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特表2022-551293血管透過性亢進を特徴とする疾患における肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または馴化培地の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-08
(54)【発明の名称】血管透過性亢進を特徴とする疾患における肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または馴化培地の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20221201BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20221201BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20221201BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20221201BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20221201BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20221201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20221201BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20221201BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20221201BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20221201BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20221201BHJP
A61K 38/55 20060101ALI20221201BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20221201BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 F
C12N5/071
C12N5/074
A61P9/00
A61P11/00
A61P9/10
A61P3/10
A61P27/02
A61P35/00
A61P31/04
A61K35/407
A61K35/545
A61K38/20
A61K38/22
A61K38/55
A61K31/661
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520880
(86)(22)【出願日】2020-10-08
(85)【翻訳文提出日】2022-06-02
(86)【国際出願番号】 EP2020078226
(87)【国際公開番号】W WO2021069553
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】19202318.2
(32)【優先日】2019-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522136120
【氏名又は名称】セライオン エスアー
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＡＩＯＮ ＳＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】エティエンヌ ソーカル
(72)【発明者】
【氏名】エリサ コリトーレ
(72)【発明者】
【氏名】セバスチャン ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】サンドリーヌ オーマン
(72)【発明者】
【氏名】マリン アンジェ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065BB19
4B065BC01
4B065BC11
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA44
4C084CA18
4C084DA12
4C084DA18
4C084DB54
4C084DB55
4C084DB57
4C084DB61
4C084DB62
4C084DC32
4C084NA14
4C084ZA33
4C084ZA36
4C084ZA59
4C084ZB26
4C084ZB35
4C084ZC35
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA42
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZA36
4C086ZA59
4C086ZB26
4C086ZB35
4C086ZC35
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB52
4C087BB61
4C087BB63
4C087BB64
4C087CA10
4C087NA14
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZA59
4C087ZB26
4C087ZB35
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または肝臓前駆細胞または幹細胞を前記培地中で培養することにより得ることができ、血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および／または状態の治療に使用するための、または対象中の炎症および／または感染後の前記対象中の細胞および組織の血管の完全性を回復するために使用するための馴化培地に関する。より詳細には、本発明は、敗血症および敗血症誘発性疾患、例えば心筋浮腫、急性腎損傷および肺敗血症に治療的に使用するための、肝臓前駆細胞または幹細胞または培地中で肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象（の細胞）における血管透過性の障害を調節するまたは感化するために使用するための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項2】
血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および／または状態の治療に使用するための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項3】
前記細胞が、CD９０、CD４４、CD７３、CD１３、CD１４０b、CD２９、ビメンチンおよびα－平滑筋アクチン（ASMA）から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対して陽性であり、必要に応じてHGFおよび／またはPGE２を分泌する、請求項１または２に記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項4】
前記細胞が、α－平滑筋アクチン（ASMA）、アルブミン（ALB）、CD１４０bおよびMMP１の群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対して陽性であり、スシドメイン含有プロテイン２（SUSD２）およびサイトケラチン－１９（CK－１９）の群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対して陰性である、請求項１～３のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項5】
前記細胞は、‐α平滑筋アクチン（ASMA）、CD１４０bおよび任意にアルブミン（ALB）について陽性であり、
‐サイトケラチン－１９（CK－１９）について陰性であり、任意に、スシドメイン含有プロテイン２（SUSD２）について陰性である、
ことが測定される、請求項１～４のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項6】
前記細胞は、CD９０、CD７３、ビメンチンおよびASMAについて陽性でことが測定される、請求項１～５のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項7】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１～６のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項8】
前記馴化培地は、肝細胞増殖因子（HGF）、インターロイキン６（IL－６）、インターロイキン８（IL－８）および血管内皮増殖因子（VEGF）の群から選択される１つまたは複数の成分を含む、請求項１～７のいずれかに記載の使用のための、培地中で肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項9】
前記馴化培地は、線維芽細胞増殖因子タンパク質、アンジオポイエチン－１、スフィンゴシン－１－ホスフェート、TGF－β、PDGF、HGF、TIMP１およびTIMP２の群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１～８のいずれかに記載の使用のための、培地中で肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項10】
前記馴化培地は、スフィンゴシン－１－ホスフェート、TGF－β１、HGFおよびTIMP２の群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１～９のいずれかに記載の使用のための、培地中で肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項11】
前記馴化培地は、少なくともスフィンゴシン－１－ホスフェートを、好ましくは３０ng／百万総細胞の最小濃度で含む、請求項１～１０のいずれかに記載の使用のための、培地中で肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項12】
血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および／または状態が、対象における心臓、肺および虚血性疾患、糖尿病および眼疾患、癌（固形腫瘍）、クラークソン病および敗血症の群から選択される、請求項１～１１のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項13】
血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および／または状態が、対象における感染によって引き起こされる、請求項１～１２のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項14】
血管透過性の障害が対象における敗血症または敗血症誘発性疾患に関連する、または、疾患および／もしくは状態が対象における敗血症または敗血症誘発性疾患である、請求項１～１３のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項15】
血管透過性の障害が対象における敗血症誘発性心筋浮腫に関連する、または、疾患および／もしくは状態が対象における敗血症誘発性心筋浮腫である、請求項１～１４のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項16】
血管透過性の障害が対象における敗血症誘発性急性腎障害に関連する、または、疾患および／もしくは状態が対象における敗血症誘発性急性腎障害である、請求項１～１５のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項17】
血管透過性の障害が対象における肺敗血症に関連する、または、疾患および／もしくは状態が対象における肺敗血症である、請求項１～１６のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項18】
血管透過性の障害が対象におけるクラークソン病に関連する、または、疾患および／もしくは状態が対象におけるクラークソン病である、請求項１～１７のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項19】
前記細胞、溶解物および／または培地が、無菌液体組成物に投与される、請求項１～１８のいずれかに記載の使用のための、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または培地中で前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地。
【請求項20】
少なくとも３０ng／百万総細胞のスフィンゴシン－１－ホスフェートを含む、ヒト肝臓前駆細胞の培養から得られた馴化培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療目的および予防目的で、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地（調整培地）の技術分野に関する。特に、前記治療目的および予防目的は、例えば炎症および／または感染後の血管の完全性の障害に起因する血管透過性の増大によって引き起こされる疾患および／または状態に関する。本発明はまた、上記のような細胞または誘導体によるAMPK経路の活性化に関する。
【背景技術】
【0002】
血管系は形態や機能の異なる血管から構成され、すべての組織に血液を分配し、生理学的組織の恒常性を維持する。血管循環系全体は、血液と組織の間の動的障壁を形成する内皮細胞によって裏打ちされている。休止状態では、血管緊張を調節するだけでなく、内皮細胞は、液体ろ過、止血、好中球動員、ホルモン輸送など、非常に重要な他の機能を示す。さらに、内皮の良好な構造は、より大きな分子および細胞の血液から組織への溢出を制限する。
【0003】
内皮バリア機能の欠陥は、癌および慢性炎症状態を含む多くの疾患の共通の特徴である。実際、血管関門の崩壊は、より大きな分子および細胞の増加した漏れと密接に関連しており、その結果、浮腫、炎症が生じ、漏れが慢性化するとしばしば疾患の進行に至る。血管漏出の根底にある機序は臓器特異的であり、特殊な血管系に依存する可能性がある。２つの主要モデルが現在提案されている：第１のモデルは小胞または液胞からのトランス内皮チャネルの形成に依存し、小胞液胞小器官（VVO）、第２のモデルは内皮間結合（IEJ）に関与し、密着結合、ギャップ結合、接着結合、およびシンデスモスを含む４つの異なるタイプがこれまでに報告されており、これらは一過性に溶解し、血管外遊出を可能にする。
【0004】
血管漏出により、血流の乏しい新しい、不安定で透過性の高い血管が過剰に形成されることがあり、これにより低酸素症および疾患の伝搬がさらに促進される。慢性血管透過性はまた、癌の転移性拡大を促進する可能性がある。外傷、虚血－再潅流傷害、敗血症、成体呼吸窮迫症候群、糖尿病、血栓症および癌に関連する血管炎症においても重大な問題である。この過程の根底にある重要な機序は、血漿液および蛋白質の傍細胞漏れを介して増加する。したがって、過剰な血管透過性を特異的に抑制することは、上記のような一連の疾患における治療的利益となり得る。
【0005】
敗血症は、世界中、特に開発途上国における主要な死因の１つであり、医療システムに対するコストは膨大である。敗血症は集中治療室における最も一般的な死因であり、敗血症関連急性腎障害などの敗血症誘発性障害は死亡の独立かつ付加的な危険因子である。敗血症および敗血症性ショックは、複雑な生物学および病態生理学の不均一なスペクトルを示す。敗血症の基本的機序の理解において実質的な進歩があったが、これらの進歩の臨床的に有効な治療法への翻訳は期待はずれであった。抗生物質以外の新しい治療法、輸液蘇生法、および基本的な支持療法は、この分野の臨床医および研究者にとって注目すべき話題である。
【0006】
幹細胞は、自己再生が可能であり、同時に、実質的に全てのタイプのヒト細胞に分化する能力を付与された細胞と定義され得る。幹細胞には基本的に２つの主要なグループがある－第１のグループは胚性幹細胞（ESC）から成り、それは出現する胚盤胞の内部細胞塊に位置する；第２のグループは全ての組織に存在するが、限定された分化能を示す体性幹細胞（SSC）から成る。体性幹細胞には、骨髄に位置し、造血前駆細胞を代表する造血幹細胞と、その中でいわゆる間葉系幹細胞（MSC）を代表する非造血幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞は、その独特の特性のため、現在注目されている。同種または自家MSCは、炎症、虚血、または生体組織への物理的損傷によって引き起こされる症状を改善する。
【0007】
MSCは、細胞外環境、特にサイトカインを含む環境に依存して異なる挙動をすることができる多面的細胞である。それらの免疫調節性、免疫抑制性および抗線維化特性の他に、MSCは組織の内因性再生能を刺激することが示された。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、可溶性細胞外マトリックス糖タンパク質、サイトカインおよび成長因子を含む多くの栄養分子を分泌することにより、自然に造血を支持することが知られている。研究は、MSCが低免疫原性であり、免疫応答の発生を阻害することができ、多様な免疫細胞集団を炎症誘発性から抗炎症性／規制表現型に歪めることを示している。この文脈において、MSCを用いた細胞ベースの治療の免疫‐リプログラミング特性は、敗血症および関連臓器機能不全における新たな治療戦略を表している。MSCが敗血症の有望な新しい治療法を提供する可能性があることは、様々な動物実験で強調されているが、現段階では、これらのアプローチのいずれも新しい商業化された治療法には至っていない。
【0008】
EP 1 969 118は、肝臓学、先天性肝代謝異常、移植、感染症および／または肝不全における使用のための、成体肝臓に由来するADHLSCとも呼ばれる、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞を報告している。欧州特許第1 969 118号は、これらの細胞を単離および特徴づける方法、ならびに移植または人工臓器装置のためのそれらの使用を報告している。EP 1 969 118の肝臓前駆細胞の特徴付けおよびその調製方法は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。肝臓または肝臓の一部からの前駆細胞または幹細胞の単離は、当該技術分野で公知の方法に従って、例えばEP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393またはEP 3 423 566に記載されているように実施される。
【0009】
GMP条件下で作成された、臨床研究を追求するためにより高スケールで産生されたADHLSCおよびHALPC（ヒト同種肝臓前駆細胞）は、文献ではHHALPCとしても言及されているが、正常な成体肝臓のコラゲナーゼ消化および単離された柔組織分画（フラクション）の初代培養後に得られた未分化前駆細胞である。これらのヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、自己再生能力を示し、間葉系および肝細胞マーカーの両方を発現し、高度な肝臓形成分化能を示す特殊性を有する。これらの細胞は、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）および急性慢性肝不全（ACLF）、および他のヒト疾患を含むヒト肝疾患を標的とすることに特に興味深い。
