特表2022-550907ＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）を含む組成物及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】ＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）を含む組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/10 20060101AFI20221128BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20221128BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221128BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20221128BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20221128BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20221128BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20221128BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20221128BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
A61K38/10
A61K38/16
A61K9/08
A61K47/22
A61K47/18
A61K47/26
C07K14/52 ZNA
C07K14/475
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520832
(86)(22)【出願日】2020-12-04
(85)【翻訳文提出日】2022-05-26
(86)【国際出願番号】 US2020063182
(87)【国際公開番号】W WO2021077125
(87)【国際公開日】2021-04-22
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519124338
【氏名又は名称】ブリム バイオテクノロジー インク
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＭ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】８Ｆ， Ｎｏ．１， Ａｌｌｅｙ ３０， Ｌａｎｅ ３５８ Ｒｕｉｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｎｅｉｈｕ Ｄｉｓｔ． Ｔａｉｐｅｉ， １１４９２ （ＴＷ）
(74)【代理人】
【識別番号】100116850
【弁理士】
【氏名又は名称】廣瀬 隆行
(74)【代理人】
【識別番号】100165847
【弁理士】
【氏名又は名称】関 大祐
(72)【発明者】
【氏名】リー フランク ウェン－チー
(72)【発明者】
【氏名】リャウ ウェイン ダブリュー シー
(72)【発明者】
【氏名】ファン ピン－イン
(72)【発明者】
【氏名】ワン シャオ－ハン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB24
4C076CC10
4C076DD38D
4C076DD51Z
4C076DD60S
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084CA18
4C084CA53
4C084CA59
4C084DB53
4C084MA05
4C084MA17
4C084NA03
4C084ZA33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045CA40
4H045DA01
4H045EA28
4H045FA10
(57)【要約】
水性製剤は、配列番号１、２、３、５、６、８、又は９のうちの１つの配列を有するＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）と、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度のヒスチジンと、抗酸化剤と、任意選択で非イオン性等張剤とを含む。ｐＨ値は約５～９である。抗酸化剤はニコチンアミドであり、これは５０ｍＭ～１０００ｍＭの濃度である。非イオン性等張剤はソルビトールであり、これは０ｍＭ～５００ｍＭの濃度である。ＰＤＳＰの濃度は０．０１％～１％ｗ／ｖである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９の配列を有するＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）と、抗酸化剤と、
１ｍＭ～１００ｍＭの濃度のヒスチジンとを含む
水性製剤。
【請求項2】
ｐＨ値が約５～９である請求項１に記載の水性製剤。
【請求項3】
