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特表2022-551488びまん性神経膠腫および治療に対する応答性を評価するための同時マーカー検出の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-09
(54)【発明の名称】びまん性神経膠腫および治療に対する応答性を評価するための同時マーカー検出の使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221202BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20221202BHJP
A61K 31/4188 20060101ALI20221202BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221202BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221202BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221202BHJP
C12N 9/22 20060101ALN20221202BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221202BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/6806 Z
A61K31/4188
A61P25/00
A61P35/00
C12N15/12
C12N9/22
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022521410
(86)(22)【出願日】2020-10-12
(85)【翻訳文提出日】2022-04-08
(86)【国際出願番号】 US2020055256
(87)【国際公開番号】W WO2021072374
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/914,141
(32)【優先日】2019-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517022555
【氏名又は名称】バイオベンチャーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅｓ， ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス，アナリズ
(72)【発明者】
【氏名】ウォンスラワット，ティダティップ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL03
4B063QA12
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4C086AA10
4C086CB05
4C086NA20
4C086ZA01
4C086ZB26
(57)【要約】
本開示は、対象の生体サンプルにおける変異およびメチル化レベルを同時に検出する方法に関する。特に、本開示は、対象における、びまん性神経膠腫などの中枢神経系腫瘍を診断するための方法を対象とし、１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に決定するステップを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるびまん性神経膠腫を検出するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象のための生体サンプルを取得すること、
ｂ）前記サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、
ｃ）前記ゲノムＤＮＡの１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、
ｄ）前記１つ以上の関心領域の前記変異の有無および前記メチル化レベルを参照値と比較すること、
ｅ）測定された変異の有無および前記メチル化レベルが前記参照値から逸脱するときに、びまん性神経膠腫を有するとして前記対象を分類すること、を含む、方法。
【請求項2】
前記ゲノムＤＮＡを単離した後、前記ゲノムＤＮＡが、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するように処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡが、脱リン酸化酵素で処理される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＤＮＡが、標的化二本鎖切断を生成するためにヌクレアーゼと接触し、それによって１つ以上の関心領域を生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ以上の関心領域が、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、前記遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記二本鎖切断が、ＣＲＩＳＰＲで生成されている、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
ＭＧＭＴに対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号１～２を含み、ＩＤＨ１に対する前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号３～４を含み、ＩＤＨ２に対する前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号５～６を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
配列決定アダプタの連結を補助するために、前記関心領域の遊離末端を修飾することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
１つ以上の配列決定アダプタ分子を前記１つ以上の関心領域に連結することと、前記関心領域を配列決定することと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ナノポア配列決定が、使用されている、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
びまん性神経膠腫を有するか、または有する疑いのある対象における治療薬に対する応答性を評価するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象のための生体サンプルを取得すること、
ｂ）前記サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、
ｃ）前記ゲノムＤＮＡの１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、
ｄ）前記１つ以上の関心領域の前記変異の有無および前記メチル化レベルを参照値と比較すること、
ｅ）前記変異の有無および前記メチル化のレベルに基づいて、治療応答性を評価すること、を含む、方法。
【請求項12】
前記ゲノムＤＮＡを単離した後、前記ゲノムＤＮＡが、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するように処理される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ゲノムＤＮＡが、脱リン酸化酵素で処理される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＤＮＡが、標的化二本鎖切断を生成するためにヌクレアーゼと接触し、それによって１つ以上の関心領域を生成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記１つ以上の関心領域が、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、前記遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記二本鎖切断が、ＣＲＩＳＰＲで生成されている、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
ＭＧＭＴに対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号１～２を含み、ＩＤＨ１に対する前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号３～４を含み、ＩＤＨ２に対する前記ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡが、配列番号５～６を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
配列決定アダプタの連結を補助するために、前記関心領域の遊離末端を修飾することを含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
１つ以上の配列決定アダプタ分子を前記１つ以上の関心領域に連結することと、前記関心領域を配列決定することと、を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ナノポア配列決定が、使用されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記治療薬が、ＴＭＺである、請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が、応答性であると決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項23】
前記治療薬が、前記対象に投与される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／９１４，１４１号の優先権を主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／９１４，１４１号の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、概して、対象の生体サンプル中でびまん性神経膠腫を検出し、治療に対する応答性を評価するための方法に関する。
【0003】
配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１０月１２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、６６３４００＿ＳｅｑｕｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５と命名され、１，４１１バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１０月１２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、６６３４００＿ＳｅｑｕｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５と命名され、１，４１１バイトのサイズである。
【背景技術】
【0004】
びまん性神経膠腫（ＤＧ）は、成人の原発性悪性中枢神経系腫瘍の８０％を占め、組織学的タイプ（例えば、星細胞腫、乏突起膠腫、または乏突起星細胞腫）および悪性腫瘍グレード（例えば、グレードＩ～ＩＶ）を定義するために、伝統的に病理学的基準で診断された。２０１６年に、世界保健機関（ＷＨＯ）の診断ガイドラインは、分子マーカーがＤＧの分類に組み込まれた。これらの診断バイオマーカーの多くはまた、予後指標としての役割を果たし、神経腫瘍学コミュニティは、臨床実践への分子マーカーのこの統合を支持してきた。しかしながら、現在までのところ、分子技術および検査の妥当性が世界中で、さらには地理的領域内でさえも一貫していないため、バイオマーカー評価には幅広いばらつきがある。したがって、複数のバイオマーカーを同時に評価することができる新規の配列決定技術の使用は、現在の臨床実践の制限を克服するための魅力的な選択肢である。
【0005】
したがって、当技術分野における必要性は、中枢神経系腫瘍の治療およびケア中の意思決定プロセスにおいて医師および患者を導くために、複数のバイオマーカーを同時に評価することができる配列決定技術のために存在する。
【発明の概要】
【0006】
本開示の様々な態様の中には、対象のための生体サンプルを取得すること、サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、ゲノムＤＮＡの１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、１つ以上の関心領域の変異の有無およびメチル化レベルを参照値と比較すること、測定された変異の有無およびメチル化レベルが参照値から逸脱するときに、びまん性神経膠腫を有するとして対象を分類すること、によって、対象におけるびまん性神経膠腫を検出するための方法の提供がある。
【0007】
いくつかの実施形態では、本方法は、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するために単離後にゲノムＤＮＡを処理することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、脱リン酸化酵素で処理される。
【0008】
別の態様では、本方法は、標的化二本鎖切断を生成するためにＤＮＡがヌクレアーゼと接触し、それによって１つ以上の関心領域を生成することを含む。例示的な実施形態では、１つ以上の関心領域は、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、該遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる。いくつかの実施形態では、標的化二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲで生成されている。例示的な実施形態では、ＭＧＭＴに対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号１～２を含み、ＩＤＨ１に対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号３～４を含み、ＩＤＨ２に対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号５～６を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、本方法は、配列決定アダプタの連結を補助するために、ヌクレアーゼで切断した後の関心領域の遊離末端を修飾することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の配列決定アダプタ分子を１つ以上の関心領域に連結することと、関心領域を配列決定することと、を含む。特定の態様では、ナノポア配列決定は、使用されている。
【0010】
本開示はまた、対象のための生体サンプルを取得すること、サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、ゲノムＤＮＡの１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、１つ以上の関心領域の変異の有無およびメチル化レベルを参照値と比較すること、変異の有無およびメチル化のレベルに基づいて、治療応答性を評価すること、ことによって、びまん性神経膠腫を有するか、または有する疑いのある対象における治療薬に対する応答性を評価するための方法の提供を提供する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本方法は、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するために単離後にゲノムＤＮＡを処理することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、脱リン酸化酵素で処理される。
【0012】
別の態様では、本方法は、標的化二本鎖切断を生成するためにＤＮＡがヌクレアーゼと接触し、それによって１つ以上の関心領域を生成することを含む。例示的な実施形態では、１つ以上の関心領域は、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、該遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる。いくつかの実施形態では、標的化二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲで生成されている。例示的な実施形態では、ＭＧＭＴに対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号１～２を含み、ＩＤＨ１に対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号３～４を含み、ＩＤＨ２に対するＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡは、配列番号５～６を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、本方法は、配列決定アダプタの連結を補助するために、ヌクレアーゼで切断した後の関心領域の遊離末端を修飾することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の配列決定アダプタ分子を１つ以上の関心領域に連結することと、関心領域を配列決定することと、を含む。特定の態様では、ナノポア配列決定は、使用されている。
【0014】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＭＺに対する応答性を評価することを含む。
【0015】
他の目的および特徴は、一部では明らかであり、一部では以下で指摘されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払に応じて、庁によって提供されるであろう。
【0017】
【図1】ｎＣＡＴＳワークフローを開発するために使用された、よく特徴付けられたサンプルでの変異およびメチル化評価を示す。図１Ａは、ＩＤＨ１野生型、ＩＤＨ２野生型、ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ変異、およびＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｇ変異の遺伝子型同定を示す。ＩＤＨ１およびＩＤＨ２のエクソン４は、ＰＣＲ増幅され、ナノポア技術で配列決定されている。Ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈは、全てのサンプルを正しく遺伝子型同定した。図１Ｂは、メチル化および非メチル化ＤＮＡ標準物で検出された、観察および予想されるＣｐＧメチル化割合を示す。ＣｐＧ上で１００％メチル化または０％メチル化された標準物は、配列決定され、メチル化呼び出しは、Ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈで行われた。データは、１０、２５、５０％、または７５％のメチル化ＣｐＧについて、≧２０の深度カバレッジ（２０倍）で各標準からの読み取り値を無作為にサンプリングすることによって生成されており、０、２５、５０、７５、および１００％のメチル化レベルが、区別されることができる。データは、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを伴う中央値を表す。ボンフェローニ補正を伴うペアワイズｔ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。したがって、２０倍は、本研究における検出の理論的限界として使用された。図１Ｃは、３つの標的遺伝子座（ＭＧＭＴ（配列番号１～２）、ＩＤＨ１（配列番号３～４）、およびＩＤＨ２（配列番号５～６））についてのガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が設計され、ＭｉｎＩＯＮデバイスを伴うナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）について使用されたことを示す。様々なタイプのサンプルは、メチル化および変異をアッセイするために、ｎＣＡＴＳの実現可能性を検査するために使用される。ＧＢＭ、膠芽腫；ＴＭＺ、テモゾロミド。図１Ｄは、１０個のサンプルについての各遺伝子座のカバレッジ中央値を示す。
