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特表2022-551046細胞由来ベシクルを利用した唾液腺疾患予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-07
(54)【発明の名称】細胞由来ベシクルを利用した唾液腺疾患予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20221130BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20221130BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20221130BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20221130BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20221130BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20221130BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20221130BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20221130BHJP
A61K 35/19 20150101ALI20221130BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
C12N5/0775
C12N5/0735
C12N5/074
C12N5/071
A23L33/10
C12P1/00 Z
A61P1/02
A61K35/19 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515500
(86)(22)【出願日】2020-09-04
(85)【翻訳文提出日】2022-03-05
(86)【国際出願番号】 KR2020011957
(87)【国際公開番号】W WO2021045567
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】10-2019-0110816
(32)【優先日】2019-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522088818
【氏名又は名称】エムディーイミュネ インコーポレート
(71)【出願人】
【識別番号】509160317
【氏名又は名称】インハ－インダストリー パートナーシップ インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】特許業務法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ペ、シンギュ
(72)【発明者】
【氏名】オ、スンウック
(72)【発明者】
【氏名】キム、セヒ
(72)【発明者】
【氏名】ハン、ソンフン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、チョンソク
(72)【発明者】
【氏名】キム、チョンミ
【テーマコード（参考）】
4B018
4B064
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018MD69
4B018ME14
4B018MF14
4B064AH19
4B064CA10
4B064CC30
4B064CE06
4B064DA03
4B064DA10
4B065AA93X
4B065BD01
4B065CA41
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB38
4C087BB63
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA67
(57)【要約】
本発明は、細胞由来ベシクルの唾液腺細胞に対する増殖能増進効果、アミラーゼ活性促進効果及び上皮透過抵抗性増進効果を利用した唾液腺治療剤に関する。本発明に係る細胞由来ベシクルを含む薬学的組成物は、放射線により損傷した唾液腺組織細胞の増殖能を増進させ、アミラーゼの活性を促進させ、上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を高める効果があり、アクアポリン５（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ５）の発現を増進させ、唾液分泌量を増加させる効果がある。従って、本発明の細胞由来ベシクルを含む薬学的組成物を利用すれば、唾液腺疾患の予防及び治療用途に使用でき、医薬業界及び健康機能食品の分野で広く使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを含む、唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記微細空隙に押出するステップは、微細空隙の大きさが大きいものから微細空隙の大きさが小さいものに順次に押出するステップである、請求項１に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記微細空隙は、直径が０．１～２０μｍである、請求項１に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記細胞は、中間葉幹細胞、誘導万能幹細胞、胚性幹細胞、唾液腺幹細胞、腺房細胞、筋上皮細胞及び血小板からなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記唾液腺疾患は、放射線照射及び放射性同位元素による唾液腺損傷、口腔乾燥症、感染性急性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｃｕｔｅ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、感染性慢性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、唾液腺結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、唾石症（ｓｉａｌｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、唾液腺症（ｓｉａｌａｄｅｎｏｓｉｓ）、唾液腺腫瘍及び老化による唾液腺機能低下からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記細胞由来ベシクルは、唾液腺組織に処理されたとき、唾液腺細胞増殖能、唾液腺で分泌されるアミラーゼ活性または唾液腺細胞の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）を自然分泌エクソソームに対比して増進させ、唾液分泌量を増加させるものである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記唾液腺は、顎下腺、舌下腺及び耳下腺からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクル（ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む、唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項9】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを個体に処理するステップを含む、唾液腺疾患予防または治療方法。
【請求項10】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用。
【請求項11】
唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞由来ベシクルの唾液腺細胞に対する増殖能増進効果、アミラーゼ活性促進効果、上皮透過抵抗性増進効果、アクアポリン５（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ５）の発現増進及び唾液分泌量を増加させる効果を利用した唾液腺治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）は、一般に、０．０３～１μｍの大きさを有する細胞小器官の一種であり、ほとんど全ての種類の細胞で細胞膜から自然に遊離して、細胞膜の構造である二重リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）膜形態を有していることを特徴とする。このようなベシクルは、物質代謝、代謝物質の運送、酵素貯蔵、化学反応等のための細胞の基本道具であって、細胞間にｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質等を伝達することで細胞間信号伝達の媒介の役割を果たすものと知られている。
一方、唾液腺は、爬虫類以上の高等脊椎動物の口腔に開口する外分泌腺の総称であり、ほとんどは粘液を分泌するが、あるものは消化液としての唾液を分泌する。哺乳類では、顎下腺、舌下腺、耳下腺があり、顎下腺と舌下腺は、哺乳類以下でもあるが、耳下腺は、哺乳類で発達したものである。三つは全て分岐複合胞状腺に属し、大きな腺塊を形成する。耳下腺は、漿液性腺細胞だけからなるが、顎下腺と舌下腺は、それと粘液性細胞からなる。両排出管の上皮は、円柱状の細胞からなる。腺体からアミラーゼ、α－Ｄ－グルコース加水分解酵素を分泌し、排出管ではＮａＣｌを分泌してアミラーゼを活性化する。唾液腺のうち主に耳下腺、ある程度は顎下腺でも腺内に分泌した物質が特定の細胞を通して血液に移行してホルモン活性を誘導すると知られている。また、このような唾液腺を大唾液腺といい、別に口腔内の数箇所にある小規模であるが唾液分泌に参加するものを小唾液腺といって区別する。
唾液腺は、消化作用を助けるアミラーゼのような酵素を分泌する重要な身体組織であるが、唾液腺組織が損傷したとき、副作用が少なく、かつ効果的な治療剤がない実情である。従って、生体由来の副作用が少ない唾液腺治療剤に対する研究開発の必要性が浮上している。
一方、唾液腺は、爬虫類以上の高等脊椎動物の口腔に開口する外分泌腺の総称であり、ほとんどは粘液を分泌するが、あるものは消化液としての唾液を分泌する。哺乳類では、顎下腺、舌下腺、耳下腺があり、顎下腺と舌下腺は、哺乳類以下でもあるが、耳下腺は、哺乳類で発達したものである。三つは全て分岐複合胞状腺に属し、大きな腺塊を形成する。耳下腺は、漿液性腺細胞だけからなるが、顎下腺と舌下腺は、それと粘液性細胞からなる。両排出管の上皮は、円柱状の細胞からなる。腺体からアミラーゼ、α－Ｄ－グルコース加水分解酵素を分泌し、排出管ではＮａＣｌを分泌してアミラーゼを活性化する。唾液腺のうち主に耳下腺、ある程度は顎下腺でも腺内に分泌した物質が特定の細胞を通して血液に移行してホルモン活性を誘導すると知られている。また、このような唾液腺を大唾液腺といい、別に口腔内の数箇所にある小規模であるが唾液分泌に参加するものを小唾液腺といって区別する。
唾液腺は、消化作用を助けるアミラーゼのような酵素を分泌する重要な身体組織であるが、唾液腺組織が損傷したとき、副作用が少なく、かつ効果的な治療剤がない実情である。従って、生体由来の副作用が少ない唾液腺治療剤に対する研究開発の必要性が浮上している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
そこで、本発明者らは、唾液腺治療に効果的な物質を探索、研究していた中で、細胞由来ベシクル（ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）が損傷した唾液腺の治療に効果的であることを確認し、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、細胞由来ベシクルを含有する唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
従って、本発明の目的は、細胞由来ベシクルを含有する唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0004】
前記目的を達成するために、本発明は、細胞由来ベシクルを含む唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、細胞由来ベシクルを含む唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを個体に処理するステップを含む、唾液腺疾患予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用を提供する。
また、本発明は、唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用を提供する。
また、本発明は、細胞由来ベシクルを含む唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを個体に処理するステップを含む、唾液腺疾患予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用を提供する。
また、本発明は、唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用を提供する。
【発明の効果】
【0005】
本発明に係る細胞由来ベシクルを含む薬学的組成物は、放射線により損傷した唾液腺組織細胞の増殖能を増進させ、アミラーゼの活性を促進させ、上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を高める効果があり、アクアポリン５（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ５）の発現を増進させ、唾液分泌量を増加させる効果がある。従って、本発明の細胞由来ベシクルを含む薬学的組成物を利用すれば、唾液腺疾患の予防及び治療用途に使用でき、医薬業界及び健康機能食品の分野で広く使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】放射線照射による耳下腺細胞の増殖能変化を測定した図である。
【図2】放射線照射により損傷した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、増殖能の変化を測定した図である。
【図3】放射線照射９日後、放射線により損傷した耳下腺細胞に対するＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの増殖能増進効果を確認した図である。
【図4】放射線照射により損傷した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、アミラーゼ活性変化を測定した図である。
【図5】放射線照射により損傷した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、上皮透過抵抗性（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の変化を測定した図である。
【図6】放射線照射による顎下腺細胞の増殖能変化を測定した図である。
【図7】放射線照射により損傷した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、増殖能の変化を測定した図である。
【図8】放射線照射９日後、放射線により損傷した顎下腺細胞に対するＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの増殖能増進効果を確認した図である。
