特表 2022-551204 ＣＤ７１結合フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-07

(54)【発明の名称】ＣＤ７１結合フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221130BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221130BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20221130BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221130BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221130BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20221130BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20221130BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20221130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221130BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221130BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20221130BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221130BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221130BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20221130BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221130BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221130BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20221130BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20221130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K16/28 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/42

C07K19/00

C12P21/02 C

C07K14/78

A61K47/64

A61K51/08 200

A61P35/00

G01N33/53 D

G01N33/574 D

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/08

A61P25/00

A61K45/00

A61K38/16

A61K38/39

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022547663

(86)(22)【出願日】2020-10-14

(85)【翻訳文提出日】2022-05-20

(86)【国際出願番号】 US2020055470

(87)【国際公開番号】W WO2021076546

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/914,643

(32)【優先日】2019-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/949,020

(32)【優先日】2019-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522149186

【氏名又は名称】アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ラッセル・シー・アディス

(72)【発明者】

【氏名】ジャンナ・ドルジナ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・コラコウスキー

(72)【発明者】

【氏名】スワップニル・クルカルニ

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン・ジー・ナドラー

(72)【発明者】

【氏名】カリン・オニール

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ・シン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA46

4C076AA94

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA17

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA08

4C084BA20

4C084BA21

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA53

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA02

4C084ZA06

4C084ZA15

4C084ZA16

4C084ZA36

4C084ZB26

4C084ZC35

4C084ZC55

4C085HH03

4C085HH11

4C085HH20

4C085KB82

4C085LL18

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＣＤ７１に結合することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのようなポリペプチド、それらの結合体、それらの分子をコードする単離されたヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、さらにはそれらを製造及び使用する方法に関する。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは天然に存在しない。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位においてヒトＣＤ７１に結合する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、もしくは８１～３０９、もしくはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、もしくは８１～３０９、もしくはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含むポリペプチド。

【請求項2】

配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうち２つを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位においてヒトＣＤ７１に結合するポリペプチド。

【請求項4】

配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９の配列を有するポリペプチドと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９の配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項6】

ポリペプチドは、検出可能な標識、オリゴヌクレオチド、治療剤、又はそれらの任意の組み合わせに結合される、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

検出可能な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンである、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

検出可能な標識は、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドロスタチン、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位元素である、請求項６又は７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

治療剤は、化学療法剤、薬物、抗体、増殖阻害剤、毒素、放射性同位元素、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子もしくはそのセンスもしくはアンチセンス鎖、アンチセンス分子もしくはその鎖、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法感作物質、トポイソメラーゼ阻害剤、又はビンカアルカロイドである、請求項６に記載のポリペプチド

【請求項10】

治療剤は、遺伝子発現、ＲＮＡ発現もしくはレベル、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、トポイソメラーゼ阻害、ＤＮＡ架橋、キレート化、スプライソソーム阻害、ＮＡＭＰＴ阻害、又はＨＤＡＣ阻害を調節することにより１つ又はそれ以上の細胞傷害性効果を誘発することができる、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項11】

ポリペプチドのＮ末端にメチオニンをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

ポリペプチドは、半減期延長部分にカップリングされる、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

半減期延長部分は、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミンバリアント、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項１２に記載のポリペプチド。

【請求項14】

アルブミン結合分子は、アルブミン又はアルブミンバリアントに結合する第二のポリペプチドである、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項18】

ＣＤ７１に結合するポリペプチドを製造する方法であって、請求項１７に記載の単離された宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養すること、及び該ポリペプチドを精製することを含む、上記方法。

【請求項19】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。

【請求項20】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する抗イディオタイプ抗体。

【請求項21】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むキット。

【請求項22】

処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、該方法は、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、もしくは８１～３０９のような本明細書において提供されるポリペプチド、又は請求項３に記載のポリペプチドを、治療剤とともに対象に投与することを含む、上記方法。

【請求項23】

がんは脳がんである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、該方法は、抗ウイルス剤、免疫系調節剤、又は核酸分子と結合された、配列番号３３～６２もしくは８１～３０９のような本明細書において記載されるポリペプチド、又は請求項３に記載のポリペプチドを、対象に投与することを含む、上記方法。

【請求項25】

がん疾患は神経膠芽腫である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法であって、
ａ） 対象から腫瘍組織のサンプルを得ること；及び
ｂ） 腫瘍組織のサンプルを、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ、そしてＣＤ７１とポリペプチドとの間の結合を検出することにより、腫瘍組織においてＣＤ７１が発現されているか否かを検出すること
を含む、上記方法。

【請求項27】

ＣＤ７１を発現する細胞を単離する方法であって、
ａ） 対象からサンプルを得ること；
ｂ） 配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドとサンプルを接触させること、及び
ｃ） ポリペプチドに結合した細胞を単離すること
を含む、上記方法。

【請求項28】

腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法であって、
ａ） 配列番号３３～６２又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むペプチドを、検出可能な標識と結合させて結合体を形成すること；
ｂ） 結合体を対象に投与すること；及び
ｃ） 結合体が結合しているＣＤ７１を発現するがん細胞を可視化すること
を含む、上記方法。

【請求項29】

請求項１９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、神経学的状態及び／又は脳腫瘍を処置する方法。

【請求項30】

脳腫瘍は、非悪性脳腫瘍、良性脳腫瘍、及び悪性脳腫瘍からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

悪性脳腫瘍は、星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、又は脊髄のがん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、及び肉腫からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

脳腫瘍は先天性腫瘍である、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

神経学的状態は、脳卒中、糖尿病、てんかん発作、高血圧性脳症、後天性免疫不全症候群、外傷性脳損傷、多発性硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項34】

請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドのような、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインにカップリングされた目的の薬剤と細胞を接触させることを含む、目的の薬剤をＣＤ７１陽性細胞に送達する方法。

【請求項35】

目的の薬剤は、ＣＤ７１媒介相互作用を介して細胞中に内部移行される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しない、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

目的の薬剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、放射性同位元素、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法感作物質、トポイソメラーゼ阻害剤、又はビンカアルカロイドである、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

ＦＮ３ドメインは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、もしくは８１～３０９の配列又は請求項３に記載のポリペプチドを含む、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

細胞は筋肉細胞である、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

細胞は、脳細胞又は血液脳関門の内側の細胞である、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合せず、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害もしない部位においてＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定する方法であって、該方法は：
トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬物の存在下で、試験ＦＮ３タンパク質とＣＤ７１を接触させること；及び
トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を同定すること
を含む、上記方法。

【請求項42】

トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を単離することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を配列決定することをさらに含む、請求項４０又は４１に記載の方法。

【請求項44】

トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列を製造するか又は得ることをさらに含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列から発現させることをさらに含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

試験ＦＮ３タンパク質は細胞において発現される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

発現された試験ＦＮ３タンパク質を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

請求項４１～４７のいずれか１項に従って同定されたＦＮ３タンパク質。

【請求項49】

請求項４８に記載のＦＮ３タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項50】

請求項４８に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項51】

請求項４９のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項52】

請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６２／９１４，６４３号（２０１９年１０月１４日出願）及び米国仮出願第６２／９４９，０２０号（２０１９年１２月１７日）に対して優先権を主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書にその全体として援用される。

【0002】

分野
本実施形態は、分化抗原群７１（ＣＤ７１）に特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、並びに該分子を製造及び使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
トランスフェリン受容体１としても知られるＣＤ７１は、細胞への鉄輸送に必須な膜貫通型である。これは多くの腫瘍型で、及び血液脳関門において高度に発現され、それ故、薬物送達のための重要な標的になる。鉄負荷トランスフェリンへの結合後に、ＣＤ７１は急速に形質膜陥入され、そして効率的に再循環されて細胞表面に戻される。ＣＤ７１抗体薬物結合体を用いた研究は、ＣＤ７１を標的化することが、薬物送達の特異性及び選択性を改善し得、そして治療指数を拡大し得るということを示唆する。さらに、抗ＣＤ７１モノクローナル抗体を使用した研究は、結合親和性が、血液脳関門経細胞輸送を可能にすることにおいて重要な役割を果たし得るということを示す。ＣＤ７１に対して高い親和性を有する抗体は、急速に内部移行され、そして通常の受容体輸送を変更し、その結果、再循環の代わりに、受容体は分解のためのリソソームに標的化される。対照的に、ＣＤ７１に対して低い親和性を有する抗体は、受容体再循環及びより高い脳曝露を可能にする。

【0004】

標的分子に対する高い親和性及び特異性が望まれる場合、抗体又は抗体フラグメントは最も広く使用される治療タンパク質のクラスであるが、非抗体タンパク質は、このような標的にも結合するように操作され得る。これらの「代替足場」タンパク質は、それらの小さいサイズ、ジスルフィド結合を欠いていること、高い安定性、原核生物宿主において発現される能力、容易な精製に起因して伝統的な抗体に優る利点を有し、そしてこれらは薬物／毒素に容易に結合され、効率的に組織中に浸透し、そして容易に多選択性バインダーの形式にされる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

１つのこのような代替の足場は免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドである。このフォールドは、抗体の可変領域、さらには数千の非抗体タンパク質において見られる。１つのこのようなＩｇタンパク質であるヒトフィブロネクチン由来の１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復は、表面に露出したループにおいて多数の変異を許容しながら、全体のＩｇフォールド構造を保持し得るということが示された。したがって、必要とされるものは、ＣＤ７１に特異的に結合することができるＦＮ３ドメイン、及びがん治療のためにそのような分子を使用する方法である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

要旨
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１タンパク質に特異的に結合するＦＮ３ドメイン（例えば、ポリペプチド）が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは単離される。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは組み換え体である。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは天然に存在しない。

【0007】

いくつかの実施形態において、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１又は６２のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号８１～３０９のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインはＣＤ７１に結合する。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位においてヒトＣＤ７１に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９のアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインが提供される。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインはＣＤ７１に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、可動性リンカーのようなリンカーにより接続された１つより多くのＦＮ３ドメインを含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ドメイン間で１つ又はそれ以上のリンカーにより互いに接続された２、３、又は４つのＦＮ３ドメインを含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【0009】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

【0010】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。

【0011】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインを製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、ＦＮ３ドメインをコードするか又は発現するベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、ＦＮ３ドメインを精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインはＣＤ７１に特異的に結合する。

【0012】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメイン及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物が提供される。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに結合する抗イディオタイプ抗体が提供される。

【0014】

いくつかの実施形態において、１つ又はそれ以上のＦＮ３ドメインを含むキットが提供される。

【0015】

いくつかの実施形態において、腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、対象から腫瘍組織のサンプルを得ること、並びに配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインと腫瘍組織のサンプルを接触させ、そしてＣＤ７１タンパク質とＦＮ３ドメインとの間の結合を検出することにより、腫瘍組織においてＣＤ７１タンパク質が発現されているか否かを決定することを含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１を発現する細胞を単離する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、対象からサンプルを得ること；配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインとサンプルを接触させ、そしてＦＮ３ドメインに結合した細胞を単離することを含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１タンパク質に結合するＦＮ３ドメインを、検出可能な標識に結合させて、結合体を形成すること；結合体を対象に投与すること；及び結合体が結合しているＣＤ７１を発現するがん細胞を可視化することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、処置を必要とする対象においてがんを処置する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、ＣＤ７１に結合するポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、もしくは８１～３０９のような配列、又は治療剤に連結もしくは結合された本明細書に提供されるポリペプチドを含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、神経学的状態及び／又は脳腫瘍を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、本明細書に提供されるポリペプチド又は医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、脳腫瘍は、非悪性、良性、及び悪性脳腫瘍からなる群から選択される。

【0020】

いくつかの実施形態において、目的の薬剤をＣＤ７１陽性細胞に送達する方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、本明細書に提供されるポリペプチドのような、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインにカップリングされた目的の薬剤と、細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、目的の薬剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素、放射性同位元素、抗チューブリン剤、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法感作物質、トポイソメラーゼ阻害剤、又はビンカアルカロイドである。

【0021】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合せず、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害もしない部位においてＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質である。

【0022】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合せず、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害もしない部位においてＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定する方法が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0023】

開示の詳細な説明
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に別のことを指示していなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ又はそれ以上の細胞の組み合わせなどを含む。

