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特表2022-551119配列最適化により増加された安定性を伴う生物学的治療薬を産生するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-07
(54)【発明の名称】配列最適化により増加された安定性を伴う生物学的治療薬を産生するための方法
(51)【国際特許分類】
C40B 10/00 20060101AFI20221130BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20221130BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221130BHJP
G16B 20/50 20190101ALI20221130BHJP
G16B 35/10 20190101ALI20221130BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20221130BHJP
C40B 40/10 20060101ALN20221130BHJP
【ＦＩ】
C40B10/00
C07K16/00 ZNA
C12N15/13
G16B20/50
G16B35/10
C12P21/08
C40B40/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520801
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(85)【翻訳文提出日】2022-05-17
(86)【国際出願番号】 IB2020059265
(87)【国際公開番号】W WO2021064671
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,841
(32)【優先日】2019-10-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ベンカトラマニ，サティヤデヴィ
(72)【発明者】
【氏名】ガネサン，ラージクマール
(72)【発明者】
【氏名】シン，サンジャヤ
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064DA01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、安定性が向上した抗体を最適化する方法であって、方法が、体細胞超変異を生殖細胞系列アミノ酸残基で変異させること、したがって、抗原に対する親和性を維持しながら、増強された熱安定性、改善された生物物理学的特性及び貯蔵寿命を提供することを含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体を最適化するための方法であって、前記方法が、ａ）最適化のための抗体を特定することと、
ｂ）前記抗体ＶＨ及び／又はＶＬにおいて１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、
ｃ）前記抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、
ｄ）前記抗体ＶＨ、ＶＬ、又はそれらの両方における１つ又は２つ以上の体細胞超変異部位を特定することと、
ｅ）前記体細胞超変異部位のうちの部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、
ｆ）前記体細胞超変異部位のうちの前記部位で前記生殖細胞系列残基を含有する変異体又は変異体のライブラリを設計及び操作することと、
ｇ）前記変異体又は変異体のライブラリの特性を評価することと、
ｈ）１つ又は２つ以上の最適化された変異体を選択することと、を含み、
前記１つ又は２つ以上の最適化された変異体が、改善された生物物理学的特性、減少された免疫原性のリスク、又はそれらの両方を有する、方法。
【請求項2】
前記異常又は低頻度残基の特定が、コンピュータベースのソフトウェアによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記コンピュータベースのソフトウェアが、ａｂＹｓｉｓである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記異常又は低頻度残基が、前記抗体ＶＨにある、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記異常又は低頻度残基が、前記抗体ＶＬにある、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記異常又は低頻度残基が、前記抗体ＶＨ及びＶＬにある、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記リード抗体が、フレームワーク領域（ＦＲ）及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は２つ以上で体細胞超変異を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記操作された変異体が、前記抗体のヒトフレームワーク領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３で作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を整列させることが、最も近いヒト生殖細胞系列配列とである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記方法が、前記変異体又は変異体のライブラリをクローニング及び産生することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記変異体又は変異体のライブラリの前記評価が、生物物理学的評価である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記生物物理学的評価が、分析的超遠心分離、熱安定性、アンフォールディングの自由エネルギー、分析的サイズ排除、貯蔵安定性、及び／又は非特異的結合である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
分析的超遠心分離評価が、前記操作された変異体の分析的超遠心分離沈降速度（ＡＵＣ－ＳＶ）を前記リード抗体のＡＵＣ－ＳＶと比較することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
熱安定性評価が、各前記操作された変異体の熱アンフォールディング曲線のＴｍを、前記リード抗体の熱アンフォールディング曲線のＴｍと比較することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
熱安定性評価が、各前記操作された変異体のＴａｇｇを、前記リード抗体のＴａｇｇと比較することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記アンフォールディングの自由エネルギーが、各前記操作された変異体のΔＧｕ１、ΔＧｕ２、又はＣ５０を、前記リード抗体のΔＧｕ１、ΔＧｕ２、又はＣ５０と比較することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記操作された変異体の前記貯蔵安定性が、２週間及び４週間に４℃又は４０℃で測定され、前記リード抗体の貯蔵安定性と比較される、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記最適な変異体が、増加されたモノマー含有量、増加されたＴｍ、増加されたＴａｇｇ、増加されたΔＧｕ１、増加されたΔＧｕ２、増加されたＣ５０値又は低減された凝集を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、２％以上のモノマー含有量の増加を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、１℃以上のＴｍ増加を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、１℃以上のＴａｇｇ増加を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、４ｋＪ／ｍｏｌ以上のアンフォールディングの自由エネルギーΔＧｕ１又はΔＧｕ２増加を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、０．１Ｍ以上のＣ５０増加を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項24】
前記最適な変異体が、前記リード抗体と比較される場合、１％以上の減少された凝集含有量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項25】
前記変異体又は変異体のライブラリの前記評価が、免疫原性リスク評価である、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記免疫原性リスク評価が、インシリコで測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
インシリコにおける前記免疫原性リスク評価が、Ｅｐｉｖａｘスコアで測定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記最適な変異体が、前記リード分子と比較される場合、同等以下のＥｐｉｖａｘスコアを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記抗体が、抗体、又は抗体の抗原結合フラグメントである、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
請求項１～２９のいずれかに記載の方法によって産生される産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、最適化された製造、インビボ挙動、及びより長い貯蔵寿命の熱力学的安定性を含む、その生物物理学的特性を高めるためにモノクローナル抗体の配列を最適化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、抗原への曝露後に一般に誘発された免疫系による保護応答として生成される。抗原の曝露後の一次応答で作製された抗体は、より低い親和性であるが、親和性は、体細胞免疫グロブリン（Ｉｇ）超変異（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７，２４８－２５４（１９９５）と称されるプロセスによって改善されることが知られている。このプロセスは、抗原に対する非常に強い親和性及び高い選択性を有する抗体をもたらす抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）における変異のセットの蓄積と共に、免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換えのいくつかのラウンド、可変性（Ｖ）、多様性（Ｄ）、及び合性（Ｊ）を含む（Ｓｕｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ４８Ｇ７ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｂｏｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３５，９９８０－９９８３（２０１３）；重複データに基づいて著者により撤回）。これらの累積変異のほとんどがＣＤＲに存在し、抗原との高親和性相互作用に重要であるが、いくつかの他のものは可変領域全体に広がり、直接抗原結合に関与しないため、抗体親和性に寄与しない（Ｗａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，４２６１－４２６６（２０１３）；重複データに基づいて著者により撤回）。ＣＤＲ（しばしば超可変領域とも呼ばれる）は、抗体抗原認識のための部位を形成する重鎖及び軽鎖の両方の可変領域におけるループである。それらの立体配座は、ループの長さ及び組成によって規定される。フレームワーク（ＦＲ）領域は、可変ドメインの構造的完全性を維持する役割を果たし、ＣＤＲの構造的足場として機能する２つのβシートに配置された逆平行β鎖である。ＦＲは、構造多様性、ＶＬ／ＶＨ配向にとって重要であり、抗原結合にも直接関与し得る（Ｓｅｌａ－Ｃｕｌａｎｇ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４（２０１３））。親和性成熟中にＣＤＲに生じる親和性変異は、抗体の安定性に有害な影響を及ぼし得る。最近、可変領域全体に位置する中性体細胞超変異は、多くの場合、親和性変異によって引き起こされる抗体安定性に対する悪影響を補償することが示されている（Ｓｕｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ４８Ｇ７ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｂｏｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３５，９９８０－９９８３（２０１３））。抗体足場の親和性と安定性との間のこの強いトレードオフはまた、ＣＤＲ内か又はフレームワーク領域のいずれかの親和性成熟プロセス中に得られた変異が機能的であると同時に脱安定化であり得る、方向付けられた進化の研究において示されている（Ｈｏｕｌｉｈａｎ，Ｇ．，Ｇａｔｔｉ－Ｌａｆｒａｎｃｏｎｉ，Ｐ．，Ｌｏｗｅ，Ｄ．＆ Ｈｏｌｌｆｅｌｄｅｒ，Ｆ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ＤＡＲＰｉｎｓ ｂｙ ＳＮＡＰ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｒａｄｅ－ｏｆｆｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ ＆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ ２８，２６９－２７９（２０１５）、Ｊｕｌｉａｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｒａｆｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ－ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ ＆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ ２８，３３９－３５０（２０１５））。
【0003】
