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特表2022-551688ｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異及びメチル化の検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-13
(54)【発明の名称】ｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異及びメチル化の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20221206BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20221206BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20221206BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20221206BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20221206BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221206BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20221206BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12Q1/6806 Z
C40B40/06
C12N15/09 Z
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022521219
(86)(22)【出願日】2020-10-13
(85)【翻訳文提出日】2022-05-25
(86)【国際出願番号】 CN2020120560
(87)【国際公開番号】W WO2021073490
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】201910983038.8
(32)【優先日】2019-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520426298
【氏名又は名称】中国医学科学院腫瘤医院
(71)【出願人】
【識別番号】519350421
【氏名又は名称】北京泛生子基因科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＴＲＯＮ ＨＥＡＬＴＨ （ＢＥＩＪＩＮＧ） ＣＯ， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ２０１，２／Ｆ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １１， Ｚｏｎｅ １， Ｎｏ．８ Ｌｉｆｅ Ｐａｒｋ Ｒｏａｄ， Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｈｕｉｌｏｎｇｇｕａｎ Ｔｏｗｎ，Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】焦宇辰
(72)【発明者】
【氏名】曲春楓
(72)【発明者】
【氏名】王宇▲てぃん▼
(72)【発明者】
【氏名】王沛
(72)【発明者】
【氏名】陳坤
(72)【発明者】
【氏名】宋欠欠
(72)【発明者】
【氏名】劉慧
(72)【発明者】
【氏名】王京京
(72)【発明者】
【氏名】王思振
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR72
4B063QS25
4B063QS28
(57)【要約】
本発明は、ｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異及びメチル化の検出方法を開示し、前記方法は、１つのサンプルにおいてｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異（点突然変異、インデル突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの複数種の突然変異の形態を含む）及び／又はメチル化を同時に検出し得る方法であり、サンプルの使用量が少ないだけでなく、該方法で製造されたＭＣライブラリが１０－２０回の後続の検出をサポートすることができ、感度及び特異性を低下させることなく、いずれかの検出結果によっても全ての元のｃｔＤＮＡ標本の突然変異及び酵素切断部位がカバーする領域のメチル化修飾を反映することができる。本発明は、腫瘍早期スクリーニング、病状追跡、有効性評価、予後予測などに対して臨床的に重要であり、応用の価値が高い。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シーケンシングライブラリの構築方法であって、ＤＮＡサンプルを用意して、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで酵素切断するステップ（１）と、
ステップ（１）で酵素切断したＤＮＡサンプルに対して末端修復及び３’末端Ａテーリングを順次行うステップ（２）と、
ステップ（２）で処理されたＤＮＡサンプルとリンカー混合物内のリンカーとを連結し、ＰＣＲ増幅を行い、ライブラリを得るステップ（３）とを順次含み、
前記リンカー混合物はｎ個のリンカーからなり、
各リンカーは、１本の上流プライマーＡと１本の下流プライマーＡによって部分二本鎖構造が形成されたものであり、上流プライマーＡには、シーケンシングリンカーＡ、ランダムタグ、アンカー配列Ａ及び末端に位置する塩基Ｔがあり、下流プライマーＡには、アンカー配列Ｂ及びシーケンシングリンカーＢがあり、前記部分二本鎖構造はアンカー配列Ａとアンカー配列Ｂが逆相補したものであり、
前記シーケンシングリンカーＡ及びシーケンシングリンカーＢは、シーケンシングプラットフォームに応じて選択した、対応するシーケンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは８－１４ｂｐのランダム塩基であり、
前記アンカー配列Ａは、長さ１２－２０ｂｐであり、連続反復塩基が３個以下であり、
ｎ個のリンカーはｎ個の異なるアンカー配列Ａを使用し、且つアンカー配列Ａごとに４種類の塩基がバランスを取り、ミスマッチ塩基数が３以上であり、
ｎは８以上の任意の自然数である、構築方法。
【請求項2】
前記上流プライマーＡは、５’末端から、前記シーケンシングリンカーＡ、前記ランダムタグ、前記アンカー配列Ａ、及び前記塩基Ｔをこの順で含み、前記下流プライマーＡは、５’末端から、前記アンカー配列Ｂ及び前記シーケンシングリンカーＢをこの順で含む、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項3】
前記ミスマッチ塩基数が３以上であるとは、前記リンカー混合物がｎ個のアンカー配列Ａを含み、アンカー配列Ａ同士で塩基が少なくとも３つ相違することを意味し、前記相違は、位置の相違又は順番の相違である、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項4】
前記ＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｔ ＤＮＡ又はｃｆ ＤＮＡサンプルである、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法により構築されたＤＮＡライブラリ。
【請求項6】
シーケンシングライブラリを構築するためのキットであって、請求項１～４中に記載のリンカー混合物と、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼとを含むキット。
【請求項7】
ＤＮＡサンプル中の腫瘍突然変異及び／又はメチル化を検出するためのキットであって、請求項１～４に記載の前記リンカー混合物と、プライマーの組み合わせとを含み、前記プライマーの組み合わせは、プライマーセットＩ、プライマーセットＩＩ、プライマーセットＩＩＩ、プライマーセットＩＶ、プライマーセットＶ、プライマーセットＶＩ、プライマーセットＶＩＩ、及びプライマーセットＶＩＩＩを含み、前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩ内の各プライマーは、腫瘍突然変異に関連する領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩは、それぞれＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖の突然変異部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶ内の各プライマーは、腫瘍特異的高メチル化領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶは、それぞれＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖のメチル化部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＶ、前記プライマーセットＶＩ、前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＶＩＩＩ内の各プライマーは、リンカー配列と特異的配列を含み、特異的配列は対象領域のさらなる濃縮に用いられ、
前記プライマーセットＶ及び前記プライマーセットＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩ及び前記プライマーセットＩＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＩＩＩにおいて、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶ中、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にある、キット。
【請求項8】
前記腫瘍は肝臓悪性腫瘍である、ことを特徴とする請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記プライマーセットＩは７８個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７８個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列２８～配列１０５で示され、前記プライマーセットＩＩは、８２個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、８２個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列１０６～配列１８７で示され、
前記プライマーセットＩＩＩは、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列１８８～配列２０１で示され、
前記プライマーセットＩＶは、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列２０２～配列２１６で示され、
前記プライマーセットＶは、７５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７５個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列２２０～配列２９４のような、５’末端からの１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列を順次含み、
前記プライマーセットＶＩは、７９個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７９個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列２９５～配列３７３のような、５’末端からの１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列を順次含み、
前記プライマーセットＶＩＩは、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列３７４～配列３８７のような、５’末端からの１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列を順次含み、
前記プライマーセットＶＩＩＩは、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列３８８～配列４０２のような、５’末端からの１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列を順次含む、ことを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項10】
請求項７～９のいずれか１項に記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項11】
以下のＳ１）又はＳ２）又はＳ３）：Ｓ１）ＤＮＡサンプル中の腫瘍突然変異及び／又はメチル化を検出するキットの製造における請求項７～９のいずれか１項に記載のプライマーの組み合わせの使用、
Ｓ２）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における、請求項７～９のいずれか１項に記載のプライマーの組み合わせの使用、
Ｓ３）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における、請求項７～９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項12】
ＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の検出方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたライブラリに対してネストＰＣＲ増幅を２回行い、生成物についてシーケンシングを行い、シーケンシング結果からＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップ（２）と、を含み、
前記ステップ（２）において、プライマーの組み合わせＡを用いて１回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＡは、上流プライマーＡと下流プライマーの組み合わせＡとからなり、
前記上流プライマーＡはステップ（１）のライブラリ増幅用のライブラリ増幅プライマーであり、
前記下流プライマーの組み合わせＡは、Ｘ個の対象標的に応じて設計されたＹ本のプライマーの組み合わせであり、Ｘ及びＹはいずれも１以上の自然数であり、且つＸ≦Ｙであり、
１回目のＰＣＲの生成物をテンプレートとして、プライマーの組み合わせＢを用いて２回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＢは、上流プライマーＢと、下流プライマーの組み合わせＢと、ｉｎｄｅｘプライマーとからなり、
前記上流プライマーＢは、ライブラリ増幅プライマーであり、且つ３’末端が前記上流プライマーＡと部分的に同一であり、１回目のＰＣＲの生成物の増幅に用いられ、
前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、シーケンシング用のセグメントＡ、サンプルを区別するｉｎｄｅｘ配列、及びシーケンシング用のセグメントＢを含み、
前記下流プライマーの組み合わせＢにおけるプライマーは、前記セグメントＢを有し、且つ下流プライマーの組み合わせＡにおいて同一対象標的が検出されたプライマーと「ネスト」関係になる、検出方法。
【請求項13】
前記ＤＮＡサンプル中の標的突然変異の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、１つの突然変異が、（ａ１）少なくとも一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は