【0024】

「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体及び原核生物酵素を含む、タンパク質において頻繁に存在するドメインを指す（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０－８９９４、１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０－１９１８、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９－１５６６５、１９９０）。例となるＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許第８，２７８，４１９号に記載されるような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及び及びタンパク質名で、例えば、テネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と呼ばれる。

【0025】

用語「捕捉剤」は、特定の種類の細胞に結合して、他の細胞からのその細胞の単離を可能にする物質を指す。例となる捕捉剤は、磁気ビーズ、磁性流体、カプセル封入試薬、特定の細胞型に結合する分子などである。

【0026】

「サンプル」は、対象から単離された同様の流体、細胞、又は組織の収集物、さらには対象内に存在する流体、細胞、又は組織を指す。例となるサンプルは組織生検、細針吸引、外科的に切除された組織、器官培養、細胞培養及び生物学的流体、例えば血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞便、痰、分泌性組織及び器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水液、胸膜、心臓周囲、腹膜、腹腔及び他の体腔の流体、気管支洗浄により集められた流体、滑液、対象もしくは生物学的供給源と接触された液体溶液、例えば、細胞又は器官順化培地を含む細胞及び器官培養培地及び洗浄液などである。

【0027】

「置換すること」又は「置換された」又は「変異すること」又は「変異した」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列において１つ又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、欠失、挿入して、その配列のバリアントを生成することを指す。

【0028】

「バリアント」は、参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと、１つ又はそれ以上の改変、例えば置換、挿入又は欠失だけ異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。

【0029】

「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、ＣＤ７１のようなその標的に、約１ｘ１０^－６Ｍもしくはそれ以下、例えば約１ｘ１０^－７Ｍもしくはそれ以下、約１ｘ１０^－８Ｍもしくはそれ以下、約１ｘ１０^－９Ｍもしくはそれ以下、約１ｘ１０^－１０Ｍもしくはそれ以下、約１ｘ１０^－１１Ｍもしくはそれ以下、約１ｘ１０^－１２Ｍもしくはそれ以下、又は約１ｘ１０^－１３Ｍもしくはそれ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合するＦＮ３ドメインの能力を指す。あるいは、「特異的結合」は、標準的ＥＬＩＳＡアッセイにおいてその標的（例えば、ＣＤ７１）にネガティブコントロールより少なくとも５倍高く結合するＦＮ３ドメインの能力を指す。いくつかの実施形態において、ネガティブコントロールは、ＣＤ７１に結合しないＦＮ３ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、他の関連する抗原、例えば、Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）のような他の種からの同じ所定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。

【0030】

「ライブラリー」はバリアントの収集を指す。ライブラリーはポリペプチド又はポリヌクレオチドのバリアントから構成され得る。

【0031】

「安定性」は、その正常な機能的活性、例えば、ＣＤ７１のような所定の抗原に結合することの少なくとも１つを保持するように、生理学的条件下で折りたたまれた状態を維持する分子の能力を指す。

【0032】

「ＣＤ７１」は、配列番号３２又は８０のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ７１タンパク質を指す、いくつかの実施形態において、配列番号３２は全長ヒトＣＤ７１タンパク質である。いくつかの実施形態において、配列番号８０はヒトＣＤ７１の細胞外ドメインである。

【0033】

「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、そして米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号に記載される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。

【0034】

「がん細胞」又は「腫瘍細胞」は、新しい遺伝物質の取り込みを必ずしも含まない自発性又は誘導された表現型変化を有する、インビボ、エクスビボ、及び組織培養のいずれかでのがん性、前がん性又は形質転換された細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスを用いた感染、及び新しいゲノム核酸の組み込み、又は外因性核酸の取り込みから生じ得るが、自然発症的に又は発がん性物質への曝露後にも生じる場合があり、それにより内因性遺伝子を変異させる。形質転換／がんは、例えば、インビトロ、インビボ、及びエクスビボでの、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベル、侵襲性、ヌードマウスのような適切な動物における腫瘍増殖又は抑制などにより例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ （第三版、１９９４年））。

【0035】

「ベクター」は、生物システム内で複製される能力があるか又はこのようなシステム間で移動され得るポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生物システムにおけるこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にするように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーのようなエレメントを含有する。このよな生物システムの例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的構成要素を利用する再構成された生物システムが挙げられ得る。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子でもこれらのハイブリッドでもよい。

【0036】

「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの翻訳を方向づけるために、生物システム又は再構成された生物システムにおいて利用され得るベクターを指す。

【0037】

「ポリヌクレオチド」は、糖－リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学により共有結合で連結されたヌクレオチドの鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型的な例である。

【0038】

「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。約５０アミノ酸未満の小さいポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれてもよい。

【0039】

「価数」は、分子中の、抗原に対して特異的な結合部位の特定の数の存在を指す。そのようにして、用語「一価」、「二価」、「四価」、及び「六価」は、分子中のそれぞれ１、２、４及び６つの、抗原に対して特異的な結合部位の存在を指す。

【0040】

「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。述べられている場合を除いて、用語「患者」又は「対象」は交換可能に使用される。

【0041】

「単離された」は、組み換え細胞のような、その分子が製造されたシステムの他の成分から実質的に分離され、かつ／又は精製された分子の均一な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はＦＮ３ドメインのようなポリペプチド）、さらには少なくとも１つの精製又は単離工程にかけられたタンパク質を指す。「単離されたＦＮ３ドメイン」は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないＦＮ３ドメインを指し、そしてより高い純度、例えば純度８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％まで単離されたＦＮ３ドメインを包含する。

【0042】

物質の組成物
いくつかの実施形態において、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９の配列と、少なくとも６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質。いくつかの実施形態において、タンパク質は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９の配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。

【0043】

本明細書において提供されるポリペプチドは、より大きなポリペプチドの一部であってよく、そしてドメインと呼ばれ得る。異なるポリペプチドにおける２つのドメイン間の相同性又は同一性は、ポリペプチド全体と対照的に類似しているドメインに基づく。例えば、ポリペプチドが、配列番号８１を含むＦＮ３ドメインを含むポリペプチドを含み、そしてそのドメインがｓｃＦＶ抗体に結合される場合、配列番号８１に類似しているが同一ではないドメインを有する別のタンパク質は、たとえｓｃＦＶが相同性を共有しなくとも、少なくとも９０％同一であり得る。したがって、同一性％は、ドメインに基づき得るか又はポリペプチドの全体の長さの基づき得る。同一性％を決定する方法は、本明細書において提供されるか又は当業者に公知である。

【0044】

いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ７１タンパク質（配列番号３２又は８０）に結合するか又は特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインが提供される。本明細書において提供されるように、ＦＮ３ドメインはＣＤ７１タンパク質に結合し得る。また、たとえ明示的に述べられていなくても、これらのドメインはＣＤ７１タンパク質にも特異的に結合し得るということが提供される。したがって、例えば、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインタンパク質も包含するだろう。これらの分子は、例えば治療適用及び診断適用において、並びにイメージングにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを製造及び使用する方法が提供される。

【0045】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するか又は特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインが提供される。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、リンカーにより接続された２つのＦＮ３ドメインを含む。リンカーは可動性リンカーであり得る。リンカーは、本明細書に記載されるもののような、短いペプチド配列であり得る。例えば、リンカーはＧ／Ｓリンカーなどであり得る。

【0047】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、当業者により実施されるように、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法により決定されて、約１ｘ１０^－７Ｍ未満、例えば約１ｘ１０^－８Ｍ未満、約１ｘ１０^－９Ｍ未満、約１ｘ１０^－１０Ｍ未満、約１ｘ１０^－１１Ｍ未満、約１ｘ１０^－１２Ｍ未満、又は約１ｘ１０^－１３Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＣＤ７１に結合し得る。特定のＦＮ３ドメイン－抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、容積オスモル濃度、ｐＨ）下で測定された場合、変動する場合がある。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ）の測定は、タンパク質足場及び抗原の標準化溶液、並びに本明細書において記載される緩衝液のような標準化緩衝液を用いて行われる。

【0048】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、標準ＥＬＩＳＡアッセイにおいてネガティブコントロールについて得られたシグナルよりも少なくとも５倍高く結合し得る。

【0049】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するか又は特異的に結合するＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結されたイニシエーターのメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するか又は特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結されたシステイン（Ｃｙｓ）を含む。Ｎ末端Ｍｅｔ及び／又はＣ末端Ｃｙｓを追加することは、半減期延長分子の発現及び／又は結合を容易にし得る。

【0050】

ＦＮ３ドメインはまた、参照によりその全体として本明細書に援用される米国特許第１０，１９６，４４６号に記載されるようなシステイン置換も含有し得る。手短には、いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、米国特許第１０，１９６，４４６号の配列番号６又は配列番号１に基づくＦＮ３ドメインの残基６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３からなる群から選択される位置、並びに関連するＦＮ３ドメインにおける等価な位置において少なくとも１つのシステイン置換を含み得る。いくつかの実施形態において、置換は残基６にある。いくつかの実施形態において、置換は残基８にある。いくつかの実施形態において、置換は残基１０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基１１にある。いくつかの実施形態において、置換は残基１４にある。いくつかの実施形態において、置換は残基１５にある。いくつかの実施形態において、置換は残基１６にある。いくつかの実施形態において、置換は残基２０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基３０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基３４にある。いくつかの実施形態において、置換は残基３８にある。いくつかの実施形態において、置換は残基４０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基４１にある。いくつかの実施形態において、置換は残基４５にある。いくつかの実施形態において、置換は残基４７にある。いくつかの実施形態において、置換は残基４８にある。いくつかの実施形態において、置換は残基５３にある。いくつかの実施形態において、置換は残基５４にある。いくつかの実施形態において、置換は残基５９にある。いくつかの実施形態において、置換は残基６０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基６２にある。いくつかの実施形態において、置換は残基６４にある。いくつかの実施形態において、置換は残基７０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基８８にある。いくつかの実施形態において、置換は残基８９にある。いくつかの実施形態において、置換は残基９０にある。いくつかの実施形態において、置換は残基９１にある。いくつかの実施形態において、置換は残基９３にある。

【0051】

ドメイン又はタンパク質中の位置におけるシステイン置換は、既存のアミノ酸残基をシステイン残基で置き換えることを含む。システイン改変の他の例を、例えば、米国特許出願公開第２０１７０３６２３０１号（参照によりその全体として本明細書に援用される）に見ることができる。配列のアライメントは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて、デフォルトパラメーターを使用するＢｌａｓｔＰを使用して行われ得る。

【0052】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、細胞中に内部移行される。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインの内部移行は、検出可能な標識又は治療剤の細胞中への送達を容易にし得る。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインの内部移行は、細胞傷害性薬剤の細胞中への送達を容易にし得る。細胞傷害性薬剤は治療剤として作用し得る。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインの内部移行は、本明細書において開示される任意の検出可能な標識、治療剤及び／又は細胞傷害性薬剤の細胞中への送達を容易にし得る。いくつかの実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は肝臓細胞である。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、場合により残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６（配列番号４に対応する残基ナンバリング）に置換を有する、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号４のＴｅｎｃｏｎ ２７配列の配列に基づく。

【0054】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０のアミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、又は６１のアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。

【0065】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２８９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３０９のアミノ酸配列を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位においてヒトＣＤ７１に結合する。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９の配列を含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結されたイニシエーターのメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。

【0089】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号３３～５０のアミノ酸配列のうちの１つと、６２％、６３％、６４％ 、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１～６１又は６２のアミノ酸配列のうちの１つと、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号８１～３０９のアミノ酸配列のうちの１つと、６２％、６３％、６４％ 、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９のアミノ酸配列のうちの１つと、６２％、６３％、６４％ 、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0090】

同一性パーセントは、ＮＣＢＩウェブサイトを介して利用可能なＢｌａｓｔＰを使用してデフォルトパラメーターを使用して２つの配列を整列して決定され得る。

【0091】

本開示のＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの結合体
いくつかの実施形態において、異種分子に結合されたＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインが提供される。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインはオリゴヌクレオチドに結合される。例えば、オリゴヌクレオチドは、遺伝子又はｍＲＮＡ転写物の発現を阻害するために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどであり得る。

【0093】

いくつかの実施形態において、ペプチドは脂質ナノ粒子に結合され、これは、例えば、細胞特異的標的化に使用され得る。

【0094】

いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＣＤ７１又はタンパク質分解のための別のタンパク質を標的とする結合部分に結合される。例えば、タンパク質は、ＰＲＯＴＡＣＳ（Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する結合部位）に結合され得、そして結果としてタンパク質をＥ３リガーゼに送達する。これらは、グリシン－セリンリンカーなどのようなリンカーを介して連結され得る。