【図2】４つのＩＤＨ変異体臨床サンプルにおけるＭＧＭＴおよびＩＤＨ状態の同時評価を示す。図２Ａは、メチル化が、２つのＤＮＡ標準物、メチル化（ＭｅｔＣｔｒｌ）および非メチル化（ＵｎＭｅｔＣｔｒｌ）ＣｐＧにおいて、パイロ配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびｎＣＡＴＳによってアッセイされたことを示す。図２Ｂは、メチル化が、４つの膠芽腫細胞株、Ｕ８７、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、およびＬＮ１８から抽出されたＤＮＡにおいてアッセイされたことを示す。ｎＣＡＴＳとパイロ配列決定との間のメチル化レベルの相関（ｒ）は、Ｐ値で計算された。各黄色点は、個々のＣｐＧである。図２Ｃは、メチル化パターンが、４つのＩＤＨ変異体臨床サンプルにおける、パイロ配列決定、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、およびｎＣＡＴＳによってアッセイされたことを示す。ｎＣＡＴＳとパイロ配列決定との間のメチル化レベルの相関（ｒ）は、Ｐ値で計算された。各黄色点は、個々のＣｐＧである。図２Ｄは、ＩＤＨ変異が、ｎＣＡＴＳ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、およびＳａｎｇｅｒ配列決定プラットフォームで検出されたことを示す。ＩＤＨ１変異は、３名の患者（青色行）で正確に検出され、ＩＤＨ２変異は、１名の患者（橙色行）で検出された。円グラフおよびパーセンテージは、各方法によって検出された対立遺伝子頻度を示す。
【図3】異なる遺伝子座でのＭＧＭＴ遺伝子発現とＣｐＧメチル化との間の相関を示す。図３Ａは、ＭＧＭＴ遺伝子発現が、４つの細胞株および４つのＩＤＨ変異体腫瘍サンプルにおいてｑＲＴ－ＰＣＲで測定されたことを示す。データは、平均±ＳＤ（３回の技術的複製）である。図３Ｂは、ＭＧＭＴエクソン１内の１２の臨床的に関連するＣｐＧ部位のパーセントメチル化を示す。図３Ｃは、ＭＧＭＴ発現と、パイロ配列決定対ｎＣＡＴＳによって検出されたメチル化との相関を示す。各黄色点は、個々のサンプルである。図３Ｄは、エクソン１ ＣｐＧおよびイントロン１ ＣｐＧの一部分のパーセントメチル化のヒートマップならびに階層クラスタリングを示す。選択されたＣｐＧ（ｒ＞０．７またはｒ＜－０．７）は、クラスタリングのために使用された。図３Ｅは、ＭＧＭＴ発現とエクソン１メチル化との間、およびＭＧＭＴ発現とイントロン１メチル化との間の相関を示す。
【図4】ｎＣＡＴＳが、神経膠腫臨床サンプル中のＭＧＭＴ ＣｐＧメチル化を同時に定量化し、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を検出することができることを示す。図４Ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲによる４つのＩＤＨ野生型サンプルにおけるＭＧＭＴ遺伝子発現を示す。データは、平均±ＳＤ（３回の技術的複製）である。図４Ｂは、ｎＣＡＴＳおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹによるメチル化パターンを示す。図４Ｃは、ＭＧＭＴ発現とエクソン１メチル化との間、およびＭＧＭＴ発現とイントロン１メチル化との間の相関を示す。図４Ｄは、ＭＧＭＴならびにＩＤＨ１／２におけるＳＮＶが、６人の患者からの腫瘍および唾液サンプルにおけるｎＣＡＴＳならびにＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定でアッセイされたことを示す。データは、ｔｒａｃｋＶｉｅｗｅｒでプロットされた。Ｐ７８５およびＰ８１６について、データは利用可能ではない。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本開示は、少なくとも部分的に、長読み取りナノポアベース配列決定技術が、対象から取得された生体サンプルにおけるＩＤＨ変異的状態およびＭＧＭＴメチル化レベルを同時に検出することが可能であるという発見に基づいている。現在、これらのバイオマーカーは、別々にアッセイされ、結果は、数日から数週間かかることがある。本明細書に示されるように、３６時間以内にＩＤＨ１およびＩＤＨ２変異を同定するためのナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）の使用は、したがって、現在開示されているアプローチは、現在使用されている臨床方法を超える改善を表す。ｎＣＡＴＳはまた、現在使用されている方法と同様に、プロモーター領域だけでなく、近位プロモーター領域にわたるＣｐＧ、エクソン１の全体、およびイントロン１の一部にわたるＭＧＭＴメチル化レベルの高分解能評価を同時に提供するのにも有用であることが示された。興味深いことに、全てのＣｐＧのメチル化レベルがＭＧＭＴ発現と比較されたときに、イントロン１のメチル化とＭＧＭＴ発現との間の正の相関は、観察された。最後に、３つの標的遺伝子座における単一ヌクレオチドバリアントは、同定された。本開示は、がん精密医療のための臨床ツールとしてｎＣＡＴＳを使用することの実現可能性を実証する。
【0019】
全体として、本開示は、現在開示されている方法が中枢神経系腫瘍の検出および予後に有用であることを示す、複数種の証拠を提供する。したがって、本開示は、びまん性ジローマなどの中枢神経系腫瘍を診断し、治療決定を導き、疾患の進行を監視し、特定の治療的介入の臨床的有効性を評価するために、生体サンプルにおけるＩＤＨ変異状態およびＭＧＭＴメチル化レベルを同時に検出するための方法の使用を包含する。本発明の他の態様および反復は、以下により徹底的に記載される。
【0020】
Ｉ．方法
本開示の一態様は、対象における中枢神経系の腫瘍を診断するための方法であって、該対象の生体サンプル（例えば、生検）における１つ以上の関心領域の変異およびメチル化レベルを同時に決定するステップを含み、該１つ以上の関心領域の変異および／またはメチル化レベルの存在が、疾患を示す、方法を包含する。いくつかの実施形態では、中枢神経系腫瘍は、びまん性神経膠腫である。本開示によるびまん性神経膠腫は、ＷＨＯグレードＩＩ～ＩＶ腫瘍の範囲で、星細胞腫、乏突起膠腫および乏突起星細胞腫などの神経膠腫と組織学的に類似して見える、中枢神経系の様々な腫瘍を包含するために使用される用語である。
本開示の一態様は、対象における中枢神経系の腫瘍を診断するための方法であって、該対象の生体サンプル（例えば、生検）における１つ以上の関心領域の変異およびメチル化レベルを同時に決定するステップを含み、該１つ以上の関心領域の変異および／またはメチル化レベルの存在が、疾患を示す、方法を包含する。いくつかの実施形態では、中枢神経系腫瘍は、びまん性神経膠腫である。本開示によるびまん性神経膠腫は、ＷＨＯグレードＩＩ～ＩＶ腫瘍の範囲で、星細胞腫、乏突起膠腫および乏突起星細胞腫などの神経膠腫と組織学的に類似して見える、中枢神経系の様々な腫瘍を包含するために使用される用語である。
【0021】
特定の変異および／またはメチル化レベルは、健康な対象からのサンプルと比較して、または参照値に関して、罹患した対象のサンプルにおいて存在し得る。したがって、本開示は、関心領域の１つ以上のゲノム変異の「有無」（「存在」または「不存在」）を決定すること、および／または関心領域のゲノムメチル化レベルを決定すること、決定されたレベルを参照レベルと比較することを包含する。したがって、本開示は、１つ以上の関心領域のゲノム変異の有無を決定するステップと、１つ以上の関心領域のゲノムメチル化レベルを決定するステップとを提供し、決定されたメチル化レベルと参照メチル化レベルとの間の１つ以上の変異および／または異なるレベルの存在が、疾患のための指標である。ゆえに、本発明はまた、中枢神経系の腫瘍を診断し、治療薬に対する応答性を決定し、中枢神経系の腫瘍の進行を監視するための方法であって、１つ以上の関心領域における１つ以上のゲノム変異の存在の有無を決定するステップと、１つ以上の関心領域におけるゲノムメチル化レベルを決定するステップとを含み、決定されたメチル化レベルと参照メチル化レベルとの間の１つ以上の変異および／または異なるレベルの存在が、疾患、治療薬に対する応答性、または疾患の進行のための指標である、方法に関する。
【0022】
本明細書に開示される方法は、概して、生体サンプルを提供するか、または提供されていることを含む。本明細書で使用される場合、「生体サンプル」という用語は、対象から単離された生体材料を意味する。１つ以上の関心領域における１つ以上のゲノム変異および／もしくはメチル化レベルを検出するために好適な任意の遺伝物質を含有する任意の生体サンプルであって、対象から取得された細胞および／もしくは非細胞物質を含み得る任意の生体サンプルは、好適である。非限定的な例は、血液、血漿、血清、尿、および組織を含む。しばしば、サンプルは、患者に由来するサンプルである「臨床サンプル」である。典型的な臨床サンプルは、滑液、喀痰、血液、尿、血漿、血清、汗、粘液、唾液、リンパ液、気管支吸引液、腹腔液、脳脊髄液、および胸水などの体液サンプル、ならびに組織サンプル、組織または細針生検サンプル、ならびにそれらからの膿瘍または細胞を含むが、これらに限定されない。生体サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片またはホルマリン固定切片などの組織の切片を含み得る。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、唾液または脳組織から選択される。
【0023】
「サンプル」はまた、増幅反応の生成物などの生化学的または化学的反応に由来するサンプルであり得る。液体サンプルは、本開示における使用の前に、１つ以上の事前処理に供され得る。そのような事前処理は、希釈、濾過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿または透析を含むが、これらに限定されない。事前処理はまた、例えば、サンプルおよび含有核酸、特にゲノムＤＮＡを安定化するために、化学物質または生化学物質を溶液に添加することを含み得る。このような化学物質または生化学物質の添加は、酸、塩基、緩衝剤、塩、溶媒、反応性染料、洗剤、乳化剤、またはキレート剤（ＥＤＴＡなど）を含む。例えば、サンプルは、採取され、そのような物質と直接混合され得る。一実施形態では、物質は、分析の開始までサンプルを安定化するために、サンプルに添加される。この文脈における「安定化」は、決定されるゲノム関心領域の分解の防止を意味する。この文脈での好ましい安定剤は、ＥＤＴＡ、例えば、Ｋ２ＥＤＴＡ、ＤＮａｓｅ阻害剤、アルコール、例えば、エタノールおよびイソプロパノール、タンパク質（ＲＮＡｌａｔｅｒなど）を塩分抜きするために使用される薬剤である。いくつかの実施形態では、本方法は、硫酸水素塩修飾を含まない。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡは、生体サンプルから抽出され、抽出されたゲノムＤＮＡを含むサンプルは、全ての遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するように処理される。例えば、ｇＤＮＡは、全ての遊離ＤＮＡ末端を還元脱リン酸化するために、仔ウシ腸管脱リン酸化酵素（ＮＥＢ）などの脱リン酸化酵素で処理される。
【0024】
当業者であれば理解されるように、生体サンプルを収集する方法は、生体サンプルの性質および行われる分析の種類に応じて変化することができる。当該技術分野で概して知られている任意の様々な方法は、生体サンプルを収集するために利用され得る。概して言えば、本方法は、好ましくは、ゲノム関心領域が本開示に従って正確に検出されることができるように、サンプルの完全性を維持する。
【0025】
いくつかの実施形態では、単一サンプルは、サンプルにおける１つ以上のゲノム関心領域を検出するために対象から取得される。代替的に、１つ以上のゲノム関心領域は、対象から経時的に取得されたサンプルにおいて検出され得る。このように、２つ以上のサンプルは、経時的に対象から収集され得る。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上のサンプルは、経時的に対象から収集され得る。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、または６サンプルは、経時的に対象から収集される。他の実施形態では、６、７、８、９、または１０サンプルは、経時的に対象から収集される。さらに別の実施形態では、１０、１１、１２、１３、または１４サンプルは、経時的に対象から収集される。他の実施形態では、１４、１５、１６以上のサンプルは、経時的に対象から収集される。
【0026】
２つ以上のサンプルが経時的に対象から収集されるとき、サンプルは、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の時間ごとに収集され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、０．５、１、２、３、または４時間ごとに収集される。他の実施形態では、サンプルは、４、５、６、または７時間ごとに収集される。さらに別の実施形態では、サンプルは、７、８、９、または１０時間ごとに収集される。他の実施形態では、サンプルは、１０、１１、１２以上の時間ごとに収集される。さらに、サンプルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の日ごとに収集され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、約６日ごとに収集される。いくつかの実施形態では、サンプルは、１、２、３、４、または５日ごとに収集される。他の実施形態では、サンプルは、５、６、７、８、または９日ごとに収集される。さらに別の実施形態では、サンプルは、９、１０、１１、１２以上の日ごとに収集される。
【0027】
いくつかの実施形態では、サンプルは、核酸（複数可）を含む。「核酸」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、二本鎖、一本鎖、環状、線状または分岐状などのあらゆる長さおよび配置の全ての可能な供給源からのリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。全てのサブユニットおよびサブタイプはまた、例えば、モノマーヌクレオチド、オリゴマー、プラスミド、ウイルスおよび細菌核酸、ならびに対象由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ、環状ＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、処理および未処理形態のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、不均一核ＲＮＡ（ｈｎ－ＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに他の考えられる全ての核酸などで構成される。しかしながら、最も好ましい実施形態では、サンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。
【0028】
概して言えば、本明細書に開示される方法は、検出ステップ内で、残りのゲノムＤＮＡからゲノム関心領域を単離するように、ゲノムＤＮＡ内で標的化二本鎖切断を生成することを含む。標的化二本鎖切断は、ゲノム関心領域の上流および下流である。したがって、本明細書で提供される方法は、連続ゲノム領域、すなわち、５’および３’標的化二本鎖切断間の連続した長さのＤＮＡを照合するために有用である。そのような連続ゲノム領域は、染色体全体またはゲノム全体まで、小部分、すなわち、約５０ｋｂのゲノム配列を含み得る。一実施形態では、組成物および方法は、ゲノムの機能的要素を照合することにおいて有用である。機能的要素は、典型的には、ゲノムＤＮＡの５０、６０、７０、８０、９０～１００ｋｂの領域などのゲノムの限定領域を包含する。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、関心対象の遺伝子のコーディング領域に加えて、関心対象の遺伝子のコーディング領域の５’および３’の領域などの非コーディングゲノム領域の照合を含む。本方法は、特定の状況下でのみ、または生物における特定の細胞もしくは組織についてのみ、表現型変化に影響を及ぼし得る遺伝子の５’および３’領域内の標的およびコード領域の同定を可能にする。
【0029】
特定の実施形態では、ゲノム関心領域は、転写因子結合部位、ＤＮａｓｅ Ｉ超感受性領域、転写エンハンサーまたはリプレッサー要素、染色体、または生化学的活性を有する配列を含有する他の遺伝子間領域を含む。他の実施形態では、ゲノム関心領域は、特定の疾患または障害のエピジェネティックサインを含む。追加的に、または代替的に、ゲノム関心領域は、エピジェネティック絶縁体を含み得る。他の実施形態では、ゲノム関心領域は、物理的に相互作用する２つ以上の連続したゲノム領域を含む。さらに他の実施形態では、ゲノム関心領域は、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンユビキチン化、ヒストンリン酸化、ＤＮＡメチル化、またはそれらの欠如のうちの１つ以上に感受性のある１つ以上の部位を含む。
【0030】
本明細書に記載される方法を使用した照合のためのゲノム関心領域の例は、信号生化学的経路、例えば、信号生化学的経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドに関連する遺伝子を含むか、またはその５’または３’に位置する領域を含む。ゲノム領域の例は、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドの遺伝子コード領域、および／または５’および／もしくは３’を含む領域、または遺伝子コード領域内に位置する領域を含む。一実施形態では、遺伝子の５’および／または３’に位置する領域は、ゲノムまたは染色体の第１のヌクレオチドからゲノムまたは染色体の第２のヌクレオチドまでのゲノム領域または染色体を指す。第２のヌクレオチドは、ゲノムまたは染色体中の第１のヌクレオチドと遺伝子との間に位置される。第１のヌクレオチドは、遺伝子に対して約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１ｋｂ、約２ｋｂ、約３ｋｂ、約４ｋｂ、約５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ、約４０ｋｂ、約５０ｋｂ、約６０ｋｂ、約７０ｋｂ、約８０ｋｂ、約９０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約５５０ｋｂ、約６００ｋｂ、約６５０ｋｂ、約７００ｋｂ、約７５０ｋｂ、約８００ｋｂ、約８５０ｋｂ、約９００ｋｂ、約９５０ｋｂ、または約１ｍｂ、５′もしくは３′である。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、疾患の影響を受ける組織に由来する細胞において、非疾患対照の組織または細胞と比較して、異常なレベルもしくは異常な形態で転写または翻訳産物を産生する任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子の別の実施形態は、異常な高レベルで発現する遺伝子であり、異常な低レベルで発現する遺伝子であり得る。変化した発現は、疾患の発生および／または進行と相関する。転写または変換された生成物は、既知である、または未知であり得、正常レベルまたは異常レベルで発現され得る。関心の遺伝子のＤＮＡ過敏症の部位、転写因子結合部位、およびエピジェネティックマーカーは、公的に利用可能なデータベースにアクセスすることによって決定されることができる。好ましい実施形態では、ゲノム関心領域は、遺伝子に対して５’または３’である塩基を含む、ＩＤＨ１遺伝子を含む。好ましい実施形態では、ゲノム関心領域は、遺伝子に対して５’または３’である塩基を含む、ＩＤＨ２遺伝子を含む。好ましい実施形態では、ゲノム関心領域は、遺伝子に対して５’または３’である塩基を含む、ＭＧＭＴ遺伝子を含む。
