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特表2022-550940リガンドのスクリーニング用のマイクロ放射性結合アッセイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-06
(54)【発明の名称】リガンドのスクリーニング用のマイクロ放射性結合アッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20221129BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20221129BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221129BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/543 541B
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520054
(86)(22)【出願日】2020-09-30
(85)【翻訳文提出日】2022-05-19
(86)【国際出願番号】 IB2020059171
(87)【国際公開番号】W WO2021064610
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,101
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/970,977
(32)【優先日】2020-02-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506027491
【氏名又は名称】エーシー イミューン ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グラッソ ルイジーノ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ08
4B063QS32
4B063QX07
(57)【要約】
本開示は、マイクロ放射性結合アッセイにおいて特定のタンパク質標的へのリガンドの結合を測定することができる結合アッセイに関する。特に、本開示は、健康なヒトドナーの試料又は罹患したヒトドナーの試料から単離された組換えタンパク質又は組織由来タンパク質等の存在量の少ないタンパク質に有用なマイクロ放射性結合アッセイに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
前記アリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法。
【請求項2】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
前記アリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法。
【請求項3】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンド及び飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法。
【請求項4】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、前記試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
前記アリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項5】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
前記アリコートを、前記試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項6】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、前記試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンド及び複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させて、前記放射性標識試験リガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項7】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、前記ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、前記放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
前記アリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
結合していない放射性標識ツールリガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）前記コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）前記コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項8】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
前記アリコートを、前記ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、前記放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）前記コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）前記コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項9】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、マイクロアレイ上の前記富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物及び前記ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、前記放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の前記病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドを前記アリコートから除去することと、
各アリコート中の前記放射性標識複合体における前記放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）前記コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）前記コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルから前記コールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法。
【請求項10】
（ａ）前記アリコートをそれぞれ単一の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、又は、（ｂ）前記アリコートを複数の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、
を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
各試験化合物について計算された競合のパーセント又はＫｉに従って前記複数の試験化合物を順位付けすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記富化された生体試料のアリコートをブロッキング剤と接触させることを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
放射性標識ツールリガンド、コールドツールリガンド、及び／又はコールド試験化合物の前に、又はそれらと同時に、前記アリコートを前記ブロッキング剤と接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ブロッキング剤は、前記放射性標識ツールリガンド、前記コールドツールリガンド、又は前記コールド試験化合物も含む１種以上のアッセイバッファー中に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記アッセイバッファーは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ブロッキング剤は、ＢＳＡ、カゼイン、又は鶏卵白由来のアルブミンである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記病理学的タンパク質は、Ａβ、タウ、α－シヌクレイン、及びＴＤＰ－４３から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記富化された生体試料の各アリコートは、約３．５ｍｇ／ｍＬ～約６．５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
各アリコートは、スポットである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記マイクロアレイは、少なくとも５個、又は少なくとも１０個、又は少なくとも１５個、又は少なくとも２０個、又は少なくとも２５個、又は少なくとも３０個、又は少なくとも４０個、又は少なくとも４５個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも５５個、又は少なくとも６０個、又は約６４個のチャンバーを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
各チャンバーは、前記富化された生体試料の少なくとも１つのアリコート、又は少なくとも６つのアリコート、又は少なくとも９つのアリコート、又は９つのアリコートを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記アリコートを複数の濃度と接触させることは、前記マイクロアレイにおける各チャンバーを様々な濃度と接触させることを含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記検出は、前記マイクロアレイをフィルムに露光した後に前記フィルム上の前記シグナルを検出することを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記フィルムは、ホスホスクリーンフィルムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記マイクロアレイは、スライドガラスである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記スライドガラスは、アミノプロピルシランでコーティングされたスライドガラスである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記富化された生体試料のアリコートを前記スライドガラス上に分注することによって前記マイクロアレイを作製することを含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項28】
放射性標識試験リガンド又はコールド試験リガンド若しくはコールド試験化合物と接触させる前に、前記マイクロアレイ上の前記複数のアリコートを乾燥させることを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
シグナルを検出する前に乾燥させることを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年１０月１日付で出願された米国仮出願第６２／９０９，１０１号及び２０２０年２月６日付で出願された米国仮出願第６２／９７０，９７７号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。
本願は、２０１９年１０月１日付で出願された米国仮出願第６２／９０９，１０１号及び２０２０年２月６日付で出願された米国仮出願第６２／９７０，９７７号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。