抗体及び関連産物は、最も速い成長クラスの治療薬である。治療用抗体は、製造及び貯蔵を容易にし、並びに長い血清半減期を促進するために、高い熱安定性及び低い凝集傾向を含む好ましい医薬特性を示す必要がある。機能的に活性な分子は、立体配座及びコロイド安定性を含む好ましい生物物理学的特性を有する場合にのみ薬物になり得る。（Ｊａｉｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１４，９４４－９４９（２０１７））。抗体の適合安定性は、例えば、より高い熱安定性及び凝集する傾向がより低いことによって決定される。熱安定性は、抗体発現に始まり、精製、製剤、及び貯蔵寿命において創薬の重要な役割を担う（Ｇｏｓｗａｍｉ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．＆ Ｏｈｔａｋｅ，Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｍＡｂ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２，４５２－５００（２０１３））。高スループット自動スクリーニングアッセイは、立体配座安定性を決定し、発生の早期に数百のヒットを順序付けるために重要である。強化された熱安定性は、最適な薬物動態及び薬力学的特性、並びにより長い貯蔵寿命及び保存のために重要である（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ，Ｇ．，Ｓｅｍｐｌｅ，Ａ．，Ｊａｍｅｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．＆ Ｓｈａｍｅｅｍ，Ｍ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＭＡｂｓ ８，１０８８－１０９７（２０１６））。インビトロ親和性成熟抗体は、それらの親抗体よりも熱安定性が低いことが、一貫して観察されている。安定したフレームワーク、哺乳動物細胞ディスプレイ、及びインビトロ体細胞超変異（ＳＨＭ）へのＣＤＲグラフト化の組み合わせによる更なる最適化は、多くの場合、抗体の安定性を改善するために必要とされる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ＭＡｂｓ ６，１２７４－１２８２（２０１４））。
【0004】
有害な副作用の予防は、患者の安全性及び生物学的治療薬候補の成功に不可欠である。抗体薬物候補の最も早い発生段階で予想される免疫原性を評価し、潜在的な有害作用を排除することは最も重要である。ＦＤＡによって厳密な前臨床的リスク評価が必要であるため、予想される免疫原性を評価及び低減するために異なる方法が開発された。
【0005】
抗体操作技術は、生物学的治療薬の発見及び発達のために極めて重要である。非ヒト種から発見された抗体は、免疫原性のリスクを克服し、低減するためにヒト化される。非ヒト種に由来する抗体のヒト化は、ｍＡｂの臨床発達を最適化するために首尾よく適用されている。ヒト化抗体は、８９個のＦＤＡに現在承認されている抗体の約４３％（すなわち、３８ｍＡｂ）を表す。完全なヒト抗体は、ますます一般的であり、診療所におけるｍＡｂの比率が増加している。それらは、ヒト化体液性免疫系、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）、Ａｂｌｅｘｉｓ（登録商標）及びＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）で遺伝子操作されたトランスジェニック動物から供給されている。現在、トランスジェニック動物から得られる２１個の完全ヒトｍＡｂが承認されており、これらは全ての市販のｍＡｂの２４％に相当する。トランスジェニック動物から得られる抗体配列のいくつかは、フレームワーク及びＣＤＲ領域における体細胞超変異を含有する。体細胞超変異は、ヒトフレームワーク領域において異常な又は低頻度の残基をもたらし、生物学的治療薬の安定性及び免疫原性に影響を与える可能性がある。
【0006】
長い貯蔵寿命及び低い免疫原性を有する安定した抗体を生成することは依然として困難であり、多くの場合、長く手間のかかるプロセスである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
特定の実施形態では、本発明は、最適化された抗体を設計する方法であって、この方法が、
ａ）最適化のための抗体を特定することと、
ｂ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬにおいて１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、
ｃ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、
ｄ）当該抗体ＶＨ、ＶＬ、又はそれらの両方における１つ又は２つ以上の体細胞超変異部位を特定することと、
ｅ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、
ｆ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で当該生殖細胞系列残基を含有する変異体又は変異体のライブラリを設計及び操作することと、
ｇ）当該変異体又は変異体のライブラリの特性を評価することと、
ｈ）１つ又は２つ以上の最適化された変異体を選択することと、を含み、
当該１つ又は２つ以上の最適化された変異体が、改善された生物物理学的特性、減少された免疫原性のリスク、又はそれらの両方を有する、方法を提供する。
ａ）最適化のための抗体を特定することと、
ｂ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬにおいて１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、
ｃ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、
ｄ）当該抗体ＶＨ、ＶＬ、又はそれらの両方における１つ又は２つ以上の体細胞超変異部位を特定することと、
ｅ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、
ｆ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で当該生殖細胞系列残基を含有する変異体又は変異体のライブラリを設計及び操作することと、
ｇ）当該変異体又は変異体のライブラリの特性を評価することと、
ｈ）１つ又は２つ以上の最適化された変異体を選択することと、を含み、
当該１つ又は２つ以上の最適化された変異体が、改善された生物物理学的特性、減少された免疫原性のリスク、又はそれらの両方を有する、方法を提供する。
【0008】
他の特定の実施形態では、本発明は、最適化された抗体を設計する方法であって、この方法が、
ａ）最適化のための抗体を特定することと、
ｂ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬにおいて１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、
ｃ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、
ｄ）当該抗体ＶＨ、ＶＬ、又はそれらの両方における１つ又は２つ以上の体細胞超変異部位を特定することと、
ｅ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、
ｆ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で当該生殖細胞系列残基を含有する変異体又は変異体のライブラリを設計及び操作することと、
ｇ）当該変異体又は変異体のライブラリをクローニング及び産生することと、
ｈ）当該変異体又は変異体のライブラリの生物物理学的特性を評価することと、
ｉ）当該変異体又は変異体のライブラリの免疫原性リスクを評価することと、
ｊ）１つ又は２つ以上の最適化された変異体を選択することと、を含み、
当該１つ又は２つ以上の最適化された変異体が、改善された生物物理学的特性、減少された免疫原性のリスク、又はそれらの両方を有する、方法を提供する。
ａ）最適化のための抗体を特定することと、
ｂ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬにおいて１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、
ｃ）当該抗体ＶＨ及び／又はＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、
ｄ）当該抗体ＶＨ、ＶＬ、又はそれらの両方における１つ又は２つ以上の体細胞超変異部位を特定することと、
ｅ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、
ｆ）当該体細胞超変異部位のうちの部位で当該生殖細胞系列残基を含有する変異体又は変異体のライブラリを設計及び操作することと、
ｇ）当該変異体又は変異体のライブラリをクローニング及び産生することと、
ｈ）当該変異体又は変異体のライブラリの生物物理学的特性を評価することと、
ｉ）当該変異体又は変異体のライブラリの免疫原性リスクを評価することと、
ｊ）１つ又は２つ以上の最適化された変異体を選択することと、を含み、
当該１つ又は２つ以上の最適化された変異体が、改善された生物物理学的特性、減少された免疫原性のリスク、又はそれらの両方を有する、方法を提供する。
【0009】
特定の実施形態では、異常又は低頻度残基の特定は、例えば、限定されないが、ａｂＹｓｉｓなどのコンピュータベースのソフトウェアによって行われる。
【0010】
特定の実施形態では、生物物理学的評価は、例えば、分析的超遠心分離、熱安定性、アンフォールディングの自由エネルギー、又は分析的サイズ排除によって行われる。
【0011】
特定の実施形態では、免疫原性リスク評価は、例えば、Ｅｐｉｖａｘ（登録商標）スコアなどによって、インシリコで行われる。
【0012】
特定の実施形態では、アミノ酸置換は、例えば、４つのＦＲのうちのいずれか１つ又は２つ以上で生じ得る。この点で、アミノ酸置換は、重鎖又は軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／又はＦＲ４で生じ得る。他の特定の実施形態では、アミノ酸置換が最適化抗体の生物物理学的特性を改善する限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を生殖細胞系列残基に置換することができる。
【0013】
いくつかの他の実施形態では、アミノ酸置換は、例えば、ＣＤＲのうちのいずれか１つ又は２つ以上で生じ得る。この点で、アミノ酸置換は、重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３で生じ得る。他の特定の実施形態では、アミノ酸置換が最適化された抗体の生物物理学的特性を改善する限り、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を生殖細胞系列残基に置換することができる。
【0014】
他の実施形態では、本発明は、抗体重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドを含む単離された抗原結合剤に限定されない。実際、体細胞超変異から生じるフレームワークの任意のアミノ酸残基は、抗原結合剤の安定性が生物学的活性の同時喪失を伴わずにアミノ酸置換の結果として増強又は改善される限り、生殖細胞系列アミノ酸残基との任意の組み合わせで置換することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】ＴＭＥＢ６７５のＶＨについてのヒト生殖細胞系列配列との配列アラインメント及び異常又は低頻度残基の特定を示す。ＶＨ（Ｒ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ、Ｈ８１Ｑ）における３つの体細胞超変異（ＳＨＭ）が、フレームワーク領域内で観察された。
【図1B】ＴＭＥＢ６７５のＶｋについてのヒト生殖細胞系列配列との配列アラインメント及び異常又は低頻度残基の特定を示す。１つの体細胞超変異（ＳＨＭ）（Ａ１Ｄ）が、フレームワーク領域中に及びＣＤＲ３（Ａ９１Ｐ）中に観察された。
【図2A】ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＴＭＥＢ６７５ ＶＨの１４位でのＳＨＭアルギニン（Ｒ）の相対頻度の評価を示す。
【図2B】ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＴＭＥＢ６７５ ＶＨの２０位でのＳＨＭプロリン（Ｐ）の相対頻度の評価を示す。
【図2C】ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＴＭＥＢ６７５ ＶＨの８１位でのＳＨＭヒスチジン（Ｈ）の相対頻度の評価を示す。
【図2D】ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＴＭＥＢ６７５ ＶＬの１位でのＳＨＭアラニン（Ａ）の相対頻度の評価を示す。
【図2E】ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＴＭＥＢ６７５ ＶＬの９１位でのＳＨＭアラニン（Ａ）の相対頻度の評価を示す。
【図3】ＴＭＥＢ６７５の分子相同性モデルを示す。フレームワーク領域に見られるＳＨＭ残基は、スティック表現でラベル付けされ、強調表示される。
【図4】ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の両方に対して分析的超遠心分離が正規化されたｇ（ｓ＊）沈降速度で実行されることを示す。グローバルフィッティング分析が、ＳＥＤＡＮＡＬ ｖ６９７によって行われ、データは、２つの種の非相互作用モデルに世界的に適合された。
【図5】示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用したＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の内因性特性の特性評価を示す。３５０／３３０ｎｍ比の一次導関数強度を温度（℃）に対してプロットする。
【図6】示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用したＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の内因性特性の特性評価を示す。熱容量Ｃｐ（ｃａｌ／ｍｏｌ／℃）を温度（℃）に対してプロットする。
【図7】蛍光強度比３５０／３３０ｎＭの変化によって監視されるＧｄｎＣｌにおける等温化学変性を使用したＴＭＥＢ６７５の内因性特性の特性評価を示す。
【図8】蛍光強度比３５０／３３０ｎＭの変化によって監視されるＧｄｎＣｌにおける等温化学変性を使用したＴＭＥＢ７６２の内因性特性の特性評価を示す。
【図9】１ヶ月にわたるＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ６７５の貯蔵（４℃）及び加速（４０℃）の安定性を示す。時間ゼロ～１ヶ月の間の凝集レベルにおける変化を日数に対してプロットしている。
【図10】異なる表面に相対結合応答単位をプロットすることにより表面プラズモン共鳴法によって決定されるＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ６７５についての非特異的結合データを示す。
【図11】最適化アルゴリズムワークフローを示す。
【図12】ＰＳＭＷ５６、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ４－３９＊０１及びＰＳＭＷ５７の重鎖（ＶＨ）の配列アラインメントを示す。６８位の希少体細胞超変異（トレオニン対イソロイシン）は太字で強調表示される。ＰＳＭＷ５７は、ＰＳＭＷ５６の操作された変異体である。Ｉｌｅ６８は、トレオニンに生殖細胞系列化された。