【0031】
ＣＲＩＳＰＲ（特に、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡを使用する）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）による編集などの技術は、本開示による二本鎖切断を生成するために、使用され得る。「標的化ゲノム修飾」（「標的化ゲノム編集」または「標的化遺伝子編集」と相互転換可能）は、ゲノムにおいて予め選択された部位での挿入、欠失、および／または置換を可能にする。本開示によれば、ゲノムＤＮＡは、ゲノムＤＮＡから１つ以上の関心領域を除去することによって標的化修飾を受ける。標的化修飾は、ヌクレアーゼ依存性アプローチのいずれかによって達成され得る。したがって、標的化修飾は、特定の希少切断エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を通じて、より高い頻度で達成されることができる。いくつかの実施形態では、標的化ヌクレアーゼの非限定的な例は、天然および組換えヌクレアーゼ、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリー由来のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどを含む。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要なコンポーネント、（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、および（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を要求する。共発現されたとき、２つのコンポーネントは、ＰＡＭと、ＰＡＭ近傍の播種領域とを含む標的ＤＮＡ配列にリクルートされる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを組み合わせて、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成して、Ｃａｓ９を選択された配列を標的に誘導することができる。
【0032】
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ法の他に、当該技術分野で知られている追加のゲノム修飾方法も、単離されたゲノムＤＮＡに二本鎖切断を導入するために使用されることができる。いくつかの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどを含む。
【0033】
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼであり、これは、１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的な方法でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインである。ジンクフィンガーは、ジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０個のアミノ酸のドメインであり、その構造は、ジンクイオンの配位を通じて安定化される。ジンクフィンガーの例は、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、およびＣ４ジンクフィンガーを含むが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、自然界では発生しないドメインであり、その設計／組成は、主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納するデータベースにおける情報を処理するための置換ルールならびにコンピュータ化アルゴリズムの適用から生じる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、および第６，５３４，２６１号を、また、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号および国際公開第０３／０１６４９６号を参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる産生が自然界に見出されないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号および米国特許第７，９７２，８５４号により詳細に記載されている。ＺＦＮの最も認識される例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
【0034】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、または「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合を担う、ＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的ＤＮＡ配列に結合し、それらのトランス活性化ドメインを介して、これらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン特異性は、エフェクター変数数の不完全３４アミノ酸反復に依存し、これは、反復可変ジレジデンス（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置での多型を含む。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されている。当技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認識されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへの融合ポリペプチドである。
【0035】
標的化二本鎖切断が生じ、残りのゲノムＤＮＡから１つ以上の関心領域を単離した後、遊離５’ホスフェート部位の濃縮は、切断部位で生じる。したがって、関心領域を取り囲む独自の５’ホスフェート部位は、配列決定アダプタ分子への連結を可能にするために、修飾されることができる。非限定的な例では、アデニン（Ａ）鎖は、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＡＴＰなどのＤＮＡポリメラーゼを使用して、切断ＤＮＡ断片の３’末端に添加されることができる。Ａオーバーハングは、配列決定アダプタのＴオーバーハングと対合することができる。アダプタ連結ＤＮＡおよびブロックＤＮＡの両方は、配列決定のためにフローセルに添加されることができる。余剰の連結されていないアダプタは、配列決定前に任意選択で除去される。好ましい実施形態では、ミニオン（ｍｉｎｉｏｎ）またはフォングルなどのナノポアフローセルは、使用される。ナノポア配列決定は、長いＤＮＡまたはＲＮＡ断片の直接的でリアルタイムの分析を可能にする独自のスケーラブルな技術である。核酸がタンパク質ナノポアを通過する際に、電流への変化を監視することによって機能する。得られた信号は、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列情報を提供するように復号される。
【0036】
本開示に関連する１つ以上の変異の「有無」またはメチル化レベルは、単一ヌクレオチド変異などの変異もしくはメチル化レベルが、それぞれ、特定の閾値を超えるまたは特定の閾値を下回るレベルで存在することを意味する。閾値が「０」の場合、これは、「存在」がサンプル中の変異の実際の存在であり、「不存在」が実際の不存在であることを意味する。しかしながら、本開示との文脈における「存在」はまた、それぞれのメチル化レベルが閾値を上回るレベル、例えば、対照で決定されたレベルに存在することを意味し得、この文脈における「不存在」は、メチル化レベルが特定の閾値以下であることを意味する。
【0037】
「参照レベル」という用語は、変異の「有無」またはメチル化レベルの区別を可能にするために、決定されたレベルが比較されるレベルに関する。参照レベルは、治療薬の有効性を実際に診断または決定する推論ステップのための決定要因であるレベルを含む。好ましい実施形態における参照レベルは、健康な対象または健康な対象の集団、すなわち、診断されるべき疾患を有しない、例えば、びまん性神経膠腫などの中枢神経系腫瘍を有しない対象における、関心領域または変異的状態のメチル化レベルに関する。本出願の開示を伴う当業者は、一般的な統計的方法を使用して適切な制御レベルを決定する立場にある。
【0038】
制御関心領域に対する「参照レベル」はまた、疾患状態の不存在または治療薬への応答性を示すメチル化もしくは変異的状態のレベルを意味し得る。いくつかの実施形態では、対象におけるメチル化または変異的状態のレベルが参照レベルよりも高いとき、それは、疾患状態の存在または治療薬に対する応答性を示している。いくつかの実施形態では、対象におけるメチル化または変異的状態のレベルが参照レベルよりも高いとき、それは、疾患状態の不存在または治療薬に対する非応答性を示している。いくつかの実施形態では、対象におけるメチル化または変異的状態のレベルが参照レベル未満であるとき、疾患状態の存在または治療薬に対する応答性を示している。いくつかの実施形態では、対象におけるメチル化または変異的状態のレベルが参照レベル未満であるとき、それは、疾患状態の欠如または治療薬に対する非応答性を示している。いくつかの実施形態では、対象におけるメチル化レベルが参照レベル内にあるとき、それは、治療薬に対する応答性または非応答性のいずれかを示す。
【0039】
１つ以上の関心領域の変異的状態および／またはメチル化レベルは、当業者に周知のいくつかの様式で分析され得る。例えば、取得された各アッセイ結果は、「正常」もしくは「対照」の値、または特定の疾患もしくは治療結果を示す値と比較され得る。特定の診断／予後は、各アッセイの結果をそのような値と比較することに依存し得、これは、診断的または予後的な「閾値」と呼ばれ得る。特定の実施形態では、１つ以上の診断または予後指標のアッセイは、アッセイにおける変異の有無だけで、コンディションまたは疾患と相関する。例えば、アッセイは、陽性信号が関心の特定閾値レベルより上でのみ発生し、およびそのレベル以下では、背景より上の信号が提供されないように設計されることができる。
【0040】
当業者は、診断または予後指標を、診断または将来の臨床転帰の予後リスクと関連付けることが、統計分析であることを理解するであろう。例えば、Ｘよりも低いマーカーレベルは、統計的有意性のレベルによって決定されるように、Ｘ以上のレベルを有する患者よりも患者が有害な転帰に罹患する可能性が高いことを知らせ得る。別のマーカーに関して、Ｘより高いマーカーレベルは、統計的有意性のレベルによって決定されるように、Ｘ以下のレベルを有する患者よりも患者が有害な転帰に罹患する可能性が高いことを知らされ得る。追加的に、ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は、患者の予後を反映され得、マーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連され得る。統計的有意性は、しばしば、２つ以上の母集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を決定することによって決定される。例えば、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照されたい。本発明の好ましい信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、および９９．９９％であり、一方で好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。疾患の診断に好適な閾値レベルは、特定の組み合わせについて決定されることができる。これは、例えば、患者の変異的状態および／またはメチル化のレベルに従って、患者の参照集団を特定の分位数、例えば、四分位数、五分位数、または好適なパーセンタイルに従ってグループ化することによって行われることができる。特定のパーセンタイルの上下の分位または群の各々について、ハザード比は、特定の疾患を有する患者とそうでない患者との間の有害な転帰、すなわち「疾患」または「治療転帰」のリスクを比較して計算されることができる。そのようなシナリオでは、ハザード比（ＨＲ）が１を超えることは、患者について有害な転帰のリスクが高くなることを示す。１未満のＨＲは、患者群における特定の治療の有益な効果を示す。１（例えば、＋／－０．１）前後のＨＲは、特定の患者群のリスクの上昇を示唆しない。特定の分位数の患者間のＨＲと、患者全体の集団のＨＲとの比較によって、リスクが上昇した患者の分位数と、薬剤の恩恵を受け、それによって本発明に従って対象を階層化した患者の分位数を同定することが可能である。
【0041】
当業者は、本発明に関連して配列決定技術を使用することができる。配列決定技術としては、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（ｄｄＮＴＰを使用する連鎖終了法）、および次世代配列決定方法、例えば、大規模並列シグネチャ配列決定（ＭＰＳＳ）、ポロニー配列決定、４５４パイロ配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、またはイオントレント半導体配列決定もしくは単一分子、リアルタイム技術配列決定（ＳＭＲＴ）を含むが、これらに限定されない。
【0042】
ＭＧＭＴは、Ｏ－６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子である。ＭＧＭＴは、染色体１０（１２９４６７１８４－１２９７６８００７染色体位置（ｂｐ））に位置付けられる。ＭＧＭＴに関する核酸およびペプチド情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１７０４３０）、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子（４２５５）、およびＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ１６４５５）などの公に利用可能なデータベースにおいて見出されることができる。本明細書に記載されるように、発現ＭＧＭＴは、テモゾロミド（ＴＭＺ）などの化学療法剤に対する対象の応答性と相関する。本明細書に記載されるように、ＭＧＭＴ発現がエクソン１メチル化レベルと負の相関関係にあり、ＭＧＭＴ発現がメチル化レベルと正の相関関係にあることが見出された。
【0043】
ＩＤＨ１は、細胞質タンパク質であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋）１）をコードする遺伝子である。ＩＤＨ１は、染色体２（２０８２３６２２７－２０８２６６０７４染色体位置（ｂｐ））に位置付けられる。ＩＤＨ１に関する核酸およびペプチド情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１３８４１３）、Ｅｎｔｒｅｚ ｇｅｎｅ（３４１７）、およびＵｎｉＰｒｏｔ（Ｏ７５８７４）などの公に利用可能なデータベースにおいて見出されることができる。ＩＤＨ２は、ミトコンドリアタンパク質であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋）２）をコードする遺伝子である。ＩＤＨ２は、染色体１５（９００８３０４５－９０１０２５０４染色体位置（ｂｐ））に位置付けられる。ＩＤＨ１に関する核酸およびペプチド情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１８２０５４）、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子（３４１８）、およびＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ４８７３５）などの公に利用可能なデータベースにおいて見出されることができる。本明細書に記載されるように、ＩＤＨ１および／またはＩＤＨ２における変異の有無は、びまん性神経膠腫の有無を決定するための診断情報を提供する。
【0044】
本明細書に開示される１つ以上の関心領域は、参照値に関して対象から取得された生体サンプルにおいて、診断および治療の決定を行うのに有用であると特定される特徴的なプロファイルを包含する。例えば、以下の例を参照されたい。様々な実施形態では、１つ以上の関心領域の変異的状態および／またはメチル化レベルを決定することは、存在、不存在、アミロイドプラーク、進行放射線撮影アッセイ、および診断アッセイを決定するためのアッセイなどの診断アッセイで補足されることができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１個の関心領域、少なくとも２個の関心領域、少なくとも３個の関心領域、少なくとも４個の関心領域、少なくとも５個の関心領域、少なくとも６個の関心領域、少なくとも６個の関心領域、少なくとも７個の関心領域、少なくとも８個の関心領域、少なくとも９個の関心領域、少なくとも１０個以上の関心領域の変異的状態および／またはメチル化レベルを決定することを含み得る。
【0046】
本開示の態様は、対象におけるびまん性神経膠腫を検出する方法であって、対象からの生体サンプルを提供するか、または提供されていること、１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、１つ以上の関心領域の変異の有無およびメチル化レベルを参照値と比較すること、測定された有無、または変異およびメチル化レベルが参照値から逸脱するときに、びまん性神経膠腫を有するとして対象を診断すること、を含む方法を包含する。いくつかの態様では、検出ステップは、以下の、サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するためにゲノムＤＮＡを処理すること、１つ以上の関心領域を生成するためにゲノムＤＮＡに標的化二本鎖切断を導入すること、配列決定アダプタの連結を補助するために関心領域の遊離末端を修飾すること、１つ以上の関心領域に１つ以上の配列決定アダプタ分子を連結すること、および関心領域を配列決定することのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノポア配列決定は、使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の関心領域は、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、該遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる。
【0047】
本開示の態様は、びまん性神経膠腫を有するか、または有する疑いのある対象における治療薬に対する応答性を決定する方法を包含し、本方法は、対象からの生体サンプルを提供するか、または提供されていること、１つ以上の関心領域における変異の有無およびメチル化レベルを同時に検出すること、１つ以上の関心領域の変異の有無およびメチル化レベルを参照値と比較すること、測定された有無、または変異およびメチル化レベルが参照値から逸脱するときに、治療薬に対する対象の応答性を評価すること、を含む。いくつかの態様では、検出ステップは、以下の、サンプルからゲノムＤＮＡを単離すること、遊離ＤＮＡ末端を脱リン酸化するためにゲノムＤＮＡを処理すること、１つ以上の関心領域を生成するためにゲノムＤＮＡに標的化二本鎖切断を導入すること、配列決定アダプタの連結を補助するために関心領域の遊離末端を修飾すること、１つ以上の関心領域に１つ以上の配列決定アダプタ分子を連結すること、および関心領域を配列決定することのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノポア配列決定は、使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の関心領域は、ＩＤＨ１遺伝子と、ＩＤＨ２遺伝子と、ＭＧＭＴ遺伝子とを含み、該遺伝子の５’および３’隣接領域を含んでいる。いくつかの実施形態では、治療薬は、ＴＭＺである。
