特表 2022-551483 複数の異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質、並びにそのようなタンパク質の製造方法及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-09

(54)【発明の名称】複数の異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質、並びにそのようなタンパク質の製造方法及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20221202BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221202BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20221202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z

C12P21/02 C ZNA

C12N5/10

C07K16/00

C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022521387

(86)(22)【出願日】2020-10-08

(85)【翻訳文提出日】2022-05-27

(86)【国際出願番号】 US2020054859

(87)【国際公開番号】W WO2021072129

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】62/912,171

(32)【優先日】2019-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503054225

【氏名又は名称】トラスティーズ オブ ボストン カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】チェン ユーナン

(72)【発明者】

【氏名】イタリア ジェームズ セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】チャッテルジー アビシェク

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG02

4B064AG13

4B064AG15

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA50

4H045DA01

4H045DA30

4H045DA50

4H045DA76

4H045DA89

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、全体として、第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２の異なるＵＡＡを含むタンパク質を生成する方法、並びに第１のＵＡＡ及び第２の異なるＵＡＡを含むタンパク質に関する。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２の異なるＵＡＡを含むタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第１のコドンにハイブリダイズし、かつ前記第１のＵＡＡを結合することができるアンチコドンを含む第１のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉ）前記第１のｔＲＮＡに前記第１のＵＡＡを結合させることができる第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第２のコドンにハイブリダイズし、かつ前記第２のＵＡＡを結合することができるアンチコドンを含む第２のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記第１及び第２のｔＲＮＡは同じアンチコドンを含有しない核酸、
（ｉｖ）前記第２のｔＲＮＡに前記第２のＵＡＡを結合させることができる第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに
（ｖ）前記第１のコドン及び前記第２のコドンを含む前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を有する哺乳動物細胞を、前記第１のｔＲＮＡが、前記細胞中で発現され前記第１のＵＡＡを結合しているときに、前記第１のコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記第１のＵＡＡの組み込みを導き、前記第２のｔＲＮＡが、前記細胞中で発現され前記第２のＵＡＡを結合しているときに、前記第２のコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記第２のＵＡＡの組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含み、
前記細胞によって発現される前記第１及び第２のＵＡＡを含む前記タンパク質の量は、同じ細胞又は同様の細胞によって発現される参照タンパク質の量の少なくとも１０％であり、前記参照タンパク質は、前記第１及び第２のＵＡＡを含まないこと以外は同一のタンパク質である方法。

【請求項2】

前記第１のｔＲＮＡが、原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡが大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡである請求項２記載の方法。

【請求項4】

前記第１のｔＲＮＡが、配列番号４９～５４又は１０８～１１３のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素が大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素である請求項５記載の方法。

【請求項7】

前記第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号４４～４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第１のコドンがＵＧＡである請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のＵＡＡがトリプトファン類似体である請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１のＵＡＡが５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択される請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第２のｔＲＮＡが、原核生物ロイシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記原核生物ロイシル－ｔＲＮＡが大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡである請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２のｔＲＮＡが、配列番号１６～４３のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、原核生物ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記原核生物ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素が大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素である請求項１４記載の方法。

【請求項16】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１～１５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２のコドンがＵＡＧである請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記第２のＵＡＡがロイシン類似体である請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記第２のＵＡＡが、ＬＣＡ及びＣｙｓ－５－Ｎ３から選択される請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第２のｔＲＮＡが、原核生物チロシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記原核生物チロシル－ｔＲＮＡが大腸菌チロシル－ｔＲＮＡである請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記第２のｔＲＮＡが、配列番号６８～６９又は１０４～１０５のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、原核生物チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である請求項２０から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記原核生物チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素が大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素である請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号７０のアミノ酸配列を含む請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記第２のコドンがＵＡＧである請求項２０から請求項２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記第２のＵＡＡがチロシン類似体である請求項２０から請求項２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記第２のＵＡＡが、ＯｍｅＹ、ＡｚＦ、及びＯｐｒｏｐＹから選択される請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記第２のｔＲＮＡが、古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡがメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡである請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記第２のｔＲＮＡが、配列番号７２～１００又は１０６～１０７のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である請求項２９から請求項３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素がメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素である請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記第２のコドンがＵＡＧである請求項２９から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記第２のＵＡＡがピロリシン類似体である請求項２９から請求項３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記第２のＵＡＡが、ＢｏｃＫ、ＣｐＫ、及びＡｚＫから選択される請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞によって発現される前記第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質の量が、前記同じ細胞又は同様の細胞によって発現される前記参照タンパク質の量の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である請求項１から請求項３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記参照タンパク質が、前記第１及び第２のＵＡＡに対応する位置に野生型アミノ酸残基を含む請求項１から請求項３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記タンパク質が、抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）、二重特異性抗体、ナノボディ、アフィボディ、ウイルスタンパク質、ケモカイン、サイトカイン、抗原、血液凝固因子、ホルモン、成長因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、又は任意の他のポリペプチド若しくはタンパク質である請求項１から請求項３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記タンパク質が抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）である請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞がヒト細胞である請求項１から請求項４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記細胞が、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記タンパク質を精製する工程をさらに含む請求項１から請求項４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記第１のＵＡＡを化学的に修飾する工程をさらに含む請求項１から請求項４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記第２のＵＡＡを化学的に修飾する工程をさらに含む請求項１から請求項４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記化学修飾が、検出可能な標識又は分子へのコンジュゲーションを含む請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記分子が薬物（例えば、小分子薬物）である請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記第１のＵＡＡを介して前記タンパク質に結合された前記検出可能な標識又は分子が、前記第２のＵＡＡを介して前記タンパク質に結合された前記検出可能な標識又は分子とは異なる請求項４５から請求項４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

トリプトファン類似体及びロイシン類似体を含むタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ前記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉ）前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ前記ロイシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｖ）前記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記ロイシン類似体を結合させることができる大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに
（ｖ）前記ＵＧＡコドン及び前記ＵＡＧコドンを含む前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を有する哺乳動物細胞を、前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記トリプトファン類似体を結合しているときに、前記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記トリプトファンの組み込みを導き、前記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記ロイシン類似体を結合しているときに、前記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記ロイシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む方法。

【請求項51】

トリプトファン類似体及びチロシン類似体を含むタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ前記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉ）前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ前記チロシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｖ）前記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記チロシン類似体を結合させることができる大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに
（ｖ）前記ＵＧＡコドン及び前記ＵＡＧコドンを含む前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を有する哺乳動物細胞を、前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記トリプトファン類似体を結合しているときに、前記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記トリプトファンの組み込みを導き、前記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記チロシン類似体を結合しているときに、前記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記チロシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む方法。

【請求項52】

トリプトファン類似体及びピロリシン類似体を含むタンパク質を生成する方法であって、
（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ前記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉ）前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ前記ピロリシン類似体を結合することができるアンチコドンを含むメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、
（ｉｖ）前記メタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの前記誘導体に前記ピロリシン類似体を結合させることができるメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに
（ｖ）前記ＵＧＡコドン及び前記ＵＡＧコドンを含む前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を有する哺乳動物細胞を、前記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記トリプトファン類似体を結合しているときに、前記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記トリプトファンの組み込みを導き、前記大腸菌ピロリシル－ｔＲＮＡの前記誘導体が、前記細胞中で発現され前記ピロリシン類似体を結合しているときに、前記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、前記タンパク質への前記ピロリシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む方法。

【請求項53】

請求項１から請求項５２のいずれか１項に記載の方法によって生成される、第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２のＵＡＡを含むタンパク質。

【請求項54】

トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及びロイシン類似体である第２のＵＡＡを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質。

【請求項55】

前記トリプトファン類似体が５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択される請求項５４に記載のタンパク質。

【請求項56】

前記ロイシン類似体がＬＣＡ及びＣｙｓ－５－Ｎ３から選択される請求項５４又は請求項５５に記載のタンパク質。

【請求項57】

トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及びチロシン類似体である第２のＵＡＡを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質。

【請求項58】

前記トリプトファン類似体が５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択される請求項５７に記載のタンパク質。

【請求項59】

前記チロシン類似体が、ＯｍｅＹ、ＡｚＦ、及びＯｐｒｏｐＹから選択される請求項５７又は請求項５８に記載のタンパク質。

【請求項60】

トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及びピロリシン類似体である第２のＵＡＡを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質。

【請求項61】

前記トリプトファン類似体が５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択される請求項６０に記載のタンパク質。

【請求項62】

前記ピロリシン類似体が、ＢｏｃＫ、ＣｐＫ、ＡｚＫ、及びＣｐＫから選択される請求項６０又は請求項６１に記載のタンパク質。

【請求項63】

検出可能な標識又は分子が、前記第１のＵＡＡを介して前記タンパク質に共有結合されている請求項５３から請求項６２のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項64】

検出可能な標識又は分子が、前記第２のＵＡＡを介して前記タンパク質に共有結合されている請求項５３から請求項６３のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項65】

前記第１のＵＡＡを介して前記タンパク質に結合された前記検出可能な標識又は分子が、前記第２のＵＡＡを介して前記タンパク質に結合された前記検出可能な標識又は分子とは異なる請求項６４に記載のタンパク質。

【請求項66】

前記タンパク質が抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）、二重特異性抗体、ナノボディ、アフィボディ、ウイルスタンパク質、ケモカイン、サイトカイン、抗原、血液凝固因子、ホルモン、成長因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、又は任意の他のポリペプチド若しくはタンパク質である請求項５３から請求項６５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項67】

前記タンパク質が抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）である請求項６６に記載のタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月８日出願の米国特許第仮出願第６２／９１２１７１号の利益及びその優先権を主張し、この仮出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本開示は、全体として、目的のタンパク質が合成される際に複数の異なるＵＡＡをその目的のタンパク質に組み込むために、直交ｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対が使用される分野に関する。

【背景技術】

【0003】

天然では、タンパク質は、転写及び翻訳として知られるプロセスを介して細胞中で産生される。転写中、目的のタンパク質を集合的にコードする一連のコドンを含む遺伝子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される。翻訳中、リボソームは、ｍＲＮＡに付着し、それに沿って移動し、コドンに対応する位置でｍＲＮＡから合成（翻訳）されるポリペプチド鎖に特定のアミノ酸を組み込んで、タンパク質を生成する。翻訳の間、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に結合した特定の天然に存在するアミノ酸がリボソームに入る。アンチコドン配列を含有するｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ中のそれらのそれぞれのコドン配列にハイブリダイズし、タンパク質が合成されるにつれて、それらが運搬しているアミノ酸を、新生タンパク質鎖の適切な位置に転移させる。

【0004】

最近数十年間にわたって、部位特異的に修飾されたタンパク質、例えば、哺乳動物タンパク質の均質な調製物を、例えば、治療及び診断を含む様々な用途で使用するための商業規模の量で製造するために、多大な努力がなされてきた。さらには、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）においてこれらの修飾された哺乳動物タンパク質を産生するための努力がなされてきたが、これは、これらのタンパク質が、適切に折り畳まれ完全に活性な形態でより容易に産生される可能性があり、かつ／又は哺乳動物細胞において天然に産生される未変性の（天然）タンパク質と同様の様式で翻訳後修飾されてもよいためである。

【0005】

部位特異的修飾を含むタンパク質を産生するための１つのアプローチは、目的のタンパク質への１つ以上の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）の部位特異的組み込みを含む。インビボでＵＡＡをタンパク質に部位特異的に組み込む能力は、タンパク質機能を増強するか、又は天然には見出されない新しい化学官能基を導入するための強力なツールとなっている。この技術に必要なコア要素としては、以下の、遺伝子操作されたｔＲＮＡ、ｔＲＮＡにＵＡＡを結合させる遺伝子操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、及び合成されているタンパク質へのＵＡＡの組み込みを導くユニークなコドン、例えば終止コドンが挙げられる。

【0006】

このアプローチの中心にあるのは、遺伝子操作されたｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の使用であり、ａａＲＳは、発現宿主細胞に通常存在するｔＲＮＡ及びアミノ酸と交差反応することなく、ｔＲＮＡに目的のＵＡＡを結合させる。これは、遺伝子操作されたｔＲＮＡ／ａａＲＳ対（例えば、操作された細菌ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対）と発現宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）において天然に見出されるｔＲＮＡ／ａａＲＳ対との間の直交性を最大にするように、発現宿主細胞としての生命の異なるドメインにある生物に由来する操作されたｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を使用することによって達成されている。ａａＲＳを介してＵＡＡを結合する操作されたｔＲＮＡは、発現されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ中に存在する未成熟終止コドン（ＵＡＧ、ＵＧＡ、ＵＡＡ）等の固有のコドンに結合又はハイブリダイズする。例えば、発現宿主細胞由来の内因性ｔＲＮＡ及び内因性ａａＲＳと、タンパク質がリボソームを介して合成される際にそのタンパク質へのＵＡＡの組み込みを容易にするように宿主細胞に導入された遺伝子操作された直交ｔＲＮＡ及び直交ａａＲＳとを用いたタンパク質の合成を示す図１を参照されたい。現在まで、天然に存在するアミノ酸のいくつかについて、様々な直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対が生成されている（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０３４９８９１号明細書、及びＺｈｅｎｇら（２０１８） ＢＩＯＣＨＥＭ． ５７：４４１－４４５を参照）。このアプローチは、治療薬（例えば、抗体薬物コンジュゲート（結合体）（ＡＤＣ）、二重特異性抗体（例えば、二重特異性モノクローナル抗体）、ナノボディ、ケモカイン、ワクチン、凝固因子、ホルモン、及び酵素）として使用することができるバイオコンジュゲーションハンドル（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｈａｎｄｌｅ）及び光活性化可能な架橋剤等の部位特異的修飾を含有するタンパク質の発現を容易にする。

【0007】

これまでに行われた努力にもかかわらず、複数の異なるＵＡＡを単一のポリペプチドに組み込むためにこの技術を利用することにおける成功は限られている。複数の異なるＵＡＡを１つのポリペプチドに組み込むために、各ＵＡＡは、別個のナンセンスコドンによってコードされなければならず、各ＵＡＡは、異なる直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対によって結合されなければならず、その際、各対は互いに直交（相互直交）でもなければならない。かなりの程度の交差反応性がａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の間に見出されており、これは、ナンセンスコドンの全相補体を解読することができないことと共に、哺乳動物細胞における２つの別個のＵＡＡの部位特異的組み込みの全体的な効率を制限している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１７／０３４９８９１号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｚｈｅｎｇら（２０１８） ＢＩＯＣＨＥＭ． ５７：４４１－４４５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従って、高効率で複数の別個の非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことを可能にする哺乳動物ベースの発現プラットフォームが依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、部分的には、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質への複数の異なるＵＡＡの効率的な部位特異的組み込みを可能にする、ナンセンスコドン、ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、及びＵＡＡの組み合わせの発見に基づく。

【0012】

１つの態様では、本発明は、第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２の異なるＵＡＡを含むタンパク質（例えば、第１及び第２のＵＡＡがそれぞれ、タンパク質ポリペプチド鎖中の特定の異なる位置でタンパク質に組み込まれる）を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第１のコドンにハイブリダイズし、かつ上記第１のＵＡＡを結合する（チャージされる、ｃｈａｒｇｅｄ）ことができるアンチコドンを含む第１のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記第１のｔＲＮＡに上記第１のＵＡＡを結合させる（チャージする、ｃｈａｒｇｉｎｇ）ことができる第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第２のコドンにハイブリダイズし、かつ上記第２のＵＡＡを結合することができるアンチコドンを含む第２のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、上記第１及び第２のｔＲＮＡは同じアンチコドンを含有しない核酸、（ｉｖ）上記第２のｔＲＮＡに上記第２のＵＡＡを結合させることができる第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記第１のコドン及び上記第２のコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記第１のｔＲＮＡが、上記細胞中で発現され上記第１のＵＡＡを結合しているときに、上記第１のコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記第１のＵＡＡの組み込みを導き（指示し）、上記第２のｔＲＮＡが、上記細胞中で発現され上記第２のＵＡＡを結合しているときに、上記第２のコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記第２のＵＡＡの組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0013】

特定の実施形態では、上記細胞によって発現される第１及び第２のＵＡＡの両方を含むタンパク質の発現収率は、参照（基準）タンパク質の発現収率の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。例えば、特定の実施形態では、細胞によって発現される第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質の量は、同じ細胞又は同様の細胞によって発現される参照タンパク質の量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。特定の実施形態では、参照タンパク質は、第１及び第２のＵＡＡを含まないが、その点を除けば第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質と同一であるタンパク質である。例えば、参照タンパク質は、野生型アミノ酸配列を含んでもよいし、又は第１及び第２のＵＡＡに対応する位置に野生型アミノ酸残基を含んでもよい。

【0014】

特定の実施形態では、第１又は第２のｔＲＮＡは、原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡ、例えば、大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である。例えば、第１又は第２のｔＲＮＡは、配列番号４９～５４又は１０８～１１３のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、原核生物トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、例えば、大腸菌トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である。例えば、第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号４４～４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のコドンはＵＧＡである。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、トリプトファン類似体、例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体である。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、５－ＨＴＰ又は５－ＡｚＷである。

【0015】

特定の実施形態では、第１又は第２のｔＲＮＡは、原核生物ロイシル－ｔＲＮＡ、例えば、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である。例えば、第１又は第２のｔＲＮＡは、配列番号１６～４３のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、原核生物ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である。例えば、第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１～１５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のコドンはＵＡＧである。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、ロイシン類似体、例えば、天然に存在しないロイシン類似体である。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡはＬＣＡ又はＣｙｓ－５－Ｎ３である。

【0016】

特定の実施形態では、第１又は第２のｔＲＮＡは、原核生物チロシル－ｔＲＮＡ、例えば、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である。例えば、第１又は第２のｔＲＮＡは、配列番号６８～６９又は１０４～１０５のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、原核生物チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である。例えば、第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号７０のアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のコドンはＵＡＧである。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、チロシン類似体、例えば、天然に存在しないチロシン類似体である。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、ＯｍｅＹ、ＡｚＦ、又はＯｐｒｏｐＹである。

【0017】

特定の実施形態では、第１又は第２のｔＲＮＡは、古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡ、例えば、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．バルケリ）ピロリシル－ｔＲＮＡの類似体又は誘導体である。例えば、第１又は第２のｔＲＮＡは、配列番号７２～１００又は１０６～１０７のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、古細菌ピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、Ｍ．バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素の類似体又は誘導体である。例えば、第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、第１又は第２のコドンはＵＡＧである。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、ピロリシン類似体、例えば、天然に存在しないピロリシン類似体である。特定の実施形態では、第１又は第２のＵＡＡは、ＢｏｃＫ、ＣｐＫ、又はＡｚＫである。

【0018】

特定の実施形態では、上記タンパク質は、抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）、二重特異性抗体、ナノボディ、アフィボディ、ウイルスタンパク質、ケモカイン、サイトカイン、抗原、血液凝固因子、ホルモン、成長因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、又は任意の他のポリペプチド若しくはタンパク質である。特定の実施形態では、上記タンパク質は、抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）であり、第１のＵＡＡ及び／又は第２のＵＡＡは、抗体の定常領域に位置する。

