▶ アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-06
(54)【発明の名称】修飾オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20221129BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221129BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20221129BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221129BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/7088
A61K31/7125
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520896
(86)(22)【出願日】2020-10-13
(85)【翻訳文提出日】2022-04-05
(86)【国際出願番号】 US2020055301
(87)【国際公開番号】W WO2021072395
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/914,010
(32)【優先日】2019-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506336728
【氏名又は名称】アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139723
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116540
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 香
(72)【発明者】
【氏名】マノハラン，ムシア
(72)【発明者】
【氏名】クマール，パワン
(72)【発明者】
【氏名】ダッタ，ドルバジョーティ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。本発明の他の態様は、治療用途に適したこれらのｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物と、例えば様々な病状を治療するために、標的遺伝子の発現を、これらのｄｓＲＮＡ分子を投与することによって阻害する方法とに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な前記標的配列との相補性を有し、前記ｄｓＲＮＡ分子は、ヘキソピラノースヌクレオシドを含み、前記ｄｓＲＮＡは、リガンドを含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【請求項2】
センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な前記標的配列との相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖のシード領域に少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドを含むか、又は前記センス鎖は、前記センス鎖の中央領域に少なくとも１つのアルトリトールヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項3】
センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な前記標的配列との相補性を有し、前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドと、少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドと、少なくとも１つの２’－ＯＭｅヌクレオチドとを含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項4】
センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な前記標的配列との相補性を有し、前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドを含み、及び前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項5】
前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖の前記シード領域にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項6】
前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて３～８位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項５に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項7】
前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて６、７、９、１２、１６、２１及び２２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項６に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項8】
前記アンチセンス鎖は、６、７及び１６位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項9】
前記アンチセンス鎖は、６及び７位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項10】
前記アンチセンス鎖は、７位にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項11】
前記センス鎖は、少なくとも２つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項12】
前記センス鎖は、少なくとも３つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項13】
前記センス鎖は、前記センス鎖の前記中央領域にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項14】
前記センス鎖は、３及び１２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項15】
前記アンチセンス鎖は、少なくとも２つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項16】
前記アンチセンス鎖は、少なくとも３つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１５に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項17】
前記センス鎖は、前記センス鎖の５’末端にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項18】
前記センス鎖は、前記センス鎖の５’末端にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項19】
センス鎖は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項20】
前記ヘキソピラノースヌクレオチドは、アロピラノースヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、グルコピラノースヌクレオチド、マンノピラノースヌクレオチド、グロピラノースヌクレオチド、イドピラノースヌクレオチド、ガラクトピラノースヌクレオチド、タロピラノースヌクレオチド、フコピラノースヌクレオチド、ラムノピラノースヌクレオチド、キノボピラノースヌクレオチド、ニューモピラノースヌクレオチド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項21】
前記ヘキソピラノースヌクレオチドは、アルトリトールヌクレオチド、グルコピラノースヌクレオチド、マンノピラノースヌクレオチド、ガラクトピラノースヌクレオチド、フコピラノースヌクレオチド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項22】
リガンドを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項23】
前記リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである、請求項１又は２２に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項24】
前記ＡＳＧＰＲリガンドは、【化1】
【請求項25】
前記センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項26】
前記センス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間並びに２位及び３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項27】
前記アンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項28】
前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項29】
前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間、ヌクレオチド位置２位及び３位間、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項30】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、独立に、１９～２５ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項31】
前記センス鎖は、２１ヌクレオチド長である、請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項32】
前記アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項33】
前記センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、及び前記アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項34】
前記アンチセンス鎖の３’末端に一本鎖オーバーハングを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項35】
前記アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項36】
前記ヘキソピラノースヌクレオチドと相補的な位置に２’－フルオロ又は２’－ＯＭｅヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項37】
ヘキソピラノース、２’－フルオロ及び２－ＯＭｅヌクレオチド以外のヌクレオチドを含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項38】
非環状ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－ａｒａ－Ｆ及び２’－デオキシからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項39】
前記センス鎖は、５’末端に５’－モルホリノ修飾、５’－ジメチルアミノ修飾、５’－デオキシ修飾、逆位脱塩基修飾又は逆位脱塩基ロックド核酸修飾を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項40】
約４０℃～約８０℃の範囲の融解温度を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項41】
単独で又は薬学的に許容できる担体若しくは賦形剤と組み合わせて、請求項１～４０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項42】
請求項１～４０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む遺伝子サイレンシングキット。
【請求項43】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に導入するステップを含む方法。
【請求項44】
前記ｄｓＲＮＡ剤は、皮下又は静脈内投与を通して投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に発現させるステップを含む方法。【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１９年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９１４，０１０号明細書の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【0002】
本発明は、標的遺伝子発現の阻害にとって有利である修飾オリゴヌクレオチド及び治療用途に適した組成物に関する。加えて、本発明は、例えば、様々な疾患の治療のために、これらの修飾オリゴヌクレオチドを投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断し得るという観察を記述するため、Ｆｉｒｅ及び同僚らによって最初に造られた用語である（非特許文献１；非特許文献２）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を試験するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、そのサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、その二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を有することが知られるが、この活性のタンパク質成分は、未知のままであった。
【0004】
１９９８年のＲＮＡ媒介性転写後遺伝子サイレンシングの発見は、生物学研究上、極めて重要であった。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるこの過程により、いかなる遺伝子も特異的にノックダウンすることが可能になったため、これは、あらゆる生物学研究に広く用いられる技法となった。治療の観点から、ＲＮＡｉには、その多くが小分子によって「創薬不能」と考えられている疾患関連ＲＮＡベースの因子をいずれも標的化できるという利点がある。さらに、標的認識が配列特異的であるため、オフターゲット毒性の懸念が低下する。ＲＮＡｉベースの戦略には、効率的なノックダウンのために異なるクラスのＲＮＡを使用するものが幾つかある。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、その一種であり、これは、転写物上の標的配列と完全に相補的であり、二重鎖として標的細胞に導入される。細胞に入った後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に負荷される。この負荷過程では、パッセンジャー鎖（センス鎖）が取り除かれ、ガイド鎖（アンチセンス鎖）がＲＩＳＣ内に残り、そこで、ガイド鎖は、標的ｍＲＮＡ上のその相補部位に結合する。結合を受けたｍＲＮＡは、次に、ＲＩＳＣのヌクレアーゼ活性によって切断され、次に細胞ヌクレアーゼによってさらに分解され得る。
【0005】
アルトリトール修飾核酸（ＡＮＡ）は、二本鎖核酸構造に含まれるとＲＮＡ様Ａ型構造を支持し、ヌクレアーゼ安定性を向上させる。ＡＮＡ修飾をｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に置くと、有効性が向上し得る一方、ＡＮＡ修飾をアンチセンス鎖の５’末端に置くと、活性が完全に失われることになる。（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）；及び（非特許文献６）を参照されたい。しかしながら、ｓｉＲＮＡ遺伝子治療薬の遺伝子サイレンシングの有効性を損なうことなく、化学修飾を合理的に適用することにより、ｓｉＲＮＡ設計を調節しようとする試みが続けられている。本発明は、この試みに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６－８１１
【非特許文献2】Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，１８８－２００
【非特許文献3】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１９９９，５，２４２４－２４３１
【非特許文献4】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７，３５，１０６４－１０７４
【非特許文献5】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００９，６０６，３８－４４
【非特許文献6】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２，４０，７５７３－７５８３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、標的遺伝子発現の阻害に有利である、ｄｓＲＮＡ分子の有効なヌクレオチド又は化学的モチーフ及び治療用途に好適なＲＮＡｉ組成物を提供する。
【0008】
本発明者らは、とりわけ、特定の位置、例えばアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖のシード領域に１つ以上のアルトリトールヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子が、意外にも、ＲＮＡ干渉の媒介において有効性が高く、且つ／又は有害でないことを発見した。したがって、一態様では、本明細書では、標的遺伝子の発現を阻害する能力のあるｄｓＲＮＡ分子が提供される。概して、このｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、及びこのｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。
【0009】
本明細書に開示される様々な態様の一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオシドは、以下の構造：
（式中、
Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、保護されたＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、ＯＲ９、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、分岐脂質又はアミノアルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）又はＯＲ９であり；及び
Ｒ９は、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
のものである。
【化1】
Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、保護されたＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、ＯＲ９、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、分岐脂質又はアミノアルキルであり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）又はＯＲ９であり；及び
Ｒ９は、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
のものである。
【0010】
例示的なヘキソピラノースヌクレオチドとしては、限定されないが、アロピラノースヌクレオチド、アルトロピラノースヌクレオチド（アルトリトールヌクレオチド）、グルコピラノースヌクレオチド、マンノピラノースヌクレオチド、グロピラノースヌクレオチド、イドピラノースヌクレオチド、ガラクトピラノースヌクレオチド及びタロピラノースヌクレオチドが挙げられる。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、デオキシヘキソピラノースヌクレオチド、例えば６－デオキシヘキソピラノースヌクレオチドである。例示的なデオキシヘキソピラノースヌクレオチドとしては、限定されないが、フコピラノースヌクレオチド、ラムノピラノースヌクレオチド、キノボピラノースヌクレオチド及びニューモピラノースヌクレオチドが挙げられる。
【0011】
【0012】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、アルトリトールヌクレオチドである。
【0013】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、ａｎである。
【0014】
一部の実施形態では、アルトリトールヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する。概して、アルトリトールヌクレオチドは、アンチセンス鎖内のいずれの箇所にも存在し得る。例えば、アルトリトールヌクレオチドは、シード領域の範囲内（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて３～８位）に存在し得る。
【0015】
一部の実施形態では、アルトリトールヌクレオチドは、センス鎖に存在する。アンチセンス鎖と同様に、アルトリトールヌクレオチドは、センス鎖内のいずれの箇所にも存在し得る。例えば、アルトリトールヌクレオチドは、５’領域の範囲内（すなわちセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２～８位）に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、センス鎖の中央領域にアルトリトールヌクレオチドを含む。
【0016】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの２’－ＯＭｅヌクレオチドを含む。
【0017】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１、２、３、４つ又はそれを超えるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【0018】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドをさらに含む。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖にコンジュゲートされたＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。好ましくは、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
【0019】
別の態様では、本開示は、標的遺伝子配列の発現を阻害する方法を提供する。概して、この方法は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子を細胞に投与することを含む。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。
【0020】
なおも別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。
【0021】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子を使用して対象を治療する方法を提供する。概して、この治療する方法は、治療有効量の、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】例示的なｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖配列を示す。
【図1B】２’－ＯＭｅ ＲＮＡ、２’－Ｆ ＲＮＡ及びアルトリトール核酸（ＡＮＡ）ヌクレオチドの構造を示す。
【図2】アンチセンス鎖にＡＮＡを有する二重鎖のインビトロＲＮＡｉ活性を示す棒グラフである。ガイド鎖とも称される、アンチセンス鎖の指示される位置にあるヌクレオチドを、対応するＡＮＡヌクレオチドに置換した。
【図3】センス鎖にＡＮＡを有する二重鎖のインビトロＲＮＡｉ活性を示す棒グラフである。パッセンジャー鎖とも称される、センス鎖の指示される位置にあるヌクレオチドを、対応するＡＮＡヌクレオチドに置換した。
【図4】ＡＮＡ修飾を含む選択の例示的ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を示す折れ線グラフである。アンチセンス鎖又はセンス鎖の指示される位置は、対応するＡＮＡヌクレオチドを担持している。
【図5】ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける例示的なｓｉＲＮＡのオンターゲット（図５Ａ）及びオフターゲット（図５Ｂ）阻害効果を示す折れ線グラフである。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、指示されるｓｉＲＮＡと共にＣＯＳ－７細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイにかけた。％標的残留率は、各ｓｉＲＮＡ濃度におけるウミシイタケ／ホタル比をｓｉＲＮＡ非存在下の比で除すことによって計算した。
【図6】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮下投与したＡＮＡ含有ｓｉＲＮＡのインビボ活性を示す。図６Ａは、ＥＬＩＳＡで決定した循環中Ｔｔｒタンパク質レベルを示す棒グラフである（平均値±ＳＤ）。図６Ｂは、試験終了時の肝臓におけるＴｔｒの転写物レベルを示す棒グラフである（１４日目；平均値±ＳＤ）。
【図7】Ａｇｏ２に結合したＳ７位にＡＮＡ－Ｇを有するｓｉＲＮＡガイド鎖のモデル概略図である。ＡＮＡ残基を青緑色の炭素原子で強調し、選択したストランド内Ｐ－Ｐ距離をÅ単位で提供する。
【図8】ＡＮＡ修飾を担持するオリゴヌクレオチドが分解に対抗する安定性を示す折れ線グラフである。図８Ａは、ポリｄＴの３’末端に単一の又は２個のＡＮＡヌクレオチドを担持するオリゴヌクレオチドがヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）による分解に対抗するヌクレアーゼ安定性を示す。図８Ｂは、ポリｄＴの５’末端に単一の又は２個のＡＮＡヌクレオチドを担持するオリゴヌクレオチドがホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＥＩＩ）による分解に対抗する安定性を示す。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を指示している。Ｕは、ウリジンであり、Ｕａｎは、核酸塩基としてウラシルを有するＡＮＡヌクレオチドである。直接比較するため、末端にウリジンを有する同一の配列を調製した。
【図9】複合体の結晶構造で観察したときの、５’Ｐ－ｄＴｄＴｄＴ－３’が結合したＸｒｎ１ ５’－エキソリボヌクレアーゼの活性部位の図である（リン及び炭素原子をそれぞれオレンジ色及び黄色で色付けしている）［参照Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２０１１］。５’Ｐ－ａＵａＵ－３’Ｐ ＡＮＡ二量体（リン及び炭素原子をそれぞれ黒色及び青緑色で色付けしている）を重ね合わせて、ＡＮＡ及びＤＮＡ（それぞれ黒色及びオレンジ色の矢印）間の偏位しているＰ－Ｐ間隔並びにＭｇ２＋イオン（緑色の球）に対するリン酸塩の向きを明らかにしている。
【図10A】ＡＮＡ ３’－エキソヌクレアーゼ安定性を示す折れ線グラフである（図１０Ａ）。ｔ１／２計算値は、ＵＵ－３’：＜＜１時間、（Ｕａｎ）（Ｕａｎ）－３’：４．７時間、ＵｓＵ－３’：１０．２、Ｕｓ（Ｕａｎ）－３’：８．０時間及び（Ｕａｎｓ）（Ｕａｎ）－３’：１６．３時間である。概して、Ｕａｎは、リン酸ジエステル（ＰＯ）の親と比較して３’－エキソヌクレアーゼ安定性が増加し、二重に取り込むと、単一の取り込みよりも安定性が高くなる。
【図10B】ＡＮＡ ５’－エキソヌクレアーゼ安定性を示す折れ線グラフである。ｔ１／２計算値は、５’－ＵＵ：＜＜１．５時間、５’－（Ｕａｎ）Ｕ：１１．５、５’－ＵｓＵ：２６．９、５’－（Ｕａｎｓ）Ｕ：１１３時間及び５’－（Ｕａｎｓ（Ｕａｎ）：４５８．５である。概して、Ｕａｎは、それぞれリン酸ジエステル（ＰＯ）及びホスホロチオエート（ＰＳ）の親と比較して５’－エキソヌクレアーゼ安定性が増加し、二重に取り込むと、単一の取り込みよりも安定性が高くなる。
【図11】ＡＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の結晶構造；ＰＤＢ ＩＤ ３ｏｋ２を示す概略図である。ＡＮＡのリン酸塩間隔（５．５Å）は、ＲＮＡ（６Å）よりも小さい。出典Ｏｖａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４０：７５７３－７５８３（２０１２）。
【図12】一部の例示的なヘキソピラノースヌクレオシドホスホラミダイトを示す。
【図13】一部の例示的なヘキソピラノースヌクレオシドホスホラミダイトを示す。
【図14】一部の例示的なヘキソピラノースヌクレオシド及びヌクレオチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
一態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、このｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害する能力があり、このｄｓＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、及びこのｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオチド、シクロヘキセンヌクレオチド、例えばアルトリトールヌクレオチドを含む。
【0024】
ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ内のいずれの箇所にも存在し得る。例えば、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に存在し得る。ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドがセンス鎖に存在し得ることが注目される。例えば、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端及び／又はセンス鎖の内部位置にあり得る。
【0025】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の３’末端に存在する。
【0026】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の内部位置に存在し得る。例えば、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５位に存在し得る。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、５’領域の範囲内（すなわちセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２～８位）に存在し得る。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖の中央領域に存在し得る。
【0027】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、センス鎖のセンス領域においてアンチセンス鎖のシード領域に対向する位置（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて３～８位）に存在し得る。
【0028】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又はそれを超えるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、３及び１２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。
【0029】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ以上のヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。２つ以上のヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドが存在するとき、それらは、互いに隣接し得る。したがって、一部の実施形態では、センス鎖は、互いに隣接している少なくとも２つ、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。換言すれば、センスは、２つ以上の独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドのストレッチを含む。
【0030】
一部の実施形態では、センス鎖は、互いに隣接している３つのヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含み、すなわち、センス鎖は、３つの独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドのストレッチを含む。
【0031】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する。概して、ヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖内のいずれの箇所にも存在し得る。例えば、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の３’末端及び／又はアンチセンス鎖の内部位置にあり得る。
【0032】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。
【0033】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の内部位置に存在し得る。例えば、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５位に存在し得る。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、シード領域の範囲内（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２～８位）に存在し得る。例えば、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて３～８位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドは、アンチセンス鎖の中央領域に存在し得る。
【0034】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又はそれを超えるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６、７、９、１２、１６、２１及び２２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６、７及び１６位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６及び７位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンスは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位にヘキソピラノースヌクレオチド又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。
【0035】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ以上のヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。２つ以上のヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドが存在するとき、それらは、互いに隣接し得る。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、互いに隣接している少なくとも２つ、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含む。換言すれば、アンチセンスは、２つ以上の独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドのストレッチを含む。
【0036】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、互いに隣接している３つのヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドを含み、すなわち、アンチセンス鎖は、３つの独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオチド及び／又はシクロヘキセンヌクレオチドのストレッチを含む。
【0037】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、アルトリトールヌクレオチドである。
【0038】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、グルコピラノースヌクレオチドである。
【0039】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、マンノピラノースヌクレオチドである。
【0040】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、ガラクトピラノースヌクレオチドである。
【0041】
一部の実施形態では、ヘキソピラノースヌクレオチドは、フコピラノースヌクレオチドである。
【0042】
一部の実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）部分を含有するヌクレオチドを含み得る。例えば、センス鎖は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）部分を含有するヌクレオチドを含む。別の例では、アンチセンス鎖は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）部分を含有するヌクレオチドを含む。
【0043】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのアルトリトールヌクレオチドを含む。ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超えるアルトリトールヌクレオチドを含み得る。限定なしに、アルトリトールヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１つ又は２つのアルトリトールヌクレオチドを含む。一部の好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１つのアルトリトールヌクレオチドを含む。