（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていること
を満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であることを同時に満たすこと
であり、
基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあること
を同時に満たすことであり、
前記ＤＮＡサンプル中のメチル化の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、
基準Ｃは、
７．ランダムタグ配列が同一であること、
８．アンカー配列が同一であること、
９．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＤＮＡサンプル中の複数の標的突然変異及び／又はメチル化の検出方法であって、（１）請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップと、
（２）ステップ（１）のライブラリについて標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、シーケンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップとを含む、検出方法。
【請求項15】
前記ＤＮＡサンプル中の標的突然変異の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、１つの突然変異が、（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は
（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていること
を満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、
基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たし、
基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあること
を同時に満たし、
前記ＤＮＡサンプル中のメチル化の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により、対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、
基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること
を同時に満たすことである、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の分野に属し、特に、ｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異及びメチル化の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）は、腫瘍細胞のアポトーシス、壊死又は分泌によって生成されたＤＮＡ断片に由来し、腫瘍組織ＤＮＡと同一の遺伝子変異及び見かけ上の修飾、例えば点突然変異、遺伝子再配列、融合、コピー数の変異、メチル化修飾などを含む。ｃｔＤＮＡの検出はがんの早期スクリーニング、診断やステージ分類、標的薬の指導、有効性の評価、再発のモニタリングなどの各方面に応用することができる。ｃｔＤＮＡが持っている腫瘍特異遺伝子の変異とメチル化の両方の情報の組み合わせは、検出の感度及び特異性を高めることに役立ち、もっと早くがんを発見し、腫瘍の早期スクリーニングに重要な意義がある。
【0003】
既存の遺伝子変異検出とメチル化検出は技術手段が異なる。ｃｔＤＮＡ遺伝子変異の検出は、ｃｆＤＮＡに占めるｃｔＤＮＡの割合が低いという制限のため、実質的には低頻度突然変異の検出であり、従来技術は、２種類に分けられている：
１）ＰＣＲに基づくホットスポット突然変異の検出法では、通常１つ又は複数のホットスポット突然変異又は既知の突然変異を検出できるが、遺伝子融合などの複雑な突然変異や未知の突然変異を検出することができず、カバー範囲が比較的小さい。
２）キャプチャーシーケンシング：複雑な突然変異を含む多重標的の検出に適しているが、キャプチャーキットは一般的に高価で、操作が複雑で、時間がかかる。使用の際には、標的の数及び特性に基づいて、適切な検出方法を選択する必要がある。ｃｔＤＮＡメチル化マーカーの利点は、クラスターとして分布し、遺伝子変異よりも特異性が高く、組織特異性があり、腫瘍の由来を追跡することができ、マーカーの数が多く、より高い感度を実現することにあり、その検出方法には以下の方法がある：
１）メチル化ＰＣＲであって、重亜硫酸塩による変換ステップによるＤＮＡ損失及び配列多様性の低下により、この方法は多重標的検出を実現しにくい。
２）プローブハイブリダイゼーションに基づくメチル化キャプチャー：８％－１３％のＣｐＧ部位をカバーでき、同時に大量のマーカーを検出できるが、ｃｔＤＮＡの開始量が限られ、しかも重亜硫酸塩処理後、ゲノム配列の豊富度は低下し、このため、プローブの特異性は保証しにくい。
３）ＭｓｐＩ酵素切断によるＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＲＲＢＳ）であって、対象となるＣｐＧ部位は酵素切断部位「ＣＣＧＧ」によって決定され、約８－１０％のＣｐＧ部位を占め、メチル化Ｃ塩基の認識も重亜硫酸塩による変換に依存する。ＲＲＢＳで検出されるメチル化部位はＣｐＧアイランドとプロモーター領域に集中しており、低コストである。上記の３種類の方法はメチル化ＰＣＲのカバー部位が限られており、メチル化キャプチャは、より多くの部位をカバーすることができ、ＲＲＢＳデータよりも安定し、ＲＲＢＳは最もコストが低く、多数のメチル化部位をカバーすることも可能であり、使用の際には、標的の数及び特性に基づいて選択すべきである。
１）ＰＣＲに基づくホットスポット突然変異の検出法では、通常１つ又は複数のホットスポット突然変異又は既知の突然変異を検出できるが、遺伝子融合などの複雑な突然変異や未知の突然変異を検出することができず、カバー範囲が比較的小さい。
２）キャプチャーシーケンシング：複雑な突然変異を含む多重標的の検出に適しているが、キャプチャーキットは一般的に高価で、操作が複雑で、時間がかかる。使用の際には、標的の数及び特性に基づいて、適切な検出方法を選択する必要がある。ｃｔＤＮＡメチル化マーカーの利点は、クラスターとして分布し、遺伝子変異よりも特異性が高く、組織特異性があり、腫瘍の由来を追跡することができ、マーカーの数が多く、より高い感度を実現することにあり、その検出方法には以下の方法がある：
１）メチル化ＰＣＲであって、重亜硫酸塩による変換ステップによるＤＮＡ損失及び配列多様性の低下により、この方法は多重標的検出を実現しにくい。
２）プローブハイブリダイゼーションに基づくメチル化キャプチャー：８％－１３％のＣｐＧ部位をカバーでき、同時に大量のマーカーを検出できるが、ｃｔＤＮＡの開始量が限られ、しかも重亜硫酸塩処理後、ゲノム配列の豊富度は低下し、このため、プローブの特異性は保証しにくい。
３）ＭｓｐＩ酵素切断によるＲＲＢＳ（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＲＲＢＳ）であって、対象となるＣｐＧ部位は酵素切断部位「ＣＣＧＧ」によって決定され、約８－１０％のＣｐＧ部位を占め、メチル化Ｃ塩基の認識も重亜硫酸塩による変換に依存する。ＲＲＢＳで検出されるメチル化部位はＣｐＧアイランドとプロモーター領域に集中しており、低コストである。上記の３種類の方法はメチル化ＰＣＲのカバー部位が限られており、メチル化キャプチャは、より多くの部位をカバーすることができ、ＲＲＢＳデータよりも安定し、ＲＲＢＳは最もコストが低く、多数のメチル化部位をカバーすることも可能であり、使用の際には、標的の数及び特性に基づいて選択すべきである。
【0004】
現在、ｃｔＤＮＡ中の遺伝子変異とメチル化という２種の重要な腫瘍特異的マーカーの同時検出を実現する簡単、低コスト、信頼性の高い手段はない。主な課題は次のとおりである。
１）一回の採血で取得したｃｔＤＮＡサンプルの量は限られており、通常は１－２回の検出しかサポートできないため、ｃｔＤＮＡ臨床検出中は通常単一プラットフォーム、使い捨てであり、１つのサンプルを用いて突然変異検出とメチル化検出を同時に行うことが困難であり、特に重亜硫酸塩による変換に基づくメチル化検出技術では、処理中に多くのＤＮＡ損失をもたらす。
２）メチル化検出技術の重亜硫酸塩による変換ステップにより、ＤＮＡ配列の大部分の突然変異情報を提示できないことになり、この部分のＤＮＡに含まれる情報の損失は低頻度突然変異検出感度の低下につながる可能性がある。
３）臨床検出では、よく最初の検出結果に基づいて後続検出の目的や計画を判断する必要があり、このため、後続検出中に再採血する必要があり、結果として、検出周期が長くなる。また、ｃｔＤＮＡ関連の臨床検出や研究には多種の技術の優劣を比較する必要がよくあり、これは、数倍の正常採血量の標本が必要とされ、患者は通常受け入れられない。
４）ＰＣＲ法であっても、キャプチャー法であっても、増幅過程中に発生した騒音突然変異はｃｔＤＮＡ低頻度突然変異の検出を深刻に妨害し、偽陽性結果をもたらし、患者の診断や治療を誤認させる。
５）ｃｔＤＮＡ突然変異の含有量が低く、操作過程中に汚染が発生しやすく、偽陽性結果をもたらす。
１）一回の採血で取得したｃｔＤＮＡサンプルの量は限られており、通常は１－２回の検出しかサポートできないため、ｃｔＤＮＡ臨床検出中は通常単一プラットフォーム、使い捨てであり、１つのサンプルを用いて突然変異検出とメチル化検出を同時に行うことが困難であり、特に重亜硫酸塩による変換に基づくメチル化検出技術では、処理中に多くのＤＮＡ損失をもたらす。
２）メチル化検出技術の重亜硫酸塩による変換ステップにより、ＤＮＡ配列の大部分の突然変異情報を提示できないことになり、この部分のＤＮＡに含まれる情報の損失は低頻度突然変異検出感度の低下につながる可能性がある。
３）臨床検出では、よく最初の検出結果に基づいて後続検出の目的や計画を判断する必要があり、このため、後続検出中に再採血する必要があり、結果として、検出周期が長くなる。また、ｃｔＤＮＡ関連の臨床検出や研究には多種の技術の優劣を比較する必要がよくあり、これは、数倍の正常採血量の標本が必要とされ、患者は通常受け入れられない。
４）ＰＣＲ法であっても、キャプチャー法であっても、増幅過程中に発生した騒音突然変異はｃｔＤＮＡ低頻度突然変異の検出を深刻に妨害し、偽陽性結果をもたらし、患者の診断や治療を誤認させる。
５）ｃｔＤＮＡ突然変異の含有量が低く、操作過程中に汚染が発生しやすく、偽陽性結果をもたらす。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、ｃｔＤＮＡ中の複数種の腫瘍特異的遺伝子の変異及び／又はメチル化を同時に検出することである。
【0006】
まず、本発明は、シーケンシングライブラリの構築方法であって、
ＤＮＡサンプルを用意して、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで酵素切断するステップ（１）と、
ステップ（１）で酵素切断したＤＮＡサンプルに対して末端修復及び３’末端Ａテーリングを順次行うステップ（２）と、
ステップ（２）で処理されたＤＮＡサンプルとリンカー混合物内のリンカーとを連結し、ＰＣＲ増幅を行い、ライブラリを得るステップ（３）とを順次含み、
前記リンカー混合物はｎ個のリンカーからなり、
各リンカーは、１本の上流プライマーＡと１本の下流プライマーＡによって部分二本鎖構造が形成されたものであり、上流プライマーＡには、シーケンシングリンカーＡ、ランダムタグ、アンカー配列Ａ及び末端（例えば３’末端）に位置する塩基Ｔがあり、下流プライマーＡには、アンカー配列Ｂ及びシーケンシングリンカーＢがあり、前記部分二本鎖構造はアンカー配列Ａとアンカー配列Ｂが逆相補したものであり、
前記シーケンシングリンカーＡ及びシーケンシングリンカーＢは、様々なシーケンシングプラットフォームに応じて選択したシーケンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは８－１４ｂｐ（例えば８－１０ｂｐ、１０－１４ｂｐ、８ｂｐ、１０ｂｐ又は１４ｂｐ）のランダム塩基であり、
前記アンカー配列Ａは、長さ１２－２０ｂｐ（例えば１２－１６ｂｐ、１６－２０ｂｐ、１２ｂｐ、１６ｂｐ又は２０ｂｐ）であり、連続反復塩基が３個以下であり、
ｎ個のリンカーは、ｎ個の異なるアンカー配列Ａを使用し、且つアンカー配列Ａごとに４種類の塩基がバランスを取り、ミスマッチ塩基数が３以上であり、
ｎは８以上の任意の自然数である、
シーケンシングライブラリの構築方法に関する。
ＤＮＡサンプルを用意して、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで酵素切断するステップ（１）と、
ステップ（１）で酵素切断したＤＮＡサンプルに対して末端修復及び３’末端Ａテーリングを順次行うステップ（２）と、
ステップ（２）で処理されたＤＮＡサンプルとリンカー混合物内のリンカーとを連結し、ＰＣＲ増幅を行い、ライブラリを得るステップ（３）とを順次含み、
前記リンカー混合物はｎ個のリンカーからなり、
各リンカーは、１本の上流プライマーＡと１本の下流プライマーＡによって部分二本鎖構造が形成されたものであり、上流プライマーＡには、シーケンシングリンカーＡ、ランダムタグ、アンカー配列Ａ及び末端（例えば３’末端）に位置する塩基Ｔがあり、下流プライマーＡには、アンカー配列Ｂ及びシーケンシングリンカーＢがあり、前記部分二本鎖構造はアンカー配列Ａとアンカー配列Ｂが逆相補したものであり、
前記シーケンシングリンカーＡ及びシーケンシングリンカーＢは、様々なシーケンシングプラットフォームに応じて選択したシーケンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは８－１４ｂｐ（例えば８－１０ｂｐ、１０－１４ｂｐ、８ｂｐ、１０ｂｐ又は１４ｂｐ）のランダム塩基であり、
前記アンカー配列Ａは、長さ１２－２０ｂｐ（例えば１２－１６ｂｐ、１６－２０ｂｐ、１２ｂｐ、１６ｂｐ又は２０ｂｐ）であり、連続反復塩基が３個以下であり、
ｎ個のリンカーは、ｎ個の異なるアンカー配列Ａを使用し、且つアンカー配列Ａごとに４種類の塩基がバランスを取り、ミスマッチ塩基数が３以上であり、
ｎは８以上の任意の自然数である、
シーケンシングライブラリの構築方法に関する。
【0007】
通常、プライマー構築用のリンカーは２本の配列をアニーリングしたものであり、「Ｙ」字形の構造を有し、２本の配列のうち相補的にペアリングした部分（即ち、アンカー配列Ａ及びアンカー配列Ｂ）はアンカー配列と呼ばれる。前記アンカー配列は配列の固定した組み込みタグとして、元のテンプレート分子をマークすることに用いられる。
【0008】
前記アンカー配列はプライマーの他の部分と相互作用（例えばヘアピン構造、二量体の形成など）しない。
【0009】
前記上流プライマーＡは、５’末端から、シーケンシングリンカーＡ、ランダムタグ、アンカー配列Ａ及び塩基Ｔをこの順で含んでもよい。
【0010】
前記上流プライマーＡは、５’末端から、シーケンシングリンカーＡ、ランダムタグ、アンカー配列Ａ及び塩基Ｔによってこの順で構成される。
【0011】
前記下流プライマーＡは、５’末端から、アンカー配列Ｂ及びシーケンシングリンカーＢをこの順で含んでもよい。
【0012】
前記下流プライマーＡは、５’末端から、アンカー配列Ｂ及びシーケンシングリンカーＢによってこの順で構成される。
【0013】
前記「各アンカー配列Ａには、４種類の塩基がバランスを取る」とは、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧが均一に分布していることを指す。
【0014】
前記「ミスマッチ塩基数が３以上である」は、前記リンカー混合物がｎ個のアンカー配列Ａを含み、アンカー配列Ａ同士で塩基が少なくとも３個相違していることであってもよい。該相違は、位置の相違又は順番の相違であってもよい。
【0015】