【図9】放射線照射により損傷した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、アミラーゼ活性変化を測定した図である。
【図10】放射線照射により損傷した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、上皮透過抵抗性（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の変化を測定した図である。
【図11】放射線照射による舌下腺細胞の増殖能変化を測定した図である。
【図12】放射線照射により損傷した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、増殖能の変化を測定した図である。
【図13】放射線照射９日後、放射線により損傷した舌下腺細胞に対するＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの増殖能増進効果を確認した図である。
【図14】放射線照射により損傷した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、アミラーゼ活性変化を測定した図である。
【図15】放射線照射により損傷した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したとき、上皮透過抵抗性（Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の変化を測定した図である。
【図16】自然分泌エクソソームに対比した中間葉幹細胞由来ベシクルの放射線により損傷した唾液腺細胞に対する増殖能を比較した図である。
【図17】自然分泌エクソソームに対比した脂肪細胞由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性を比較した図である。
【図18】自然分泌エクソソームに対比した臍帯由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性を比較した図である。
【図19】自然分泌エクソソームに対比した中間葉幹細胞由来ベシクルの唾液腺組織が損傷したマウスモデルに対するアミラーゼ活性促進効果を比較した図である。
【図20】中間葉幹細胞由来ベシクルをマウスモデルに適用した場合、唾液分泌量の変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクル（ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の用語「細胞由来ベシクル」は、細胞から発生したベシクルをいい、一般に、細胞小器官の一種であり、ほとんど全ての種類の細胞で細胞膜から遊離して、細胞膜の構造である二重リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）膜形態を有しているものをいう。
本発明の用語「細胞由来ベシクル」は、細胞から発生したベシクルをいい、一般に、細胞小器官の一種であり、ほとんど全ての種類の細胞で細胞膜から遊離して、細胞膜の構造である二重リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）膜形態を有しているものをいう。
【0008】
本発明の細胞由来ベシクルは、マイクロメートル大きさ、例えば０．０３～１μｍを有し得る。本発明のベシクルは、由来した細胞の細胞膜成分からなる脂質二重膜により内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質と細胞膜タンパク質、核酸及び細胞成分等を有しており、元来、細胞より大きさが小さいものを意味するが、それに制限されるものではない。
【0009】
本発明において、前記細胞は、細胞由来ベシクルの分離が可能な細胞であれば制限なく使用され得、自然界生物個体から分離された細胞であってよい。また、前記細胞は、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物、植物由来であってよく、多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞、腺房細胞、筋上皮細胞または血小板であってよく、好ましく前記幹細胞は、中間葉幹細胞、誘導万能幹細胞、胚性幹細胞及び唾液腺幹細胞からなる群から選択されたいずれか一つ以上であってよく、好ましくは、脂肪細胞由来の中間葉幹細胞または臍帯由来の中間葉幹細胞であるものであってよいが、それに制限されるものではない。
【0010】
本発明の細胞由来ベシクルは、唾液腺組織細胞の増殖能を増進させ、アミラーゼの活性を促進させ、上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を高める効果があり、アクアポリン５（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ ５）の発現を増進させ得るものであってよく、唾液分泌量を増加させ得るものであってよい。
【0011】
本発明のベシクルは、有核細胞を含む懸濁液を押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、化学物質処理、機械的分解及び外部的に細胞に力を加えた物理的刺激の処理からなる群から選択された方法を使用して製造できるが、それに制限されるものではない。本願発明においては、例示的に有核細胞を含む懸濁液を押出機を使用して押出する方法でベシクルを製造した。本発明の有核細胞由来ベシクルを製造するために加える押出機の押出力は、５～２００ｐｓｉであってよく、１０～１５０ｐｓｉであってよく、５０～１００ｐｓｉであってよい。
【0012】
本発明の前記ベシクルは、幹細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造されるものであってよく、好ましくは、微細空隙の大きさが大きいものから微細空隙の大きさが小さいものに順次に押出するステップにより製造されるものであってよい。
本発明の前記細胞由来ベシクルは、自然状態で分泌されるエクソソームと発現するマーカー等が異なるものであってよい。
本発明の前記微細空隙の直径は、０．０１～１００μｍのものであってよく、好ましくは、０．１～２０μｍのものであってよく、より好ましくは、０．４～１０μｍのものであってよい。
本発明の前記細胞由来ベシクルは、自然状態で分泌されるエクソソームと発現するマーカー等が異なるものであってよい。
本発明の前記微細空隙の直径は、０．０１～１００μｍのものであってよく、好ましくは、０．１～２０μｍのものであってよく、より好ましくは、０．４～１０μｍのものであってよい。
【0013】
本発明において、「唾液腺疾患」は、唾液腺組織が損傷したか炎症が発生して正常な機能が作動し難い状態であってよく、好ましくは、放射線照射及び放射性同位元素による唾液腺損傷、口腔乾燥症、感染性急性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｃｕｔｅ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、感染性慢性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、唾液腺結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、唾石症（ｓｉａｌｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、唾液腺症（ｓｉａｌａｄｅｎｏｓｉｓ）、唾液腺腫瘍及び老化による唾液腺機能低下からなる群から選択されたいずれか一つであってよく、より好ましくは、放射線照射及び放射性同位元素による唾液腺損傷または口腔乾燥症であってよく、前記放射性同位元素は、例えば、放射性ヨウ素であってよい。特に、顎下腺と耳下腺のような主唾液腺は、それぞれ平常唾液の分泌と刺激による唾液の分泌を担当するが、放射線及び放射性同位元素治療等の理由で放射線に唾液腺が露出すると唾液腺分泌上皮細胞に不可逆的な損傷を与えるようになり、それによって細胞間の緻密結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が緩くなって唾液腺細胞の上皮透過性が増加する。唾液腺細胞上皮透過性が増加するようになると、吸収されてはならない巨大分子や細菌が吸収されるか、唾液酵素であるアミラーゼの分泌、水とイオン輸送等が非正常に作用して、唾液分泌量及び唾液成分が変わり得る。本発明の細胞由来ベシクルは、細胞唾液腺細胞増殖能増進、アミラーゼ活性促進、上皮透過抵抗性増進効果及び唾液分泌量増加効果に基づいて、前記唾液腺疾患による症状を改善、治療する効果があるものであってよい。
【0014】
本発明において、前記唾液腺は、耳下腺、顎下腺または舌下腺であってよい。
本発明において、前記細胞由来ベシクルは、唾液腺疾患の予防または治療効果を奏することができる限り、剤形、配合目的等によって任意の量（有効量）で含まれ得、ここで「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくは、ヒトに医療専門家等の提言による投与期間の間に本発明の組成物が投与されるとき、唾液腺細胞増殖能増進効果等、意図した機能的・薬理学的効果を奏することのできる、本発明の組成物に含まれる有効成分の量をいう。このような有効量は、当業者の通常の能力範囲内で実験的に決定され得、好ましくは、１×１０５～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むことができ、より好ましくは、５×１０７～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよく、さらに好ましくは、５×１０８～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよく、より一層好ましくは、１×１０９～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよい。
本発明において、前記細胞由来ベシクルは、唾液腺疾患の予防または治療効果を奏することができる限り、剤形、配合目的等によって任意の量（有効量）で含まれ得、ここで「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくは、ヒトに医療専門家等の提言による投与期間の間に本発明の組成物が投与されるとき、唾液腺細胞増殖能増進効果等、意図した機能的・薬理学的効果を奏することのできる、本発明の組成物に含まれる有効成分の量をいう。このような有効量は、当業者の通常の能力範囲内で実験的に決定され得、好ましくは、１×１０５～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むことができ、より好ましくは、５×１０７～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよく、さらに好ましくは、５×１０８～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよく、より一層好ましくは、１×１０９～１×１０１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で含むものであってよい。
【0015】
本発明の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物は、有効成分以外に、唾液腺疾患予防または治療効果の上昇・補強のために既に安全性が検証され、唾液腺疾患予防または治療効果を有するものと公知になった任意の化合物や天然抽出物をさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、それぞれ常法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用され得る。前記薬学組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、本発明の薬学的組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
本発明の薬学的組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わるだろう。このような因子に基づいた投与量の決定は、当業者の水準内にあり、一般に、投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～略２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。さらに好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、一日に一度投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学的組成物は、マウス、家畜、ヒト等の哺乳動物に多様な経路で投与され得る。投与の全ての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、ガーグリング（ｇａｒｇｌｉｎｇ）、口腔内の唾液腺に注射、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得る。本発明の化合物は、毒性及び副作用がほとんどないので、予防の目的で長期間服用時にも安心して使用できる薬剤である。
本発明の薬学的組成物は、それぞれ常法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用され得る。前記薬学組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、本発明の薬学的組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチン等を混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
本発明の薬学的組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わるだろう。このような因子に基づいた投与量の決定は、当業者の水準内にあり、一般に、投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～略２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。さらに好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、一日に一度投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の薬学的組成物は、マウス、家畜、ヒト等の哺乳動物に多様な経路で投与され得る。投与の全ての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、ガーグリング（ｇａｒｇｌｉｎｇ）、口腔内の唾液腺に注射、子宮内硬膜または脳血管内注射により投与され得る。本発明の化合物は、毒性及び副作用がほとんどないので、予防の目的で長期間服用時にも安心して使用できる薬剤である。
【0016】
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクル（ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
