(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-07
(54)【発明の名称】機能性チトクロームＰ４５０インビトロアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/26 20060101AFI20221130BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20221130BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221130BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221130BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221130BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20221130BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20221130BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221130BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20221130BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/26 ZNA
C12N9/02
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N15/85 Z
C12Q1/66
C12Q1/02
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022522245
(86)(22)【出願日】2020-10-14
(85)【翻訳文提出日】2022-06-06
(86)【国際出願番号】 EP2020078867
(87)【国際公開番号】W WO2021074206
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】A60228/2019
(32)【優先日】2019-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522147632
【氏名又は名称】ファームジェネティクス ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】ノフツィガー チャリティ
(72)【発明者】
【氏名】ポールミヒル マルクス
(72)【発明者】
【氏名】ヴァノニ シモーヌ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD11
4B050LL03
4B063QA08
4B063QQ22
4B063QR02
4B063QR77
4B063QS36
4B063QX02
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA28
(57)【要約】
本発明は、チトクロームＰ４５０酵素変異体、特にＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのインビトロ方法を提供する。さらに、本発明は、本明細書中に開示される方法を実施するために必要とされる試薬（および生物学的材料、すなわち細胞）を含むキットを提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの基質を代謝するためのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのインビトロ方法であって、ｉ）チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ４５０）の酵素を発現しないか、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体を発現するか、または基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０を発現するヒト標的細胞を提供する工程と、
ｉｉ）少なくとも１つのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログをコードする少なくとも１つの核酸分子で標的細胞を一過性にトランスフェクトする工程と、
ｉｉｉ）トランスフェクトされた前記標的細胞を、少なくとも１つの基質の存在下で、ＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログの発現および基質の代謝を可能にする条件下で、培養する工程と、
ｉｖ）基質のＣＹＰ４５０誘導代謝のレベルを決定し、ここで、基質のＣＹＰ４５０誘導代謝の検出は、ＣＹＰ４５０活性を示す工程と、を含む、インビトロ方法。
【請求項2】
前記ＣＹＰ４５０変異体がＣＹＰ２Ｄ６変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記標的細胞が、排出された発光産生酵素をコードするベクターでさらにトランスフェクトされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記標的細胞が、各々が少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをコードする２つ以上の核酸分子でトランスフェクトされる、請求項２～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記標的細胞が、少なくとも２つのＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをコードする１つの核酸分子でトランスフェクトされる、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記オルソログがウマ、ネコ、またはイヌ由来のオルソログであり、好ましくは、前記オルソログがＣＹＰ２Ｄ６のウマのオルソログである、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＣＹＰ２Ｄ６変異体が、配列番号１または配列番号２と少なくとも７５％同一のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記標的細胞がＣＹＰ４５０欠損ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞またはその改変体であり、かつ／または前記標的細胞が基質の代謝に関与する機能性ＣＹＰ４５０酵素変異体を発現しない、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記標的細胞が、機能性ＣＹＰ２Ｄ６変異体を欠損し、任意にＣＹＰ２Ｄ６変異体の非機能性変異体を発現するＨＥＫ細胞の改変体である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記標的細胞が、ＣＹＰ２Ｄ６＊４または他の任意の完全に機能喪失したＣＹＰ２Ｄ６変異体を発現する、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記標的細胞が、１つ以上の合成もしくは非合成基質または合成もしくは非合成基質の混合物と共に培養される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
発光分子を、コードされた前記ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログおよび少なくとも１つのルシフェラーゼ酵素と接触させて反応混合物を生成し、続いて前記反応混合物の発光を測定して、前記ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの機能性を決定する工程をさらに含む、請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
コードされた変異体またはそのオルソログの機能性が質量分析により決定される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
ａ）チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ４５０）の酵素を発現しないか、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体を発現する細胞、およびｂ）ＣＹＰ４５０対照変異体をコードするベクターを含む、少なくとも１つのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのキット。
【請求項15】
前記キットが、ｃ）目的のＣＹＰ４５０変異体をコードするベクターをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
前記キットが、ｄ）発光排出タンパク質をコードするベクターおよび前記発光排出タンパク質の定量化のための試薬をさらに含む、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項17】
前記キットが、ｅ）ＣＹＰ２Ｄ６の合成基質または非合成基質、および代謝基質の定量化のための試薬をさらに含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項18】
試験されるＣＹＰ４５０変異体がＣＹＰ２Ｄ６変異体であり、対照変異体がＣＹＰ２Ｄ６変異体である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項19】
目的の変異体が、【表1】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、チトクロームＰ４５０酵素変異体、特にＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）の機能性を決定するためのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法を提供する。さらに、本発明は、本明細書中に開示される方法を実施するために必要とされる試薬（および生物学的材料物質、すなわち細胞）を含むキットを提供する。
【0002】
ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の原理に基づいて、本発明による方法は、ＣＹＰ変異体に関する個々の遺伝情報に関する情報を使用して、投薬を最適化し、個人化する。
【背景技術】
【0003】
ゲノム薬理学（ファーマコゲノミクス）とは、薬物応答におけるゲノムの役割を研究する学問である。その名前は、薬理学とゲノム学の融合を反映している。ゲノム薬理学は、個々の遺伝子構成が薬物に対する応答にどのように影響するかを分析する。遺伝子発現または一塩基多型を薬物動態（薬物の吸収、分布、代謝、排出）および薬力学（薬物の生物学的標的を介した作用）と関連付けることにより、後天的および遺伝的な遺伝子変異が患者の薬物反応に与える影響を扱う。ファーマコゲノミクスという用語は、薬理遺伝学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）と同じ意味で使われることがある。両用語は遺伝的影響に基づく薬物応答に関係するが、薬理遺伝学が単一の薬物と遺伝子の相互作用に焦点を当てている。これに対し、ゲノム薬理学はよりゲノムワイドな関連付けのアプローチを包含し、ゲノムとエピジェネティクスを取り入れながら複数の遺伝子が薬物反応に与える影響を扱う。
【0004】
ゲノム薬理学は、患者の遺伝子型を考慮して薬物療法を最適化し、最大限の効率と最小限の副作用を確保する合理的な手段を開発することを目的としている。ゲノム薬理学を活用することで、いわゆる“ｏｎｅ－ｄｏｓｅ－ｆｉｔｓ－ａｌｌ”と呼ばれるアプローチから脱却することが期待される。ゲノム薬理学はまた、試行錯誤的な処方方法を排除し、医師が患者の遺伝子やその機能性を考慮し、それが患者の現在または将来の治療効果にどのように影響するかを考慮することを可能にする（場合によっては、過去の治療の失敗についての説明も提供する）ものである。