【0002】
本出願は、コーティングされた表面上に固定化されたタンパク質に対するリガンドの特性評価及びスクリーニング用のマイクロ放射性結合アッセイのための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
放射性結合アッセイは、リガンドと標的との間の相互作用を司る結合パラメーターを決定することを目的としている。このようなアッセイを、飽和結合実験、競合結合実験、及び動力学的結合実験を含む様々な実験パラダイムに使用して、リガンド－標的相互作用の別個のパラメーターを規定することができる。
【0004】
存在量の少ない生物学的標的用の高感度アッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
飽和アッセイは、Ｋｄと呼ばれる標的に対するリガンドの親和性を測定することを目的としている。Ｋｄは平衡状態での解離定数であり、所与の標的の結合部位の５０％を占めるのに必要なリガンドの濃度として定義される。Ｋｄを決定するのに、標的タンパク質を放射性標識試験リガンドとともにインキュベートする。ここで、そのタンパク質は一定の（固定）濃度である一方で、放射性標識試験リガンドの濃度を変動させる。平衡状態で、飽和が起こるまで、放射性標識試験リガンドの各濃度について、結合したリガンドの量を定量化する。得られたデータは、標的タンパク質に結合したリガンドのモル濃度での量として表現され得るため、リガンドのＫｄが計算され得る。放射性結合実験の２つ目の種類は、競合的放射性結合アッセイである。競合的な形式においては、放射性結合アッセイは、非放射性標識（コールド）試験リガンドが放射性標識試験リガンドを置換する能力を測定する。放射性標識試験リガンドをそのＫｄに近い固定濃度で使用し、非放射性標識試験リガンドを様々な濃度で使用することで、阻害（又は置換）定数（Ｋｉ）が決定され得る。この競合的な方式は、スクリーニングアッセイとして使用することもでき、その際、１つ又は複数の非放射性標識試験リガンド／試験化合物を単一の濃度又は複数の濃度で、１つの共通の放射性標識ツールリガンドを置換するそれらの能力について試験する。競合のパーセンテージ（試験リガンドが単一の濃度で使用される場合）又はＫｉ（試験リガンドが複数の濃度で使用される場合）の計算に続いて、試験リガンド／試験化合物を、放射性標識ツールリガンドを置換する強さに従って順位付けすることができる。順位付けを使用して、規定の標的タンパク質に対する強力なリガンドを特定し、こうして発見プログラムを駆動させることができる。
【0006】
放射性結合アッセイにおいては、放射性標識リガンドは放射性同位体で標識されており、これにより、標的に結合したその画分の定量化が可能となる。これは、光電子増倍管デバイスを含む検出器でリガンド固有の電離放射性を測定することによって得られる。平衡状態での標的に結合するリガンドの量を推定するには、標的－リガンド複合体（リガンドの結合した画分）を非結合リガンド（リガンドの遊離の画分）から分離する必要がある。古典的な放射性結合アッセイにおいては、通常、濾過によって物理的分離が行われ、ここで、一般にニトロセルロース又はガラス繊維からできたフィルターは結合したリガンド－標的複合体のみを保持する一方で、遊離のリガンドはフィルターを通過して除去される。次に、リガンドの結合した画分を定量化することができる。古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイは、濾過プロセスに必要とされる大容量において所要タンパク質濃度を達成するには大量の標的タンパク質を必要とする。かなりのタンパク質量が必要とされることから、特に標的タンパク質が低いレベルで存在する可能性のあるヒト組織試料から、その標的タンパク質を単離する必要がある場合に、そのアッセイの使用は制限される。
【0007】
本明細書に記載されるマイクロ放射性リガンド結合アッセイは、脳又は他の患者の組織又は体液に由来するタンパク質等の存在量の少ないタンパク質へのリガンドの結合の特性評価を可能にする。これには、限定されるものではないが、神経変性疾患に関連するタンパク質が挙げられる。実際、これらのタンパク質はコンフォメーション変化を受け、それによりタンパク質沈着が引き起こされることが知られており、それらのタンパク質性沈着物の蓄積は、疾患の発現及び進行に直接関連付けられている。これらのタンパク質の例は、アミロイドベータ（Ａβ）及びタウ（それらの沈着物はアルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群、及びその他のタウオパチーの特徴である）、α－シヌクレイン（ａ－ｓｙｎ）（その沈着物はパーキンソン病（ＰＤ）及びレビー小体型認知症の特徴である）、及びＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）（その沈着物は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びＴＤＰ前頭側頭葉変性症（ＴＤＰ－ＦＴＬＤ）の特徴である）である（Serrano-Pozo et al., 2011、Spillantini et al., 1997、Neumann et al., 2006、及びNelson et al., 2019）。これらの病理学的タンパク質の沈着物は、組換えタンパク質から人工的にｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得るが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される沈着物（例えば、凝集体）は、患者組織から単離されたタンパク質とはコンフォメーションが異なることが広く認識されている。したがって、これらのタンパク質沈着物（例えば、凝集体）を治療剤又は診断剤で標的化することを目的とする発見プログラムは、より高い探索値を有する前臨床データを確実に生成するために、理想的には、脳由来タンパク質試料が薬理学的アッセイの標的として使用されることとなる。
【0008】
従来のフィルターベースの放射性結合アッセイにおいて必要とされる生物学的標的の量を最小限に抑えることの必要性から、細胞系統から単離されたプロテインＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）へのリガンドの結合を調査するマイクロアレイ技術の開発につながった（Posner et al., 2007）。しかしながら、存在量の少ない病理学的タンパク質、例えばヒト脳試料に由来するタンパク質に適合された正確で高感度のアッセイ法が依然として求められている。
【0009】
本出願は、存在量の少ないタンパク質標的用に特に設計されて、患者の脳試料に由来する病理学的タンパク質の沈着物に特に適したものとなる小型化された放射性結合アッセイを記載している。必要とされる患者由来組織の量を最小限に抑えつつ、ヒト由来の病理学的タンパク質の沈着物に対して化合物をスクリーニングする能力は、一般的に使用されるフィルターベースの放射性結合アッセイの主な制限に相当し、本明細書に記載されるマイクロ放射性結合アッセイの主な利点に相当する。マイクロ放射性結合アッセイは非常に少量のタンパク質標的の使用を可能にし、古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイよりも少ない最大５００分の１の量のタンパク質標的材料が使用される。このアッセイは、Ｋｄ及びＫｉ値の生成だけでなく、リガンドライブラリーのスクリーニング用のハイスループットアッセイにも使用され得る。このアッセイは、古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイと直接比較することにより好結果に検証された。
【0010】
本明細書に記載される方法は、コーティングされた表面上に病理学的タンパク質の局在化した微量試料を有するマイクロアレイを使用する。幾つかの態様においては、病理学的タンパク質標的の生化学的に富化された試料を、コーティングされた表面（例えば、コーティングされたガラス表面）上にスポッティングして、明確に画定された位置にスポットを有する病理学的タンパク質アレイを形成する。幾つかの態様においては、脳由来タンパク質試料を富化工程に供して、タンパク質沈着物を濃縮し（アッセイからの適切なシグナルを確実にするために）、コーティングされた表面上に適切に分注又はスポッティングするのに適した粘度を有する富化試料を生成する。シグナルの検出は、蛍光イメージングによって、種々のインキュベーション工程の最後に、乾燥したコーティングされた表面を蛍光イメージングフィルム又はスクリーンに露光して得られる。表面をスクリーン又はフィルムに適切な時間にわたって露光した後に、スクリーンを蛍光イメージングスキャナーでスキャニングし、ＩｍａｇｅＪ－ｗｉｎ ６４ソフトウェア等の画像解析ソフトウェアを使用してシグナルを定量化する。
【0011】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
アリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
アリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0012】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0013】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの結合親和性（Ｋｄ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンド及び飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度の放射性標識試験リガンド及び飽和固定濃度のコールド試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｄを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0014】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0015】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
アリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させることと、
アリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0016】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンド及び複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度の放射性標識試験リガンド及び複数の濃度のコールド試験リガンドと接触させて、放射性標識試験リガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識試験リガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識試験リガンドからのシグナルを検出することと、
各アリコート中の検出されたシグナルからＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0017】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
アリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0018】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
アリコートを、ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物と接触させることと、
アリコートを、ツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【0019】
幾つかの態様においては、本開示は、富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価する方法であって、
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物及びツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
マイクロアレイ上の富化された生体試料の複数のアリコートを、単一の濃度又は複数の濃度のコールド試験化合物及びツールリガンドのＫｄに近い固定濃度の放射性標識ツールリガンドと接触させて、放射性標識ツールリガンドと各アリコート中の病理学的タンパク質との間で放射性標識複合体を形成することと、