【図13】６８位の異常又は低頻度フレームワーク残基（Ｉｌｅ）を示す。この残基を、Ｔｈｒ残基中に再操作した。Ｔｈｒの選択は、生殖細胞系列残基（ＩＧＨＶ４－３９＊０１）に基づいていた。
【図14】示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用したＰＳＭＷ５６及びＰＳＭＷ５７の内因性特性の特性評価を示す。操作された変異体ＰＳＭＷ５７は、親変異体ＰＳＭＷ５６と比較して、著しく改善されたＴｍ及びＴａｇｇを示す。
【図15A】ＤＬ３Ｂ３５５重鎖の、ヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ３－１３＊０５）並びに操作された変異体：ＤＬ３Ｂ３５５－１、ＤＬ３Ｂ３５５－２及びＤＬ３Ｂ３５５－３との配列アラインメントを示す。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列には下線が付されている。８５位（ヒスチジン）での希少体細胞超変異を太字で強調表示している。
【図15B】ＤＬ３Ｂ３５５軽鎖の、ヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ１－５＊０３）並びに操作された変異体：ＤＬ３Ｂ３５５－１、ＤＬ３Ｂ３５５－２及びＤＬ３Ｂ３５５－３との配列アラインメントを示す。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列には下線が付されている。８４位（Ｇｌｕ）での希少体細胞超変異を太字で強調表示している。
【図16A】ＤＬ３Ｂ３５５の重鎖位置８５での異常又は低頻度フレームワーク残基を示す。この残基を、対応する生殖細胞系列残基（アスパラギン）と適合するように再操作した。
【図16B】ＤＬ３Ｂ３５５の８４位の軽鎖での異常又は低頻度フレームワーク残基を示す。この残基を、対応する生殖細胞系列残基（グリシン）と適合するように再操作した。
【図17】示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用したＤＬ３Ｂ３５５及びＤＬＬ３変異体の内因性特性の特性評価を示す。３つの操作されたＤＬ３Ｂ３５５変異体は全て、親クローンと比較して改善された熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇ）を示した。
【発明を実施するための形態】
【0016】
上記の概要、及び本出願の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【0017】
本明細書に含まれる文書、作用、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、先行技術の一部を構成すること又は開示若しくは特許請求されたいずれかの発明を限定することを容認するものではない。
【0018】
本明細書全体を通して、抗体定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
【0019】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
【0020】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【0021】
移行句「含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting of）」は、特許用語において全般的に受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、かつ（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。句「含む（comprising）」（又はその同等語）に関して記載される実施形態はまた、実施形態として、「からなる」及び「から本質的になる」に関して独立して記載されるものを提供する。
【0022】
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0023】
発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者に理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【0024】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は１０％までの範囲のいずれかのより大きい範囲内であることを意味する。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0025】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0026】
「抗原」は、免疫応答を媒介することができるいずれかの分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。
【0027】
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子操作されたポリペプチドであってもよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬなどの抗原、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを模倣したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３に結合した免疫グロブリンの部分、抗原に結合した代替足場、並びに断片に結合した抗原を含む多重特異性タンパク質を含んでもよい。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結されて、ＶＨ／ＶＬドメインが、分子内で、又はＶＨ及びＶＬドメインが別々の単鎖によって発現される場合には分子間で対形成して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は抗原などの一価の抗原結合ドメイン又は二重特異性抗体を形成する様々な種類の単鎖抗体の設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又は代替足場にコンジュゲートされてもよい。
【0028】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多重特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【0029】
「生物学的活性」は、例えば、抗原の結合親和性、中和又は阻害を指す。
【0030】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２（２）：２１１－２５０）、（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（５）：１７０９－１９）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１－１７、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５－７７）及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３（５）：８００－８１５）などの様々な描写を使用して定義され得る。様々な描写と可変領域の付番との間の対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（１）：５５－７７；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９（３）：６５７－６７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照のこと）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」及び「ＬＣＤＲ３」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【0031】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ用の足場として機能する抗体領域である。フレームワーク領域は、抗原の抗体への結合を支持する役割を担う。フレームワーク残基は、抗原に接触する残基を含み、抗体の結合部位の一部であり、折り畳まれた三次元構造にあるときに、ＣＤＲに対する配列に近接して位置するか、又はＣＤＲに近接して位置する。フレームワーク残基はまた、抗原と接触しないが、ＣＤＲの構造的支持を補助することによって間接的に結合に影響を与える残基を含む。ＦＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２６３：８００－８１５）などの様々な描写を使用して定義され得る。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＦＲを描写することができる。「ＦＲ１」、「ＦＲ２」、「ＦＲ３」、「ＦＲ４」という用語は、上記の方法のいずれかによって定義されるＦＲを含む。「ＨＣＦＲ」という用語は、重鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４を表す。「ＬＣＦＲ」という用語は、軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４を表す。
【0032】
「免疫グロブリン」は、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【0033】
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【0034】
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【0035】
「単離された」は、組換え細胞などの、分子が産生される系の他の成分から実質的に分離及び／又は精製された分子（本開示のｓｃＦｖ又は本開示のｓｃＦｖを含む異種タンパク質）の均質な集団、並びに、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離／単離された」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
【0036】
「変異体（variant）」、「変異体（mutant）」”又は「変化（altered）」は、１つ又は２つ以上の改変、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。より具体的には、本発明は、生殖細胞系免疫グロブリン配列と整列されるときに、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３における任意のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、置換部位が、リード抗体で特定されたＳＭＨ部位である、変異体ポリペプチドに関する。変異体ポリペプチドは、特に安定性に関連する特性に関して、参照ポリペプチドと比較して改善された特性を有し得る。改善された安定性は、改善された熱安定性、増加されたアンフォールディングのエネルギー、より低い凝集、改善された貯蔵安定性又は改善された非特異的結合特性を示す変異体によって実証され得る。改善された特性は、典型的には、製造における変異体抗体の使用に関連する特性である。本発明のいくつかの実施形態では、改変部位は、生殖細胞系列抗体との配列アラインメントによって特定される。特定の実施形態では、配列アラインメントは、ソフトウェアａｂＹｓｉｓ（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．ａｂＹｓｉｓ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２９，３５６－３６４（２０１７））によって行われる。いくつかの実施形態では、改変置換、挿入又は欠失は、抗体操作技術によって行われる。
【0037】
「Ｔｍ」又は「中間点温度」は、熱アンフォールディング曲線の温度中間点である。それは、アミノ酸配列の５０％がその天然の立体配座にあり、他方の５０％が変性される温度を指す。熱アンフォールディング曲線は、典型的には温度の関数としてプロットされる。Ｔｍは、タンパク質の安定性を測定するために使用される。一般に、より高いＴｍは、より安定なタンパク質の指標である。Ｔｍは、円形二色性分光法、示差走査熱量測定、示差走査蛍光定量法（内因性及び外因性色素ベースの両方）、ＵＶ分光法、ＦＴ－ＩＲ及び等温熱量測定（ＩＴＣ）などの当業者に周知の方法を使用して容易に決定され得る。
【0038】
「Ｔａｇｇ」は、タンパク質が二量体化か又はオリゴマー化のいずれかを介して凝集し始める温度を指す。凝集温度は凝集の開始を検出し、その温度でタンパク質は凝集する傾向を示す。Ｔａｇｇは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）又は円二色性（ＣＤ）によって決定され得る。これらの技術は、タンパク質の立体配座における小さな変化を検出し、したがって凝集の開始点を検出することができる。Ｔａｇｇ値は、Ｔｍよりも低くても又は高くてもよい。ＴａｇｇがＴｍよりも低い場合、タンパク質は、最初に二量体化する及び／又はオリゴマー化する、のいずれかであり、次いで、Ｔａｇｇよりも高い温度で後にアンフォールディングを開始する。ＴａｇｇがＴｍよりも高い場合、タンパク質は最初にアンフォールディングを開始し、次いでＴｍよりも高い温度で凝集する。両方の事象は、一般に観察され、アミノ酸組成及びタンパク質立体配座に依存する。
【0039】
化学変性は、より低い温度（４℃～４０℃、保管及び生理学的温度）であっても、タンパク質の内因性安定性を測定するための熱変性に対する完全な相補的な方法であり、より高い温度からの推定安定値の必要性を排除する。タンパク質の温度依存性安定性は、ΔＨ、アンフォールディングエンタルピー、ΔＳ、アンフォールディングのエントロピー及びΔＣｐ及びアンフォールディングの熱容量変化などの３つの重要なパラメータの関数であるため、温度外挿は、エラーが非常に発生しやすい。
【0040】
「ΔＧｕ」は「アンフォールディングのギブス自由エネルギー」を指し、より低い温度でのタンパク質の内因性安定性を決定する際に重要な役割を果たす。ΔＧｕは、化学変性によって測定される。ΔＧｕの決定は、安定性の最適化及び凝集最小化に使用される。より高いΔＧｕを有するタンパク質は、その天然の立体配座においてより安定である。より低い温度で少量の変性タンパク質であっても存在することで、凝集、化学的劣化、並びにしたがって結合及び機能の損失を引き起こす可能性がある。したがって、治療薬候補のアンフォールディングの自由エネルギーを決定して、それらの天然の立体配座の安定性を理解することは重要である。化学変性は、紫外線、蛍光、及び円形二色性分光法などの技術によるグアニジン塩酸塩及び／又は尿素などの変性剤の存在下で測定され得る。３つのパラメータ（ΔＧｕ、Ｃ５０及びｍ）は、化学変性から収集されたデータの非線形最小二乗法フィッティングにより決定され、式中、ｍは、変性剤濃度の関数としてのΔＧｕにおける変化率であり、Ｃ５０は、タンパク質分子の５０％が天然に折り畳まれた状態にありかつ５０％がアンフォールディングされた変性状態にある変性剤濃度である。ΔＧｕ及びＣ５０の両方における増加は、タンパク質の内因性安定性の増加を示す。２つのアンフォールディング遷移が観察される場合、ΔＧｕ１及びΔＧｕ２は、それぞれ、第１のアンフォールディング遷移及び第２のアンフォールディング遷移を指す。