【0095】

ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインはまた、ＣＤ７１以外の異なる標的に結合する別のＦＮ３ドメインに結合又は連結され得る。これは、ペプチドが多選択性（例えば、二重特異性、三重特異性など）となることを可能にし、その結果、ＣＤ７１及び別の、例えば、タンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１ ＦＮ３結合ドメインは、腫瘍細胞により発現される抗原（腫瘍抗原）に結合する別のＦＮ３ドメインに連結される。

【0096】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、リンカーにより一緒に連結されて、二価ＦＮ３ドメインを形成し得る。リンカーは可動性リンカーであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーはＧ／Ｓリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは１、２、３、又は４つのＧ／Ｓ反復を有する。Ｇ／Ｓ反復単位は、４つのグリシン、続いてセリン、例えばＧＧＧＧＳである。

【0097】

いくつかの実施形態において、異種分子は、検出可能な標識又は治療剤、例えば、限定されないが細胞傷害性薬剤である。

【0098】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識に結合されたＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。検出可能な標識の非限定的な例は本明細書において提供される。

【0099】

いくつかの実施形態において、治療剤に結合されたＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが提供される。治療剤、例えば、限定されないが細胞傷害性薬剤の非限定的な例は、本明細書において提供される。

【0100】

検出可能な標識に結合されたＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、腫瘍組織のようなサンプルでインビボ又はインビトロでＣＤ７１の発現を評価するために使用され得る。

【0101】

検出可能な標識としては、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに結合された場合に、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、又は他の化学的方法によりＣＤ７１を検出可能にする組成物が挙げられる。

【0102】

例となる検出可能な標識としては、限定されないが、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位元素、シンチラント（ｃｉｎｔｉｌｌａｎｔｓ）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ^２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／電子受容体、アクリジニウムエステル、及び比色分析基質が挙げられる。

【0103】

検出可能な標識は、例えば検出可能な標識が放射性同位元素である場合のように、自発的にシグナルを発し得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、磁場、もしくは電場、又は電磁場のような外部刺激により刺激された結果としてシグナルを発する。

【0104】

例となる放射性同位元素は、γ放射、オージェ放出、β放出、アルファ放出又は陽電子放出放射性同位元素であり得る。例となる放射性同位元素としては、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５５Ｃｏ、^５７Ｃｏ、^６０Ｃｏ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｓｒ、^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^１１５Ｉｎ、^１２３１、^１２４１、^１２５Ｉ、^１３１１、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２６Ｒａ、^２２５Ａｃ及び^２２７Ａｃが挙げられる。

【0105】

例となる金属原子は、２０より大きい原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。

【0106】

いくつかの実施形態において、金属原子は２０より大きい原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。

【0107】

いくつかの実施形態において、金属原子はランタニド系元素であり得る。

【0108】

いくつかの実施形態において、金属原子はアクチニドであり得る。

【0109】

いくつかの実施形態において、金属原子は遷移金属であり得る。

【0110】

いくつかの実施形態において、金属原子は卑金属であり得る。

【0111】

いくつかの実施形態において、金属原子は金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。

【0112】

いくつかの実施形態において、金属原子は５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。

【0113】

いくつかの実施形態において、金属原子は磁気共鳴イメージングに適した原子であり得る。

【0114】

金属原子は、＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオン、例えば、Ｂａ^２＋、Ｂｉ^３＋、Ｃｓ^＋、Ｃａ^２＋、Ｃｒ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｃｒ^６＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｏ^３＋、Ｃｕ^＋、Ｃｕ^２＋、Ｃｕ^３＋、Ｇａ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ａｕ^＋、Ａｕ^３＋、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｆ^３＋、Ｐｂ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｍｎ^３＋、Ｍｎ^４＋、Ｍｎ^７＋、Ｈｇ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｎｉ^３＋、Ａｇ^＋、Ｓｒ^２＋、Ｓｎ^２＋、Ｓｎ^４＋、及びＺｎ^２＋であり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含んでいてもよい。

【0115】

適切な色素としては、任意の市販されている色素、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などが挙げられる。

【0116】

適切なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４；Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光色素、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル色素である。

【0117】

検出可能な標識に結合されたＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、腫瘍分布、腫瘍細胞の存在についての診断及び／又は、腫瘍の再発を評価するための造影剤として使用され得る。

【0118】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、限定されないが、細胞傷害性薬剤のような、治療剤に結合される。

【0119】

いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらのフラグメント）、又は放射性同位元素（すなわち、ラジオコンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））である。

【0120】

本明細書に開示される治療剤に結合されたＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、ＣＤ７１を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）への治療剤の標的化送達、及びそこでの細胞内蓄積において使用され得る。いずれの特定の理論に拘束されないが、この種の送達は、これらの非結合体化薬剤の全身投与が正常細胞に対して許容されないレベルの毒性を生じ得る場合に役立つ場合がある。

【0121】

いくつかの実施形態において、治療剤は、限定されないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、トポイソメラーゼ阻害、ＤＮＡ交差連結、キレート化、スプライソソーム阻害、ＮＡＭＰＴ阻害、及びＨＤＡＣ阻害のような機序によりそれらの細胞傷害性効果及び／又は細胞分裂停止効果を誘発することができる。

【0122】

いくつかの実施形態において、治療剤は、スプライソソーム阻害剤、ＮＡＭＰＴ阻害剤、又はＨＤＡＣ阻害剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は免疫系アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７，８，９、ＲＩＧ－Ｉ（ｄｓＲＮＡ）、及びＳＴＩＮＧ（ＣｐＧ）アゴニストである。いくつかの実施形態において、薬剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、ヒマ毒、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド又はカリケアマイシンである。

【0123】

いくつかの実施形態において、治療剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、ヒマ毒Ａ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ－サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、又はトリコテセン類（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）のような酵素活性毒素である。

【0124】

いくつかの実施形態において、治療剤は、放射性核種、例えば^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、又は^１８６Ｒｅである。

【0125】

いくつかの実施形態において、治療剤は、ドラスタチン又はドロスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）ペプチドアナログ及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例となる分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示される。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、並びに核及び細胞分裂（Ｗｏｙｋｅら（２００１） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０－３５８４）を妨害し、そして抗癌活性及び抗真菌活性を有することが示された。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して（ＷＯ ０２／０８８１７２）、又はＦＮ３ドメイン中に操作されたいずれかのシステインを介してＦＮ３ドメインに結合され得る。

【0126】

いくつかの実施形態において、治療剤は、例えば、アウリスタチン類、カンプトテシン、デュオカルマイシン類、エトポシド、マイタンシン及びマイタンシノイド、タキサン類、ベンゾジアゼピン類又はベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ［１，４１－ベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン類、及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン類）又はビンカアルカロイド類であり得る。

【0127】

ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、公知の方法を使用して、検出可能な標識に結合され得る。

【0128】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、キレート剤と複合体化される。

【0129】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインにリンカーを介して結合される。

【0130】

検出可能な標識、治療化合物、又は細胞傷害性化合物は、公知の方法を使用して、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに直接的又は間接的に連結され得る。適切なリンカーは当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、例えば、補欠分子族、非フェノール性リンカー（安息香酸Ｎ－スクシンイミジルの誘導体；ドデカボラート）、大環状化合物及び非環式キレート剤の両方のキレート化部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、並びに１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジポイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）及び他のキレート化部分が挙げられる。適切なペプチドリンカーは周知である。

【0131】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、腎クリアランスを経て血液から除去される。

【0132】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいたライブラリーからのＣＤ７１結合ＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ、ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７－１１７、２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的な７つのベータ－鎖を接続する６つの表面に露出したループを示し、これらのベータ鎖はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、そしてループはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれる（Ｂｏｒｋ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０－８９９２、１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基は、ＣＤ７１に結合する新規な分子を選択するために使用され得るフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するために無作為化され得る。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における各ループ及びベータ鎖の位置及び配列を示す。

【0133】

したがって、Ｔｅｎｃｏｎ配列にもとづいて設計されたライブラリーは、無作為化されたＦＧループ、又は無作為化されたＢＣ及びＦＧループ、例えば、以下に記載されるようなライブラリーＴＣＬ１又はＴＣＬ２を有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは７アミノ酸長であり、したがって１、２、３、４、５、６又は７つのアミノ酸が、ＢＣループにおいて多様化されそしてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリーにおいて無作為化され得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは７アミノ酸長であり、したがって１、２、３、４、５、６又は７つのアミノ酸が、ＦＧループにおいて多様化されそしてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリーにおいて無作為化され得る。Ｔｅｎｃｏｎライブラリーにおけるループにおけるさらなる多様性は、ループにおける残基の挿入及び／又は欠失により達成され得る。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループは、１～２２個のアミノ酸だけ延長され得、又は１～３個のアミノ酸だけ減少され得る。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは７アミノ酸長であるが、抗体重鎖における対応するループは４～２８残基の範囲に及ぶ。最大の多様性をもたらすために、ＦＧループは、配列、さらには４～２８残基の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応する長さにおいて多様化され得る。例えば、ＦＧループは、さらなる１、２、３、４又は５個のアミノ酸だけループを延長することにより長さがさらに多様化され得る。

【0134】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリーはまた、ＦＮ３ドメインの側に形成する無作為化された代替の表面を有し得、そして２つ又はそれ以上のベータ鎖、及び少なくとも１つのループを含み得る。１つのこのような代替の表面は、Ｃ及びＦベータ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループ（Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面）においてアミノ酸により形成される。Ｔｅｎｃｏｎ代替Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面に基づいたライブラリー設計は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記載される。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリーはまた、Ｔｅｎｃｏｎバリアント、例えば残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６（配列番号１に対応する残基ナンバリング）において置換を有するＴｅｎｃｏｎバリアントに基づいて設計されたライブラリーも含み、そしてこれらのバリアントは、改善された熱安定性を示す。例となるＴｅｎｃｏｎバリアントは、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記載され、そして配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較した場合に置換Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉを有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号４）を含む。

【0135】

【表1】

【0136】

Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリーは、アミノ酸の無作為又は規定されたセットを使用して選択された残基位置において無作為化され得る。例えば、無作為な置換を有するライブラリーにおけるバリアントは、２０個の天然に存在するアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを使用して生成され得る。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンが使用され得る。あるいは、２０のアミノ酸残基を全て生じさせ、そして同時に終止コドンの頻度を減少させるためにＮＮＳコドンが使用され得る。多様化させようとする位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリーは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を使用して合成され得る。この技術は、数千の遺伝子合成プロセスに十分な万能ビルディングブロックとして作用する予め作成された二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するために必要な全ての可能な配列組み合わせを表す。コドン指定は周知のＩＵＢコードに従う。

【0137】

ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ｃｉｓディスプレイを使用して、足場タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントに連結し、各タンパク質がそれをコードするＤＮＡと安定に結合されている、インビトロ翻訳後に形成されるタンパク質－ＤＮＡ複合体のプールを生成して（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１、２８０６－２８１０、２００４）、ＴｅｎｃｏｎライブラリーのようなＦＮ３ライブラリーを製造し、そしてそのライブラリーを、当該分野で公知で実施例において記載されるいずれかの方法によりＰＳＭＡへの特異的結合についてアッセイすることにより単離され得る。使用することができる例となる周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合及び非競合アッセイ（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）である。ＣＤ７１に特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインは、それらのＣＤ７１への結合、ＣＤ７１活性の調節、内部移行、安定性、及び他の望ましい特徴についてさらに特徴づけされる。

【0138】

ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリーを生成するためにテンプレートとしていずれかのＦＮ３ドメインを使用し、そして示される方法を使用してＣＤ７１に特異的に結合する分子についてライブラリーをスクリーニングして生成され得る。使用され得る例のＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、Ｆｉｂｃｏｎ、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。したがって、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０５１２７４、ＷＯ ２０１１／１３７３１９、及びＷＯ ２０１３／０４９２７５は、それら全体として本明細書に援用される。ライブラリーをベクター中にクローン化するため、又はライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成するため、インビトロでライブラリーを発現又は翻訳するために、標準的クローニング及び発現技術が使用される。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、４９３７－４９４２、１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９４、１２２９７－１２３０２、１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）が使用され得る。ＦＮ３ドメインバリアントのライブラリーは、例えば任意の適切なバクテリオファージの表面上に提示された融合タンパク質として発現され得る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを提示するための方法は周知である（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。

