特表 2022-551756 宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-13

(54)【発明の名称】宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20221206BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20221206BHJP

   C07K 1/20 20060101ALI20221206BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20221206BHJP

   C07K 1/12 20060101ALI20221206BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20221206BHJP

   G01N 30/84 20060101ALI20221206BHJP

   G01N 30/08 20060101ALI20221206BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20221206BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20221206BHJP

   B01J 20/285 20060101ALI20221206BHJP

   B01J 20/287 20060101ALI20221206BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20221206BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20221206BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20221206BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22 ZNA

C07K1/16

C07K1/20

C07K1/18

C07K1/12

G01N30/88 J

G01N30/84 J

G01N30/08 L

G01N30/72 C

B01J20/281 R

B01J20/285

B01J20/287

G01N33/68

C07K16/00

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022522652

(86)(22)【出願日】2020-10-15

(85)【翻訳文提出日】2022-05-19

(86)【国際出願番号】 US2020055744

(87)【国際公開番号】W WO2021076735

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/915,344

(32)【優先日】2019-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/986,324

(32)【優先日】2020-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】チェン シャオジン

(72)【発明者】

【氏名】オブライエン ジョンソン リード

(72)【発明者】

【氏名】グリア タイラー

【テーマコード（参考）】

2G045

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045BA13

2G045BB03

2G045BB12

2G045CB01

2G045DA36

2G045DA37

2G045FA40

2G045FB06

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA10

4H045BA16

4H045BA17

4H045CA40

4H045EA50

4H045FA15

4H045FA16

4H045FA70

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA23

4H045GA25

4H045GA26

(57)【要約】

試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法が提供される。
【選択図】図１３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法であって、
前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、
前記親和性クロマトグラフィーからのフロースルーに対して分画を実施する工程と、
質量分析計を使用して、前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記親和性クロマトグラフィー支持体が、プロテインＡクロマトグラフィー支持体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記親和性クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄する工程、および
フロースルーを収集する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記親和性クロマトグラフィー支持体が、プロテインＡまたはプロテインＧを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記プロテインＡまたは前記プロテインＧが、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定されている、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記質量分析計が、タンデム質量分析計である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムと連結されている、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを、高電場非対称波形イオン移動度分光法デバイスを使用して特徴付ける工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記試料マトリックスが、目的のタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記目的のタンパク質が、抗体である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記目的のタンパク質が、融合タンパク質である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記分画が、サイズベースの分画である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記分画が、疎水性ベースの分画である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

分画が、電荷ベースの分画である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

分画が、ｐＩベースの分画である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記分画が、液体クロマトグラフィーによる分画を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記分画ステップを実施することなく前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮することなく分画を実施する方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記分画ステップを実施することなく前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮することなく分画を実施する方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法であって、
前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、
前記親和性クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄する工程と、
フロースルーを収集する工程と、
前記濃縮ステップを実施した後に得られた試料に対して分画を実施する工程と、
質量分析計を使用して、前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と
を含む、方法。

【請求項24】

前記フロースルーが、前記試料マトリックスよりも低減された量の目的のタンパク質を有する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法であって、
前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることによって、前記混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、
前記混合物を非変性消化条件に供する工程と、
質量分析計を使用して、前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と
を含む、方法。

【請求項26】

前記親和性クロマトグラフィー支持体が、プロテインＡクロマトグラフィー支持体である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記親和性クロマトグラフィー支持体からフロースルーを収集する工程
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記親和性クロマトグラフィー支持体が、プロテインＡまたはプロテインＧを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記プロテインＡまたは前記プロテインＧが、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定されている、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記質量分析計が、タンデム質量分析計である、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムと連結されている、請求項２５に記載の方法。

【請求項32】

前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記質量分析計が、高電場非対称波形イオン移動度分光器である、請求項２５に記載の方法。

【請求項34】

前記試料マトリックスが、目的のタンパク質をさらに含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項35】

前記目的のタンパク質が、抗体またはその断片もしくは誘導体、融合タンパク質、および生理学的に活性な非抗体タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることによって前記混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮することなく前記混合物を非変性消化条件に供して混合物を形成する方法よりも、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることによって前記混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮することなく前記混合物を非変性消化条件に供して混合物を形成する方法よりも、少なくとも約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法であって、
前記試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、前記試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、
前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して特徴付ける工程と
を含む、方法。