前記抗酸化剤がニコチンアミドである請求項１に記載の水性製剤。
【請求項4】
ニコチンアミドの濃度が５０ｍＭ～１０００ｍＭである請求項３に記載の水性製剤。
【請求項5】
非イオン性等張剤をさらに含む請求項１に記載の水性製剤。
【請求項6】
前記非イオン性等張剤がソルビトールである請求項５に記載の水性製剤。
【請求項7】
ソルビトールの濃度が０ｍＭ～５００ｍＭである請求項６に記載の水性製剤。
【請求項8】
前記ヒスチジンの濃度が５ｍＭ～６０ｍＭである請求項１に記載の水性製剤。
【請求項9】
前記ヒスチジンの濃度が１０ｍＭ～４０ｍＭである請求項１に記載の水性製剤。
【請求項10】
前記ＰＤＳＰが配列番号３の配列を有する請求項１～９のいずれか一項に記載の水性製剤。
【請求項11】
前記ＰＤＳＰの濃度が０．０１％～１％ｗ／ｖである請求項１０に記載の水性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＥＤＦ由来の短いペプチドの組成物に関し、詳細には、そのようなペプチドの製剤及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、約５０ｋＤａの分子量を有する４１８個のアミノ酸からなる分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、多くの生物学的機能を有する多機能タンパク質である（米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号明細書を参照されたい）。ヒトＰＥＤＦの異なるペプチド領域は、異なる機能を担うことが分かっている。例えば、３４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基４４～７７）は抗血管新生活性を有することが確認されており、一方、４４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基７８～１２１）は神経栄養特性を有することが確認されている。
【0003】
ヒトＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）は、様々な疾患又は障害を治療又は予防するための有望な治療薬であることが分かっている。例えば、ＰＤＳＰは、筋肉再生又は動脈形成の促進（米国特許第９，８８４，０１２号明細書）、脱毛症及び／又は脱毛症の治療（米国特許第９，９３８，３２８号明細書）、変形性関節症の治療（米国特許第９，７７７，０４８号）、皮膚老化の予防又は改善（米国特許第９，８１５，８７８号明細書）、肝硬変の治療（米国特許第８，５０７，４４６号明細書）、又は様々な眼の疾患又は状態の治療（例えば、網膜変性、マイボーム腺疾患、ドライアイ）に有効であることが分かっている。対応するマウスＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ｍｏＰＤＳＰ）も、同じ治療効果を有することが分かっている。しかしながら、これらのペプチドの調製物は、長期安定性を欠くことが見出された。したがって、この有望なバイオ医薬品としての良好な製剤が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
本発明の実施形態は、配列番号１（３９ｍｅｒ）、配列番号２（３４ｍｅｒ）、配列番号３（２９ｍｅｒ）、配列番号５（２４ｍｅｒ）、配列番号６（２０ｍｅｒ）、配列番号８（ｍｏ２９ｍｅｒ）、及び配列番号９（ｍｏ２０ｍｅｒ）を含む、ＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）の製剤に関し、ここで、ｍｏ２９ｍｅｒ及びｍｏ２０ｍｅｒは、それぞれヒト２９ｍｅｒ及び２０ｍｅｒに対応するマウスＰＤＳＰである。
【0005】
本発明の一態様は、配列番号１、２、３、５、６、８、又は９のうちの１つの配列を有するＰＤＳＰと、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度のヒスチジンと、抗酸化剤と、任意選択で非イオン性等張剤とを含む水性製剤に関する。抗酸化剤は、アスコルビン酸又はニコチンアミドである。非イオン性等張化剤は、ソルビトール、デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム、エチレングリコール又はプロピレングリコールである。
【0006】
本発明のいくつかの実施形態によれば、水性製剤のｐＨ値は、約５～９、好ましくは約６．５～７．５であり得る。非イオン性等張剤はソルビトールであり、これは０ｍＭ～５００ｍＭの濃度である。抗酸化剤はニコチンアミドであり、これは５０ｍＭ～１０００ｍＭの濃度である。ＰＤＳＰの濃度は０．０１％～１％ｗ／ｖであり得る。
【0007】
本発明の他の態様は、以下の説明及び添付の図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ＰＤＳＰ溶液の様々な製剤の安定性を評価するための試験プロトコルを示す概略図である。実験設計に従って様々なＰＤＳＰ溶液を調製した。ＰＤＳＰ溶液のｐＨ値を１Ｎ ＨＣｌ又は２Ｎ ＮａＯＨで調整し、０．２μｍシリンジフィルターを通して濾過し、５０ｍｌガラス瓶に入れた。濾過したＰＤＳＰ溶液を室温で１１５０ＲＰＭで撹拌した。４００μｌのＰＤＳＰ溶液のアリコートを異なる時点で（７時間又は９時間たつまで３０分ごとに）採取し、１３０００ｒｐｍで遠心分離して、沈殿が現れるかどうかを観察した。ＰＤＳＰ溶液の撹拌を継続し、１０、１２、１８及び２４時間の時点で沈殿を調べた。懸濁物、沈殿及び濁りの出現時間を記録した。