本発明の健康機能食品は、食品の製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。例えば、ドリンク剤に製造される場合は、有効成分として細胞由来ベシクル以外に香味剤または天然炭水化物を追加成分として含めることができる。例えば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコース、フルクトース等）、ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロース等）、オリゴ糖、ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリン等）、及び糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等）を含む。香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマリン、ステビア抽出物等）及び合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテーム等）を利用できる。
本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤等の形態を含み、本発明の細胞由来ベシクルを添加できる食品としては、例えば、各種のドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、キャンディ類、スナック類、麺類、アイスクリーム、乳製品、スープ、イオン飲料、飲料水、アルコール飲料、ガム、茶及びビタミン複合剤等がある。
本発明の唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品は、前記唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物の有効成分及び効果が同一であるため、この二つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを個体に処理するステップを含む、唾液腺疾患予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用を提供する。
また、本発明は、唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用を提供する。
本発明を以下の実施例を通して詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の健康機能食品は、食品の製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。例えば、ドリンク剤に製造される場合は、有効成分として細胞由来ベシクル以外に香味剤または天然炭水化物を追加成分として含めることができる。例えば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコース、フルクトース等）、ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロース等）、オリゴ糖、ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリン等）、及び糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等）を含む。香味剤として、天然香味剤（例えば、タウマリン、ステビア抽出物等）及び合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテーム等）を利用できる。
本発明の健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤または液剤等の形態を含み、本発明の細胞由来ベシクルを添加できる食品としては、例えば、各種のドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、キャンディ類、スナック類、麺類、アイスクリーム、乳製品、スープ、イオン飲料、飲料水、アルコール飲料、ガム、茶及びビタミン複合剤等がある。
本発明の唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品は、前記唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物の有効成分及び効果が同一であるため、この二つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを個体に処理するステップを含む、唾液腺疾患予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用を提供する。
また、本発明は、唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用を提供する。
本発明を以下の実施例を通して詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【0017】
実施例１．ヒト唾液腺細胞の培養
耳下腺切除術を受ける患者の唾液腺正常組織である耳下腺（ｐａｒｏｔｉｄ ｇｌａｎｄ）、顎下腺（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ）及び舌下腺（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｇｌａｎｄ）を得て顕微鏡を観察下に周辺組織を除去した後、直ちに１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ含有ＨＢＳＳに入れて一次培養実験する前まで４℃に保管した。本研究に使用されたヒト由来唾液腺組織は、仁荷大学病院機関生命倫理委員会で承認を受けて実験に使用された（ＩＲＢ承認番号：ＮＯＮ２０１７－００２）。新鮮な組織は、手術ハサミを使用して細かく切断した後、０．２５％ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）添加して３７℃で３０分間処理した。得られた細胞懸濁液を７０ｕｍ ｓｔｒａｉｎｅｒにろ過した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して得られた細胞を１０％ ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）と１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に懸濁した後、細胞培養ディッシュに細胞を移して３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した。
耳下腺切除術を受ける患者の唾液腺正常組織である耳下腺（ｐａｒｏｔｉｄ ｇｌａｎｄ）、顎下腺（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ）及び舌下腺（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｇｌａｎｄ）を得て顕微鏡を観察下に周辺組織を除去した後、直ちに１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ含有ＨＢＳＳに入れて一次培養実験する前まで４℃に保管した。本研究に使用されたヒト由来唾液腺組織は、仁荷大学病院機関生命倫理委員会で承認を受けて実験に使用された（ＩＲＢ承認番号：ＮＯＮ２０１７－００２）。新鮮な組織は、手術ハサミを使用して細かく切断した後、０．２５％ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）添加して３７℃で３０分間処理した。得られた細胞懸濁液を７０ｕｍ ｓｔｒａｉｎｅｒにろ過した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して得られた細胞を１０％ ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）と１％ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に懸濁した後、細胞培養ディッシュに細胞を移して３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0018】
実施例２．放射線（ＩＲ）により損傷した唾液腺組織の準備
実施例１で準備したｐａｓｓａｇｅ３～６で継代培養した耳下上皮細胞（ｐａｒｏｔｉｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＰＥＣｓ、以下、耳下腺細胞）、舌下上皮細胞（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＬＥＣｓ、以下、舌下腺細胞）、そして顎下上皮細胞（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＭＥＣｓ、以下、顎下腺細胞）にｌｉｎｅａｒ ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ ４ ＭＶ Ｘ－ｒａｙ（Ｍｅｖａｔｒｏｎ ＭＤ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）を使用して放射線を照射した。細胞によって放射線に対する感受性が異なるため、耳下上皮細胞と舌下上皮細胞は、それぞれ０、２、５Ｇｙを照射し、顎下上皮細胞は、０、７、１５Ｇｙの放射線を照射し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで細胞培養した。
実施例１で準備したｐａｓｓａｇｅ３～６で継代培養した耳下上皮細胞（ｐａｒｏｔｉｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＰＥＣｓ、以下、耳下腺細胞）、舌下上皮細胞（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＬＥＣｓ、以下、舌下腺細胞）、そして顎下上皮細胞（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、ｈＭＥＣｓ、以下、顎下腺細胞）にｌｉｎｅａｒ ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ ４ ＭＶ Ｘ－ｒａｙ（Ｍｅｖａｔｒｏｎ ＭＤ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）を使用して放射線を照射した。細胞によって放射線に対する感受性が異なるため、耳下上皮細胞と舌下上皮細胞は、それぞれ０、２、５Ｇｙを照射し、顎下上皮細胞は、０、７、１５Ｇｙの放射線を照射し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで細胞培養した。
【0019】
実施例３．脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクル（Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）の製造
脂肪由来中間葉幹細胞から押出法を通してベシクルを製造した。幹細胞ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍで培養された中間葉幹細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗滌し、洗滌した幹細胞を０．２５～１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度としてＰＢＳに再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた。押出機（ｅｘｔｒｕｄｅｒ）で前記懸濁溶液を微細空隙の大きさが１０μｍであるメンブレンフィルタ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）に通過させた後、微細空隙の大きさが５μｍであるメンブレンフィルタに通過させ、次いで微細空隙の大きさが１または０．４μｍであるメンブレンフィルタに通過させた。これを通して得た懸濁液にＤＮＡ除去のためにｂｅｎｚｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅを入れて、３７℃で９０分間反応させた。ＤＮＡが除去された懸濁液の精製のためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）でメンブレンカラム（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｌｕｍｎ）を通過させた。仮に濃縮が必要である場合、収得した懸濁液を超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を進行し、これを通して沈殿した層をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊した。これを０．２ｕｍメンブレンフィルタでろ過して、中間葉幹細胞由来ベシクルを収得した。
脂肪由来中間葉幹細胞から押出法を通してベシクルを製造した。幹細胞ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍで培養された中間葉幹細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗滌し、洗滌した幹細胞を０．２５～１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度としてＰＢＳに再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた。押出機（ｅｘｔｒｕｄｅｒ）で前記懸濁溶液を微細空隙の大きさが１０μｍであるメンブレンフィルタ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）に通過させた後、微細空隙の大きさが５μｍであるメンブレンフィルタに通過させ、次いで微細空隙の大きさが１または０．４μｍであるメンブレンフィルタに通過させた。これを通して得た懸濁液にＤＮＡ除去のためにｂｅｎｚｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅを入れて、３７℃で９０分間反応させた。ＤＮＡが除去された懸濁液の精製のためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）でメンブレンカラム（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｌｕｍｎ）を通過させた。仮に濃縮が必要である場合、収得した懸濁液を超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を進行し、これを通して沈殿した層をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊した。これを０．２ｕｍメンブレンフィルタでろ過して、中間葉幹細胞由来ベシクルを収得した。
【0020】
実施例４．放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの効果確認
４．１ 耳下腺細胞に放射線露出時の増殖能変化
耳下腺細胞に放射線露出時、耳下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、放射線照射後の時間経過による増殖度の変化をＣＣＫ８ ｕｐｔａｋｅ ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。ＣＣＫ８ ｕｐｔａｋｅ ａｓｓａｙは、次のとおりである。前記放射線により損傷した耳下腺細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして９６ｗｅｌｌにそれぞれ接種した。その後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで１、３、６、９、１２日間それぞれ培養し、１０ｕＬ ＣＣＫ８ ｒｅａｇｅｎｔを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで３時間の間培養後、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ、Ｄｙｎｅｘ Ｌｔｄ、ＵＫ）を使用して４９０ｎｍでの吸光度を測定して増殖能を測定した。測定された増殖能を図１に示した。