【0005】
薬理遺伝学的誘導治療（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ｇｕｉｄｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）の利点は、有効性の改善、安全性の改善、入院の減少または費用の削減のいずれかである［３０］。
【0006】
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）は、補酵素としてヘム基を持つモノオキシゲナーゼ酵素ファミリーであり、ステロイド、脂肪酸、生体異物など、いくつかの分子の酸化に利用されている［１］。これらの酵素は生物界に存在し、哺乳類では主に肝細胞のミクロソームあるいは小腸、肺、胎盤、腎臓などの他の細胞タイプに存在する［２］。ＣＹＰ４５０は薬物の代謝に必須であり、このファミリーには５０種類以上のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）が確認されている。そのうち６種類（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２ＤＣ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５）だけが既存薬の９０％を代謝している［２，３］。
【0007】
肝臓のＣＹＰ４５０のわずか１～４％を占めるにすぎないにもかかわらず、ＣＹＰ２Ｄ６は最も重要な代謝酵素の１つであり、一般に処方される薬の約２５％の代謝に関与し、特に抗うつ薬と抗精神病薬に関連する［４－７］。その遺伝子は比較的小さい（約４．４ｋｂ、９つのエクソンと８つのイントロンを含む）が、ヒトＣＹＰ４５０の対立遺伝子命名データベースであるＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｐｈａｒ－ｍＶａｒ）に登録されているｓｔａｒ（＊）対立遺伝子として定義され、１３５以上のユニークな対立遺伝子が存在する［８］。
【0008】
遺伝子の多型性により、ＣＹＰ２Ｄ６酵素活性は広範囲にわたり、超急速代謝型（ＵＭ）、正常代謝型（ＮＭ）、中間代謝型（ＩＭ）、代謝不良型（ＰＭ）の４つの表現型に大別される［９］。これらの表現型の中で、ＵＭおよびＰＭは副作用や治療失敗のリスクが最も高いとされている。ヨーロッパだけでも人口の１５～２５％がＣＹＰ２Ｄ６ＮＭではないことを考慮すると［１０，１１］、分子標的治療のために酵素の代謝活性を測定することの重要性は非常に高いといえる。本発明者らの患者コホートからの未発表データ（本発明者らの方法による包括的なＣＹＰ２Ｄ６薬理遺伝学的評価で得られた）は、ヨーロッパにおけるＣＹＰ２Ｄ６の有効なＮＭが＜５０％であることを示している。さらに、ＰｈａｒｍＶａｒに従って、既知のＣＹＰ２Ｄ６変異体のうち、機能的に十分に特性化されているものは非常に少ないことが判明した［８］。
【0009】
ＣＹＰ２Ｄ６活性を測定する方法の１つに治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）があり、ＣＹＰ２Ｄ６で代謝される薬物を患者に投与し、その代謝物の生体内濃度を直接測定する［１２］。この方法は、患者に特有ではあるが、バイオプローブを採取した時点で投与されている薬物に対してのみ正確であり（その時点を超える外挿を許容しない）、手間がかかり、物流的（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に困難であり（試料は２４時間以内にドライアイスで保存し、分析する必要がある）、費用がかかり、得られた値は実験室間で大きく異なり、ＣＹＰ２Ｄ６の機能性だけでなく、投与された薬物の全代謝経路、エピジェネティック因子の寄与度のほか、容易に制御できない因子（食事に関連した異なるＣＹＰ系の阻害または活性化）も考慮に入れていない。
【0010】
さらに、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で特定のＣＹＰ２Ｄ６変異体の活性を明確に同定するために、遺伝子型は有益であるべきである。このことは、目的の対立遺伝子が、ｉ）ホモ接合性、またはｉｉ）ヘテロ接合性のＣＹＰ２Ｄ６の完全欠失（ＣＹＰ２Ｄ６＊５）のいずれかで見つかる必要があることを意味する。しかしながら、ＣＹＰ２Ｄ６変異体のほとんどは稀であるため、ＴＤＭ研究のためのこのような有用な遺伝子型を持つ患者を容易に見つけることができ、さらに、遺伝学的に予測された表現型（ＰＭからＵＭまで）については、ＣＰＩＣ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）によって具体的な投与量に関するアドバイスが提供されている。治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）アプローチについては、そのような直接的な投与量に関するアドバイスは提供されない。
【0011】
いくつかの、コンピュータを用いた（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）活性予測研究の創出は、以前のＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の活性を同定するため戦略の１つであったが［１３～１５］、不均一な結果とＣＹＰ２Ｄ６蛋白質構造および立体構造のレベルでの知識の欠如による問題が、これらのアルゴリズムの信頼性を疑問視する議論につながった。
【0012】
ＣＹＰ２Ｄ６活性の分析において、よりターゲットを絞った信頼性の高いシステムを求めて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）［１６、１７］、放射能［１８］、蛍光［１９、２０］、またはそれらの組み合わせのいずれかによる、合成または非合成基質代謝の測定に基づいて、種々のインビトロのハイスループットスクリーニングアッセイが開発されている［２１～２３］。蛍光に基づくアッセイに関して、特に天然物由来の化合物を用いた阻害試験において、固有の蛍光や消光が存在し、酵素活性の過大評価や過小評価につながることが大きな制約となっている［２４］。
【0013】
この課題を回避するために、第二世代の生物発光アッセイが開発された［２５］。そのうちの１つは、メトキシルシフェリン－エチレングリコールエステル（ルシフェリン－ＭＥ－ＥＧＥ）の使用を含む。ルシフェリン－ＭＥ－ＥＧＥは、ＣＹＰ２Ｄ６によって脱メチル化されてルシフェリンエチレングリコールエステル（ルシフェリン－ＥＧＥ）を得るルシフェリン誘導体であり、分子は次にエステラーゼによって加水分解されてルシフェリンを遊離させる。最終段階として、ルシフェラーゼ酵素は、ルシフェリンを光シグナルに変換し、このシグナルはＣＹＰ２Ｄ６活性に正比例する［２６］。このシステムはＣＹＰ２Ｄ６阻害の研究に用いられ成功しているが［２７－２９］、現在までに異なるＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子変異体に関する広範な研究は報告されていない。この理由は、ルシフェリン－ＭＥ－ＥＧＥがＣＹＰ２Ｄ６のみに特異的ではないからである。実際のところ、ルシフェリン－ＭＥ－ＥＧＥはＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ａ２によっても代謝される可能性があり、細胞内または肝ミクロソーム抽出物分析ではなく、ＮＡＤＰＨ再生成システムと結合した組換えＣＹＰ２Ｄ６への使用に限定されている［２６］。それぞれの変異体、そして全ての変異体についての組換えＣＹＰ２Ｄ６の産生がタイムリーで、資源集約的（ｒｅｓｏｕｒｃｅ－ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）であると仮定すると、このシステムがハイスループット分析に理想的ではないことは明らかである。
【0014】
さらに、今日では、配列解析を容易かつ迅速に行えるようになったため、代謝活性に関して評価する必要がある、長期間かけて、より多くのＣＹＰ４５０変異体が次々と同定されるようになった。そのため、例えばＣＹＰ２Ｄ６変異体のような膨大なレパートリーのＣＹＰ４５０変異体に関する機能情報を迅速に取得する必要があることは明らかである。
【0015】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、ＣＹＰ４５０、特にＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を、迅速で、費用効果があり、定量的で、比較可能で、かつ信頼できる方法で決定するための方法を提供することである。
【0016】
上記の技術的課題に対する解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる方法を提供することによって達成される。
【発明の概要】
【0017】
本発明の配列の簡単な説明
遺伝子、ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の公式な野生型参照配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースによって提供されていることに留意することが重要である。ＣＹＰ２Ｄ６野生型の場合、これらは、遺伝子についてはＮＧ＿００８３７６．４であり、ｍＲＮＡ転写物についてはＮＭ＿０００１０６．６であり、そしてタンパク質についてはＮＰ＿００００９７．３である。ＣＹＰ２Ｄ６の参照配列には、ローカスリファレンスゲノム（ＬＲＧ）番号ＬＲＧ＿３０３も付与されている。Ｐｈａｒｍａｃｏ－ｇｅｎｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＰｈａｒｍＶａｒ）は公式な薬理遺伝子命名データベースであり、ＰｈａｒｍＶａｒウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｖａｒ．ｏｒｇ）で定義された特定の座標セット内の野生型ＮＣＢＩ参照配列と異なるＣＹＰ４５０変異型対立遺伝子に独自の識別番号、ＰｈａｒｍＶａｒ ＩＤ（ＰＶＩＤ）を付与している。
遺伝子、ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の公式な野生型参照配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースによって提供されていることに留意することが重要である。ＣＹＰ２Ｄ６野生型の場合、これらは、遺伝子についてはＮＧ＿００８３７６．４であり、ｍＲＮＡ転写物についてはＮＭ＿０００１０６．６であり、そしてタンパク質についてはＮＰ＿００００９７．３である。ＣＹＰ２Ｄ６の参照配列には、ローカスリファレンスゲノム（ＬＲＧ）番号ＬＲＧ＿３０３も付与されている。Ｐｈａｒｍａｃｏ－ｇｅｎｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＰｈａｒｍＶａｒ）は公式な薬理遺伝子命名データベースであり、ＰｈａｒｍＶａｒウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｖａｒ．ｏｒｇ）で定義された特定の座標セット内の野生型ＮＣＢＩ参照配列と異なるＣＹＰ４５０変異型対立遺伝子に独自の識別番号、ＰｈａｒｍＶａｒ ＩＤ（ＰＶＩＤ）を付与している。
【0018】
配列番号１は、ヒト野生型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の核酸配列に対応する。
配列番号２は、ヒト野生型ＣＹＰ２Ｄ６ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号３は、ヒト野生型ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質のポリペプチド配列に対応する。