【0041】
「改善された安定性」は、高温又は低温、免疫グロブリン凝集、及び抗体製造中に試験された他の応力に対する耐性を増加させる抗体変異体を指す。改善された安定性を有する本開示の抗体は、モノマー含有量の増加、上昇した融点（Ｔｍ）、上昇したＴａｇｇ、上昇したアンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧｕ１、ΔＧｕ１、Ｃ５０）、又は１つ若しくは２つ以上の体細胞超変異部位のみにおいて異なる同じ抗体と比較した場合、低減された凝集のレベルを有する抗体である。モノマー含有量の上昇は、２％以上であり得る。上昇したＴｍは、１℃以上、例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、又は２５℃の上昇であり得る。上昇したＴａｇｇは、１℃以上、例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、又は２５℃の上昇であり得る。上昇したΔＧｕ１（最初のアンフォールディング遷移）又はΔＧｕ２（第２のアンフォールディング遷移）は、４ｋＪ／ｍｏｌ以上の増加であってもよい。Ｃ５０の増加は、０．１Ｍ以上であってもよい。凝集の減少は、１％以上であってもよい。
【0042】
「表面露出」は、タンパク質の表面に少なくとも部分的に露出され、溶媒にアクセス可能である、例えば、重水素化にアクセス可能であるアミノ酸残基を指す。一次配列又はタンパク質に基づく残基の表面アクセス可能性を予測するためのアルゴリズムは、当該技術分野で周知である。代替的に、表面露出残基は、タンパク質の結晶構造から特定され得る。
【0043】
「体細胞超変異」又は「ＳＨＭ」は、クラス切り替え中に見られるように、免疫系が新しい外来要素に適合する、細胞メカニズムの作用によって開始され得るか、又はそれと関連付けられ得るポリヌクレオチド配列の変異を指す。親和性成熟のプロセスの主要な成分、ＳＨＭは、抗原などの外来要素を認識するために使用されるＢ細胞受容体を多様化し、免疫系が生物の寿命中に新しい脅威に応答を適合させることを可能にする。体細胞超変異は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に影響を与える。本発明は、抗体の安定性を増加させる方法を提供し、この方法は、生殖細胞系列抗体との配列アラインメントを介して抗体のフレームワーク又はＣＤＲ領域における体細胞超変異を特定する工程を含む。この方法は、ＳＨＭ部位に存在するアミノ酸残基の頻度を評価し、それを対応する生殖細胞系列アミノ酸に変異させる工程を更に含む。
【0044】
「生殖細胞系列抗体」は、特定の抗体の発現のための遺伝的再編成及び変異につながる成熟プロセスを受けていない非リンパ細胞によってコードされる抗体配列である。本発明の様々な実施形態によって提供される利点のうちの１つは、生殖細胞系列抗体遺伝子が成熟抗体遺伝子よりも可能性が高くて、動物種の個体に特徴的な本質的なアミノ酸配列構造を節約し、したがって安定性を高めている可能性が高いという認識に由来する。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、ヒト抗体遺伝子のライブラリ、特に、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子のライブラリを使用して、免疫化キャンペーンから生じる所与の抗体における体細胞超変異を特定する。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関する生殖細胞系列ＤＮＡ及びコードタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｗｅｂリソース／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇに見出され得る。
【0046】
本発明の別の実施形態は、抗体分子のライブラリであり、各抗体分子は、ＶＨ相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のセット、並びにフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなるＶＨドメインと、ＶＬ相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４のセットからなるＶＬドメインとを含み、ＳＨＭを受けたフレームワークの１つ又は２つ以上の残基は生殖細胞系列残基に変異している。
【0047】
場合によっては、抗体のＶＨ及びＶＬフレームワーク領域は、ヒト遺伝子の生殖細胞系列アミノ酸配列に対する１つ若しくは２つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含む。場合によっては、抗体のＶＨ及びＶＬフレームワーク領域は、生殖細胞系列アミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換を含む。場合によっては、それらの置換、欠失、及び／又は挿入のうちの１つ若しくは２つ以上は、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域にある。場合によっては、それらの置換、欠失、及び／又は挿入のうちの１つ若しくは２つ以上は、重鎖及び軽鎖のＣＤＲにある。場合によっては、置換は、参照抗体中のアミノ酸に対するそのような位置での保存的又は非保存的アミノ酸置換を表し得る。
【0048】
場合によっては、重鎖の可変ドメインは、生殖細胞系列アミノ酸配列由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換、欠失及び／又は挿入を含む。場合によっては、置換は、生殖細胞系列アミノ酸配列と比較した非保存的置換である。場合によっては、置換、欠失及び／又は挿入は、重鎖フレームワーク領域にある。場合によっては、アミノ酸置換、欠失及び／又は、重鎖のＣＤＲ領域にある。
【0049】
場合によっては、軽鎖の可変ドメインは、生殖細胞系列アミノ酸配列由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換、欠失及び／又は挿入を含む。場合によっては、置換は、生殖細胞系列アミノ酸配列と比較した非保存的置換である。場合によっては、置換、欠失及び／又は挿入は、軽鎖のフレームワーク領域にある。場合によっては、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入は、軽鎖のＣＤＲ領域にある。
【0050】
別の態様では、フレームワーク領域は、結果として生じるフレームワーク領域が対応する生殖細胞系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異される。変異は、抗体の熱安定性を増加させ、貯蔵寿命を改善するために、フレームワーク領域又はＣＤＲ領域で作製され得る。フレームワーク領域の変異はまた、抗体の免疫原性を変更又は低減するために作製され得、単一抗体は、可変ドメイン又は定常ドメインのＣＤＲ又はフレームワーク領域のうちのいずれか１つ若しくは２つ以上に変異を有し得る。
【0051】
「生殖細胞系列化」という用語は、抗体ＶＨ又はＶＬ配列に見られる１つ若しくは２つ以上のアミノ酸を生殖細胞系列配列の対応するアミノ酸に反転させるプロセスである。いくつかの例では、生殖細胞系列化は、最も近い一致する生殖細胞系列配列由来の同等の残基で、異常な又は低頻度の残基を置換することを含む。ヒトＶＨ３ファミリーのメンバーに相同なアミノ酸配列を有するＶＨ又はＶＬドメインの生殖細胞系列化は、しばしば、その位置に異常又は低頻度の残基又は希少残基であることが見出された残基の置換（replacement）／置換（substitution）を伴う。異常又は低頻度残基は、体細胞超変異の結果であり得る。
【0052】
本明細書に記載の生殖細胞系列化の一般原理は、本発明のこの実施形態では等しく適用される。例として、ＶＨ及びＶＬドメインにおいて異常又は低頻度残基を含有するリード選択されたクローンは、ライブラリアプローチを適用することによってそれらのフレームワーク領域（ＦＲ）で生殖細胞系列化され得る。最も近いヒト生殖細胞系列（ＶＨ及びＶＬの場合）及びに他のヒト生殖細胞系列に対する整列後、ＦＲに変更される残基が特定され、ヒト残基が選択される。体細胞超変異残基の最も近い一致するヒト生殖細胞系列由来の同等の残基との置換を伴い得るが、これは必須ではなく、他のヒト生殖細胞系列由来の残基も使用され得る。
【0053】
生殖細胞系列化プロセスの全体的な目的は、親ＶＨ及びＶＬドメインによって形成された抗原結合部位の特異性及び親和性を保持しながら、ヒト対象に導入され、安定性が改善されたときにＶＨ及びＶＬドメインが最小限の免疫原性を示す分子を産生することである。
【0054】
「異常な残基」は、生殖細胞系列抗体に見られるアミノ酸残基の頻度と比較して、その頻度が１％未満である抗体の可変領域に見られるアミノ酸残基を指す。
【0055】
「低頻度残基」は、生殖細胞系列抗体に見られるアミノ酸残基の頻度と比較して、その頻度が低い抗体の可変領域に見られるアミノ酸残基を指す。頻度は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の頻度であり得る。
【0056】
「ＫＤ」という用語は、「平衡解離定数」を指し、平衡時の滴定測定で、又は解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を関連速度定数（Ｋｏｎ）で除算することによって得られた値を指す。「Ｋａ」は、「親和性定数」を指す。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合速度定数及び解離速度定数を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。蛍光ベースの技術を使用することにより、高い感度及び平衡状態で生理的緩衝液中のサンプルを検査する能力が提供される。他の実験アプローチ及びＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの機器を使用することができる。
【0057】
本明細書全体を通しての抗体定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（５）：１７０９－１９に記載されているＥＵインデックスに従う。
【0058】
従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードは、本明細書では、表１に示すとおりに使用される。
【0059】
【表1】
【0060】
抗体安定性を改善する方法
本発明は、抗体を改善する方法を提供し、この方法は、最適化のための抗体を特定する工程のうちの１つ若しくは２つ以上又は全てを含み、抗体ＶＨ若しくはＶＬ又はＶＨ及びＶＬ中の１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、抗体ＶＨ及びＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、ＶＨ及びＶＬのフレームワークにおける体細胞超変異部位を特定することと、体細胞超変異の部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、体細胞超変異の部位における１つ又は２つ以上の生殖細胞系列変異を含有する変異体及び変異体のライブラリを設計及び操作することと、操作された変異体をクローニング及び産生することと、操作された変異体の生物物理学的特性を評価することと、操作された変異体の免疫原性リスクを評価することと、１つ又は２つ以上の最適な変異体を選択することと、を含む。
本発明は、抗体を改善する方法を提供し、この方法は、最適化のための抗体を特定する工程のうちの１つ若しくは２つ以上又は全てを含み、抗体ＶＨ若しくはＶＬ又はＶＨ及びＶＬ中の１つ若しくは２つ以上の異常又は低頻度残基を特定することと、抗体ＶＨ及びＶＬ配列を、最も近いヒト又は非ヒト生殖細胞系列配列と整列させることと、ＶＨ及びＶＬのフレームワークにおける体細胞超変異部位を特定することと、体細胞超変異の部位で典型的に観察された１つ又は２つ以上の生殖細胞系列残基を特定することと、体細胞超変異の部位における１つ又は２つ以上の生殖細胞系列変異を含有する変異体及び変異体のライブラリを設計及び操作することと、操作された変異体をクローニング及び産生することと、操作された変異体の生物物理学的特性を評価することと、操作された変異体の免疫原性リスクを評価することと、１つ又は２つ以上の最適な変異体を選択することと、を含む。
【0061】
本発明の特定の実施形態では、異常又は低頻度残基の特定は、コンピュータベースのソフトウェアによって行われる。特定の実施形態では、コンピュータベースのソフトウェアは、ソフトウェアａｂＹｓｉｓである。異常又は低頻度残基を特定するために使用できるフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開データベース又は刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子についての生殖細胞系列ＤＮＡ及びコードタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）に見出され得る。
【0062】
生殖細胞系列配列に由来するフレームワーク領域を含有する抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる抗体、例えば、トランスジェニックマウス、ラット、若しくはニワトリ、又はファージディスプレイライブラリなどから得られる抗体を指す。そのような抗体は、例えば、自然発生する体細胞変異又は意図的な置換が原因で、その由来となった配列と比べてアミノ酸の違いを含み得る。特定の実施形態では、リード抗体の異常又は低頻度残基は、フレームワーク領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３における体細胞超変異である。
【0063】
安定性を改善するために置換され得る異常又は低頻度残基は、ソフトウェアａｂＹｓｉｓ（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．ａｂＹｓｉｓ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２９，３５６－３６４（２０１７））によって計算される最も低い頻度を有する異常又は低頻度残基である。本発明の特定の実施形態では、生殖細胞系列残基によって置換される異常な残基の頻度は、１％未満である。生殖細胞系列残基によって置換される低頻度残基の頻度は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％である。
【0064】
本発明は、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、抗体のフレームワーク領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸置換を任意選択的に含む、変異体抗体を設計する方法を提供する。任意選択的に、置換は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３内にあってもよいが、抗体の結合に影響を与えない。本発明の文脈において、置換は、異常な又は低頻度残基が観察された部位での生殖細胞系列置換である。置換の可能な部位は、抗体のフレームワーク領域内にある。例示的な置換は、生殖細胞系列置換であり得る。
