特表 2022-551514 ＫＲＡＳ突然変異を識別するＴ細胞受容体およびそのコード配列

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-09

(54)【発明の名称】ＫＲＡＳ突然変異を識別するＴ細胞受容体およびそのコード配列

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221202BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221202BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20221202BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20221202BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221202BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20221202BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20221202BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20221202BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20221202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221202BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20221202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221202BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221202BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20221202BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20221202BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/725 ZNA

C12N15/867 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0783

C12N5/0789

A61K35/76

A61K47/64

A61K35/12

A61K35/17 Z

A61K35/545

A61P35/00

A61P37/02

A61P43/00 111

A61K48/00

A61K38/17

C07K16/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022521508

(86)(22)【出願日】2020-10-10

(85)【翻訳文提出日】2022-04-08

(86)【国際出願番号】 CN2020120191

(87)【国際公開番号】W WO2021068938

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】201910960523.3

(32)【優先日】2019-10-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521121053

【氏名又は名称】エックスライフエスシー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100135183

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 克之

(72)【発明者】

【氏名】胡静

(72)【発明者】

【氏名】孫含麗

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA02

4C084CA53

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZC02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZC02

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ）抗原に特異的に結合できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、突然変異抗原の短いペプチドは、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫであり、ＨＬＡ Ａ１１０１と複合体を形成することができ、本発明のＴＣＲは、上記複合体に特異的に結合できる。本発明は、前記ＴＣＲをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含むベクターを更に提供する。更に、本発明は、本発明のＴＣＲを形質導入する細胞を更に提供する。
【選択図】無し

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に特異的に結合でき、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である、
ことを特徴とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。

【請求項2】

前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α ＣＤＲ１－ ＤＲＶＳＱＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、
α ＣＤＲ２－ ＩＹＳＮＧＤ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、
α ＣＤＲ３－ ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および／または
前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１－ ＳＧＨＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、
β ＣＤＲ２－ ＦＱＮＥＡＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、
β ＣＤＲ３－ ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項3】

ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項4】

前記ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体にも特異的に結合できる、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項5】

前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項6】

前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項7】

前記ＴＣＲはαβヘテロ二量体であり、ＴＣＲのα鎖の定常ドメインＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲのβ鎖の定常ドメインＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項8】

前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７である、
ことを特徴とする請求項７に記載のＴＣＲ。

【請求項9】

前記ＴＣＲは可溶である、
ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のＴＣＲ。

【請求項10】

前記ＴＣＲは一本鎖である、
ことを特徴とする請求項９に記載のＴＣＲ。

【請求項11】

前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインとβ鎖の可変ドメインとをペプチド連結配列を介して連結してなる、
ことを特徴とする請求項１０に記載のＴＣＲ。

【請求項12】

前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはα鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、または最後から７番目に１つまたは複数の突然変異があり、および／または前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはβ鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から２番目、最後から４番目、または最後から６番目に１つまたは複数の突然変異があり、アミノ酸位置の番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）に記載された位置番号に従う、
ことを特徴とする請求項１１に記載のＴＣＲ。

【請求項13】

前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４を含む、
ことを特徴とする請求項１２に記載のＴＣＲ。

【請求項14】

前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０である、ことを特徴とする請求項１３に記載のＴＣＲ。

【請求項15】

前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのα鎖、および（ｂ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのβ鎖を含み、
且つ、（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能性可変ドメインを含むか、または機能性可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ鎖の定常ドメインの少なくとも一部を更に含む、
ことを特徴とする請求項９に記載のＴＣＲ。

【請求項16】

システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖の定常ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する、ことを特徴とする請求項１５に記載のＴＣＲ。

【請求項17】

前記ＴＣＲで人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換する、
ことを特徴とする請求項１６に記載のＴＣＲ。

【請求項18】

前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８である、
ことを特徴とする請求項１７に記載のＴＣＲ。

【請求項19】

前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる、ことを特徴とする請求項１５に記載のＴＣＲ。

【請求項20】

前記ＴＣＲで人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換する、
ことを特徴とする請求項１９に記載のＴＣＲ。

【請求項21】

前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメイン、β鎖の可変ドメイン、および膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のβ鎖の定常ドメインを含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成する、
ことを特徴とする請求項１９または２０に記載のＴＣＲ。

【請求項22】

前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ－末端またはＮ－末端にコンジュゲートが結合されている、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項23】

前記Ｔ細胞受容体に結合されたコンジュゲートは、検出可能マーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分、またはこれらの物質の任意の組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は抗－ＣＤ３抗体である、
ことを特徴とする請求項２２に記載のＴ細胞受容体。

【請求項24】

少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、且つ、そのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子は、上記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲである、
ことを特徴とする多価ＴＣＲ複合体。

【請求項25】

上記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含む、
ことを特徴とする核酸分子。

【請求項26】

ＴＣＲのα鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３を含む、
ことを特徴とする請求項２５に記載の核酸分子。

【請求項27】

ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５を含む、
ことを特徴とする請求項２５または２６に記載の核酸分子。

【請求項28】

ＴＣＲのα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４および／またはＴＣＲのβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８を含む、
ことを特徴とする請求項２５に記載の核酸分子。

【請求項29】

請求項２５から２８のいずれか１項に記載の核酸分子を含み、好ましくは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、レンチウイルスベクターである、
ことを特徴とするベクター。

【請求項30】

請求項２９に記載のベクターが含まれ、または染色体に外因性の請求項２５から２８のいずれか１項に記載の核酸分子が組み込まれている、
ことを特徴とする分離された宿主細胞。

【請求項31】

請求項２５から２８のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項２９に記載のベクターが形質導入され、好ましくは、Ｔ細胞または幹細胞である、
ことを特徴とする細胞。

【請求項32】

医薬的に許容されるベクターおよび請求項１から２３のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項２４に記載のＴＣＲ複合体、または請求項３１に記載の細胞を含む、
ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項33】

請求項１から２３のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、または請求項２４に記載のＴＣＲ複合体、または請求項３１に記載の細胞の使用であって、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬剤の調製に使用される、
ことを特徴とする使用。

【請求項34】

請求項１から２３のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体または請求項２４に記載のＴＣＲ複合体または請求項３１に記載の細胞を、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬剤として使用する、
ことを特徴とする使用。

【請求項35】

治療を必要とする対象に適量の請求項１から２３のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項２４に記載のＴＣＲ複合体、請求項３１に記載の細胞、または請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含み、
好ましくは、前記疾患は腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、または胃癌である、
ことを特徴とする疾患の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原に由来する短いペプチドを識別できるＴＣＲおよびそのコード配列に関し、本発明は、更に、上記ＴＣＲを形質導入することにより得られたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ関連疾患の予防および治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＫＲＡＳ遺伝子（ｐ２１遺伝子）は、マウス系肉腫ウイルス癌遺伝子であり、長さが約３５ｋｂであり、１２番染色体に位置し、ｒａｓ遺伝子ファミリーのメンバーの１つであり、ＫＲＡＳタンパク質をコードする。ＫＲＡＳ遺伝子は、野生型または突然変異型に分けられる。正常な状態で、野生型のＫＲＡＳは細胞成長の経路を制御調節することができる。突然変異が発生すると、細胞成長を刺激し続け、腫瘍の発生を引き起こす。ＫＲＡＳ遺伝子のよく見られる突然変異部位は、ＫＲＡＳ遺伝子の２番エクソンの１２番および１３番のコドンに位置し、ここで、Ｇ１２Ｖは、７つのよく見られる突然変異部位の１つである（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１２、Ｖｏｌ．３５、Ｎｏ．１１）。ＫＲＡＳ突然変異体（ｍＫＲＡＳ）でコードされたＫＲＡＳタンパク質は、持続的に活性化されている状態にあり、更に、細胞増殖が暴走し、腫瘍の形成を引き起こす。研究によると、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖは、様々なヒト悪性腫瘍に関連し、肺癌、結腸直腸癌（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｙ、３７（５）：６８２３～３０）、膵臓癌、胃癌（Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９、１０（４）：８２１～８２８）等を含んでもよいが、これらに限定されず、且つ、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ突然変異を持っている腫瘍患者の生存期間は最も短いことが分かった（Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ｏｃｔ ２０、１１３（８）：１２０６～１２１５）。ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原に由来する短いペプチドであり、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ関連疾患の治療の１つのターゲットである。