【請求項39】

高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法よりも、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法よりも、少なくとも約３０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法であって、
試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることにより、前記試料マトリックス中の前記宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、
前記混合物を非変性消化条件に供する工程と、
前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して特徴付ける工程と
を含む、方法。

【請求項42】

試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることによって前記試料マトリックス中の前記宿主細胞タンパク質を濃縮し、前記混合物を非変性消化条件に供し、前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを、高電場非対称波形イオン移動度分光法装置以外の質量分析装置を使用して特徴付ける方法よりも、少なくとも約１５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて混合物を得ることによって前記試料マトリックス中の前記宿主細胞タンパク質を濃縮し、前記混合物を非変性消化条件に供し、前記宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを、高電場非対称波形イオン移動度分光法装置以外の質量分析装置を使用して特徴付ける方法よりも、少なくとも約１５％～約６０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる、請求項４１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

分野
本発明は概して、宿主細胞タンパク質を特徴付けることに関する。

【背景技術】

【0002】

背景
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、および心臓代謝障害の治療のための重要な薬物として登場しており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントのうちの１つを表す。タンパク質ベースの生物治療薬を臨床にもたらすことは、発見、プロセスおよび製剤開発、分析的特徴付け、ならびに前臨床毒性学および薬理学を含む、様々な研究開発分野にわたって協調的な努力を必要とする複数年にわたる事業である場合がある。タンパク質ベースのバイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たす必要がある。したがって、薬物の開発、製造、保管、および取り扱いの種々の段階で、かかるバイオ医薬品におけるいかなる不純物をも監視することが重要であり得る。

【0003】

例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、細胞ベースのシステムを使用して開発されるタンパク質ベースのバイオ医薬品に存在する可能性がある。医薬品中のＨＣＰの存在を監視する必要があり、一定の量を超えると許容されない可能性がある。ＨＣＰを特徴付けるアッセイのための分析方法は、十分な正確さおよび分解能を示す必要がある。直接的な分析は、アッセイのために十分に多量の産物の単離を必要とする可能性があり、これは、望ましくなく、選択された場合においてのみ可能であった。したがって、圧倒的に高い濃度の活性薬物と混合した場合に、試料マトリックス中のＨＣＰを特徴付けるためのワークフローおよび分析試験を決定するのは困難な作業である。上記から、バイオ医薬プロセスの様々な段階でＨＣＰを特徴付け、監視するための改善された方法の必要性が存在することが理解されるであろう。

【発明の概要】

【0004】

概要
バイオ医薬品の開発における重要な基準は、製品中の不純物を監視することであり得る。かかる不純物が生じる場合、それらの特徴付けは、バイオプロセスにおける重要なステップを構成する。

【0005】

本明細書に開示される例示的な実施形態は、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法を提供することによって、前述の要求を満たす。

【0006】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによる、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0007】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0008】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0009】

別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0010】

一態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0011】

別の態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0012】

さらに別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0013】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0014】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0015】

さらに別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0016】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。別の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0017】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0018】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0019】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0020】

別の態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0021】

さらに別の態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0022】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0023】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0024】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0025】

一態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0026】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0027】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0028】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0029】

別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0030】

さらに別の態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0031】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0032】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0033】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0034】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0035】

さらに別の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。

【0036】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0037】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0038】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0039】

さらに別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0040】

一態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0041】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0042】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0043】

別の態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0044】

さらに別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0045】

一態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。

【0046】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0047】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0048】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0049】

さらに別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0050】

一態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0051】

別の態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0052】

さらに別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0053】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0054】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0055】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0056】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0057】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0058】

別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0059】

別の態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0060】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0061】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0062】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0063】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0064】

一例示的な実施形態において、目的とするタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させ、親和性クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄してフロースルーを収集し、分画ステップを実施することによる試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質に対する濃縮ステップを含み得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0065】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0066】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0067】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0068】