【0048】
ＩＩ．治療
本開示の別の態様は、それを必要とする対象を治療するための方法である。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、それを必要とする対象に、訓練され、免許を受けた専門家による医療を提供することを指す。医療は、診断検査、治療的治療、および／または予防もしくは予防措置であり得る。治療的および予防的治療の目的は、望ましくない生理学的変化または疾患／障害を予防または減速（軽減）することである。治療的または予防的治療の有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか否かに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または緩徐、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全な）を含むが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合の予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味する。治療を必要とするものには、既に疾患、コンディション、もしくは障害を有するもの、ならびに疾患、コンディション、もしくは障害を有する傾向があるもの、または疾患、コンディション、もしくは障害が予防されるべきものが含まれる。いくつかの実施形態では、治療を受ける対象は、無症候性である。本明細書で使用される場合、「無症候性の対象」は、中枢神経系腫瘍の兆候または症状を示さない対象を指す。他の実施形態では、対象は、中枢神経系腫瘍の兆候または症状（例えば、記憶喪失、気分または行動の変化、疼痛など）を呈し得る。
本開示の別の態様は、それを必要とする対象を治療するための方法である。本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、それを必要とする対象に、訓練され、免許を受けた専門家による医療を提供することを指す。医療は、診断検査、治療的治療、および／または予防もしくは予防措置であり得る。治療的および予防的治療の目的は、望ましくない生理学的変化または疾患／障害を予防または減速（軽減）することである。治療的または予防的治療の有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか否かに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または緩徐、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全な）を含むが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合の予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味する。治療を必要とするものには、既に疾患、コンディション、もしくは障害を有するもの、ならびに疾患、コンディション、もしくは障害を有する傾向があるもの、または疾患、コンディション、もしくは障害が予防されるべきものが含まれる。いくつかの実施形態では、治療を受ける対象は、無症候性である。本明細書で使用される場合、「無症候性の対象」は、中枢神経系腫瘍の兆候または症状を示さない対象を指す。他の実施形態では、対象は、中枢神経系腫瘍の兆候または症状（例えば、記憶喪失、気分または行動の変化、疼痛など）を呈し得る。
【0049】
本開示の一態様は、中枢神経系腫瘍を有するか、または有する疑いのある対象が、本明細書に開示されるような１つ以上の関心領域における変異およびメチル化レベルの検出に基づいて、治療薬（例えば、ＴＭＺまたは放射線などの化学療法）に対する応答性、または非応答性を評価するための方法に関する。本明細書で使用される場合、治療薬に対する「応答性」または「非応答性」を評価することは、治療薬に応答するかまたは応答しないための対象の可能性の決定を指す。
【0050】
本方法のように、２つ以上の関心領域が調査されるとき、ＲＯＩの変異的状態およびメチル化レベルは、例えば、ＲＯＩのパターンを特徴付ける数（複数可）によって表されることができる、プロファイルを生成するために計算プログラムによって処理されることができる。
【0051】
対象が記載される任意の方法によって応答性または非応答性であると決定されるとき、この対象は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意の中枢神経系腫瘍治療を含む、中枢神経系腫瘍についての治療を受けることができる。一態様では、対象は、本明細書に記載される方法を使用して応答性である可能性が高いと決定され、対象は、次いで、中枢神経系腫瘍を治療するための有効量の化学療法または放射線を投与され得る。非限定的な例は、ＴＭＺを含む。
【0052】
特定の態様では、治療有効量の薬学的組成物は、対象に投与され得る。投与は、末梢（すなわち、中枢神経系への投与によるものではない）または局所的に中枢神経系への投与を含む、標準的な有効な技術を使用して行われる。末梢投与は、経口投与、吸入投与、静脈内投与、腹腔内投与、関節内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、または坐剤投与を含むが、これらに限定されない。局所投与は、腰椎カテーテル、脳室内カテーテルもしくは実質内カテーテルを介して、または外科的に移植された制御放出製剤を使用することを含むが、これらに限定されない。投与経路は、治療される疾患またはコンディションによって規定され得る。
【0053】
効果的な投与のための薬学的組成物は、選択された投与様式に適しているように意図的に設計されており、適合性分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの薬学的に許容される賦形剤は、適宜使用される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，１６Ｅｄ ＩＳＢＮ：０－９１２７３４－０４－３、最新版は、概して、実施者に知られている製剤技術の総集編を提供する。
【0054】
上記の実施形態の各々では、薬学的組成物は、造影剤を含み得る。造影剤の非限定的な例は、機能的造影剤（例えば、フルオロデオキシグルコースなど）および分子造影剤（例えば、ピッツバーグ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモール、放射性核種標識抗体など）を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、最小用量は、投与され、用量は、用量制限毒性の不存在において漸増される。治療的有効用量の決定および調整、ならびにそのような調整を行うタイミングおよび方法の評価は、医学の技術分野における通常の当業者に既知である。
【0056】
用量の頻度は、症状を効果的に治療するために必要に応じて、毎日もしくは週または月に１回、２回、３回以上であり得る。疾患自体に関する治療の投与のタイミングおよび治療期間は、症例を取り巻く状況によって決定される。救急医療従事者によって投与されるような負傷の部位などの治療は、直ちに開始されることができる。治療は、病院または診療所自体で開始することも、退院後、または外来で診察を受けた後に開始することもできる。治療期間は、１回限りで投与される単回用量から、治療的治療の生涯経過までの範囲であることができる。
【0057】
典型的な用量レベルは、標準的な臨床技術を使用して決定および最適化されることができ、投与様式に依存する。
【0058】
対象は、げっ歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオン動物、または動物学的動物であり得る。一実施形態では、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであり得る。別の実施形態では、対象は、家畜動物であり得る。好適な家畜動物の非限定的な例は、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、およびアルパカを含み得る。さらに別の実施形態では、対象は、コンパニオン動物であり得る。コンパニオン動物の非限定的な例は、イヌ、ネコ、ウサギ、および鳥類などのペットを含み得る。さらに別の実施形態では、対象は、動物学的動物であり得る。本明細書で使用される場合、「動物学的動物」は、動物園において見出され得る動物を指す。そのような動物は、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミ、およびクマを含み得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【0059】
ＩＩＩ．キット
また、キットも提供されている。そのようなキットは、本明細書に記載される薬剤または組成物、および特定の実施形態では、投与のための説明書を含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載される方法の実施を容易にすることができる。キットとして供給されるとき、組成物の異なるコンポーネントは、別々の容器に包装され、使用直前に混合されることができる。コンポーネントは、システム、アッセイ、プライマー、またはソフトウェアを含むが、これらに限定されない。必要に応じて、コンポーネントのそのような別個の包装は、組成物を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、パックまたはディスペンサーデバイス内に提示されることができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。コンポーネントのそのような別個の包装はまた、特定の例では、コンポーネントの活性を失うことなく長期保存を可能にすることができる。
また、キットも提供されている。そのようなキットは、本明細書に記載される薬剤または組成物、および特定の実施形態では、投与のための説明書を含み得る。そのようなキットは、本明細書に記載される方法の実施を容易にすることができる。キットとして供給されるとき、組成物の異なるコンポーネントは、別々の容器に包装され、使用直前に混合されることができる。コンポーネントは、システム、アッセイ、プライマー、またはソフトウェアを含むが、これらに限定されない。必要に応じて、コンポーネントのそのような別個の包装は、組成物を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、パックまたはディスペンサーデバイス内に提示されることができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。コンポーネントのそのような別個の包装はまた、特定の例では、コンポーネントの活性を失うことなく長期保存を可能にすることができる。
【0060】
キットはまた、別々に包装された凍結乾燥活性コンポーネントに添加される、例えば、滅菌水または生理食塩水などの別個の容器中の試薬を含み得る。例えば、密封されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたコンポーネントを含有し、窒素などの中性の非反応性ガスの下に包装された別個のアンプル、滅菌水、滅菌生理食塩水、または滅菌水中に含有され得る。アンプルは、ガラスなどの任意の好適な材料、ポリカーボネート、ポリスチレン、セラミック、金属などの有機ポリマー、または試薬を保持するために典型的に使用される任意の他の材料から構成され得る。好適な容器の他の例は、アンプルと同様の物質から製造され得るボトル、およびアルミニウムまたは合金などの箔で裏打ちされた内部から構成され得る包みを含む。他の容器は、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどを含む。容器は、皮下注射針によって貫通されることができる、ストッパーを有するボトルなどの滅菌アクセスポートを有し得る。他の容器は、取り外し時にコンポーネントが混合することを可能にする容易に除去可能な膜によって隔てられた２つの区画を有し得る。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであり得る。
【0061】
特定の実施形態では、キットは、説明資料と共に供給されることができる。説明書は、紙または他の基材上に印刷され得、および／または電子可読媒体またはビデオとして供給され得る。詳細な説明書は、キットと物理的に関連付けられなくともよく、代わりに、ユーザーは、キットの製造元または販売元によって指定されたインターネットウェブサイトに誘導され得る。
【0062】
本明細書に記載される対照サンプルまたは参照サンプルは、健康な対象から、または対象の無作為化群からのサンプルであることができる。参照値は、健常な対象または健常な対象の群から以前に取得された、対照または参照サンプルの代わりに使用されることができる。対照サンプルまたは参照サンプルはまた、検出可能な既知の量の化合物を有する、またはスパイクされたサンプルであることができる。
【0063】
本発明の方法およびアルゴリズムは、コントローラまたはプロセッサに封入され得る。さらに、本発明の方法およびアルゴリズムは、そのようなコンピュータ実装方法（複数可）を実行するための１つ以上のコンピュータ実装方法として具現化されることができ、またコンピュータプログラムまたは他の機械可読命令（本明細書では、「コンピュータプログラム」）を含む有形または非一時的なコンピュータ可読格納媒体の形態で具現化されることができ、コンピュータプログラムがコンピュータまたは他のプロセッサ（本明細書では、「コンピュータ」）にロードされるとき、および／またはコンピュータによって実行されるとき、コンピュータは、方法（複数可）を実践するための装置になる。そのようなコンピュータプログラムを包含するための格納媒体は、例えば、フロッピーディスクおよびディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）－ＲＯＭ（書き込み可能であるか否かに関わらず）、ＤＶＤデジタルディスク、ＲＡＭおよびＲＯＭメモリ、コンピュータハードドライブおよびバックアップドライブ、外部ハードドライブ、「サムドライブ」、ならびにコンピュータによって読み取り可能な任意の他の格納媒体を含む。方法（複数可）はまた、コンピュータプログラムの形態で具現化される、例えば、格納媒体に格納される、電気伝導体、光ファイバーまたは他の光伝導体などの伝送媒体を介して伝送される、または電磁放射によって伝送されることができ、コンピュータプログラムがコンピュータにロードされるとき、および／またはコンピュータによって実行されるとき、コンピュータは、方法（複数可）を実践するための装置になる。方法（複数可）は、汎用マイクロプロセッサ上、またはプロセス（複数可）を実践するように具体的に構成されたデジタルプロセッサ上に実装され得る。汎用マイクロプロセッサが採用されるとき、コンピュータプログラムコードは、特定の論理回路配列を作成するために、マイクロプロセッサの回路を構成する。コンピュータによって読み取り可能な格納媒体は、コンピュータ自体、またはコンピュータ命令を読み取り、それらの命令をコンピュータに提供し、その動作を制御する別の機械によって読み取り可能な媒体を含む。そのような機械は、例えば、上述した格納媒体を読み取るための機械を含み得る。
【0064】
一般的な技術
本開示の実践は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を採用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で十分に説明されている。
本開示の実践は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を採用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で十分に説明されている。
【0065】
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語は、最初に定義される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似した、修飾された、または同等の多くの方法および材料は、過度の実験なしに本発明の実施形態の実践に使用することができ、好ましい材料および方法は、本明細書に記載されている。本発明の実施形態を記載すること、および請求することでは、以下の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。
【0066】
本明細書で使用される場合、それがＩＤＨ変異およびＭＧＭＴの検出を指すような「同時」という用語は、単一反応混合物において同じ時に前述のマーカーを検出することを意味する。したがって、本明細書に記載されるように、本開示は、ｎＣＡＴＳが、天然ＤＮＡ上のメチル化の増幅および定量分析なしでゲノム領域の濃縮を可能にし、単一ヌクレオチドバリアントの同定を同時に検出することができることを実証する。
【0067】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、質量、体積、時間、距離、および量を含むがこれらに限定されない任意の定量化可能な変数に関して、例えば、典型的な測定技術および機器を通じて生じ得る数値量の変動を指す。さらに、現実世界で使用される固体および液体の取り扱い手順を考えると、組成物を作製する、または方法などを実施するために使用される成分の製造、供給源、または純度の違いを通じて生じる可能性が高い、特定の不用意な過誤および変動が存在する。「約」という用語はまた、これらの変形を包含し、最大±５％であることができるが、±４％、３％、２％、１％などであることができる。「約」という用語によって修飾されるかどうかに関わらず、特許請求の範囲は、量に対する均等を含む。
【0068】
本開示の要素またはその好ましい態様を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【0069】
「測定すること」もしくは「測定」、または代替的に「検出すること」または「検出」は、そのような物質の定性的または定量的濃度レベルの導出を含む、臨床または対象由来のサンプル内の所与の物質の存在、不存在、量、または量（有効量であり得る）のいずれかを決定すること、またはそれ以外の場合、対象の臨床パラメータの値または分類を決定することを意味する。
【0070】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では相互転換可能に使用され、インビトロまたはインサイツに関わらず、本明細書に記載される方法に適した任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【0071】
本明細書で使用される「プラットフォーム」または「技術」とは、本開示に従った、署名、例えば、遺伝子発現レベルを測定するために使用され得る装置（例えば、本明細書で教示される１つ以上のデータベースを含む機器および関連部品、コンピュータ、コンピュータ可読媒体、試薬など）を指す。プラットフォームの例は、アレイプラットフォーム、サーマルサイクラープラットフォーム（例えば、多重化および／またはリアルタイムＰＣＲプラットフォーム）、核酸配列決定プラットフォーム、ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化（例えば、蛍光）検出器プラットフォームなど、核酸質量分析プラットフォーム、磁気共鳴プラットフォーム、ならびにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0072】
いくつかの実施形態では、プラットフォームは、遺伝子発現レベルを半定量的に測定するように構成されており、すなわち、離散的または絶対的な発現で測定するのではなく、発現レベルは、互いに、または特定のマーカー（複数可）（例えば、別の「標準」もしくは「参照」遺伝子の発現）に対する推定値および／または測定値として測定される。