【0010】
国際公開第2015 001 124号は、成体由来ヒト肝幹細胞／前駆細胞を細胞培養培地中で培養し、得られた馴化培地を単離することによって得られる無細胞組成物に関する。国際公開第2015 001 124号は、臓器損傷、臓器不全を含む疾病治療のための、ならびに臓器または細胞移植、特に肝臓内での使用のための、これらの無細胞組成物の使用を記載している。
WO 2016 200 340には、感染症、慢性肝不全および肝臓がんの治療に使用するための特異的マーカーを有するヒト肝幹細胞が記載されている。
WO 2016 200 340には、感染症、慢性肝不全および肝臓がんの治療に使用するための特異的マーカーを有するヒト肝幹細胞が記載されている。
【0011】
EP 3 016 665は、成体由来ヒト肝幹／前駆細胞を細胞培養培地中で培養し、細胞培養培地を細胞から分離することによって得ることができる無細胞の馴化培地（コンディショニング培地）に関する。
欧州特許第1 969 118号は、肝臓疾患、肝癌および肝感染の治療に使用するための特異的マーカーを有するヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を最終的に開示する。
欧州特許第1 969 118号は、肝臓疾患、肝癌および肝感染の治療に使用するための特異的マーカーを有するヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を最終的に開示する。
【発明の概要】
【0012】
本発明は、請求項１に記載の肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地の治療的使用を提供することを目的とする。現在の目的のために有用な大人肝臓由来前駆細胞または幹細胞、その細胞株または細胞集団の例は、欧州特許第1 969 118号、欧州特許第3 039 123号、欧州特許第3 140 393号および欧州特許第3 423 566号に開示されており、参照として本明細書に組み込まれる。成体由来ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を細胞培養培地中で培養することによって得られる可能な有用な馴化培地は、詳細には、国際公開第2015 001 124号に報告されており、本明細書において参考として援用される。
【0013】
内皮のバリア機能は、膜細胞間結合（ジャンクション）によって提供される内皮構造の完全性に由来する。これらの結合の変化は、液体および溶質への血管透過性亢進を促進し、敗血症、癌、臓器不全などの種々の病理学的状態に関連する損傷に大きく寄与し得る。細胞間結合の構造的および機能的完全性は、血管透過性の主要な決定因子である。
【0014】
細胞における異なる役割の中で、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）は内皮間結合（IEJ）を調節することが知られており、したがって内皮細胞の機能的完全性保存に関与している。AMPKは、内皮バリアの完全性を調節することにより、敗血症性損傷および高透過性に対する防御として作用する。従って、内皮細胞におけるAMPKの活性化は、血管内皮の機能的完全性に対する潜在的有益な効果を提供する。
【0015】
予期せぬことに、肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、該細胞の溶解によって得られた溶解物、および／または該肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、もしくはその一部を培養することによって得ることができる馴化培地、またはそれらの一部を、血管透過性の増加または変化に関連する条件下で使用することができ、および／または血管透過性の障害を調節または感化することができることが見出された。
前記肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、その溶解物および／または前記肝臓前駆細胞もしくは幹細胞またはその一部を培養することによって得ることができる馴化培地は、AMPKの活性化を介して、密着結合および接着結合の形成の集合または復元を促進する。
前記肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、その溶解物および／または前記肝臓前駆細胞もしくは幹細胞またはその一部を培養することによって得ることができる馴化培地は、AMPKの活性化を介して、密着結合および接着結合の形成の集合または復元を促進する。
【0016】
これらの作用は、炎症性および感染状態における内皮の機能的構造の回復を容易にする潜在的な有益な作用機序を示唆している。
【0017】
好ましい実施形態は、従属請求項２～１９として示される。
【0018】
また、本発明は、請求項２０に記載のヒト肝臓前駆細胞の培養から得られる馴化培地に関する。特に、前記培地は、スフィンゴシン－１－ホスフェートを少なくとも３０ng／百万総細胞（百万個のトータル細胞数）で含む。
【0019】
試験された条件は、図１～５において同じであり、以下に列挙される：
‐「対照」条件は、HDBECがEGM－２MV培地にあることを意味する。EGM－２MV培地を対照培地とする。前記対照培地において、HDBECは、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞、すなわち、HepaStemと接触されない。
‐「HepaStem CM」条件は、HDBECが、前記肝臓前駆細胞または幹細胞の培養によって得られた馴化培地に曝露されることを意味する。
‐「対照－LPS」条件は、HDBECが単独でLPSによって刺激され、電流発明の馴化培地に曝露されないことを意味する。
‐「HepaStem CM - LPS」条件は、HDBECが前記馴化培地に曝露され、次いでLPSによって刺激されることを意味する。
‐「対照」条件は、HDBECがEGM－２MV培地にあることを意味する。EGM－２MV培地を対照培地とする。前記対照培地において、HDBECは、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞、すなわち、HepaStemと接触されない。
‐「HepaStem CM」条件は、HDBECが、前記肝臓前駆細胞または幹細胞の培養によって得られた馴化培地に曝露されることを意味する。
‐「対照－LPS」条件は、HDBECが単独でLPSによって刺激され、電流発明の馴化培地に曝露されないことを意味する。
‐「HepaStem CM - LPS」条件は、HDBECが前記馴化培地に曝露され、次いでLPSによって刺激されることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、ACC（アセチルCoAカルボキシラーゼ）リン酸化の分析によって評価される、内皮細胞と肝幹細胞の馴化培地とのインキュベーション後のAMPKの活性化を示す。図１Aは、代表的なウエスタンブロットを可視化したものである。AICAR：５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボヌクレオチド処理群。図１Bは、試験した４つの条件の相対的ACCリン酸化を可視化したものである。
【図2】図２は、ベースの状態（LPS処理なし）、ならびにLPS処理後、およびLPS処理および肝幹細胞由来の馴化培地の投与後の内皮細胞におけるZO－１免疫染色および細胞結合のパターンを示す。図２Aは、ドナー１（４００倍）の培養肝臓前駆細胞または幹細胞から得られた馴化培地を用いて得られた結果を可視化し、図２Bは、ドナー２（４００倍）の培養肝臓前駆細胞または幹細胞から得られた馴化培地を用いて得られた結果を可視化し、図２Cは、ドナー３（４００倍）の培養肝臓前駆細胞または幹細胞から得られた馴化培地を用いて得られた結果を可視化する。
【図3】図３は、LPS処理有りおよび無しで試験した、ギャップ結合に対する対照群と比較した、肝臓幹細胞からの馴化培地の効果を示す。ドナー３の肝臓前駆細胞または幹細胞を培養し、得られた馴化培地について、Cx４３の免疫抑制効果（２００x）が示される。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
他に定義されない限り、技術的および科学的用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。さらなるガイダンスにより、本発明の教示をより良く理解するために、用語定義が含まれる。
他に定義されない限り、技術的および科学的用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。さらなるガイダンスにより、本発明の教示をより良く理解するために、用語定義が含まれる。
【0022】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語は、一般に、インビボで細胞が会合している１つ以上の細胞または１つ以上の細胞成分と会合していない細胞を指す。例えば、単離された細胞は、その天然環境から除去されていてもよく、またはその天然環境から除去された細胞の繁殖（増殖）、例えばex vivo繁殖から生じてもよい。
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語は、一般に、インビボで細胞が会合している１つ以上の細胞または１つ以上の細胞成分と会合していない細胞を指す。例えば、単離された細胞は、その天然環境から除去されていてもよく、またはその天然環境から除去された細胞の繁殖（増殖）、例えばex vivo繁殖から生じてもよい。
【0023】
本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、動物または人体の外部または外部を示す。本明細書で使用される用語「インビトロ」は、「ex vivo」を含むと理解されるべきである。「ex vivo」という用語は、典型的には、動物または人体から取り出され、体外で、例えば培養容器内で、維持または繁殖される組織または細胞を指す。
【0024】
「肝臓前駆細胞」という用語は、肝臓またはその一部から単離された細胞を培養することによって産生され、そのうちのいずれか、またはその子孫が少なくとも１つの比較的より特殊な細胞型を生じ得る、非特異的であって増殖能力のある細胞を指す。肝臓前駆細胞は、次第に特殊化した細胞（しかし好ましくは肝細胞または肝活性細胞）を産生するために１つ以上の系統に沿って分化しうる子孫を生じさせ、そのような子孫はそれ自体が前駆細胞であることもあれば、最終分化した肝細胞（例えば、完全に特殊化した細胞、特に初代ヒト肝細胞のものと類似した形態学的および機能的特徴を呈する細胞）を産生することさえある。
【0025】
用語「幹細胞」は、自己再生が可能な前駆細胞、すなわち、分化することなく増殖することができ、それによって、幹細胞の子孫またはその少なくとも一部が、非分化または比較的低分化の表現型、分化能、および母幹細胞の増殖能を実質的に保持する前駆細胞を指す。この用語は、実質的に無制限の自己再生が可能な幹細胞、すなわち、さらなる増殖のための後代またはその一部の能力が、母細胞と比較して実質的に減少していない幹細胞、ならびに限定された自己再生を示す幹細胞、すなわち、さらなる増殖のための後代またはその一部の能力が、母細胞と比較して明らかに減少している幹細胞を包含する。
【0026】
用語「肝臓前駆細胞または幹細胞」とは、臨床研究を追求するためにより高いスケールで産生された成体由来ヒト肝幹／前駆細胞（ADHLSC）およびヒト同種肝臓前駆細胞（HALPCまたはHALPC）を指し、「ヒト成体肝由来前駆細胞」、「異種ヒト成体肝由来前駆細胞」、「HHALPC」または「HHALPC」と略して同義で使用される。これらの細胞は、本明細書に記載されるように得ることができる、特定種類のヒト肝由来前駆細胞を表す。
【0027】
多様な細胞型を生じる能力に基づき、前駆細胞または幹細胞は、通常、全能性、多能性、多分化能性または単分化能性と記載され得る。単一の「全能性」細胞は、生体全体に増殖、すなわち発育することができると定義される。「多能性」細胞は、生物体全体に成長することができないが、３つの胚葉、すなわち中胚葉、内胚葉、および外胚葉のすべてに由来する細胞型を生じることができ、生物体のすべての細胞型を生じることができる可能性がある。「多分化能性」細胞は、生物の２つ以上の異なる器官または組織の各々から少なくとも１つの細胞型を生じさせることができ、ここで、該細胞型は、同じまたは異なる胚葉から生じ得るが、生物のすべての細胞型を生じさせることはできない。「単分化能性」細胞は、ただ１つの細胞系譜の細胞に分化することができる。
【0028】
用語「間葉系幹細胞」は、主として間葉細胞由来または間質細胞に由来するまたはこれらから単離された多能性間質細胞として理解されるべきである。前記間葉系幹細胞は、肝細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、テノサイト（tenocyte）および脂肪細胞を含むが、これらに限定されない様々な細胞型に分化することができる。
【0029】
用語「肝細胞」は、異なるサイズまたは倍数性（例えば、二倍体、四倍体、八倍体）の肝細胞を含むが、これらに限定されない、上皮および実質肝細胞を包含する。
【0030】
「抽出物」または「溶解物」という用語は、本明細書で使用する場合、溶解細胞含有量を意味する。好ましくは、このような抽出物または溶解物は、さらに精製されておらず、したがって、全細胞溶解内容物を含有する。別の好ましい態様において、抽出物は、タンパク質抽出物、RNA抽出物、脂質、または膜小胞を指す。
【0031】
「分画（フラクション）」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の馴化培地から得ることができる部分、組成物または誘導体を指す。
【0032】
用語「リポポリサッカライド」または略称「LPS」は、本明細書中で使用される場合、グラム陰性生物によって放出される、錯体病原体関連分子パターンの単一成分を意味する。LPSは、O抗原、外核、内核からなる脂質とポリサッカライド（多糖類）からなる大きな分子で、共有結合でつながれ、グラム陰性菌の外膜に見られる。
【0033】
「肝臓」という用語は、肝臓器官を意味する。「肝臓の一部」という用語は、概して、肝臓器官の任意の部分に由来する組織試料を指し、これらの部分の量またはそれが由来する肝臓器官の領域に関して限定されるものではない。好ましくは、肝臓器官に存在する全ての細胞型は、前記肝臓の部分にも表され得る。肝臓の部分の量は、少なくとも部分的に、本発明の方法を合理的に実施するために十分な一次肝細胞を得る必要性に対する実際的な考慮に従うことができる。したがって、肝臓の一部は、肝臓の臓器の割合（例えば、少なくとも１％、１０％、２０％、５０％、７０％、９０％、またはそれ以上、典型的にはw／w）を示すことがある。他の非限定的な例では、肝臓の一部は、重量（例えば、少なくとも１g、１０g、１００g、２５０g、５００g、またはそれ以上）によって定義され得る。例えば、肝臓の一部は、肝葉、例えば、右葉または左葉、または分割肝手術中または肝生検中に切除される多数の細胞を含む任意のセグメントまたは組織試料であり得る。
【0034】
「成体肝臓」という用語は、出生後、すなわち、出生後の任意の時間、好ましくは満期のものであり、例えば、少なくとも１日、１週間、１ヶ月もしくは生後１ヶ月以上、または少なくとも１年、５年、１０年以上であってもよい対象の肝臓を指す。したがって、「成体肝臓」、すなわち成熟肝臓は、「幼児」、「子」、「青年」、または「成体」という従来の用語で記述されるであろうヒト対象中に見出され得る。当業者は、肝臓が、異なる動物種において、出生後の異なる時間間隔で実質的な発達成熟を達成し得、そして、各種を参照して、「成体肝臓」という用語を適切に構成し得ることを認識するであろう。
【0035】
「哺乳動物」という用語は、例えばマウス、ラット、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよび霊長類、例えばサルおよびエイプのような、ヒト、家畜および農場動物、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、ペット動物、コンパニオン動物および実験動物を包含するが、これらに限定されない。
【0036】
本明細書で使用される「解離する」という用語は、一般に、組織または器官の細胞組織を部分的または完全に破壊すること、すなわち、細胞と組織または器官の細胞成分との間の会合を部分的または完全に破壊することを指す。当業者に理解され得るように、組織または器官を解離する目的は、前記組織または器官から細胞の懸濁液、すなわち細胞集団を得ることである。懸濁液は、単細胞または単セル、ならびに２つ以上の細胞のクラスターまたは凝集体を形成するために物理的に結合された細胞を含み得る。解離は、好ましくは、細胞生存性の低下を可能な限り少なく引き起こさないか、または引き起こさない。
【0037】
本明細書中で使用される用語「一次細胞」は、上記外植組織または臓器中に存在する細胞を適切な技術で解離することにより、対象の組織または臓器、例えば肝臓から得られた細胞の懸濁液中に存在する細胞を含む。
【0038】
用語「培養すること」は、当該技術分野において一般的であり、細胞および／またはその後代の維持および／または増殖を広く意味する。
【0039】
「継代培養」という用語は、当該技術分野において一般的であり、培養された細胞を培養基材から、および互いに分離することを指す。簡単のために、被着材培養条件下で細胞を初めて増殖させた後に行われる継代は、本明細書では、本発明の方法内で「第一継代」（または継代１、P１）と称される。細胞は、少なくとも１回、好ましくは２回以上継代され得る。継代１に続く各継代は、本明細書では、１だけ増加する数、例えば、継代２、３、４、５、またはP１、P２、P３、P４、P５などで参照される。
【0040】
用語「コンフルエント」は、本明細書で使用される場合、細胞が、増殖のために利用可能な表面の実質的にすべてを覆って互いに接触する（すなわち、完全にコンフルエントである）培養細胞の密度を指す。
【0041】
「プラズマ」という用語は、従来定義されている通りであり、人体または動物体の一部を形成しない組成物を指す。
【0042】
「血清」という用語は、従来定義されているように、まず試料中で凝固が起こることを可能にし、続いて、そのように形成された凝血塊および血液試料の細胞成分を、適当な技術、典型的には遠心分離によって、液体成分（血清）から分離することによって、全血の試料から得られる。不活性触媒、例えば、ガラスビーズまたは粉末は、凝固を促進することができる。有利には、哺乳動物に対する不活性触媒を含有する血清分離管（SST）を用いて血清を調製することができる。
【0043】
「細胞培地」または「細胞培養培地」または「培地」という用語は、細胞の維持または増殖のために使用され得る栄養素を含む水性液体またはゼラチン状物質を指す。細胞培養培地は、血清を含むことができ、または血清を含まないことができる。
【0044】