結合していない放射性標識ツールリガンドをアリコートから除去することと、
各アリコート中の放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドからのシグナルを検出することと、
（ａ）コールド試験化合物を単一の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についての競合のパーセントを計算すること、又は（ｂ）コールド試験化合物を複数の濃度で接触させる場合に、各アリコート中の検出されたシグナルからコールド試験化合物についてのＫｉを計算することと、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】マイクロ放射性結合アッセイの構成を示す図である。固体表面（例えば、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）等の疎水性接着表面でコーティングされたスライドガラス）（Ａ）を、タンパク質標的をスポッティングする支持体として使用する。自動スポッティングデバイスを使用して表面にタンパク質をスポッティングした後に、それぞれ９個のスポットの６４個のパッドが得られる（Ｂ）。幾つかの実施形態においては、表面上に水密チャンバーを備えた表面（Ｃ）に、タンパク質標的を手動でスポッティングする（Ｄ）。
【図2】古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイ（Ａ）及びマイクロ放射性結合アッセイ（Ｂ）を用いた、ＡＤのヒト脳由来タウ沈着物に対するツールリガンドについての結合親和性（Ｋｄ）の決定の結果を示す図である。図２ＡのＹ軸は、カウント毎分（ｃｐｍ）で表される、標的に結合した特定の放射性標識リガンドの量の測定値を示している。図２ＢのＹ軸は、標的に結合した特定の放射性標識リガンドの量により得られるシグナルに比例する、フィルム上に存在するシグナルの強度の定量値を表している。ツールリガンド化合物は、フィルターベースのアッセイ（Ａ）により１１．８ｎＭのＫｄを示し、マイクロ放射結合アッセイ（Ｂ）により７．９ｎＭのＫｄを示した。両方のＫｄは、良好なフィッティングを有した（（Ａ）の場合はＲ２＝０．９７、そして（Ｂ）の場合はＲ２＝０．８５）。
【図3】マイクロ放射性結合アッセイを使用した、ＰＤのヒト脳由来ａ－ｓｙｎ及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のヒト脳由来ＴＤＰ－４３沈着物に対する試験化合物についての結合定数（Ｋｄ）の決定の結果を示す図である（化合物３、ａ－ｓｙｎ、Ａ；化合物２、ａ－ｓｙｎ、Ｂ；化合物３、ＴＤＰ－４３、Ｃ）。各図のＹ軸は、標的に結合した特定の放射性標識リガンドの量により得られるシグナルに比例する、フィルム上に存在するシグナルの強度の定量値を表している。化合物３は、ＰＤの脳由来ａ－ｓｙｎに対して１０．８ｎＭのＫｄを示し、良好なフィッティング（Ｒ２＝０．８７；Ａ）を有し、ＦＴＤの脳由来ＴＤＰ－４３に対して１３８ｎＭのＫｄを示し、良好なフィッティング（Ｒ２＝０．７９；Ｃ）を有した。化合物２は、ＰＤの脳由来ａ－ｓｙｎに対して７．８ｎＭのＫｄを示し、良好なフィッティング（Ｒ２＝０．８０；Ｂ）を有した。
【図4】マイクロ放射性結合アッセイを使用した、ＡＤのヒト脳由来タウ沈着物（Ａ）に対するトリチウム化されたツールリガンドのＫｉによって測定された置換能力、及びＰＤのヒト脳由来ａ－ｓｙｎ沈着物（Ｂ）に対する化合物３のＫｉによって測定された置換能力の決定の結果を示す図である。各図のＹ軸は、パーセンテージで表された標識化合物の置換を表しており、ここで、１００％は完全な置換に相当する。ツールリガンドは１ｎＭのＫｉを示し、良好なフィッティング（Ｒ２＝０．９７）を有した。化合物３は４１ｎＭのＫｉを示し、良好なフィッティング（Ｒ２＝０．８４）を有した。
【図5】ツールリガンドとして放射性標識化合物３を使用したマイクロ放射性結合アッセイにおける化合物４、化合物５、及び化合物６（それぞれ、Ａ、Ｂ、及びＣ）のスクリーニングの結果を示す図である。各図のＹ軸は、パーセンテージで表された標識化合物の置換を表しており、ここで、１００％は完全な置換に相当する。化合物４、化合物５、及び化合物６のＫｉは、１３ｎＭ、３７ｎＭ、及び１４７ｎＭで測定され、全ては良好なフィッティング（それぞれＲ２＝０．９７、０．８０、及び０．６４）を有した。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本開示の追加の態様及び利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかとなり、ここでは、本開示の例示的な態様が示され、説明される。理解されるように、本開示は、他の様々な態様が可能であり、その幾つかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な態様において変更が可能である。したがって、この詳細な説明は、本来例示的なものと見なされるべきであり、限定的なものと見なされるべきではない。
【0022】
本明細書に挙げられる全ての出版物、特許、及び特許出願は、各個別の出版物、特許、又は特許出願が引用することにより本明細書の一部をなすと具体的かつ個別に示されているのと同じ程度で、引用することにより本明細書の一部をなす。
【0023】
病理学的タンパク質は、ヒト組織又は体液における異常な蓄積に際して病理学的作用を生ずるタンパク質である。幾つかの実施形態においては、病理学的タンパク質は、そのような蓄積に際してフィラメント、濃縮体、又は他の凝集体等の沈着物を形成するタンパク質であり、これらの沈着物が機能不全及び疾患の進行を引き起こす。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されるアッセイにおいて使用される病理学的タンパク質は、当業者に知られる方法によって生成される。幾つかの実施形態においては、本明細書において使用される病理学的タンパク質は、ヒト生体試料に由来する。幾つかの実施形態においては、病理学的タンパク質はヒト生体試料中に存在し、これは、本明細書に記載されるアッセイにおいて使用されるより濃縮された生体試料をもたらす当業者に知られる方法によって富化される。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料は、約１ｍｇ／ｍＬ～約６．５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（病理学的タンパク質標的＋他の試料タンパク質）を含む。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（病理学的タンパク質標的＋他の試料タンパク質）を含む。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料は、約３．５ｍｇ／ｍＬ～約６．５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質（病理学的タンパク質標的＋他の試料タンパク質）を含む。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料はまた、脂質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は他の細胞成分を含む。
【0024】
幾つかの実施形態においては、ヒト生体試料は、ヒト体液（例えば、鼻分泌物、尿試料、血液試料、血漿試料、血清試料、間質液（ＩＳＦ）試料、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料）又はヒト組織試料（例えば、心臓、筋肉、脳等に由来する組織）である。他の実施形態においては、ヒト生体試料は、血液試料又は脳脊髄液試料である。幾つかの実施形態においては、ヒト生体試料は、大脳皮質試料又は海馬試料等の脳試料である。幾つかの実施形態においては、病理学的タンパク質は、神経変性疾患に関連している。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料は、神経変性疾患に罹患している患者又は神経変性疾患に罹患していた死亡した患者からのヒト生体試料に由来する。幾つかの実施形態においては、神経変性疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、又は外傷性脳損傷、辺縁系優位型加齢性ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）である。幾つかの実施形態においては、病理学的タンパク質は、タウ、Ａβ、α－シヌクレイン、インフラマソーム成分（限定されるものではないが、ＡＳＣを含む）、Ｃ９ｏｒｆ７２又はＴＤＰ－４３に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）である。好ましい実施形態においては、病理学的タンパク質は、タウ、Ａβ、α－シヌクレイン、又はＴＤＰ－４３である。
【0025】
幾つかの実施形態においては、マイクロアレイは、富化された生体試料のアリコートを、固体支持体上に繰り返し様式で分注することによって作製される。幾つかの実施形態においては、アリコートを固体支持体上に分注する。幾つかの実施形態においては、アリコートを固体支持体上にスポッティングする。したがって、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、富化された生体試料のアリコートをスライドガラス上に分注することによってマイクロアレイを作製することを更に含む。幾つかの実施形態においては、富化された生体試料のアリコートをマイクロアレイ上で実質的に乾燥させる。幾つかの実施形態においては、マイクロアレイは、少なくとも２５個、若しくは少なくとも５０個、若しくは少なくとも１００個、若しくは少なくとも２００個、若しくは少なくとも３００個、若しくは少なくとも４００個、若しくは少なくとも５００個のスポット、又は２５０個～６００個のスポット、若しくは５００個～６００個のスポットを含む。幾つかの実施形態においては、スポットは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個のスポット、又は４個～１０個のスポット、又は９個のスポットを含むパッドプロファイル（pad profiles）においてグループ化される。幾つかの実施形態においては、マイクロアレイの固体支持体は複数のチャンバーに分割され、ここで、各チャンバーは、チャンバー内のスポットの数として定義されるパッドプロファイルを含む。幾つかの実施形態においては、別個のチャンバーは、様々な流体又は試薬を個々の各チャンバーに加えることができるが、チャンバー間で混ざらないように構成される。幾つかの実施形態においては、マイクロアレイは、少なくとも２個、又は少なくとも５個、又は少なくとも１０個、又は少なくとも１５個、又は少なくとも２０個、又は少なくとも２５個、又は少なくとも３０個、又は少なくとも４０個、又は少なくとも４５個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも５５個、又は少なくとも６０個、又は約６４個のチャンバーを含む。幾つかの実施形態においては、様々な既知の濃度の試験リガンドが、マイクロアレイにおいて様々なアリコート、スポット、パッドプロファイル、又はチャンバーで使用される。幾つかの実施形態においては、アリコートを複数の濃度と接触させることは、マイクロアレイにおける各チャンバーを様々な濃度と接触させることを含む。各チャンバーが複数のアリコート又はスポットを含む場合に、それらのアリコート又はスポットは、そのチャンバーに関する試験条件（例えば、試験化合物又は試験濃度）についての反復実験として機能する。
【0026】
幾つかの実施形態においては、富化された生体試料からの病理学的タンパク質のアリコートの分注又はスポッティングは、自動スポッティングデバイス（例えば、Ｎａｎｏ－Ｐｌｏｔｔｅｒ）等のスポッティングデバイスを使用して、又は手動ピペット操作によって行われる。幾つかの実施形態においては、スポッティングは、Ｎａｎｏ－Ｐｌｏｔｔｅｒ ２．１（商標）（GESIM；ドイツ）を使用して行われる。本発明の幾つかの実施形態においては、アレイ化される病理学的タンパク質を含む富化された生体試料の容量は、少なくとも３００ピコリットル、若しくは少なくとも１ナノリットル、若しくは少なくとも１０ナノリットル、若しくは少なくとも３６ナノリットルであり、又は約２００ピコリットル～約３６ナノリットル、若しくは約２００ピコリットル～約１０ナノリットル、若しくは約２００ピコリットル～約１ナノリットルの範囲の容量である。