【0073】
いくつかの実施形態では、半定量的測定は、指定されたｍＲＮＡを示す信号が検出されるまでＰＣＲサイクルを行うこと、およびシグネチャ内の遺伝子の推定または相対的な発現レベルを提供するために、検出されるまでに必要なＰＣＲサイクルの数を使用することによる「リアルタイムＰＣＲ」を含む。
【0074】
リアルタイムＰＣＲプラットフォームは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）を含み、サンプルが、多重化された逆転写を受け、続いて、リアルタイムＰＣＲが行われるウェルの収集を伴うアレイカード上のリアルタイムＰＣＲを受ける。リアルタイムＰＣＲプラットフォームはまた、例えば、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ Ｉｄｙｌｌａ（商標）サンプル・ツー・リザルト（ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ｒｅｓｕｌｔ）技術を含み、細胞が溶解され、ＤＮＡ／ＲＮＡが抽出され、リアルタイムＰＣＲが行われ、結果が検出される。リアルタイムＰＣＲプラットフォームはまた、例えば、ＣｙＴＯＦ分析を含み、ＣｙＴＯＦ（Ｆｌｕｄｉｇｍ）は、最近導入された質量細胞計であり、単一細胞上で重金属に同時に接合された最大４０個のマーカーを検出することができる質量細胞計である。
【0075】
磁気共鳴プラットフォームは、分子標的が、精製を必要とせずに生体サンプルにおいて同定され得る、例えば、Ｔ２ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｔ２ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（Ｔ２ＭＲ（登録商標））技術を含む。
【0076】
「アレイ」、「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」、および「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏ ａｒｒａｙ）」という用語は、相互転換可能であり、基材上に提示されるヌクレオチド配列の収集の配列を指す。任意のタイプのアレイは、本明細書に提供される方法において利用されることができる。例えば、アレイは、スライドガラスのような固体基材（固相アレイ）上、またはニトロセルロース膜のような半固体基材上にあることができる。アレイはまた、ビーズ、すなわちビーズアレイ上に提示されることができる。これらのビーズは、典型的には微視的であり、例えば、ポリスチレンで作られ得る。アレイはまた、例えば、特に金であってもよいが、銀、パラジウム、または白金で作られ得る、ナノ粒子上に提示されることができる。例えば、金ナノ粒子プローブ技術を使用する、Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを参照されたい。磁性ナノ粒子はまた、使用され得る。他の例は、核磁気共鳴マイクロコイルを含む。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の置換（例えば、架橋型核酸（ＬＮＡ）などのヌクレオチド類似体）であることができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡではなく、スプライスまたは成熟ＲＮＡ種の遺伝子発現を検出するためにエクソン／イントロン境界を跨ぐ。ヌクレオチド配列は、遺伝子由来の部分配列、プライマー、全遺伝子配列、非コード配列、コード配列、公開された配列、既知の配列、または新規の配列であることができる。アレイは、抗体、ペプチド、タンパク質、組織、細胞、化学物質、炭水化物などの、タンパク質または代謝産物に特異的に結合する他の化合物をさらに含み得る。
【0077】
アレイプラットフォームは、例えば、上述のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マイクロアレイプラットフォームを含む。
【0078】
ハイブリダイゼーションおよびマルチシグナルコード化検出器プラットフォームは、例えば、標的特異的プローブ（例えば、関心の遺伝子発現転写産物に対応する）に付着した色コード化バーコードのハイブリダイゼーションが検出されるＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）、ならびにマイクロスフィアビーズを色コード化し、検出のための標的特異的（例えば、遺伝子発現転写産物）プローブでコーティングするＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）技術、ならびにマイクロビーズを光ファイバー束または平面シリカスライド上に組み立て、検出のための標的特異的（例えば、遺伝子発現転写産物）プローブでコーティングするＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＢｅａｄＡｒｒａｙ技術を含む。
【0079】
核酸質量分析プラットフォームは、ＤＮＡ質量分析が、質量プロファイルを使用して増幅されたＤＮＡを検出するために使用される、例えば、Ｉｂｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｌｅｘ－ＩＤ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｏｒを含む。
【0080】
サーマルサイクラープラットフォームは、例えば、未処理サンプルから核酸を抽出および精製し、ネストされたマルチプレックスＰＣＲを行う、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）マルチプレックスＰＣＲシステム、マイクロ流体チップを使用する液滴ベースのＰＣＲプラットフォームであるＲａｉｎＤｒｏｐ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステム、およびＧｅｎＭａｒｋ ｅＳｅｎｓｏｒまたはｅＰｌｅｘシステムを含む。
【0081】
「遺伝物質」という用語は、生物の細胞の核またはミトコンドリアに遺伝情報を格納するために使用される物質を指す。遺伝物質の例は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【0082】
「複数の核酸オリゴマー」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる、２つ以上の核酸オリゴマーを指す。
【0083】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示されることができる。範囲形式の記載は、利便性および簡潔性のためだけであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能なサブ範囲ならびに個々の数値を具体的に開示されたと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのサブ範囲、およびその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６などを具体的に開示したものと見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用する。
【0084】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、ヒト、霊長類、家畜、げっ歯類、およびペットを含むが、これらに限定されない。対象は、医療または治療を待っていてもよく、医療または治療中であってもよく、または医療または治療を受けていてもよい。
【0085】
本明細書で使用される「健常な対照群」、「正常な群」、または「健常な」対象からのサンプルという用語は、定性的または定量的な検査結果に基づいて、中枢神経系腫瘍、または中枢神経系腫瘍に関連付けられた臨床疾患に罹患していないとして医師によって診断される対象、または群の対象を意味する。「正常な」対象は、通常、同年代の対象および５～１０年の範囲内の対象を含むがこれらに限定されない、評価される個体とほぼ同じ年齢である。
【0086】
本明細書で提供される方法は、上述のゲノム関心領域を照合するために有用である。また、本発明の方法における「哺乳動物細胞のゲノムまたは染色体の連続領域」という用語が、上述のゲノム関心領域と相互転換可能に使用されることができることは、当業者には容易に明らかであろう。
【0087】
さらに詳述することなく、当業者は、上記の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題について、参照により組み込まれる。
【0088】
様々な変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、上で記載の材料および方法に加えることができるため、上の記載および以下の実施例に含有される全ての事項は、例示的であると解釈され、限定的な意味で解釈されないことが意図される。
【実施例】
【0089】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実践において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実践のための好ましいモードを構成すると見なすことができることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が、開示され、依然として本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を得る特定の実施形態において行われることができることを理解すべきである。
【0090】
実施例１：びまん性神経膠腫の新鮮な生検におけるＩＤＨ１／２変異および臨床的に関連するＭＧＭＴメチル化の同時検出のための新規なＣａｓ９標的化長期読み取りアッセイ
本実施例では、ナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）の使用は、中枢神経系腫瘍の検出における現在の臨床実践上の制限を克服するための魅力的な選択肢として、複数のバイオマーカーを同時に評価することができる配列決定技術として探求された。
本実施例では、ナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）の使用は、中枢神経系腫瘍の検出における現在の臨床実践上の制限を克服するための魅力的な選択肢として、複数のバイオマーカーを同時に評価することができる配列決定技術として探求された。
【0091】
びまん性神経膠腫（ＤＧ）を診断するために、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１および２（ＩＤＨ１／２）遺伝子変異の存在は、サブタイプの同定のために必要とされ、また予後分子マーカーである［Ｌｏｕｉｓ ＤＮ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１６；１３１：８０３－８２０、Ｙａｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６０：７６５－７７３］。Ｏ６－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）プロモーターのメチル化状態は、特に、ＤＧの最も一般的なタイプである膠芽腫（ＧＢＭ）（例えば、グレードＩＶの星細胞腫）において、化学療法治療の決定を導くために日常的に使用される。
【0092】
様々な方法は、ＩＤＨ１／２変異およびＭＧＭＴプロモーターメチル化についてスクリーニングするために、使用されることができる。典型的には、ＩＤＨ１／２変異スクリーニングは、ＩＤＨ１アルギニン１３２（アルギニン対ヒスチジン、Ｒ１３２Ｈ）における最も一般的な変異について特異的な免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイと共に行われる。しかしながら、ＩＨＣは、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｇ、およびＲ１３２Ｌ置換、またはＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋを含む、他のあまり一般的でない変異を検出することができない。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＳａｎｇｅｒ配列決定は、ＩＨＣ陰性腫瘍についての第２のステップ検査として推奨される［Ｌｏｕｉｓ ＤＮ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１６；１３１：８０３－８２０、Ｃａｐｐｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２０：２４５－２５４］。
【0093】
ＭＧＭＴメチル化をアッセイすることは、転写開始部位を取り囲む９８個のＣｐＧジヌクレオチドを含む、プロモーターにおけるＣｐＧアイランド上のシトシン残基の修飾（ＣｐＧメチル化）を同定するために必要とする。これらのアッセイは、使用される方法論および評価されるプロモーター領域が異なる。しかしながら、ほとんどは、ＭＧＭＴ遺伝子の転写活性を予測し、次に、経口化学療法薬である、テモゾロミド（ＴＭＺ）に対する潜在的な治療応答を予測するために、ほんの一部のＣｐＧ部位のみを照合する。２つの異なるメチル化された領域（ＤＭＲ）は、ＣｐＧ２５～５０（ＤＭＲ１）およびＣｐＧ７３～９０（ＤＭＲ２）をカバーし、転写サイレンシングと相関することが実証されている［Ｂｉｅｎｋｏｗｓｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ３４：２５０－２５７］。ＤＭＲ２は、細胞ベースのレポーター研究におけるＭＧＭＴの転写を制御するいくつかのシス作用部位を有する［Ｍａｌｌｅｙ ＤＳ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２１：６５１－６６１］。ＭＧＭＴプロモーターメチル化の存在は、ＴＭＺ治療に対する応答性を予示し［Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ Ａ，ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １３：９１６－９２６、Ｗｉｃｋ Ｗ，ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １３：７０７－７１５］、しかし、ＴＭＺ治療応答に対応するメチル化の程度は、議論の対象であり、どのアッセイ方法が最適であるかについてのコンセンサスはない。メチル化特異的ＰＣＲ、パイロ配列決定、および質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標））などの一般的に使用される方法は、ＰＣＲバイアスを導入し、亜硫酸水素塩処理による限定的な配列長を研究するために制限される。
【0094】
ナノポア技術（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）またはＯＮＴ）は、メチル化および変異の両方を評価するために、前述のアッセイの制限を克服することができる。電解電流信号がシトシン（５ｍＣ）における炭素５のメチル化に感受性であるため、亜硫酸水素塩変換を伴わない定量的メチル化評価は、ナノポア配列決定により可能である［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＴ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：４０７－４１０］。加えて、長時間読み取り単一分子配列決定の能力で、プロモーター領域および追加の周辺領域における複数のＣｐＧは、捕捉されることができる。ここで、ナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）は、適用され［Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ：１－６］、低コストのナノポアＭｉｎＩＯＮデバイス（ＯＮＴ）が、ＩＤＨ変異およびＭＧＭＴメチル化を同時にアッセイするために使用した。次いで、取得された結果は、現在使用されている臨床検査と比較された。全ての捕捉されたＣｐＧのメチル化と遺伝子発現レベルとの間の正の相関は、観察され、ｎＣＡＴＳおよび既存のディープ配列決定法の両方が、臨床ＤＧサンプルにおいて同じ単一ヌクレオチドバリアントを検出したことが示された。
【0095】
方法
インフォームドコンセント。この研究は、神経膠腫と診断された８名の患者を含む。症例記録は、審査され、脳組織サンプルは、アーカンソー大学医学部の機関審査委員会の承認を受けて取得された（ＩＲＢプロトコル番号２２８４４３）。全ての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。ＩＤＨ変異を有する４つのサンプルおよびＩＤＨ野生型を有する４つのサンプルは、Ａ．Ｒによって選択された。しかしながら、全てのサンプルは、変異的状態が分析群（Ｔ．Ｗ．およびＰ．Ｊ．）に開示される前に、単一盲検で処理および分析された。
インフォームドコンセント。この研究は、神経膠腫と診断された８名の患者を含む。症例記録は、審査され、脳組織サンプルは、アーカンソー大学医学部の機関審査委員会の承認を受けて取得された（ＩＲＢプロトコル番号２２８４４３）。全ての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。ＩＤＨ変異を有する４つのサンプルおよびＩＤＨ野生型を有する４つのサンプルは、Ａ．Ｒによって選択された。しかしながら、全てのサンプルは、変異的状態が分析群（Ｔ．Ｗ．およびＰ．Ｊ．）に開示される前に、単一盲検で処理および分析された。
【0096】
ｎＣＡＴＳについてのＤＮＡサンプルおよびＤＮＡ抽出－対照ＤＮＡ。ＩＤＨ１／２野生型ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）標準物（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ＵＳＡ）は、ＰＣＲおよびナノポア配列決定による遺伝子型同定のための陰性対照として使用された（ＯＮＴ、ＵＳＡ）。陽性対照について、ＩＤＨ１コドン１３２変異体ＤＮＡ（ＣＧＴ→ＧＧＴ）は、本研究における患者から取得され、ＩＤＨ２コドン１７２変異体ＤＮＡ（ＡＧＧ→ＡＡＧ）は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから購入された。各標準のＩＤＨ１／２のエクソン４は、特異的プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して増幅された。ＩＤＨ１／２増幅のためのＰＣＲ条件は、以下のプログラム、９５℃２分、［９５℃１５秒、６０℃３０秒、６５℃４０秒］の２５サイクル、６５℃１０分、４℃ホールドで、１００ｎｇのｇＤＮＡ、２０ｍＭプライマー、および２５μｌのＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）を使用したのと、同一である。ＰＣＲ反応は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で精製し、２０μｌヌクレアーゼフリー水（ＮＥＢ）中で溶出した。精製されたＰＣＲ生成物は、ＥＸＰ－ＮＢＤ１０３およびＳＱＫ－ＬＳＫ１０８プロトコル（ＯＮＴ）を伴う１ＤネイティブバーコーディングゲノムＤＮＡ、ならびにＲ９．４．１／ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６フローセル（ＯＮＴ）を伴うナノポア配列決定を使用して、ライブラリ調製のために使用された。
【0097】
５－ｍＣおよび非修飾シトシンを含有するＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、ＵＳＡ）は、定量分析のために使用された。標準ＤＮＡは、５２個のＣｐＧ部位を伴う直鎖二本鎖ＤＮＡ（８９７ｂｐ）からなり、各標準は、１００％ ５－ｍＣまたは非修飾シトシンのいずれかを含有する。
【0098】