「増殖因子」という用語は、本明細書で使用される場合、種々の細胞型の増殖、成長、分化、生存および／またはマイグレーション（移動）に影響を及ぼし、単独でまたは他の物質によって調節される場合に、生物における発生、形態学的および機能的変化に影響を及ぼし得る生物学的に活性な物質を指す。増殖因子は、典型的には、リガンド（配位子）として、細胞内に存在するレセプター（例えば、表面または細胞内レセプター）に結合することによって作用し得る。本明細書中の増殖因子は、特に、１つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質性エンティティであり得る。用語「成長因子」は、線維芽細胞成長因子（FGF）ファミリー、骨形態形成タンパク質（BMP）ファミリー、血小板由来成長因子（PDGF）ファミリー、形質転換増殖因子β（TGF－β）ファミリー、神経成長因子（NGF）ファミリー、上皮成長因子（EGF）ファミリー、インスリン関連成長因子（IGF）ファミリー、肝細胞成長因子（HGF）ファミリー、インターロイキン－６（IL－６）ファミリー（オンコスタチンM、OSMなど）、造血成長因子（HeGF）、血小板由来内皮細胞成長因子（PD－ECGF）、アンジオポイエチン、血管内皮成長因子（VEGF）ファミリー、またはグルココルチコイドのメンバーが含まれる。本方法がヒト肝細胞に使用される場合、本方法で使用される増殖因子はヒトまたは組換え増殖因子であり得る。本方法におけるヒトおよび組換え増殖因子の使用は、上記増殖因子が細胞機能に望ましい効果を誘発すると予想されるので好ましい。
【0045】
本明細書で使用される用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞、または多能性細胞に作用する他の細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、組織細胞、造血細胞、間葉系幹細胞および前駆細胞を含む多能性細胞、または他の細胞タイプが挙げられるが、これらに限定されない、免疫系または他の細胞によって分泌される増殖、分化または化学栄養因子などのシグナル伝達分子を指す。代表的なサイトカインには、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（IDO）、プロスタグランジンE２（PGE２）、プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ２（PTGS２）、肝細胞成長因子（HGF）、インターロイキン－１α（IL－１α）、インターロイキン－１β（IL－１β）、インターロイキン－２（IL－２）、インターロイキン－３（IL－３）、インターロイキン－４（IL－４）、インターロイキン－６（IL－６）、インターロイキン－１０（IL－１０）などのこれらに限定されないインターロイキン、インターフェロン－α（INF－α）およびインターフェロン－γ（INF－γ）などのインターフェロン、腫瘍壊死因子－α（TNF－α）、および顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM－CSF）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
用語「細胞集団」および「細胞の集団」は、一般的に、細胞の群を意味する。特に明記しない限り、用語は、本明細書に定義される細胞から本質的になるか、またはそれを含む細胞群を指す。細胞集団は、本質的に、共通の表現型を有する細胞からなり得るか、または共通の表現型を有する細胞の少なくとも１つの分画を含み得る。細胞は、形態学的外観、特定の細胞成分または産物（例えば、RNAまたはタンパク質）の発現レベル、特定の生化学的経路の活性、増殖能および／または動態、分化能、および／またはin vitro培養中の分化シグナルまたは挙動に対する応答（例えば、付着または単層増殖）を含むがこれらに限定されない、１つ以上の実証可能な特性において実質的に類似または同一である場合、共通の表現型を有すると言われる。したがって、そのような実証可能な特性は、細胞集団またはその分画を定義し得る。細胞集団は、細胞の実質的大多数が共通の表現型を有する場合、「実質的に均質」であり得る。「実質的に均質である」細胞集団は、共通の表現型、例えば、特異的に言及される表現型（例えば、本発明の肝臓前駆細胞もしくは幹細胞の表現型、または本発明の肝臓前駆細胞もしくは幹細胞の後代）を有する細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９９％を含み得る。さらに、もし集団中に存在する他の細胞が細胞集団の全体的な特性を変化させないか、または物質的効果を有しない場合には、細胞集団は、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞（すなわち、発明の肝臓前駆細胞または幹細胞の後代）の表現型のような共通の表現型を有する細胞から本質的に構成され得る。
【0047】
本明細書で使用される「AMPK」という略語は、５’AMP活性化プロテインキナーゼまたは５’アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼを指し、これは、細胞エネルギー恒常性において役割を果たし、主に、細胞エネルギーが低いときにグルコースおよび脂肪酸の取り込みおよび酸化を活性化する酵素である。
【0048】
「薬学的に薬学的に許容可能な担体」という用語は、本明細書で使用される場合、対象に重大な刺激を引き起こさず、かつ投与される組成物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。担体の実施例は、限定されるものではないが、プロピレングリコール、生理食塩水、乳化および有機溶媒と水との混合物である。
【0049】
用語「障害」は、本明細書で使用される場合、器官／器官系の系統的機能および生理学的構造の破壊を意味する。
【0050】
「治療」という用語は、治療的処置および予防的または防止的処置の両方を意味し、目的は、標的とされる病的状態または障害を予防または減速（低減）することである。処置が必要な患者には、すでに病気にかかっている患者、病気にかかりやすい患者、病気を予防しようとする患者などがある。
【0051】
本明細書中で使用される「同種」という用語は、寄贈された材料が、レシピエントとは異なるが、しばしば関連する個々に由来することを意味する。同種幹細胞移植とは、遺伝的に類似しているが同一ではないドナーから幹細胞を移植する手順をいう。これはしばしば姉や兄弟であるが、無関係のドナーになることもある。
【0052】
本明細書で使用される「血管透過性」という用語は、血管内および血管外で小分子（薬物、栄養素、水、イオン）またはさらには全細胞の流れを可能にする血管壁の容量として理解される。
【0053】
本明細書で使用される「血管透過性の増大」という用語は、急性および慢性炎症、癌、および創傷治癒の原因となり得るこれらの分子の通過を含む、血管壁を通る様々な分子の増大した通過を意味する。前記の透過性亢進または透過性亢進は、血管透過性物質、特に血管透過性因子／血管内皮増殖因子（VPF／VEGF、VEGF－A）への急性または慢性の暴露によって媒介され得る。
【0054】
用語「血管の完全性」は、本明細書で使用される場合、血管の恒常性を維持する血管壁の様々な構成要素の適切な機能を指す。血管の完全性を悪化させる初期の特徴の１つは、主に内皮ジャンクションの安定性によって制御される透過性の亢進である。血管透過性の選択的調節は、傍細胞間隙の大きさと状態の調節と経細胞輸送の制御によって達成される。
【0055】
用語「心疾患」は、本明細書で使用される場合、心臓に影響を与える任意の障害および／または条件を指す。前記心疾患には、特に、冠動脈疾患などの血管疾患；心拍（心臓のリズム）の問題（不整脈）；および先天性心臓欠陥が含まれ得る。
【0056】
「心疾患」という用語は、「心血管疾患」という用語と互換的に用いられることが多い。心血管疾患とは、一般に、心臓発作、胸痛（狭心症）または脳卒中を引き起こす可能性のある血管の狭窄または閉塞を伴う条件をいう。心臓の筋肉、弁またはリズムに影響を及ぼすような他の心臓病も、心臓病の形成と考えられる。
【0057】
本明細書で使用される「肺疾患」という用語は、肺が適切に機能することを妨げる、肺における任意の問題である任意の肺疾患を指す。
【0058】
本明細書で使用される「虚血性疾患」という用語は、血流の減少および前記組織／臓器または臓器系への酸素の十分な補給により、組織／臓器または臓器系の機能障害に関連する任意の疾患および／または条件を指す。虚血性疾患のタイプには、冠動脈心疾患、大脳または脳の虚血、肺の虚血、腎臓の虚血などが含まれるが、これらに限定されない。
【0059】
本明細書で使用される「糖尿病」という用語は、長期間にわたって高血糖レベルが存在する代謝障害群を指す。高血糖の症状には、頻尿、のどの渇きの増加、空腹感の増加などがある。糖尿病は、特に治療せずに放置すると、多くの合併症を引き起こす。急性合併症には、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖状態、または死亡がありうる。重篤な長期合併症には、心血管疾患、脳卒中、慢性腎臓病、足の潰瘍、眼の損傷などがある。
【0060】
本明細書で使用される用語「眼疾患」は、眼に影響を及ぼす障害および状態を指す。
【0061】
用語「癌」は、本明細書で使用される場合、体の他の部分に浸潤他広がる可能性を有する異常な細胞増殖を含む疾患群を指す。
【0062】
「固形腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、通常、 嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な集まり（集団）を指す。固形腫瘍は良性（癌ではない）の場合もあれば、悪性（癌）の場合もある。固形腫瘍の種類は、その形成する細胞の種類によって異なる。固形腫瘍の例は、肉腫、がん腫、リンパ腫である。白血病は一般に固形腫瘍を形成しない。
【0063】
本明細書中で使用される用語「クラークソン病」は、特発性全身性毛細血管漏出症候群（SCLS）を意味し、これは可逆性微小血管関門機能不全から生じると考えられる低血圧ショックおよび全身浮腫の過渡的なエピソードを特徴とするまれな障害である。この潜在的に致命的な障害は、血中濃度（ヘマトクリット値の上昇によって検出される）および低アルブミン血症に関連するさまざまな強度の血液量減少性ショックおよび全身性浮腫の常同的「発作」を特徴とし、通常はアルブミン尿がない場合に起こる。
【0064】
本明細書中で使用される用語「敗血症」は、感染に対する調節不全宿主応答によって引き起こされる寿命を脅かす臓器機能不全を意味する。敗血症は、微生物感染によって誘発される散在性炎症反応を特徴とする。敗血症は一般的に、リンパ球のアポトーシスと院内感染に対する感受性を特徴とする免疫抑制状態に至る。
【0065】
本明細書で使用される「敗血症誘発性」という用語は、敗血症および関連事象の結果である、組織、器官および／または器官系において生じるすべての疾患および状態を指す。このような状態には、敗血症誘発性心筋症、敗血症誘発性凝固障害、臓器機能不良、急性腎障害、肺敗血症、臓器機能不良および／または血流不足などが含まれるが、これらに限定されない。
【0066】
本明細書中で使用される用語「敗血症性心筋症」または「敗血症誘発性心筋浮腫」は、敗血症中の左心室壁浮腫と関連した、収縮期および／または拡張期左心室（LV）機能の可逆的減少によって特徴付けられる、重度敗血症患者における心血管合併症を意味する。
【0067】
用語「盲腸結紮および穿刺」は、盲腸の穿孔上で、糞便物質の腹腔内への放出を可能にし、複数菌感染によって誘導された増悪した免疫反応を発生させる障害を意味する。針穿刺後の便流出から多菌性敗血症が発生する。盲腸結紮および穿刺モードは、ヒト敗血症の進行および特性に酷似しているため、敗血症の研究に最も頻繁に使用されるゴールドスタンダードであるモデルである。
【0068】
本明細書中で使用される用語「敗血症誘発性肺損傷」は、敗血症に続発して起こる急性肺損傷または障害を意味する。肺は、敗血症関連の全身性炎症反応に最もしばしば侵される臓器であり、急性肺損傷またはより重度の急性呼吸窮迫症候群をもたらす。
【0069】
発明の詳細な説明
本発明は、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培地中で培養することによって得ることができる馴化培地の、血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および状態の治療のための使用に関する。さらなるまたは他の実施形態において、前記細胞、その溶解物および／または馴化培地は、前記対象における炎症および／または感染後に、対象における細胞および組織の血管の完全性を回復するために使用することができる。代わりに、または加えて、前記細胞、その溶解物および／または馴化培地は、AMPK活性化により、対象、好ましくはヒト対象におけるAMPシグナル伝達を調節するために使用され得る。
本発明は、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記肝臓前駆細胞または幹細胞を培地中で培養することによって得ることができる馴化培地の、血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および状態の治療のための使用に関する。さらなるまたは他の実施形態において、前記細胞、その溶解物および／または馴化培地は、前記対象における炎症および／または感染後に、対象における細胞および組織の血管の完全性を回復するために使用することができる。代わりに、または加えて、前記細胞、その溶解物および／または馴化培地は、AMPK活性化により、対象、好ましくはヒト対象におけるAMPシグナル伝達を調節するために使用され得る。
【0070】
AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）は、低酸素、熱ショック、虚血、およびグルコース欠乏などの細胞ストレッサーによって「オン」に切り替えられるエネルギーセンサである。その活性化は同化（ATP消費）経路を阻害し、異化（ATP生成）経路の刺激を誘導する。IEJを調節することが知られているAMPKは、内皮細胞の機能的完全性、内皮バリアの完全性を保存し、したがって敗血症性損傷および透過性亢進に対する防御として作用する。細胞におけるAMPKの活性化は、血管内皮の機能的完全性に有益な効果をもたらす可能性がある。
【0071】
肝臓前駆細胞または幹細胞、および後者を単離するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393またはEP 3 423 566によって証明され、これらは、本明細書中に参考として援用される。肝疾患を治療するための肝臓前駆細胞または幹細胞の使用は、同じように議論されてきた。成体由来ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を細胞培養培地中で培養することにより得られた無細胞組成物、ならびに臓器損傷、臓器不全、ならびに臓器または細胞移植、特に肝臓への使用を含む疾病治療のためのそれらの使用は、WO 2015 001 124の目的である。
【0072】
ここでは、肝臓前駆細胞または幹細胞、ならびにその溶解物および前記細胞を培地中で培養することにより得られた馴化培地が、特にAMPK活性化を介して、内皮の機能的構造の回復（復元）を促進することにより、細胞および組織の血管の完全性の回収に有用であることが初めて示される。結果として、肝臓前駆細胞または幹細胞、ならびにその溶解物および培地中で前記細胞を培養することによって得られた馴化培地は、血管透過性亢進に関連する状態および疾患の治療を提供する。
【0073】
本発明で使用される細胞は、肝臓前駆細胞または幹細胞であり、好ましくは、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞などの哺乳動物細胞である。
１つの実施形態において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、少なくとも１つの間葉マーカーに対して陽性である。間葉系マーカーには、ビメンチン、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびＣＤ１４０ｂが含まれるが、これらに限定されない。さらに、肝臓前駆細胞は、HGFおよび／またはPGE２を分泌し得る。さらに、これらは、任意に、少なくとも１つの肝臓マーカーに対して陽性であり、および／または少なくとも１つの肝臓特異的活性を示すことができる。例えば、肝臓マーカーには、HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４およびα－１アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されず、アルブミン（ALB）も含まれ得る。肝臓特異的活性には、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、少なくとも１つの間葉マーカーに対して陽性である。間葉系マーカーには、ビメンチン、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびＣＤ１４０ｂが含まれるが、これらに限定されない。さらに、肝臓前駆細胞は、HGFおよび／またはPGE２を分泌し得る。さらに、これらは、任意に、少なくとも１つの肝臓マーカーに対して陽性であり、および／または少なくとも１つの肝臓特異的活性を示すことができる。例えば、肝臓マーカーには、HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４およびα－１アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されず、アルブミン（ALB）も含まれ得る。肝臓特異的活性には、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性が含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
本発明の別の実施態様において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、CD９０、CD４４、CD７３、CD１３、CD１４０b、CD２９、ビメンチンおよびα－平滑筋アクチン（ASMA）から選択される少なくとも１つの間葉系マーカーを発現し、更にそれらはHGFを分泌する。
【0075】
本発明の別の実施態様において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、CD９０、CD４４、CD７３、CD１３、CD１４０b、CD２９、ビメンチンおよびα－平滑筋アクチン（ASMA）から選択される少なくとも１つの間葉系マーカーを発現し、更にそれらはHGFおよびPGE２を分泌する。
【0076】
本発明の別の実施形態では、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２９、ビメンチンおよびα－平滑筋アクチン（ASMA）から選択される少なくとも１つの間葉系マーカーを発現し、それらは、場合により、少なくとも１つの肝マーカーも発現し、および／または肝特異的活性を示し、および／または肝特異的活性を示す。
【0077】
１つの実施形態において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１３、ＣＤ１４０ｂ、ビメンチン、ＣＤ２９、およびα－平滑筋アクチン（ASMA）を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの間葉系マーカーを、α－フェトプロテイン（AFP）、α－１アンチトリプシン、HNF－４および／またはMRP２トランスポーター、任意に肝細胞マーカーアルブミン（ALB）を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの肝または肝細胞マーカーと共発現する（すなわち、陽性である）という特徴を有することができる。また、任意に、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性から選択され得る肝臓特異的活性を示す。さらに、HALPCは、HGFおよびPGE－２を発現することが好ましい。