【0044】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５つ又はそれを超えるアルトリトールヌクレオチドを含む。限定なしに、アンチセンス鎖のアルトリトールヌクレオチドは、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、シード領域の範囲内（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて３～８位）に少なくとも１つのアルトリトールヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて６、７、９、１２、１６、２１及び２２位の少なくとも１つにアルトリトールヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、６、７及び１６位の少なくとも１つにアルトリトールヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて少なくとも６位にアルトリトールヌクレオチドを含む。別の例では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて少なくとも７位にアルトリトールヌクレオチドを含む。なおも別の例では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて少なくとも１６位にアルトリトールヌクレオチドを含む。
【0045】
本発明者らは、アンチセンス鎖（ＡＳ１）の５’末端がアルトリトールヌクレオチドによって修飾されたｄｓＲＮＡに有効性があることを発見した。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて１位及び／又は２位にアルトリトールヌクレオチドを含まない。
【0046】
一部の実施形態では、アルトリトールヌクレオチドは、センス鎖に存在する。アンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５つ又はそれを超えるアルトリトールヌクレオチドを含む。アンチセンス鎖と同様に、アルトリトールヌクレオチドは、センス鎖内のいずれの箇所にも存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、シード領域に対向するか又はそれと相補的な位置（すなわちアンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて３～８位に少なくとも１つのアルトリトールヌクレオチドを含み得る。例えば、センス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて３及び２１位の少なくとも１つにアルトリトールヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から数えて１位にアルトリトールヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アルトリトールヌクレオチドを含まない。
【0047】
本明細書に開示される様々な態様の一部の実施形態では、アルトリトールヌクレオチドは、構造：
（式中、
Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、ＯＲ９又はＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）であり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）又はＯＲ９であり；及び
Ｒ９は、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
を有する修飾されたアルトリトールヌクレオチドである。
【化2】
Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、ＯＲ９又はＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）であり；
Ｒ７及びＲ８は、独立に、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）又はＯＲ９であり；及び
Ｒ９は、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
を有する修飾されたアルトリトールヌクレオチドである。
【0048】
ｄｓＲＮＡ分子
本発明の態様には、二本鎖ＲＮＡ分子が含まれる。一般に、そのｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも称される）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも称される）を含む。ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は、独立に、１２～４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、独立に、１４～４０ヌクレオチド長、１７～３７ヌクレオチド長、２５～３７ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長又は２１～２３ヌクレオチド長であり得る。限定されないが、センス及びアンチセンス鎖は、等しい長さ又は不等な長さであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、センス鎖と比べて長く、例えば１、２、３、４又は５ヌクレオチドだけ長い。
本発明の態様には、二本鎖ＲＮＡ分子が含まれる。一般に、そのｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも称される）及びアンチセンス鎖（ガイド鎖とも称される）を含む。ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は、独立に、１２～４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、独立に、１４～４０ヌクレオチド長、１７～３７ヌクレオチド長、２５～３７ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長又は２１～２３ヌクレオチド長であり得る。限定されないが、センス及びアンチセンス鎖は、等しい長さ又は不等な長さであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、センス鎖と比べて長く、例えば１、２、３、４又は５ヌクレオチドだけ長い。
【0049】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１８～３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１～２５、１９～２５、１９～２１又は２１～２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
【0050】
アンチセンス鎖と同様、センス鎖は、一部の実施形態では、１８～３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、２１～２５、１９～２５、１９～２１又は２１～２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
【0051】
一部の特定の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、及びアンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
【0052】
二本鎖ＲＮＡ分子は、二本鎖又は二重鎖領域を有する。概して、二重鎖領域（二本鎖領域）は、１２～４０ヌクレオチド塩基対長である。例えば、ｄｓＲＮＡは、１２～２５ヌクレオチド対長の二重鎖領域を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド塩基対長の二重鎖領域を有する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド塩基対長の二重鎖領域を有する。
【0053】
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の核酸修飾を含み得る。ｄｓＲＮＡには、１つ又は複数のアルトリトールヌクレオチドに加えて、１つ以上の核酸修飾が存在することが注記される。
【0054】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－フルオロヌクレオチド、すなわち２’－フルオロ修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える２’－フルオロヌクレオチドを含み得る。限定なしに、２’－フルオロヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各２’－フルオロ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２’－フルオロ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0055】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）の２’－フルオロヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２、３、４、５又は６つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定なしに、アンチセンス鎖の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、少なくとも４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも５つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。なおも一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも６つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0056】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）の２’－フルオロヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、４又は５つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センス鎖は、３又は４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定なしに、センス鎖の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも３つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、１０及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、少なくとも４つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0057】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３及び１５位に対して対向的又は相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３又は４つの２’－フルオロヌクレオチドの遮断を含む。
【0058】
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0059】
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0060】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて３～９位に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
【0061】
ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超える２’－ＯＭｅヌクレオチドを含み得る。限定なしに、２’－ＯＭｅヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくとも１つの２’－ＯＭｅヌクレオチドを含む。２’－ＯＭｅ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、２’－ＯＭｅ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各熱安定化修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２’－ＯＭｅ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の熱安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上の熱安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－ＯＭｅ修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0062】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又はそれを超える２’－ＯＭｅ修飾を含み得る。限定なしに、アンチセンス鎖の熱安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの熱安定化修飾を含む。
【0063】
例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４及び１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。なおも一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。
【0064】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又はそれを超える２’－ＯＭｅ修飾を含み得る。限定なしに、センス鎖の２’－ＯＭｅ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センスは、５’末端から少なくとも７、１０及び１１位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。一部の他の実施形態では、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に２’－ＯＭｅ修飾を含まない。
【0065】
ｄｓＲＮＡ分子は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるＬＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、ＬＮＡヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくともＬＮＡ修飾を含む。ＬＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、ＬＮＡ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各ＬＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、ＬＮＡ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のＬＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上のＬＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0066】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＬＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、アンチセンス鎖のＬＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
【0067】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＬＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、センス鎖のＬＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＬＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて３～９位に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
【0068】
ｄｓＲＮＡ分子は、架橋型核酸（ＢＮＡ）を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるＢＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、ＢＮＡヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくともＢＮＡ修飾を含む。ＢＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、ＢＮＡ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各ＢＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、ＢＮＡ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のＢＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上のＢＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0069】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＢＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、アンチセンス鎖のＢＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
【0070】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＢＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、センス鎖のＢＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるＢＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて３～９位に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
【0071】
ｄｓＲＮＡ分子は、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるＣｅＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、ＣｅＮＡヌクレオチドは、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくともＣｅＮＡ修飾を含む。ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各ＣｅＮＡ修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、ｃｅＮＡ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のＣｅＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上のｃｅＮＡ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0072】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるｃｅＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、アンチセンス鎖のｃｅＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。
【0073】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるｃｅＮＡ修飾を含み得る。限定なしに、センス鎖のｃｅＮＡ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるｃｅＮＡ修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から数えて３～９位に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
【0074】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、熱安定化修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える熱安定化修飾を含み得る。
【0075】
限定なしに、熱安定化修飾は、全てが一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が少なくとも１つ、例えば２、３、４つ又はそれを超える熱安定化修飾を含む。熱安定化修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に現れ得る。例えば、熱安定化修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に現れ得るか；各熱安定化修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで現れ得るか；又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、熱安定化修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の熱安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上の熱安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の熱安定化修飾の交互パターンに対してシフトし得る。
【0076】
ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える熱安定化修飾を含み得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２、３、４、５又は６つの熱安定化修飾を含む。限定なしに、アンチセンス鎖の熱安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも３つの熱安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から２、１４及び１６位の少なくとも１つ、例えば２又は３つに熱安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、少なくとも４つの熱安定化修飾を含む。例えば、アンチセンスは、５’末端から少なくとも２、６、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも５つの熱安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。なおも一部のさらなる実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも６つの熱安定化修飾を含む。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。
【0077】
ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える熱安定化修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３、４又は５つの熱安定化修飾を含む。例えば、センス鎖は、３又は４つの熱安定化修飾を含む。限定なしに、センス鎖の熱安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも３つの熱安定化修飾を含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、１０及び１１位に熱安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、少なくとも４つの熱安定化修飾を含む。例えば、センスは、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に熱安定化修飾を含む。
【0078】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２及び１５位に対向するか又はそれと相補的な位置に熱安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３及び１５位に対向するか又はそれと相補的な位置に熱安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３又は４つの熱安定化修飾のブロックを含む。
【0079】
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。
【0080】
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から少なくとも７、９、１０及び１１位に熱安定化修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端から少なくとも２、６、８、９、１４及び１６位に熱安定化修飾を含む。
【0081】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖にある二重鎖の熱不安定化修飾に対向するか又はそれと相補的な位置に熱安定化修飾を含まない。
【0082】
例示的な熱安定化修飾としては、限定されないが、２’－フルオロ修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、脱塩基修飾；逆鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’－デオキシ修飾などの糖修飾又は非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）若しくはグリコール核酸（ＧＮＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、不安定化修飾は、ＧＮＡ－ｉｓｏＣ、ＧＮＡ－ｉｓｏＧ、５’－ｍＵＮＡ、４’－ｍＵＮＡ、３’－ｍＵＮＡ及び２’－ｍＵＮＡからなる群から選択される。
【0083】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、鎖の３’末端又は５’末端又は両方の末端にｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のオーバーハング領域（すなわち一本鎖領域）及び／又はキャッピング基を含む。限定なしに、オーバーハングは、１～１０ヌクレオチド長、１～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～６ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長２～４ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長又は１～２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長い結果又は同じ長さの２本の鎖がずれている結果であり得る。オーバーハングは、標的となる配列とミスマッチを形成し得るか、又はそれは、標的となる配列に相補的であるか若しくは他の配列であり得る。第１及び第２の鎖は、例えば、追加の塩基でヘアピンを形成することによるか、又は他の非塩基リンカーによって連結され得る。限定なしに、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に存在し得る。
【0084】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一のオーバーハングを含む。例えば、ｄｓＲＮＡ分子は、単一のオーバーハングを有し、このオーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【0085】
ｄｓＲＮＡは、平滑末端も有し得る。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の末端が平滑末端であり、他方の末端がオーバーハングを有する。限定なしに、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）に位置するか又はその逆であり得る。概して、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端が平滑型である。理論によって拘束されないが、非対称にアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端があり、アンチセンス鎖の３’末端オーバーハングがあると、ガイド鎖をＲＩＳＣに負荷するプロセスに有利に作用する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【0086】
一部の他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、平滑末端を２つ有し、すなわちｄｓＲＮＡの両方の末端に有する。
【0087】
ｄｓＲＮＡ分子のオーバーハング領域におけるヌクレオチドは、それぞれ独立に、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン、ＧＮＡ、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ、ｈ’ＧＮＡ及びこれらの任意の組み合わせなど、２’－糖修飾されたものを含むが、それに限定されない修飾された又は修飾されていないヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴ（又はＵＵ）は、いずれか一方の鎖のいずれか一方の末端についてのオーバーハング配列であり得る。ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’－又は３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、その間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含有し、ここで、オーバーハング領域の２つのヌクレオチドは、同じであるか又は異なり得る。
【0088】
ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖若しくはアンチセンス鎖又は両方の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に生じ得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチド上に生じ得るか；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖上に交互パターンで生じ得るか；又はセンス鎖若しくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであるか又は異なり得、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有し得る。
【0089】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域内にホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するためにも設けられ得る。例えば、少なくとも２、３、４若しくは全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通して連結され得、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在し得、ここで、３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、且つ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。好ましくは、これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
【0090】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される、２～１０のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の１～１０のブロックを含み、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0091】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される２つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0092】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される３つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0093】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される４つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0094】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0095】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される６つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0096】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７又は８つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される７つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0097】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５又は６つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される８つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0098】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される９つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここで、ホスホロチオエート又はメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸及びリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖又はホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸若しくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【0099】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス及び／又はアンチセンス鎖の末端位置の１～１０以内に１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のヌクレオチドは、センス及び／又はアンチセンス鎖の一端又は両端でホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通して連結され得る。
【0100】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス及び／又はアンチセンス鎖各々の二本鎖の内部領域の１～１０以内に１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ又は１０のヌクレオチドは、二本鎖領域のセンス鎖の５’末端から数えて８～１６位でホスホロチオエートメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合を通して連結され得；ｄｓＲＮＡ分子は、任意選択で、１つ以上のホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を末端１～１０位以内にさらに含み得る。
【0101】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に１～５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１～５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１～５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１～５つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0102】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエート又はメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0103】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0104】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0105】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0106】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0107】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0108】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0109】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0110】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0111】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0112】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８～２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0113】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０及び２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0114】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０及び２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0115】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１及び２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0116】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１及び２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0117】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２２及び２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾及び２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0118】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾並びにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２３及び２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を含む。