一態様において、分画ステップは、サイズベースの分画、疎水性ベースの分画、電荷ベースの分画、ｐＩベースの分画、液体クロマトグラフィーによる分画、またはそれらの組み合わせであり得るあり得る。特定の態様において、液体クロマトグラフィーによる分画ステップは、逆相液体クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0069】

別の態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0070】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0071】

一態様において、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0072】

別の態様において、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約５０％～約７５％宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0073】

一態様において、フロースルーは、試料マトリックスよりも低減された量の目的のタンパク質を有し得る。

【0074】

別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）デバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0075】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、を含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0076】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0077】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0078】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0079】

別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0080】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0081】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0082】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、を含み得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0083】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0084】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0085】

別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0086】

さらに別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0087】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0088】

別の態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0089】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｃ）質量分析計を使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。別の特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。さらに別の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0090】

一態様において、濃縮ステップは、親和性クロマトグラフィー支持体からフロースルーを収集することをさらに含み得る。

【0091】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0092】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0093】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0094】

別の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。

【0095】

さらに別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0096】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0097】

別の態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0098】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｃ）質量分析計を使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0099】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0100】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0101】

別の態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0102】

さらに別の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0103】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0104】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）を含むが、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0105】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させることによって試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0106】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0107】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0108】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0109】

一態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法と比較して、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0110】

別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法と比較して、少なくとも約３０％～約７５％多くの宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0111】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0112】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0113】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0114】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0115】

一態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法と比較して、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0116】

別の態様において、本方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を含まない方法と比較して、少なくとも約３０％～約７５％多くの宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0117】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｃ）高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。特定の態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0118】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0119】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0120】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0121】

別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0122】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）を含むがステップ（ｃ）を含まない方法よりも、少なくとも約１５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0123】

さらに別の態様において、本方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）を含むがステップ（ｃ）を含まない方法よりも、少なくとも約１５％～約６０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0124】

一例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、（ｂ）混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｃ）高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡクロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、プロテインＡまたはプロテインＧを含み得る。特定の態様において、プロテインＡまたはプロテインＧは、アガロースまたはセファロース樹脂上に固定され得る。

【0125】

一態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を洗浄緩衝液で洗浄し、フロースルーを収集することをさらに含み得る。別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体を溶出緩衝液で洗浄し、溶出された画分を収集することをさらに含み得る。

【0126】

別の態様において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。一態様において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。一態様において、処理は、還元剤を試料に添加することを含み得る。一態様において、処理は、アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。別の態様において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0127】

一態様において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。特定の態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0128】

別の態様において、本方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結され得る。その態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムと連結したタンデム質量分析計であり得る。別の態様において、本方法は、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。別の特定の態様において、本方法は、ＬＣおよびＭＳと併せてＦＡＩＭＳデバイスを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0129】

一態様において、本方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）を含むがステップ（ｃ）を含まない方法よりも、少なくとも約１５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0130】

さらに別の態様において、本方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）を含むがステップ（ｃ）を含まない方法よりも、少なくとも約１５％～約６０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0131】

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の特定の詳細を示しているが、例示のために与えられており、限定のためではない。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

【図面の簡単な説明】

【0132】

【図1】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、プロテインＡクロマトグラフィーを伴わない方法およびプロテインＡクロマトグラフィーを伴う方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図2】例示的な実施形態に従って実施される分画ステップのためのプロトコルを示す。

【図3】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、分画ステップを伴わない方法および分画ステップを伴う方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図4】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、プロテインＡクロマトグラフィーステップを伴う方法およびプロテインＡクロマトグラフィーステップと分画ステップとを伴う方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図5】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、タンパク質の通常の消化が行われた方法、およびタンパク質の天然の消化が行われた方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図6】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、プロテインＡクロマトグラフィーを伴わない方法およびプロテインＡクロマトグラフィーを伴う方法によって特徴付けられた、天然条件に供された試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図7】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、ＦＡＩＭＳデバイスを伴わない方法およびＦＡＩＭＳデバイスを伴う方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図8】例示的な実施形態に従って実施される方法の再現性統計とともに、ＦＡＩＭＳデバイスを伴わないプロテインＡクロマトグラフィーを含む方法およびＦＡＩＭＳデバイスを伴うプロテインＡクロマトグラフィーを含む方法によって特徴付けられた、試料マトリックス中のタンパク質および特有のペプチドの数を示す。