【0009】
【0010】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の実施形態は、安定性が向上したＰＥＤＦ由来の短いペプチド（ＰＤＳＰ）の製剤に関する。様々なヒトＰＤＳＰは、筋肉再生若しくは動脈形成、脱毛症及び／若しくは脱毛、変形性関節症、皮膚老化、肝硬変、又は眼の疾患若しくは状態を含む様々な疾患又は障害を治療又は予防するための有望な治療薬であることが見出された。そのようなＰＤＳＰの例として、表１に示すものを挙げることができる。
【表1】
【0013】
本発明の実施形態によれば、ＰＤＳＰは、配列番号１、２、３、５、６、８、又は９であり得る。さらに、これらのペプチドのＮ末端は、任意選択でアシル化（例えば、アセチル又はプロピオニル保護）で保護されていてもよく、Ｃ末端は、任意選択でアミドとして保護されていてもよい。
【0014】
これらのＰＤＳＰはクエン酸緩衝液（buffer）中で調製され、様々な前臨床研究において治療目的に有効であることが分かっている。しかしながら、これらの短いペプチドの調製物（例えば、０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中のＰＤＳＰ（配列番号３））は、（数ヶ月にわたる）長期安定性を欠くことが見出された。
【0015】
化学的ストレス（例えば、酸化、加水分解など）及び物理的ストレス（例えば、温度、光、及び撹拌）を含む多くの要因が、特に長期保存におけるバイオ医薬品の品質及び安定性に影響を及ぼす可能性がある。異なる製剤のＰＤＳＰの安定性を調査するために、加速安定性試験を実施した。具体的には、最適な製剤を同定するために、ストレス条件下、特に剪断応力下で様々な製剤を試験した。広範な試験後、特定の製剤が、予想外にも、元のクエン酸緩衝製剤よりも優れた長期安定性を有することが見出された。
【0016】
以下では、本発明の実施形態を説明するための具体例について説明する。しかしながら、当業者は、これらの特定の例が例示のためのものに過ぎず、本発明の範囲から逸脱することなく他の変更及び変形が可能であることを理解するであろう。例えば、以下の例では説明のためにＰＤＳＰ（配列番号３）を使用しているが、代わりに他のＰＤＳＰを使用してもよい。
１．クエン酸緩衝液（０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭ作業クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）
１．クエン酸緩衝液（０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭ作業クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）
【0017】
クエン酸緩衝液をクエン酸及びクエン酸三ナトリウムから調製して、所望の緩衝能及びｐＨを達成した。例えば、クエン酸一水和物（ＭＷ２１０．１４ｋＤａ）（メルク）及びクエン酸三ナトリウム二水和物（ＭＷ２９４．１２ｋＤａ）（ＢｉｏＳｈｏｐ）を用いて、溶液Ａ及び溶液Ｂをそれぞれ調製した。次いで、これらの２つの溶液を使用して、所望の濃度及びｐＨ値を有するクエン酸緩衝液を作製する。溶液Ａ及び溶液Ｂの式は以下の通りである。
【0018】
溶液Ａ（０．１Ｍクエン酸一水和物）（１０ｍｌ）：２１０．１４ｋＤａ×１０／１０００×０．１＝０．２１ｇクエン酸一水和物。クエン酸一水和物０．２１ｇを秤量し、１０ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解して、１０ｍｌの溶液Ａストックを生成する。
【0019】
溶液Ｂ（０．１Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物）（１０ｍｌ）：２９４．１２ｋＤａ×１０／１０００×０．１＝０．２９４ｇクエン酸三ナトリウム二水和物。クエン酸一水和物０．２９４ｇを秤量し、１０ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解して、１０ｍｌの溶液Ｂストックを生成する。
【0020】
ｐＨ６．０の１０倍クエン酸緩衝液ストックを調製するために、１．１５ｍｌの溶液Ａ及び８．８５ｍｌの溶液Ｂを混合して、０．１Ｍクエン酸緩衝液１０ｍＬを得た。次いで、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液ストックを９０ｍｌのｄｄＨ２Ｏで希釈して、１０ｍＭの作業クエン酸緩衝液１００ｍｌ（１倍溶液）を生成した。
【0021】
０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液を調製するために、０．８５ｇのＮａＣｌを１００ｍｌの１０ｍＭ作業クエン酸緩衝液に添加した。使用前に、実験設計に基づいてｐＨを測定及び調整する必要がある。