【0139】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、配列番号１又は配列番号４は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／又は８６において場合により置換を有する。

【0140】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３タンパク質又はポリペプチドは、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位においてヒトＣＤ７１に結合するものである。本明細書において使用されるように、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないＣＤ７１上の部位は、その部位でのＦＮ３タンパク質の結合が、ＣＤ７１へのトランスフェリンの結合と競合もせず、ＣＤ７１へのトランスフェリンの結合を阻害もしない、ＣＤ７１のエピトープ又は部分を指す。競合又は競合が無いことは、完全でも部分的でもよい。いくつかの実施形態において、結合はまた、ＣＤ７１とのその相互作用を介した細胞中へのトランスフェリンの内部移行を阻害しない。

【0141】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合を競合も阻害もしない部位においてＣＤ７１に結合するＦＮ３タンパク質を同定するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下で、ＣＤ７１を試験ＦＮ３タンパク質と接触させること；及びトランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を同定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を単離することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を配列決定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法は、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列を製造するか又は得ること含む。いくつかの実施形態において、該方法は、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質をコードする核酸配列から、トランスフェリン又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合する薬剤の存在下でＣＤ７１に結合する試験ＦＮ３タンパク質を発現させることを含む。いくつかの実施形態において、試験ＦＮ３タンパク質は細胞において発現される。いくつかの実施形態において、該方法は、発現された試験ＦＮ３タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。

【0142】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるいずれかの方法に従って同定されたＦＮ３タンパク質が提供される。

【0143】

ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性並びに熱フォールディング及びアンフォールディングの可逆性の改善のようなそれらの特性を改善するように改変され得る。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を増加させるためにいくつかの方法が適用されており、これらとしては、高度に類似した熱に安定な配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、アルファ－ヘリックス傾向を増加させる変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変更、定向進化、及びコンセンサス配列の構成が挙げられる（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２、３７１－３７５、２００１）。高い熱安定性は、発現されるタンパク質の収量を増加させ得、可溶性又は活性を改善し得、免疫原性を減少させ得、そして製造におけるコールドチェーンの必要を最少にし得る。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を改善するために置換され得る残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６であり、そして米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記載される。これらの残基に対応する置換は、本明細書において開示されるＦＮ３ドメイン含有分子に組み込まれ得る。

【0144】

タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の尺度は、タンパク質完全性の同じか又は異なる局面として評価され得る。タンパク質は、熱、紫外線若しくは電離放射線により引き起こされる変性、液体溶液ちゅうの場合は周囲浸透圧及びｐＨ、小さい孔径の濾過により加えられる機械的せん断力、紫外線、電離放射線、例えばガンマ線照射、化学的若しくは熱脱水、又はタンパク質構造破壊を引き起こし得る任意の他の作用若しくは力に対して感受性であるか又は「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法により決定され得る。例えば、分子の安定性は、熱溶融（「Ｔ_ｍ」）温度、分子の半分が折り畳まれていない状態になる摂氏温度（℃）を、標準的な方法を使用して測定することにより決定され得る。典型的には、Ｔ_ｍが高いほど、その分子はより安定である。熱に加えて、化学的環境も、タンパク質が特定の３次元構造を維持する能力を変化させる。

【0145】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔ_ｍの増加により測定して操作前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％又はそれ以上増加した安定性を示し得る。

【0146】

化学的変性も同様に、様々な方法により測定され得る。化学的変性としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオトレイトール、ベータ－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、及びヒドリド、例えばホウ水素化ナトリウム）、非イオン性及びイオン性界面活性剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、並びに標的化変性剤が挙げられる。変性の程度の定量は、機能的特性、例えば、標的分子に結合する能力の喪失、又は生理化学的特性、例えば、凝集する傾向、以前は溶媒がアクセスできなかった残基の露出、又はジスルフィド結合の破壊若しくは形成に依存し得る。

【0147】

ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、原子価を増加させ、そして結果として、標的分子結合のアビディティを増加させる手段として、又は２つ若しくはそれ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性若しくは多選択性足場を生成するための手段として、単量体、二量体、又は多量体として生成されてもよい。例えば、アミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含有するリンカーを含めることにより、単一特性、二重特異性又は多選択性タンパク質足場を連結することにより、二量体及び多量体が生成され得る。例となるリンカーとしては、（ＧＳ）_２、（配列番号６３）、（ＧＧＧＳ）_２（配列番号６４）、（ＧＧＧＧＳ）_５（配列番号６５）、（ＡＰ）_２ （配列番号６６）、（ＡＰ）_５（配列番号６７）、（ＡＰ）_１０（配列番号６８）、（ＡＰ）_２０（配列番号６９）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）_５ＡＡＡ（配列番号７０）が挙げられる。二量体及び多量体は、ＮからＣの方向で互いに連結され得る。ポリペプチドを接続して新規な連結された融合ポリペプチドにするための、天然に存在するペプチドリンカーに加えて人工的なペプチドリンカーの使用も文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４、５２６０－５２６８、１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８、７２５－７３１、１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ＆Ｓａｕｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、１０９－１１６、１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。

【0148】

半減期延長部分
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば共通結合相互作用を介して他のサブユニットを組み込み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、半減期延長部分をさらに含む。例となる半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン及びそれらのフラグメント及びアナログ、並びにＦｃ領域である。ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列は周知であり、そしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、限定されないが、本明細書に記載される半減期延長部分のいずれかのような、分子全体の半減期を延長する分子に結合する第二のＦＮ３ドメインを組み込み得る。いくつかの実施形態において、第二のＦＮ３ドメインは、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、並びにそれらのフラグメント及びアナログに結合する。

【0149】

抗体定常領域の全て又は一部は、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに結合されて、抗体様特性、特にＦｃ領域に関連するそれらの特性、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節のようなＦｃエフェクター機能を付与し、そしてこれらの活性の原因であるＦｃにおける残基を改変することによりさらに改変され得る（概説については；Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６８５－６９１、２００９を参照のこと）。

【0150】

所望の特性のために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００、様々な鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）のようなさらなる部分が、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン中に組み込まれ得る。これらの部分は、タンパク質足場をコードする配列との融合を方向づけ得、そして標準的なクローニング及び発現技術により生成され得る。あるいは、周知の化学的カップリング方法を使用して、本明細書において開示される組み換え産生された分子にこれらの部分を結合し得る。

【0151】

ペグ化部分は、例えば、システイン残基を分子のＣ末端に組み込むか、又は分子のＣＤ７１結合面から離れた方に向いている残基位置にシステインを操作し、そしてペグ化された基を周知の方法を使用してシステインに結合することにより、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインに加えられ得る。

【0152】

さらなる部分を組み込んだＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、いくつかの周知のアッセイにより機能性について比較され得る。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメインバリアントの組み込みに起因して変更された特性は、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ若しくはＦｃＲｎ受容体のような受容体の可溶性形態を使用して、又は例えばＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを測定する周知の細胞ベースのアッセイを使用して、又はインビボモデルにおいて本明細書に開示される分子の薬物動態特性を評価して、アッセイされ得る。

【0153】

ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は線状ＤＮＡ配列の一部として、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする核酸が提供され、これらとしては、インビトロ転写／翻訳のために使用される線状ＤＮＡ配列、組成物又はその定方向変異原の原核生物、真核生物又は繊維状ファージ発現、分泌及び／又はディスプレイと適合性のベクターが挙げられる。しかし、特定の例となるポリヌクレオチドは本明細書に開示され、遺伝コードの縮重又は所定の発現系におけるコドン優先度を考慮して、本明細書に開示されるＦＮ３ドメインをコードする他のポリヌクレオチドもまた本開示の範囲内である。

【0154】

いくつかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする。

【0155】

本明細書において開示されるポリヌクレオチドは、自動化ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により製造され得、そして完全な一本鎖又は二本差分子に組み立てられ得る。あるいは、本明細書において開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲとその後の慣用のクローニングのような他の技術により製造され得る。所定の既知の配列のポリヌクレオチドを製造するか又は得るための技術は当該分野で周知である。

【0156】

本明細書において開示されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非コード配列、例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するＣｉｓ配列などを含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製又は検出を容易にするマーカー、又はヒスチジンタグ若しくはＦＡタグのようなタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡのような融合タンパク質パートナー、Ｆｃ又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩのようなバクテリオファージコートタンパク質をコードする、さらなるアミノ酸をコードするさらなる配列も含み得る。

【0157】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、トランスポゾンベースのベクター又は本明細書において開示されるポリヌクレオチドを所定の生物若しくは遺伝的背景に任意の手段により導入するために適した任意の他のベクターであり得る。このようなベクターは、このようなベクターによりコードされるポリペプチドの発現を制御し、調節し、引き起こし、又は可能にすることができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターであり得る。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所定の発現系においてコードされるポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、当該分野で周知の細胞ベースでも無細胞系でもよい。

【0158】

いくつかの実施形態において、ベクターを含む宿主細胞が提供される。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、場合により、当該分野で公知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団により製造され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ（１９８７－２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ （１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ （１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ （１９９４－２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ、（１９９７－２００１）を参照のこと。

【0159】

発現のために選択される宿主細胞は、哺乳動物起源のものであり得、又はＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ－１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換された細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）のような原核細胞又は原核生物、及び天然の又は操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種株のいずれかから選択され得る。

【0160】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で、単離された宿主細胞を培養すること、及びＦＮ３ドメインを精製することを含む、ＣＤ７１に結合する単離されたＦＮ３ドメインを製造する方法。

【0161】

ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインは、周知の方法、例えば、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、組み換え細胞培養物から精製され得る。

【0162】

抗イディオタイプ抗体
いくつかの実施形態において、抗イディオタイプ抗体はＦＮ３ドメインに結合する。

【0163】

いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインに結合する抗イディオタイプ抗体は、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含む。

【0164】

キット
いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含むキットが提供される。

【0165】

キットは、治療用途のため、及び診断キットとして使用され得る。

【0166】

いくつかの実施形態において、キットは、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメイン、及びＦＮ３ドメインを検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態において、キットは、二価ＦＮ３ドメインを含む。キットは、使用のための指示書；他の試薬、例えば、標識、キレート化又は他の方法のカップリングに有用な薬剤、放射線防護組成物；イメージング、診断又は治療目的のための投与のために、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを準備するためのデバイス又は他の材料；薬学的に許容しうる担体；及び対象への投与のための他のデバイス又は材料：を含む、１つ又はそれ以上の他のエレメントを含み得る。

【0167】

いくつかの実施形態において、キットは、配列番号３３～５０のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。

【0168】

いくつかの実施形態において、キットは、配列番号５１～６１のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。

【0169】

いくつかの実施形態において、キットは、配列番号８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。

【0170】

いくつかの実施形態において、キットは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９のうちの１つのアミノ酸配列を含む、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを含む。

【0171】

ＣＤ７１結合ＦＮ３ドメインの使用
ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はその結合体は、ヒト疾患の症状又は細胞、組織、器官、流体、若しくは一般的に、宿主における特定の病理を、診断するため、モニタリングするため、調節するため、処置するため、緩和するため、それらの発生の予防に役立てるため、又は減少させるために使用され得る。

【0172】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はその結合体はまた、対象におけるＣＤ７１陽性腫瘍組織のイメージングにおいて使用され得る。本明細書において開示される方法は、任意の分類に属する動物患者に使用され得る。このような動物の例としては、ヒト、齧歯動物、イヌ、ネコ及び家畜のような哺乳動物が挙げられる。

【0173】

いくつかの実施形態において、がん組織の細胞によるＣＤ７１の発現にもとづいて組織のがんを有する対象、又は組織のがんを発症する可能性がある対象を診断する方法、免疫療法の成功を予測する方法、予後の方法、及び処置方法が提供される。

【0174】

いくつかの実施形態において、腫瘍組織においてＣＤ７１を発現しているがん細胞を検出する方法が提供され、該方法は：対象から腫瘍組織サンプルを得ること；腫瘍組織の先端（ｔｏｅ）サンプルを、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインと接触させ、そしてＣＤ７１とＦＮ３ドメインとの間の結合を検出することにより、腫瘍組織においてＣＤ７１が発現されているか否かを検出することを含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１細胞は、ＣＮＳ疾患、炎症／免疫疾患、例えば脳のＭＳ及び感染性疾患に関与する細胞である。