【0065】
この方法はまた、元のリード抗体及び操作された変異体の安定性を評価する工程を含む。本発明の文脈において、抗体の安定性は、例えば、限定されないが、アンフォールディング、熱安定性、モノマーの定量的サイズ分布、及び他のより高次の凝集体、貯蔵、及び非特異的結合の自由エネルギーを測定することなどの、当該技術分野で既知の好適なアッセイのいずれかを使用して測定され得る。タンパク質安定性を測定する方法には、分析的超遠心分離、示差走査熱量測定、分析的サイズ排除、示差走査蛍光定量法が含まれるが、これらに限定されない。安定性を予測する方法は、分子モデリングを含んでもよい。インビボ及びインビトロでタンパク質安定性を測定する他の方法もまた、本発明に照らして使用することができる。抗体の安定性は、遷移中間点値Ｔｍ、凝集Ｔａｇｇの温度、ΔＧｕ及びＣ５０の自由エネルギー、凝集状態の変化、又は非特異的表面への結合の観点から測定することができる。本明細書で使用される「安定性」という用語は、抗体製造において試験された高温又は低温、免疫グロブリン凝集、及び他の応力に供されたときに、その構造的立体配座及び／又はその活性及び／又は親和性を保持する抗体の能力を指す。改善された安定性を有する抗体変異体は、抗体製造中に試験された高温又は低温、免疫グロブリン凝集、及び他の応力に対する耐性を増加させる抗体変異体を指す。
【0066】
いくつかの実施形態では、分析的超遠心分離評価は、操作された変異体の分析的超遠心分離速度（ＡＵＣ－ＳＶ）を、当該リード抗体のＡＵＣ－ＳＶと比較することを更に含む。好ましくは、抗体のフレームワーク領域において異常又は低頻度残基を特定し、異常又は低頻度残基を生殖細胞系列残基と置換する本発明の方法は、改善されたＡＵＣ－ＳＶ値を有する抗体バリアントを提供する。例えば、変異体抗体は、＞９５％のモノマー（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のモノマー）を示す。改善されたＡＵＣ－ＳＶ値を有する抗体は、２％以上のモノマー含有量の増加を示す。
【0067】
いくつかの実施形態では、熱安定性評価は、各当該操作された変異体の熱アンフォールディング曲線のＴｍを、当該リード抗体の熱アンフォールディング曲線のＴｍに比較することを更に含む。好ましくは、抗体のフレームワーク領域において異常又は低頻度残基を特定し、異常又は低頻度残基を生殖細胞系列残基と置換する本発明の方法は、増加されたＴｍ値を有する抗体変異体を提供する。本発明に記載される変異体抗体の熱安定性に対する１つ又は２つ以上の変異の効果は、熱アンフォールディング曲線から外挿されたＴｍ値の変化を測定することによって決定される。変異体抗体の安定性を増加させる好ましい変異は、Ｔｍを増加させることが予想される。例えば、変異体抗体は、元のリード抗体Ｔｍと比較した場合、１℃以上のΔＴｍ増加（１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、又は２５℃のΔＴｍなど）を示す。
【0068】
いくつかの実施形態では、熱安定性評価は、各当該操作された変異体のＴａｇｇ値を、当該リード抗体のＴａｇｇ値と比較することを更に含む。好ましくは、抗体のフレームワーク領域において異常又は低頻度残基を特定し、異常又は低頻度残基を生殖細胞系列残基と置換する本発明の方法は、増加されたＴａｇｇ値を有する抗体変異体を提供する。変異体抗体の安定性を増加させる好ましい変異は、Ｔａｇｇを増加させることが予想される。例えば、変異体抗体は、１～２５℃のΔＴａｇｇを示す。元のリード抗体Ｔａｇｇと比較した場合（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、又は２５℃のΔＴａｇｇ）。
【0069】
一実施形態では、アンフォールディングの自由エネルギーは、各操作された変異体のΔＧｕ１、ΔＧｕ２、Ｃ５０を、リード抗体のΔＧｕ１、ΔＧｕ２、Ｃ５０と比較することを更に含む。好ましくは、抗体のフレームワーク領域において異常又は低頻度残基を特定し、生殖細胞系列残基と異常又は低頻度残基を置換する本発明の方法は、増加したΔＧｕ１、ΔＧｕ２、Ｃ５０値を有する抗体変異体を提供する。変異体抗体の安定性を増加させる好ましい変異は、変異体抗体のΔＧｕ１、ΔＧｕ２、又はＣ５０値を増加させ得る。例えば、変異体抗体は、元のリード抗体ΔＧｕ１又はΔＧｕ２と比較した場合、４ｋＪ／ｍｏｌ以上のΔＧｕ１又はΔＧＵ２の増加を示す。変異体抗体はまた、リード抗体と比較した場合、０．１Ｍ以上のＣ５０の増加を示し得る。
【0070】
一実施形態では、当該操作された変異体の貯蔵安定性は、４℃、又は４０℃で２週間及び４週間測定され、当該リード抗体の貯蔵安定性と比較される。特定の実施形態では、貯蔵安定性は、時間ゼロ～１ヶ月の凝集レベルの変化を見ることによって測定される。好ましくは、抗体のフレームワーク領域において異常又は低頻度残基を特定し、生殖細胞系列残基と異常又は低頻度残基を置換する本発明の方法は、凝集が低減された抗体変異体を提供する。例えば、変異体抗体は、元のリード抗体凝集レベルと比較した場合、１～５％のΔ％凝集（例えば、１、２、３、４又は５％のΔ％凝集）の減少を示す。
【0071】
別の実施形態では、安定した抗体を産生する方法は、操作された変異体の免疫原性リスクを評価することを含む。
【0072】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性リスク評価は、インシリコで測定される。特定の実施形態では、インシリコでの免疫原性リスク評価は、Ｅｐｉｖａｘスコアで測定される。特定の実施形態では、変異体抗体の免疫原性リスクは、元のリード抗体の免疫原性リスクと同等か、又はそれより低い。
【0073】
特定の実施形態では、操作された変異体は、抗体のヒトフレームワーク領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３で作製される。アミノ酸置換は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって生じ得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、特許請求される発明の方法は、リード抗体及び抗体変異体の親和性を測定し、抗体変異体の親和性をリード抗体の親和性と比較することを含む。リード抗体及び抗体変異体の親和性は、任意の好適な方法を使用して実験的に決定され得る。例示的な方法は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００、Ｏｃｔｅｔ、ＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に既知の競合的結合アッセイを利用する。抗体の測定された親和性は、異なる条件（例えば、オスモル濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、及びＫｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準的な条件及び例えば本明細書に記載の緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを使用した親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定される）は典型的に、典型的な検出限界内での測定の場合、５～３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、「約」という用語は、ＫＤ値に言及する場合、アッセイにおける典型的な標準偏差を反映する。
【0075】
本発明の方法はまた、増強された安定性を示すが、リード分子と同様の親和性が保持される変異体抗体を選択することを含む。いくつかの実施形態では、変異体抗体の親和性は、当業者によって理解されるように、機能的に同じ又は同様である。他の実施形態では、変異体抗体の親和性は、元のリード抗体の親和性よりも緊密であり得る。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【実施例1】
【0076】
以下の実施例では、抗体のフレームワークで特定されたＳＨＭ部位の生殖細胞系列化による、抗前立腺標的抗体、ＴＭＥＢ６７５の最適化について記載されている。抗体は、高親和性抗体に特有の機能的基準を満たしたが、不十分な内因性の特性を示した。ＴＭＥＢ６７５の再操作は、その機能及び好ましい生物物理学的特性の両方に基づいて、ＴＭＥＢ７６２が選択された変異体のパネルを生成した。
【0077】
発見、操作及び生殖細胞系列の最適化
モノクローナル抗体（ＴＭＥＢ６７５）は、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックプラットフォームにおいて、組換えヒトＴＭＥＦＦ２でＯｍｎｉＲａｔを免疫することによって発見された。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、高度に多様化された完全ヒト抗体レパートリーを産生する治療用ヒト抗体プラットフォームである。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（２２個のヒトＶＨ、ラットＣＨ遺伝子座に連結された自然構成の全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全ヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎ Ｉｇ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＨ／Ｉｇｋａｐｐａ／Ｉｇｌａｍｂｄａ ｌｏｃｉ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔ ＣＨ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０，１４８１－１４９０（２０１３））と共に含有する。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。８９日間の免疫化レジメンに続いて、ラット由来のリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによって組換えヒトＴＭＥＦＦ２への結合に対してスクリーニングした。
モノクローナル抗体（ＴＭＥＢ６７５）は、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックプラットフォームにおいて、組換えヒトＴＭＥＦＦ２でＯｍｎｉＲａｔを免疫することによって発見された。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、高度に多様化された完全ヒト抗体レパートリーを産生する治療用ヒト抗体プラットフォームである。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（２２個のヒトＶＨ、ラットＣＨ遺伝子座に連結された自然構成の全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全ヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６個のＶλ）（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎ Ｉｇ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＨ／Ｉｇｋａｐｐａ／Ｉｇｌａｍｂｄａ ｌｏｃｉ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔ ＣＨ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０，１４８１－１４９０（２０１３））と共に含有する。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。８９日間の免疫化レジメンに続いて、ラット由来のリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによって組換えヒトＴＭＥＦＦ２への結合に対してスクリーニングした。
【0078】
スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能性について特性評価した。ＴＭＥＢ６７５は、望ましい組換えタンパク質親和性及び細胞結合属性を示し（表２）、更なる研究のために選択された。
【0079】
【表2】
【0080】
ａｂＹｓｉｓツールは、抗体重鎖及び軽鎖配列内の「異常な残基」を検索することを可能にする（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．ａｂＹｓｉｓ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２９，３５６－３６４（２０１７））。抗体配列のデータベースにおいて１％未満の閾値によって規定される異常な残基は、特定の位置の重要な機能についてのヒントを提供する。抗体配列のデータベースにおける１～１０％の閾値によって規定される低頻度の異常な残基は、特定の位置の重要な機能についてのヒントを提供する。
【0081】
ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＶＨ及びＶＬについてのヒト生殖細胞系列配列を有するＴＭＥＢ６７５の可変重鎖及び軽鎖領域の配列アラインメントは、フレームワーク領域内のいくつかの体細胞超変異（ＳＨＭ）を示した。ＶＨ（Ｒ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ、Ｈ８１Ｑ）及び２つのＳＨＭ（Ａ１Ｄ、Ａ９１Ｐ）において得られた３つの体細胞超変異が、Ｖｋで観察された（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ～図２Ｄ）。重鎖ヒトフレームワーク（ＨＣＦＲ）の１４、２０及び８１位のそれぞれに見られるアルギニン、プロリン、及びヒスチジンアミノ酸残基、並びに軽鎖ヒトフレームワークの１位に見られるアラニン残基は、ａｂＹｓｉｓ分析で低い頻度をスコア化し、これらが異常であるか、又は低頻度残基であることを示した（図２Ａ～図２Ｅ）。ＴＭＥＢ６７５のＨＣＦＲの１４位のアルギニン及び２０位のプロリンは、低頻度残基である（＜１％、表３、表４及び表５）。
【0082】
１４位に見られるＳＨＭアルギニンは、この位置で最も頻繁に見られるプロリン残基（プロリン残基頻度９５．０２９％）と比較して、希少（頻度０．１５１％）である。（表３及び表４、図２Ａ）。重鎖の２０位に見られるＳＨＭ、プロリンの頻度もまた、最も頻繁に見られるロイシン残基（頻度７３．０２４％）と比較して低い（頻度０．０８８％）。（表３及び表５、図２Ｂ）。第３のＳＨＭ、８１位のヒスチジンを見る頻度は、その位置（頻度５７．５７６％）に典型的に見られる最も頻繁に見られるグルタミン残基と比較して、比較的まれである（頻度１．６０４％）（表３及び表６、図２Ｃ）。表３は、ヒト重鎖生殖細胞系列配列、並びに１４位、２０位及び８１位での典型的な組成を示す。表４、表５及び表６は、それぞれ、ａｂＹｓｉｓデータベース重鎖配列、並びに１４位、２０位及び８１位での残基の組成を示す。表７及び表８は、ａｂＹｓｉｓデータベース軽鎖配列、並びに１位及び９１位での残基の組成をそれぞれ示す。