【0078】
１つの実施形態において、前記細胞は、好ましくは、少なくとも１つの肝マーカーおよび少なくとも１つの間葉マーカーに対して陽性であり、少なくとも１つの肝特異的活性を示すヒト肝臓前駆細胞または幹細胞である。例えば、肝マーカーには、HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４およびα－１アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されず、アルブミン（ALB）も含まれ得る。間葉系マーカーには、ビメンチン、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびＣＤ１４０ｂが含まれるが、これらに限定されない。肝臓特異的活性には、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性が含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
前記肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、またはそのような細胞を含む細胞集団は、少なくとも肝細胞様細胞を生じさせることができる。好ましくは、前記細胞は骨細胞または脂肪細胞に分化しない。
【0080】
本発明の好ましい態様において、使用されるヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、α－平滑筋アクチン（ASMA）、アルブミン（ALB）、CD１４０b、およびMMP１の群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対して陽性であり、プロテイン２（SUSD２）およびサイトケラチン－１９（CK－１９）を含有する群スシドメインから選択されるマーカーのうちの少なくとも１つに対して陰性である。
【0081】
本発明の別の実施形態では、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、α－平滑筋アクチン（ASMA）、CD１４０b、および任意選択的にアルブミン（ALB）に対して陽性であり、サイトケラチン－１９（CK－１９）に対して陰性であると測定される。
【0082】
さらなる実施形態において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、α－平滑筋アクチン（ASMA）、CD１４０b、および任意にアルブミン（ALB）およびスシドメイン含有プロテイン２（SUSD２）に対して陽性であり、サイトケラチン－１９（CK－１９）に対して陰性であると測定される。
【0083】
本発明の別の実施形態では、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、α－平滑筋アクチン（ASMA）、CD１４０b、および任意選択的にアルブミン（ALB）に対して陽性であり、スシドメイン含有プロテイン２（SUSD２）およびサイトケラチン－１９（CK－１９）に対して陰性であると測定される。
【0084】
本発明の別の態様において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、CD９０、CD７３、ビメンチンおよびASMAに対して陽性であると測定される。
【0085】
本発明のさらなる実施形態において、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、CD９０、CD７３、ビメンチンおよびASMAに対して陽性であり、分裂中期（メタフェーズ／metaphase）あたり平均約２．５％未満のクローン性異常および／または中期あたり約１５％未満の非クローン性異常を示す。
【0086】
別の実施形態では、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、CD９０、CD７３、ビメンチンおよびASMAに対して陽性であり、CK－１９に対して陰性であると測定される。
【0087】
別のまたはさらに好ましい実施形態では、前記ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、
‐α平滑筋アクチン（ASMA）、アルブミン（ALB）、CD１４０b、MMP１；
‐HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４から選択される少なくとも１つの肝マーカー；
‐ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９から選択される少なくとも１つの間葉系マーカー；
‐尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性から選択される少なくとも１つの肝臓特異的活性；
‐ATP２B４、ITGA３、TFRC、SLC３A２、CD５９、ITGB５、CD１５１、ICAM１、ANPEP、CD４６、CD８１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐ITGA１１、FMOD、KCND２、CCL１１、ASPN、KCNK２、およびHMCN１から選択される少なくとも１つのマーカー；
の群から選択される１つ以上のマーカーに対して陽性であると測定される。
‐α平滑筋アクチン（ASMA）、アルブミン（ALB）、CD１４０b、MMP１；
‐HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４から選択される少なくとも１つの肝マーカー；
‐ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９から選択される少なくとも１つの間葉系マーカー；
‐尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性から選択される少なくとも１つの肝臓特異的活性；
‐ATP２B４、ITGA３、TFRC、SLC３A２、CD５９、ITGB５、CD１５１、ICAM１、ANPEP、CD４６、CD８１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐ITGA１１、FMOD、KCND２、CCL１１、ASPN、KCNK２、およびHMCN１から選択される少なくとも１つのマーカー；
の群から選択される１つ以上のマーカーに対して陽性であると測定される。
【0088】
本発明のさらに別のまたはさらなる実施形態では、HALPC細胞はさらに、
‐HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１およびCYP３A４、ならびに任意にアルブミンから選択される少なくとも１つの肝マーカー；
‐ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、およびCD２９から選択される少なくとも１つの間葉系マーカー；
‐尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌、およびCYP３A４活性から選択される少なくとも１つの肝臓特異的活性；
‐ATP２B４、ITGA３、TFRC、SLC３A２、CD５９、ITGB５、CD１５１、ICAM１、ANPEP、CD４６、およびCD８１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐MMP１、ITGA１１、FMOD、KCND２、CCL１１、ASPN、KCNK２、およびHMCN１から選択される少なくとも１つのマーカー；
について陽性であると測定される。
‐HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１およびCYP３A４、ならびに任意にアルブミンから選択される少なくとも１つの肝マーカー；
‐ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、およびCD２９から選択される少なくとも１つの間葉系マーカー；
‐尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌、およびCYP３A４活性から選択される少なくとも１つの肝臓特異的活性；
‐ATP２B４、ITGA３、TFRC、SLC３A２、CD５９、ITGB５、CD１５１、ICAM１、ANPEP、CD４６、およびCD８１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐MMP１、ITGA１１、FMOD、KCND２、CCL１１、ASPN、KCNK２、およびHMCN１から選択される少なくとも１つのマーカー；
について陽性であると測定される。
【0089】
細胞は、上に与えられたマーカーの任意の組合せに対して陽性であり得ることが理解されるであろう。特に好ましい態様において、前記細胞は、上記のすべてのマーカーに対して陽性である。
【0090】
別のまたはさらなる実施形態では、前記細胞は、
‐プロテイン２（SUSD２）とサイトケラチン１９（CK－１９）を含むスシドメイン；
‐CD２７１；
‐ITGAM、ITGAX、IL１R２、CDH５、およびNCAM１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐HP、CP、RBP４、APOB、LBP、ORM１、CD２４、CPM、およびAPOC１から選択される少なくとも１つのマーカー；
の群から選択される１つまたは複数のマーカーについて陰性で測定される。
‐プロテイン２（SUSD２）とサイトケラチン１９（CK－１９）を含むスシドメイン；
‐CD２７１；
‐ITGAM、ITGAX、IL１R２、CDH５、およびNCAM１から選択される少なくとも１つのマーカー；および
‐HP、CP、RBP４、APOB、LBP、ORM１、CD２４、CPM、およびAPOC１から選択される少なくとも１つのマーカー；
の群から選択される１つまたは複数のマーカーについて陰性で測定される。
【0091】
細胞は、上記のように付与されたマーカーの任意の組合せに対して陰性であり得ることが理解されるであろう。特に好ましい態様において、前記細胞は、上記のすべてのマーカーに対して陰性である。
【0092】
さらなる実施形態において、前記細胞は、HLA－DRに対して陰性である。
【0093】
さらなる実施形態において、HALPCは、CD１３３、CD４５、CK１９および／またはCD３１などの特定のマーカーに対して陰性である。
【0094】
さらなる実施形態において、HALPCはまた、WO2016/030525、表６に列挙されている酵素活性の１つまたは複数に対して陽性であると測定され得る。いくつかの実施形態において、このタイプの成体肝臓前駆細胞は、一連の陰性マーカー、特にITGAM、ITGAX、IL１R２、CDH５、およびNCAM１からなる群の１つまたは複数について、さらに特徴づけることができる。さらに、HALPCは、HP、CP、RBP４、APOB、LBP、ORM１、CD２４、CPM、およびAPOC１からなる群のうちの１つ以上について陰性であると測定されてもよい。
【0095】
上記に列挙された生物学的活性、マーカー、および形態学的／機能的特徴は、以下のようなマーカーの異なる組合せでHALPC中に存在することができる：
‐a－平滑筋アクチン、ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９、CD１４０b、CYP３A４活性、および任意にアルブミンについて陽性；
‐スシドメイン含有プロテイン２、サイトケラチン－１９、CD２７１について陰性。
‐a－平滑筋アクチン、ビメンチン、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９、CD１４０b、CYP３A４活性、および任意にアルブミンについて陽性；
‐スシドメイン含有プロテイン２、サイトケラチン－１９、CD２７１について陰性。
【0096】
さらなる特徴は、任意の機能的および技術的組み合わせにおいて、例えば、ATP２B４、ITGA３、TFRC、SLC３A２、CD５９、ITGB５、CD１５１、ICAM１、ANPEP、CD４６、およびCD８１から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーに対する陽性を測定することによって、上記実施形態のHALPCについても決定することができる。上記実施形態のいくつかでは、HALPCは、ITGAM、ITGAX、IL１R２、CDH５、およびNCAM１からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるマーカーについて陰性で測定することができる。上記実施形態のいくつかでは、HALPCは、HP、CP、RBP４、APOB、LBP、ORM１、CD２４、CPM、およびAPOC１のうちの少なくとも１つについて陰性で測定することができる。
【0097】
このようなマーカーを同定し、それらを陽性または陰性として測定するために使用される技術の中で、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、およびELISAが好ましい。なぜなら、これらは、この段階で利用可能な低量の肝臓前駆細胞または幹細胞でさえ、タンパク質レベルでマーカー検出を可能にするからである。
【0098】
さらに好ましい態様において、前記肝臓前駆細胞または幹細胞は、単層、平坦化形態、広範な細胞質および１つまたは２つの核小体を有する卵形核の成長のいずれかまたはすべてを含む間葉様形態を有する。
【0099】
これらの前駆細胞または幹細胞は、それらの増殖能力および特定の培地中でのインキュベーションを保持することができ、これにより、細胞は、中胚葉細胞型にではなく、肝臓特異的細胞型に特異的に分化することが可能になる。
【0100】
本発明の実施形態では、実際の細胞ではなく、上記のような細胞の細胞溶解物が使用される。前記細胞溶解物は、細胞または細胞培養物の酵素消化、界面活性剤および／または緩衝処理など、当技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。
【0101】
さらに好ましい実施形態において、前記肝臓前駆細胞または幹細胞はヒトである。特に好ましい実施形態において、前記ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は成体である。
【0102】
上記のようなヒト肝臓前駆細胞または幹細胞は、例えば、EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393またはEP 3 423 566（実施例１参照）に記載されるような、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって得ることができる。簡単に述べると、肝臓初代（プライマリ）細胞の集団は、まず、肝臓またはその一部の解離から得られ、該肝臓またはその一部から肝臓初代細胞の集団を形成する。続いて、この調製物に含まれる細胞は、好ましくは支持体上への細胞の接着性および増殖を可能にするように、接着性条件下で培養される。次に、これらの細胞を少なくとも１回、好ましくは７０％、８０％または９０％コンフルエントで継代する。最後に、細胞を単離し、少なくとも１つの肝マーカーおよび少なくとも１つの間葉系マーカーに対して陽性であり、かつ少なくとも１つの肝特異的活性を有する細胞である。
【0103】
好ましい実施形態では、そのような方法は、以下の工程を含む：
（a）成体肝臓またはその一部を解離させて、初代肝細胞の集団を形成し；
（b）（a）の初代肝細胞の調製物を生成し；
（c）（b）の調製物に含まれる細胞を、それに対する細胞の接着性および増殖、ならびに細胞集団の出現を可能にする支持体上に培養し；
（d）（c）の細胞を少なくとも１回継代し；
（e）（d）の継代後に得られ、「発明の概要」において同定されたマーカーに対して陽性である細胞集団を単離する。
（a）成体肝臓またはその一部を解離させて、初代肝細胞の集団を形成し；
（b）（a）の初代肝細胞の調製物を生成し；
（c）（b）の調製物に含まれる細胞を、それに対する細胞の接着性および増殖、ならびに細胞集団の出現を可能にする支持体上に培養し；
（d）（c）の細胞を少なくとも１回継代し；
（e）（d）の継代後に得られ、「発明の概要」において同定されたマーカーに対して陽性である細胞集団を単離する。
【0104】
そこから初代（一次）細胞の集団（懸濁液）を得るために肝臓またはその一部を解離するための適切な方法は、酵素消化、機械的分離、ろ過、遠心分離およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の任意の方法であり得る。
【0105】
本方法の工程（a）に関して、解離工程は、完全に分化した肝細胞と共に、肝臓前駆細胞または幹細胞を産生するために使用され得る量の初代細胞を含む、肝またはその一部を得ることを含む。
【0106】
肝臓またはその一部は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを交換可能に指す「対象」、「ドナー対象」または「ドナー」から得られる。肝臓の一部は、肝臓の任意の部分に由来する組織試料とすることができ、肝臓に存在する異なるセル型を含むことができる。本発明による細胞は、好ましくは哺乳動物の肝臓または肝臓の一部から単離され、ここで、哺乳動物という用語は、ヒト、飼育動物および家畜を含む哺乳動物、ならびに動物園、研究所、スポーツ、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギなどとして分類される任意の動物を指す。より好ましくは、肝臓前駆細胞または幹細胞は、ヒト肝またはその一部、好ましくはヒト成体肝またはその一部から単離される。成体ヒト対象の肝臓から本発明により誘導される肝臓前駆細胞もしくは幹細胞、細胞株、またはそれらの後代は、例えば、炎症、自己免疫疾患および肝疾患を含む移植片拒絶などの望ましくない免疫反応を含む障害に罹患している患者、特にヒト患者の研究および治療において有利に使用され得る。他の幹細胞源、例えば、腫瘍増殖を生じやすい胚性幹細胞とは対照的に、大人肝臓由来の幹細胞は、発癌性偏差のリスクの減少をもたらし、それらを細胞移植においてより安全に使用する。
【0107】
本発明の代替実施において、成体肝臓またはその一部は、非ヒト動物対象、好ましくは非ヒト哺乳動物対象由来であってもよい。非ヒト動物もしくは非ヒト哺乳動物対象の肝臓から本明細書に記載されるように誘導される前駆体もしくは幹細胞もしくは幹細胞株、またはその子孫は、例えば、同じ、関連するもしくは他の非ヒト動物もしくは非ヒト哺乳動物種のメンバーにおける肝疾患の研究および治療において、または肝疾患に罹患しているヒト患者の治療においてさえ、有利に使用され得る（例えば、異種移植、非ヒト動物もしくは非ヒト哺乳動物細胞を含む生物人工肝臓装置）。限定ではなく例示によって、ヒト治療に使用するのに特に適切な非ヒト哺乳動物細胞は、ブタに由来することができる。
【0108】
ドナー対象は、例えば、「心肺」基準（通常、循環および呼吸機能の不可逆的停止を含む）または「脳死」基準（通常、脳幹を含む脳全体のすべての機能の不可逆的停止を含む）のような当業者受け入れられた基準によって決定されるように、生きているかまたは死んでいてもよい。ハーベスティング（収集）は、例えば、生検、切除または切除などの、当技術分野で公知の手順を含むことができる。
【0109】