前記ＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｔ ＤＮＡ又はｃｆ ＤＮＡサンプルであってもよい。
【0016】
前記ｎは、特に１２である。
【0017】
前記ランダムタグは、特に８ｂｐのランダム塩基であってもよい。
【0018】
前記アンカー配列Ａの長さは、特に１２ｂｐであってもよい。
【0019】
ｎ＝１２の場合、前記アンカー配列Ａのヌクレオチド配列は、特に、それぞれ、配列表の配列１の５’末端から３０－４１位、配列表の配列３の５’末端から３０－４１位、配列表の配列５の５’末端から３０－４１位、配列表の配列７の５’末端から３０－４１位、配列表の配列９の５’末端から３０－４１位、配列表の配列１１の５’末端から３０－４１位、配列表の配列１３の５’末端から３０－４１位、配列表の配列１５の５’末端から３０－４１位、配列表の配列１７の５’末端から３０－４１位、配列表の配列１９の５’末端から３０－４１位、配列表の配列２１の５’末端から３０－４１位、配列表の配列２３の５’末端から３０－４１位で示されてもよい。
【0020】
前記シーケンシングリンカーＡは、特に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社からのＴｒｕｓｅｑシーケンシングキットのシーケンシングリンカーであってもよい。前記シーケンシングリンカーＡは、特に、配列表の配列１の５’末端から１－２９位で示されてもよい。
【0021】
前記シーケンシングリンカーＢは、特に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社からのｎｅｘｔｅｒａシーケンシングキット的シーケンシングリンカーであってもよい。前記シーケンシングリンカーＢは、特に、配列表の配列２の５’末端から１３－４１位で示されてもよい。
【0022】
ｎ＝１２の場合、前記１２個のリンカーは以下のとおりである。
リンカー１は、配列表の配列１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー２は、配列表の配列３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー３は、配列表の配列５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列６で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー４は、配列表の配列７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列８で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー５は、配列表の配列９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１０で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー６は、配列表の配列１１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー７は、配列表の配列１３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー８は、配列表の配列１５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１６で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー９は、配列表の配列１７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１８で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１０は、配列表の配列１９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２０で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１１は、配列表の配列２１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１２は、配列表の配列２３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよい。
リンカー１は、配列表の配列１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー２は、配列表の配列３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー３は、配列表の配列５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列６で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー４は、配列表の配列７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列８で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー５は、配列表の配列９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１０で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー６は、配列表の配列１１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー７は、配列表の配列１３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー８は、配列表の配列１５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１６で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー９は、配列表の配列１７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１８で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１０は、配列表の配列１９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２０で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１１は、配列表の配列２１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２２で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよく、リンカー１２は、配列表の配列２３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２４で示される一本鎖ＤＮＡ分子によって部分二本鎖構造が形成されたものであってもよい。
【0023】
前記リンカーは、上流プライマーＡと下流プライマーＡをアニーリングしたものであってもよい。
【0024】
前記リンカー混合物中、それぞれのリンカーは等モルで混合されてもよい。
【0025】
前記方法は、ステップ（３）で得られたライブラリを増幅するステップをさらに含んでもよい。前記増幅されるプライマーはリンカー配列に基づいて設計されたものであり、即ち、前記増幅されるプライマーは、少なくとも１つの配列セグメントがリンカーのある配列セグメントと完全に同一である。前記増幅に使用されるプライマー対は、特に、配列表の配列２５と配列２６で示される２本の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0026】
配列表の配列２５で示される一本鎖ＤＮＡ分子は、シーケンシングリンカーＡの５’末端から１～１９位である。
【0027】
配列表の配列２６で示される一本鎖ＤＮＡ分子は、シーケンシングリンカーＢの３’端から１～２２位である。
【0028】
本発明はまた、前記方法によって構築されたＤＮＡライブラリに関する。
【0029】
本発明はまた、上記のいずれかのリンカー混合物と、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼとを含むシーケンシングライブラリを構築するためのキットに関する。
【0030】
前記のシーケンシングライブラリを構築するためのキットは、特に、上記のいずれかに記載のリンカー混合物と、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼとからなる。
【0031】
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中腫瘍突然変異及び／又はメチル化を検出するためのキットに関し、上記のいずれかに記載のリンカー混合物と、プライマーの組み合わせを含み、前記プライマーの組み合わせは、プライマーセットＩ、プライマーセットＩI、プライマーセットＩIＩ、プライマーセットＩＶ、プライマーセットＶ、プライマーセットＶＩ、プライマーセットＶＩＩ、及びプライマーセットＶＩＩＩを含み、
前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩ内の各プライマーは、腫瘍突然変異に関連する領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩは、それぞれ、ＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖の突然変異部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶ内の各プライマーは、腫瘍特異的高メチル化領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶは、それぞれＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖のメチル化部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＶ、前記プライマーセットＶＩ、前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＶＩＩＩ内の各プライマーは、リンカー配列と特異的配列を含み、特異的配列は対象領域のさらなる濃縮に用いられ、
前記プライマーセットＶ及び前記プライマーセットＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩ及び前記プライマーセットＩＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＩＩＩにおいて、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶにおいて、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にある。
前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩ内の各プライマーは、腫瘍突然変異に関連する領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩは、それぞれ、ＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖の突然変異部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶ内の各プライマーは、腫瘍特異的高メチル化領域に応じて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定位置に局在化して、対象領域へのＰＣＲ濃縮を実現する役割を果たし、前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶは、それぞれＤＮＡプラス鎖及びマイナス鎖のメチル化部位の検出に用いられ、
前記プライマーセットＶ、前記プライマーセットＶＩ、前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＶＩＩＩ内の各プライマーは、リンカー配列と特異的配列を含み、特異的配列は対象領域のさらなる濃縮に用いられ、
前記プライマーセットＶ及び前記プライマーセットＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩ及び前記プライマーセットＩＩにおいて、同一突然変異部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＩＩＩにおいて、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にあり、
前記プライマーセットＶＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶにおいて、同一メチル化部位に対して設計された２つのプライマーは「ネスト」関係にある。
【0032】
前記「腫瘍突然変異に関連する領域に応じて設計された特異的プライマー」は、特に、腫瘍特異的遺伝子変異（例えば点突然変異、インデル突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの複数の突然変異の形態）の領域に応じて設計された遺伝子特異的プライマーである。
【0033】
前記「腫瘍特異的高メチル化領域に応じて設計された特異的プライマー」は、特に、腫瘍特異的メチル化領域に応じて設計された遺伝子特異的プライマーである。
【0034】
前記キットにおいて、前記腫瘍は肝臓悪性腫瘍、即ち肝細胞がんである。
【0035】
前記の肝細胞がん突然変異に関連する領域は、特に、肝細胞がんの高頻度突然変異遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ）の関連領域、及びＨＢＶ組み込みに対するホットスポット領域である。
【0036】
上記のいずれかに記載のキットにおいて、前記プライマーセットＩは、７８個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７８個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列２８～配列１０５で示される。前記プライマーセットＩＩは８２個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、８２個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列１０６～配列１８７で示される。前記プライマーセットＩＩＩは、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列１８８～配列２０１で示される。前記プライマーセットＩＶは１５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、順次配列表の配列２０２～配列２１６で示される。前記プライマーセットＶは７５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７５個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列２２０～配列２９４の５’末端から１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列をこの順で含む。前記プライマーセットＶＩは、７９個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、７９個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列２９５～配列３７３の５’末端から１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列をこの順で含む。前記プライマーセットＶＩＩは１４個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列３７４～配列３８７の５’末端から１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列をこの順で含む。前記プライマーセットＶＩＩＩは、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子は、配列表の配列３８８～配列４０２の５’末端からの１６位～３’末端で示されるヌクレオチド配列をこの順で含む。