図１に示したように、０Ｇｙ、２Ｇｙ、５Ｇｙの放射線照射後の耳下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９、１２日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、２Ｇｙまたは５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して３日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
４．２ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、２Ｇｙの放射線を照射したグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１２日に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図２ａ乃至図２ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（何も処理していないグループ）、ＩＲグループ（２Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（２ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理）に分類して比較した結果を図３ａ及び図３ｂに示した。
図２ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、５×１０８及び１×１０９／ｍｌ濃度を処理したグループで細胞増殖能が増加することを６日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図２ｂに示したように、２Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、５×１０８そして１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相を６日目から示し、１２日目まで持続された。
図２ｃに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して細胞増殖能が増加することを確認し、このような効果は、放射線照射後６日から１２日まで持続された。
図３ａに示したように、２Ｇｙ放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、２Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、２Ｇｙ放射線を照射し、５×１０８または１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が濃度依存的に増加することを確認した。
図３ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が遥かに高いことを確認し、２Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、２Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが２Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した耳下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
４．３ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、耳下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、次のような方法で実験を実施した。実験群と対照群の耳下腺細胞を９６ウェルプレートに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、放射線照射直後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶをそれぞれ設定されたように処理した。放射線照射後６日及び９日目に細胞培養液に分泌されるアミラーゼの活性を測定するためにａ－ａｍｙｌａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）をプロトコルによって実施し、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して４０５ｎｍでの吸光度値を測定した。測定された結果を図４に示した。
図４に示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理したグループを６日及び９日培養した結果、６日及び９日の全てで、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性と類似した水準に回復することを確認した。即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した耳下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより促進されることを確認した。
４．４ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、耳下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、次のような方法で実験を実施した。実験群と対照群の耳下腺細胞をトランスウェル（１２ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、０．４ｕｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、放射線照射直後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶをそれぞれ設定されたように処理した。処理した細胞を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した後、６日及び９日目にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ－２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を使用して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定し、放射線照射６日後の測定結果を図５ａに示し、放射線照射９日後の測定結果を図５ｂに示した。
図５ａに示したように、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線だけを照射したグループで上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に減少し、５Ｇｙ放射線照射後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理した全てのグループは、放射線だけを照射したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に高いことを確認した。
図５ｂに示したように、５Ｇｙ放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線だけを照射したグループで上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が減少し、減少した上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）は、５×１０７、１×１０８及び１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループでまた増加することを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した耳下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
４．１ 耳下腺細胞に放射線露出時の増殖能変化
耳下腺細胞に放射線露出時、耳下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、放射線照射後の時間経過による増殖度の変化をＣＣＫ８ ｕｐｔａｋｅ ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。ＣＣＫ８ ｕｐｔａｋｅ ａｓｓａｙは、次のとおりである。前記放射線により損傷した耳下腺細胞を１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして９６ｗｅｌｌにそれぞれ接種した。その後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで１、３、６、９、１２日間それぞれ培養し、１０ｕＬ ＣＣＫ８ ｒｅａｇｅｎｔを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで３時間の間培養後、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎｅｘ Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ、Ｄｙｎｅｘ Ｌｔｄ、ＵＫ）を使用して４９０ｎｍでの吸光度を測定して増殖能を測定した。測定された増殖能を図１に示した。
図１に示したように、０Ｇｙ、２Ｇｙ、５Ｇｙの放射線照射後の耳下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９、１２日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、２Ｇｙまたは５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して３日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
４．２ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、２Ｇｙの放射線を照射したグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１２日に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図２ａ乃至図２ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（何も処理していないグループ）、ＩＲグループ（２Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（２ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理）に分類して比較した結果を図３ａ及び図３ｂに示した。
図２ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、５×１０８及び１×１０９／ｍｌ濃度を処理したグループで細胞増殖能が増加することを６日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図２ｂに示したように、２Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、５×１０８そして１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相を６日目から示し、１２日目まで持続された。
図２ｃに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９、及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して細胞増殖能が増加することを確認し、このような効果は、放射線照射後６日から１２日まで持続された。
図３ａに示したように、２Ｇｙ放射線を照射した耳下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、２Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、２Ｇｙ放射線を照射し、５×１０８または１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が濃度依存的に増加することを確認した。
図３ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が遥かに高いことを確認し、２Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、２Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが２Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した耳下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
４．３ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、耳下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、次のような方法で実験を実施した。実験群と対照群の耳下腺細胞を９６ウェルプレートに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、放射線照射直後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶをそれぞれ設定されたように処理した。放射線照射後６日及び９日目に細胞培養液に分泌されるアミラーゼの活性を測定するためにａ－ａｍｙｌａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）をプロトコルによって実施し、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して４０５ｎｍでの吸光度値を測定した。測定された結果を図４に示した。
図４に示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理したグループを６日及び９日培養した結果、６日及び９日の全てで、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性と類似した水準に回復することを確認した。即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した耳下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより促進されることを確認した。
４．４ 放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した耳下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、耳下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、次のような方法で実験を実施した。実験群と対照群の耳下腺細胞をトランスウェル（１２ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ、０．４ｕｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種し、放射線照射直後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶをそれぞれ設定されたように処理した。処理した細胞を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで培養した後、６日及び９日目にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ－２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を使用して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定し、放射線照射６日後の測定結果を図５ａに示し、放射線照射９日後の測定結果を図５ｂに示した。
