特表 2022-551732 がん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-13

(54)【発明の名称】がん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221206BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20221206BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221206BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221206BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221206BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221206BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221206BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221206BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20221206BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221206BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20221206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C07K14/47

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P37/04

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K39/00 H

A61K45/00

A61K48/00

A61K35/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022522289

(86)(22)【出願日】2020-10-17

(85)【翻訳文提出日】2022-06-10

(86)【国際出願番号】 US2020056197

(87)【国際公開番号】W WO2021077051

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/916,854

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516384081

【氏名又は名称】イミュノミック セラピューティックス， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(72)【発明者】

【氏名】ハイラント， テリー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA45

4C084AA17

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA03

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085CC32

4C085DD61

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045CA41

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、がん抗原を免疫細胞に送達するためにＬＡＭＰ内腔ドメインの特定の断片を含む、プロセシングを増強するための改良ＬＡＭＰ構築物を提供する。これらのＬＡＭＰ構築物は、疾患、特に過剰増殖性障害および／またはがんの治療に使用することができる。改良ＬＡＭＰ構築物は、対象に投与されると免疫応答の生成のための適切に構成された三次元エピトープの提示を可能にする。改良ＬＡＭＰ構築物は、多価分子であり得、および／または２つ以上のＬＡＭＰ構築物を含む多価ワクチンの一部として提供することができる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物はまた、非ヒト脊椎動物に投与した場合、抗体が産生されるように使用することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む改良ＬＡＭＰ構築物：
ａ．ＬＡＭＰタンパク質のシステイン保存断片；および
ｂ．下記から選択される少なくとも１つのがん抗原：大型Ｔ抗原、小型Ｔ抗原、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥ－Ｂ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、またはＭＡＧＥＬ２。

【請求項2】

ａ．前記抗原が前記システイン保存断片のＮ末端に配置されている、
ｂ．前記抗原が単一のシステイン保存断片のＣ末端に配置されている、または
ｃ．前記抗原が２つのシステイン保存断片の間に配置されている、
請求項１に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項3】

表１の１列目または４列目に記載の少なくとも１つの断片／エピトープを含み、好ましくはＩＬＣ－１、ＩＬＣ－２、ＩＬＣ－３、ＩＬＣ－４、ＩＬＣ－５またはＩＬＣ－６に示すように構築される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項4】

各抗原がリンカーによって分離されており、好ましくは前記リンカーがアミノ酸配列ＧＰＧＰＧ（配列番号１５２）またはＰＭＧＬＰ（配列番号１５３）である、請求項３に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項5】

複数のシステイン保存断片を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項6】

前記システイン保存断片がＬＡＭＰタンパク質の相同ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項7】

ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項8】

シグナル配列をさらに含み、好ましくは前記シグナル配列はＬＡＭＰタンパク質に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項9】

前記ＬＡＭＰタンパク質が、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ－３、ＬＩＭＰ２、マクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＡＭＰ５またはＬＩＭＢＩＣから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項10】

以下を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物：
Ａ）配列番号１～１１３のいずれか１つから選択されるＬＡＭＰタンパク質、および配列番号１１４～１１６のいずれか１つから選択されるがん抗原；
Ｂ）ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰのアミノ酸配列（配列番号１５１）；または
Ｃ）配列番号１１７～１５０のいずれか１つと組み合わせた（Ａ）または（Ｂ）のいずれか。

【請求項11】

前記ＬＡＭＰタンパク質が、配列番号１～１１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、および／または前記がん抗原が、配列番号１１４～１５１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、請求項１２に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項12】

配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、好ましくは前記ＬＡＭＰタンパク質がヒトＬＡＭＰ１であり、および、好ましくはＩＬＣ－４である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチド。

【請求項14】

ＤＮＡワクチンである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

自己複製ＲＮＡワクチンである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。

【請求項17】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１６に記載の宿主細胞を含む組成物。

【請求項18】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の組成物を、それを必要とする対象に疾患または障害を軽減または治療するための十分量で投与することを含む、疾患または障害を有する対象を治療する方法。

【請求項19】

プライミング工程および少なくとも１回のブースティング工程を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の組成物をプライミング工程に使用する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ブースティング工程が、抗原、改良ＬＡＭＰ構築物、改良ＬＡＭＰ構築物によりコードされるポリペプチド、または前記改良ＬＡＭＰ構築物を含む細胞の投与を含む、請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

ａ）プライムに使用される抗原がブーストに使用されるものと同じである；
ｂ）プライムに使用される抗原が、ブーストに使用される第２の抗原と同じタンパク質に由来する；
ｃ）複数の抗原がプライムおよび／またはブーストに使用される、
請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記対象が過剰増殖性障害を有する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記過剰増殖性障害が、腺がん、肉腫、皮膚がん、（例えば、メルケル細胞がん）、黒色腫、膀胱がん、脳がん（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）（多形性神経膠芽腫を含む）、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん（限定するものではないが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮がんを含む）、結腸直腸がん、肛門がん、直腸がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭頸部がん、口腔がん、唾液腺がん、食道がん、膵臓がん、膵管腺がん（ＰＤＡ）、腎がん、胃がん、腎がん、多発性骨髄腫または脳がん（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）から選択される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記過剰増殖性障害がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって引き起こされる、請求項２３または２４のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記対象にさらにチェックポイント阻害剤が投与され、好ましくは前記チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＣＴＬＡ阻害剤である、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））から選択される、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物、ならびに過剰増殖性障害および／またはがんを患う対象の治療におけるそれらの使用に関する。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を利用するプライム・ブーストプロトコルも記載している。

【背景技術】

【0002】

以下の考察では、背景技術と導入を目的として特定の記事および方法を記載する。本明細書に含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。出願人は、必要に応じて、本明細書において参照されている記事および方法が、先行技術を構成しないことを実証する権利を適切な法律規定の下で明確に留保する。

【0003】

ＤＮＡワクチンは、予防ワクチンおよび治療ワクチンの両方を開発するための新しい有望な候補である。それらは安全であることが証明されており、臨床的利益を達成するためにワクチン接種の反復サイクルが必要な場合、ベクター骨格に対して免疫応答を示さないことは決定的な利点となり得る。しかし、従来のＤＮＡワクチンの欠点の１つは、ヒトにおける免疫原性が低いことである。エピトープベースのＤＮＡワクチンの免疫原性における重要な制限段階は、Ｔ細胞に対する主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）クラスＩＩ提示の経路へのエピトープのアクセスであり得、これは標的化技術のないワクチンの場合には確率的方法であると思われる。

【0004】

米国特許第５，６３３，２３４号は、改変されたインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）の抗原性ドメインと、抗原を効果的にその区画の標的とする細胞質エンドソーム／リソソーム標的化シグナルとを含むキメラタンパク質を記載している。抗原性ドメインはプロセシングされ、それに由来するペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子の協力によって細胞表面に提示された。ＬＡＭＰ－１の細胞質尾部を使用して、キメラタンパク質のエンドソーム／リソソーム標的化ドメインが形成された。

【0005】

米国特許第８，３１８，１７３号は、これらの最初の観察を拡張して、ＬＡＭＰ－１の完全内腔ドメインと膜貫通ドメインとの間に挿入されたＨＩＶ－１ Ｇａｇタンパク質を含むキメラタンパク質（およびこれらのタンパク質をコードする対応するＤＮＡ）を記載した。この構築物は樹状細胞に導入され、ＭＨＣ ＩＩ経路を標的とすることがその後報告された。

【0006】

このアプローチは、いくつかのウイルス抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７、デングウイルス膜タンパク質、ＨＩＶ－１ ｇｐ１６０膜タンパク質、ＨＩＶ－１ ｐ５５ Ｇａｇ、西ナイル膜タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびサイトメガロウイルスｐｐ６５に対する細胞性および体液性応答の増加に有用であることが証明されている（例えば、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０－５２５７，２００１を参照されたい）。免疫応答の増強は、ＬＡＭＰおよびＭＨＣ ＩＩの共局在化、ならびに抗原ペプチドのより効率的なプロセシングおよび送達に起因する。さらに、ＬＡＭＰ標的化により、増加数の免疫原性エピトープの提示が生じることが報告されており、したがって非標的抗原と比較して質的に拡大した免疫応答が誘導される。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３－４３は、ワクシニアベクターにコードされたＬＡＭＰ輸送ＯＶＡ抗原の提示ペプチドの数の増加を示した。外因的に供給されたＯＶＡから生成された１２個のペプチドのうち、９個がＯＶＡ／ＬＡＭＰキメラによって提示されたのに対して、ＬＡＭＰを含まない構築物では２個のみの提示であった。

【0007】

ＬＡＭＰの細胞質ドメインが（シグナル配列および膜貫通ドメインとともに）必要であると決定づけられているが、すべての抗原のエンドソーム／リソソーム輸送には必ずしも十分ではない。代わりに、ＬＡＭＰの完全内腔ドメインは、リソソーム小胞経路へのタンパク質の輸送にも必要であることが示されている。

【0008】

しかし、ＬＡＭＰの完全な内腔ドメインおよび完全な膜貫通／細胞質尾部（「完全ＬＡＭＰ構築物」）が存在する場合でも、特定の抗原の免疫応答を高める効果は、これらの構築物において使用される特定の配列に高度に依存することが徐々に見出されてきた。実際、完全ＬＡＭＰ構築物に挿入した場合、同じタンパク質の異なる抗原断片は同じ免疫応答を誘発しないことがわかってきた。ある時は抗原断片が免疫応答を生成するが、他の時は生成しない。これらの観察により、目的のタンパク質のどの特定の抗原配列が、完全ＬＡＭＰ構築物では困難な免疫応答を引き起こすかを事前に予測することができる。

【0009】

さらに、完全ＬＡＭＰ構築物の作製において、抗原を適切に発現およびプロセシングするには完全内腔ドメインが必要であることが繰り返し観察されている。例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７において、著者は、完全かつ無傷の内腔ドメインが、抗原をリソソームの標的とするために必要な最小領域であり、内腔ドメインの断片では機能しないことを報告した。６ページのｉｄを参照されたい。

【0010】

具体的には、著者のＧｏｄｉｎｈｏは、第１の内腔ドメインと第２の内腔ドメインのいくつか（すなわち、Ｔ１－Ｌｕｍ／ｇａｇ構築物）とを完全に除去することにより、タンパク質発現と抗体応答との両方が減少することを示した。同様に、第１の内腔ドメインの２５％は削除するが、無傷の第２の内腔ドメイン（すなわち、Ｔ２－ｌｕｍ／ｇａｇ）を有すると、タンパク質発現と抗体応答との両方が比較的増加したが、それでも完全ＬＡＭＰ構築物で得られる結果よりも少なかった。

【0011】

さらに、著者らは、免疫応答を引き起こす能力は、これらの完全ＬＡＭＰ構築物で使用される特定の抗原およびエピトープに依存することを認めた。例えば、９ページの第２欄に、著者は「したがって、以前の研究では、ＶＬＰとして、または可溶性の形態で分泌されるＧａｇを生成するＤＮＡワクチンが、異なるレベルのＴ細胞およびＢ細胞活性化を誘導し、これらは細胞質Ｇａｇにより誘導される応答とも異なることが実証された」と述べている。しかし、この文献に記載されているように、ＬＡＭＰの完全内腔ドメインとＬＡＭＰの完全な膜貫通／細胞質ドメインとの間に抗原配列を挿入すると、商業レベルで生産するには費用がかかりすぎるか、または科学的な視点から実用的ではなくなるような大きなポリヌクレオチド配列が生じる。

【0012】

以前に、本発明者らは、文献では、ＬＡＭＰ－１の完全内腔ドメインよりも小さい断片が強固な免疫応答の生成に効果的ではないことが広く報告されているが（例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏらを参照されたい）、特定の配置において特定の断片が実際に抗原を免疫系に効果的に提示し、抗体の異なるレパートリーの生成を含む強固な免疫応答を生成することを発見した。例えば、本発明者らは、強固な免疫応答を生成するために有効な最小ＬＡＭＰ内腔ドメイン断片は、（文献で広く報告されているように）完全内腔ドメインではなく、むしろＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインであることを特定した。したがって、構築物は、完全内腔ドメインを含まなくてもよく、その代わりにＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインを含めばよい。それにもかかわらず、本発明者らは、ＩＬＣ－４と命名された、同時係属中の特許出願第１６／６０７，０８２号に記載の好ましい構築物（本明細書の図１に示す）が、ＬＡＭＰタンパク質の第１の相同性ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同性ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合された少なくとも１つの目的の抗原を含み、例えば、少なくとも１つの目的の抗原はＬＡＭＰヒンジ領域に配置されてもよいことを見出した。好ましい実施形態では、この構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部をさらに含む。２つの相同ドメインは、例えば、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ－２、ＬＡＭＰ－３、またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来し得る。本発明者らは、ＩＬＣ－４などの改良ＬＡＭＰ構築物が、例えば、目的の（１または複数の）抗原に対する強いＴ細胞応答および抗体応答を誘発し、それらをＤＮＡワクチンとして使用するための実行可能な候補にできることを予期せず見出した。

【0013】

上記にもかかわらず、例えば、過剰増殖性障害および／またはがんを効果的に治療するためのワクチンとして使用できる、新しい改良ＬＡＭＰ構築物を設計するさらなる必要がある。さらに、いったん改良されれば、これらの新しいＬＡＭＰ構築物を使用して抗体を作製することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】米国特許第５，６３３，２３４号

【特許文献2】米国特許第８，３１８，１７３号

【特許文献3】米国特許出願第１６／６０７，０８２号

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５２５０－５２５７，２００１

【非特許文献2】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（８）：２３３３－４３

【非特許文献3】Ｇｏｄｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

この概要は、以下の詳細な説明でさらに記載される構想の選択を、簡略化された形式で紹介するために提供している。この概要は、特許請求される主題の重要または本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を限定するために使用されることも意図していない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面に示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の詳細な説明から明らかになる。

【0017】

本発明の目的は、本明細書に明示のがん抗原を免疫系に効果的に提示して増強された免疫応答を生成する、ＬＡＭＰドメインの特定の断片および／または変異体を含む新規な構築物（「改良ＬＡＭＰ構築物」）を提供することである。これらの改良ＬＡＭＰ構築物は抗原をリソソーム／エンドソーム区画に効果的に指向させ、そこで抗原がプロセシングされて、ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激されるように、および／または抗体が生成されるように主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に提示される。

【0018】

本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物および方法は、対象において免疫応答を誘発し得る。免疫応答は、改良ＬＡＭＰ構築物（例えば、ワクチン）中の抗原のエピトープに対する免疫応答であり得る。ワクチンは、免疫系が、ワクチンの抗原を含むものを対象において検出および破壊できるように、対象の免疫系を武装させる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物および方法は、対象においてＴｈ１免疫応答を誘発し得る。Ｔｈ１免疫応答には、免疫細胞のサブセット（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）による炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の分泌が含まれ得る。場合によっては、炎症性サイトカインは、抗原を含むものを破壊することができる、免疫細胞の別のサブタイプ（細胞障害性Ｔ細胞など）を対象において活性化する。

【0019】

場合によっては、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物および方法で使用されるエピトープおよび／または抗原は対象の免疫系によって認識可能であり、Ｔｈ１免疫応答を誘発し、Ｉ型サイトカインが放出される。Ｔｈ１応答は、エピトープとＴ細胞との間、より具体的には、Ｔ細胞により発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との間の相互作用により開始され得る。例えば、エピトープのＭＨＣ受容体への高親和性結合は、Ｔｈ１応答を刺激することができる。ＭＨＣ受容体は、複数の型のＭＨＣ受容体のうちの少なくとも１つであり得る。Ｔ細胞に関与するＭＨＣ受容体は、集団内の個体によって異なる場合がある。

【0020】

場合によっては、免疫応答は１型免疫反応である。場合によっては、免疫応答は、Ｉ型サイトカイン産生とＩＩ型サイトカイン産生との比が１を超えることによって特徴付けられる。場合によっては、免疫応答は、Ｉ型サイトカイン産生とＩＩ型サイトカイン産生との比が１未満であることによって特徴付けられる。場合によっては、免疫応答は、ＩＦＮγ産生とＩＬ－１０産生との比が１を超えることによって特徴付けられる。場合によっては、免疫応答は、ＩＦＮγ産生とＩＬ－１０産生との比が１未満であることによって特徴付けられる。

【0021】

プライム・ブーストプロトコルも企図される。例えば、本発明はさらに、本明細書に記載のがん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物による対象のプライミング、続く抗原または関連抗原（例えば、同一または非常に類似したタンパク質配列に由来する第２の抗原）による対象の少なくとも１回のブースティングを含む、対象においてがん抗原に対する免疫応答を生成する方法を提供する。抗原の混合物は、プライミング工程およびブースティング工程のいずれかまたは両方で使用することができる。プライム工程、それに続く抗原ブースト工程のための改良ＬＡＭＰ構築物の使用は、非常に高い力価を生み出すことが示されており、抗体応答の増強におけるＬＡＭＰの力を示している。

【0022】

さらに好ましい実施形態では、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物をコードする核酸分子を、対象においてがん抗原に対する増強された免疫応答（例えば、有意により高い抗体力価を含む免疫応答）を誘発するプライム・ブーストを提供する様式で使用することができる。例えば、本明細書に記載のエピトープおよび／またはがん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、免疫応答（すなわち、エピトープおよび／または抗原がプロセシングされ、ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激されるようにＭＨＣクラスＩＩ分子に提示され、メモリ細胞が惹起されるか、および／または抗体が生成される）をプライミングするために、ならびに、例えばメモリ応答を拡大することによって免疫応答をブースティングするためのさらなるがんエピトープおよび／または抗原の発現を提供し、該ブースティングエピトープおよび／または抗原が対象の循環内に分泌されるために、使用することができる。免疫応答をプライミングするためのがんエピトープおよび／または抗原は、免疫応答をブースティングするためのエピトープおよび／または抗原と同じであっても異なっていてもよい。

【0023】

本発明のさらに別の目的は、（例えば、ヘルパーＴ細胞の刺激を介して抗腫瘍免疫応答を誘発することにより、がんおよび／または過剰増殖性障害の改良された治療方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0024】

本発明はさらに、本明細書に記載のがん抗原、具体的には、表１に列挙されるがん抗原である以下のがん抗原のいずれか１つを含む改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードする核酸分子を提供する：大型Ｔ抗原、小型Ｔ抗原、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥ－Ｂ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、またはＭＡＧＥＬ２。本発明はまた、核酸分子が、例えば、プライミングのための少なくとも１つの抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物をコードする核酸配列と、ブースティングのための少なくとも１つの抗原をコードする核酸配列とを含み、核酸配列のいずれかまたは両方が、（１または複数の）発現制御配列に動作可能に連結されている、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を提供する。好ましい一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物をコードする核酸分子は、対象にワクチン接種するのに適したワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、改良ＬＡＭＰ構築物、エピトープおよび／または抗原の細胞への導入を促進するための送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、脂質ベース（例えば、リポソーム製剤）、ウイルスベース（例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む）、または細胞ベースであり得る。

【0025】

好ましい実施形態では、本発明は、がん抗原に対する免疫応答（例えば、抗体の産生）を哺乳動物において誘発するための、目的のがん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を含む注射可能な組成物を提供する。好ましい実施形態では、このワクチンは、Ｔｈ２応答より優先的にＴｈ１応答を生成する。改良ＬＡＭＰ構築物は、本明細書に記載のがん抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。

【0026】

本発明はまた、免疫応答を生成するために使用できる、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む細胞を提供する。一態様では、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞など）であっても、または操作された抗原提示細胞（例えば、抗原提示に必要な分子、例えばＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように操作された非プロフェッショナル抗原提示細胞）であってもよい。抗原提示に必要な分子は、他の細胞、例えば天然細胞に由来するものであっても、またはそれ自体が操作されていても（例えば、抗原性エピトープに対する親和性が高いまたは低いなど、所望の特性を発現するように変異または改変されていても）よい。一態様では、抗原提示細胞は共刺激シグナルを一切発現せず、および／または任意選択のプライミング抗原およびブースティング抗原は自己抗原である。

【0027】

本発明は、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかを含む複数の細胞を含むキットをさらに提供する。少なくとも２種の細胞が異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、各細胞は同じＬＡＭＰ構築物を含む。一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物およびベクターを受け取るための細胞を含むキットが提供される。

【0028】

本発明はまた、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞および／または少なくとも１種の改良ＬＡＭＰ構築物を含むトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の細胞の少なくとも１種を含むトランスジェニック動物を提供する。

【0029】

本発明はさらに、上記細胞を対象（例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物）に投与することを含む、前記対象において抗原に対する増強された免疫応答を生成する方法であり、前記細胞が、前記対象において改良ＬＡＭＰ構築物を発現するか、または発現するように誘導され得る、方法を提供する。一態様では、細胞は、対象がＭＨＣクラスＩＩ分子に対する免疫応答を生成しないように、対象のＭＨＣタンパク質と適合するＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。好ましい一態様では、対象はヒトである。

【0030】

さらなる一態様において、本発明は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物などの対象に、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかを投与することを含む、がん抗原に対する増強された免疫応答を誘発する方法を提供する。好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物は対象の細胞に対して感染性である。例えば、改良ＬＡＭＰ構築物は、ワクシニアベクターなどのウイルスベクターであり得る。

【0031】

例えば、本発明は、本明細書に記載の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物による動物のプライミング、続く動物の少なくとも１回のブースティングを含む、動物においてがん抗原に対する免疫応答を生成する方法をさらに提供する。プライム工程、それに続く抗原ブースト工程のための改良ＬＡＭＰ構築物の使用は、非常に高い力価を生み出すことが示されており、抗体応答の増強におけるＬＡＭＰの力を示している。

【0032】

さらなる態様において、細胞は対象から得られ、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物（および任意選択的にブースティンエピトープおよび／または抗原と併せて）がこの細胞に導入され、この細胞またはこの細胞の子孫が対象に再導入される。一態様では、細胞は、抗原提示細胞に分化することができる幹細胞である。ヒト患者の治療および獣医学的使用が特に企図されている。

【0033】

本発明はまた、非ヒト脊椎動物において抗体を生成する方法を含み、当該方法では、非ヒト脊椎動物に、本明細書に記載の目的の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を注入する。次いで、目的のがん抗原は、非ヒト脊椎動物においてＬＡＭＰの助けを借りて免疫系に効率的に提示され、メモリ細胞が惹起され、抗原に対する抗体が産生される。

【0034】

具体的には、目的の抗原の提示をＬＡＭＰと組み合わせることにより、その後抗原は細胞質エンドソーム／リソソーム区画に効率的に輸送され、そこで抗原がプロセシングされ、抗原由来のペプチドが主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子の協力によって細胞表面に提示される。