【0037】
前記プライマーセットＶにおいて、７５個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は順次配列表の配列２２０～配列２９４で示されてもよい。前記プライマーセットＶＩにおいて、７９個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は順次配列表の配列２９５～配列３７３で示されてもよい。前記プライマーセットＶＩＩにおいて、１４個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は順次配列表の配列３７４～配列３８７で示されてもよい。前記プライマーセットＶＩＩＩにおいて、１５個の一本鎖ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は順次配列表の配列３８８～配列４０２で示されてもよい。
【0038】
前記プライマーセットＩは、特に、前記７８個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0039】
前記プライマーセットＩＩは、特に、前記８２個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0040】
前記プライマーセットＩＩＩは、特に、前記１４個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0041】
前記プライマーセットＩＶは、特に、前記１５個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0042】
前記プライマーセットＶは、特に、前記７５個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0043】
前記プライマーセットＶＩは、特に、前記７９個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0044】
前記プライマーセットＶＩＩは、特に、前記１４個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0045】
前記プライマーセットＶＩＩＩは、特に、前記１５個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる。
【0046】
上記のいずれかの前記キットは、特に、上記のいずれかの前記リンカー混合物と、前記プライマーの組み合わせとからなる。
【0047】
上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせは、特に、前記プライマーセットＩ、前記プライマーセットＩＩ、前記プライマーセットＩＩＩ、前記プライマーセットＩＶ、前記プライマーセットＶ、前記プライマーセットＶＩ、前記プライマーセットＶＩＩ及び前記プライマーセットＶＩＩＩからなる。
【0048】
上記のいずれかの前記キットは、ＤＮＡ抽出用の試薬、ＤＮＡプライマー構築用の試薬、ライブラリ精製用の試薬、ライブラリキャプチャー用の試薬など、ライブラリ構築用の材料をさらに含んでもよい。
【0049】
本発明はまた、上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせに関する。前記プライマーの組み合わせの使用は、ＤＮＡサンプル中の腫瘍突然変異及び／又はメチル化の検出としてもよい。
【0050】
本発明はまた、Ｓ１）又はＳ２）又はＳ３）に関する：
Ｓ１）ＤＮＡサンプル中の腫瘍突然変異及び／又はメチル化を検出するためのキットの製造における、上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせの使用、
Ｓ２）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせの使用、
Ｓ３）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における上記のいずれかの前記キットの使用。
Ｓ１）ＤＮＡサンプル中の腫瘍突然変異及び／又はメチル化を検出するためのキットの製造における、上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせの使用、
Ｓ２）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における上記のいずれかの前記プライマーの組み合わせの使用、
Ｓ３）腫瘍患者血液サンプルと非腫瘍患者血液サンプルの区別における上記のいずれかの前記キットの使用。
【0051】
上記の使用において、前記腫瘍は肝臓悪性腫瘍、即ち肝細胞がんであってもよい。
【0052】
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の検出方法に関し、この方法は、
上記のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたライブラリに対してネストＰＣＲ増幅を２回行い、生成物についてシーケンシングを行い、シーケンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップ（２）とを含み、
前記ステップ（２）において、プライマーの組み合わせＡを用いて１回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＡは、上流プライマーＡと下流プライマーの組み合わせＡとからなり、
前記上流プライマーＡはステップ（１）のライブラリ増幅用のライブラリ増幅プライマーであり、
前記下流プライマーの組み合わせＡは、Ｘ個の対象標的に応じて設計されたＹ本のプライマーの組み合わせであり、Ｘ及びＹはいずれも１以上の自然数であり、且つＸ≦Ｙであり、
１回目のＰＣＲの生成物をテンプレートとして、プライマーの組み合わせＢを用いて２回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＢは、上流プライマーＢと、下流プライマーの組み合わせＢと、ｉｎｄｅｘプライマーとからなり、
前記上流プライマーＢは、ライブラリ増幅プライマーであり、且つ３’末端が前記上流プライマーＡと部分的に同一であり、１回目のＰＣＲの生成物の増幅に用いられ、
前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、シーケンシング用のセグメントＡ、サンプルを区別するｉｎｄｅｘ配列、及びシーケンシング用のセグメントＢを含み、
前記下流プライマーの組み合わせＢにおけるプライマーは、前記セグメントＢを有し、且つ下流プライマーの組み合わせＡにおける同一対象標的が検出されるプライマーとネスト関係になるようにしてもよい。
上記のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたライブラリに対してネストＰＣＲ増幅を２回行い、生成物についてシーケンシングを行い、シーケンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップ（２）とを含み、
前記ステップ（２）において、プライマーの組み合わせＡを用いて１回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＡは、上流プライマーＡと下流プライマーの組み合わせＡとからなり、
前記上流プライマーＡはステップ（１）のライブラリ増幅用のライブラリ増幅プライマーであり、
前記下流プライマーの組み合わせＡは、Ｘ個の対象標的に応じて設計されたＹ本のプライマーの組み合わせであり、Ｘ及びＹはいずれも１以上の自然数であり、且つＸ≦Ｙであり、
１回目のＰＣＲの生成物をテンプレートとして、プライマーの組み合わせＢを用いて２回目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマーの組み合わせＢは、上流プライマーＢと、下流プライマーの組み合わせＢと、ｉｎｄｅｘプライマーとからなり、
前記上流プライマーＢは、ライブラリ増幅プライマーであり、且つ３’末端が前記上流プライマーＡと部分的に同一であり、１回目のＰＣＲの生成物の増幅に用いられ、
前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、シーケンシング用のセグメントＡ、サンプルを区別するｉｎｄｅｘ配列、及びシーケンシング用のセグメントＢを含み、
前記下流プライマーの組み合わせＢにおけるプライマーは、前記セグメントＢを有し、且つ下流プライマーの組み合わせＡにおける同一対象標的が検出されるプライマーとネスト関係になるようにしてもよい。
【0053】
前記上流プライマーＢにおけるヌクレオチド配列は、配列表の配列２１７で示されてもよい。
【0054】
前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、特に、前記セグメントＡ、前記ｉｎｄｅｘ配列及び前記セグメントＢからなる。
【0055】
前記セグメントＡのヌクレオチド配列は配列表の配列２１８で示されてもよい。
【0056】
前記セグメントＢのヌクレオチド配列は配列表の配列２１９で示されてもよい。
【0057】
前記上流プライマーＡの一部の配列は、「各リンカーの上流プライマーＡのシーケンシングリンカーＡ」の配列と完全に同一である。
【0058】
前記上流プライマーＢは、ライブラリ分子のリンカー配列を完全に補充することで、増幅産物を直接シーケンシングすることを可能とする。前記上流プライマーＢ及び前記上流プライマーＡ（１回目のＰＣＲ増幅用のプライマー）の一部のヌクレオチド配列は完全に同一である。
【0059】
前記上流プライマーＡのヌクレオチド配列は、特に、配列表の配列２７で示される。
【0060】
前記上流プライマーＢのヌクレオチド配列は、特に、配列表の配列１８８で示される。
【0061】
前記標的突然変異が肝細胞がん突然変異である場合、前記下流プライマーの組み合わせＡは、上記のいずれかの前記プライマーセットＩと、プライマーセットＩＩとからなる。前記下流プライマーの組み合わせＢは、上記のいずれかの前記プライマーセットＶと、プライマーセットＶＩとからなる。プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩを用いてそれぞれテンプレートに１回目のＰＣＲ増幅を行う。プライマーセットＩを用いて増幅された生成物は２回目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＶで増幅される。プライマーセットＩＩを用いて増幅された生成物は２回目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＶＩで増幅される。最後に、増幅生成物は等体積で混合される。
【0062】
前記対象メチル化が肝細胞がんのメチル化である場合、前記下流プライマーの組み合わせＡは、上記のいずれかの前記プライマーセットＩＩＩと、プライマーセットＩＶとからなる。前記下流プライマーの組み合わせＢは、上記のいずれかの前記プライマーセットＶＩＩと、プライマーセットＶＩＩＩとからなる。
【0063】
プライマーセットＩＩＩ及びプライマーセットＩＶを用いてそれぞれテンプレートに対して１回目のＰＣＲ増幅を行う。プライマーセットＩＩＩを用いて増幅された生成物は２回目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＶＩＩで増幅される。プライマーセットＩＶを用いて増幅される生成物は２回目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＶＩＩＩで増幅される。最後に、増幅生成物は等体積で混合される。
【0064】
上記の方法では、前記ＤＮＡサンプル中の標的突然変異の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、１つの突然変異が、
（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされている（該条件はキャプチャーシーケンシングのデータだけをサポートし、ｒａｃｅのデータに適されていない）こと、又は
（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていること
を満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であることを同時に満たすこと
であり、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
であるようにしてもよい。
（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされている（該条件はキャプチャーシーケンシングのデータだけをサポートし、ｒａｃｅのデータに適されていない）こと、又は
（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていること
を満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であることを同時に満たすこと
であり、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
であるようにしてもよい。
【0065】
上記の方法では、前記ＤＮＡサンプル中のメチル化の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること
を同時に満たすことであるようにしてもよい。
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること
を同時に満たすことであるようにしてもよい。
【0066】
以上の前記ＤＮＡ挿入断片は、特に、リンカー以外の増幅によるＤＮＡ断片である。
【0067】
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の複数の標的突然変異及び／又はメチル化の検出方法に関し、この方法は、
上記のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）のライブラリについて標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、シーケンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップ（２）と
を含んでもよい。
上記のいずれか１項に記載の方法によってライブラリを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）のライブラリについて標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、シーケンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の標的突然変異及び／又はメチル化の発生を分析するステップ（２）と
を含んでもよい。
【0068】
上記の方法では、前記ＤＮＡサンプル中の標的突然変異の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、ある突然変異が、（ａ１）少なくとも一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていることを満たすと、該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たし、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
であるようにしてもよい。