図５ａに示したように、耳下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線だけを照射したグループで上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に減少し、５Ｇｙ放射線照射後ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理した全てのグループは、放射線だけを照射したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に高いことを確認した。
図５ｂに示したように、５Ｇｙ放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線だけを照射したグループで上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が減少し、減少した上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）は、５×１０７、１×１０８及び１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループでまた増加することを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、耳下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した耳下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
【0021】
実施例５．放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの効果確認
５．１ 顎下腺細胞に放射線照射時の増殖能変化
顎下腺細胞に放射線照射時、顎下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、実施例４．１と同様の方法で顎下腺細胞の増殖能を放射線照射後１、３、６、９日目に測定した。測定された増殖能を図６に示した。
図６に示したように、０Ｇｙ、５Ｇｙ、１５Ｇｙの放射線照射後、顎下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、５Ｇｙまたは１５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して６日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
５．２ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループ、１５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６及び９日目に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図７ａ乃至図７ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（放射線及びＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループ）、ＩＲグループ（ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理せず、５Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理する）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（５ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）に分類して比較した結果を図８ａ及び図８ｂに示した。
図７ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶ処理による増殖能増加効果は現れないことを確認した。
図７ｂに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、１×１０８、５×１０８及び１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相が９日目から現れることを確認した。
図７ｃに示したように、１５Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して９日目から細胞増殖能が増加することを確認した。
図８ａに示したように、５Ｇｙ放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が高いことを確認した。
図８ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が差がないことを確認し、５Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、５Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが５Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した顎下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
５．３ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、顎下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、顎下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、実施例４．３と同様の方法でアミラーゼ活性を測定し、測定された結果を図９に示した。
図９に示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理したグループを６日及び９日培養した結果、６日及び９日の全てで、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性と類似した水準に回復することを確認した。即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した顎下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
５．４ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、顎下腺細胞に何も処理していないグループ及び１５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、顎下腺細胞に１５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。実施例４．４と同様の方法で上皮透過抵抗性を測定し、測定結果を図１０ａ及び図１０ｂに示した。
図１０ａに示したように、顎下腺細胞に放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に低いことを確認し、１５Ｇｙ放射線照射後、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループは、１５Ｇｙ放射線照射後、５×１０７～５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が高いことを確認した。
図１０ｂに示したように、放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が低いことを確認し、低くなった上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が５×１０８及び１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループでまた増加することを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した顎下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
５．１ 顎下腺細胞に放射線照射時の増殖能変化
顎下腺細胞に放射線照射時、顎下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、実施例４．１と同様の方法で顎下腺細胞の増殖能を放射線照射後１、３、６、９日目に測定した。測定された増殖能を図６に示した。
図６に示したように、０Ｇｙ、５Ｇｙ、１５Ｇｙの放射線照射後、顎下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、５Ｇｙまたは１５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して６日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
５．２ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループ、１５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６及び９日目に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図７ａ乃至図７ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（放射線及びＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループ）、ＩＲグループ（ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理せず、５Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理する）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（５ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）に分類して比較した結果を図８ａ及び図８ｂに示した。
図７ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶ処理による増殖能増加効果は現れないことを確認した。
図７ｂに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、１×１０８、５×１０８及び１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相が９日目から現れることを確認した。
図７ｃに示したように、１５Ｇｙの放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６及び９日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して９日目から細胞増殖能が増加することを確認した。
図８ａに示したように、５Ｇｙ放射線を照射した顎下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が高いことを確認した。
図８ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が差がないことを確認し、５Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、５Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが５Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した顎下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
５．３ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、顎下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、顎下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、実施例４．３と同様の方法でアミラーゼ活性を測定し、測定された結果を図９に示した。
図９に示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理したグループを６日及び９日培養した結果、６日及び９日の全てで、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性と類似した水準に回復することを確認した。即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した顎下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
５．４ 放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した顎下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した顎下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、顎下腺細胞に何も処理していないグループ及び１５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、顎下腺細胞に１５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。実施例４．４と同様の方法で上皮透過抵抗性を測定し、測定結果を図１０ａ及び図１０ｂに示した。
図１０ａに示したように、顎下腺細胞に放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に低いことを確認し、１５Ｇｙ放射線照射後、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループは、１５Ｇｙ放射線照射後、５×１０７～５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が高いことを確認した。
図１０ｂに示したように、放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が低いことを確認し、低くなった上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が５×１０８及び１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループでまた増加することを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、顎下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した顎下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