【0019】

特定の実施形態では、上記細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

【0020】

特定の実施形態では、当該方法は、細胞を第１及び／又は第２のＵＡＡと接触させる工程をさらに含む。特定の実施形態では、当該方法は、上記タンパク質を精製する工程をさらに含む。特定の実施形態では、当該方法は、第１及び／又は第２のＵＡＡを化学的に修飾する工程をさらに含む。例えば、この化学修飾は、検出可能な標識又は分子、例えば、薬物、例えば、小分子薬物へのコンジュゲーション（結合）を含んでもよい。

【0021】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）及びロイシン類似体（例えば、天然に存在しないロイシン類似体）を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記ロイシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記ロイシン類似体を結合させることができる大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記ロイシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記ロイシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0022】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）及びチロシン類似体（例えば、天然に存在しないチロシン類似体）を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記チロシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記チロシン類似体を結合させることができる大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記チロシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記チロシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0023】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）及びピロリシン類似体（例えば、天然に存在しないピロリシン類似体）を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記ピロリシン類似体を結合することができるアンチコドンを含むメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記メタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記ピロリシン類似体を結合させることができるメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌ピロリシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記ピロリシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記ピロリシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0024】

別の態様では、本発明は、上述の方法のいずれかによって生成される第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２のＵＡＡを含むタンパク質を提供する。

【0025】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）と、ロイシン類似体（例えば、天然に存在しないロイシン類似体）である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はロイシン類似体はＬＣＡ及びＣｙｓ－５－Ｎ３から選択される。

【0026】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）と、チロシン類似体（例えば、天然に存在しないチロシン類似体）である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は、５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はチロシン類似体は、ＯｍｅＹ、ＡｚＦ、及びＯｐｒｏｐＹ ＵＡＡから選択される。

【0027】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体（例えば、天然に存在しないトリプトファン類似体）である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）と、ピロリシン類似体（例えば、天然に存在しないピロリシン類似体）である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は、５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はピロリシン類似体は、ＢｏｃＫ、ＣｐＫ、ＡｚＫ、及びＣｐＫから選択される。

【0028】

上述のタンパク質のいずれかの特定の実施形態では、検出可能な標識又は分子（例えば、薬物、例えば、小分子薬物）は、上記第１のＵＡＡ及び／又は第２のＵＡＡを介してタンパク質に共有結合される。特定の実施形態では、上記タンパク質は、抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）、二重特異性抗体、ナノボディ、アフィボディ、ウイルスタンパク質、ケモカイン、サイトカイン、抗原、血液凝固因子、ホルモン、成長因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、又は任意の他のポリペプチド若しくはタンパク質である。

【0029】

本発明のこれら及び他の態様及び特徴は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0030】

本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解することができる。

【0031】

【図1】図１は、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を用いた遺伝コード拡大の概略図を描く。

【図2A】図２Ａは、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを描く。

【図2B】図２Ｂは、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを描く。

【図2C】図２Ｃは、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを描く。

【図3】図３は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを示す。

【図4A】図４Ａは、ＵＡＡ Ｃ５Ａｚ、ＬＣＡ、及びＡｚＷを描く。

【図4B】図４Ｂは、Ｃ５Ａｚの合成経路を描く。

【図4C】図４Ｃは、ＡｚＷの合成経路を描く。

【図4D】図４Ｄは、ＬＣＡの合成経路を描く。

【図4E】図４Ｅは、ＬＣＡの合成経路を描く。

【図4F】図４Ｆは、ＬＣＡの合成経路を描く。

【図5】図５は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを描く。

【図6】図６は、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素に対する例示的な基質であるＵＡＡのサブセットを描く。

【図7】図７は、２つの別個の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）の部位特異的組み込みの概略図である。

【図8】図８は、蛍光レポーターを用いた例示的なｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）対の哺乳動物細胞におけるＴＧＡ終止コドン抑制の比較を示す。

【図9A】図９Ａ～９Ｂは、試験したｔＲＮＡ－合成酵素対の交差反応性を示す。図９Ａは、蛍光レポーターを用いた、哺乳動物細胞におけるＬｅｕＲＳ、ＥｃＴｙｒＲＳ、ＰＩＲＳ、及びＥｃＴｒｐＲＳ対のＴＡＧ終止コドン抑制の比較を描く。

【図9B】図９Ａ～９Ｂは、試験したｔＲＮＡ－合成酵素対の交差反応性を示す。図９Ｂは、蛍光レポーターを用いた、哺乳動物細胞におけるＬｅｕＲＳ、ＥｃＴｙｒＲＳ、ＰｙＩＲＳ、及びＥｃＴｒｐＲＳ対のＴＧＡ終止コドン抑制の比較を描く。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｂは、２つのＵＡＡの部位特異的組み込みを示す。図１０Ａは、組み込みについてのレポーターとしてＥＧＦＰ蛍光を使用する例示的なＵＡＡ対の部位特異的組み込み効率を示す棒グラフである。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｂは、２つのＵＡＡの部位特異的組み込みを示す。図１０Ｂは、部位特異的取り込みの読み出しとしてＧＦＰタンパク質産生を用いて、２つのＵＡＡを有する例示的なタンパク質の産生を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ａは、例示的なＵＡＡ ＨＴＰ及びＢｏｃＫを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｂは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＯＭｅＹを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11C】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｃは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＣｙｓ－５－Ｎ３を含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11D】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｄは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＢｏｃＫを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11E】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｅは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びシクロプロペン－Ｋを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11F】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｆは、例示的なＵＡＡ ＡｚＷ及びシクロプロペン－Ｋを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11G】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｇは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有するＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11H】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｈは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有する蛍光ジアゾ標識ＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11I】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｉは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有するＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡ標識ＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図11J】図１１Ａ～１１Ｊは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）結果を示す。図１１Ｊは、例示的なＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有する蛍光ジアゾ及びＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡ標識ＥＧＦＰの質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図12A】図１２Ａは、フルオレセインを有する蛍光標識ＥＧＦＰの生成を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図12B】図１２Ｂは、ＴＡＭＲＡを有する蛍光標識ＥＧＦＰの生成を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、２つのＵＡＡを含有するＩｇＧのタンパク質収率を示す。図１３Ａは、Ｔ２０２（重鎖）及びＫ１１３（軽鎖）におけるＵＡＡ組み込みを有するＩｇＧについての総タンパク質収量をｍｇ／Ｌで示す棒グラフである。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｂは、２つのＵＡＡを含有するＩｇＧのタンパク質収率を示す。図１３Ｂは、Ｔ２０２及びＫ１１３におけるＵＡＡ組み込みを有するＩｇＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図14A】図１４Ａ～１４Ｂは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のＥＳＩ－ＭＳ結果を示す。図１４Ａは、例示的なＵＡＡ ＨＴＰを含有するＰＮＧａｓｅ還元ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）の質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図14B】図１４Ａ～１４Ｂは、２つのＵＡＡを含有するＥＧＦＰタンパク質のＥＳＩ－ＭＳ結果を示す。図１４Ｂは、例示的なＵＡＡ ＬＣＡを含有するＰＮＧａｓｅ還元ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）の質量分析結果を示すヒストグラムである。

【図15】図１５は、複数のＵＡＡの部位特異的組み込みのために利用されるＩｇＧタンパク質構造の保存領域を描く。

【図16】図１６は、例えば、質量分析研究のための、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の模式図を描く。

【図17A】図１７Ａ～１７Ｅは、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の高速液体クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＨＩＣ）トレースを示す。

【図17B】図１７Ａ～１７Ｅは、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の高速液体クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＨＩＣ）トレースを示す。

【図17C】図１７Ａ～１７Ｅは、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の高速液体クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＨＩＣ）トレースを示す。

【図17D】図１７Ａ～１７Ｅは、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の高速液体クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＨＩＣ）トレースを示す。

【図17E】図１７Ａ～１７Ｅは、クリックケミストリー及びジアゾカップリングで標識された、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを含む抗体の高速液体クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＨＩＣ）トレースを示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明は、部分的には、哺乳動物細胞において産生されるタンパク質への複数の異なるＵＡＡの効率的な部位特異的組み込みを可能にする、ナンセンスコドン、ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、及びＵＡＡの組み合わせの発見に基づく。タンパク質への複数のＵＡＡの成功した効率的な組み込みを可能にする成分の選択は、そのようなマルチサイト組み込みのために使用することができる、異なるａａＲＳ、ｔＲＮＡ、ＵＡＡ、コドン、及び対の組み合わせの２００万を超える可能な組み合わせが存在することを考えると、困難である。結果として、２つの別個のバイオコンジュゲーションハンドルの部位特異的組み込みに使用するのに適したこれらの要素の特定の組み合わせを見出すことは困難である。

【0033】

１つの態様では、本発明は、第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２の異なるＵＡＡを含むタンパク質（例えば、第１及び第２のＵＡＡがそれぞれ、タンパク質ポリペプチド鎖中の特定の異なる位置でタンパク質に組み込まれる）を産生する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第１のコドンにハイブリダイズし、かつ上記第１のＵＡＡを結合することができるアンチコドンを含む第１のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記第１のｔＲＮＡに上記第１のＵＡＡを結合させることができる第１のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから選択される第２のコドンにハイブリダイズし、かつ上記第２のＵＡＡを結合することができるアンチコドンを含む第２のｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、上記第１及び第２のｔＲＮＡは同じアンチコドンを含有しない核酸、（ｉｖ）上記第２のｔＲＮＡに上記第２のＵＡＡを結合させることができる第２のアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記第１のコドン及び上記第２のコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記第１のｔＲＮＡが、上記細胞中で発現され上記第１のＵＡＡを結合しているときに、上記第１のコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記第１のＵＡＡの組み込みを導き、上記第２のｔＲＮＡが、上記細胞中で発現され上記第２のＵＡＡを結合しているときに、上記第２のコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記第２のＵＡＡの組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0034】

特定の実施形態では、細胞によって発現される第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質の発現収率は、参照タンパク質の発現収率の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。例えば、特定の実施形態では、細胞によって発現される第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質の量は、同じ細胞又は同様の細胞によって発現される参照タンパク質の量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。特定の実施形態では、参照タンパク質は、第１及び第２のＵＡＡを含まないが、その点を除けば第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質と同一であるタンパク質である。例えば、参照タンパク質は、野生型アミノ酸配列を含んでもよいし、又は第１及び第２のＵＡＡに対応する位置に野生型アミノ酸残基を含んでもよい。タンパク質発現は、例えば、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定されてもよい。発現は、タンパク質の精製後の規定の体積及び純度の溶液中のタンパク質濃度を測定することによって（例えば、２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸収又はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイによって）測定されてもよい。蛍光タンパク質（例えば、レポータータンパク質）の発現は、本明細書の実施例２～４に記載されるように、蛍光顕微鏡法によって測定されてもよい。特定の実施形態では、開示された方法によると、第１及び第２のＵＡＡを含有するＥＧＦＰレポータータンパク質（例えば、２つの終止コドンを含有するヌクレオチド配列によってコードされるＥＧＦＰレポータータンパク質、例えば、実施例４に記載されるような、終止コドンＴＡＧ及びＴＧＡを含有するＥＧＦＰ－３９ＴＡＧ－１５１ＴＧＡ）の発現収率が、第１及び第２のＵＡＡを含有しない対応するＥＧＦＰレポータータンパク質（例えば、野生型ＥＧＦＰタンパク質）の発現収率の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％となる。

【0035】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体及びロイシン類似体を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記ロイシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記ロイシン類似体を結合させることができる大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記ロイシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記ロイシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0036】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体及びチロシン類似体を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記チロシン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記チロシン類似体を結合させることができる大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌チロシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記チロシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記チロシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0037】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体及びピロリシン類似体を含むタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、（ｉ）ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、かつ上記トリプトファン類似体を結合することができるアンチコドンを含む大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉ）上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記トリプトファン類似体を結合させることができる大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｉｉ）ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、かつ上記ピロリシン類似体を結合することができるアンチコドンを含むメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、（ｉｖ）上記メタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡの上記誘導体に上記ピロリシン類似体を結合させることができるメタノサルシナ・バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素の誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、並びに（ｖ）上記ＵＧＡコドン及び上記ＵＡＧコドンを含む上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を有する哺乳動物細胞を、上記大腸菌トリプトファニル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記トリプトファン類似体を結合しているときに、上記ＵＧＡコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記トリプトファンの組み込みを導き、上記大腸菌ピロリシル－ｔＲＮＡの上記誘導体が、上記細胞中で発現され上記ピロリシン類似体を結合しているときに、上記ＵＡＧコドンにハイブリダイズし、上記タンパク質への上記ピロリシン類似体の組み込みを導くことを可能にする条件下で培養する工程を含む。

【0038】

別の態様では、本発明は、上述の方法のいずれかによって製造された第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及び第２のＵＡＡを含むタンパク質を提供する。

【0039】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）とロイシン類似体である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はロイシン類似体はＬＣＡ及びＣｙｓ－５－Ｎ３から選択される。

【0040】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）とチロシン類似体である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は、５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はチロシン類似体は、ＯｍｅＹ、ＡｚＦ、及びＯｐｒｏｐＹ ＵＡＡから選択される。

【0041】

別の態様では、本発明は、トリプトファン類似体である第１の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）とピロリシン類似体である第２のＵＡＡとを含む、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質を提供する。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は、５－ＨＴＰ及び５－ＡｚＷから選択され、かつ／又はピロリシン類似体は、ＢｏｃＫ、ＣｐＫ、ＡｚＫ、及びＣｐＫから選択される。

【0042】

別の態様では、本発明は、上述のタンパク質のいずれかを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物中の第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質の純度は、少なくとも５０％である（すなわち、第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質は、当該組成物中の総タンパク質の少なくとも５０％である）。特定の実施形態では、組成物中の上記タンパク質の純度は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。特定の実施形態では、当該組成物中の総タンパク質の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満は、第１又は第２のＵＡＡを含まないがその点を除けば第１及び第２のＵＡＡを含むタンパク質と同一である任意のタンパク質である。

【0043】

本明細書で使用する場合、「直交」という用語は、目的の発現系（例えば、内因性細胞翻訳系）によって低い効率で使用される分子（例えば、直交ｔＲＮＡ又は直交アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素）を指す。例えば、目的の翻訳系における直交ｔＲＮＡは、内因性アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素による内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較した場合に、低減された効率で、又はさらにゼロの効率で、目的の翻訳系の任意の内因性アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によってアミノアシル化される。別の例では、直交アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、内因性アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素による内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、低減された効率で、又はさらにゼロの効率で、目的の翻訳系における任意の内因性ｔＲＮＡをアミノアシル化する。

【0044】

本発明の種々の特徴及び態様は、以下により詳細に論じられる。

【0045】

Ｉ． アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素
本発明は、タンパク質への組み込みのためにｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させることができる遺伝子操作されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（又はａａＲＳ）に関する。本明細書で使用する場合、「アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素」という用語は、タンパク質への組み込みのためにｔＲＮＡにアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を結合させるか、又は結合させることができる任意の酵素又はその機能的断片を指す。本明細書で使用する場合、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素の「機能的断片」という用語は、対応する完全長ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、天然に存在するｔＲＮＡ合成酵素）の酵素活性の例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を保持する完全長アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素の断片を指す。アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素の酵素活性は、当該技術分野で公知の任意の方法によってアッセイされてもよい。例えば、インビトロアミノアシル化アッセイは、Ｈｏｂｅｎら（１９８５） ＭＥＴＨＯＤＳ ＥＮＺＹＭＯＬ． １１３：５５－５９及び米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されており、細胞ベースのアミノアシル化アッセイは米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００９０４９号明細書に記載されている。特定の実施形態では、機能的断片は、完全長ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、天然に存在するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素）に存在する少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は８００個の連続するアミノ酸を含む。

【0046】

アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素という用語は、野生型アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素配列に対して１つ以上の変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入）を有する変異体（すなわち、変異タンパク質（ムテイン））を含む。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は、単一の変異（例えば、本明細書で企図される変異）を含むか、それからなるか、若しくはそれから本質的になってもよいし、又は２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個若しくは１５個を超える数の変異（例えば、本明細書で企図される変異）の組み合わせを含むか、それらからなるか、若しくはそれから本質的になってもよい。アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質が、１～１５、１～１０、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１５、２～１０、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１５、３～１０、３～７、３～６、３～５、又は４～１０、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～７、５～６、６～１０、６～７、７～１０、７～８又は８～１０の変異（例えば、本明細書で企図される変異）を含むか、それらからなるか、又はそれから本質的になってもよいということが企図される。

【0047】

アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は、野生型配列又は本明細書に開示される配列に対して保存的置換を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、構造的に類似のアミノ酸による置換を指す。例えば、保存的置換は、以下の群内のものを含んでもよい：Ｓｅｒ及びＣｙｓ；Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌ；Ｇｌｕ及びＡｓｐ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ；並びにＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、及びＨｉｓ。保存的置換はまた、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ置換行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２行列）、又はＰＡＭ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｐ行列（例えば、ＰＡＭ ２５０行列）によって定義されてもよい。

【0048】

特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質の基質特異性は、対応する（又は鋳型の）野生型アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素と比較して、所望の非天然アミノ酸のみが基質ｔＲＮＡに結合するが、一般的な２０個のアミノ酸のいずれも結合しないように変更される。

【0049】

アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、細菌源、例えば、大腸菌（エシェリキア・コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、又はバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ）に由来してもよい。アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素はまた、古細菌源、例えば、メタノサルシナセア属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃａｅａ）又はデスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｍ．バルケリ（Ｍｂ）、Ｍ．アルバス（Ｍ．ａｌｖｕｓ）（Ｍａ）、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）（Ｍｍ）又はＤ．ハフニエンス（Ｄ．ｈａｆｎｉｓｅｎｓｅ）（Ｄｈ）ファミリーのいずれか、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ－１、又はアルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）に由来してもよい。他の実施形態では、真核生物源、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、又は動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物等）も使用することができる。本明細書で使用する場合、用語「誘導体」又は「…に由来」は、特定された分子若しくは生物から単離されるか、又はそれからの情報を使用して作製される成分を指す。本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は、参照（基準）成分（例えば、野生型ｔＲＮＡ、野生型ｔＲＮＡ合成酵素、若しくは天然アミノ酸）に由来するか、又はそれと（構造及び／若しくは機能に関して）類似する成分（例えば、ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ合成酵素、若しくは非天然アミノ酸）を指す。特定の実施形態では、誘導体又は類似体は、参照又は起源成分（例えば、野生型成分）としての所与の活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上を有する。

【0050】

アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、インビトロ若しくはインビボで基質ｔＲＮＡをアミノアシル化してもよく、ポリペプチド若しくはタンパク質として、又はアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドとして翻訳系（例えば、インビトロ翻訳系若しくは細胞）に提供されること可能であるということが企図される。

【0051】

特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来し、例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ（又はその変異体）を、天然に存在するロイシンアミノ酸よりもロイシン類似体で優先的にアミノアシル化する。

