▶ インスティトゥート ナシオナル デ メディシナ ヘノミカの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-08
(54)【発明の名称】動物由来のＲＮＡフリー血清
(51)【国際特許分類】
C12N 5/02 20060101AFI20221201BHJP
【ＦＩ】
C12N5/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022510996
(86)(22)【出願日】2020-08-19
(85)【翻訳文提出日】2022-03-14
(86)【国際出願番号】 MX2020050027
(87)【国際公開番号】W WO2021034181
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】MX/A/2019/009864
(32)【優先日】2019-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】MX
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522063848
【氏名又は名称】インスティトゥート ナシオナル デ メディシナ ヘノミカ
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＯ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡ ＧＥＮＯＭＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】Ｐｅｒｉｆｅｒｉｃｏ Ｓｕｒ Ｎｏ． ４８０９． Ｃｏｌｏｎｉａ Ａｒｅｎａｌ Ｔｅｐｅｐａｎ． Ａｌｃａｌｄｉａ Ｔｌａｌｐａｎ． Ｃｉｕｄａｄ ｄｅ Ｍｅｘｉｃｏ， １４６１０， Ｍｅｘｉｃｏ
(74)【代理人】
【識別番号】110002295
【氏名又は名称】弁理士法人Ｍ＆Ｐａｒｔｎｅｒｓ
(72)【発明者】
【氏名】フロレス ハッソ カルロス ファビアン
(72)【発明者】
【氏名】アベンダーニョ バスケス セルマ エレンディラ
(72)【発明者】
【氏名】フロレス トーレス マリアナ
(72)【発明者】
【氏名】チャビラ デサレス ディアナ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD08
4B065BD15
(57)【要約】
【課題】ＲＮＡを含まない、あるいは最小限のＲＮＡ含有量で、血清自身のＲＮＡによる汚染や干渉のリスクなしに細胞培養研究が可能な、ＦＢＳを中心とした動物用血清を提供する。
【解決手段】
本発明は、サプリメントの特徴を維持するという事実のために、細胞培養のため、または医薬生物学的製品の製造のために有用であることができるＲＮＡフリー哺乳類血清に関するものである。本発明の別の実施形態は、連続的な血清加熱、アルカリ化および中和ステップの適用による哺乳類血清からＲＮＡを除去するための方法に関するものである。
【選択図】 無し
【解決手段】
本発明は、サプリメントの特徴を維持するという事実のために、細胞培養のため、または医薬生物学的製品の製造のために有用であることができるＲＮＡフリー哺乳類血清に関するものである。本発明の別の実施形態は、連続的な血清加熱、アルカリ化および中和ステップの適用による哺乳類血清からＲＮＡを除去するための方法に関するものである。
【選択図】 無し
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡを含まない、または実質的に含まないことを特徴とする動物由来の血清。
【請求項2】
前記血清がウシ、ウマ、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、またはそれぞれの胎児血清の変種のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の血清。
【請求項3】
前記血清は、ウシの胎児血清であることを特徴とする請求項１又は２記載の血清。
【請求項4】
哺乳類の血清からＲＮＡを除去するのに有用な方法であって、a）血清を５２℃から６３℃の間の温度に加熱するステップ、
b）血清を８℃から２５℃の間の温度に冷却するステップ、
c）血清を１０から１２の間のｐＨにアルカリ化するステップ、
d）血清を生理的なｐＨに中和するステップ
を含み、これらのステップが順次行われることを特徴とする方法。
【請求項5】
前記血清が、ウシ、ウマ、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、またはそれぞれの胎児血清の変種のいずれかであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項6】
前記血清を５５℃から５７℃の間の温度に加熱するステップを有することを特徴とする請求項４又は５記載の方法。
【請求項7】
前記ステップａ）の温度をさらに３０～４５分間維持することを特徴とする請求項４から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記ホエイ（血清）をｐＨ１２にアルカリ化することを特徴とする請求項４から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項9】
水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）からなる群から選択された塩基性の化学的性質を持つ化合物を用いてさらに前記ホエイのアルカリ化を行うことを特徴とする請求項４から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
前記アルカリ化を３分から２０分間維持することを特徴とする請求項４から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記アルカリ化を５～１０分間さらに維持することを特徴とする請求項４から１０のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
前記血清の中和を、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硝酸（ＨＮＯ3）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、塩酸（ＨＣｌ）からなる群から選択された酸性化学的性質の化合物を用いてさらに行うことを特徴とする請求項４から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項13】
前記血清の中和を、７．２から７．５の間のｐＨに達するまで行うことをさらに特徴とする請求項４から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項14】
前記ホエイの中和を、ｐＨ７．４になるまで行うことを特徴とする請求項４から１３のいずれか1項記載の方法。
【請求項15】
最初または最後のステップに超遠心分離ステップをさらに含むことを特徴とする請求項４から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項16】
哺乳類の血清からＲＮＡを除去するのに有用な方法であって、a）血清を５２℃から６３℃の間の温度に加熱するステップ、
b）血清を８℃から２５℃の間の温度に冷却するステップ、
c）血清を８０，０００ ｘｇから１００，０００ ｘｇの間で少なくとも５から７時間超遠心分離するステップ、
を含み、これらのステップがこの連続した順序で行われることを特徴とする方法。
【請求項17】
前記血清が、ウシ、ウマ、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、またはそれぞれの胎児血清の変種のいずれかであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項18】
前記血清を５２℃から６３℃の間の温度に加熱することを特徴とする請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項19】
前記ステップａ）の温度を３０～４５分間維持することを特徴とする請求項１６から１８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項20】
前記超遠心分離を１００，０００ ｘｇで７時間行うことを特徴とする、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記超遠心分離を５～１０時間行うことを特徴とする請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記血清を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１６から１８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞生物学の分野に属し、特に、細胞培養補助剤の分野に属する。一般論として、本発明は、リボ核酸（ＲＮＡ）が減少した、または検出限界以下の最小ＲＮＡ含量を有する血清、好ましくはウシ胎児血清、および血清からＲＮＡを除去するのに有用な方法に関するものである。このＲＮＡ低減血清は、動物血清中に通常存在するＲＮＡが細胞培養からのＲＮＡ発現解析に干渉することなく、解析を行うのに有用である。
【0002】
細胞培養は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの基礎研究や生物医学研究の主要なツールの一つである。昆虫から哺乳類まで、さまざまな種類の動物の細胞を、温度や湿度、二酸化炭素の割合などを制御しながら維持することで成り立っている。細胞を生き生きとさせ、絶えず分裂させるために、細胞培養は、細胞が最も重要な代謝機能を果たすために適切な量の塩を含む液体培地で維持される（Swain P. Basic Techniques and Limitations in Establishing Cell Culture: a Mini Review）。Adv Anim Vet Sci (201４） doi:10.14737/journal.aavs/2014/2.4s.1.10、Arora M. Cell Culture Media: A Review. Mater Methods (2013） doi:10.13070/mm.en.3.175）。
【0003】
試験管内での細胞培養に重要な成分は血清である。血清には、細胞が絶えず分裂し続けるために必要な成長因子、脂質、タンパク質などが多く含まれている。このように、血清は細胞培養を維持するための合成液体培地に栄養補助として添加される。この目的のために使用される血清は、ヒト、ウマ、ウシ由来のものがあり、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が世界的に最も広く使用されている（Arora M. Cell Culture Media: A Review）。Mater Methods (2013） doi:10.13070/mm.en.3.175.)