【0119】
一部の例示的なｄｓＲＮＡ分子では、センス鎖は、０、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、センス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間並びにヌクレオチド位置２位及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【0120】
一部の例示的なｄｓＲＮＡ分子では、アンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオネートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、センス鎖は、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらなる例では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間、ヌクレオチド位置２位及び３位間、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【0121】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間並びにヌクレオチド位置２位及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、センス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間並びにヌクレオチド位置２位及び３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間、ヌクレオチド位置２位及び３位間、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【0122】
５’－修飾
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化され得るか、又は５’末端にホスホリル類似体を含み得る。例示的な５’－リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾は、５’－一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－モノジチオリン酸（ジチオリン酸；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄が置換された一リン酸、二リン酸及び三リン酸の任意のさらなる組み合わせ（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸など）、５’－ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわちビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）を含む。修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内に配置され得る。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端に５’－ビニルホスホネートヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化され得るか、又は５’末端にホスホリル類似体を含み得る。例示的な５’－リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾は、５’－一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）及び任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－モノジチオリン酸（ジチオリン酸；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄が置換された一リン酸、二リン酸及び三リン酸の任意のさらなる組み合わせ（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸など）、５’－ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわちビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）を含む。修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内に配置され得る。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端に５’－ビニルホスホネートヌクレオチドを含み得る。
【0123】
一部の実施形態では、アンチセンスは、５’－Ｅ－ビニルホスホネートを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’－Ｅ－ビニルホスホネートと、アンチセンス鎖配列が同じであるが、非修飾のＮ－１位置を有するｓｉＲＮＡと比べてｓｉＲＮＡの活性を低下させるか又は阻害するＮ－１位のヌクレオシド及びアンチセンス鎖配列が同じであるが、非修飾のＮ－１位置を有するｓｉＲＮＡと比べてｓｉＲＮＡの活性を低下させるか又は阻害するＮ－１位のヌクレオシドとを含む。
【0124】
一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端に５’－モルホリノ修飾、５’－ジメチルアミノ修飾、５’－デオキシ修飾、逆位脱塩基修飾又は逆位脱塩基ロックド核酸修飾を含む。
【0125】
概して、ｄｓＲＮＡは、約４０℃～約８０℃の範囲の融解温度を有する。例えば、ｄｓＲＮＡは、範囲の下端が約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃又は６５℃からであり、範囲の上端が約７０℃、７５℃又は８０℃からである融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５５℃～約７０℃の範囲又は約６０℃～約７５℃の範囲の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５７℃～約６７℃の範囲の融解温度を有する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６０℃～約６７℃の範囲の融解温度を有する。一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６２℃～約６６℃の範囲の融解温度を有する。
【0126】
理論によって拘束されることを望むものではないが、少なくとも６０℃の融解温度を有するｄｓＲＮＡ分子は、インビボ及びインビトロで有効性が高くなる。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも６０℃の融解温度を有する。
【0127】
理論によって拘束されることを望むものではないが、ｄｓＲＮＡ分子がインビボで一層有効となるために、アンチセンス鎖が一定の代謝安定性を有しなければならない。換言すれば、ｄｓＲＮＡ分子がインビボで一層有効となるために、投与後、ある期間が経った後に生体内に一定量のアンチセンス鎖が存在する必要があり得る。したがって、一部の実施形態では、生体内投与後５日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後６日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後７日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後８日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後９日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１０日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１１日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１２日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１３日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１４日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。一部の実施形態では、生体内投与後１５日目にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％又は少なくとも８０％が生体内、例えばマウス肝臓に存在する。
【0128】
理論によって拘束されることを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’領域における（すなわちアンチセンス鎖の５’末端から２～９位にある）熱不安定化修飾は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減又は阻害することができる。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチド位置の範囲内に二重鎖の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５つ又はそれを超える）の熱不安定化修飾を含む。用語「１つ又は複数の熱不安定化修飾」には、かかる１つ又は複数の修飾を有しないｄｓＲＮＡのＴｍよりも全体的に低い融解温度（Ｔｍ）（好ましくは１、２、３又は４度低いＴｍのｄｓＲＮＡをもたらすであろう１つ又は複数の修飾が含まれる。
【0129】
一部の実施形態では、熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５、６、７、８若しくは９位又は好ましくは４、５、６、７若しくは８位に位置する。一部の実施形態では、熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５又は９位に位置する。一部の他の実施形態では、熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７又は８位に位置する。一部の特定の実施形態では、熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。
【0130】
熱不安定化修飾としては、限定されないが、脱塩基修飾；逆鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’－デオキシ修飾などの糖修飾又は非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）又はグリコール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。
【0131】
例示的な脱塩基修飾としては、限定されないが、以下が挙げられる：
（式中、Ｒは、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅであり；Ｒ’は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅであり；Ｒ’’は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ又はＯＭｅであり；及び＊は、Ｒ、Ｓのいずれか又はラセミ体を表す）。
【化3】
【0132】
例示的な不安定化糖修飾としては、限定されないが、以下が挙げられる：
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基である）。
【化4】
【0133】
さらなる糖修飾としては、限定されないが、以下が挙げられる：
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基である）。
【化5】
【0134】
一部の実施形態において、熱不安定化修飾は、
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓのいずれか又はラセミ体を表す）
からなる群から選択される。
【化6】
からなる群から選択される。
【0135】
用語「非環状ヌクレオチド」は、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えば、ここで、リボース炭素間（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’又はＣ１’－Ｏ４’）の結合のいずれかが存在せず、及び／又はリボース炭素又は酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが独立に又は組み合わせでヌクレオチドに存在しない。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
（式中、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３又はアルキルであり；及びＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）
である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、ここで、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成している。一例では、ＵＮＡには、Ｃ１’～Ｃ４’間の結合（すなわちＣ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合性の炭素－酸素－炭素結合）が除去されている単量体も包含される。別の例では、糖のＣ２’～Ｃ３’結合（すなわちＣ２’炭素とＣ３’炭素との間の共有結合性の炭素－炭素結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）（これらは、本明細書によって全体として参照により援用される）を参照されたい）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック対合への影響なしに骨格の柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは、２’－５’又は３’－５’結合で連結することができる。
【化7】
である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、ここで、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成している。一例では、ＵＮＡには、Ｃ１’～Ｃ４’間の結合（すなわちＣ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合性の炭素－酸素－炭素結合）が除去されている単量体も包含される。別の例では、糖のＣ２’～Ｃ３’結合（すなわちＣ２’炭素とＣ３’炭素との間の共有結合性の炭素－炭素結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）（これらは、本明細書によって全体として参照により援用される）を参照されたい）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック対合への影響なしに骨格の柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは、２’－５’又は３’－５’結合で連結することができる。
【0136】
用語「ＧＮＡ」は、グリコール核酸を指し、これは、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似しているが、リン酸ジエステル結合によって連結されたグリセロールの繰り返し単位で構成されている点でその「骨格」の組成が異なるポリマーである。
【化8】
【0137】
二重鎖の熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二重鎖内にある熱不安定化ヌクレオチドと、逆鎖の対向するヌクレオチドとの間のミスマッチ（すなわち非相補性塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ又はこれらの組み合わせが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチド又は修飾されたヌクレオチドのいずれのヌクレオチド間にも現れ得、すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは無関係に、それぞれのヌクレオチドからの核酸塩基間に現れ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－デオキシ核酸塩基であり；例えば、２’－デオキシ核酸塩基がセンス鎖にあるミスマッチ対合の少なくとも１つの核酸塩基を含む。
【0138】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域における熱不安定化修飾には、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのＷ－Ｃ Ｈ結合の障害を示すヌクレオチドが含まれる。標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのＷ－Ｃ Ｈ結合が障害されている例示的なヌクレオチドとしては、限定されないが、以下から独立に選択される核酸塩基を含むヌクレオチドが挙げられる。
【化9】
【0139】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡ及びＧＮＡを含む）及びミスマッチ修飾のさらなる例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）に詳細に記載されている。
【0140】
熱不安定化修飾には、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低下又は消失したユニバーサル核酸塩基及びリン酸修飾も含まれ得る。
【0141】
一部の実施形態では、熱不安定化修飾には、限定されないが、逆鎖の塩基と水素結合を形成する能力が障害された又は完全に消失した核酸塩基修飾など、非標準塩基を有するヌクレオチドが含まれる。これらの核酸塩基修飾は、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（全体として参照により本明細書中に援用される）に記載されるとおり、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中央領域の不安定化に関して評価されている。例示的なかかる核酸塩基修飾は、以下である。
【化10】
【0142】
一部の実施形態では、熱不安定化修飾には、
（式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２又はＯ－アルキルである）
など、標的ｍＲＮＡ上の塩基に相補的な１つ以上の□－ヌクレオチドが含まれる。
【化11】
など、標的ｍＲＮＡ上の塩基に相補的な１つ以上の□－ヌクレオチドが含まれる。
【0143】
天然リン酸ジエステル結合と比較してｄｓＲＮＡ二重鎖の熱安定性を減少させることが公知の例示的なリン酸修飾としては、限定されないが、以下が挙げられる。
【化12】
【0144】
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとしては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。
【0145】
一部の実施形態では、不安定化修飾は、以下から選択される。
【化13】
【0146】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端又は３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から－１位又は＋１位にあるヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端及び３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から－１位及び＋１位に安定化修飾を含む。
【0147】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１位及び＋２位に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
【0148】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖にある二重鎖の熱不安定化修飾に対向するか又はそれと相補的な位置に熱安定化修飾を含まない。
【0149】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端又は３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から－１位又は＋１位にあるヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端及び３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から－１位及び＋１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0150】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１位及び＋２位に少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
【0151】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖にある二重鎖の熱不安定化修飾に対向するか又はそれと相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
【0152】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、非連結リン酸酸素及び／又は連結リン酸酸素の１つ以上の一方又は両方の１つ以上の変化；リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの変化；リン酸部分を「デホスホ」リンカーにする大規模置換；天然に存在する塩基の修飾又は置換；及びリボース－リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る同じ又は異なる修飾で修飾され得る。
【0153】
核酸は、単量体のポリマーであるため、多くの修飾は、核酸内で繰り返される位置に現れ、例えば塩基又はリン酸部分若しくはリン酸部分の非連結Ｏの修飾である。ある場合には、修飾は、核酸内の対象位置の全てに現れることになるが、多くの場合、そうはならないであろう。例として、修飾は、３’又は５’末端位置にのみ現れ得、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチドにある位置にのみ現れ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域又は両方に現れ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域にのみ現れ得るか又はＲＮＡの一本鎖領域にのみ現れ得る。例えば、非連結Ｏ位置にあるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端にのみ現れ得、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上又は鎖の最後の２、３、４、５又は１０ヌクレオチドにある位置にのみ現れ得るか、又は二本鎖及び一本鎖領域において、特に末端に現れ得る。１つ又は複数の５’末端がリン酸化され得る。
【0154】
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること或いは一本鎖オーバーハング、例えば５’若しくは３’オーバーハング又は両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましいこともある。一部の実施形態において、３’又は５’オーバーハング中の塩基の全て又は一部は、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、リボース糖の２’位における当技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えばデオキシリボヌクレオチド、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）又は２’－Ｏ－メチル及びリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾の使用を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【0155】
一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立に、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ又は２’－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立に、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロで修飾される。ｄｓＲＮＡには、１つ又は複数のアルトリトールヌクレオチドに加えて、これらの修飾が存在することが理解されるべきである。
【0156】
一部の実施形態では、１つ又は複数のアルトリトールヌクレオシドに加えて、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖上に少なくとも２つの異なる修飾が存在し得る。これらの２つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ修飾、非環状ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ及び／又は２’－デオキシから選択される２つの異なる修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立に、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド又は２’－ａｒａ－Ｆヌクレオチドで修飾される。この場合にもやはり、ｄｓＲＮＡには、１つ又は複数のアルトリトールヌクレオチドに加えて、これらの修飾が存在することが理解されるべきである。
【0157】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域に交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」又は「交互パターン」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有し、各修飾が一方の鎖の交互のヌクレオチドに現れるモチーフを指す。交互のヌクレオチドとは、１つおきのヌクレオチド若しくは３つおきのヌクレオチド又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれヌクレオチドに対する１つの種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」等であり得る。
【0158】
交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであるか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれヌクレオチド上の１つの種類の修飾を表す場合、交互パターン、すなわち１つおきのヌクレオチドの修飾は、同じであり得るが、センス鎖又はアンチセンス鎖の各々は、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」「ＢＤＢＤＢＤ．．．」又は「ＣＤＣＤＣＤ．．．」などの交互モチーフの範囲内にある修飾の幾つかの可能性から選択され得る。
【0159】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖上の交互モチーフ修飾パターンがアンチセンス鎖上の交互モチーフ修飾パターンに対してシフトしたもの含む。このシフトは、センス鎖の修飾された一群のヌクレオチドが、アンチセンス鎖の別様に修飾された一群のヌクレオチドに対応するようなもの及びその逆であり得る。例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖においてセンス鎖がアンチセンス鎖と対を成すとき、二重鎖領域の範囲内でセンス鎖の交互モチーフが鎖の５’－３’に「ＡＢＡＢＡＢ」で始まり得、アンチセンス鎖の交互モチーフが鎖の３’－５’に「ＢＡＢＡＢＡ」で始まり得る。別の例として、二重鎖領域の範囲内でセンス鎖の交互モチーフが鎖の５’－３’に「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり得、アンチセンス鎖の交互モチーフが鎖の３’－５’に「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まり得、したがってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な又は部分的なシフトがある。
【0160】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、標的との、二重鎖の範囲内にあるか又はこれらの組み合わせの１つ又は複数のミスマッチを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二重鎖領域に現れ得る。塩基対は、解離又は融解を促進するその傾向を基準として順位を付けることができる（例えば、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も単純な手法は、個々の対塩基上の対を調べることであるが、隣接塩基分析又は同様の分析を用いることもできる）。解離を促進する点では、Ｇ：ＣよりもＡ：Ｕが好ましく；Ｇ：ＣよりもＧ：Ｕが好ましく；及びＧ：ＣよりもＩ：Ｃが好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非標準的な又は標準以外の対合（本明細書の他の部分に記載されるとおり）は、標準的な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；及びユニバーサル塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
【0161】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内にある最初の１、２、３、４又は５塩基対の少なくとも１つ（これは、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択され得る）及びミスマッチ対、例えば非標準的な若しくは標準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含み、二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進する。
【0162】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１つの位置にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ及びｄＴからなる群から選択される。代わりに、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内にある最初の１、２又は３塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内にある最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
【0163】
理論によって拘束されることを望むものではないが、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置にあるジヌクレオチドのリン酸ジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）及び／又はホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’末端に４’－修飾及び／又は５’－修飾ヌクレオチドを導入すると、ヌクレオチド間結合に立体効果が及ぼされ、したがってそれがヌクレアーゼから保護されるか又は安定化し得る。
【0164】
一部の実施形態では、５’－修飾ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡ分子の任意の位置にあるジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、ｄｓＲＮＡの任意の位置にあるジヌクレオチドの３’末端に５’－アルキル化ヌクレオシドが導入され得る。リボース糖の５’位置にあるアルキル基は、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドは、５’－メチルヌクレオシドである。５’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【0165】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの任意の位置にあるジヌクレオチドの３’末端に４’－修飾ヌクレオシドが導入される。例えば、ｄｓＲＮＡの任意の位置にあるジヌクレオチドの３’末端に４’－アルキル化ヌクレオシドが導入され得る。リボース糖の４’位置にあるアルキル基は、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドは、４’－メチルヌクレオシドである。４’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。代わりに、一本鎖又は二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置にあるジヌクレオチドの３’末端に４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドが導入され得る。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【0166】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に５’－アルキル化ヌクレオシドが導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’－アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドは、５’－メチルヌクレオシドである。５’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【0167】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に４’－アルキル化ヌクレオシドが導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。４’－アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドは、４’－メチルヌクレオシドである。４’－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【0168】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖上の任意の位置に４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドが導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持又は改善する。５’－アルキルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体又はキラル的に純粋なＲ若しくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【0169】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－５’結合（２’－Ｈ、２’－ＯＨ及び２’－ＯＭｅ含有及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ含有）を含み得る。例えば、２’－５’結合修飾を使用してヌクレアーゼ耐性を促進するか、若しくはセンス鎖がアンチセンス鎖に結合するのを阻害することができるか、又はセンス鎖の５’末端に使用して、ＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避することができる。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から数えてＮ－１位とＮ－２位との間に２’－５’結合を含む。
【0170】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨ及び２’－ＯＭｅ含有のＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、こうしたＬ糖修飾を使用してヌクレアーゼ耐性を促進するか、若しくはセンス鎖がアンチセンス鎖に結合するのを阻害することができるか、又はセンス鎖の５’末端に使用して、ＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避することができる。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端にＬ糖ヌクレオチドを含む。
【0171】
したがって、センス鎖及びアンチセンスの少なくとも一方は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端から数えて５～１７位、例えば６～１６位、６～１５位、６～１４位、６～１３位、６～１２位、７～１５位、７～１４位、７～１３位、７～１２位、８～１６位、８～１５位、８～１４位、８～１３位、８～１２位、９～１６位、９～１５位、９～１４位、９～１３位、９～１２位、１０～１６位、１０～１５位、１０～１４位、１０～１３位又は１０～１２位に少なくとも１つ、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７つ又はそれを超える２’－デオキシ修飾を含み得る。
【0172】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも３つの２’－デオキシ修飾を含み、ここで、２’－デオキシ修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の２及び１４位にあり、及びセンス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の１１位にある。