【0035】

これらの生成された抗体は、脊椎動物の血液から（ポリクローナルとして）単離され、さらに標準的な技術を使用してモノクローナル抗体を生成するためにさらに分離される。

【0036】

好ましい実施形態では、非ヒト脊椎動物のゲノムは、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含み、前記導入領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座コード配列および非ヒト脊椎動物の内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づく非コード配列を含む。好ましくは、非ヒト脊椎動物のゲノムは、内因性免疫グロブリン領域の少なくとも一部またはすべてが除去されている。

【0037】

さらに好ましい実施形態では、非ヒト脊椎動物におけるヒトモノクローナル抗体の産生は、宿主がヒト重鎖免疫グロブリンタンパク質を発現する少なくとも１つの遺伝子座およびヒト軽鎖免疫グロブリンタンパク質を発現する１つの遺伝子座を有することを必要とする。

【0038】

いくつかの態様では、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈコード配列および非ヒト脊椎動物の内因性Ｖ_Ｈ領域に基づく非コードＶ_Ｈ配列を含む。これらの態様では、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子配列をさらに含む。

【0039】

他の態様では、免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｌコード配列および非ヒト脊椎動物の内因性Ｖ_Ｌ領域に基づく非コードＶ_Ｌ配列を含む導入領域を含む。より好ましくは、ヒトＶ_Ｌコード配列を含む導入部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＪ遺伝子コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＪ遺伝子配列をさらに含む。

【0040】

特定の態様では、脊椎動物は哺乳動物であり、好ましくは、哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスまたはラットである。他の態様では、脊椎動物は鳥類、例えばニワトリである。その他の非ヒト脊椎動物には、ウサギ、ラマ、ラクダ、牛、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、真猿類（例えばサルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、または類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）が含まれる。

【0041】

さらなる実施形態では、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子コード領域を含み、さらに、ｉ）ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列、ならびにｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子とｐｒｅ－ＤＪ配列を含む。他の態様では、Ｖ_Ｈ遺伝子コード領域は（少なくとも部分的に）他の供給源に由来する、例えば、それらは合理的に、または他の方法で設計された配列、ヒトと他の設計された配列との組み合わせである配列、または他の種、例えば非ヒト霊長類由来の配列であり得る。

【0042】

さらに別の特定の態様では、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｌ遺伝子コード領域を含み、さらに、ｉ）ヒトＪ遺伝子コード配列、およびｉｉ）非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＪ遺伝子配列を含む。特定の態様において、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトＶ_Ｈコード領域、ヒトＤおよびＪ遺伝子コード配列、ならびに非ヒト脊椎動物宿主の内因性ゲノムに基づく非コードＤおよびＪ遺伝子とｐｒｅ－ＤＪ配列とをさらに含む。

【0043】

本明細書に記載の方法は、診断および治療用途のための、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体を含む抗体の産生および／または最適化に使用することができる。そのような抗体を産生するハイブリドーマも本発明のさらなる目的である。

【0044】

これらおよびその他の態様、目的および特徴については、以下でさらに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0045】

本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、よりよく理解することができる。

【0046】

【図1】図１は、本明細書に記載のように使用できるさまざまなタイプの改良ＬＡＭＰ構築物（ＩＬＣ－１、ＩＬＣ－２、ＩＬＣ－３、ＩＬＣ－４、ＩＬＣ－５およびＩＬＣ－６として同定される）の一般的なスキームを例示している図である。

【図2】図２Ｂは、本明細書で定義されるＬＡＭＰタンパク質のドメインを示す図であり、図２Ａは、ヒトＬＡＭＰ－１（配列番号１）、ヒトＬＡＭＰ－２（配列番号２）、ヒトＬＡＭＰ－３（配列番号３）、ヒトＬＩＭＰ－２（配列番号４）、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）、ヒトマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）（配列番号８０）、ヒトＬＡＭＰ－５（配列番号９３）およびヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）に関するこれらのドメインの特定のアミノ酸境界を定義する図である。本明細書に記載されるように、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、相同ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部およびシグナル配列を使用して、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ－１、ＩＬＣ－２、ＩＬＣ－３、ＩＬＣ－４、ＩＬＣ－５およびＩＬＣ－６を作製することができる。

【図3】図３は、ヒトＬＡＭＰ－１（配列番号１）と比較した、他の種に見出されるＬＡＭＰ－１タンパク質のアライメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図３でヒトＬＡＭＰ－１に関して特定されたドメインと、図３に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図4】図４は、ヒトＬＡＭＰ－２（配列番号２）と比較した、他の種に見出されるＬＡＭＰ－２タンパク質のアライメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図４でヒトＬＡＭＰ－２に関して特定されたドメインと、図４に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図5】図５は、ヒトＬＡＭＰ－３（配列番号３）と比較した、他の種に見出されるＬＡＭＰ－３タンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図５でヒトＬＡＭＰ－３に関して特定されたドメインと、図５に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図6】図６は、ヒトＬＩＭＰ－２（配列番号４）と比較した、他の種に見出されるＬＩＭＰ－２タンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図６でヒトＬＩＭＰ－２に関して特定されたドメインと、図６に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図7】図７は、ヒトＬＩＭＢＩＣ（配列番号６７）と比較した、他の種に見出されるＬＩＭＢＩＣタンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図７でヒトＬＩＭＢＩＣに関して特定されたドメインと、図７に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図8】図８は、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ（配列番号５）と比較した、他の種に見出されるＥｎｄｏｌｙｎタンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図８でヒトＥｎｄｏｌｙｎに関して特定されたドメインと、図８に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図9】図９は、ヒトマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）（配列番号８０）と比較した、他の種に見出されるヒトマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）タンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図９でヒトマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）に関して特定されたドメインと、図９に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図10】図１０は、ヒトＬＡＭＰ－５（配列番号９３）と比較した、他の種に見出されるＬＡＭＰ－５タンパク質のアラインメントを提供する図である。これらの他の種の同等のドメインは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を生成するために使用することができ、図２および図１０でヒトＬＡＭＰ－５に関して特定されたドメインと、図１０に示されたアラインメントとを比較することで容易に同定可能である。

【図11A】図１１Ａは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物にクローニングされたＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}のアミノ酸配列を提供する図である。好ましくは、ＩＬＣ－４が使用され、例示される。

【図11B】図１１Ｂは、研究デサインを示す図である。

【図11C】図１１Ｃは、ＩＬＣ－４中のＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}が全脾細胞においてＩＦＮγペプチドのリコール応答を誘導する結果を示す図である。

【図11D】図１１Ｄは、ＩＬＣ－４中のＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}が、脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞ではペプチドのリコール応答においてＩＦＮγおよびＴＮＦα産生を誘導するが、脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞では誘導しないことを示す図である。

【図11E】図１１Ｅは、ペプチドプール２（配列番号１１４のａａ１４１～１６０）、ペプチド１３（配列番号１１４のａａ１４５～１５７）、および程度は低いが、ペプチド６（配列番号１１４のａａ１１７～１２９）、１２（配列番号１１４のａａ１４１～１５３）、および１７（配列番号１１４のａａ１６１～１７３）が、全脾細胞において観察されたＩＦＮγペプチドリコール応答を誘導することを示す図である。

【図12A】図１２Ａは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが、Ｂ１６－ＬＴＳ２２０Ａ腫瘍を与えられたワクチン接種マウスにおいて腫瘍発症を遅延させることを示す図である。

【図12B】図１２Ｂは、血液ＥＬＩＳＰＯＴ応答により、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種したマウスにおける最終的な腫瘍負荷が予測され得ることを報告している図である。

【図13A】図１３Ａは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａモデルにおいて生存を有意に延長することを示す図である。

【図13B】図１３Ｂは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含むＣＤ４５＋免疫細胞の腫瘍浸潤を誘導することを示す図である。

【図13C】図１３Ｃは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＮＫおよびＮＫＴ細胞の両方の腫瘍浸潤を誘導することを実証する図である。

【図13D】図１３Ｄは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが腫瘍内の骨髄細胞を変化させることを示す図である。

【図13E】図１３Ｅは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＴＭＥ内の制御性Ｔ細胞の数を増強するが、Ｔｒｅｇの数の増加は腫瘍負荷と相関しないことを示す図である。

【図13F】図１３Ｆは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰとの併用療法の価値を示唆する図である。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本発明は、改良ＬＡＭＰ構築物を提供し、これらはワクチンを生成するために、および／または抗体を産生するために使用することができる。改良ＬＡＭＰ構築物を使用して、免疫応答を調節または増強できる。好ましい一態様では、本発明は、本明細書に記載のがん抗原の１または複数を含む改良ＬＡＭＰ構築物を提供することにより、がんまたは過剰増殖性障害を有する患者を治療する方法を提供する。改良ＬＡＭＰ構築物はまた、非ヒト脊椎動物、および好ましくは非ヒト哺乳動物において抗体を産生するために使用することができる。

【0048】

定義
以下の定義は、以下の記述で使用される特定の用語に対して提供される。

【0049】

本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「細胞」には、それらの混合物を含む複数の細胞が含まれる。「核酸分子」という用語には、複数の核酸分子が含まれる。

【0050】

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、改良ＬＡＭＰ構築物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないという意味を意図している。「本質的に～からなる」は、改良ＬＡＭＰ構築物および方法を定義するために使用される場合、組み合わせにとって本質的に重要な任意の他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本質的に本明細書で定義される要素からなる改良ＬＡＭＰ構築物は、単離および精製方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」とは、他の成分の微量要素および本発明の改良ＬＡＭＰ構築物を投与するための実質的な方法工程を超えるものを除外することを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

【0051】

用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容範囲内であることを意味し、これは、値の測定または決定方法、例えば測定系の限界に一部依存する。例えば、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。または、特に生物学的な系または過程に関して、この用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特に他のことが明記されない限り、「約」という用語は、特定の値の許容誤差範囲内、例えば±１～２０％、好ましくは±１～１０％、より好ましくは±１～５％を意味する。

【0052】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値、およびその記載された範囲内の他の記載値または介在値は本発明に包含されることが理解されよう。これらのより小さな範囲の上限および下限は、このより小さな範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的な限界の除外を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれるそれらの限界の両方を除外した範囲も本発明に含まれる。

【0053】

本明細書で使用される「リソソーム／エンドソーム区画」とは、膜内にＬＡＭＰ分子、抗原プロセシングで機能する加水分解酵素、ならびに抗原の認識および提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む膜結合酸性液胞を指す。この区画は、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシス、およびピノサイトーシスを含むさまざまなメカニズムのいずれかによって細胞表面から内在化した異物、および特殊な自己分解現象によってこの区画に送達される細胞内物質の分解部位として機能する（ｄｅ Ｄｕｖｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１，１９８３）。本明細書で使用される「エンドソーム」という用語は、リソソームを包含する。

【0054】

本明細書で使用される「リソソーム関連オルガネラ」は、リソソームを含む任意のオルガネラを指し、限定するものではないが、ＭＩＩＣ、ＣＩＩＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解顆粒、血小板高密度顆粒、好塩基球顆粒、ビルベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソームなどを含む。好ましくは、そのようなオルガネラは、マンノース６－リン酸受容体を欠き、ＬＡＭＰを含むが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は含んでも、または含まなくてもよい。総説については、例えば、Ｂｌｏｔｔ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：１２６５－１２７８，２０００を参照されたい。

【0055】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を実行することができる。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子はまた、修飾された核酸分子（例えば、修飾された塩基、糖、および／またはヌクレオチド間リンカーを含む）を含んでもよい。

【0056】

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体の化合物、またはペプチド模倣物を指す。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル、エーテルなど）によって連結されていてもよい。

【0057】

本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合（例えば、約１０アミノ酸超）、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含するが、「ポリペプチド」は完全長タンパク質より短くてもよい。

【0058】

本明細書で使用される「ＬＡＭＰタンパク質またはＬＡＭＰポリペプチド」とは、本明細書に記載の哺乳動物のリソソーム関連膜タンパク質であるヒトＬＡＭＰ－１、ヒトＬＡＭＰ－２、ヒトＬＡＭＰ－３、ヒトＬＩＭＰ－２、ヒトＥｎｄｏｌｙｎ、ヒトＬＩＭＢＩＣ、ヒトＬＡＭＰ－５、またはヒトマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）、およびオルソログ（例えば、図３～１０に示されるＬＡＭＰタンパク質など）、ならびに対立遺伝子変異体のいずれかを指す。

【0059】

本明細書で使用される「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、および／またはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0060】

本明細書で使用される「転写制御下」または「作動可能に連結された」とは、発現制御エレメントおよびコード配列の適切な並置によって制御されるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）を指す。一態様では、発現制御配列がその配列の転写を制御および調節する場合、核酸配列は該発現制御配列に「作動可能に連結されている」。別の文脈において、「作動可能に連結されている」という用語は、エピトープまたは抗原などのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と、宿主細胞からのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分泌をもたらす分泌シグナル配列などのシグナル配列との連結を指す。

【0061】

本明細書で使用される「シグナル配列」とは、小胞体転座配列を示す。この配列は、細胞と通信して、（例えば化学結合を介して）細胞に連結しているポリペプチドを小胞体小胞区画に誘導し、エキソサイトーシス／エンドサイトーシスオルガネラに進入させ、細胞小胞区画、細胞表面のいずれかに送達させる、またはこのポリペプチドを分泌させるシグナルペプチドをコードする。このシグナル配列は、時としてポリペプチドの成熟時に細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有のさまざまなタンパク質に関連して見出される。

【0062】

本明細書で使用される「コード配列」とは、適切な発現制御配列の制御下に置かれたときに、転写されてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定するものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列も含むことができる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コード配列の３’に配置される。

【0063】

本明細書で使用される場合、配列またはそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードする場合、２つのコード配列は互いに「対応する」。

【0064】

本明細書で使用される「輸送」とは、粗面小胞体からエンドソーム／リソソーム区画への経路中の細胞オルガネラもしくは区画を介した、または抗原プロセシングおよびＭＨＣ ＩＩとの結合が生じる関連オルガネラを介した、改良ＬＡＭＰ構築物によってコードされるポリペプチドの移動または進行を表す。

【0065】

本明細書で使用される場合、「改良ＬＡＭＰ構築物」および「抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物」および「目的の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物」は互換的に使用される。改良ＬＡＭＰ構築物のさまざまな配置を、ＩＬＣ１～ＩＬＣ６として図１に示す。さらに、「改良ＬＡＭＰ構築物」の使用は、改良ＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列、および改良ＬＡＭＰ構築物のポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の両方を包含する。好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。

【0066】

本発明で使用される「がん抗原」または「抗原」は、表１に列挙されるがん抗原の１つ、特に、少なくとも１つの大型Ｔ抗原、小型Ｔ抗原、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥ－Ｂ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、またはＭＡＧＥＬ２として定義される。好ましい実施形態では、抗原は、配列番号１１５または配列番号１１６を含む。

【0067】

本明細書で使用される「改良ＬＡＭＰ構築物送達ビヒクル」は、改良ＬＡＭＰ構築物を宿主細胞に運ぶことができる、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物と関連して生じる任意の分子または分子群または高分子（例えば、遺伝子または遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマーなど）として定義される。

【0068】

本明細書で使用される「改良ＬＡＭＰ構築物送達」または「改良ＬＡＭＰ構築物移送」とは、導入に使用される方法に関係なく、改良ＬＡＭＰ構築物の宿主細胞への導入を指す。導入された改良ＬＡＭＰ構築物は、宿主細胞内で安定的または一時的に維持され得る。通常、安定した維持には、導入された改良ＬＡＭＰ構築物が、宿主細胞と互換性のある複製起点を含むか、染色体外レプリコン（プラスミドなど）または核またはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンに組み込まれることが必要である。

【0069】

本明細書で使用される「ウイルス性改良ＬＡＭＰ構築物」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達される改良ＬＡＭＰ構築物を含むウイルスまたはウイルス粒子を指す。ウイルス性改良ＬＡＭＰ構築物の例としては、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。遺伝子導入がアデノウイルスベクターによって媒介される態様では、改良ＬＡＭＰ構築物は、アデノウイルスゲノムまたはその一部、およびアデノウイルスカプシドタンパク質と関連する選択された非アデノウイルス遺伝子を含む。

【0070】

本明細書で使用される「アデノウイルス媒介遺伝子導入」または「アデノウイルス形質導入」とは、アデノウイルスが細胞に入ることにより、改良ＬＡＭＰ構築物が宿主細胞に導入される方法を指す。好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物は、細胞内で複製および／または組込みおよび転写され得る。

【0071】

本明細書で使用される「アデノウイルス粒子」は、外部カプシドおよび改良ＬＡＭＰ構築物を含む個々のアデノウイルスビリオンであり、このカプシドはさらにアデノウイルスエンベロープタンパク質を含む。アデノウイルスエンベロープタンパク質は、例えば、アデノウイルス粒子が特定の細胞および／または組織型を標的とするために、ウイルスタンパク質に共有結合したポリペプチドリガンドを含有する融合ポリペプチドを含むように改変されてもよい。

【0072】

本明細書で使用される場合、改良ＬＡＭＰ構築物の「投与」または「免疫化」または「注入」という用語は、改良ＬＡＭＰ構築物で細胞を形質導入、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または発射することを指す。いくつかの態様では、改良ＬＡＭＰ構築物は、標的細胞を送達細胞と接触させることにより（例えば、細胞融合により、または送達細胞が標的細胞に近接している場合に送達細胞を溶解することにより）標的細胞に導入される。

【0073】

本明細書で使用される「プライム・ブースト」という語句は、Ｔ細胞応答をプライムするために使用される本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物の使用、その後の、抗原を含む第２の改良ＬＡＭＰ構築物、抗原もしくは組換え抗原を含むＤＮＡワクチンの、前記応答をブーストするための使用（またはその逆）を表す。これらの異種プライム・ブースト免疫化は、同じベクターによるプライミングおよびブースティングにより達成できるよりも高く幅広い免疫応答を誘発する。抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物によるプライミングは、メモリ細胞を惹起し、ブースト工程は、メモリ応答を拡大させる。好ましくは、互いに対する反応を引き起こさない、したがって、互いの活性に干渉しない２つの異なる薬剤が使用される。抗原の混合物は、プライムおよび／またはブースト工程において特に企図される。ブースティングは１回または複数回行ってもよい。

【0074】

さらなる実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物をコードする核酸分子が、対象において増強された免疫応答（例えば、有意により高い抗体力価を含む免疫応答）を誘発するプライム・ブーストを提供するために使用され得る。例えば、核酸分子（例えば、プラスミドまたはベクター）は：免疫応答をプライミングするためのがんエピトープおよび／または抗原（本明細書において「プライミングエピトープ」または「プライミング抗原」と呼ばれる）を含む改良ＬＡＭＰ構築物を発現し、該プライミングエピトープおよび／または抗原がプロセシングされ、ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激されるようにＭＨＣクラスＩＩ分子に提示され、メモリ細胞が惹起されるか、および／または抗体が生成されるために；ならびに、メモリ応答を拡大することによって免疫応答をブースティングするためのエピトープおよび／または抗原（本明細書において「ブースティングエピトープ」および／または「ブースティング抗原」と呼ばれる）を発現し、該ブースティングエピトープおよび／またはブースティング抗原が対象の循環内に分泌されるために、提供され得る。免疫応答をプライミングするためのプライミングエピトープおよび／または抗原は、免疫応答をブースティングするためのブースティングエピトープおよび／または抗原と同じであっても異なっていてもよく、エピトープと抗原の混合物もまた具体的に企図される。

【0075】

本明細書で使用される「分泌される」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が細胞外環境に放出され、例えば対象の循環に入り得るように、細胞壁を通って輸送されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をもたらす細胞内のプロセスおよび経路を指す。細胞外環境に向かう運命の（すなわち、分泌されるべき）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質には、典型的には、一般にＮ末端に位置する分泌シグナル配列が備わっており、これが該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を翻訳するリボソームを粗面小胞体（粗面ＥＲ）に向かわせて、そこから、新しく作られたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、放出のためにペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を細胞表面に輸送する小輸送小胞または分泌小胞に組み込まれ得る。

【0076】

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などの、より広範な方法の工程を構成してもよい。

【0077】

本明細書で使用される場合、別の配列に対して特定の割合（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、当技術分野で日常的なソフトウェアプログラムを使用して最大限にアライメントした場合、その塩基（またはアミノ酸）割合は、２つの配列を比較すると同じであることを意味する。

【0078】

少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％のヌクレオチドが、ＤＮＡ配列の規定された長さにわたって一致する場合、２つの配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。同様に、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％のポリペプチドのアミノ酸残基がポリペプチド配列の規定された長さにわたって一致する場合、２つの配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより同定することができる。実質的に相同な核酸配列は、例えば、その特定の系に対して定義されたストリンジェントな条件の下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定することもできる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、４２℃における５ｘＳＳＣおよび５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、６０℃における０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムでの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、以下が挙げられる：約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６ｘＳＳＣ～約１０ｘＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；約６ｘＳＳＣの洗浄液。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、以下が挙げられる：約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９ｘＳＳＣ～約２ｘＳＳＣのバッファー濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；約５ｘＳＳＣ～約２ｘＳＳＣの洗浄溶液。高ストリンジェントな条件の例としては、以下が挙げられる：約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１ｘＳＳＣ～約０．１ｘＳＳＣのバッファー濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；約１ｘＳＳＣ、０．１ｘＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分～２４時間で１、２回、またはそれ以上の洗浄工程があり、洗浄インキュベーション時間は約１、２、または１５分である。ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸バッファーである。他のバッファー系を使用するＳＳＣの同等物を使用できることは理解されよう。類似性は配列決定により検証できるが、好ましくは、または代替として、問題の特定のドメインに適したアッセイを使用して、機能（例えば、エンドソーム区画への輸送能力など）により検証することもできる。

【0079】

「配列類似性パーセント（％）」、「配列同一性パーセント（％）」などの用語は、一般に、共通の進化的起源を共有していても、またはしていなくてもよい、核酸分子の異なるヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す。（上記Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージのプログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィスコンシン）など、多数の公的に利用可能な配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して決定することができる。

【0080】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸分子間の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較対象についてアライメントする。２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）ｘ１００）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さであるか、またはほぼ同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許可するかどうかにかかわらず、以下で説明するものと同様の手法を使用して決定できる。配列同一性パーセントの計算では、通常、完全一致がカウントされる。

【0081】

２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現できる。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０，８７：２２６４の、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０：５８７３－５８７７で修正されたアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行して、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行されて、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較対象のギャップのあるアラインメントを取得するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９に記載のギャップのあるＢＬＡＳＴを利用できる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行できる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップのあるＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータ（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴなど）を使用できる。ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい。

【0082】

配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ １９８８；４：１ １－１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用できる。

【0083】

好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂのａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４４－４５３）のアルゴリズムを、使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット（および、どのパラメータを、分子が本発明の配列同一性または相同限界内にあるかを決定するために適用されなければならないかを、実施者が確認できない場合に使用できるパラメータ）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスで１２のギャップオープンペナルティ、４のギャップ拡張ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを使用する。

【0084】

同一性パーセントを決定する方法の別の非限定的な例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載されているようなソフトウェアプログラムを使用することである。好ましくは、デフォルトのパラメータをアライメントに使用する。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類方法（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで確認できる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。