【0083】
【表3-1】
【0084】
【表3-2】
【0085】
【表3-3】
【0086】
【表3-4】
【0087】
【表3-5】
【0088】
【表3-6】
【0089】
【表3-7】
【0090】
【表3-8】
【0091】
【表4】
【0092】
【表5】
【0093】
【表6】
【0094】
軽鎖には２つのＳＨＭが見られた。ＳＨＭは、ＬＣＦＲの１位に見られ、その位置にアラニンをもたらした（図１Ｂ、表７）。アスパラギン酸は、この位置で最も頻繁に見出される残基（頻度３７．３５５％）であり、この位置でのＡｌａは、比較的希少である（頻度６．０９９％）（表７、図２Ｄ）。ＳＨＭは、ＬＣＣＤＲの９１位にも見られ、その位置にアラニン残基をもたらした。９１位のプロリンは、この位置で見られる最も頻度の高い残基（５０．９９６％）であるが、Ａｌａは比較的希少である（頻度２．３３２％）（表８、図２Ｅ）。
【0095】
【表7】
【0096】
【表8】
【0097】
標的タンパク質への結合に対するＳＨＭの潜在的な影響を評価するために、結合エピトープをＨＸＭＳによって決定した。４つの領域が、ＨＤＸ－ＭＳによるパラトープ規定領域として特定された。これらの領域は、体細胞超変異が観察されたフレームワークの外側の抗体の重鎖の３つの場所及び軽鎖の１つの領域に分布される（データは示さず）。したがって、これらの部位の生殖細胞系列化は、結合親和性及び機能に影響を与えると予想されない。
【0098】
重鎖ＳＨＭ部位か、又は軽鎖ＳＨＭ部位か、又は重鎖及び軽鎖の組み合わされたＳＨＭ部位のいずれかに変異を有する生殖細胞系列変異体を発現させ、機能的活性及び内因性特性の両方について試験した。図１１に概説されているワークフローは、改善された分子属性を有するＳＨＭ及び操作抗体を特定するために採用された。構築されたバイナリー変異体のライブラリは、表９に記載されている。各変異体の機能的及び生物物理学的特性を、以下に記載されるように試験した。
【0099】
【表9】
【0100】
生物物理学的評価
生物物理学的特性を評価するために使用される方法
示差走査熱量測定（ＤＳＦ）
抗体変異体の熱安定性は、自動Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用してＮａｎｏＤＳＦによって決定された。サンプルを３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーにロードすることによって、測定を行った。各サンプルについて、２回測定を行った。典型的なＩｇＧサンプルの熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃に及んだ。３３０ｎｍ及び３５０ｎｍの発光波長での内因性トリプトファン及びチロシン蛍光、並びに比Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍ比を温度に対してプロットして、アンフォールディング曲線を生成した。
生物物理学的特性を評価するために使用される方法
示差走査熱量測定（ＤＳＦ）
抗体変異体の熱安定性は、自動Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ機器を使用してＮａｎｏＤＳＦによって決定された。サンプルを３８４ウェルサンプルプレートから２４ウェルキャピラリーにロードすることによって、測定を行った。各サンプルについて、２回測定を行った。典型的なＩｇＧサンプルの熱走査は、１．０℃／分の速度で２０℃～９５℃に及んだ。３３０ｎｍ及び３５０ｎｍの発光波長での内因性トリプトファン及びチロシン蛍光、並びに比Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍ比を温度に対してプロットして、アンフォールディング曲線を生成した。
【0101】
ｎａｎｏＤＳＦ機器の後方反射光学系は、タンパク質によって吸収されない波長で近ＵＶ光を発する。凝集したタンパク質は光を散乱させ、非散乱光は検出器に到達する。後方反射光の低減は、凝集の直接測定値であり、温度に対するｍＡＵ（減衰単位）としてプロットされる。
【0102】
抗体変異体の熱アンフォールディングパラメータ（Ｔｍ及びＴａｇｇ）を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍＬで測定した。
【0103】
化学変性実験は、精製されたｍＡｂを、０Ｍ～６Ｍの異なる濃度のＧｄｎＣｌで室温で一晩インキュベートすることによって実施した。内因性蛍光を、２５℃でＮａｎｏＤＳＦを使用して次の日に測定した。Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍ比を、アンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧｕ）を得るために２状態又は３状態アンフォールディングの式のいずれかによってフィットされたアンフォールディング曲線を生成するためにＧｄｎＣｌの各濃度で、及び分子の５０％が（Ｃ１／２ａｋａ Ｃ５０）として存在する変性剤の濃度でプロットした。
【0104】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
熱安定性は、キャピラリーＶＰ－ＤＳＣマイクロ熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）によって特徴付けられた。温度スキャンを２５～１２０℃で１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び１℃／分のスキャン速度で行った。緩衝液参照スキャンをタンパク質スキャンから減算し、タンパク質の濃度を熱力学分析の前に正規化した。ＤＳＣ曲線を非２状態モデルを使用してフィットさせて、エンタルピー及び見かけの遷移温度（Ｔｍ）値を得た。
熱安定性は、キャピラリーＶＰ－ＤＳＣマイクロ熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）によって特徴付けられた。温度スキャンを２５～１２０℃で１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度及び１℃／分のスキャン速度で行った。緩衝液参照スキャンをタンパク質スキャンから減算し、タンパク質の濃度を熱力学分析の前に正規化した。ＤＳＣ曲線を非２状態モデルを使用してフィットさせて、エンタルピー及び見かけの遷移温度（Ｔｍ）値を得た。
【0105】
非特異的結合
リード分子の無関係な表面への非特異的結合を、バイオセンサー技術（ＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ）によって決定した。１μＭの濃度での抗体変異体を、無関係なタンパク質でコーティングされたＳＰＲ表面上に通過させた。無関係な表面に対して有意な結合を示す抗体は、インビボ特性が乏しく、製造上の問題を有すると予測される。無関係な表面には、負及び正に帯電したタンパク質、疎水性タンパク質、並びにヒトＩｇＧが含まれる。
リード分子の無関係な表面への非特異的結合を、バイオセンサー技術（ＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ）によって決定した。１μＭの濃度での抗体変異体を、無関係なタンパク質でコーティングされたＳＰＲ表面上に通過させた。無関係な表面に対して有意な結合を示す抗体は、インビボ特性が乏しく、製造上の問題を有すると予測される。無関係な表面には、負及び正に帯電したタンパク質、疎水性タンパク質、並びにヒトＩｇＧが含まれる。
【0106】
分析的超遠心分離
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＡＵＣ機器を使用して、分析的超遠心分離による溶液中のモノマー及びタンパク質の他のより高次の凝集体の定量的サイズ分布を測定した。サンプルを、１．２ｃｍのＢｅｃｋｍａｎセンターピース（５０Ｋｒｐｍの速度に設定）及び石英窓を備える遠心セルにロードした。細胞を集合させて、１３０ｌｂまでトルクを与えた。遠心セルを、Ａｎ－５０（８穴）又はＡｎ－６０（４穴）ローターに入れ、ＡＵＣチャンバ内に配置した。ＡＵＣ機器の温度を、実行を開始する前に少なくとも１時間２０．５℃に設定した。実行は、４０Ｋｒｐｍ２５０スキャンカウント（２５０スキャン）、スキャン収集の９０秒頻度、１０μＭデータ分解能、及び波長２８０ｎｍで行った。直接境界フィッティングソフトウェアＳＥＤＡＮＡＬを使用してデータを分析した。
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＡＵＣ機器を使用して、分析的超遠心分離による溶液中のモノマー及びタンパク質の他のより高次の凝集体の定量的サイズ分布を測定した。サンプルを、１．２ｃｍのＢｅｃｋｍａｎセンターピース（５０Ｋｒｐｍの速度に設定）及び石英窓を備える遠心セルにロードした。細胞を集合させて、１３０ｌｂまでトルクを与えた。遠心セルを、Ａｎ－５０（８穴）又はＡｎ－６０（４穴）ローターに入れ、ＡＵＣチャンバ内に配置した。ＡＵＣ機器の温度を、実行を開始する前に少なくとも１時間２０．５℃に設定した。実行は、４０Ｋｒｐｍ２５０スキャンカウント（２５０スキャン）、スキャン収集の９０秒頻度、１０μＭデータ分解能、及び波長２８０ｎｍで行った。直接境界フィッティングソフトウェアＳＥＤＡＮＡＬを使用してデータを分析した。
【0107】
短期安定性（４℃、４０℃）
濃縮されたｍＡｂを分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって試験して、モノマーのパーセンテージを測定した。次いで、ＭＡｂを４℃及び４０℃で４週間インキュベートした。アリコートを一定の間隔で採取し、完全性をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって確認した。
濃縮されたｍＡｂを分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって試験して、モノマーのパーセンテージを測定した。次いで、ＭＡｂを４℃及び４０℃で４週間インキュベートした。アリコートを一定の間隔で採取し、完全性をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって確認した。
【0108】
分子モデリング
ＭＯＥモデリングソフトウェア（ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）の標準的な抗体モデリングプロトコルを使用するＭＯＥモデリングソフトウェアを使用して、分子相同性モデルを生成した。生殖細胞系列化変異を特定し、スティック表現で強調表示した。分子図は、コンピュータグラフィックスプログラムＰｙＭｏｌで生成された。
ＭＯＥモデリングソフトウェア（ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）の標準的な抗体モデリングプロトコルを使用するＭＯＥモデリングソフトウェアを使用して、分子相同性モデルを生成した。生殖細胞系列化変異を特定し、スティック表現で強調表示した。分子図は、コンピュータグラフィックスプログラムＰｙＭｏｌで生成された。
【0109】
生物物理学的評価の結果
ＳＨＭ残基の再操作は、より良好な生物物理学的属性を有する最適化された変異体の発見につながった。試験された１１個の変異体のうち、３つの重鎖再操作生殖細胞系列変異、Ｒ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ及びＨ８１Ｑ、並びに２つの軽鎖生殖細胞系列変異、Ａ１Ｄ及びＡ９１Ｐを含有するＴＭＥＢ７６２は、最も最適な生物物理学的特性を有していた。残基の付番はＫａｂａｔに従う。熱安定化のためのＳＨＭ及び構造基準の効果をよりよく理解するために、５つの生殖細胞系列変異は、Ｆｖ’ｓ、（ＭＯＥ、ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）の両方の分子モデルにマッピングされた（図３）。５つの生殖細胞系列変異のうち、Ａ１Ｄ及びＨ８２Ｈが表面を露出され、したがってドメイン安定性に対する寄与がほとんどない可能性がある。ＶＨ Ｒ１４Ｐは、その構造に影響を及ぼし得、したがってドメイン安定性にわずかな影響を及ぼし得る。分子モデリングによれば、ＶＨ Ｐ２０Ｌ及びＶＬ Ａ９５Ｐ変異は、２つの主要な構造決定基である可能性が高い。β鎖の中央に位置するＰ２０Ｌは、その側鎖がＶＨコアに埋め込まれている。プロリンは、典型的なβ鎖構造においては好ましい残基ではない。この位置のＬｅｕは、好ましい残基を回復させ、ロイシン側鎖はコア内に十分に詰まっている。このクラスのＶＬの９５位でのアミノ酸残基は、典型的には、安定性を最大化するシス立体配座である。この位置での非Ｐｒｏ変異の安定性及び構造への影響については以前に報告されている（Ｌｕｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｖｋａｐｐａ ＣＤＲ－Ｌ３ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０２，７０８－７１９（２０１０））。この位置でのＡｌａは、局所的なカノニカル構造を歪ませるか、又はエネルギー的に不利な非Ｐｒｏシスペプチド結合に強制される可能性が高い。両方とも安定性に悪影響を与えるであろう。全体として、生殖細胞系列変異の理論的根拠は、十分に支持されている。
ＳＨＭ残基の再操作は、より良好な生物物理学的属性を有する最適化された変異体の発見につながった。試験された１１個の変異体のうち、３つの重鎖再操作生殖細胞系列変異、Ｒ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ及びＨ８１Ｑ、並びに２つの軽鎖生殖細胞系列変異、Ａ１Ｄ及びＡ９１Ｐを含有するＴＭＥＢ７６２は、最も最適な生物物理学的特性を有していた。残基の付番はＫａｂａｔに従う。熱安定化のためのＳＨＭ及び構造基準の効果をよりよく理解するために、５つの生殖細胞系列変異は、Ｆｖ’ｓ、（ＭＯＥ、ＣＣＧ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）の両方の分子モデルにマッピングされた（図３）。５つの生殖細胞系列変異のうち、Ａ１Ｄ及びＨ８２Ｈが表面を露出され、したがってドメイン安定性に対する寄与がほとんどない可能性がある。ＶＨ Ｒ１４Ｐは、その構造に影響を及ぼし得、したがってドメイン安定性にわずかな影響を及ぼし得る。分子モデリングによれば、ＶＨ Ｐ２０Ｌ及びＶＬ Ａ９５Ｐ変異は、２つの主要な構造決定基である可能性が高い。β鎖の中央に位置するＰ２０Ｌは、その側鎖がＶＨコアに埋め込まれている。プロリンは、典型的なβ鎖構造においては好ましい残基ではない。この位置のＬｅｕは、好ましい残基を回復させ、ロイシン側鎖はコア内に十分に詰まっている。このクラスのＶＬの９５位でのアミノ酸残基は、典型的には、安定性を最大化するシス立体配座である。この位置での非Ｐｒｏ変異の安定性及び構造への影響については以前に報告されている（Ｌｕｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｖｋａｐｐａ ＣＤＲ－Ｌ３ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０２，７０８－７１９（２０１０））。この位置でのＡｌａは、局所的なカノニカル構造を歪ませるか、又はエネルギー的に不利な非Ｐｒｏシスペプチド結合に強制される可能性が高い。両方とも安定性に悪影響を与えるであろう。全体として、生殖細胞系列変異の理論的根拠は、十分に支持されている。