【0022】
実施例６．放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの効果確認
６．１ 舌下腺細胞に放射線照射時の増殖能変化
舌下腺細胞に放射線照射時、舌下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、実施例４．１と同様の方法で舌下腺細胞の増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１３日目に測定した。測定された増殖能を図１１に示した。
図１１に示したように、０Ｇｙ、２Ｇｙ、５Ｇｙの放射線照射後の舌下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９、１３日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、２Ｇｙまたは５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して６日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
６．２ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、２Ｇｙの放射線を照射したグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１２日目に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図１２ａ乃至図１２ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（放射線及びＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループ）、ＩＲグループ（ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理せず、２Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理する）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（２ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）に分類して比較した結果を図１３ａ及び図１３ｂに示した。
図１２ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度を処理したグループで細胞増殖能が増加することを６日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１２ｂに示したように、２Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相を９日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１２ｃに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して細胞増殖能が増加することを９日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１３ａに示したように、２Ｇｙ放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、２Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、２Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が高いことを確認した。
図１３ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が遥かに高いことを確認し、２Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、２Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが２Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した舌下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
６．３ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、舌下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、舌下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、実施例４．３と同様の方法でアミラーゼ活性を測定し、放射線照射６日後に測定された結果を図１４ａに示し、放射線照射９日後に測定された結果を図１４ｂに示した。
図１４ａに示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性より高い水準であることを確認した。
図１４ｂに示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼ活性が、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループ、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループ、及び５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼ活性より増加したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性より高い水準であることを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した舌下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
６．４ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、舌下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、舌下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。実施例４．４と同様の方法で上皮透過抵抗性を測定し、測定結果を図１５ａ及び図１５ｂに示した。
図１５ａに示したように、舌下腺細胞に放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に低いことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７／ｍｌ及び５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループは、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が高いことを確認した。
図１５ｂに示したように、放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が低いことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７～１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が５Ｇｙ放射線だけを照射したグループより高いことを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した舌下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
６．１ 舌下腺細胞に放射線照射時の増殖能変化
舌下腺細胞に放射線照射時、舌下腺細胞の増殖能にどのような変化が発生するかを確認する実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射して細胞を損傷させた。その後、実施例４．１と同様の方法で舌下腺細胞の増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１３日目に測定した。測定された増殖能を図１１に示した。
図１１に示したように、０Ｇｙ、２Ｇｙ、５Ｇｙの放射線照射後の舌下腺細胞の増殖程度を１、３、６、９、１３日間観察した結果、放射線を照射していないグループ（０Ｇｙ）は、時間が経つにつれて細胞増殖がよく生じているのに対し、２Ｇｙまたは５Ｇｙの放射線を照射したグループでは、放射線を照射していないグループに比して６日目から細胞増殖が顕著に減少することを確認した。
６．２ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を確認するための実験を実施した。実験群は、次のように設定した。放射線を照射していないグループ、２Ｇｙの放射線を照射したグループ、５Ｇｙの放射線を照射したグループに分けて、それぞれのグループに０、５×１０７、１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌと実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶの処理濃度を異にする下位グループを設定し、それぞれの下位グループの増殖能を放射線照射後１、３、６、９及び１２日目に測定した。細胞増殖能は、実施例４．１と同様の方法を使用して測定し、測定結果を図１２ａ乃至図１２ｃに示した。
また、放射線損傷９日後に測定した増殖能をＮｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌグループ（放射線及びＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループ）、ＩＲグループ（ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理せず、２Ｇｙの放射線（ＩＲ）だけを処理する）、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（放射線を処理せず、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）、ＩＲ＋ ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶグループ（２ＧｙのＩＲと１×１０８、５×１０８または１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理する）に分類して比較した結果を図１３ａ及び図１３ｂに示した。
図１２ａに示したように、０Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度を処理したグループで細胞増殖能が増加することを６日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１２ｂに示したように、２Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して増殖能が増加する様相を９日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１２ｃに示したように、５Ｇｙの放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した後、細胞増殖能を１、３、６、９及び１２日目に確認した結果、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループがＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理していないグループに比して細胞増殖能が増加することを９日目から確認し、このような効果は、１２日目まで持続されることを確認した。
図１３ａに示したように、２Ｇｙ放射線を照射した舌下腺細胞にＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを濃度別に処理し、９日後の細胞増殖能を確認した結果、２Ｇｙ放射線だけを照射したグループの細胞増殖能に比して、２Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が高いことを確認した。
図１３ｂに示したように、何も処理していないグループに比して、放射線を照射せず、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの細胞増殖能が遥かに高いことを確認し、２Ｇｙの放射線だけを照射したグループは、何も処理していないグループより細胞増殖能が減少したものと示されたが、２Ｇｙの放射線を照射し、１×１０９／ｍｌ濃度のＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループが２Ｇｙの放射線だけを照射したグループより細胞増殖能が確実に高いことを確認した。
前記データをまとめると、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞の増殖能を増進させ、放射線により損傷した舌下腺細胞の増殖能もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより増加することを確認した。
６．３ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、舌下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、舌下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。具体的に、実施例４．３と同様の方法でアミラーゼ活性を測定し、放射線照射６日後に測定された結果を図１４ａに示し、放射線照射９日後に測定された結果を図１４ｂに示した。
図１４ａに示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性より高い水準であることを確認した。
図１４ｂに示したように、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線だけを照射したグループでアミラーゼの活性が減少したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼ活性が、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループ、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループ、及び５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼ活性より増加したことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループのアミラーゼの活性が何も処理していないグループのアミラーゼ活性より高い水準であることを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞のアミラーゼ活性を促進し、放射線により損傷した舌下腺細胞のアミラーゼ活性もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
６．４ 放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した舌下腺組織に対する脂肪由来中間葉幹細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を確認するための実験を実施した。具体的に、実施例１で準備した舌下腺細胞を実施例２と同様の方法で放射線を照射し、舌下腺細胞に何も処理していないグループ及び５Ｇｙ放射線だけを照射したグループを対照群に設定し、舌下腺細胞に５Ｇｙ放射線を照射し、実施例３で製造したＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを５×１０７～１×１０９／ｍｌの濃度で処理した群を実験群に設定した。実施例４．４と同様の方法で上皮透過抵抗性を測定し、測定結果を図１５ａ及び図１５ｂに示した。