【0085】

本明細書に記載される特性の統計分析は、標準的な試験、例えば、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、またはカイ二乗検定によって実行することができる。通常、統計的有意性はｐ＝０．０５（５％）、より好ましくはｐ＝０．０１、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００００１のレベルまで測定される。

【0086】

ドメイン配列の「保存的に改変された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって実現できる（Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８）。

【0087】

野生型タンパク質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な同等物」および「機能的誘導体」という用語は、活性の検出に適したアッセイを使用して測定された野生型タンパク質の生物活性と少なくとも実質的に等しい（例えば、有意に異ならない）生物学的活性を有する。

【0088】

本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｖｏ」核酸送達、核酸導入、核酸療法」などは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物（および任意選択的にブースティングがんエピトープおよび／または抗原と併せて）をヒトまたは非ヒト哺乳動物などの対象の体内に直接導入し、これにより、改良ＬＡＭＰ構築物がそのような生物の細胞にｉｎ ｖｉｖｏで導入されることを指す。

【0089】

本明細書で使用される「ｉｎ ｓｉｔｕ」という用語は、改良ＬＡＭＰ構築物が標的細胞に近接するｉｎ ｖｉｖｏ核酸送達を指す（例えば、核酸は全身投与されない）。例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ送達法は、限定するものではないが、改良ＬＡＭＰ構築物を部位に（例えば、腫瘍または心筋などの組織に）直接注入する工程、改良ＬＡＭＰ構築物と（１または複数の）細胞または組織とを直視下手術野を介して接触させる工程、または改良ＬＡＭＰ構築物をカテーテルなどの医療用アクセス装置を使用して部位に送達する工程を含む。

【0090】

本明細書で使用される「単離された」または「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が通常自然に関連する細胞およびその他の構成要素から分離（または実質的に遊離）されることを意味する。例えば、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物に関して、単離されたポリヌクレオチドは、それが通常染色体に関連している５’および３’配列から分離されたものである。当業者には明らかなように、非天然のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、その天然の対応物と区別するために「単離」を必要としない。実質的に含まない、または実質的に精製されたとは、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、天然には一緒である成分を含まないことを意味する。

【0091】

本明細書で使用される「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、個々の細胞、または本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のレシピエントであることが望まれる、またはレシピエントであった細胞を指す。この用語は、単一細胞の子孫を含むことも意図しており、子孫は、自然、偶発的、または意図的な突然変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ相補体）ではない場合がある。標的細胞は、他の細胞（例えば、組織の細胞）と接触している場合もあれば、または生物の体内で循環している場合もある。

【0092】

本明細書で使用される「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定するものではないが、ネズミ、真猿類、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが挙げられる。他の好ましい実施形態では、「対象」は、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、またはウサギ）、ラマ、ラクダ、ウシ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、真猿類（例えばサルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、または類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）である。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療効果を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えば、ネズミ、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ動物）を使用してもよい。

【0093】

「がん」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は互換的に、単数形または複数形のいずれでも使用され、宿主生物を病的にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性がん細胞の形質転換は、宿主生物を病的にする。原発性がん細胞（すなわち、悪性形質転換部位の近くから得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査により、非がん性細胞と容易に識別可能である。本明細書で使用されるがん細胞の定義には、原発性がん細胞だけでなく、がん細胞祖先に由来する任意の細胞が含まれる。これには、転移したがん細胞、およびがん細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として現れるタイプのがんに言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診などの手順によって、腫瘍塊に基づいて検出可能なもの、および／または患者から得られるサンプル中の１または複数のがん特異的抗原の発現のために検出可能なものである。

【0094】

好ましい実施形態では、がん（過形成を含むすべての進行段階を含む）は、腺がん、肉腫、皮膚がん、（例えば、メルケル細胞がん）、黒色腫、膀胱がん、脳がん（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）（多形性神経膠芽腫を含む）、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん（限定するものではないが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮がんを含む）、結腸直腸がん、肛門がん、直腸がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭頸部がん、口腔がん、唾液腺がん、食道がん、膵臓がん、膵管腺がん（ＰＤＡ）、腎がん、胃がん、腎がん、多発性骨髄腫または脳がん（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）である。また、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物で治療される好ましい疾患には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって引き起こされる過剰増殖性障害またはがんが含まれる。

【0095】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水などの標準的な医薬担体のいずれか、および油／水または水／油乳エマルジョンなどのエマルジョンおよびさまざまな種類の湿潤剤を包含する。改良ＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、安定剤および防腐剤も含むことができる。担体、安定剤、アジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照されたい。

【0096】

改良ＬＡＭＰ構築物の核酸分子が細胞内に導入された場合、そのような核酸によって細胞は「形質転換」、「形質導入」、または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合）されていても、組み込まれていなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、改良ＬＡＭＰ構築物の核酸分子は、プラスミドなどのエピソーム要素において維持され得る。真核細胞では、安定に形質転換された細胞とは、改良ＬＡＭＰ構築物の核酸分子が染色体に組み込まれ、染色体複製を通じて娘細胞に継承される細胞である。この安定性は、該核酸分子を含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」とは、有糸分裂による単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代（例えば、少なくとも約１０世代）にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで安定した増殖が可能な、初代細胞のクローンである。

【0097】

本明細書で使用される「有効量」とは、有益なまたは所望の結果に影響を与えるのに十分な量、例えば、改良ＬＡＭＰ構築物の移入および／または発現の有効量、および／または所望の治療終点の達成の有効量などである。有効量は、１または複数回の投与、適用または投与量で投与することができる。一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物の有効量は、少なくとも２つの細胞を含む細胞集団内の少なくとも１つの細胞を形質転換／形質導入／トランスフェクトするのに十分な量である。

【0098】

本明細書で使用される「治療有効量」は、異常な生理学的応答を予防、修正、および／または正常化するのに十分な量を意味するために本明細書で使用される。一態様では、「治療有効量」は、例えば、病理学の臨床的に重要な特徴、例えば、腫瘍塊の大きさ、抗体産生、サイトカイン産生、発熱または白血球数などを少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント減少させるために十分な量である。

【0099】

「抗体」とは、特異的抗原に結合する抗体およびその断片を含む免疫グロブリンである。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）が包含される。「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ｖ）部分を含むパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分であり、それらの部分は本明細書に記載の治療方法での使用に好ましい。したがって、抗体という用語は、全抗体分子だけでなく、抗体断片、ならびに抗体および抗体断片の変異体（融合タンパク質などの誘導体を含む）も包含する。本出願において「抗体」という用語によって説明される分子の例には、限定するものではないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むか、またはそれらからなる断片が含まれる。本明細書で使用される「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体のＶＨドメインに連結された抗体のＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。Ｃａｒｔｅｒ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４３を参照されたい。

【0100】

さらに、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を使用して生成され得る抗体には、限定するものではないが、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、ヒト、ヒト化、マウス、またはキメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ科抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ドメイン抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。

【0101】

最も好ましくは、抗体はヒト抗体である。本明細書で使用される「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーおよびゼノマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）またはヒト抗体を産生するように遺伝子操作された他の生物から単離された抗体が含まれる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、例示のプロトコルに記載されるように、ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するための公知の技術と組み合わせて使用することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；および第５，９３９，５９８号；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい。

【0102】

ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、改良ＬＡＭＰ構築物を本明細書に記載の技術または当技術分野で公知の他の技術と組み合わせて使用して作製することができる。例えば、キメラ抗体を作製するための標準的な方法は当技術分野で公知である。総説については、以下の参考文献を参照されたい：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６０１５３３号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８７０２６７１号；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）。

【0103】

本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を使用して生成され得る抗体は、一価、二価、三価または多価であり得る。例えば、一価ｓｃＦｖは、化学的に、または別のタンパク質もしくは物質との結合により多量体化することができる。ヘキサヒスチジンタグまたはＦｌａｇタグと融合したｓｃＦｖは、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）または抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）を使用して多量体化することができる。さらに、改良ＬＡＭＰ構築物を使用して、改良ＬＡＭＰ構築物に含まれるコードされた（１または複数の）抗原に対する単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性を生成することができる。例えば、ＰＣＴ公報国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい。

【0104】

「エピトープ」は、通常、短いペプチド配列またはオリゴ糖で構成される構造であり、免疫系の成分によって特異的に認識または特異的に結合される。Ｔ細胞エピトープは、一般に線状オリゴペプチドであることが示されている。同じ抗体が特異的に結合できる場合、２つのエピトープは互いに対応する。両方が同じＢ細胞受容体または同じＴ細胞受容体に結合できる場合、２つのエピトープは互いに対応し、１つの抗体がそのエピトープに結合すると、他のエピトープによる結合が実質的に妨げられる（例えば、約３０％未満、好ましくは、約２０％未満、より好ましくは約１０％、５％、１％、または約０．１％未満の他のエピトープが結合する）。複数のエピトープが抗原を構成できることは理解されよう。

【0105】

表１および／または図１１Ａに示されるように、本明細書で使用される「抗原」または「目的の抗原」という用語は、自然免疫応答または適応免疫応答を誘発するために使用される、改良ＬＡＭＰ構築物にクローニングされたポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド配列を包含する。「抗原」は、改良ＬＡＭＰ構築物にクローニングされた単一の抗原および複数の抗原配列（同じまたは異なるタンパク質に由来する）の両方を包含する。

【0106】

本明細書で使用される「抗原提示細胞」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子もしくはその一部、または１もしくは複数の非古典的ＭＨＣ分子もしくはその一部に関連する抗原をその表面に提示する任意の細胞を含む。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に説明するが、これらの例としては、限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、およびフォスター抗原提示細胞（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）などの細胞全体が挙げられる。

【0107】

本明細書で使用される「操作された抗原提示細胞」とは、その表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、そのような細胞は、その表面に天然に共刺激物質を有さないか、その表面に天然共刺激物質に加えて追加の人工共刺激物質を有し得るか、その表面に非天然のクラスＩＩ分子を発現することができる。好ましい実施形態では、操作された抗原提示細胞は、その表面上に改良ＬＡＭＰ構築物により発現された抗原を有する。

【0108】

本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」とは、抗原に結合することができ、免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、限定するものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ系統、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症性、または他の浸潤からのＣＴＬが含まれる。

【0109】

本明細書で使用される「部分的ヒト」とは、ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方由来の配列を有する核酸を指す。部分的ヒト配列の文脈において、部分的ヒト核酸は、ヒト免疫グロブリンコード領域の配列および非ヒト脊椎動物の内因性免疫グロブリン領域の非コード配列に基づく配列を有する。非ヒト脊椎動物由来の内因性非コード配列に関して使用される場合、「に基づく」という用語は、非コード配列に対応し、宿主脊椎動物、例えば、ＥＳ細胞が由来する非ヒト脊椎動物の内因性遺伝子座の非コード配列と比較的高度の相同性を共有する配列を指す。好ましくは、非コード配列は、非コードを含む部分的ヒト分子が導入されている非ヒト脊椎動物宿主細胞の内因性遺伝子座に見出される、対応する非コード配列と少なくとも８０％、より好ましくは９０％の相同性を共有する。

【0110】

本明細書で使用される「免疫グロブリン可変領域」という用語は、抗体分子の可変領域のすべてもしくは一部、または抗体分子の発現を制御する調節ヌクレオチド配列のすべてもしくは一部をコードするヌクレオチド配列を指す。重鎖の免疫グロブリン領域は、限定するものではないが、Ｖ、Ｄ、Ｊ、およびイントロンを含むスイッチ領域のすべてまたは一部を含み得る。軽鎖の免疫グロブリン領域は、限定するものではないが、ＶおよびＪ領域、それらの上流隣接配列、軽鎖定常領域遺伝子に関連または近接するイントロンを含み得る。

【0111】

「トランスジェニック動物」とは、その細胞の一部に染色体外要素として存在する、または生殖系列ＤＮＡに（すなわち、その細胞の大部分またはすべてのゲノム配列中に）安定的に組み込まれた、外因性核酸配列を有する非ヒト動物、通常哺乳動物を意味する。ヒト配列を含むトランスジェニック動物の作製では、部分的ヒト核酸が、当技術分野で周知の方法に従って、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝子操作により、そのようなトランスジェニック動物の生殖系列に導入される。

【0112】

「ベクター」には、自己複製するかどうかに関係なく、細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用できるプラスミドとウイルス、および任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。

【0113】

細胞の「単離」または「精製」集団は、天然には付随する細胞および材料を実質的に含まない。実質的に含まない、または実質的に精製されたＡＰＣとは、集団の少なくとも５０％がＡＰＣである、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、天然には付随する非ＡＰＣ細胞を含まないことを意味する。

【0114】

本明細書で使用される「遺伝子改変」とは、細胞の正常なヌクレオチドへの任意の付加、欠失、または破壊を指す。ＡＰＣの遺伝子改変を達成することができる任意の方法は、本発明の精神および範囲内にある。当技術分野で認められている方法には、ウイルス媒介遺伝子導入、リポソーム媒介導入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づく改良ＬＡＭＰ構築物ならびにレトロウイルスベースのベクターの使用などのウイルス媒介遺伝子導入が含まれる。

【0115】

本発明の実施は、特に他のことが明記されない限り、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｉ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。

【0116】

特に他のことが定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本明細書に記載される発明に関連して使用され得るデバイス、製剤、および方法論を説明および開示する目的で参照により組み込まれる。

【0117】

例示的な実施形態
以下は、例示的な好ましい実施形態である。
１．以下を含む改良ＬＡＭＰ構築物：
ａ．ＬＡＭＰタンパク質のシステイン保存断片；および
ｂ．下記から選択される少なくとも１つのがん抗原：大型Ｔ抗原、小型Ｔ抗原、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥ－Ｂ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ１＿（ＭＡＧＥ１）、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、またはＭＡＧＥＬ２。
２．ａ．前記抗原が前記システイン保存断片のＮ末端に配置されている、
ｂ．前記抗原が単一のシステイン保存断片のＣ末端に配置されている、または
ｃ．前記抗原が２つのシステイン保存断片の間に配置されている、
請求項１に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
３．表１の１列目または４列目に記載の少なくとも１つの断片／エピトープを含み、好ましくはＩＬＣ－１、ＩＬＣ－２、ＩＬＣ－３、ＩＬＣ－４、ＩＬＣ－５またはＩＬＣ－６に示すように構築される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
４．各抗原がリンカーによって分離されており、好ましくは前記リンカーがアミノ酸配列ＧＰＧＰＧ（配列番号１５２）またはＰＭＧＬＰ（配列番号１５３）である、請求項３に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
５．複数のシステイン保存断片を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
６．前記システイン保存断片がＬＡＭＰタンパク質の相同ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
７．ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
８．シグナル配列をさらに含み、好ましくは前記シグナル配列はＬＡＭＰタンパク質に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
９．前記ＬＡＭＰタンパク質が、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ－３、ＬＩＭＰ２、マクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＡＭＰ５またはＬＩＭＢＩＣから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
１０．以下を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物：
Ａ）配列番号１～１１３のいずれか１つから選択されるＬＡＭＰタンパク質、および配列番号１１４～１１６のいずれか１つから選択されるがん抗原；
Ｂ）ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰのアミノ酸配列（配列番号１５１）；または
Ｃ）配列番号１１７～１５０のいずれか１つと組み合わせた（Ａ）または（Ｂ）のいずれか。
１１．前記ＬＡＭＰタンパク質が、配列番号１～１１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、および／または前記がん抗原が、配列番号１１４～１５１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、請求項１２に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
１２．配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、好ましくは前記ＬＡＭＰタンパク質がヒトＬＡＭＰ１であり、また、好ましくはＩＬＣ－４である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物。
１３．請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチド。
１４．ＤＮＡワクチンである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
１５．自己複製ＲＮＡワクチンである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
１６．請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１７．請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１６に記載の宿主細胞を含む組成物。
１８．請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の組成物を、それを必要とする対象に疾患または障害を軽減または治療するための十分量で投与することを含む、疾患または障害を有する対象を治療する方法。
１９．プライミング工程および少なくとも１回のブースティング工程を含む、請求項１８に記載の方法。
２０．請求項１～１２のいずれか一項に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１７に記載の組成物をプライミング工程に使用する、請求項１９に記載の方法。
２１．前記ブースティング工程が、抗原、改良ＬＡＭＰ構築物、改良ＬＡＭＰ構築物によりコードされるポリペプチド、または前記改良ＬＡＭＰ構築物を含む細胞の投与を含む、請求項１９または２０のいずれかに記載の方法。
２２．
ａ）プライムに使用される抗原がブーストに使用されるものと同じである；
ｂ）プライムに使用される抗原が、ブーストに使用される第２の抗原と同じタンパク質に由来する；
ｃ）複数の抗原がプライムおよび／またはブーストに使用される、
請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記対象が過剰増殖性障害を有する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記過剰増殖性障害が、腺がん、肉腫、皮膚がん、（例えば、メルケル細胞がん）、黒色腫、膀胱がん、脳がん（多形性神経膠芽腫を含む）、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん（限定するものではないが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮がんを含む）、結腸直腸がん、肛門がん、直腸がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭頸部がん、口腔がん、唾液腺がん、食道がん、膵臓がん、膵管腺がん（ＰＤＡ）、腎がん、胃がん、腎がん、多発性骨髄腫または脳がんから選択される、請求項２３に記載の方法。
２５．前記過剰増殖性障害がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）によって引き起こされる、請求項２３または２４のいずれかに記載の方法。
２６．前記対象にさらにチェックポイント阻害剤が投与され、好ましくは、前記チェックポイント阻害剤がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＣＴＬＡ阻害剤である、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））から選択される、請求項２６に記載の方法。

【0118】

ＬＡＭＰ構築物
ｃＤＮＡクローンから推定されるＬＡＭＰ－１（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８７５４，１９８８）は、約３８２アミノ酸のポリペプチドコアと大きな（３４６残基）内腔アミノ末端ドメイン、それに続く２４残基の疎水性膜貫通領域と短い（１２残基）カルボキシル末端細胞質尾部からなる。図２Ａおよび図２Ｂを参照されたい。内腔ドメインは高度にグリコシル化され、約２０個のアスパラギン連結複合型オリゴ糖で置換されており、プロリン／セリンリッチ２２残基の「ヒンジ」領域によって分離された２つの約１６０残基の「相同ドメイン」からなる。これらの「相同ドメイン」はそれぞれ、４つの均一に間隔を空けたシステイン残基を含み、ジスルフィド結合して、内腔ドメインの両半分に対称的に配置された４つの３６～３８の残基ループを形成する（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７４１９，１９９０；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５：２６３（１８）：８７５４－８，１９８８も参照されたい）。図２Ａは、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ－２、ＬＡＭＰ－３、Ｅｎｄｏｌｙｎ、ＬＩＭＢＩＣ、ＬＡＭＰ５、またはマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）間の保存されたドメインを模式的に示している。

【0119】

以前に報告されたＬＡＭＰ構築物は、この特定の配置で以下の要素を含む：
（ａ）ＬＡＭＰ－１タンパク質の完全内腔ドメイン、抗原、次いでＬＡＭＰ－１タンパク質の完全な膜貫通／細胞質尾部；または
（ｂ）抗原およびＬＡＭＰ－１タンパク質の完全な膜貫通／細胞質尾部。

【0120】

例（ａ）では、抗原配列は、ＬＡＭＰ－１タンパク質の完全内腔ドメインとＬＡＭＰ－１完全膜貫通ドメイン／細胞質尾部との間に挿入される。両方の構築物は、抗原配列をうまくリソソーム／エンドソームの標的とすることが示されており、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物ＩＬＣ－１～ＩＬＣ－６と比較して、図１に示すように「完全ＬＡＭＰ構築物」と呼ばれる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、先行技術に記載の完全ＬＡＭＰ構築物は含まない。

【0121】

さらに、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインのＮ末端、ＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つの相同ドメインのＮ末端もしくはＣ末端、またはＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つのシステイン保存断片のＮ末端もしくはＣ末端に融合した少なくとも１つの目的のプライミングエピトープおよび／または抗原を含み得る（例えば、図１のＩＬＣ－１～ＩＬＣ－６を参照されたい）。しかし、いくつかの好ましい改良ＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の第１の相同ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合された少なくとも１つの目的のプライミングエピトープおよび／または抗原を含む（例えば、図１のＩＬＣ－４を参照されたい）。例えば、少なくとも１つの目的の抗原は、ＬＡＭＰヒンジ領域内に配置されてもよく、またはＬＡＭＰヒンジ領域を置換してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、この構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部をさらに含む。

【0122】

文献では、ＬＡＭＰ－１の完全内腔ドメインよりも小さい断片は、強固な免疫応答を生成するのに有効ではないことが広く報告されている（例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏらを参照されたい）。対照的に、本発明者らは、予想外にも、特定の配置において、特定の断片が実際に本抗原を免疫系に効果的に提示し、多くの場合、抗体の異なるレパートリーの生成を含む、より強固な免疫応答を生成することを発見した。例えば、本発明者らは、強固な免疫応答を生成するために有効な最小ＬＡＭＰ内腔ドメイン断片は、（文献で広く報告されているように）完全内腔ドメインではなく、むしろＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインであることを特定した。

【0123】

例えば、構築物は、完全内腔ドメインを含まなくてもよく、その代わりにＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインを含めばよい。本明細書で使用される「相同ドメイン」は、図３～１０に示される少なくとも４つの均一に間隔を空けたシステイン残基を含む。これらのシステインの存在は、図３～１０に示すように、各相同ドメインにおいて１、２、３、および４と標記され（ＬＩＭＰ－２およびマクロシアリン（Ｍａｃｒｏｓａｉｌｉｎ）では５つのシステインが同定され、ＬＩＭＢＩＣでは６つのシステインが同定され、Ｅｎｄｏｌｙｎでは８つのシステインが同定されている）、本明細書では「システイン保存断片」と定義される。追加のアミノ酸をシステイン保存断片のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかに含めて、ＬＡＭＰタンパク質の完全相同ドメインを生成することができる。これらの追加の付加アミノ酸は、システイン保存断片が由来する相同ドメインに由来するか、または他のＬＡＭＰタンパク質相同ドメインに由来し得る。したがって、本明細書で使用する場合、ＬＡＭＰ相同ドメインは、１つのシステイン保存断片を含み、および／またはそれからなる。少なくとも２つのＬＡＭＰ相同ドメインが、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ－２、ＬＡＭＰ－３、またはＥｎｄｏｌｙｎの内腔ドメインを構成する。