配列番号４は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊３（ＰＶ００４２８）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号５は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊９（ＰＶ００４３４）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号６は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０（ＰＶ００４３５）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号７は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１４（ＰＶ００４３９）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号８は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊２９（ＰＶ００４５３）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号９は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（ＰＶ００５２５）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号１０は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（修飾１）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。（Ｃ．１０７４Ａ＞Ｇ）
配列番号１１は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（修飾１）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。（Ｃ．１０８３Ａ＞Ｇ）
配列番号２は、ヒト野生型ＣＹＰ２Ｄ６ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号３は、ヒト野生型ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質のポリペプチド配列に対応する。
配列番号４は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊３（ＰＶ００４２８）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号５は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊９（ＰＶ００４３４）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号６は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０（ＰＶ００４３５）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号７は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１４（ＰＶ００４３９）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号８は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊２９（ＰＶ００４５３）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号９は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（ＰＶ００５２５）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。
配列番号１０は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（修飾１）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。（Ｃ．１０７４Ａ＞Ｇ）
配列番号１１は、ヒト変異型ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（修飾１）ｍＲＮＡ転写産物の核酸配列に対応する。（Ｃ．１０８３Ａ＞Ｇ）
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明による機能性ＣＹＰ２Ｄ６インビトロアッセイのためのプロトコルの概略図である。
【図2】本発明の方法によるＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（ＰＶ００５２５）変異体およびＣＹＰ２Ｄ６＊１０８の２つの変異体の機能分析結果を示す。
【図3】本発明の方法によるＣＹＰ２Ｄ６＊９（ＰＶ００４３４）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０（ＰＶ００４３５）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１４（ＰＶ００４３９）およびＣＹＰ２Ｄ６＊２９（ＰＶ００４５３）変異体の機能分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
第１の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの基質を代謝するためのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのインビトロ方法に関し、以下の工程を含む。
ｉ）チトクロームＰ４５０ファミリーの酵素（ＣＹＰ４５０）を発現しないか、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体を発現するか、または使用される基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０酵素を発現するヒト標的細胞を提供し、
ｉｉ）標的細胞を、少なくとも１つのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログをコードする少なくとも１つの核酸分子でトランスフェクトし、
ｉｉｉ）トランスフェクトされた標的細胞を、ＣＹＰ４５０変異体又はそのオルソログの発現および基質の代謝を可能にする条件の下に、少なくとも１つの基質の存在下で培養し、
ｉｖ）基質のＣＹＰ４５０に誘導された代謝のレベルを決定する。ここで、ＣＹＰ４５０に誘導された基質代謝の検出は、ＣＹＰ４５０の活性を示すものである。
ｉ）チトクロームＰ４５０ファミリーの酵素（ＣＹＰ４５０）を発現しないか、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体を発現するか、または使用される基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０酵素を発現するヒト標的細胞を提供し、
ｉｉ）標的細胞を、少なくとも１つのＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログをコードする少なくとも１つの核酸分子でトランスフェクトし、
ｉｉｉ）トランスフェクトされた標的細胞を、ＣＹＰ４５０変異体又はそのオルソログの発現および基質の代謝を可能にする条件の下に、少なくとも１つの基質の存在下で培養し、
ｉｖ）基質のＣＹＰ４５０に誘導された代謝のレベルを決定する。ここで、ＣＹＰ４５０に誘導された基質代謝の検出は、ＣＹＰ４５０の活性を示すものである。
【0021】
用語「ＣＹＰ４５０変異体」は、野生型ならびに任意の対立遺伝子、ハプロタイプ、またはその突然変異型を含む任意のヒトＣＹＰ４５０変異体を意味する。
すなわち、本発明による方法は、野生型配列、もしくはその改変された変異体、特定の対立遺伝子、ハプロタイプ、変異体などのいずれかによってコードされる任意のＣＹＰ４５０タンパク質の機能性を決定するために使用することができる。
すなわち、本発明による方法は、野生型配列、もしくはその改変された変異体、特定の対立遺伝子、ハプロタイプ、変異体などのいずれかによってコードされる任意のＣＹＰ４５０タンパク質の機能性を決定するために使用することができる。
【0022】
工程ｉ）において提供されるヒト「標的細胞」は、工程ｉｉ）においてトランスフェクトされる細胞である。トランスフェクトされる前の細胞は「標的細胞」と呼ばれ、一方、トランスフェクション後の細胞は「トランスフェクトされた細胞」と呼ばれる。標的細胞は、チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ４５０）の酵素をコードするいかなる核酸も含まない。標的細胞が、チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ４５０）の酵素をコードする任意の核酸分子を含む場合、核酸分子は、対応する基質を代謝することができないＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体のみをコードする。したがって、標的細胞は、ＣＹＰ４５０ファミリーのいかなる機能性酵素も発現することができない。言い換えれば、標的細胞はチトクロムＰ４５０ファミリーの酵素を内因的に発現しない。さらに、標的細胞が機能性ＣＹＰ酵素を発現する場合、それは、使用される基質の代謝に関与しないＣＹＰ酵素、すなわち、目的のＣＹＰ４５０変異体としていかなる場合も使用される基質を代謝することができないＣＹＰ酵素である。これにより、測定された結果、すなわち、基質のＣＹＰ４５０により誘導された代謝は、標的細胞にトランスフェクトされた核酸によってコードされるＣＹＰ４５０変異体にのみ由来することが保証される。
【0023】
細胞がチトクロームＰ４５０ファミリーの酵素（ＣＹＰ４５０）を発現しないか、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体のみを発現するか、または基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０を発現するかを評価することは、当業者には周知である。これらの要件を満たす細胞を同定する方法としては、いくつか例を挙げると、配列決定、リアルタイムＰＣＲ及び／又はウェスタンブロッティングである。
【0024】
実際、標的細胞は常に増殖している（分裂周期（ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅｓ）と通常の突然変異率を経る）ので、標的細胞の有用性は常に確認される必要がある。
【0025】
工程ｉｉ）における培養条件は、それらがＣＹＰ４５０ポリペプチドの発現を可能にするような条件である。ポリペプチドの発現を可能にする培養条件を最適化することは、当業者の日常的な能力で十分に可能である。さらに、選択された培養条件がポリペプチドの発現を可能にするか否かの同定もまた日常的であり、そしてポリペプチドの発現量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングなどの標準的な技術を使用して検出することができる。
【0026】
工程ｉｉ）における培養条件は、基質の存在下であり、それらが基質のＣＹＰ４５０誘導代謝を可能にするような条件である。言い換えれば、培養条件は、機能性ＣＹＰ４５０酵素が試験サンプル中に存在する場合、少なくともいくらかのＣＹＰ４５０に誘導された代謝が生じるような条件である。基質のＣＹＰ４５０誘導代謝を可能にする培養条件を最適化することは、十分に当業者の日常的能力の範囲内である。
【0027】
用語「基質」は、酵素が作用する分子、すなわち、本発明ではＣＹＰ４５０ファミリーの酵素が作用する分子を指す。基質が１つの場合、基質は酵素活性部位と結合し、酵素－基質複合体が形成される。基質は、１つ以上の生成物に変換され、次いで、活性部位から放出される。その後、活性部位は、別の基質分子を自由に受け入れることができる。
【0028】