【0003】

Ｔ細胞養子免疫治療は、標的細胞抗原に対して特異性を持つ反応性Ｔ細胞を患者の体内に導入することにより、標的細胞に対して作用を発揮させる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面の膜タンパク質であり、対応する標的細胞表面の抗原の短いペプチドを識別することができる。免疫システムにおいて、抗原の短いペプチド特異的ＴＣＲと短いペプチド－主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ複合体）との結合により、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）とが直接物理的に接触し、その後、Ｔ細胞とＡＰＣとの両者の他の細胞膜表面分子が相互作用し、一連の後続の細胞シグナル伝達および他の生理反応を引き起こし、異なる抗原の特異的なＴ細胞がその標的細胞に対して免疫効果を発揮する。従い、当業者は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の突然変異した短いペプチドに対して特異性を持つＴＣＲを分離し、および該ＴＣＲをＴ細胞に形質導入してＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドに対して特異性を持つＴ細胞を取得し、それらに細胞免疫治療で作用を発揮させることに専念している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドを識別するＴ細胞受容体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の態様１において、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に特異的に結合できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。

【0006】

別の好ましい例において、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である。

【0007】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α ＣＤＲ１－ ＤＲＶＳＱＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、
α ＣＤＲ２－ ＩＹＳＮＧＤ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、
α ＣＤＲ３－ ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および／または
前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１－ ＳＧＨＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、
β ＣＤＲ２－ ＦＱＮＥＡＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、
β ＣＤＲ３－ ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である。

【0008】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に特異的にも結合できる。

【0009】

別の好ましい例において、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

【0010】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含む。

【0011】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５を含む。

【0012】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲはαβヘテロ二量体であり、ＴＣＲのα鎖の定常ドメインＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲのβ鎖の定常ドメインＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む。

【0013】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７である。

【0014】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは可溶である。

【0015】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは一本鎖である。

【0016】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインとβ鎖の可変ドメインとをペプチド連結配列を介して連結してなる。

【0017】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはα鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、または最後から７番目に１つまたは複数の突然変異があり、および／または前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはβ鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から２番目、最後から４番目、または最後から６番目に１つまたは複数の突然変異があり、アミノ酸位置の番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）に記載された位置番号に従う。

【0018】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４を含む。

【0019】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０である。

【0020】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのα鎖、および（ｂ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのβ鎖を含み、
且つ、（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能性可変ドメインを含むか、または機能性可変ドメインおよび前記ＴＣＲ鎖の定常ドメインの少なくとも一部を含む。

【0021】

別の好ましい例において、システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖の定常ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する。

【0022】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲで人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換する。

【0023】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８である。

【0024】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。

【0025】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲで人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換する。

【0026】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメイン、β鎖の可変ドメイン、および膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のβ鎖の定常ドメインを含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成する。

【0027】

別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ－末端またはＮ－末端にコンジュゲートが結合されている。

【0028】

別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体に結合されたコンジュゲートは、検出可能マーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分、またはこれらの物質の任意の組み合わせである。好ましくは、前記治療剤は抗－ＣＤ３抗体である。

【0029】

本発明の態様２において、少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、且つ、そのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子が本発明の態様１に記載のＴＣＲである多価ＴＣＲ複合体を提供する。

【0030】

本発明の態様３において、本発明の態様１に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含む核酸分子を提供する。

【0031】

別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３を含む。

【0032】

別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５を含む。

【0033】

別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲのα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４および／またはＴＣＲのβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８を含む。

【0034】

本発明の態様４において、本発明の態様３に記載の核酸分子を含み、好ましくは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、レンチウイルスベクターであるベクターを提供する。

【0035】

本発明の態様５において、本発明の態様４に記載のベクターが含まれ、またはゲノムに外因性の本発明の態様３に記載の核酸分子が組み込まれている分離された宿主細胞を提供する。

【0036】

本発明の態様６において、本発明の態様３に記載の核酸分子または本発明の態様４に記載のベクターが形質導入され、好ましくは、Ｔ細胞または幹細胞である細胞を提供する。

【0037】

本発明の態様７において、医薬的に許容されるベクターおよび本発明の態様１に記載のＴＣＲ、本発明の態様２に記載のＴＣＲ複合体、本発明の態様３に記載の核酸分子、本発明の態様４に記載のベクター、または本発明の態様６に記載の細胞を含む医薬組成物を提供する。

【0038】

本発明の態様８において、本発明の態様１に記載のＴ細胞受容体、または本発明の態様２に記載のＴＣＲ複合体、本発明の態様３に記載の核酸分子、本発明の態様４に記載のベクター、または本発明の態様６に記載の細胞の使用であって、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬剤の調製に使用される使用を提供する。好ましくは、前記腫瘍は、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、または肺癌である。

【0039】

本発明の態様９において、本発明の態様１に記載のＴ細胞受容体、または本発明の態様２に記載のＴＣＲ複合体、本発明の態様３に記載の核酸分子、本発明の態様４に記載のベクター、または本発明の態様６に記載の細胞を、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬剤として使用する、使用を提供する。好ましくは、前記腫瘍は、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、または肺癌である。

【0040】

本発明の態様１０において、治療を必要とする対象に適量の本発明の態様１に記載のＴ細胞受容体、または本発明の態様２に記載のＴＣＲ複合体、本発明の態様３に記載の核酸分子、本発明の態様４に記載のベクター、または本発明の態様６に記載の細胞、または本発明の態様７に記載の医薬組成物を投与することを含み、
好ましくは、前記疾患は腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、または肺癌である疾患の治療方法を提供する。

【発明の効果】

【0041】

本発明の範囲内で、本発明の上記各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴との間は、互いに組み合わせて新しいまたは好ましい技術案を構成することができることが理解されるべきである。紙面の都合、ここでは網羅的に列挙しない。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆは、それぞれＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列、ＴＣＲのα鎖のヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列、およびリーダー配列を有するＴＣＲのα鎖のヌクレオチド配列である。

【図2】図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列、ＴＣＲのβ鎖のヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列、およびリーダー配列を有するＴＣＲのβ鎖のヌクレオチド配列である。

【図3】モノクローナル細胞のＣＤ８⁺および四量体－ＰＥ二重陽性染色結果である。

【図4】図４ａおよび図４ｂは、それぞれ可溶性ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図5】図５ａおよび図５ｂは、それぞれ可溶性ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図6】図６ａおよび図６ｂは、精製後に得られた可溶性ＴＣＲのゲル図である。ここで、図６ａおよび図６ｂの右側レーンは、それぞれ還元ゲルおよび非還元ゲルであり、左側レーンは、いずれも分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）である。

【図7】図７ａおよび図７ｂは、それぞれ一本鎖ＴＣＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図8】図８ａおよび図８ｂは、それぞれ一本鎖ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図9】図９ａおよび図９ｂは、それぞれ一本鎖ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図10】図１０ａおよび図１０ｂは、それぞれ一本鎖ＴＣＲの連結配列（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。

【図11】精製後に得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのゲル図である。左側レーンは分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であり、右側レーンは非還元ゲルである。

【図12】本発明の可溶性ＴＣＲとＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップである。

【図13】本発明の可溶性一本鎖ＴＣＲとＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップである。

【図14】得られたＴ細胞のクローンのＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能の検証結果である。

【図15】本発明のＴＣＲを形質導入する効果細胞のＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能の検証結果（標的細胞がＴ２である）である。

【図16】本発明のＴＣＲを形質導入する効果細胞のＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能の検証結果（標的細胞が腫瘍細胞系である）である。

【図17】本発明のＴＣＲを形質導入する効果細胞のＬＤＨ殺傷機能の検証結果である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本発明者は、広範かつ深い研究により、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８）に特異的に結合できるＴＣＲを見出し、前記抗原の短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫまたはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫは、それぞれＨＬＡ Ａ１１０１と複合体を形成して共に細胞表面に提示することができる。本発明は、前記ＴＣＲをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含むベクターを更に提供する。また、本発明は、本発明のＴＣＲを形質導入する細胞を更に提供する。

【0044】

用語
ＭＨＣ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であり、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子であってもよい。従い、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる個体は異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原における異なる短いペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示することができる。ヒトのＭＨＣは、通常、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。

【0045】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に提示された特異的な抗原ペプチドの唯一の受容体である。免疫システムにおいて、抗原の特異的なＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合により、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）とが直接物理的に接触し、その後、Ｔ細胞とＡＰＣとの両者の他の細胞膜表面分子が相互作用し、一連の後続の細胞シグナル伝達および他の生理反応を引き起こし、異なる抗原の特異的なＴ細胞がその標的細胞に対して免疫効果を発揮する。