【0027】
マイクロアレイは、コーティングされた固体支持体を含み、固体支持体は、ガラス又はポリマー等のあらゆる適切な固体材料であり得る。幾つかの実施形態においては、固体支持体はスライドガラスである。幾つかの実施形態においては、マイクロアレイの固体支持体は、被着剤でコーティングされている。幾つかの実施形態においては、被着剤は、シラン、チオール、ジスルフィド、エポキシド、及び／又はポリマーである。幾つかの実施形態においては、被着剤はシランである。幾つかの実施形態においては、被着剤はアミノプロピルシランである。幾つかの実施形態においては、マイクロアレイの固体支持体は、アミノプロピルシランでコーティングされたスライドガラスである。
【0028】
リガンド、ツールリガンド、試験化合物、又は試験リガンドは、有機化合物、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、又は抗体によって捕捉されたタンパク質である。幾つかの実施形態においては、リガンド、ツールリガンド、試験化合物、又は試験リガンドは、化学的化合物又は小分子化合物等の有機化合物である。幾つかの実施形態においては、ツールリガンド及び試験リガンドは、両者とも小分子化合物である。幾つかの実施形態においては、ツールリガンド及び試験化合物は、両者とも小分子化合物である。
【0029】
標識リガンド、放射性標識リガンド、標識ツールリガンド、放射性標識ツールリガンド、標識試験リガンド、標識試験化合物、放射性標識試験化合物、又は放射性標識試験リガンドは、リガンド、ツールリガンド、試験化合物、又は試験リガンドの定量化を可能にする標識を含む有機化合物、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、又は抗体によって捕捉されたタンパク質である。幾つかの態様においては、標識は、病理学的タンパク質に結合したリガンド、ツールリガンド、試験化合物、又は試験リガンドの量の定量化を可能にする。標識の種類は特に限定されるものではなく、選択された検出方法によって異なる。検出可能な標識が本発明のリガンドに取り付けられる位置は特に限定されない。
【0030】
幾つかの実施形態においては、放射性標識試験リガンドは、試験リガンドが放射性標識されたものである。幾つかの実施形態においては、放射性標識ツールリガンドは、既知のリガンドが放射性標識されたものである。幾つかの実施形態においては、ツールリガンド又は放射性標識ツールリガンドは、対象となる病理学的タンパク質に対する既知のリガンドである。例示的な放射性標識ツールリガンドとしては、Ａβ（［１１Ｃ］ＰｉＢ（ピッツバーグ化合物Ｂ）、［１８Ｆ］フロルベタピル、［１８Ｆ］フロルベタベン、又は［１８Ｆ］フルテメタモール）、タウ（［１８Ｆ］Ｔ－８０７（ＡＶ１４５１としても知られる）、フロルタウシピル［１８Ｆ］ＭＫ－６２４０、［１８Ｆ］ＲＯ６９５８９４８、［１８Ｆ］ＰＩ－２６２０、［１８Ｆ］－ＧＴＰ－１、［１８Ｆ］ＪＮＪ－０６７、［１８Ｆ］ＰＭ－ＰＢＢ３、又は［１１Ｃ］ＰＢＢ３）、ＴＨＫ－５３５１、ＴＨＫ－５５６２、又はα－シヌクレイン（［３Ｈ］ＳＩＬ２６）が挙げられる。例示的なツールリガンドとしては、これらの例示的な放射性標識ツールリガンドの非標識のものが挙げられる。
【0031】
例示的な標識としては、放射性核種、陽電子放出体、又はガンマ線放出体等の同位体だけでなく、蛍光標識、発光標識、及び／又は発色性標識が挙げられる。本明細書において使用される放射性同位体標識は、放射性同位体の天然存在比と同一ではない存在比で存在する。さらに、使用される量は、選択された検出方法によるその検出を可能にするべきである。幾つかの実施形態においては、標識は放射性核種標識である。放射性核種としての適切な放射性同位体の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、及び７７Ｂｒが挙げられる。幾つかの実施形態においては、放射性核種標識は、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、又は１８Ｆである。幾つかの実施形態においては、放射性核種標識は、２Ｈ、３Ｈ、及び１８Ｆである。幾つかの実施形態においては、放射性核種標識は、３Ｈである。本明細書に記載される放射性標識化合物は一般に、当業者に知られる従来の手順によって、市販されている又は既知の合成技術によって調製される適切な試薬の適切な同位体の変形形態を使用して調製される。
【0032】
ツールリガンド、放射性標識ツールリガンド、試験リガンド、試験化合物、及び放射性標識試験リガンドはまた、１つ以上のブロッキング剤、診断的に許容可能な担体、希釈剤、添加剤、又はバッファーを含む組成物の形態において提供され得る。幾つかの実施形態においては、上記組成物はブロッキング剤を含む。幾つかの実施形態においては、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、又は鶏卵白由来のアルブミンである。幾つかの実施形態においては、ブロッキング剤はＢＳＡである。ブロッキング剤は、病理学的タンパク質における非特異的結合部位をブロッキングし、バックグラウンドシグナルを低減する。幾つかの実施形態においては、この方法は、アリコートの最初の接触の前に又はそれと同時に、富化された生体試料のアリコートをブロッキング剤で処理することを含む。幾つかの実施形態においては、アリコートをブロッキング剤で処理することは、アリコートをブロッキング剤を含むアッセイバッファーで処理することを含み、ここで、任意に、アッセイバッファーは、トリス－ＨＣｌ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【0033】
本明細書において使用される場合に、「飽和固定濃度」は、特定のタンパク質に対する特異的結合を飽和する濃度を意味する。
【0034】
本明細書において使用される場合に、マイクロアレイ上のアリコートを「複数の濃度」のリガンド又は化合物と接触させることは、異なるアリコート又はアリコートのセットを異なる濃度のリガンド又は化合物と接触させることを意味する。マイクロアレイ上のアリコートのセットが所与の濃度と接触される場合に、そのセットにおけるアリコートは、試験濃度についての反復実験として機能する。アリコート又はアリコートのセットは、マイクロアレイ上の、例えば個々のチャンバー内の他のアリコート又はアリコートのセットから隔離され得る。結合親和性を決定することを含む方法の場合に、幾つかの実施形態においては、試験濃度の適切な範囲は、飽和固定濃度と比べて低く少なくとも５０分の１である。
【0035】
試験リガンドの阻害定数を決定する方法においては、アリコートを、Ｋｄの約２倍以内を指す「試験リガンドについてのＫｄに近い固定濃度で」放射性標識試験リガンドと接触させる。
【0036】
幾つかの実施形態においては、非結合リガンド（例えば、試験リガンド、試験化合物、又は放射性標識リガンド）の除去は、マイクロアレイを洗浄して、タンパク質標的に結合していないリガンド（非結合リガンド）を除去することを含む。幾つかの実施形態においては、洗浄は、バッファーでの洗浄を含む。幾つかの実施形態においては、バッファーはＰＢＳである。
【0037】
幾つかの実施形態においては、検出は、放射性標識ツールリガンド又は放射性標識試験リガンドを含む複合体を含むマイクロアレイをフィルムに露光した後に、フィルム上のシグナルを検出することを含む。幾つかの実施形態においては、フィルムはホスホスクリーンフィルムである。幾つかの実施形態によるシグナルの定量化は、スキャニングによって、又はＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ Ｔｙｐｈｏｏｎ ＩＰ等のフォトイメージャーソフトウェアによって実現される。画像はＩｍａｇｅＪ－ｗｉｎ ６４ソフトウェア等の画像解析ソフトウェアを使用することによって定量化され得る。幾つかの実施形態においては、検出は、放射性標識試験リガンド又は放射性標識ツールリガンドを含むマイクロアレイをホスホスクリーンフィルム等のフィルムに露光し、それによりフィルム上にシグナルを生成し、フィルム上のシグナルを定量化することを含む。幾つかの実施形態においては、検出は、放射性標識ツールリガンド又は放射性標識試験リガンドを含む複合体を含むマイクロアレイを、新世代のガス検出器に基づくリアルタイムオートラジオグラフィーシステム（例えば、ＢｅａＱｕａｎｔ機器［ai4R］、ＢｅｔａＩＭＡＧＥＲ［Biospace Lab］）で露光することによって放射性シグナル（崩壊数）を測定することを含む。幾つかの実施形態によるシグナルの定量化は、デジタルイメージングによって行われる。幾つかの実施形態においては、画像は、画像解析ソフトウェア（Ｂｅａｍａｇｅ［ai4R］、Ｍ３ ｖｉｓｉｏｎ［Biospace Lab］）を使用することによって定量化され得る。幾つかの実施形態においては、画像を画像処理ツールにエクスポートすることができ、ＩｍａｇｅＪ－ｗｉｎ ６４ソフトウェア等の画像解析ソフトウェアを使用することによって定量化することができる。
【0038】
幾つかの実施形態においては、
病理学的タンパク質を、パッドプロファイルにおけるガラス支持体、例えば、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされたスライドガラス上にスポッティングすることと、
スポッティングされたタンパク質を、非標識（コールド）リガンドと接触させて、リガンドとタンパク質との間で複合体を形成することと、
複合体を標識リガンドと接触させて、標識リガンドとタンパク質との間で標識複合体を形成することと、
標識複合体をバッファー、例えばＰＢＳバッファーで洗浄することと、
ガラス支持体を、例えば室温又はアルゴン流下で乾燥させることと、
ガラス支持体をフィルム、例えばホスホスクリーンフィルムに露光することと、
タンパク質に結合した標識リガンドの露光後にフィルム上のシグナルを定量化することと、
を含む方法である。幾つかの実施形態においては、スポッティングされたタンパク質をブロッキング剤と接触させる。幾つかのそのような実施形態においては、ブロッキング剤は、コールドリガンドを含むアッセイバッファー及び／又は標識リガンドを含むアッセイバッファー中に存在する。
病理学的タンパク質を、パッドプロファイルにおけるガラス支持体、例えば、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされたスライドガラス上にスポッティングすることと、
スポッティングされたタンパク質を、非標識（コールド）リガンドと接触させて、リガンドとタンパク質との間で複合体を形成することと、
複合体を標識リガンドと接触させて、標識リガンドとタンパク質との間で標識複合体を形成することと、
標識複合体をバッファー、例えばＰＢＳバッファーで洗浄することと、
ガラス支持体を、例えば室温又はアルゴン流下で乾燥させることと、
ガラス支持体をフィルム、例えばホスホスクリーンフィルムに露光することと、
タンパク質に結合した標識リガンドの露光後にフィルム上のシグナルを定量化することと、
を含む方法である。幾つかの実施形態においては、スポッティングされたタンパク質をブロッキング剤と接触させる。幾つかのそのような実施形態においては、ブロッキング剤は、コールドリガンドを含むアッセイバッファー及び／又は標識リガンドを含むアッセイバッファー中に存在する。
【0039】
幾つかの実施形態においては、上記方法は、タンパク質に結合した標識リガンドの露光後にフィルム上のシグナルを定量化することと、例えば、定量化された値をグラフ上にプロットすることによって、例えば、画像ソフトウェア解析を使用することによりグラフ上に値をプロットすることによって、結合親和性（Ｋｄ）の値を決定することとを含む。
【0040】
幾つかの実施形態においては、パッドプロファイルにおいて組織化されたガラス支持体上、特にアミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされたスライドガラス上に病理学的タンパク質をスポッティングすることと、標識リガンドを含む組成物を、スポッティングされたタンパク質と接触させることと、標識リガンドをタンパク質と複合体形成させることと、非標識（コールド）リガンドを含む組成物を、タンパク質及び標識リガンドを含む複合体と接触させることと、ＰＢＳバッファー等のバッファーで洗浄することと、ＡＰＳでコーティングされたスライドガラス等のガラス支持体を、任意に室温又はアルゴン流下で乾燥させることと、ＡＰＳでコーティングされたスライドガラス等のガラス支持体をホスホスクリーンフィルム等のフィルムに露光することと、タンパク質に結合した標識リガンドの露光後にフィルム上のシグナルを定量化することと、阻害定数（Ｋｉ）を、好ましくは定量化されたシグナルをグラフ上にプロットすることによって、より好ましくは定量化された値を、画像ソフトウェア解析を使用することによりグラフ上にプロットすることによって決定することとを含む方法である。