当業者は、ドナー対象から肝臓またはその一部を採取する少なくともいくつかの態様が、それぞれの法的および倫理的規範に従うことができることを理解するであろう。限定ではなく例として、ヒト生体ドナーからの肝組織の採取は、ドナーのさらなる生命の維持と両立する必要がある。したがって、肝臓の一部のみが、例えば、生検または切除を用いて、生きたヒトドナーから除去され得、その結果、ドナーにおいて十分なレベルの生理学的肝機能が維持される。一方、非ヒト動物からの肝臓またはその一部の採取は、非ヒト動物のさらなる生存と両立する必要はない。例えば、非ヒト動物は、組織を採取した後に、人道的に殺処分することができる。これらおよび類似の考慮事項は、当業者に明らかであり、法的および倫理的基準を反映する。
【0110】
肝臓またはその一部は、持続的循環、例えば、拍動性心臓、および持続的呼吸機能、例えば、呼吸肺または人工換気を有するドナー、好ましくはヒトドナーから得ることができる。倫理的および法的規範に従うことを条件として、ドナーは、脳死である必要があるか、または脳死である必要がないかもしれない（例えば、ヒトドナーのさらなる生存と適合しないであろう、肝臓全体またはその一部の除去は、脳死のヒトにおいて許容され得る）。このようなドナーからの肝臓またはその一部の採取は、組織が実質的な酸素欠乏症（酸素化の欠如）を被らないので、有利であり、これは通常、虚血（循環の停止）に起因する。
【0111】
あるいは、肝臓またはその一部は、ドナー、好ましくはヒトドナーから得ることができ、ドナーは、組織を採取する際に、循環を停止した、例えば、拍動しない心臓を有し、および／または呼吸機能を停止した、例えば、非呼吸肺を有し、人工換気を有していない。これらのドナー由来の肝臓またはその一部は、少なくともある程度の酸素欠乏症に罹患している可能性があるが、生存可能な前駆細胞または幹細胞も、そのような組織から単離することができる。肝臓またはその一部は、ドナーの循環（例えば、心拍）が停止してから約２４時間以内、例えば約２０時間以内、例えば約１６時間以内、より好ましくは約１２時間以内、例えば約８時間以内、さらにより好ましくは約６時間以内、例えば約５時間以内、約４時間以内または約３時間以内、さらにより好ましくは約２時間以内、最も好ましくは約１時間以内、例えばドナーの循環（例えば、心拍）が停止してから約４５、３０または１５分以内に収穫され得る。
【0112】
採取された組織は、約室温まで、または室温より低い温度まで冷却され得るが、通常、組織またはその一部の凍結は回避され、特に、上記凍結が核生成または氷結晶成長をもたらす場合には、回避される。例えば、組織は、約１℃から室温の間、約２℃から室温の間、約３℃から室温の間、または約４℃から室温の間の任意の温度に保持することができ、約４℃に保持することが有利である。組織はまた、当技術分野で公知のように「氷上」に保持されてもよい。組織は、虚血時間の全部または一部、すなわち、ドナーにおける循環停止後の時間の間、冷却され得る。すなわち、組織は、温虚血、冷虚血、または温虚血と冷虚血の組合せをに供されることができる。回収された組織は、処理前、例えば４８時間まで、好ましくは２４時間未満、例えば１６時間未満、より好ましくは１２時間未満、例えば１０時間未満、６時間未満、３時間未満、２時間未満または１時間未満の間、そのように保持され得る。
【0113】
採取された組織は、有利には、組織をさらに処理する前に、例えば、適切な媒体中に完全にまたは少なくとも部分的に浸漬して保持する必要はなく、および／または適切な媒体で潅流する必要はない。当業者は、処理前の期間中、組織の細胞の生存を支持することができる適切な培地を選択することができる。
【0114】
肝臓または肝臓の一部からの前駆細胞または幹細胞の単離は、当該技術分野で公知の方法に従って、例えば、EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393またはEP 3 423 566（実施例１参照）に記載されているように実施される。
【0115】
簡単に述べると、肝臓初代細胞の集団は、まず、肝臓またはその一部の解離から得られ、該肝臓またはその一部から初代細胞の集団を形成する。続いて、この調製物に含まれる細胞は、好ましくは支持体上への細胞の密着性および増殖を可能にするように、密着性条件下で培養される。次に、これらの細胞を少なくとも１回、好ましくは７０％コンフルエントで継代する。最後に、少なくとも１つの肝マーカーおよび少なくとも１つの間葉系マーカーに対して陽性であり、少なくとも１つの肝特異的活性を有する細胞を単離する。
【0116】
本方法の工程（b）に関して、肝臓またはその一部を解離することによって本明細書で定義されるおよび得られる初代細胞の集団は、典型的には不均一であり得、すなわち、肝実質および／または肝非実質分画中に存在し得る、前駆細胞または幹細胞を含む、任意の肝臓構成細胞タイプに属する１つまたは複数の細胞タイプに属する細胞を含み得る。例示的な肝臓構成細胞タイプは、肝細胞、胆管細胞（胆管細胞）、クッパー細胞、肝星細胞（伊東細胞）、楕円形細胞および肝臓内皮細胞を含むが、これらに限定されない。上記の用語は、当技術分野で確立された意味を有し、本明細書では、そのように分類される任意の細胞タイプを包含するものとして広く解釈される。
【0117】
一次細胞集団は、物性（寸法、モルフォロジー）、生存率、細胞培養条件、または細胞表面マーカー発現に基づいて、肝細胞および／または他の細胞タイプのための初期調製物を、任意の適切な技術を適用することによって分画または濃縮するための任意の方法に従って、異なる割合（総細胞の０．１％、１％、１０％、またはそれ以上）で肝細胞を含むことができる。
【0118】
肝臓（またはその一部）を解離することによって本明細書で定義および得られる一次（初代）細胞集団は、細胞培養物を新鮮な一次肝細胞として確立するために直ちに使用することができ、または好ましくは、それらの長期保存のための共通技術を用いて一次肝細胞の凍結保存調製物として保存することができる。
【0119】
工程（c）に関して、工程（b）で得られた肝臓初代細胞の調製物を、次いで、完全合成支持体（例えば、プラスチックまたは任意のポリマー物質）、またはフィーダー細胞、タンパク質抽出物、または類似の初代細胞の密着性および増殖を可能にする生物由来の任意の他の材料でプレコートされた合成支持体上で直接培養し、所望のマーカーを有する成体肝臓前駆細胞または幹細胞の集団の出現を可能にし、かかるマーカーは、免疫組織化学、フローサイトメトリー、または他の抗体に基づく技術によって、好ましくはタンパク質レベルで同定される。一次細胞は、それらの密着性、増殖、および均質な細胞集団の出現を維持する細胞培養培地中で培養される。上述のように初代肝細胞を培養するこの工程は、培養中の肝臓前駆細胞または幹細胞出現および増殖につながり、肝臓前駆細胞または幹細胞が十分に増殖するまで継続することができる。例えば、培養は、細胞集団がある程度のコンフルエント（例えば、少なくとも５０％、７０％、８０％または少なくとも９０％以上のコンフルエント）を達成するまで継続することができる。
【0120】
工程（c）で得られた肝臓前駆細胞または幹細胞は、欧州特許第3 140 393号または欧州特許第3 423 566号に記載されているように、この段階で既に（すなわち、工程（d）で示されているように細胞を継代する前に）関連マーカーを検出することを可能にする技術によってさらに特徴付けることができる。このようなマーカーを同定し、それらを陽性または陰性として測定するために使用される技術の中で、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、およびELISAが好ましい。なぜなら、これらは、この段階で利用可能な低量の肝臓前駆細胞または幹細胞でさえ、タンパク質レベルでマーカー検出を可能にするからである。
【0121】
次いで、陽性マーカーの存在に基づいて、肝臓前駆細胞または幹細胞の単離を行うことができ、肝臓前駆細胞または幹細胞は、少なくとも１つの間葉系マーカーに対して陽性である。間葉系マーカーには、ビメンチン、CD１３、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびCD１４０－bが含まれるが、これらに限定されない。さらに、肝臓前駆細胞は、HGFおよび／またはPGE２を分泌し得る。さらに、これらは、任意に、少なくとも１つの肝臓マーカーに対して陽性であり、および／または少なくとも１つの肝臓特異的活性を示すことができる。例えば、肝マーカーには、HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４およびα－１アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されず、アルブミン（ALB）も含まれ得る。肝臓特異的活性には、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１－アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性が含まれるが、これらに限定されない。
【0122】
特定の実施態様において、肝臓前駆細胞または幹細胞の単離は、ビメンチン、CD１３、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびCD１４０－bから選択される陽性間葉系マーカーの存在に基づき、また、任意にHGFおよび／またはPGE２の分泌に基づいて行うことができる。
【0123】
一実施形態では、次いで、肝臓前駆細胞または幹細胞の単離は、陽性マーカーの存在に基づいて行うことができ、肝臓前駆細胞または幹細胞は、少なくとも１つの肝臓マーカーおよび少なくとも１つの間葉系マーカーに対して陽性であり、少なくとも１つの肝特異的活性を有する。例えば、肝臓マーカーには、アルブミン（ALB）、HNF－３B、HNF－４、CYP１A２、CYP２C９、CYP２E１、CYP３A４およびα－１アンチトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。間葉系マーカーには、ビメンチン、CD１３、CD９０、CD７３、CD４４、CD２９、α－平滑筋アクチン（ASMA）およびCD１４０bが含まれるが、これらに限定されない。肝臓特異的活性には、尿素分泌、ビリルビン抱合、α－１アンチトリプシン分泌およびCYP３A４活性が含まれるが、これらに限定されない。
【0124】
本方法の工程（d）に関して、初代細胞は、少なくとも１回の継代後に、肝臓前駆細胞または幹細胞が次第に濃縮される均質な細胞集団の出現、ならびにそれらの密着性および増殖を維持する細胞培養培地中で培養される。これらの肝臓前駆細胞または幹細胞は、所望の特性（EP 3 140 393またはEP 3 423 566に記載されているように）を有する子孫を得るための十分な細胞を得るために、４８～７２時間以内に得ることができる細胞倍増、および少なくとも２、３、４、５またはそれ以上の継代の間、所望の特性を有する肝臓前駆細胞または幹細胞の維持を伴って、急速に増殖させることができる。
【0125】
単離された肝臓前駆細胞または幹細胞は、それに対する細胞の接着性を可能にする基材上にプレーティングされ、それらのさらなる増殖を維持する培地、一般的には、血清を含有するか、または無血清であり得る液体培養培地中で培養される。一般に、細胞の密着性を可能にする基質は、任意の実質的に親水性の基質であってもよい。付着細胞を増殖させるための現在の標準的な実施は、ウシ、ヒトまたは他の動物血清の添加を伴うまたは伴わない、定義された化学媒体の使用を含むことができる。これらの培地は、有機化合物または無機化合物の適切な混合物を補足することができ、栄養素および／または成長促進剤を提供する以外に、特定の細胞タイプの増殖／付着または除去／剥離を促進することもできる。添加された血清は、栄養素および／または成長促進剤を提供することに加えて、処理されたプラスチック表面を、細胞がより良好に接着し得るマトリックスの層で被覆することによって、細胞接着を促進し得る。当業者には理解されるように、細胞は、所望の密度での細胞のその後のプレーティング（播種）を容易にするために計数され得る。
【0126】
細胞が平板培養される環境は、本発明の方法において、単離された肝臓前駆細胞の生存および／または成長を支持する、典型的には液体培地である、少なくとも細胞培地を含むことができる。液体培養培地は、細胞の導入前、導入とともに、または、導入後にシステムに添加されてもよい。
【0127】
典型的には、培地は、当技術分野で公知の基本培地配合を含むであろう。多くの基礎培地配合は、本明細書において、初代細胞を培養するために使用することができ、限定されるものではないが、イーグル最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、アルファ改変最小必須培地（α-MEM）、Basal Medium Essential（BME）、Iscove's改変ダルベッコ培地（IMDM）、BGJb培地、F-12 Nutrient Mixture（Ham）、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、必須改変イーグル培地（EMEM）、RPMI-1640、Medium 199、Waymouth's MB 752/1または、Williams Medium E、並びに、改変および／またはその組み合わせを含む。上記基礎培地の組成物は、当業者には一般的に知られており、培養された細胞に必要に応じて培地および／または培地サプリメントの濃度を改変または調節することは当業者の範囲内である。好ましい基礎培地配合は、成体肝細胞のin vitro培養を維持することが報告されており、それらの適切な成長、増殖、所望のマーカーおよび／または生物学的活性の維持、または長期保存のための増殖因子の混合物を含む、市販されているウィリアムズ培地E、IMDMまたはDMEMなどのものの１つであり得る。別の好ましい培地は、例えば、Miltenyi社のStemMacs（商標）、FUJIFILM Irvine Scientific社のPrime-XVまたはDMEM10% FBS（Gibco）などの肝臓前駆細胞または幹細胞の成長を支持する市販の無血清培地である。
【0128】
このような基礎培地配合は、それ自体公知の哺乳動物細胞の成長に必要な成分を含有する。限定ではなく例示として、これらの成分には、無機塩（特に、Na、K、Mg、Ca、Cl、Pおよび場合によってはCu、Fe、SeおよびZnを含有する塩）、生理学的緩衝液（例えば、HEPES、重炭酸塩）、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび／または核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、酸化防止（例えば、グルタチオン）および炭素源（例えば、グルコース、ピルビン酸塩、例えば、ピルビン酸ナトリウム、酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウム）などが含まれ得る。ピルビン酸ナトリウムの有無にかかわらず、低グルコース配合物として多くの培地が利用可能であることも明らかであろう。
【0129】
培養に使用するために、基礎培地には、１つ以上のさらなる成分を供給することができる。例えば、追加のサプリメントを用いて、最適な成長および増殖のために必要な微量元素および物質を細胞に供給することができる。そのようなサプリメントには、インスリン、トランスフェリン、セレン塩、および上記の組合せが含まれる。これらの成分は、限定するものではないが、Hanks’平衡塩溶液（HBSS）、Earle’s塩溶液のような塩溶液中に含まれ得る。さらなる抗酸化サプリメント、例えば、β－メルカプトエタノールを添加してもよい。多くの基礎培地はすでにアミノ酸を含有しているが、いくつかのアミノ酸、例えば、溶液中では安定性が低いことが知られているL－グルタミンを後で補充することができる。培地には、典型的には、ペニシリンとストレプトマイシンの混合物、および／または他の化合物、例示されるがこれらに限定されない、アムホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、およびゼオシンの混合物などの抗生物質および／または抗真菌性化合物をさらに供給することができるが、他に限定されない。
【0130】
ホルモンはまた、細胞培養において有利に使用することができ、これらに限定されないが、D－アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（DES）、デキサメタゾン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（HGH）、チロトロピン、チロキシン、L－チロニン、上皮成長因子（EGF）および肝細胞成長因子（HGF）を含む。肝細胞は、トリヨードチロニン、α－トコフェロールアセテート、およびグルカゴンとの培養からも利益を得ることができる。
【0131】
脂質および脂質担体もまた、細胞培養培地を補充するために使用することができる。上記脂質および担体には、特に限定されないが、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミンに結合したリノール酸、アルブミンに結合したリノール酸およびオレイン酸、非結合リノール酸、アルブミンに結合したリノール－オレイン－アラキドン酸、アルブミンに結合したオレイン酸、アルブミンに非結合のオレイン酸が含まれ得る。アルブミンは、脂肪酸を含まない製剤でも同様に使用することができる。
【0132】
細胞培養培地に哺乳動物の血漿または血清を添加することも考えられる。血漿または血清はしばしば、生存能および増殖に必要な細胞因子および成分を含む。適切な血清置換の使用もまた、考えられる。本明細書に上記の培地に使用するための適切な血漿または血清は、ヒト血漿または血清；または非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類（例えば、キツネザル、サル、類人猿）、胎児または成牛、ウマ、ブタ、ラム、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウスまたはラットの血清または血漿などに由来する血漿または血清を含むことができる。別の実施形態では、上記血漿および／または血清の任意の組み合わせを、細胞培地中で使用することができる。
【0133】
継代培養されると、培養された細胞は、分離され、培養基質から、および互いに解離される。細胞の分離および解離は、当技術分野で一般的に知られているように、例えば、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、例えば、I型、II型、III型またはIV型、ディスパーゼ、プロナーゼ、パパインなどから選択される）による酵素処理、二価イオンキレート化剤（例えば、EDTAまたはEGTA）による処理、または機械的処理（例えば、小口径ピペットまたはピペットチップを通した反復ピペッティング）、またはこれらの処理の任意の組合せによって行うことができる。
【0134】
細胞の剥離および分散の適切な方法は、培養中の細胞の大部分を保存しながら、所望の程度の細胞の剥離および分散を確実にするべきである。好ましくは、培養細胞の剥離および解離は、単一の生存細胞（例えば、細胞の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）としてかなりの割合の細胞を生じるであろう。残りの細胞は、それぞれが比較的少数の細胞（例えば、平均して、１～１００個の細胞）を含有する細胞クラスター中に存在してもよい。
【0135】
次に、そのように分離され解離された細胞（典型的には、等張緩衝液または培地中の細胞懸濁液として）を、それへの細胞の密着性を可能にする基材上に再めっきし、その後、HALPCおよびHALPC後代のさらなる増殖を維持する上記のような培地中で培養することができる。次いで、これらの細胞を、１０～１０5細胞／cm2の間の密度で、そして約１／１６～１／２の間、好ましくは約１／８～１／２の間、より好ましくは約１／４～１／２の間のスプリット比（分離比）で、再プレーティングすることによって培養することができる。スプリット比は、細胞が得られた容器と同じ表面積の空の（典型的には新しい）培養容器に播種される継代細胞の分画を示す。培養容器の種類、ならびに培養容器および細胞培養培地への細胞接着を可能にする表面は、最初に使用されたものと同じであり得、上記のものであり得るか、または異なっていてもよい。好ましくは、細胞は、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲン）またはGMP条件下で許容される合成ペプチドでコーティングされた、CellBindまたは任意の他の適切な支持体上に維持される。