【0110】
生物物理学的特徴
分析的超遠心分離（ＡＵＣ）
微量のプロセス及び産物関連不純物の存在は、安全性及び免疫原性関連リスクの上昇に重大な脅威をもたらす。高品質分子に対して生物物理学的特徴付けを行うことは、その内因性特性を真に決定するために不可欠である。ＡＵＣは、モノマーの定量的サイズ分布及び溶液中のタンパク質の他のより高次の凝集体を測定する強力な技術である（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．ＡＡＰＳ Ｊ ８，Ｅ５９０－６０５（２００６））。特に、沈降速度（ＳＶ）ベースの分析は、偏りのない様式で任意の緩衝液中のタンパク質の流体力学的サイズ及び形状を一意に測定する。ＴＭＥＢ７６２（黒線）及びＴＭＥＢ６７５（灰色線）の両方の分析的超遠心分離速度（ＡＵＣ－ＳＶ）実行を、図４に示す。ＳＶ－ＡＵＣ分析に基づいて、ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の両方は、精製後に＞９５％のモノマーを示し、したがって、更なる生物物理学的特徴付けのための良好な出発材料である。
分析的超遠心分離（ＡＵＣ）
微量のプロセス及び産物関連不純物の存在は、安全性及び免疫原性関連リスクの上昇に重大な脅威をもたらす。高品質分子に対して生物物理学的特徴付けを行うことは、その内因性特性を真に決定するために不可欠である。ＡＵＣは、モノマーの定量的サイズ分布及び溶液中のタンパク質の他のより高次の凝集体を測定する強力な技術である（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．ＡＡＰＳ Ｊ ８，Ｅ５９０－６０５（２００６））。特に、沈降速度（ＳＶ）ベースの分析は、偏りのない様式で任意の緩衝液中のタンパク質の流体力学的サイズ及び形状を一意に測定する。ＴＭＥＢ７６２（黒線）及びＴＭＥＢ６７５（灰色線）の両方の分析的超遠心分離速度（ＡＵＣ－ＳＶ）実行を、図４に示す。ＳＶ－ＡＵＣ分析に基づいて、ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の両方は、精製後に＞９５％のモノマーを示し、したがって、更なる生物物理学的特徴付けのための良好な出発材料である。
【0111】
熱安定性
立体配座及びコロイド安定性の両方は、安定性、貯蔵寿命及び薬剤開発成功を予測する製造可能性パラメータを十分に示している。両方のパラメータの同時評価は、長期安定性決定のための非常に強力なアプローチである。温度は、分子の構造的安定性を詳細に吟味するために広く使用されている変性方法のうちの１つである。トリプトファン系蛍光発光を、プロメウスＮＴ．４８機器を使用してＰＢＳ中の両方のｍＡｂの熱アンフォールディングを監視するために使用した。高蛍光感度検出によって、異なるサブドメインのアンフォールディングによるｍＡｂ立体配座の変化の監視が可能になる。同時に、蛍光検出は、後方反射光強度技術を使用して温度誘起凝集を監視することによって、コロイド安定性における変化を検出することができる。同様に、示差走査熱量測定は、より高い温度でドメインベースの安定性を決定するための業界最高標準の熱溶融ツールである。図５は、Ｎａｎｏ ＤＳＦによって決定されるＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の熱アンフォールディングプロファイルを提供する。データは、ＴＭＥＢ７６２がより安定であることを示している。ＴＭＥＢ７６２のアンフォールディングは、７５℃に近いＦａｂアンフォールディング発生を有する約５９℃での、ＴＭＥＢ６７５の場合より高い温度で開始する（表１０）。抗体は非常に安定であり、その温度より低い凝集（Ｔａｇｇ）の兆候を示さない。図６は、ＤＳＣによって決定されるＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の熱アンフォールディングプロファイルを示す。
立体配座及びコロイド安定性の両方は、安定性、貯蔵寿命及び薬剤開発成功を予測する製造可能性パラメータを十分に示している。両方のパラメータの同時評価は、長期安定性決定のための非常に強力なアプローチである。温度は、分子の構造的安定性を詳細に吟味するために広く使用されている変性方法のうちの１つである。トリプトファン系蛍光発光を、プロメウスＮＴ．４８機器を使用してＰＢＳ中の両方のｍＡｂの熱アンフォールディングを監視するために使用した。高蛍光感度検出によって、異なるサブドメインのアンフォールディングによるｍＡｂ立体配座の変化の監視が可能になる。同時に、蛍光検出は、後方反射光強度技術を使用して温度誘起凝集を監視することによって、コロイド安定性における変化を検出することができる。同様に、示差走査熱量測定は、より高い温度でドメインベースの安定性を決定するための業界最高標準の熱溶融ツールである。図５は、Ｎａｎｏ ＤＳＦによって決定されるＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の熱アンフォールディングプロファイルを提供する。データは、ＴＭＥＢ７６２がより安定であることを示している。ＴＭＥＢ７６２のアンフォールディングは、７５℃に近いＦａｂアンフォールディング発生を有する約５９℃での、ＴＭＥＢ６７５の場合より高い温度で開始する（表１０）。抗体は非常に安定であり、その温度より低い凝集（Ｔａｇｇ）の兆候を示さない。図６は、ＤＳＣによって決定されるＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の熱アンフォールディングプロファイルを示す。
【0112】
【表10】
【0113】
アンフォールディングの自由エネルギー
疑いのない熱変性実験は、初期に分子を等級序列化するための高スループットとして利用可能な一般的な安定性決定ツールのうちの１つである。しかしながら、既存の課題は、より高い温度データに基づいて、より低い温度で内因性安定性を正確に計算することである。この計算は、熱溶融が多くの場合により低い温度での信頼性の高い安定性パラメータの外挿を妨げる凝集に起因して不可逆的であるために、エラーが発生しやすい（Ｆｒｅｉｒｅ，Ｅ．，Ｓｃｈｏｎ，Ａ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｂ．Ｍ．＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｋ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １８，１００７－１０１３（２０１３））。更に、リード候補の安定性は、多くの場合、２５℃又は３７℃でのみ測定される。単一温度での等温化学変性（ＩＣＤ）は、任意の溶媒中のタンパク質の内因性安定性を提供するための証明された高信頼性熱力学解析である（Ｓｖｉｌｅｎｏｖ，Ｈ．，Ｍａｒｋｏｊａ，Ｕ．＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏｏｌ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ １２５，１０６－１１３（２０１８））。ＩＣＤ実験では、ｍＡｂは、立体配座変化を測定する前に、最小限１２～１６時間の変性化学物質の濃度を増加させる所与の濃度でインキュベートされる。Ｆ３５０／Ｆ３３０蛍光比の変化を使用して、変性化学物質の各測定濃度でのアンフォールディングタンパク質の画分を決定する。フィッティング曲線から計算されたアンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧｕ）は、特定の温度でのｍＡｂの内因性立体配座安定性の指標である。このフィッティングからの別の重要なパラメータはｃ５０であり、これは、抗体の５０％がアンフォールディングされる変性剤の濃度を表す。図７及び図８は、２５℃で測定したＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２のＩＣＤアンフォールディング曲線を提供する。ＴＭＥＢ６７５は、２４．３ｋＪ／ｍｏｌのΔＧｕでの単一の遷移を示し、ＴＭＥＢ７６２は、６３．５ｋＪ／ｍｏｌの第１の遷移ΔＧｕ及び３７．３ｋＪ／ｍｏｌの第２の遷移ΔＧｕで正常に挙動するｍＡｂの典型的な３つのアンフォールディング状態を示す。ＴＭＥＢ７６２の第１の遷移のアンフォールディングの自由エネルギーのおよそ３倍の増加は、その生殖細胞系列最適化ＦＡＢドメインのためにＴＭＥＢ７６２がＴＭＥＢ６７５よりも内因的に安定である可能性が高いことを明確に実証している（表１１）。
疑いのない熱変性実験は、初期に分子を等級序列化するための高スループットとして利用可能な一般的な安定性決定ツールのうちの１つである。しかしながら、既存の課題は、より高い温度データに基づいて、より低い温度で内因性安定性を正確に計算することである。この計算は、熱溶融が多くの場合により低い温度での信頼性の高い安定性パラメータの外挿を妨げる凝集に起因して不可逆的であるために、エラーが発生しやすい（Ｆｒｅｉｒｅ，Ｅ．，Ｓｃｈｏｎ，Ａ．，Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，Ｂ．Ｍ．＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｋ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １８，１００７－１０１３（２０１３））。更に、リード候補の安定性は、多くの場合、２５℃又は３７℃でのみ測定される。単一温度での等温化学変性（ＩＣＤ）は、任意の溶媒中のタンパク質の内因性安定性を提供するための証明された高信頼性熱力学解析である（Ｓｖｉｌｅｎｏｖ，Ｈ．，Ｍａｒｋｏｊａ，Ｕ．＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏｏｌ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ １２５，１０６－１１３（２０１８））。ＩＣＤ実験では、ｍＡｂは、立体配座変化を測定する前に、最小限１２～１６時間の変性化学物質の濃度を増加させる所与の濃度でインキュベートされる。Ｆ３５０／Ｆ３３０蛍光比の変化を使用して、変性化学物質の各測定濃度でのアンフォールディングタンパク質の画分を決定する。フィッティング曲線から計算されたアンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧｕ）は、特定の温度でのｍＡｂの内因性立体配座安定性の指標である。このフィッティングからの別の重要なパラメータはｃ５０であり、これは、抗体の５０％がアンフォールディングされる変性剤の濃度を表す。図７及び図８は、２５℃で測定したＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２のＩＣＤアンフォールディング曲線を提供する。ＴＭＥＢ６７５は、２４．３ｋＪ／ｍｏｌのΔＧｕでの単一の遷移を示し、ＴＭＥＢ７６２は、６３．５ｋＪ／ｍｏｌの第１の遷移ΔＧｕ及び３７．３ｋＪ／ｍｏｌの第２の遷移ΔＧｕで正常に挙動するｍＡｂの典型的な３つのアンフォールディング状態を示す。ＴＭＥＢ７６２の第１の遷移のアンフォールディングの自由エネルギーのおよそ３倍の増加は、その生殖細胞系列最適化ＦＡＢドメインのためにＴＭＥＢ７６２がＴＭＥＢ６７５よりも内因的に安定である可能性が高いことを明確に実証している（表１１）。
【0114】
【表11】
【0115】
貯蔵安定性評価
加速熱応力は、十分な分解産物を生成し、短縮されたタイムラインにおける抗体の分解メカニズムを理解するための業界で広く使用されている強制分解アッセイである。これは、長期貯蔵安定性のための直接予測として使用される。長期貯蔵（４℃）及び加速貯蔵（４０℃）の両方を、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によるそれらの分解を監視することによって、ＰＢＳにおいて１ヶ月間ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２について研究した。ａＳＥＣクロマトグラム（データは示さず）は、抗体が、凝集を介するが断片化を介せずに、経時的に劣化したことを示した。０週間、２週間及び４週間の間の凝集レベルの変化を、両方のｍＡｂについてプロットした（図９）。ＴＭＥＢ７６２は、４℃で＜０．３％の凝集体、及び４０℃での加速貯蔵時に＜１％の凝集体を１ヶ月間有していた。しかしながら、ＴＭＥＢ６７５は、４℃及び４０℃でそれぞれ、１ヶ月後に０．５％及び３％凝集増加を示した。様々な文献と一致するように、高い熱安定性が高ければ高いほど、より低い凝集の傾向と相関する（Ｂｒａｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １２，１００５－１０１７（２０１５）、Ｈｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９９，２５９８－２６０８（２０１０））。
加速熱応力は、十分な分解産物を生成し、短縮されたタイムラインにおける抗体の分解メカニズムを理解するための業界で広く使用されている強制分解アッセイである。これは、長期貯蔵安定性のための直接予測として使用される。長期貯蔵（４℃）及び加速貯蔵（４０℃）の両方を、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によるそれらの分解を監視することによって、ＰＢＳにおいて１ヶ月間ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２について研究した。ａＳＥＣクロマトグラム（データは示さず）は、抗体が、凝集を介するが断片化を介せずに、経時的に劣化したことを示した。０週間、２週間及び４週間の間の凝集レベルの変化を、両方のｍＡｂについてプロットした（図９）。ＴＭＥＢ７６２は、４℃で＜０．３％の凝集体、及び４０℃での加速貯蔵時に＜１％の凝集体を１ヶ月間有していた。しかしながら、ＴＭＥＢ６７５は、４℃及び４０℃でそれぞれ、１ヶ月後に０．５％及び３％凝集増加を示した。様々な文献と一致するように、高い熱安定性が高ければ高いほど、より低い凝集の傾向と相関する（Ｂｒａｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １２，１００５－１０１７（２０１５）、Ｈｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９９，２５９８－２６０８（２０１０））。
【0116】
非特異的結合