【0041】
幾つかの実施形態においては、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされたスライドガラス等のパッドプロファイルにおいて組織化されたガラス支持体上に病理学的タンパク質をスポッティングすることと、標識リガンドを含む組成物をスポッティングされた病理学的タンパク質と接触させて、標識リガンドをタンパク質と複合体形成させることと、非標識リガンドを含む組成物を、タンパク質及び標識リガンドを含む複合体と接触させることと、ＰＢＳ等のバッファーで洗浄することと、ガラス支持体を、任意に室温又はアルゴン流下で乾燥させることと、ガラス支持体をホスホスクリーンフィルム等のフィルムに露光することと、タンパク質に結合した標識リガンドの露光後にフィルム上のシグナルを定量化することと、阻害能力（阻害定数、Ｋｉ）を、例えば定量化されたシグナルをグラフ上にプロットすることによって、又は定量化された値を、画像ソフトウェア解析を使用することによりグラフ上にプロットすることによって決定することとを含む方法である。幾つかの実施形態においては、乾燥の前に含まれる工程を、少なくとも６回、又は少なくとも８回、又は少なくとも１２回繰り返す。幾つかの実施形態においては、リガンドの量は、これらの工程が繰り返されるたびに増加／減少する。幾つかの実施形態においては、Ｋｉ値を使用して、化合物がタンパク質への標識リガンドの結合と競合する能力を有するかどうかを評価する。幾つかの実施形態においては、Ｋｉ値を使用して、試験された化合物をそれらのＫｉ値に従って順位付けする。
【0042】
また、標的に結合するそれらの能力について又は標的への標識リガンドの結合と競合するそれらの能力について試験リガンド／試験化合物をスクリーニング又は評価する際に使用されるキットも本明細書に開示される。そのようなキットは、例えば、バッファー、検出可能な色素、ラボ用機器、反応容器、使用説明書等のような本明細書に記載される方法を実施するための構成要素を含む。
【0043】
幾つかの実施形態においては、本開示は、病理学的タンパク質標的に対する試験リガンド／試験化合物の結合親和性（Ｋｄ）を決定するアッセイを提供する。他の実施形態においては、本開示は、病理学的タンパク質標的に対する試験リガンド／試験化合物についての阻害定数（Ｋｉ）を決定するアッセイを提供する。幾つかの態様においては、本開示は、試験リガンド／試験化合物又は一連の試験リガンド／試験化合物の評価、選択、及び／又はスクリーニング用のアッセイであって、アッセイ結果に従って、試験リガンド／試験化合物を選択する又は試験リガンド／試験化合物を順位付けする、アッセイを提供する。
【0044】
富化された生体試料中の病理学的タンパク質との放射性標識複合体における放射性標識ツールリガンドを置換する能力について試験化合物を評価又はスクリーニングする幾つかの方法において、該方法は、
（ａ）アリコートをそれぞれ単一の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、又は、
（ｂ）アリコートを複数の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、
を含む。幾つかの実施形態においては、上記方法は、各試験化合物についての計算された競合のパーセント又はＫｉに従って複数の試験化合物を順位付けすることを含む。幾つかの実施形態においては、複数のコールド試験化合物は、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２５種、少なくとも５０種、若しくは少なくとも１００種のコールド試験化合物、又は２種～１００種、若しくは５種～１００種、若しくは１０種～１００種、若しくは２５種～１００種、若しくは５０種～１００種のコールド試験化合物である。
（ａ）アリコートをそれぞれ単一の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、又は、
（ｂ）アリコートを複数の濃度の複数のコールド試験化合物と接触させること、
を含む。幾つかの実施形態においては、上記方法は、各試験化合物についての計算された競合のパーセント又はＫｉに従って複数の試験化合物を順位付けすることを含む。幾つかの実施形態においては、複数のコールド試験化合物は、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２５種、少なくとも５０種、若しくは少なくとも１００種のコールド試験化合物、又は２種～１００種、若しくは５種～１００種、若しくは１０種～１００種、若しくは２５種～１００種、若しくは５０種～１００種のコールド試験化合物である。
【0045】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、富化された生体試料の複数のアリコートがスポッティングされたコーティング表面を非放射性標識リガンドと接触させることは、コーティング表面を放射性標識リガンドと接触させる前に、それと同時に、又はその後に行われ得る。
【実施例】
【0046】
以下の実施例は、本開示の幾つかの実施形態を更に説明するために含まれており、本開示の範囲を限定するのに使用されるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が、実施される全ての又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して精度を保証するのに努力が払われているが、幾らかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は近大気圧である。
【0047】
本開示の態様が本明細書において示され、説明されているが、そのような態様が単なる例として示されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。ここで、当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変形、変化、及び置き換えに想到するであろう。本明細書に記載される開示の態様に対する様々な代替物が、本開示の実施において使用され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造物、並びにそれらの同等物は、それによって対象に含められることが意図される。
【0048】
実施例１：マイクロアレイ製造用のタンパク質の調製
ａ）ＡＤの脳由来の病理学的タウタンパク質
ＡＤの脳由来のタウの対になった螺旋状のフィラメント（ＰＨＦ）は、外部供給元（Tissue Solutions、英国）から入手した１人のアルツハイマー病（ＡＤ）患者の死後の脳から富化された。富化手順は、Jicha et al., 1997及びRostagno and Ghiso, 2009から改変され、当初はアルツハイマー病の脳から散在性の対になった螺旋状のフィラメント及びくびれのないフィラメントを抽出するのに開発された手順（Greenberg, S. G. et al., 1990、Goedert, et al., 1992）を適用するＰＤ症例の脳からの散在性のａ－ｓｙｎフィラメントの抽出を記載したSpillantini et al., 1998から抜粋された。手短に言えば、ガラス製のダウンス型ホモジナイザーにおいて、組織を１：４の比率の組織対均質化バッファー容量［プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Roche １１６９７４９８００１）を補充したＲＡＢバッファー（１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）中０．７５ＭのＮａＣｌ］の重量対容量比で均質化した。次に、均質化物を４℃で２０分間インキュベートして、全ての残留微小管を脱重合させた後に、ポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において予冷した７０．１ローター（Beckman、３４２１８４）を使用して１１０００ｇ（１２７００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを氷上で保持した。上清をポリカーボネート製のボトル中にプールし、７０．１ Ｔｉローターにおいて１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて４℃で１時間再度遠心分離して、ＰＨＦに富むペレットを分離したが、可溶性のタウは上清中に残留した。１回目及び２回目の遠心分離からのペレットを１２０ｍＬの抽出バッファー［１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％のスクロース、０．８５ＭのＮａＣｌ、１％のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem ５３９１３１）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のホスファターゼ阻害剤（Sigma Ｐ５７２６及びＰ００４４）］中に再懸濁した。次に、溶液をポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において７０．１ Ｔｉローターを使用して１５０００ｇ（１４８００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。１０％のスクロースの存在下で低速遠心分離では、ほとんどのＰＨＦが上清に残留したが、インタクトな又は断片化されたＮＦＴ及びより大きなＰＨＦ沈着物／凝集体はペレット化された。ペレットを廃棄した。２０％のサルコシル（Sigma Ｌ７４１４－１０ＭＬ）を上清に１％の最終濃度になるまで加え、室温で１時間撹拌した。次に、この溶液をポリカーボネート製のボトル中で１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて７０．１ Ｔｉローターにおいて４℃で１時間遠心分離し、ＰＨＦに富む材料を含むペレットをＰＢＳ中に１：０．１の組織対ＰＢＳの重量対容量比で再懸濁し、アリコートに分けて、－８０℃で貯蔵した。試料をウエスタンブロットによりタウについて分析した。
ａ）ＡＤの脳由来の病理学的タウタンパク質
ＡＤの脳由来のタウの対になった螺旋状のフィラメント（ＰＨＦ）は、外部供給元（Tissue Solutions、英国）から入手した１人のアルツハイマー病（ＡＤ）患者の死後の脳から富化された。富化手順は、Jicha et al., 1997及びRostagno and Ghiso, 2009から改変され、当初はアルツハイマー病の脳から散在性の対になった螺旋状のフィラメント及びくびれのないフィラメントを抽出するのに開発された手順（Greenberg, S. G. et al., 1990、Goedert, et al., 1992）を適用するＰＤ症例の脳からの散在性のａ－ｓｙｎフィラメントの抽出を記載したSpillantini et al., 1998から抜粋された。手短に言えば、ガラス製のダウンス型ホモジナイザーにおいて、組織を１：４の比率の組織対均質化バッファー容量［プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Roche １１６９７４９８００１）を補充したＲＡＢバッファー（１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）中０．７５ＭのＮａＣｌ］の重量対容量比で均質化した。次に、均質化物を４℃で２０分間インキュベートして、全ての残留微小管を脱重合させた後に、ポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において予冷した７０．１ローター（Beckman、３４２１８４）を使用して１１０００ｇ（１２７００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを氷上で保持した。上清をポリカーボネート製のボトル中にプールし、７０．１ Ｔｉローターにおいて１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて４℃で１時間再度遠心分離して、ＰＨＦに富むペレットを分離したが、可溶性のタウは上清中に残留した。１回目及び２回目の遠心分離からのペレットを１２０ｍＬの抽出バッファー［１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％のスクロース、０．８５ＭのＮａＣｌ、１％のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem ５３９１３１）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のホスファターゼ阻害剤（Sigma Ｐ５７２６及びＰ００４４）］中に再懸濁した。次に、溶液をポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において７０．１ Ｔｉローターを使用して１５０００ｇ（１４８００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。１０％のスクロースの存在下で低速遠心分離では、ほとんどのＰＨＦが上清に残留したが、インタクトな又は断片化されたＮＦＴ及びより大きなＰＨＦ沈着物／凝集体はペレット化された。ペレットを廃棄した。２０％のサルコシル（Sigma Ｌ７４１４－１０ＭＬ）を上清に１％の最終濃度になるまで加え、室温で１時間撹拌した。次に、この溶液をポリカーボネート製のボトル中で１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて７０．１ Ｔｉローターにおいて４℃で１時間遠心分離し、ＰＨＦに富む材料を含むペレットをＰＢＳ中に１：０．１の組織対ＰＢＳの重量対容量比で再懸濁し、アリコートに分けて、－８０℃で貯蔵した。試料をウエスタンブロットによりタウについて分析した。