【0004】
前述の成分に加えて、ＦＢＳは核酸を多く含んでおり、最も豊富なのは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－タンパク質群結合小分子ＲＮＡ（ｐｉ－ＲＮＡ）、核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）など、さまざまな生物学的機能形態のＲＮＡである（Chen X, et al. Cell Res. 2008 Oct;18(10):997-1006）。様々な種類のＲＮＡの中には、細胞外小胞（ＥＶ）の中に含まれるものと、その外に含まれるものがある（Keerthikumar S. et al. J Mol Biol. 2016 Feb 22;428(４）:688-69２）。
【0005】
ＥＶは、直径５０～４００ｎｍの脂質二重層からなる微小構造体で、その中にはタンパク質、さまざまな種類の生物学的機能を持つＲＮＡ、およびいくつかの小分子が含まれている。ＥＶは、直径や分子量が互いに異なるサブグループから構成されており、直径５０～１２０0ｎｍのＥＶであるエクソソームが最も広く研究されている（Colombo M. et al. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:255-89）。ＥＶの重要な点は、ＥＶがその内容物をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でレシピエントの細胞に転送できることが示されていることで、ＥＶは細胞間コミュニケーションシステムとして提案されており、代謝や、がんや糖尿病などの病気の発症に大きな重要性を持つ可能性がある（Muralidharan-Chari V.ら、J Cell Sci. 2010 May 15;123(Pt 10):1603-11およびBobrie A.ら、Traffic. 2011 Dec;12(1２）:1659-68）。
【0006】
培養細胞を用いた研究では、ＦＢＳのＥＶはそのＲＮＡコンテンツをヒトやネズミの細胞株に転送する能力があることが示され、ＦＢＳを使用した場合、ウシのＲＮＡが細胞培養物に転送される可能性があることが強調された。この発見により、ｍｉＲＮＡが発見されてから今日までに、ｍｉＲＮＡの発現を検出・解析したと報告されている科学文献には、当該研究の細胞株が由来する種のＲＮＡとウシのＲＮＡが混在している可能性が非常に高いことが明らかになった。ウシのＲＮＡの検出と、細胞培養内でのその可能な機能の両方において、どの程度の干渉があるかは、現時点では不明である。その主な理由は、牛のｍｉＲＮＡの７０％以上が、ヒトのｍｉＲＮＡを含む他の哺乳類のｍｉＲＮＡと同一であることである（Wei Z. et al. Sci Rep. 2016 Aug 9;6:31175）。
【0007】
この点について、Weiらは、ＦＢＳには、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、小核ＲＮＡなど、タンパク質をコードするＲＮＡと制御するＲＮＡの両方を含むさまざまな種類のＲＮＡが含まれており、超遠心分離処理を行っても、そのうちの最大７０％が血清中に残る可能性があると述べている。
【0008】
Weiらは、ＦＢＳ由来のＲＮＡは細胞培養由来のＲＮＡと一緒に単離され、その後のＲＮＡ分析に干渉や誤解を与える可能性があるため、このような研究にはＲＮＡフリー血清が望ましいと指摘している（Tosar JP. J Extracell Vesicles.2017 Jan 12;6(１）:127283２）
【0009】
細胞培養に使用する血清中に内因性のＥＶが存在することで起こりうる干渉や誤解を減らすために、血清からＥＶを除去するいくつかの方法が開発された。
【0010】
この意味で、特許US9,005,888には、動物細胞が産生するＥＶを分離する方法と、ＥＶの含有量が減少した血漿または血清を製造する方法が記載されており、もともと存在していたｍｉＲＮＡの一部が、その方法を適用した後に定量的ＰＣＲ（qＰＣＲ）で検出できなくなることが示されている。しかし、特許US9,005,888号に記載されている方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む沈殿液を使用するなど、いくつかの欠点があり、そのうちの残留物が処理された血清に残り、汚染物質とみなされる可能性がある。
【0011】
例えば、ＰＥＧがヘテロカリオンの形成、すなわち細胞融合を誘発して多核細胞を生成することが報告されており（Davidson RL, Gerald PS. Somatic Cell Genet. 1976 Mar;2(２）:165-76.)、そのためＦＢＳに残ったＰＥＧが細胞の生物学的機能を変化させ、分子生物学的実験の結果を変化させる可能性がある。
【0012】
さらに、血清中に残っているＰＥＧが、Trizolなどの従来の方法によるＲＮＡ抽出に影響を与えている可能性も否定できず、特許US9,005,888号に記載されているＲＮＡがほとんど或いは全く検出されないという影響は、ＰＥＧに起因する人為的構造によるものであり、ＲＮＡの除去によるものではないと考えられる。
【0013】
注目すべきは、Weiらが述べているように、血清中のＲＮＡのほとんどがＥＶ内ではなくＥＶ外に含まれていることで、ＰＥＧ処理した血清を使用した場合、細胞培養にＲＮＡの混入がないという確実性が大きく損なわれる。さらに、ＰＥＧ沈殿法は血清から高濃度のタンパク質を沈殿させることもできるが、ＥＶ内包物以外の外因性循環ＲＮＡと結合したタンパク質複合体を完全に除去できるかどうかは不明である（Tosar et al）。
【0014】
また、特許US9,005,888号に記載されている方法では、血清の無菌状態を約束する手順や操作が必要であり、無菌状態の細胞培養でＦＢＳを使用するためには、一度ＰＥＧで処理した血清を無菌状態に戻す追加の手順が必要になる可能性があることにも注意が必要である。これでは、ＥＶなしの血清を製造するための時間と費用が増えてしまう。もう一つの重要な点は、ＰＥＧ法では血清中に存在するＥＶを完全には除去できないということであり、記載されている方法の一つでは、1mlあたり104個以下の小胞濃度のＥＶ低減血清を定義している。
【0015】
Kornilovら(Kornilov R. et al. J Extracell Vesicles. 2018 Jan 21;7(１）:142267４）は、限外濾過によってＦＢＳからＥＶを除去する方法を述べている。ＥＶを除去する方法として、実験室規模では方法論的にシンプルな選択肢を提供しているものの、この方法論では、遠心分離や高価な材料（限外濾過材料や装置など）の使用が必要であり、この方法論の実用性や工業規模での応用性は低い。また、この方法では、ＥＶの量を減らすことはできても、ＥＶの外にあるＲＮＡを取り除くことができないため、この方法で処理した血清には、ＦＢＳのＲＮＡが大量に残ってしまう。
【0016】
上述のＦＢＳを処理して、ＥＶ含有量やＲＮＡ量を減らす方法に加えて、細胞培養用のＦＢＳ代替物が市販されている。このような血清代替品は、血清の天然成分の一部を含む合成製剤であるため、一部の細胞株は制御された培養条件下で最適な条件で増殖することができる（Barnes D, Sato G. Anal Biochem. 1980 Mar 1;102(２）:255-70）。しかし、合成血清代替品は、ＦＢＳに比べて非常に高価であることが多く、また、特定の種類の細胞を培養するように設計されているため、一般的には、幹細胞などの特定の細胞株や培養条件で培養する場合にのみ、ＦＢＳ代替品として有効であると考えられる（Ohnuma K. et al. J Neurosci Methods. 2006 Mar 15;151(２）:250-6１）
【0017】
細胞培養におけるエクソソームの生物学的効果を研究し、血清からのｍｉＲＮＡが培養物を汚染して実験の結論を妨げないようにする必要性から、すでにｍｉＲＮＡを低減したＦＢＳ製品が市販されているが（Paszkiet B. et al. Development of an improved process for the depletion of exosomes from fetal bovine serum.Thermo Fisher Scientific Inc.2016）、これらには他の種類のＲＮＡが多量に含まれており、その培養への影響は調べられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