リード候補の配列最適化は、疎水性、電荷不均一性、折り畳み、溶解度、及び溶媒アクセシビリティなどのそれらの物理的特性の予期せぬ改変につながる場合がある。これらの内因性特性の改変は、開発可能性及び薬物動態学的挙動に大きな影響を及ぼすであろう。ｍＡｂのより速いクリアランスは、インビボでの他の無関係なタンパク質との非特異的相互作用に起因し得る。これらの単純な物理的特性は、非特異的結合アッセイによって測定され得る（Ｄｏｓｔａｌｅｋ，Ｍ．，Ｐｒｕｅｋｓａｒｉｔａｎｏｎｔ，Ｔ．＆ Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｅ－ｒｉｓｋｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅａｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．ＭＡｂｓ ９，７５６－７６６（２０１７））。ここで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの非特異的結合アッセイを使用して、ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の両方の非特異的結合特性を疎水性、荷電、及びＩｇＧ表面に対して決定した。市販の抗体を含む多くの早期及び後期の段階の候補について収集された実験データに基づいて、非特異的結合について試験される候補に対する相対的結合応答の基準（ここでは明らかにされていない）が得られた。適切な対照抗体（陽性及び陰性）は、検証のために単一の実験ごとに実行される。ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の相対応答単位を、異なる表面への結合に対してプロットした。対照デキストラン表面フローセルに対する結合応答を、各データセットから減算した。ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ６７５は、１μＭの濃度であっても試験される荷電表面のいずれにも非特異的結合を示さない（図１０）。任意の無関係な表面への非特異的結合は、インビボ挙動に関する潜在的な懸念を伴うこれらのｍＡｂを開発するための重大な課題であったことがある。
リード候補の配列最適化は、疎水性、電荷不均一性、折り畳み、溶解度、及び溶媒アクセシビリティなどのそれらの物理的特性の予期せぬ改変につながる場合がある。これらの内因性特性の改変は、開発可能性及び薬物動態学的挙動に大きな影響を及ぼすであろう。ｍＡｂのより速いクリアランスは、インビボでの他の無関係なタンパク質との非特異的相互作用に起因し得る。これらの単純な物理的特性は、非特異的結合アッセイによって測定され得る（Ｄｏｓｔａｌｅｋ，Ｍ．，Ｐｒｕｅｋｓａｒｉｔａｎｏｎｔ，Ｔ．＆ Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｅ－ｒｉｓｋｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅａｄ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．ＭＡｂｓ ９，７５６－７６６（２０１７））。ここで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの非特異的結合アッセイを使用して、ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の両方の非特異的結合特性を疎水性、荷電、及びＩｇＧ表面に対して決定した。市販の抗体を含む多くの早期及び後期の段階の候補について収集された実験データに基づいて、非特異的結合について試験される候補に対する相対的結合応答の基準（ここでは明らかにされていない）が得られた。適切な対照抗体（陽性及び陰性）は、検証のために単一の実験ごとに実行される。ＴＭＥＢ６７５及びＴＭＥＢ７６２の相対応答単位を、異なる表面への結合に対してプロットした。対照デキストラン表面フローセルに対する結合応答を、各データセットから減算した。ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ６７５は、１μＭの濃度であっても試験される荷電表面のいずれにも非特異的結合を示さない（図１０）。任意の無関係な表面への非特異的結合は、インビボ挙動に関する潜在的な懸念を伴うこれらのｍＡｂを開発するための重大な課題であったことがある。
【0117】
生物物理学的評価は、フレームワーク残基の生殖細胞系列化が、ＴＭＥＢ７６２の熱安定性を安全にかつ良好に増強し、抗体の立体配座を著しく変化させることなく凝集傾向を低下させることを示した。
【0118】
免疫原性リスク評価
ＴＭＥＢ７６２は、ヒト生殖細胞系列配列の同一性％の改善によって示されるように、ＴＭＥＢ６７５と比較して免疫原性のリスクが低下したことを示した。更に、インシリコ免疫原性リスク評価スコアも同様に大幅に改善された（表１２）。免疫原性のためのＥｐｉＶａｘスクリーニングは、ペプチド及びタンパク質の免疫原性を予測するために免疫インフォマティクスツールのセットに依存する。
ＴＭＥＢ７６２は、ヒト生殖細胞系列配列の同一性％の改善によって示されるように、ＴＭＥＢ６７５と比較して免疫原性のリスクが低下したことを示した。更に、インシリコ免疫原性リスク評価スコアも同様に大幅に改善された（表１２）。免疫原性のためのＥｐｉＶａｘスクリーニングは、ペプチド及びタンパク質の免疫原性を予測するために免疫インフォマティクスツールのセットに依存する。
【0119】
【表12】
【0120】
結合親和性
ＴＭＥＢ７６２の結合親和性を測定し、ＴＭＥＢ６７５と比較し、表１３にまとめた。
ＴＭＥＢ７６２の結合親和性を測定し、ＴＭＥＢ６７５と比較し、表１３にまとめた。
【0121】
【表13】
【0122】
結論
試験された１１個の変異体のうち、ＴＭＥＢ７６２は、最も望ましい機能的及び生物物理学的特性を有していた。ＴＭＥＢ６７５の生殖細胞系列化は、凝集する傾向が非常に低い（＜１％）、より立体配置的に安定したＴＭＥＢ７６２につながり、承認されたＦＤＡ／ＥＭＡ及び臨床ステージｍＡｂ候補の品質属性と整合する。
試験された１１個の変異体のうち、ＴＭＥＢ７６２は、最も望ましい機能的及び生物物理学的特性を有していた。ＴＭＥＢ６７５の生殖細胞系列化は、凝集する傾向が非常に低い（＜１％）、より立体配置的に安定したＴＭＥＢ７６２につながり、承認されたＦＤＡ／ＥＭＡ及び臨床ステージｍＡｂ候補の品質属性と整合する。
【実施例2】
【0123】
実施例１に記載のワークフローを適用して、異なる構造及び機能の他の抗体を最適化した。実施例２には、抗体のフレームワークで特定されたＳＨＭ部位の生殖細胞系列化による、抗前立腺標的抗体ＰＳＭＷ５６の最適化が記載されている。
【0124】
発見、操作及び生殖細胞系列の最適化
モノクローナル抗体（ＰＳＭＷ５６）が、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックプラットフォームにおいて、ＯｍｎｉＲａｔを組換えヒトＰＳＭＡタンパク質で免疫化することによって発見された。８９日間の免疫化レジメンに続いて、ラット由来のリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによる組換え抗原への結合のためにスクリーニングした。スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能性について特性評価した。変異体ＰＳＭＷ５６は、望ましい組換えタンパク質親和性を示し（表１４）、更なる研究のために選択された。抗体は、高親和性抗体の機能的基準特性を満たしたが、熱安定性が低いことを示した。
モノクローナル抗体（ＰＳＭＷ５６）が、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックプラットフォームにおいて、ＯｍｎｉＲａｔを組換えヒトＰＳＭＡタンパク質で免疫化することによって発見された。８９日間の免疫化レジメンに続いて、ラット由来のリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによる組換え抗原への結合のためにスクリーニングした。スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能性について特性評価した。変異体ＰＳＭＷ５６は、望ましい組換えタンパク質親和性を示し（表１４）、更なる研究のために選択された。抗体は、高親和性抗体の機能的基準特性を満たしたが、熱安定性が低いことを示した。
【0125】
【表14】
【0126】
抗ＰＳＭＡ抗体の操作
ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＶＨに対するヒト生殖細胞系列配列とのＰＳＭＷ５６の可変重鎖領域の配列アラインメントは、フレームワーク領域内のいくつかの体細胞超変異（ＳＨＭ）を示した。１つの体細胞超変異が、ＶＨ（Ｉｌｅ６８）において観察された（図１２及び図１３）。トレオニンは、６８位に見られる高頻度のアミノ酸残基である。６８位に見られるＩｌｅのＳＨＭは、この位で最も頻繁に見られるＴｈｒ残基（Ｔｈｒ残基頻度８５％）と比較して、低頻度（３％）である。表１５は、ａｂＹｓｉｓデータベース重鎖配列及び６８位での残基の組成を示す。操作された変異体ＰＳＭＷ５７は、Ｉｌｅ６８を親クローンＰＳＭＷ５６上のＴｈｒに置換されることによって生成された。
ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＶＨに対するヒト生殖細胞系列配列とのＰＳＭＷ５６の可変重鎖領域の配列アラインメントは、フレームワーク領域内のいくつかの体細胞超変異（ＳＨＭ）を示した。１つの体細胞超変異が、ＶＨ（Ｉｌｅ６８）において観察された（図１２及び図１３）。トレオニンは、６８位に見られる高頻度のアミノ酸残基である。６８位に見られるＩｌｅのＳＨＭは、この位で最も頻繁に見られるＴｈｒ残基（Ｔｈｒ残基頻度８５％）と比較して、低頻度（３％）である。表１５は、ａｂＹｓｉｓデータベース重鎖配列及び６８位での残基の組成を示す。操作された変異体ＰＳＭＷ５７は、Ｉｌｅ６８を親クローンＰＳＭＷ５６上のＴｈｒに置換されることによって生成された。
【0127】
【表15】
【0128】
抗ＰＳＭＡ抗体変異体－熱安定性の生物物理学的評価
重鎖Ｉ６８Ｔ変異を伴う生殖細胞系列変異体（ＰＳＭＷ５７）を発現させ、熱安定性について試験した。操作された抗ＰＳＭＡ変異体（ＰＳＭＷ５７）は、図１１に示すワークフローが他の抗体に適用可能であることを示す図１４に示すＰＳＭＷ５６と比較して、熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇの両方）の有意な増加を示した。
重鎖Ｉ６８Ｔ変異を伴う生殖細胞系列変異体（ＰＳＭＷ５７）を発現させ、熱安定性について試験した。操作された抗ＰＳＭＡ変異体（ＰＳＭＷ５７）は、図１１に示すワークフローが他の抗体に適用可能であることを示す図１４に示すＰＳＭＷ５６と比較して、熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇの両方）の有意な増加を示した。
【実施例3】
【0129】
図１１のワークフローは他の抗体に広く適用して適用可能であることを更に示すために、このワークフローを、抗前立腺癌抗体ＤＬ３Ｂ３５５を最適化するために適用した。以下の実施例では、抗体のフレームワークで特定されたＳＨＭ部位の生殖細胞系列化による、ＤＬ３Ｂ３５５の最適化について記載されている。
【0130】
発見、操作及び生殖細胞系列の最適化
抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体は、組換えヒトＤＬＬ３を有するヒトイディオタイプを有する抗体の多様なレパートリーを産生するＡｌｉｖａｍＡｂマウス、トランスジェニック完全ヒト抗体プラットフォームを免疫化することによって発見された。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによる組換え抗原への結合のためにスクリーニングした。
抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体は、組換えヒトＤＬＬ３を有するヒトイディオタイプを有する抗体の多様なレパートリーを産生するＡｌｉｖａｍＡｂマウス、トランスジェニック完全ヒト抗体プラットフォームを免疫化することによって発見された。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによる組換え抗原への結合のためにスクリーニングした。
【0131】
スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能性について特性評価した。ＤＬ３Ｂ３５５は、望ましい組換えタンパク質親和性を示し（表１６）、更なる研究のために選択された。
【0132】
【表16】
【0133】
実施例１に記載されるように、ＡｂＹｓｉｓツールを使用して、抗体重鎖及び軽鎖配列内の「異常な残基」を探索した。抗体配列のデータベースにおける１％閾値によって規定される異常な残基は、特定の位置の重要な機能についてのヒントを提供する。
【0134】
抗ＤＬＬ３抗体の操作
ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＶＨ及びＶＬのヒト生殖細胞系列配列とのＤＬ３Ｂ３５５の可変重鎖及び軽鎖領域の配列アラインメントは、フレームワーク領域内のいくつかの体細胞超変異（ＳＨＭ）を示した。１つの体細胞超変異が、ＶＨ（Ｈｉｓ８５）において観察された（図１５Ａ及び図１６Ｂ）。重鎖において、アスパラギンは、８５位に見られる高頻度のアミノ酸残基である。８５位に見られるＨｉｓのＳＨＭは、この位置で最も頻繁に見られるＡｓｎ残基（Ａｓｎ残基頻度５２％、表１７）と比較して、希少な頻度（＜１％）である。１つの体細胞超変異が、ＶＬ（Ｇｌｕ８４）で観察された（図１５Ｂ及び図１６Ｂ）。重鎖において、グリシンは、８４位に見られる高頻度アミノ酸残基である。８４位に見られるＧｌｕのＳＨＭは、この位置で最も頻繁に見られるＧｌｙ残基（Ｇｌｙ残基頻度９３％、表１８）と比較して、希少な頻度（＜１％）である。ＤＬ３Ｂ３５５の３つの操作された変異体を、表１９に示すように生成した。
ａｂＹｓｉｓポータルを使用したＶＨ及びＶＬのヒト生殖細胞系列配列とのＤＬ３Ｂ３５５の可変重鎖及び軽鎖領域の配列アラインメントは、フレームワーク領域内のいくつかの体細胞超変異（ＳＨＭ）を示した。１つの体細胞超変異が、ＶＨ（Ｈｉｓ８５）において観察された（図１５Ａ及び図１６Ｂ）。重鎖において、アスパラギンは、８５位に見られる高頻度のアミノ酸残基である。８５位に見られるＨｉｓのＳＨＭは、この位置で最も頻繁に見られるＡｓｎ残基（Ａｓｎ残基頻度５２％、表１７）と比較して、希少な頻度（＜１％）である。１つの体細胞超変異が、ＶＬ（Ｇｌｕ８４）で観察された（図１５Ｂ及び図１６Ｂ）。重鎖において、グリシンは、８４位に見られる高頻度アミノ酸残基である。８４位に見られるＧｌｕのＳＨＭは、この位置で最も頻繁に見られるＧｌｙ残基（Ｇｌｙ残基頻度９３％、表１８）と比較して、希少な頻度（＜１％）である。ＤＬ３Ｂ３５５の３つの操作された変異体を、表１９に示すように生成した。
【0135】
【表17】
【0136】
【表18】
【0137】
【表19】
【0138】
ＤＬＬ３抗体変異体－熱安定性の生物物理学的評価
各操作された抗ＤＬＬ３変異体について熱安定性パラメータを測定して、生殖細胞系列変異が生物物理学的属性にプラスの効果を有するかどうかを判定した。アンフォールディング及びＦａｂドメインアンフォールディングＴｍの開始を、ＤＳＦ及びＤＳＣによって測定した。操作された抗ＤＬＬ３変異体は、図１７に示す熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇの両方）において有意な増加を示した。
各操作された抗ＤＬＬ３変異体について熱安定性パラメータを測定して、生殖細胞系列変異が生物物理学的属性にプラスの効果を有するかどうかを判定した。アンフォールディング及びＦａｂドメインアンフォールディングＴｍの開始を、ＤＳＦ及びＤＳＣによって測定した。操作された抗ＤＬＬ３変異体は、図１７に示す熱安定性（Ｔｍ及びＴａｇｇの両方）において有意な増加を示した。
【0139】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【国際調査報告】