【0173】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５つの２’－デオキシ修飾を含み、ここで、２’－デオキシ修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の２、１２及び１４位にあり、及びセンス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の９及び１１位にある。
【0174】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも７つの２’－デオキシ修飾を含み、ここで、２’－デオキシ修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の２、５、７、１２及び１４位にあり、及びセンス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の９及び１１位にある。
【0175】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて２、５、７、１２及び１４位に少なくとも５つの２’－デオキシ修飾を含む。これの一部のさらなる実施形態において、アンチセンス鎖は、長さが１８～２５ヌクレオチド、好ましくは長さが１８～２３ヌクレオチドである。
【0176】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、非天然ヌクレオチドを２０％未満、例えば１５％未満、１０％未満又は５％未満だけ含み得るか、又はｄｓＲＮＡは、非天然ヌクレオチドを含まない。例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、全て天然ヌクレオチドを含む。一部の例示的な非天然ヌクレオチドとしては、限定されないが、非環状ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）及び２’－ａｒａ－Ｆが挙げられる。
【0177】
リガンド
多様な実体が本発明のオリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい部分は、好ましくは共有結合的に、直接的に又は介在テザーを介して間接的にカップリングされたリガンドである。
多様な実体が本発明のオリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい部分は、好ましくは共有結合的に、直接的に又は介在テザーを介して間接的にカップリングされたリガンドである。
【0178】
好ましい実施形態では、リガンドは、それが中に組み込まれる分子の分布、ターゲティング又は寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、選択される標的、例えば分子、細胞若しくは細胞型、区画、受容体、例えば細胞若しくは臓器区画、組織、臓器又は身体領域に対して、例えばかかるリガンドを有しない種と比べて、増強された親和性をもたらす。選択された標的に対して増強された親和性をもたらすリガンドは、標的化リガンドとも称される。
【0179】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性及び膜融合性を示す、ポリアニオンペプチド又はペプチドミメティックであり得る。一部の実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームｐＨでその活性型立体構造を取る。「活性型」立体構造は、エンドソーム溶解リガンドがエンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物若しくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進するような立体構造である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとして、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４－２９７２、その全体が参照により援用される）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１－１５８６、その全体が参照により援用される）及びそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６－６８、その全体が参照により援用される）が挙げられる。一部の実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して、電荷又はプロトン化にて変化を経ることになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム溶解成分は、線状又は分岐状であり得る。
【0180】
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション及び特異性特性を改善し得、また得られる天然又は修飾オリゴリボヌクレオチド或いは本明細書に記載の単量体及び／又は天然若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善し得る。
【0181】
リガンドは、一般に、例えば取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば分布を監視するための診断化合物又はレポーター基；架橋剤；及びヌクレアーゼ耐性を与える部分を含み得る。一般例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン及びペプチド模倣物が挙げられる。
【0182】
リガンドは、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドは、組換え又は合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）でもあり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル－マレイン無水物共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－アクリル酸エチル）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー又はポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩又はαヘリカルペプチドが挙げられる。
【0183】
リガンドは、標的基、例えば細胞又は組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体も含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロトピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチドミメティック又はアプタマーであり得る。表２は、ターゲティングリガンドの幾つかの例及びその関連する受容体を示す。
【0184】
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ又はＡＰが挙げられる。
【0185】
リガンドは、例えば、糖タンパク質などのタンパク質；又は例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；又は例えば癌細胞、内皮細胞又は骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドは、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド化学種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子又はＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。
【0186】
リガンドは、例えば、細胞の微小管、微小繊維及び／又は中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン又はミオセルビンであり得る。
【0187】
リガンドは、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを、例えば炎症性応答を活性化することにより増強し得る。かかる効果を有することになる例示的リガンドは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１β又はγインターフェロンを含む。
【0188】
一態様では、リガンドは、脂質又は脂質に基づく分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば、身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンを使用し得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得、（ｂ）標的細胞又は細胞膜の標的化又はそれへの輸送を増大させ得、及び／又は（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するために使用され得る。
【0189】
例えば、複合体の標的組織への結合を調節するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するために使用され得る。
【0190】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし、親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
【0191】
他の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も脂質ベースのリガンドに代えて又はそれに加えて使用され得る。
【0192】
別の態様では、リガンドは、例えば、増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えば、癌細胞などの悪性又は非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するために特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン又は癌細胞に取り込まれる他のビタミン又は栄養素が挙げられる。またＨＡＳ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及び高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）も挙げられる。
【0193】
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔ又はアンテノペディアなどのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチド又は偽ペプチド結合及びＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性及び疎油性相を有するα－らせん剤である。
【0194】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。ペプチド又はペプチド模倣薬は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド及びタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチド又はペプチドミメティック、例えばファージディスプレイライブラリー又は１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－９４，１９９１、その全体が参照により援用される）から同定されるペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によりコードされ得る。好ましくは、組み込まれた単量体単位を介してｉＲＮＡ剤に繋ぎ止められたペプチド又はペプチドミメティックは、細胞を標的とするペプチド、例えばアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド又はＲＧＤミミックである。ペプチド部分は、約５アミノ酸長～約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増強するか又は立体構造的特性を導くために構造的修飾を有し得る。下記の構造的修飾のいずれかを用いることができる。腫瘍細胞、例えば内皮腫瘍細胞又は乳癌腫瘍細胞を標的とするため、ＲＧＤペプチド部分を用いることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２、その全体が参照により援用される）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓又は肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進し得る（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１、その全体が参照により援用される）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進することになる。ＲＧＤペプチドは、線状又は環状であり得、また特定組織への標的化を促進するため、修飾、例えばグリコシル化又はメチル化がなされ得る。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達し得る（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１、その全体が参照により援用される）。増殖性細胞内に豊富に存在するマーカーを標的にするペプチドを用いることができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチドミメティックは、癌細胞、特にインテグリンを提示する細胞を標的にし得る。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを有する環状ペプチド、Ｄ－アミノ酸を含むＲＧＤペプチド並びに合成ＲＧＤミミックを用いることができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にする他の部分を用いることができる。一般に、増殖性細胞及び血管新生を制御するため、かかるリガンドを用いることができる。このタイプのリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ又は他の癌遺伝子、例えば本明細書に記載の癌遺伝子を標的にする。
【0195】
「細胞透過性ペプチド」は、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞又はヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－らせん直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７又はセクロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシン又はバクテネシン）又は１つ又は２つの主要アミノ酸（例えば、ＰＲ－３９又はインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、二連の両親媒性ペプチド、例えばＭＰＧであり得、それはＨＩＶ－１ ｇｐ４１及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインから誘導される（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３、その全体が参照により援用される）。
【0196】
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α－ヘリカルペプチドであり得る。例示的な両親媒性α－ヘリカルペプチドとして、限定されないが、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．クラバ（Ｓ．Ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸管抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン－２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン－１及びカエリンが挙げられる。らせん安定性の完全性を維持するため、好ましくは幾つかの要素が考慮されることになる。例えば、最大数のらせん安定化残基が用いられることになり（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ又はｌｙｓ）、最小数のらせん不安定化残基が用いられることになる（例えば、プロリン又は環状単量体単位。キャッピング残基が検討されることになり（例えば、Ｇｌｙは例示的なＮ－キャッピング残基であり、且つ／又はさらなるＨ結合を提供し、らせんを安定化するため、Ｃ末端アミド化を用いることができる。ｉ±３又はｉ±４位によって分離された、反対の電荷を有する残基間での塩架橋の形成は、安定性をもたらし得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン又はヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基のグルタミン酸又はアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
【0197】
ペプチド及びペプチドミメティックリガンドは、天然又は修飾ペプチド、例えばＤ又はＬペプチド；α、β又はγペプチド；Ｎ－メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上のアミドを有するペプチド、すなわち結合が１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート又はスルホニル尿素結合と置換されたペプチド；又は環状ペプチドを有するものを含む。
【0198】
標的リガンドは、特定の受容体を標的とする能力がある任意のリガンドであり得る。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、糖のクラスター、例えばＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター又はアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えばアプタマーにも基づき得る。アプタマーは、修飾されないか、又は本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有し得る。
【0199】
エンドソーム放出剤は、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、膜融合ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスク化オリゴ若しくはポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク化若しくは非マスク化カチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク化若しくは非マスク化カチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーを含む。
【0200】
ＰＫ修飾因子は、薬物動態修飾因子を表す。ＰＫ修飾因子は、脂溶性剤、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的なＰＫ修飾因子として、限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。幾つかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質、すなわち短いオリゴヌクレオチド、例えば約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドに結合することも知られており、骨格において複数のホスホロチオエート結合を含むことで、さらにリガンドとして（例えば、ＰＫ調節性リガンドとして）本発明に適する。
【0201】
さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもＰＫ調節性リガンドとして本発明に適する。
【0202】
本発明に適した他のリガンドコンジュゲートは、米国特許出願の、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願公開第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日に出願された米国特許出願公開第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日に出願された米国特許出願公開第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日に出願された米国特許出願公開第１１／１１５，９８９号明細書及び２００７年１１月２１日に出願された米国特許出願公開第１１／９４４，２２７号明細書（あらゆる目的でそれら全体が参照により援用される）に記載されている。
【0203】
２つ以上のリガンドが存在するとき、リガンドは、全部が同じ特性を有する、全部が異なる特性を有するか、又は一部のリガンドが同じ特性を有する一方、その他は異なる特性を有する可能性がある。例えば、リガンドは、標的化特性を有する、エンドソーム溶解活性を有するか、又はＰＫ調節特性を有する可能性がある。好ましい実施形態では、全てのリガンドは、異なる特性を有する。
【0204】
リガンドは、様々な場所、例えば３’末端、５’末端及び／又は内部位置で、オリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば本明細書に記載の担体を介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンド又はテザーリガンドは、単量体上に、前記単量体が伸長鎖に組み込まれるときに存在し得る。一部の実施形態では、リガンドは、前記「前駆体」単量体が伸長鎖に組み込まれた後、「前駆体」単量体へのカップリングを介して組み込まれ得る。例えば、例えばＴＡＰ－（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ終端テザー（すなわち会合されるリガンドを有しない）を有する単量体は、伸長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ得る。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドは、次いでリガンドの求電子基を前駆体単量体のテザーの末端求核基とカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【0205】
別の例では、クリックケミストリー反応への関与に適した化学基、例えばアジド又はアルキン終端テザー／リンカーを有する単量体が組み込まれ得る。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、相補的化学基、例えばアルキン又はアジドを有するリガンドは、アルキン及びアジドを一緒にカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【0206】
二重鎖オリゴヌクレオチドでは、リガンドは、片鎖又は両鎖に結合され得る。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。
【0207】
一部の実施形態では、リガンドは、核酸塩基、糖部分又は核酸分子のヌクレオシド間結合にコンジュゲートされ得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションは、環内及び環外原子を含む、任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位は、コンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションも任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位は、コンジュゲート部分と置換され得る。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で生じ得る。コンジュゲート部分に結合され得る糖部分の炭素原子の例として、２’、３’及び５’炭素原子が挙げられる。１’位も例えば脱塩基残基においてコンジュゲート部分に結合され得る。ヌクレオシド間結合もコンジュゲート部分を有し得る。リン含有結合（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロアミド酸など）では、コンジュゲート部分は、リン原子に直接的に、又はリン原子に結合されたＯ、Ｎ若しくはＳ原子に結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）では、コンジュゲート部分は、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
【0208】
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされる。本明細書に記載のとおり、リガンドは、センス鎖の３’末端、５’末端又は内部位置にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。さらに、リガンドは、センス鎖の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合にコンジュゲートされ得る。
【0209】
ＲＮＡ干渉の分野における任意の好適なリガンドが用いられ得るが、リガンドは、典型的には、炭水化物、例えば単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【0210】
リガンドを核酸にコンジュゲートするリンカーは、上で検討されたものを含む。例えば、リガンドは、一価、二価又は三価分岐リンカーを通して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体であり得る。
【0211】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、二価及び三価分岐リンカーにコンジュゲートされ、式（ＩＶ）～（ＶＩＩ）：
（式中、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、独立に、０～２０の各存在を表し、ここで、反復単位は、同じ又は異なる可能性があり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、それぞれ独立に、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏの各存在を表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立に、不在、アルキレン、置換アルキレンの各存在を表し、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ以上により中断又は終結され得；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、それぞれ独立に、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
又はヘテロシクリルの各存在を表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表す；すなわちそれぞれ独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖又は多糖の各存在を表し；且つ
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である）
のいずれかに示される構造を含む。
【化14】
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、それぞれ独立に、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏの各存在を表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立に、不在、アルキレン、置換アルキレンの各存在を表し、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ以上により中断又は終結され得；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、それぞれ独立に、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
【化15】
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表す；すなわちそれぞれ独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖又は多糖の各存在を表し；且つ
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である）
のいずれかに示される構造を含む。
【0212】
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子、例えば式（ＶＩＩ）：
（式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す）
のものの発現を阻害するための、ＲＮＡｉ剤との併用において特に有用である。
【化16】
のものの発現を阻害するための、ＲＮＡｉ剤との併用において特に有用である。
【0213】
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価分岐リンカー基の例として、限定されないが、以下の化合物：
が挙げられる。
【化17-1】
【化17-2】
【化17-3】
【0214】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、リガンド１、すなわち以下の構造を有するリガンドを含む。
【化18】
【0215】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、米国特許第５，９９４，５１７号明細書又は米国特許第６，９０６，１８２号明細書（これらの各々の内容は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるリガンドを含む。
【0216】
一部の実施形態では、リガンドは、米国特許第６，９０６，１８２号明細書の図３に記載されるトリアンテナ型リガンドであり得る。例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、以下のトリアンテナ型リガンドから選択されるリガンドを含み得る。
【化19】
【0217】
一部の実施形態では、リガンドは、多価リガンド、例えば式（ＶＩＩ）のリガンドである。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば本明細書に開示されるリガンド１～８から選択されるリガンドである。
【0218】
リガンドは、担体を介してｄｓＲＮＡに付着し得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点」、好ましくは２つの「骨格付着点」、及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー係留用付着点」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基を指すか、又は一般にリボ核酸の骨格、例えばリン酸塩骨格又は修飾されたリン酸塩骨格、例えば含硫骨格への担体の取り込みに利用可能であり且つそれに好適な結合を指す。「テザー係留用付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を結び付ける環状担体の構成環原子、例えば炭素原子又はヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザーによって環状担体に結び付けられる。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含むか、又は一般に構成環への別の化学的実体、例えばリガンドの取り込み又はテザー係留に好適な結合を提供することになる。
【0219】
１つの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、担体によってリガンドにコンジュゲートされ、ここで、担体は、環式基又は非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
【0220】
リガンドは、３’末端、５’末端又は両方の末端でセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に付着し得る。例えば、リガンドは、センス鎖、詳細には、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされ得る。
【0221】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドを含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、
など、二価又は三価分岐リンカーを介して付着した１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【化20】
【0222】
一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に付着する。
【0223】
リンカー
本明細書に開示されるコンジュゲートの態様は、１つ以上のリンカー成分を含み得るリンカーを含む。用語「リンカー」は、化合物の２つのパート、例えばＤＶＤ免疫グロブリンをｄｓＲＮＡに結び付ける有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接的な結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位又は一連の原子、例えば置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な連結基、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロ環式基が割り込み得るか、又はそれが末端にあり得；式中、Ｒ１は、水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である）などを含む。
本明細書に開示されるコンジュゲートの態様は、１つ以上のリンカー成分を含み得るリンカーを含む。用語「リンカー」は、化合物の２つのパート、例えばＤＶＤ免疫グロブリンをｄｓＲＮＡに結び付ける有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接的な結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位又は一連の原子、例えば置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な連結基、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロ環式基が割り込み得るか、又はそれが末端にあり得；式中、Ｒ１は、水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である）などを含む。
【0224】
限定なしに、主題のｄｓＲＮＡには、限定されないが、切断可能リンカー及び非切断可能リンカー並びに可逆的リンカー及び不可逆的リンカーを含め、各種のリンカー官能基が含まれ得る。
【0225】
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。切断可能リンカーは、リンカーが一体に保持している２つのパートを遊離させるために、細胞質における還元、リソソーム若しくはエンドソームにおける酸性条件への曝露又は細胞内での特異的酵素（例えばプロテアーゼ）による切断など、標的細胞内部の過程に依存するものである。したがって、切断可能リンカーによれば、標的細胞内部でのインターナリゼーション及びプロセシング後に２つのパートがその元の形態で放出されることが可能となる。切断可能リンカーとしては、限定されないが、酵素（例えば、ペプチドリンカー）；還元条件（例えば、ジスルフィドリンカー）；又は酸性条件（例えば、ヒドラゾン及び炭酸塩）によってその結合を切断できるものが挙げられる。
【0226】
概して、切断可能リンカーは、少なくとも１つの切断可能な連結基を含む。切断可能な連結基は、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞への侵入時、切断され、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、標的細胞において、又は第１の参照状態（例えば、細胞内状態を模倣するか又は表すように選択され得る）下において、又は第２の参照状態（例えば、血液又は血清中に見出される状態を模倣するか又は表すように選択され得る）下において、対象の血液又は血清中よりも少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。
【0227】
切断可能な連結基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部により広く存在しているか、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。かかる分解剤の例として、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性を有しないレドックス剤、例えば細胞内に存在する、酸化若しくは還元酵素又は還元によりレドックス切断可能な連結基を分解し得る還元剤、例えばメルカプタン；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を創出し得る薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することにより酸切断可能な連結基を加水分解又は分解し得る酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。
【0228】
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対して、細胞内平均ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。幾つかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから又は細胞の所望の区画にカチオン性脂質が放出される。
【0229】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば、肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通してカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富む他の細胞型としては、肺、腎皮質及び精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
【0230】
一般に、切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において又は他の非標的組織との接触時、切断に抵抗する能力についても検査することが望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件が他の組織又は例えば血液又は血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１及び第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器又は組織培養中又は全身の動物中で実施し得る。無細胞又は培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（又は細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０又は１００倍より迅速に切断される。