基質は、細胞培養の開始時にトランスフェクトされた標的細胞に添加してもよく、またはポリペプチド発現が既に開始された後に添加されてもよい。トランスフェクトされた細胞が基質の存在下で培養される時点の最適化は、十分に当業者の日常的能力の範囲内である。
【0029】
さらに、細胞を２つ以上の基質と共にインキュベートすることが可能であり、ここで基質は、全ての合成基質または全ての非合成基質、または両方の混合物のいずれかである。これにより、種々の基質を同時にまたは次々に代謝するＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を決定することができる。
【0030】
用語「オルソログ」は、例えばウマ、ネコ、イヌなどの異なる種において見出されるＣＹＰ２Ｄ６の任意の相同遺伝子配列を指す。
【0031】
「トランスフェクション」という用語は、核酸を移入する実際の方法又は標的細胞／器官に限定されることなく、哺乳動物細胞への核酸の伝達を可能にする任意の方法を指す。すなわち、用語「トランスフェクション」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」および「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、本明細書中で交換可能に使用される。一般に、トランスフェクションは安定（ｓｔａｂｌｅ）であっても一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）であってもよい。安定なトランスフェクションでは、プラスミドＤＮＡは細胞ゲノムにうまく組み込まれ、細胞の将来の世代に受け継がれることになる。しかし、一過性のトランスフェクションでは、トランスフェクトされた物質は細胞内に入るが、細胞ゲノムに組み込まれず、したがって娘細胞には引き継がれない。安定なトランスフェクションは、外来ＤＮＡが宿主ゲノムにうまく組み込まれた細胞を選択および同定するために多くの時間（数週間～数ヶ月）を必要とし、一過性のトランスフェクションは数時間（４～４８時間）で容易に達成できるため、本発明による方法のトランスフェクションの形成は、一過性トランスフェクションであるといえる。
【0032】
これはまた、臨床介入が必要な時間枠内で臨床医を紹介できるようにすることによって、記載される方法は臨床的有用性にも適している（これは、安定なトランスフェクションアプローチでは不可能である）。
【0033】
「核酸」という用語は、ＣＹＰ４５０変異体をコードする任意の種類の核酸配列を指す。これは、例えば、１本鎖または２本鎖核酸配列またはベクターであり得る。好ましくは、核酸分子は発現ベクター（本明細書では「ベクター」と呼ぶ）の一部である。本発明の目的のために適切なベクターを提供することは、十分に当業者の日常的能力の範囲内である。
【0034】
「基質のＣＹＰ４５０誘導代謝のレベルを決定する」という用語は、基質の代謝のレベルに基づいて、核酸によってコードされるＣＹＰ４５０変異体酵素の機能性または活性を決定、評価または測定することを可能にする任意の適切な方法を指す。これは、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。したがって、「機能性」および「活性」という用語は、互換的に使用される。基質代謝の程度のレベルを決定することによって、ＣＹＰ４５０変異体がどの程度機能性／活性があるかを相関させることができる。
【0035】
本発明による方法において、ＣＹＰ４５０変異体の機能性を決定する工程は、トランスフェクトされた細胞を少なくとも１つのＣＹＰ４５０基質で処理することを含み、それによって基質の代謝の程度、換言すれば、基質のＣＹＰ４５０誘導代謝のレベルは、ＣＹＰ４５０変異体の高活性に対応する高度の代謝を有する核酸またはベクターによって発現されるＣＹＰ４５０の活性に対応する。ＣＹＰ４５０変異体の機能性を試験するために、ＣＹＰ４５０変異体をコードするベクターでトランスフェクトされた細胞を、目的となるあらゆる種類の基質で処理することができる。次いで、各変異体は、ｉ）機能の喪失、ｉｉ）機能の低下、ｉｉｉ）正常な機能およびｉｖ）機能の増大の４つのカテゴリのいずれかに分類される。用語「ＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体」は、何らかの理由で基質を代謝することができないＣＹＰ４５０ファミリーのいずれかの酵素を指す。可能性のある非機能性変異体は、とりわけ、ＣＹＰ２Ｄ６＊４（ＰＶ００４２９）、ＣＹＰ２Ｃ９＊６（ＰＶ００５４２）、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２（ＰＶ００５９９）、ＣＹＰ２Ａ１３＊７（ＰＶ００２７５）、ＣＹＰ２Ｂ６＊８（ＰＶ００７４６）である。
【0036】
本発明による方法は、哺乳動物細胞系においてＣＹＰ４５０変異体を容易に、迅速に、そして信頼性をもって試験し、そして種々の基質に関するそれらの機能性についての情報を得ることを可能にする。
【0037】
ＣＹＰ酵素の機能を調べるために使用される他の真核細胞系（昆虫細胞または酵母）と比較して、本発明は、哺乳動物細胞系、特にヒト細胞系におけるＣＹＰ酵素機能を決定する利点を有し、したがって、ヒト酵素が働く通常の環境を提供する。
【0038】
ヒトについてのインビボ方法と比較して、本発明は、侵襲性でないという利点を有し、そしてさらに、患者の健康を危険にさらす必要なしに、種々の基質の試験を行うことができる。
【0039】
さらに、本発明による方法は、迅速に実施することができ、これは、ＣＹＰ４５０変異体の機能性に関する必要な情報を数日以内に得ることができる。これにより、副作用のリスクや、提供された薬剤に反応しない可能性を排除して、どのような薬剤を患者に提供するかを数日以内に決定することができる。
【0040】
患者を４つの代謝表現型グループ（ＰＭからＵＭまで）に層別化するための現在のシステムは、定量的ではなく定性的である。現在、ＣＰＩＣはその機能に基づいて各対立遺伝子に活性スコア（ＡＳ）を割り当てている。
１＝完全に機能性（すなわち＊１対立遺伝子）
０．５＝機能低下（すなわち＊４１対立遺伝子）
０．２５＝機能の大幅な低下（＊１０対立遺伝子）
０＝機能なし（＊４対立遺伝子）
ＴＡＳ（ｔｏｔａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、患者がもつそれぞれの対立遺伝子のＡＳを合計することによって算出される。例えば、＊１／＊１遺伝子型のＴＡＳは２（１＋１）、＊１／＊４遺伝子型のＴＡＳは１（１＋０）、＊１／＊１０遺伝子型のＴＡＳは１．２５（１＋０．２５）、＊１／＊４１遺伝子型のＴＡＳは１．５（１＋０．５）である。２．２５を超えるＴＡＳはＵＭであり、１．２５から２．２５の間のＴＡＳはＮＭであり、０から１．２５の間のＴＡＳはＩＭであり、０に等しいＴＡＳはＰＭである。上記の例では、代謝表現型は、＊１／＊１、＊１／＊１０及び＊１／＊４１についてはＮＭ、＊１／＊４についてはＩＭである。
１＝完全に機能性（すなわち＊１対立遺伝子）
０．５＝機能低下（すなわち＊４１対立遺伝子）
０．２５＝機能の大幅な低下（＊１０対立遺伝子）
０＝機能なし（＊４対立遺伝子）
ＴＡＳ（ｔｏｔａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、患者がもつそれぞれの対立遺伝子のＡＳを合計することによって算出される。例えば、＊１／＊１遺伝子型のＴＡＳは２（１＋１）、＊１／＊４遺伝子型のＴＡＳは１（１＋０）、＊１／＊１０遺伝子型のＴＡＳは１．２５（１＋０．２５）、＊１／＊４１遺伝子型のＴＡＳは１．５（１＋０．５）である。２．２５を超えるＴＡＳはＵＭであり、１．２５から２．２５の間のＴＡＳはＮＭであり、０から１．２５の間のＴＡＳはＩＭであり、０に等しいＴＡＳはＰＭである。上記の例では、代謝表現型は、＊１／＊１、＊１／＊１０及び＊１／＊４１についてはＮＭ、＊１／＊４についてはＩＭである。
【0041】
このように、機能が不明な対立遺伝子はこの系に適用できないことは明らかである。また、特定の対立遺伝子の機能評価がより定量的であればあるほど、より正確な層別化を行うことができる。４つの代謝グループの代わりに、８つ（またはそれ以上）を区別することができたことで、本発明による方法の臨床的有用性を増大させることができた。本明細書に開示されるようなインビトロ系は、このような可能性を提供する。
【0042】
さらに、トランスフェクトされた標的細胞はヒト細胞であるので、本発明による方法は、核酸によってコードされるヒトＣＹＰ４５０変異体の天然環境に類似するシステムを提供する。したがって、例えば、対応するＮＡＤＰＨ再生系を提供することによって、ヒト細胞の環境に近い環境を人工的に作り出す必要がない。ヒト細胞の環境は、コードされたＣＹＰ４５０変異体がヒトの体内で提供される条件下と同様に作用することを可能にする。したがって、ＣＹＰ４５０変異体の機能性／活性が、ヒトの体内におけるその機能性／活性と比較して損なわれたり変化したりしないことが保証される。従って、本発明による方法は、ヒトの体内とほぼ同一の条件下で、コードされたＣＹＰ４５０変異体の機能性を決定することができる。
【0043】
チトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ４５０）のいかなる（機能的）酵素も内因的に発現しない標的細胞株を使用するため、または使用する基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０酵素のみを使用する場合、本方法の結果は、細胞株にトランスフェクトされたＣＹＰ４５０変異体の機能性のみを反映し、標的細胞ゲノムによってコードされる任意のＣＹＰ酵素活性に影響されないであろう。
【0044】
本発明による方法を用いて、単一またはいくつかのＣＹＰ４５０変異体の機能性に関する情報を、迅速、容易、かつ信頼性の高い方法で得ることができ、（ｉ）単一または複数の遺伝子変異体の特異的機能及び／又は（ｉｉ）その基質特異性を調べることを可能にし、したがって、それを必要とする患者への投薬の可能性についての迅速かつ正確に決定することが可能である。
【0045】
患者への投薬に関する決定は、タイムリーに（速く）行われる必要があり、本発明が可能にする数週間または数ヶ月とは対照的に、数日で行われなければならない。
【0046】
本発明による方法は、特許のための可能な投薬方法について正確な結論を引き出すことを可能にするが、他のアプローチは、それらの実験的設定のために誤った投薬を選択するリスクを負う可能性がある。例えば、様々なＣＹＰ酵素を発現する細胞を用いた毒性スクリーニング、または全ての遺伝子変異体またはその組み合わせを網羅していないスコアリングシステム、または治療対象の患者がまだ記載されていない変異体を有するにもかかわらず既知の酵素変異体に基づくデータに依存するなどである。
【0047】
さらに、本発明による方法では、様々なＣＹＰ４５０バリアントの機能性に関する情報を含むデータベースを容易に作成することができ、これは、ＣＹＰ４５０バリアントの任意の機能性をさらに予測するのに役立つと考えられる。
【0048】
本発明による方法は、変異スキームに基づいて人々の特定のサブグループを同定するのに役立ち得る。または特定のレベルの酵素活性に関与すると思われる対応するＣＹＰ遺伝子の特定の部分を同定することを可能にすることができる。一般に、本発明による方法を用いて、機能予測に使用することができる特定のＣＹＰ変異体及びそれらの組み合わせについてのデータを収集することが可能である。
【0049】
本発明は、ＣＹＰ４５０ファミリーの任意の酵素変異体に適用可能である。
【0050】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＹＰ４５０変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６変異体である。
【0051】
例えば、変異体ＣＹＰ２Ｄ６＊２９（ＰＶ００４５３）は、野生型ＣＹＰ２Ｄ６＊１（ＰＶ００１２６）に基づき、次にあげる違いを有する。ｃ．４２５Ｇ＞Ａ、ｃ．４２７Ｇ＞Ｃ、ｃ．９０５Ｃ＞Ｔ、ｃ．１０３１Ｇ＞Ａ、ｃ．１４７６Ｇ＞Ｃ。
【0052】
すべてのＣＹＰ２Ｄ６変異型対立遺伝子はすべてＰｈａｒｍＶａｒ社によって公式に認められ、カタログ化されており、現時点では以下のＣＹＰ２Ｄ６変異体が含まれている。
【0053】
【表1】
【表2】
【0054】