【図9】（Ａ）天然消化物対通常消化物、（Ｂ）通常消化物対プロテインＡ枯渇消化物、（Ｃ）天然消化物対プロテインＡ枯渇天然消化物、（Ｄ）ＦＡＩＭＳを伴うプロテインＡ枯渇天然消化物およびＦＡＩＭＳを伴わないプロテインＡ枯渇天然消化物、ならびに（Ｅ）最適化された方法対報告されたＨＣＰの例示的な実施形態による分析において検出されたＨＣＰの数および重複を示す。すべての同定されたタンパク質は、１％のペプチドＦＤＲおよび５％のタンパク質ＦＤＲを有する２＋特有のペプチドを有する。

【図10】例示的な実施形態に従って実施される、ＦＡＩＭＳを伴って、およびＦＡＩＭＳを伴わず実行された試料を示す。（Ａ）ＨＣＰペプチドのＤＳ干渉を示すインサートを有する、ＦＡＩＭＳを伴って実行された試料（青色、赤色、および緑色）およびＦＡＩＭＳを伴わず実行された試料（灰色）についての塩基ピーククロマトグラム、（Ｂ）「明らかにされた」ＨＣＰペプチドの断片化スペクトル。ペプチド配列には、Ｋ．ＫＬＥＥＬＤＬＤＥＱＱＲ．Ｋ（配列番号１）、Ｋ．ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ．Ｓ（配列番号２）、およびＫＬＥＥＬＤＬＤＥＱＱＲ（配列番号３）が含まれる。

【図11】例示的な実施形態に従って試みられた方法のすべての組み合わせについて、複製物の実行において検出されたＨＣＰの数および重複を示す。すべての同定されたタンパク質は、１％のペプチドＦＤＲおよび５％のタンパク質ＦＤＲを有する２＋特有のペプチドを有する。

【図12】他のすべての方法（Ｂ～Ｈ）と比較した、ＦＡＩＭＳを使用して（Ａ）検出されたプロテインＡ枯渇天然消化試料中のＨＣＰの数および重複を示す。すべての同定されたタンパク質は、１％のペプチドＦＤＲおよび５％のタンパク質ＦＤＲを有する２つ以上の特有のペプチドを有する。

【図13】例示的な実施形態のワークフローを示す。

【発明を実施するための形態】

【0133】

詳細な説明
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、すべての細胞由来タンパク質治療薬から除去される必要がある不純物の部類である。これらの治療用タンパク質の細胞ベースの産生の間、最終的なタンパク質ベースの医薬品は、細胞由来の不純物が臨床使用前に許容可能な低いレベルにあるように、高度に精製される必要がある。不純物、特に、哺乳類発現系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、監視される必要がある。最終原薬の総ＨＣＰレベルの一般的ガイドラインは、１００ｐｐｍ未満である（Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｃｈｏｎ ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｚａｒｂｉｓ－Ｐａｐａｓｔｏｉｔｓｉｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２８ ＮＥＷ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ４５８－４６３（２０１１））。ＨＣＰは、患者の安全性と薬物の有効性の両方にとって懸念事項である。Ｌｅｓｌｉｅ Ｃ．Ｅａｔｏｎ，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，７０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ａ １０５－１１４（１９９５）、Ｘｉｎｇ Ｗａｎｇ，Ａｌａｎ Ｋ．Ｈｕｎｔｅｒ ＆ Ｎｅｄ Ｍ．Ｍｏｚｉｅｒ，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，１０３ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ４４６－４５８（２００９）、およびＣｈｒｉｓｔｉｎａ Ｌ．Ｚｕｃｈ Ｄｅ Ｚａｆｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： Ａ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ，１１２ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ２２８４－２２９１（２０１５）を参照されたい。１００ｐｐｍを下回るＨＣＰレベルは、一般に許容されるとみなされるが、特定の汚染物質に関連するリスクは、個別に評価される必要があり、さらに低い検出限界を必要とする場合がある（Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓ ＆ Ｃ．Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｒｉｓｋ－ｂａｓｅｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ，１１２ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ １７２７－１７３７（２０１５）、Ｔａｎｊａ Ｗｏｌｔｅｒ ＆ Ａｎｄｒｅａｓ Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，４０ ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ４０－４６（２００５）。

