じ方向であることを見出す。血液研究において使用されたプライマーは、上記において記載されたプライマーと同じであり、具体的には、ＤＥ ｃｉｒｃＲＮＡのバックスプライスジャンクションを、特異的に増幅する多様なプライマー対としての、配列番号１～２０である。
【0214】
均等物
本明細書において、本発明のいくつかの実施形態が、記載および例示されたが、当業者は、機能を実施し、かつ／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つもしくは複数を得るための、他の様々な手段および／または構造を、たやすく想定し、このような変動および／または改変の各々は、本明細書において記載される、本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般に、当業者は、本明細書において記載される、全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が、例示的であることを意図されるものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、具体的な適用、または本発明の教示が使用される適用に依存することをたやすく理解するであろう。当業者は、規定を超えない実験を使用して、本明細書において記載される、本発明の具体的実施形態の、多くの均等物を認識または確認することが可能であろう。したがって、前出の実施形態は、例だけを目的として提示されるものであり、付属の特許請求の範囲およびこれらの均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に記載され、特許請求されるのと別の形においても実施されうることを理解されたい。本開示における、本発明の実施形態は、本明細書において記載される、各個別の特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、２つまたはこれを超え、このような特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法の、任意の組合せも、このような特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法が、相互に矛盾しない限りにおいて、本開示における、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において、本発明のいくつかの実施形態が、記載および例示されたが、当業者は、機能を実施し、かつ／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つもしくは複数を得るための、他の様々な手段および／または構造を、たやすく想定し、このような変動および／または改変の各々は、本明細書において記載される、本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般に、当業者は、本明細書において記載される、全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が、例示的であることを意図されるものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、具体的な適用、または本発明の教示が使用される適用に依存することをたやすく理解するであろう。当業者は、規定を超えない実験を使用して、本明細書において記載される、本発明の具体的実施形態の、多くの均等物を認識または確認することが可能であろう。したがって、前出の実施形態は、例だけを目的として提示されるものであり、付属の特許請求の範囲およびこれらの均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に記載され、特許請求されるのと別の形においても実施されうることを理解されたい。本開示における、本発明の実施形態は、本明細書において記載される、各個別の特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、２つまたはこれを超え、このような特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法の、任意の組合せも、このような特色、システム、品目、材料、キット、および／または方法が、相互に矛盾しない限りにおいて、本開示における、本発明の範囲内に含まれる。
【0215】
本明細書において開示される、全ての参考文献、特許、および特許出願は、それについてそれらの各々が引用される対象物に関して、参照により組み込まれ、場合によって、文献の全体を包含しうる。
【0216】
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「および／または」という語句は、このように接続された要素の「一方または両方」、すなわち、ある場合には、連言的に存在し、他の場合には、選言的に存在する要素を意味するように理解されるものとする。「および／または」を伴って列挙される複数の要素は、同じ形において、すなわち、このように接続される要素のうちの「１つまたは複数」であると理解されるものとする。「および／または」節により、具体的に同定される要素以外に、具体的に同定される要素と関連する場合であれ、関連しない場合であれ、他の要素が存在してもよい。したがって、非限定例として述べると、「～を含むこと」などのオープンエンドの表現と共に使用される場合の、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、一実施形態において、Ａだけを指す場合もあり（Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態において、Ｂだけを指す場合もあり（Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方を指す場合もある（他の要素を含んでもよい）などである。
【0217】
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「または」とは、上記において規定された「および／または」と同じ意味を有するように理解されるものとする。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、要素の数またはリストのうちの、少なくとも１つの包含であるが、また、１つを超える数またはリストも含み、列挙されていない、さらなる項目を含んでもよいと解釈されるものとする。「～のうちの１つだけ」もしくは「～のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される場合の、「～からなること」など、逆のことが明確に指し示された用語だけが、要素の数またはリストのうちの、正確に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される「または」という用語は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つだけ」、または「～のうちの正確に１つ」など、排他性の用語により先立たれている場合に限り、排他的代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を指し示すと解釈されるものとする。特許請求の範囲において使用される場合の、「～から本質的になること」は、特許法の分野において使用される場合の、その通常の意味を有するものとする。
【0218】
１つまたは複数の要素を有するリストに言及して、本明細書および特許請求の範囲において使用される、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちの、いずれか１つまたは複数から選択されるが、要素のリスト内において、具体的に列挙される、各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを、必ずしも含まず、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外しない、少なくとも１つの要素を意味するように理解されるものとする。この定義はまた、要素が、具体的に同定される要素に関連する場合であれ、関連しない場合であれ、「少なくとも１つの」という語句が指す要素のリスト内において、具体的に同定される要素以外に、適宜存在しうることを可能とする。したがって、非限定例として述べると、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、これと同義に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、これと同義に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態において、１つを超えるＡを含むが、Ｂは存在しない、少なくとも１つのＡを指してもよく（かつ、Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態において、１つを超えるＢを含むが、Ａは存在しない、少なくとも１つのＢを指してもよく（かつ、Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態において、１つを超えるＡを含む、少なくとも１つのＡ、および１つを超えるＢを含む、少なくとも１つのＢを指してもよい（かつ、他の要素を含んでもよい）などである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】