【0176】

いくつかの実施形態において、組織は、ＣＤ７１を発現する任意の器官又は解剖学的系の組織であり得る。

【0177】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１発現は、免疫組織化学又はＥＬＩＳＡのような公知の方法を使用して評価され得る。

【0178】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１を発現する細胞を単離する方法が提供され、該方法は：対象からサンプルを得ること；配列番号３３～５０のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインとサンプルを接触させ、そしてＦＮ３ドメインに結合した細胞を単離すること、を含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、ＣＤ７１を発現する細胞を単離する方法が提供され、該方法は：対象からサンプルを得ること；配列番号５１～６１のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインとサンプルを接触させ、そしてＦＮ３ドメインに結合した細胞を単離すること、を含む。

【0180】

いくつかの実施形態において、腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法が提供され、該方法は：配列番号３３～５０のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、検出可能な標識に結合させて結合体を形成すること；結合体を対象に投与すること；及び結合体が結合したＣＤ７１発現がん細胞を可視化すること、を含む、
いくつかの実施形態において、腫瘍組織においてＣＤ７１を発現するがん細胞を検出する方法が提供され、該方法は：配列番号５１～６２又は８１～３０９のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを、検出可能な標識に結合させて結合体を形成すること；結合体を対象に投与すること；及び結合体が結合したＣＤ７１発現がん細胞を可視化すること、を含む。

【0181】

いくつかの実施形態において、がんを有する対象を処置する方法が提供され、該方法は、ＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＦＮ３ドメインは、治療剤（例えば、細胞傷害性薬剤、オリゴヌクレオチド、別の標的に結合するＦＮ３ドメインなど）に結合される。

【0182】

いくつかの実施形態において、対象は固形腫瘍を有する。

【0183】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は黒色腫である。

【0184】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は肺がんである。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は扁平上皮非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は非扁平上皮ＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は肺腺がんである。

【0185】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は腎細胞がん（ＲＣＣ）である。

【0186】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は中皮腫である。

【0187】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は上咽頭がん（ＮＰＣ）である。

【0188】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は結腸直腸癌である。

【0189】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は前立腺がんである。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は去勢抵抗性前立腺がんである。

【0190】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）である。

【0191】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は卵巣がんである。

【0192】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）である。

【0193】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は肝臓がんである。

【0194】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は膵臓がんである。

【0195】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は甲状腺がんである。

【0196】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は頭頸部扁平上皮がんである。

【0197】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は食道又は胃腸管のがんである。

【0198】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は乳がんである。

【0199】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は卵管がんである。

【0200】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は脳がんである。

【0201】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は尿道がんである。

【0202】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は泌尿生殖器がんである。

【0203】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は子宮内膜症である。

【0204】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍は子宮頸がんである。

【0205】

いくつかの実施形態において、固形腫瘍はがんの転移巣である。

【0206】

いくつかの実施形態において、対象は血液悪性腫瘍を有する。

【0207】

いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、骨髄腫又は白血病である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍はＢ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍はバーキットリンパ腫である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍はホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。

【0208】

いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は骨髄異形成症候群である。

【0209】

いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。

【0210】

いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

【0211】

いくつかの実施形態において、血液悪性腫瘍は形質細胞腫である。

【0212】

いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物又は医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と組み合わせて、すなわち、同時に又は連続して投与され得る。いくつかの実施形態において、他の又はさらなる治療剤は、他の抗腫瘍剤又は治療剤である。異なる腫瘍型及び腫瘍ステージは、癌の処置に有用な様々な補助化合物の使用を必要とする場合がある。例えば、本明細書において提供される組成物は、とりわけ、タキソール、チロシンキナーゼ阻害剤、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン、ホスファターゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤のような様々な化学療法剤と組み合わせて使用され得る。組成物はまた、とりわけ、抗ＰＤ－１又は抗ＣＴＬＡ－４のような腫瘍に対する免疫応答を調節する薬物と組み合わせて使用され得る。さらなる処置は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体のような、免疫系を調節する薬剤であり得る。

【0213】

いくつかの実施形態において、細胞、組織、器官、流体、又は一般に宿主において、ヒト疾患の症状又は特定の病態を、診断するか、モニタリングするか、調節するか、処置するか、軽減するか、それらの発生の予防に役立てるか、低減するために使用され得る、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はその結合体はまた、血液脳関門を横切ることができる特性を示す。血液脳関門（ＢＢＢ）は、大部分の高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びポリペプチド）及び多くの小分子が脳に進入することを防止する。ＢＢＢは、高度に制限的な緊密な接合部を有する特殊な内皮細胞から主に構成され、結果として、大小の物質の血液から中枢神経系への通過がＢＢＢにより制御される。多くの治療剤は所望の有効性を伴ってＢＢＢを渡って送達されることができないので、この構造は、神経性疾患及び障害（例えば、脳がん）を有する患者の処置及び管理を困難にする。ＢＢＢの混乱を含むさらなる状態としては：脳卒中、糖尿病、てんかん発作、高血圧性脳症、後天性免疫不全症候群、外傷性脳損傷、多発性硬化症、パーキンソン病（ＰＤ）及びアルツハイマー病が挙げられる。この能力は、脳がんを処置するために特に有用であり、これらの脳がんとしては、例えば：星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、及び先天性腫瘍；又は脊髄のがん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、及び肉腫が挙げられる。特定の実施形態において、配列番号３３～５０のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はその結合体は、例えば、治療剤又は細胞傷害性薬剤を血液脳関門を越えて送達するために有用である。特定の実施形態において、配列番号５１～６１のうちの１つのアミノ酸配列を含むＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はその結合体は、例えば、治療剤又は細胞傷害性薬剤を血液脳関門を越えて送達するために有用である。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、１４９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は８１～３０９の配列を含む。

【0214】

いくつかの実施形態において、ＢＢＢを越える治療剤の輸送を容易にすることができるポリペプチドは、配列番号１４６、２１４、１０４、２５９、１３４、９２、３０２、２３５、２３７、１５２、２３８、１３６、１９７、２１２、２９６、２２６、２６１、３０７、１１５、１１２、２７８、２９７、９６、２２２、９５、２３３、２１７、２５２、１９４、１６４、１６８、１７４、１９０、２５７、３０３、２８４、８５、又は１４９の配列を含むタンパク質である。

【0215】

「処置する」又は「処置」は、治療的処置及び予防的手段を指し、ここで目的は、がんの発生又は拡散のような望ましくない生理学的変化又は障害を防止するか又は鈍化させる（減少させる）ことである。いくつかの実施形態において、有益又は望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出可能でも検出不可能でも、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は鈍化、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解（部分的でも完全でも）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較して、生存を延長することを意味する場合がある。処置を必要とするものとしては、既に状態若しくは障害を有するものに加えて、状態若しくは障害を有する傾向があるもの。又は状態若しくは障害を予防しようとするものが挙げられる。

【0216】

「治療有効量」は、必要な投薬量及び期間で、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重のような因子によって変わり得る。有効なＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインの例となる指標は、患者の改善された健康、腫瘍のサイズの減少若しくは縮小、腫瘍の停止若しくは鈍化した成長、及び／又は体内の他の位置へのがん細胞の転移がないことである。

【0217】

投与／医薬組成物
いくつかの実施形態において、本明細書において開示される、検出可能な標識、治療剤又は細胞傷害性薬剤に場合により結合された、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメイン、及び薬学的に許容しうる担体の医薬組成物が提供される。治療用途のために、ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインは、薬学的に許容しうる担体中に、活性成分として有効量のドメイン又は分子を含有する医薬組成物として製造され得る。「担体」は、活性化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水及びオイルのような液体であり得、これらとしては、石油起源、動物起源、植物起源又は合成起源のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。例えば、０．４％食塩水及び０．３％グリシンが使用され得る。これらの溶液は無菌であり、そして一般的には粒状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、ろ過）により滅菌され得る。組成物は、生理状態に近づけるために必要に応じて薬学的に許容しうる補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本明細書において開示される分子の濃度は広く、すなわち、約０．５％未満から、通常は少なくとも約１％から、１５又は２０質量％ほどの多くまで変化し得、主に必要な用量、流体体積、粘性などに基づいて、選択される特定の投与形式に従って選択される。適切なビヒクル及び製剤は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｔｒｏｙ、Ｄ．Ｂ．編、Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００６、Ｐａｒｔ ５、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ６９１－１０９２頁に記載される、特に９５８－９８９頁を参照のこと。

【0218】

本明細書に開示されるＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与様式は、当該分野で周知のように、宿主へ薬剤を送達する任意の適切な経路、例えば、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下、経肺；錠剤、カプセル剤、液剤、散剤、ゲル、粒子での処方を使用する経粘膜（経口、鼻腔内、腟内、直腸）であり得；そしてシリンジ、移植されるデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；又は当業者により理解される他の手段に含有される。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝内、心臓内、骨内（ｉｎｔｒａｏｓｔｅａｌ）、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮送達により達成され得る。

【0219】

医薬組成物は、本明細書に記載される医薬組成物を入れる容器を含むキットとして供給され得る。医薬組成物は、例えば、単回用量若しくは複数用量のための注射可能液剤の形態で、又は注射前に再構成される滅菌粉末として提供され得る。あるいは、このようなキットは、医薬組成物の投与のために、乾燥粉末分散器、液体エアロゾル発生器、又は噴霧器を含み得る。このようなキットは、医薬組成物の適応症及び利用に関する書面の情報をさらに含む場合がある。

【実施例】

【0220】

以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態の説明に役立つ。これらの実施例は、説明の目的のみのために提供され、そして実施形態は、これらの実施例に限定されるといかなるようにも解釈されるべきではなく、むしろ本明細書において提供される教示の結果として証拠となる任意かつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。本質的に同様の結果を得るために変更され得又は改変され得る重要でない様々なパラメーターを、当業者は容易に理解するだろう。

【0221】

実施例１．無作為化ループを含むＴｅｎｃｏｎライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃ由来の１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ、ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７－１１７、２０１２；米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータ鎖を接続する６つの表面に露出したループを示す。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基は、特定の標的に結合する新規な分子を選択するために使用され得るフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するために無作為化され得る。

【0222】

Ｔｅｎｃｏｎ：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ （配列番号１）
様々なライブラリーが、Ｔｅｎｃｏｎ足場及び様々な設計方針を使用して生成された。一般に、ライブラリーＴＣＬ１及びＴＣＬ２は良好なバインダーを生じた。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリーの生成は、国際特許公開第ＷＯ／２０１４０８１９４４Ａ２号に詳細に記載される。

【0223】

ＴＣＬ１ライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみを無作為化するように設計されたライブラリーであるＴＣＬ１を、ｃｉｓディスプレイシステム（Ｊａｃｏｂｓら、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ、ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２５：１０７－１１７、２０１２）を用いた使用のために構築した。このシステムにおいて、Ｔａｃプロモータのための配列、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓ－エレメント、及びｏｒｉエレメントを組み込んだ一本鎖ＤＮＡを生成した。インビトロ転写／翻訳系における発現の際に、それがコードされるＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃｏｎ－ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体を生成した。次いで、以下に記載されるように、標的分子に結合する複合体を単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。

【0224】

ｃｉｓディスプレイを用いた使用のためのＴＣＬ１ライブラリーの構築は、ＰＣＲを複数回連続して行い、最終の線状二本差ＤＮＡ分子を半分を２つで生成することにより達成された；５’フラグメントはプロモーター及びＴｅｎｃｏｎ配列を含有するが、３’フラグメントはｒｅｐＡ遺伝子並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含有する。これら２つの半分を制限消化により組み合わせて構築物全体を生成した。ＴＣＬ１ライブラリーを、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループにのみ無作為なアミノ酸を組み込むように設計した。ＮＮＳコドンをこのライブラリーの構築において使用し、２０のアミノ酸全て及び１つの終止コドンのＦＧループへの可能な組み込みを生じた。ＴＣＬ１ライブラリーは６つの別個のサブライブラリーを含有し、各々が多様性をさらに増加させるために７～１２残基の異なる無作為化ＦＧループ長を有する。

【0225】

ＴＣＬ１ライブラリー（配列番号２）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ_７－１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
ここで
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１及びＸ_１２は任意のアミノ酸であるか又は欠失される。