【0052】

例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１、又はその機能的断片若しくは変異体を含み、以下の変異のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上を有する：（ｉ）配列番号１の位置２に対応する位置のグルタミン残基の置換、例えばグルタミン酸による置換（Ｑ２Ｅ）；（ｉｉ）配列番号１の位置２０に対応する位置のグルタミン酸残基の置換、例えばリシン（Ｅ２０Ｋ）、メチオニン（Ｅ２０Ｍ）、若しくはバリン（Ｅ２０Ｖ）による置換；（ｉｉｉ）配列番号１の位置４０に対応する位置のメチオニン残基の置換、例えばイソロイシン（Ｍ４０Ｉ）若しくはバリン（Ｍ４０Ｖ）による置換；（ｉｖ）配列番号１の位置４１に対応する位置のロイシン残基の置換、例えばセリン（Ｌ４１Ｓ）、バリン（Ｌ４１Ｖ）、若しくはアラニン（Ｌ４１Ａ）による置換；（ｖ）配列番号１の位置２５２に対応する位置のトレオニン残基の置換、例えば、アラニン（Ｔ２５２Ａ）若しくはアルギニン（Ｔ２５２Ｒ）による置換；（ｖｉ）配列番号１の位置４９９に対応する位置のチロシン残基の置換、例えばイソロイシン（Ｙ４９９Ｉ）、セリン（Ｙ４９９Ｓ）、アラニン（Ｙ４９９Ａ）、若しくはヒスチジン（Ｙ４９９Ｈ）による置換；（ｖｉｉ）配列番号１の位置５２７に対応する位置のチロシン残基の置換、例えばアラニン（Ｙ５２７Ａ）、ロイシン（Ｙ５２７Ｌ）、イソロイシン（Ｙ５２７Ｉ）、バリン（Ｙ５２７Ｖ）、若しくはグリシン（Ｙ５２７Ｇ）による置換；若しくは（ｖｉｉｉ）配列番号１の位置５３７に対応する位置のヒスチジン残基の置換、例えばグリシンによる置換（Ｈ５３７Ｇ）、又は上述のものの任意の組み合わせ。

【0053】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下を含む：（ｉ）配列番号１のＨｉｓ５３７に対応する位置の少なくとも１つの置換（例えば、疎水性アミノ酸による置換）、（ｉｉ）Ｅ２０Ｖ、Ｅ２０Ｍ、Ｌ４１Ｖ、Ｌ４１Ａ、Ｙ４９９Ｈ、Ｙ４９９Ａ、Ｙ５２７Ｉ、Ｙ５２７Ｖ、Ｙ５２７Ｇ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、（ｉｉｉ）Ｅ２０Ｋ及びＬ４１Ｓ並びにこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、並びにＭ４０Ｉ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ及びＹ５２７Ａ並びにこれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）並びに（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）。

【0054】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１の位置２０に対応する位置のグルタミン酸残基の置換、例えばＧｌｕ又はＬｙｓ以外のアミノ酸による置換、例えば疎水性アミノ酸（例えばＬｅｕ、Ｖａｌ又はＭｅｔ）による置換を含む。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１の位置４１に対応する位置のロイシン残基の置換、例えば、Ｌｅｕ又はＳｅｒ以外のアミノ酸による置換、例えば、Ｌｅｕ以外の疎水性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、又はＭｅｔ）による置換を含む。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１の位置４９９に対応する位置のチロシン残基の置換、例えば、小さい疎水性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、若しくはＶａｌ）による置換、又は正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、若しくはＨｉｓ）による置換を含む。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１の位置５２７に対応する位置のチロシン残基の置換、例えば、Ａｌａ又はＬｅｕ以外の疎水性アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ）による置換を含む。特定の実施形態では、ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質はＬ４１Ｖを含む。

【0055】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下から選択される変異の組み合わせを含む：（ｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｉｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｖ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ｒ、Ｙ４９９Ｓ、Ｙ５２７Ｌ、及びＨ５３７Ｇ；（ｉｉｉ）Ｑ２Ｅ、Ｍ４０Ｉ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｉｖ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｍ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｖ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｖ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｖｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｖ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｖｉｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ａ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｖｉｉｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ａ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｉｘ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｈ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｉ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｖ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｉｉ）Ｑ２Ｅ、Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｇ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｉｉｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｉｖ）Ｅ２０Ｍ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｖ）Ｅ２０Ｖ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｖｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｖ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｖｉｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ａ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｖｉｉｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ａ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｉｘ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｈ、Ｙ５２７Ａ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｘ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｉ、及びＨ５３７Ｇ；（ｘｘｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｖ、及びＨ５３７Ｇ；並びに（ｘｘｉｉ）Ｅ２０Ｋ、Ｍ４０Ｉ、Ｌ４１Ｓ、Ｔ２５２Ａ、Ｙ４９９Ｉ、Ｙ５２７Ｇ、及びＨ５３７Ｇ。

【0056】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２～１３のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号２～１３のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

特定の実施形態では、上記ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は、Ｘ_２がＱ又はＥであり、Ｘ_２０がＥ、Ｋ、Ｖ又はＭであり、Ｘ_４０がＭ、Ｉ又はＶであり、Ｘ_４１がＬ、Ｓ、Ｖ又はＡであり、Ｘ_２５２がＴ、Ａ又はＲであり、Ｘ_４９９がＹ、Ａ、Ｉ、Ｈ又はＳであり、Ｘ_５２７がＹ、Ａ、Ｉ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ_５３７がＨ又はＧである配列番号１４のアミノ酸配列を含み、上記ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は、配列番号１と比較して少なくとも１つの変異（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又はそれ以上の変異）を含む。特定の実施形態では、ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は、Ｘ_２０がＫ、Ｖ又はＭであり、Ｘ_４１がＳ、Ｖ又はＡであり、Ｘ_４９９がＡ、Ｉ又はＨであり、Ｘ_５２７がＡ、Ｉ又はＶである配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質は配列番号１と比較して少なくとも１つの変異を含む。

【0058】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に由来し、例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌トリプトファニルｔＲＮＡ（又はその変異体）を、天然に存在するトリプトファンアミノ酸よりもトリプトファン類似体で優先的にアミノアシル化する。

【0059】

例えば、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号４４、又は配列番号４４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号４４、又はその機能的断片若しくは変異体を含むが、以下の変異のうちの１つ以上を有する：（ｉ）配列番号４４の位置８に対応する位置のセリン残基の置換、例えばアラニンによる置換（Ｓ８Ａ）；（ｉｉ）配列番号４４の位置１４４に対応する位置のバリン残基の置換、例えばセリン（Ｖ１４４Ｓ）、グリシン（Ｖ１４４Ｇ）又はアラニン（Ｖ１４４Ａ）による置換；（ｉｉｉ）配列番号４４の位置１４６に対応する位置のバリン残基の置換、例えばアラニン（Ｖ１４６Ａ）、イソロイシン（Ｖ１４６Ｉ）、又はシステイン（Ｖ１４６Ｃ）による置換。特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、以下から選択される変異の組み合わせを含む：（ｉ）Ｓ８Ａ、Ｖ１４４Ｓ、及びＶ１４６Ａ、（ｉｉ）Ｓ８Ａ、Ｖ１４４Ｇ、及びＶ１４６Ｉ、（ｉｉｉ）Ｓ８Ａ、Ｖ１４４Ａ、及びＶ１４６Ａ、並びに（ｉｖ）Ｓ８Ａ、Ｖ１４４Ｇ、及びＶ１４６Ｃ。

【0060】

特定の実施形態では、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号４５～４８のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号４５～４８のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0061】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来し、例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ（又はその変異体）を、天然に存在するトリプトファンアミノ酸よりもチロシン類似体で優先的にアミノアシル化する。例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号７０、又は配列番号７０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくはその機能的断片若しくは変異体を含んでもよい。

【0062】

特定の実施形態では、上記アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍ．バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来し、例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍ．バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ（又はその変異体）を、天然に存在するピロリシンアミノ酸よりもピロリシン類似体で優先的にアミノアシル化する。例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１０１、又は配列番号１０１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、若しくはその機能的断片若しくは変異体を含んでもよい。

【0063】

配列同一性は、当業者の技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して決定されてもよい。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎら、（１９９０） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３） Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ． ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７） ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ２５：３３８９－３４０２。これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって採用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析は、配列類似性検索のために調整されている。配列データベースを検索する際の基本的な問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９４） ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ６：１１９－１２９を参照。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ヒストグラム、説明、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ、行列及びフィルタの検索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトスコア行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、（１９９２） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、以下のように調整されてもよい：Ｑ＝１０（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ生成ペナルティ））；Ｒ＝１０（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ伸張ペナルティ））；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ったｗｉｎｋ^ｔｈ位置ごとにワードヒットを生成する）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップ付き（分離した）アライメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。等価なｂｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であってもよい。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物工学情報センター））ＢＬＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｏｎパラメータ（例えば：－Ｇ、ギャップを開くためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについては５／タンパク質については１１；－Ｅ、ギャップを伸張するためのコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについて２／タンパク質について１；－ｑ、ヌクレオチドミスマッチのペナルティ［整数］：デフォルト＝－３；－ｒ、ヌクレオチドマッチに対する報酬［整数］：デフォルト＝１；－ｅ、期待値［実数］：デフォルト＝１０；－Ｗ、ワードサイズ［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドについて１１／メガブラスト（ｍｅｇａｂｌａｓｔ）について２８／タンパク質について３；－ｙ、ビット単位のｂｌａｓｔ（ブラスト）伸張のためのドロップオフ（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎについては２０／その他については７；－Ｘ、ギャップ付きアライメントについてのＸドロップオフ値（ビット単位）：デフォルト＝すべてのプログラムについて１５であり、ｂｌａｓｔｎには適用なし；並びに－Ｚ、ギャップ付きアライメントについての最終Ｘドロップオフ値（ビット単位）：ｂｌａｓｔｎについては５０、その他については２５）を使用して検索が行われてもよい。ペアワイズタンパク質アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷも使用されてもよい（デフォルトパラメータは、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列及びＧａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ開放ペナルティ）＝１０及びＧａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１を含んでもよい）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において入手可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）及びＬＥＮ＝３（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用する。Ｂｅｓｔｆｉｔタンパク質比較における同等の設定は、ＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。

【0064】

タンパク質、例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素を生成する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法によって合成することができる。目的のタンパク質をコードする得られたＤＮＡ分子を、例えば発現制御配列を含む他の適切なヌクレオチド配列にライゲーション（連結）して、所望のタンパク質をコードする従来の遺伝子発現構築物（すなわち発現ベクター）を生成することができる。明確な（規定の）遺伝子構築物の生成は、当該技術分野における日常的な技術の範囲内である。

【0065】

所望のタンパク質（例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素）をコードする核酸を発現ベクターに組み込む（ライゲーションする）ことができ、これを従来のトランスフェクション又は形質転換技術によって宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、及び骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が所望のタンパク質を発現することを可能にする条件下で増殖させることができる。

【0066】

具体的な発現及び精製の条件は、用いられる発現系に応じて変わる。例えば、遺伝子が大腸菌において発現される場合、遺伝子は、最初に、適切な細菌プロモーター（例えば、Ｔｒｐ又はＴａｃ）及び原核生物シグナル配列の下流に操作された遺伝子を配置することによって発現ベクターにクローニングされる。発現されたタンパク質は分泌されてもよい。発現されたタンパク質は、屈折体又は封入体中に蓄積してもよく、これは、フレンチプレス又は超音波処理による細胞の破壊後に収集することができる。次いで、屈折体が可溶化され、タンパク質が、当該技術分野で公知の方法によってリフォールディング及び／又は切断されてもよい。

【0067】

操作された遺伝子が真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において発現される場合、遺伝子は最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリＡ配列、及び終止コドンを含有する発現ベクターに挿入される。場合により、ベクター又は遺伝子構築物は、エンハンサー及びイントロンを含有してもよい。この遺伝子構築物は、従来の技術を用いて真核生物宿主細胞に導入することができる。

【0068】

目的のタンパク質（例えば、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素）は、そのようなタンパク質の発現を可能にする条件下で、そのタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させる（培養する）ことによって生成することができる。発現後、タンパク質を回収し、当該技術分野で公知の技術、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ又はヒスチジンタグ等の親和性タグを用いて精製又は単離することができる。

【0069】

アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素を生成するための、及びこの合成酵素の基質特異性を変化させるためのさらなる方法は、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００９０４９号明細書、Ｈａｍａｎｏ－Ｔａｋａｋｕら（２０００） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ． ２７５（５１）：４０３２４－４０３２８、Ｋｉｇａら（２００２） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９９（１５）：９７１５－９７２３、及びＦｒａｎｃｋｌｙｎら（２００２） ＲＮＡ、８：１３６３－１３７２に見出すことができる。

【0070】

本発明は、本明細書に開示されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸も包含する。例えば、本明細書に開示されるロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５５～６７に示されている。従って、本発明は、配列番号５５～６７のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号５５～６７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号５５～６７のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号５５～６７のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。

【0071】

本明細書に開示されるトリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０３に示される。従って、本発明は、配列番号１０３のヌクレオチド配列、又は配列番号１０３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号１０３によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０３によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。

【0072】

本明細書に開示されるチロシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７１に示される。従って、本発明は、配列番号７１のヌクレオチド配列、又は配列番号７１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号７１によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号７１によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。

【0073】

本明細書に開示されるピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０２に示される。従って、本発明は、配列番号１０２のヌクレオチド配列、又は配列番号１０２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号１０２によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０２によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。

【0074】

ＩＩ． ｔＲＮＡ
本発明は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みを媒介する転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に関する。

【0075】

タンパク質合成時に、ｔＲＮＡ分子は、成長中のタンパク質（ポリペプチド）鎖への組み込みのためにアミノ酸をリボソームに渡す（届ける）。ｔＲＮＡは、典型的には７０～１００ヌクレオチド程度の長さである。活性ｔＲＮＡは、その合成中にｔＲＮＡに転写されてもよく、又は転写後プロセシング中に後に付加されてもよい３’ＣＣＡ配列を含有する。アミノアシル化の間、所与のｔＲＮＡ分子に結合しているアミノ酸は、３’末端リボースの２’又は３’ヒドロキシル基に共有結合して、アミノアシル－ｔＲＮＡ（ａａ－ｔＲＮＡ）を形成する。アミノ酸は、２’－ヒドロキシル基から３’－ヒドロキシル基に、及びその逆に自発的に移動することができるが、３’－ＯＨ位置からリボソームにおいて成長中のタンパク質鎖に組み込まれることが理解される。折り畳まれたａａ－ｔＲＮＡ分子の他端のループは、アンチコドンとして知られる３塩基の配列を含む。このアンチコドン配列がリボソーム結合ｍＲＮＡ中の相補的な３塩基コドン配列とハイブリダイズ又は塩基対合すると、ａａ－ｔＲＮＡはリボソームに結合し、そのアミノ酸がリボソームによって合成されているポリペプチド鎖に組み込まれる。特定のコドンと塩基対合するすべてのｔＲＮＡは、単一の特定のアミノ酸でアミノアシル化されるので、遺伝コードの翻訳は、ｔＲＮＡによって行われる。ｍＲＮＡ中の６１個の非終止コドンの各々は、その同族ａａ－ｔＲＮＡの結合及びリボソームによって合成されている成長中のポリペプチド鎖への単一の特定のアミノ酸の付加を導く。用語「同族」は、共に機能する成分、例えば、ｔＲＮＡ及びアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素を指す。

【0076】

サプレッサーｔＲＮＡは、所与の翻訳系におけるｍＲＮＡの読み取りを変化させる修飾ｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは、終止コドン、４塩基コドン、又はレアコドン（使用頻度の低いコドン）等のコドンを介して読み込まれてもよい。サプレッサー（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）におけるこの単語の使用は、特定の状況下で、その修飾ｔＲＮＡがｍＲＮＡ中のコドンの典型的な表現型効果を「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」という事実に基づく。サプレッサーｔＲＮＡは、典型的には、コドン特異性を変化させるアンチコドン、又はｔＲＮＡのアミノアシル化特性（アイデンティティ）を変化させるある位置のいずれかに変異（修飾）を含有する。「抑制活性」という用語は、ｔＲＮＡ、例えばサプレッサーｔＲＮＡが、目的の系における内因性翻訳機構によって読み込まれないコドン（例えば、未成熟終止コドン）を読み込む能力を指す。

【0077】

特定の実施形態では、ｔＲＮＡ（例えば、サプレッサーｔＲＮＡ）は、修飾アンチコドン領域を含有し、修飾アンチコドンは、対応する天然に存在するアンチコドンとは異なるコドンとハイブリダイズする。

【0078】

特定の実施形態では、ｔＲＮＡは、ＵＡＧ（すなわち、「アンバー（ａｍｂｅｒ）」終止コドン）、ＵＧＡ（すなわち、「オパール（ｏｐａｌ）」終止コドン）、及びＵＡＡ（すなわち、「オーカー（ｏｃｈｒｅ）」終止コドン）から選択されるコドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む。

【0079】

特定の実施形態では、ｔＲＮＡは、非標準コドン、例えば４ヌクレオチドコドン又は５ヌクレオチドコドン、にハイブリダイズするアンチコドンを含む。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ及びＣＣＣＵが挙げられる。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、及びＵＡＧＧＣが挙げられる。非標準コドン、例えば４ヌクレオチドコドン又は５ヌクレオチドコドン、にハイブリダイズするアンチコドンを含むｔＲＮＡ、及びそのようなｔＲＮＡを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、例えば、Ｍｏｏｒｅら（２０００） Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ． ２９８：１９５；Ｈｏｈｓａｋａら（１９９９） Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． １２１：１２１９４；Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００２） ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ ９：２３７－２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ（２００１） Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．３０７：７５５－７６９；及び国際公開第２００５／００７８７０号パンフレットに記載されている。

【0080】

本明細書で使用する場合、用語「ｔＲＮＡ」は、参照（例えば、野生型）ｔＲＮＡ配列と比較して１つ以上の変異（例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入）を有する変異体を含む。特定の実施形態では、ｔＲＮＡは、単一の変異（例えば、本明細書で企図される変異）を含むか、それからなるか、若しくはそれから本質的になってもよいし、又は２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個若しくは１５個を超える数の変異（例えば、本明細書で企図される変異）の組み合わせを含むか、それらからなるか、若しくはそれから本質的になってもよい。ｔＲＮＡが、１～１５、１～１０、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～１５、２～１０、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１５、３～１０、３～７、３～６、３～５、又は３～４の変異（例えば、本明細書で企図される変異）を含むか、それらからなるか、又はそれから本質的になってもよいということが企図される。

【0081】

特定の実施形態では、変異体サプレッサーｔＲＮＡは、対応する野生型サプレッサーｔＲＮＡ（この文脈において、野生型サプレッサーｔＲＮＡは、抑制活性を付与するためのアンチコドン領域に対する任意の修飾を除いて野生型ｔＲＮＡ分子に対応するサプレッサーｔＲＮＡを指す）と比較して、非天然アミノ酸（例えば、本明細書で企図される非天然アミノ酸）を哺乳動物タンパク質に組み込む活性が増加している。変異体サプレッサーｔＲＮＡの活性は、野生型サプレッサーｔＲＮＡと比較して、例えば、約２．５～約２００倍、約２．５～約１５０倍、約２．５～約１００倍、約２．５～約８０倍、約２．５～約６０倍、約２．５～約４０倍、約２．５～約２０倍、約２．５～約１０倍、約２．５～約５倍、約５～約２００倍、約５～約１５０倍、約５～約１００倍、約５～約８０倍、約５～約６０倍、約５～約４０倍、約５～約２０倍、約５～約１０倍、約１０～約２００倍、約１０～約１５０倍、約１０～約１００倍、約１０～約８０倍、約１０～約６０倍、約１０～約４０倍、約１０～約２０倍、約２０～約２００倍、約２０～約１５０倍、約２０～約１００倍、約２０～約８０倍、約２０～約６０倍、約２０～約４０倍、約４０～約２００倍、約４０～約１５０倍、約４０～約１００倍、約４０～約８０倍、約４０～約６０倍、約６０～約２００倍、約６０～約１５０倍、約６０～約１００倍、約６０～約８０倍、約８０～約２００倍、約８０～約１５０倍、約８０～約１００倍、約１００～約２００倍、約１００～約１５０倍、又は約１５０～約２００倍増加してもよい。