【0049】
ｂ）ＰＤの脳由来のａ－ｓｙｎタンパク質
手順は、Spillantini et al., 1998に記載されるプロトコルから抜粋された。側頭皮質又は扁桃体脳領域のいずれかからの凍結組織ブロックを氷上で解凍し、メスを使用して白質を除去した。ガラス製のダウンス型ホモジナイザーを使用して、組織を、１：４の組織対均質化バッファー容量の重量対体積比で均質化した。均質化のために、０．７５ｍＭのＮａＣｌ及び１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Roche １１６９７４９８００１）を含有するＲＡＢバッファー（１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）を使用した。次に、均質化物を４℃で２０分間インキュベートして、全ての残留微小管を脱重合させた後に、ポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において予冷した７０．１ローター（Beckman、３４２１８４）を使用して１１０００ｇ（１２７００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットは氷上で保持したのに対して、上清をポリカーボネート製のボトル中にプールし、７０．１ Ｔｉローターにおいて１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて４℃で１時間再度遠心分離して、ａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体を可溶性ａ－ｓｙｎから分離した。１回目及び２回目の遠心分離からのペレットを抽出バッファー［１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％のスクロース、０．８５ｍＭのＮａＣｌ、１％のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem ５３９１３１）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のホスファターゼ阻害剤（Sigma Ｐ５７２６及びＰ００４４）］中に１：１０（重量対容量、重量／容量）比で再懸濁した。次に、溶液をポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、１５０００×ｇ（１４８００ＲＰＭ、７０．１ Ｔｉローター）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを破棄し、サルコシル（２０％のストック溶液、Sigma Ｌ７４１４）を上清に１％の最終濃度になるまで加え、室温で１時間撹拌した。次に、この溶液をポリカーボネート製のボトルに移し、１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ、７０．１ Ｔｉローター）にて４℃で１時間遠心分離した。富化されたａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体を含むペレットをＰＢＳ中で１：０．１の組織対ＰＢＳの重量対体積比において再懸濁し、アリコートに分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。この手順によって得られた最終的な画分を、ａ－ｓｙｎに対する抗体を用いて生化学的（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及びドットブロット）に分析して、ａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体の富化を確認した。
手順は、Spillantini et al., 1998に記載されるプロトコルから抜粋された。側頭皮質又は扁桃体脳領域のいずれかからの凍結組織ブロックを氷上で解凍し、メスを使用して白質を除去した。ガラス製のダウンス型ホモジナイザーを使用して、組織を、１：４の組織対均質化バッファー容量の重量対体積比で均質化した。均質化のために、０．７５ｍＭのＮａＣｌ及び１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Roche １１６９７４９８００１）を含有するＲＡＢバッファー（１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）を使用した。次に、均質化物を４℃で２０分間インキュベートして、全ての残留微小管を脱重合させた後に、ポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、超遠心分離機（Beckman、ＸＬ１００Ｋ）において予冷した７０．１ローター（Beckman、３４２１８４）を使用して１１０００ｇ（１２７００ＲＰＭ）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットは氷上で保持したのに対して、上清をポリカーボネート製のボトル中にプールし、７０．１ Ｔｉローターにおいて１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ）にて４℃で１時間再度遠心分離して、ａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体を可溶性ａ－ｓｙｎから分離した。１回目及び２回目の遠心分離からのペレットを抽出バッファー［１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％のスクロース、０．８５ｍＭのＮａＣｌ、１％のプロテアーゼ阻害剤（Calbiochem ５３９１３１）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のホスファターゼ阻害剤（Sigma Ｐ５７２６及びＰ００４４）］中に１：１０（重量対容量、重量／容量）比で再懸濁した。次に、溶液をポリカーボネート製の遠心分離ボトル（１６ｍｍ×７６ｍｍ；Beckman ３５５６０３）中に移し、１５０００×ｇ（１４８００ＲＰＭ、７０．１ Ｔｉローター）にて４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを破棄し、サルコシル（２０％のストック溶液、Sigma Ｌ７４１４）を上清に１％の最終濃度になるまで加え、室温で１時間撹拌した。次に、この溶液をポリカーボネート製のボトルに移し、１０００００ｇ（３８０００ＲＰＭ、７０．１ Ｔｉローター）にて４℃で１時間遠心分離した。富化されたａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体を含むペレットをＰＢＳ中で１：０．１の組織対ＰＢＳの重量対体積比において再懸濁し、アリコートに分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。この手順によって得られた最終的な画分を、ａ－ｓｙｎに対する抗体を用いて生化学的（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及びドットブロット）に分析して、ａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体の富化を確認した。
【0050】
ｃ）前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の脳由来のＴＤＰ－４３タンパク質
ＴＤＰ－４３の病状のヒトの脳からの脳組織（皮質）の切片をＰ２実験室においてメスで切除し、組織をペトリ皿上で秤量した。組織をピンセットで２ｍｌの均質化チューブ（ＣＫｍｉｘ）に移した。プロテアーゼ阻害剤を含む均質化バッファーを１：４（重量／容量）の比率で解剖した組織に加え、２０％の脳均質物を得た。懸濁液をｐｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、５０００ｒｐｍで３０秒を３回、各サイクルの間に１５秒一時停止というプログラムを使用して４℃で均質化した。均質化した組織を５ｍｌのエッペンドルフチューブ中にプールし、再懸濁した。均質化された脳の６００μｌのアリコートを調製し、ドライアイス上で凍結し、－８０℃で貯蔵した。１．５ｍＬのタンパク質低結合チューブ（Eppendorf）中で可溶化を行った。
ＴＤＰ－４３の病状のヒトの脳からの脳組織（皮質）の切片をＰ２実験室においてメスで切除し、組織をペトリ皿上で秤量した。組織をピンセットで２ｍｌの均質化チューブ（ＣＫｍｉｘ）に移した。プロテアーゼ阻害剤を含む均質化バッファーを１：４（重量／容量）の比率で解剖した組織に加え、２０％の脳均質物を得た。懸濁液をｐｒｅｃｅｌｌｙｓを用いて、５０００ｒｐｍで３０秒を３回、各サイクルの間に１５秒一時停止というプログラムを使用して４℃で均質化した。均質化した組織を５ｍｌのエッペンドルフチューブ中にプールし、再懸濁した。均質化された脳の６００μｌのアリコートを調製し、ドライアイス上で凍結し、－８０℃で貯蔵した。１．５ｍＬのタンパク質低結合チューブ（Eppendorf）中で可溶化を行った。
【0051】
脳均質物を氷上で解凍し、ＨＳバッファー中で再懸濁して、２％のサルコシル、１ユニット／μＬのベンゾナーゼ、及び１ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度にし、サーモミキサーにおいて６００ｒｐｍでの一定の振盪下で３７℃にて４５分間インキュベートした。上清を新しいチューブに収集した。ペレットを１０００μｌのミエリン浮遊バッファー中に再懸濁し、ベンチトップ型遠心分離機において２００００ｇで４℃にて６０分間遠心分離した。１０００μｌのチップで上清を注意深く除去して、浮遊脂質を全て除去した。脂質を単回の遠心分離工程で除去することができなければ、再懸濁、遠心分離、及び上清の除去を繰り返す。得られたペレットをＰＢＳで洗浄し、ベンチトップ型遠心分離機において４℃で３０分間遠心分離した。次に、ペレットを２００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した。富化された材料を全てプールし、－８０℃で凍結した。
【0052】
試料をウエスタンブロットによって分析した（リン酸化ＴＤＰ－４３、ＴＤＰ－４３、ヒストンＨ３、Ａβ）。
【0053】
実施例２：病理学的タンパク質用のマイクロアレイの作製
ａ）方法１－自動スポッティング
タンパク質試料をＰＢＳ又はアッセイバッファー（０．９％のＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ中の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で１：３（容量／容量）に希釈し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおいてＰ２００（Eppendorf）を用いてピペッティングすることにより均質化した。こうして、試料は、自動スポッティングデバイスである非接触圧電式プリンターのＮａｎｏ－Ｐｌｏｔｔｅｒ ２．１（GeSiM；ドイツ）を使用して、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされた６４パッドのマイクロアレイスライドガラス（Lucerna-Chem、番号６３４７５）上に自動スポッティングする準備が整った。自動スポッティングデバイスは、電気パルスで少量（ピコリットルからナノリットル）の液体を分注することができる汎用性のある非接触式アレイプリンターである。