理想的には、細胞培養内でのＲＮＡの汚染を避けるために、培地を補充するために使用される血清は、ＲＮＡを含まないか、または実質的に減少させ、ＥＶを含まないか、または実質的に減少させる必要があるが、例えばＰＥＧのような追加の化学化合物を含まないことも望ましい。ただし、この血清は、細胞培養に不可欠な他の血清成分を保持している必要がある。
【0019】
現在の技術状況から、ＲＮＡを含まない、あるいは最小限のＲＮＡ含有量で、血清自身のＲＮＡによる汚染や干渉のリスクなしに細胞培養研究が可能な、ＦＢＳを中心とした動物用血清が明確に求められている。同様に、細胞培養に使用される動物の血清からＲＮＡを除去する方法として、血清の無菌性を損なわず、製品のコストを急激に増加させることなく工業的に拡張可能な、シンプルで低コストの技術が明らかに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明は、ＲＮＡを含まない、または実質的に含まない動物由来の血清に関するものである。この血清は、細胞外小胞（ＥＶ）を含まない、または実質的に含まないが、細胞培養に不可欠な血清の他の成分は保持しているため、血清に内在するＥＶやＲＮＡによる汚染のリスクを伴わずに、細胞培養をベースとした研究を行う上で有用である。
【0021】
ウシ、ウマ、ヒト、マウス、ラット、ヤギの血清や、それぞれの胎児血清など、動物由来のさまざまな種類の血清が本発明の態様に含まれる。
【0022】
さらに本出願は、加熱、冷却、アルカリ化、中和の各ステップを順次適用することにより、動物血清、主にウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に存在するＲＮＡの量を除去または実質的に減少させるのに有用な方法に関するものである。この方法では、動物の血清中に存在する内因性のＥＶを分解し、その結果、血清中のフリーのＲＮＡを変性・分解することで、血清中に存在するＲＮＡを除去または大幅に減少させることができる。ＥＶの分解は、ＥＶ本来の機能を否定するものである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】様々な市販のＦＢＳ製品におけるＲＮＡクラス（種類）の割合と量（アバンダンス）をまとめた棒グラフ
【図2】ＦＢＳサンプルに適用した異なるプロセスの組み合わせでＲＮＡを除去した後に回収したＲＮＡの濃度を示すグラフ
【図3】ＦＢＳに含まれる粒子の量と大きさを表したヒストグラム
【図4】様々な市販のＦＢＳ製品のＲＮＡ濃度を、本発明の方法の適用前と適用後で示した棒グラフ
【図5】本発明に記載のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳを補体として用いた細胞培養の細胞増殖を示すグラフ
【図6】異なる補充条件で培養した細胞の形態
【図7】異なる補充条件で培養した場合の細胞生存率を比較した棒グラフ
【図8】ＲＮＡフリーのＦＢＳを添加した細胞株と、対照として未処理の血清を添加した細胞株の増殖率の比率
【図9】ＲＮＡフリーのＦＢＳを添加したラインと未処理の血清（対照）の細胞生存率の比率
【図10】未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の様々なｍｉＲＮＡの存在量を示すグラフ
【図11】未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の他のクラスのＲＮＡの存在量を示すグラフ
【図12】未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の様々なｍｉＲＮＡの存在量を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【0024】
図１は、様々な市販のＦＢＳ製品におけるＲＮＡクラス（種類）の割合と量（アバンダンス）をまとめた棒グラフである。それぞれのバーは、異なる市販のＦＢＳ製品のプレゼンテーションを示している。
１）通常のＦＢＳ Ａ、
２）通常のＦＢＳ Ｂ、
3）キャラクター化されたＦＢＳ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ）、
4）修飾されたＦＢＳ（ｇｒａｄｅｄ ＦＢＳ）、
5）認証されたＦＢＳ（ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＦＢＳ）、
6）トリプルフィルターされたＦＢＳ（ｔｒｉｐｌｅ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ＦＢＳ）、
7）エクソソームを減少させたＦＢＳ（ＦＢＳ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅｓ）。
市販のプレゼンテーションとは異なるクラスの含有量やＲＮＡ量（アバンダンス）が見られ、ｍｉＲＮＡを含まないものもあるが、すべてのクラスにＲＮＡが存在することがわかる。黒のバーはｍｉＲＮＡ、濃いグレーのバーはnon-annotated ＲＮＡ（家畜牛（Bos taurus）のゲノムに存在するが、特定の機能を持つＲＮＡタイプに関連づけることができなかった配列）、薄いグレーのバーはｔＲＮＡ、白のバーは家畜牛（Bos taurus）のゲノムに存在しないその他のＲＮＡで、その起源はウシ以外である可能性がある。
１）通常のＦＢＳ Ａ、
２）通常のＦＢＳ Ｂ、
3）キャラクター化されたＦＢＳ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ）、
4）修飾されたＦＢＳ（ｇｒａｄｅｄ ＦＢＳ）、
5）認証されたＦＢＳ（ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＦＢＳ）、
6）トリプルフィルターされたＦＢＳ（ｔｒｉｐｌｅ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ＦＢＳ）、
7）エクソソームを減少させたＦＢＳ（ＦＢＳ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅｓ）。
市販のプレゼンテーションとは異なるクラスの含有量やＲＮＡ量（アバンダンス）が見られ、ｍｉＲＮＡを含まないものもあるが、すべてのクラスにＲＮＡが存在することがわかる。黒のバーはｍｉＲＮＡ、濃いグレーのバーはnon-annotated ＲＮＡ（家畜牛（Bos taurus）のゲノムに存在するが、特定の機能を持つＲＮＡタイプに関連づけることができなかった配列）、薄いグレーのバーはｔＲＮＡ、白のバーは家畜牛（Bos taurus）のゲノムに存在しないその他のＲＮＡで、その起源はウシ以外である可能性がある。
【0025】
図２は、ＦＢＳサンプルに適用した異なるプロセスの組み合わせでＲＮＡを除去した後に回収したＲＮＡの濃度を示すグラフである。使用したプロセスとその順番を表１に示す。3つの異なる条件でＲＮＡを除去した（バー11、13、18）。ＩＮＤはＲＮＡ濃度が検出されなかったことを示す。加熱、冷却、アルカリ化、中和の順に不活性化する組み合わせが、ＦＢＳ中のＲＮＡを除去または大幅に減少させることができる組み合わせの一つである。ＲＮＡの量を減らす他の組み合わせでは、超遠心分離のステップが追加される。
【0026】
図３は、ＦＢＳに含まれる粒子の量と大きさを表したヒストグラムである。灰色のヒストグラムは、本発明の方法で処理されたＦＢＳのサンプル（表１に従った組み合わせ＃１１）に存在する粒子のサイズ（粒径）と量に対応し、黒い輪郭のヒストグラムは、何も処理していない対照（コントロール）サンプルに対応する。エクソソームを含む代表的なＥＶサイズ（直径５０～４００ｎｍ）の粒子は、未処理の血清（対照）に比べてサイズが小さくなり、加熱、冷却、アルカリ化、中和の後、大部分は直径が約３０ｎｍになった。
【0027】