【0124】

具体的には、好ましい一実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は、表１に記載の少なくとも１つのがん抗原（好ましくは表１の４列目に記載の配列／断片／エピトープ）、および／またはＬＡＭＰタンパク質の内腔ドメイン、ＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つの相同ドメイン、またはＬＡＭＰタンパク質の少なくとも１つのシステイン保存断片のＮ末端に融合された段落［１３４］に記載の組合わせを含む。例えば、図１のＩＬＣ－２およびＩＬＣ－６を参照されたい。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部をさらに含む。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインが改良ＬＡＭＰ構築物に含まれる（例えば、図１のＩＬＣ－１）。さらに好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ－２、ＬＡＭＰ－３、またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。または、２つの相同ドメインは異なるＬＡＭＰタンパク質に由来する。２つの相同ドメインを含むこれらの構築物には、ＬＡＭＰヒンジドメインも含まれ得る。内腔ドメインの断片が強固な免疫応答の生成に有効であるという報告は為されていないので、この段落に記載された改良ＬＡＭＰ構築物は、抗原は常に完全内腔ＬＡＭＰ－１ドメインと完全ＬＡＭＰ－１膜貫通／細胞質尾部との間に常に配置されるという先行技術の観点から予想外である。

【0125】

別の好ましい一実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は、表１に記載の少なくとも１つのがん抗原（好ましくは表１の４列目に記載の配列／断片／エピトープ）、および／またはＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインもしくはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片のＣ末端に融合された、段落［１３４］に記載の組合わせ（例えば、図１のＩＬＣ－５）を含む。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部をさらに含む（例えば、図１のＩＬＣ－３）。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。表１に記載のがん抗原は、図１に示すように完全ＬＡＭＰ構築物に挿入することもできる。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質由来の２つの相同ドメインを使用してもよい。内腔ドメインの断片が強固な免疫応答の生成に有効であるという報告は為されていないので、この段落に記載された改良ＬＡＭＰ構築物は、抗原は常に完全内腔ＬＡＭＰ－１ドメインと完全ＬＡＭＰ－１膜貫通／細胞質尾部との間に配置されるという先行技術の観点からは予想外である。

【0126】

したがって、改良ＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の単一の相同ドメインまたはＬＡＭＰタンパク質の単一のシステイン保存断片のＣ末端に融合された、表１に記載の少なくとも１つのがん抗原（好ましくは表１の４列目に記載の配列／断片／エピトープ）を含む。例えば、図１のＩＬＣ－３およびＩＬＣ－５を参照されたい。好ましい実施形態では、これらの構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部をさらに含む。他の好ましい実施形態では、抗原が膜貫通ドメインを含む場合、ＬＡＭＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび／またはＬＡＭＰタンパク質のサイトゾル尾部は不要である。この段落に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、上記の先行技術の観点から予想外である。

【0127】

別の好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の第１の相同ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合された少なくとも１つの目的の抗原を含む。例えば、図１のＩＬＣ－４を参照されたい。好ましい実施形態では、２つの相同ドメインは、ＬＡＭＰ－１、ＬＡＭＰ－２、ＬＡＭＰ－３、またはＥｎｄｏｌｙｎタンパク質に由来する。これらの構築物において、抗原はＬＡＭＰヒンジ領域に配置され得る。あるいは、２つの異なるＬＡＭＰタンパク質由来の２つの相同ドメインを使用してもよい。２つのＬＡＭＰ相同ドメイン（システイン保存断片を含む）の間に融合された、表１に記載の少なくとも１つのがん抗原（好ましくは表１の４列目に記載の配列／断片／エピトープ）のこの配置は、上記の先行技術の観点からは予想外である。

【0128】

上記の改良ＬＡＭＰ構築物は、図で定義されたドメインを使用して作製することができる。例えば、図１に例示される改良ＬＡＭＰ構築物に含まれるドメインは、例えば、オルソロガス配列に由来する配列を起源とし得ることが特に企図される。例えば、図３～１０を参照されたい。図２Ａおよび２Ｂで定義された同等のドメインを使用して、オルソロガス配列について図１に例示された改良ＬＡＭＰ構築物を作製することが明確に企図される。さらに、図３～１０に示されているオルソロガス配列は、ドメインの生成に使用できる配列の代表である。他のオルソロガス配列および／またはアイソタイプを同定し、それらを図３～１０に示されているアラインメントと比較することは、十分に当業者の技術の範囲内である。したがって、図３～１０に示す配列を有するヒトＬＡＭＰタンパク質の図２Ａおよび２Ｂで定義された同等の境界を同定することにより、図１に例示する改良ＬＡＭＰ構築物を生成することができる。

【0129】

当業者には十分に理解されるように、各ドメインの境界は近似値であり、クローニングの考慮事項および制限酵素の配置に基づいて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を調整することができる。したがって、特定のドメイン（例えば、ＬＡＭＰ相同ドメイン）が改良ＬＡＭＰ構築物に含まれる場合、ドメインの開始と終了のアミノ酸は、図２Ａで定義されている境界において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を調整することができる。

【0130】

本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物はそれぞれ、当技術分野で周知のように、クローニング目的のために各ドメイン間にシグナル配列および／または追加のアミノ酸をさらに含み得る。さらに、ＬＡＭＰ相同ドメイン、ＬＡＭＰ内腔ドメイン、ＬＡＭＰ膜貫通ドメイン、および／またはＬＡＭＰサイトゾル尾部ドメインは、同じＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ－１）または異なるＬＡＭＰタンパク質（例えば、ヒトＬＡＭＰ－１由来の内腔ドメイン、ヒトＬＡＭＰ－２由来の膜貫通ドメイン、および／または同じ遺伝子ファミリー（例えばＬＡＭＰ－１）または異なる遺伝子ファミリー（ＬＡＭＰ－１およびＬＡＭＰ－２）のオルソロガスドメインの混合）が起源であってよい。

【0131】

記載されたＬＡＭＰ構築物のポリペプチド変異体が企図される。例えば、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のポリペプチド、ならびにこれらの変異体をコードするポリヌクレオチド。改良ＬＡＭＰ構築物の変異体は、抗原配列をリソソームの標的とすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変された内腔配列は、膜抗原性物質および非膜抗原性物質の両方をエンドソーム区画に、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫応答を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、十分に特徴付けられたオボアルブミンの抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定リソソーム／エンドソーム標的化シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含む改良ＬＡＭＰ構築物を構築することによって同定することができる。標的化の効率は、改良ＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞の、ＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞を刺激する能力を測定することで測定できる（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照されたい）。

【0132】

記載された改良ＬＡＭＰ構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物ポリヌクレオチドのいずれかと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のポリヌクレオチドとともに、本発明の好ましい実施形態である。改良ＬＡＭＰ構築物の変異体は、抗原配列をリソソームの標的とすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変された内腔配列は、膜抗原性物質および非膜抗原性物質の両方をエンドソーム区画に、元のドメイン配列と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の有効性、すなわち、免疫応答を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、十分に特徴付けられたオボアルブミンの抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定リソソーム／エンドソーム標的化シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含む改良ＬＡＭＰ構築物を構築することによって同定することができる。標的化の効率は、改良ＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞の、ＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞を刺激する能力を測定することで測定できる（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５を参照されたい）。

【0133】

がん抗原
表１に示す以下の抗原は、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物のそれぞれにクローニングすることができる。第４列に記載の配列／断片／エピトープは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物にもクローニングすることができる。さらに、表１に列挙したがん抗原のいずれか１つを、表１に列挙した任意の他の抗原（第４列に記載の配列／断片／エピトープを含む）と組み合わせて、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物に挿入できることが特に企図される。

【0134】

【表1-1】

【0135】

【表1-2】

【0136】

さらに、表１に記載の抗原（４列目に示す配列／断片／エピトープを含む）は、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物に個別に、または互いに組み合わせてクローニングし得る。したがって、表１の４列目に記載のエピトープ／断片を含む表１の１列目に示される配列のそれぞれ１つを使用して、表１の１列目または４列目からさらに選択される別の配列と組み合わせてＬＡＭＰ構築物を作製することができる。様々な可能な組み合わせを示すために、本開示を限定するものでは決してないが、抗原の組み合わせ（表１の１列目に示される配列および／または表１の４列目に記載される配列／断片／エピトープを含む）は、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物にクローニングすることができる。特定のＬＡＭＰ構築物中の抗原の組み合わせの順序は多様であり得る。さらに、これらの抗原は、単一のＬＡＭＰ構築物内で組み合わせることも、または複数のＬＡＭＰ構築物を含む組成物で送達することも可能であることが特に想定される。

【0137】

改良ＬＡＭＰ構築物をコードする配列のアセンブリ
目的の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を構築する手順は、当技術分野で周知である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１：９５５，１９９０を参照されたい）。所望のセグメントをコードするＤＮＡ配列は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．または所望のＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから入手可能なものなど、容易に入手可能な組換えＤＮＡ材料から得ることができる。

【0138】

例えば、所望のドメイン配列に対応するＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ方法論の通常の手順を使用して適切な制御配列およびシグナル配列を用いて組み立てることができる。例えば、米国特許第４，５９３，００２号、およびＬａｎｇｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３１９１，１９８６を参照されたい。

【0139】

タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、化学的に合成するか、いくつかのアプローチの１つによって単離することができる。合成されるＤＮＡ配列は、目的のアミノ酸配列に適したコドンを使用して設計することができる。一般に、配列が発現に使用される意図される宿主に好ましいコドンが選択される。完全な配列は、標準的な方法で調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列に組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６，１９８１；Ｎａｍｂａｉｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９，１９８４；Ｊａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１，１９８４を参照されたい。

【0140】

一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物のドメイン配列をコードする１または複数の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個別に単離される（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。ドメインは、それらを含むことが知られている公的に入手可能なクローンから単離されることが好ましいが、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから単離されてもよい。好ましくは、単離された断片は、がん抗原配列をコードする改良ＬＡＭＰ構築物を構築可能にする、適合する制限エンドヌクレアーゼ部位に接している。この技術は、当業者に周知である。ドメイン配列は、互いに直接（例えば、介在配列なしで）融合するか、または互いに挿入する（例えば、ドメイン配列が不連続である場合）か、または介在配列（例えば、リンカー配列など）により分離することができる。

【0141】

オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するための基本戦略、ならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４、上記を参照されたい。適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの構築は、当技術分野の範囲内である。例えば、上記のＰｅｒｂａｌ，１９８４を参照されたい。あるいは、適切なＤＮＡライブラリーまたは公的に入手可能なクローンは、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈやＳｔｒａｔａｇｅｎｅなどの生物学的研究材料の供給者から、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎなどの公的な寄託機関から入手可能である。

【0142】

選択は、ＤＮＡの発現ライブラリーから配列を発現させ、発現されたペプチドを免疫学的に検出することにより達成することができる。ＭＨＣ ＩＩ分子および所望の抗体／Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。これらの選択手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９、上記を参照されたい）。

【0143】

所望のポリペプチド配列のコード配列を含むクローンが調製または単離されると、好ましくは宿主細胞においてこの配列を維持するための複製起点を含む任意の適切なベクターにこの配列をクローニングすることができる。

【0144】

核酸送達ビヒクル
一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物が細胞に導入される。細胞は、核酸を複製するため、または改良ＬＡＭＰ構築物を発現するための宿主細胞であり得る。好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物を発現するための宿主細胞は抗原提示細胞である（以下でさらに説明する）。

【0145】

好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列と、それに作動可能に連結された、細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するための発現制御配列とをさらに含む。例としては、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、ならびに複製可能であるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞など）および／または標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など）において複製され得る他の配列、および／または改良ＬＡＭＰ構築物をコードする配列を標的細胞内の所望の位置に運ぶことができる他の配列が挙げられる。

【0146】

別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物をコードする第１のポリヌクレオチド配列（例えば、いくつかの好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物は、ＬＡＭＰタンパク質の第１の相同性ドメインとＬＡＭＰタンパク質の第２の相同性ドメインとの間（または少なくとも２つのシステイン保存断片の間）に融合された少なくとも１つの目的のプライミングエピトープおよび／または抗原を含み、例えば、少なくとも１つの目的のエピトープおよび／または抗原は、ＬＡＭＰヒンジ領域に配置されてもよく、またはＬＡＭＰヒンジ領域を置換してもよい）；ならびに（ｉｉ）分泌シグナル配列に作動可能に連結された少なくとも１つのブースティングエピトープおよび／または抗原をコードして、該ブースティングエピトープおよび／または抗原が対象の循環中に分泌される第２のポリヌクレオチド配列；を含む核酸分子（例えば、プラスミドまたはベクター）を提供する。免疫応答をプライミングするためのエピトープおよび／または抗原は、免疫応答をブースティングするためのエピトープおよび／または抗原と同じであっても異なっていてもよく、これらは好ましくは表１から選択される。

【0147】

核酸分子は、ワクチン組成物として提供され、細胞に導入され得る。細胞は、核酸分子を複製するための、または改良ＬＡＭＰ構築物を発現するための（プライミングエピトープおよび／または抗原を提供するための）、および分泌シグナル配列に作動可能に連結されたブースティングエピトープおよび／または抗原を発現する（したがって、ブースティングエピトープおよび／または抗原が細胞から分泌される）ための宿主細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は抗原提示細胞である（以下でさらに説明する）。

【0148】

好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物をコードする第１のポリヌクレオチドは、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列と、それに作動可能に連結された、細胞における第１のポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するための発現制御配列とをさらに含む。同様に、好ましい実施形態では、ブースティングエピトープおよび／または抗原をコードする第２のポリヌクレオチドは、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列と、それに作動可能に連結された、細胞における第２のポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するための発現制御配列とをさらに含む。第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子は、例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、ならびに複製可能であるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞など）および／または標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など）において複製され得る他の配列、および／または改良ＬＡＭＰ構築物および／またはブースティングエピトープおよび／または抗原をコードする配列を標的細胞内の所望の位置に運ぶことができる他の配列として提供することができる。

【0149】

組換え発現ベクターは、人間、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコ、ニワトリなどの動物に容易に感染する微生物に由来してもよい。好ましいベクターには、ワクシニアなどの生ワクチンとしてすでに使用されているものが含まれる。これらの組換え体は宿主に直接接種することができ、微生物ベクターに対してだけでなく、外来抗原の発現に対する免疫も付与する。本明細書において生組換えワクチンとして企図される好ましいベクターには、例えば、Ｆｌｅｘｎｅｒ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：５１，１９９０に教示されているように、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ならびにワクシニアおよび他のポックスウイルスが含まれる。

【0150】

発現制御配列には、限定するものではないが、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、エンハンサー配列または転写アクチベーターとリプレッサーとにそれぞれ結合する負の調節エレメント、および／またはリボソーム結合の翻訳開始配列が含まれる。例えば、細菌性発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、および転写開始のために、シャイン－ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを含むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９、上記）。同様に、真核生物発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種、相同、またはキメラプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの分離のための終止コドンを含む。

【0151】

発現制御配列は、天然に存在する遺伝子から得ることも、または設計することもできる。設計された発現制御配列には、限定するものではないが、突然変異および／またはキメラ発現制御配列または合成またはクローニングされたコンセンサス配列が含まれる。プロモーターと、ポリヌクレオチドを作動可能に連結できるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。

【0152】

発現および／または転写を最適化するために、ベクターの５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加または変更して、余分もしくは代替の翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳レベルのいずれかで発現に干渉するもしくは発現を減少させる可能性のある他の配列を排除することが必要な場合がある。または、コンセンサスリボソーム結合部位を、開始コドンのすぐ５’に挿入して、発現を増強することができる。多種多様な発現制御配列（それに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列）をこれらのベクターにおいて使用して、本発明のポリヌクレオチド配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーター、および哺乳動物細胞の遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにそれらのさまざまな組み合わせが含まれる。

【0153】

第１および第２のポリヌクレオチド配列（改良ＬＡＭＰ構築物ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原をコードする）は、同じ発現制御配列から発現されても、または異なる発現制御配列から発現されてもよい。例えば、単一のプロモーターを、改良ＬＡＭＰ構築物ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原の両方をコードするバイシストロン性ｍＲＮＡ分子の転写に使用することができる。当業者は、コードされたタンパク質の「第２」の翻訳が、翻訳増強エレメント、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ ３：１９５－２１２，２０１２）または翻訳の終結後再開始を達成するための非構造化連結配列（Ｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）６（１２）：４１１５－４１２５，２０１６）を含めることによって達成され得ることを十分に承知していると思われる。しかしながら、いくつかの好ましい実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、異なる発現制御配列（例えば、異なるプロモーター）により発現される。

【0154】

少なくとも１つのブースティングエピトープおよび／または抗原の分泌を達成するために、第２のポリヌクレオチド配列は、典型的には１６～３０アミノ酸長の分泌シグナル配列（リーダー配列としても知られる）をコードするポリヌクレオチド配列を含み得、その結果、第２のポリヌクレオチド配列の発現により、分泌シグナル配列に作動可能に連結されたブースティングエピトープおよび／または抗原がもたらされる。当業者は、適切な分泌シグナル配列を十分に承知しており、例えば、インターロイキン－２、ＣＤ５、免疫グロブリンカッパ軽鎖（以下、Ｉｇカッパリーダーと称する）、トリプシノゲン、血清アルブミンおよびプロラクチン（Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：１－１７，２００７；Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１１０：１１６４－１１７３，２０１３）のシグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列は、場合によっては、ブースティング抗原に「ネイティブな」分泌シグナル配列であり得る。

【0155】

一態様では、核酸分子は、複製のための複製起点を含む。好ましくは、起点は、標的細胞への送達に使用するのに十分な数の配列のコピーを生成するために使用できる少なくとも１種類の宿主細胞において機能する。したがって、適切な起点には、限定するものではないが、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．））、酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ ｓｐ．）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）など）、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において機能するものが含まれる。好ましい一態様では、核酸送達ビヒクルが導入される標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞）で機能する複製起点が提供される。別の態様では、少なくとも２つの複製起点が提供され、１つは宿主細胞において機能し、もう１つは標的細胞において機能する。

【0156】

核酸分子は、核酸分子（例えば、核酸送達ベクター）の少なくとも一部を標的細胞染色体に組み込むことを促進する（１または複数の）ポリヌクレオチド配列を、代替的に、または追加的に含み得る。例えば、核酸分子は、標的細胞染色体ＤＮＡと相同性の領域を含み得る。一態様では、核酸分子は、改良ＬＡＭＰ構築物ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原をコードする核酸配列に隣接する２つ以上の組換え部位を含む送達ベクターとして提供される。

【0157】

ベクターは、ベクターが標的細胞に首尾よく導入され、および／または標的細胞によって発現され得ることを検証するために、検出可能および／または選択可能マーカーをさらに含んでもよい。これらのマーカーは、限定するものではないが、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生などの活性をコードすることができ、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物または組成物などの結合部位を提供することができる。

【0158】

検出可能／選択可能マーカー遺伝子の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：毒性化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する生成物をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞に欠けている生成物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定可能な生成物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ベータガラクトシダーゼなどの表現型マーカー、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＧ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、それらの変異型、改変型または増強型など）、および細胞表面タンパク質）；細胞の生存および／または機能に有害である生成物に結合するＤＮＡセグメント；他の核酸セグメントの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；基質を改変する生成物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合するＤＮＡセグメント；所望の分子を単離または同定するために使用できるＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位をコードするセグメント）；プライマー配列；存在しない場合、特定の化合物に対する抵抗性または感受性を直接的または間接的に付与するＤＮＡセグメント；および／またはレシピエント細胞に毒性のある生成物をコードするＤＮＡセグメント。

【0159】

マーカー遺伝子は、成功した遺伝子導入の立体構造のマーカーとして、および／または導入遺伝子を発現する細胞を単離するため、および／または細胞から導入遺伝子を回収するために使用できる。例えば、一態様では、マーカー遺伝子が、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞を単離および精製するために使用される。

【0160】

実質的に類似の遺伝子、例えば、公知の遺伝子と約５０％超、約７０％超、８０％超、約９０％超、好ましくは約９５％超の同一性を有する遺伝子を提供することができる。実質的に類似したドメイン配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で目的のドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより最初に同定され得る。相同、変異、または改変型ドメイン配列の適合性を決定するためのアッセイの実行は、適切な活性を発現する配列の単なるスクリーニングである。そのようなスクリーニングは、当技術分野では日常的である。

【0161】

改良ＬＡＭＰ構築物および任意選択的にブースティングエピトープをコードする核酸分子は、裸の核酸として提供されても、または細胞への核酸の進入を促進するための１または複数の分子に関連する送達ビヒクル中で提供されてもよい。適切な送達媒体には、限定するものではないが、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工ウイルスエンベロープなどを含む）、細胞送達ビヒクルなどが含まれる。

【0162】

脂質ベースの製剤
改良ＬＡＭＰ構築物の細胞内送達を促進するように設計された送達ビヒクルは、非極性環境と極性環境との両方と（例えば、原形質膜、組織液、細胞内の区画などにおいて）相互作用する必要がある。したがって、好ましくは、送達ビヒクルは、極性および非極性ドメインの両方、または改良ＬＡＭＰ構築物を細胞に移行させるための移行配列を含むように設計されている。

【0163】

極性ドメインと非極性ドメインとを持つ化合物は両親媒性物質と呼ばれる。カチオン性両親媒性物質は、ＤＮＡなどの負に帯電したポリヌクレオチドと相互作用するために、生理学的ｐＨまたはその付近で正に帯電できる極性基を有する。

【0164】

本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物および任意選択的にブースティング抗原は、細胞膜を横切るベクターの移行を促進するために脂質単層または二重層を含む製剤で提供することができる。リポソームまたは任意の形態の脂質膜、例えば平面脂質膜または無傷の細胞、例えば赤血球の細胞膜を使用することができる。リポソーム製剤は、静脈内または経口投与を含む任意の手段によって投与することができる。

【0165】

リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法に従って調製することができ、当技術分野で周知である、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ，１９９５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７－２１０；Ａｌｖｉｎｇ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５－３１；Ｓｚｏｋａ，１９８０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ ９：４６７；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；および米国特許第４，８３７，０２８号を参照されたい。一態様では、リポソームは、リポソーム：核酸分子（改良ＬＡＭＰ構築物および任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原をコードする）複合体を特定の細胞型に標的化するための標的化分子を含む。特に好ましい態様では、標的化分子は、標的組織に見られる血管または細胞の表面上の生体分子（例えば、受容体またはリガンド）に対する結合パートナー（例えば、リガンドまたは受容体）を含む。

【0166】

リポソームの電荷は血液からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負に帯電したリポソームは細網内皮系によってより迅速に取り込まれ（Ｊｕｌｉａｎｏ，１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１）、したがって血流中での半減期が短くなる。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を組み込むと、リポソームの凝集が防止されることによって、循環時間が延長される。例えば、Ｎ－（オメガ－カルボキシ）アシルアミドホスファチジルエタノールアミンをＬ－アルファ－ジステアロイルホスファチジルコリンの大きな単層ベシクルに組み込むと、ｉｎ ｖｉｖｏのリポソーム循環寿命が劇的に延長される（例えば、Ａｈｌ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３２９：３７０－３８２を参照されたい）。循環半減期が延長されたリポソームは、通常、治療および診断用途に望ましい。薬物動態の一般的な考察については、例えば、ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３７－３９，Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ １９９６）を参照されたい。