【0226】

ＴＣＬ２ライブラリーの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方が無作為化されており、かつ各位置におけるアミノ酸の分布が厳密に制御されたＴＣＬ２ライブラリーを構築した。表２は、ＴＣＬ２ライブラリーにおける所望のループ位置におけるアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は２つの目的を有していた。第一に、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の分析に基づき、かつ／又は相同性モデリングから、Ｔｅｎｃｏｎフォールディング及び安定性のために構造的に重要であると予測された残基にライブラリーを偏らせた。例えば、位置２９の残基はＴｅｎｃｏｎ折り畳みの疎水性コア中に埋もれているので、位置２９を疎水性アミノ酸のサブセットのみに固定した。設計の第二層は、高親和性バインダーを効率的に生じるように、アミノ酸分布を、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に見られる残基のアミノ酸分布に偏らせることを含んでいた（Ｂｉｒｔａｌａｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８－２８、２００８；Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６－８４、２００７）。この目的のために、表２における「設計された分布」は、以下のような分布を指す：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％スレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布はメチオニン、システイン、及び終止（ＳＴＯＰ）コドンを欠いている。

【0227】

ＴＣＬ２ライブラリー（配列番号３）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＳＸ_１４Ｘ_１５ＬＳＡＥＦＴＴ；ここで、
Ｘ_１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒであり；
Ｘ_９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；そして
Ｘ_１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌである。

【0228】

【表2】

【0229】

その後、これらのライブラリーを様々な方法で改善し、これらの方法は、野生型ｔｅｎｃｏｎと比較した場合に置換Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉを組み込んだ（Ｔｅｎｃｏｎ２７；配列番号４）安定化されたＴｅｎｃｏｎフレームワーク（米国特許第８，５６９，２２７号）上にライブラリーを構築すること、さらにはＢＣ及びＦＧループにおける無作為化された位置の変更を含む。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際特許出願第ＷＯ２０１３０４９２７５号に記載される。このことから、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループのみ（ライブラリーＴＣＬ９）、又はＢＣ及びＦＧループの組み合わせ（ライブラリーＴＣＬ７）を無作為化するように設計された新しいライブラリーを生成した。これらのライブラリーを、ｃｉｓディスプレイシステムとの使用のために構築した（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：２８０６－２８１０、２００４）。この設計の詳細を以下に示す：

【0230】

安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号４）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0231】

ＴＣＬ７ （無作為化ＦＧ及びＢＣループ）（配列番号５）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５及びＸ_１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり；そして
Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１７、Ｘ_１８及びＸ_１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか又は欠失されている。

【0232】

ＴＣＬ９ （無作為化ＦＧループ）（配列番号６）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＸ_７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１及びＸ_１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか又は欠失されている。

【0233】

ライブラリー構築のために、無作為化ＢＣループ（長さ６～９の位置）又はＦＧループ（長さ７～１２の位置）をコードするＤＮＡフラグメントを、ライブラリーのアミノ酸分布を制御するように、そして終止コドンを除外するように、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ）を使用して合成した。ＢＣループ又はＦＧループのいずれかを無作為化するＤＮＡ分子の２つの異なるセットを独立して合成し、その後、ＰＣＲを使用して組み合わせて完全ライブラリー製品を製造した。

【0234】

ＦＧループライブラリーの構築（ＴＣＬ９）
５’Ｔａｃプロモーターと、それに続くＦＧループ中の無作為化されたコドンを除いたＴｅｎｃｏｎの完全遺伝子配列とからなる合成ＤＮＡ分子のセットを製造した（配列番号２６～３１）。ＦＧループ無作為化のために、システイン及びメチオニンを除いて全てのアミノ酸を等しいパーセンテージでコードした。多様化された部分の長さを、それらがＦＧループ中の７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸をコードするようにした。各長さのバリエーションのサブライブラリーを、２ｕｇスケールで個々に合成し、次いでオリゴＳｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ（配列番号９）及びＳｌｏｎｉｎｇ－Ｒｅｖ（配列番号１０）を使用したＰＣＲにより増幅した。

【0235】

ライブラリーの３’フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含有する定常ＤＮＡ配列である。Ｍ１３順方向及びＭ１３逆方向プライマーを用いてテンプレートとしてプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を行い、このフラグメントを増幅した。得られたＰＣＲ生成物をＰｓｐＯＭＩにより終夜消化し、そしてゲル精製した。ライブラリーＤＮＡの５’部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含有する３’ＤＮＡに連結するために、５’ＤＮＡ ２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇ～５６０ｎｇ）を、等モル濃度（約１．２５μｇ）の３’ ｒｅｐＡ ＤＮＡに、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で３７℃にて終夜連結した。連結されたライブラリー生成物を、オリゴＰＯＰ２２５０（配列番号１１）及びＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号１２）を用いるＰＣＲを１２サイクル使用することにより増幅した。各サブライブラリーのために、１２ ＰＣＲ反応の結果として得られたＤＮＡを合わせて、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムにより精製した。ＴＣＬ９の各サブライブラリーの収量は３２～３４μｇの範囲に及んだ。

【0236】

ＦＧ／ＢＣループライブラリー（ＴＣＬ７）の構築
ＴＣＬ７ライブラリーは、無作為化されたＴｅｎｃｏｎ ＢＣ及びＦＧループを含むライブラリーを備える。このライブラリーにおいて、６～９アミノ酸長のＢＣループを、７～１２アミノ酸長の無作為化ＦＧループと組合せ論的に（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉｃａｌｌｙ）混合した。合成ＴｅｎｃｏｎフラグメントＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、及びＢＣ９（それぞれ配列番号１３～１６）を、タンパク質のＮ末端部分を、残基ＶＸを含めて残基ＶＸまでコードするＴｅｎｃｏｎ遺伝子を含むように製造し、その結果ＢＣループは、６、７、８、又は９個のいずれかの無作為化アミノ酸で置き換えられ、これは本明細書に提供される配列において「Ｎ」の文字列により表される。これらのフラグメントを、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８３Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）の発見の前に合成したが、これらの変異は、以下に記載される分子生物学工程において導入された。このフラグメントを、無作為化ＦＧループをコードするフラグメントと組み合わせるために、以下の工程を進めた。

【0237】

第一に、Ｔａｃプロモーター及びアミノ酸Ａ１７をコードするヌクレオチドまでのＴｅｎｃｏｎの５’配列をコードするＤＮＡフラグメント（１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ、配列番号１７）を、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号１８）及びＬＳ１１１４（配列番号１９）を使用したＰＣＲにより製造した。これはライブラリーにおいてＬ１７Ａ変異を含めるために行われた（ＣＥＮ５２４３）。次に、無作為化ＢＣループを含むＴｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８～Ｖ７５をコードするＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、又はＢＣ９並びにオリゴＬＳ１１１５（配列番号２０）及びＬＳ１１１７（配列番号２１）を使用したＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ工程はＢｓａＩ部位を３’末端に導入した。その後、プライマーとしてオリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ及びＬＳ１１１７を使用してオーバーラップＰＣＲによりこれらのＤＮＡフラグメントを接合した。得られた２４０ｂｐのＰＣＲ生成物をプールし、そしてＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットにより精製した。精製したＤＮＡをＢｓａＩ－ＨＦを用いて消化し、そしてゲル精製した。

【0238】

ＦＧループをコードするフラグメントを、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号２２）及びＳＤＧ２４（配列番号２３）を用いてテンプレートとしてＦＧ７、ＦＧ８、ＦＧ９、ＦＧ１０、ＦＧ１１、及びＦＧ１２を使用したＰＣＲを使用して増幅し、ＢｓａＩ制限部位並びにＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異を組み入れた（ＣＥＮ５２４３）。

【0239】

消化されたＢＣフラグメント及びＦＧフラグメントを、３ウェイライゲーションを使用して単一工程で一緒に連結した。１６の可能な組み合わせにおける４つのライゲーション反応を設定し、各ライゲーション反応は、２つのＢＣループ長と２つのＦＧループ長を組み合わせた。各ライゲーションは総ＢＣフラグメント約３００ｎｇ及びＦＧフラグメント３００ｎｇを含有していた。次いで、これら４つのライゲーションプールを、オリゴＰＯＰ２２２２（配列番号２４）及びＳＤＧ２８ 配列番号２５）を使用するＰＣＲにより増幅した。次いで、各反応生成物７．５μｇをＮｏｔ１を用いて消化し、そしてＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムを用いて浄化した。このＤＮＡ ５．２μｇを、等モル量のＲｅｐＡ ＤＮＡフラグメント（約１４μｇ）に連結し、ＰｓｐＯＭＩを用いて消化し、そして生成物を、オリゴＰＯＰ２２２２を使用するＰＣＲにより増幅した。

【0240】

実施例２：代替の結合表面を有するＴｅｎｃｏｎライブラリーの生成
特定のライブラリー設計において無作為化しようとする残基の選択は、生成される相互作用表面の形状全体に影響を与える。ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループが無作為化されたライブラリーから、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように選択された足場タンパク質を含有するＦＮ３ドメインのＸ線結晶構造解析は、ＭＢＰの活性部位に適合する大きく湾曲した境界面を有することが示された（Ｋｏｉｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４： ６６３２－６６３７、２００７）。対照的に、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリン反復足場タンパク質は、かなりより平坦な相互作用表面を有し、そして活性部から離れたＭＢＰの外面に結合することが分かった（Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２： ５７５－５８２、２００４）。これらの結果は、足場分子の結合表面の形状（湾曲 対 平坦）が、どの標的タンパク質又はそれらの標的タンパク質上の特定のエピトープが、足場により効率的に結合されることが可能であるかを決定し得るということを示唆する。タンパク質結合のためのＦＮ３ドメインを含有するタンパク質足場の操作を中心とした公開された取り組みは、標的結合のための隣接ループの操作に依存しており、それ故、湾曲した結合表面を生じた。このアプローチは、このような足場によりアクセス可能な標的及びエピトープの数を限定するかもしれない。

【0241】

Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３ドメインは、分子の反対の面にある二組のＣＤＲ様ループを含有し、第一の組はＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループにより形成され、そして第二の組は、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループにより形成される。二組のループはＦＮ３構造の中心を形成するベータ鎖により隔てられている。Ｔｅｎｃｏｎの画像を９０度回転させる場合、別の表面が視覚化され得る。このわずかにくぼんだ表面はＣＤ及びＦＧループ、並びに２つの逆平行ベータ鎖であるＣ及びＦベータ鎖により形成され、そして本明細書ではＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面と呼ばれる。Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面は、表面を形成する残基のサブセットを無作為化することにより、タンパク質足場相互作用表面のライブラリーを設計するためのテンプレートとして使用され得る。ベータ鎖は、他の全部の残基の側鎖がタンパク質の表面に露出された反復構造を有する。したがって、ライブラリーは、ベータ鎖における一部の又は全ての表面に露出した残基を無作為化することにより作製され得る。ベータ鎖における適切な残基を選択することにより、他のタンパク質との相互作用のための独特の足場表面を提供しながら、Ｔｅｎｃｏｎ足場の固有の安定性の妥協は最小になるはずである。

【0242】

ライブラリーＴＣＬ１４（配列番号７）をＴｅｎｃｏｎ２７足場（配列番号４）に設計した。

【0243】

このライブラリーを構築するために使用した方法の十分な説明は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記載される。

【0244】

ＴＣＬ１４ライブラリー（配列番号７）：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１ＩＸ_２ＹＸ_３ＥＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ_８ＶＸ_９ＩＸ_１０ＧＶＫＧＧＸ_１１Ｘ_１２ＳＸ_１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２及びＸ_１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ，Ｙ、Ｃ又はＭである。

【0245】

Ｔｅｎｃｏｎ２７においてＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面を形成する２つのベータ鎖は、無作為化され得る合計９つの表面に露出した残基を有し；Ｃ鎖：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６；Ｆ鎖： Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、及びＶ７４、一方でＣＤループは６つの潜在的な残基を有し：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、及びＥ４３、そしてＦＧループは７つの潜在的な残基を有する：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、及びＮ８１。２２個全ての残基が無作為化された場合のライブラリーのより大きな理論的サイズに起因して、選択した残基をＴＣＬ１４設計に含めるために選んだ。