図４は、様々な市販のＦＢＳ製品のＲＮＡ濃度を、本発明の方法の適用前と適用後で示した棒グラフである。１）通常のＦＢＳ Ａ、２）通常のＦＢＳ Ｂ、3）キャラクター化されたＦＢＳ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ）、4）修飾されたＦＢＳ（ｇｒａｄｅｄ ＦＢＳ）、5）認証されたＦＢＳ（ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＦＢＳ）、6）トリプルフィルターされたＦＢＳ（ｔｒｉｐｌｅ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ＦＢＳ）、7）エクソソームを減少させたＦＢＳ（ＦＢＳ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅｓ）。
市販品とその初期のＲＮＡ濃度に関わらず、本願記載のＲＮＡ除去方法を適用すると、ＲＮＡ濃度が検出不能（ＩＮＤ）になることが確認された。
市販品とその初期のＲＮＡ濃度に関わらず、本願記載のＲＮＡ除去方法を適用すると、ＲＮＡ濃度が検出不能（ＩＮＤ）になることが確認された。
【0028】
本発明に記載のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳを補体として用いた細胞培養の細胞増殖を示すグラフを図５に示す。ＨＥＫ２９３細胞を異なる補充条件で培養した。白丸は未処理（対照）のＦＢＳ、黒丸は本発明のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳ（表１）の組み合わせ＃１１で得られたもの）、灰色の三角は合成血清代替品を示す。ＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳで培養した細胞は、未処理のＦＢＳ（対照）で培養した細胞と同様の増殖を示し、合成代替品のそれよりも優れていることから、本発明の方法を適用して得られたＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳは、細胞増殖を効果的に促進するのに必要な特性を維持していることが示された。
【0029】
図６は、異なる補充条件で培養した細胞の形態を示している。未処理のＦＢＳ（対照）、本発明に記載のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳ（表１に記載の組み合わせ＃１１で得られたもの）、及び合成血清補充剤を用いた。本発明のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳは、対照に対して（との比較において）も、合成血清に対して（との比較において）も、細胞の形態に悪影響を及ぼさず、細胞の増殖に必要な特性を維持していることが確認された。
【0030】
図７は、異なる補充条件で培養した場合の細胞生存率を比較した棒グラフである。未処理のＦＢＳ（対照）は白棒、本発明のＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳは黒棒、および合成血清代替物は灰色棒を使用した。対照のＦＢＳとＲＮＡフリーのＦＢＳと合成代用物を補充した細胞の間で、６日目の累積生存率に有意な差がないことが確認され、本発明の方法を適用した後も、ＲＮＡフリーの血清がその補充性を維持していることが確認された。
【0031】
図８は、ＲＮＡフリーのＦＢＳを添加した細胞株と、対照として未処理の血清を添加した細胞株の増殖率の比率を示している。１）ＨＥＫ ２９３、２）ＨｅＬａ、３）ＣＨＯ、４）ＭＣＦ７、５）ＭＥＦ細胞に、未処理のＦＢＳ（対照）と、ＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡフリーのＦＢＳを補充してインキュベートし、両補充条件での増殖の比率を求めた。ＲＮＡフリーのＦＢＳで培養した細胞株はいずれも、未処理のＦＢＳを補充した場合と比較して、６日目の累積増殖量に違いが見られなかった。
【0032】
図９は、ＲＮＡフリーのＦＢＳを添加したラインと未処理の血清（対照）の細胞生存率の比率を示している。１）ＨＥＫ２９３, ２）ＨｅＬａ、３）ＣＨＯ、４）ＭＦＣ７、５）ＭＥＦ細胞に未処理のＦＢＳを補充したものと、ＲＮＡフリーまたはＲＮＡ実質フリーのＦＢＳを補充したものをインキュベートし、両補充条件での生存率の比率を求めた。ＲＮＡフリーのＦＢＳで培養した細胞株は、いずれも６日目の累積生存率に、それぞれの対照ＦＢＳと比較して差が見られなかった。
【0033】
図１０は、未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の様々なｍｉＲＮＡの存在量を示すグラフである。ｍｉＲＮＡは、
１）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１４３、
２）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１８１ａ、
３）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１９２、
４）Ｂｔａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐ、
５）Ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ
を定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で検出した。白棒は未処理のＦＢＳ、黒棒は本発明の方法で処理したＦＢＳを示す。すべてのケースで、本発明の方法はｍｉＲＮＡの存在量を検出限界（約３８Ｃｔ）以下のレベルまで減少させ、ＦＢＳからｍｉＲＮＡを除去する方法の有効性を示した。
１）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１４３、
２）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１８１ａ、
３）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１９２、
４）Ｂｔａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐ、
５）Ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ
を定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で検出した。白棒は未処理のＦＢＳ、黒棒は本発明の方法で処理したＦＢＳを示す。すべてのケースで、本発明の方法はｍｉＲＮＡの存在量を検出限界（約３８Ｃｔ）以下のレベルまで減少させ、ＦＢＳからｍｉＲＮＡを除去する方法の有効性を示した。
【0034】
図１１は、未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の他のクラスのＲＮＡの存在量を示すグラフである。ＲＮＡは、
１）Ｕ４７と２）非アノテーションＲＮＡ ＃４９６２７とを、ｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。白棒は無処理のＦＢＳ（対照）、黒棒は本発明の方法で処理した後のＦＢＳを示しており、本発明の方法が様々なクラスのＲＮＡの除去に有効であることが明らかになった。
１）Ｕ４７と２）非アノテーションＲＮＡ ＃４９６２７とを、ｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。白棒は無処理のＦＢＳ（対照）、黒棒は本発明の方法で処理した後のＦＢＳを示しており、本発明の方法が様々なクラスのＲＮＡの除去に有効であることが明らかになった。
【0035】
図１２は、未処理の血清（対照）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清中の様々なｍｉＲＮＡの存在量を示すグラフである。ｍｉＲＮＡは、
１）ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６、
２）ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、