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たし、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
であるようにしてもよい。
【0069】
上記の方法では、前記ＤＮＡサンプル中のメチル化の分析方法において、シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、
基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一である；
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一である；
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
【0070】
前記標的領域濃縮は、従来の市販の標的キャプチャーキット（例えばＡｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャーキット、Ａｇｉｌｅｎｔ５１９０－８６４６）によって行われてもよく、ここで、最後のステップのＰＣＲ増幅プライマー対をプライマーＡとプライマーＢからなるプライマー対に変更する。前記プライマーＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列４０３で示されてもよい。前記プライマーＢはセグメントＡ、ｉｎｄｅｘ配列、及びセグメントＢを含んでもよい。前記プライマーＢは、特に、前記セグメントＡ、前記ｉｎｄｅｘ配列及び前記セグメントＢからなる。前記セグメントＡのヌクレオチド配列は配列表の配列４０４で示されてもよい。前記セグメントＢのヌクレオチド配列は配列表の配列４０５で示されてもよい。
【0071】
上記のいずれかの前記方法では、前記標的突然変異及び／又はメチル化は、腫瘍突然変異及び／又はメチル化であってもよい。前記腫瘍は肝臓悪性腫瘍、即ち肝細胞がんであってもよい。
【0072】
以上では、通常、複数の異なるサンプルのライブラリは混合されたものとしてシーケンシングを行い、前記ｉｎｄｅｘ配列は、異なるサンプルをマークするものである。シーケンシング終了後、各ｉｎｄｅｘ配列に応じて全体としてのシーケンシングデータを分割する。Ｉｎｄｅｘを設計する原則は、前記したアンカー配列の設計原則とほぼ同じである。
【0073】
以上では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡサンプルを切断すると、ＤＮＡ断片（このときのＤＮＡ断片の両端が全て粘着末端となり、末端の一本鎖の一部のヌクレオチド配列はブレークポイント配列となる）が形成され、ＤＮＡ断片が末端修復を受けた後リンカーに連結され（５’末端と３’末端はそれぞれ１つのリンカーに連結され、リンカーは同一であってもよく、逆のものであってもよい）、このとき、ＤＮＡ分子では、２つのリンカーの間のＤＮＡ断片はＤＮＡ挿入断片である。
【0074】
本発明は、１つのサンプルにおいてｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異（点突然変異、インデル突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの複数の突然変異の形態を含む）及び／又はメチル化を同時に検出し得る方法を提供し、サンプルの使用量が少ないだけでなく、該方法で製造されたＭＣライブラリが１０－２０回の後続の検出をサポートすることができ、感度及び特異性を低下させることなく、いずれかの検出結果によっても全ての元のｃｔＤＮＡ標本の突然変異及び酵素切断部位がカバーする領域のメチル化修飾を反映することができる。該方法を用いて構築されたライブラリは、ＰＣＲのホットスポット検出及びキャプチャー法によるシーケンシングの両方に用いられ、付加されたＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅにより偽陽性結果が効果的に除去され得、このように、ｄｕｐｌｅｘに基づく高特異性のシーケンシングが達成される。また、ライブラリ構築方法は、ｃｆＤＮＡサンプルだけでなく、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡサンプルに適用できる。本発明は、腫瘍早期スクリーニング、病状追跡、有効性評価、予後予測などに対して臨床的に重要であり、応用の価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】ａｄａｐｔｅｒ及びプライマー構造の模式図である。
【図2】ＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮及びライブラリ構築の模式図である。
【図3】ＭＣライブラリに対するキャプチャー及びｄｕｐｌｅｘシーケンシングの模式図である。
【図4】Ｐａｄｌｏｃｋ方法及び突然変異／メチル化共検出法（即ち、本発明で提供される方法）によるＡＫ０５５９５７遺伝子のメチル化レベルの検出結果である。
【図5】突然変異単独検出法及び突然変異／メチル化共検出法による突然変異及び突然変異頻度の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0076】
以下の実施例は本発明を理解しやすくするが、本発明を限定するものではない。
【0077】
特に断らない限り、下記実施例における実験方法は常法である。
特に断らない限り、下記実施例に使用される試験材料は、一般的な生化学試薬店より購入したものである。
以下の実施例における定量的試験は、全て３つの重複実験を設置し、結果として平均値を取る。
特に断らない限り、下記実施例に使用される試験材料は、一般的な生化学試薬店より購入したものである。
以下の実施例における定量的試験は、全て３つの重複実験を設置し、結果として平均値を取る。
【0078】
下記実施例におけるＴＥ緩衝液はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社の製品であり、カタログ番号が１２０９００１５である。
下記実施例では、肝細胞がん患者から本発明の内容についてインフォームドコンセントを得た。
下記実施例では、肝細胞がん患者から本発明の内容についてインフォームドコンセントを得た。
【0079】
実施例１、ＭＣライブラリの構築
一、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる酵素切断
ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表１に示すように反応系を調製した後、表２に記載のプログラムに従ってＰＣＲ装置にて酵素切断処理を行い、酵素切断生成物を得た（４℃で保存）。
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ及びＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ １０×Ｂｕｆｆｅｒは全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社の製品。Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ及びＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ １０×Ｂｕｆｆｅｒは、検出対象領域内に少なくとも１つの該メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる酵素切断部位が含まれていることを基準に、検出対象の標的領域に応じて選択してもよい。
一、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる酵素切断
ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表１に示すように反応系を調製した後、表２に記載のプログラムに従ってＰＣＲ装置にて酵素切断処理を行い、酵素切断生成物を得た（４℃で保存）。
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ及びＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ １０×Ｂｕｆｆｅｒは全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社の製品。Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ及びＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ １０×Ｂｕｆｆｅｒは、検出対象領域内に少なくとも１つの該メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる酵素切断部位が含まれていることを基準に、検出対象の標的領域に応じて選択してもよい。
【0080】
【0081】
【0082】
二、酵素切断生成物の精製
ステップ１で得られた酵素切断生成物について、Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘＴＭ 高性能無細胞ＤＮＡ濃縮分離キット（High Efficiency Cell-Free DNAIsolation Kit）（標準版）（Ａｐｏｓｔｌｅ社の製品、カタログ番号Ａ１７６２２－５０）により精製して濃縮し、精製生成物を得た。
ステップ１で得られた酵素切断生成物について、Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘＴＭ 高性能無細胞ＤＮＡ濃縮分離キット（High Efficiency Cell-Free DNAIsolation Kit）（標準版）（Ａｐｏｓｔｌｅ社の製品、カタログ番号Ａ１７６２２－５０）により精製して濃縮し、精製生成物を得た。
【0083】
三、精製生成物の平滑末端の修復及びＡテーリング処理
ステップ二で得られた精製生成物について、表３に示すように反応系を調製した後、表４の反応プログラムに従ってＰＣＲ装置にて末端修復及び３’末端Ａテーリングを行い、反応生成物を得た（４℃で保存）。
ステップ二で得られた精製生成物について、表３に示すように反応系を調製した後、表４の反応プログラムに従ってＰＣＲ装置にて末端修復及び３’末端Ａテーリングを行い、反応生成物を得た（４℃で保存）。
【0084】
【0085】
【0086】
四、反応生成物とａｄａｐｔｅｒの連結
表５のように反応系を調製し、２０℃で１５ｍｉｎ（分）反応させ、連結生成物を得た（４℃で保存）。
表５のように反応系を調製し、２０℃で１５ｍｉｎ（分）反応させ、連結生成物を得た（４℃で保存）。
【0087】
【0088】
Ａｄａｐｔｅｒ配列情報を表６に示す。
表６に記載の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれＴＥ緩衝液で溶解して、濃度１００μＭとなるまで希釈した。同一群の２本の一本鎖ＤＮＡ分子を等体積で混合し（各５０μｌ）、次に、アニーリング（アニーリング手順：９５℃、１５ｍｉｎ；２５℃、２ｈ（時間））を行い、１２群のＤＮＡ溶液を得て、１２群のＤＮＡ溶液を等体積で混合し、Ａｄａｐｔｅｒ Ｍｉｘを得た。
表６に記載の一本鎖ＤＮＡ分子をそれぞれＴＥ緩衝液で溶解して、濃度１００μＭとなるまで希釈した。同一群の２本の一本鎖ＤＮＡ分子を等体積で混合し（各５０μｌ）、次に、アニーリング（アニーリング手順：９５℃、１５ｍｉｎ；２５℃、２ｈ（時間））を行い、１２群のＤＮＡ溶液を得て、１２群のＤＮＡ溶液を等体積で混合し、Ａｄａｐｔｅｒ Ｍｉｘを得た。
【0089】
【0090】
表６には、８個のＮは、８ｂｐのランダムタグを表す。実際の適用では、ランダムタグ長さは８－１４ｂｐであってもよい。
下線は１２ｂｐのアンカー配列を表し、各群の上流配列（名称に「Ｆ」が付いたものは上流配列）及び下流配列（名称に「Ｒ」が付いたものは下流配列）において、下線付き部分は逆相補となり、アニーリングによって上流配列と下流配列は結合されてリンカーとなる。また、アンカー配列は配列が固定された組み込みタグとして、元のテンプレート分子をマークしてもよい。実際の適用では、アンカー配列長さは１２－２０ｂｐであってもよく、連続反復塩基が３以下であり、且つプライマーの他の部分と相互作用（例えばヘアピン構造、二量体などの形成）できず、１２群の全て位置において塩基がバランスを取り（即ち、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧは均一に分布）、ミスマッチ塩基数が３以上である（即ち、アンカー配列同士で塩基が少なくとも３つ相違しており、相違は位置の相違又は順番の相違）。
上流配列において末端が太字となったＴは元の分子末端に付いた「Ａ」と相補的であり、ＴＡ連結が行われる。
上流配列において、５’末端から１～２１位（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕｓｅｑシーケンシングキット）はシーケンシングプライマー結合配列であり、ここで、５’末端から１～１９位はライブラリ増幅プライマー部分である。
下流配列において、非下線付き部分（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｎｅｘｔｅｒａシーケンシングキット）はシーケンシングプライマー結合配列であり、ここで、３’端から１～２２位はライブラリ増幅プライマー部分である。
下線は１２ｂｐのアンカー配列を表し、各群の上流配列（名称に「Ｆ」が付いたものは上流配列）及び下流配列（名称に「Ｒ」が付いたものは下流配列）において、下線付き部分は逆相補となり、アニーリングによって上流配列と下流配列は結合されてリンカーとなる。また、アンカー配列は配列が固定された組み込みタグとして、元のテンプレート分子をマークしてもよい。実際の適用では、アンカー配列長さは１２－２０ｂｐであってもよく、連続反復塩基が３以下であり、且つプライマーの他の部分と相互作用（例えばヘアピン構造、二量体などの形成）できず、１２群の全て位置において塩基がバランスを取り（即ち、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧは均一に分布）、ミスマッチ塩基数が３以上である（即ち、アンカー配列同士で塩基が少なくとも３つ相違しており、相違は位置の相違又は順番の相違）。
上流配列において末端が太字となったＴは元の分子末端に付いた「Ａ」と相補的であり、ＴＡ連結が行われる。
上流配列において、５’末端から１～２１位（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕｓｅｑシーケンシングキット）はシーケンシングプライマー結合配列であり、ここで、５’末端から１～１９位はライブラリ増幅プライマー部分である。
下流配列において、非下線付き部分（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｎｅｘｔｅｒａシーケンシングキット）はシーケンシングプライマー結合配列であり、ここで、３’端から１～２２位はライブラリ増幅プライマー部分である。
【0091】
表６においては、合計１２群のリンカーが含まれており、１２×１２＝１４４種類のマーク組み合わせが形成され得、分子自体の配列情報と組み合わせると、元のサンプル中の全ての分子を区別するのに十分であり、実際の適用では、群数は適宜増加（合成コストが高まる）又は減少（区別效果がわずか劣る）。
【0092】
連結生成物の構造は図１に示される。ここで、ａはリンカー部分であり、ｂ及びｆはそれぞれライブラリ増幅プライマーであり、ｃは８ｂｐランダムタグ（表６における８個のＮで表示）、ｄは１２ｂｐアンカー配列（表６における下線で表示）、ｅは挿入断片（ｃｆＤＮＡ）である。
【0093】
五、連結生成物の精製
ステップ四で得られた連結生成物に、１１０－２２０μｌ（即ち体積の１－２倍）のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（ベックマンＡ６３８８０）を加えて、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、溶液が澄明になると上清を捨てて、その後、８０体積％エタノール水溶液２００μｌを加えて２回洗浄し、上清を捨てて、エタノールが揮発された後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ３０μｌを加えて、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、上清溶液をＰＣＲ管に吸い取り、ＰＣＲテンプレートとした。