２．ヒスチジン緩衝液（０～２６０ｍＭソルビトール及び／又は１５０～３５０ｍＭニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．０）
２．ヒスチジン緩衝液（０～２６０ｍＭソルビトール及び／又は１５０～３５０ｍＭニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．０）
【0022】
試験用に２０ｍＬの２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ７．０を調製するために、０．０６２ｇのヒスチジン並びに異なる重量のソルビトール及び／又はニコチンアミドを１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解した。異なるソルビトール及びニコチンアミドの濃度を有する様々な調製物の例は、表２に示す以下の組成物を用いて調製する。
【表2】
【0023】
緩衝液のｐＨ値を、２Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨ７．０に調整した。ｐＨ値調整のための２Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌの体積を記録し、次いでｄｄＨ２Ｏを添加して総体積を２０ｍｌにした。
３．異なる製剤のＰＤＳＰの調製
３．異なる製剤のＰＤＳＰの調製
【0024】
これらの実施例で使用されるＰＤＳＰは、ＮＨ２末端がアセチル化され、ＣＯＯＨ末端にアミドを有する短い合成ペプチド（２９ｍｅｒ）である。ＰＤＳＰの分子量は３２４３．６ｋＤａである。ＰＤＳＰを上記の各溶液に特定の濃度で溶解した。
【0025】
例えば、ヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液中又はクエン酸緩衝液中の２０ｍｌのＰＤＳＰ溶液を調製するために、ペプチド生成物６．７７２ｍｇをヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液又はクエン酸緩衝液２０ｍｌに添加した。
【0026】
ＰＤＳＰが溶液に完全に溶解した後、ＰＤＳＰ溶液のｐＨ値を測定し、次いで、実験設計に従ってｐＨ値を７．０又は６．０に調整した。使用前に、ＰＤＳＰ溶液をそれぞれ０．２μｍシリンジフィルターで濾過した。
４．異なる製剤のＰＤＳＰの安定性評価
４．異なる製剤のＰＤＳＰの安定性評価
【0027】
本発明者らは、クエン酸緩衝液中のＰＤＳＰの以前の製剤が（数ヶ月にわたる）長期保存において安定ではないことに気付いた。安定性に対する異なる製剤の効果を試験するために、様々なＰＤＳＰ製剤を、変化を早めるべく、ストレス条件（例えば、せん断応力）に供した。
【0028】
これらの試験のために、異なる緩衝液及び賦形剤（表３に示す）中で調製した２０ミリリットルのＰＤＳＰをそれぞれ濾過後に５０ｍＬビーカーに入れた。次いで、溶液を室温にて１１５０ＲＰＭで撹拌した。４００μｌのＰＤＳＰ溶液のアリコートをそれぞれ１．５ｍｌエッペンドルフチューブに３０分ごとに最大７時間又は９時間採取した。採取した試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿が生じたかどうかを評価した。継続的に観察した後、ＰＤＳＰ溶液の撹拌を２４時間たつまで続けた。溶液の外観及び沈殿の有無を、１０時間、１２時間、１８時間及び２４時間の撹拌の後に調べた。懸濁物、沈殿及び濁りの出現時間を記録した。実験手順を図１に示す。
結果
１．０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製したＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の剪断力に抵抗する能力
【表3】
１．０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製したＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の剪断力に抵抗する能力
【0029】
ＰＤＳＰ調製用の元の製剤は、０．８５％ｗ／ｖのＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）である。この製剤は、様々な前臨床研究に適していた。しかし、この製剤は、長期保存（何ヶ月）にわたって濁りを発現した。したがって、その安定性を、剪断力に抵抗するその能力を解明するための強制凝集法を使用して調べた。図２に示すように、溶液は、撹拌前は澄んで透明であった（図２、上部パネル）。この製剤では、撹拌開始後、約１時間で懸濁物が見られた（図２、左パネル及び表４）。撹拌開始から１．５時間後に沈殿が、２．５時間後に濁った溶液がそれぞれ観察された。これらの観察結果は、他の製剤と比較するためのベースラインとして使用する。
２．ニコチンアミドを含むヒスチジン緩衝液で調製されたＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の剪断力に抵抗する能力
【表4】
【0030】