３）ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ
をｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。白棒は無処理のＦＢＳ（対照）を、黒棒は本発明の方法で処理した後のＦＢＳを示す。見てわかるように、これらのｍｉＲＮＡは使用した血清サンプル中では存在量が少ないが、本発明の方法では検出不可能なレベルまで除去することができる。
１）ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６、
２）ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、
３）ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ
をｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。白棒は無処理のＦＢＳ（対照）を、黒棒は本発明の方法で処理した後のＦＢＳを示す。見てわかるように、これらのｍｉＲＮＡは使用した血清サンプル中では存在量が少ないが、本発明の方法では検出不可能なレベルまで除去することができる。
【0036】
細胞株や初代組織の培養は、生物医学研究のための主要なツールの一つである。一般的に、細胞培養は、細胞を生きたまま、あるいは一定の増殖状態に保つためのサプリメントを含む液体培地で細胞を培養することによって行われる。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、細胞の成長に重要なタンパク質、核酸、ホルモン、成長因子、脂質、ビタミンやミネラルなどの小分子が複雑に混ざり合っているため、培養液の補助的な役割を果たす。
【0037】
ＦＢＳにはさまざまなクラスのＲＮＡが混在しているが、その中でもｍｉＲＮＡは高度に保存されているため、進化的に離れた種の間でも配列やサイズが全く同じｍｉＲＮＡが存在する。ｍｉＲＮＡは、その高度な保存性と特異性から、遺伝子発現の重要な制御因子と考えられている（Bartel D. P. Metazoan MicroＲＮＡs. Cell (2018) 173:20-5１）。
【0038】
最近、細胞培養に血清を補助的に用いると、ＦＢＳに存在するＲＮＡが細胞内のｍｉＲＮＡの検出を妨害することが報告されている（Wei Z. et al. Sci Rep. 2016 Aug 9;6:31175）。というのも、細胞培養におけるＲＮＡ遺伝子発現の特徴を明らかにする研究の大半は、ＦＢＳを補助的に使用しており、培養細胞由来のｍｉＲＮＡとＦＢＳ由来のｍｉＲＮＡの混合の影響によって、得られる結果が変化する可能性があるからである。この状況をさらに悪化させているのが、かなりの数のｍｉＲＮＡにおいて、その由来となる種を区別することができないという事実である。サプリメントとして使用されている血清に含まれるｍｉＲＮＡやその他のＲＮＡが、遺伝子発現や生理的状態を変化させることによって培養細胞に生物学的機能を及ぼす可能性は否定できず、その結果、実施された実験の結果に影響を及ぼすことがある。
【0039】
ウシのｍｉＲＮＡが培養細胞に移行する原因の一つとして、ＦＢＳに含まれる細胞外小胞（ＥＶｓ）が考えられるが、ＥＶｓの内部にも外部にもｍｉＲＮＡや他の種類のＲＮＡが同等の割合で存在しているため、ウシのＲＮＡの汚染は、ＥＶｓ以外の媒体からも発生し、そのためＥＶｓを血清から除去しても、汚染ＲＮＡを完全に除去することはできない。
【0040】
最後に、ＦＢＳに含まれるＲＮＡは、ＥＶの内外を問わず非常に安定しているため、ＲＮＡ結合タンパク質によって保護されている筈である。ＦＢＳには、効果的に保護されていなければＲＮＡを分解する多数のＲＮＡ分解酵素（ＲＮＡａｓｅ）が自然に含まれているからである(Chen X, et al. Cell Res. 2008 Oct;18(10):997-1006)。
【0041】
ＦＢＳからＥＶを減少または除去する方法として、限外濾過、超遠心分離、化学剤を用いた沈殿などからなるいくつかの方法が現状では説明されているが、これらの方法はＥＶとＥＶに含まれる生物学的物質の除去に焦点を当てている。但し、哺乳類の血清に含まれるＲＮＡの最大６０％を占める可能性のある血清中のフリーフォームのＲＮＡを減少または除去することはできないため、これらの方法やＦＢＳ製剤はいずれもＲＮＡフリー、または実質的にフリーのものではない。代替案としては、合成サプリメントの使用が考えられるが、これはＦＢＳの使用に比べてはるかに高価であることが多く、すべての種類の細胞の成長に効果的ではない。
【0042】
したがって、サプリメントとしての特性や機能を維持しながら、分子生物学的実験の結果を汚染したり、変更したりする可能性なく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養を可能にするＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡを低減した哺乳類血清が望まれている。この意味で、サプリメントとしての機能を変えることなく、また、細胞培養やそれを用いた分子生物学的実験に支障をきたす可能性のある化学物質を残留させることなく、ＲＮＡを含まない、あるいは実質的にＲＮＡを減少させた血清を製造することができる方法があることも望ましい。
【0043】
本発明は、ＲＮＡを含まないまたは実質的にＲＮＡが減少した血清、および哺乳類の血清、特にＦＢＳに含まれるＲＮＡを効率的に除去する方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服するものである。この方法は、ＥＶに含まれているかどうかにかかわらず、哺乳類の血清中に存在するＲＮＡを効率的に除去することができ、その結果、ＲＮＡを含まない、または実質的に減少させた異なる哺乳類種由来の血清を製造することができる。
【0044】
もう一つの技術的な利点は、遠心分離や超遠心分離、フィルターの使用を必要としないシンプルな方法であるため、アプリケーションや工業的なスケールアップのコストが減少することである。さらに、この方法は、血清を異なる容器に移す必要なく実施できるため、使用時に要求される無菌状態を維持することが容易になる。本願明細書に記載された方法で製造された血清は、ＥＶおよびトータルＲＮＡが含まれていないか、または実質的に減少しており、先行技術に記載された他の血清よりも高いＲＮＡ除去率を達成している。
【0045】
本発明は、哺乳類の血清に加熱、冷却、アルカリ化、中和の順に処理を施すことで、血清中に自然に存在するＲＮＡが実質的に除去または減少するという予想外の事実に基づいている。これらのプロセスは一般的に使用されており、血清中に存在するさまざまな生体分子に対するそれぞれのプロセスの効果は知られているが、４つのプロセスをこの特定の実行順序で組み合わせ、ＲＮＡの除去においてこの有効性を発揮する方法は、これまで説明されていなかった。本発明に記載されているように、これらのプロセスを特定の順序で適用することで、哺乳類の血清中に存在するＲＮＡの除去効率を高めることができる。
【0046】
本発明は、加熱、冷却、アルカリ化、中和のプロセスをその特定の順序で適用することに基づいており、これは現在の技術の状態に反しているので、この分野の平均的な知識を持つ技術者が同様の結論に達することは期待できないだろう。これらのプロセスを別々に、あるいは異なる順序で血清に適用しても、同じ結果は得られないので、本方法は技術の状態から明らかではない。
【0047】