【0167】

典型的には、リポソームは、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールなどの負に帯電したリン脂質が約５～１５モルパーセントで調製される。ホスファチジルグリセロールなどの負に帯電したリン脂質を加えると、自発的なリポソーム凝集を防ぐ働きもするため、リポソーム凝集体が過小形成されるリスクを最小限に抑えまる。少なくとも約５０モルパーセントの濃度のスフィンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質、および５～１５モルパーセントのモノシアリルガングリオシドなどの膜剛性化剤も、剛性などの望ましいリポソーム特性を付与し得る（例えば、米国特許第４，８３７，０２８号を参照されたい）。

【0168】

さらに、リポソーム懸濁液は、保存時にフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。α－トコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー、およびフェリオキサミン（ｆｅｒｒｉｏｘｉａｎｉｎｅ）などの水溶性鉄特異的キレート剤が好ましい。

【0169】

本発明の改良ＬＡＭＰ構築物は、不均一なサイズの多層小胞を含むことができる。例えば、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性ガス下で乾燥させて、薄い脂質膜を形成することができる。必要に応じて、フィルムを第三級ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解し、凍結乾燥して、より容易に水和される粉末状のより均質な脂質混合物を形成することができる。このフィルムは、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水溶液で覆われ、典型的には撹拌しながら１５～６０分かけて水和させることができる。結果として得られる多重膜小胞のサイズ分布は、より激しい攪拌条件下で脂質を水和させるか、またはデオキシコール酸などの可溶化界面活性剤を加えることにより、より小さなサイズにシフトできる。水和媒体は、好ましくは、最終リポソーム懸濁液中のリポソームの内部容積において望ましい濃度の核酸を含む。

【0170】

リポソーム調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲およびリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようにサイズ調整することができる。１つの好ましいサイズ範囲は約０．２～０．４ミクロンであり、これにより、従来のフィルター、典型的には０．２２ミクロンフィルターを介した濾過によりリポソーム懸濁液を滅菌することができる。リポソームのサイズが約０．２～０．４ミクロンまで小さくなっている場合、フィルター滅菌はハイスループットで実行できる。リポソームを所望のサイズにサイズ調整するためのいくつかの技術が利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照されたい）。

【0171】

適切な脂質としては、限定するものではないが、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｉｎ（商標）（Ｂｅｈｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９８２－６９８６）、ＤＮＥＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：６７－７５）、ＤＣ－ＣＨＯＬ（Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９１，ＢＢＲＣ １７９：２８０－２８５）、ＤＯＴＡＰ（商標）（ＭｃＬａｃｈｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６７４－６２２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）およびグリセロ脂質化合物（例えば、欧州特許第９０１４６３号および国際公開第９８／３７９１６号を参照されたい）が挙げられる。

【0172】

改良ＬＡＭＰ構築物との複合化に適した他の分子としては、カチオン性分子、例えば、ポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，１９９３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２－３７９）、樹枝状ポリシン（国際公開第９５／２４２２１号）、ポリエチレンイリニンまたはポリプロピレンｈ－ナイン（国際公開第９６／０２６５５号）、ポリリジン（米国特許第５，５９５，８９７号；仏国特許第２ ７１９ ３１６号）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号）、ＤＮＡ－ゼラチンコアセルベート（例えば、米国特許第６，２０７，１９５号；米国特許第６，０２５，３３７号；米国特許第５，９７２，７０７号）またはＤＥＡＥデキストラン（Ｌｏｐａｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：５７０７－５７１７）が挙げられる。

【0173】

ウイルスベースの遺伝子送達ビヒクル
一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物、および／またはブースティングエピトープおよび／または抗原は、ウイルスまたはウイルス粒子を含む送達ビヒクルとして提供される。この態様において、好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物はウイルスベクターを含む。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスなどのウイルスベクターは、多くの場合２つの成分、改変されたウイルスゲノムとそれを囲むコート構造とで構成されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７－８３８を参照されたい）が、ウイルスベクターは裸の形で導入されたり、ウイルスタンパク質以外のタンパク質でコーティングされることがある。現在の大部分のベクターは、野生型ウイルスと類似のコート構造を有する。この構造は、ウイルス核酸をパッケージングして保護し、標的細胞に結合して進入する手段を提供する。

【0174】

好ましくは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を含むウイルスベクターは、標的細胞ではウイルスが増殖できず、感染性粒子の調製に使用される宿主細胞（例えば、パッケージング細胞またはヘルパー細胞など）におけるウイルスの増殖を可能にするように野生型ウイルスゲノムから改変される。ベクター核酸は一般に、ヘルパー系での複製およびパッケージングのためのシス作用性ウイルス配列、および標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列が不可欠である。他のウイルス機能は、当技術分野で公知のように、特定のパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株でトランスで発現される。

【0175】

好ましいウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来し得る。そのようなウイルスベクターは当技術分野で周知である。

【0176】

好ましい一態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製サイクルを完了するために必要な約３０を超える遺伝子を運ぶ約３６ｋｂの線形二本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。初期遺伝子は４つの領域（Ｅ１～Ｅ４）に分けられ、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられているＥ３領域は別として、これらはウイルス複製に不可欠である。Ｅ１領域（ＥＩＡおよびＥＩＢ）は、ウイルスゲノムの転写制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成をもたらす。Ｅ３領域によってコードされるタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防ぐ（Ｗｏｌｄ ａｎｄ Ｇｏｏｄｉｎｇ，１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：１－８）。Ｅ４領域によってコードされるタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現およびスプライシング、ならびに宿主細胞の遮断に関与する（Ｈａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０－２５７）。後期遺伝子は一般に、ウイルスカプシドに寄与する構造タンパク質をコードする。さらに、アデノウイルスゲノムは、シス作用性５’および３’ＩＴＲ（逆位末端配列）およびＤＮＡ複製に不可欠なパッケージング配列を保有している。ＩＴＲはＤＮＡ複製の起点を有し、アデノウイルスＤＮＡの感染粒子へのパッケージングにはカプシド形成領域が必要である。

【0177】

Ｈｅｉｓｅ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：８４７－８５ １に記載されているように、特定の細胞（例えば、増殖細胞など）で選択的に複製するために、アデノウイルスベクターを、条件付きで複製するように操作することができる（ＣＲＡｄベクター）。別の態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１機能の複製欠損である（例えば、Ｅ１の全体的または部分的な欠失または突然変異誘発による）。ベクターのアデノウイルス骨格は、追加の改変（１または複数のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異）を含んでもよい。Ｅ２改変の例は、ＤＢＰ（ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）コード遺伝子に局在する温度感受性突然変異によって示される（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８－３３９）。アデノウイルス配列は、Ｅ４領域のすべてまたは一部を欠失してもよい（例えば、欧州特許第９７４ ６６８号；Ｃｈｒｉｓｔ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：４１５－４２７；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３０８－８３１９）。非必須Ｅ３領域内の追加の欠失により、送達されるポリヌクレオチドのサイズを増加させることができる（Ｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １１：６１５ ６２３）。しかし、ウイルスが免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：５３－７１）または炎症反応（欧州特許第００４４０２６７．３号）から逃れることを可能にするポリペプチド（例えば、ｇｐ１９ｋなど）をコードするＥ３配列のすべてまたは一部を保持することは有利であり得る。

【0178】

ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残留合成を無効にする実質的な遺伝子改変を含む第２世代のベクターも、形質導入細胞における発現遺伝子の長期発現を改善するために使用できる（例えば、国際公開第９４／２８１５２号；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：２０２２－２０３２を参照されたい）。

【0179】

細胞に導入される改良ＬＡＭＰ構築物は、シス作用性配列を除いて、ウイルスゲノムの任意の場所に挿入することができる。好ましくは、それは、欠失領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）との置き換えで、好ましくは欠失Ｅ１領域内に挿入される。

【0180】

アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物源、特にイヌ（例えば、ＣＡＶ－１またはＣＡＶ－２、それぞれＧｅｎｂａｎｋ ｒｅｆ．ＣＡＶＩＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、鳥類（Ｇｅｎｂａｎｋ ｒｅｆ．ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（ＢＡＶ３など、Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３９４ １４０２）、ネズミ（Ｇｅｎｂａｎｋ ｒｅｆ．ＡＤＲＭＵＳＭＡＶＩ）、ヒツジ、ネコ、ブタもしくは真猿類起源に由来してもよく、またはハイブリッドウイルスであってもよい。任意の血清型を使用することができる。しかしながら、Ｃサブグループのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。このようなウイルスは、例えばＡＴＣＣから入手可能である。

【0181】

アデノウイルス粒子または空のアデノウイルスカプシドを使用して、米国特許第５，９２８，９４４号に記載のウイルス媒介共内部移行法によって改良ＬＡＭＰ構築物を導入することもできる。この方法は、１または複数の脂質層を含むポリカルベン（ｐｏｌｙｃａｒｂｅｎｅ）または脂質小胞などの（１または複数の）カチオン剤の存在下で達成することができる。

【0182】

アデノウイルス粒子は、ウイルス複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する相補細胞株またはヘルパーウイルスを使用して、当技術分野の任意の従来技術（例えば、国際公開第９６／１７０７０号）に従って調製および増殖させることができる。細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７２）およびＰＥＲＣ６（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１９０９－１９１７）は、Ｅ１欠失を補完するために一般的に使用されている。他の細胞株は、欠損ベクターを補完するように設計されている（Ｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９－５６５；Ｋｒｏｕｇｈａｋ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ，１９９５，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１５７５－１５８６；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：７７５－７８３；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０２２－２０３；ＥＰ ９１９６２７および国際公開第９７／０４１１９号）。アデノウイルス粒子は、培養上清からも溶解後の細胞からも回収することができ、任意選択で標準的な技術（例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離、国際公開第９６／２７６７７号、国際公開第９８／００５２４号、国際公開第９８／２６０４８号および国際公開第００／５０５７３号に記載のもの）に従ってさらに精製することができる。

【0183】

細胞型特異的標的化は、ウイルス表面タンパク質の改変により、広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターで達成され得る。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への付着によって決定される。これに関して、アデノウイルスカプシドの表面に存在する繊維およびペントンは、細胞付着において重要な役割を果たす（Ｄｅｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３６６１－３６７３）。したがって、アデノウイルスの細胞標的化は、繊維および／またはペントンをコードするウイルス遺伝子を、固有の細胞表面受容体との特異的相互作用が可能な改変された繊維および／またはペントンを生成するように遺伝子改変することによって実行することができる。そのような改変の例は、Ｗｉｃｋａｒｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８２２１－８２２９；Ａｒｒｉｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：６８６６－６８６９；Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９０７９－９０８３；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｖｉｌｅ，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１９０－１９９；ＷＯ ９３／０９２２１および国際公開第９５／２８４９４号に記載されている。

【0184】

特に好ましい態様では、アデノ随伴ウイルス配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスＡＡＶ－２（アデノ随伴ウイルス２型）に由来するベクターは、現在開発されている最も有望な遺伝子送達ビヒクルの１つでである。一本鎖ＤＮＡをパッケージングするためのこの系の特徴のいくつかは、それが送達のための裸のＤＮＡに代わり得るものであることを示唆している。ワクシニアまたはアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは対照的に、主な魅力的な特徴は、ＡＡＶベクターがウイルス遺伝子をまったく発現しないことである。ワクチン構築物に含まれる唯一のウイルスＤＮＡ配列は、１４５ｂｐの逆位末端配列（ＩＴＲ）である。したがって、裸のＤＮＡによる免疫化の場合と同様に、発現される遺伝子は抗原または抗原キメラの遺伝子のみである。さらに、ＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方、例えばヒト末梢血単球由来樹状細胞に、導入遺伝子の持続的な発現、および粘膜免疫の生成のための経口および鼻腔内送達の可能性を導入することが公知である。さらに、必要なＤＮＡの量もはるかに数桁少ないと思われ、裸のＤＮＡ用量が５０ｕｇまたは約１０^１５コピーであるのに対して、１０^１０～１０^１１粒子またはＤＮＡコピーの用量で最大の応答が得られる。

【0185】

一態様において、ＡＡＶベクターは、構築物をコードするＡＡＶ ＩＴＲキメラタンパク質に含まれるＤＮＡとＩＴＲを含まないＡＡＶコード領域（ＡＡＶ ｒｅｐおよびキャップ遺伝子）を含むＡＡＶヘルパープラスミドＡＣＧ２との共トランスフェクションにより、適切な細胞株（例えば、ヒト２９３細胞）にパッケージングされる。その後、細胞にアデノウイルスＡｄ５を感染させる。ベクターは、当技術分野で公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配超遠心分離など）を使用して細胞溶解物から精製でき、検出可能な複製コンピテントＡＡＶまたはアデノウイルスが含まれないことを確認するために（例えば、細胞変性効果バイオアッセイにより）検証される。ＡＡＶ力価は、プロテイナーゼＫでの消化後に調製されたウイルスＤＮＡサンプルを用いた定量的ＰＣＲにより決定することができる。好ましくは、そのような方法により精製されたベクター力価は、約５ｘ１０^１２～１ｘ１０^１３ＤＮａｓｅ耐性粒子／ｍｌである。

【0186】

他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは、ウイルスにコードされた逆転写酵素を使用して複製する組込みウイルスのクラスであり、ウイルスのＲＮＡゲノムを感染細胞（例えば、標的細胞）の染色体ＤＮＡに組み込まれる二本鎖ＤＮＡに複製する。そのようなベクターには、マウス白血病ウイルス、特にモロニー（Ｇｉｌｂｏａ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：２９）またはＦｒｉｅｎｄ’ｓ ＦＢ２９株（国際公開第９５／０１４４７号）に由来するものが含まれる。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのすべてまたは一部が欠失され、５’および３’ＬＴＲおよびカプシド形成配列を保持している。これらの要素は、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を高めるために改変することができる。そのような改変には、ＶＬ３０などのレトロトランスポゾンの１つによるレトロウイルスカプシド形成配列の置換が含まれる（例えば、米国特許第５，７４７，３２３号を参照されたい）。好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物は、カプシド形成配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向に挿入される。細胞特異的標的化は、当技術分野で公知であるように、レトロウイルスエンベロープタンパク質への抗体または抗体断片のコンジュゲーションによって達成され得る。

【0187】

レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下、またはレトロウイルスベクターが欠損しているレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）がゲノムに組み込まれた適切な補完（パッケージング）細胞株において調製される。そのような細胞株は、先行技術に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｖｉｒｏｌ．１６７：４００）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、標的細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合を担い、したがってレトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明の文脈において、ヒトおよび他の種の標的細胞の感染を可能にするために、広宿主性エンベロープタンパク質を含むパッケージング細胞株、例えば、ＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９０７８）または２９３ＥＩ６（ＷＯ９７／３５９９６）を使用することが有利である。レトロウイルス粒子は、培養上清から回収されることが好ましく、任意選択で標準的な技術（例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離）に従ってさらに精製されてもよい。

【0188】

他の適切なウイルスには、ポックスウイルスが含まれる。ポックスウイルス科（ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）のいくつかのメンバーのゲノムはマッピングされており、配列決定されている。ポックスウイルスベクター（ｐｏｘｙｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）は、ポックスウイルス科（ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）の任意のメンバー、特にカナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得ることができる。適切なワクシニアウイルスには、限定するものではないが、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（Ｇｏｅｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７－２６６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｖｉｒｏｌ．１９６：３８１－４０１）、Ｗｙｅｔｈ株および改変Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｖｉｒｏｌ．２４４：３６５－３９６）が含まれる。ワクシニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は、当技術分野では公知である（例えば、欧州特許第８３ ２８６号および欧州特許第２０６ ９２０号；Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３：６－１４；Ｓｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８４７－１０８５１を参照されたい）。好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、非コード遺伝子間領域または不活化または欠失がウイルスの成長および複製を著しく損なわない任意の遺伝子などの非必須遺伝子座内に挿入される。

【0189】

ポックスウイルス（ｐｏｘｙｖｉｒａｌ）粒子は、当技術分野で記載されているように調製される（Ｐｉｃｃｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５４５－５６３；米国特許第４，７６９，３３０号；米国特許第４，７７２，８４８号；米国特許第４，６０３，１１２号；米国特許第５，１００，５８７号および米国特許第５，１７９，９９３号）。一般に、ドナープラスミドが構築され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での増殖により増幅され、従来の手順により単離される。次に、ポックスウイルスゲノムとともに適切な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞）に導入し、相同組換えによりポックスウイルス（ｐｏｘｙｖｉｒａｌ）粒子を生成する。これらは、溶解工程（例えば、化学的溶解、凍結／解凍、浸透圧ショック、超音波処理など）後に培養上清または培養細胞から回収できる。連続したプラーク精製を使用して、汚染野生型ウイルスを除去できる。次いで、ウイルス粒子は、当技術分野で公知の技術（例えば、クロマトグラフィー法または塩化セシウムまたはスクロース勾配での超遠心分離）を使用して精製することができる。

【0190】

天然痘撲滅のための世界的なキャンペーンにおける生ウイルスワクチンとしてのワクシニアの使用は、ワクシニアを生組換えワクチンベクターとして開発するための明確な選択肢にした。１００種近くの異なる外来タンパク質を発現する生組換えワクシニアウイルスが報告されており、これらの多くは効果的な実験用ワクチンである（Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｆｌｅｘｎｅｒ，１９８７による総説）。ワクシニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも２５，０００塩基対の外来ＤＮＡを受け入れる能力、および昆虫細胞を含むほとんどの真核細胞タイプに感染する能力のため、発現ベクターとして特に用途が広い（同上）。他のＤＮＡウイルスとは異なり、ポックスウイルスは感染細胞の細胞質で排他的に複製し、組換えウイルスＤＮＡと宿主染色体との遺伝的交換の可能性を減らす。組換えワクシニアベクターは、ヒト、他の哺乳動物、寄生虫、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス、細菌およびバクテリオファージを含むさまざまな供給源からのタンパク質を適切にプロセシングおよび発現することが示されている。

【0191】

外来タンパク質をコードするＤＮＡの発現は、上流のプロモーター配列や、必要に応じてＲＮＡプロセシングシグナルなど、宿主ウイルスの調節エレメントによって制御される。外来ＤＮＡのワクシニアウイルスゲノムの非必須領域への挿入は、相同組換えにより行われてきた（Ｐａｎｉｃａｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７９：４９２７，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５，１９８２）。

【0192】

改良ＬＡＭＰ構築物ならびに任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原によるがん抗原の発現は、挿入部位またはその近くの転写調節エレメントにより、またはより正確な遺伝子操作により行うことができる。外来遺伝子の挿入と発現を大いに促進するプラスミドベクターが構築されている（Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４９：８５７，１９８２）。これらのベクターは、ワクシニア転写プロモーターと、ワクシニアゲノムの非必須領域由来ＤＮＡに隣接する、外来コード配列の挿入のための１または複数の固有の制限エンドヌクレアーゼ部位とで構成される発現部位を含む。プロモーターの選択は、発現の時間（例えば、初期または後期）と発現レベルとの両方を決定するが、隣接するＤＮＡ配列は相同組換えの部位を決定する。

【0193】

この手順で生成されたウイルス粒子のうち、組換え体であるのはわずか約１０００分の１である。組換えウイルスのプラークはＤＮＡハイブリダイゼーションによって同定できるが、効率的な選択手順が開発されている。非必須ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のセグメントを隣接配列として使用することにより、外来遺伝子がＴＫ遺伝子座に組換えられ、挿入によりＴＫ遺伝子が不活性化される。ＴＫウイルスの選択は、５－ブロモデオキシウリジンの存在下でＴＫ細胞においてウイルスプラークアッセイを実施することによって達成される。ヌクレオシド類似体のリン酸化と、結果として生じるウイルスＤＮＡへの致命的な組込みとは、ＴＫ＋親ウイルスに感染した細胞でのみ起こる。トランスフェクションと組換えの効率に応じて、最大８０個のプラークが望ましい組換え体であり、残りは自発的ＴＫ変異体である。

【0194】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベータガラクトシダーゼ遺伝子と第２の遺伝子の発現部位とを含むプラスミドベクターにより、組換えウイルスを親ウイルスと識別する代替方法が可能になる（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３４０３，１９８５）。そのような組換え体によって形成されたプラークは、適切な指標を追加すると形成される青色によって明確に同定することができる。ＴＫ選択とベータガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることにより、組換えウイルスが容易かつ迅速に単離される。次いで、組換え体は、適切な細胞株での増殖により増幅され、挿入された遺伝子の発現は、適切な酵素学的、免疫学的または物理的手順により確認される。

【0195】

ワクシニアウイルスゲノムに追加できる遺伝情報の量の上限は未知である。しかし、外来ＤＮＡのほぼ２５，０００塩基対を追加しても、ウイルス収量に明らかな悪影響はなかった（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５：２１，１９８３）。必要な場合、ワクシニアウイルスゲノムの大きなセグメントを欠失して、追加の容量を提供できる（Ｍｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：３８７，１９８１）。

【0196】

ウイルスカプシド分子は、標的化および／または細胞への進入を促進する標的化部分を含んでもよい。適切な標的分子には、限定するものではないが、化学的コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、国際公開第９４／４０９５８号を参照されたい）、ビタミン、抗原、レクチン、抗体およびその断片が含まれる。好ましくは、そのような標的分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識して、これに結合する。

【0197】

ウイルス粒子に基づく改良ＬＡＭＰ構築物を、任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて含む組成物は、１０～１０^１４ｉ．ｕ．（感染単位）、好ましくは、１０～１０^１１ｉ．ｕ．の用量の形態で製剤化され得る。力価は、従来の技術により決定することができる。ＬＡＭＰ構築物の用量は、好ましくは０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ、より詳細には０．１～２ｍｇ／ｋｇで構成される。

【0198】

自己複製ＲＮＡ
自己複製ＲＮＡウイルスベクターは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を使用して構築することもできる。例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅ ｖｉｒｕｓ）およびラブドウイルスを使用して、自己複製ＲＮＡウイルスワクチンを生成することができる。自己複製ＲＮＡウイルスの好ましい株には、限定するものではないが、狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｓｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）および／またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）が含まれる。

【0199】

自己複製ＲＮＡウイルスは、組織への送達時に天然の抗原を発現するため、病原性への復帰のリスクを伴わずに弱毒生ワクチンを模倣する。また、それらは自然免疫系を刺激し、反応を強化する。例えば、Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ，Ｋ．’’Ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ，’’Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２）：１７７－９４（２０１５）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，’’Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ’’，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ５：９（２０１７）；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．’’Ｒｅｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，’’Ｖａｃｃｉｎｅｓ ４：３９（２０１６）を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ワクチンの使用は、プライム・ブーストプロトコルでも使用することができる。

【0200】

さらに、本明細書に記載のように、自己複製ＲＮＡウイルスをリポソームによりカプセル化して、送達および標的化を改善することもできる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を含む自己複製ＲＮＡウイルスによる免疫化は、抗原のより高い一時的発現レベルを提供し、安全な条件下での中和抗体応答の生成および致死的負荷に対する保護をもたらす。