【0136】
上記工程（e）に関して、HALPCの集団の単離は、列挙されたマーカーに対して陽性である細胞に適用され、上記工程（c）でHALPCを最初に同定するための基準をさらに検証するが、継代培養後に利用可能な細胞の量が多くなれば、より容易に確立することができる。
【0137】
本発明は、同様に、上記の使用のためにヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地に関する。細胞培養物から採取された培地（通常、コンディショニング培地として知られる）のような細胞に加えて、内皮細胞の密着結合および接着結合の集合を促進することが示された。
【0138】
特に好ましい態様において、本発明の前記馴化培地は無細胞である。無細胞性は、ろ過、酵素消化、遠心分離、吸収、および／またはクロマトグラフィーによる分離、またはそのような方法の繰り返しおよび／または組合せなどの当技術分野における通常の方法によって得ることができる。前記馴化培地は、可溶性蛋白、微小胞およびエキソソームをさらに含む。
【0139】
上記の肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる馴化培地は、可溶性タンパク質、とりわけ、増殖因子、ケモカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ、およびその存在が有用な生物学的活性を提供することができる前炎症性および抗炎症性サイトカインを含むことが見出された。これらの成分は培地中の細胞によって分泌されると推定される。
【0140】
１つの実施形態において、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞は、それに対する細胞の密着性を可能にする基材上にプレーティングされ、それらのさらなる増殖を維持する培地、一般的には血清を含有するか、または無血清であり得る液体培養培地中で培養される。一般に、細胞の密着性を可能にする基質は、任意の実質的に親水性の基質であってもよい。接着細胞を増殖させるための現在の標準的な実施は、ウシ、ヒトまたは他の動物血清の添加を伴うまたは伴わない、定義された化学媒体の使用を含むことができる。特に好ましい実施形態において、かかる培養培地は血清を含む。これらの培地は、有機化合物または無機化合物の適切な混合物を補足することができ、栄養素および／または成長促進剤を提供する以外に、特定の細胞型の増殖／接着または除去／剥離を促進することもできる。添加された血清は、栄養素および／または成長促進剤を提供することに加えて、処理されたプラスチック表面を、細胞がより良好に接着し得るマトリックスの層で被覆することによって、細胞接着を促進し得る。当業者には理解されるように、細胞は、所望の密度での細胞のその後のプレーティングを容易にするために計数され得る。別の特に好ましい実施形態において、かかる培養培地は無血清である。
【0141】
本明細書に教示する無細胞の馴化培地を製造するための方法は、上記方法のいずれかによってヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を得る工程、細胞培養培地中でヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を培養する工程、およびヒト肝臓前駆細胞または幹細胞から培養培地を分離する工程を含むことができる。
【0142】
細胞が平板培養される環境は、本発明の方法において、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞の生存および／または成長を支持する、典型的には液体培地を少なくとも細胞培地で含むことができる。液体培養培地は、細胞の導入前、導入とともに、導入後にシステムに添加されてもよい。好ましい媒体配合は、上記に記載されている。
【0143】
前記方法は、無血清培地である細胞培養培地を用いて、細胞培養の特定の条件を改変することにより、および／または所定の時点（例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２４時間）でヒト肝臓前駆細胞または幹細胞を培養した後、前記ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞から細胞培養培地を分離することにより行うことができる。得られた馴化培地は、馴化培地内で分解（または不安定）されるか、またはヒト肝臓前駆細胞または幹細胞により通常の方法ではなく、一定時間の前または後にのみ分泌される（したがって、馴化培地中に徐々に蓄積されない）可溶性蛋白、RNA、エキソソームおよび／または微小胞中に濃縮（または枯渇）された組成物を有する。関連する時点は、２４時間、３６時間またはそれ以上など、より短い（例えば、２時間以下）か、またはより長くすることができる。これらの時点または中間体の時点（例えば、１、２、４、６、８、１２、または１８時間）で前記馴化培地の試料を得て、その組成物および／または活性について上記試料を試験することにより、ヒト肝臓前駆細胞または幹細胞由来の所望の馴化培地を得るための最適なタイミングを決定することができる。
【0144】
１つの実施形態において、前記馴化培地は、肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる無細胞の馴化培地に由来する生成物である。前記生成物は、前記馴化培地を分画することにより得られた画分である。上記分画は、例えば、ろ過、酵素的消化、遠心分離、吸着、および／またはクロマトグラフィーによる分離など、当技術分野で公知の１つ以上の技術を適用することを含むことができる。
【0145】
本発明の馴化培地および／またはその分画は、典型的には可溶性蛋白、RNA、エキソソームおよび／または微小小胞を含有する。
【0146】
好ましい態様において、馴化培地は、肝細胞増殖因子（HGF）、インターロイキン６（IL－６）、インターロイキン８（IL－８）および血管内皮増殖因子（VEGF）の群から選択される１つ以上の成分を含む。
【0147】
さらに好ましい態様において、馴化培地および／またはその分画は、少なくとも肝細胞増殖因子（HGF）、インターロイキン６（IL－６）、インターロイキン８（IL－８）および血管内皮増殖因子（VEGF）を含む。
【0148】
特定の実施形態では、馴化培地および／またはその分画は、以下を含む：
(a)肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、エオタキシン（CCL１１）、インターロイキン－６（IL－６）、およびインターロイキン－８（IL－８）からなる群より選択される可溶性タンパク質の少なくとも１つ；および任意に
(b)マトリックスメタロプロテイナーゼ、成長因子、ケモカイン、およびサイトカインからなる群から選択される可溶性タンパク質の少なくとも1つ。
(a)肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、エオタキシン（CCL１１）、インターロイキン－６（IL－６）、およびインターロイキン－８（IL－８）からなる群より選択される可溶性タンパク質の少なくとも１つ；および任意に
(b)マトリックスメタロプロテイナーゼ、成長因子、ケモカイン、およびサイトカインからなる群から選択される可溶性タンパク質の少なくとも1つ。
【0149】
上記可溶性タンパク質は、好ましくは、少なくとも１ng／mlの濃度で、馴化培地中および／またはその画分中に存在し得る。特に、HGF、VEGF、CCL１１、IL－６、またはIL－８のうちの１つ以上（好ましくはすべて）は、少なくとも１ng／mlの濃度で存在し得る。
【0150】
別の実施形態では、HGF、VEGF、CCL１１、IL－６、およびIL－８からなる群から選択される１つ以上の可溶性タンパク質が、少なくとも１ng／ml／百万細胞の濃度で、馴化培地および／またはその画分中に存在する。
【0151】
別の実施形態では、馴化培地および／またはその分画は、特徴付けられ、適切な場合、それらのサイズ（特定の実施形態では、０．４０μmより小さいサイズ）、分子量、および／または組成物に従って選択される微小胞（マイクロベシクル）を含む。
【0152】
別の実施形態およびさらなる実施形態では、馴化培地および／またはその分率は、特徴付けられるエキソソーム（特定の実施形態では、８０nmより小さいサイズ）を含み、適切な場合、そのサイズ、分子量、および／または組成に従って選択される。
【0153】
別の好ましい実施形態では、馴化培地およびその分画は、RNA、例えばmiRNAを含む。
【0154】
特に所望の濃度のかかる可溶性タンパク質、RNA、エキソソームおよび／または微小胞馴化培地および／またはその分画は、例えば、それぞれの調製物を少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍に適切に濃縮（または希釈）することによって得ることができる。したがって、特定の実施形態は、そのように濃縮された、またはそのように希釈された馴化培地および／またはその分画を提供する。
【0155】
さらに好ましい態様において、本発明は、前記馴化培地から得ることができる画分を提供し、該分画は、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、エオタキシン（CCL１１）、インターロイキン－６（IL－６）、およびインターロイキン－８（IL－８）を含み、各画分は少なくとも１ng／mlの濃度で存在する。
【0156】
別の実施形態では、前記馴化培地から得られる分画は、HGF、VEGF、CCL１１、IL－６、およびIL－８からなる群から選択される１つ以上の可溶性タンパク質を含み、各１つは、少なくとも１ng／ml／百万細胞の濃度である。
【0157】
前述のように、馴化培地および／またはその画分は、上記のような使用に適している。そのような医学的、例えば予防的または治療的使用は、馴化培地および／またはその画分を単独で、または１つもしくは複数の外因性の活性成分と組み合わせて使用することを含み得、これらは適切に添加され得る。上記外因性の活性成分の実施例としては、細胞（例えば、肝臓前駆細胞または幹細胞またはex vivoまたはin vivo適用に適した他の細胞）、タンパク質（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、ホルモン、抗原、または抗体）、栄養素（例えば、糖またはビタミン）および／または化学物質（例えば、抗菌性、抗炎症性、または抗ウイルス性を有する薬物）が挙げられ、これらは、最初は、馴化培地および／またはその画分中に存在せず、所望の表示のための医薬として有効であることが知られている。
【0158】
本発明の実施形態では、実際の細胞ではなく、上記のような細胞の細胞溶解物が使用される。前記細胞溶解物は、細胞または細胞培養物の酵素消化、界面活性剤および／または緩衝処理など、当技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。
【0159】
さらに好ましい態様において、本発明は、薬学的に有効な量の肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物および／またはコンディショニングされた細胞培地を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤はまた、所望により、上述のタイプ、例えば、細胞、タンパク質、栄養素、および／または化学物質であってもよい、１つ以上の外因性の活性成分の薬学的有効量をさらに含み得る。外因性の活性成分は、上述のタイプ、例えば、細胞、タンパク質、栄養素、および／または化学物質であってもよい。
【0160】
一部の間葉系前駆細胞および幹細胞は、臓器の機能不全を減弱させ、動物の敗血症のいくつかのモデルにおいて生存率を改善することが知られており、敗血症患者の治療のためのその使用可能性が示唆される。間葉系幹細胞は、肺、心筋、脳、肝臓、腎臓などの損傷組織への固有の移動能力を有し、炎症誘発性サイトカインの産生の減少および抗炎症性サイトカインの産生の増加を介して、局所および全身性の両方の炎症を減少させることにより、病変を改善することができる。
【0161】
予期せぬことに、前駆細胞または幹細胞を培地中で培養することによって得ることができる肝臓前駆細胞または幹細胞、細胞溶解物、および／または馴化培地が、血管透過性の増加によって引き起こされる疾患および／または状態の治療に使用するのに、または対象における炎症および／または感染後の細胞および組織の血管の完全性の回復に使用するのに有効であることが見出された。内皮関門機能の欠陥は、多くの疾患に共通する特徴である。培地中で前記細胞を培養することによって得られる肝臓前駆細胞または幹細胞、細胞溶解物または馴化培地は、末梢血管疾患、脳卒中、心疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、慢性腎不全、腫瘍増殖、転移、静脈血栓症および重度のウイルス感染症などの疾病治療に用いることができる。
【0162】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、限定されるものではないが、一連の障害および／または状態の治療（予防または治療として）に使用するために、培地中で前駆細胞または幹細胞を培養することによって得ることができる、肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物および／または馴化培地を提供する：
‐喘息、急性肺障害、人工呼吸器による肺障害、その他肺水腫に至る条件等の肺疾患（成体呼吸窮迫症候群を除く）；
‐虚血性疾患、通常、心筋梗塞および臓器移植後に観察される、例えば、
虚血再灌流傷害や、血液供給が以前の虚血領域に戻った後の組織損傷を指すその他の障害；
‐糖尿病および眼（網膜）疾患のほか、網膜症、心筋症、腎症、脳および末梢血管疾患として現れる、複数の臓器に影響を及ぼす一連の合併症；
‐微小循環機能異常と内皮バリア障害に関連する疾患・障害；
‐癌、特に肉腫、癌腫および内皮機能不全のような固形腫瘍；および癌関連微小循環障害；
‐心筋病理、心筋梗塞、心筋浮腫、虚血性心疾患などの心疾患；
‐クラークソン病；および
‐敗血症および敗血症誘発性疾患、例えば敗血症誘発性心筋浮腫、敗血症誘発性腎不全および肺敗血症。
‐喘息、急性肺障害、人工呼吸器による肺障害、その他肺水腫に至る条件等の肺疾患（成体呼吸窮迫症候群を除く）；
‐虚血性疾患、通常、心筋梗塞および臓器移植後に観察される、例えば、
虚血再灌流傷害や、血液供給が以前の虚血領域に戻った後の組織損傷を指すその他の障害；
‐糖尿病および眼（網膜）疾患のほか、網膜症、心筋症、腎症、脳および末梢血管疾患として現れる、複数の臓器に影響を及ぼす一連の合併症；
‐微小循環機能異常と内皮バリア障害に関連する疾患・障害；
‐癌、特に肉腫、癌腫および内皮機能不全のような固形腫瘍；および癌関連微小循環障害；
‐心筋病理、心筋梗塞、心筋浮腫、虚血性心疾患などの心疾患；
‐クラークソン病；および
‐敗血症および敗血症誘発性疾患、例えば敗血症誘発性心筋浮腫、敗血症誘発性腎不全および肺敗血症。
【0163】
したがって、本発明の細胞、その溶解物および／または馴化培地は、心疾患、肺疾患、虚血性疾患、糖尿病、眼疾患、脳卒中、癌、クラークソン病および敗血症を含むがこれらに限定されない血管透過性亢進関連疾患および／または状態の治療に使用することができる。IFN－γ、TNF－αおよびIL－１βを含む炎症誘発性サイトカインのほとんどは、内皮細胞のタイトジャンクション透過性の増大を引き起こすが、一方、IL－１０およびTGF－βなどの抗炎症性サイトカインの一部は、腸管のタイトジャンクションバリアの破壊および炎症の発生から保護することが示されている。
【0164】
培地中で前記細胞を培養することによって得られる肝臓前駆細胞または幹細胞、細胞溶解物および／または馴化培地は、対象におけるクラークソン病の治療に適している。
【0165】
培地中で前記細胞を培養することによって得られる肝臓前駆細胞または幹細胞、細胞溶解物および／または馴化培地は、対象における炎症および／または感染によって引き起こされる血管透過性亢進の治療に特に適している。
【0166】
好ましい態様において、前記肝臓前駆細胞または幹細胞、細胞溶解物および／または前記細胞を培地中で培養することによって得られる馴化培地は、グラム陽性菌(Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、Bacillus cereus)またはグラム陰性菌(Pseudomonas aeruginosa)誘導血管透過性増加、好ましくはグラム陰性菌誘導血管透過性増加、最も好ましくはリポ多糖誘導血管透過性増加のいずれかの感染誘導血管透過性増加の治療に特に適している。
【0167】
上記のように、肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または前記培地中で前記細胞を培養することによって得られた馴化培地の血管完全性回復特性により、対象、例えば、ヒト患者に投与して、血管透過性の増加によって影響を受ける組織、器官および／またはその器官系を保護することができる。
【0168】
これは、対象の微生物感染、特に対象のバクテリア感染の間、特に有利である。特に好ましい態様において、肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または前記培地中で前記細胞を培養することによって得られる馴化培地は、対象における敗血症または敗血症誘発性疾患の治療に特に適している。特に、対象における敗血症誘発性疾患は、敗血症誘発性心筋浮腫、敗血症誘発性急性腎損傷、または肺敗血症であり得る。
【0169】
敗血症は感染によって引き起こされ、病原体と宿主免疫細胞との複雑な相互作用が関与する。このような状態は、全身性の炎症状態を特徴とする。免疫応答の役割は、感染と闘うために極めて重要である；しかし、それはまた、敗血症の特徴である炎症性組織浸潤および重度の臓器損傷の原因でもある。エビデンスから、炎症誘発性および抗炎症性因子の変調が免疫エフェクター細胞の抑制に寄与し、全身性炎症を誘発し、敗血症中に組織損傷を引き起こすことが示唆されている。肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または前記培地中で前記細胞を培養することによって得られる馴化培地は、自然免疫応答および適応免疫応答の両方を調節する能力を有する免疫応答の強力なモジュレーターであることが予想外に見出される。
【0170】
肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または前記培地中で前記細胞を培養することによって得られた馴化培地は、カスケードにおいて、なかでも、AMP活性化プロテインキナーゼシグナル伝達を活性化する抗透過性因子の分泌を介して、内皮の完全性に対する保護機能を発揮することが見出されている。
【0171】
好ましい実施形態において、血管内皮に対する機能的完全性に有益な影響を及ぼす前記抗透過性因子は、線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリー、アンギオポイエチン－１、スフィンゴシン－１－リン酸（S１P）、TGF－β、PDGF、HGF、TIMP１、およびTIMP２を含む群から選択される少なくとも因子である。