図１５ａに示したように、舌下腺細胞に放射線を照射して６日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が顕著に低いことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７／ｍｌ及び５×１０８／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループは、５Ｇｙ放射線だけを照射したグループに比して上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が高いことを確認した。
図１５ｂに示したように、放射線を照射して９日後に上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を測定した結果、何も処理していないグループに比して５Ｇｙ放射線を照射した全てのグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が低いことを確認し、５Ｇｙ放射線を照射し、５×１０７～１×１０９／ｍｌのＡｄＭＳＣ－ＣＤＶを処理したグループの上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）が５Ｇｙ放射線だけを照射したグループより高いことを確認した。
即ち、ＡｄＭＳＣ－ＣＤＶは、舌下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）を増加させ、放射線により損傷した舌下腺細胞の上皮透過抵抗性（ＴＥＥＲ）もまたＡｄＭＳＣ－ＣＤＶにより回復することを確認した。
【0023】
実施例７．自然分泌エクソソームに対比した細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
７．１ 脂肪細胞由来中間葉幹細胞（ＡＤＭＳＣ）由来自然分泌エクソソームの製造
脂肪細胞由来中間葉幹細胞培養液から超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）またはＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通して自然分泌エクソソームを収得した。具体的に、細胞ｃｏｍｐｌｅｔｅ成長培地で培養された中間葉幹細胞の既存の培養液を除去した後、１２０，０００ｇの条件で１６時間の間の超遠心分離を利用して得たエクソソームが除去された（Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｄｅｐｌｅｔｅｄ）培養液を入れた後、２４時間の間培養した。その後、培養液から次の順次的な超遠心分離を通して自然分泌エクソソームを分離した。まず、３００ｇの条件で１０分、２０００ｇの条件で１０分、１００００ｇの条件で３０分ずつ順次に遠心分離を進行して上清液を得るか、実施例３と同様の方法でＴＦＦを通してメンブレンカラムを通過させた後、ろ液を収得した。以後、１２０，０００ｇの条件で２時間の間超遠心分離をし、沈殿した層を得て、これをリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊した後、洗滌のためにもう一度１２０，０００ｇの条件で２時間または３時間の間超遠心分離を進行した。この後、沈殿した層をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊して懸濁液を収得した。前記懸濁液を０．２ｕｍ Ｓｔｅｒｉｔｏｐ Ｔｈｒｅａｄｅｄ Ｂｏｔｔｌｅ Ｔｏｐ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させてろ過し、中間葉幹細胞由来自然分泌エクソソームを収得した。
７．２ 自然分泌エクソソームに対比した中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する自然分泌エクソソームと細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を比較するための実験を実施した。具体的に、実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、実施例７．１で製造した１×１０９個の自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＮＥ）、実施例３で製造した１×１０９個のＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。放射線露出９日目にそれぞれの実験群の増殖能を実施例４．１と同様の方法で測定し、測定結果を図１６及び表１に示した。
［表１］
図１６及び表１に示したように、自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＮＥ）の場合、無処理実験群（ＩＲ）と比較して放射線により損傷した耳下腺の増殖能を回復させることができなかった。しかし、ＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）の場合、無処理実験群（ＩＲ）に比して耳下腺増殖能が有意な程度に回復したことを確認した。
７．１ 脂肪細胞由来中間葉幹細胞（ＡＤＭＳＣ）由来自然分泌エクソソームの製造
脂肪細胞由来中間葉幹細胞培養液から超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）またはＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通して自然分泌エクソソームを収得した。具体的に、細胞ｃｏｍｐｌｅｔｅ成長培地で培養された中間葉幹細胞の既存の培養液を除去した後、１２０，０００ｇの条件で１６時間の間の超遠心分離を利用して得たエクソソームが除去された（Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｄｅｐｌｅｔｅｄ）培養液を入れた後、２４時間の間培養した。その後、培養液から次の順次的な超遠心分離を通して自然分泌エクソソームを分離した。まず、３００ｇの条件で１０分、２０００ｇの条件で１０分、１００００ｇの条件で３０分ずつ順次に遠心分離を進行して上清液を得るか、実施例３と同様の方法でＴＦＦを通してメンブレンカラムを通過させた後、ろ液を収得した。以後、１２０，０００ｇの条件で２時間の間超遠心分離をし、沈殿した層を得て、これをリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊した後、洗滌のためにもう一度１２０，０００ｇの条件で２時間または３時間の間超遠心分離を進行した。この後、沈殿した層をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で再浮遊して懸濁液を収得した。前記懸濁液を０．２ｕｍ Ｓｔｅｒｉｔｏｐ Ｔｈｒｅａｄｅｄ Ｂｏｔｔｌｅ Ｔｏｐ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通過させてろ過し、中間葉幹細胞由来自然分泌エクソソームを収得した。
７．２ 自然分泌エクソソームに対比した中間葉幹細胞由来ベシクルの増殖能増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する自然分泌エクソソームと細胞由来ベシクルの増殖能増進効果を比較するための実験を実施した。具体的に、実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、実施例７．１で製造した１×１０９個の自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＮＥ）、実施例３で製造した１×１０９個のＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＩＲ＋ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。放射線露出９日目にそれぞれの実験群の増殖能を実施例４．１と同様の方法で測定し、測定結果を図１６及び表１に示した。
［表１］
【0024】
実施例８．自然分泌エクソソームに対比した細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
８．１ 自然分泌エクソソームに対比した脂肪細胞由来中間葉幹細胞由来ベシクル（ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する自然分泌エクソソームと細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を比較するための実験を実施した。具体的に、放射線を照射していない耳下腺細胞である対照群（ｃｏｎ）、実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、実施例７．１で製造した１×１０８、１×１０９、１×１０１０個の自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群、実施例３で製造した１×１０８、１×１０９、１×１０１０個のＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。放射線露出９日目にそれぞれの実験群の上皮透過抵抗性を実施例４．４と同様の方法で測定し、測定結果を図１７に示した。
図１７に示したように、自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群では、エクソソームの個数と関係なく、無処理実験群（ＩＲ）と有意味な差が現れなかったが、ＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群では、全て無処理実験群（ＩＲ）に対比して上皮透過抵抗性が増加したことを確認した。
８．２ 自然分泌エクソソームに対比した臍帯由来中間葉幹細胞由来ベシクル（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
細胞由来ベシクルの由来細胞を異にした場合にも、上皮透過抵抗性が増加するかを確認するための実験を実施した。具体的に、臍帯由来中間葉幹細胞から実施例３と同様の方法で細胞由来ベシクル（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）を製造し、実施例７．１と同様の方法で自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を製造した。実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、５×１０７、１×１０９個の自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群、１×１０９、１×１０１０個のＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。実施例９．１と同様の方法でＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶと臍帯由来中間葉幹細胞から分離した自然分泌エクソソームの上皮透過抵抗性を放射線露出３日目、６日目、９日目に測定し、それを図１８に示した。
図１８に示したように、自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群では、エクソソームの個数及び放射線露出経過時間と関係なく、無処理実験群（ＩＲ）と有意味な差が現れなかったが、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群では、全て無処理実験群（ＩＲ）に対比して上皮透過抵抗性が増加したことを確認した。このような結果から、本発明の細胞由来ベシクルは、由来細胞を異にしても、自然に分泌されるエクソソームとは異なり細胞に処理されたとき、上皮透過抵抗性を増進させる効果があることを確認した。
８．１ 自然分泌エクソソームに対比した脂肪細胞由来中間葉幹細胞由来ベシクル（ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
放射線により損傷した耳下腺組織に対する自然分泌エクソソームと細胞由来ベシクルの上皮透過抵抗性増進効果を比較するための実験を実施した。具体的に、放射線を照射していない耳下腺細胞である対照群（ｃｏｎ）、実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、実施例７．１で製造した１×１０８、１×１０９、１×１０１０個の自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群、実施例３で製造した１×１０８、１×１０９、１×１０１０個のＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＡｄＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。放射線露出９日目にそれぞれの実験群の上皮透過抵抗性を実施例４．４と同様の方法で測定し、測定結果を図１７に示した。
図１７に示したように、自然分泌エクソソーム（ＡｄＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群では、エクソソームの個数と関係なく、無処理実験群（ＩＲ）と有意味な差が現れなかったが、ＡｄＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群では、全て無処理実験群（ＩＲ）に対比して上皮透過抵抗性が増加したことを確認した。
８．２ 自然分泌エクソソームに対比した臍帯由来中間葉幹細胞由来ベシクル（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）増進効果確認
細胞由来ベシクルの由来細胞を異にした場合にも、上皮透過抵抗性が増加するかを確認するための実験を実施した。具体的に、臍帯由来中間葉幹細胞から実施例３と同様の方法で細胞由来ベシクル（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）を製造し、実施例７．１と同様の方法で自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を製造した。実施例２で準備した５Ｇｙ放射線により損傷した耳下腺細胞を対象に、何も処理していない無処理実験群（ＩＲ）、５×１０７、１×１０９個の自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群、１×１０９、１×１０１０個のＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群（ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ）を設定した。実施例９．１と同様の方法でＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶと臍帯由来中間葉幹細胞から分離した自然分泌エクソソームの上皮透過抵抗性を放射線露出３日目、６日目、９日目に測定し、それを図１８に示した。
図１８に示したように、自然分泌エクソソーム（ＵＣ－ＭＳＣ ＮＥ）を処理した実験群では、エクソソームの個数及び放射線露出経過時間と関係なく、無処理実験群（ＩＲ）と有意味な差が現れなかったが、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した実験群では、全て無処理実験群（ＩＲ）に対比して上皮透過抵抗性が増加したことを確認した。このような結果から、本発明の細胞由来ベシクルは、由来細胞を異にしても、自然に分泌されるエクソソームとは異なり細胞に処理されたとき、上皮透過抵抗性を増進させる効果があることを確認した。