ＲＮＡフリーまたはＲＮＡが実質的に減少した血清は、あらゆる種類のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養（ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＭＦＣ７、ＭＥＦなど）や、研究対象となる細胞の代謝または生理学的状態を調査することを目的としたあらゆる分子生物学的実験の補助剤として使用することができる。同様に、ＲＮＡを含まない、またはＲＮＡが実質的に減少した血清は、遺伝子発現の解析に関連するすべての研究、より詳細には、様々なクラスのＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、mＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなどの発現の解析を補完するものとして有用である。同様に、ＲＮＡを含まない、またはＲＮＡが実質的に減少した血清は、ホルモン、組換えタンパク質、抗体、凝固因子、ワクチンなどの治療薬の製造に有用な細胞を培養するための補助剤として使用できる（Ashish Verma, Anchal Singh Academic Press, 4 Nov.2013）。
【0048】
本願明細書では、「ＲＮＡフリー血清」および「ＲＮＡが実質的に減少した血清」という用語は、ＲＮＡ除去プロセスを経た動物、好ましくは哺乳類由来の血清を指し、その内因性ＲＮＡ含有量は、水性サンプル中の核酸濃度を測定するのに有用な従来の高感度な方法、例えば、分光光度法および分光蛍光光度法、あるいは特定のＲＮＡ配列の存在、ひいてはその相対的な量を検出する方法による、特定ＲＮＡ配列の検出によっては、検出されないレベルである。そして、ＲＮＡ配列がほとんど検出されない、または検出されないということは、典型的には、「存在しない」または「検出されない」配列と解釈される。増幅サイクル（Ｃｔ）が目的の配列の存在量の指標となるｑＲＴ－ＰＣＲの場合に、Ｃｔが３８サイクルより大きいアバンダンスシグナルは、目的の配列が存在しない、または検出されないことを示していると考慮されるように、次世代シーケンサー（ＲＮＡ－ｓｅｑ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ）などの配列特異的な検出技術では、従来、リード数が目的の配列の豊富さを示していると考えられており、リード数が0の配列は、ＲＮＡが存在しないか、技術の検出限界以下であることを示している。
【0049】
本発明の開発にあたっては、まず、血清中に存在するさまざまな種類のＲＮＡの組成と相対的な存在比を分析した（図１）。このため、異なる市販のＦＢＳ製品（１）通常のＦＢＳ Ａ、２）通常のＦＢＳ Ｂ、3）特徴のあるＦＢＳ、4）適格なＦＢＳ、5）認証されたＦＢＳ、6）トリプルフィルターされたＦＢＳ、7）エクソソームを減少させたＦＢＳ）のサンプルをＲＮＡseq法（Illumina社）で分析した。バイオインフォマティクス解析の結果、ＦＢＳには異なるクラスのＲＮＡが異なる量で含まれていることがわかる。最も豊富なＲＮＡクラスの中には、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、unannotated ＲＮＡ（Bos taurusのゲノムに配列されているが、特定のＲＮＡタイプに関連付けることができなかったもの）がある。ここで注意したいのは、市販品によって異なるＲＮＡの種類の割合が異なり、中には他の製品に比べてｍｉＲＮＡの割合が低いものもあるが、すべての製品に何らかのＲＮＡが含まれているということである。
【0050】
血清中に存在するＲＮＡの除去プロセスに最も適した条件を決定するために、加熱、冷却、アルカリ化、酵素（リボヌクレアーゼ）の添加、超遠心分離など、さまざまなプロセスとその組み合わせをテストした。異なるプロセスの組み合わせでテストした結果を表１に示す。各プロセスの適用後、ＲＮＡをTRIzol試薬（Thermo社）で抽出し、抽出したＲＮＡをQubit型分光蛍光光度計（Thermo社）で定量した。
【0051】
（表１）
【0052】
図２は、ＦＢＳサンプルにおける異なるプロセスとその組み合わせによるＲＮＡ除去効率を示している。異なるプロセスの特定の3つの組み合わせのみが、スペクトロフルオロメトリーによる検出限界250ｐｇ／μＬ以下の検出不可能なレベル（ＩＮＤ）までＲＮＡを除去する。ある組み合わせ（図２、棒グラフ１１）では、加熱と冷却の後、アルカリ化と中和を行う。もう一つの効果的な組み合わせ（図２、バー＃１３）は、加熱と冷却の後に超遠心分離を行う方法である。3つ目の効果的な組み合わせ（図２、バー＃１８）は、超遠心分離、加熱・冷却、アルカリ化、中和というステップを順に組み合わせたものである。
【0053】
他のプロセスや組み合わせは、血清からＲＮＡを除去するのにある程度の有効性を示すが、いずれもＲＮＡを完全に除去したり、検出限界以下にするのに有用ではない。血清からＲＮＡを除去するには、加熱、冷却、アルカリ化、中和の４つのプロセスを組み合わせて適用するだけではなく、これらのプロセスを適用する順序が特に重要であることに留意する必要がある。なぜなら、3つのプロセスを組み合わせても、異なる順序で適用しても（図２、棒グラフ＃１２）、血清からＲＮＡを除去する効果は同じではないからである。結論として、これらのプロセスを別々に、あるいは異なる順序で血清に適用しても、それに含まれるＲＮＡを除去することはできない。
【0054】
血清中に存在するＲＮＡの一部はＥＶに含まれているため、ＦＢＳ中に存在するＥＶに対する本発明の方法の効果を検証するために、NanoSight装置（Malvern社）を用いたナノ粒子追跡分析（NTA）によるナノ粒子定量を行った（図３）。
【0055】
ＦＢＳに自然に含まれている粒子の大きさは、直径５０～４００ｎｍで、１００ｎｍと１８０ｎｍ付近に粒子濃度の２つのピークがある（図３、Control.ブラックコンターヒストグラム）。本願明細書に記載の方法を適用した後、ＦＢＳに存在する粒子のサイズに著しい減少が見られ、直径３０ｎｍに近い粒子濃度の最大ピークを有する（図３、＃１１ 灰色のヒストグラム）。
【0056】
これらの結果から、ＲＮＡ除去法の適用により、エクソソームを含む血清中のＥＶが分解されていることがわかる。３０ｎｍ付近に観測されたピークは、対照サンプルの2つのメインピークの粒子量の合計と相関する存在量（１．５×１０８個）であることから、ＥＶの自然な状態が分解され、血清中のＥＶ含有量がなくなるか、大幅に減少していることがわかる。ＥＶを分解すると、動物の血清に含まれる全ＲＮＡの除去がより効率的になるが、これはおそらく、ＥＶ内に存在するＲＮＡをさらなる分解のために放出するためだと思われる。
【0057】
この結果は、加熱と冷却によってＥＶが変性し、含まれるＲＮＡが放出された後、強塩基で処理することでＲＮＡがアルカリ加水分解され、さらに強酸を加えることでＲＮＡの分解が促進され、その結果、血清からのＲＮＡ除去効率が向上したことによるものと考えられる。この処理後に血清中に残ったＲＮＡは、ＲＮＡ分子が分解されてできた機能しない断片であるため、培養細胞に影響を与えないと考えられる。
【0058】
血清からＲＮＡを除去する方法の有効性を裏付けるために、7つの異なる市販のＦＢＳ製品から、本願明細書に記載されている方法による処理の前後でＲＮＡを定量した。ＲＮＡはTRIzol試薬（Thermo社）で抽出し、抽出したＲＮＡはQubit型分光蛍光光度計（Thermo社）で定量した。
【0059】
本願に記載されているＲＮＡ除去方法は、テストされたすべての市販のＦＢＳ製品に有効である：１）通常のＦＢＳ Ａ、２）通常のＦＢＳ Ｂ、3）特徴のあるＦＢＳ、4）適格なＦＢＳ、5）認証されたＦＢＳ、6）トリプルフィルターされたＦＢＳ、7）エクソソームを減少させたＦＢＳ。
図４は、先に決定したように異なるＲＮＡ含有クラスを有するにもかかわらず（図１）、本方法は異なる市販品から検出限界以下のレベルまでＲＮＡを除去できることを示しており、本方法は血清中に存在するＲＮＡの濃度や種類にかかわらず有効であり、したがってあらゆる種類の動物血清に適用可能であることを示している。
図４は、先に決定したように異なるＲＮＡ含有クラスを有するにもかかわらず（図１）、本方法は異なる市販品から検出限界以下のレベルまでＲＮＡを除去できることを示しており、本方法は血清中に存在するＲＮＡの濃度や種類にかかわらず有効であり、したがってあらゆる種類の動物血清に適用可能であることを示している。
【0060】
次に、本願発明に記載された遊離または実質的に減少したＲＮＡ ＦＢＳが、ＲＮＡ除去方法を適用した後に、細胞培養を補完する能力の点で変化するかどうかを評価した。この目的のために、ＲＮＡを含まない血清を添加したヒト細胞（ＨＥＫ２９３細胞）の成長曲線を行い、６日間の増殖、形態、生存率を、未処理の血清を添加した培地で培養した細胞や、合成血清代替品（いくつかの種類の細胞株が培養で成長するために必要な成分を含み、その合成の性質上、ＲＮＡやＥＶを含まない合成製剤）で培養した細胞から得られたものと比較した。