【0082】

上記ｔＲＮＡは、インビトロ又はインビボで機能してもよく、翻訳系（例えば、インビトロ翻訳系又は細胞）に、成熟ｔＲＮＡ（例えば、アミノアシル化されたｔＲＮＡ）として、又はｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして提供されることが可能であることが企図される。

【0083】

ｔＲＮＡは、細菌源、例えば、大腸菌、サーマス・サーモフィルス、又はバチルス・ステアロサーモフィルスに由来してもよい。ｔＲＮＡはまた、古細菌源、例えば、メタノサルシナセア属又はデスルフィトバクテリウム属、Ｍ．バルケリ（Ｍｂ）、Ｍ．アルバス（Ｍａ）、Ｍ．マゼイ（Ｍｍ）又はＤ．ハフニエンス（Ｄｈ）ファミリーのいずれか、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、ハロフェラックス・ボルカニ、ハロバクテリウム種ＮＲＣ－１、又はアルカエオグロブス・フルギダスに由来してもよい。他の実施形態では、真核生物源、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、又は動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物等）も使用することができる。

【0084】

特定の実施形態では、上記ｔＲＮＡは、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡに由来し、例えば、大腸菌ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、本明細書で企図されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然に存在するロイシンアミノ酸よりもロイシン類似体を優先的に結合する。

【0085】

例えば、上記ｔＲＮＡは、配列番号１６～４３のいずれか１つのヌクレオチド配列、若しくは配列番号１６～４３のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなってもよい。

【0086】

特定の実施形態では、上記ｔＲＮＡは、大腸菌トリプトファニルｔＲＮＡに由来し、例えば、大腸菌トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に由来するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、本明細書で企図されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然に存在するトリプトファンアミノ酸よりもトリプトファン類似体を優先的に結合する。

【0087】

例えば、上記ｔＲＮＡは、配列番号４９～５４若しくは１０８～１１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、若しくは配列番号４９～５４若しくは１０８～１１３のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなってもよい。

【0088】

特定の実施形態では、上記ｔＲＮＡは、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡに由来し、例えば、大腸菌チロシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、本明細書で企図されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然に存在するチロシンアミノ酸よりもチロシン類似体を優先的に結合する。

【0089】

例えば、上記ｔＲＮＡは、配列番号６８～６９若しくは１０４～１０５のいずれか１つのヌクレオチド配列、若しくは配列番号６８～６９若しくは１０４～１０５のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなってもよい。

【0090】

特定の実施形態では、上記ｔＲＮＡは、Ｍ．バルケリピロリシル－ｔＲＮＡに由来し、例えば、Ｍ．バルケリピロリシル－ｔＲＮＡ合成酵素に由来するアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、本明細書で企図されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然に存在するピロリシンアミノ酸よりもピロリシン類似体を優先的に結合する。

【0091】

例えば、上記ｔＲＮＡは、配列番号７２～１００若しくは１０６～１０７のいずれか１つのヌクレオチド配列、若しくは配列番号７２～１００若しくは１０６～１０７のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなってもよい。

【0092】

本明細書全体を通して、ｔＲＮＡが１つ以上のチミン（Ｔ）を含むヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる各場合において、１つ以上のチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）を、若しくはすべてのチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）含む同じヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるｔＲＮＡも企図されることが理解される。同様に、ｔＲＮＡが１つ以上のウラシル（Ｕ）を含むヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる各場合において、１つ以上のウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を、若しくはすべてのウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）含むヌクレオチド配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるｔＲＮＡも企図される。加えて、塩基に対するさらなる修飾が存在してもよい。

【0093】

組換えｔＲＮＡを生成する方法は、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００９０４９号明細書、Ｆｏｒｓｔｅｒら（２００３） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ １００（１１）：６３５３－６３５７、及びＦｅｎｇら（２００３） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ １００（１０）：５６７６－５６８１に記載されている。

【0094】

ｔＲＮＡは、酵素的方法又は化学的方法を含む任意の方法によって、所望の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）でアミノアシル化されてもよい（すなわち、所望の非天然アミノ酸を結合してもよい）。

【0095】

ｔＲＮＡに結合させることができる酵素分子としては、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、例えば、本明細書に開示されるアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる。ｔＲＮＡに結合させることができるさらなる酵素分子としては、例えば、Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅら（１９９５） ＳＣＩＥＮＣＥ ２６７：６４３－６４７、Ｌｏｈｓｅら（１９９６） ＮＡＴＵＲＥ ３８１：４４２－４４４、Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００３） ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ １０：１０７７－１０８４、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されているリボザイムが挙げられる、

【0096】

化学的アミノアシル化法としては、Ｈｅｃｈｔ（１９９２）ＡＣＣ．ＣＨＥＭ．ＲＥＳ． ２５：５４５、Ｈｅｃｋｌｅｒら（１９８８） ＢＩＯＣＨＥＭ． １９８８、２７：７２５４、Ｈｅｃｈｔら（１９７８） Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ． ２５３：４５１７、Ｃｏｒｎｉｓｈら（１９９５） ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．ＩＮＴ．ＥＤ．ＥＮＧＬ． ３４：６２１、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９９１） Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． １１３：２７２２、Ｎｏｒｅｎら（１９８９） ＳＣＩＥＮＣＥ ２４４：１８２、Ｂａｉｎら（１９８９） Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． １１１：８０１３、Ｂａｉｎら（１９９２） ＮＡＴＵＲＥ ３５６：５３７、Ｇａｌｌｉｖａｎら（１９９７） ＣＨＥＭ．ＢＩＯＬ． ４：７４０、Ｔｕｒｃａｔｔｉら（１９９６） Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ． ２７１：１９９９１、Ｎｏｗａｋら（１９９５） ＳＣＩＥＮＣＥ ２６８：４３９、Ｓａｋｓら（１９９６）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ． ２７１：２３１６９、及びＨｏｈｓａｋａら（１９９９） Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． １２１：３４に記載されているものが含まれる。

【0097】

ＩＩＩ． 非天然アミノ酸（ＵＡＡ）
本発明は、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）及びタンパク質へのそれらの組み込みに関する。

【0098】

本明細書で使用する場合、非天然アミノ酸は、以下の２０個の遺伝的にコードされるα－アミノ酸以外の任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はアミノ酸類似体を指す：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン。これら２０種の天然アミノ酸の構造については、例えば、Ｌ．ＳｔｒｙｅｒによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、１９８８、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨークを参照されたい。非天然アミノ酸という用語は、天然アミノ酸の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸も含む。

【0099】

非天然アミノ酸は、典型的には、側鎖の構造のみにおいて天然アミノ酸と異なるため、非天然アミノ酸は、例えば、天然に存在するタンパク質において形成されるのと同じ様式で、他のアミノ酸とアミド結合を形成してもよい。しかしながら、非天然アミノ酸は、それ自体を天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、側鎖は、アルキル－、アリール－、アシル－、ケト－、アジド－、ヒドロキシル－、ヒドラジン、シアノ－、ハロ－、ヒドラジド、アルケニル、アルキル、エーテル、チオール、セレノ－、スルホニル－、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン等、又はこれらのいずれかの組み合わせを含んでもよい。他の非天然アミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識したアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合又は非共有結合で相互作用するアミノ酸、光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）アミノ酸及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含むアミノ酸、糖置換セリン等のグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長された側鎖（ポリエーテル又は長鎖炭化水素（約５を超える数、又は約１０を超える数の炭素が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない）を有するアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0100】

新規な側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸はまた、場合により修飾された骨格構造も含む。

【0101】

多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン等の天然アミノ酸に基づく。チロシン類似体には、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが含まれ、この置換チロシンは、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ_６～Ｃ_２０の直鎖又は分岐炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素基、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。加えて、多置換アリール環も企図される。グルタミン類似体としては、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なフェニルアラニン類似体としては、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されず、置換基は、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むが、これに限定されない）等を含む。非天然アミノ酸の具体例としては、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－Ｄｏｐａ、フッ素化されたフェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン（リン酸化セリン）、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、及びｐ－プロパルギルオキシ－フェニルアラニン等が挙げられるが、これらに限定されない

【0102】

種々の非天然アミノ酸の構造の例は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５号明細書、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット及びＫｉｉｃｋら（２００２） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９９：１９－２４に提供されている。

【0103】

特定の実施形態では、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、バイオコンジュゲーションハンドルを含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、それぞれが異なるバイオコンジュゲーションハンドルを有する２つの異なるＵＡＡを単一のタンパク質に部位特異的に組み込むために使用されてもよい。特定の実施形態では、２つのバイオコンジュゲーションハンドルは、相互に直交するコンジュゲーション化学を用いて、それぞれが２つの異なる標識に化学選択的にコンジュゲートすることができるように選択することができる。このようなバイオコンジュゲーションハンドルの対としては、例えば、以下が挙げられる：アジド及びアルキン、アジド及びケトン／アルデヒド、アジド及びシクロプロペン、ケトン／アルデヒド及びシクロプロペン、５－ヒドロキシインドール及びアジド、５－ヒドロキシインドール及びシクロプロペン、並びに５－ヒドロキシインドール及びケトン／アルデヒド。

【0104】

ポリペプチド中の非天然アミノ酸は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、安定化剤（例えば、ポリエチレングリコールの誘導体、光活性化可能な架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類似体、抗体若しくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、核内低分子ＲＮＡ（小核ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）、若しくは非コードＲＮＡ）、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア（蛍光色素）、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合若しくは非共有結合で相互作用する基、光ケージ化部分、化学線励起可能部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長された側鎖、炭素結合糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ若しくは生化学的プローブ（例えば、ＰＥＴプローブ、蛍光プローブ若しくはＥＰＲプローブ）、リン光基、化学発光基、電子密度の高い基、磁気基、介在（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能な標識（例えば、生細胞対非生細胞における取り込みの分析のため）、小分子、量子ドット、ナノトランスミッター、免疫調節分子、標的化剤、脂質ベースの構造（例えば、脂質ベースのナノ粒子）、ミクロスフェア、又は上記の任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない別の分子をポリペプチドに結合させるために使用されてもよい。

【0105】

任意の適切な非天然アミノ酸を、目的のタンパク質に組み込むための本明細書に記載の方法と共に使用することができる。

【0106】

非天然アミノ酸は、ロイシン類似体（本明細書では誘導体とも呼ばれる）であってもよい。特定の実施形態では、ロイシン類似体は、天然に存在しないロイシン類似体である。本発明は、図２Ａに示されるロイシン類似体、又はこのロイシン類似体を含む組成物を提供する。例えば、図２Ａの式Ａは、ｎ単位（０～２０単位）の長さの炭素含有鎖を含む側鎖を含有するアミノ酸類似体を描く。Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２又はＮＨはＸ位に存在し、ｎ単位（０～２０単位）の長さの別の炭素含有鎖が続くことができる。官能基Ｙは、第２の炭素含有鎖の末端炭素に結合している（例えば、図２Ａに描かれる官能基１～１２。式中、Ｒは、第２の炭素含有側鎖の末端炭素原子への連結部分を表す）。１つの例では、これらの官能基は、部位特異的ＵＡＡ組み込みに適している任意の目的のタンパク質への任意の適したリガンドのバイオコンジュゲーションに使用することができる。図２Ａの式Ｂは、第２の炭素含有鎖又は第１の炭素含有鎖にそれぞれ結合したＺ－Ｙ_２又はＺ－Ｙ_３のいずれかとして示される側鎖を含有する類似のアミノ酸類似体を描く。Ｚは、（ＣＨ_２）ｎ単位を含む炭素鎖を表し、式中、ｎは０～２０の任意の整数である。Ｙ_２又はＹ_３は、独立して、Ｙ_１のものと同じ又は異なる基であることができる。本発明は、図２Ｂに示されるロイシン類似体（ＬＣＡ、ＬＫＥＴ、若しくはＡＣＡ）、又は図２Ｂに示されるロイシン類似体を含む組成物も提供する。さらなる例示的なロイシン類似体には、官能基、例えば、アルキン、アジド、シクロプロペン、アルケン、ケトン、アルデヒド、ジアジリン、又はテトラジン官能基を含む直鎖状ハロゲン化アルキル及び直鎖状脂肪族鎖、並びに図２Ｃに示される構造１～６から選択されるものが含まれる。しかしながら、図２Ａ～２Ｃに示される任意のアミノ酸の第１の炭素に両方とも結合したアミノ基及びカルボキシレート基は、ロイシン類似体がタンパク質又はポリペプチド鎖に組み込まれるとき、ペプチド結合の部分を構成するということが企図される。

【0107】

加えて、Ｃ５ＡｚＭｅ及びＬＣＡと呼ばれる、図４Ａに示されるロイシン類似体を、本発明の実施において使用することができる。

【0108】

Ｃ５ＡｚＭｅ（図４Ｂに示される化合物５）は、図４Ｂに概説される合成と同様の様式で調製することができる。化合物５は、例えば、化合物４の脱保護によって得ることができる。化合物４の脱保護は、保護基（例えば、Ｂｏｃ）の除去を含む。脱保護のための条件としては、ＤＣＭ中のＨＣｌを挙げてもよいが、これに限定されない。化合物４は、例えば、適切な求核試薬（例えば、Ｎ_３ ^－）に曝露されたときの化合物３の求核置換を介して生成することができる。求核置換のための例示的な条件としては、８０℃のＤＭＦ中のＮａＮ_３が挙げられるが、これに限定されない。化合物３は、例えば、化合物２への化合物１の求核付加を介して調製することができる。求核付加のための例示的な条件としては、０℃～ＲＴでのＫ_２ＣＯ_３が挙げられるが、これに限定されない。さらには、所望に応じて、化合物５のエステルは、穏やかな水性塩基性条件への曝露によって除去して、ＵＡＡのカルボン酸形態を生成することができる。

【0109】

ＬＣＡ（図４Ｆに示される化合物２１）は、図４Ｆに概説される合成と同様の方法で調製することができる。化合物２１は、例えば、化合物２０を適切な酸、例えば、限定されないが、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌに曝露することによって化合物２０から調製することができる。化合物２０は、イミン１９の加水分解によって生成することができる。イミン１９の加水分解は、例えばＴＨＦ中の１Ｍ ＨＣｌ（水溶液）を用いて達成することができる。化合物１９は、例えば、適切な求核試薬（例えば、Ｎ_３ ^－）に曝露されたときの化合物１８の求核置換を介して生成することができる。求核置換のための例示的な条件としては、ＤＭＦ中のＮａＮ_３が挙げられるが、これに限定されない。化合物１８は、化合物１６のエノレートの化合物１７への求核付加によって調製することができる。化合物１６及び１７からの化合物の合成を達成するための適切な条件としては、ＤＣＭ中の硫酸水素テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨＳ）及び１０％ＮａＯＨが挙げられるが、これに限定されない。ＬＣＡの合成のためのさらなる方法は図４Ｄ及び４Ｅに示されている。

【0110】

特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、トリプトファン類似体（本明細書では誘導体とも呼ばれる）である。特定の実施形態では、トリプトファン類似体は、天然に存在しないトリプトファン類似体である。例示的なトリプトファン類似体としては、５－アジドトリプトファン、５－プロパルギルオキシトリプトファン、５－アミノトリプトファン、５－メトキシトリプトファン、５－Ｏ－アリルトリプトファン又は５－ブロモトリプトファンが挙げられる。さらなる例示的なトリプトファン類似体は図３に描かれている。しかしながら、図３のトリプトファン類似体の第１の炭素に両方とも結合したアミノ及びカルボキシレート基は、トリプトファン類似体がタンパク質又はポリペプチド鎖に組み込まれるとき、ペプチド結合の部分を構成するということが企図される。

【0111】

加えて、ＡｚＷと称される、図４Ａに示されるトリプトファン類似体を、本発明の実施において使用することができる。

【0112】

ＡｚＷ（図４Ｃに示される化合物１５）は、図４Ｃに概説される合成と同様の様式で調製することができる。化合物１５は、例えば、塩基性条件下で、その塩酸塩１４から調製することができる。例示的な塩基性条件としては、ＴＨＦ中のＫＯｔＢｕが挙げられるが、これに限定されない。塩酸塩１４は、例えば、化合物１３の鹸化に続く脱保護によって調製することができる。鹸化及び保護基（例えば、Ｂｏｃ）の脱保護のための条件は、当業者に公知である。例えば、鹸化は、ＭｅＯＨ中１Ｍ ＮａＯＨを用いて達成することができる。特定の実施形態では、脱保護のための条件としては、ＨＣｌ（水溶液）が挙げられるが、これに限定されない。化合物１３は、例えば、化合物１２と適切なアジド源との金属媒介カップリングによって合成することができる。化合物１３は、例えば、化合物１２から、ＭｅＯＨ中のＮａＮ_３、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２を使用して作製することができる。化合物１２は、例えば、化合物１１の金属触媒ホウ素化によって化合物１１から調製することができる。金属触媒ホウ素化のための例示的な条件としては、１，４－ジオキサン中のＢ_２ｐｉｎ_２、ＰｄＣｌ_２・ｄｐｐｆ、及びＫＯＡｃが挙げられるが、これに限定されない。化合物１１は、例えば、適切な保護基（例えば、Ｂｏｃ）を用いた化合物１０の保護を介して調製することができる。化合物１０の保護は、ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＢｏｃ_２Ｏ、Ｅｔ_３Ｎ、及びＤＭＡＰを使用して達成することができる。化合物１０は、例えば、オキシムを還元するのに適した条件下で、例えば、ＡｃＯＨ中のＺｎを使用して、化合物９から合成することができる。化合物９は、例えば、化合物７へのインドール８の求核付加を介して合成することができる。化合物８の化合物７へのナルコレプシー（ｎａｒｃｏｌｅｐｔｉｃ）付加は、ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＮａ_２ＣＯ_３の存在下で起こることが可能である。化合物７は、例えば、メタノール中で化合物６をヒドロキシルアミン塩酸塩に曝露することによって調製することができる。

【0113】

特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、チロシン類似体（本明細書では誘導体とも呼ばれる）である。特定の実施形態では、チロシン類似体は、天然に存在しないチロシン類似体である。例示的なチロシン類似体としては、ｏ－メチルチロシン（ＯｍｅＹ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ＡｚＦ）、ｏ－プロパルギルチロシン（ＯｐｒｏｐＹ又はＰｒＹ）、及びｐ－アセチルフェニルアラニン（ＡｃＦ）が挙げられる。例示的なトリプトファン類似体は図５に描かれている。

【0114】

特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、ピロリシン類似体（本明細書では誘導体とも呼ばれる）である。特定の実施形態では、ピロリシン類似体は、天然に存在しないピロリシン類似体である。例示的なピロリシン類似体としては、アミノカプリル酸（Ｃａｐ）、Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（Ｂｏｃ－リシン、ＢｏｃＫ）、アジドリシン（ＡｚＫ）、Ｈ－プロパルギル－リシン（ｈＰｒＫ）、及びシクロプロペンリシン（ＣｐＫ）が挙げられる。例示的なピロリシン類似体は図６に描かれている。