【0231】
切断可能な連結基の１つのクラスは、レドックス切断可能な連結基であり、それは、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、還元又は酸化時に切断される。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に依拠することができる。例えば、候補は、例えば、標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価され得る。好ましい実施形態では、１つの候補化合物は、血中で最大で１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（又は細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０又は約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
【0232】
リン酸に基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤により切断される。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【0233】
酸切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境内において又は一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基又はジメチルペンチル又はｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【0234】
エステルに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、細胞内でエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【0235】
ペプチドに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられ得、細胞内でペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸間に形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間に形成されて、ペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸間に形成されて、ペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【0236】
ｄｓＲＮＡの使用
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。したがって、別の態様では、本明細書には、標的遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。この方法は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを細胞に投与するステップを含む。好ましい実施形態では、本発明は、インビトロで標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの使用にさらに関する。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。したがって、別の態様では、本明細書には、標的遺伝子の発現を阻害する方法が提供される。この方法は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを細胞に投与するステップを含む。好ましい実施形態では、本発明は、インビトロで標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの使用にさらに関する。
【0237】
例示的な標的遺伝子としては、限定されないが、β－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）、ＩＲＦ４、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ－２遺伝子、ヘプシジン、活性化プロテインＣ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ－１遺伝子、β－カテニン遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制遺伝子の突然変異及びｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異が挙げられる。
【0238】
一部の態様では、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、対象又は哺乳類の治療に使用することができる。
【0239】
医薬組成物
治療に使用するため、本明細書に記載されるｄｓＮＲＡは、医薬組成物に製剤化することができる。したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に定義するとおりのｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる組成物は、単独で摂取されるか、又は１つ以上の薬学的に許容できる担体（添加剤）、賦形剤及び／又は希釈剤と一緒に配合される、本明細書に記載のｄｓＲＮＡの１つ以上を治療有効量で含む。
治療に使用するため、本明細書に記載されるｄｓＮＲＡは、医薬組成物に製剤化することができる。したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に定義するとおりのｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる組成物は、単独で摂取されるか、又は１つ以上の薬学的に許容できる担体（添加剤）、賦形剤及び／又は希釈剤と一緒に配合される、本明細書に記載のｄｓＲＮＡの１つ以上を治療有効量で含む。
【0240】
医薬組成物は、固体又は液体形態、例えば（１）経口投与、例えば水薬（水溶液又は非水溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば頬側、舌下及び全身吸収を標的とするもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布のためのペースト剤；（２）例えば、例えば無菌溶液若しくは懸濁液又は徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏剤又は徐放性パッチ若しくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームとして腟内又は直腸内；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；又は（８）経鼻に適応するものでの投与に特化して配合され得る。皮下又は静脈内方法を用いる送達は、特に有利であり得る。
【0241】
語句「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、任意の医学的処置に適用可能な合理的なリスク・ベネフィット比で、少なくとも動物における細胞の亜集団において幾らかの所望される治療効果をもたらすのに有効である、本明細書に記載のコンジュゲートを含む化合物、材料又は組成物の量を意味する。
【0242】
語句「薬学的に許容できる」は、合理的なリスク・ベネフィット比に適う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応又は他の課題若しくは合併症と伴わない、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に含まれる、化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指すように本明細書中で用いられる。
【0243】
語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、対象化合物を１つの臓器又は身体の一部から別の臓器又は身体の一部へ運搬又は輸送することに関与する、薬学的に許容できる材料、組成物又は媒体、例えば液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、マグネシウム、カルシウム又はステアリン酸亜鉛又はステアリン酸）又は溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分に適合しており、且つ患者に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばマグネシウムステート、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク；（８）賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ；並びに（２２）医薬製剤中に用いられる他の無毒性親和性物質が挙げられる。
【0244】
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」には、薬学的投与と適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれることが意図される。薬学的に活性な物質へのかかる媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合でない限り、組成物中へのその使用が企図される。補足的な活性化合物も組成物に配合することができる。医薬担体には、滅菌水溶液又は水分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質へのかかる媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
【0245】
製剤は、便宜上、単位剤形で提示され得、また薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製され得る。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、治療を受けているホスト、特定の投与様式に応じて変動することになる。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらすような化合物の量となる。一般に、１００％中でのこの量は、活性成分が約０．１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲となる。
【0246】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸及び高分子担体、例えばポリエステル及びポリ無水物からなる群から選択される賦形剤；及び本明細書に記載のコンジュゲートを含む。特定の実施形態では、上記製剤は、本明細書に記載のコンジュゲートを経口生体利用可能にする。
【0247】
ｄｓＲＮＡ製剤は、別の薬剤、例えば別の治療薬又はｄｓＲＮＡを安定化する薬剤と組み合わせて配合され得る。さらに他の薬剤として、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広範特異性リボヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【0248】
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明のｄｓＲＮＡを担体、任意選択で１つ以上の付属成分と会合させるステップを含む。一般に、その製剤は、本発明のｄｓＲＮＡを液体担体若しくは微粉化された固体担体又は両方と均一且つ緊密に会合させ、次いで必要な場合、生成物を形成させることにより調製される。
【0249】
場合により、薬剤の効果を延長させるため、皮下又は筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水難溶性を有する結晶質又は非晶質材料の懸濁液の使用により行われ得る。ここで、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで結晶サイズ及び結晶性形態に依存し得る。代わりに、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油媒体に溶解又は懸濁することによって行われる。
【0250】
本発明によるｄｓＲＮＡは、他の医薬品に類似して、ヒト又は動物薬において用いられる任意の便宜的方法での投与のために配合され得る。
【0251】
組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び／又は分散剤などの補助剤も含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順と、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることとの両方によって確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もあり得る。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤を含めることにより、注射用医薬品形態の持続的吸収をもたらすことができる。
【0252】
組成物は、無菌であり、且つシリンジによる組成物の送達が可能な程度に流動性がなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは、等張性緩衝生理食塩溶液である。
【0253】
投与経路
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ又はそれを含む医薬組成物は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者が理解するであろうとおり、投与の経路及び／又は様式は、標的とする疾患又は病態及び所望の結果に応じて変わることになる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを特定の投与経路によって投与するために、その不活性化を防ぐ材料でｄｓＲＮＡをコートするか、又はそれとｄｓＲＮＡとを共投与する必要があり得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤で対象に投与することができる。薬学的に許容できる希釈剤としては、生理食塩水及び緩衝水溶液が挙げられる。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ又はそれを含む医薬組成物は、当技術分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者が理解するであろうとおり、投与の経路及び／又は様式は、標的とする疾患又は病態及び所望の結果に応じて変わることになる。本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを特定の投与経路によって投与するために、その不活性化を防ぐ材料でｄｓＲＮＡをコートするか、又はそれとｄｓＲＮＡとを共投与する必要があり得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤で対象に投与することができる。薬学的に許容できる希釈剤としては、生理食塩水及び緩衝水溶液が挙げられる。
【0254】
例示的な投与経路としては、限定されないが、静脈内、皮下、腫瘍内、局所、直腸、肛門、膣、鼻腔、肺及び眼が挙げられる。
【0255】
本発明の組成物は、局所又は全身治療が所望されるか否かに応じて、また治療されるべき領域に対して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口又は非経口であり得る。非経口投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又はくも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。
【0256】
投与の経路及び部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、筋細胞を標的にするため、目的の筋肉への筋肉内注射であれば、論理的な選択となる。肺細胞であれば、ｄｓＲＮＡをエアロゾル形態で投与することにより標的にされ得る。血管内皮細胞であれば、バルーンカテーテルをｄｓＲＮＡでコーティングし、ｄｓＲＮＡを機械的に導入することにより標的にされ得る。
【0257】
用量
本発明の医薬組成物中における活性成分、例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの実際の用量レベルは、患者にとって毒性のない、特定の患者、組成物及び投与様式に望ましい治療反応を実現するのに有効な活性成分の量が達成されるように変更することができる。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び過去の病歴並びに医学分野で周知の同様の要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存することになる。
本発明の医薬組成物中における活性成分、例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡの実際の用量レベルは、患者にとって毒性のない、特定の患者、組成物及び投与様式に望ましい治療反応を実現するのに有効な活性成分の量が達成されるように変更することができる。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び過去の病歴並びに医学分野で周知の同様の要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存することになる。
【0258】
一部の実施形態では、単位用量は、ｄｓＲＮＡ分子の１０ｍｇ／ｋｇ体重未満又は１０未満、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５若しくは０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重及び２００ｎモル未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）／ｋｇ体重又はｄｓＲＮＡ分子の１５００未満、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎモル／ｋｇ体重である。
【0259】
規定量は、疾患又は障害、例えば標的遺伝子に関連した疾患又は障害を治療又は予防するのに有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内、皮下又は筋肉内）、吸入投与又は局所適用により投与され得る。一部の実施形態では、用量は、１０未満、５、２、１又は０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【0260】
一部の実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない、例えば２、４、８又は３０日ごとよりも少ない頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度（例えば、定期的頻度）で投与されない。例えば、単位用量は、単回投与され得る。
【0261】
一部の実施形態では、有効用量は、他の従来の治療様式で投与される。
【0262】
一部の実施形態では、対象は、初期用量及び１回以上の維持用量を投与される。１回又は複数回の維持用量は、初期用量と同じであるか又は初期用量よりも低い、例えば初期用量よりも半分少ない可能性がある。維持投与計画は、対象を、０．０１μｇ～１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば１０、１、０．１、０．０１、０．００１又は０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の１回又は複数回用量で治療することを含み得る。維持用量は、例えば、２、５、１０又は３０日ごとに１回以下、投与される。さらに、治療計画は、一時期続き得、その期間は、患者の特定疾患の性質、その重症度及び全身状態に応じて変動することになる。特定の実施形態では、その用量は、１日１回以下、例えば２４、３６、４８又はより長時間ごとに１回以下、例えば５又は８日ごとに１回以下送達され得る。治療後、患者は、その状態における変化について、また病態の症状の軽減について監視され得る。その化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに対して有意に応答しない場合に増加され得るか、又はその用量は、病態の症状の軽減が認められる場合、病態が消失している場合若しくは望まれない副作用が認められる場合に低減され得る。
【0263】
有効用量は、所望されるとき又は特定の環境下で適切と考えられるとき、単回用量又は２回以上の用量で投与され得る。反復又は頻回注入を容易にすることが望まれる場合、送達デバイス、例えばポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内又は関節内）又はリザーバーの移植が得策である場合がある。
【0264】
一部の実施形態では、その組成物は、複数のｄｓＲＮＡ分子種を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子種は、天然に存在する標的配列に対して別種と重複せず、またそれらに隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ分子種は、異なる天然に存在する標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、対立遺伝子特異的である。
【0265】
本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、幾つかの方法で哺乳類、特に非ヒト霊長類又はヒトなどの大型哺乳類に投与され得る。
【0266】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの投与は、非経口、例えば静脈内（例えば、ボーラス又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道又は眼内投与である。投与は、対象又は別の人物、例えばヘルスケア提供者によって提供され得る。投薬は、測定用量において又は定量用量を送達する計量分配装置で提供され得る。
【0267】
リポソーム及び脂質製剤
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、膜状分子集合体、例えばリポソーム又はミセルで送達するように製剤化することができる。本明細書で用いられるとき、用語「リポソーム」は、少なくとも１つの二重層、例えば１つの二重層又は複数の二重層状に配置された両親媒性脂質で構成されている小胞を指す。リポソームには、親油性材料で形成された膜と内部水溶液とを有する単層及び多層小胞が含まれる。水溶液部分がｓｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料が内部水溶液を外部水溶液と隔離し、外部水溶液は、典型的にはｄｓＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、活性成分を作用部位に運び、送達するのに有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層が細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との合体が進むにつれ、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含む内部水溶液内容物が細胞中に送達され、そこで、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを媒介することができる。ある場合には、リポソームは、例えば、特定の細胞型とのコンジュゲートを導くため、特異的に標的化もされる。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、膜状分子集合体、例えばリポソーム又はミセルで送達するように製剤化することができる。本明細書で用いられるとき、用語「リポソーム」は、少なくとも１つの二重層、例えば１つの二重層又は複数の二重層状に配置された両親媒性脂質で構成されている小胞を指す。リポソームには、親油性材料で形成された膜と内部水溶液とを有する単層及び多層小胞が含まれる。水溶液部分がｓｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料が内部水溶液を外部水溶液と隔離し、外部水溶液は、典型的にはｄｓＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、活性成分を作用部位に運び、送達するのに有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層が細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との合体が進むにつれ、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含む内部水溶液内容物が細胞中に送達され、そこで、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを媒介することができる。ある場合には、リポソームは、例えば、特定の細胞型とのコンジュゲートを導くため、特異的に標的化もされる。
【0268】
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分がデタージェントに溶解され、そのようにして脂質成分とのミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。デタージェントは、臨界ミセル濃度が高く、非イオン性であり得る。例示的なデタージェントとしては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、脂質成分を含むミセルにｄｓＲＮＡ製剤が加えられる。脂質上のカチオン基がｄｓＲＮＡと相互作用し、ｄｓＲＮＡの周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、デタージェントが例えば透析によって除去されると、ｄｓＲＮＡのリポソーム製剤が生じる。
【0269】
凝縮反応時、必要に応じて、凝縮を促進する担体化合物を例えば制御添加法によって加えることができる。例えば、この担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。ｐＨも、凝縮に有利に作用するように調整することができる。
【0270】
送達媒体の構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を取り込む安定ポリヌクレオチド送達媒体の作製方法についてのさらなる説明は、例えば、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソーム形成には、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４（これらは、全体として参照により援用される）に記載される例示的方法の１つ以上の態様も含まれ得る。送達媒体としての使用に適切なサイズの脂質凝集体の調製によく用いられる技法としては、音波処理及び凍結融解＋押出が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６（これは、全体として参照により援用される）を参照されたい）。一貫して小型の（５０～２００ｎｍ）且つ比較的均一な凝集体が所望される場合、マイクロ流体技術を用いることができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４、これは、全体として参照により援用される）。これらの方法は、リポソームへのｓｉＲＮＡ製剤の封入に容易に応用される。
【0271】
ｐＨ感受性のある又は負電荷のリポソームは、核酸分子と複合体化するというよりむしろそれを捕捉する。核酸分子及び脂質は、両方とも電荷が同様であるため、複合体形成よりむしろ斥力が起こる。それにも関わらず、一部の核酸分子は、こうしたリポソームの内部水溶液内に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層に送達するために用いられている。標的細胞でこの外因性遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）２６９－２７４、これは、全体として参照により援用される）。
【0272】
主要な種類のリポソーム組成物の１つには、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から中性リポソーム組成物を形成することができる。一般には、アニオン性リポソーム組成物がジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、アニオン性膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ及び卵ＰＣなど、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から別の種類が形成される。
【0273】
インビトロでリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【0274】
一部の実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜と融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、形質膜と効率的に融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、マクロファージへのｓｉＲＮＡの送達に使用することができる。
【0275】
リポソームのさらなる利点として、天然リン脂質から得られたリポソームが生体適合性且つ生分解性であること；リポソームが広範囲の水及び脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、その内部区画において、封入されたｓｉＲＮＡを代謝及び分解から保護できることが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な点は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ及び水溶液容積である。
【0276】
正電荷合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用すると、核酸と自発的に相互作用して脂質－核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負電荷脂質と融合する能力があるため、ｓｉＲＮＡの送達がもたらされる（ＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７及び米国特許第４，８９７，３５５号明細書（これは、全体として参照により援用される）を参照されたい）。
【0277】
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用すると、ＤＮＡ複合体化小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）は、負電荷ポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正電荷ＤＯＴＭＡリポソームを含む組織培養生細胞に、高度にアニオン性の核酸を送達するのに有効な薬剤である。十分な正電荷のリポソームが使用されるとき、得られる複合体の正味電荷も正である。このようにして調製された正電荷複合体は、負電荷の細胞表面に自発的に付着し、形質膜と融合して、例えば組織培養細胞に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）は、ＤＯＴＭＡと異なり、オレオイル部分がエーテル結合でなく、むしろエステル結合によって連結されている。
【0278】
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、例えば、２種類の脂質の一方にコンジュゲートされている、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）などの化合物を含むカルボキシスペルミンを含め、種々の部分にコンジュゲートされているものが挙げられる。
【0279】
別のカチオン性脂質コンジュゲートとしては、コレステロールによる脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）が挙げられ、これは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されている（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作られるリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１、これは、全体として参照により援用される）。特定の細胞株について、コンジュゲート型カチオン性脂質を含有するこうしたリポソームの方がＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を呈し、高いトランスフェクション効率をもたらすと言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。
【0280】
リポソーム製剤は、特に局所投与に適している。リポソームは、他の製剤を上回る幾つかの利点を呈する。かかる利点としては、投与薬物の高い全身性吸収に関連する副作用の低下、所望の標的における投与薬物の蓄積の増加及びｓｉＲＮＡを皮膚に投与可能であることが挙げられる。一部の実装形態では、リポソームを使用することにより、ｓｉＲＮＡを表皮細胞に送達し、また皮膚組織、例えば皮膚へのｓｉＲＮＡの浸透を増強する。例えば、リポソームは局所適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達は、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０及びｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７（これらは、全体として参照により援用される）を参照されたい）。
【0281】
非イオン性リポソームシステム、詳細には非イオン性界面活性剤とコレステロールとを含むシステムも、皮膚への薬物の送達におけるその有用性を判定しようと調査されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚の真皮に薬物が送達されている。ｓｉＲＮＡを含むかかる製剤は、皮膚科学的障害の治療に有用である。
【0282】
本明細書に記載されるコンジュゲートを含むリポソームは、高度に変形し易くすることができる。かかる変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい細孔を通したリポソームの透過を可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形能のあるリポソームの一種である。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤、通常、界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に加えることによって作成され得る。ｓｉＲＮＡを皮膚のケラチノサイトに送達するために、ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームを例えば感染によって皮下に送達することができる。哺乳類のインタクトな皮膚を越えるために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下でそれぞれ直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通り抜けなければならない。加えて、脂質特性に起因して、こうしたトランスファーソームは、自己最適化性であり（例えば皮膚にある細孔の形状に適応できる）、自己修復性であり、断片化することなくその標的に高頻度で到達することができ、且つ多くの場合に自己負荷性であり得る。
【0283】
本発明に適している他の製剤については、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００７／０８０３３１号明細書も、本発明に適した製剤について記載している。
【0284】
界面活性剤。界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソーム（上記を参照されたい）など、製剤に広い応用性を見出す。コンジュゲート製剤は、界面活性剤を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤化される。天然及び合成の両方の多くの異なる種類の界面活性剤の特性を分類し及び等級分けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を用いることによるものである。親水基の性質は、製剤中に使用される種々の界面活性剤を区分する最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【0285】
界面活性剤分子がイオン化しない場合、それは、非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬製品に広い応用性があり、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル類、プロピレングリコールエステル類、グリセリルエステル類、ポリグリセリルエステル類、ソルビタンエステル類、スクロースエステル類及びエトキシ化エステル類などの非イオン性エステル類が挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート類、プロポキシ化アルコール類及びエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミド類及びエーテル類もこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの中で最もよく知られているメンバーである。
【0286】
界面活性剤分子が水への溶解又は分散時に負電荷を有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド類、アルキル硫酸塩及びエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル類、アルキルベンゼンスルホン酸塩などのスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウリン酸塩及びスルホコハク酸塩及びリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの中で最も重要なメンバーは、アルキル硫酸塩及び石鹸である。
【0287】
界面活性剤分子が水への溶解又は分散時に正電荷を有する場合、その界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性としては、第４級アンモニウム塩及びエトキシ化アミン類が挙げられる。第４級アンモニウム塩は、このクラスの中で最もよく使用されているメンバーである。
【0288】
界面活性剤分子が正電荷又は負電荷のいずれも有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、Ｎ－アルキルベタイン類及びホスファチド類が挙げられる。
【0289】
薬物製品、製剤及びエマルションにおける界面活性剤の使用については、レビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【0290】