【0246】

Ｔｅｎｃｏｎ中の１３個の位置を無作為化のために選んだ：Ｃ鎖におけるＬ３２、Ｑ３４及びＱ３６、ＣＤループにおけるＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０及びＶ４１、Ｆ鎖におけるＴ６８、Ｓ７０及びＹ７２、ＦＧループにおけるＨ７８、Ｒ７９、及びＮ８１。Ｃ及びＦ鎖において、Ｓ３０及びＥ６６は、ＣＤ及びＦＧループを越えてすぐのところにあり、そしてＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の一部であるようには見えないので、無作為化されなかった。ＣＤループについては、可動性をもたらすグリシンはループ領域において有益であり得、そしてＥ４３は表面の接合分にあるので、Ｇ４２及びＥ４３は無作為化されなかった。ＦＧループは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及びＳ８０を除外された。グリシンは上記の理由から除外されたが、結晶構造を注意深く調べることにより、Ｓ８０がコアと鍵となる接触をして安定なＦＧループを形成することに役立っていることがわかった。Ｋ７５はＣ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面の表面から離れた方を向いており、無作為化にはあまり魅力的な候補ではなかった。上述の残基は元のＴＣＬ１４設計では無作為化されなかったが、これらは、新規な選択のため又は例えば、選択されたＴＣＬ１４標的に特異的なヒットに対する親和性成熟ライブラリーのための、さらなる多様性を生じるためにその後のライブラリー設計に含まれ得る。

【0247】

ＴＣＬ１４の製造後に、同様の設計の３つのさらなるＴｅｎｃｏｎライブラリーを製造した。これら２つのライブラリー、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３を、ＴＣＬ１４と同じ位置で（上を参照のこと）無作為化したが、これらの位置に存在するアミノ酸の分布を変更した（表３）。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１は、システイン及びメチオニンだけを除外して、全ての位置において１８の天然アミノ酸の等しい分布（それぞれ５．５５％）を含むように設計された。ＴＣＬ２３は、表３に記載されるように、各無作為化位置が機能的抗体のＨＣＤＲ３ループにおいて見られるアミノ酸分布に近づくように設計された（Ｂｉｒｔａｌａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７７： １５１８－１５２８、２００８）。ＴＣＬ２１ライブラリーと同様に、システイン及びメチオニンを除外した。

【0248】

第三のさらなるライブラリーを、他のライブラリーの潜在的な標的結合表面を拡大するために構築した。このライブラリーＴＣＬ２４において、４つのさらなるＴｅｎｃｏｎ位置を、ライブラリーＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、及びＴＣＬ２３と比較して無作為化した。これらの位置は、Ｄ鎖からＮ４６及びＴ４８、並びにＧ鎖からＳ８４及びＩ８６を含む。位置４６、４８、８４、及び８６の残基の側鎖は、ベータ鎖Ｄ及びＧから表面露出しており、そしてＣ及びＦ鎖の無作為化される位置と構造的に隣接しており、それ故、標的タンパク質への結合のためにアクセス可能な表面積を増加させるので、これらの残基を特に選択した。ＴＣＬ２４について各位置において使用されたアミノ酸分布は、表３においてＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１について記載されたものと同じであった。

【0249】

ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１ＩＸ_２ＹＸ_３ＥＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＧＥＡＩＸ_８ＬＸ_９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ_１０ＶＸ_１１ＩＸ_１２ＧＶＫＧＧＸ_１３Ｘ_１４ＳＸ_１５ＰＬＸ_１６ＡＸ_１７ＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６及びＸ_１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷである。

【0250】

【表3】

【0251】

ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４ライブラリーの生成
ＴＣＬ２１ライブラリーを、アミノ酸分布を制御するためにＣｏｌｉｂｒａライブラリー技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を使用して生成した。ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４遺伝子フラグメントを、アミノ酸分布を制御するためにＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して生成した。ＰＣＲを使用して、最初の合成の後に各ライブラリーを増幅し、続いて、ループライブラリーについて上で記載したように、ＣＩＳ－ディスプレイシステム（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：２８０６－２８１０、２００４）を使用した選択において使用されるようにＲｅｐＡのための遺伝子に連結した。

【0252】

実施例３： ＣＤ７１に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
パニング及び生化学スクリーニング
ヒトＣＤ７１に特異的なＦＮ３ドメインを、Ｎ末端６Ｈｉｓタグを有する組み換えビオチン化ＣＤ７１細胞外ドメイン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を使用してＣＩＳ－ディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐら、２００４年）により選択した。インビトロでの転写及び翻訳（ＩＴＴ）のために、ＦＮ３ドメインライブラリーＴＣＬ１８、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４からのＤＮＡ ３μｇを使用し、未結合のライブラリーメンバーを洗浄により除去した。ＤＮＡを標的タンパク質から加熱により溶出し、そしてさらなるパニングの一連のラウンドのためにＫＯＤポリメラーゼを使用してＰＣＲにより増幅した。各ラウンドの間に標的ＣＤ７１の濃度を４００ｎＭから１００ｎＭに連続して低下させ、そして洗浄ストリンジェンシーを増加させることにより、高親和性バインダーを単離した。第五ラウンドのパニングからのアウトプットを、４回のさらなるオフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）選択にかけた。ビオチン化標的抗原濃度を、６及び７ラウンドで２５ｎＭから８及び９ラウンドで２．５ｎＭまで減らした。

【0253】

パニングに続いて、選択されたＦＮ３ドメインをコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅し、リガーゼ非依存性クローニング部位を含むように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングし、そして標準的分子生物学技術を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での可溶性発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。Ｃ末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を各ＦＮ３ドメインに加えて、精製及び検出を可能にした。

【0254】

ＣＤ７１に特異的に結合するＦＮ３ドメインについてスクリーニングするために、ストレプトアビジン被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃカタログ４３６１１０）を、１時間Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０ （Ｐｉｅｒｃｅ）においてブロックし、次いでビオチン化ＣＤ７１（パニングにおける抗原と同じ抗原を使用）又はネガティブコントロール（無関係のＦｃ融合組み換えタンパク質及びヒト血清アルブミン）で１時間コーティングした。プレートをＴＢＳＴでリンスし、そして希釈した溶解物をプレートに１時間適用した。さらにリンスした後、ウェルをＨＲＰ結合抗Ｖ５タグ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３２５）で１時間処理し、次いでＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，１１５８２９５０００１）で検定した。ストレプトアビジンコントロールのシグナルより少なくとも１０倍高いＥＬＩＳＡシグナルを有するＦＮ３ドメイン溶解物からのＤＮＡを配列決定して、２３の異なる読み取り可能なＦＮ３ドメイン配列をラウンド９スクリーニングから単離した（表４）。

【0255】

【表4】

【0256】

サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、抗ＣＤ７１ ＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。精製された各ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にＰＢＳ ｐＨ７．４の移動相中で流量０．３ｍＬ／分にて注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍでの吸光度によりモニタリングした。Ｔｅｎｃｏｎタンパク質を対照として各ランに含めた。Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、溶出プロフィールを解析した。１８の同定されたＦＮ３ドメインについての選択されたＳＥＣパラメーターを表５に列挙する。

【0257】

【表5】

【0258】

ハイスループット発現及び結合体化
同定されたクローンを、二連の５ｍＬ培養において２４ウェルディープブロックプレートにおいて増殖させた。手短には、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＴＢ培地５ｍＬ／ウェルに、終夜培養物１５０μＬを播種し、そして約３時間３７℃にて２２０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた（ＯＤ６００ 約１）。培養物をＩＰＴＧを用いて誘導してさらに４時間３７℃、２２０ｒｐｍで最終濃度１ｍＭとした。細菌ペレットを２２５０ｘｇで１５分間の遠心分離により回収した。０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を添加した６００μＬ／ウェル ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ＨＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を各ウェルに加えた；ペレットをピペットにより分離させ、次いで振盪プラットフォームで約３０分間ペレットが溶解するまで激しく振盪した。プレートを２２５０ｘｇで１５分間回転してライセートを透明にし、そして各サンプルについて２つの６００μＬアリコートを合わせた。Ｈｉｓタグ化ＦＮ３ドメインを、製造者の指示に従ってＨｉｓＴｒａｐプレート（ＧＥ）で精製し、続いてＺｅｂａ Ｓｐｉｎ ７Ｋ脱塩プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して緩衝液をＴＢＳに交換した。タンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐにより評価した。ＧｌｙＧｌｙ－ＶＣ－ＭＭＡＦへの結合のために、ＦＮ３ドメイン（３０μＭ）を１５０μＭ ＧｌｙＧｌｙＶＣ－ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）及び１μＭ Ｓｏｒｔａｓｅ Ａと混合して総体積２００μＬとした。１．５時間室温で結合を進行させ、そしてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の９６ウェルＨｉｓ Ｍｕｌｔｉｔｒａｐ ＨＰプレートを製造者の指示に従って使用して再び精製した。ＰＢＳへの緩衝液交換を、Ｚｅｂａ脱塩プレートを使用して達成し、続いて３０００ｘｇで２分間の遠心分離とともにＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＧＶプレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を使用して滅菌ろ過を行った。濃度をＮａｎｏｄｒｏｐにより評価した。

【0259】

ＳＫ－ＢＲ３結合ＦＮ３ドメインの同定
ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、ＭｃＣｏｙの５ａ培地 ＋ １０％ウシ胎仔血清において培養した。ＦＮ３希釈をＦＡＣＳ緩衝液で準備した。５０，０００ ＳＫ－ＢＲ－３細胞を各ウェルに加え；培地を遠心分離後に吸引し、そしてＨｉＬｙｔｅ標識ＦＮ３ドメインを含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに細胞を再懸濁した。細胞を２時間３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回リンスし、そして最終的にＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに再懸濁した。蛍光をＩｎｔｅｌｌｉｃｔｙｅにより検出した。細胞集団をＦＳＣ－ＳＳＣドットプロットにより同定し、続いてＦＬ４ ＭＦＩを記録した。データを８つの非染色細胞の平均に対して正規化し、そして用量応答曲線をＧｒａｐｈＰａｄを使用してフィッティングした。

【0260】

用量－応答ＥＬＩＳＡによる選択されたクローンの結合
選択されたクローンをＥＬＩＳＡにより分析して、結合についてのＥＣ５０値を決定した。手短には、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、ストレプトアビジンで５μｇ／ｍｌで終夜４Ｃにてコーティングした。次いでプレートをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で室温にて１時間ブロックし、次いでＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ビオチン化ＣＤ７１（２μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジンプレート上に捕捉し、そして段階希釈したＣｅｎｔｙｒｉｎｓを適切なウェルに１時間室温で加えた。洗浄した後、結合したＣｅｎｔｙｒｉｎをＨＲＰ及びＰＯＤ基質に結合された抗Ｖ５タグ抗体及び発光プレートリーダーを用いて検出した。発光値を濃度の関数としてプロットし、そしてＰＲＩＳＭを使用して用量応答に対してフィッティングして、結合のＥＣ５０値を決定した。

【0261】

毒素結合体を介した内部移行ＦＮ３ドメインの同定。ＦＮ３ドメインを、細胞傷害性チューブリン阻害剤モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）に、ＮＥＭ結合について記載された方法を使用して酵素切断可能Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカー又は切断不可能なＰＥＧ４リンカー（ＶＣ－ＭＭＡＦ）を介して結合した。システインバリアント－細胞毒結合体に曝露した後にＳＫＢＲ－３細胞の生存性を測定することにより殺細胞を評価した。白色ウェル、不透明底、組織培養処理プレート（Ｆｉｓｈｅｒ、ＰＩ１５０４２）において３０００／ウェルで１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むフェノールレッドＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、１１８７５０９３）５０μＬ／ウェル中に細胞をプレーティングした。細胞を加湿した５％ ＣＯ２雰囲気下で終夜３７℃で付着させた。細胞を、新鮮な培地２５ｕＬ及び新鮮な培地で作製された４×阻害剤２５ｕＬで処理した。細胞生存性を、７２時間でＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたエンドポイントアッセイにより決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して可変勾配を用いたシグモイド用量応答についての等式にデータをフィッティングすることにより、ＩＣ５０値を決定した。結果を表６に示し、そしてＣＤ７１に結合するＦＮ３ドメインが内部移行され、そして細胞傷害性であったことを実証する。