このリストは網羅的ではなく、当業者は、変更（追加、削除または他の修正）がこれらのリストに起こり得ることを十分に認識しているが、当業者は、ＣＹＰ４５０変異体がＣＹＰ２Ｄ６変異体であるとみなせるかどうかを常に評価することが可能であるだろう。
【0055】
ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性、すなわち、基質のＣＹＰ２Ｄ６誘導代謝を分類するために、以下を適用する。機能喪失ＣＹＰ２Ｄ６変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３（機能喪失変異体のポジティブコントロール）と有意差のない活性を有する。正常機能変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１（正常機能に対するポジティブコントロール）と有意差のない活性を有する。機能増加型変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１よりも有意に大きい活性を有する。機能低下型変異体はＣＹＰ２Ｄ６＊３よりも有意に高く、ＣＹＰ２Ｄ６＊１よりも有意に低い活性を有する。
【0056】
本発明による方法は、標的細胞を、排出された発光産生酵素をコードするベクターでトランスフェクトする工程をさらに含むことができる。
【0057】
排出された発光産生酵素をコードするベクターで標的細胞をトランスフェクトすることによって、排出された酵素、すなわち細胞外のタンパク質によって産生される発光を、トランスフェクションの成功率と相関させることができる。細胞外のタンパク質に由来する高い発光が測定される場合、核酸、好ましくはベクター、すなわちＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードするものおよび排出される発光産生酵素をコードするものの両方が同時にトランスフェクトされる。すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードするものと、排出される発光産生酵素をコードするものが同時トランスフェクトされる、すなわち、並行してトランスフェクトされる。これにより、単一細胞または細胞培養物間で正規化計算を行うことが可能になる。
【0058】
次に、各変異体は、ｉ）機能喪失、ｉｉ）機能低下、ｉｉｉ）機能正常、ｉｖ）機能増加の４つのカテゴリのいずれかに分類される。詳細は「材料と方法」を参照されたい。従って、本発明の方法によって得られた情報を用いて、患者への投薬に関する決定を行うのに役立つ、患者のＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を分類することが可能である。
【0059】
本発明の方法において、標的細胞は、少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをコードする２つ以上の核酸又はベクターでトランスフェクトすることが可能である。
【0060】
少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをそれぞれコードする２つ以上の核酸またはベクターで細胞をトランスフェクトすることによって、
少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体を含む２つの対立遺伝子、１つは母親由来の対立遺伝子、もう１つは父親由来の対立遺伝子を常にコードしているヒトや動物体の状況をよりよく模倣することが可能である。
少なくとも１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体を含む２つの対立遺伝子、１つは母親由来の対立遺伝子、もう１つは父親由来の対立遺伝子を常にコードしているヒトや動物体の状況をよりよく模倣することが可能である。
【0061】
さらに、１つの細胞内でＣＹＰ２Ｄ６変異体の組み合わせを調べることができ、未知の相乗効果や拮抗効果を明らかにできる可能性がある。
【0062】
また、２つ以上の核酸分子がそれぞれ同じＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをコードして、所望の変異体の通常より高い発現率を得ることも可能である。
【0063】
本発明によれば、細胞を、少なくとも２つのＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログをコードする１つの核酸またはベクターでトランスフェクトすることもできる。対象となるすべてのＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードする１つの核酸またはベクターで標的細胞をトランスフェクトすることによって、標的細胞が、１つの核酸またはベクターによってコードされるので、コードされるすべてのＣＹＰ２Ｄ６変異体で同様にうまくトランスフェクトされたことが保証される。異なる遺伝子をコードするいくつかのベクターで細胞をトランスフェクトする場合、１つのベクターのトランスフェクションが、他のベクターのトランスフェクションよりも成功し、標的細胞において異なる量のベクターを生じることを排除することはできない。
【0064】
本発明による方法の好ましい実施形態は、各々１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードする２つのベクターで標的細胞をトランスフェクションすることを含んでいる。
【0065】
本発明の方法のより好ましい実施形態は、２つのＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードする１つのベクターで標的細胞をトランスフェクションすることを含んでいる。これにより、ゲノムにコードされる２つのＣＹＰ２Ｄ６変異体を有する人体のような状況が、両方のバリアントが同量でトランスフェクションされることによって得られる。このことは、ＣＹＰ２Ｄ６変異体のオルソログをコードするベクターを細胞にトランスフェクトした場合にも当てはまる。
【0066】
ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの核酸またはベクターの量のあらゆる組み合わせが可能である。例えば、細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードする１つのベクターでトランスフェクトされ得る。他の例としては、細胞が、各々が１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＣＹＰ２Ｄ６変異体をコードする１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のベクターでトランスフェクトされることが挙げられる。
【0067】
人々は、実際に変異体の複数のコピー、特にＣＹＰ２Ｄ６変異体（少なくとも１３コピーまで）を実際に有することができることが知られている。複数のコピーをコードするベクターでのトランスフェクションすること、または複数のコピーをコードするいくつかのベクターでトランスフェクションすることは本発明による方法に包含される。
【0068】
本発明による一実施形態では、ベクターによってコードされるオルソログは、とりわけ、ウマ、ネコまたはイヌ由来のオルソログである。
【0069】
好ましい実施形態において、オルソログは、ＣＹＰ２Ｄ５０またはＣＹＰ２Ｄ１４のようなウマ由来のオルソログである。
【0070】
当業者は、動物ゲノムの同定又は配列決定により、実際にヒトＣＹＰ２Ｄ６のオルソログとみなせるものに変化が生じるかもしれないという事実について認識している。したがって、ここに列挙されていなくても、ＣＹＰ２Ｄ５０またはＣＹＰ２Ｄ１４のようなオルソログよりも別のＣＹＰ２Ｄ６オルソログを、本実施形態によるウマＣＹＰ２Ｄ６オルソログとみなされるべきかもしれない。
【0071】
本発明によれば、ＣＹＰ２Ｄ６変異体は、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７５％同一のヌクレオチド配列によってコードされ得る。用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」は、本明細書において交換可能に使用される。
【0072】
本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」は、配列間で、好ましくは配列番号１及び／又は配列番号２によってコードされるヌクレオチド配列の全長にわたって同一である核酸分子のパーセンテージを示す。
【0073】
本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１によってコードされるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％、８０％または８５％の配列同一性を有するか、または配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を有する。
【0074】
本発明の方法について、標的細胞は、ＣＹＰ２Ｄ６欠損ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞又はその改変体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）であってもよく、及び／又は標的細胞は、基質の代謝に関与する機能的ＣＹＰ４５０酵素変異体を発現しない。ＨＥＫ細胞は、トランスフェクトが容易であり、細胞培養のためのハンドリングに関して容易である。
【0075】
用語「その改変体」は、ＨＥＫ細胞に由来するが、例えばＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞のように改変されたＨＥＫ細胞を指し、これは、ＳＴＡＴ６を安定的に発現するように操作されている。本発明者らが購入したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞は、非機能性ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型（＊４／＊４）を有する。これは、内因的に発現するＣＹＰ酵素の干渉を受けずにＣＹＰ変異体を試験するための、事実上完全なヒト細胞系を提供する。先に述べたように、この細胞株はＳＴＡＴ６を安定的に発現しており、その目的は、生物活性のあるヒトインターロイキン４及びヒト／マウスインターロイキン１３の検出を可能にすることであり、これは全く異なる系統／研究分野である。この細胞株はすでに遺伝子改変されており、本発明者の手によって複数の分裂サイクルが行われているので、当然にすべての市販されているＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞株がこの特定のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型を有するものではない。ある細胞が改変型とみなせるかどうかを評価することは、十分に当業者の知識の範囲内である。
【0076】
好ましい実施形態では、標的細胞は、機能性ＣＹＰ２Ｄ６変異体を欠損し、場合によりＣＹＰ２Ｄ６変異体の非機能性変異体のみを発現し得るＨＥＫ細胞の改変バージョンであり得る。
【0077】
本発明のさらなる実施形態によれば、標的細胞は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４又は他の任意の完全機能喪失ＣＹＰ２Ｄ６変異型対立遺伝子を（内因的に）発現することができる。用語「完全機能喪失」は、基質を代謝することができないＣＹＰ２Ｄ６酵素の任意の変異体を指す。完全機能喪失ＣＹＰ２Ｄ６変異体酵素のさらなる例は、とりわけ、＊３、＊５、＊７、＊１５である。
【0078】