【0046】

ＴＣＲは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖がヘテロ二量体の形式で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲヘテロ二量体はα鎖とβ鎖とで構成される一方、５％のＴ細胞は、γ鎖とδ鎖とで構成されたＴＣＲを有する。天然のαβヘテロ二量体化ＴＣＲはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖は、αβヘテロ二量体化ＴＣＲのサブユニットを構成する。大まかに言って、αとβの各鎖は、可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多変領域を更に含むが、該多変領域は、通常連結領域の一部としてみなされる。各可変領域は、フレームワーク構造（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ＣＤＲ領域は、ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合を決定し、ここで、ＣＤＲ３は、可変領域と連結領域とで再構成され、超可変領域と呼ばれる。ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、一般的にそれぞれ２つの「ドメイン」、即ち可変ドメインと定常ドメインとを有すると見なされ、可変ドメインは、連結された可変領域と連結領域とで構成される。ＴＣＲの定常ドメインの配列は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）の公開データベースで見つかることができ、例えば、ＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であり、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」である。また、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、膜貫通領域と細胞質領域とを更に含み、細胞質領域は短い。

【0047】

本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」という用語は、交換可能に使用される。

【0048】

天然の鎖間ジスルフィド結合および人工的な鎖間ジスルフィド結合
天然のＴＣＲの膜近位領域ＣαとＣβ鎖との間には、１群のジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合を、「人工的な鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。

【0049】

ジスルフィド結合の位置を容易に説明するために、本発明におけるＴＲＡＣ＊０１およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号は、Ｎ端からＣ端まで順番に位置番号を付け、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順番の順序に従う６０番目のアミノ酸がＰ（プロリン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と記述することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸と記述することもでき、また、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順番の順序に従う６１番目のアミノ酸がＱ（グルタミン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と記述することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸と記述することもでき、他は、類推によって推測される。本発明において、可変領域ＴＲＡＶとＴＲＢＶとのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに記載の位置番号に従う。例えば、ＴＲＡＶにおけるあるアミノ酸について、ＩＭＧＴに記載の位置番号が４６であると、本発明においてＴＲＡＶ４６番目のアミノ酸と記述され、他は、類推によって推測される。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な説明がある場合、特別な説明に従う。

【0050】

発明の詳細な説明
ＴＣＲ分子
抗原の加工過程において、抗原は、細胞内で分解された後、ＭＨＣ分子によって細胞表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は、抗原提示細胞表面のペプチド－ＭＨＣ複合体を識別することができる。従い、本発明の態様１は、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に結合できるＴＣＲ分子を提供する。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、分離されたものまたは精製されたものである。該ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。

【0051】

本発明の１つの好ましい実施形態において、前記ＴＣＲのα鎖は、
α ＣＤＲ１－ ＤＲＶＳＱＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、
α ＣＤＲ２－ ＩＹＳＮＧＤ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、
α ＣＤＲ３－ ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）というアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、および／または
前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１－ ＳＧＨＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、
β ＣＤＲ２－ ＦＱＮＥＡＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、
β ＣＤＲ３－ ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である。

【0052】

上記本発明のＣＤＲ領域アミノ酸配列を、任意の適切なフレームワーク構造に埋め込んでキメラＴＣＲを調製することができる。フレームワーク構造が本発明のＴＣＲのＣＤＲ領域と交換性がある限り、当業者は、本発明に開示されたＣＤＲ領域に基づいて対応する機能を有するＴＣＲ分子を設計または合成することができる。従い、本発明のＴＣＲ分子は、上記α鎖および／またはβ鎖のＣＤＲ領域配列および任意の適切なフレームワーク構造を含むＴＣＲ分子を指す。本発明のＴＣＲのα鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または本発明のＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

【0053】

本発明の１つの好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖とβ鎖とで構成されるヘテロ二量体である。具体的には、一方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のα鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、上記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １である。他方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のβ鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５である。

【0054】

本発明の１つの好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖の一部または全ておよび／またはβ鎖の一部または全てから構成される一本鎖ＴＣＲ分子である。一本鎖ＴＣＲ分子についての記述は、文献Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１２６５４～１２６５８を参照することができる。文献の記載によると、当業者は、本発明のＣＤＲｓ領域を含む一本鎖ＴＣＲ分子を容易に構築することができる。具体的には、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、Ｖα、ＶβおよびＣβを含み、好ましくは、Ｎ端からＣ端までの順序に従って連結される。

【0055】

前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、上記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １である。前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５である。

【0056】

本発明の１つの好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子の定常ドメインは、ヒトの定常ドメインである。当業者は、関連書籍またはＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）の公開データベースを参照することにより、ヒトの定常ドメインアミノ酸配列を知るか、または得ることができる。例えば、本発明のＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であってもよく、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」であってもよい。ＩＭＧＴのＴＲＡＣ＊０１に与えられたアミノ酸配列の５３番目はＡｒｇであり、ここでは、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３として表され、他は、類推によって推測される。好ましくは、本発明のＴＣＲ分子のα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３であり、および／またはβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７である。

【0057】

天然に存在するＴＣＲは、膜貫通領域によって安定化された膜タンパク質である。抗原識別分子としての免疫グロブリン（抗体）と同様に、ＴＣＲも、診断および治療に適用するように開発でき、この場合、可溶性ＴＣＲ分子を取得する必要がある。可溶性ＴＣＲ分子は、膜貫通領域を含まない。可溶性ＴＣＲは、広範な用途を有し、ＴＣＲとｐＭＨＣとの相互作用の研究に使用できるだけでなく、感染を検出するための診断ツールまたは自己免疫疾患のマーカーとしても使用できる。それに類似し、可溶性ＴＣＲは、治療剤（例えば、細胞毒素化合物または免疫刺激性化合物）を、特異的抗原を提示する細胞に送達することに使用でき、また、可溶性ＴＣＲは、他の分子（例えば、抗－ＣＤ３抗体）に結合してＴ細胞をリダイレクトし、特定の抗原の細胞を標的に提示することもできる。本発明は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドに対して特異性を有する可溶性ＴＣＲも取得する。

【0058】

可溶性ＴＣＲを取得するために、一方で、本発明のＴＣＲは、そのα鎖およびβ鎖の定常ドメインの残基間に人工的なジスルフィド結合を導入するＴＣＲである。システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常ドメイン間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然のＴＣＲにおける適切な部位の他のアミノ酸残基を置換して人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７のシステイン残基を置換してジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入してジスルフィド結合を形成する他の部位は、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の Ａｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であってもよい。即ち、システイン残基は、上記α鎖およびβ鎖の定常ドメインにおけるいずれか群の部位を置換する。本発明のＴＣＲの定常ドメインの１つまたは複数のＣ末端で、最大５０個、または最大３０個、または最大１５個、または最大１０個、または最大８個、またはより少ないアミノ酸を切り詰めることにより、システイン残基を含まないようにして天然ジスルフィド結合を欠損するという目的を達成してもよいし、天然のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸に突然変異することにより、上記目的を達成してもよい。

【0059】

上述したように、本発明のＴＣＲは、そのα鎖およびβ鎖の定常ドメインの残基間に導入された人工的なジスルフィド結合を含んでもよい。なお、定常ドメイン間に上記導入された人工的なジスルフィド結合を含んでも含まなくても、本発明のＴＣＲは、いずれもＴＲＡＣの定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の定常ドメイン配列を含むことができる。ＴＣＲのＴＲＡＣの定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の定常ドメイン配列は、ＴＣＲに存在する天然ジスルフィド結合を介して連結できる。

【0060】

可溶性ＴＣＲを取得するために、他方、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域に突然変異が発生するＴＣＲを更に含み、これらの疎水性コア領域の突然変異は、公開番号ＷＯ２０１４／２０６３０４の特許文献に記載されたように、本発明の可溶性ＴＣＲの安定性を向上させることができる突然変異であることが好ましい。このようなＴＣＲは、（α鎖および／またはβ鎖の）可変領域のアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番目、および／またはα鎖のＪ遺伝子（ＴＲＡＪ）の短いペプチドのアミノ酸位置の最後から３、５、７番目、および／またはβ鎖のＪ遺伝子（ＴＲＢＪ）の短いペプチドのアミノ酸位置の最後から２、４、６番目という可変ドメインの疎水性コア位置に突然変異が発生でき、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に記載された位置番号に従う。当業者は、上記国際免疫遺伝学情報システムを知り、該データベースに基づいて異なるＴＣＲのアミノ酸残基のＩＭＧＴにおける位置番号を取得することができる。