ステップ四で得られた連結生成物に、１１０－２２０μｌ（即ち体積の１－２倍）のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（ベックマンＡ６３８８０）を加えて、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、溶液が澄明になると上清を捨てて、その後、８０体積％エタノール水溶液２００μｌを加えて２回洗浄し、上清を捨てて、エタノールが揮発された後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ３０μｌを加えて、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、上清溶液をＰＣＲ管に吸い取り、ＰＣＲテンプレートとした。
【0094】
六、ライブラリ増幅及び精製
１、ステップ五で得られたＰＣＲテンプレートを用いて、表７のように反応系を調製し、表８のようにＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅生成物を得た（４℃で保存）。
１、ステップ五で得られたＰＣＲテンプレートを用いて、表７のように反応系を調製し、表８のようにＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅生成物を得た（４℃で保存）。
【0095】
【0096】
表７には、プライマー情報は以下のとおりである。
ＭＣ＿Ｆ（配列２５）：５’－ＧＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ－３’；
ＭＣ＿Ｒ（配列２６）：５’－ＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ－３’。
ＭＣ＿Ｆ（配列２５）：５’－ＧＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ－３’；
ＭＣ＿Ｒ（配列２６）：５’－ＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ－３’。
【0097】
【0098】
２、ステップ１で得られたＰＣＲ増幅生成物に、７０－１４０μｌ（即ち体積の１－２倍）のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズを加え、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、溶液が澄明になると上清を捨てて、その後、８０体積％エタノール水溶液２００μｌを加えて２回洗浄し、上清を捨てて、エタノールが揮発された後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ １００μｌを加えて、均一にボルテックス混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着し、上清溶液を吸い取り、生成物を得た（－２０℃で保存）。生成物は長期間保存、繰り返し使用可能なＭＣライブラリである。
検出した結果、ＭＣライブラリは１０－２０回の後続の検出を支持することができ、各検出の結果は全ての元のサンプルの突然変異及び酵素切断部位がカバーする領域のメチル化修飾を反映することができ、感度及び特異性を低下させることはない。また、ライブラリの構築方法は、ｃｆＤＮＡサンプルだけでなく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡサンプルに適用する。
検出した結果、ＭＣライブラリは１０－２０回の後続の検出を支持することができ、各検出の結果は全ての元のサンプルの突然変異及び酵素切断部位がカバーする領域のメチル化修飾を反映することができ、感度及び特異性を低下させることはない。また、ライブラリの構築方法は、ｃｆＤＮＡサンプルだけでなく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡサンプルに適用する。
【0099】
実施例２、ＲａｃｅＳｅｑによる標的領域の濃縮及びシーケンシングライブラリ構築
図２に示すように、中国の肝細胞がん高頻度突然変異遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ）の関連領域、ＨＢＶ組み込みホットスポット領域、及び肝細胞がん特異的高メチル化領域（ＥＭＸ１、ＬＲＲＣ４、ＢＤＨ１など）について設計されたプライマーを、所定のプライマーと組み合わせて、ＭＣライブラリに対して２回のＰＣＲ増幅を行い、増幅生成物はシーケンシングライブラリである。
図２においては、ａは１回目のライブラリ増幅の上流プライマーであり、ｂは２回目のライブラリ増幅の上流プライマーであり、ｃは１回目のライブラリ増幅の下流プライマーライブラリであり、対象配列の特異的濃縮用であり、ｄは２回目のライブラリ増幅の下流プライマーライブラリであり、対象配列の特異的濃縮用であり、ｅはｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒであり、ｉｎｄｅｘ配列付加用である。
図２に示すように、中国の肝細胞がん高頻度突然変異遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ）の関連領域、ＨＢＶ組み込みホットスポット領域、及び肝細胞がん特異的高メチル化領域（ＥＭＸ１、ＬＲＲＣ４、ＢＤＨ１など）について設計されたプライマーを、所定のプライマーと組み合わせて、ＭＣライブラリに対して２回のＰＣＲ増幅を行い、増幅生成物はシーケンシングライブラリである。
図２においては、ａは１回目のライブラリ増幅の上流プライマーであり、ｂは２回目のライブラリ増幅の上流プライマーであり、ｃは１回目のライブラリ増幅の下流プライマーライブラリであり、対象配列の特異的濃縮用であり、ｄは２回目のライブラリ増幅の下流プライマーライブラリであり、対象配列の特異的濃縮用であり、ｅはｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒであり、ｉｎｄｅｘ配列付加用である。
【0100】
１、実施例１で製造されたＭＣライブラリ ３００ｎｇを、2つの部分に分けて、表９に記載の反応系（１つはＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ、もう１つはＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘに加えて）を調製し、表１１に記載の反応プログラムに従って１回目のＰＣＲ増幅を行い、１回目の増幅生成物を得た（１回目の増幅生成物は合計２つ得られ、１つはＧＳＰ１Ａ ｍｉｘの増幅生成物であり、もう１つはＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘの増幅生成物である）。
【0101】
【0102】
表９において、プライマー情報は以下のとおりである。
上流プライマー１３５５（配列２７）：５’－ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ－３’。
ＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ：表１０においてプライマープールＧＳＰ１Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ａにおけるプライマーはテンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘ：表１０においてプライマープールＧＳＰ１Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ｂにおけるプライマーはテンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
プライマープールＧＳＰ１Ａ及びプライマープールＧＳＰ１Ｂでは、同じ番号のプライマー（即ちプライマー番号の最後の4桁は同じ）について正方向と逆方向から同一突然変異部位が検出され、また、最大限に濃縮可能な元の分子情報が使用された。
上流プライマー１３５５（配列２７）：５’－ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ－３’。
ＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ：表１０においてプライマープールＧＳＰ１Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ａにおけるプライマーはテンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘ：表１０においてプライマープールＧＳＰ１Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ｂにおけるプライマーはテンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
プライマープールＧＳＰ１Ａ及びプライマープールＧＳＰ１Ｂでは、同じ番号のプライマー（即ちプライマー番号の最後の4桁は同じ）について正方向と逆方向から同一突然変異部位が検出され、また、最大限に濃縮可能な元の分子情報が使用された。
【0103】
【0104】
【0105】
２、ステップ１で得られた２つの１回目の増幅生成物をそれぞれ３０－６０μｌ（即ち体積の１－２倍）のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズで精製し、その後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ２５μｌで溶出し、１回目の精製生成物を得た。
【0106】
３、ステップ２で得られた１回目の精製生成物をそれぞれテンプレートとし、表１２に記載の反応系を調製し（ＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ増幅生成物をテンプレートとして使用する場合、ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘで増幅、ＧＳＰ１Ｂｍｉｘ増幅生成物をテンプレートとして使用する場合、ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘで増幅）、表１４に記載の反応プログラムに従って２回目のＰＣＲ増幅を行い、２回目の増幅生成物を得た（４℃で保存）。
【0107】
【0108】
表１２において、プライマー情報は以下のとおりである。
上流プライマー３３５５（配列２１７）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ－３’；下線部分は１回目の上流プライマー１３５５の同一部分であり、３３５５及び１３５５は全てＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームシーケンシングの固定配列である（他のシーケンシングプラットフォームでシーケンシング可能な配列に変更してもよい）。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ：表１３においてプライマープールＧＳＰ２Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭまで希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ａにおけるプライマーはテンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ：表１３においてプライマープールＧＳＰ２Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ｂにおけるプライマーはテンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
上流プライマー３３５５（配列２１７）：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ－３’；下線部分は１回目の上流プライマー１３５５の同一部分であり、３３５５及び１３５５は全てＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームシーケンシングの固定配列である（他のシーケンシングプラットフォームでシーケンシング可能な配列に変更してもよい）。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ：表１３においてプライマープールＧＳＰ２Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭまで希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ａにおけるプライマーはテンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ：表１３においてプライマープールＧＳＰ２Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ｂにおけるプライマーはテンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
【0109】
表１３において、５’末端から１～１５位はＩｎｄｅｘプライマーに結合される部分である。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ及びＧＳＰ１Ａ ｍｉｘでは、プライマー番号が同じプライマー（即ちプライマー番号の最後の４桁は同じ）は同一突然変異部位について設計されたものであり、２本のプライマーはネスト関係になる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ及びＧＳＰ２Ａ ｍｉｘでは、プライマー番号が同じプライマー（即ちプライマー番号の最後の４桁は同じ）は同一突然変異部位について設計されたものであり、２本のプライマーはネスト関係になる。
Ｉｎｄｅｘプライマー：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列２１８）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡ－３’（配列２１９）；下線部分はＧＳＰ２ ｍｉｘに結合される部分である。＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置であり、ｉｎｄｅｘは、長さ６－８ｂｐであり、サンプル同士の配列を区別し、複数のサンプルを混合してシーケンシングすることに寄与する。ｉｎｄｅｘ配列に加えて、残りは全てＩｌｌｕｍｉｎａ社のｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングキット由来の固定配列である。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ及びＧＳＰ１Ａ ｍｉｘでは、プライマー番号が同じプライマー（即ちプライマー番号の最後の４桁は同じ）は同一突然変異部位について設計されたものであり、２本のプライマーはネスト関係になる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ及びＧＳＰ２Ａ ｍｉｘでは、プライマー番号が同じプライマー（即ちプライマー番号の最後の４桁は同じ）は同一突然変異部位について設計されたものであり、２本のプライマーはネスト関係になる。