ヒスチジン系緩衝液中のＰＤＳＰの安定性に対する、抗酸化剤であるニコチンアミドの効果を調べるために、１５０ｍＭ、３００ｍＭ又は３５０ｍＭのニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ７．０）で調製されたＰＤＳＰを比較として選択した。図２及び表４に示すように、それぞれ１５０ｍＭ、３００ｍＭ及び３５０ｍＭのニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液で調製されたＰＤＳＰについて、撹拌開始後、５時間、４．５時間及び１４時間で懸濁物が観察された（表４）。ヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液を含む製剤中の懸濁物は、クエン酸緩衝液中の製剤と比較して有意に遅れて発現した。
【0031】
実験では、０．８５％ＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液で調製されたＰＤＳＰ中の懸濁物が粗いことがわかり、解剖顕微鏡下で小さな粒子又は繊維を観察することができた。しかしながら、ヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤中の懸濁物は非常に微細であり、解剖顕微鏡下で目に見える粒子はなく、溶液の透明性を低下させただけであった。
【0032】
懸濁物の存在により、併せて沈殿が起こり得るかどうかを評価するために、各ＰＤＳＰ溶液４００μｌのアリコートを遠心分離用の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに採取した（１３０００ｒｐｍ、５分間）。図２（中央パネル）及び表４に示すように、それぞれ１５０ｍＭ、３００ｍＭ及び３５０ｍＭニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液中で調製したＰＤＳＰについて、撹拌開始後、５．５時間、４．５時間及び１４．５時間で目に見える沈殿が観察された。
【0033】
懸濁物又は沈殿が観察された後、ＰＤＳＰ溶液が濁るまでその撹拌を続けた。図２（下のパネル）及び表４は、１５０ｍＭ、３００ｍＭ及び３５０ｍＭのニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤が、それぞれ撹拌開始後、１３．５時間、７～２４時間及び１６．５時間で濁ったことを示す。
【0034】
クエン酸緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤と比較して、ヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤は剪断応力により良好に耐えることができる。さらに、これらのヒスチジン／ニコチンアミド製剤の中で、３５０ｍＭニコチンアミドを含む溶液は、１５０ｍＭ及び３００ｍＭニコチンアミドを含む溶液よりも沈殿が現れるのに長い時間を示し、より高い濃度のニコチンアミドがヒスチジン系緩衝液で調製された製剤中のＰＤＳＰの安定性を増加させることができることを示唆した。
３．異なる濃度のソルビトールを含むヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の剪断力に抵抗する能力
３．異なる濃度のソルビトールを含むヒスチジン／ニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の剪断力に抵抗する能力
【0035】
ニコチンアミドを眼に投与すると眼刺激を引き起こす可能性があることが報告されている（Ｋｅｒｉ，Ｇ．２００５．Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｆｏｒ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、米国環境保護庁、ワシントンＤ．Ｃ．２０４６０．１－１２）。したがって、ソルビトールを使用して、ヒスチジン系緩衝液中のニコチンアミドの全部又は一部を置換した。表４に示すように、２０ｍＭヒスチジン／２６０ｍＭソルビトールのみの製剤中では、わずか３時間撹拌した後に懸濁物が観察された。そして、この懸濁物は、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ及び１８０ｍＭソルビトールを含む２０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＤＳＰ中での撹拌開始後、それぞれ３時間、４．５時間、４時間、１３時間、１３．５時間、６、５時間及び４．５時間で見出された（図３、図４及び表４）。
【0036】
これらのヒスチジン／ニコチンアミド製剤の中でも、懸濁物、沈殿及び濁りは、１４０ｍＭ及び１５０ｍＭのソルビトールを含む２０ｍＭのヒスチジン／１５０ｍＭのニコチンアミドで調製されたＰＤＳＰ中で１３時間連続撹拌した後に観察され、約１４０ｍＭ～１５０ｍＭの範囲がヒスチジン／ニコチンアミド製剤中のソルビトールの最適濃度であり得ることを示唆している。（図３、図４及び表４）。さらに、２０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭニコチンアミド／１４０又は１５０ｍＭソルビトール緩衝液で調製したＰＤＳＰ、及び２０ｍＭヒスチジン／３５０ｍＭニコチンアミドのみの緩衝液で調製したＰＤＳＰの安定性は同等であり、ソルビトールを使用してニコチンアミドの一部を置き換えることができることを示唆した。
【0037】