【0061】

本発明における疎水性コア領域に突然変異が発生するＴＣＲは、柔軟なペプチド鎖を介してＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを連結することにより構成された安定的な可溶性一本鎖ＴＣＲであってもよい。なお、本発明における柔軟なペプチド鎖は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変ドメインの連結に適した任意のペプチド鎖であってもよい。本発明の実施例４で構築された一本鎖可溶性ＴＣＲのように、そのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２であり、コードされたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３であり、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４であり、コードのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５である。

【0062】

また、安定性の観点から、特許文献２０１６８０００３５４０．２は、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ＴＣＲの安定性を著しく向上させることができることを更に開示する。従い、本発明の高親和性ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に、人工的な鎖間ジスルフィド結合が更に含まれてもよい。具体的には、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸を置換する。好ましくは、このようなＴＣＲは、（ｉ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのα鎖、および（ｉｉ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのβ鎖を含んでもよく、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）はいずれもＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび少なくとも一部の定常ドメインを含み、α鎖とβ鎖とは、ヘテロ二量体を形成する。より好ましくは、このようなＴＣＲは、α鎖の可変ドメイン、β鎖の可変ドメイン、および膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のβ鎖の定常ドメインを含んでもよいが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成する。

【0063】

本発明のＴＣＲは、多価複合体の形式で提供することもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、２つ、３つ、４つ、またはより多くの本発明のＴＣＲを結合してなったポリマーを含んでもよく、例えば、ｐ５３の四量体化ドメインを使用して形成された四量体、または複数の本発明のＴＣＲを別の分子と結合してなった複合体であってもよい。本発明のＴＣＲ複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原の細胞を追跡するまたは標的に提示することに使用でき、このような適用を有する他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を生成することにも使用できる。

【0064】

本発明のＴＣＲは、単独で使用してもよいし、コンジュゲートと共有結合または他の方式で結合してもよく、好ましくは、共有結合の方式で結合する。前記コンジュゲートは、検出可能マーカー（診断を目的とし、ここで、前記ＴＣＲは、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１、またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体を提示する細胞の存在を検出することに使用される）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、または以上のこれらの物質の任意の組み合わせ結合もしくはカップリングを含む。

【0065】

診断目的に使用される検出可能マーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、またはＣＴ（電子コンピュータＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含んでもよいが、これらに限定されない。

【0066】

本発明のＴＣＲと結合またはカップリングできる治療剤は、１．放射性核種（Ｋｏｐｐｅら、２００５、癌転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖｉｅｗｓ）２４、５３９）、２．生物学的毒性（（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９、自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９、３９４、Ｅｐｅｌら、２００２、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１、５６５）、３．ＩＬ－２等のようなサイトカイン（Ｇｉｌｌｉｅｓら１９９２、米国国立科学アカデミーの学術誌（ＰＮＡＳ）８９、１４２８、Ｃａｒｄら、２００４、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３、３４５、Ｈａｌｉｎら、２００３、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３、３２０２）、４．抗体Ｆｃフラグメント（Ｍｏｓｑｕｅｒａら、２００５、免疫学ジャーナル（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７４，４３８１）、５．抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｚｈｕら、１９９５、癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）６２、３１９）、６．金ナノ粒子／ナノロッド（Ｌａｐｏｔｋｏら、２００５、癌通信（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ）２３９、３６、Ｈｕａｎｇら、２００６、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８、２１１５）、７．ウイルス粒子（Ｐｅｎｇら、２００４、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）１１、１２３４）、８．リポソーム（Ｍａｍｏｔら、２００５、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５、１１６３１）、９．ナノ磁性粒子、１０．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）、またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、１１．化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形式のナノ粒子等を含んでもよいが、これらに限定されない。

【0067】

また、本発明のＴＣＲは、１つ以上の種に由来する配列を含むハイブリッドＴＣＲであってもよい。例えば、研究によると、マウス科ＴＣＲは、ヒトＴＣＲよりもヒトＴ細胞でより効果的に発現することが示されている。従い、本発明のＴＣＲは、ヒト可変ドメインおよびマウスの定常ドメインを含んでもよい。この方法の欠陥は、免疫応答を引き起こす可能性があることである。従い、養子Ｔ細胞治療に使用される場合、マウス科Ｔ細胞を発現する移植を可能にするために、免疫抑制を行うための調節形態が必要となる。

【0068】

本明細書におけるアミノ酸名称は、国際で汎用される単一の英字または３つの英字で表され、アミノ酸名称の単一の英字と３つの英字との対応関係は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）のとおりであることが理解されるべきである。

【0069】

核酸分子
本発明の態様２は、本発明の態様１のＴＣＲ分子またはその一部をコードする核酸分子を提供し、前記一部は、１つまたは複数のＣＤＲ、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメイン、およびα鎖および／またはβ鎖であってもよい。

【0070】

本発明の態様１のＴＣＲ分子のα鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
α ＣＤＲ１－ｇａｃｃｇａｇｔｔｔｃｃｃａｇｔｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）、
α ＣＤＲ２－ ａｔａｔａｃｔｃｃａａｔｇｇｔｇａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）、
α ＣＤＲ３－ｇｃｃｔｃｃｃｔｃａａｇｇｇｔａａｃａａｔｇａｃａｔｇｃｇｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）である。

【0071】

本発明の態様１のＴＣＲ分子のβ鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
β ＣＤＲ１－ ｔｃｇｇｇｔｃａｔｇｔａｔｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）、
β ＣＤＲ２－ ｔｔｃｃａｇａａｔｇａａｇｃｔｃａａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）、
β ＣＤＲ３－ｇｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃａｇｔａｇｇｔｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）である。

【0072】

従い、本発明のＴＣＲのα鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８を含み、および／または本発明のＴＣＲのβ鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１を含む。

【0073】

本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖であってもよく、該核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、且つイントロンを含んでも含まなくてもよい。好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、イントロンを含まないが、本発明のポリペプチドをコードすることができ、例えば、本発明のＴＣＲのα鎖の可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含み、および／または本発明のＴＣＲのβ鎖の可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６を含む。あるいは、本発明のＴＣＲのα鎖の可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３を含み、および／または本発明のＴＣＲのβ鎖の可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５を含む。より好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８を含む。または、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１である。

【0074】

遺伝暗号の縮重により、異なるヌクレオチド配列は、同じポリペプチドをコードすることができることが理解されるべきである。従い、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、本発明の図面に示された核酸配列と同じであるか、または縮重された変異体であってもよい。本発明における一例について説明し、「縮重された変異体」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を有するタンパク質配列をコードするが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の配列と異なる核酸配列を指す。

【0075】

ヌクレオチド配列は、コドンにより最適化されたものであってもよい。異なる細胞は、具体的なコドンの利用上で異なり、細胞のタイプに応じ、配列内のコドンを変更することにより発現量を増やすことができる。哺乳動物の細胞および他の多くの生物のコドン選択リストは、当業者によく知られている。

【0076】

本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法、または人工的合成法によって得ることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得ることができる。その後、該ＤＮＡ配列を本分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター）および細胞に導入することができる。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であってもよい。

【0077】

ベクター
本発明は、更に本発明の核酸分子を含むベクターに関し、発現ベクター、即ち、インビボまたはインビトロで発現できる構築体を含む。よく使用されるベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージおよび動植物ウイルスを含む。

【0078】

ウイルス送達システムは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含んでもよいが、これらに限定されない。

【0079】

好ましくは、ベクターは、本発明のヌクレオチドを細胞に移すことができ、例えば、Ｔ細胞において、該細胞にＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原に特異的なＴＣＲを発現させることができる。理想的な場合、該ベクターは、Ｔ細胞において継続的に高レベルで発現することができる。

【0080】

細胞
本発明は、更に本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学により生成した宿主細胞に関する。前記宿主細胞に本発明のベクターが含まれるか、または染色体に本発明の核酸分子が組み込まれた。宿主細胞は、原核細胞、および大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯ細胞等のような真核細胞から選ばれる。

【0081】

また、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する分離された細胞、特にＴ細胞を更に含む。該Ｔ細胞は、被験者から分離されたＴ細胞に由来することができるか、または被験者から分離された混合細胞群であってもよく、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）群の一部である。例えば、該細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離されてもよいし、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８⁺細胞毒性Ｔ細胞であってもよい。該細胞は、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８⁺細胞毒性Ｔ細胞の混合群に存在してもよい。一般的に、該細胞は、トランスフェクションをより受け入れやすくすることができるように、抗体（例えば、抗－ＣＤ３または抗－ＣＤ２８の抗体）で活性化することができ、例えば、本発明のＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いてトランスフェクションを行う。