ミセル及び他の膜状製剤。本明細書に記載されるコンジュゲートを含む製剤は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、分子の疎水性部分が全て内側に向き、親水性部分が周囲の水相と接触した状態に置かれているような球状構造状に両親媒性分子が配置されている特定の種類の分子集合体として定義される。環境が疎水性の場合、逆の配置が存在する。
【0291】
経皮膜を通した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物を混合することにより調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、薬学的に許容できるヒアルロン酸塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート類、モノラウレート類、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容できる塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル類及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル類及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩及びこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその添加後に加えられ得る。混合ミセルは、これらの成分の実質的にあらゆる種類の混合で、但し小型のミセルをもたらすために激しく混合することで形成されることになる。
【0292】
１つの方法では、本明細書に記載されるコンジュゲートと、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、この第１のミセル組成物を少なくとも３つのミセル形成化合物と混合すると、混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、本明細書に記載されるコンジュゲートと、アルカリ金属アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物の少なくとも１つとを混合し、続いて残りのミセル形成化合物を激しく混合しながら加えることにより、ミセル組成物が調製される。
【0293】
製剤を安定化させ、細菌増殖を防ぐため、混合ミセル組成物にフェノール及び／又はｍ－クレゾールを加え得る。代わりに、フェノール及び／又はｍ－クレゾールは、ミセル形成成分と共に加えられ得る。グリセリンなどの等張剤も混合ミセル組成物の形成後に加えられ得る。
【0294】
ミセル製剤を噴霧剤として送達するため、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴射剤が装填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー内では液体形態である。これらの成分の比率は、水相及び噴射剤相が一体となるように、すなわち相が１つであるように調整される。２つの相がある場合、内容物の一部を例えば定量弁から分注する前に、ディスペンサーを振盪する必要がある。分注用量の医薬品は、定量弁から微細噴霧として噴射される。
【0295】
噴射剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。
【0296】
必須成分の具体的な濃度は、比較的単純な実験により決定することができる。経口吸収には、多くの場合、注射又は経胃腸管的投与による際の用量を増量する、例えば少なくとも２倍又は３倍にすることが望ましい。
【0297】
粒子。一部の実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートは、粒子、例えばマイクロパーティクルに取り込むことができる。マイクロパーティクルは噴霧乾燥によって作製し得るが、また凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥又はこれらの技法の組み合わせを含めた他の方法によって作製され得る。
【0298】
キット
本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含むキットも提供する。
本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡを含むキットも提供する。
【0299】
本態様のいずれか１つの例示的な実施形態は、以下のとおり記載することができる。
【0300】
実施形態１：センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、ｄｓＲＮＡ分子は、ヘキソピラノースヌクレオシドを含み、及びｄｓＲＮＡは、リガンドを含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子。
【0301】
実施形態２：センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドを含むか、又はセンス鎖は、センス鎖の中央領域に少なくとも１つのアルトリトールヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【0302】
実施形態３：センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドと、少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドと、少なくとも１つの２’－ＯＭｅヌクレオチドとを含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【0303】
実施形態４：センス鎖及びアンチセンス鎖であって、各鎖は、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な標的配列との相補性を有し、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヘキソピラノースヌクレオシドを含み、及びｄｓＲＮＡは、少なくとも４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、二本鎖ＲＮＡ分子。
【0304】
実施形態５：アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0305】
実施形態６：アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて３～８位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0306】
実施形態７：アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６、７、９、１２、１６、２１及び２２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0307】
実施形態８：アンチセンス鎖は、６、７及び１６位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態７の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0308】
実施形態９：アンチセンス鎖は、６及び７位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態８の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0309】
実施形態１０：アンチセンス鎖は、７位にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態９の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0310】
実施形態１１：センス鎖は、少なくとも２つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0311】
実施形態１２：センス鎖は、少なくとも３つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0312】
実施形態１３：センス鎖は、センス鎖の中央領域にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0313】
実施形態１４：センス鎖は、３及び１２位の少なくとも１つにヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0314】
実施形態１５：アンチセンス鎖は、少なくとも２つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0315】
実施形態１６：アンチセンス鎖は、少なくとも３つ以上の連続する独立に選択されるヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0316】
実施形態１７：センス鎖は、センス鎖の５’末端にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0317】
実施形態１８：センス鎖は、センス鎖の５’末端にヘキソピラノースヌクレオシドを含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0318】
実施形態１９：センス鎖は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）基を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0319】
実施形態２０：ヘキソピラノースヌクレオチドは、アロピラノースヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、グルコピラノースヌクレオチド、マンノピラノースヌクレオチド、グロピラノースヌクレオチド、イドピラノースヌクレオチド、ガラクトピラノースヌクレオチド、タロピラノースヌクレオチド、フコピラノースヌクレオチド、ラムノピラノースヌクレオチド、キノボピラノースヌクレオチド、ニューモピラノースヌクレオチド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0320】
実施形態２１：ヘキソピラノースヌクレオチドは、アルトリトールヌクレオチド、グルコピラノースヌクレオチド、マンノピラノースヌクレオチド、ガラクトピラノースヌクレオチド、フコピラノースヌクレオチド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0321】
実施形態２２：リガンドを含む、実施形態２～２１のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0322】
実施形態２３：リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである、実施形態１又は２２に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0323】
実施形態２４：ＡＳＧＰＲリガンドは、
である、実施形態２３に記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【化21】
【0324】
実施形態２５：センス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0325】
実施形態２６：センス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間並びに２位及び３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0326】
実施形態２７：アンチセンス鎖は、１、２、３又は４つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0327】
実施形態２８：アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0328】
実施形態２９：アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１位及び２位間、ヌクレオチド位置２位及び３位間、ヌクレオチド位置２１位及び２２位間並びにヌクレオチド位置２２位及び２３位間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0329】
実施形態３０：センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立に、１９～２５ヌクレオチド長である、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0330】
実施形態３１：センス鎖は、２１ヌクレオチド長である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0331】
実施形態３２：アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0332】
実施形態３３：センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、及びアンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0333】
実施形態３４：アンチセンス鎖の３’末端に一本鎖オーバーハングを含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0334】
実施形態３５：アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0335】
実施形態３６：ヘキソピラノースヌクレオチドと相補的な位置に２’－フルオロ又は２’－ＯＭｅヌクレオチドを含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0336】
実施形態３７：ヘキソピラノース、２’－フルオロ及び２－ＯＭｅヌクレオチド以外のヌクレオチドを含まない、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0337】
実施形態３８：非環状ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－ａｒａ－Ｆ及び２’－デオキシからなる群から選択されるヌクレオチドを含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0338】
実施形態３９：センス鎖は、５’末端に５’－モルホリノ修飾、５’－ジメチルアミノ修飾、５’－デオキシ修飾、逆位脱塩基修飾又は逆位脱塩基ロックド核酸修飾を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0339】
実施形態４０：約４０℃～約８０℃の範囲の融解温度を有する、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡ分子。
【0340】
実施形態４１：単独で又は薬学的に許容できる担体若しくは賦形剤と組み合わせて、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【0341】
実施形態４２：実施形態１～４０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ分子を含む遺伝子サイレンシングキット。
【0342】
実施形態４３：細胞における標的遺伝子をサイレンシングする方法であって、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入するステップを含む方法。
【0343】
実施形態４４：ｄｓＲＮＡ剤は、皮下投与又は静脈内投与を通して投与される、実施形態４３に記載の方法。
【0344】
実施形態４５：細胞における標的遺伝子をサイレンシングする方法であって、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のｄｓＲＮＡ分子を細胞に発現させるステップを含む方法。
【0345】
幾つかの選択された定義
便宜上、ここで、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここにまとめる。特に定めがない限り又は文脈上黙示的でない限り、以下の用語及び語句は、下記に提供する意味を含む。特に明示的な定めがない限り又は文脈上明らかでない限り、下記の用語及び語句は、その用語又は語句が関連する技術分野において既に獲得している意味を除外しない。これらの定義は、特定の実施形態の説明を補助するために提供され、特許請求される本発明を限定することを意図されず、なぜなら、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。さらに、文脈上特に必要がない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
便宜上、ここで、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここにまとめる。特に定めがない限り又は文脈上黙示的でない限り、以下の用語及び語句は、下記に提供する意味を含む。特に明示的な定めがない限り又は文脈上明らかでない限り、下記の用語及び語句は、その用語又は語句が関連する技術分野において既に獲得している意味を除外しない。これらの定義は、特定の実施形態の説明を補助するために提供され、特許請求される本発明を限定することを意図されず、なぜなら、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。さらに、文脈上特に必要がない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
【0346】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において任意の公知の方法、装置及び材料を使用し得るが、ここで、この関連で方法、装置及び材料が記載される。
【0347】
さらに、本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の技能の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を利用し得る。かかる技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７及び定期的更新版）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）などの文献に十分に説明されている。
【0348】
値の範囲が提供される場合、文脈上特に明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１に至るまでの、その範囲の上限と下限との間にある各中間値及びその指定範囲にある任意の他の指定される値又は中間値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、そのより小さい範囲に含まれ得ると共に、それらも、指定範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として本発明の範囲内に包含される。指定範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【0349】
特定の範囲は、本明細書では、数値の前に用語「約」を付けて提供される。用語「約」は、本明細書では、それが前に付く数字そのもの並びにこの用語が前に付く数字に近い又は近似的にその数字である数字に文字による裏付けを与えるために使用される。ある数字が、具体的に記載されている数字に近いか又は近似的にその数字であるかどうかを決める際、その記載されていない近い又は近似の数字は、それが提示される文脈上、具体的に記載されている数字の実質的に均等物を提供する数字であり得る。
【0350】
本明細書で用いられるとき、用語「含んでいる」又は「含む」は、必須であるか否かに関わらず、本発明にとって必須の、しかし特定されていない要素が含まれる余地がある組成物、方法及びそのそれぞれの１つ又は複数の構成要素に関連して使用される。
【0351】
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「又は」は、文脈上特に明確に指示されない限り、「及び」を含むことが意図される。さらに、特許請求の範囲は、いずれの任意選択の要素も除外するように作成され得ることが注記される。そのため、この規定は、特許請求の範囲の要素の記載に関連した、「もっぱら」、「のみ」などのような排他的用語法の使用又は「否定的な」限定の使用の際の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【0352】
本明細書で用いられるとき、用語「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」及び「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる薬剤を指して同義的に使用される。便宜上、かかるｍＲＮＡは、本明細書では、サイレンシングしようとするｍＲＮＡとも称される。かかる遺伝子は、標的遺伝子とも称される。一般に、サイレンシングしようとするＲＮＡは、内因性遺伝子、外因性遺伝子又は病原体遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ及びウイルスＲＮＡも標的化され得る。
【0353】
本明細書で用いられるとき、表現「ＲＮＡｉを媒介する」は、標的遺伝子、例えばｍＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする能力を指す。理論によって拘束されることを望むものではないが、サイレンシングとは、ＲＮＡｉ機構又は過程と、ガイドＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖であって、２１～２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖とを用いるものであると考えられる。
【0354】
本明細書で用いられるとき、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定した特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性があることを指し示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下、すなわちアッセイ若しくは治療的処置の場合には生理的条件下又はインビトロアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下において、非標的配列とのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が必要である。非標的配列は、典型的には、少なくとも５ヌクレオチドが異なる。
【0355】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡに対して、その標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をｄｓＲＮＡ分子がサイレンシングするように「十分に相補的」である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡと「正確に相補的」であり、例えば標的ＲＮＡとｄｓＲＮＡ二重鎖剤とがアニールして、例えば正確な相補性の領域においてワトソン・クリック塩基対のみで作られるハイブリッドを形成する。「十分に相補的」な標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡと正確に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に見分ける。この場合、ｄｓＲＮＡ分子は、単一ヌクレオチドの違い（例えば、それから７ヌクレオチド以内の）領域に正確な相補性が見出される場合に限り、ＲＮＡｉを媒介する。
【0356】
本明細書で用いられるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、長さ１００、２００、３００又は４００ヌクレオチド未満の核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。
【0357】
用語「ＢＮＡ」は、架橋核酸を指し、多くの場合、拘束されたＲＮＡ又は接触不可能なＲＮＡと称される。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’－ｅｎｄｏ糖のパッカリングを有する５員、６員又はさらに７員架橋構造を含み得る。この架橋は、典型的には、リボースの２’位、４’位に取り込まれ、２’，４’－ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ又はＥＮＡ）をもたらす。ＢＮＡヌクレオチドの例としては、以下のヌクレオシドが挙げられる。
【化22】
【0358】
用語「ＬＮＡ」は、ロックド核酸を指し、多くの場合、拘束されたＲＮＡ又は接触不可能なＲＮＡと称される。ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、同じリボース糖の２’ヒドロキシルを４’炭素に結び付ける追加の架橋（例えば、メチレン架橋又はエチレン架橋）で修飾されている。例えば、この架橋は、リボースを３’－ｅｎｄｏ Ｎｏｒｔｈ）配座に「ロック」することができる。
【化23】
【0359】
用語「ＥＮＡ」は、エチレン架橋型核酸を指し、多くの場合、拘束されたＲＮＡ又は接触不可能なＲＮＡと称される。
【0360】
「切断部位」は、本明細書では、ｉＲＮＡ剤を利用することによりＲＩＳＣ機構によって切断される標的遺伝子中又はセンス鎖中の主鎖連結基を意味する。また、標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも１つ又は少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖について、切断部位は、センス鎖自体がＲＮＡｉ機構によって切断しようとする標的であった場合に切断を受けたであろうセンス鎖中の主鎖連結基である。切断部位は、当技術分野で公知の方法、例えばＳｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２，１７３－１７８（これは、全体として参照により援用される）に詳述されるとおりの５’－ＲＡＣＥアッセイを用いて決定することができる。当技術分野においてよく理解されているとおり、２つの２１ヌクレオチド長鎖（ここで、これらの鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する１９連続塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む標準的な二本鎖ＲＮＡｉ剤の切断部位領域、切断部位領域は、センス鎖の５’末端からの９～１２位に対応する。
【0361】
用語「減少した」、「低下した」、「低下」又は「阻害」の全ては、本明細書では、統計的に有意な量の減少を意味して使用される。一部の実施形態では、「低下する」、「低下」又は「減少する」又は「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば所与の治療がない場合）と比較したときの少なくとも１０％の減少を意味し、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれを超える減少を含み得る。本明細書で用いられるとき、「低下」又は「阻害」は、参照レベルと比較したときの完全な阻害又は低下を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較したときの１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害がない個体についての正常範囲内として一般に認められているレベルにまで下がり得る。
【0362】
本明細書で用いられるとき、鎖の「中央領域」は、鎖の５’末端から数えて８～１６位、例えば８～１５位、８～１４位、８～１３位、８～１２位、９～１６位、９～１５位、９～１４位、９～１３位、９～１２位、１０～１６位、１０～１５位、１０～１４位、１０～１３位又は１０～１２位を指す。例えば、鎖の中央領域は、鎖の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６位を意味する。センス鎖の好ましい中央領域は、センス鎖の５’末端から数えて８、９、１０、１１、１２、１３及び１４位である。センス鎖のより好ましい中央領域は、センス鎖の５’末端から数えて１０、１１、１２及び１３位である。アンチセンス鎖の好ましい中央領域は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６位である。アンチセンス鎖のより好ましい中央領域は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１０、１１、１２、１３、１４及び１５位である。
【0363】
用語「特異的結合」、又は「～に特異的に結合する」、又は「～に特異的な」は、免疫グロブリンによる特定のポリペプチド、ペプチド又は他の標的（例えば糖タンパク質標的）上の標的抗原、例えばエピトープへの結合など、結合部分による結合標的への結合を指し、非特異的相互作用（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミン又はカゼインへの結合であり得る）と測定可能な差がある結合を意味する。特異的結合は、例えば、結合部分又は免疫グロブリンによる標的分子への結合を対照分子への結合と比較して決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的と同様の対照分子、例えば過剰量の非標識標的との競合によって決定し得る。この場合、標識した標的によるプローブへの結合が過剰量の非標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が指示される。用語「特異的結合」、又は「～に特異的に結合する」、又は「～に特異的な」は、本明細書で用いられるとき、例えば少なくとも約２００ｎＭ、代わりに少なくとも約１５０ｎＭ、代わりに少なくとも約１００ｎＭ、代わりに少なくとも約６０ｎＭ、代わりに少なくとも約５０ｎＭ、代わりに少なくとも約４０ｎＭ、代わりに少なくとも約３０ｎＭ、代わりに少なくとも約２０ｎＭ、代わりに少なくとも約１０ｎＭ、代わりに少なくとも約８ｎＭ、代わりに少なくとも約６ｎＭ、代わりに少なくとも約４ｎＭ、代わりに少なくとも約２ｎＭ、代わりに少なくとも約１ｎＭ又はそれより強いＫｄを有する分子によって示され得る。特定の例では、用語「特異的結合」は、ある分子が実質的にいかなる他の分子にも結合することなく特定の標的分子に結合する結合を指す。
【0364】
「結合親和性」は、分子（例えば、免疫グロブリン）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、結合対（例えば、免疫グロブリンと抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれより強いことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、概して抗原への結合が遅く、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は、概して抗原への結合が速く、より長く結合し続ける傾向がある。当技術分野では、結合親和性を測定する種々の方法が公知である。
【0365】
本明細書で用いられるとき、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、免疫グロブリンと標的の対に適切な技法により、例えば表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えばＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００又はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を２５℃で固定化抗原ＣＭ５チップと共に用いて測定される解離定数を指す。
【0366】
「治療すること」又は「治療」は、治療的処置及び予防的又は防御的措置の両方を指し、ここで、目的は、標的とする病的状態又は障害を防ぐこと又は遅らせる（減らす）ことである。例えば、対象又は哺乳類は、治療量の本明細書に記載されるコンジュゲートの投与を受けた後、癌細胞数の低下又は癌細胞の欠如；腫瘍サイズの低下；軟部組織及び骨への癌の広がりを含めた、末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわちそれをある程度遅らせる、好ましくは止めること）；腫瘍転移の阻害（すなわちそれをある程度遅らせる、好ましくは止めること）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連する症状の１つ以上のある程度の軽減；罹患率及び／又は死亡率の低下及びクオリティオブライフの改善の１つ以上の観察可能及び／又は測定可能な低下又はその欠如が対象に見られる場合、癌が成功裏に「治療される」。一部の実施形態では、「治療すること」又は「治療」は、治療的処置を指す。
【0367】
本明細書で用いられるとき、「対象」は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル及びマカク、例えばアカゲザルが含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが含まれる。家畜及び狩猟動物には、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科動物種、例えばイエネコ、イヌ科動物種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ及び魚類、例えばマス、ナマズ及びサケが含まれる。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「個体」、「患者」及び「対象」は、本明細書では同義的に使用される。
【0368】
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又は雌ウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、有利には、癌の動物モデルに相当する対象として用いることができる。対象は、雄又は雌であり得る。
【0369】
対象は、治療が必要な病態（例えば癌）又はかかる病態に関連する１つ以上の合併症と以前に診断されているか、又はそれに罹患しているか若しくはそれを有すると同定されている対象であって、任意選択で、癌又は癌に関連する１つ以上の合併症に対する治療を既に受けたことがある対象であり得る。代わりに、対象は、癌又は癌に関連する１つ以上の合併症を有するとの診断をそれまで受けたことがない対象でもあり得る。例えば、対象は、癌又は癌に関連する１つ以上の合併症の１つ以上のリスク因子を呈する対象であるか、又はリスク因子を呈しない対象であり得る。
【0370】
特定の病態に対する治療を「必要としている対象」は、その病態を有する対象、その病態を有すると診断された対象又はその病態を発症するリスクがある対象であり得る。
【0371】
本開示を読むと当業者に明らかであろうとおり、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく他の幾つかの態様のいずれかの特徴と容易に分離するか又は組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。記載されるいずれの方法も、記載されるイベント順又は論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
【0372】
本発明は、以下の例によってさらに例示され、これらの例は、さらなる限定と解釈されてはならない。本願全体を通して引用される全ての参考文献、係属中の特許出願及び公開特許の内容は、本明細書によって参照により明示的に援用される。
【実施例】
【0373】
実施例１：アルトリトール修飾ｓｉＲＮＡ：インビトロ及びインビボＲＮＡｉ活性並びに構造研究
天然ＲＮＡヌクレオチドには、Ｃ３’－ｅｎｄｏ配座をとってＡ型二重鎖を形成するリボース糖が含まれる。興味深いことに、リボース糖を６員環アルトリトール糖に置き換えたとき、得られるオリゴヌクレオチド（アルトリトール核酸又はＡＮＡと呼ばれる）の骨格は、Ａ型の幾何学的構造を維持している。したがって、ＡＮＡは、ＲＮＡ類似体と考えられ、ＲＮＡの幾何学的構造が保たれる必要がある場合に有用な適用が見出され得る。本研究では、本発明者らは、本来、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡ化学修飾によって完全に修飾されるものである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖の修飾としてのＡＮＡを調べた。このｓｉＲＮＡは、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）遺伝子の発現をサイレンシングするように設計し、ヘパトサイトへの標的化した送達のためＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）にコンジュゲートした。親二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖に沿ってＡＮＡ修飾の単一ヌクレオチド位置ウォークを実施し、得られた修飾二重鎖がインビトロでＴｔｒ ｍＲＮＡを標的化するその潜在的能力をスクリーニングした。この分析により、予想外且つ意外にも、ＡＮＡがシード領域、特にアンチセンス鎖の６及び７位に良好に適応することが明らかになった。対応する二重鎖もルシフェラーゼレポーターアッセイで良好なオン及びオフターゲット活性を示した。最後に、シード領域中のアンチセンス鎖の７位にＡＮＡを有する二重鎖は、インビボでＲＮＡｉ活性を維持し、オリゴヌクレオチドの５’末端にＡＮＡを取り込むと、５’－エキソヌクレアーゼに対する安定性に起因して代謝安定性が向上することが示された。
天然ＲＮＡヌクレオチドには、Ｃ３’－ｅｎｄｏ配座をとってＡ型二重鎖を形成するリボース糖が含まれる。興味深いことに、リボース糖を６員環アルトリトール糖に置き換えたとき、得られるオリゴヌクレオチド（アルトリトール核酸又はＡＮＡと呼ばれる）の骨格は、Ａ型の幾何学的構造を維持している。したがって、ＡＮＡは、ＲＮＡ類似体と考えられ、ＲＮＡの幾何学的構造が保たれる必要がある場合に有用な適用が見出され得る。本研究では、本発明者らは、本来、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡ化学修飾によって完全に修飾されるものである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖の修飾としてのＡＮＡを調べた。このｓｉＲＮＡは、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）遺伝子の発現をサイレンシングするように設計し、ヘパトサイトへの標的化した送達のためＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）にコンジュゲートした。親二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖に沿ってＡＮＡ修飾の単一ヌクレオチド位置ウォークを実施し、得られた修飾二重鎖がインビトロでＴｔｒ ｍＲＮＡを標的化するその潜在的能力をスクリーニングした。この分析により、予想外且つ意外にも、ＡＮＡがシード領域、特にアンチセンス鎖の６及び７位に良好に適応することが明らかになった。対応する二重鎖もルシフェラーゼレポーターアッセイで良好なオン及びオフターゲット活性を示した。最後に、シード領域中のアンチセンス鎖の７位にＡＮＡを有する二重鎖は、インビボでＲＮＡｉ活性を維持し、オリゴヌクレオチドの５’末端にＡＮＡを取り込むと、５’－エキソヌクレアーゼに対する安定性に起因して代謝安定性が向上することが示された。
【0374】