本発明による方法のための細胞の例は、それらが要件を満たし、かつチトクロームＰ４５０ファミリーの酵素（ＣＹＰ４５０）を発現せず、またはＣＹＰ４５０酵素の非機能性変異体を発現せず、または基質の代謝に関与しないＣＹＰ４５０を発現しないことを条件として、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、トゥールーズ、フランス）である。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞は、本発明者らによってサンガーシークエンス（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって試験されており、この細胞株が非機能性ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型（＊４／＊４）のみを発現することが実証されている。
【0079】
ＣＹＰ２Ｄ６欠損の標的細胞を使用することにより、及び／又は完全機能喪失を発現するＣＹＰ２Ｄ６変異体、またはそれらがＣＹＰ４５０酵素を（内因的に）発現する場合、この酵素は使用される基質の代謝に関与しないため、本発明の方法は、標的細胞のトランスフェクションに使用される核酸又はベクターによってコードされるＣＹＰ２Ｄ６変異体のみの機能性を決定することを可能にする。これらのタイプの標的細胞を使用することにより、内因性ＣＹＰ２Ｄ６のバックグラウンドが得られる結果を損なうことが回避される。したがって、決定された機能性は、細胞のトランスフェクションに使用されたベクターによってコードされるＣＹＰ２Ｄ６変異体に完全に由来することが保証される。これにより、特定のＣＹＰ２Ｄ６変異体が、特定の基質を代謝する機能性についての明確な記述が可能になる。
【0080】
このことは、細胞内で２つ以上のＣＹＰ２Ｄ６酵素が発現すると、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性が異なり、様々なＣＹＰ２Ｄ６変異体が互いの機能性に影響を与える可能性があることを排除できないため、これは特に重要である。他のＣＹＰ２Ｄ６変異体が測定結果に関与しないことを確認する場合にのみ、この１つのＣＹＰ２Ｄ６変異体について正確な記述が可能である。
【0081】
本発明による方法の場合、使用される基質は、合成基質あるいは非合成基質であり得る。
【0082】
本発明による方法は、任意のＣＹＰ２Ｄ６基質に関して、それが合成または非合成基質であるかどうかにかかわらず、目的とするＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を決定することを可能にする。ＣＹＰ２Ｄ６に対する任意の基質または潜在的基質を本発明による方法に使用することができ、所望のＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を、選択された基質に関して決定することができる。
【0083】
さらに、上記の異なる基質を、それぞれのＣＹＰ酵素によって代謝される薬剤の存在下または非存在下で試験することができ、したがって、照会されるＣＹＰ酵素に対する基質特異性及び／又はその変異体の存在下で決定することができる。
【0084】
これにより、特定のＣＹＰ２Ｄ６変異体の迅速なスクリーニングを実施して、対象となり得る基質の全範囲を考慮してその機能性を決定することができる。したがって、数日以内に、患者のＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を、患者の治療にとって目的となり得る基質を代謝するその機能性について試験することができる。結果に基づいて、どの種類の薬剤が適用され得るか、または適用され得ないかの判断がなされ得る。
【0085】
合成基質の例としては、以下のものが挙げられる。３－［２－（Ｎ，Ｎ－ジエチル－Ｎ－メチル－アンモニウム）エチル］－７－メトキシ－４－メチルクマリン（ＡＭＭＣ）、７－エトキシ－メチルオキシ－３－シアノクマリン（ＥＯＭＣＣ）、メトキシ－ルシフェリン－エチレングリコールエステル（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＭＥ－ＥＧＥ）、［Ｏ－メチル－１４Ｃ］－デキストロメトルファン、および５′－カルボキシプロパルギルアミドプローブである。
【0086】
非合成基質の例としては、ミプラミン、アミトリプチリン、フルオキセチン、パロキセチン、フルボキサミン、ベンラファキシン、デュロキセチン、ミアンセリン、ミルタザピン、コデイン、トラマドール、Ｏ－デスメチルトラマドール、Ｎ－デスメチルトラマドール、オキシコドン、ヒドロコドン、タペンタドール、ハロペリドール、リスペリドン、ペルフェナジン、チオリダジン、ズクロペンチキソール、イロペリドン、アリピプラゾール、クロルプロマジン、レボメプロマジン、レモキシプリド、ミナプリン、タモキシフェン、メトプロロール、チモロール、アルプレスノロール、カルベジロール、ブフラロール、ネビボロール、プロプラノロール、デブリソキン、フレカイニド、プロパフェノン、エンカイニド、メキシレチン、リドカイン、スパルテイン、オンダンセトロン、ドネペジル、ペーンフォルミン、トロピセトロン、アンフェタミン、メトキシアンフェタミン、デキストロメタンフェタミン、アトモキセチン、クロルフェナミン、デクス－フェンフルラミン、デストメトホルファン、メトクロプラミド、ペルヘキシリン、フェナセチン、プロメタジン、ｍ－チラミン、ｐ－チラミン、ジルチアゼム、ニフェジピン、シタロプラムなどを含む。
【0087】
合成基質および非合成基質に関するこれらのリストは、網羅的ではない。当業者は、何がＣＹＰ２Ｄ６基質とみなされ得るかを認識している。さらに、そのように同定されていないポテンシャル基質または基質の使用もまた、本発明に包含される。これはまた、薬剤の代謝と相互作用することができる食品中の物質を包含する。
【0088】
本発明の方法によって基質を代謝するＣＹＰ２Ｄ６変異体酵素の機能性を決定するために、当業者に周知の機能性を評価するための様々な可能性が存在する。ＣＹＰ２Ｄ６誘導代謝は、例えば、ＥＬＩＳＡ、生細胞イメージング、イムノブロット、クロマトグラフィー、放射性標識、蛍光、ルミネセンス、質量分析、それぞれの代謝産物を同定することができる他の方法などによって決定することができる。
【0089】
本発明の方法は、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を決定するための追加ステップを含むことができ、この工程は、発光性分子を、コードされたＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログ、および少なくとも１つのルシフェラーゼ酵素と接触させて反応混合物を生成し、続いて反応混合物の発光を測定して、ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの活性を決定することを含む。
【0090】
したがって、ＣＹＰ２Ｄ６基質としてメトキシルシフェリン－エチレングリコールエステル（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＭＥ－ＥＧＥ）を利用する市販の第２世代生物発光アッセイを使用する。この基質は、ＣＹＰ２Ｄ６変異体によって代謝され、ルシフェリン生成物となり、酵素反応終了後に添加するルシフェリン検出試薬で発光する。測定される発光に応じて、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性は、高い発光が測定される場合には高機能に、低い発光が測定される場合には低機能に相関させることができる。
【0091】
ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの機能性を測定するための別の可能性としては、質量分析によるものがある。従って、トランスフェクトされた細胞は、目的の基質で処理され、続いて細胞溶解を行う。次いで、固相抽出カラムを使用して、代謝産物を溶解産物から抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離する。各異なる代謝産物についてのＨＰＬＣピークを、質量分析計を使用して検出し、そしてピーク面積比を、既知濃度の内部標準のピーク面積比と比較して、代謝産物濃度を決定する。代謝産物濃度に応じて、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性は、高濃度の代謝産物が測定される場合には高機能性に、低濃度が測定される場合には低機能性に相関させることができる。
この複合戦略は、測定された代謝物濃度（ＴＤＭも参照）を、投与の助言が存在する定義された表現型（ＰＭからＵＭ）に相関させることができることは重要である。
この複合戦略は、測定された代謝物濃度（ＴＤＭも参照）を、投与の助言が存在する定義された表現型（ＰＭからＵＭ）に相関させることができることは重要である。
【0092】
従って、本発明は、種々の基質に対する機能性についてＣＹＰ２Ｄ６変異体を迅速かつ容易に試験することを可能にする。従って、数日以内に、１つ以上の個々のＣＹＰ２Ｄ６変異体は、１つ以上の基質に対するそれらの機能性に関して容易に試験することができ。これは、治療、特に患者の投薬について決定する際に、高い関連性を有することがある。
【0093】
本発明の別の実施形態は、ａ）ＣＹＰ４５０欠損細胞またはその改変型、例えばＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞、およびｂ）ＣＹＰ４５０対照変異体をコードするベクターを含む、ＣＹＰ４５０変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのキットである。
【0094】
このようなキットを用いて、当業者は、本発明による目的のＣＹＰ４５０変異体の機能性試験を実施することができる。
【0095】
ａ）における細胞は、本明細書の他の箇所で詳細に記載されている。
【0096】
任意に、キットは、目的のＣＹＰ４５０変異体をコードする１つ以上の核酸または発現ベクターをさらに含む。
【0097】
任意に、キットは、発光排出タンパク質をコードするベクターと、発光排出タンパク質の定量化のための試薬とをさらに含む。
【0098】
任意に、キットは、ＣＹＰ２Ｄ６用の（合成）基質および代謝された（合成）基質の定量化のための試薬をさらに含む。
【0099】
本発明の好ましい実施形態において、キットは、ＣＹＰ２Ｄ６変異体またはそのオルソログの機能性を決定するためのものである。
【0100】
ＣＹＰ２Ｄ６対照変異体は、機能性を示さない非機能性ＣＹＰ２Ｄ６変異体（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊３（ＰＶ００４２８）、ＣＹＰ２Ｄ６＊４（ＰＶ００４２９）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１５（ＰＶ００４４０）など）、ＣＹＰ２Ｄ６野生型（ＣＹＰ２Ｄ６＊１（ＰＶ００１２６））および／または機能性が低下した変異体（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊９（ＰＶ００４３４）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０（ＰＶ００４３５）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１７（ＰＶ００４４１）など）をコードするベクターを含むことができる。
【0101】
キットの一部となりうる潜在的な目的のＣＹＰ２Ｄ６変異体は以下である。
【0102】
【表3】
【表4】
【0103】
任意選択で、キットは、ルシフェラーゼ活性を検出するための試薬をさらに含む。適切な試薬は、当該技術分野で周知であり、ルシフェリン、フリマジン、コエレンテラジン、ＡＴＰおよび他の公知のルシフェラーゼ基質を含むが、これらに限定されない。
【0104】
キットは、アッセイ試薬、緩衝液、及び代謝基質の１つ以上の選択的結合パートナーのいずれか又は全てを含むことができ、これらの全ては、輸送に適した容器に収容され得る。
【0105】
さらに、キットは、キットに提供される材料の使用のための指示（すなわち、プロトコル）を含む説明資料を含んでもよい。説明資料は、典型的には、書面又は印刷物を含むが、それらは、そのような取扱説明書を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体で提供されてもよい。好適な媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）および光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。媒体は、説明資料を提供するウェブサイトへのアドレスを含むことができる。そのような説明書は、本明細書で詳述される方法または使用のいずれかに従うことができる。