【0082】

あるいは、本発明の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）のような幹細胞であるか、または幹細胞に由来する。幹細胞の表面がＣＤ３分子を発現しないため、遺伝子をＨＳＣに導入しても、細胞表面でのＴＣＲの発現を引き起こさない。しかし、幹細胞が、胸腺に移動したリンパ球前駆細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に分化される場合、ＣＤ３分子の発現は、該導入されたＴＣＲ分子の胸腺細胞の表面での発現を開始する。

【0083】

本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを用いてＴ細胞のトランスフェクションを行うことに適した方法が多くある（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら．， （２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０： ６１１６～６１３１）。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫治療に使用できる。当業者は、養子治療を行う多くの適切な方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら．， （２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８（４）： ２９９～３０８）。

【0084】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原関連疾患
本発明は、更に被験者でＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ関連疾患を治療および／または予防する方法に関し、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞を該被験者に養子移入するステップを含む。該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞は、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体を識別することができる。

【0085】

本発明のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ特異的Ｔ細胞は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体を提示する任意のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ関連疾患の治療に使用でき、膵臓癌、肺癌、結腸癌、直腸癌等のような腫瘍を含んでもよいが、これらに限定されない。

【0086】

突然変異が発生していない、即ち、野生型ＫＲＡＳタンパク質の最初からの２０個のアミノ酸配列は、ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧ ＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９）であり、その１２番目のアミノ酸はＧである。ＶＶＧＡＧＧＶＧＫおよびＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫは、それぞれＫＲＡＳタンパク質の８～１６番目および７～１６番目に対応し、上記対応位置でＧ１２Ｖ突然変異が発生すると、短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫおよびＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫが形成される。

【0087】

治療方法
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原関連疾患を罹患した患者またはボランティアのＴ細胞を分離し、本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入した後、これらの遺伝子工学により修飾された細胞を患者の体内に再注入することにより治療を行うことができる。従い、本発明は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ関連疾患を治療する方法を提供し、分離された本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞（好ましくは、該Ｔ細胞は患者自身に由来する）を、患者の体内に注入することを含む。一般的には、（１）患者のＴ細胞を分離することと、（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードできる核酸分子を用いてＴ細胞をインビトロで形質導入することと、（３）遺伝子工学により修飾されたＴ細胞を患者の体内に注入することとを含む。分離、トランスフェクションおよび再注入する細胞の数は、医師によって決定され得る。

【0088】

本発明の主な利点は、以下のとおりである。

【0089】

（１）本発明のＴＣＲは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチド複合体ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１またはＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１に結合することができるとともに、本発明のＴＣＲを形質導入した細胞は、特異的に活性化され得る。

【0090】

（２）本発明のＴＣＲを形質導入する効果細胞は、標的細胞に対して良好な特異的殺傷作用を有する。

【0091】

以下の具体的な実施例は、本発明について更に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではないことが理解されるべきである。以下の実施例における具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、通常の条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローン：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、またはメーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量で計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、特に明記されない限り、市販から入手できる。

【0092】

実施例１ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的Ｔ細胞のクローン
合成された短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）（北京サイバーソン遺伝子技術有限公司）を利用して遺伝子型がＨＬＡ－Ａ１１０１である健康なボランティアに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激した。短いペプチドを、ビオチンマーカーを有するＨＬＡ－Ａ１１０１で再生し、ｐＨＬＡ半数体を調製した。これらの半数体は、ＰＥでマーカーされたストレプトアビジン（ＢＤ社）と組み合わせてＰＥでマーカーされた四量体を形成し、該四量体および抗ＣＤ８－ＡＰＣ二重陽性細胞を選別した。選別された細胞を増幅し、上記方法に従って二次選別を行い、その後、限界希釈法を使用して単一クローンを行った。モノクローナル細胞を四量体で染色し、スクリーニングされた二重陽性クローンは、図３に示すとおりであった。反復したスクリーニングにより得られた二重陽性クローンは、更なる機能テストを満たす必要があった。

【0093】

ＥＬＩＳＰＯＴ実験により、該Ｔ細胞のクローンの機能および特異性を更に検出した。当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を利用して細胞機能を検出する方法を良く知っている。本実施例のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用される効果細胞は、本発明で得られたＴ細胞のクローンであり、標的細胞は、本発明の短いペプチドを担持したＬＣＬｓ細胞であり、対照グループは、他の短いペプチドを担持したＬＣＬｓ細胞および任意の短いペプチドを担持していないＬＣＬｓ細胞であった。

【0094】

まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備し、ＥＬＩＳＰＯＴ実験のステップは以下のとおりであった。試験の各成分を、ＬＣＬｓ細胞２×１０⁴個／ウェル、Ｔ細胞のクローン２×１０³個／ウェルでＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、実験グループに２０μＬの特異的な短いペプチドを加え、対照グループに２０μＬの非特異的な短いペプチドを加え、ブランクグループに２０μＬの培地（試験培地）を加え、２つのデュープリケートウェルを設けた。その後、一晩インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ₂）。その後、プレートを洗浄して二次検出および発色を行い、プレートを１時間乾燥させ、また、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ社）を使用して膜に形成されたスポットを数えた。実験結果は、図１４に示すように、得られた特定の抗原特異的Ｔ細胞のクローンは、本発明の短いペプチドを担持したＬＣＬｓ細胞に対して著しい特異的反応を有し、他の無関連なペプチドを担持したおよび短いペプチドを担持していないＬＣＬｓ細胞に対してほぼ反応がなかった。

【0095】

実施例２ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的Ｔ細胞のクローンを取得するためのＴＣＲ遺伝子およびベクターの構築
Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ^TM ＭｉｎｉＰｒｅｐ（ＺＹＭＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して実施例１でスクリーニングされた抗原の短いペプチドの特異的な、ＨＬＡ－Ａ１１０１の制限的なＴ細胞のクローンの総ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成は、ｃｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを採用し、使用されたプライマーは、ヒトＴＣＲ遺伝子のＣ端保存領域で設計されるものであった。配列をＴベクター（ＴＡＫＡＲＡ）にクローンしてシーケンシングした。なお、該配列は、イントロンを含まない相補配列であった。シーケンシング後、該二重陽性クローンによって発現されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖の配列構造は、それぞれ図１および図２に示すとおりであり、図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆは、それぞれＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列、ＴＣＲのα鎖のヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列、およびリーダー配列を有するＴＣＲのα鎖のヌクレオチド配列であり、図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列、ＴＣＲのβ鎖のヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列、およびリーダー配列を有するＴＣＲのβ鎖のヌクレオチド配列であった。

【0096】

同定によると、α鎖は、
α ＣＤＲ１－ ＤＲＶＳＱＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、
α ＣＤＲ２－ ＩＹＳＮＧＤ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、
α ＣＤＲ３－ ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）というアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
β鎖は、
β ＣＤＲ１－ ＳＧＨＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）
β ＣＤＲ２－ ＦＱＮＥＡＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）
β ＣＤＲ３－ ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）というアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んだ。

【0097】

オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲにより、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の全長遺伝子をそれぞれレンチウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉ（ａｄｄｇｅｎｅ）にクローンした。具体的には、ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを用いてＴＣＲのα鎖およびＴＣＲのβ鎖の全長遺伝子を連結してＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβフラグメントを取得した。レンチウイルス発現ベクターおよびＴＣＲα－２Ａ－ＴＣＲβを酵素切断して連結し、ｐＬｅｎｔｉ－ＴＲＡ－２Ａ－ＴＲＢ－ＩＲＥＳ－ＮＧＦＲプラスミドを取得した。対照として、ｅＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ－ｅＧＦＰも同時に構築した。その後、２９３Ｔ／１７で偽ウイルスをパッケージした。

【0098】

実施例３ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的な可溶性ＴＣＲの発現、再折りたたみおよび精製
可溶性ＴＣＲ分子を取得するために、本発明のＴＣＲ分子のα鎖およびβ鎖は、それぞれその可変ドメインおよび一部の定常ドメインのみを含んでもよく、且つ、α鎖およびβ鎖の定常ドメインには、それぞれ１つのシステイン残基が導入されて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、システイン残基が導入された位置は、それぞれＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７であり、そのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図４ａおよび図４ｂに示すとおりであり、そのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図５ａおよび図５ｂに示すとおりであった。『分子クローン実験マニュアル』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）に記載された標準方法により、上記ＴＣＲα鎖およびβ鎖のターゲット遺伝子配列を合成してから、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入し、上流と下流のクローン部位は、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩであった。挿入されたフラグメントは、シーケンシングにより、誤りがないことが確認された。