【0172】
一実施形態によると、本発明の馴化培地は、FGFファミリー、アンギオポイエチン－１、スフィンゴシン－１－リン酸、TGF－β、HGF、TIMP１、およびTIMP２の群からの少なくとも１つの成分を含む。
【0173】
別の実施形態では、本発明の馴化培地は、スフィンゴシン－１－リン酸、TGF－β１、HGFおよびTIMP２から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【0174】
さらに好ましい態様において、本発明の馴化培地は、少なくともスフィンゴシン－１－リン酸（S１P）を含む。
【0175】
本発明はまた、スフィンゴシン－１－ホスフェートの少なくとも３０ng／百万総細胞、好ましくは少なくとも５０ng／百万総細胞、少なくとも１００ng／百万総細胞、少なくとも１５０ng／百万総細胞、少なくとも２００ng／百万総細胞、少なくとも２５０ng／百万総細胞または少なくとも３００ng／百万総細胞を含む、ヒト肝臓前駆細胞の培養から得られた馴化培地に関する。一実施形態では、上記または下記の実施形態のいずれかに記載されているように、馴化培地が得られる。
【0176】
敗血症は一般的に、リンパ球のアポトーシスと院内感染に対する感受性を特徴とする免疫抑制状態に至る。しかしながら、臨床医は、進行性の皮下浮腫および体腔浮腫が敗血症患者に典型的に発現することも知っており、血管透過性の広範な亢進が示唆される。実質および間質液の集積は、酸素の拡散に必要な距離を増加させること、および間質圧の増加のために微小血管潅流を損なうことにより、臓器機能を損なう可能性のある重度の組織浮腫をもたらす。サイトカインや他の炎症性メディエーターは、細胞間結合の解離によって、細胞骨格構造の変化によって、あるいは細胞単層を直接傷害することによって、内皮細胞間のギャップを誘導する。敗血症からの回復は、浮腫の減少を伴う自然利尿として現れ、血管の完全性の回復と一致する。
【0177】
肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または前記培地中で前記細胞を培養することによって得られた馴化培地が、内皮細胞の壁に存在する４種類の細胞接合部の集合を促進することができることが予想外に見出された。細胞結合は構造と機能の両方が異なり、１）密着結合、２）接着結合、３）GAP結合、４）シンデスモス（syndesmos）である。したがって、本発明の細胞、その溶解物、および／または馴化培地は、４つのタイプの細胞ジャンクションのいずれかの障害および機能不全の結果である、血管透過性の処理および正常な血管透過性の回復に特に有効である。
【0178】
別の実施形態では、前記培地中で前記細胞を培養して得られた肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物または馴化培地は、敗血症状態の血液、脾臓、腹腔液などに存在する細菌コロニー形成単位（CFU）の数を減少させることによって抗細菌活性を発揮する。
【0179】
別の実施形態では、肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記細胞を培地中で培養することによって得られた馴化培地を、腫瘍関連異常血管系、特に固形腫瘍関連異常血管系の治療に使用することができる。固形腫瘍は、癌細胞、間質細胞、免疫細胞、血液・リンパ管から構成され、すべてマトリックスに埋め込まれた、自身の「臓器」として概念化され得る。大部分の腫瘍は非常に血管に富むことが数十年にわたって認識されてきた。一方、固形腫瘍は、血流障害、炎症細胞浸潤および腫瘍細胞血管外漏出を示す、組織を乱す漏出性血管網の成長を促進する因子を放出することが知られている。
【0180】
肝臓前駆細胞または幹細胞および／またはその溶解物、および／または本発明の前記細胞を培養することによって得られる馴化培地は、生理的循環の回復および浮腫の減少が患者の生存のための重要な因子である敗血症および敗血症誘発性疾患に特に適している。
【0181】
肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または前記細胞を培地中で培養することによって得られた馴化培地は、本発明の範囲から逸脱することなく、哺乳動物、より好ましくはヒト、または代替的に適切な医薬組成物の一部として、必要とする対象に投与することができることを理解されたい。本発明の一実施形態において、肝臓前駆細胞または幹細胞、その細胞溶解物、および／または馴化培地は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物として投与される。薬学的に許容される担体または希釈剤は、本発明の細胞が生存可能なままであり、それらの血管修復および免疫調節特性を保持するように選択される。担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する薬学的に許容される溶媒または分散媒体であり得る。したがって、本発明は、単離された肝臓前駆細胞または幹細胞および／または細胞溶解物および／または馴化培地を含む医薬組成物を開示する。好ましくは、本発明の単離された肝臓前駆細胞を含む組成物は、少なくとも１０3個の、１０6個の、１０9個のまたはそれ以上の細胞（例えば、各用量または投与ごとに、５００万～５億個または５００万～２億５０００万個または５０００万～５億個または５０００万～２億５０００万個または１億～５億個または１億～２億５０００万個の細胞）を含むことができる。そのような細胞ベースの組成物は、さらなる治療、診断、または任意の他の有用な効果を提供し得る、生物学的（例えば、抗体または増殖因子）または化学的起源（例えば、薬物、細胞保存または標識化合物）の他の薬剤を含んでもよい。文献は、さらなる比緩衝液、成長因子、またはアジュバントを含み得る細胞ベースの医薬組成物と適合性である任意の添加剤、賦形剤、ビヒクル、および／または担体のいくつかの例を提供し、ここで、組成物の各成分の量は、（マイクログラム／ミリグラム、体積、または百分率で）定義され、ならびにそれらを肝臓前駆細胞と組み合わせる手段を提供する。
【0182】
本発明の前駆細胞または幹細胞の治療的使用に関する問題は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。投与のための用量は可変であってもよく、初回投与後にその後の投与を含んでもよく、本開示を熟練した当業者によって確認することができる。典型的には、投与された用量（単回）または用量（複数回）は、治療的に有効な量の細胞、すなわち、所望の局所的または全身的効果および性能を達成する細胞を提供するであろう。さらに、当業者は、対象に投与される本発明の医薬組成物中の任意の添加剤、ビヒクル、および／または担体を容易に決定することができる。
【0183】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、生体内投与（ヒトまたは動物モデルにおいて）のための治療方法において、または単離された肝前駆細胞もしくは幹細胞、その溶解物、および／またはフレッシュもしくは長期保存に適した製剤（例えば、凍結保存細胞）としての馴化培地を含む組成物の形態でのインビトロ適用のための医薬組成物として提供することができる。これらの医薬組成物は、HALPCを所望の治療方法、選択された投与経路、および／または貯蔵に適切な液体担体（例えば、細胞培養培地または緩衝液）と任意に組み合わせたHALPC生成物として、ならびに上記医薬組成物を提供するための好ましい手段（例えば、キット内）として提供することができる。任意の他の有用な効果をもたらし得る生物学的（例えば、抗体または増殖因子）または化学的起源（例えば、薬物、保存または標識化合物）の他の薬剤も、そのような組成物中で組み合わせることができる。
【0184】
例えば、細胞は、単離手順後または凍結保存後に解凍した後に、任意の保存培地中の細胞懸濁液として提供され得る。一例として、細胞懸濁液は、必要に応じて患者と生理学的に両立であるpH調整剤および／またはヒト血清アルブミンのような賦形剤を含む、無菌水溶液のような無菌希釈剤で調製することができる。
【0185】
滅菌注射溶液は、本発明を実施する際に利用される細胞を、必要量の適当な溶媒中に、必要に応じて、種々の量の他の成分と共に組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、さらに、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合することができる。組成物は、投与経路および所望の調製に応じて、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化剤または粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。
【0186】
別のまたはさらなる実施形態では、本発明の組成物は、細胞の懸濁液、スポンジまたは他の三次元構造として提供することができ、ここで、細胞は、生体人工肝臓装置、天然もしくは合成マトリックス、または適切な位置（細胞のホーミング（homing）および生着を助けるケモカインを発現する炎症または組織傷害の領域を含む）における細胞の生着および機能性を可能にする他のシステムを含む、インビトロおよび／またはインビボで増殖および分化することができる。特に、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または馴化培地を含む組成物は、射出（カテーテル投与、静脈内または動脈内にも包含する）または移植、例えば、局所射出、全身射出、脾臓内射出、関節内射出、腹腔内射出、門脈内射出、肝臓パルプへの射出、例えば、肝臓カプセルの下、非経口投与、または胚もしくは胎児への子宮内射出を介して投与することができる。
【0187】
肝臓前駆細胞または幹細胞、その溶解物、および／または馴化培地は、内皮バリアを支持し、血管内皮の機能的完全性に有益な潜在的効果を提供する対象において、関心のある組織、好ましくは、血管透過性の増加を特徴とする組織および／または器官に投与することができる。
【0188】
前述の実施形態のいずれにおいても、肝臓前駆細胞または幹細胞を含む組成物は、無菌液体の形態で患者に投与され得る。
【0189】
前記無菌液体は、例えば、解凍された濃縮肝臓前駆細胞または幹細胞懸濁液を無菌の希釈液、例えば、必要に応じてpH調整剤および／またはヒト血清アルブミンのような賦形剤を含む無菌水溶液で希釈することによって調製される、肝臓前駆細胞または幹細胞の再構成懸濁液から調製され得る。
【0190】
本発明は、本発明をさらに説明する以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、解釈すべきでもない。
。
実施例
。
実施例
【0191】
実施例１：細胞および馴化培地の製造
細胞は、WO 2007 071 339、WO 2016 030 525、またはEP 3 423 566に記載のプロトコルに従って、３つの異なるドナーから得られた。
ヒト成体肝臓前駆細胞を、EP 3 140 393またはEP 3 423 566に記載されているように、健康な死体ドナーまたは非心拍ドナーの肝臓から単離した。
細胞は、WO 2007 071 339、WO 2016 030 525、またはEP 3 423 566に記載のプロトコルに従って、３つの異なるドナーから得られた。
ヒト成体肝臓前駆細胞を、EP 3 140 393またはEP 3 423 566に記載されているように、健康な死体ドナーまたは非心拍ドナーの肝臓から単離した。
【0192】
簡単に述べると、肝細胞調製物を、９% FBS、１０mg/ml INS、１mM DEXおよび１% P/Sを補充したWilliams E培地に再懸濁する。プライマリ細胞（一次培養細胞）は、Corning（登録商標）CellBIND（登録商標）フラスコ上で培養され、５%CO2を含む完全に湿らせた雰囲気で３７°Cで培養される。２４時間後、非付着細胞を除去するために培地を交換し、その後週２回、培養物を顕微鏡的に毎日観察する。培養培地は、１２～１６日後に、０．９% P/Sの有無にかかわらず、９%FBSを添加した高グルコースDMEMに切り替える。間葉様のモルフォロジーをとる細胞型が出現し、増殖する。７０～９５％コンフルエントに達したら、細胞を組換えトリプシンと１mM EDTAでトリプシン処理し、１～１０×１０3細胞／cm2の濃度で再平板培養する。各継代において、細胞を８０～９０％コンフルエントでトリプシン処理した。
【0193】
馴化培地は、以下のようにして得られた：継代数４または５で、細胞を洗浄し、培養培地を新鮮な培養培地(DMEM + ０．５～１０% FBS)で置き換えた。６～９６時間、一般的には２４時間インキュベーション後、上清を回収し、遠心分離により浮遊細胞およびデブリから除去し、さらなるアッセイのために保存した。分泌された蛋白質の濃度は、１０個の6細胞によって２４時間で分泌されるナノグラム（ng）またはピコグラム（pg）として表される。
【0194】
ELISAを用いて、馴化培地中の内皮透過性の潜在的可溶性メディエーターであるアンギオポイエチン‐１、スフィンゴシン‐１‐リン酸、TGF‐β１、HGFおよびTIMP２の存在を分析した。結果は以下の通りであり、データはn = ２バッチに基づいている。
【0195】
【表1】
【0196】
これらのELISAの結果は、少なくともスフィンゴシン－１－リン酸、TGF－β１、HGFおよびTIMP２が、馴化培地（コンディショニング培地）中の細胞によって分泌され、中～高濃度で存在することを示している。加えて、ELISAアッセイは、馴化培地中に分泌されたアンギオポイエチン‐１の可変かつ低存在性を示した。
【0197】
ヒト皮膚血上皮細胞（HDBEC）の細胞結合と血管透過性に対する馴化培地の効果をチェックした。実施例２、３、４および５に記載されているように、内皮間接合（IEJ）マーカーの免疫染色、透過性アッセイ、AMPKリン酸化の３つの異なるタイプの分析が行われた。
【0198】
実施例２：内皮間結合（IEJ）のモルフォロジー、IEJマーカーの免疫染色。
細胞接合研究のために、HDBEC（２×１０4細胞）をカバースリップ上に２４ウェルプレートに入れ、５% FBSを含むコンプリートEGM－２MV培地（１ml）中で、３７℃、５% CO2加湿雰囲気中、コンフルエンスまで増殖させた。あるいは、HDBEC（２×１０4細胞）を、コンプリートEGM－２MV培地と混合し、１０% FBS (５００μl）を含む馴化媒体（CM、５００μl）に２４時間曝露した。いずれの場合も、LPS（５０μg／ml）で６時間処理する前に培地を２時間、１% FBSを補充したEGM－２MVに変えた。LPS刺激後、HDBECを固定し、透過処理し、特異抗体（ZO‐１、コネキシン４３、およびVE‐カドヘリン）で免疫染色した。５‐アミノイミダゾール‐４‐カルボキサミドリボヌクレオチド（AICAR）は、陽性対照として用いられたAMPKの強力な薬理学的活性化剤である。
細胞接合研究のために、HDBEC（２×１０4細胞）をカバースリップ上に２４ウェルプレートに入れ、５% FBSを含むコンプリートEGM－２MV培地（１ml）中で、３７℃、５% CO2加湿雰囲気中、コンフルエンスまで増殖させた。あるいは、HDBEC（２×１０4細胞）を、コンプリートEGM－２MV培地と混合し、１０% FBS (５００μl）を含む馴化媒体（CM、５００μl）に２４時間曝露した。いずれの場合も、LPS（５０μg／ml）で６時間処理する前に培地を２時間、１% FBSを補充したEGM－２MVに変えた。LPS刺激後、HDBECを固定し、透過処理し、特異抗体（ZO‐１、コネキシン４３、およびVE‐カドヘリン）で免疫染色した。５‐アミノイミダゾール‐４‐カルボキサミドリボヌクレオチド（AICAR）は、陽性対照として用いられたAMPKの強力な薬理学的活性化剤である。
【0199】
スライスは、Zeiss Axio Imager顕微鏡（Zeiss、Wetzlar、Germany）を用いて蛍光下で検査した。これらの分析は、生物学的に３重に（個々の実験ごとにn＝６）で行った。
【0200】
ZO－１免疫染色（４００x）
細胞接合‐完全性は、ZO‐１免疫染色の評価によって測定した。ZO－１機構に対する本発明の馴化培地の影響を、細胞の密度、規則性、線状模様、およびギャップ形成などのパラメータの分析によって調べた。
細胞接合‐完全性は、ZO‐１免疫染色の評価によって測定した。ZO－１機構に対する本発明の馴化培地の影響を、細胞の密度、規則性、線状模様、およびギャップ形成などのパラメータの分析によって調べた。
【0201】
基礎状態（コントロール）におけるHDBECとLPS処理に供されたHDBEC(コントロール‐LPS)の比較から、LPSが細胞膜でのZO－１の線形発現パターンに予想通りイレギュラリティ（不規則性）を誘導することが確認される。これらのイレギュラリティは、細胞を本発明の馴化培地（HepaStem CM‐LPS）で処理すると減少するように見えた。これは、試験したすべてのドナーで観察されている（ドナー１、２および３について、それぞれ図２A、２Bおよび２C）。LPS刺激なし（HepaStem CM）およびLPS刺激あり（HepaStem CM‐LPS）の馴化培地による処理後のHDBECの画像は、わずかな差異を示し、本試験における本発明の馴化培地の保護的役割を確認する。
【0202】
Cx ４３ 免疫染色（２００x）
対照群（コントロール）およびLPS処理有りおよび無しの馴化培地（HepaStem CM）で処理した群において、Gapジャンクションに及ぼす本発明の馴化培地の効果を、コネキシン４３（Cx４３）免疫染色により評価した。馴化培地で処理した後の細胞および対照群の画像を、ドナー３について図３に示す。ZO－１とは対照的に、Cx４３の染色は、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得られた馴化培地によって誘導された有意な変調を示さなかった。
対照群（コントロール）およびLPS処理有りおよび無しの馴化培地（HepaStem CM）で処理した群において、Gapジャンクションに及ぼす本発明の馴化培地の効果を、コネキシン４３（Cx４３）免疫染色により評価した。馴化培地で処理した後の細胞および対照群の画像を、ドナー３について図３に示す。ZO－１とは対照的に、Cx４３の染色は、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞を培養することによって得られた馴化培地によって誘導された有意な変調を示さなかった。
【0203】
VE‐cad免疫染色（２００x）
内皮細胞の結合（ジャンクション）をVE‐カドヘリンの免疫染色によって評価した。画像は図４（２００x）に示されており、コントロールと比較したLPSチャレンジに応じて、馴化培地による相互結合の強化を強調した。前記染色は、タイトな結合に関してZO－１で観察された効果と同様に、ジャンクションの完全性の保存に対する本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞の培養によって得られた馴化培地の保護効果を大いに確認した。
内皮細胞の結合（ジャンクション）をVE‐カドヘリンの免疫染色によって評価した。画像は図４（２００x）に示されており、コントロールと比較したLPSチャレンジに応じて、馴化培地による相互結合の強化を強調した。前記染色は、タイトな結合に関してZO－１で観察された効果と同様に、ジャンクションの完全性の保存に対する本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞の培養によって得られた馴化培地の保護効果を大いに確認した。
【0204】
実施例３：内皮単層の透過性の分析
内皮透過性アッセイは、Evans Blue Dye（EBD）を用いて行った。