【0106】
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２ｄ Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１ ９４）、およびＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）は、当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施において使用されるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。したがって、以下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによって、より完全に説明される。また、本明細書で使用されるように、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形の言及を含む。特に断らない限り、核酸分子は５′から３′の方向で左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは、当業者によって使用される文脈に依存して、変化し得ることが理解されるべきである。本発明の態様は、以下の非限定的な実施例によって実証される。
【0107】
例
本発明者らは、本発明による方法を使用することによって、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を、時間効率的かつ費用効率的な方法で決定することができることを示した。
本発明者らは、本発明による方法を使用することによって、ＣＹＰ２Ｄ６変異体の機能性を、時間効率的かつ費用効率的な方法で決定することができることを示した。
【0108】
したがって、目的のＣＹＰ２Ｄ６コード配列（ＣＤＳ）をｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣベクターにクローニングし、目的の変異体を部位特異的変異導入によって産生する（図１、工程１）。ｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣ（Ａ）およびｐＮＬ１．３ＣＭＶ［ｓｅｃＮｌｕｃ／ＣＭＶ］（Ｂ）ベクターをＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞に同時トランスフェクトする（図１、工程２）。トランスフェクションの４８時間後、分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）を検出し、そしてマルチプレートリーダーを使用して発光により測定する（図１、工程３）。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）検出後、古い培地をＬｕｃｉｆｅｒｉｎ ＭＥ－ＥＧＥ含有培地で置き換える（図１、工程４）。３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を溶解し、そしてルシフェリン産生量（ＣＹＰ２Ｄ６活性に比例する）を、マルチプレートリーダーを使用して測定する（図１、工程５）。
【0109】
ＣＹＰ２Ｄ６＊１０８（ＰＶ００５２５）対立遺伝子を含むベクター、またはそれを特徴付ける２つのヌクレオチド変異体（Ｃ．１０７４Ａ＞ＧおよびＣ．１０８３Ａ＞Ｇ）の一方のみを、ＣＹＰ２Ｄ６なし（ｎｏ－ＣＹＰ２Ｄ６）（ＭＯＣＫ）、ポジティブコントロール（＊１（ＰＶ００１２６）－ｗｔ、ｗｔ＝野生型）およびネガティブコントロール（＊３（ＰＶ００４２８）－ｃ．７９４ｄｅｌＡ、ｄｅｌ＝欠失）と共に、記載の方法でアッセイした（図２）。＊１０８対立遺伝子は＊１に関して約６５％の活性を有することが示され、機能低下をもたらすヌクレオチド変異はＣ．１０８３Ａ＞Ｇ（測定活性約５０％）であることが示されるが、Ｃ．１０７４Ａ＞Ｇ変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６活性に影響しない（測定活性９８％）。棒グラフは、４つの異なる実験から得られた合計２４反復の平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。＊＊＊＊ｐ≦＜０，０００１は一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの事後検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）により示される。ＡＮＯＶＡ、分散分析、ｎ．ｓ＝有意ではない。
【0110】
ＣＹＰ２Ｄ６＊９（ＰＶ００４３４）、＊１０（ＰＶ００４３５）、＊１４（ＰＶ００４３９）および＊２９（ＰＶ００４５３）対立遺伝子を含むベクターを、記載の方法を用いて、ＣＹＰ２Ｄ６なし（ＭＯＣＫ）、ポジティブコントロール（＊１（ＰＶ００１２６）－ｗｔ）およびネガティブコントロール（＊３（ＰＶ００４２８）－ｃ．７９４ｄｅｌＡ）と共にアッセイした（図３）。これらの対立遺伝子は、薬理遺伝子変異コンソーシアム（ＰｈａｒｍＶａｒ）のウェブサイトに記載されているように活性が既に検証されていることから選択した。＊１および＊３のコントロールとはすべて有意に異なるので、方法のセクションで説明したように分類したところ、４つの変異体はすべて、既知の機能活性の低下に一致した。棒グラフは、４つの異なる実験から得られた合計２４反復の平均値±ＳＤを表す。＊＊＊＊ｐ≦０，０００１は一元配置分散分析とそれに続くＤｕｎｎｅｔｔの事後検定により示される。ＡＮＯＶＡ、分散分析。
【0111】
材料および方法
プラスミド調製および変異誘発ＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡを、肝臓の全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ウィーン、オーストリア）から、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）の後に、メーカーの指示に従って入手した。次いで、ＣＹＰ２Ｄ６コード配列（ＣＤＳ）を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。５′－ＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧ－３′（フォワードプライマー）および５′－ＣＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＡＧＧ－３′（リバースプライマー）。次に、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ制限消化酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ワルタム、米国ＭＡ）を用いて、ＣＭＶ即時エンハンサーおよびプロモーターの制御下で、ＣＹＰ２Ｄ６ ＣＤＳをｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣ真核生物タンパク質発現ベクターにクローン化した。クローニングされた配列の部位特異的変異誘発は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って行い、完全機能性（＊１（ＰＶ００１２６））、完全機能喪失（＊３（ＰＶ００４２８））および機能低下（＊１０（ＰＶ００４３５））ＣＹＰ２Ｄ６変異体を得て、アッセイのためのコントロールとして選択した。他の試験されたＣＹＰ２Ｄ６変異体もすべて同様に作製した。作製後、ベクターおよびクローン化したインサートを、野生型参照配列（配列番号２）に対するサンガー配列決定で確認した。
プラスミド調製および変異誘発ＣＹＰ２Ｄ６ｃＤＮＡを、肝臓の全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ウィーン、オーストリア）から、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）の後に、メーカーの指示に従って入手した。次いで、ＣＹＰ２Ｄ６コード配列（ＣＤＳ）を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。５′－ＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧ－３′（フォワードプライマー）および５′－ＣＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＡＧＧ－３′（リバースプライマー）。次に、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ制限消化酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ワルタム、米国ＭＡ）を用いて、ＣＭＶ即時エンハンサーおよびプロモーターの制御下で、ＣＹＰ２Ｄ６ ＣＤＳをｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣ真核生物タンパク質発現ベクターにクローン化した。クローニングされた配列の部位特異的変異誘発は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従って行い、完全機能性（＊１（ＰＶ００１２６））、完全機能喪失（＊３（ＰＶ００４２８））および機能低下（＊１０（ＰＶ００４３５））ＣＹＰ２Ｄ６変異体を得て、アッセイのためのコントロールとして選択した。他の試験されたＣＹＰ２Ｄ６変異体もすべて同様に作製した。作製後、ベクターおよびクローン化したインサートを、野生型参照配列（配列番号２）に対するサンガー配列決定で確認した。
【0112】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ－２９３細胞に由来する操作された細胞株であるヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－Ｂｌｕｅ（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１．５％ＮａＨＣＯ３、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬ＿ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬ＿ブラスチシジンおよび１００μｇ／ｍＬ＿Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２で培養した。培地を週３回交換した。
ＨＥＫ－２９３細胞に由来する操作された細胞株であるヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）－Ｂｌｕｅ（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１．５％ＮａＨＣＯ３、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬ＿ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬ＿ブラスチシジンおよび１００μｇ／ｍＬ＿Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともに、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２で培養した。培地を週３回交換した。
【0113】
これらの細胞は、ＣＹＰ２Ｄ６に対するそれらの遺伝子型が＊４／＊４であり、完全に非機能的な内因性ＣＹＰ２Ｄ６をもたらすことから選択された。さらに、ウェスタンブロットによるさらなる解析の結果、これらの細胞が検出可能なレベルの内因性ＣＹＰ２Ｄ６を発現しないことを確認した。