【0099】

ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の発現ベクターを、それぞれ化学形質転換法により形質転換して発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に入れ、細菌をＬＢ培養液で成長させ、ＯＤ₆₀₀＝０．６時に最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖を発現した後に形成した封入体を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）により抽出し、且つ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液で複数回繰り返し洗浄し、最後に、封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．１）に溶解した。

【0100】

溶解後のＴＣＲのα鎖およびβ鎖を、１：１の質量比で５Ｍの尿素、０．４Ｍのアルギニン、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．１）、３．７ｍＭのｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．６ｍＭのβ－ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）にすばやく混合し、最終濃度が６０ｍｇ／ｍＬであった。混合後、溶液を１０倍体積の脱イオン水に入れて透析し（４℃）、１２時間後に脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）に変えて４℃で１２時間透析し続けた。透析が終了した後の溶液を０．４５μＭの濾過膜で濾過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、５ｍｌ、ｇＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。溶出されたピークに再生に成功したαおよびβ二量体が含まれるＴＣＲは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって確認された。その後、ＴＣＲは、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ ＨＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により更に精製された。精製後のＴＣＲの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで９０％よりも大きいと測定され、濃度はＢＣＡ法によって確定された。本発明により得られた可溶性ＴＣＲのＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲル図は、図６ａおよび図６ｂ示すとおりであった。

【0101】

実施例４ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲの生成
特許文献ＷＯ２０１４／２０６３０４に記載されたように、部位特異的突然変異の方法を利用し、実施例２におけるＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを、１つの柔軟な短いペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結された安定した可溶性一本鎖ＴＣＲ分子に構築した。該一本鎖ＴＣＲ分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図７ａおよび図７ｂに示すとおりであった。そのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図８ａおよび図８ｂに示すとおりであった。そのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図９ａおよび図９ｂに示すとおりであった。そのｌｉｎｋｅｒ配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図１０ａおよび図１０ｂに示すとおりであった。

【0102】

ターゲット遺伝子をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素切断し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで二重酵素切断されたｐＥＴ２８ａベクターに連結した。連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で転倒して一晩培養し、陽性クローンを選択してＰＣＲスクリーニングを行い、陽性組換え単位をシーケンシングし、配列が正しいことを確認した後、組換えプラスミドを抽出してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、発現に使用した。

【0103】

実施例５ ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲの発現、再生および精製
実施例４で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－テンプレート鎖を含む全てのＢＬ２１（ＤＥ ３）コロニーを、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、３７℃で４ｈ培養し続けた。５０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して細胞ペレットを回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを分解し、６０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離して封入体を回収し、更にＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、封入体を収集した。封入体を緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、８Ｍの尿素）に溶解し、高速で遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を捨ててＢＣＡ法で定量した後、分注して－８０℃で保存し、使用に備えた。

【0104】

溶解した５ｍｇの一本鎖ＴＣＲの封入体のタンパク質に、２．５ｍＬの緩衝液（６ＭのＧｕａ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、また、最終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴを加え、３７℃で３０ｍｉｎ処理した。注射器で１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、０．４ＭのＬ－アルギニン、５Ｍの尿素、２ｍＭのＥＤＴＡ、６．５ｍＭのβ－ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１．８７ｍＭのＣｙｓｔａｍｉｎｅ）に上記処理後の一本鎖ＴＣＲを滴下し、４℃で１０ｍｉｎ撹拌した後、再生溶液をカットオフが４ｋＤａであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを１Ｌの予冷水に入れ、４℃でゆっくりと一晩撹拌した。１７時間後、透析液を１Ｌの予冷した緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）に変え、４℃で８ｈ透析し続けた後、透析液を同じ新鮮な緩衝液に変えて一晩透析し続けた。１７時間後、サンプルを０．４５μｍの濾過膜で濾過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ｇＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で調製された０－１ＭのＮａＣｌ線形勾配溶出液でタンパク質を精製し、収集された溶出成分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、一本鎖ＴＣＲを含む成分を濃縮した後、更にゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００、ｇＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ターゲット成分もＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。

【0105】

ＢＩＡｃｏｒｅ分析用の溶出成分を、更にゲル濾過法でその純度を試験した。条件は以下のとおりであった。クロマトグラフィーカラムがＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－３（３００ Ａ、φ７．８×３００ｍＭ）で、移動相が１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液で、流速が０．５ｍＬ／ｍｉｎで、カラム温度が２５℃で、ＵＶ検出波長が２１４ｎｍである。

【0106】

本発明により得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル図は、図１１に示すとおりであった。

【0107】

実施例６ 結合の特徴付け
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
本実施例は、可溶性の本発明のＴＣＲ分子とＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体との特異的な結合の親和性を測定した。

【0108】

ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００リアルタイム分析システムを用いて実施例３および実施例５で得られたＴＣＲ分子とＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体との結合活性を検出した。抗ストレプトアビジンの抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７７）に加えた後、抗体を、事前にＥＤＣおよびＮＨＳで活性化されたＣＭ５チップに流させ、抗体をチップ表面に固定し、最後に、エタノールアミンの塩酸溶液を用いて反応してない活性化表面を密封し、カップリングプロセスを終了し、カップリングレベルが約１５０００ＲＵであった。

【0109】

低濃度のストレプトアビジンを抗体でコーティングされたチップ表面に流させた後、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体を検出通路に流させ、別の通路を参照通路とし、また、０．０５ｍＭのビオチンを１０μＬ／ｍｉｎの流速でチップに２ｍｉｎ流させ、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密封した。

【0110】

上記ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体の調製プロセスは、以下のとおりであった。

【0111】

ａ．精製
重鎖または軽鎖の発見を誘導する１００ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ菌液を収集し、８０００ｇ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離した後、１０ｍＬのＰＢＳで菌体を１回洗浄し、その後、５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で菌体を激しく振とうして再懸濁し、室温で回転させて２０ｍｉｎインキュベートした後、６０００ｇ、４℃で１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てて封入体を収集した。

【0112】

上記封入体を５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに再懸濁し、室温で回転させて５ｍｉｎインキュベートし、１０倍希釈したＢｕｇＢｕｓｔｅｒを３０ｍＬ加え、均一に混合させ、６０００ｇ、４℃で１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１０倍希釈したＢｕｇＢｕｓｔｅｒを３０ｍＬ加えて封入体を再懸濁し、均一に混合させ、６０００ｇ、４℃で１５ｍｉｎ遠心分離し、２回繰り返し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を３０ｍＬ加えて封入体を再懸濁し、均一に混合させ、６０００ｇ、４℃で１５ｍｉｎ遠心分離し、最後に、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ８Ｍの尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで封入体の純度を検出し、ＢＣＡキットで濃度を測定した。

【0113】

ｂ．再生
合成された短いペプチドＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（北京サイバーソン遺伝子技術有限公司）をＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。軽鎖および重鎖の封入体を８Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴで溶解し、再生前に３Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡを加えて更に変性した。ＶＶＧＡＶＧＶＧＫペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．３、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、５ｍＭの還元型グルタチオン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、４℃まで冷却した）に加えた後、２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖（最終濃度、重鎖を３回分けて加え、８ｈ／回）を順次加え、再生を４℃で少なくとも３日間行い、終了後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで再生に成功できるか否かを検出した。

【0114】

ｃ．再生後の精製
１０体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０を透析として用いて再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して溶液のイオン強度を十分に低減した。透析後、０．４５μｍの酢酸セルロース濾過膜でタンパク質溶液を濾過し、その後、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ）陰イオン交換カラム（５ｍＬのベッドボリューム）にロードした。Ａｋｔａ精製器（ＧＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ）を使用し、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０で調製された０－４００ｍＭのＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣは、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出され、各ピーク成分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を検出した。

【0115】

ｄ．ビオチン化
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限界濾過チューブで精製されたｐＭＨＣ分子を濃縮したとともに、緩衝液を２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０に置き換え、その後、ビオチン化試薬である０．０５ＭのＢｉｃｉｎｅ ｐＨ８．３、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＯＡｃ、５０μＭのＤ－Ｂｉｏｔｉｎ、１００μｇ／ｍｌのＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ－ＢｉｒＡ）を加え、室温で混合物を一晩インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでビオチン化が完全であるか否かを検出した。