【0115】

多くの非天然アミノ酸は、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）（セントルイス、ミズーリ州、米国）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ノババイオケム）（ダルムシュタット、ドイツ）、又はＰｅｐｔｅｃｈ（ペプテック）（バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州、米国）から市販されている。市販されていないものは、当業者に公知の標準的な方法を用いて合成することができる。有機合成技術については、例えば、Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｎｄｏｎのＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第２版、Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ、ボストン、マサチューセッツ州）；ＭａｒｃｈのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）；並びにＣａｒｅｙ及びＳｕｎｄｂｅｒｇのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、パートＡ及びパートＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）を参照。非天然アミノ酸の合成を記載するさらなる例示的な刊行物は、国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット、米国特許出願公開第２００４／０１９８６３７号明細書、Ｍａｔｓｏｕｋａｓら（１９９５） Ｊ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ． ３８：４６６０－４６６９、Ｋｉｎｇら（１９４９） Ｊ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． ３３１５－３３１９、Ｆｒｉｅｄｍａｎら（１９５９） Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ． ８１：３７５０－３７５２、Ｃｒａｉｇら（１９８８） Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ． ５３：１１６７－１１７０、Ａｚｏｕｌａｙら（１９９１） ＥＵＲ．Ｊ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ． ２６：２０１－５、Ｋｏｓｋｉｎｅｎら（１９８９） Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ． ５４：１８５９－１８６６、Ｃｈｒｉｓｔｉｅら（１９８５） Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ． ５０：１２３９－１２４６、Ｂａｒｔｏｎら（１９８７） ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ４３：４２９７－４３０８、及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら（１９９２） Ｊ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ． ３５：４６０２－７に見られる。

【0116】

ＩＶ． ベクター
ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、又は任意の他の目的の分子は、その分子をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことによって、目的の細胞において発現されてもよい。本明細書で使用する場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために充分なシスエレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給されることが可能である。

【0117】

ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、又は任意の他の目的の分子は、その分子をコードする遺伝子を適切な導入ベクターに組み込むことによって、目的の細胞に導入されてもよい。「導入ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを細胞の内部に送達するために使用することができる組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。ベクターは、発現ベクター及び導入ベクターの両方であってもよいことが理解される。

【0118】

ベクター（例えば、発現ベクター又は導入ベクター）は、コスミド、プラスミド（例えば、裸のもの又はリポソームに含まれるもの）、レトロトランスポゾン（例えば、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ（ピギーバック）、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（スリーピングビューティー））、並びに目的の組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の当該技術分野で公知のすべてのベクターを含む。

【0119】

典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネーター配列（転写終止配列）、真核生物若しくは原核生物、又は両方におけるカセットの複製を可能にする配列（シャトルベクターを含むが、これに限定されない）、並びに原核生物系及び真核生物系の両方の選択マーカーを含有する汎用発現カセットを含む。

【0120】

特定の実施形態では、ベクターは、上記サプレッサーｔＲＮＡ及び／又はｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列又はプロモーターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、遺伝子に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、典型的には連続している。しかしながら、エンハンサーは概して、プロモーターから数キロベースだけ離れているときに機能し、イントロン配列は可変長であってもよいので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結されてもよいが、直接隣接しておらず、異なる対立遺伝子又は染色体からのトランスでさえ機能してもよい。

【0121】

使用されてもよい例示的なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＵｂｉＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、７ＳＫプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、又は任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩ、及びβ－アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない、真核細胞プロモーター等の細胞プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。使用されてもよい他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、及びＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好適なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかであろう。特定の実施形態では、ベクターは、ＣＭＶ若しくはＥＦ１αプロモーターに作動可能に連結されたアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするヌクレオチド配列、及び／又はＵ６若しくはＨ１プロモーターに作動可能に連結されたサプレッサーｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0122】

特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。用語「ウイルス」は、タンパク質合成機構又はエネルギー生成機構を有さない偏性細胞内寄生体を指すために本明細書で使用される。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ポリオーマウイルスベクター（例えば、サル空胞化ウイルス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ４０、ＳＶ４０）ベクター）、ポックスウイルスベクター、及びシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。

【0123】

ウイルスは、ＲＮＡウイルス（ＲＮＡから構成されるゲノムを有する）又はＤＮＡウイルス（ＤＮＡから構成されるゲノムを有する）であってもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクターはＤＮＡウイルスベクターである。例示的なＤＮＡウイルスとしては、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アスファルウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２））、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０））、並びにポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、鶏痘ウイルス、羊痘ウイルス、粘液腫ウイルス）が挙げられる。特定の実施形態では、ウイルスベクターはＲＮＡウイルスベクターである。例示的なＲＮＡウイルスとしては、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１））及びトロウイルスが挙げられる。

【0124】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
特定の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、ディペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属及びパルボウイルス科の小さな無エンベロープの正２０面体ウイルスである。ＡＡＶは、約４．７ｋｂの一本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、いくつかの組織型の分裂細胞及び静止細胞の両方に感染することができ、異なるＡＡＶ血清型は異なる組織向性を示す。

【0125】

ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２、並びに非ヒト霊長類由来の１００を超える血清型（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（２００８） Ｊ．ＣＥＬＬ ＢＩＯＣＨＥＭ．、１０５（１）：１７－２４、及びＧａｏら（２００４） Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７８（１２）、６３８１－６３８８を参照）を含む、多数の血清学的に区別可能な型を含む。本発明において使用されるＡＡＶベクターの血清型は、送達の効率、組織向性、及び免疫原性に基づいて当業者が選択することができる。例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９は、中枢神経系への送達に使用することができる。ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９は、心臓への送達に使用することができる。ＡＡＶ－２は、腎臓への送達に使用することができる。ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９は、肝臓への送達に使用することができる。ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－９は肺への送達に使用することができ、ＡＡＶ－８は膵臓への送達に使用することができ、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、及びＡＡＶ－８は光受容細胞への送達に使用することができる。ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、及びＡＡＶ－８は、網膜色素上皮への送達に使用することができる。ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９は、骨格筋への送達に使用することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、限定されないが、ＡＡＶ－９（米国特許第７，１９８，９５１号明細書の配列番号１～３）、ＡＡＶ－２（米国特許第７，１９８，９５１号明細書の配列番号４）、ＡＡＶ－１（米国特許第７，１９８，９５１号明細書の配列番号５）、ＡＡＶ－３（米国特許第７，１９８，９５１の配列番号６）、及びＡＡＶ－８（米国特許第７，１９８，９５１号明細書の配列番号７）等の米国特許第７，１９８，９５１号明細書に開示される配列を含む。アカゲザルから特定されたＡＡＶ血清型、例えば、ｒｈ．８、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、及びｒｈ．７４も本発明において企図される。天然のＡＡＶ血清型に加えて、修飾されたＡＡＶカプシドが、送達の効率、組織向性及び免疫原性を改善するために開発されている。例示的な天然及び修飾ＡＡＶカプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号明細書、米国特許第９，４９３，７８８号明細書、及び米国特許第７，１９８，９５１号明細書、並びに国際公開第２０１７１８９９６４Ａ２号パンフレットに開示されている。

【0126】

野生型ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成及び組み込みを導くシグナル配列を含有する２つの１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ、ＩＴＲ）を含有する。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーターｐ５、ｐ１９、及びｐ４０は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの選択的スプライシングと結合した２つのｒｅｐプロモーターは、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質はゲノム複製に関与する。Ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、ｃａｐ遺伝子のスプライスバリアントである３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを形成する。

【0127】

複製、カプシド形成、及び組み込みのためのシス作用シグナルはＩＴＲ内に含まれるので、４．３ｋｂの内部ゲノムの一部又はすべては、外来ＤＮＡ、例えば、目的の外因性遺伝子のための発現カセットで置換されてもよい。従って、特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲに隣接する外因性遺伝子のための発現カセットを含むゲノムを含む。これらのＩＴＲは、カプシドと同じ血清型又はその誘導体に由来してもよい。あるいは、ＩＴＲは、カプシドとは異なる血清型のものであってもよく、それによってシュードタイプ（偽型）ＡＡＶを生成してもよい。特定の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ－２に由来する。特定の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ－５に由来する。ＩＴＲの少なくとも１つは、末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を変異又は欠失させるように改変されてもよく、それによって自己相補的ＡＡＶベクターの産生が可能になる。

【0128】

ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、ＡＡＶベクターを産生するために、例えばプラスミド上にトランスで提供されることが可能である。ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞株は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、並びにヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＶＡ（Ｗｅｉｔｚｍａｎら、Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１－２３頁、２０１１）によって提供されるヘルパー機能を発現しなければならない。ＡＡＶベクターを生成及び精製する方法は、詳細に記載されている（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒら、（２０１２） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、１４Ｄ．１．１－１４Ｄ．１．２１、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓを参照）。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、並びに昆虫細胞を含む、多数の細胞型が、ＡＡＶベクターを生成するために好適である（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号明細書、米国特許第５，３８７，４８４号明細書、米国特許第５，７４１，６８３号明細書、米国特許第５，６９１，１７６号明細書、米国特許第５，６８８，６７６号明細書、及び米国特許第８，１６３，５４３号明細書、米国特許出願公開第２００２００８１７２１号明細書、並びに国際公開第００／４７７５７号パンフレット、国際公開第００／２４９１６号パンフレット、及び国際公開第９６／１７９４７号パンフレットを参照）。ＡＡＶベクターは、典型的には、これらの細胞型において、ＩＴＲ隣接発現カセットを含有する１つのプラスミド、並びにさらなるＡＡＶ及びヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つ以上のさらなるプラスミドによって産生される。

【0129】

任意の血清型のＡＡＶが本発明において使用されてもよい。同様に、任意のアデノウイルス型が使用されてもよいことが企図され、当業者は、それらの所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の産生に適したＡＡＶ及びアデノウイルス型を特定することができる。ＡＡＶ粒子は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオジキサノール勾配、又はＣｓＣｌ勾配によって精製されてもよい。

【0130】

ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂであるか、又は４．７ｋｂより大きいか若しくは小さい（５．２ｋｂ程度の大きさの過大なサイズ、又は３．０ｋｂ程度の大きさのサイズのゲノムを含む）一本鎖ゲノムを有してもよい。従って、ＡＡＶベクターから発現される目的の外因性遺伝子が小さい場合、ＡＡＶゲノムはスタッファー配列（挿入配列、ｓｔｕｆｆｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでもよい。さらに、ベクターゲノムは、実質的に自己相補的であってもよく、それによって細胞における迅速な発現が可能になる。特定の実施形態では、自己相補的ＡＡＶベクターのゲノムは、５’から３’に向かって、５’ＩＴＲ；目的の遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター及び／又はエンハンサーを含む第１の核酸配列；機能的末端分離部位を有さない改変ＩＴＲ；第１の核酸配列に相補的又は実質的に相補的な第２の核酸配列；並びに３’ＩＴＲを含む。すべてのタイプのゲノムを含むＡＡＶベクターが、本発明の方法における使用に適している。

【0131】

ＡＡＶベクターの非限定的な例としては、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アジレント・テクノロジー））、ｐＡＡＶＫ－ＥＦ１α－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏ（システム・バイオ） カタログ番号ＡＡＶ５０２Ａ－１）、ｐＡＡＶＫ－ＥＦ１α－ＭＣＳ１－ＣＭＶ－ＭＣＳ２（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏ カタログ番号ＡＡＶ５０３Ａ－１）、ｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック） カタログ番号６２３１）、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ２（Ａｄｄｇｅｎｅ（アドジーン） プラスミド番号４６９５４）、ＡＡＶ－Ｓｔｕｆｆｅｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号１０６２４８）、ｐＡＡＶｓｃＣＢＰＩＧｐｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号３５６４５）、ＡＡＶＳ１＿Ｐｕｒｏ＿ＰＧＫ１＿３ｘＦＬＡＧ＿Ｔｗｉｎ＿Ｓｔｒｅｐ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号６８３７５）、ｐＡＡＶ－ＲＡＭ－ｄ２ＴＴＡ：：ＴＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ｐＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号６３９３１）、ｐＡＡＶ－ＵｂＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号６２８０６）、ｐＡＡＶＳ１－Ｐ－ＭＣＳ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号８０４８８）、ｐＡＡＶ－Ｇａｔｅｗａｙ（Ａｄｇｅｎｅ プラスミド番号３２６７１）、ｐＡＡＶ－Ｐｕｒｏ＿ｓｉＫＤ（Ａｄｇｅｎｅ プラスミド番号８６６９５）、ｐＡＡＶＳ１－Ｎｓｔ－ＭＣＳ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号８０４８７）、ｐＡＡＶＳ１－Ｎｓｔ－ＣＡＧ－ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号８０４８９）、ｐＡＡＶＳ１－Ｐ－ＣＡＧ－ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号８０４９０）、ｐＡＡＶｆ－ＥｎｈＣＢ－ｌａｃＺｎｌｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号３５６４２）及びｐＡＡＶＳ１－ｓｈＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド番号８２６９７）が挙げられる。これらのベクターは、治療的使用に適するように改変することができる。例えば、目的の外因性遺伝子を多重クローニング部位に挿入することができ、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏ又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を欠失させるか、又は別の（同じ又は異なる）目的の外因性遺伝子で置き換えることができる。ＡＡＶベクターのさらなる例は、米国特許第５，８７１，９８２号明細書、米国特許第６，２７０，９９６号明細書、米国特許第７，２３８，５２６号明細書、米国特許第６，９４３，０１９号明細書、米国特許第６，９５３，６９０号明細書、米国特許第９，１５０，８８２号明細書、及び米国特許第８，２９８，８１８号明細書、米国特許出願公開第２００９／００８７４１３号明細書、並びに国際公開第２０１７０７５３３５Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１７０７５３３８Ａ２号パンフレット、及び国際公開第２０１７２０１２５８Ａ１号パンフレットに開示されている。

【0132】

レンチウイルスベクター
特定の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターの例としては、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルスベクター、脾臓壊死ウイルスベクター、並びにラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルス等のレトロウイルス由来のベクターが挙げられる。レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入を媒介するための薬剤として有用である。

【0133】

特定の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。例示的なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）に由来するベクターが挙げられる。

【0134】

レトロウイルスベクターは、典型的には、ウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が欠失し、目的の遺伝子（複数種可）によって置き換えられるように構築される。構造遺伝子（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）は、当該技術分野で公知の遺伝子操作技術を用いてレトロウイルス骨格から除去されることが多い。従って、最小のレトロウイルスベクターは、５’から３’に向かって、５’末端反復配列（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル、任意選択の外因性プロモーター及び／又はエンハンサー、目的の外因性遺伝子、並びに３’ＬＴＲを含む。外因性プロモーターが提供されない場合、遺伝子発現は５’ＬＴＲによって駆動されるが、５’ＬＴＲは弱いプロモーターであり、発現を活性化するためにＴａｔの存在を必要とする。構造遺伝子は、レンチウイルスの製造のために別々のベクターで提供することができ、これは、産生されたビリオンを複製欠損にする。具体的には、レンチウイルスに関して、パッケージング系は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔ遺伝子をコードする単一のパッケージングベクター、並びにエンベロープタンパク質Ｅｎｖ（通常、その広い感染性のためにＶＳＶ－Ｇ）をコードする第３の別個のベクターを含んでもよい。パッケージング系の安全性を改善するために、パッケージングベクターを分割して、１つのベクターからＲｅｖを、別のベクターからＧａｇ及びＰｏｌを発現させることができる。Ｔａｔは、キメラ５’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを使用することによってパッケージング系から排除されることも可能であり、この場合、５’ＬＴＲのＵ３領域は、異種調節エレメントで置き換えられる。

【0135】

遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に組み込むことができる。最も簡単な構築物は、レトロウイルスの構造遺伝子が、ＬＴＲ内のウイルス調節配列の制御下で転写される単一の遺伝子によって置き換えられるものである。複数の遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクターも構築されている。通常、そのようなベクターにおいて、１つの遺伝子はウイルスＬＴＲの調節制御下にあるが、第２の遺伝子はスプライシングされたメッセージから発現されるか、又はそれ自体の内部プロモーターの調節下にある。

【0136】

従って、新しい遺伝子（複数種可）は、それぞれビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進する働きをする５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲに隣接している。「末端反復配列」又は「ＬＴＲ」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインであって、その天然配列の文脈において、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ及びＵ５の領域を含有するものを指す。ＬＴＲは、概して、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始及びポリアデニル化）及びウイルス複製に基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、並びにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含む多数の調節シグナルを含有する。Ｕ３領域はエンハンサー及びプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３及びＵ５領域に隣接している。特定の実施形態では、Ｒ領域は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）遺伝子エレメントを含み、これは、トランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用して、ウイルス複製を増強する。このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられる実施形態では必要とされない。

【0137】

特定の実施形態では、上記レトロウイルスベクターは、修飾された５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの修飾は、ウイルスを複製欠損にすることによってレンチウイルス系又はレトロウイルス系の安全性を改善するために行われることが多い。具体的な実施形態では、レトロウイルスベクターは、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターである。本明細書で使用する場合、ＳＩＮレトロウイルスベクターは、３’ＬＴＲ Ｕ３領域が、ウイルス複製の第１ラウンドを超えるウイルス転写を妨げるように（例えば、欠失又は置換によって）改変されている複製欠損レトロウイルスベクターを指す。これは、３’ＬＴＲ Ｕ３領域がウイルス複製中に５’ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用され、従って、ウイルス転写物はＵ３エンハンサー－プロモーターなしでは作製できないためである。さらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリアデニル化配列で置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、又は３’ＬＴＲ及び５’ＬＴＲの両方に対する改変等のＬＴＲに対する改変も本発明に含まれることに留意されたい。

【0138】

特定の実施形態では、５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために異種プロモーターで置き換えられる。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、高レベルの転写をＴａｔ非依存的に駆動することができる。この置き換えは、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないため、複製コンピテントウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する。

【0139】

５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及び粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングに必要な配列（Ｐｓｉ部位）がある。本明細書で使用する場合、「パッケージングシグナル」又は「パッケージング配列」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す（例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５ Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ、６９（４）：２１０１－０９を参照）。パッケージングシグナルは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小限のパッケージングシグナル（ｐｓｉ（Ψ、プサイ）配列とも呼ばれる）であってもよい。

【0140】

特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ＦＬＡＰをさらに含む。本明細書中で使用される場合、用語「ＦＬＡＰ」、「フラップ」は、核酸であって、その配列がレトロウイルス、例えばＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２、の中心ポリプリントラクト及び中心終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号明細書及びＺｅｎｎｏｕら（２０００） ＣＥＬＬ、１０１：１７３に記載されている。逆転写の間、ｃＰＰＴにおけるプラス鎖ＤＮＡの中央部開始及びＣＴＳにおける中央部終結は、三本鎖ＤＮＡ構造：中央部ＤＮＡフラップの形成をもたらす。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス活性決定因子として作用してもよく、かつ／又はウイルスの力価を増大させてもよい。特定の実施形態では、レトロウイルスベクター骨格は、ベクター中の目的の異種遺伝子の上流又は下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、導入プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。１つの実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ－１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。