【0262】

【表6】

【0263】

二価ＦＮ３タンパク質
二価ＦＮ３タンパク質は、４反復Ｇ／Ｓリンカーにより接続された２つのＦＮ３ドメインを使用して製造される。二価ＦＮ３タンパク質を、記載されたようにＶＣ－ＭＭＡＦに結合し、そしてＳＫ－ＢＲ３細胞において細胞傷害性について評価した。二価分子についてのＩＣ５０値はより優れていることがわかった。

【0264】

トランスフェリン結合及び内部移行についての競合
ＦＮ３ドメインＶＣＭＭＡＦ結合体を、上記の細胞傷害性アッセイを使用して、ヒトトランスフェリンとの競合についてスクリーニングした。ＦＮ３ドメインを、０．６ｕＭホロ－ヒトトランスフェリン（Ｔ０６６５－１００ＭＧ）の不在下又は存在下でスクリーニングした。競合物の不在下又は存在下でスクリーニングされるＳＫ－ＢＲ３細胞に対するＦＮ３ドメイン毒素結合体についてのＩＣ５０値を表７に示す。

【0265】

【表7】

【0266】

配列番号１＝元のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ

【0267】

配列番号２＝ＴＣＬ１ライブラリー
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ（Ｘ）_７－１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は、任意のアミノ酸であり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１及びＸ_１２は、任意のアミノ酸であるか又は欠失している。

【0268】

配列番号３＝ＴＣＬ２ライブラリー
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＳＸ_１４Ｘ_１５ＬＳＡＥＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_３ Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ；
Ｘ_４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒであり；
Ｘ_９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；
Ｘ_１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり；そして
Ｘ_１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌである。

【0269】

配列番号４＝安定化Ｔｅｎｃｏｎ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0270】

配列番号５＝ＴＣＬ７（ＦＧ及びＢＣループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５及びＸ_１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり；そして
Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１７、Ｘ_１８及びＸ_１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか又は欠失している。

【0271】

配列番号６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６及びＸ_７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり；そして
Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１及びＸ_１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであるか又は欠失している。

【0272】

ＴＣＬ１４ライブラリー（配列番号７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１ＩＸ_２ＹＸ_３ＥＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ_８ＶＸ_９ＩＸ_１０ＧＶＫＧＧＸ_１１Ｘ_１２ＳＸ_１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２及びＸ_１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ，Ｙ、Ｃ又はＭである。

【0273】

ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ_１ＩＸ_２ＹＸ_３ＥＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＧＥＡＩＸ_８ＬＸ_９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ_１０ＶＸ_１１ＩＸ_１２ＧＶＫＧＧＸ_１３Ｘ_１４ＳＸ_１５ＰＬＸ_１６ＡＸ_１７ＦＴＴ；
ここで、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６及びＸ_１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷである。

【0274】

配列番号９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＦＯＲ
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣ

【0275】

配列番号１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ－ＲＥＶ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧ

【0276】

配列番号１１＝ＰＯＰ２２５０
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣ

【0277】

配列番号１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ
ＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡ

【0278】

配列番号１３＝ＢＣ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0279】

配列番号１４＝ＢＣ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0280】

配列番号１５＝ＢＣ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0281】

配列番号１６＝ＢＣ６
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0282】

配列番号１７＝１３０ｍｅｒ－Ｌ１７Ａ
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧ

【0283】

配列番号１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ
ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＡＣ

【0284】

配列番号１９＝ＬＳ１１１４
ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＡＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＴＣ

【0285】

配列番号２０＝ＬＳ１１１５
ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧ

【0286】

配列番号２１＝ＬＳ１１１７
ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＧＡＡ

【0287】

配列番号２２＝ＳＤＧ１０
ＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ

【0288】

配列番号２３＝ＳＤＧ２４
ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＡＧ

【0289】

配列番号２４＝ＰＯＰ２２２２
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣ

【0290】

配列番号２５＝ＳＤＧ２８
ＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣ

【0291】

配列番号２６＝ＦＧ１２
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0292】

配列番号２７＝ＦＧ１１
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0293】

配列番号２８＝ＦＧ１０
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0294】

配列番号２９＝ＦＧ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0295】

配列番号３０＝ＦＧ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0296】

配列番号３１＝ＦＧ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ （ここでＮは任意の塩基である）

【0297】

配列番号３２＝ヒト成熟ＣＤ７１
ＭＴＫＥＹＱＤＬＱＨＬＤＮＥＥＳＤＨＨＱＬＲＫＧＰＰＰＰＱＰＬＬＱＲＬＣＳＧＰＲＬＬＬＬＳＬＧＬＳＬＬＬＬＶＶＶＣＶＩＧＳＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ

【0298】

配列番号８０＝ヒト成熟ＣＤ７１細胞外ドメイン
ＱＮＳＱＬＱＥＥＬＲＧＬＲＥＴＦＳＮＦＴＡＳＴＥＡＱＶＫＧＬＳＴＱＧＧＮＶＧＲＫＭＫＳＬＥＳＱＬＥＫＱＱＫＤＬＳＥＤＨＳＳＬＬＬＨＶＫＱＦＶＳＤＬＲＳＬＳＣＱＭＡＡＬＱＧＮＧＳＥＲＴＣＣＰＶＮＷＶＥＨＥＲＳＣＹＷＦＳＲＳＧＫＡＷＡＤＡＤＮＹＣＲＬＥＤＡＨＬＶＶＶＴＳＷＥＥＱＫＦＶＱＨＨＩＧＰＶＮＴＷＭＧＬＨＤＱＮＧＰＷＫＷＶＤＧＴＤＹＥＴＧＦＫＮＷＲＰＥＱＰＤＤＷＹＧＨＧＬＧＧＧＥＤＣＡＨＦＴＤＤＧＲＷＮＤＤＶＣＱＲＰＹＲＷＶＣＥＴＥＬＤＫＡＳＱＥＰＰＬＬ

【0299】

【表8-1】

【表8-2】

【0300】

実施例４： ＣＤ７１に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害しない、ＣＤ７１に結合するＦｎ３ドメインを同定するためのパニング及び生化学的スクリーニング方法。ＣＤ７１に特異的に結合し、かつＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害しないＦＮ３ドメインをスクリーニングするために、ストレプトアビジン被覆Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃカタログ４３６１１０）を、１時間Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）中でブロックし、次いでビオチン化ＣＤ７１（パニングと同じ抗原を使用）又はネガティブコントロール（無関係のＦｃ融合組み換えタンパク質及び血清アルブミン）で１時間トランスフェリンの存在下にて、又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合するＦＮ３タンパク質の存在下でコーティングした。トランスフェリンの濃度は３５μＭまでである。いずれの特定の理論にも拘束されないが、トランスフェリン、又はＣＤ７１トランスフェリン結合部位に結合するＦＮ３タンパク質を含めることは、ＦＮ３ドメインの選択を、ＣＤ７１へのトランスフェリン結合と競合しないか又はＣＤ７１へのトランスフェリン結合を阻害しないものに進める。プレートをＴＢＳＴでリンスし、そして希釈したライセートを１時間プレートに適用した。さらなるリンス後に、ウェルをＨＲＰ結合抗Ｖ５タグ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３２５）で１時間処理し、次いでＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ，１１５８２９５０００１）を用いて検定した。ストレプトアビジンコントロールのＥＬＩＳＡシグナルよりも少なくとも１０倍高いＥＬＩＳＡシグナルを有するＦＮ３ドメインライセートからのＤＮＡを配列決定し、スクリーニングから単離されたＦＮ３ドメイン配列が得られた。

【0301】

実施例５： ＣＤ７１に結合し、かつトランスフェリンと競合しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
トランスフェリンと競合しないか又は最少の競合しかしないＣＤ７１結合ＦＮ３ドメインを同定するために、偏ったＣＩＳディスプレイストラテジーを設計した。手短に言えば、ヒトＣＤ７１のＥＣＤでの５ラウンドのパニングの後に回収されたアウトプットを使用する（実施例３）。１）最終溶出工程の前に、ヒトホロトランスフェリンを用いて、トランスフェリンと同じ部位で結合したＣｅｎｔｙｒｉｎｓを溶出する洗浄工程、又は２）モノクローナル抗体ＯＫＴ９を用いたＦＮ３ドメインバインダーの溶出、のいずれかを加えて、実施例３において記載されるようにオフレート選択のさらなるラウンドを行った。トランスフェリン洗浄ストラテジー及びＯＫＴ９溶出ストラテジーから回収されたＦＮ３ドメインドメインをＰＣＲ増幅し、そして以前に記載されたように（実施例３）ｐＥＴベクターにクローン化した。ｈｕＣＤ７１に特異的に結合した２２８のＦＮ３ドメインを、ｈｕＣＤ７１ ＥＣＤへの結合についてＥＬＩＳＡにより確認した（表８）。独特なバインダーのサブセットをＳＥＣにより分析し（表９）、ＭＭＡＦに結合させ、そしてＳＫＢＲ－３細胞＋／－ホロヒトトランスフェリンにおいて細胞生存性アッセイにより内部移行について評価した（表１０）。ポリペプチドは、受容体により内部移行されたことがわかった。ヒットのデータ及び配列を、以下の表において同定する。

【0302】

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【0303】

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【表10-4】

【表10-5】

【表10-6】

【0304】

【表11-1】

【表11-2】

【0305】

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【表12-4】

【表12-5】

【表12-6】

【表12-7】

【表12-8】

【表12-9】

【表12-10】

【0306】

実施例６．ＣＤ７１ ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチド結合体を使用した筋肉細胞におけるｍＲＮＡのノックダウン。ＦＮ３ドメインに特異的に操作されるシステインを介したマレイミド化学を使用して、ｍｕＣＤ７１結合ＦＮ３ドメインをｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に結合した。システイン置換は、本明細書に示され、そして米国特許出願公開第２０１５０１０４８０８号（参照によりその全体として本明細書に援用される）にも示されるようなものであり得る。ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯを、標準的な化学改変を用いて改変し、そしてインビトロで標的にしたｍＲＮＡのノックダウンを可能にすることを確認した。ＦＮ３ドメイン－オリゴヌクレオチド結合体を、マウスに１０ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドペイロードまでの用量で静脈内投与した。投与後の様々な時点でマウスを屠殺した；骨格筋、心筋及び様々な他の組織を回収し、そしてＲＮＡｌａｔｅｒ^ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で必要になるまで保存した。標的遺伝子ノックダウンを、標準的ｑＰＣＲ ΔΔＣ_Ｔ法並びに標的遺伝子及び対照遺伝子に特異的なプライマーを使用して評価した。標的遺伝子は、筋肉においてノックダウンされていることが分かり、そしてこのようなノックダウンは、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯをＣＤ７１ ＦＮ３結合ドメインに結合することにより増強される。

【0307】

実施例７．一般的方法
分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ （１９８２年及び１９８９年 第２版、２００１年第３版） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ （１９９３） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｖｏｌ．２１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載される。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１～４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにも見られ、これは細菌細胞におけるクローニング及びＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞及び酵母におけるクローニング（第２巻）、複合糖質及びタンパク質発現（第３巻）、及びバイオインフォマティクス（第４巻）を記載する。

【0308】

免疫沈降法、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含むタンパク質精製方法が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学改変、翻訳後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載される（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ、１６．０．５～１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｏ．（２００１） Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；４５～８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （２００１） ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４～３９１頁を参照のこと）。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造、精製及び断片化が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９９９） Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、前出）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけするための標準的技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

【0309】

本明細書において引用される全ての参考文献は、各々個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列又はＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、又は特許が、参照により援用されると具体的かつ個別に示されると同じ程度まで、参照により援用される。この参照による援用の声明は、たとえこのような引用が参照による援用の専用の声明に直接隣接していなくとも、各々全ての個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列又はＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、又は特許（これらの各々は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に確認される）に関連すると、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って出願人らにより意図される。参照による援用の専用の声明を、それがある場合に明細書内に含めることは、参照による援用のこの一般的な声明をいかなるようにも弱めることはない。本明細書における参照の引用は、その参照が従来技術に関連するということの承認とは意図されず、これらの刊行物又は書類の内容又は日付に関するいずれの承認も構成しない。

【0310】

本実施形態は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて実施形態の様々な改変が、前述の記載から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあると意図される。

【0311】

前述の記載された明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするために十分であるとみなされる。本明細書に示されそして記載されるものに加えて、実施形態の様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかとなり、そして添付の特許請求の範囲内である。

【配列表】

2022551204000001.app

【国際調査報告】