新規医薬の開発における低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の多大な可能性は、遺伝性トランスサイレチン媒介性アミロイドーシスの多発ニューロパチーの治療用のファーストインクラス薬物であるＯｎｐａｔｔｒｏ（登録商標）の成功から明白である１。多くの他のｓｉＲＮＡが初期～後期臨床試験で評価されているところである２。ｓｉＲＮＡは、所与の目的遺伝子の発現のサイレンシングのために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる天然の遺伝子調節機構を利用する３、４。天然ＲＮＡヌクレオチドで構成されるｓｉＲＮＡは、急速な酵素分解を受け易く、全身投与したときに標的器官への到達が容易でない。したがって、治療適用には、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡを使用する必要がある５。２’－デオキシ－２’－フルオロ－（２’－Ｆ ＲＮＡ、図１ｂ）６、７及び２’－Ｏ－メチル－（２’－ＯＭｅ ＲＮＡ、図１ｂ）ＲＮＡ修飾は、天然のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と適合性があり、ｓｉＲＮＡを安定化させるために広く使用されている。ホスホロチオエート結合を戦略的に配置し、且つＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドにコンジュゲートした２’－Ｆ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡで構成されるｓｉＲＮＡが臨床で研究中である８。本発明者らは、効力があり且つ安全なｓｉＲＮＡを作成するため、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡと相乗作用的に用いることができる幾つものさらなる化学修飾ヌクレオチドを調査してきた９～１２。例えば、本来、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡで完全に修飾されているｓｉＲＮＡのシード領域にグリコール核酸（ＧＮＡ）を合理的に使用すると、シード媒介性オフターゲット毒性が低下し得る１０、１２。同様に、センス鎖に５’－モルホリノ－２’－ＯＭｅ ＲＮＡヌクレオチドを置くと、ＲＮＡｉ活性を向上させることができる９一方、４’－Ｃ－メトキシ－２’－デオキシ－２’－フルオロウリジンは、遺伝子サイレンシングを維持しつつ代謝安定性を向上させることができる１３。このように、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡ修飾と相乗作用的に修飾ヌクレオチドを用いる戦略は、有効性及び特異性が向上したｓｉＲＮＡを作成するためのバリデートされた手法である。
【0375】
アルトリトール核酸（ＡＮＡ）は、２’－（Ｓ）－位に核酸塩基及び３’－位にヒドロキシル基を有する６員環糖を有する（図１）１４、１５。ＡＮＡは、Ｎ型フラノース糖を模倣する予め組織化された構造を有する一方、３’－位のヒドロキシル基の存在は、水和による二重鎖の安定化に寄与する。ＡＮＡは、ＲＮＡ様（Ａ型の幾何学的構造であるため、ＲＮＡ様構造の維持が有利となるｓｉＲＮＡへの取り込みに好適な候補となる。ＡＮＡ修飾ｓｉＲＮＡは、評価されており、非修飾ｓｉＲＮＡと比較してＲＮＡｉ活性が良好であることが明らかとなっている１６～１９。しかしながら、他の修飾ヌクレオチド／リガンドと相乗的に使用したときにＡＮＡがどのように振る舞うかは、依然として不明である。これに関連して、本発明者らは、ＡＮＡ、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡヌクレオチドで修飾したｓｉＲＮＡ二重鎖のインビトロ及びインビボ遺伝子サイレンシング活性を初めて提示する。ＡＮＡがオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に存在するときの核酸分解からの保護に与える影響も評価する。ＡＮＡ－Ａ残基が取り込まれたＲＮＡ八量体二重鎖の結晶構造を２Å分解能で決定した。本発明者らは、ＡＮＡヌクレオチドが位置特異的に取り込まれたＲＮＡのそれぞれ有利な活性及び代謝安定性を合理的に説明する補助となるように、アルゴノート２（Ａｇｏ２）に結合したＡＮＡ修飾を７位に有するｓｉＲＮＡガイド鎖及びＸｒｎ１ ＲＮＡ ５’－エキソヌクレアーゼに結合した２つの５’末端ＡＮＡ－Ｕ残基を有するＲＮＡのモデルも構築した。
【0376】
材料及び方法
オリゴヌクレオチド合成：既発表のプロトコル１２に従い、但し脱トリチル化にはＣＨ２Ｃｌ２中３％トリクロロ酢酸を使用して、ＡＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを入手した。簡潔に言えば、オリゴヌクレオチドの全ては、ＡＢＩ ３９４又はＭｅｒＭａｄｅ １９２シンセサイザーにおいて１μｍｏｌ規模で汎用又はカスタムの支持体を使用して調製した。ＡＢＩには、全てのホスホラミダイトを１００％アセトニトリル又は９：１アセトニトリル：ＤＭＦ（２’－ＯＭｅ－Ｃ、２’－ＯＭｅ－Ｕ）中に０．１５Ｍの濃度で溶解させた。Ｍｅｒｍａｄｅ １９２には、０．１０Ｍの濃度を用いた。ＥＴＴを活性化剤として使用し、ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸を使用して脱トリチル化した。
オリゴヌクレオチド合成：既発表のプロトコル１２に従い、但し脱トリチル化にはＣＨ２Ｃｌ２中３％トリクロロ酢酸を使用して、ＡＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを入手した。簡潔に言えば、オリゴヌクレオチドの全ては、ＡＢＩ ３９４又はＭｅｒＭａｄｅ １９２シンセサイザーにおいて１μｍｏｌ規模で汎用又はカスタムの支持体を使用して調製した。ＡＢＩには、全てのホスホラミダイトを１００％アセトニトリル又は９：１アセトニトリル：ＤＭＦ（２’－ＯＭｅ－Ｃ、２’－ＯＭｅ－Ｕ）中に０．１５Ｍの濃度で溶解させた。Ｍｅｒｍａｄｅ １９２には、０．１０Ｍの濃度を用いた。ＥＴＴを活性化剤として使用し、ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸を使用して脱トリチル化した。
【0377】
ＭｅｒＭａｄｅ １９２ワークアップ：ＭｅｒＭａｄｅ １９２を使用したトリチル除去合成後、カラムを１５０μＬの４０％メチルアミン水溶液と共に室温で３０分間インキュベートし、溶液を真空で９６ウェルプレートに排出させた。インキュベーション及び排液を新鮮な分量のメチルアミン水溶液で繰り返した後、粗オリゴヌクレオチドが入ったプレートを密封し、室温でさらに６０分間振盪して、あらゆる保護基を完全に除去した。各ウェルに１．２ｍＬの９：１アセトニトリル：ＥｔＯＨを加え、続いて－２０℃で一晩インキュベートすることにより、粗オリゴヌクレオチドの沈殿を達成した。次に、プレートを４℃において３０００ｒｐｍで４５分間遠心し、各ウェルから上清を除去し、ペレットを９５０μＬの２０ｍＭ ＮａＯＡｃ水溶液に再懸濁した。最後に、各粗溶液をＧＥ Ｈｉ－Ｔｒａｐ脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）で水を用いて脱塩することにより、最終的なオリゴヌクレオチド生成物を溶出させた。全てのオリゴヌクレオチドのアイデンティティ及び純度を、それぞれＥＳＩ－ＭＳ及びＩＥＸ ＨＰＬＣを用いて確認した。
【0378】
ＡＢＩ ３９４ワークアップ：切断及び脱保護には、標準プロトコルを用いた。強陰イオン交換及び臭化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．５）を用いて粗オリゴヌクレオチドを精製した。全てのオリゴヌクレオチドのアイデンティティ及び純度を、それぞれＥＳＩ－ＬＣ／ＭＳ及びＩＥＸ ＨＰＬＣを用いて確認した。
【0379】
インビトロｍＲＮＡノックダウン：３８４ウェルコラーゲンコートプレートに５μＬのｓｉＲＮＡを入れ、続いて各ウェルに４．９０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。最終ｓｉＲＮＡ濃度は、０．１又は１０ｎＭであった。プレートを室温で１５分間インキュベートした。初代マウスヘパトサイト細胞を培地Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｏ ＣＰげっ歯類培地（＃Ｚ９９００２８ ＢｉｏＩＶＴ）に懸濁し、４０μＬのこの懸濁液（約５０００細胞を含有する）を各ウェルに加えた。各ｓｉＲＮＡにつき４回のレプリケートで評価した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＲＮＡを単離した。次に、ＲＮＡを製造者のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってｃＤＮＡに逆転写した。Ｔｔｒに対する遺伝子特異的ＴａｑＭａｎアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｍｍ００４４３２６７＿ｍ１）及び内因性対照としてのマウスＧａｐｄｈ（＃４３５２３３９Ｅ）を用いて、マルチプレックスｑＰＣＲ反応を実施した。Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【0380】
オフターゲットアッセイ：１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２でＣＯＳ－７細胞を培養した。２μｇ／ｍＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従って使用して、細胞を９６ウェルプレートにおいて（１５，０００細胞／ウェル）、１０ｎｇルシフェラーゼレポータープラスミド及び５倍希釈の０．６４ｐＭ～５０ｎＭ ｓｉＲＮＡでコトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、製造者の指示に従ってデュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にかけた。オンターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’－非翻訳（３’ＵＴＲ）に、アンチセンス鎖と完全に相補的な単一の部位を含んでいた。オフターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’－ＵＴＲに、１９ヌクレオチドスペーサー（ＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡ）だけ離れた４つのタンデムなシード相補部位を含んでいた。両方のプラスミドとも、トランスフェクション対照としてホタルルシフェラーゼを共発現した。
【0381】
インビボ遺伝子発現サイレンシング：いずれの研究も、適用可能な場合、地方、州及び連邦政府の規制に従うプロトコルを用いて行い、Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）による承認を受けた。６～８週齢の雌Ｃ５６ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１×ＰＢＳ中に製剤化した１ｍｇ／ｋｇ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡを皮下投与し、対照コホートは、ｓｉＲＮＡ投与動物と同じ容積（２００ｕＬ）の１×ＰＢＳの投与を受けた。循環中にプレアルブミン／Ｔｔｒが見られることがあるため、治療投与直前、ｓｉＲＮＡ投与から７及び１４日後に血液試料を採取した。採取した血清試料は、さらなる分析時まで－８０℃で保存した。化合物投与から２週間後、動物を安楽死させ、肝臓を摘出し、次に凍結保存した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｈｅｍａｇｉｃシステム（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で供給業者のガイドラインに従って肝臓からのＲＮＡの単離を行い、続いてｃＤＮＡを調製し、マルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ解析でＴｔｒ転写物レベルを評価した（Ｔａｑｍａｎプローブ Ｍｍ００４４３２６７＿ｍ１；ＡＢＩからのマウスＧａｐｄｈ ４３５１３０９）。マウスプレアルブミン／Ｔｔｒ ＥＬＩＳＡキット（４１－ＰＡＬＭＳ－Ｅ０１）で、製造者のプロトコル（ＡＬＰＣＯ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）に従って血清中のＴｔｒタンパク質レベルの定量化を分光光度法により行った。
【0382】
ヌクレアーゼ安定性アッセイ：３’特異的又は５’特異的エキソヌクレアーゼに対する安定性を評価するため、それぞれ１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）のいずれかに修飾オリゴヌクレオチドを０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で調製した。ＩＥＸ ＨＰＬＣ（ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００、４×２５０ｍｍ）による１ｍＬ／分の流速で７．５分にわたる３７～５２％移動相のグラジエント（１Ｍ ＮａＢｒ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ１１、１５％ＭｅＣＮ；固定相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５％ＭｅＣＮ、ｐＨ１１）を用いた分析の直前にエキソヌクレアーゼ（１５０ｍＵ／ｍＬ ＳＶＰＤＥ又は５００ｍＵ／ｍＬホスホジエステラーゼＩＩ）を加えた。所与の時点で試料を注入し、最長２４時間までモニタした。完全長ＯＮの量をＡ２６０における曲線下面積として決定した。ｔ＝０における曲線下面積で除して１００を乗じることにより、パーセント完全長ＯＮを計算した。末端ホスホロチオエート結合（３’－又は５’－エキソヌクレアーゼ活性について、それぞれ５’－Ｔ１９・Ｔ又は５’－Ｔ・Ｔ１９）を有するオリゴ－２’－デオキシチミジル酸を含めることにより、実験毎に酵素の活性を確認した。酵素の各アリコートは、実験直前に解凍した。一次反応速度式に当てはめることによって半減期を決定した。
【0383】
Ｘ線結晶構造解析：２つのＡＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを結晶化実験に供した。十二量体ＣＧＣＧＡ（ＡＮＡ－Ａ）ＢｒＵＵＡＧＣＧの結晶は、単位格子定数ａ＝４７．２６Å、ｂ＝８１．７１、ｃ＝１２５．６２Åの空間群Ｉ２２２であり、４．４Å分解能まで回折した。八量体ＢｒＣＧＡ（ＡＮＡ－Ａ）ＵＵＣＧの結晶は、単位格子定数ａ＝ｂ＝９６．１４、ｃ＝１２５．９９Å、γ＝１２０°の空間群Ｐ６５２２であり、２．１Å分解能まで回折した。後者の臭素エッジ（Ｂｒ－ＳＡＤ）における単波長異常分散データをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｒｇｏｎｎｅ、ＩＬ）にあるＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ（ＬＳ－ＣＡＴ）の２１－ＩＤ－Ｄビームラインで収集した。プログラム．．．でデータを処理した（構造の位相が決定できる場合には継続する）。
【0384】
分子モデリング：ＰＤＢ ＩＤコード３ＯＫ２のＡＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖ａ（ＣＣＧＵＡＡＵＧＣＣ－Ｐ）：ｒ（ＧＧＣＡＵＵＡＣＧＧ）［Ｏｖａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．ＮＡＲ ２０１２を参照されたい］の結晶構造及びＰＤＢ ｉＤ ４Ｆ３Ｔのヒトアルゴノート２（Ａｇｏ２）に結合したマイクロＲＮＡ ｍｉＲ－２０ａ２０の結晶構造の座標をｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇのタンパク質データバンクから取得した。Ａｇｏ２複合体におけるＲＮＡの７位のＧ残基を切り出し、プログラムＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用いてＡＮＡ Ａ鎖とのハイブリッド二重鎖からのＡＮＡ－Ｇ３に置き換えた［Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００４を参照されたい］。得られた融合体モデルの幾何学的構造をＡｍｂｅｒ１４［Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．ＵＣＳＦ ２０１４を参照されたい］で局所的に精密化し、及びＡＮＡプリン残基のグリコシドねじれ角を少し調整して、未変性ＲＮＡとのＡｇｏ２複合体の結晶構造に見られるとおりの隣接残基Ｃ８のスタッキングを回復させた。タンパク質データバンクから、ＰＤＢ ＩＤ ２Ｙ３５を有するＸｒｎ１ ５’－エキソリボヌクレアーゼと５’Ｐ－ｄＴｄＴｄＴ－３’との間の複合体２１の結晶構造を取得した。ＡＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖の結晶構造の鎖Ａから二量体５’Ｐ－ａＣ９ａＣ１０－３’Ｐを切り出し、プログラムＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを用いて塩基をＵに変換した。次に、選択された骨格及び塩基原子でＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａのマッチ機能を用いて、この二量体をＸｒｎ１複合体中のｄＴ三量体の最初の２ヌクレオチドに重ね合わせた。
【0385】
インビトロｍＲＮＡノックダウン：げっ歯類（マウス及びラット）トランスサイレチン（Ｔｔｒ）ｍＲＮＡを標的化するように設計された以前に研究されたｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドを系統的に置換することにより、ＡＮＡ修飾がインビトロＲＮＡｉ活性に及ぼす位置依存性の影響を評価した（図１）１２、２２～２４。この設計には、２’－Ｆ ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ ＲＮＡヌクレオチドで修飾された、アンチセンス鎖に２ヌクレオチドオーバーハングを有する２１ｍｅｒ二重鎖が含まれる。ＧａｌＮａｃ部分にコンジュゲートするセンス鎖の３’末端を除いて、各鎖の端に２つのホスホロチオエート結合を導入することにより、末端を保護した。
【0386】
センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド位置にわたってＡＮＡヌクレオチドをウォーキングさせて、得られた修飾ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を初代ヘパトサイトで研究した（図２）。先行研究と一致して１６、アンチセンス鎖の５’末端（１位；ＡＳ１）におけるＡＮＡは効力が低下した。この活性損失は、恐らく細胞キナーゼがＡＮＡヌクレオチドに５’－一リン酸基を導入できないことに起因する。５’－一リン酸は、ＲＩＳＣ負荷においてＡｇｏ２ ＭＩＤドメインと相互作用することにより重要な役割を果たし、したがって５’－一リン酸がないと、ＲＮＡｉ活性が損なわれることが公知である２５～２８。ＡＮＡ修飾がＡＳ２位に存在することは、ＲＮＡｉ活性に有害であった。
【0387】
予想外にも、シード（ヌクレオチド３～８）におけるＡＮＡ修飾は、より良好に適応し、ＡＳ６又はＡＳ７位にＡＮＡヌクレオチドを有する２つの修飾二重鎖は、１０ｎＭで親二重鎖と同等のＲＮＡｉ活性を示した（図２）。加えて、ＡＳ１６位のＡＮＡもＲＮＡｉ活性を維持した。しかしながら、これらの修飾二重鎖のいずれも、親ｓｉＲＮＡと比較すると、それほど高い活性を示さなかった。０．１ｎＭの低濃度でも同様の結果が得られた（図Ｓ１）。センス鎖に修飾を有するｓｉＲＮＡ二重鎖のインビトロＲＮＡｉ活性を図３及び図Ｓ２に示す。一般に、センス鎖にＡＮＡ修飾が存在すると、活性がやや失われることにつながった。しかしながら、大多数の修飾二重鎖について、有意な変化は認められなかった。
【0388】
この初期インビトロスクリーニング結果に基づき、一部の二重鎖を濃度依存的ＲＮＡ活性の記録に選択し、それらのＩＣ５０値を決定した（図４）。この初期結果に従うと、ＡＮＡ ＡＳ７を有するｓｉＲＮＡ二重鎖が０．１１５ｎＭのＩＣ５０値で傑出していた（親二重鎖は、０．１１２のＩＣ５０値を示した）。
【0389】
ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるオンターゲット及びオフターゲット活性：シード媒介性オフターゲット活性は、ｓｉＲＮＡのラット肝毒性に寄与することが報告されている１０。かかるオフターゲット効果を低減するため、ｓｉＲＮＡ二重鎖のシード領域にＧＮＡなどの熱不安定化修飾が取り入れられている１０。ＧＮＡは、オンターゲット効力を維持しつつ、シード媒介性オフターゲット効果を効率的に軽減することができる。ＡＮＡは、シード領域においてアンチセンス鎖の６又は７位で良好に忍容される。このことに触発されて、本発明者らは、ＡＮＡがオフターゲット活性に及ぼす効果を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて測定し、このアッセイでは、ｓｉＲＮＡとの４つのタンデムシードマッチをルシフェラーゼ３’－ＵＴＲ領域にクローニングした（図５Ａ及び図５Ｂ）２９～３１。ＡＳ６及びＡＳ７におけるＡＮＡでは、オンターゲット活性が維持され、先のインビトロスクリーニングと一致する観察であった。親二重鎖及び修飾二重鎖（ＡＳ６及びＡＳ７）のオフターゲット活性は、同程度であった。したがって、ＡＮＡによってオフターゲット活性が増加することはない。
【0390】
インビボ遺伝子発現サイレンシング：選択のｓｉＲＮＡ二重鎖は、マウスにおいてＴｔｒ遺伝子の発現をサイレンシングするその能力についてもスクリーニングした。動物に１ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、対照コホートは、１×ＰＢＳ媒体の投与を受けた。投与直前並びに投与７及び１４日後に血液試料を採取した。マウスプレアルブミン／Ｔｔｒ ＥＬＩＳＡキットを用いて血清中のＴｔｒタンパク質レベルを測定した。結果を図６Ａに示す。７日目、ＡＳ６又はＡＳ７位にＡＮＡを有する二重鎖は、親二重鎖と同等の効力を示した。これは、これらの二重鎖によるインビトロスクリーニング実験の結果と整合している。しかしながら、１４日目には、ＡＳ７のみに活性が認められる一方、ＡＳ６は、親よりも効力が低かった。現時点では、この挙動の理由は、不明である。興味深いことに、ＡＳ１６にＡＮＡ修飾を有する二重鎖は、親二重鎖よりも活性が有意に低かった。対照的に、同じ二重鎖がインビトロスクリーニングで親二重鎖と同等のＲＮＡｉ活性を示しており、これは、インビトロモデルとインビボモデルとの間に固有の細胞内差異があることを示唆し得る。Ｓ１２にＡＮＡ修飾を有する二重鎖は、親よりやや低活性であったが、その活性は、１４日目まで維持された。インビトロデータと一致して、アンチセンス鎖の５’末端（ＡＳ１）がＡＮＡで修飾された二重鎖は有効でなかったが、これは、ＡＮＡが内因性細胞内キナーゼによるリン酸化を受けることができないことが理由である可能性が最も高い。１４日目に動物を犠牲死させて、肝臓からＲＮＡを抽出し、続いてｃＤＮＡを調製し、マルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ解析によってＴｔｒ転写物レベルを評価した（図６Ｂ）。結果は、１４日目に血清試料から得られたものと良好に整合していた。
【0391】
ＡＳ７をＡＮＡヌクレオチドに置き換えたｓｉＲＮＡに見られた活性に対する有利な効果について洞察を得るため、本発明者らは、Ａｇｏ２：ｍｉＲ－２０ａ複合体２０の結晶構造に基づき、Ａｇｏ２に結合した修飾鎖のモデルを構築した。Ｇ７の代わりにマイクロＲＮＡ鎖に取り込むためのＡＮＡ－Ｇ残基は、ＡＮＡ：ＲＮＡ十量体二重鎖３２の結晶構造から取った。このハイブリッド二重鎖（ＡＮＡ－鎖ＡがＲＮＡ－鎖Ｅと対を成すもの）では、ＡＮＡ残基のストランド内Ｐ－Ｐ距離が平均５．５３Åであり、比較してＲＮＡ残基は、５．９３Åである。ｍｉＲ－２０ａにおけるシード領域の残基６、７及び８間（Ｐ６．．．Ｐ７及びＰ７．．．Ｐ８）のリン酸間の間隔は、この部分における顕著なねじれの結果として短くなっている。したがって、Ａｇｏ２に結合したＡＮＡ－Ｇ７によってＧ７を置き換えたＲＮＡのモデルにより実証されるとおり、本質的に５’－リン酸基と３’－リン酸基との間の距離が短いＡＮＡヌクレオチドは、このねじれた骨格配座に極めて良好に適合する（図７）。
【0392】
ヌクレアーゼ安定性：ポリｄＴオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端に単一のＡＮＡヌクレオチド又は２つのいずれかを取り込んだ。直接比較するため、末端にウリジンを有する同一の配列を調製した。３’末端に修飾を有するＯＮを、３’－特異的エキソヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）とインキュベートし、イオン交換ＨＰＬＣを用いて完全長オリゴヌクレオチドの分解をモニタした。興味深いことに、ウリジン又はＡＮＡ－Ｕのいずれを含有するＯＮも、両方ともＳＶＰＤに対して同様の安定性、したがって同等の半減期を呈した。重要なことに、２つ目のＡＮＡを取り込むと、半減期が２倍に改善した（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【0393】
次に、５’－修飾オリゴヌクレオチドを、５’－特異的エキソヌクレアーゼであるホスホジエステラーゼＩＩ（ＰＤＥＩＩ）とインキュベートした。重要なことに、５’末端にＡＮＡ修飾を有するオリゴヌクレオチドに有意な改善が観察された。５’末端に２つ目の修飾を加えると、オリゴヌクレオチドは、分解に対して事実上不活性になった（図８）。５’－エキソリボヌクレアーゼＸｒｎａ１に結合したオリゴｄＴの結晶構造に見られるとおり［Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２０１１を参照されたい］２１、２つの５’末端ｄＴにＡＮＡ ５’Ｐ－ａＵａＵ－３’Ｐ二量体を重ね合わせると、Ｐ－Ｐ間隔（ＡＮＡの方が短い）及びリン酸の向きの違い並びに（２’－デオキシ）リボースと比較したヘキソース糖のバルク性の増加が容易に明らかになる（図９）。
【0394】
結論
本研究は、アルトリトール６員糖環を特徴とするヌクレオチドが、予想外且つ意外にも、インビトロ及びインビボの両方で効率的な遺伝子サイレンシングを誘導することを示している。特に、ＡＮＡ修飾はＡＳ７位に最も良好に適応した。ＡＮＡ修飾ＲＮＡ八量体の結晶構造から、ＡＮＡ残基の５’－リン酸と３’－リン酸との間の距離がリボヌクレオチドのリン酸間の平均距離と比べてむしろ短くなることが実証された。したがってＡＮＡ残基は、ｓｉＲＮＡガイド鎖のねじれによってリン酸塩間距離が局所的に縮まることになるＡＳ７位におけるリボヌクレオチドを完全に模倣することができる。５’末端にＡＮＡを有するＯＮは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性が天然ＲＮＡ対応物よりも高かった。しかしながら、この安定性の上昇は、３’－エキソヌクレアーゼであるＳＶＰＤによる分解に対する耐性を試験するアッセイで認められなかった。５’－エキソリボヌクレアーゼに結合した５’末端に２つのＡＮＡ－ウリジンを有するＯＮのモデルは、立体的バルク性並びにＤＮＡ及びＲＮＡと比べたリン酸間の間隔の変化が、ヌクレアーゼ分解からの保護が増加する主な理由であることを示している。
本研究は、アルトリトール６員糖環を特徴とするヌクレオチドが、予想外且つ意外にも、インビトロ及びインビボの両方で効率的な遺伝子サイレンシングを誘導することを示している。特に、ＡＮＡ修飾はＡＳ７位に最も良好に適応した。ＡＮＡ修飾ＲＮＡ八量体の結晶構造から、ＡＮＡ残基の５’－リン酸と３’－リン酸との間の距離がリボヌクレオチドのリン酸間の平均距離と比べてむしろ短くなることが実証された。したがってＡＮＡ残基は、ｓｉＲＮＡガイド鎖のねじれによってリン酸塩間距離が局所的に縮まることになるＡＳ７位におけるリボヌクレオチドを完全に模倣することができる。５’末端にＡＮＡを有するＯＮは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性が天然ＲＮＡ対応物よりも高かった。しかしながら、この安定性の上昇は、３’－エキソヌクレアーゼであるＳＶＰＤによる分解に対する耐性を試験するアッセイで認められなかった。５’－エキソリボヌクレアーゼに結合した５’末端に２つのＡＮＡ－ウリジンを有するＯＮのモデルは、立体的バルク性並びにＤＮＡ及びＲＮＡと比べたリン酸間の間隔の変化が、ヌクレアーゼ分解からの保護が増加する主な理由であることを示している。
【0395】
参考文献
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５．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４，８（６），５７０－５７９．
６．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｒ．Ｋ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｈａｄｗｉｇｅｒ，Ｐ．；Ｊｏｈｎ，Ｍ．；Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｎｅｃｈｅｖ，Ｌ．；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｍ．；Ｐａｌｌａｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｒｏｚｎｅｒｓ，Ｅ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．，Ｕｎｉｑｕｅ ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２’－ｆｌｕｏｒｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ）２０１１，５０（１０），２２８４－２２８８．
７．Ｊａｎａｓ，Ｍ．Ｍ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．；Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．Ａ．；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｐ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｌｉｕ，Ｘ．；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｂｌａｉｒ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｄａｓ，Ｂ．；Ｔｒａｎ，Ｃ．；Ａｌｕｒｉ，Ｋ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．；Ｉｎｄｒａｋａｎｔｉ，Ｒ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．；Ｓｅｐｐ－Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ，Ｌ．；Ｘｕ，Ｙ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｆ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｗｕ，Ｊ．－Ｔ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９，４７（７），３３０６－３３２０．
８．Ｓｅｔｔｅｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．；Ｈａｎ，Ｓ．－ｐ．，Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＲＮＡｉ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１９，１８（６），４２１－４４６．
９．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｋｕｍａｒ，Ｐ．；Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．；Ｂａｂｕ，Ｒ．Ｉ．；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．，５’－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ａｎ ｓｉＲＮＡ ｍａｋｅｓ ｉｔ ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）２０１９，Ａｈｅａｄ ｏｆ Ｐｒｉｎｔ．
１０．Ｊａｎａｓ，Ｍ．Ｍ．；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｈａｒｂｉｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｙｉｌｍａｚ，Ｖ．Ｏ．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．；Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｃａｓｔｏｒｅｎｏ，Ａ．；Ｘｕ，Ｈ．；Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ｓ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，Ｎ．Ｄ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧａｌＮＡｃ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｉｔｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ－ｄｒｉｖｅｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８，９（１）．
１１．Ｍａｌｅｋ－Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｓ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｂｕｒａｉ Ｐａｔｒａｓｃｕ，Ｍ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｆａｋｈｏｕｒｙ，Ｊ．；Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｌ．；Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ，Ｎ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，４’－Ｃ－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７，１３９（４１），１４５４２－１４５５５．
１２．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｌａｃｋｅｙ，Ｊ．Ｇ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｐａｌｌａｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｉＲＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７，１３９（２５），８５３７－８５４６．
１３．Ｍａｌｅｋ－Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｓ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｂｕｒａｉ Ｐａｔｒａｓｃｕ，Ｍ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｆａｋｈｏｕｒｙ，Ｊ．；Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｌ．；Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ，Ｎ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，４’－Ｃ－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１７，１３９（４１），１４５４２－１４５５５．
１４．Ａｌｌａｒｔ，Ｂ．；Ｋｈａｎ，Ｋ．；Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｇ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｃ．；Ｒｏｔｈｅｎｂａｃｈｅｒ，Ｋ．；Ｓｅｅｌａ，Ｆ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｄ－Ａｌｔｒｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＡＮＡ）：Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ．１９９９，５（８），２４２４－２４３１．
１５．Ａｌｌａｒｔ，Ｂ．；Ｂｕｓｓｏｎ，Ｒ．；Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｄ－ａｌｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９９，５５（２１），６５２７－６５４６．
１６．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｘｕ，Ｄ．；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＲ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７，３５（４），１０６４－１０７４．
１７．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ．；Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｘｉｔｏｌ ａｎｄ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ－Ｒａｆ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００９，６０６（１－３），３８－４４．
１８．Ｈｅａｎ，Ｊ．；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｃ．；Ｅｌｙ，Ａ．；ｕｌ Ｉｓｌａｍ，Ｒ．；Ｂａｒｉｃｈｉｅｖｙ，Ｓ．；Ｂｌｏｏｍ，Ｋ．；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．；ｖａｎ Ｏｔｔｅｒｌｏ，Ｗ．Ａ．Ｌ．；ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ，Ｃ．Ｂ．；Ｓａｌａｚａｒ，Ｆ．；Ｍａｒｉｏｎ，Ｐ．；Ｒｏｅｓｃｈ，Ｅ．Ｂ．；ＬｅＭａｉｔｒｅ，Ｍ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，Ｐ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｉＲＮＡｓ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：ＰＮＡ＆ＸＮＡ ２０１０，１（１），１７－２６．