【0141】

特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、核外輸送エレメントをさらに含む。１つの実施形態では、レトロウイルスベクターは、１つ以上の核外輸送エレメントを含む。用語「核外輸送エレメント」は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ核外輸送エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＲＥ（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら、（１９９１） Ｊ．ＶＩＲＯＬ． ６５：１０５３；及びＣｕｌｌｅｎら、（１９９１） ＣＥＬＬ ５８：４２３を参照）、並びにＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＲＮＡ核外輸送エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１コピー又は複数コピーとして挿入することができる。

【0142】

特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、転写後調節エレメントをさらに含む。様々な転写後調節エレメント、例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９９） Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７３：２８８６を参照）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．、５：３８６４）；及び同類のもの（Ｌｉｕら、（１９９５）、ＧＥＮＥＳ ＤＥＶ．、９：１７６６）が、異種核酸の発現を増大させることができる。転写後調節エレメントは、通常、異種核酸配列の３’末端に位置する。この構成は、５’部分が異種核酸コード配列を含み、３’部分が転写後調節エレメント配列を含むｍＲＮＡ転写物の合成をもたらす。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥ若しくはＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントを欠くか又は含まないが、それは、いくつかの例では、これらのエレメントが細胞形質転換のリスクを増加させ、かつ／又はｍＲＮＡ転写物の量を実質的に若しくは顕著には増加させないか、若しくはｍＲＮＡ安定性を増加させないためである。それゆえ、特定の実施形態では、本発明のベクターは、追加の安全性対策としてのＷＰＲＥ若しくはＨＰＲＥを欠くか又は含まない。

【0143】

異種核酸転写物の効率的な終結及びポリアデニル化を導くエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、通常、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。従って、特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル」又は「ポリアデニル化配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＨによる新生ＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化シグナルを欠く転写物は不安定であり急速に劣化するため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化は望ましい。本発明のベクターにおいて使用することができるポリアデニル化シグナルの具体例としては、理想的なポリアデニル化配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリアデニル化配列（ｒβｇｐＡ）、又は当該技術分野で公知の別の適切な異種性若しくは内因性ポリアデニル化配列が挙げられる。

【0144】

特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、インスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レトロウイルス発現配列、例えば、治療用遺伝子を、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントによって媒介されてもよくかつ導入された配列の調節解除された発現をもたらしうる組み込み部位効果（すなわち、位置効果；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅら（２００２） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ、９９：１６４３３；Ｚｈａｎら、２００１、ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．、１０９：４７１を参照）から保護することに寄与してもよい。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、一方若しくは両方のＬＴＲ中に、又は細胞ゲノムに組み込まれるベクターの領域中の他の場所にインスレーターエレメントを含む。本発明での使用に好適なインスレーターとしては、ニワトリβ－グロビンインスレーター（Ｃｈｕｎｇら、（１９９３） ＣＥＬＬ ７４：５０５；Ｃｈｕｎｇら、（１９９７） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ ９４：５７５；及びＢｅｌｌら、１９９９． ＣＥＬＬ ９８：３８７参照）が挙げられるが、これに限定されない。インスレーターエレメントの例には、ニワトリＨＳ４等のβ－グロビン遺伝子座由来のインスレーターが含まれるが、これに限定されない。

【0145】

レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａｌｐｈａ－ＡｃＧＦＰ１－Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ カタログ番号６３１９８４）、ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａｌｐｈａ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ カタログ番号６３１９８７）、ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ カタログ番号６３２１５９）、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ カタログ番号６３２１８６）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標） （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））、ｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標） （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＬＫＯ．１（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１０８７８）、ｐＬＫＯ．３Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１４７４８）、ｐＳｉｃｏ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１１５７８）、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１９３１９）、ＦＵＧＷ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１４８８３）、ｐＬＶＴＨＭ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１２２４７）、ｐＬＶＵＴ－ｔＴＲ－ＫＲＡＢ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１１６５１）、ｐＬＬ３．７（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１１７９５）、ｐＬＢ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１１６１９）、ｐＷＰＸＬ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１２２５７）、ｐＷＰＩ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１２２５４）、ＥＦ．ＣＭＶ．ＲＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１７６１９）、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１７４５２）、ｐＬｅｎｔｉ－ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号３９４８１）、ｐＵＬＴＲＡ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号２４１２９）、ｐＬＸ３０１（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号２５８９５）、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号２１３７３）、ｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号３６０８４）、ｐＬｉｏｎＩＩ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１７３０）、ｐＩｎｄｕｃｅｒ１０－ｍｉｒ－ＲＵＰ－ＰｈｅＳ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号４４０１１）が挙げられる。これらのベクターは、治療的使用に適するように改変することができる。例えば、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏ、ＥＧＦＰ、又はｍＣｈｅｒｒｙ）を欠失させることができるし、又は目的の第２の外因性遺伝子で置き換えることもできる。レンチウイルスベクターのさらなる例は、米国特許第７，６２９，１５３号明細書、米国特許第７，１９８，９５０号明細書、米国特許第８，３２９，４６２号明細書、米国特許第６，８６３，８８４号明細書、米国特許第６，６８２，９０７号明細書、米国特許第７，７４５，１７９号明細書、米国特許第７，２５０，２９９号明細書、米国特許第５，９９４，１３６号明細書、米国特許第６，２８７，８１４号明細書、米国特許第６，０１３，５１６号明細書、米国特許第６，７９７，５１２号明細書、米国特許第６，５４４，７７１号明細書、米国特許第５，８３４，２５６号明細書、米国特許第６，９５８，２２６号明細書、米国特許第６，２０７，４５５号明細書、米国特許第６，５３１，１２３号明細書、及び米国特許第６，３５２，６９４号明細書、並びに国際公開第２０１７／０９１７８６号パンフレットに開示されている。

【0146】

アデノウイルスベクター
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることができる。アデノウイルスは、ヌクレオカプシド及び二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムから構成される中サイズ（９０～１００ｎｍ）の無エンベロープ（裸）の正２０面体ウイルスである。用語「アデノウイルス」は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、及びサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されない、アデノウイルス属の任意のウイルスを指す。典型的には、アデノウイルスベクターは、例えば、遺伝子導入のための非天然核酸配列のアデノウイルスへの挿入に適応するように、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムに１つ以上の変異（例えば欠失、挿入又は置換）を導入することによって生成される。

【0147】

ヒトアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として使用することができる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８及び３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５及び５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５及び６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、及び４２～４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０及び４１）、非分類血清群（例えば、血清型４９及び５１）、又は任意の他のアデノウイルスの血清群若しくは血清型のものであることが可能である。アデノウイルス血清型１～５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、ＡＴＣＣ、マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州）から入手可能である。非Ｃ群アデノウイルスベクター、非Ｃ群アデノウイルスベクターを作製する方法、及び非Ｃ群アデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、及び米国特許第５，８４９，５６１号明細書、並びに国際公開第１９９７／０１２９８６号パンフレット及び国際公開第１９９８／０５３０８７号パンフレットに開示されている。

【0148】

非ヒトアデノウイルス（例えば、類人猿、サル、トリ、イヌ、ヒツジ、又はウシのアデノウイルス）を、アデノウイルスベクターを作製するために（すなわち、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として）使用することができる。例えば、アデノウイルスベクターは、サルアデノウイルス（新世界サル及び旧世界サルの両方を含む）に基づくことができる（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（国際ウイルス分類委員会）のＶｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ： ＶＨＩｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ（２００５）を参照）。霊長類に感染するアデノウイルスの系統発生分析は、例えば、Ｒｏｙら（２００９） ＰＬＯＳ ＰＡＴＨＯＧ． ５（７）：ｅ１０００５０３に開示されている。ゴリラアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのためのアデノウイルスゲノムの供給源として使用することができる。ゴリラアデノウイルス及びアデノウイルスベクターは、例えば、国際公開第２０１３／０５２７９９号パンフレット、国際公開第２０１３／０５２８１１号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０５２８３２号パンフレットに記載されている。アデノウイルスベクターはまた、亜型（サブタイプ）の組み合わせを含むこともでき、それにより、「キメラ」アデノウイルスベクターであることができる。

【0149】

アデノウイルスベクターは、複製コンピテント、条件的複製コンピテント、又は複製欠損であることができる。複製コンピテントな（複製能力のある）アデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞、すなわち、通常アデノウイルスに感染することができる細胞において複製することができる。条件的複製アデノウイルスベクターは、所定の条件下で複製するように操作されたアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス初期領域によってコードされる遺伝子機能は、誘導性、抑制性、又は組織特異性の転写制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結することができる。条件的複製アデノウイルスベクターは、米国特許第５，９９８，２０５号明細書においてさらに記載されている。複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが典型的な宿主細胞、とりわけアデノウイルスベクターによって感染されるヒトにおける宿主細胞において複製しないように、例えば、１つ以上の複製に必須の遺伝子機能又は領域の欠損の結果として、複製に必要とされるアデノウイルスゲノムの１つ以上の遺伝子機能又は領域の補完を必要とするアデノウイルスベクターである。

【0150】

好ましくは、アデノウイルスベクターは複製欠損であり、そのため、複製欠損アデノウイルスベクターは、増殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域（すなわち、Ｅ１～Ｅ４領域）のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域（すなわち、Ｌ１～Ｌ５領域）のみ、アデノウイルスゲノムの初期領域及び後期領域の両方、又はすべてのアデノウイルス遺伝子（すなわち、高容量アデノベクター（ＨＣ－Ａｄ））の１つ以上の複製に必須の遺伝子機能を欠損してもよい。例えば、Ｍｏｒｓｙら（１９９８） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９５：９６５－９７６、Ｃｈｅｎら（１９９７） ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ９４：１６４５－１６５０、及びＫｏｃｈａｎｅｋら（１９９９） ＨＵＭ．ＧＥＮＥ ＴＨＥＲ． １０（１５）：２４５１－９を参照。複製欠損アデノウイルスベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第６，１２７，１７５号明細書、米国特許第６，４８２，６１６、及び米国特許第７，１９５，８９６号明細書、並びに国際公開第１９９４／０２８１５２号パンフレット、国際公開第１９９５／００２６９７号パンフレット、国際公開第１９９５／０１６７７２号パンフレット、国際公開第１９９５／０３４６７１号パンフレット、国際公開第１９９６／０２２３７８号パンフレット、国際公開第１９９７／０１２９８６号パンフレット、国際公開第１９９７／０２１８２６号パンフレット、及び国際公開第２００３／０２２３１１号パンフレットに開示されている。

【0151】

本発明の複製欠損アデノウイルスベクターは、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルで、複製欠損アデノウイルスベクター中には存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株中で産生することができる。そのような補完細胞株は公知であり、その例としては、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７７） Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ． ３６：５９－７２に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際公開第１９９７／０００３２６号パンフレット、及び米国特許第５，９９４，１２８号明細書及び米国特許第６，０３３，９０８号明細書に記載されている）、並びに２９３－ＯＲＦ６細胞（例えば、国際公開第１９９５／０３４６７１号パンフレット及びＢｒｏｕｇｈら（１９９７） Ｊ．ＶＩＲＯＬ． ７１：９２０６－９２１３に記載されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の複製欠損アデノウイルスベクターを産生するための他の適切な補完細胞株としては、発現すると宿主細胞におけるウイルス増殖を阻害する導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを増殖させるために作製された補完細胞が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００８／０２３３６５０号明細書を参照）。さらなる適切な補完細胞は、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号明細書及び米国特許第６，６８２，９２９号明細書、並びに国際公開第２００３／０２０８７９号パンフレットに記載されている。アデノウイルスベクター含有組成物のための製剤は、例えば、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、及び米国特許第６，５１４，９４３号明細書、並びに国際公開第２０００／０３４４４４号パンフレットにさらに記載されている。

【0152】

さらなる例示的なアデノウイルスベクター、及び／又はアデノウイルスベクターを作製若しくは増殖させる方法は、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、米国特許第６，０８３，７１６号明細書、米国特許第６，１１３，９１３号明細書、米国特許第６，３０３，３６２号明細書、米国特許第７，０６７，３１０号明細書、及び米国特許第９，０７３，９８０号明細書に記載されている。

【0153】

市販のアデノウイルスベクター系としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）から入手可能なＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）アデノウイルス発現系、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＡｄＥａｓｙ（商標）アデノウイルスベクター系、及びＴａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（タカラバイオＵＳＡ）から入手可能なＡｄｅｎｏ－Ｘ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ３が挙げられる。

【0154】

Ｖ． 宿主細胞及び細胞株
本明細書に開示されるｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、非天然アミノ酸、核酸、及び／又はベクターを含む宿主細胞又は細胞株（例えば、原核生物又は真核生物の宿主細胞又は細胞株）も本発明に包含される。遺伝子操作されたｔＲＮＡ及びアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸は、発現宿主細胞内で自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド又はウイルス粒子）として、又は発現宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞のゲノム中の安定な組み込まれたエレメント若しくは安定な組み込まれたエレメントの系列を介してのいずれかで、発現宿主細胞内で発現されることが可能である。

【0155】

宿主細胞は、例えば、本明細書に開示される核酸又はベクターを使用して、遺伝子操作される（形質転換、形質導入又はトランスフェクトを含むが、これらに限定されない）。例えば、特定の実施形態では、１つ以上のベクターは、所望の宿主細胞又は細胞株において機能的である遺伝子発現制御エレメントに作動可能に連結された、直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、及び任意選択で１つ以上のＵＡＡを含めることによって修飾されるタンパク質のコード領域を含む。例えば、ｔＲＮＡ合成酵素及びｔＲＮＡ並びに任意の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ピューロマイシン耐性カセット）をコードする遺伝子は、導入ベクター（例えば、トランスフェクションの前に線状化することができるプラスミド）に組み込まれることが可能であり、例えば、ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子は、ポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＵｂｉＣ、又はＰＧＫ、例えば、ＣＭＶ又はＥＦ１α）の制御下にあることができ、ｔＲＮＡをコードする遺伝子は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６、７ＳＫ、又はＨ１、例えば、Ｕ６）の制御下にあることができる。ベクターは、エレクトロポレーション又はウイルスベクターによる感染を含む標準的な方法によって細胞及び／又は微生物にトランスフェクトされ、クローンは、選択マーカーの発現を介して（例えば、抗生物質耐性によって）選択することができる。

【0156】

例示的な原核生物の宿主細胞又は細胞株としては、細菌、例えば、大腸菌、サーマス・サーモフィルス、バチルス・ステアロサーモフィルス、シュードモナス・フルオレセンス（蛍光菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（緑膿菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びシュードモナス・プチダ（プチダ菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に由来する細胞が挙げられる。例示的な真核生物及び宿主細胞又は細胞株としては、植物（例えば、単子葉植物若しくは双子葉植物等の複雑な植物（複合植物））、藻類、原生生物、真菌、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、出芽酵母）を含む）、又は動物（哺乳動物、昆虫、節足動物等を含む）に由来する細胞が挙げられる。さらなる例示的な宿主細胞又は細胞株としては、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨｅＬａ、Ｕ２０Ｓ、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、ＣＡＤ、Ｐ１９、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｎ２ａ、ＭＣＦ－７、Ｙ７９、ＳＯ－ＲＢ５０、ＨｅｐＧ２、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、Ｊ５５８Ｌ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＮＳ０、又はＥＳＣが挙げられる。宿主細胞又は細胞株は、個々のコロニー、単離された集団（モノクローナル）、又は細胞の異種混合物を含んでもよいことが理解される。

【0157】

企図される細胞又は細胞株は、例えば、随意に細胞のゲノム又は細胞によって維持されるＤＮＡの別の断片において安定に維持される、直交ｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対の１つ又は複数のコピーを含む。例えば、細胞又は細胞株は、（ｉ）細胞によって安定に維持されるトリプトファニルｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対（野生型又は操作されたもの）、及び／又は（ｉｉ）細胞によって安定に維持されるロイシル－ｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対（野生型又は操作されたもの）の１つ以上のコピーを含有してもよい。

【0158】

例えば、特定の実施形態では、上記細胞株は安定な細胞株であり、その細胞株は、（ｉ）アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させることができる原核生物トリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質、若しくはｔＲＮＡに非天然アミノ酸を結合させることができる原核生物ロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質）をコードする核酸配列、及び／又は（ｉｉ）サプレッサーｔＲＮＡ（例えば、非天然アミノ酸を結合することができる原核生物サプレッサートリプトファニル－ｔＲＮＡ、若しくは非天然アミノ酸を結合することができる原核生物サプレッサーロイシル－ｔＲＮＡ、例えば本明細書に開示されるサプレッサーｔＲＮＡ）をコードする核酸配列が安定に組み込まれたゲノムを含む。

【0159】

ｔＲＮＡ及び／若しくはアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸を目的の細胞のゲノムに導入する方法、又はゲノムの外側にある細胞によって複製されるＤＮＡ中の核酸を安定に維持する方法は、当該技術分野において周知である。

【0160】

ｔＲＮＡ及び／又はアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸は、発現ベクター、導入ベクター、又はＤＮＡカセット、例えば本明細書に開示される発現ベクター、導入ベクター、又はＤＮＡカセット中で細胞に提供することができる。ｔＲＮＡ及び／若しくはアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする発現ベクター、導入ベクター、又はＤＮＡカセットは、任意選択で、誘導性又は構成的に活性なプロモーターの制御下で、ｔＲＮＡ及び／又はアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素の１つ以上のコピーを含有することができる。この発現ベクター、導入ベクター又はＤＮＡカセットは、例えば、他の標準成分（エンハンサー、ターミネーター等）を含有してもよい。ｔＲＮＡをコードする核酸及びアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸は、同じ若しくは異なるベクター上にあってもよく、同じ若しくは異なる比率で存在してもよく、同時に若しくは連続して、細胞に導入されてもよく、又は細胞ゲノムに安定に組み込まれてもよいことが企図される。

【0161】

ｔＲＮＡ及び／又はアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡカセットの１つ以上のコピーは、トランスポゾン系（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター若しくは他のレトロウイルスベクター）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの組換え、エレクトロポレーション及び天然の組換え、ＢｘＢ１リコンビナーゼ系を使用して、若しくは複製／維持ＤＮＡ断片（エプスタイン・バーウイルス由来のもの等）を使用して、宿主細胞ゲノムに組み込むか、又は細胞中で安定に維持することができる。

【0162】

ｔＲＮＡ及び／又はアミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸を安定に維持し、かつ／又はＵＡＡを目的のタンパク質に組み込むのに効率的である細胞株を選択するために、選択マーカーを使用することができる。例示的な選択マーカーとしては、ｚｅｏｃｉｎ（ゼオシン）、ピューロマイシン、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＥＧＦＰ融合体、又は他の蛍光タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、選択マーカータンパク質をコードする遺伝子（又は選択マーカーの存在下での検出可能な機能、例えば、生存度に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子）は、細胞株が未成熟終止コドンの部位にＵＡＡを組み込むことができる場合にのみタンパク質が発現されるように、未成熟終止コドンを含んでもよい。

【0163】

特定の実施形態では、２つ以上のｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対を含む宿主細胞又は細胞株を開発するために、ゲノム組み込み及び選択の反復ラウンドを通して２つ以上のｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対の複数のコピーを組み込んだ宿主細胞又は細胞株を特定するために、複数の同一又は異なるＵＡＡ誘導（指示）コドンを使用することができる。増強されたＵＡＡ組み込み効率、低いバックグラウンド、及び減少した毒性を含有する宿主細胞又は細胞株は、１つ以上の終止コドンを含有する選択マーカーを介して最初に単離することができる。続いて、宿主細胞又は細胞株を選択スキームに供して、ｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素対の所望のコピーを含有し、１つ以上の終止コドンを含有する目的の遺伝子（ゲノム的に組み込まれたか否かのいずれか）を発現する宿主細胞又は細胞株を特定することができる。タンパク質発現は、例えば、目的のタンパク質又はＣ末端タグに結合する抗体を使用するウエスタンブロットを含む、当該技術分野で公知の任意の方法を使用してアッセイされてもよい。