ａ）方法１－自動スポッティング
タンパク質試料をＰＢＳ又はアッセイバッファー（０．９％のＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ中の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で１：３（容量／容量）に希釈し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにおいてＰ２００（Eppendorf）を用いてピペッティングすることにより均質化した。こうして、試料は、自動スポッティングデバイスである非接触圧電式プリンターのＮａｎｏ－Ｐｌｏｔｔｅｒ ２．１（GeSiM；ドイツ）を使用して、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされた６４パッドのマイクロアレイスライドガラス（Lucerna-Chem、番号６３４７５）上に自動スポッティングする準備が整った。自動スポッティングデバイスは、電気パルスで少量（ピコリットルからナノリットル）の液体を分注することができる汎用性のある非接触式アレイプリンターである。
【0054】
ＡＰＳスライドガラス（図１Ａ）を手動で自動トレイル（automatic trail）に配置し、適切に固定されていることを確認して、スライド間のスポッティングの高い再現性と、各スライドガラスがチャンバーを備えている場合の液滴の適切な位置調節とを保証した。圧電チップを使用して、ローディングプレート（loading plate）から適切な容量をピペットで移した。システムは、１スポット当たり１２×３ｎＬの液滴を分注することができるように最適化されており、１パッド当たり９スポットで、各スライドに合計６４パッドを有する（図１Ｂ）。試料のスポッティングは、６５％の相対湿度の湿度制御された雰囲気中で行われた。スポッティングの前に、分注された液滴の均質化品質を評価して、試料の容量及び密度が分注全体を通して一定であることを保証した。そのために、各液滴をそれがチップから分注されたときに測定し、液滴の分散を特定の電圧下で測定した。スライドにスポッティングしたら、Ｐｒｏｐｌａｔｅマルチウェルチャンバー６４ウェル（２５ｍｍ×７５ｍｍのガラス製の顕微鏡ガラス）でチャンバーを組み立て、スライドガラスの両側にステンレス鋼製の２つのＰｒｏＰｌａｔｅ（商標）クリップを使用して区画の水密性を確保した。この系は６４個の独立したウェルを有した。試料を加湿したチャンバー内で１５分間乾燥させた後に、使用するまで４℃で貯蔵した。
【0055】
ｂ）方法２－手動スポッティング
マイクロピペットｐ２（Eppendorf）を用いてチャンバーを備えたスライドガラス上に１μＬをピペットで移すことにより、タンパク質試料を手動でスポッティングした（図１Ｃ及び図１Ｄ）。各位置に１滴だけをピペットで移し、１滴はスライドガラス上のスポットに対応した。得られたスライドガラスを、古典的なラボ用フード内で室温にて少なくとも２時間乾燥させた。
マイクロピペットｐ２（Eppendorf）を用いてチャンバーを備えたスライドガラス上に１μＬをピペットで移すことにより、タンパク質試料を手動でスポッティングした（図１Ｃ及び図１Ｄ）。各位置に１滴だけをピペットで移し、１滴はスライドガラス上のスポットに対応した。得られたスライドガラスを、古典的なラボ用フード内で室温にて少なくとも２時間乾燥させた。
【0056】
実施例３：コールド試料の調製
コールド化合物（試験リガンド又は試験化合物）を、１００％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭ又は１０ｍＭのストック溶液として再懸濁した。２倍～３倍の希釈倍率で１２点の段階希釈系列を行うことによって、コールド化合物の希釈物を得た。希釈を１００％のＤＭＳＯ中で行い、結合アッセイ反応容量において１％～２．５％の一定濃度の最終ＤＭＳＯ濃度を確保した。使用されたコールド化合物の最大濃度は、標的に応じて２μＭ又は３μＭであり、その条件をシグナルの最大の置換を決定するのにも使用した。
コールド化合物（試験リガンド又は試験化合物）を、１００％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭ又は１０ｍＭのストック溶液として再懸濁した。２倍～３倍の希釈倍率で１２点の段階希釈系列を行うことによって、コールド化合物の希釈物を得た。希釈を１００％のＤＭＳＯ中で行い、結合アッセイ反応容量において１％～２．５％の一定濃度の最終ＤＭＳＯ濃度を確保した。使用されたコールド化合物の最大濃度は、標的に応じて２μＭ又は３μＭであり、その条件をシグナルの最大の置換を決定するのにも使用した。
【0057】
実施例４：標識試料の調製
標識化合物（放射性標識試験リガンド又は放射性標識ツールリガンド；１ｍＣｉ／ｍＬ）を合成し、１００％のエタノール中に溶解した。Ｋｄを決定する実験においては一連の濃度の適切な濃度に、又は置換の強さを評価するのに使用される実験においては一定の固定濃度で、標識化合物をアッセイバッファー中に希釈した。
標識化合物（放射性標識試験リガンド又は放射性標識ツールリガンド；１ｍＣｉ／ｍＬ）を合成し、１００％のエタノール中に溶解した。Ｋｄを決定する実験においては一連の濃度の適切な濃度に、又は置換の強さを評価するのに使用される実験においては一定の固定濃度で、標識化合物をアッセイバッファー中に希釈した。
【0058】
実施例５：マイクロ放射性結合アッセイによるタウ結合親和性（Ｋｄ）の決定
病理学的タウタンパク質試料がスポッティングされたチャンバーを取り付け、２μＭのコールド試験リガンドを含むアッセイバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ：７．５）、１３８ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ）で満たした。チャンバーを室温で１２０分間インキュベートした。封止フィルムを使用して蒸発を防いだ。様々な濃度でのアッセイバッファー中の等容量のトリチウム化された試験リガンドを各チャンバーに加え、よく混合し、室温でインキュベートした。最終反応容量は４０μＬであった。６０分間インキュベートした後に、放射性物質を含む反応溶液を適切な入れ物に収集した。チャンバーを氷冷洗浄バッファーで５回洗浄した。ＰｒｏＰｌａｔｅ（商標）チャンバーをスライドガラスから取り外し、スライドガラスを再蒸留Ｈ２Ｏで洗浄した。スライドガラスを、化学フードの下でアルゴン流下にて乾燥させた。ハイパーカセット（Amersham、ＲＰＮ １１６４３）内でfujifilmのＢＡＳ－ＩＰ ＴＲ ２０２５上にて、フィルムを少なくとも３日間露光させた。フィルムを、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ Ｔｙｐｈｏｏｎ ＩＰを用いて、５０μｍの解像度及び４０００の感度でスキャニングした。次に、ＩｍａｇｅＪ－ｗｉｎ ６４ソフトウェアを使用して、画像を解析し、定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用してグラフを作成した。ツールリガンドとタウ沈着物／凝集体とについて、良好なフィットで７．９ｎＭのＫｄが決定された（図２Ｂ）。
病理学的タウタンパク質試料がスポッティングされたチャンバーを取り付け、２μＭのコールド試験リガンドを含むアッセイバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ：７．５）、１３８ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ）で満たした。チャンバーを室温で１２０分間インキュベートした。封止フィルムを使用して蒸発を防いだ。様々な濃度でのアッセイバッファー中の等容量のトリチウム化された試験リガンドを各チャンバーに加え、よく混合し、室温でインキュベートした。最終反応容量は４０μＬであった。６０分間インキュベートした後に、放射性物質を含む反応溶液を適切な入れ物に収集した。チャンバーを氷冷洗浄バッファーで５回洗浄した。ＰｒｏＰｌａｔｅ（商標）チャンバーをスライドガラスから取り外し、スライドガラスを再蒸留Ｈ２Ｏで洗浄した。スライドガラスを、化学フードの下でアルゴン流下にて乾燥させた。ハイパーカセット（Amersham、ＲＰＮ １１６４３）内でfujifilmのＢＡＳ－ＩＰ ＴＲ ２０２５上にて、フィルムを少なくとも３日間露光させた。フィルムを、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ Ｔｙｐｈｏｏｎ ＩＰを用いて、５０μｍの解像度及び４０００の感度でスキャニングした。次に、ＩｍａｇｅＪ－ｗｉｎ ６４ソフトウェアを使用して、画像を解析し、定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用してグラフを作成した。ツールリガンドとタウ沈着物／凝集体とについて、良好なフィットで７．９ｎＭのＫｄが決定された（図２Ｂ）。
【0059】
実施例６：マイクロ放射性結合アッセイとフィルターベースの放射性結合アッセイとの比較
この古典的なフィルターベースのアッセイ及び上記のマイクロ放射性結合アッセイを使用したＫｄ決定の直接的な比較を行って、これらの方法間の違いを評価した。フィルターベースのアッセイを行うために、ＡＤの脳由来のタウを１／８０に希釈し、１ｎＭ～５０ｎＭの範囲の濃度のトリチウム化された試験リガンド（既知のタウ結合体）とともに２μＭの一定の（固定）濃度のコールド試験リガンドを含めて又は含めずに２５℃にて１２０分間インキュベートした。３５μＬの容量の各試料をＧＦ／Ｃフィルタープレート（PerkinElmer ６００５１７４）において真空下で濾過して、試験リガンドが結合されたＡＤの脳由来のタウを捕捉し、ＧＦ／Ｃフィルターを５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７－５）で３回洗浄した。次に、ＧＦ／Ｃフィルターを真空乾燥し、５０μＬのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｇｏｌｄ ＭＢ、PerkinElmer）を各ウェルに加え、フィルターをＭｉｃｒｏｂｅｔａ２デバイスにおいて分析した。非特異的シグナルは、過剰なコールド試験リガンド（２μＭ）を含む試料を用いて決定され、特異的結合は、総シグナルから非特異的シグナルを差し引くことによって計算された。全ての測定は、少なくとも２回の技術的反復実験で行った。Ｐｒｉｓｍ Ｖ７（GraphPad）を１サイト特異的結合で使用して非線形回帰によってＫｄ値を計算して、１１．８ｎＭのＫｄが得られた（図２Ａ）。同じ試験リガンドを使用して、独立したＡＤの脳由来のタウ沈着物／凝集体についての非常に類似した結合親和性値が２つの方法を使用して得られたことが分かった（１１．８ｎＭ（図２Ａ）対７．９ｎＭ（図２Ｂ、実施例５に記載される））。この結果は、マイクロ放射性結合アッセイ法が、古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイの頑健な代替手段であることを実証している。
この古典的なフィルターベースのアッセイ及び上記のマイクロ放射性結合アッセイを使用したＫｄ決定の直接的な比較を行って、これらの方法間の違いを評価した。フィルターベースのアッセイを行うために、ＡＤの脳由来のタウを１／８０に希釈し、１ｎＭ～５０ｎＭの範囲の濃度のトリチウム化された試験リガンド（既知のタウ結合体）とともに２μＭの一定の（固定）濃度のコールド試験リガンドを含めて又は含めずに２５℃にて１２０分間インキュベートした。３５μＬの容量の各試料をＧＦ／Ｃフィルタープレート（PerkinElmer ６００５１７４）において真空下で濾過して、試験リガンドが結合されたＡＤの脳由来のタウを捕捉し、ＧＦ／Ｃフィルターを５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７－５）で３回洗浄した。次に、ＧＦ／Ｃフィルターを真空乾燥し、５０μＬのシンチレーション液（Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｇｏｌｄ ＭＢ、PerkinElmer）を各ウェルに加え、フィルターをＭｉｃｒｏｂｅｔａ２デバイスにおいて分析した。非特異的シグナルは、過剰なコールド試験リガンド（２μＭ）を含む試料を用いて決定され、特異的結合は、総シグナルから非特異的シグナルを差し引くことによって計算された。全ての測定は、少なくとも２回の技術的反復実験で行った。Ｐｒｉｓｍ Ｖ７（GraphPad）を１サイト特異的結合で使用して非線形回帰によってＫｄ値を計算して、１１．８ｎＭのＫｄが得られた（図２Ａ）。同じ試験リガンドを使用して、独立したＡＤの脳由来のタウ沈着物／凝集体についての非常に類似した結合親和性値が２つの方法を使用して得られたことが分かった（１１．８ｎＭ（図２Ａ）対７．９ｎＭ（図２Ｂ、実施例５に記載される））。この結果は、マイクロ放射性結合アッセイ法が、古典的なフィルターベースの放射性結合アッセイの頑健な代替手段であることを実証している。