【0025】
実施例９．動物モデルでの自然発生エクソソームに対比した中間葉幹細胞由来ベシクルのアミラーゼ活性促進効果確認
本発明の中間葉幹細胞由来ベシクルが実際に唾液腺が損傷した動物モデルに適用されたとき、唾液腺の機能回復に効果があるかを確認するための実験を実施した。実験用マウス（４週齢 ｆｅｍａｌｅ Ｃ３Ｈ；１８－２２ｇ）は、オリエントバイオ社の実験動物生産センター（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ．，城南、大韓民国）で購入し、仁荷大学校実験動物ガイドラインによって飼育した。２０匹のマウスは、正常実験群（Ｃｏｎｔ）、１５Ｇｙ放射線処理した実験群（ＩＲ）、放射線照射後４×１０９個のＵＣ－ＭＳＣ－ＣＤＶ処理した実験群（ＩＲ＋ＵＣ－ＭＳＣ－ＣＤＶ）、放射線照射後４×１０９個のＵＣ－ＭＳＣ－ＮＥ処理した実験群（ＩＲ＋ＵＣ－ＭＳＣ－ＮＥ）に分け、全ての動物実験は、仁荷大学校実験動物倫理委員会の承認を受けた後に進行した（ＩＮＨＡ １６１２１４０４６４）。前記設定された４個の実験群のマウスから得られた唾液を１，５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清液だけを得てアミラーゼアッセイプロトコル（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）によってアミラーゼ活性を測定した。唾液（５０ｕＬ）が入った９６ｗｅｌｌに、予め作っておいた反応混合物を１００ｕＬ添加してよく混ぜた後、常温で１０分、そして６０分反応させた後、４０５ｎｍでそれぞれの吸光度を測定した。６０分反応させた時の吸光度から１０分反応させた時の吸光度の差を求めてアミラーゼ活性に換算して確認し、その結果を図１９に示した。
図１９に示したように、唾液腺組織が放射線損傷により損傷したマウスモデルにＵＣ－ＭＳＣ ＮＥを処理した場合、アミラーゼ活性に有意な変化が観察されなかったが、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した場合、アミラーゼ活性に有意な増加が観察された。このような結果から、本発明の細胞由来ベシクルが唾液腺組織の損傷に対する治療効果があることをｉｎ ｖｉｖｏステップで確認した。
本発明の中間葉幹細胞由来ベシクルが実際に唾液腺が損傷した動物モデルに適用されたとき、唾液腺の機能回復に効果があるかを確認するための実験を実施した。実験用マウス（４週齢 ｆｅｍａｌｅ Ｃ３Ｈ；１８－２２ｇ）は、オリエントバイオ社の実験動物生産センター（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ．，城南、大韓民国）で購入し、仁荷大学校実験動物ガイドラインによって飼育した。２０匹のマウスは、正常実験群（Ｃｏｎｔ）、１５Ｇｙ放射線処理した実験群（ＩＲ）、放射線照射後４×１０９個のＵＣ－ＭＳＣ－ＣＤＶ処理した実験群（ＩＲ＋ＵＣ－ＭＳＣ－ＣＤＶ）、放射線照射後４×１０９個のＵＣ－ＭＳＣ－ＮＥ処理した実験群（ＩＲ＋ＵＣ－ＭＳＣ－ＮＥ）に分け、全ての動物実験は、仁荷大学校実験動物倫理委員会の承認を受けた後に進行した（ＩＮＨＡ １６１２１４０４６４）。前記設定された４個の実験群のマウスから得られた唾液を１，５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清液だけを得てアミラーゼアッセイプロトコル（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）によってアミラーゼ活性を測定した。唾液（５０ｕＬ）が入った９６ｗｅｌｌに、予め作っておいた反応混合物を１００ｕＬ添加してよく混ぜた後、常温で１０分、そして６０分反応させた後、４０５ｎｍでそれぞれの吸光度を測定した。６０分反応させた時の吸光度から１０分反応させた時の吸光度の差を求めてアミラーゼ活性に換算して確認し、その結果を図１９に示した。
図１９に示したように、唾液腺組織が放射線損傷により損傷したマウスモデルにＵＣ－ＭＳＣ ＮＥを処理した場合、アミラーゼ活性に有意な変化が観察されなかったが、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理した場合、アミラーゼ活性に有意な増加が観察された。このような結果から、本発明の細胞由来ベシクルが唾液腺組織の損傷に対する治療効果があることをｉｎ ｖｉｖｏステップで確認した。
【0026】
実施例１０．中間葉幹細胞由来ベシクルの唾液分泌量増加効果の確認
本発明の中間葉幹細胞由来ベシクルがマウスモデルに適用されたとき、唾液分泌量を増加させる効果があるかを確認するための実験を実施した。具体的に、実験用マウス（４週齢 ｆｅｍａｌｅ Ｃ３Ｈ；１８－２２ｇ）にケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔させ、インスリン注射器を利用して１０９個／ｕＬのＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ ４０ｕＬを両側顎下腺に局所注射した後、縫合した。以後、７週後にマウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）注射して麻酔させ、ムスカリン性、コリン性作用剤であるピロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ、０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射した直後から７分間マウスの口で溜められる唾液を集めて重さを測定して、唾液分泌量を測定し、その結果を図２０に示した。
図２０に示したように、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理したマウスの場合、それを処理していない対照群マウスと比較して、唾液分泌量が有意に増加したことを確認した。このような結果から、本願発明の細胞由来ベシクルは、唾液分泌量を増加させる効果があるものであることを確認した。
以下、本発明の細胞由来ベシクルを含む唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物の製剤例を説明するが、本発明を限定しようとするものではなく、単にそれを具体的に説明しようとするものである。
本発明の中間葉幹細胞由来ベシクルがマウスモデルに適用されたとき、唾液分泌量を増加させる効果があるかを確認するための実験を実施した。具体的に、実験用マウス（４週齢 ｆｅｍａｌｅ Ｃ３Ｈ；１８－２２ｇ）にケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔させ、インスリン注射器を利用して１０９個／ｕＬのＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶ ４０ｕＬを両側顎下腺に局所注射した後、縫合した。以後、７週後にマウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）注射して麻酔させ、ムスカリン性、コリン性作用剤であるピロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ、０．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射した直後から７分間マウスの口で溜められる唾液を集めて重さを測定して、唾液分泌量を測定し、その結果を図２０に示した。
図２０に示したように、ＵＣ－ＭＳＣ ＣＤＶを処理したマウスの場合、それを処理していない対照群マウスと比較して、唾液分泌量が有意に増加したことを確認した。このような結果から、本願発明の細胞由来ベシクルは、唾液分泌量を増加させる効果があるものであることを確認した。
以下、本発明の細胞由来ベシクルを含む唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物の製剤例を説明するが、本発明を限定しようとするものではなく、単にそれを具体的に説明しようとするものである。
【0027】
製剤例１．散剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合し、気密包に充填して散剤を製造した。
製剤例２．錠剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造した。
製剤例３．カプセル剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
製剤例４．丸の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、常法に従って１丸当たり４ｇとなるように製造した。
製剤例５．顆粒の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
デンプン ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エタノール１００ｍｇを添加して摂氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。
製剤例６．注射剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法に従って１アンプル当たり（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。
製剤例７．錠剤型健康機能食品
オクタコサノール粉末１５重量％、乳糖加水分解物粉末１５重量％、分離大豆タンパク粉末１５重量％、キトオリゴ糖１５重量％、酵母抽出物粉末１０重量％、ビタミンミネラル混合剤材１０重量％、ステアリン酸マグネシウム４．６重量％、二酸化チタン０．２重量％、及びグリセリン脂肪酸エステル０．２重量％と本発明の細胞由来ベシクル２０重量％を配合して常法で錠剤型健康機能食品を製造する。
製剤例８．健康飲料
蜂蜜５重量％、果糖３重量％、塩酸リボフラビンナトリウム０．０００１重量％、塩酸ピリドキシン０．０００１重量％、水８６．９９９８重量％及び本発明の細胞由来ベシクル５重量％を配合して常法で健康飲料を製造する。
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合し、気密包に充填して散剤を製造した。
製剤例２．錠剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠して錠剤を製造した。
製剤例３．カプセル剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
製剤例４．丸の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、常法に従って１丸当たり４ｇとなるように製造した。
製剤例５．顆粒の製造
本発明の細胞由来ベシクル １００ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
デンプン ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エタノール１００ｍｇを添加して摂氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。
製剤例６．注射剤の製造
本発明の細胞由来ベシクル １０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法に従って１アンプル当たり（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。
製剤例７．錠剤型健康機能食品
オクタコサノール粉末１５重量％、乳糖加水分解物粉末１５重量％、分離大豆タンパク粉末１５重量％、キトオリゴ糖１５重量％、酵母抽出物粉末１０重量％、ビタミンミネラル混合剤材１０重量％、ステアリン酸マグネシウム４．６重量％、二酸化チタン０．２重量％、及びグリセリン脂肪酸エステル０．２重量％と本発明の細胞由来ベシクル２０重量％を配合して常法で錠剤型健康機能食品を製造する。
製剤例８．健康飲料
蜂蜜５重量％、果糖３重量％、塩酸リボフラビンナトリウム０．０００１重量％、塩酸ピリドキシン０．０００１重量％、水８６．９９９８重量％及び本発明の細胞由来ベシクル５重量％を配合して常法で健康飲料を製造する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2022-03-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルを含む、唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記微細空隙に押出するステップは、微細空隙の大きさが大きいものから微細空隙の大きさが小さいものに順次に押出するステップである、請求項１に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記微細空隙は、直径が０．１～２０μｍである、請求項１に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記細胞は、中間葉幹細胞、誘導万能幹細胞、胚性幹細胞、唾液腺幹細胞、腺房細胞、筋上皮細胞及び血小板からなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記唾液腺疾患は、放射線照射及び放射性同位元素による唾液腺損傷、口腔乾燥症、感染性急性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｃｕｔｅ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、感染性慢性唾液腺炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｉａｌａｄｅｎｉｔｉｓ）、唾液腺結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、唾石症（ｓｉａｌｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、唾液腺症（ｓｉａｌａｄｅｎｏｓｉｓ）、唾液腺腫瘍及び老化による唾液腺機能低下からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記細胞由来ベシクルは、唾液腺組織に処理されたとき、唾液腺細胞増殖能、唾液腺で分泌されるアミラーゼ活性または唾液腺細胞の上皮透過抵抗性（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＴＥＥＲ）を自然分泌エクソソームに対比して増進させ、唾液分泌量を増加させるものである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記唾液腺は、顎下腺、舌下腺及び耳下腺からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の唾液腺疾患予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクル（ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅ）を含む、唾液腺疾患予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項9】
細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの唾液腺疾患予防または治療用医薬としての使用。
【請求項10】
唾液腺疾患予防または治療用医薬製剤を生産するための、細胞を含む試料を微細空隙に押出するステップを含む製造方法により製造される細胞由来ベシクルの使用。
【国際調査報告】