【0201】

細胞ベースの送達ビヒクル
本発明による改良ＬＡＭＰ構築物は、この構築物を含む他の細胞（「送達細胞」）によって標的細胞に送達させ得る。改良ＬＡＭＰ構築物を細胞に導入する方法は当技術分野で公知であり、細胞の核へのＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：４７９－４８８）；ＣａＰ０_４によるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２７４５ ２７５２）、エレクトロポレーション（Ｃｈｕ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：１３１１－１３２６）；リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１７）および粒子衝撃（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５６８－９５７２）が含まれる。適切な細胞には、自己細胞および非自己細胞が含まれ、異種細胞が含まれてもよい。送達細胞は、それらの死を誘導することにより（例えば、これらの細胞に誘導性自殺遺伝子を提供することにより）標的細胞にその内容物を送達するよう誘導することができる。

【0202】

アクセサリー分子
本発明による改良ＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、細胞への改良ＬＡＭＰ構築物の導入を促進するため、および／または特定の治療効果の増強および／または抗体産生の増強のために、１または複数のアクセサリー分子を含むことができる。

【0203】

さらに、本発明による改良ＬＡＭＰ構築物を含む組成物は、動物／人体内での分解を阻害するため、および／またはベクターの標的細胞へのトランスフェクション／感染を改善するために、１または複数の安定化物質、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（国際公開第９８／５３８５３号）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート剤（欧州特許第８９０３６２号を含むことができる。そのような物質は、単独で使用されても、または組み合わせて使用されてもよい（例えば、カチオン性および中性の脂質）。

【0204】

また、アデノウイルスタンパク質がエンドソームを不安定化し、ＤＮＡの細胞への取り込みを増強することも示されている。脂質複合体ＤＮＡベクターを含む溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋剤を使用してアデノウイルスに共有結合したポリリジンへのＤＮＡの結合は、改良ＬＡＭＰ構築物の、任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せた取り込みおよび発現を大幅に改善することがある（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｍ．Ｉ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７－２５２）。

【0205】

宿主細胞
本発明による改良ＬＡＭＰ構築物は、さまざまな宿主細胞、限定するものではないが、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）；酵母細胞（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．））；昆虫細胞；線虫細胞；植物細胞；両生類細胞（アフリカツメガエルなど）；鳥類細胞；および哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、解剖組織などからの初代培養哺乳動物細胞）において発現され得る。

【0206】

分子は、生物から単離された宿主細胞、生物の一部である宿主細胞、または生物に導入された宿主細胞において発現させることができる。一態様では、改良ＬＡＭＰ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培養中の宿主細胞において発現される。別の態様では、改良ＬＡＭＰ構築物は、この改良ＬＡＭＰ構築物を、任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原を併せてコードする核酸を含む体細胞および／または生殖系列細胞を含むトランスジェニック生物（例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類など）において発現される。トランスジェニック動物を構築する方法は当技術分野で周知であり、日常的である。

【0207】

改良ＬＡＭＰ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入することもでき、細胞（例えば、幹細胞、造血細胞、リンパ球など）を宿主生物に導入することもできる。細胞は、宿主生物に関して異種であっても、または自己であってもよい。例えば、細胞を宿主生物から得て、改良ＬＡＭＰ構築物を、（任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて）ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入して、その後宿主生物に再導入させることができる。

【0208】

抗原提示細胞
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、天然または操作された抗原提示細胞に導入される。

【0209】

本明細書で使用される「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子またはその一部に関連する抗原をその表面に提示する任意の細胞を意図する。適切なＡＰＣの例は以下で詳細に説明するが、これらの例としては、限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、およびフォスター抗原提示細胞（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）などの細胞全体が挙げられる。ハイブリッドＡＰＣを作製する方法は記載されており、当技術分野において公知である。

【0210】

樹状細胞（ＤＣ）は、強力な抗原提示細胞である。ＤＣはＴ細胞の活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは２つのタイプに分類できる。免疫応答に特異性を与える第１のタイプは、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体と、ＡＰＣの表面の主要組織適合遺伝子複合体（上記の「ＭＨＣ」）クラスＩまたはＩＩタンパク質によって提示される抗原ペプチドとの相互作用によって媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化が起こるために必要であるが、十分ではない。実際、第２のタイプのシグナルがなければ、第１のタイプのシグナルはＴ細胞免疫不応答をもたらす可能性がある。共刺激シグナルと呼ばれる第２のタイプのシグナルは、抗原特異的でもＭＨＣ制限的でもなく、第１のタイプのシグナルの存在下でＴ細胞の完全な増殖反応とＴ細胞エフェクター機能の誘導をもたらすことができる。

【0211】

いくつかの分子が共刺激活性を増強させることが示されている。これらの分子には、限定するものではないが、熱安定抗原（ＨＳＡ）、コンドロイチン硫酸修飾ＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ－ＣＳ）、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ－１）、およびＡＰＣ表面のＢ７共刺激分子、ならびにＴ細胞上のそのカウンター受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ－４が含まれる。

【0212】

他の重要な共刺激分子はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。本明細書で使用される「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲにより結合されるペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒に作用する場合、このペプチドに結合するＴ細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する任意の単一分子または分子の組み合わせを包含する。したがって、この用語は、Ｂ７、またはＴ細胞の表面のＴＣＲがペプチドに特異的に結合すると、ペプチド／ＭＨＣ複合体とともに同族リガンドに結合し、Ｔ細胞の活性化をもたらすＡＰＣ上の他の共刺激分子、その断片（単独、（１または複数の）別の分子と複合体化して、または融合タンパク質の一部として）を包含する。共刺激分子は、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒを含むさまざまな供給元から市販されている。

【0213】

本発明の一態様では、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１３５－１５１，１９９６、およびＢｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１２１－１３５，１９９６に記載の方法を使用して、マウス、サル、またはヒトなどの哺乳動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未成熟および成熟両方の樹状細胞を生成する。簡潔には、単離ＰＢＭＣは免疫磁気技術によりＴ細胞およびＢ細胞を枯渇させるように予備処理される。次いで、リンパ球が枯渇したＰＢＭＣを、ヒト血漿（好ましくは自己血漿）およびＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４を添加したＲＰＭＩ培地９において（例えば約７日間）培養して、樹状細胞を生成させる。樹状細胞は、単球前駆細胞と比較すると非接着性である。したがって、約７日目に、非接着細胞をさらなる処理のために回収する。

【0214】

ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下でＰＢＭＣに由来する樹状細胞は、サイトカイン刺激が培養物から除去されると、非接着性を失い、マクロファージ細胞の運命に戻り得るという点で未成熟である。未成熟状態の樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ制限経路の天然タンパク質抗原のプロセシングに非常に効果的である（Ｒｏｍａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９，１９８９）。培養樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含むマクロファージ馴化培地（ＣＭ）で３日間培養することにより達成される。成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捕捉する能力は低いが、休止Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方）を刺激して成長および分化させることにはるかに優れている。

【0215】

成熟樹状細胞は、より運動性の細胞質突起（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ）の形成などのその形態変化によって、それらの非接着性によって、以下のマーカー：ＣＤ８３、ＣＤ６８、ＨＬＡ－ＤＲもしくはＣＤ８６の少なくとも１つの存在によって；またはＣＤ １１５などのＦｃ受容体の喪失によって（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１，１９９１において総説）同定することができる。成熟樹状細胞は、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｔａｒなどの典型的な細胞蛍光検査法および細胞選別技術およびデバイスを使用して収集および分析可能である。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は、成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的なものであり、市販されている。二次抗体は、ビオチン化Ｉｇ、続くＦＩＴＣまたはＰＥ結合ストレプトアビジンであり得る。

【0216】

または、樹状細胞を上方制御（活性化）し、単球を活性化樹状細胞表現型に変換する方法が報告されている。この方法では、培養培地にカルシウムイオノフォアを添加して、単球を活性化樹状細胞に変換する。例えば、２４～４８時間の培養期間の開始時にカルシウム２１イオノフォアＡ２３１８７を追加すると、プールされた「単球＋ＤＣ」画分の均一な活性化と樹状細胞表現型変換が得られ、特徴的には、活性化された集団は均一にＣＤ１４（Ｌｅｕ Ｍ３）陰性となり、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＩＣＡＭ－１，１３７．１、および１３７．２を上方制御する。さらに、この活性化されたバルク集団は、さらに精製されると少数ベースでも同様に機能する。サイトカインの特定の（１または複数の）組み合わせは、カルシウムイオノフォアで達成される活性化／変換を増幅（または部分的に置換）するための使用に成功しており、これらのサイトカインには、限定するものではないが、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、およびＩＬ－４が含まれる。単独で投与した場合、各サイトカインは最適な上方制御には不十分である。

【0217】

ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、血液中にすでに循環している比較的多数の事前コミット済みＡＰＣを収集することである。コミットされたＡＰＣをヒト末梢血から単離するための以前の技術は、メトリザミド勾配などの物理的手順と、付着／非付着工程（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８７：７６９８－７７０２，１９９０）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ－Ｄａｍａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：９９６－１００３，１９９４）；および蛍光活性化細胞選別技術（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０－５２，１９９３）との組み合わせを含んでいた。

【0218】

プロフェッショナル抗原提示細胞（またはその前駆体）を単離するための当技術分野で日常的な他の多くの方法があり、そのような方法および開発され得る他の方法は限定されず、本発明の範囲内に包含される。

【0219】

一実施形態では、ＡＰＣ、したがって１または複数の抗原を提示する細胞は自己由来である。別の実施形態では、抗原を提示するＡＰＣは同種異系である、すなわち異なる対象に由来する。

【0220】

本明細書で議論されるように、改良ＬＡＭＰ構築物は、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスベースの送達、または細胞ベースの送達を含む上記の方法または当技術分野で公知の他の方法を使用してＡＰＣに導入することができる。Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（ｌ）：１７－２５，１９９７は、ヒト樹状細胞における遺伝子導入法の比較を報告している。

【0221】

ヒトＭＨＣの遺伝子名称であるヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の、コンセンサス配列を含む公知の部分的および推定のアミノ酸およびヌクレオチド配列が公開されており（例えば、Ｚｅｍｍｏｕｒ ａｎｄ Ｐａｒｈａｍ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３３：３１０－３２０，１９９１を参照されたい）、ＨＬＡ変異体を発現する細胞株が公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から多くが一般に利用可能である。したがって、ＰＣＲを使用して、ＭＨＣクラスＩＩをコードするヌクレオチド配列は、本発明の発現ベクターに容易に作動可能に連結され、次いで、発現のために適切な細胞を形質転換するためにその中で使用される。

【0222】

マクロファージ、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞などのプロフェッショナルＡＰＣが使用可能である。これらは、１）自己ドナー；２）治療対象の宿主と異なるＨＬＡ特異性を有する異種ドナー；または３）標準的な手順を使用して異なる種の異種間ドナーからの血液または組織から収集される（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ３ ａｎｄ １４，１９９４）。細胞は、正常な宿主または感染症、がん、自己免疫疾患、またはアレルギーを有する患者から単離されてもよい。

【0223】

プロフェッショナルＡＰＣは、白血球除去および「ＦＩＣＯＬＬ／ＨＹＰＡＱＵＥ」密度勾配遠心分離（フィコールおよび不連続パーコール密度勾配による段階的遠心分離）を使用して、末梢血から得ることができる。ＡＰＣによって内在化され得る抗原へのＡＰＣの曝露を回避する手順を利用して、目的の抗原に特異的ではないＴ細胞の活性化をもたらす。

【0224】

本来は抗原提示ではない細胞を、適切な分子をコードする配列を導入することにより、抗原提示になるように操作することができる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、アクセサリー分子、共刺激分子および抗原プロセシング補助分子をコードする核酸配列を、そのような遺伝子を含む細胞由来のＤＮＡの直接合成、クローニング、精製などの後で導入することができる。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物および方法で使用される分子をコードする遺伝子を得るための都合のよい１つの手段は、選択された核酸鋳型における選択されたオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によるものである。例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、活性化Ｔ細胞、好酸球、ケラチノサイト、アストロサイト、ミクログリア細胞、胸腺皮質上皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、腸細胞、甲状腺細胞および腎尿細管細胞が使用可能である。これらは、宿主から最近外植され、確立された細胞株を形成するために細胞培養で広範囲に継代されていない初代細胞であるか、または比較的均質で何世代にもわたり無期限に増殖できる確立された細胞株である。

【0225】

プロフェッショナルＡＰＣではない細胞は、自己ドナー、それらが存在する異種ドナーまたは異種間ドナーの任意の組織から、さまざまな公知の分離方法を使用して単離される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉａ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。非自己細胞、例えば異種細胞または異種間細胞を ｅｘ ｖｉｖｏで操作して、公知のヒトＨＬＡ特異性に一致するＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現させることができる。次に、これらの細胞を、操作された細胞のＨＬＡ特異性に一致するヒト対象に導入することができる。細胞は、本発明による１または複数のＬＡＭＰ構築物を発現するようにエｅｘ ｖｉｖｏでさらに操作される。

【0226】

操作された細胞は、標準的な細胞培養法による細胞培養で維持される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉａ’’．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ’’．Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。本発明で使用するための細胞株は、さまざまな供給源（ｅ．ｇ．，ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ＆Ｈｙｂｉｄｏｍａｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）から得られるか、または標準的な方法（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６）を用いて作製される。非形質転換細胞株は、ヒト対象での使用に好ましい。

【0227】

一態様では、ＧＭ－ＣＳＦの影響下で樹状細胞に分化するＣＤ３４＋前駆体は、対象の身体から得られ、改良ＬＡＭＰ構築物をコードする核酸分子が細胞に導入され、その後、対象に注入される。本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を使用すると、特定の抗原に由来するペプチドと形質導入された抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子との結合が増強され、結果として著しくより強力な全身性Ｔ細胞依存性免疫応答および／または抗体産生がもたらされる。この戦略においてトランスフェクトされた抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であるが、宿主内で抗原を効果的に提示する任意のＭＨＣクラスＩＩ細胞を上記のように使用してもよい。

【0228】

ペプチドワクチン
改良ＬＡＭＰ構築物によってコードされるペプチドワクチンも本発明の範囲内である。好ましくは、抗原は区画／オルガネラ（またはそれが送達される後続の区画／オルガネラ）内でプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した免疫応答を調節することができるエピトープを生成する。

【0229】

改良ＬＡＭＰ構築物によりコードされるペプチドワクチンはまた、膜構造に結合されて、生物の身体へのその投与を容易にすることができる。例えば、改良ＬＡＭＰ構築物によりコードされたペプチドワクチンは、米国特許第４，４４８，７６５号に記載のように、リポソーム内に組み込むことができる。

【0230】

タンパク質またはポリペプチドを免疫原として使用する場合、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物の任意の１または複数を組換え細胞において発現させることによって産生させるか、または化学合成により調製することができる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｆ技術（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２１４９－２１５４，１９６８）を使用することができる。

【0231】

ＬＡＭＰ構築物を使用して抗体を生産する方法
本明細書に記載の核酸分子および／または核酸分子が導入されている細胞（本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞など）を使用して、当業者に周知の方法、例えば、当技術分野で説明されている方法などにより抗体を生成することができる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０－９１４（１９８５）；およびＢｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７－２３５４（１９８５）を参照されたい。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化が使用される場合、動物は、改良ＬＡＭＰ構築物によってコードされるタンパク質、および／または本明細書に記載の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を、任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて含むポリヌクレオチドを用いて免疫化することができる。ポリヌクレオチドとしての改良ＬＡＭＰ構築物、改良ＬＡＭＰ構築物のコードタンパク質、および／または細胞（本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞など）を用いたプライミング、それに続く抗原を用いたブースティングは本発明の好ましい実施形態である。さらなる好ましい実施形態では、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を用いたプライミング、それに続く抗原を用いたブースティングが特に企図され、特に抗体レパートリーの多様性および力価の点から見て、さらに強固な免疫応答を生み出すために使用できる。

【0232】

抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、抗体を産生するために非ヒト脊椎動物に注入することができる。ＬＡＭＰ構築物の調製および非ヒト脊椎動物への注入は、当業者に周知の動物の免疫化の原理に従って達成されすることができる。

【0233】

抗原を効果的に提示するための改良ＬＡＭＰ構築物の使用は、一態様では、エンドサイトーシスおよびエンドソームとリソソームとの融合後に抗原提示細胞においてＬＡＭＰによってプロセシングされる抗原を伴う。エンドソームは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子を含むゴルジ体からのエキソサイトーシス小胞と融合し、結果として生じるペプチドが結合する。次に、ＭＨＣ－ペプチド複合体は、抗原がＣＤ４^＋Ｔ細胞へのディスプレイに利用できる原形質膜に輸送される。

【0234】

ウサギ、ラット、マウス、ラマ、ラクダ、および／またはウシなどの動物は、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物および／または抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドで免疫化することができる。免疫化に適した追加の動物には、非ヒト哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ（例えば、マウス）、イヌ（例えば、犬）、ネコ（例えば、猫）、ウマ（例えば、馬）、霊長類、真猿類（例えば、サルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）が含まれる。

【0235】

例えば、約１００マイクログラムの抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物または担体タンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することが公知の任意の他のアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射が使用できる。固体表面に直接または（例えば、ビオチン化ＡｖｉＴａｇを介して）間接的に吸着した遊離の抗原を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能な、抗抗原抗体の有用な力価を提供するために、いくつかのブースター注射（組換え抗原タンパク質を含むものなど）を、例えば約２週間の間隔で必要としてもよい。免疫化動物の血清中の抗抗原抗体の力価は、抗抗体の選択により、例えば、固体支持体上の抗原への吸着および当技術分野で周知の方法による選択された抗体の溶出により増加させることができる。

【0236】

また、抗原含む改良ＬＡＭＰ構築物は、（任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて）コードする核酸分子を動物に直接導入し得る。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；第６，８７５，７４８号；第５，６６１，１３３号；Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４Ｏｃｔ；１３（１０）：７５９－８０；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００８Ｎｏｖ；１６（１１）：１８３３－４０；Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，２０１１，Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４２；米国特許第６，５１１，８３２号を参照されたい。一例では、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、非ヒト脊椎動物に直接注入される。動物への注射は、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、静脈内、気管内、およびくも膜下腔内の送達を介して行うことができる。継続する組換え抗原によるブースティングも、抗体の生成に含めることができる。

【0237】

さらに、開示の方法によって生成された抗体は、例えばファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して親和性成熟させることができる。一例では、ファージ粒子の表面にディスプレイされる単鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」）をスクリーニングして、抗原および／または出発タンパク質に免疫特異的に結合するｓｃＦｖを同定する。本発明は、ｓｃＦｖならびに抗原および／または出発タンパク質に免疫特異的に結合することが同定されたその部分の両方を包含する。そのようなｓｃＦｖは、例えば、ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を定常ドメイン配列を含む発現ベクターに挿入し、免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作することにより、免疫グロブリン分子に日常的に「変換」することができる。

【0238】

抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物および／または本発明の抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドを使用した、産生された抗体（ｓｃＦｖおよび抗体断片またはその変異体（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖もしくはその一部、または本発明の単鎖抗体）を含むか、またはそれらからなる他の分子を含む）の組換え発現には、抗体またはその断片または変異体をコードするポリヌクレオチドを含む（１または複数の）発現ベクターの構築が必要である。抗体分子（例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその変異体もしくは部分（必ずしもそうではないが、重鎖または軽鎖可変ドメインを含むことが好ましい））をコードするポリヌクレオチドが得られたら、該抗体分子の産生のための（１または複数の）ベクターは、当該分野で周知の技術を使用した組換えＤＮＡ技術により作製することができる。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることにより抗体を調製する方法を、本明細書に記載する。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれ、これを本明細書に記載する。したがって、本発明は、本明細書に記載のように得られ、単離された抗抗原抗体（例えば、全抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、またはその一部、または重鎖もしくは軽鎖のＣＤＲ、単鎖Ｆｖ、またはその断片もしくは変異体）をコードする、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ公報国際公開第８６／０５８０７号；ＰＣＴ公報国際公開第８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖および全軽鎖両方の発現のために、そのようなベクターにクローニングすることができる。

【0239】

（１または複数の）発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入することができ、その後、トランスフェクトされた細胞は、従来の技術によって培養され、いずれかの抗抗原抗体を産生する。したがって、本発明は、抗抗原抗体（例えば、全抗体、その重鎖もしくは軽鎖、またはその一部、または本発明の単鎖抗体、またはその断片もしくは変異体）をコードする、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。好ましい実施形態では、全抗体分子の発現のために、以下に詳述するように、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞において全免疫グロブリン分子の発現のために同時発現させることができる。

【0240】

さまざまな宿主発現ベクター系を利用して、抗抗原抗体を発現させることができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を生成し、その後精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした場合、抗抗原抗体を発現する細胞のことも表す。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（バキュロウイルスなど）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、またはコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞が、抗抗原抗体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと組み合わせて有効な発現系となる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。

【0241】

細菌系では、意図する用途に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のタンパク質を生産する場合（抗体産生または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドのいずれかのために）、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいと思われる。このようなベクターには、限定するものではないが、融合タンパク質が産生されるように、コード配列がｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクター内に個別にライゲーションされ得る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ １．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１－３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９（１９８９））などが含まれる。ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。

【0242】

昆虫系では、オートグラファカリフォルニアニュークレア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させることができる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞内で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。

【0243】

哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用して、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現させることができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションされ得る。次いで、このキメラ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。

【0244】

ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、感染宿主において生存可能な、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現できる組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ １：３５５－３５９（１９８４）を参照されたい）。

【0245】

挿入されたコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要になり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同時性（ｉｎ ｐｈａｓｅ）でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方のさまざまな起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることにより高めることができる（例えば：Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４（１９８７）を参照されたい）。

【0246】

加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の様式で改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特定のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正しい改変とプロセシングを確実に行うことができ、この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ならびに特に、例えばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄなどの乳がん細胞株、およびＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔなどの正常な乳腺細胞株が含まれる。

【0247】

組換えタンパク質の長期にわたる高収量の生産には、安定した発現が好ましい。例えば、抗抗原抗体の発現または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを安定して発現する細胞株に操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）よって制御されるポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞は、栄養強化培地で１～２日間増殖させ、その後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定して組み込んで成長し、細胞株内でクローニングされ、増殖できる病巣（ｆｏｃｉ）を形成可能にする。この方法は、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。

【0248】

多数の選択系、例えば、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８ １７（１９８０））の遺伝子は、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、またはａｐｒｔ－細胞において使用することができる。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、メトトレキサートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与する（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１２：４８８－５０５（１９９３）；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，ＡｎｎＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２ １５（Ｍａｙ；１９９３））；ならびにｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ １２および１３、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。

【0249】

抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅によって増加させ得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養中に存在する阻害剤のレベルを増加させるとマーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域はコード配列に関連付けられているため、抗抗原抗体の発現または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドの産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。