Ｉｎｄｅｘプライマー：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列２１８）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡ－３’（配列２１９）；下線部分はＧＳＰ２ ｍｉｘに結合される部分である。＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置であり、ｉｎｄｅｘは、長さ６－８ｂｐであり、サンプル同士の配列を区別し、複数のサンプルを混合してシーケンシングすることに寄与する。ｉｎｄｅｘ配列に加えて、残りは全てＩｌｌｕｍｉｎａ社のｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングキット由来の固定配列である。
【0110】
【0111】
【0112】
４、ステップ３で得られたＧＳＰ２Ａ ｍｉｘによる２回目の増幅の生成物と、ＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘによる２回目の増幅の生成物とを等体積で混合し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズを用いて１：（１－２）の割合で精製し、その後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ５０μｌで溶出し、２回目の精製生成物として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｘプラットフォームにてシーケンシング可能なシーケンシングライブラリを得た。
ＭＣライブラリにおけるＤＮＡランダムタグはｃｆＤＮＡ配列とともにシーケンシングライブラリのＲｅａｄ１配列下流に付加された。シーケンシング中、ＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列、ｃｆＤＮＡ配列（図１のｃ、ｄ、ｅ配列）が順次得られた。
ＭＣライブラリにおけるＤＮＡランダムタグはｃｆＤＮＡ配列とともにシーケンシングライブラリのＲｅａｄ１配列下流に付加された。シーケンシング中、ＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列、ｃｆＤＮＡ配列（図１のｃ、ｄ、ｅ配列）が順次得られた。
【0113】
肝細胞がん特異的遺伝子変異の分析方法：シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、１つの突然変異が、（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていることを満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異であり、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たすことであり、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
である。
肝細胞がん特異的メチル化修飾の度合いの分析方法：シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たすことであり、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
である。
肝細胞がん特異的メチル化修飾の度合いの分析方法：シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
【0114】
実施例３、ＭＣライブラリのキャプチャー及びシーケンシング
図３に示すように、標的領域濃縮は、従来の市販の標的キャプチャーキットに基づいて最適化設計を行ってキャプチャーされてもよい。例えば、メチル化領域に基づくキャプチャーは、Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ ０７１３８８８１００１）又はＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐＷＧ－３１７－１００１）を参照してもよく、メチル化領域を標的とするキャプチャーの設計は、酵素切断部位のカバーする度合いに応じて選別し、プローブ中の亜硫酸水素塩処理で変換された塩基を調整することを必要とする。遺伝子変異領域に基づくキャプチャーは、最後のステップのＰＣＲ増幅のプライマーを以下のプライマーに変更すること以外、Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ５１９０－８６４６）を参照すればよい。
上流プライマー：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列４０３）（図３の「ａ」）、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｆ部分と同じであり、ライブラリ増幅用であり、残りの部分はｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに必要な固定配列である。
下流プライマー：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列４０４）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ－３’（配列４０５）（図３の「ｂ」）、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｒと同じであり、ライブラリ増幅用である。＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置であり、ｉｎｄｅｘは長さ６－８ｂｐであり、サンプル同士の配列を区別し、複数のサンプルを混合してシーケンシングすることに寄与する。残りの部分はｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに必要な固定配列である。
キャプチャー後のライブラリでは、ＭＣライブラリと同じＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列、及びｃｆＤＮＡ配列があり、この順でＲｅａｄ１下流に位置する。
図３に示すように、標的領域濃縮は、従来の市販の標的キャプチャーキットに基づいて最適化設計を行ってキャプチャーされてもよい。例えば、メチル化領域に基づくキャプチャーは、Ｒｏｃｈｅ ＳｅｑＣａｐ Ｅｐｉ ＣｐＧｉａｎｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ ０７１３８８８１００１）又はＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐＷＧ－３１７－１００１）を参照してもよく、メチル化領域を標的とするキャプチャーの設計は、酵素切断部位のカバーする度合いに応じて選別し、プローブ中の亜硫酸水素塩処理で変換された塩基を調整することを必要とする。遺伝子変異領域に基づくキャプチャーは、最後のステップのＰＣＲ増幅のプライマーを以下のプライマーに変更すること以外、Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的キャプチャーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ５１９０－８６４６）を参照すればよい。
上流プライマー：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列４０３）（図３の「ａ」）、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｆ部分と同じであり、ライブラリ増幅用であり、残りの部分はｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに必要な固定配列である。
下流プライマー：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列４０４）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ－３’（配列４０５）（図３の「ｂ」）、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｒと同じであり、ライブラリ増幅用である。＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置であり、ｉｎｄｅｘは長さ６－８ｂｐであり、サンプル同士の配列を区別し、複数のサンプルを混合してシーケンシングすることに寄与する。残りの部分はｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに必要な固定配列である。
キャプチャー後のライブラリでは、ＭＣライブラリと同じＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列、及びｃｆＤＮＡ配列があり、この順でＲｅａｄ１下流に位置する。
【0115】
シーケンシングデータが基準Ａを満たすＤＮＡ分子を１つの分子クラスタまでバックトラックし、基準Ａは、
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たすことである。基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
である。１つの突然変異が、（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていることを満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされる突然変異は、信頼性がより高く、９０％の偽陽性突然変異を減少できる。
シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
１．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
２．ランダムタグ配列が同一であること、
３．アンカー配列が同一であること
を同時に満たすことである。基準Ｂを満たす分子クラスタを一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタとしてマークし、基準Ｂは、
４．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致すること、
５．分子クラスタの両端のアンカー配列が同一であるが、逆の位置にあることを同時に満たすこと
である。１つの突然変異が、（ａ１）少なくとも一対ｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされていること、又は（ａ２）少なくとも４つの分子クラスタによってサポートされていることを満たすと、当該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。一対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスタによってサポートされる突然変異は、信頼性がより高く、９０％の偽陽性突然変異を減少できる。
シーケンシングデータが基準Ｃを満たすＤＮＡ分子をクラスタとしてマークし、断片末端が興味のある酵素切断部位であるクラスタの数をそれぞれ算出し、非メチル化断片として記録し、増幅断片が１番目の酵素切断部位と同程度又はそれ以上の全てのクラスタの数を算出し、断片総数として記録し、２種の断片の数から、領域のメチル化レベル＝（１－非メチル化断片数／断片総数）×１００％により対応する領域の平均メチル化レベルを算出し、基準Ｃは、
６．ランダムタグ配列が同一であること、
７．アンカー配列が同一であること、
８．ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致することを同時に満たすこと
である。
【0116】
実施例４、検出方法の比較
一、検出方法の比較１
１、２１例の肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡ標本を採取した。
２、ステップ１を完了した後、各ｃｆＤＮＡ標本について、実施例１の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、ＡＫ０５５９５７遺伝子のメチル化レベルを得た。
３、ステップ１を完了した後、各ｃｆＤＮＡ標本について、Ｐａｄｌｏｃｋ方法（Xu R H , Wei W , Krawczyk M , et al. Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Nature Materials, 2017, 16(11):1155.）によって、ＡＫ０５５９５７遺伝子のメチル化レベルを検出した。Ｐａｄｌｏｃｋは、メチル化を標的とするシーケンシング技術であり、Ｐａｄｌｏｃｋプローブはパドロックのようなコンフォメーションを有し、メチル化を標的とするハイスループットシーケンシングに適用でき、亜硫酸水素塩で変換された後の効率的な構築方法であり、「ＢＳＰＰ」とも呼ばれる。ｃｆＤＮＡを亜硫酸水素塩で変換した後、亜硫酸塩ロックプローブ（ＢＳＰＰ）のキャプチャーアームと相補的にペアリングすると、増幅されてループに連結され、エキソヌクレアーゼによりループに連結されたロックプローブを選別し、増幅生成物をシーケンシングすると、対応するＤＮＡメチル化情報を得ることができる。
結果を図４に示す。結果から明らかなように、Ｐａｄｌｏｃｋ方法及び突然変異／メチル化共検出法（即ち本発明で提供される方法）は、ＡＫ０５５９５７遺伝子（肝細胞がん特異的遺伝子）のメチル化レベルの検出結果がほぼ同じである。
一、検出方法の比較１
１、２１例の肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡ標本を採取した。
２、ステップ１を完了した後、各ｃｆＤＮＡ標本について、実施例１の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、ＡＫ０５５９５７遺伝子のメチル化レベルを得た。
３、ステップ１を完了した後、各ｃｆＤＮＡ標本について、Ｐａｄｌｏｃｋ方法（Xu R H , Wei W , Krawczyk M , et al. Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Nature Materials, 2017, 16(11):1155.）によって、ＡＫ０５５９５７遺伝子のメチル化レベルを検出した。Ｐａｄｌｏｃｋは、メチル化を標的とするシーケンシング技術であり、Ｐａｄｌｏｃｋプローブはパドロックのようなコンフォメーションを有し、メチル化を標的とするハイスループットシーケンシングに適用でき、亜硫酸水素塩で変換された後の効率的な構築方法であり、「ＢＳＰＰ」とも呼ばれる。ｃｆＤＮＡを亜硫酸水素塩で変換した後、亜硫酸塩ロックプローブ（ＢＳＰＰ）のキャプチャーアームと相補的にペアリングすると、増幅されてループに連結され、エキソヌクレアーゼによりループに連結されたロックプローブを選別し、増幅生成物をシーケンシングすると、対応するＤＮＡメチル化情報を得ることができる。
結果を図４に示す。結果から明らかなように、Ｐａｄｌｏｃｋ方法及び突然変異／メチル化共検出法（即ち本発明で提供される方法）は、ＡＫ０５５９５７遺伝子（肝細胞がん特異的遺伝子）のメチル化レベルの検出結果がほぼ同じである。
【0117】
二、検出方法の比較２
１、突然変異／メチル化共検出法による突然変異及び突然変異頻度の検出
（１）ある肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡを採取した。
（２）ステップ（１）を完了した後、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表１に示す反応系を調製し、その後、ＰＣＲ装置にて酵素切断処理を行い、得到酵素切断生成物を得た（４℃で保存）。ここで、酵素切断処理の時間は０ｈ、０．２ｈ、０．４ｈ、０．６ｈ、０．８ｈ又は１ｈとした。