これらの結果は、上記のデータと共に、ヒスチジン／ニコチンアミドを含有する製剤がクエン酸塩／ＮａＣｌ製剤よりもＰＤＳＰの安定性に優れていることを示唆している。沈殿は、０．８５％ＮａＣｌを含む１０ｍＭクエン酸塩で調製したＰＤＳＰについては撹拌開始１時間後に現れたが、１５０ｍＭ～３５０ｍＭニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジンで調製したＰＤＳＰについては５時間撹拌後に沈殿が観察された。ヒスチジン／ニコチンアミド製剤の沈殿を生じる持続時間が５倍長いことは、クエン酸塩／ＮａＣｌ製剤と比較して、ヒスチジン／ニコチンアミド製剤においてＰＤＳＰが劇的により安定であることを示している。さらに、ニコチンアミドの濃度が異なる製剤間では、連続撹拌後１４．５時間たつまで沈殿は観察されず、より高い濃度のニコチンアミドが賦形剤であるＰＤＳＰの安定性を維持するのにより適していることを示した。
【0038】
クエン酸緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤と比較して、ヒスチジン／ソルビトールのみの緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤は、ＰＤＳＰの安定性を維持するより良好な能力を示す。しかしながら、ヒスチジン／ニコチンアミドのみの製剤と比較した場合、ヒスチジン／ソルビトールのみの製剤でのＰＤＳＰの安定性を維持する能力は、依然として十分に良好ではなく、ニコチンアミドがヒスチジン系緩衝液中のＰＤＳＰの安定性の維持のための重要な成分であり得ることを示している。
【0039】
ソルビトールなどの等張化剤を使用してニコチンアミドの一部を置換した場合、沈殿出現の時間は、２０ｍＭヒスチジン／３５０ｍＭニコチンアミドで調製したＰＤＳＰ（１４．５時間）及び２０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭニコチンアミド／１４０ｍＭ又は１５０ｍＭソルビトールで調製したＰＤＳＰ（それぞれ１３時間及び１４時間）で同様であった。これらのデータは、約１４０～１５０ｍＭの濃度が、２０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭニコチンアミド緩衝液で調製されたＰＤＳＰ製剤のソルビトール濃度のより良い選択であることをさらに裏付けている。
【0040】
全体として、本発明者らが試験した製剤から、ヒスチジン／ニコチンアミドが、クエン酸緩衝液よりもＰＤＳＰ（例えば、ＰＤＳＰ；配列番号３）を含有する製剤のためのはるかに良好なベース緩衝液であることが示された。本発明の実施形態によれば、ＰＤＳＰは、任意の適切な濃度（例えば０．０１％～５％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１％～１％ｗ／ｖ）であってもよく、ヒスチジン緩衝液は、任意の適切な濃度、例えば、１ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ～６０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～４０ｍＭ、最も好ましくは１５ｍＭ～３０ｍＭで使用されてもよい。製剤のｐＨ値は、５から９の範囲であってもよく、好ましくはｐＨ値は約中性、例えば６．５から７．５、最も好ましくは約７．０である。製剤は、適切な濃度、例えば５０ｍＭ～１０００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ～７００ｍＭ、より好ましくは２００ｍＭ～５００ｍＭ、最も好ましくは３００ｍＭ～４００ｍＭの抗酸化剤、好ましくはニコチンアミドを含む。例えば、ＰＤＳＰ溶液の好ましい製剤は、３５０ｍＭニコチンアミドを含む２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．０）を含み得る。製剤はまた、非イオン性等張剤、好ましくはソルビトールを適切な濃度、例えば、０ｍＭ～５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ～４００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ～３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ～２００ｍＭで含み得る。例えば、ＰＤＳＰ溶液の好ましい製剤は、１５０ｍＭニコチンアミド及び１５０ｍＭソルビトールを含む２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．０）を含み得る。
【0041】
本発明の製剤は、網膜変性、マイボーム腺疾患、ドライアイなどの様々な疾患及び状態を治療するために使用され得る。眼への投与のために、製剤は点眼薬であり得る。
【0042】
本発明の実施形態は、限られた数の例を用いて例示されている。当業者は、これらの実施例が例示のみのためであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の変更及び変形が可能であることから、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】