【0114】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞を、白色９６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）ΔＳｕｒｆａｃｅプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に、各コントロールまたはテストベクターごとに６ウェルのレイアウトで播種した。播種から２４時間後に、播種の２４時間後、古い培地を７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２ ４．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．０４５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、０．２７ｆＭ ｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣベクターおよび０．０３８ｆＭ ｐＮＬ１．３ＣＭＶ［ｓｅｃＮＩｕｃ／ＣＭＶ］ベクターからなるトランスフェクション混合物を含有する培地で置き換えることによって、細胞にｐｃＤＮＡ３．１－ＨＩＳＣ－ＣＹＰ２Ｄ６コンストラクトおよびｐＮＬ１．３．ＣＭＶ［ｓｅｃＮＩｕｃ／ＣＭＶ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を一過的に共導入した。
【0115】
ｐＮＬ１．３．ＣＭＶ［ｓｅｃＮＩｕｃ／ＣＭＶ］プラスミドは、ヒトＣＭＶ即時エンハンサーおよびプロモーターの制御下で、Ｎ末端分泌シグナルに融合した小さなルシフェラーゼレポーター（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））を発現する。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）分泌により、細胞を妨害することなく形質移入レベルを正規化することができる。
【0116】
このプレートから、２つの別々のアッセイを実施した。最初のアッセイでは、各ウェルの上清からのアリコートをＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）検出に使用し、第２のアッセイでは、細胞単層を使用してＣＹＰ２Ｄ６活性を確立した。
【0117】
Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの４８時間後、上清の２０ｍｌアリコートを、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を用いて分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レベルを検出するために、各ウェルから新しい白色９６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）ΔＳｕｒｆａｃｅプレートに移した。分泌されたルシフェラーゼを含む上清アリコートを、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞培地を使用してそれぞれのウェルについて１００μＬに希釈し、次いで、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ基質として発光分子フリマジンを含む１００μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬と混合した。室温（ＲＴ）で３分間インキュベートした後、Ｓｐａｒｋ（登録商標）１０Ｍマルチモードマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、グレーディヒ、オーストリア）を用いて、光学密度フィルター１（ＯＤ１）と１秒間の積分時間を維持しながら発光を測定した。発光レベルは、分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の量に直接的に対応し、トランスフェクション効率の正規化に使用される。
トランスフェクションの４８時間後、上清の２０ｍｌアリコートを、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を用いて分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レベルを検出するために、各ウェルから新しい白色９６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ（登録商標）ΔＳｕｒｆａｃｅプレートに移した。分泌されたルシフェラーゼを含む上清アリコートを、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞培地を使用してそれぞれのウェルについて１００μＬに希釈し、次いで、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ基質として発光分子フリマジンを含む１００μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬と混合した。室温（ＲＴ）で３分間インキュベートした後、Ｓｐａｒｋ（登録商標）１０Ｍマルチモードマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、グレーディヒ、オーストリア）を用いて、光学密度フィルター１（ＯＤ１）と１秒間の積分時間を維持しながら発光を測定した。発光レベルは、分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の量に直接的に対応し、トランスフェクション効率の正規化に使用される。
【0118】
Ｐ４５０－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ
分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の検出に続いて、上清を除去し、細胞をアッセイして、外因的に発現されたＣＹＰ２Ｄ６変異体の活性水準を決定した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。次いで、５０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ-ＭＥ ＥＧＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を含む新鮮なＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）培地を各ウェルに１００μＬずつ添加した。ルシフェリン－ＭＥ ＥＧＥは、プロルシフェリン化合物で、ＣＹＰ２Ｄ６によってＤ－ルシフェリンに変換される。次いで、ＣＹＰ２Ｄ６トランスフェクト細胞を３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、外因的に発現されたＣＹＰ２Ｄ６による代謝を可能にした。３時間の端部に、１００μＬルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を各ウェルに添加し、細胞をＲＴで２０分間インキュベートした。発生した光は、Ｓｐａｒｋ（登録商標）１０Ｍマルチモードマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、グレーディヒ、オーストリア）を用いて、積分時間１秒、フィルターなしで測定する。検出された光シグナルは、Ｄ－ルシフェリンレベルに比例し、したがってＣＹＰ２Ｄ６活性に比例し、トランスフェクション効率の変動を考慮して事前に測定された分泌ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レベルに対して正規化される。
分泌されたＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の検出に続いて、上清を除去し、細胞をアッセイして、外因的に発現されたＣＹＰ２Ｄ６変異体の活性水準を決定した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。次いで、５０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ-ＭＥ ＥＧＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を含む新鮮なＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）培地を各ウェルに１００μＬずつ添加した。ルシフェリン－ＭＥ ＥＧＥは、プロルシフェリン化合物で、ＣＹＰ２Ｄ６によってＤ－ルシフェリンに変換される。次いで、ＣＹＰ２Ｄ６トランスフェクト細胞を３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、外因的に発現されたＣＹＰ２Ｄ６による代謝を可能にした。３時間の端部に、１００μＬルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マンハイム、ドイツ）を各ウェルに添加し、細胞をＲＴで２０分間インキュベートした。発生した光は、Ｓｐａｒｋ（登録商標）１０Ｍマルチモードマルチプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、グレーディヒ、オーストリア）を用いて、積分時間１秒、フィルターなしで測定する。検出された光シグナルは、Ｄ－ルシフェリンレベルに比例し、したがってＣＹＰ２Ｄ６活性に比例し、トランスフェクション効率の変動を考慮して事前に測定された分泌ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レベルに対して正規化される。
【0119】
評価した変異体の分類
ＣＹＰ２Ｄ６変異体の活性値は、野生型ＣＹＰ２Ｄ６（＊１）によって生成されたものに対する割合で表される。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）によって作製した。次に、各変異体は、４つのカテゴリｉ）機能喪失、ｉｉ）機能低下、ｉｉｉ）正常機能、ｉｖ）機能増加のいずれかにビン分割（ｂｉｎｎｅｄ）される。機能喪失型変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３（機能喪失型変異体のポジティブコントロール）と有意差のない値を有し、正常機能型変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１（正常機能のポジティブコントロール）と有意差のない値を有する。機能増加型は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１よりも有意に大きい値を有する。機能低下型は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３より有意に高く、ＣＹＰ２Ｄ６＊１より有意に低い値を示す。
ＣＹＰ２Ｄ６変異体の活性値は、野生型ＣＹＰ２Ｄ６（＊１）によって生成されたものに対する割合で表される。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）によって作製した。次に、各変異体は、４つのカテゴリｉ）機能喪失、ｉｉ）機能低下、ｉｉｉ）正常機能、ｉｖ）機能増加のいずれかにビン分割（ｂｉｎｎｅｄ）される。機能喪失型変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３（機能喪失型変異体のポジティブコントロール）と有意差のない値を有し、正常機能型変異体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１（正常機能のポジティブコントロール）と有意差のない値を有する。機能増加型は、ＣＹＰ２Ｄ６＊１よりも有意に大きい値を有する。機能低下型は、ＣＹＰ２Ｄ６＊３より有意に高く、ＣＹＰ２Ｄ６＊１より有意に低い値を示す。
【0120】
【表5】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】