【0250】

ベクター配列に含めることができる他の要素としては、異種シグナルペプチド（分泌シグナル）、膜固定配列、イントロン、代替スプライス部位、翻訳開始および停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位、および翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質またはペプチドへの融合をコードする配列、内部リボソーム再進入部位により分離された別個のコード領域、例えば選択性（例えば抗生物質耐性）または選別性（例えば蛍光）を付与する「マーカー」タンパク質をコードする配列、修飾ヌクレオチドおよびシス作用特徴の他の公知のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらの例に限定されない。

【0251】

宿主細胞には、本発明の２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを同時トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含んでもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現できる単一のベクターを使用してもよい。このような状況では、過剰な毒性のない重鎖を避けるために、軽鎖は重鎖の前に配置することが好ましい（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２ １９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。

【0252】

抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドが組換え発現によって生成されると、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特にプロテインＡの親和性および特異的抗原に対する免疫親和性による）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質精製のための任意の他の標準技術により精製することができる。さらに、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドは、精製を促進するために本明細書に記載の、または当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合され得る。

【0253】

一例では、抗抗原抗体または改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）またはその一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの一部）、またはアルブミン（限定するものではないが、組換えヒトアルブミンまたはその断片または変異体を含む（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０ ４１３ ６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号を参照されたい））と融合されて、キメラポリペプチドをもたらし得る。そのような融合タンパク質は、精製を促進し、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長し得る。これは、ヒトＣＤ４－ポリペプチドの最初の２つのドメインと哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域のさまざまなドメインからなるキメラタンパク質として示されている。例えば、欧州特許第３９４，８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４－８６（１９８８）を参照されたい。免疫系に対する上皮バリアを通過する抗原送達の増強は、ＩｇＧまたはＦｅ断片などのＦｃＲｎ結合パートナーに結合した抗原（例えば、インスリン）について実証されている（例えば、ＰＣＴ公報国際公開第９６／２２０２４号および国際公開第９９／０４８１３を参照されたい）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合によるジスルフィド連結二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質は、単量体ポリペプチドまたはその断片単独よりも他の分子の結合および中和においてより効率的であることがわかっている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８－３９６４（１９９５）を参照されたい。抗抗原抗体または本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドをコードする核酸を、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラグタグ）として目的の遺伝子と組換え、発現されたポリペプチドの検出および精製を助けることもできる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらに記載されている系は、ヒト細胞株で発現した非変性融合タンパク質を即時精製することができる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２－８９７）。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳融合されるように、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。タグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして機能する。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸－アガロースカラムに負荷し、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有バッファーで選択的に溶出することができる。

【0254】

投与
本発明によるワクチン材料は、本明細書に記載の免疫刺激性改良ＬＡＭＰ構築物（ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原）をコードする核酸分子を含んでも、または組換え微生物、もしくは免疫刺激性改良ＬＡＭＰ構築物（ならびにブースティングエピトープおよび／または抗原）を発現する抗原提示細胞であってもよい。個体の免疫化のためのそのような核酸分子の調製および投与は、当業者に周知の免疫化の原理に従って達成される。

【0255】

核酸分子を含む組換え細胞または形質転換細胞を培養することにより、これらの材料を大量に得ることができる。培養方法は、当業者に周知であり、上記で引用した文書の１つまたは複数で教示されている。本明細書に記載の核酸分子を含むワクチンは一般に、組換え細胞または形質転換細胞の培養によって製造され、通常生理学的に適合性のある水溶液である薬理学的に許容される溶液もしくは懸濁液、または当技術分野で、例えば米国特許第４，４４６，１２８号に記載のようにコーティング錠、錠剤、カプセル、坐剤またはアンプルに製剤化され、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる。投与は、経口、直腸、鼻腔内または注射による任意の適切な経路であり得、注射は、例えば、経皮、皮下、筋肉内または静脈内であり得る。

【0256】

本明細書に記載の核酸分子は、哺乳動物に免疫応答を誘発するのに十分な量で哺乳動物に投与され得る。投与のための好ましい最小量は、投与前に存在した濃度の少なくとも４倍の濃度まで抗体形成を誘発するのに必要な量である。投与の一般的な初期用量は、静脈内、筋肉内または皮下投与の場合１０～５０００マイクログラム、または１０^５～１０^１１プラーク形成単位の組換えベクターであるが、この量は、ワクチンおよび免疫応答を誘発する他の薬剤の投与を一般に行う、投与を実施する臨床医によって調整されてもよい。通常、免疫を誘発するには単回投与で十分であり得るが、応答を確実にする、またはブーストするために、複数回投与を行ってもよい。

【0257】

改良ＬＡＭＰ構築物ワクチンは、最初に非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたは霊長類）で試験することができる。例えば、接種したマウスの免疫応答のアッセイを使用して、野生型抗原よりも多くの、改良ＬＡＭＰ構築物に対する抗体、Ｔ細胞増殖、および細胞傷害性Ｔ細胞応答を示すことができる。改良ＬＡＭＰ構築物をアカゲザルで評価して、マウスで非常に効果的なワクチン製剤が適切なサルの免疫応答を誘発するかどうかを判断することができる。一態様では、各サルに、合計５ｍｇの核酸分子／免疫化を、ＩＭ送達で２つの部位に分けて０日目に投与し、任意選択の追加の用量で４、８、および２０週目に免疫化した。抗体応答、ＡＤＣＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞抗原特異的サイトカイン染色を測定して、ワクチンに対する免疫応答をモニターすることができる。

【0258】

本発明による製剤化および投与の適切な方法のさらなる説明は、米国特許第４，４５４，１１６号（構築物）、米国特許第４，６８１，７６２号（組換え細菌）、ならびに米国特許第４，５９２，００２号および第４，９２０，２０９号（組換えウイルス）に見出すことができる。

【0259】

がん免疫療法：予防および治療の候補
表１に記載の少なくとも１つのがん抗原を含む本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物は、がんおよび／または過剰増殖性障害を有する患者を治療するために使用することができる。例としては、エプスタイン－バーウイルス関連リンパ腫が記録されている患者、ＨＰＶ関連子宮頸がん患者、慢性ＨＣＶ患者、またはがん遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子に明確な再配列または変異がある患者が挙げられる。さらに好ましい実施形態には、ＣＭＶ感染から生じるがんを含む過剰増殖性障害を有する患者が含まれる。

【0260】

好ましい実施形態では、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物を使用して治療可能ながんは、限定するものではないが、すべての進行段階の、腺がんの過形成、肉腫、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん）、黒色腫、膀胱がん、脳がん（多形性神経膠芽腫を含む）、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん（限定するものではないが、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、扁平上皮がんを含む）、結腸直腸がん、肛門がん、直腸がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭頸部がん、口腔がん、唾液腺がん、食道がん、膵臓がん、膵管腺がん（ＰＤＡ）、腎がん、胃がん、腎がん、多発性骨髄腫または脳がんが挙げられる。

【0261】

改良ＬＡＭＰ構築物を含むワクチン組成物の場合などの、改良ＬＡＭＰ構築物による治療は、個体のがんが特定されれば、その経過中の任意の期間で利用できることが想定される。リスクの高い患者では、その後のがんの発生を防ぐためのワクチン接種も可能である。表１の（１または複数の）がん抗原を含む、タンパク質ベースのＬＡＭＰ構築物ワクチンならびに細胞療法（例えば、ＬＡＭＰ構築物を含む樹状細胞療法）および自己複製構築物もまた想定される。

【0262】

治療の手順
一実施形態では、改良ＬＡＭＰ構築物を（任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて）、悪性腫瘍の経過中の任意の適切な時間に患者に注入することができる。例えば、表１に記載の少なくとも１つのがん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、腫瘍負荷が低い段階で注入される。改良ＬＡＭＰ構築物が個体の抗原提示細胞（例えば樹状細胞など）に導入される代替実施形態では、抗原提示細胞の前駆体または成熟抗原提示細胞は、静脈穿刺により個体の骨髄または末梢血のいずれかから採取される。これらの細胞は培養で確立され、改良ＬＡＭＰ構築物を形質導入される。形質導入が行われると、これらの抗原提示細胞が患者に注入され、戻される。

【0263】

特に好ましい実施形態では、本発明は、疾患の初期、新生物腫瘍の切除後、または腫瘍細胞の負荷が減少した場合など、腫瘍負荷が低いがん患者の治療方法を提供する。この方法では、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞に分化することができる自己幹細胞を含む細胞集団が患者から得られる。これらの細胞を培養し、改良ＬＡＭＰ構築物を、ブースティングエピトープおよび／または抗原と共に、またはそれなしに導入することにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連するがん抗原をこの区画／オルガネラ内、または抗原が送達される別の区画／オルガネラ内のいずれかに送達して、ブースティング抗原が循環内に分泌されるように形質転換する。

【0264】

次いで、トランスフェクトされた幹細胞集団を患者に再導入し、そこで幹細胞は、抗原からのＴ_ｈエピトープと複合体化したＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞に分化する。抗原に対する免疫応答は、ヘルパーＴ細胞集団の刺激を増強することにより増強される。分泌されたブースティング抗原は、例えば、メモリ応答を拡大させることによって免疫応答をブーストする。

【0265】

より一般的には、一実施形態では、本発明は、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を調節する（すなわち、そのような応答を刺激、増強、または低減する）ための改良ＬＡＭＰ構築物を（任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原と併せて）含むワクチン組成物を提供する。

【0266】

キット
本発明はさらに、本明細書に記載の方法の実施を容易にするキットを含む。一態様では、キットは、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物と任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原、ならびに改良ＬＡＭＰ構築物を受け取るための細胞を含む。キットは、細胞をプロフェッショナルＡＰＣに操作するための１または複数の核酸をさらに含み得る。一態様では、細胞はプロフェッショナルＡＰＣである。細胞は、共刺激分子を発現してもしなくてもよい。好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しない場合、改良ＬＡＭＰ構築物によりコードされる抗原は自己抗原である。別の態様において、異なるＭＨＣ分子（例えば、ヒトで発現されることが知られている）を発現する細胞のパネルが提供される。さらなる態様において、キットは、改良ＬＡＭＰ構築物の細胞への進入を促進する試薬（例えば、脂質ベースの製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など）を含む。なおさらなる態様では、改良ＬＡＭＰ構築物によってコードされる抗原に特異的な１または複数のＴ細胞株が提供され、改良ＬＡＭＰ構築物の免疫応答を誘発、調節または増強する能力が検証される。

【実施例】

【0267】

ここで、以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。以下のことは単なる例に過ぎず、本発明の範囲内にある限り詳細を変更可能であることを理解されたい。

【0268】

実施例１－ＬＡＭＰ構築物の構築
図１に示す改良ＬＡＭＰ構築物は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して構築することができる。例えば、ポリヌクレオチドを含むプラスミドは、図１に示されるＩＬＣ－１からＩＬＣ－６の異なる構造を生成するように設計できる。図１に示したＬＡＭＰドメインは、図３～１０に示したアミノ酸配列に由来する。好ましくは、ＬＡＭＰドメインは、図３～１０に示されるヒトＬＡＭＰタンパク質に由来する。各ドメインの境界は、図２Ａおよび図２Ｂから導き出すことができる。ヒト配列と比較して同等のドメインを同定することにより、対応するドメインをオルソロガス配列からクローニングすることも想定される。表１に記載のがん抗原は、個別にまたは組み合わせて、記載のＬＡＭＰ構築物にクローニングすることができる。

【0269】

実施例２－ＬＡＭＰ構築物に対するマウスの免疫応答評価
実施例１に記載の改良ＬＡＭＰ構築物の能力を、免疫応答を調節する能力について試験することができる。例えば、メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｌＰＢＳ中の、５０μｇの改良ＬＡＭＰ構築物および５μｇのＧＭＣＳＦにより、ナノパスを使用して０、１４、２８日目に免疫化することができる。実験は、最後の投与の４週間後に終了させた。

【0270】

脾細胞（３ｘ１０^５／ウェル）をＴ細胞培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１ｘ２－ＭＥを含むＲＰＭＩ）において抗原タンパク質（１０ｕｇ／ｍｌ）で刺激し、７２時間後に上清を収集する。上清を希釈し（上清４００ｕｌ＋Ｔ細胞培地２００ｕｌ）、サイトカインをＥＬＩＳＡによって評価する。ＩＬ－１０またはＩＬ－４の産生を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定できる。

【0271】

実施例３－ＬＡＭＰ構築物を使用した抗原提示の改善
がんは、他の身体部分に侵入する可能性のある異常な細胞増殖が正常な恒常性を制御し、適時かつ適切に治療されなければ致命的になる異種の疾患群である。免疫療法は腫瘍細胞を特異的に標的とし、それにより非腫瘍細胞への付随的損傷を回避し、抗腫瘍応答を誘導する。この抗腫瘍応答は、外科的切除では不可能な場合がある体内の遠隔部位の腫瘍を根絶する可能性も有する。腫瘍細胞は複数の回避戦略を使用し、免疫細胞による検出または排除を回避するため、抗腫瘍免疫応答の誘導または増強は、がんにおける手ごわい課題である。

【0272】

このプロジェクトの目的は、Ｉ．Ｄ．によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注入されたすべての新世代ＬＡＭＰ構築物のｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答を評価することである。具体的には、マウスを、皮内注射により被験構築物５０μｇで免疫化した。この実験ではアジュバントは添加しない。６匹のマウス／群にワクチンを７日ごとに、１か月に合計３回投与する。免疫応答を、最後の免疫化の１４日後にモニターする。

【0273】

被験がん抗原ＬＡＭＰ構築物を、本明細書に記載されるように生成し、各被験構築物の配列を図１１に示した。ＩＦＮγに対するＥＬＩＳＰＯＴ抗体ペアはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。蛍光結合ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、ＣＤ６９モノクローナル抗体およびＺｏｍｂｉｅ ａｑｕａ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ストレプトアビジン－ＨＲＰは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。

【0274】

好ましい実施形態では、各がん抗原ＬＡＭＰ構築物５０μｇを、Ｐｈａｒｍａｊｅｔの用量あたりマウスあたり１００ｕｌの総体積で使用する。マウスを、０、７、および１４日目にｉ．ｄ．送達によってワクチンを用いて免疫化する。血清収集のため、２８日目にマウスから採血する。血清を収集し、－３０℃において保存する。脾臓を２８日目の実験終了時に収集し、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＦＡＣＳのために処理して、Ｔ細胞応答を評価する。

【0275】

ＥＬＩＳＡによる血漿抗原特異的総ＩｇＧの測定。がん抗原に対するマウス抗体応答は、間接ＥＬＩＳＡによって評価することができる。ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）を炭酸－重炭酸バッファー中２μｇ／ｍｌのがん抗原で一晩コーティングし、次いでＰＢＳ中２％ ＢＳＡでブロックする。血漿試料をブロッキングバッファーで１：１００に希釈する。試料を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を用いて検出する。反応をＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質で発色させ、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のＴＭＢ停止溶液で停止させる。Ｅｐｏｃｈ ＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、プレートを読み取る（ＯＤ４５０）。

【0276】

抗原特異的Ｔ細胞応答の評価。本明細書に記載のがん抗原ＬＡＭＰ構築物をワクチン接種されたマウスの抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウスの脾細胞を、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）による抗原特異的ＩＦＮγ産生について評価した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中捕捉モノクローナル抗体で４℃において一晩コーティングする。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、室温で少なくとも２時間、２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地でブロッキングする。脾細胞を３×１０^５細胞／ウェルで播種し、２μｇ／ｍｌのプールされたがん抗原のペプチド（表２）、またはコンカバリンＡ（０．１２５μｇ／ｍｌ）と共に、または培地のみで、総量２００μｌ／ウェルのＴ細胞培地（Ｌ－グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、および５×１０^－５Ｍのβ－ＭＥを含むＲＰＭＩ－１６４０）中３×１０^５細胞／ウェルで３７℃、５％ＣＯ_２において４８時間共培養する。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで２回、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）で２回洗浄する。希釈した検出抗体（ＰＢＳ－Ｔ／０．５％ＢＳＡ中５０μｌ／ウェル）を添加し、室温で振とうしながらプレートを２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳで４回洗浄する。ＰＢＳで希釈したストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（５０μｌ／ウェル）を添加し、２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）基質で１０分間発色させる。水道水の流水で洗浄することにより発色を停止させる。暗所で室温において７２時間乾燥させた後、ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ高解像度リーダーシステムおよびＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴソフトウェアバージョン３．５（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ）を使用して、着色スポットをカウントする。

【0277】

ウエスタンブロット。リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３Ｔ細胞に被験構築物をトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞をＰＢＳで洗浄し、停止プロテイナーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含む２００μｌのＲＩＰＡ溶解バッファーに懸濁する。溶解物を遠心分離機にかけ（７００ｇ、４℃において１５分間）、次いでＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、清澄化された上清のタンパク質濃度を測定する。１０μｇのタンパク質をプレキャスト（４－２０％）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において電気泳動し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写し、ｈＬＡＭＰに対するｍＡｂを用いて免疫ブロットする。膜を、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標）ブロックバッファー（ＫＰＬ）でブロックし、ウサギ抗ヒトＬＡＭＰ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）または抗がん抗原抗体とヤギ抗ウサギＨＲＰ抗体とでプローブして、ＴＭＢ（ＫＰＬ）で発色させる。

【0278】

フローサイトメトリー。細胞をまずＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅ ａｑｕａ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅで標識し（１：５００希釈）、続いて染色バッファー（ＰＢＳ中４％ＦＢＳ、２％ラット血清、２％マウス血清）中の表面抗体（１：１００希釈）で標識する。細胞内染色の場合、細胞をＺｏｍｂｉｅ ａｑｕａで染色した後、表面染色し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理バッファー（１％ＦＣＳ、０．１％サポニンを含むＰＢＳ）中で細胞内抗体により染色する。試料をＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析し、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析することができる。

【0279】

統計。統計的有意性を評価するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアまたはＲファイルを使用して、二元配置ＡＮＯＶＡ検定を実行する。各マウスのＲＰＭＩ結果は、抗原活性化の結果から差し引く。

【0280】

ワクチンおよび免疫化。対照、がん抗原＋完全ＬＡＭＰ、がん抗原－ＩＬＣ－１構築物、がん抗原－ＩＬＣ－２、がん抗原－ＩＬＣ－３、およびがん抗原－ＩＬＣ－４構築物ワクチンを、２５μｌ／マウス／用量の総体積で使用する。マウスを、０、７、および１４日目にＩＤ送達によってワクチンを用いて免疫化する。血清収集のため、－１３および２８日目にマウスから採血する。血清を収集し、－３０℃において保存する。脾臓を２８日目に収集し、ＥＬＩＳＰＯＴ／ＥＬＩＳＡアッセイのために処理する。

【0281】

実施例４：ＬＡＭＰ構築物による治療的処置
雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、同系の７０００ ４Ｔ１乳がん細胞を０日目に皮下接種することができる。腫瘍が触知可能になったら、ナノパスを使用して、１００ｕｌ ＰＢＳ中の５０ｕｇのワクチンおよび５ｕｇのＧＭＣＳＦをｉ．ｄ投与する。原発腫瘍はノギスで測定し、腫瘍体積は式ｐ／６（長さｘ幅）３／２を使用して計算する。腫瘍接種後の日数の関数として平均腫瘍体積を測定することができる。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットを使用して、終了時点での全生存率を示すことができる。

【0282】

実施例５－プライム／ブーストプロトコル
本明細書に記載のがん抗原構築物をコードするＤＮＡワクチンは、治療用途に使用され得る。この設定では、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入することができる。ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびＴＭＢ停止液は、ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入することができる。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、カタログ番号ＭＡＩＰＳ４５１０）に注文する。ＥＬＩＳＰＯＴで使用されるＩＦＮ－γ抗体ペアはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、クローンＡＮ１８およびＲ４６Ａ２をそれぞれコーティングおよび検出に使用した。ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＡＥＣ基質はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入する。

【0283】

６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＡ）から購入し、Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ）の動物施設で飼育することができる。マウス（ｎ＝６）を、０、７、および１４日目にエレクトロポレーションＩＭ送達によって、１０μｇ／用量の本明細書に記載のがん抗原改良ＬＡＭＰ構築物（および適切な対照）で処置する。３５日目に、マウスを、例えばミョウバンの存在下で５μｇのがん抗原タンパク質でｉ．ｐ．注射によりブーストする。２８日目と４９日目に、マウスから採血し、抗体検出のために血清を単離する。マウスを５６日目に屠殺し、脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ－γ産生について試験する。

【0284】

次いで、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ；（１０）：１－１５（２０１６）によるＥＬＩＳＡ手順を行う。プレートを５μｇ／ｍｌのがん抗原タンパク質でコーティングする。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して分析する。

【0285】

実施例６－Ｃ５７ＢＬ／６中におけるＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}の検証
メルケル細胞がん（ＭＣＣ）は、まれな種類の皮膚がんであり、米国では毎年約２５００人が罹患している。ＭＣＣは、急速に成長する肌色または青みがかった赤色の小結節として、典型的には、顔、頭、または頸部に存在する。ＭＣＣの発生率は年齢とともに増加し、長期の日光曝露および免疫抑制と相関する。ＭＣＣは非常に侵襲性で高度に転移性であり、治療選択肢は限られており、この疾患に対する新しい標的療法の必要性を実証している。ＭＣＣ症例の約８０％は、皮膚内のメルケル細胞にクローン的に組み込まれる環状二本鎖ＤＮＡウイルスであるメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰγＶ）による感染に関連する。ＭＣＰγＶによる感染は、ヒト皮膚微生物叢において遍在的に発現されるウイルスと共通していると考えられる。ＭＣＣは非常にまれであるので、疾患発症は明らかに多因子性である。

【0286】

ＭＣＣ細胞は、変異したウイルスタンパク質を発現し、その主なものは、ＭＣＰγＶ４の大型Ｔ（ＬＴ）抗原の切断型である。健常者およびＭＣＣ患者の両方からのＣＤ４ Ｔ細胞はＬＴを認識し、それがワクチン開発のための魅力的な潜在的腫瘍関連抗原となる。ＬＴは、主に網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲＢ）のＮ末端媒介隔離を介して、がんタンパク質として機能する。２２０位でセリンをアラニンに変異させると、ｐＲＢへのＬＴ結合が排除され、その発がん促進特性が無効になる。Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．３８，１１５３－１１６２（ＩＪＣ ２０１６）。ＣＤ４ Ｔ細胞はＬＴＳ２２０Ａおよび野生型ＬＴの両方を認識し、ＬＴＳ２２０Ａをワクチン接種すると腫瘍内の内因性ＬＴを認識できる免疫応答を誘導できることを示唆している。

【0287】

本発明者らは、本明細書に記載のリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）に加えて、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}（配列番号１５１）をコードするＤＮＡワクチンを作製した。具体的には、２２０位に変異（セリンをアラニンに置換）を有する配列番号１１６を構築し、ＩＬＣ－４で説明したように、ＬＡＭＰのヒンジ領域に挿入した。図１１Ａおよび配列番号１５１を参照されたい。