【0116】

ｅ．ビオチン化後の複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限界濾過チューブでビオチン化によりマーカーされたｐＭＨＣ分子を１ｍＬに濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてビオチン化されたｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ）を使用し、濾過されたＰＢＳでＨｉＰｒｅｐ^TM １６／６０ Ｓ２００ ＨＲカラム（ＧＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＥＬＥＣＴＲＩＣ ＣＯＭＰＡＮＹ）を予め平衡化し、１ｍＬの濃縮されたビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードした後、ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出した。ビオチン化されたｐＭＨＣ分子は、約５５ｍＬ時に単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む成分を合わせ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限界濾過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、タンパク質酵素阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えてビオチン化されたｐＭＨＣ分子を分注し、－８０℃で保存した。

【0117】

ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて動力学パラメータを計算することにより得られた本発明の可溶性ＴＣＲ分子および本発明で構築された可溶性一本鎖ＴＣＲ分子と、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体との結合の動態学マップは、それぞれ図１２および図１３に示すとおりであった。マップによると、本発明で得られた可溶性ＴＣＲ分子および可溶性一本鎖ＴＣＲ分子の両方は、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に結合することができることを示した。それと同時に、更に上記方法を用いて本発明の可溶性のＴＣＲ分子と、他のいくつかの無関係な抗原の短いペプチドおよびＨＬＡ複合体との結合活性を検出し、結果によると、本発明のＴＣＲ分子が他の無関係な抗原に結合しなかったことを示した。

【0118】

実施例７ 本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞の活性化実験（標的細胞がＴ２である）
当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験で細胞機能を検出する方法をよく知っている。ＥＬＩＳＰＯＴ試験で検出されたＩＦＮ－γ生成量を、Ｔ細胞活性化の読み出し値とし、本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞の標的細胞特異性に対する活性化反応を証明した。

【0119】

まず、以下を含む試薬を準備した。
試験培地：１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１６０００－０４４）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、＃Ｃ１１８７５５００ＢＴ）、
洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）：０．０１ＭのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃Ｃ１００１０５００ＢＴ）／０．０５％、
Ｔｗｅｅｎ２０：ＰＶＤＦ ＥＬＩＳＰＯＴ ９６ウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＳＩＰＳ４５１０）、
ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ ＰＶＤＦ－酵素キット（ＢＤ）には、必要な他の全ての試薬（捕捉および検出抗体、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）が入っている。

【0120】

本実験で使用される標的細胞は、特異的な短いペプチドを担持しているＴ２細胞、非特異的な短いペプチドを担持しているＴ２細胞、短いペプチドを担持していないＴ２細胞であった。Ｔ２細胞は、ＨＬＡ－Ａ１１０１をトランスフェクションした。ここで、特異的な短いペプチドは、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、９ペプチド）およびＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、１０ペプチド）であり、非特異的な短いペプチドは、ＶＶＧＡＧＧＶＧＫ（突然変異が発生していないＫＲＡＳの短いペプチド）、ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ（突然変異が発生していないＫＲＡＳの短いペプチド）、ＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（ＫＲＡＳｇ１２Ｄ、１２番目は、他の突然変異したＫＲＡＳの短いペプチドである）、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（ＫＲＡＳｇ１２Ｄ、１２番目は、他の突然変異したＫＲＡＳの短いペプチドである）、およびＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ（他の抗原の短いペプチド）であった。

【0121】

本実験で使用される効果細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲを発現するＣＤ３⁺Ｔ細胞であり、同じボランティアの本発明のＴＣＲをトランスフェクションしていないＣＤ３⁺Ｔ細胞を対照グループとした。抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔ細胞増幅物、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＴ細胞を刺激し、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲ遺伝子を担持しているレンチウイルスで形質導入し、形質導入してからの９～１２日まで、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７を含む１０％のＦＢＳ含有の１６４０培地で増幅し、その後、これらの細胞を試験培地に入れ、３００ｇで常温にて１０分間遠心分離して洗浄した。その後、細胞を、所望の最終濃度の２倍で試験培地に再懸濁した。同様に、ネガティブコントロール効果細胞を処理した。その後、短いペプチドのＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートにおける最終濃度が１０^-6Ｍとなるように、対応する短いペプチドを加えた。

【0122】

製造業者により提供された説明書に従い、ウェルプレートを次のように準備した。抗ヒトＩＦＮ－γ捕捉抗体をプレートあたり１０ｍｌの滅菌ＰＢＳを用いて１：２００で希釈した後、１００μｌの希釈された捕捉抗体を各ウェルに均等に加えた。４℃でウェルプレートを一晩インキュベートした。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して過剰の捕捉抗体を除去した。１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地を１００μｌ／ウェルで加え、室温でウェルプレートを２時間インキュベートしてウェルプレートを密封した。その後、ウェルプレートから培地を洗い流し、紙上でＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートをフリックして軽くたたくことにより、任意の残りの洗浄緩衝液を除去した。その後、試験の各成分を、標的細胞２×１０⁴個／ウェル、効果細胞１×１０³個／ウェル（トランスフェクション陽性率で計算）でＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートに加え、２つのデュープリケートウェルを設けた。

【0123】

その後、ウェルプレートを一晩インキュベートし（３７℃／５％のＣＯ₂）、翌日、培地を捨て、再蒸留水でウェルプレートを２回洗浄し、更に洗浄緩衝液で３回洗浄し、ティッシュペーパーで軽くたたいて残りの洗浄緩衝液を除去した。その後、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳを用いて１：２００で検出抗体を希釈し、１００μｌ／ウェルで各ウェルに入れた。室温でウェルプレートを２時間インキュベートし、更に洗浄緩衝液で３回洗浄し、ティッシュペーパー上でウェルプレートを軽くたたいて過剰の洗浄緩衝液を除去した。１０％のＦＢＳを含むＰＢＳを用いて１：１００でストレプトアビジン－アルカリホスファターゼを希釈し、１００μｌの希釈されたストレプトアビジン－アルカリホスファターゼを各ウェルに入れ、室温でウェルプレートを１時間インキュベートした。その後、洗浄緩衝液で４回洗浄してＰＢＳで２回洗浄し、ティッシュペーパー上でウェルプレートを軽くたたいて過剰の洗浄緩衝液およびＰＢＳを除去した。洗浄終了後、キットにより提供されたＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を１００μｌ／ウェルで入れ現象した。現象期間中に、アルミホイルでウェルプレートを覆って遮光し、５～１５分間静置した。この期間中に、現象ウェルプレートのスポットを定常検出し、反応を終了する最適な時間を確認した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を除去して再蒸留水でウェルプレートを洗い流し、現象反応を停止し、スピンドライした後、ウェルプレートの底部を除去し、各ウェルが完全に乾くまでウェルプレートを室温で乾燥し、更に、イムノスポットプレートリーダー（ＣＴＬ、細胞技術有限公司（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ））を用いてウェルプレートの下地膜に形成されたスポットを数えた。

【0124】

ＥＬＩＳＰＯＴ実験（例えば、上記のように）により、標的細胞に反応する本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞のＩＦＮ－γ放出を検査した。ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ６を用いて各ウェル内で観察されたＥＬＳＰＯＴスポット数を描画した。

【0125】

実験結果は、図１５に示すように、本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞（効果細胞）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（９ペプチドおよび１０ペプチド）を担持している標的細胞に対していずれも良好な活性化反応を有し、突然変異が発生していない野生型のＫＲＡＳ（９ペプチドおよび１０ペプチド）、１２番目に他の突然変異が発生したＫＲＡＳｇ１２Ｄ（９ペプチドおよび１０ペプチド）、他の抗原の短いペプチドおよび担持していない標的細胞に対して、いずれも活性化反応がなかった。本発明のＴＣＲがＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（９ペプチドおよび１０ペプチド）に特異的に結合し、細胞活性化反応を起こすことができることを意味する。

【0126】

実施例８ 本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞の活性化実験（標的細胞が腫瘍細胞系である）
本実施例は、同様に、本発明の高親和性ＴＣＲをトランスフェクションする効果細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性化作用を有すること検証した。ＥＬＩＳＰＯＴ実験により、本発明の高親和性ＴＣＲの細胞内の機能および特異性を検出した。