【0164】

宿主細胞又は細胞株は、例えば、スクリーニング工程、プロモーターの活性化又は形質転換体の選択等の活性に適するように改変された従来の栄養培地中で培養することができる。これらの細胞は、任意選択でトランスジェニック生物に培養することができる。例えば、細胞単離及び培養（例えば、その後の核酸単離）のための他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク；Ｐａｙｎｅら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ニューヨーク州；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ（ベルリン、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ニューヨーク）、並びにＡｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州が挙げられる。

【0165】

ＵＡＡを組み込む抗体を産生することができる例示的な細胞株の産生は、Ｒｏｙら（２０２０） ＭＡＢＳ １２（１）、ｅ１６８４７４９に記載されている。

【0166】

ＶＩ． 非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を含むタンパク質及びその製造方法
非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を含むタンパク質及びその製造方法も本発明に包含される。

【0167】

非天然アミノ酸の組み込みは、タンパク質の構造及び／又は機能の変化の調整、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分への標的化（例えば、タンパク質アレイの場合）、生物学的に活性な分子の添加、ポリマーの付着、放射性核種の付着、血清半減期の調節、組織浸透の調節（例えば、腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞若しくは器官の特異性又は分布の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ耐性の調節等を含む、様々な目的のために行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、増強された触媒特性若しくは生物物理学的特性、又はさらには完全に新しい触媒特性若しくは生物物理学的特性を有してもよい。例えば、以下の特性は、非天然アミノ酸をタンパク質に含めることによって任意に改変される：毒性、生体分布、構造特性、分光学的特性、化学的及び／又は光化学的特性、触媒能力、半減期（血清半減期を含むがこれに限定されない）、他の分子と反応する能力（共有結合的若しくは非共有結合的を含むがこれに限定されない）等。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、新規な治療薬、診断薬、酵素、及び結合タンパク質（例えば、治療用抗体）（これらに限定されない）に有用である。

【0168】

タンパク質は、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０個以上のＵＡＡを有してもよい。このＵＡＡは、同じであってもよいし異なっていてもよい。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０個以上の異なる部位が、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０個以上の異なるＵＡＡを含むタンパク質中に存在することが可能である。タンパク質は、そのタンパク質中に存在する少なくとも１つ（しかし、すべてより少ない）の特定のアミノ酸がＵＡＡで置換されていてもよい。複数のＵＡＡを有する所与のタンパク質について、ＵＡＡは同一であってもよいし異なっていてもよい（例えば、タンパク質は、２つ以上の異なるタイプのＵＡＡを含むことができ、又は２つの同じＵＡＡを含むことができる）。２つを超えるＵＡＡを有する所与のタンパク質について、ＵＡＡは、同じであってもよいし、異なっていてもよく、又は同じ種類の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なるＵＡＡとの組み合わせであってもよい。

【0169】

特定の実施形態では、タンパク質は、抗体（又はその断片、例えば、その抗原結合断片）、二重特異性抗体、ナノボディ、アフィボディ、ウイルスタンパク質、ケモカイン、サイトカイン、抗原、血液凝固因子、ホルモン、成長因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、又は任意の他のポリペプチド若しくはタンパク質である。

【0170】

本明細書で使用する場合、特段の記載がない限り、「抗体」という用語は、インタクトな抗体（例えば、インタクトなモノクローナル抗体）、又はその断片、例えば、抗体のＦｃ断片（例えば、モノクローナル抗体のＦｃ断片）、又は抗体の抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体の抗原結合断片）を意味し、修飾、操作、若しくは化学的にコンジュゲートされたインタクトな抗体、抗原結合断片、若しくはＦｃ断片を含むと理解される。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディ、及びダイアボディが挙げられる。改変又は操作された抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が挙げられる。化学的にコンジュゲートされた抗体の例は、毒素部分にコンジュゲートされた抗体である。

【0171】

典型的には、抗体は、４つのポリペプチド鎖を含有する多量体タンパク質である。そのポリペプチド鎖の２つは免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）と呼ばれ、ポリペプチド鎖の２つは免疫グロブリン軽鎖（Ｌ鎖）と呼ばれる。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって接続されている。免疫グロブリン重鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって接続されている。軽鎖は、１つの可変領域（Ｖ_Ｌ）及び１つの定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。重鎖は、１つの可変領域（Ｖ_Ｈ）及び少なくとも３つの定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２及びＣＨ_３）からなる。可変領域は、抗体の結合特異性を決定する。

【0172】

可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、これは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保存された領域とともに散在する。ヒト抗体は、フレームワーク領域ＦＲ１～ＦＲ４によって分離された３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを有する。ＦＲ及びＣＤＲの範囲は定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１） ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（米国保健福祉省）、ＮＩＨ刊行物番号９１－３２４２；及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７） Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ． １９６：９０１－９１７）。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシル末端へと配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。

【0173】

抗体分子は、（ｉ）例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥの重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域；特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域、並びに／又は（ｉｉ）例えば、κ（カッパ）若しくはλ（ラムダ）の（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有してもよい。

【0174】

特定の実施形態では、ＵＡＡ、例えば、第１及び／又は第２のＵＡＡは、抗体の重鎖又は軽鎖定常領域に位置する。例えば、特定の実施形態では、第１及び／又は第２のＵＡＡを含むタンパク質は、（例えば、配列番号１１４のアミノ酸配列、若しくは配列番号１１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）ヒトＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常領域を含む抗体又はその断片であり、第１及び／又は第２のＵＡＡは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常領域内に（例えば、配列番号１１４の位置７８のトレオニンに対応する位置に）位置する。特定の実施形態では、第１及び／又は第２のＵＡＡを含むタンパク質は、（例えば、配列番号１１５のアミノ酸配列、若しくは配列番号１１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）ヒトκ定常領域を含む抗体又はその断片であり、第１及び／又は第２のＵＡＡは、ヒトκ定常領域内に位置する。

【0175】

特定の実施形態では、ＵＡＡ、例えば、第１及び／又は第２のＵＡＡは、抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）領域のフレームワーク領域、例えば、ＦＲ４に位置する。

【0176】

特定の実施形態では、第１及び／又は第２のＵＡＡを含むタンパク質は、配列番号１１６のアミノ酸配列、若しくは配列番号１１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又はその断片であり、第１及び／又は第２のＵＡＡは、配列番号１１６内に（例えば、配列番号１１６の位置１１のトレオニンに対応する位置に）位置する。特定の実施形態では、第１及び／又は第２のＵＡＡを含むタンパク質は、配列番号１１７のアミノ酸配列、若しくは配列番号１１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又はその断片であり、第１及び／又は第２のＵＡＡは、配列番号１１７内に（例えば、配列番号１１７の位置１１のリシンに対応する位置に）位置する。

【0177】

１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾することができる治療用、診断用、及び他のタンパク質のさらなる例は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００９０４９号明細書に記載されている。

【0178】

本明細書に開示されるｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、及び／又は非天然アミノ酸は、任意の適切な翻訳系を使用して、非天然アミノ酸を目的のタンパク質に組み込むために使用されてもよい。

【0179】

用語「翻訳系」は、成長中のポリペプチド鎖（タンパク質）にアミノ酸を組み込むために必要な成分を含む系を指す。翻訳系の成分としては、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。翻訳系は、細胞性又は無細胞性であってよく、原核生物由来又は真核生物由来であってよい。例えば、翻訳系は、非真核細胞、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、真核細胞、例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞を含んでもよいし、又はそれらに由来してもよい。

【0180】

翻訳系には、宿主細胞又は細胞株、例えば、本明細書で企図される宿主細胞又は細胞株が含まれる。非天然アミノ酸を有する目的のポリペプチドを宿主細胞において発現させるために、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、転写を導くプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及びタンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにクローニングしてもよい。

【0181】

翻訳系は、所望の核酸配列がｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが翻訳されることが可能な、透過処理細胞又は細胞培養物等の全細胞調製物も含む。無細胞翻訳系は市販されており、多くの異なるタイプ及び系が周知である。無細胞系の例としては、原核生物溶解物、例えば大腸菌溶解物、並びに真核生物溶解物、例えばコムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、ウサギ卵母細胞溶解物及びヒト細胞溶解物が挙げられるが、これらに限定されない。再構成された翻訳系を使用してもよい。再構成された翻訳系は、精製された翻訳因子の混合物、並びに開始因子－１（ＩＦ－１）、ＩＦ－２、ＩＦ－３（α若しくはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ－Ｔｕ）、若しくは翻訳終了因子（終結因子）等の精製された翻訳因子を補充した溶解物の組み合わせ又は溶解物を含んでもよい。無細胞系は、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、そしてそのｍＲＮＡが翻訳される共役転写／翻訳系であってもよい。

【0182】

本発明は、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を発現させる方法、及びタンパク質中の特定の位置に１つ以上の非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成する方法を提供する。当該方法は、細胞内で発現されるタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みを可能にする条件下で翻訳系をインキュベートする（例えば、宿主細胞若しくは細胞株、例えば、本明細書に開示される宿主細胞若しくは細胞株を培養又は増殖させる）工程を含む。この翻訳系は、タンパク質への１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みに適した条件下で、１つ以上の非天然アミノ酸（例えば、ロイシル類似体又はトリプトファニル類似体）と接触してもよい（例えば、細胞培養培地をその１つ以上の非天然アミノ酸と接触させてもよい）。

【0183】

特定の実施形態では、上記タンパク質は、未成熟終止コドンを含む核酸配列から発現される。翻訳系（例えば、宿主細胞又は細胞株）は、例えば、サプレッサーロイシルｔＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるサプレッサーロイシルｔＲＮＡ）に、上記未成熟終止コドンに対応する位置でタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸（例えば、ロイシル類似体）を結合させることができるロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質（例えば、本明細書に開示されるロイシル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質）を含有してもよい。特定の実施形態では、ロイシルサプレッサーｔＲＮＡは、未成熟終止コドンにハイブリダイズしてその未成熟終止コドンに対応する位置でタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むことを可能にするアンチコドン配列を含む。

【0184】

特定の実施形態では、上記タンパク質は、未成熟終止コドンを含む核酸配列から発現される。翻訳系（例えば、宿主細胞又は細胞株）は、例えば、サプレッサートリプトファニルｔＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるサプレッサートリプトファニルｔＲＮＡ）に、上記未成熟終止コドンに対応する位置でタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸（例えば、トリプトファン類似体）を結合させることができるトリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質（例えば、本明細書に開示されるトリプトファニル－ｔＲＮＡ合成酵素変異タンパク質）を含有してもよい。特定の実施形態では、トリプトファニルサプレッサーｔＲＮＡは、その未成熟終止コドンにハイブリダイズして未成熟終止コドンに対応する位置でタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むことを可能にするアンチコドン配列を含む。

【0185】

特定の実施形態では、タンパク質（例えば、ＵＡＡ、例えば第１及び／又は第２のＵＡＡを含有するタンパク質）は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）において発現又は産生される。特徴は、原核細胞（例えば、細菌）において産生されるタンパク質を真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）において産生されるタンパク質から区別してもよい。例えば、哺乳動物細胞において産生されるタンパク質は、翻訳後修飾、例えば、小胞体又はゴルジ装置等の細胞小器官に位置する酵素に依存する修飾を受けてもよい。例えば、小胞体におけるジスルフィド結合形成は、タンパク質の立体構造及び／又は安定化に影響を及ぼす可能性がある。このような翻訳後修飾のさらなる例としては、硫酸化、アミド化、パルミチン化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、及びグリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化及びＯ結合型グリコシル化）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、特定の実施形態では、タンパク質（例えば、ＵＡＡ、例えば第１及び／又は第２のＵＡＡを含有するタンパク質）は、硫酸化、アミド化、パルミチン化、並びにグリコシル化（例えば、Ｎ結合型グリコシル化及びＯ結合型グリコシル化）から選択される１つ以上の翻訳後修飾を含む。

【0186】

本明細書全体にわたって、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載されるか、又はプロセス及び方法が、特定の工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、若しくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載されるが、加えて、列挙された成分から本質的になる、若しくはそれからなる本発明の組成物が存在すること、並びに列挙された処理工程から本質的になる、若しくはそれからなる本発明に係るプロセス及び方法が存在することが企図される。

【0187】

本出願では、要素又は構成要素が、列挙された要素又は構成要素のリストに含まれる、及び／又は列挙された要素又は構成要素のリストから選択されると記載されるが、その要素又は構成要素は、列挙された要素若しくは構成要素のいずれか１つであってもよいし、又はその要素若しくは構成要素が列挙された要素若しくは構成要素の２つ以上からなる群から選択されることが可能であることを理解されたい。

【0188】

さらに、本明細書に記載される組成物若しくは方法の要素及び／又は特徴は、本明細書で明示的又は暗示的であろうと、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の方法で組み合わせることができるということを理解されたい。例えば、特定の化合物について言及されるが、その化合物は、文脈から矛盾すると理解されない限り、本発明の組成物の様々な実施形態及び／又は本発明の方法において使用することができる。言い換えれば、本出願内では、明確かつ簡潔な応用を記述及び描写することを可能にするように、実施形態が説明及び描写されたが、実施形態は、本教示及び本発明から逸脱することなく、様々に組み合わされ又は分離されてもよいことが意図されており、これは理解されるであろう。例えば、本明細書に記載及び描写されるすべての特徴は、本明細書に記載及び描写される本発明のすべての態様に適用可能であることができることが理解されるであろう。

【0189】

「…のうちの少なくとも１つ」という表現は、文脈及び使用から矛盾すると理解されない限り、表現の後の列挙された対象の各々、及び列挙された対象のうちの２つ以上の様々な組み合わせを個々に含むことを理解されたい。３つ以上の列挙された対象に関する表現「及び（並びに）／又は（若しくは）」は、文脈から矛盾すると理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。

【0190】

用語「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｅ（有する）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎ（含有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」、又は「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」の使用は、その文法的等価物を含めて、オープンエンド型でも非限定的でもないと具体的に述べられない限り、又は文脈から理解されない限り、全体として、例えば、追加の列挙されていない要素又は工程を除外しない、オープンエンド型で非限定的であると理解されるべきである。

【0191】

定量値の前に「約」という用語が使用される場合、本発明には、特に具体的に断らない限り、具体的な定量値そのものも含まれる。本明細書で使用する場合、「約」という用語は、特段の記載又は推測がない限り、記載値から±１０％の変動を指す。

【0192】

工程の順序又は特定の動作を実行するための順序は、本発明が作動可能なままである限り重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上の工程又は動作が同時に行われてもよい。

【0193】

本明細書におけるいずれかの及びすべての例、又は例示的な語句、例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ（等、など）」又は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含めて）」の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、請求項に記載されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる語句も、請求項に記載されていない要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。

【0194】

配列表

【表1(1)】

【表1(2)】

【表1(3)】

【表1(4)】

【表1(5)】

【表1(6)】

【表1(7)】

【表1(8)】

【表1(9)】

【表1(10)】

【表1(11)】

【表1(12)】

【表1(13)】

【表1(14)】

【表1(15)】

【表1(16)】

【表1(17)】

【表1(18)】

【表1(19)】

【表1(20)】

【表1(21)】

【表1(22)】

【表1(23)】

【表1(24)】

【表1(25)】

【表1(26)】

【表1(27)】

【表1(28)】

【表1(29)】

【表1(30)】

【実施例】

【0195】

以下の実施例は単に例示的であり、本発明の範囲又は内容を限定することを何ら意図するものではない。

【0196】

実施例１ － タンパク質中の複数の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）の組み込みのためのマルチサイト組み込みスキーム
本実施例は、単一のタンパク質への複数のＵＡＡの組み込みのために利用されるアプローチを説明する。

【0197】

図７は、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質への２つの異なるＵＡＡの部位特異的組み込みのための一般的スキームを描く。ＵＧＡコドンは、適切なｔＲＮＡ／アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）対１と共に使用されて第１のＵＡＡ（ＵＡＡ１）を組み込み、一方、ＵＡＧコドンは、第２のｔＲＮＡ／ａａＲＳ対２と共に使用されて第２のＵＡＡ（ＵＡＡ２）を組み込む。コドンの位置に関係なく、適切なｔＲＮＡ／ａａＲＳ対と組み合わせた２つの異なるコドンは、それぞれの部位に組み込まれた２つの異なるＵＡＡを含む、リボソームで発現されたタンパク質を生成する。

【0198】

タンパク質への複数のＵＡＡの成功した効率的な組み込みを可能にする成分の選択は、そのようなマルチサイト組み込みのために使用することができる、異なるａａＲＳ、ｔＲＮＡ、ＵＡＡ、コドン、及び対の組み合わせの２００万を超える可能な組み合わせが存在することを考えると、困難である。結果として、２つの別個のバイオコンジュゲーションハンドルの部位特異的組み込みに使用するのに適したこれらの要素の特定の組み合わせを見出すことは困難である。

【0199】

実施例２ － 哺乳動物細胞におけるＴＧＡ－終止コドン媒介抑制の比較
本実施例は、単一のタンパク質への複数のＵＡＡの組み込みに対するＴＧＡ－終止コドンの有効性を分析するための研究を記載する。

【0200】

すべての小規模ＥＧＦＰ組み込み分析のために、以下のプロトコルを使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、１２ウェルプレートについて１ウェル当たり６００，０００細胞の密度で播種した。総量で１．２μｇ ＤＮＡ ＋ ４μｌ ＰＥＩ ＋ ２０μｌ ＤＭＥＭを、各ウェルのトランスフェクションに使用した。モジュール式３プラスミドトランスフェクションでは、０．４μｇの各プラスミドを使用した。２プラスミドトランスフェクションでは、０．６μｇの各プラスミドを使用した。蛍光顕微鏡法で蛍光画像（蛍光像）を取得し、その後のＥＧＦＰ発現解析はトランスフェクション後４８時間で行った。ＥＧＦＰ発現データを得るために、細胞を回収し、以前に記載したように溶解した（ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５５０６号を参照）。溶解液中のＥＧＦＰ蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モレキュラーデバイス））を用いて（ｅｘ＝４８０ｎｍ及びｅｍ＝５３０ｎｍ）９６ウェルプレートで収集した。３つの独立した実験の平均を報告し、エラーバーは標準偏差を表す。

【0201】

２つのＵＡＡを組み込むより大規模なタンパク質発現研究のために、トランスフェクションの２日前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ細胞培養皿に播種した（１皿当たり５００万個の細胞）。１２μｇ ＤＮＡ ＋ ５０μｌ ＰＥＩ ＋ ２００μｌ ＤＭＥＭの反応混合物を用いて、８０％～９０％のコンフルエント（培養密度）になった細胞にトランスフェクションを行った。ＵＡＡは、トランスフェクション時に１ｍＭの最終濃度で補充した。トランスフェクション後４８時間で細胞を回収し、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍで溶解し、Ｃ末端ポリヒスチジンタグ付きタンパク質をコバルト含有ＴＡＬＯＮ金属アフィニティー樹脂カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造者のプロトコルに従って精製した。精製したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＯＦ ＨＰＬＣ－ＭＳ）に供して、さらなる特徴評価を行った。