（３）ステップ（２）を完了した後、前記酵素切断生成物を用いて、実施例１の二～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。データ分析において、ランダムタグ配列が同一であり、ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致するＤＮＡ分子シーケンシングデータを、１つの分子クラスタまでバックトラックし、クラスタ内の分子数＞５個、且つクラスタ内の分子突然変異一致率＞８０％、クラスタ個数≧５である場合、該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。該分子突然変異を含むクラスタの割合は突然変異頻度である。
２、突然変異単独検出法による突然変異及び突然変異頻度の検出
（１）ある肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡを採取した。
（２）ステップ（１）を完了した後、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表３に示す反応系を調製し、その後、表４の反応プログラムに従ってＰＣＲ装置にて末端修復及び３’末端Ａテーリングを行い、反応生成物を得た（４℃で保存）。
（３）ステップ（２）を完了した後、前記反応生成物を用いて、実施例１の四～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。データ分析において、ランダムタグ配列が同一であり、ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致するＤＮＡ分子シーケンシングデータを、１つの分子クラスタまでバックトラックし、クラスタ内の分子数＞５、クラスタ内の分子突然変異一致率＞８０％且つクラスタ個数≧５である場合、該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。該分子突然変異を含むクラスタの割合は突然変異頻度である。
３、突然変異部位について突然変異／メチル化共検出法により得られた突然変異頻度を横座標、突然変異単独検出法により得られた突然変異頻度を縦座標として、散布図をプロットし、線形フィット曲線及び相関係数Ｒ２を付加した。
結果を図５に示す。結果から明らかなように、突然変異／メチル化共検出法及び突然変異単独検出法は、突然変異及び突然変異頻度の検出結果がほぼ一致し、即ち、メチル化検出は突然変異の検出に影響しなかった。
１、突然変異／メチル化共検出法による突然変異及び突然変異頻度の検出
（１）ある肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡを採取した。
（２）ステップ（１）を完了した後、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表１に示す反応系を調製し、その後、ＰＣＲ装置にて酵素切断処理を行い、得到酵素切断生成物を得た（４℃で保存）。ここで、酵素切断処理の時間は０ｈ、０．２ｈ、０．４ｈ、０．６ｈ、０．８ｈ又は１ｈとした。
（３）ステップ（２）を完了した後、前記酵素切断生成物を用いて、実施例１の二～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。データ分析において、ランダムタグ配列が同一であり、ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致するＤＮＡ分子シーケンシングデータを、１つの分子クラスタまでバックトラックし、クラスタ内の分子数＞５個、且つクラスタ内の分子突然変異一致率＞８０％、クラスタ個数≧５である場合、該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。該分子突然変異を含むクラスタの割合は突然変異頻度である。
２、突然変異単独検出法による突然変異及び突然変異頻度の検出
（１）ある肝細胞がん患者からｃｆＤＮＡを採取した。
（２）ステップ（１）を完了した後、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、表３に示す反応系を調製し、その後、表４の反応プログラムに従ってＰＣＲ装置にて末端修復及び３’末端Ａテーリングを行い、反応生成物を得た（４℃で保存）。
（３）ステップ（２）を完了した後、前記反応生成物を用いて、実施例１の四～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。データ分析において、ランダムタグ配列が同一であり、ＤＮＡ挿入断片が、同一長さであり、且つ突然変異部位以外の配列が一致するＤＮＡ分子シーケンシングデータを、１つの分子クラスタまでバックトラックし、クラスタ内の分子数＞５、クラスタ内の分子突然変異一致率＞８０％且つクラスタ個数≧５である場合、該突然変異は元のＤＮＡサンプル由来の真の突然変異である。該分子突然変異を含むクラスタの割合は突然変異頻度である。
３、突然変異部位について突然変異／メチル化共検出法により得られた突然変異頻度を横座標、突然変異単独検出法により得られた突然変異頻度を縦座標として、散布図をプロットし、線形フィット曲線及び相関係数Ｒ２を付加した。
結果を図５に示す。結果から明らかなように、突然変異／メチル化共検出法及び突然変異単独検出法は、突然変異及び突然変異頻度の検出結果がほぼ一致し、即ち、メチル化検出は突然変異の検出に影響しなかった。
【0118】
実施例５、正確性実験
突然変異標準品はＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社の製品であり、カタログ番号がＨＤ７０１である。
突然変異標準品はＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社の製品であり、カタログ番号がＨＤ７０１である。
【0119】
一、正確性実験１
１、突然変異標準品を用いて、実施例１の一～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法（ただし、ステップ３におけるＧＳＰ２Ａ ｍｉｘをＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ－１、ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘをＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ－１に変更）によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ－１：表１５においてプライマープールＧＳＰ２Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ａにおけるプライマーは、テンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ－１：表１５においてプライマープールＧＳＰ２Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ｂにおけるプライマーは、テンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
１、突然変異標準品を用いて、実施例１の一～六の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法（ただし、ステップ３におけるＧＳＰ２Ａ ｍｉｘをＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ－１、ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘをＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ－１に変更）によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ－１：表１５においてプライマープールＧＳＰ２Ａに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ａにおけるプライマーは、テンプレートのプラス鎖増幅に用いる。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ－１：表１５においてプライマープールＧＳＰ２Ｂに属する各プライマーを、ＴＥ緩衝液で溶解して濃度１００μＭとなるまで希釈し、その後、等体積で混合し、ＴＥ緩衝液で０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ｂにおけるプライマーは、テンプレートのマイナス鎖増幅に用いる。
【0120】
【0121】
２、シーケンシング結果に基づいて、突然変異部位の突然変異頻度を得た。
検出結果を表１６に示す。結果から明らかなように、突然変異／メチル化共検出法によって突然変異標準品について検出を行った結果、得られた突然変異部位の突然変異頻度は理論値に近い。このことから、突然変異／メチル化共検出法は、肝細胞がん特異的遺伝子（例えばＣＴＮＮＢ１遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＡＸＩＮ１遺伝子）の変異検出に対する正確性が高いことが分かった。
検出結果を表１６に示す。結果から明らかなように、突然変異／メチル化共検出法によって突然変異標準品について検出を行った結果、得られた突然変異部位の突然変異頻度は理論値に近い。このことから、突然変異／メチル化共検出法は、肝細胞がん特異的遺伝子（例えばＣＴＮＮＢ１遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＡＸＩＮ１遺伝子）の変異検出に対する正確性が高いことが分かった。
【0122】
【0123】
二、正確性実験２
ヒトメチル化及び非メチル化標準品はＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の製品であり、カタログ番号がＤ５０１４である。
１、ヒトメチル化及び非メチル化標準品のうち、メチル化標準品と非メチル化標準品を異なる割合で混合し、被験サンプルを得た。被験サンプル中、メチル化標準品の割合は０％、２０％又は１００％であり、即ち、腫瘍特異的遺伝子（ＢＤＨ１遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、ＬＲＲＣ４遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＨＯＸＡ１遺伝子、ＡＫ０５５９５７遺伝子、ＣＯＴＬ１遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子又はＤＡＢ２ＩＰ遺伝子）メチル化の割合は０％、２０％又は１００％である。
２、被験サンプルを用いて、実施例１の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、メチル化部位の検出値を得た。
検出結果を表１７及び表１８に示す（サンプルタイプの最後の４桁は腫瘍特異的遺伝子の名称である）。突然変異／メチル化共検出法によってメチル化標準品について検出を行った結果、検出値は理論値にほぼ近い。このことから、突然変異／メチル化共検出法は、腫瘍特異的遺伝子（例えばＢＤＨ１遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、ＬＲＲＣ４遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＨＯＸＡ１遺伝子、ＡＫ０５５９５７遺伝子、ＣＯＴＬ１遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＤＡＢ２ＩＰ遺伝子）のメチル化レベルに対する検出正確性が高いことが分かった。
ヒトメチル化及び非メチル化標準品はＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の製品であり、カタログ番号がＤ５０１４である。
１、ヒトメチル化及び非メチル化標準品のうち、メチル化標準品と非メチル化標準品を異なる割合で混合し、被験サンプルを得た。被験サンプル中、メチル化標準品の割合は０％、２０％又は１００％であり、即ち、腫瘍特異的遺伝子（ＢＤＨ１遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、ＬＲＲＣ４遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＨＯＸＡ１遺伝子、ＡＫ０５５９５７遺伝子、ＣＯＴＬ１遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子又はＤＡＢ２ＩＰ遺伝子）メチル化の割合は０％、２０％又は１００％である。
２、被験サンプルを用いて、実施例１の方法によってＭＣライブラリを構築し、その後、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングし、メチル化部位の検出値を得た。
検出結果を表１７及び表１８に示す（サンプルタイプの最後の４桁は腫瘍特異的遺伝子の名称である）。突然変異／メチル化共検出法によってメチル化標準品について検出を行った結果、検出値は理論値にほぼ近い。このことから、突然変異／メチル化共検出法は、腫瘍特異的遺伝子（例えばＢＤＨ１遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、ＬＲＲＣ４遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＨＯＸＡ１遺伝子、ＡＫ０５５９５７遺伝子、ＣＯＴＬ１遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＤＡＢ２ＩＰ遺伝子）のメチル化レベルに対する検出正確性が高いことが分かった。
【0124】
【0125】
【0126】
実施例６、突然変異／メチル化共検出法の肝細胞がん患者ｃｆＤＮＡにおける使用
１、健常人１例、肝硬変患者１例、及び肝細胞がん患者３例の血液サンプルから、ｃｆＤＮＡを抽出した。
２、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、実施例１のようにＭＣライブラリを構築し、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。
３、メチル化検出結果を表１９及び表２０に示す。
その結果、肝細胞がん特異的高メチル化の遺伝子は、検出される肝細胞がんサンプル中のメチル化レベルが非肝細胞がんサンプル中のメチル化レベルよりも高かった。突然変異／メチル化共検出法は、肝細胞がんｃｆＤＮＡサンプルの検出に有用であった。
１、健常人１例、肝硬変患者１例、及び肝細胞がん患者３例の血液サンプルから、ｃｆＤＮＡを抽出した。
２、ｃｆＤＮＡ ５－４０ｎｇを用いて、実施例１のようにＭＣライブラリを構築し、実施例２の方法によってＲａｃｅＳｅｑ標的領域濃縮を行い、シーケンシングした。
３、メチル化検出結果を表１９及び表２０に示す。
その結果、肝細胞がん特異的高メチル化の遺伝子は、検出される肝細胞がんサンプル中のメチル化レベルが非肝細胞がんサンプル中のメチル化レベルよりも高かった。突然変異／メチル化共検出法は、肝細胞がんｃｆＤＮＡサンプルの検出に有用であった。
【0127】
【0128】
【産業上の利用可能性】
【0129】
本発明は、１つのサンプルにおいてｃｔＤＮＡ中の腫瘍特異的遺伝子の変異（点突然変異、インデル突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの複数の突然変異の形態を含む）及び／又はメチル化を同時に検出し得る方法を開示し、サンプルの使用量が少ないだけでなく、該方法で製造されたＭＣライブラリが１０－２０回の後続の検出をサポートすることができ、感度及び特異性を低下させることなく、いずれかの検出結果によっても全ての元のｃｔＤＮＡ標本の突然変異及び酵素切断部位がカバーする領域のメチル化修飾を反映することができる。また、ライブラリ構築方法は、ｃｆＤＮＡサンプルだけでなく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡサンプルに適用できる。本発明は、腫瘍早期スクリーニング、病状追跡、有効性評価、予後予測などに対して臨床的に重要であり、応用の価値が高い。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】