ｎＣＡＴＳおよびメチル化状態評価のための陽性および陰性対照として、ＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＆ Ｎｏｎ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）は、使用された。Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄは、全てのＣｐＧジヌクレオチド（＞９５％）で酵素的にメチル化される。Ｎｏｎ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄは、５％未満のメチル化ＤＮＡを含有する。
【0099】
細胞株ｇＤＮＡ。４つのＧＢＭ細胞株は、この研究、Ｕ８７、Ｕ２５１、Ｔ９８Ｇ、およびＬＮ１８（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）において使用された。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ（Ｕ８７）、２ｍＭグルタミン、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ならびに１０％ＦＢＳ添加ＥＭＥＭ（Ｕ２５１およびＴ９８Ｇ）、ならびに標準技術を利用する５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（ＬＮ１８）の１０ｃｍ皿において、細胞を８５～９０％コンフルエンスまで増殖された。細胞は、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）でＤＮＡ抽出する前に、ＰＢＳで洗浄された。溶出されたｇＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製され、濃縮され、２０～４０μｌのヌクレアーゼフリー水中で溶出され、－２０℃で保管された。
【0100】
臨床サンプル。本研究は、委員会認定の神経病理学者、Ｍｕｒａｔ Ｇｏｋｄｅｎ Ｍ．Ｄ．による、びまん性神経膠腫の２０１６年のＷＨＯ分類に従ってグレード付けされた８つの脳組織サンプルを含む（表１）。外科的切除に続いて、組織サンプルは、ドライアイス上で直ちに凍結され、ＤＮＡ抽出まで－８０℃で保管された。ＤＮＡ抽出は、上で記載されたようにＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で実行された。
【表1-1】
【表1-2】
【0101】
ＲＮＡ抽出。全ての細胞株および組織サンプルについて、ＲＮＡおよびＤＮＡは、同じサンプルから抽出された。ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）は、同じサンプルからのｇＤＮＡおよび総ＲＮＡの同時精製を可能にする。
【0102】
ＤＮＡおよびＲＮＡの純度、量および完全性。ＤＮＡおよびＲＮＡの純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ－２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で、全てのサンプルにおいて評価された。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ３．０定量アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定された。ＤＮＡおよびＲＮＡの完全性は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ２２００（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用して決定された。
【0103】
単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡ設計。ｃｒＲＮＡを設計するために、我々は、ＯＮＴプロトコル［Ｌａｂｕｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７：Ｗ１７１－Ｗ１７４］に記載されるようにＣＨＯＰＣＨＯＰを使用した。ｃｒＲＮＡの特異性は、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して検索するために、ＵＣＳＣ Ｉｎ－Ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲツールで検査された。設計されたｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＨｉＦｉ Ｃａｓ９は、ＩＤＴから購入された。以下のｃｒＲＮＡは、
ＭＧＭＴ＿ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿ｌｅｆｔ：ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＡＴＴＧＡ（配列番号１）、
ＭＧＭＴ＿ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿ｒｉｇｈｔ：ＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＡＧＣＴＣＣＧＴＡＣ（配列番号２）、ＩＤＨ１＿ｌｅｆｔ：ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号３）、ＩＤＨ１＿ｒｉｇｈｔ：
ＧＧＣＡＣＣＡＴＡＣＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴ（配列番号４）、ＩＤＨ２＿ｌｅｆｔ：
ＧＣＴＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴ（配列番号５）、ＩＤＨ２＿ｒｉｇｈｔ：
ＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡ（配列番号６）が使用された。
ＭＧＭＴ＿ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿ｌｅｆｔ：ＡＴＧＡＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＡＴＴＧＡ（配列番号１）、
ＭＧＭＴ＿ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿ｒｉｇｈｔ：ＡＣＣＴＧＡＧＴＡＴＡＧＣＴＣＣＧＴＡＣ（配列番号２）、ＩＤＨ１＿ｌｅｆｔ：ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号３）、ＩＤＨ１＿ｒｉｇｈｔ：
ＧＧＣＡＣＣＡＴＡＣＧＡＡＡＴＡＴＴＣＴ（配列番号４）、ＩＤＨ２＿ｌｅｆｔ：
ＧＣＴＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴ（配列番号５）、ＩＤＨ２＿ｒｉｇｈｔ：
ＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡ（配列番号６）が使用された。
【0104】
ＯＮＴによる標的化配列決定のためのｎＣＡＴＳライブラリ調製。各サンプルについて、３．５μｇ～５．５μｇのｇＤＮＡは、ｎＣＡＴＳライブラリを調製するための入力として使用された。ライブラリ調製プロトコルは、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｈａｎｎｅｌ，Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ（プロトコルバージョン：ＥＮＲ＿９０８４＿ｖ１０９＿ｒｅｖＡ＿０４Ｄｅｃ２０１８）を介してＯＮＴによって提供された。簡潔に述べると、ｇＤＮＡ末端は、非標的鎖への配列決定アダプタの連結を低減するために、仔ウシ腸脱リン酸化酵素（ＮＥＢ）で処理される。次いで、Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質複合体（Ｃａｓ９ ＲＮＰ）は、新たに調製され、ブロックＤＮＡの標的化領域で二本鎖切断を生成するために使用される。アデニン（Ａ）鎖は、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＡＴＰ（ＮＥＢ）を使用して、切断ＤＮＡ断片の３’末端に直ちに添加された。Ａオーバーハングは、ナノポア配列決定アダプタのＴオーバーハングと対合することができる。アダプタ連結ＤＮＡおよびブロックＤＮＡの両方は、配列決定のためにフローセルに添加された。過剰な連結されていないアダプタは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で除去された。ライブラリ（アダプタに連結した分子）は、ＭｉｎＩＯＮ Ｍｋ１Ｂで配列決定された。各ライブラリは、Ｒ９．４．１／ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６フローセル（ＯＮＴ）上で３６時間配列決定された。
【0105】
バイオインフォマティクスおよび統計分析－読み取りのデータ処理およびマッピング：ＭｉｎＫｎｏｗソフトウェア（バージョン１．７．１４）によって生成されたＯＮＴ生信号データ（ＦＡＳＴ５ファイル）は、ＧＵＰＰＹアルゴリズム（バージョン３．０．３）を使用してＤＮＡ（ＦＡＳＴＱファイル）に変換された。ＯＮＴ読み取りのための品質管理は、ＮａｎｏＦｉｌｔプログラム［ＰＭＩＤ：２９５４７９８１］を使用して、Ｐｈｒｅｄスコア８よりも高い平均品質閾値および２００塩基を超える読み取り長に基づいて、ＦＡＳＴＱファイルをフィルタリングするために行われた。我々は、Ｍｉｎｉｍａｐ２を使用して、フィルタリングされた読み取りをヒト参照ゲノム（Ｈｇ１９）に整列させ、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（バージョン１．６）でソートした。
コマンドライン：
ｇｕｐｐｙ＿ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ－－ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ－－ｅｎａｂｌｅ＿ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｔｒｕｅ－－ｑｓｃｏｒｅ＿ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ－－ｍｉｎ＿ｑｓｃｏｒｅ ８－－ｋｉｔ ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９－－ｆｌｏｗｃｅｌｌ ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６－－ｉｎｐｕｔ＿ｐａｔｈ ｆａｓｔ５＿ｄｉｒ－－ｓａｖｅ＿ｐａｔｈ ｆａｓｔｑ＿ｄｉｒ
ｃａｔ ｆａｓｔｑ＿ｄｉｒ／ｐａｓｓ／＊．ｆａｓｔｑ｜ＮａｎｏＦｉｌｔ－ｌ ２００＞ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ
ｍｉｎｉｍａｐ２－ａｘ ｍａｐ－ｏｎｔ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ｜ｓａｍｔｏｏｌｓ ｓｏｒｔ－Ｔ ｔｍｐ－ｏ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ
ｓａｍｔｏｏｌｓ ｉｎｄｅｘ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ
コマンドライン：
ｇｕｐｐｙ＿ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ－－ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ－－ｅｎａｂｌｅ＿ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｔｒｕｅ－－ｑｓｃｏｒｅ＿ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ－－ｍｉｎ＿ｑｓｃｏｒｅ ８－－ｋｉｔ ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９－－ｆｌｏｗｃｅｌｌ ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６－－ｉｎｐｕｔ＿ｐａｔｈ ｆａｓｔ５＿ｄｉｒ－－ｓａｖｅ＿ｐａｔｈ ｆａｓｔｑ＿ｄｉｒ
ｃａｔ ｆａｓｔｑ＿ｄｉｒ／ｐａｓｓ／＊．ｆａｓｔｑ｜ＮａｎｏＦｉｌｔ－ｌ ２００＞ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ
ｍｉｎｉｍａｐ２－ａｘ ｍａｐ－ｏｎｔ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ｜ｓａｍｔｏｏｌｓ ｓｏｒｔ－Ｔ ｔｍｐ－ｏ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ
ｓａｍｔｏｏｌｓ ｉｎｄｅｘ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ
【0106】
ナノポアメチル化呼び出し：ＣｐＧメチル化（５ｍＣ）呼び出しは、各サンプルのための読み取り（ＦＡＳＴＱファイル）、整列された読み取り（ＢＡＭファイル）、および生信号（ＦＡＳＴ５ファイル）を使用して、Ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｖ ０．１１．０９を使用して行われた。次いで、我々は、Ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈパッケージからの「ｃａｌｃｕｌａｔｅ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．ｐｙ」を使用して、各位置でメチル化頻度およびメチル化の対数尤度比を計算した。我々は、各サンプルにおける読み取り数が１０未満であり、対数尤度比が２．５未満である任意の位置をフィルタリングした。
コマンドライン：
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｉｎｄｅｘ－ｄ ｆａｓｔ５＿ｄｉｒ／ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｃａｌｌ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｒ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ－ｂ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ－ｇ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ＞ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｔｓｖ
ｃａｌｃｕｌａｔｅ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．ｐｙ－ｉ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｔｓｖ｜ａｗｋ’ＢＥＧＩＮ｛ＯＦＳ＝”＼ｔ”｝｛ｉｆ（＄５＞＝１０）ｐｒｉｎｔ ＄１，＄２，＄３，＄７｝’＞ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｂｄｇ
コマンドライン：
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｉｎｄｅｘ－ｄ ｆａｓｔ５＿ｄｉｒ／ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｃａｌｌ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｒ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ－ｂ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ－ｇ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ＞ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｔｓｖ
ｃａｌｃｕｌａｔｅ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．ｐｙ－ｉ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｔｓｖ｜ａｗｋ’ＢＥＧＩＮ｛ＯＦＳ＝”＼ｔ”｝｛ｉｆ（＄５＞＝１０）ｐｒｉｎｔ ＄１，＄２，＄３，＄７｝’＞ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｃａｌｌｓ．ｂｄｇ
【0107】
単一ヌクレオチドバリアント呼び出し：ＳＮＶは、ＦＡＳＴＱファイル、ＢＡＭファイル、およびＦＡＳＴ５ファイルを使用して、標的領域にわたってＮａｎｏｐｏｌｉｓｈで呼び出された。Ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈは、整列後の生信号を再分析し、信号レベルでのＯＮＴデータからＳＮＶ対立遺伝子周波数を計算するために、使用された。「ナノポリッシュ（ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ）バリアント」サブプログラムは、修飾されたパラメータ設定、－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＝０．１５、－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｄｅｐｔｈ＝１０、－－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ａｗａｒｅ＝ｃｐｇ、－－ｓｎｐｓ、および－－ｐｌｏｉｄｙ＝２を伴うＳＮＶを同時に呼び出すために使用された。我々は、ＳＮＶのバリアント品質を審査し、それらをＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＶｉｅｗｅｒおよびｔｒａｃｋＶｉｅｗｅｒで視覚化した［Ｏｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１６（６）：４５３－４５４，２２、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：２４－２６］。
コマンドライン：
ｄｅｃｌａｒｅ－ａ ｒｅｇｉｏｎｓ＝（＼
’ｃｈｒ１０：１３１２６４６１０－１３１２６６８２５’＼
’ｃｈｒ２：２０９１１１２７５－２０９１１３１８３’＼
’ｃｈｒ１５：９０６３１７５４－９０６３３０４６’＼
）
ｆｏｒ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ＄｛ｒｅｇｉｏｎｓ［＠］｝；ｄｏ
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｖａｒｉａｎｔｓ－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｄｅｐｔｈ １０－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ０．１５＼
－－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ａｗａｒｅ＝ｃｐｇ－－ｓｎｐｓ－ｒ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ－ｂ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ＼
－ｇ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ－－ｐｌｏｉｄｙ＝２－ｗ ＄ｌｏｃｕｓ ＞ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ
ｂｇｚｉｐ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ
ｂｃｆｔｏｏｌｓ ｉｎｄｅｘ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ．ｇｚ
ｄｏｎｅ
ｂｃｆｔｏｏｌｓ ｃｏｎｃａｔ ｓｎｖ＿＊＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ．ｇｚ－ｏ ｓｎｖ＿＊＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｃｏｍｂｉｎｅ．ｖｃｆ
コマンドライン：
ｄｅｃｌａｒｅ－ａ ｒｅｇｉｏｎｓ＝（＼
’ｃｈｒ１０：１３１２６４６１０－１３１２６６８２５’＼
’ｃｈｒ２：２０９１１１２７５－２０９１１３１８３’＼
’ｃｈｒ１５：９０６３１７５４－９０６３３０４６’＼
）
ｆｏｒ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ＄｛ｒｅｇｉｏｎｓ［＠］｝；ｄｏ
ｎａｎｏｐｏｌｉｓｈ ｖａｒｉａｎｔｓ－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｄｅｐｔｈ １０－ｍｉｎ－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ０．１５＼
－－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ａｗａｒｅ＝ｃｐｇ－－ｓｎｐｓ－ｒ ｒｅａｄｓ．ｆａｓｔｑ－ｂ ｒｅａｄｓ．ｍａｐｐｉｎｇｓ．ｂａｍ＼
－ｇ ｈｇ１９．ｇｅｎｏｍｅ．ｆａｓｔａ－－ｐｌｏｉｄｙ＝２－ｗ ＄ｌｏｃｕｓ ＞ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ
ｂｇｚｉｐ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ
ｂｃｆｔｏｏｌｓ ｉｎｄｅｘ ｓｎｖ＿＄｛ｌｏｃｕｓ｝＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ．ｇｚ
ｄｏｎｅ
ｂｃｆｔｏｏｌｓ ｃｏｎｃａｔ ｓｎｖ＿＊＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｖｃｆ．ｇｚ－ｏ ｓｎｖ＿＊＿ｖａｒｉａｎｔｓ．ｃｏｍｂｉｎｅ．ｖｃｆ
【0108】
定量的逆転写酵素（ｑＲＴ）－ＰＣＲを伴うＭＧＭＴ遺伝子発現解析。抽出された合計１μｇのＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）、およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して行われた。リアルタイムＰＣＲは、技術的３反復で実行され、それは、９５℃で１０分間、９５℃の４０サイクルで１５秒間、６０℃で６０秒間実施された。公開されたプライマーセットは、ＭＧＭＴおよびβ－アクチン遺伝子（ＡＣＴＢ）のために使用された［Ｃａｒｔｕｌａｒｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１：ｅ０１５５００２、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２９４９、Ｕｎｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｌｉｎｉｃｓ ６６：１７４７－１７５５］。データ解析について、各３反復における平均結果は、使用された。
【0109】
患者腫瘍サンプルのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定。ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定は、Ｔｅｍｐｕｓ ｘＴアッセイを使用して、８人の患者のうちの６人について、臨床腫瘍標本および（腫瘍標本と同じ患者からの）唾液標本上で行われた［Ｂｅａｕｂｉｅｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７：１３５１－１３６０］。簡潔に述べると、核酸は、Ｃｈｅｍａｇｉｃ３６０器具およびソース固有の磁気ビーズプロトコルを使用して、２０％を超える腫瘍細胞性を伴う腫瘍組織切片から抽出された。全核酸は、ＤＮＡライブラリ構築のために使用され、一方ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化および磁気ビーズ精製によってさらに精製された。核酸は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ＫｉｔまたはＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量され、品質が、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔまたはＬａｂＣｈｉｐ ＲＮＡ Ｈｉｇｈ ＨＴ Ｐｉｃｏ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で確認された。
【0110】
ＤＮＡライブラリ構築のために、腫瘍または正常サンプルからの１００ｎｇのＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波計を使用して、２００ｂｐの平均サイズに機械的にせん断された。これらのライブラリは、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して調製された。簡潔に述べると、ＤＮＡは、酵素末端修復およびＡ－ｔａｉｌｉｎｇ、続いて、アダプタ連結、ビーズベースのサイズ選択、およびＰＣＲを受けた。捕捉されたＤＮＡ標的は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して増幅された。増幅された標的捕捉ライブラリは、パターン化フローセル技術を伴うＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍ上で配列決定された。
【0111】
結果
（ｉ）ナノポア配列決定は、変異的状態およびメチル化レベルを正確に評価する。
生のナノポア配列決定読み取りの過誤率は、減少し続け、本技術が遺伝子型同定およびメチル化アッセイのために使用されることを可能にする［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：４０７－４１０］。ナノポア配列決定過誤は、ほぼランダムであり、十分な読み取り深度からのコンセンサス配列の使用は、配列決定エラーのほぼ全てを排除することができる。ＩＤＨ変異を正確に遺伝子型同定するためのナノポア配列決定の能力を確認するために、ＰＣＲ増幅器は、ナノポアＭｉｎＩＯＮデバイスを使用して、ＩＤＨ１／２野生型またはＩＤＨ１／２変異体であるように配列決定された。この検査は、人為的な過誤は避けられないが、これらの２つの遺伝子におけるヘテロ接合変異が正確に検出されることができることが示される（図１Ａ）。
（ｉ）ナノポア配列決定は、変異的状態およびメチル化レベルを正確に評価する。
生のナノポア配列決定読み取りの過誤率は、減少し続け、本技術が遺伝子型同定およびメチル化アッセイのために使用されることを可能にする［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：４０７－４１０］。ナノポア配列決定過誤は、ほぼランダムであり、十分な読み取り深度からのコンセンサス配列の使用は、配列決定エラーのほぼ全てを排除することができる。ＩＤＨ変異を正確に遺伝子型同定するためのナノポア配列決定の能力を確認するために、ＰＣＲ増幅器は、ナノポアＭｉｎＩＯＮデバイスを使用して、ＩＤＨ１／２野生型またはＩＤＨ１／２変異体であるように配列決定された。この検査は、人為的な過誤は避けられないが、これらの２つの遺伝子におけるヘテロ接合変異が正確に検出されることができることが示される（図１Ａ）。
【0112】
ＣｐＧメチル化について検出の限界を決定するために、２つの合成ＤＮＡ標準物は、ＣｐＧ上で１００％メチル化または０％メチル化されたもののいずれかで配列決定され、次いで、メチル化呼び出しのためにＮａｎｏｐｏｌｉｓｈが使用された［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：４０７－４１０］。１０％、２５％、５０％、または７５％メチル化ＣｐＧのためのデータは、０および１００％メチル化標準物からの読み取りを無作為にサンプリングすることによって生成された。約１０の読み取り（１０倍）の低い配列決定カバレッジで、メチル化が測定されることができるが、変動が大きいことが分かった。配列決定深度の増加のときの変動係数の低下は、観察された。より高い深度、≧２０倍では、標準偏差は、より低く（図１Ｂ）、０％、２５％、５０％、７５％、および１００％のメチル化レベルは、区別されることができた。したがって、２０倍は、本実施例における検出の理論的限界として使用された。
【0113】
（ｉｉ）ｎＣＡＴＳ ＭＧＭＴメチル化アッセイは、パイロ配列決定アッセイに匹敵する。
次いで、これらの予備データに基づいて、ナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）ワークフローのためのガイドＲＮＡは、４つのヒトＧＢＭ細胞株（２つのＴＭＺ感受性［Ｕ８７およびＵ２５１］）ならびに２つのＴＭＺ耐性［Ｔ９８ＧおよびＬＮ１８］ならびに８つの臨床ＤＧサンプル（４つのＩＤＨ変異体および４つのＩＤＨ野生型）で検査するように設計された（図１Ｃおよび表１）。配列決定深度カバレッジは、ＭＧＭＴ、ＩＤＨ１、およびＩＤＨ２について、それぞれ、１８４、６６４、および９３９の平均であった（図１Ｄ）。
次いで、これらの予備データに基づいて、ナノポアＣａｓ９標的化配列決定（ｎＣＡＴＳ）ワークフローのためのガイドＲＮＡは、４つのヒトＧＢＭ細胞株（２つのＴＭＺ感受性［Ｕ８７およびＵ２５１］）ならびに２つのＴＭＺ耐性［Ｔ９８ＧおよびＬＮ１８］ならびに８つの臨床ＤＧサンプル（４つのＩＤＨ変異体および４つのＩＤＨ野生型）で検査するように設計された（図１Ｃおよび表１）。配列決定深度カバレッジは、ＭＧＭＴ、ＩＤＨ１、およびＩＤＨ２について、それぞれ、１８４、６６４、および９３９の平均であった（図１Ｄ）。
【0114】
次いで、ｎＣＡＴＳは、ＭＧＭＴ遺伝子の標的化配列決定を行うために使用され、このアプローチは、９８個のＣｐＧ（プロモーターおよびエクソン１に位置する）および１２１個のＣｐＧ（イントロン１の５’末端に位置する）を捕捉した。ＣｐＧ遺伝子座のゲノム座標は、表２に示される。最初の９８個のＣｐＧは、他の人によって研究されており、この領域におけるＣｐＧのサブセットは、メチル化を評価するために臨床的に使用されている［Ｍａｎｓｏｕｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ（２０１８）ＭＧＭＴ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ］。したがって、まず９８個のＣｐＧは、焦点を当てられ、ｎＣＡＴＳによって取得されたメチル化レベルを、パイロ配列決定アッセイによって取得されたレベルと比較するために、それらが使用される。ｎＣＡＴＳは、それぞれ、＞９５％対＜５％のメチル化を伴うメチル化および非メチル化ＤＮＡ標準を使用して、両方のサンプルにおいて（図２Ａ）、ＣｐＧ１～２５および７０～８４についての亜硫酸水素塩修飾－ＰＣＲ－パイロ配列決定の結果に匹敵する、明確なメチル化パターンを提供した。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【0115】
次に、ｎＣＡＴＳは、よく特徴付けられた４つのＧＢＭ細胞株（上で記載された）に適用された。ｎＣＡＴＳによってアッセイしたこれらの４つの細胞株のパーセントメチル化はまた、パイロ配列決定によって返されたパーセントメチル化と正の相関があった（ｒ＝０．７３、Ｐ＝６．９×１０－８～ｒ＝０．９４、Ｐ＝２．２×１０－１６）（図２Ｂ）。この時点で、ｎＣＡＴＳに由来するメチル化データは、均質なサンプル（例えば、不死化神経膠腫細胞株）に適用されたとき、パイロ配列決定アッセイに由来するデータに匹敵すると結論付けられた。
【0116】
（ｉｉｉ）びまん性神経膠腫を伴う患者におけるメチル化および変異バイオマーカーの同時評価
次に、ｎＣＡＴＳが、神経膠腫細胞株と対照的な異種細胞集団を有する臨床サンプルにおいて、使用されることができることを確認した。臨床サンプルにおけるＭＧＭＴメチル化およびＩＤＨ１／２変異をアッセイするためのｎＣＡＴＳの精度を検査すること。ＭＧＭＴメチル化のために、ｎＣＡＴＳデータは、亜硫酸水素塩修飾－ＰＣＲ－パイロ配列決定または２つの独立した臨床検査改善修正（ＣＬＩＡ）認定ラボによって実施されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システムで生成されたデータと比較された。ｎＣＡＴＳ定量メチル化とパイロ配列決定との間には、統計的に有意な正の相関があった（ｒ＝０ ０．６４、Ｐ＝１．０４×１０－５～ｒ＝０．８０、Ｐ＝４．３９×１０－１０）（図２Ｃ）。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）の結果は、半定量的であり、ＣｐＧ部位７０～８１および８４～８７について３つのカテゴリーにおけるメチル化レベルのみが示された（検出されなかった：＜１０％、低メチル化：１０～３０％、検出された：＞３０％）。これらのＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）の結果はまた、同じＣｐＧ部位にわたってｎＣＡＴＳの結果と同様の傾向が示された。
次に、ｎＣＡＴＳが、神経膠腫細胞株と対照的な異種細胞集団を有する臨床サンプルにおいて、使用されることができることを確認した。臨床サンプルにおけるＭＧＭＴメチル化およびＩＤＨ１／２変異をアッセイするためのｎＣＡＴＳの精度を検査すること。ＭＧＭＴメチル化のために、ｎＣＡＴＳデータは、亜硫酸水素塩修飾－ＰＣＲ－パイロ配列決定または２つの独立した臨床検査改善修正（ＣＬＩＡ）認定ラボによって実施されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システムで生成されたデータと比較された。ｎＣＡＴＳ定量メチル化とパイロ配列決定との間には、統計的に有意な正の相関があった（ｒ＝０ ０．６４、Ｐ＝１．０４×１０－５～ｒ＝０．８０、Ｐ＝４．３９×１０－１０）（図２Ｃ）。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）の結果は、半定量的であり、ＣｐＧ部位７０～８１および８４～８７について３つのカテゴリーにおけるメチル化レベルのみが示された（検出されなかった：＜１０％、低メチル化：１０～３０％、検出された：＞３０％）。これらのＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）の結果はまた、同じＣｐＧ部位にわたってｎＣＡＴＳの結果と同様の傾向が示された。
【0117】
患者５５３からのサンプルは、標的化ＣｐＧ部位にわたって８％のメチル化を有し、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）は、低レベルのメチル化を有すると決定した。他の３人の患者では、メチル化は、３８％～５１％の範囲であり、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）は、「検出された」メチル化（すなわち、＞３０％）を報告した（図２Ｃ）。新鮮な生検を、ｎＣＡＴＳおよびパイロ配列決定に使用し、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍにおいて使用されたことに留意すべきである。
【0118】
ＩＤＨ変異の検出に関して、ｎＣＡＴＳは、Ｓａｎｇｅｒ（ＣＬＩＡ認定実験室）およびエクソーム配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）データと一致する全ての患者サンプルにおいてＩＤＨ変異を示した。ｎＣＡＴＳおよびＩｌｌｕｍｉｎａによって検出された対立遺伝子頻度は、類似していた（±３％以内）、Ｐ＝０．９１８９２（カイ二乗検定）であった（図２Ｄ）。
【0119】
（ｉｖ）ＭＧＭＴ発現は、ＭＧＭＴエクソンメチル化と負の相関があるが、ＭＧＭＴイントロンメチル化と正の相関がある。
次に、４つの細胞株および４つの腫瘍サンプルにおけるＭＧＭＴ遺伝子発現とＭＧＭＴメチル化レベルとの関係は、決定された。ＭＧＭＴ発現は、ＴＭＺ臨床応答と負に相関する。ｎＣＡＴＳとパイロ配列決定データを比較することができるだけでなく、これらのＣｐＧが臨床的に関連しているため、差次的にメチル化された領域２（ＤＭＲ２、本研究ではエクソン１におけるＣｐＧ７０～８１）における合計１２個のＣｐＧは、検討された。予想されるように、ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴＭＺ耐性細胞株において高いＭＧＭＴ発現を、およびＴＭＺ感受性細胞株において非常に低いＭＧＭＴ発現を示した（図３Ａ）。ＭＧＭＴ発現とメチル化との間の逆相関（図３Ｂ）は、ｎＣＡＴＳおよびパイロ配列決定（ｒ＝－０．７２）の両方で、同様の有意水準で示された（Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。これらのデータは、一般に、ｎＣＡＴＳが、従来の方法に匹敵する配列決定データを産生したことを示唆した。
次に、４つの細胞株および４つの腫瘍サンプルにおけるＭＧＭＴ遺伝子発現とＭＧＭＴメチル化レベルとの関係は、決定された。ＭＧＭＴ発現は、ＴＭＺ臨床応答と負に相関する。ｎＣＡＴＳとパイロ配列決定データを比較することができるだけでなく、これらのＣｐＧが臨床的に関連しているため、差次的にメチル化された領域２（ＤＭＲ２、本研究ではエクソン１におけるＣｐＧ７０～８１）における合計１２個のＣｐＧは、検討された。予想されるように、ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴＭＺ耐性細胞株において高いＭＧＭＴ発現を、およびＴＭＺ感受性細胞株において非常に低いＭＧＭＴ発現を示した（図３Ａ）。ＭＧＭＴ発現とメチル化との間の逆相関（図３Ｂ）は、ｎＣＡＴＳおよびパイロ配列決定（ｒ＝－０．７２）の両方で、同様の有意水準で示された（Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。これらのデータは、一般に、ｎＣＡＴＳが、従来の方法に匹敵する配列決定データを産生したことを示唆した。
【0120】
各サンプルは、さらに詳細に調査され、Ｔ９８Ｇ細胞株における予期しない結果の同定をもたらした。以前の研究［Ｍｏｅｎ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １３：１３３４－１３４４］として、ＭＧＭＴの高発現が観察されたが、観察されたメチル化レベルおよび遺伝子発現は、対照されなかった（図３Ａおよび図３Ｂ）。この予期しない結果は、ｎＣＡＴＳを伴う追加のＣｐＧのメチル化の調査につながった（ＣｐＧ ９９～２１９）。ＭＧＭＴ発現とメチル化との間に強い相関（ｒ＞０．７またはｒ＜－０．７）を有したＣｐＧは、エクソン１における１２個のＣｐＧおよびイントロン１における３４個のＣｐＧを含むクラスタリング分析によって選択された。ＣｐＧ部位による階層的クラスタリングは、エクソン１におけるＣｐＧが一緒にクラスター化され、イントロン１におけるＣｐＧから分離された、２つの明確な位置依存性クラスターを示した（図３Ｄ）。８つのサンプル（４つの細胞株および４つの腫瘍）の階層的クラスタリングは、類似のメチル化プロファイルを伴う２つのＴＭＺ感受性細胞株が一緒にクラスター化され、２つのＴＭＺ耐性細胞株および４つの臨床サンプルが一緒にクラスター化された、２つの異なるクラスターを示した（図３Ｄ）。さらに、イントロンＣｐＧメチル化は、ＭＧＭＴ発現と正の相関があることが分かり（ｒ＝０．７８、Ｐ＝０．０２４）、反して、エクソンＣｐＧメチル化は、ＭＧＭＴ発現と負の相関があるままであった（ｒ＝－０．７７、Ｐ＝０．０２６）（図３Ｅ）。
【0121】