【0061】
図５は、3つの補充条件での細胞増殖の比較を示している。ＨＥＫ２９３細胞を培養液中で６０％コンフルエントになるまで通常の条件で培養した。その後、培養液をいずれかの変種（対照ＦＢＳ、ＲＮＡフリーＦＢＳ、合成血清補充剤）を添加した培地に変更し、細胞密度を定量化した（０～６日目）。その結果、ＲＮＡフリー血清を添加した培養液（黒丸）と未処理のＦＢＳ（対照、白丸）では、細胞の増殖に差がないことがわかった。ＲＮＡフリー血清を用いて得られた増殖は、合成血清代替物を添加した培地で培養した細胞よりも優れている（灰色の三角形）。
【0062】
図６は、3つの補充条件で培養した細胞の形態を示したものである。ＲＮＡフリーのＦＢＳは、対照や合成血清と比較して、細胞の形態に影響を与えないことが確認されており、細胞の生理機能に二次的な影響を与えることなく、細胞の増殖を促進するために必要な特性を維持していることが示されている。
【0063】
細胞の生存率は、膜の完全性を評価するトリパンブルー排除アッセイを用いてＨＥＫ２９３細胞を定量化することにより決定した。図７は、3つの補充条件（対照ＦＢＳ、白棒、ＲＮＡフリーＦＢＳ、黒棒、；合成サロゲート、グレー棒）で培養した細胞の６日目の累積細胞生存率を示している。その結果、６日目の累積細胞生存率は、使用したサプリメントの違いによって変化していないことから、本発明に記載のＲＮＡフリーＦＢＳは細胞生存率に悪影響を及ぼさず、安全に使用できることが分かった。
【0064】
これらの生存率と増殖のアッセイは、他の細胞株でも繰り返し行われた（それぞれ図８と図９）。図８は、ＲＮＡフリーのＦＢＳを添加した培地で培養した細胞株と、未処理の血清を添加した培地で培養した細胞株（対照）の増殖率の比率を示したものである。１） ＨＥＫ２９３, ２） ＨｅＬａ, ３） ＣＨＯ, ４） ＭＦＣ７, ５） ＭＥＦ細胞を、未処理のＦＢＳと遊離または実質的に遊離のＦＢＳ ＲＮＡを添加した培地で培養し、両添加条件での増殖の比率を求めた。ＨＥＫ２９３細胞と同様に、試験したすべての細胞株において、両補給条件の間の増殖比は1に近く、ＲＮＡフリーＦＢＳと対照ＦＢＳの間に補給能力の差がないことを示している。
【0065】
図９は、2つの培養条件における同一細胞株の６日目の累積生存率を示しており、両補充条件の生存率比は1に近いことがわかる。 この結果から、本発明の方法で処理した血清を使用した場合、対照血清と比較して細胞生存率に大きな差がないことがわかる。
【0066】
この方法が血清からＲＮＡを除去するのに有効であることを確認するために、この方法の適用前と適用後にいくつかのｍｉＲＮＡの測定を行った。この目的のために、先に述べたように、ｍｉＲＮＡが豊富に含まれている市販のＦＢＳ製品からＲＮＡを抽出し（図１）、その後、大量のシーケンス結果のバイオインフォマティクス解析に従って、血清中の最も代表的なｍｉＲＮＡの相対的な存在比をｑＲＴ－ＰＣＲで同定した。
【0067】
各ｍｉＲＮＡの判定に使用したプローブを表2に示す。図１０に見られるように、評価したすべてのｍｉＲＮＡが １）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１４３、２）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１８１ａ、３）Ｂｔａ－ｍｉＲ－１９２。4）Ｂｔａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐおよび5）Ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐは、対照血清（白棒）では検出されたが、本発明の方法で処理した血清（黒棒）では３８Ｃｔ（点線）以下のｍｉＲＮＡは検出されなかったことから、本発明の方法を適用することで、ＦＢＳの最も豊富なｍｉＲＮＡが排除されるか、検出限界以下に減少したことがわかる。
【0068】
市販のＦＢＳ製品の中には、ｍｉＲＮＡの含有量は少ないが、他のＲＮＡを大量に含むものがある（図１、棒グラフ4および7）。これらの市販製品の1つに含まれる様々なＲＮＡクラスを計算機で解析したところ、Ｕ４７に分類されるＲＮＡと、「unannotated」に分類されるＲＮＡ（ここでは＃４９６２７とする）の2つのＲＮＡ配列が豊富に含まれていることがわかった。
【0069】
他のＲＮＡタイプが排除されていることを裏付けるために、特定のプローブを用いたｑＲＴ－ＰＣＲを行い、これら2つのＲＮＡの存在量を評価した。Ｕ４７の測定に使用したプローブを表２に示す。
【0070】
（表２）
注釈のないＲＮＡ配列＃４９６２７については、表３に記載のプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、既報の手法でSYBR-green蛍光を用いた。
【0071】
（表３）
【0072】
図１１は、未処理の市販品（白棒）と、本発明の方法で処理した後の同じ血清（黒棒）における１）Ｕ４７と２）＃４９６２７の存在量を示したものである。どちらのＲＮＡも未処理の血清では20Ｃｔ以下のレベルであり、本発明の方法を適用することで、検出限界である３８Ｃｔ以下にレベルを下げて両タイプのＲＮＡを排除することができる。
【0073】
ｍｉＲＮＡを含まないように見える市販製品の重要な点は、Ｂｔａ－ｍｉＲ－１４３、Ｂｔａ－ｍｉＲ－１８１ａ、Ｂｔａ－ｍｉＲ－１９２、Ｂｔａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐ、Ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐなど、検出不可能なレベルのｍｉＲＮＡが含まれているにもかかわらず、検出可能な量のｍｉＲＮＡが含まれていることである。図１２は、これらの市販品の1つにおける１）Hsa-miR-486、２）Hsa-miR-423-5p、および3）Hsa-miR-10bの測定のためのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、処理前（白棒）および本発明の方法を適用した後（黒棒）に示している。未処理のＦＢＳでは、これらのｍｉＲＮＡは３４Ｃｔ前後で検出され、本発明の方法を適用することで、これらのｍｉＲＮＡは検出限界である３８Ｃｔ以下に減少することが確認された。
【0074】
本願明細書に記載された記述によれば、本明細書に記載された発明は、ＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡが低減された哺乳類の血清、およびそのようなＲＮＡフリーまたは実質的にＲＮＡが低減された血清を得る方法に関するものである。本方法で得られた血清は、細胞培養を補完する能力を維持しており、細胞培養に悪影響を及ぼす可能性のある化学残留物を含んでいない。
【0075】
本発明の方法を実施するためには、血清サンプルの制御された加熱に有用な先行技術に記載されている任意の方法論を採用することができ、好ましくは無菌の容器またはコンテナ、あるいは工業用コンテナで、限定されるものではないが、温度制御された水への入浴および浸漬、温度制御されたキャビネット（オーブン）でのインキュベーション、または他の制御された加熱装置の使用が含まれる。
【0076】
血清の加熱ステップには、５２℃～６３℃、好ましくは５５℃～３７℃の温度を用いることができる。加熱時間は２５分から５０分、好ましくは３５分である。
【0077】
冷却ステップは、加熱後、室温まで冷却することで温度を操作せずに徐々に行ってもよいし、冷却手段を用いて、例えば室温以下の水や液体に浸すことで、あるいはその他の制御された冷却装置を用いることで、ステップを加速してもよい。最終冷却温度は８℃から２５℃の間、好ましくは１６℃である。
【0078】