Transwellインサートに塗布されたHDBEC（５×１０4細胞）は、５% FBSを含む完全EGM－２MV培地（１ml）で培養されるか、または、１０% FBS (５００μl）を含む完全EGM－２MV培地と組み合わせた発明の馴化培地（CM，５００μl）に２４時間暴露される。Evans Blue Dye（EBD）をロードする２時間前に培地を１% FBSを添加したEGM－２MVに変更した。直後、細胞をLPS（５０μg／ml）で６時間処理した。
内皮透過性アッセイは、Evans Blue Dye（EBD）を用いて行った。
Transwellインサートに塗布されたHDBEC（５×１０4細胞）は、５% FBSを含む完全EGM－２MV培地（１ml）で培養されるか、または、１０% FBS (５００μl）を含む完全EGM－２MV培地と組み合わせた発明の馴化培地（CM，５００μl）に２４時間暴露される。Evans Blue Dye（EBD）をロードする２時間前に培地を１% FBSを添加したEGM－２MVに変更した。直後、細胞をLPS（５０μg／ml）で６時間処理した。
【0205】
これらの分析は、生物学的に３重に（個々の実験ごとにn＝６）で行った。
内皮透過性（浸透率）アッセイに及ぼす本発明の馴化培地の効果を図５に示す。このアッセイは、LPSチャレンジの非存在下では、非馴化培地NCM（GIBCO、培地のみ、細胞なし）とCM条件（本発明の馴化培地）との間で同様の細胞透過性を示したが、LPSチャレンジ下では、NCMと比較して、馴化培地では、細胞透過性の重要な減少が観察された。観察された効果は、LPSで前処理した真皮内皮細胞に対する本発明の馴化培地の添加によるジャンクションの内皮間構造の保護を示唆した。細胞を最初にHepaStem馴化培地と内皮細胞培地の混合物（１：１）と２４時間インキュベートし、次いで低FBSと共に１時間インキュベートし、続いてLPSと共に６時間インキュベートするので、インキュベーションの最後の７時間の間、CMはこれ以上存在しない。したがって、内皮透過性に対する観察された効果は予防／保護であり、回復ではない。
内皮透過性（浸透率）アッセイに及ぼす本発明の馴化培地の効果を図５に示す。このアッセイは、LPSチャレンジの非存在下では、非馴化培地NCM（GIBCO、培地のみ、細胞なし）とCM条件（本発明の馴化培地）との間で同様の細胞透過性を示したが、LPSチャレンジ下では、NCMと比較して、馴化培地では、細胞透過性の重要な減少が観察された。観察された効果は、LPSで前処理した真皮内皮細胞に対する本発明の馴化培地の添加によるジャンクションの内皮間構造の保護を示唆した。細胞を最初にHepaStem馴化培地と内皮細胞培地の混合物（１：１）と２４時間インキュベートし、次いで低FBSと共に１時間インキュベートし、続いてLPSと共に６時間インキュベートするので、インキュベーションの最後の７時間の間、CMはこれ以上存在しない。したがって、内皮透過性に対する観察された効果は予防／保護であり、回復ではない。
【0206】
実施例４：S１P活性を遮断する際の内皮単層の透過性
LPS誘発内皮細胞透過性に対するHepaStem馴化培地の効果を、HBDECおよびEvan Blue色素を用いたTranswellアッセイを用いてin vitroで試験し、前述のように透過性を評価した（実施例３）。スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体阻害剤（S１P３阻害剤）を用いてS１P活性をブロックする機能喪失実験を行った（n＝３HepaStemバッチ）。S１Pは、実施例１に示すように、コンディショニングされた細胞培地中の細胞によって高度に分泌される化合物である。
LPS誘発内皮細胞透過性に対するHepaStem馴化培地の効果を、HBDECおよびEvan Blue色素を用いたTranswellアッセイを用いてin vitroで試験し、前述のように透過性を評価した（実施例３）。スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体阻害剤（S１P３阻害剤）を用いてS１P活性をブロックする機能喪失実験を行った（n＝３HepaStemバッチ）。S１Pは、実施例１に示すように、コンディショニングされた細胞培地中の細胞によって高度に分泌される化合物である。
【0207】
相対的内皮細胞透過性を以下の４条件で試験した：LPS負荷の有／無下での非馴化培地（NCM）、またはLPSチャレンジの有／無下でのHepaStem馴化培地（CM）。これら４つの条件の各々は、続いて、S１P３阻害剤またはモック（CM）で治療された。
【0208】
結果は、HepaStem CM存在下でのS１P３インヒビターの添加が内皮透過性を増加させることを示し、LPS誘導透過性増加の防止におけるS１Pの関与を示した。結果を図６に示す。
【0209】
実施例５：本発明の馴化培地によるAMPK活性化の評価
HDBECを６ウェルプレート（１０5細胞／プレート）で増殖させ、５% FBSを含むEGM‐２MV培地（２ml）に曝露するか、または１０% FBS（１ml）を含む完全EGM‐２MV培地と混合した肝臓前駆細胞（CM，１ml）で得た馴化培地に２４時間曝露した。処理後、細胞をPBSで洗浄し、SDS含有緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物を４～２０％ゲル上で分離し、PVDF膜に移した。特異抗体（抗ホスホ‐ACC、抗ACC、抗eiF２α）で染色したのち、膜を、ECLを用いて現像（develop）した。
HDBECを６ウェルプレート（１０5細胞／プレート）で増殖させ、５% FBSを含むEGM‐２MV培地（２ml）に曝露するか、または１０% FBS（１ml）を含む完全EGM‐２MV培地と混合した肝臓前駆細胞（CM，１ml）で得た馴化培地に２４時間曝露した。処理後、細胞をPBSで洗浄し、SDS含有緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物を４～２０％ゲル上で分離し、PVDF膜に移した。特異抗体（抗ホスホ‐ACC、抗ACC、抗eiF２α）で染色したのち、膜を、ECLを用いて現像（develop）した。
【0210】
試験した３人のドナー（未処理の肝臓前駆細胞または幹細胞）の平均を図１に示す。アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）はAMPKの下流標的であるが、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミドリボヌクレオチド（AICAR）は陽性対照として用いられたAMPKの有効な薬理学的活性化剤である。
【0211】
ウェスタンブロット分析は、肝臓前駆細胞または幹細胞からの馴化培地が、ACCリン酸化の有意な増加により反映されるように、AMPK活性化を導くことを示した。特に、この増加はLPS存在下でより高いレベルに達した。
【0212】
実施例６：エンドトキシン血症によって誘発される心筋浮腫に対する肝臓前駆細胞または幹細胞の効果。
敗血症性心筋症は、敗血症中の左心室壁浮腫と関連した、収縮期および／または拡張期左心室（LV）機能の可逆的減少を特徴とする、重度敗血症患者における良く認識された心血管合併症である。マウスにおけるエンドトキシン血症のin vivoモデルを用いて、心筋浮腫に対する肝臓前駆細胞または幹細胞の効果を評価した。簡単に言えば、実験は８週齢の雄型C５７BL／６マウスで行った。動物を１２：１２時間明暗サイクル下で飼料および水に自由にアクセスできるようにして維持した。マウスにLPS（または生理食塩水ビヒクル）を腹腔内（IP）注射することによりエンドトキシン血症を誘発した。アルブミン血管外遊出のマーカーであるエバンスブルー色素（EBD）を、LPSまたは生理食塩水ビヒクルと共に、肝臓前駆細胞、幹細胞またはその溶解物または馴化培地の事前投与の有無にかかわらず、IP（２０mg／kg）を投与した。６時間または２４時間後、ペントバルビタール３００mg/kg IPで動物を安楽死させた。
敗血症性心筋症は、敗血症中の左心室壁浮腫と関連した、収縮期および／または拡張期左心室（LV）機能の可逆的減少を特徴とする、重度敗血症患者における良く認識された心血管合併症である。マウスにおけるエンドトキシン血症のin vivoモデルを用いて、心筋浮腫に対する肝臓前駆細胞または幹細胞の効果を評価した。簡単に言えば、実験は８週齢の雄型C５７BL／６マウスで行った。動物を１２：１２時間明暗サイクル下で飼料および水に自由にアクセスできるようにして維持した。マウスにLPS（または生理食塩水ビヒクル）を腹腔内（IP）注射することによりエンドトキシン血症を誘発した。アルブミン血管外遊出のマーカーであるエバンスブルー色素（EBD）を、LPSまたは生理食塩水ビヒクルと共に、肝臓前駆細胞、幹細胞またはその溶解物または馴化培地の事前投与の有無にかかわらず、IP（２０mg／kg）を投与した。６時間または２４時間後、ペントバルビタール３００mg/kg IPで動物を安楽死させた。
【0213】
リードアウト（Read-out）：血管漏出の評価
LPS注射の６時間後および２４時間後に胸部を開放し、生理食塩水３０mLを左室（LV）を通して洗い流した。心臓を摘出し、凍結した。血管外コンパートメント中の色素量に対応する血管漏出を、凍結切片（７μm厚み）上の蛍光の相対表面（５９４nm）としてイメージJソフトウェアにより定量した。
LPS注射の６時間後および２４時間後に胸部を開放し、生理食塩水３０mLを左室（LV）を通して洗い流した。心臓を摘出し、凍結した。血管外コンパートメント中の色素量に対応する血管漏出を、凍結切片（７μm厚み）上の蛍光の相対表面（５９４nm）としてイメージJソフトウェアにより定量した。
【0214】
リードアウト：IHC免疫組織化学
心臓を凍らせた。７μmの心臓切片を氷冷アセトンまたはパラホルムアルデヒド４％で固定した。次いで、組織を０．１％トリトンX－１００中で透過処理し、５% BSA溶液でブロックした。組織を抗ZO－１（１：５０）で免疫染色した。
心臓を凍らせた。７μmの心臓切片を氷冷アセトンまたはパラホルムアルデヒド４％で固定した。次いで、組織を０．１％トリトンX－１００中で透過処理し、５% BSA溶液でブロックした。組織を抗ZO－１（１：５０）で免疫染色した。
【0215】
リードアウト：心エコーによる評価（心機能）
ベースラインおよびLPS注射の６時間後と２４時間後に、マウスを吸入イソフルランにより麻酔し、続いて心エコー検査を行った。傍胸骨長軸および短軸像、４室像、僧帽弁脈波ドップラーを記録した。胸骨傍長軸像からMモードデータを得た。LVの大きさは拡張終期および収縮終期に測定した。
ベースラインおよびLPS注射の６時間後と２４時間後に、マウスを吸入イソフルランにより麻酔し、続いて心エコー検査を行った。傍胸骨長軸および短軸像、４室像、僧帽弁脈波ドップラーを記録した。胸骨傍長軸像からMモードデータを得た。LVの大きさは拡張終期および収縮終期に測定した。
【0216】
実施例７：盲腸結紮および穿刺（CLP）モデルにおける肝臓前駆細胞または幹細胞の効果
ヒト敗血症の病因を検討するために、検討者らは異なる動物モデルを開発した。盲腸結紮および穿刺（CLP）により誘発される多菌性敗血症は、ヒト敗血症の進行および特性に酷似するため、最も頻繁に使用されるモデルである。CLPモデルは、盲腸の穿孔によって腹腔内への糞便物質の放出が可能になり、複数菌感染によって誘発された増悪した免疫反応を発生させることで成り立っている。針穿刺後の便流出から多菌性敗血症が発生する。
ヒト敗血症の病因を検討するために、検討者らは異なる動物モデルを開発した。盲腸結紮および穿刺（CLP）により誘発される多菌性敗血症は、ヒト敗血症の進行および特性に酷似するため、最も頻繁に使用されるモデルである。CLPモデルは、盲腸の穿孔によって腹腔内への糞便物質の放出が可能になり、複数菌感染によって誘発された増悪した免疫反応を発生させることで成り立っている。針穿刺後の便流出から多菌性敗血症が発生する。
【0217】
多菌性敗血症に対する肝臓前駆細胞または幹細胞の影響を、C５７BL／６マウス、好ましくは８週齢の雌マウスで評価した。雌マウスは敗血症誘発致死に対して雄よりも抵抗性が高いが、８週齢以上のマウスはCLP後の生存に関して若齢マウスよりも可変の少ない結果をもたらすことが観察されている。
【0218】
１群あたり約n＝１０匹のマウスを生存解析に用いた。動物にケタミン（７５mg／kg）とキシラジン（１５mg／kg）を腹腔内（IP）注射することにより重量を測定し、麻酔した。メスを用いて、小さな長手方向の皮膚切開を平行にし、腹腔内に貫通することなく約１cm左から正中線まで行った。盲腸をライゲーションし（６０％ライゲーション）、中等級敗血症を達成した。盲腸の７５％に等しいかそれ以上のライゲーションは一般に高度敗血症をもたらすが、盲腸の２５％に等しいかそれ以下のライゲーションは低グレード敗血症をもたらすことに注意する。２１G針を用いて、盲腸をライゲーション近傍の１回の貫通および貫通穿刺（２つの穴）により穿孔した。穿孔の方向は盲腸の腸間膜側から反対の腸間膜側であった。次いで、食物および水へのアクセスが無制限であるように、動物をケージに戻した。マウスは瀕死状態（触れたときに動かない、チアノーゼなどの臨床徴候で示される）になったときに安楽死させた。マウスを安楽死前に死亡させないように、１時間ごとにチェックした。
【0219】
細胞処理の有効性を評価するために、CLPの２時間後に、２００μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、１．０×１０5～１．０×１０6細胞の範囲の投与量で、本発明の肝臓前駆細胞または幹細胞の尾静脈を介して静脈内（IV）注射をEBDと共にマウスは受けた。最終的に、２００μlのPBS中２．５×１０5個細胞の追加尾静脈注射を、いったん投与した肝臓前駆細胞または幹細胞の半減期に応じて、CLPの２４時間後および４８時間後に静脈内投与した。生存実験における非細胞対照群として、PBSを２００μlの体積で同じタイムポイントで投与した。
【0220】
リードアウト：血管漏出の評価と in vivo 組織像
腎臓、肝臓、脾臓を採取し、組織学的に損傷スコアを評価するために凍結した。組織を凍結した。７μmの切片を氷冷アセトンまたはパラホルムアルデヒド４％で固定した。次いで、組織を０．１％トリトンX－１００中で透過処理し、５%BSA溶液でブロックした。組織を抗ZO－１（１：５０）で免疫染色した。血管外コンパートメント中の色素量に対応する血管漏出を、凍結切片（７μm厚）上の蛍光（５９４nm）の相対表面としてイメージJソフトウェアにより定量した。
腎臓、肝臓、脾臓を採取し、組織学的に損傷スコアを評価するために凍結した。組織を凍結した。７μmの切片を氷冷アセトンまたはパラホルムアルデヒド４％で固定した。次いで、組織を０．１％トリトンX－１００中で透過処理し、５%BSA溶液でブロックした。組織を抗ZO－１（１：５０）で免疫染色した。血管外コンパートメント中の色素量に対応する血管漏出を、凍結切片（７μm厚）上の蛍光（５９４nm）の相対表面としてイメージJソフトウェアにより定量した。
【0221】
実施例８：敗血症関連急性腎障害モデルにおける肝臓前駆細胞または幹細胞の効果。
実験は、盲腸結紮および穿刺（CLP）を以前に行った雄C５７BL／６マウスで行った。盲腸結紮および穿刺手術の２４時間後、敗血症マウスは腎損傷を発症した。敗血症誘発から３時間後、マウスに肝臓前駆細胞または幹細胞を１０6個の細胞の容量で静脈内投与した（EBDと併用）。
実験は、盲腸結紮および穿刺（CLP）を以前に行った雄C５７BL／６マウスで行った。盲腸結紮および穿刺手術の２４時間後、敗血症マウスは腎損傷を発症した。敗血症誘発から３時間後、マウスに肝臓前駆細胞または幹細胞を１０6個の細胞の容量で静脈内投与した（EBDと併用）。
【0222】
リードアウト：
腎臓、肝臓、肺および脾臓の凍結切片についてin vivo組織学的検査を実施し、血管漏出および損傷スコアリング（腎臓に関するZO－１免疫染色）を評価した。
腎臓、肝臓、肺および脾臓の凍結切片についてin vivo組織学的検査を実施し、血管漏出および損傷スコアリング（腎臓に関するZO－１免疫染色）を評価した。
【0223】
実施例９：肺敗血症に対する肝臓前駆細胞または幹細胞の効果
方法１：
肺敗血症の発生モデルは、Escherichia coli（大腸菌）懸濁液と非無菌糞便内容物を含む滅菌ゼラチンカプセルを腹腔内に導入することであった。簡単に述べると、動物の体重を測定し、次にケタミン（８０mg／kg）とキシラジン（２０mg／kg）の混合物で腹腔内麻酔した。各動物の腹部を削り、ポビドンヨード溶液で洗浄した。腹部正中に１cmの切開をおき、白線を露出させた。鈍的剥離により腹膜を開放し、Escherichia coli（３μL; Ref．ATCC25922）懸濁液と非無菌糞便内容物（２０mg）を入れた別の滅菌ゼラチンカプセルを腹腔内に導入して敗血症を誘発した。その後、動物を３群に分けた：
i）偽（空のカプセルを移植、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受けたマウス）；
ii）敗血症（敗血症誘発、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受けたマウス）；
iii）敗血症＋MSC（敗血症誘発、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受け、１×１０6の肝臓前駆細胞または幹細胞で治療されたマウス）。
方法１：
肺敗血症の発生モデルは、Escherichia coli（大腸菌）懸濁液と非無菌糞便内容物を含む滅菌ゼラチンカプセルを腹腔内に導入することであった。簡単に述べると、動物の体重を測定し、次にケタミン（８０mg／kg）とキシラジン（２０mg／kg）の混合物で腹腔内麻酔した。各動物の腹部を削り、ポビドンヨード溶液で洗浄した。腹部正中に１cmの切開をおき、白線を露出させた。鈍的剥離により腹膜を開放し、Escherichia coli（３μL; Ref．ATCC25922）懸濁液と非無菌糞便内容物（２０mg）を入れた別の滅菌ゼラチンカプセルを腹腔内に導入して敗血症を誘発した。その後、動物を３群に分けた：
i）偽（空のカプセルを移植、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受けたマウス）；
ii）敗血症（敗血症誘発、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受けたマウス）；
iii）敗血症＋MSC（敗血症誘発、および１００μLのPBS＋EBDの後眼窩注射を受け、１×１０6の肝臓前駆細胞または幹細胞で治療されたマウス）。
【0224】
リードアウト：血管漏出と生体内組織像の評価
組織学的検査（抗ZO－１染色、血管外コンパートメントにおける色素の定量）により損傷スコアおよび血管漏出を評価するために、肺を採取し、凍結する。
組織学的検査（抗ZO－１染色、血管外コンパートメントにおける色素の定量）により損傷スコアおよび血管漏出を評価するために、肺を採取し、凍結する。
【0225】
方法２：
肺敗血症の誘発に使用できる別のモデルは、大腸菌由来のリポ多糖（LPS）（１２．５mg／kg）を腹腔内注射するものである。
その後、動物を前のモデルと同じグループに分ける。
肺敗血症の誘発に使用できる別のモデルは、大腸菌由来のリポ多糖（LPS）（１２．５mg／kg）を腹腔内注射するものである。
その後、動物を前のモデルと同じグループに分ける。
【0226】
本発明は、前述したどのような形態の実現にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲を再評価することなく、いくつかの修正を提示された本実施例の製造に加えることができると想定される。例えば、本発明は、肝臓前駆細胞または幹細胞を参照して記載されているが、本発明は、例えば、特定のヒト肝臓前駆細胞株またはその得られた任意の溶解物に適用することができることは明らかである。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】