１９．Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａ．Ｆ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｂ．；Ｂｕｓ，Ｃ．；Ｌａｎｇｋｊａｅｒ，Ｎ．；Ｂａｂｕ，Ｂ．Ｒ．；Ｈφｊｌａｎｄ，Ｔ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｏｄａｄｚｉｃ，Ｄ．；Ｓｍｉｃｉｕｓ，Ｒ．；Ｈａａｓ，Ｊ．；Ａｎｄｒｅｅ，Ｃ．；Ｂａｒｍａｎ，Ｊ．；Ｗｅｎｓｋａ，Ｍ．；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．；Ｚｈｏｕ，Ｃ．；Ｈｏｎｃｈａｒｅｎｋｏ，Ｄ．；Ｈｅｓｓ，Ｓ．；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｂｏｂｋｏｖ，Ｇ．Ｖ．；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ，Ｓ．Ｎ．；Ｆａｖａ，Ｅ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．Ｆ．；Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，Ｊ．；Ｚｅｒｉａｌ，Ｍ．；Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｋｊｅｍｓ，Ｊ．，Ａ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎ ｒｕｌｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（９），２８６７－２８８１．
２０．Ｅｌｋａｙａｍ，Ｅ．；Ｋｕｈｎ，Ｃ．－Ｄ．；Ｔｏｃｉｌｊ，Ａ．；Ｈａａｓｅ，Ａ．Ｄ．；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｍ．；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｊｏｓｈｕａ－Ｔｏｒ，Ｌ．，Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｒｇｏｎａｕｔｅ－２ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－２０ａ．Ｃｅｌｌ ２０１２，１５０（１），１００－１１０．
２１．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．；Ｃｏｙｌｅ，Ｓ．Ｍ．；Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｕｐｌｅｄ ５’ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｘｒｎ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ２０１１，４１（５），６００－６０８．
２２．Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｋｅｉｓｅｒ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｐ．；Ｐｅｎｇ，Ｃ．Ｇ．；Ｖ．Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．；Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｌｉｅｂｏｗ，Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｙｕｃｉｕｓ，Ｋ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｅｌｉｃｉｔ Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５，１０（５），１１８１－１１８７．
２３．Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｙｕｃｉｕｓ，Ｋ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．；Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ｓ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｌｉｅｂｏｗ，Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６（６），９０３－９０８．
２４．Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｃｈａｎ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ａｌａｍ，Ｍ．Ｒ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．；Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．；Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．；Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｕｉｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．；Ｋｕｃｈｉｍａｎｃｈｉ，Ｓ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．；ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．Ｃ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｒｏｂｕｓｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１４，１３６（４９），１６９５８－１６９６１．
２５．Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｎ．Ｔ．；ＭａｃＲａｅ，Ｉ．Ｊ．，Ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６（６０８４），１０３７．
２６．Ｗａｎｇ，Ｙ．；Ｊｕｒａｎｅｋ Ｓ Ｆａｕ－Ｌｉ，Ｈ．；Ｌｉ Ｈ Ｆａｕ－Ｓｈｅｎｇ，Ｇ．；Ｓｈｅｎｇ Ｇ Ｆａｕ－Ｗａｒｄｌｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｗａｒｄｌｅ Ｇｓ Ｆａｕ－Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．；Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ Ｆａｕ－Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．；Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ Ａｇｏ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．（１４７６－４６８７（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ））．
２７．Ｗａｎｇ，Ｙ．；Ｊｕｒａｎｅｋ，Ｓ．；Ｌｉ，Ｈ．；Ｓｈｅｎｇ，Ｇ．；Ｗａｒｄｌｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．；Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ Ａｇｏ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００９，４６１（７２６５），７５４－７６１．
２８．Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｆａｃｉｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｅｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ２’－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ５’－（Ｅ）－ ａｎｄ ５’－（Ｚ）－Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，６１（３），７３４－７４４．
２９．Ｖａｉｓｈ，Ｎ．；Ｃｈｅｎ Ｆ Ｆａｕ－Ｓｅｔｈ，Ｓ．；Ｓｅｔｈ Ｓ Ｆａｕ－Ｆｏｓｎａｕｇｈ，Ｋ．；Ｆｏｓｎａｕｇｈ Ｋ Ｆａｕ－Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｌｉｕ Ｙ Ｆａｕ－Ａｄａｍｉ，Ｒ．；Ａｄａｍｉ Ｒ Ｆａｕ－Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．；Ｂｒｏｗｎ Ｔ Ｆａｕ－Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｃｈｅｎ Ｙ Ｆａｕ－Ｈａｒｖｉｅ，Ｐ．；Ｈａｒｖｉｅ Ｐ Ｆａｕ－Ｊｏｈｎｓ，Ｒ．；Ｊｏｈｎｓ Ｒ Ｆａｕ－Ｓｅｖｅｒｓｏｎ，Ｇ．；Ｓｅｖｅｒｓｏｎ Ｇ Ｆａｕ－Ｇｒａｎｇｅｒ，Ｂ．；Ｇｒａｎｇｅｒ Ｂ Ｆａｕ－Ｃｈａｒｍｌｅｙ，Ｐ．；Ｃｈａｒｍｌｅｙ Ｐ Ｆａｕ－Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｍ．；Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｍ Ｆａｕ－Ｔｅｍｐｌｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｔｅｍｐｌｉｎ Ｍｖ Ｆａｕ－Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．；Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｉＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｓ．（１３６２－４９６２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ））．
３０．Ｕｉ－Ｔｅｉ，Ｋ．；Ｎａｉｔｏ，Ｙ．；Ｎｉｓｈｉ，Ｋ．；Ｊｕｎｉ，Ａ．；Ｓａｉｇｏ，Ｋ．，Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，３６（２２），７１００－７１０９．
３１．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．；Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，ｓｉＲＮＡｓ ｃａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｍｉＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００３，１７（４），４３８－４２．
３２．Ｏｖａｅｒｅ，Ｍ．；Ｓｐｏｎｅｒ，Ｊ．；Ｓｐｏｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ｖａｎ Ｍｅｅｒｖｅｌｔ，Ｌ．，Ｈｏｗ ｄｏｅｓ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｕｐｌｅｘ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２，４０（１５），７５７３－７５８３．
１．Ａｄａｍｓ，Ｄ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｄｕａｒｔｅ，Ａ．；Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｗ．Ｄ．；Ｙａｎｇ，Ｃ．－Ｃ．；Ｕｅｄａ，Ｍ．；Ｋｒｉｓｔｅｎ，Ａ．Ｖ．；Ｔｏｕｒｎｅｖ，Ｉ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈ．Ｈ．；Ｃｏｅｌｈｏ，Ｔ．；Ｂｅｒｋ，Ｊ．Ｌ．；Ｌｉｎ，Ｋ．－Ｐ．；Ｖｉｔａ，Ｇ．；Ａｔｔａｒｉａｎ，Ｓ．；Ｐｌａｎｔｅ－Ｂｏｒｄｅｎｅｕｖｅ，Ｖ．；Ｍｅｚｅｉ，Ｍ．Ｍ．；Ｃａｍｐｉｓｔｏｌ，Ｊ．Ｍ．；Ｂｕａｄｅｓ，Ｊ．；Ｂｒａｎｎａｇａｎ，Ｔ．Ｈ．；Ｋｉｍ，Ｂ．Ｊ．；Ｏｈ，Ｊ．；Ｐａｒｍａｎ，Ｙ．；Ｓｅｋｉｊｉｍａ，Ｙ．；Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｐ．Ｎ．；Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｓ．Ｄ．；Ｐｏｌｙｄｅｆｋｉｓ，Ｍ．；Ｄｙｃｋ，Ｐ．Ｊ．；Ｇａｎｄｈｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｇｏｙａｌ，Ｓ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｓｔｒａｈｓ，Ａ．Ｌ．；Ｎｏｃｈｕｒ，Ｓ．Ｖ．；Ｓｗｅｅｔｓｅｒ，Ｍ．Ｔ．；Ｇａｒｇ，Ｐ．Ｐ．；Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．Ｋ．；Ｇｏｌｌｏｂ，Ｊ．Ａ．；Ｓｕｈｒ，Ｏ．Ｂ．，Ｐａｔｉｓｉｒａｎ，ａｎ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，ｆｏｒ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１８，３７９（１），１１－２１．
２．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｃ．；Ｓｈａｒｍａ，Ａ．Ｒ．；Ｓｈａｒｍａ，Ｇ．；Ｄｏｓｓ，Ｃ．Ｇ．Ｐ．；Ｌｅｅ，Ｓ．－Ｓ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｉＲＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ：Ｍｏｖｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ ａｓ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２０１７，８，１３２－１４３．
３．Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．；Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．；Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．；Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１（６８３６），４９４－４９８．
４．Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．；Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｓ．；Ｉｍａｎｉ，Ｆ．；Ｆｉｒｅ，Ａ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡｓ ｉｎ ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００１，９８（１７），９７４２－９７４７．
５．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４，８（６），５７０－５７９．
６．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｒ．Ｋ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｈａｄｗｉｇｅｒ，Ｐ．；Ｊｏｈｎ，Ｍ．；Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｎｅｃｈｅｖ，Ｌ．；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｍ．；Ｐａｌｌａｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｒｏｚｎｅｒｓ，Ｅ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．，Ｕｎｉｑｕｅ ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２’－ｆｌｕｏｒｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ）２０１１，５０（１０），２２８４－２２８８．
７．Ｊａｎａｓ，Ｍ．Ｍ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．；Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．Ａ．；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｅ．；Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｐ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｌｉｕ，Ｘ．；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｂｌａｉｒ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｄａｓ，Ｂ．；Ｔｒａｎ，Ｃ．；Ａｌｕｒｉ，Ｋ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．；Ｉｎｄｒａｋａｎｔｉ，Ｒ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．；Ｓｅｐｐ－Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ，Ｌ．；Ｘｕ，Ｙ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｆ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｗｕ，Ｊ．－Ｔ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１９，４７（７），３３０６－３３２０．
８．Ｓｅｔｔｅｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．；Ｈａｎ，Ｓ．－ｐ．，Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＲＮＡｉ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１９，１８（６），４２１－４４６．
９．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｋｕｍａｒ，Ｐ．；Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．；Ｂａｂｕ，Ｒ．Ｉ．；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．，５’－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ａｎ ｓｉＲＮＡ ｍａｋｅｓ ｉｔ ａ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）２０１９，Ａｈｅａｄ ｏｆ Ｐｒｉｎｔ．
１０．Ｊａｎａｓ，Ｍ．Ｍ．；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｈａｒｂｉｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｙｉｌｍａｚ，Ｖ．Ｏ．；Ｊｉａｎｇ，Ｙ．；Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｃａｓｔｏｒｅｎｏ，Ａ．；Ｘｕ，Ｈ．；Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ｓ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ，Ｎ．Ｄ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧａｌＮＡｃ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｉｔｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ－ｄｒｉｖｅｎ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８，９（１）．
１１．Ｍａｌｅｋ－Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｓ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｂｕｒａｉ Ｐａｔｒａｓｃｕ，Ｍ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｆａｋｈｏｕｒｙ，Ｊ．；Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｌ．；Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ，Ｎ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，４’－Ｃ－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７，１３９（４１），１４５４２－１４５５５．
１２．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｌａｃｋｅｙ，Ｊ．Ｇ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｐａｌｌａｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｉＲＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１７，１３９（２５），８５３７－８５４６．
１３．Ｍａｌｅｋ－Ａｄａｍｉａｎ，Ｅ．；Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｓ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｈａｒｐ，Ｊ．；Ｂｕｒａｉ Ｐａｔｒａｓｃｕ，Ｍ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｆａｋｈｏｕｒｙ，Ｊ．；Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｌ．；Ｍｏｉｔｅｓｓｉｅｒ，Ｎ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｂｉｓｂｅ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，４’－Ｃ－Ｍｅｔｈｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙ－２’－ｆｌｕｏｒｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１７，１３９（４１），１４５４２－１４５５５．
１４．Ａｌｌａｒｔ，Ｂ．；Ｋｈａｎ，Ｋ．；Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｇ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｃ．；Ｒｏｔｈｅｎｂａｃｈｅｒ，Ｋ．；Ｓｅｅｌａ，Ｆ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｄ－Ａｌｔｒｉｔｏｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＡＮＡ）：Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ．１９９９，５（８），２４２４－２４３１．
１５．Ａｌｌａｒｔ，Ｂ．；Ｂｕｓｓｏｎ，Ｒ．；Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｄ－ａｌｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｓ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９９，５５（２１），６５２７－６５４６．
１６．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｘｕ，Ｄ．；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＲ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７，３５（４），１０６４－１０７４．
１７．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ．；Ｄｉｘｉｔ，Ｖ．；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｘｉｔｏｌ ａｎｄ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ－Ｒａｆ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００９，６０６（１－３），３８－４４．
１８．Ｈｅａｎ，Ｊ．；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｃ．；Ｅｌｙ，Ａ．；ｕｌ Ｉｓｌａｍ，Ｒ．；Ｂａｒｉｃｈｉｅｖｙ，Ｓ．；Ｂｌｏｏｍ，Ｋ．；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．；ｖａｎ Ｏｔｔｅｒｌｏ，Ｗ．Ａ．Ｌ．；ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ，Ｃ．Ｂ．；Ｓａｌａｚａｒ，Ｆ．；Ｍａｒｉｏｎ，Ｐ．；Ｒｏｅｓｃｈ，Ｅ．Ｂ．；ＬｅＭａｉｔｒｅ，Ｍ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ，Ｐ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｔｒｉｔｏｌ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｉＲＮＡｓ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：ＰＮＡ＆ＸＮＡ ２０１０，１（１），１７－２６．
１９．Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｌａｕｒｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａ．Ｆ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｂ．；Ｂｕｓ，Ｃ．；Ｌａｎｇｋｊａｅｒ，Ｎ．；Ｂａｂｕ，Ｂ．Ｒ．；Ｈφｊｌａｎｄ，Ｔ．；Ａｂｒａｍｏｖ，Ｍ．；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ，Ａ．；Ｏｄａｄｚｉｃ，Ｄ．；Ｓｍｉｃｉｕｓ，Ｒ．；Ｈａａｓ，Ｊ．；Ａｎｄｒｅｅ，Ｃ．；Ｂａｒｍａｎ，Ｊ．；Ｗｅｎｓｋａ，Ｍ．；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．；Ｚｈｏｕ，Ｃ．；Ｈｏｎｃｈａｒｅｎｋｏ，Ｄ．；Ｈｅｓｓ，Ｓ．；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｂｏｂｋｏｖ，Ｇ．Ｖ．；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ，Ｓ．Ｎ．；Ｆａｖａ，Ｅ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．Ｆ．；Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，Ｊ．；Ｚｅｒｉａｌ，Ｍ．；Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｋｊｅｍｓ，Ｊ．，Ａ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｅｓｉｇｎ ｒｕｌｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（９），２８６７－２８８１．
２０．Ｅｌｋａｙａｍ，Ｅ．；Ｋｕｈｎ，Ｃ．－Ｄ．；Ｔｏｃｉｌｊ，Ａ．；Ｈａａｓｅ，Ａ．Ｄ．；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｍ．；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｊｏｓｈｕａ－Ｔｏｒ，Ｌ．，Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｒｇｏｎａｕｔｅ－２ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－２０ａ．Ｃｅｌｌ ２０１２，１５０（１），１００－１１０．
２１．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．；Ｃｏｙｌｅ，Ｓ．Ｍ．；Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｕｐｌｅｄ ５’ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｘｒｎ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ２０１１，４１（５），６００－６０８．
２２．Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｋｅｉｓｅｒ，Ｋ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｒ．Ｍ．；Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｐ．；Ｐｅｎｇ，Ｃ．Ｇ．；Ｖ．Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．；Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｌｉｅｂｏｗ，Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｙｕｃｉｕｓ，Ｋ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｅｌｉｃｉｔ Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５，１０（５），１１８１－１１８７．
２３．Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｙｕｃｉｕｓ，Ｋ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．；Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ｓ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｌｉｅｂｏｗ，Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ Ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６（６），９０３－９０８．
２４．Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｃｈａｎ，Ａ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ａｌａｍ，Ｍ．Ｒ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｍ．；Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．；Ｋｅｌ’ｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．；Ｔａｎｅｊａ，Ｎ．；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．；Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｕｉｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．；Ｋｕｃｈｉｍａｎｃｈｉ，Ｓ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．；ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．Ｃ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｒｏｂｕｓｔ ＲＮＡｉ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１４，１３６（４９），１６９５８－１６９６１．
２５．Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｎ．Ｔ．；ＭａｃＲａｅ，Ｉ．Ｊ．，Ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６（６０８４），１０３７．
２６．Ｗａｎｇ，Ｙ．；Ｊｕｒａｎｅｋ Ｓ Ｆａｕ－Ｌｉ，Ｈ．；Ｌｉ Ｈ Ｆａｕ－Ｓｈｅｎｇ，Ｇ．；Ｓｈｅｎｇ Ｇ Ｆａｕ－Ｗａｒｄｌｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｗａｒｄｌｅ Ｇｓ Ｆａｕ－Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．；Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ Ｆａｕ－Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．；Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ Ａｇｏ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．（１４７６－４６８７（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ））．
２７．Ｗａｎｇ，Ｙ．；Ｊｕｒａｎｅｋ，Ｓ．；Ｌｉ，Ｈ．；Ｓｈｅｎｇ，Ｇ．；Ｗａｒｄｌｅ，Ｇ．Ｓ．；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．；Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ Ａｇｏ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００９，４６１（７２６５），７５４－７６１．
２８．Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．Ｇ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．；Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｅｇｌｉ，Ｍ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｆａｃｉｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｅｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ２’－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ５’－（Ｅ）－ ａｎｄ ５’－（Ｚ）－Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，６１（３），７３４－７４４．
２９．Ｖａｉｓｈ，Ｎ．；Ｃｈｅｎ Ｆ Ｆａｕ－Ｓｅｔｈ，Ｓ．；Ｓｅｔｈ Ｓ Ｆａｕ－Ｆｏｓｎａｕｇｈ，Ｋ．；Ｆｏｓｎａｕｇｈ Ｋ Ｆａｕ－Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｌｉｕ Ｙ Ｆａｕ－Ａｄａｍｉ，Ｒ．；Ａｄａｍｉ Ｒ Ｆａｕ－Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．；Ｂｒｏｗｎ Ｔ Ｆａｕ－Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｃｈｅｎ Ｙ Ｆａｕ－Ｈａｒｖｉｅ，Ｐ．；Ｈａｒｖｉｅ Ｐ Ｆａｕ－Ｊｏｈｎｓ，Ｒ．；Ｊｏｈｎｓ Ｒ Ｆａｕ－Ｓｅｖｅｒｓｏｎ，Ｇ．；Ｓｅｖｅｒｓｏｎ Ｇ Ｆａｕ－Ｇｒａｎｇｅｒ，Ｂ．；Ｇｒａｎｇｅｒ Ｂ Ｆａｕ－Ｃｈａｒｍｌｅｙ，Ｐ．；Ｃｈａｒｍｌｅｙ Ｐ Ｆａｕ－Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｍ．；Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｍ Ｆａｕ－Ｔｅｍｐｌｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｔｅｍｐｌｉｎ Ｍｖ Ｆａｕ－Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．；Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｉＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｓ．（１３６２－４９６２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ））．
３０．Ｕｉ－Ｔｅｉ，Ｋ．；Ｎａｉｔｏ，Ｙ．；Ｎｉｓｈｉ，Ｋ．；Ｊｕｎｉ，Ａ．；Ｓａｉｇｏ，Ｋ．，Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８，３６（２２），７１００－７１０９．
３１．Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．；Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，ｓｉＲＮＡｓ ｃａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｍｉＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００３，１７（４），４３８－４２．
３２．Ｏｖａｅｒｅ，Ｍ．；Ｓｐｏｎｅｒ，Ｊ．；Ｓｐｏｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．；Ｖａｎ Ｍｅｅｒｖｅｌｔ，Ｌ．，Ｈｏｗ ｄｏｅｓ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｔｒｉｔｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｕｐｌｅｘ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１２，４０（１５），７５７３－７５８３．
【0396】
本明細書中で参照される米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願及び非特許論文の全てが、それら全体が参照により本明細書中に援用される。実施形態の態様は、さらなる実施形態をさらに提供するため、様々な特許、出願及び公開の概念を利用する必要がある場合、変更され得る。
【0397】
実施形態に対するこれら及び他の変更形態は、上記の詳細な説明のためになされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、特許請求の範囲を、明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定するように解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲に権利が付与されている均等物の全範囲と共に、あらゆる考えられる実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】