【0127】

当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を用いて細胞機能を検出する方法を良く知っている。使用した効果細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲをトランスフェクションするＣＤ３⁺Ｔ細胞であり、同じボランティアの本発明のＴＣＲをトランスフェクションしていないＣＤ３⁺Ｔ細胞を対照グループとした。標的細胞系は、Ａ５６２－Ａ１１－ＴＭＧ１（Ａ１１およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ過発現）、Ａ５６２－Ａ１１（Ａ１１過発現）、Ａ５６２－Ａ１１－ＴＭＧ２（Ａ１１およびＫＲＡＳｇ１２Ｄ過発現）、ＳＫ－ＭＥＬ－１、ＳＷ６２０－Ａ１１（Ａ１１過発現）、およびＳＷ６２０細胞であった。ここで、対照として、標的細胞系Ａ５６２－Ａ１１－ＴＭＧ１およびＳＷ６２０－Ａ１１を陽性腫瘍細胞系とし、Ａ５６２－Ａ１１、Ａ５６２－Ａ１１－ＴＭＧ２、ＳＫ－ＭＥＬ－１およびＳＷ６２０を陰性腫瘍細胞系とした。

【0128】

まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化してコーティングし、４℃で一晩置いた。実験の初日、コーティング液を除去し、洗浄して密封し、室温で２時間インキュベートし、ブロッキング液を除去し、試験の各成分を、標的細胞２×１０⁴個／ウェル、効果細胞１０³個／ウェル（トランスフェクションの陽性率で計算した）でＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、２つのデュープリケートウェルを設けた。一晩インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ₂）。実験の翌日、プレートを洗浄して二次検出および発色を行い、プレートを乾燥し、更に、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０社）で膜に形成されたスポットを数えた。

【0129】

実験結果は、図１６に示すように、陽性標的細胞系に対し、本発明のＴＣＲをトランスフェクションした効果細胞は、良好な特異的活性化作用を果たし、陰性標的細胞系に反応しなかった。また、標的細胞に対し、他のＴＣＲを形質導入する効果細胞は、ほぼ活性化作用を果たしなかった。

【0130】

実施例９．本発明のＴＣＲをトランスフェクションする効果細胞のＬＤＨ殺傷機能実験
本実施例は、非放射性細胞毒性実験により、ＬＤＨの放出を測定し、本発明のＴＣＲを形質導入する細胞の殺傷機能を検証した。該試験は、５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験であり、細胞分解後に放出されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定した。３０分間カップリングした酵素反応で培地に放出されたＬＤＨを検出し、酵素反応で、ＬＤＨは、テトラゾール塩（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に形質転換することができた。生成された赤色の生成物の量は分解した細胞数に比例した。標準の９６ウェルのプレートリーダーで４９０ｎｍ可視光の吸光値データを収集した。

【0131】

当業者は、ＬＤＨの放出実験を用いて細胞機能を検出する方法をよく知っている。使用した効果細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＫＲＡＳＴＣＲをトランスフェクションするＣＤ３⁺Ｔ細胞であり、同じボランティアの本発明をトランスフェクションしていないＴＣＲのＣＤ３⁺Ｔ細胞を対照グループとした。標的細胞系は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（９ペプチド）ＶＶＧＡＶＧＶＧＫを担持しているＴ２－Ａ１１（Ａ１１過発現）、_T2-A11（Ａ１１過発現）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＳＷ６２０－Ａ１１（Ａ１１過発現）、ＳＷ６２０、およびＳＷ４８０－Ａ１１（Ａ１１過発現）細胞であった。ここで、対照として、ＶＶＧＡＶＧＶＧＫを担持している短いペプチドのＴ２－Ａ１１、ＳＷ６２０－Ａ１１およびＳＷ４８０－Ａ１１は陽性腫瘍細胞系であり、Ｔ２－Ａ１１、ＳＫ－ＭＥＬ－２８およびＳＷ６２０は陰性腫瘍細胞系であった。

【0132】

まず、ＬＤＨプレートを準備した。実験の初日、試験の各成分を、標的細胞系の細胞３×１０⁴個／ウェル、効果細胞３×１０⁴個／ウェルでプレートに加え、３つのデュープリケートウェルを設けた。それと同時に、効果細胞自発ウェル、標的細胞自発ウェル、標的細胞最大ウェル、体積校正対照ウェル、および培地背景対照ウェルを設けた。一晩インキュベートした（３７℃、５％のＣＯ₂）。実験の翌日、発色を検出し、反応を終了した後、プレートリーダ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）で４９０ｎｍにて吸光値を記録した。

【0133】

実験結果は図１７に示すように、陽性標的細胞系に対し、本発明のＴＣＲを形質導入する効果細胞は、それに対して強い殺傷作用を有したが、陰性標的細胞に対して殺傷作用がなかった。また、他のＴＣＲを形質導入する効果細胞は、標的細胞に対してほぼ殺傷作用がなかった。

【0134】

本発明で言及されたすべての文献は、各文書が個別に参照として引用されるように、いずれも本願で参照として引用される。更に、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は本発明に対して様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、同様に本願の添付の特許請求の範囲によって限定された範囲に含まれることが理解されるべきである

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2022551514000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-04-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体に特異的に結合でき、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）であり、
好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α ＣＤＲ１－ ＤＲＶＳＱＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）、
α ＣＤＲ２－ ＩＹＳＮＧＤ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、
α ＣＤＲ３－ ＡＳＬＫＧＮＮＤＭＲ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）であり、および／または
前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１－ ＳＧＨＶＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、
β ＣＤＲ２－ ＦＱＮＥＡＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、
β ＣＤＲ３－ ＡＳＳＳＳＲＷＥＱＱＦ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）である、
ことを特徴とするＴ細胞受容体ＴＣＲ。

【請求項2】

ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとＴＣＲのβ鎖の可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項3】

前記ＴＣＲは、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ－ＨＬＡ Ａ１１０１複合体にも特異的に結合でき、
好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含み、および／または
前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項4】

前記ＴＣＲはαβヘテロ二量体であり、ＴＣＲのα鎖の定常ドメインＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲのβ鎖の定常ドメインＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含み、
好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項5】

前記ＴＣＲは可溶であり、
好ましくは、前記ＴＣＲは一本鎖であり、
好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインとβ鎖の可変ドメインとをペプチド連結配列を介して連結してなり、
好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはα鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、または最後から７番目に１つまたは複数の突然変異があり、および／または前記ＴＣＲは、β鎖の可変ドメインのアミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目、および／またはβ鎖のＪ遺伝子の短いペプチドのアミノ酸の最後から２番目、最後から４番目、または最後から６番目に１つまたは複数の突然変異があり、アミノ酸位置の番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）に記載された位置番号に従い、
好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４を含み、
より好ましくは、前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０である、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。

【請求項6】

前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのα鎖、および（ｂ）膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のＴＣＲのβ鎖を含み、
且つ、（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能性可変ドメインを含むか、または機能性可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ鎖の定常ドメインの少なくとも一部を更に含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項7】

システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖の定常ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成し、
好ましくは、前記ＴＣＲで人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換し、
より好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項8】

前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖の定常ドメインとの間に、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれ、
好ましくは、前記ＴＣＲで人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
から選ばれる１群または複数群の部位を置換し、
より好ましくは、前記ＴＣＲは、α鎖の可変ドメイン、β鎖の可変ドメイン、および膜貫通ドメイン以外の全てまたは一部のβ鎖の定常ドメインを含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成する、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項9】

前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ－末端またはＮ－末端にコンジュゲートが結合され、
好ましくは、前記Ｔ細胞受容体に結合されたコンジュゲートは、検出可能マーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分、またはこれらの物質の任意の組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は抗－ＣＤ３抗体である、
ことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項10】

少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、且つ、そのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子は、上記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲである、
ことを特徴とする多価ＴＣＲ複合体。

【請求項11】

上記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含み、
好ましくは、ＴＣＲのα鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３を含み、
好ましくは、ＴＣＲのβ鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５を含み、
より好ましくは、ＴＣＲのα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４および／またはＴＣＲのβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８を含む、
ことを特徴とする核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸分子を含み、好ましくは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、レンチウイルスベクターである、
ことを特徴とするベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載のベクターが含まれ、または染色体に外因性の請求項１１に記載の核酸分子が組み込まれている、
ことを特徴とする分離された宿主細胞。

【請求項14】

請求項１１に記載の核酸分子または請求項１２に記載のベクターが形質導入され、好ましくは、Ｔ細胞または幹細胞である、
ことを特徴とする細胞。

【請求項15】

医薬的に許容されるベクターおよび請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１０に記載のＴＣＲ複合体、または請求項１４に記載の細胞を含む、
ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項16】

請求項１から９のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体または請求項１０に記載のＴＣＲ複合体または請求項１４に記載の細胞を用いて、腫瘍または自己免疫疾患を治療するための薬剤であって、
好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、または胃癌である、
ことを特徴とする薬剤。

【国際調査報告】