【0202】

図８は、ＣＭＶプロモーター下のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）及びｈ１／Ｕ６プロモーター下のｔＲＮＡを有するｐＡｃＢａｃプラスミドを用いたｔＲＮＡ／ａａＲＳ対間の異なるコドン組み込み効率の比較を記載する。この研究で使用したｔＲＮＡ／ａａＲＳは、大腸菌チロシン、ピロリシン、大腸菌ロイシル、大腸菌トリプトファンにそれぞれ１ｍＭ ＯｍｅＹ、ＢｏｃＫ、Ｃ５Ａｚ（図２、式１、Ｘ＝Ｓ、ｎ＝３）、及びＨＴＰを加えたものであった。無細胞抽出物中の特徴的な蛍光によって測定した全長ＥＧＦＰレポーター発現を、ナンセンス抑制効率を表すために各場合において決定した。各ａａＲＳ（Ｔｙｒ、Ｐｙｌ、Ｌｅｕ、又はＴｒｐ）を、その同族ｔＲＮＡのＴＡＧ又はＴＧＡサプレッサーのいずれか及び適切なＥＧＦＰ変異体（ＴＡＧ又はＴＧＡ）のいずれかと共トランスフェクトし、各対が２つの異なるナンセンスコドンをどれだけ抑制したかを評価した。

【0203】

図８に対応する研究において、以下のｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を使用した：チロシン － 配列番号７０、６９（ＣＵＡ）、及び６８、ピロリシン － 配列番号１０１、７３（ＣＵＡ）、及び７２、ロイシル － 配列番号４、１６及び１７、並びにトリプトファン － 配列番号４５、５０、及び５１。

【0204】

これらの研究において、トリプトファンは、最も高いＴＧＡ発現レベルを示した。

【0205】

実施例３ － 合成酵素の交差反応性の分析
この実施例は、ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の選択された組み合わせの交差反応性の検討を提供する。

【0206】

ＥＧＦＰ ＴＡＧ又はＴＧＡレポーターを、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４５５０６号に記載されているのと同じプロトコルに従って使用した。１ｍＭのＵＡＡであるＯｍｅＹ、ＢｏｃＫ、Ｃ５Ａｚ、又はＨＴＰを、各ｔＲＮＡと、それぞれのＬｅｕＲＳ、ＴｙｒＲＳ、ＰｙｌＲＳ、及びＴｒｐＲＳ合成酵素と組み合わせて使用した（図９）。図９に対応する研究では、以下のｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を使用した：チロシン － 配列番号７０、６９（ＣＵＡ）、及び６８、ピロリシン － 配列番号１０１、７３（ＣＵＡ）、及び７２、ロイシル － 配列番号４、１６、及び１７、並びにトリプトファン － 配列番号４５、５０、及び５１。

【0207】

図９Ａは、ＴＡＧサプレッサーｔＲＮＡを用いた交差反応性を強調し、一方、図９Ｂは、ＴＧＡサプレッサーｔＲＮＡを用いた交差反応性を強調する。例えば、ＬｅｕＲＳはその同族ｔＲＮＡに対してのみ選択性を示し（図９Ａ）、ＬｅｕＲＳをマルチサイトＵＡＡ組み込みにおける使用の有力候補とした。対照的に、ＥｃＴｙｒＲＳはその同族チロシンｔＲＮＡにＯｍｅＹを結合させることができるが、Ｌｅｕ－ｔＲＮＡ_ＣＵＡに対して追加的に交差反応性であった（図９Ａ）。この交差反応性の傾向は、より低い割合ではあるが、チロシルａａＲＳとロイシルｔＲＮＡとの間のＴＧＡ抑制でも観察された（図９Ｂ）。チロシル及びロイシル－ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の間の交差反応性は、ロイシルサプレッサーｔＲＮＡに結合させることができるＥｃＴｙｒＲＳに起因し、それゆえこの組み合わせは、この設定における二重抑制に不適合である。

【0208】

実施例４ － ＥＧＦＰ^＊＊レポーターアッセイを介して実証された２つのＵＡＡの部位特異的組み込み
この実施例は、ＥＧＦＰレポーター系を用いて、哺乳動物細胞において２つのＵＡＡをタンパク質に組み込むことが可能であることを実証する。

【0209】

二重のＵＡＡの組み込みのために特別にプラスミドを構築した。典型的には、各対のためのプラスミド構成要素は、Ｕ６／Ｈ１プロモーターの下で、ＣＭＶ促進ａａＲＳと、４～１６コピーの範囲のｔＲＮＡのマルチコピーカセットとを含む。プラスミドの１つにおいて構成的プロモーター下でレポーターを導入することにより、トランスフェクションにおいて必要とされるプラスミドの数を減少させることが企図される。

【0210】

図１０に対応する研究において、以下のｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を使用した：チロシン － 配列番号７０、６９（ＣＵＡ）、及び６８、ピロリシン － 配列番号１０１、７３（ＣＵＡ）、及び７２、ロイシル － 配列番号４、１６及び１７、並びにトリプトファン － 配列番号４５、５０、及び５１。

【0211】

いくつかの例では、ＥｃＴｙｒ_ＴＧＡ＋Ｐｙｌ_ＴＡＧについては、プラスミドｐＡｃＢａｃ３－ＥｃＴｙｒ_ＴＧＡ－ＥＧＦＰ^＊＊（ＥＧＦＰ^＊＊はＥＧＦＰ－３９ＴＡＧ－１５１ＴＧＡを表す）及びｐＡｃＢａｃ１－ＵｂｉＣＭｂＰｙｌＲＳ－８ｘｔＲＮＡ_ＣＵＡ Ｐｙｌを構築した。ＥｃＴｙｒ_ＴＡＧ＋Ｐｙｌ_ＴＧＡについては、プラスミドｐＡｃＢａｃ３－ＥｃＴｙｒ_ＴＡＧＥＧＦＰ^＊＊及びｐＡｃＢａｃ１－ＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ－８ｘｔＲＮＡ_ＵＣＡ Ｐｙｌを構築した。ｐＡｃＢａｃ３－ＥｃＴｙｒ_ＴＡＧ－ＥＧＦＰ^＊＊は以前記載したように（例えば、Ｚｈｅｎｇら（２０１７） ＣＨＥＭ ＳＣＩ． ８（１０）：７２１１－７２１７）構築したが、ただし、（元のｐＡｃＢａｃ３における２０コピーの代わりに）１６のｔＲＮＡコピーのみを組み込んだ。類似のｐＡｃＢａｃ３－ＥｃＴｙｒ_ＴＧＡ－ＥＧＦＰ^＊＊プラスミドを、８つのｔＲＮＡコピーを組み込んだことを除いて、同様に作製した。ｐＡｃＢａｃ１－ＣＭＶ－ＭｂＰｙｌＲＳ－８ｘｔＲＮＡ_ＵＣＡ Ｐｙｌプラスミドを生成するために、まず、Ｕ６プロモーターによってそれぞれ駆動されるタンデムｔＲＮＡ_ＵＣＡ Ｐｙｌのコピーを８個含むｐＩＤＴ－Ｋａｎ－８ｘｔＲＮＡ_ＵＣＡ Ｐｙｌプラスミドを調製した。このプラスミドから８ｘｔＲＮＡカセットをＮｈｅＩ／ＡｖｒＩＩ消化で切り出し、既報のｐＡｃＢａｃ１－ＭｂＰｙｌＲＳプラスミドのＳｐｅＩ部位に挿入した。類似のクローニング戦略を用いて、対応するＴＡＧ抑制プラスミドｐＡｃＢａｃ１－ＵｂｉＣ－ＭｂＰｙｌＲＳ８ｘｔＲＮＡ_ＣＵＡ Ｐｙｌを作製した。ｐＡｃＢａｃ３－ＥｃＬｅｕＴＡＧ－ＥＧＦＰ^＊＊プラスミドの構築のために、既報のプラスミドｐＡｃＢａｃ２Ｒ－８ｘＥｃＬｔＲ－ＡｎａｐＲＳ３中のＡｎａｐＲＳをＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素部位により置き換えるために、ＥｃＬｅｕＲＳをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＥｃＬｅｕＲＳ遺伝子も後述の作業で他のａａＲＳ変異体で置き換えた。その後、ＥＧＦＰ^＊＊をＰＣＲ増幅し、ＳｆｉＩ部位に挿入して最終的なプラスミドを作製した。同様に設計したプラスミドを、大腸菌のＴｒｐＲＳ／ｔＲＮＡ対について、ＤＮＡ領域の相違を最小限に抑えて作製した。

【0212】

ＥＧＦＰ^＊＊レポーターにおけるマルチサイトＵＡＡ組み込みの発現レベルは、ｐＡｃＢａｃ－ｔＲＮＡ／ａａＲＳ及びｐＡｃＢａｃ－ｔＲＮＡ／ａａＲＳ／ＥＧＦＰ^＊＊の種々の組み合わせを使用して図１０において決定した。１ｍＭの各ＵＡＡを使用した。例えば、チロシンＴＧＡサプレッサーとピロリシンＴＡＧサプレッサープラスミドの第１のプラスミドの組み合わせは、ＵＡＡの組み合わせＯＭｅＹ＋ＢｏｃＫ又はＵＡＡの組み合わせＡｚＦ＋ＣｐＫを含むＥＧＦＰ^＊＊の比較的低い収量（収率）となった。ＡｚＦ＋ＣｐＫ（７９７）、及びＣｙ５－Ｎ３＋ＣｐＫ（２０４）等、低いがバイオコンジュゲーションに適したアミノ酸の組み合わせの蛍光レベルを、５ＨＴＰ＋ＣｐＫ（１２２６）、Ｃｙ５－Ｎ３＋５ＨＴＰ（１０７７）、及び５ＨＴＰ＋ＡｚＦ（１６７０）等の高収量組み合わせと比較することが重要であり、この高収量組み合わせでは、他のすべての既存のバイオコンジュゲーションの選択肢と比較して収量が２～１０倍改善している。試験したＵＡＡの組み合わせについて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析したところ、均質な生成物を示す単一のバンドが観察された（図１０Ｂ）。

【0213】

標準的な全タンパク質ＥＳＩ－ＭＳ分析を、上記の１０個のＥＧＦＰ^＊＊変異体について実施した。図１１Ａ～Ｇにおいて、２つの異なるＵＡＡを含有する非標識タンパク質を、分子量及び純度について分析した。図１１Ａは、ＵＡＡ ＨＴＰ及びＢｏｃＫを含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｂは、ＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＯＭｅＹを含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｃは、ＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＣｙｓ－５－Ｎ３を含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｄは、ＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＢｏｃＫを含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｅは、ＵＡＡ ５ＨＴＰ及びシクロプロペン－Ｋを含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｆは、ＵＡＡ ＡｚＷ及びシクロプロペン－Ｋを含有するＥＧＦＰの結果を示し、図１１Ｇは、ＵＡＡ ５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有するＥＧＦＰの結果を示す。すべてのタンパク質試料は均質であり、各ＵＡＡの部位特異的な組み込みを実証した。予想される質量が、各実施例において観察された。

【0214】

ＥＧＦＰ^＊＊レポーターは、２つの終止コドン（ＴＡＧ及びＴＧＡ）を有するＥＧＦＰタンパク質を含有する。続いて、フルオロフォアをワンポット反応においてこの変異体にコンジュゲートした。アジドを含むＥＧＦＰ^＊＊タンパク質をクリック標識するために、１μｇの精製ＥＧＦＰ^＊＊を２０μＭ ＤＢＣＯ－Ｃｙ５（Ｓｉｇｍａ（シグマ））とインキュベートした。アルキンＵＡＡを含有するＥＧＦＰ^＊＊については、１μｇのタンパク質を５０μＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ピコリルアジド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フィッシャー・サイエンティフィック））と室温で２時間インキュベートした。対照実験として、野生型ＥＧＦＰを用いた同一の反応を設定した。ＣｐＫを含有するＥＧＦＰを標識するために、５μＭのタンパク質を２００μＭのテトラジン・フルオレセインと、ＰＢＳ中、室温で３０分間インキュベートした。５ＨＴＰを含有するタンパク質について、１μｇの精製ＥＧＦＰ^＊＊（約６～１０μＭ）を５倍過剰のジアゾニウムで標識した。図１１Ｈは、５ＨＴＰ及びＡｚＫを含むＥＧＦＰ^＊＊を、標的５ＨＴＰのみが標識されるジアゾニウムフルオロフォアで上述の条件を用いて単一標識したものの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）結果を示し、非標識の図１１Ｇからの単一の予想質量シフトを描いている。図１１Ｉは、５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有するＥＧＦＰ^＊＊を、標的アジドのみが標識されるＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡで上述の条件を用いて単一標識したもののＬＣＭＳ結果を示し、非標識の図１１Ｇからの単一の予想質量シフトを描いている。図１１Ｊは、５ＨＴＰ及びＡｚＫを含有するＥＧＦＰ^＊＊を、５ＨＴＰがジアゾニウムで選択的に標識され、ＡｚＫがＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡで選択的に標識されるジアゾニウムフルオロフォア及びＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡで上述した条件を用いて二重標識したもののＬＣＭＳ結果を示し、非標識の図１１Ｇからの単一の予想質量シフトを描いている。

【0215】

標識後、得られたタンパク質もＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供し、ＢｉｏＲａｄ（バイオ・ラッド） Ｃｈｅｍｉｄｏｃイメージング装置でフルオレセイン又はＴＡＭＲＡの設定のいずれかによって画像化した。これらの設定の下では、標識されたタンパク質を含むバンドのみが見え、この分析の結果は、図１２に示されている。

【0216】

実施例５ － 抗体への複数の異なるＵＡＡの組み込み及びその後の特性解析
この実施例は、抗体への２つのＵＡＡの組み込み、及びその後の抗体タンパク質の特性解析を説明する。

【0217】

２つの異なるＵＡＡをタンパク質に組み込む能力を、抗体に拡張した。この研究で利用した抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン）等の抗体に相同な領域を含む完全長のヒトＩｇＧ１サブクラスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であった。４ｘＵ６促進Ｔｒｐ－ｔＲＮＡ_ＵＣＡ（配列番号５１）を有するＣＭＶ促進ＴｒｐＲＳ．ｈ１４（配列番号４５）を含有するトリプトファンプラスミドを構築した。ロイシルサプレッサープラスミドは、４ｘＵ６促進ＬｅｕｔＲＮＡ_ＣＵＡ（配列番号１６）を有するＣＭＶ促進ＬｅｕＲＳ．ｖ１（配列番号２）を含有する構築物であった。軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）抗体断片は、ＣＭＶプロモーターの下で構成的に発現させた。本明細書では、改良された系が、ＬＣ及びＨＣ抗体断片をサプレッサープラスミド上に導入し、既報の他のどのマルチサイト抑制タンパク質よりもすでに有意に高い一過性のトランスフェクション収率を増加させることが企図されている。これらのプラスミドを、図１５に描かれているように、ＨＣミュータントを含む１つのプラスミド及び終止コドンを有するＬＣミュータントを含む１つのプラスミドとともに、製造者のプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３にトランスフェクトした。

【0218】

１ｍＭ ＵＡＡを用いて製造者のプロトコルに記載のように及び上記のようにして、標準的なプロテインＧカラムを介してタンパク質を精製して、ＨＣ－Ｔ２０２－ＴＧＡ／ＬＣ－Ｋ１１３－ＴＡＧ（ＵＡＡ ＨＴＰ及びＬＣＡを組み込んでいる）並びにＨＣ－Ｔ２０２－ＴＡＧ／ＬＣ－Ｋ１１３－ＴＧＡ（ＵＡＡ ＬＣＡ及びＨＴＰを組み込んでいる）抗体について６６ｍｇ／Ｌ及び７２ｍｇ／Ｌの総タンパク質を得た。タンパク質収量を図１３Ａに示す。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ又はＩｇＧ設定のＮａｎｏｄｒｏｐを用いた紫外可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）吸光度を用いて測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図１３Ｂ）は、野生型（ＷＴ）（１）、ＨＴＰ／ＬＣＡ（２）及びＬＣＡ／ＨＴＰ（３）についてのきれいなバンドを描き、大きい切断は観察されない。これらの抗体は、直交する／適合性のあるコンジュゲーションケミストリーを持つ２つの部位特異的な異なるＵＡＡを含有する。図１４は、標的ＰＮＧａｓｅ／還元ＬＣＭＳデータを描く。Ｋ１１３－ＬＣＡを含有するＬＣの標的質量が、単独で観察される（図１４Ａ）。ＨＣ質量については、２つのピークが観察される（図１４Ａ）。４９，８５３の脱グリコシル化標的質量が観測されたが、部分的な脱グリコシル化によりグリコシル化生成物（５１，２９６）が生じた。理論に縛られることを望まないが、この結果は、ＵＡＡの導入部位がグリコシル化部位に立体的に近接している場合に起こるのかもしれない。それにもかかわらず、重要なことは、ＰＮＧａｓｅ／還元がない場合、純粋な完全なタンパク質質量が観察されることである。

【0219】

ＨＣ－Ｔ２０２－ＴＧＡ／ＬＣ－Ｋ１１３－ＴＡＧ（ＨＴＰ／ＬＣＡ）抗体を、上記のような方法論を用いて、図１６に模式的に描かれたジアゾ－ＰＥＧ４－ビオチン及びＤＢＣＯ－ＡＦ６４７で標識化した。図１６は、ｍＡｂの二量体の性質のために、各標識試薬が抗体を２回標識する（結果として、合計４つのコンジュゲートを生成する）ので、簡略化された描写である。図１７のＨＰＬＣ－ＨＩＣトレースは、疎水性分子ＡＦ６４７及びビオチンの添加に伴う適切なシフトを示した。図１７Ａは、非標識のＬＣ及びＨＣピークを示す。図１７Ｂは、ＤＢＣＯ－ＡＦ６４７の添加に伴うＬＣピークのシフトを示す。２つの追加のピークが見られるが、これらは、ｍＡｂが含まれないＤＢＣＯ－ＡＦ６４７のみの対照によって明らかにされるように（図１７Ｅ）、ＤＢＣＯ－ＡＦ６４７添加物に対応し、それゆえ、試料純度の減少を示すものではない。図１７Ｃは、ジアゾ－ビオチンの添加によるＨＣピークシフトを示す。図１７Ｄは、一緒に標識した場合、より疎水性のピークへの完全なシフトを示す。全体として、約１００％の標識化がＨＰＬＣ－ＨＩＣによって観察され、全体的なタンパク質純度が非常に高いことが示された。

【0220】

全体として、これらの研究は、複数の異なるＵＡＡを抗体に組み込む能力、及びこれらの抗体を（上記のＥＧＦＰ^＊＊レポーター実験で行ったように）治療ペイロード又はフルオロフォアで標識する能力を実証している。

【0221】

参照による組み込み
本明細書で言及される各特許及び科学文献の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。

【0222】

均等物
本発明は、その趣旨又は本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化されてもよい。それゆえ、上述の実施形態は、すべての点において、本明細書に記載された発明を限定するのではなく、例示的であるとみなされる。従って、本発明の範囲は、上述の説明によってではなく、添付の請求項によって示され、請求項の意味及び均等の範囲内に入るすべての変更は、本発明に包含されることが意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【配列表】

2022551483000001.app

【国際調査報告】