追加の腫瘍グレードを検査するために、原発性ＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶ（高グレード神経膠腫）として分類される４つの腫瘍サンプルは、ＭＧＭＴ発現についてはｑＲＴ－ＰＣＲで、メチル化についてはｎＣＡＴＳでアッセイされた。これらの４つのサンプルは、腫瘍分類だけでなく、それらがＩＤＨ野生型患者からもたらされた、以前の臨床サンプルとは異なった。ＭＧＭＴ発現（図４Ａ）およびＭＧＭＴメチル化パターン（図４Ｂ）は、サンプル間で異なっていた。これらの４つのサンプルについてのデータは、相関分析のために、以前の８つのサンプル（細胞株を含む）についてのデータと組み合わされた。１２個のサンプルで、エクソン１におけるＭＧＭＴ発現とメチル化との間に負の相関が存在した（ｒ＝－０．５１）が、統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．０９３）。しかしながら、イントロン１におけるＭＧＭＴ発現およびメチル化について統計的に有意な正の相関があった（ｒ＝０．６７、Ｐ＝０．０１６）（図４Ｃ）。これらの最後の４つの臨床サンプルにおけるＩＤＨ遺伝子型同定について、ｎＣＡＴＳは、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＳａｎｇｅｒ配列決定結果と一致する、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２を野生型として検出した。
【0122】
（ｖ）ｎＣＡＴＳで同定された単一ヌクレオチドバリアント
最後に、ｎＣＡＴＳは、ＭＧＭＴおよびＩＤＨ１／２遺伝子座における単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を同定するために使用されることができることが示された（図４Ｄ）。ナノポア配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定と比較され、また、患者のうちの６人からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定された唾液サンプルを使用して、生殖細胞ＤＮＡにおける病原性ＳＮＶの不存在が検証された（Ｐ７８５およびＰ８１６についてのＩｌｌｕｍｉｎａデータが利用可能ではなかった）。ｎＣＡＴＳおよびＩｌｌｕｍｉｎａは、ＭＧＭＴ遺伝子座１および２について類似の遺伝子型同定を返した（図４Ｄ）。遺伝子座２について、両方の方法は、患者７１２からの腫瘍および唾液の両方におけるヘテロ接合対立遺伝子（Ｃ／Ａ）を検出した。遺伝子座３について、ｎＣＡＴＳは、全てのサンプルにおいてヘテロ接合対立遺伝子を検出したが、Ｉｌｌｕｍｉｎａは、たった１個のサンプルにおいてヘテロ接合対立遺伝子を示した。遺伝子座４、５（ＩＤＨ１）、および６（ＩＤＨ２）について、ｎＣＡＴＳおよびＩｌｌｕｍｉｎａは、一貫して体細胞バリアントを検出した（バリアントは、唾液サンプル中では同定されなかった）。
最後に、ｎＣＡＴＳは、ＭＧＭＴおよびＩＤＨ１／２遺伝子座における単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を同定するために使用されることができることが示された（図４Ｄ）。ナノポア配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定と比較され、また、患者のうちの６人からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定された唾液サンプルを使用して、生殖細胞ＤＮＡにおける病原性ＳＮＶの不存在が検証された（Ｐ７８５およびＰ８１６についてのＩｌｌｕｍｉｎａデータが利用可能ではなかった）。ｎＣＡＴＳおよびＩｌｌｕｍｉｎａは、ＭＧＭＴ遺伝子座１および２について類似の遺伝子型同定を返した（図４Ｄ）。遺伝子座２について、両方の方法は、患者７１２からの腫瘍および唾液の両方におけるヘテロ接合対立遺伝子（Ｃ／Ａ）を検出した。遺伝子座３について、ｎＣＡＴＳは、全てのサンプルにおいてヘテロ接合対立遺伝子を検出したが、Ｉｌｌｕｍｉｎａは、たった１個のサンプルにおいてヘテロ接合対立遺伝子を示した。遺伝子座４、５（ＩＤＨ１）、および６（ＩＤＨ２）について、ｎＣＡＴＳおよびＩｌｌｕｍｉｎａは、一貫して体細胞バリアントを検出した（バリアントは、唾液サンプル中では同定されなかった）。
【0123】
論議
この実施例では、ナノポアＣａｓ９標的化長読み取り配列決定（ｎＣＡＴＳ）は、びまん性神経膠腫臨床サンプルならびに細胞株－ＭＧＭＴメチル化およびＩＤＨ１／２変異における２つの予後分子マーカーを同時に評価するために使用された。ｎＣＡＴＳは、増幅なしのゲノム領域の濃縮、天然ＤＮＡ上のメチル化の定量分析、および単一ヌクレオチドバリアントの同定を可能にする。Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋらは、乳がん細胞株および１つの患者腫瘍サンプルにおけるｎＣＡＴＳを伴う臨床がんバイオマーカー（例えば、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、およびＢＲＡＦ）を評価し、その実現可能性を実証した［Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ：１－６］。ここでは、いくつかの臨床固形腫瘍サンプル上でｎＣＡＴＳを使用して、臨床的に関連する遺伝的およびエピジェネティック予後バイオマーカーの両方を評価することの実現可能性を実証した。
この実施例では、ナノポアＣａｓ９標的化長読み取り配列決定（ｎＣＡＴＳ）は、びまん性神経膠腫臨床サンプルならびに細胞株－ＭＧＭＴメチル化およびＩＤＨ１／２変異における２つの予後分子マーカーを同時に評価するために使用された。ｎＣＡＴＳは、増幅なしのゲノム領域の濃縮、天然ＤＮＡ上のメチル化の定量分析、および単一ヌクレオチドバリアントの同定を可能にする。Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋらは、乳がん細胞株および１つの患者腫瘍サンプルにおけるｎＣＡＴＳを伴う臨床がんバイオマーカー（例えば、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、およびＢＲＡＦ）を評価し、その実現可能性を実証した［Ｇｉｌｐａｔｒｉｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ：１－６］。ここでは、いくつかの臨床固形腫瘍サンプル上でｎＣＡＴＳを使用して、臨床的に関連する遺伝的およびエピジェネティック予後バイオマーカーの両方を評価することの実現可能性を実証した。
【0124】
ｎＣＡＴＳは、合理化されたワークフローにおけるＩＤＨ１／２変異的状態およびＭＧＭＴメチル化レベルの同時評価を可能にし、３６時間以内のバイオマーカー評価をもたらした（図１Ｃ）。天然ＤＮＡ配列からのメチル化を評価するナノポア配列決定の能力は、亜硫酸水素塩修飾の必要性を排除し、本実施例は、臨床サンプルにおいても増幅することなく、適切な深度カバレッジを達成することができた。ＩＤＨ変異的状態の評価は、臨床的に使用されるＳａｎｇｅｒ法と相関し、さらにＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定と比較された（図４Ｄ）。
【0125】
ＭＧＭＴメチル化評価は、現在、使用される方法論および評定される遺伝子領域の両方が、臨床医の間で一貫していないため、非常に変動が大きい。さらに、ＭＧＭＴメチル化レベルにおけるカットオフ値は、ＭＧＭＴ発現と相関することが検証されていないため、臨床的コンセンサスは、存在しない［Ｍａｎｓｏｕｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ Ａ，ｅｔ ａｌ（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３４４９］。多くの機関は、細胞株および患者コホートにおけるＭＧＭＴ発現と相関することが示されている、ＭＧＭＴプロモーターおよびエクソン１内の２つの差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）を評価し、ＭＧＭＴメチル化は、次いで、テモゾロミド（ＴＭＺ）療法に対する応答性を予測するために使用される。我々の機関は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）を使用し、患者を、メチル化なし（＜１０％）、低メチル化（１０～３０％）、および高メチル化（＞３０％）の３つのグループに分類する。この研究では、細胞株および患者サンプルの両方からのｎＣＡＴＳデータは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）データおよびパイロ配列決定の両方と相関した（図２Ｃおよび図４Ｂ）。しかしながら、この恣意的なカットオフ値（例えば、１０％）を下回る何人かの患者は、ＴＭＺ療法に応答し［Ｄｏｖｅｋ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔ．６（３）：１９４－２０２、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ ＬＥ，ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５：４３７－４４６、およびＲａｄｋｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ ７：８９］、それらを「グレーゾーン」に置き、臨床的困惑を生成する。これを念頭に置いて、Ｃｈａｉらは、少なくとも３つのＣｐＧがそれぞれのカットオフ値を超えるときにＭＧＭＴプロモーターがメチル化されると定義する、パイロ配列決定データのための新規のＣｐＧ平均化モデルを開発し、これは、臨床医が、非常に低いレベル（例えば、１０％未満）のメチル化を伴う患者をより良好に層別化することを可能にする［Ｃｈａｉ Ｒ－Ｃ，ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ ３２：４－１５］。我々は、ｎＣＡＴＳが、ＭＧＭＴ遺伝子の複数の領域におけるＣｐＧメチル化を定量化するために使用されることができ、治療応答の可変性についてのさらなる洞察を提供し得ることを実証する。
【0126】
ｎＣＡＴＳの長い読み取り配列決定能力を考慮すると、我々はまた、ＭＧＭＴプロモーター全体、エクソン１、およびイントロン１の一部に沿ったＣｐＧメチル化を定量化することができた。ＴＭＺ耐性細胞株の１つ（Ｔ９８Ｇ）は、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化レベルとＭＧＭＴ発現との間の予想される逆相関を有していなかった。全てのＧＢＭ細胞株、ＩＤＨ変異体サンプル、および野生型ＤＧサンプルについて、イントロンＣｐＧ部位のメチル化とＭＧＭＴ発現との間に正の相関があった（図３Ｅおよび図４Ｃ）。この発見は、イントロンがＭＧＭＴ発現を決定するために重要であることができるため、遺伝子体のメチル化をアッセイすることの潜在的な利点を示唆する。
【0127】
最後に、２つのＳＮＶは、ＭＧＭＴのプロモーター領域において同定され、そのうちの１つ（ｒｓ１６２５６４９）は、ＭＧＭＴメチル化膠芽腫を伴う患者に予後的影響を及ぼした［Ｈｓｕ Ｃ－Ｙｅｔ ａｌ．，（２０１７）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８６４３０、およびＸｕ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３５：５６４－５７１］。ＭＧＭＴでは、ｎＣＡＴＳとＩｌｌｕｍｉｎａの結果との間の不整合はまた、観察された。遺伝子座３（図４Ｄ）では、ｎＣＡＴＳは、全ての患者において２つの対立遺伝子を検出したが、Ｉｌｌｕｍｉｎａは、Ｐ５６８のみにおいて２つの対立遺伝子を示した。我々は、次いで、この領域におけるＤＮＡ配列を検討し、この遺伝子座における６つの連続したグアニン（ホモポリマー）を見出した。ナノポアの現在のバージョンについて、ホモポリマーリッチ領域は、過誤の主な発生源である。したがって、この遺伝子座について、ｎＣＡＴＳは、ナノポアのこのバージョン（Ｒ９．４．１）を使用するときに、正確な遺伝子型同定を送達することができなかった。より長いセンサーを組み込んだナノポアの更新バージョンは、ホモポリマーリッチ領域における過誤を克服するために開発されている。
【0128】
我々のｎＣＡＴＳ技術はまた、ＩＤＨ１およびＩＤＨ２における変異バリアント（遺伝子座番号４～５（図４））を同定した。ＩＤＨ１におけるバリアントは、急性骨髄性白血病を伴う患者の生存に関連付けられるが、ＧＢＭにおけるその予後値は、知られていない。しかしながら、新しいＩＤＨ指向性療法の到来に伴い、ＩＤＨ１／２におけるバリアントは、将来的に重要になり得る。これらの洞察は、ｎＣＡＴＳとバイオマーカー同定と同時に行うことができる、治療上の意思決定における追加の要因としてのＳＮＶの組み込みにつながることができる。
【0129】
結論として、ｎＣＡＴＳ技術は、従来の方法よりも潜在的に低い資本コストで、外科的切除から２日以内に結果を提供する。臨床固形腫瘍サンプルにおける実現可能性は、遺伝的およびエピジェネティックバイオマーカーの両方が臨床的に使用されることを考慮して、実証され、ＤＧをモデルとして使用された。ｎＣＡＴＳ方法はまた、現在使用されている方法と比較して、より大きな遺伝子領域全体にわたるＭＧＭＴメチル化の評価を提供した。臨床的にｎＣＡＴＳを使用して、ＤＧにおける分子マーカー検査を標準化し、治療応答に対する患者の可変性に関する洞察を提供することには大きな可能性がある。さらに、ナノポアプラットフォームは、費用対効果が高く、スループットが高く、限られたリソースの国でアクセス可能であることができる。ｎＣＡＴは、出発材料として＞３μｇの高品質ＤＮＡを要求し、ホルマリン固定検体を検査することを非実用的にする。新鮮なサンプルから組織を取得することは、ＤＮＡ抽出を最適化するために、壊死が少なく、腫瘍含有量が高い領域を選択することの考慮を要求する。それにも関わらず、ｎＣＡＴＳ方法は、複数の分子標的を同時に評価するための可能性を伴うがん精密医療を強化するための有望なツールを提供する。
【0130】
均等物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され、例示されてきたが、当業者であれば、機能を実行し、結果および／または本明細書に記載される利点のうちの１つ以上を取得するための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形および／または修飾のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であると見なされる。より概して、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途または用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の発明的実施形態に対する多くの均等を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載および特許請求される以外の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
いくつかの本発明の実施形態が本明細書に記載され、例示されてきたが、当業者であれば、機能を実行し、結果および／または本明細書に記載される利点のうちの１つ以上を取得するための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形および／または修飾のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であると見なされる。より概して、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途または用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の発明的実施形態に対する多くの均等を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載および特許請求される以外の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【0131】
本明細書に開示される全ての参照文献、特許および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、文書の全体を包含し得る。
【0132】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、語句「および／または」は、このように結合された要素、すなわち、いくつかの場合では結合的に存在し、他の場合では分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じ方法、すなわち、このように結合された要素の「１つ以上」で解釈されるべきである。他の要素は、特に特定されたそれらの要素に関連するかどうかに関わらず、「および／または」条項によって具体的に特定された要素以外に、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの開放的な言語と併せて使用されるとき、一実施形態では、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択で、他の要素を含む）などを指すことができる。
【0133】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記に定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内のアイテムを分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されなければならず、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも１つであるが、２つ以上のものを含み、任意選択で、追加の非公開アイテムを含む。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」などの、または特許請求の範囲で使用されるとき、「からなる」などの、明確に反対の用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すことになる。一般に、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」などの排他的用語が先行するとき、排他的代替案（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【0134】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト内の要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各々および全ての要素のうちの少なくとも１つを含まずともよく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が参照する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定されたそれらの要素に関連するかどうかに関わらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または等価的に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または等価的に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂの存在を伴わない（および任意選択でＢ以外の要素を含む）、任意選択で、２つ以上のＡを含む、少なくとも１つを指し、別の実施形態では、Ａの存在を伴わない（および任意選択でＡ以外の要素を含む）、任意選択で、２つ以上のＢを含む、少なくとも１つを指し、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、任意選択で、２つ以上のＡを含む、および任意選択で、２つ以上のＢを含む（ならびに、任意選択で、他の要素を含む）、少なくとも１つを指すことができる、などである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【配列表】
【国際調査報告】