【0288】

本発明者らは、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方の産生によって測定されるように、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが強力な全身性抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘導することを報告する。この研究は、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}が機能的であり、ＬＴ－ＭＣＰγＶに対する全身性抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘導し得ることを示唆している。

【0289】

ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰは、Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によって製造された。対照ベクターはＩＴＩにより作製された。ＬＴ－ＭＣＰγＶにまたがる重複ペプチドライブラリーをＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。ペプチドをＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、それぞれ２５のペプチドを含む５つのペプチドプールを２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で作成した。全てのペプチドの作業濃度は２ｕｇ／ｍｌであった。コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃ５２７５）を０．１２５ｕｇ／ｍｌで使用した。使用した「培地」は「Ｔ細胞培地」（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１％ β－メルカプトエタノール）であった。ＲＢＣ溶解バッファーは、Ｔｏｎｂｏから購入した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＳＩＰＳ４５１０）を精製抗マウスＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５１７９０２）でコーティングし、ビオチン結合抗マウスＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５０５７０４）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＢＤ ５５７６３０）およびＡＥＣ基質キット（ＢＤ ５５１０１５）で発色させた。細胞内フローサイトメトリーのために、細胞を、実施説明書に従ってブレフェルジンＡ（ＢＤ ５５５０２９）、モネンシン（ＢＤ ５５４７２４）および／または細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ００－４９７０－０３）と共にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ）で洗浄し、表面標的に対する蛍光色素結合抗体：ＣＤ４ ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００４０６）、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００７３４）、ＣＤ４４ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０３０３０）、ＣＤ３ Ａ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２１６）、ＣＤ６２Ｌ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０４４３８）で染色した。次いで、細胞を固定し（ＢＤ ５５４７１４）、細胞内標的に対する蛍光色素結合抗体：グランザイムＢ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２－８８９８－８２）、ＴＮＦα ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５０６３０８）、およびＩＦＮγ ｅ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４８－７３１１－８２）で染色した。

【0290】

免疫化およびサイトカイン測定。７～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＡ）から購入し、ＩＴＩ動物施設（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で飼育した。週用量のワクチンを４回、０日目から開始して毎週耳（ＩＤ／ＥＰ）に投与した。最後のワクチン接種の２週間後にマウスを安楽死させ、血清および脾細胞を収集し、ＲＢＣを溶解した。脾細胞を分析前に１０％ ＤＭＳＯ中で凍結した。解凍後、生存脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生の測定に使用した。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＡＩＤプレートリーダー、ＦｌｏｗＪｏ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、およびＰｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用してデータを分析した。

【0291】

結果。図１１Ｃに示すように、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰは全脾細胞においてＩＦＮγペプチドのリコール応答を誘導する。図１１Ｂに示すように、マウスにＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種した。脾細胞を、安楽死時に１０％ ＤＭＳＯ中で凍結した。解凍後、１ウェル当たり３×１０^５個の生存脾細胞を、精製抗マウスＩＦＮγでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ＬＴ－ＭＣＰγＶにまたがる重複するペプチドライブラリーのセグメントを含む５つの別個のペプチドプール（２ｕｇ／ｍｌ）、および陽性対照としてのコンカナバリンＡを含む適切な刺激を加えた。４８時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄し、ビオチン結合抗マウスＩＦＮγ、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＡＥＣ基質を使用して発色させた。プレートを乾燥させ、ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーで画像化した。

【0292】

ペプチドプール２および５は、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種したマウスの脾細胞において最も強いリコール応答をもたらした。裏付けとなる実験では、ＩＬ－１０産生は、どの条件下でもどの群でも検出できなかった（データ非掲載）。注目すべきことに、ペプチドプール５は、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞の両方について免疫優性エピトープであることが他の群によって以前に同定されたものを含む、さらなる非重複ペプチドを含む。免疫優性ＣＤ８エピトープはプール１にも見られ、免疫優性ＣＤ４エピトープはプール２にも見られる。これらのＥＬＩＳＰＯＴデータは、ＣＤ４ Ｔ細胞が、以前の研究と一致して、このモデルにおいてＩＦＮγの支配的な産生細胞である可能性が高いことを示唆している。さらに、リコール応答はプール５と比較してペプチドプール２に対してより強かったため、プール２は、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰとの関連で免疫優性エピトープとして働く追加のペプチドおよび／またはさらに最適化されたペプチドを含み得る。さらなる研究により、ＩＦＮγ産生を誘導するペプチドプール２内の特異的ペプチドを特性評価すべきである。

【0293】

図１１Ｄ：ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰは、脾臓ＣＤ４ Ｔ細胞ではペプチドのリコール応答においてＩＦＮγおよびＴＮＦα産生を誘導するが、脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞では誘導しない。図１１Ｂに示すように、マウスにＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種した。脾細胞を、安楽死時に１０％ ＤＭＳＯ中で凍結した。解凍後、ブレフェルジンＡ、モネンシン、およびＬＴ－ＭＣＰγＶにわたる重複ペプチドライブラリーのセグメントを含む５つの別個のペプチドプール（２ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、１ウェルあたりおよそ２Ｅ６個の脾細胞を播種した。陽性対照およびアイソタイプ対照として使用するために、ＰＭＡ／イオノマイシンを含む２つのウェルをインキュベートした。各脾細胞試料もペプチド非含有対照として播種した。５時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、蛍光色素結合抗体で染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターで分析した。

【0294】

細胞内サイトカイン染色データはＥＬＩＳＰＯＴデータと一致しており、ペプチドプール２および５は、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種したマウスの脾細胞において最も強いリコール応答を生成する。さらに、予測されたように、ＣＤ４ Ｔ細胞は、このモデルにおいてＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方の支配的な産生細胞であったが、ＣＤ８ Ｔ細胞に対する影響は無視できるものであった。

【0295】

図１１Ｅは、ペプチドプール２（配列番号１１４のａａ１４１～１６０）、ペプチド１３（配列番号１１４のａａ１４５～１５７）、および程度は低いが、ペプチド６（配列番号１１４のａａ１１７～１２９）、１２（配列番号１１４のａａ１４１～１５３）、および１７（配列番号１１４のａａ１６１～１７３）が、全脾細胞において観察されたＩＦＮγペプチドリコール応答を誘導することを示す。上記の脾細胞を終了日に凍結し、１５日後に解凍し、個々のマウスを群内にプールした。１ウェル当たり３×１０^５個の生存脾細胞を、精製抗マウスＩＦＮγでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチドプール２からの２５ペプチドをそれぞれ、２ｕｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。培地のみおよび陽性対照としてコンカナバリンＡを用いて、公知のＣＤ４およびＣＤ８エピトープも参照用に試験した。４８時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄し、ビオチン結合抗マウスＩＦＮγ、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよびＡＥＣ基質を使用して発色させた。プレートを乾燥させ、ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーで画像化した。

【0296】

プール２由来のペプチド１３は、公知のすでに同定されているＣＤ４免疫優性エピトープを使用して観察されたものよりもさらに強い、最も強いＩＦＮγペプチドリコール応答を誘導した。ペプチド１３は、両方の公知のエピトープとの重複を示すが、際立っている。このペプチドは、抗原がＬＡＭＰとの関連でプロセシングされる場合に最適であり得る。公知のエピトープと重複しないペプチド６および１７を含むさらなるペプチドは、ＩＦＮγペプチドリコール応答を示した。

【0297】

実施例８：Ｃ５７ＢＬ／６における予防的Ｂ１６－ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}研究
この研究では、Ｂ１６のマウスモデルにおいて腫瘍成長を予防するＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの能力を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、エレクトロポレーションを用いずに皮内投与によって週に１回のワクチン接種を３回行った。最後のワクチン接種の１週間後、末梢血をＩＦＮγペプチドリコール応答について分析して、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰのワクチン接種に対する免疫応答を評価した。最後のワクチン接種の２週間後、マウスの右側腹部に２Ｅ５個のＢ１６－ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}腫瘍細胞を皮下投与した。腫瘍成長および全生存を経時的に測定した。予想外にも、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰ ３０００の予防的ワクチン接種は、腫瘍成長の開始を約３０日間、有意に遅延させた。ワクチン接種マウスにおいて腫瘍増殖が観察されたら、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの追加用量を週に１回、合計５用量投与した。ワクチン接種マウスの約５０％は、腫瘍成長の開始後に、腫瘍動態のさらなる遅延を示した。ワクチン接種マウスの１０匹に１匹（１０％）は、腫瘍細胞の最初の注射後７０日において腫瘍がないままであった。この研究は、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが、予防的環境で投与された場合にＢ１６－ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}腫瘍の成長を有意に遅延および／または予防できることを実証している。

【0298】

具体的には、図１２Ａは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが、Ｂ１６－ＬＴＳ２２０Ａ腫瘍を与えられたワクチン接種マウスにおいて腫瘍発症を遅延させることを示す。マウスにＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種した。２Ｅ５個のＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａ腫瘍細胞を右側腹部に皮下注射し、腫瘍成長および動態を経時的に測定した。腫瘍が任意の方向に２０ｍｍまたは２０００ｍｍ３のサイズに達したとき、腫瘍が２ｍｍを超える潰瘍形成を有したとき、または腫瘍が腹膜壁を通って成長したことを示す腹膜腫瘍の苦痛または徴候をマウスが示したとき、マウスを安楽死させた。

【0299】

予想通り、対照ベクターをワクチン接種したマウスは、急速で制御されない腫瘍成長を経験し、１００％の動物を腫瘍注射の２０日後までに安楽死させた。ワクチン接種マウスの１００％がＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａ腫瘍成長の有意な遅延を示し、動物の１０％が腫瘍注射後７０日において腫瘍がないままであった。腫瘍を発症し続けたワクチン接種マウスのうち、これらの５０％が反復ワクチン接種に対して部分応答を示し、約３週間の期間にわたって腫瘍成長が低減した。

【0300】

図１２Ｂは、血液ＥＬＩＳＰＯＴ応答により、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰをワクチン接種したマウスにおける最終的な腫瘍負荷が予測され得ることを報告している。上記のような血液ＥＬＩＳＰＯＴからのデータは、図１１Ａに示す腫瘍動態と相関していた。血液ＥＬＩＳＰＯＴデータをコンカナバリンＡシグナルに対して正規化し、発がんイニシエーション後の生存率と比較した。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰのさらなるワクチン接種に応答したマウス（図１２Ａ）を「応答者」と命名した。これらのデータは統計学的に有意ではないが、有意性に向う傾向がある（ｐ＝０．０５９）。

【0301】

実施例９：Ｃ５７ＢＬ／６におけるＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａに対するＬＴＳ２２０Ａ ＤＮＡワクチンの治療研究
この研究では、上記のＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａのマウスモデルにおける腫瘍成長の防止または遅延におけるＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療有効性を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^４個のＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａ腫瘍細胞を右側腹部の皮下に注射した３日後に開始して、エレクトロポレーションによる皮内投与によって週に１回のワクチン接種を４回行った。腫瘍成長および全生存を経時的に測定した。発がんイニシエーション後１７日目に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の細胞構成をフローサイトメトリーによって８匹のワクチン接種マウスおよび８匹の非ワクチン接種マウスで試験した。図１３に示すように、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰのワクチン接種は、治療設定では予想外に有意に生存を増強し（ｐ＝０．００３）、非ワクチン接種マウスで見られる生存期間よりも中央値が７日長かった（３１日対２４日）。以前の研究と一致して、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰは、ＴＭＥ内で顕著な細胞変化を誘導した。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰワクチン接種マウスは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞を含む腫瘍内の免疫細胞の大きな流入を示した。

【0302】

具体的には、図１３Ａは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＢ１６－ＬＴＳ２２０Ａモデルにおいて生存を有意に延長することを示している。全生存は、ワクチン接種マウスで有意に増強され、生存期間中央値が、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰワクチン接種マウスでは３１日、対照ワクチン接種マウスでは２４日であった。ワクチン接種動物の５０％（５／１０）がワクチンに対して最も強い応答を示した。

【0303】

図１３Ｂは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を含むＣＤ４５＋免疫細胞の腫瘍浸潤を誘導することを示す。発がんイニシエーション後１７日目に、各処置群の８匹のマウスにブレフェルジンＡを腹腔内注射した。注射の４時間後、マウスを安楽死させ、脾臓および腫瘍を収集し、処理し、フローサイトメトリーによって分析した。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療的ワクチン接種は、総Ｔ細胞数の増加ならびに総ＣＤ４５＋細胞集団のＴ細胞の頻度の増加を含む、ＴＭＥ内のＣＤ４５＋免疫細胞の有意な増加をもたらした。ワクチン接種マウスでは、腫瘍１グラム当たりのＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方が増加した。これらのＣＤ４ Ｔ細胞のうち、ワクチン接種マウスではＰＤ－１＋の頻度がより高かった。

【0304】

図１３Ｃは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＮＫおよびＮＫＴ細胞の両方の腫瘍浸潤を誘導することを実証している。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療的ワクチン接種は、総ＣＤ４５＋ＣＤ３－細胞の腫瘍１グラム当たりの総数および頻度の両方で、ＴＭＥ内のＮＫ細胞の有意な増加をもたらした。ワクチン接種マウス由来の腫瘍におけるＮＫ細胞はまた、ＣＤ１１ｂのより高い発現を示し、より成熟した表現型を示唆した。ワクチン接種マウスはまた、ＴＭＥ内の総ＮＫＴ細胞が増加していた。

【0305】

図１３Ｄは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰが腫瘍内の骨髄細胞を変化させることを示す。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療的ワクチン接種は、ＴＭＥ内のバルクＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の頻度の低下をもたらした。さらに、ワクチン接種マウスは、腫瘍関連マクロファージにおけるｉＮＯＳ産生の増強傾向を示した。

【0306】

図１３Ｅは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰがＴＭＥ内の制御性Ｔ細胞の数を増強するが、Ｔｒｅｇの数の増加は腫瘍負荷と相関しないことを示す。ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療的ワクチン接種は、ワクチン接種動物のＴＭＥ内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数の増加をもたらした。しかしながら、Ｔｒｅｇの頻度は変化せず、Ｔｒｅｇの絶対数も総ＣＤ４ Ｔ細胞のＴｒｅｇの頻度も腫瘍負荷と相関しなかった。

【0307】

図１３Ｆは、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰとの併用療法の潜在的価値を示唆している。上記で実証されたように、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの治療的ワクチン接種は、ＴＭＥに浸潤するＴ細胞の相対的頻度の増加をもたらし、同時にＴＭＥに浸潤する骨髄細胞の頻度の低下をもたらした。ＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１の増加は、ワクチン接種状態にかかわらず、腫瘍負荷の増強と相関し、ＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰとＰＤ－１遮断とを組み合わせることが有効な治療戦略であり得ることを示唆している。ＰＤ－１遮断は、メルケル細胞がんのためのＦＤＡ承認処置である。ＴＭＥ中の骨髄細胞の頻度はまた、ワクチン接種状態にかかわらず、腫瘍負荷の増強と相関しており、ＴＭＥ内の骨髄細胞の動員および／または極性化を標的とすることがＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰの有効性を増強し得ることを示唆している。したがって、これらの結果は、本明細書に記載の改良ＬＡＭＰ構築物、好ましくはＬＴ^{Ｓ２２０Ａ}－ＬＡＭＰとチェックポイント阻害剤との併用療法を支持する。チェックポイント阻害剤の例としては、限定するものではないが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＣＴＬＡ阻害剤、例えばペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標））、セミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標））、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）またはイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））が挙げられる。

【0308】

実施例１０：ポリペプチドからの抗体作製
抗抗原抗体は、動物への注射を使用して抗体を産生させるさまざまな標準的な方法で調製することができる。（現プロトコル、第２章を参照されたい。）例えば、本明細書に記載のがん抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を発現する細胞を非ヒト脊椎動物に投与して、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。好ましい方法では、ＬＡＭＰ／抗原タンパク質の調製物を調製および精製して、天然汚染物質を実質的に含まないようにする。次いで、そのような調製物を非ヒト脊椎動物に導入して、より高い特異的活性のポリクローナル抗血清を産生させる。

【0309】

最も好ましい方法では、本発明の抗抗原抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合断片）である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる。（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３－６８１（１９８１）。）一般に、そのような手順は、抗原を含む改良されたＬＡＭＰ構築物、抗原を含む改良されたＬＡＭＰ構築物のコード化ポリペプチドを用いて、またはより好ましくは、改良ＬＡＭＰ構築物発現細胞を用いて、非ヒト脊椎動物（好ましくはウサギ、マウス、牛、ラクダ、ラマ）を免疫化することを含む。そのような細胞は、任意の適切な組織培養培地で培養することができるが、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活性化）を添加し、約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００ Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＥａｒｌｅの改変イーグル培地で細胞を培養することが好ましい。

【0310】

そのような非ヒト脊椎動物宿主（例えば、マウス）の脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞株と融合させる。本発明に従って、任意の適切な骨髄腫細胞株を使用することができる。しかしながら、ＡＴＣＣ（商標）から入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２０）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５－２３２（１９８１）。）によって記載されているように限界希釈によってクローニングする。次いで、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、抗原に結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。

【0311】

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および抗抗原抗体の他の断片が、本明細書に開示の方法に従って使用できることは理解されよう。そのような断片は、典型的には、パパイン（Ｆａｂ断片を生成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する）などの酵素を使用して、タンパク質切断により生成される。または、分泌タンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用を介して。または合成化学を介して生成することができる。

【0312】

ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいと思われる。そのような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して作製することができる。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６０１５３３号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８７０２６７１号；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照されたい）。

【0313】

実施例１１：ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するためのポリヌクレオチドの使用
動物にポリヌクレオチドを直接注入する方法は、当技術分野で十分に説明されている。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；第６，８７５，７４８号；第５，６６１，１３３号を参照されたい。例えば、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物（ならびに任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原）をコードするポリヌクレオチドを、拘束された覚醒マウス（雌６～１２週齢ＢＡＬＢ／ｃまたはヌード、ｎｕ／ｎｕ（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．による））の四頭筋に注射することができる。一実施形態では、Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１２０５－１２１７（１９９６）に記載のように、５０μｌ溶液中の５０μｇのポリヌクレオチドを、使い捨ての滅菌プラスチックインスリン注射器およびマイクロピペットチップからカットされたプラスチックカラーを備えた２８Ｇ１／２針（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、カタログ番号３２９４３０）を使用して、マウスに注射することができる。

【0314】

または、６週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雌マウス（体重２０～２５グラム）に、注射の２４時間前から飲料水に５０００ｐｐｍのＺｎＯＳＯ４を与えてもよい。この量の亜鉛は、メタロチオネインプロモーターを活性化できることが示されている。次に、各マウスに、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物（ならびに任意選択的にブースティングエピトープおよび／または抗原）をコードするポリヌクレオチド３０μｇと、それと複合体を形成した１５０μｇのリポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標））とを総容積３０μｌで、２５ゲージ針を用いて尾静脈穿刺により静脈内注射する。動物の世話は本研究を通して維持されるべきであり、’’Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ’’，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓに従って実施されなければならない。

【0315】

注射された、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドが動物の細胞に送達された後、該抗原はエンドソーム／リソソームに送達され、プロセシングされ、プライミング抗原として免疫系に提示されるが、一方、ブースティングエピトープおよび／または抗原は細胞から分泌される。次いで、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、該抗原に特異的な抗体の産生を刺激することができ、ブースティング抗原は、抗原に特異的な抗体のこの産生を増強することができる。これらの抗体は、ポリクローナル混合物として単離して使用することも、または単一種もしくはモノクローナルにさらに単離することもできる。免疫応答の過程およびｉｎ ｖｉｖｏでの外来抗原に対する抗体の産生は、当技術分野で周知である。

【0316】

第３の動物モデルでは、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３ Ａ３１細胞に、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物をコードするポリヌクレオチドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。抗原を含むＬＡＭＰ構築物を発現するＧ４１８耐性クローンは、ヒトＲＢＣに結合する能力によって同定される。ポリクローナル抗体を生成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１４日間の間隔で２回腹腔内に、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物を含む１０^７個の細胞で免疫化する。最終ブースト後、免疫血清を収集し、ＩｇＧをプロテインＧセファロースで精製し、精製抗原１．０ｍｇを臭化シアンで活性化したセファロースＣＬ－４Ｂに結合させて調製した抗原カラムに通す。結合したＩｇＧは、０．１Ｍ グリシンバッファーｐＨ２．５で溶出でき、０．１容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で中和することができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを抗原を含むＬＡＭＰ構築物で免疫化し、標準的な方法に従って免疫脾細胞とＳＰ２骨髄腫とを融合することによりハイブリドーマを生成する（２８）。抗原と特異的に反応する陽性ウェルは、当技術分野で説明されている酵素結合免疫吸着検定法によって同定することができる。ハイブリドーマを限界希釈によって３回クローニングして、抗体を産生する。

【0317】

実施例１２：抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物による免疫化
哺乳動物において抗体を産生させる方法は、当技術分野で周知である。一例において、抗原を含むＬＡＭＰ構築物に対するポリクローナル抗血清は、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物合計５００μｇを用いた病原体フリーウサギの２ヶ月間にわたる免疫化により産生される。例えば、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物は、ＰＢＳに溶解して、等量のフロイントアジュバントで乳化し得る。最終ブースターの後、ウサギの血清を分離して、ポリクローナル抗血清の力価を決定し得る。

【0318】

追加の動物モデルでは、５匹のマウス群（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、ミョウバンで乳化されたエンドトキシンフリーの抗原を含むＬＡＭＰ構築物５μｇで皮下に免疫化し得る。３週間後、マウスから採血し、ＥＬＩＳＡで血清を滴定することにより、抗抗原特異的抗体の存在を確認できる（血清中の抗体を、ウェルを直接、または間接的に（ビオチン化タグおよびストレプトアビジンを介して）コーティングしている野生型ＢＰＴＩまたはＡＰＰ－ＫＩに直接結合させる）。

【0319】

モノクローナル抗体を得るには、４～６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物で免疫化する（例えば、１回の注射あたり１０～１００μｇを、初回の注射にはフロイント完全アジュバント、その後の免疫化のためにはフロイント不完全アジュバントに溶解して、２週間間隔で４回）。脾細胞を単離し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞などの融合細胞株と融合させた後、限界希釈を行う。成長中のクローンを、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してスクリーニングする。９６細胞プレートを、抗原を含む改良ＬＡＭＰ構築物またはコントロールタンパク質でコーティングする。培養上清を加えた後、洗浄し、検出用の標識抗マウス抗体を添加する。限界希釈後、安定したハイブリドーマを産生する抗抗原抗体のクローニングが得られる。各細胞から上清を回収し、プロテインＡセファロースカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーによりモノクローナル抗体を精製することができる。

【0320】

本明細書に記載されているものの変形、修正、および他の実装は、本発明および特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に見出されると思われる。特定されたすべての特許、特許出願、国際出願、および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる。

【図1】

【図2A-1】

【図2A-2】

【図2B】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図4-6】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10-1】

【図10-2】

【図11A-1】

【図11A-2】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【配列表】

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【国際調査報告】