【0060】
実施例７：マイクロ放射性結合アッセイによるａ－ｓｙｎ及びＴＤＰ－４３に対するＫｄの決定
実施例５に記載される方法をまた使用して、試験リガンド（化合物２（ＰＣＴ出願の国際公開第２０１９／２３４２４３号を参照）及び化合物３）のタンパク質標的ａ－ｓｙｎ（化合物２及び化合物３について）及びＴＤＰ－４３（化合物３について）に対する結合定数（Ｋｄ）を決定した。ＦＴＤの脳から単離されたＴＤＰ－４３が富化された画分、又はＰＤの脳から単離されたａ－ｓｙｎが富化された画分を、漸増濃度（それぞれ１ｎＭ～３００ｎＭ又は１ｎＭ～３０ｎＭ）の放射性標識［３Ｈ］化合物３とともに２μＭの一定量のコールド化合物３を含めて又は含めずにインキュベートした。同様に、ＰＤの脳から単離されたａ－ｓｙｎが富化された画分を、漸増濃度（１ｎＭ～３０ｎＭ）の放射性標識［３Ｈ］化合物２とともに２μＭの一定量のコールド化合物２を含めて又は含めずにインキュベートした。一定の過剰濃度のコールド化合物２（２μＭ）又はコールド化合物３（２μＭ）を使用して、非特異的結合を決定した。化合物３についてはａ－ｓｙｎタンパク質及びＴＤＰ－４３タンパク質に対してそれぞれ１０．８ｎＭ（図３Ａ）及び１３８ｎＭ（図３Ｃ）のＫｄ値が決定され、化合物２についてはａ－ｓｙｎに対して７．８ｎＭのＫｄが決定された（図３Ｂ）。これらの結果は、生体組織中に少ない存在量で又は比較的少ない存在量で存在することが知られている幾つかの標的タンパク質に対して、記載されたマイクロ放射性結合アッセイによってＫｄ値を決定することができることを示している。例えば、病理学的ａ－ｓｙｎ及び病理学的ＴＤＰ－４３は、罹患したヒトの脳において病理学的タウよりも少ない存在量で存在すると考えられる。
実施例５に記載される方法をまた使用して、試験リガンド（化合物２（ＰＣＴ出願の国際公開第２０１９／２３４２４３号を参照）及び化合物３）のタンパク質標的ａ－ｓｙｎ（化合物２及び化合物３について）及びＴＤＰ－４３（化合物３について）に対する結合定数（Ｋｄ）を決定した。ＦＴＤの脳から単離されたＴＤＰ－４３が富化された画分、又はＰＤの脳から単離されたａ－ｓｙｎが富化された画分を、漸増濃度（それぞれ１ｎＭ～３００ｎＭ又は１ｎＭ～３０ｎＭ）の放射性標識［３Ｈ］化合物３とともに２μＭの一定量のコールド化合物３を含めて又は含めずにインキュベートした。同様に、ＰＤの脳から単離されたａ－ｓｙｎが富化された画分を、漸増濃度（１ｎＭ～３０ｎＭ）の放射性標識［３Ｈ］化合物２とともに２μＭの一定量のコールド化合物２を含めて又は含めずにインキュベートした。一定の過剰濃度のコールド化合物２（２μＭ）又はコールド化合物３（２μＭ）を使用して、非特異的結合を決定した。化合物３についてはａ－ｓｙｎタンパク質及びＴＤＰ－４３タンパク質に対してそれぞれ１０．８ｎＭ（図３Ａ）及び１３８ｎＭ（図３Ｃ）のＫｄ値が決定され、化合物２についてはａ－ｓｙｎに対して７．８ｎＭのＫｄが決定された（図３Ｂ）。これらの結果は、生体組織中に少ない存在量で又は比較的少ない存在量で存在することが知られている幾つかの標的タンパク質に対して、記載されたマイクロ放射性結合アッセイによってＫｄ値を決定することができることを示している。例えば、病理学的ａ－ｓｙｎ及び病理学的ＴＤＰ－４３は、罹患したヒトの脳において病理学的タウよりも少ない存在量で存在すると考えられる。
【0061】
実施例８：試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定するためのマイクロ放射性結合アッセイの使用
マイクロ放射性結合アッセイを使用して、ＡＤの脳由来のタウ沈着物／凝集体及びＰＤの脳由来のａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定した。実施例１（工程ａ及び工程ｂ）及び実施例２（工程ａ）に記載されるように、タンパク質を調製し、コーティングされたスライドガラス上にスポッティングした。
マイクロ放射性結合アッセイを使用して、ＡＤの脳由来のタウ沈着物／凝集体及びＰＤの脳由来のａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体に対する試験リガンドの阻害定数（Ｋｉ）を決定した。実施例１（工程ａ及び工程ｂ）及び実施例２（工程ａ）に記載されるように、タンパク質を調製し、コーティングされたスライドガラス上にスポッティングした。
【0062】
３ｎＭのトリチウム化された試験リガンド（既知のタウ結合体）を、スポッティングされたタウ堆積物／凝集体及び１０ｐＭ～３μＭの濃度のコールド試験リガンドとともにインキュベートした（図４Ａ）。最大シグナル（１００％の結合）はコールドツールリガンドの不存在下で得られたのに対して、最大の置換は３μＭのコールドツールリガンドの存在下で得られた。Ｋｉ値は、Ｐｒｉｓｍ Ｖ７（GraphPad）を使用して１サイト－Ｆｉｔ Ｋｉによって計算された。試験リガンドについてのＫｉ値は１ｎＭで測定され、Ｒ２＝０．９７の良好なフィッティングを有した。
【0063】
コールド化合物３を、５０ｐＭ～２μＭ（又は１０ｎＭ～３μＭ）の濃度範囲でスポッティングされたａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体とともに４０ｎＭの［３Ｈ］化合物３と一緒にインキュベートした。最大シグナル（１００％の結合）はコールド化合物３の不存在下で得られたのに対して、最大の置換は２μＭのコールド化合物３の存在下で得られた。化合物３についてのＫｉ値は４１ｎＭで測定され、良好なフィットを有した（図４Ｂ）。
【0064】
これらの結果は、生体組織中に少ない存在量で又は比較的少ない存在量で存在することが知られている幾つかのタンパク質標的において、記載されたマイクロ放射性結合アッセイによって化合物の自己置換能力（計算されたＫｉによって決定される）を決定することができることを示している。
【0065】
実施例９：ライブラリー化合物の活性を順位付けするマイクロ放射性結合アッセイ
試験化合物を、ＰＤ患者の脳由来のａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体への［３Ｈ］化合物３（放射性標識ツールリガンド）の結合と競合するそれらの強さについてスクリーニングした。試験化合物の置換をスクリーニング形式で評価して、放射性標識ツールリガンドを置換するそれらの能力に基づいて試験化合物を順位付け（計算されたＫｉ値に基づく順位付け）することができる。タンパク質試料の調製及びスポッティングは、上記の実施例１の（ｂ）及び実施例２の（ａ）に記載されるように実施した。
試験化合物を、ＰＤ患者の脳由来のａ－ｓｙｎ沈着物／凝集体への［３Ｈ］化合物３（放射性標識ツールリガンド）の結合と競合するそれらの強さについてスクリーニングした。試験化合物の置換をスクリーニング形式で評価して、放射性標識ツールリガンドを置換するそれらの能力に基づいて試験化合物を順位付け（計算されたＫｉ値に基づく順位付け）することができる。タンパク質試料の調製及びスポッティングは、上記の実施例１の（ｂ）及び実施例２の（ａ）に記載されるように実施した。
【0066】
試験化合物を２回の独立した実験において２連で試験したところ、図５Ａ～図５Ｃに示される平均値±ＳＥＭを有した。放射性標識ツールリガンドとして４０ｎＭの［３Ｈ］化合物３を使用して、試験化合物を５０ｐＭ～２μＭの範囲の濃度でスクリーニングした。代表的な競合曲線は以下の化合物について示されている：化合物４（図５Ａ、Ｋｉ １３ｎＭ、強い結合体）、化合物５（図５Ｂ、Ｋｉ ３７ｎＭ、中程度の結合体）、及び化合物６（図５Ｃ、Ｋｉ １４７ｎＭ、弱い結合体）。まとめると、これらの結果は、記載されたマイクロ放射性結合アッセイを使用して、スクリーニング形式において試験化合物の置換能力（Ｋｉ）を測定することができ、これにより、計算されたＫｉ値に従って、例えば最弱の結合体から最強の結合体までの、スクリーニングされた試験化合物の順位付けが可能となる。より低いＫｉ値を示す試験化合物ほどより強い結合体と見なされ、試験されたタンパク質標的に対する潜在的なヒット化合物を表すこととなる。さらに、放射性標識ツールリガンドを置換する試験化合物の能力は、試験化合物が、放射性標識ツールリガンドのタンパク質結合部位と重複する部位でタンパク質標的に結合することを示している。
【0067】
本開示の態様を本明細書において示し、説明してきたが、そのような態様が単なる例として示されているにすぎないことは当業者には明らかであろう。ここで、当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変形、変化、及び置き換えに想到するであろう。本明細書に記載される開示の態様に対する様々な代替が、本開示の実施において使用され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造物、並びにそれらの同等物は、それによって対象に含められることが意図される。
【0068】
参考文献
Greenberg, S.G. and P. Davies, "A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87(15), 5827-31.
Goedert, M. et al., "Cloning of a big tau microtubule-associated protein characteristic of the peripheral nervous system," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 1983-1987.
Jicha, G.A. et al., "A Conformation- and Phosphorylation-Dependent Antibody Recognizing the Paired Helical Filaments of Alzheimer' s Disease," J. Neurochem. 1997, 69, 2087-2095.
Mandelkow, E. and E. Mandelkow, "Tau in Alzheimer's disease," Trends Cell Biol, 8(11), 425-427.
Neumann, M. et al., "Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis," Science 2006, 314 (5796), 130-133.
Nelson, P.T. et al., "Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy (LATE): consensus working group report," Brain 2019, 142(6), 1503-27.
Posner, B. et al., "Multiplexing G protein-coupled receptors in microarrays: A radioligand-binding assay," Anal. Biochem. 2007, 365, 266-73.
Rostagno, A. and J. Ghiso, "Isolation and biochemical characterization of amyloid plaques and paired helical filaments," Curr. Protoc. Cell Biol. 2009, 44(1), 3.33.1-3.33.33.
Spillantini, M.G. et al., "α-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, pp. 6469-6473.
Serrano-Pozo et al., "Neuropathological alternations in Alzheimer disease," Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2011, 1, a006189.
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【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】