水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ(ＯＨ)２）、水酸化カルシウム（Ca(OH)２）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）など、水酸化イオン（OH－）を放出するアルカリ性または塩基性の各種化合物または塩を、溶液または無水状態で使用することができるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、本手法で必要な加熱・冷却ステップの最適な温度と時間を日常的に標準化することができる。
【0079】
アルカリ濃度は１０～１２Ｎ、好ましくは１２Ｎの間で変化してもよい。当業者であれば、本方法で必要とされるアルカリ化プロセスの最適濃度を日常的に標準化することができる。
【0080】
血清は、ｐＨ１０から１２の間、好ましくはｐＨ１２にアルカリ化されるべきである。
【0081】
血清のアルカリへの曝露時間は、存在するＲＮＡの濃度や容量に応じて変化するが、少なくとも3分間維持する必要があるが、３分から２０分、好ましくは５分から１０分の間で変化しても構わない。
【0082】
中和処理には、酸性の化学的性質を持つさまざまな化合物または塩を使用することができ、これには、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、塩酸（ＨＣｌ）など、同様の性質を持つ化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【0083】
酸の濃度は、０．１～２Ｎの間で変化してもよく、好ましくは１Ｎの濃度を使用してもよい。当業者であれば、本方法で必要な中和処理のための最適濃度を日常的に標準化することができる。
【0084】
血清は、生理的ｐＨである７．２～７．５、好ましくはｐＨ７．４になるまで酸性化する必要がある。
【0085】
本発明の好ましい実施形態では、血清を５５℃～５７℃の温度に３０～４５分間加熱し、２０℃の室温まで徐々に冷却し、無水ＮａＯＨ（粉末または顆粒）を用いて１０分間かけてｐＨ１２までアルカリ化し、その後、１Ｎ濃度のＨＣｌを用いて生理的ｐＨ７．４に中和されるまでアルカリ化した血清のｐＨを低下させる。
【0086】
ＤＮＡ濃度が非常に高い場合、例えば４５または５０ｎｇ／ｍＬ以上の場合には、本発明の方法を連続して繰り返し適用し、ＲＮＡの除去を確実に行うことができる。
【0087】
本発明の一実施形態では、本願明細書に記載の方法は、８０，０００ ｘｇから１００，０００ ｘｇの間の追加の超遠心分離ステップを統合してもよい。超遠心分離を行い、その過程で血清の無菌性が損なわれる場合には、０．２ミクロンの孔を持つ膜でのろ過など、当業界で知られている技術を用いて、追加の滅菌処理を行う必要がある。
【0088】
本発明を実施するためには、それぞれの胎児血清に加えて、ウシ、ウマ、ヒト、マウス、ラット、ヤギの血清を含むがこれらに限定されない、あらゆるタイプの動物血清を使用することができる。
【0089】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は、いかなる意味でも特許請求の範囲に課される制限とはみなされない。それどころか、これらの実施例は、本発明の実施をよりよく理解するために提示されており、本発明の実施形態の一部を表しているに過ぎないことが理解される。
【0090】
実施例1
ＦＢＳ ＲＮＡの除去。
通常の市販のＦＢＳ製品から出発して、メーカーの推奨事項に従ってTrizol製品で抽出することにより、total ＲＮＡの濃度を最初に決定し、３５ｎｇ／ｍＬの濃度が得られた。
このＦＢＳを５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却した。次に、１２Ｎの無水ＮａＯＨを用いて血清をｐＨ１２までアルカリ化し、１５分間保持した後、１ＮのＨＣｌを用いてアルカリ化した血清のｐＨを生理的ｐＨ７．４まで下げた。
この方法を適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
ＦＢＳ ＲＮＡの除去。
通常の市販のＦＢＳ製品から出発して、メーカーの推奨事項に従ってTrizol製品で抽出することにより、total ＲＮＡの濃度を最初に決定し、３５ｎｇ／ｍＬの濃度が得られた。
このＦＢＳを５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却した。次に、１２Ｎの無水ＮａＯＨを用いて血清をｐＨ１２までアルカリ化し、１５分間保持した後、１ＮのＨＣｌを用いてアルカリ化した血清のｐＨを生理的ｐＨ７．４まで下げた。
この方法を適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
【0091】
実施例2
発明の方法と超遠心分離を組み合わせたＦＢＳからのＲＮＡ除去。
ＲＮＡ濃度が４０ｎｇ／ｍＬであることが判明した通常の市販ＦＢＳ製品を出発点として、血清を１００，０００×g、４℃で７時間の超遠心分離を行った。超遠心分離の終了時には、得られたボタンを邪魔することなく、サンプルの上澄みを新しい無菌容器に移した。無菌状態を維持するために、血清の上清を孔径０．２ミクロンの無菌フィルターに通した。
続いて、ＦＢＳ上清を５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却し、無水ＮａＯＨを用いて血清をｐＨ１２までアルカリ化して１５分間保持した後、アルカリ化した血清のｐＨを１Ｎ ＨＣｌを用いて生理的ｐＨ７．４まで低下させた。
この方法を適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
発明の方法と超遠心分離を組み合わせたＦＢＳからのＲＮＡ除去。
ＲＮＡ濃度が４０ｎｇ／ｍＬであることが判明した通常の市販ＦＢＳ製品を出発点として、血清を１００，０００×g、４℃で７時間の超遠心分離を行った。超遠心分離の終了時には、得られたボタンを邪魔することなく、サンプルの上澄みを新しい無菌容器に移した。無菌状態を維持するために、血清の上清を孔径０．２ミクロンの無菌フィルターに通した。
続いて、ＦＢＳ上清を５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却し、無水ＮａＯＨを用いて血清をｐＨ１２までアルカリ化して１５分間保持した後、アルカリ化した血清のｐＨを１Ｎ ＨＣｌを用いて生理的ｐＨ７．４まで低下させた。
この方法を適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
【0092】
実施例3
本発明の方法を用いたＦＢＳからのＲＮＡ除去を異なる反復で行った結果
市販されている血清の種類によって、ＲＮＡの含有量が異なることが予想される。ＲＮＡ含有量の高い血清サンプルの場合、本発明の方法を繰り返して、そのＲＮＡ除去効率の加算結果を与えることができる。
ＲＮＡ含量が４５ｎｇ／ｍＬ以上と定量された血清を用いて、５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却し、無水ＮａＯＨを用いてｐＨ１２までアルカリ化し、１５分間保持した後、１Ｎ ＨＣｌを用いてアルカリ化した血清のｐＨを生理的ｐＨである７．４まで下げた。
その後、同じ条件で加熱、冷却、アルカリ化、中和のプロセスを繰り返した。
この方法を２回連続して適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
本発明の方法を用いたＦＢＳからのＲＮＡ除去を異なる反復で行った結果
市販されている血清の種類によって、ＲＮＡの含有量が異なることが予想される。ＲＮＡ含有量の高い血清サンプルの場合、本発明の方法を繰り返して、そのＲＮＡ除去効率の加算結果を与えることができる。
ＲＮＡ含量が４５ｎｇ／ｍＬ以上と定量された血清を用いて、５６℃で３５分間加熱した後、２０℃になるまでゆっくりと室温まで冷却し、無水ＮａＯＨを用いてｐＨ１２までアルカリ化し、１５分間保持した後、１Ｎ ＨＣｌを用いてアルカリ化した血清のｐＨを生理的ｐＨである７．４まで下げた。
その後、同じ条件で加熱、冷却、アルカリ化、中和のプロセスを繰り返した。
この方法を２回連続して適用した後、上述のTrizolを用いた抽出法でtotal ＲＮＡの濃度を測定したところ、スペクトロフルオロメトリーで検出限界以下の濃度が得られた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】