【0134】

多数の報告された症例は、ＨＣＰ活性による治療用タンパク質または安定化剤の分解を説明している（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ１６５７－１６６６（２０１６）、Ｔｒｏｉｉ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １６３３－１６４２、Ｓｈａｒｏｎ Ｘ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ ｒｅｓｉｄｕａｌ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，１０８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ９７７－９８２（２０１０）、Ｄｅｅｐｔｉ Ａｈｌｕｗａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ１，１４１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ３２－３８（２０１７）、Ａｍａｒｅｔｈ Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ＣＨＯ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，３４ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＰＲＯＧＲＥＳＳ １２０－１２９（２０１７））。

【0135】

ＦＤＡは、ＨＣＰの最大許容レベルを指定していないが、最終医薬品中のＨＣＰ濃度は、制御され、バッチごとに再現可能である必要がある（ＦＤＡ、１９９９）。しかしながら、総ＨＣＰ不純物が原薬中に低レベルで存在する場合でも、注射後に毒性または生物学的に活性である、免疫応答を引き起こし得るいくつかの特定のＨＣＰについては、微量のＨＣＰが許容されない場合がある（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｅｒｉｃｈ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ，７５ ＡＣＴＡ ＰＡＥＤＩＡＴＲＩＣＡ １３－１８（１９８６）、Ｔ．Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３０ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮ ５７８－５８９（２００７）、Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓ ＆ Ｃ．Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ） ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｒｉｓｋ－ｂａｓｅｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ，１１２ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ １７２７－１７３７（２０１５）、Ｓａｌｏｕｍｅｈ Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｂ－Ｌｉｋｅ ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｉｎ Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ，１９ ＴＨＥ ＡＡＰＳ ＪＯＵＲＮＡＬ ２５４－２６３（２０１６）、Ａｎｄｒｅｓ Ｈ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｍｏｉｓｅ ＆ Ａｎｎｉｅ Ｓ．Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｏｆ［ｈａｍｓｔｅｒｓ］ａｎｄ ｍｅｎ，８ ＨＵＭＡＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １１７２－１１７４（２０１２）、Ｖｉｂｈａ Ｊａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｒｉｓｋ Ｄｕｅ ｔｏ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１８ ＴＨＥ ＡＡＰＳ ＪＯＵＲＮＡＬ １４３９－１４５２（２０１６）、Ｎａｇｈｍｅｈ Ａｂｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｏｆ ＯｓｒＨＳＡ，１３ ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１８））。ＨＣＰが、抗体を分解するか、または抗体結合力を変化させる力に関する場合、それは許容できない場合もある（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ１６５７－１６６６（２０１６）、Ｔｒｏｉｉ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １６３３－１６４２））。したがって、すべてのＨＣＰ成分を個別に監視することができる方法を有することが望ましい場合がある。

【0136】

従来、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を有する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、全体的なＨＣＰの存在量を定量化するために使用されてきた（Ｄｅｎｉｓｅ Ｃ．Ｋｒａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ，６ ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ ９４－１１０（２００６）、Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｅｍ Ｈｏｇｗｏｏｄ，Ｄａｎｉｅｌ Ｇ Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ ＆ Ｃ Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ，４ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ２８８－２９１（２０１３）、Ａｎｎｅ Ｌｕｉｓｅ Ｔｓｃｈｅｌｉｅｓｓｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ － ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＪＯＵＲＮＡＬ ６５５－６７０（２０１３））。個々のＨＣＰ成分の測定に対する需要を考えると、ＥＬＩＳＡはＨＣＰのレベルを評価するための最終的な解決策ではないかもしれない。さらに、いくつかの弱いまたは免疫原性でないＨＣＰは、ＥＬＩＳＡ検出用の抗体が生成されない場合があり、したがって、これらのＨＣＰを、検出することができない。ＥＬＩＳＡは、プロセス内対照および放出試験として有用であるが、それは、総ＨＣＰレベルのみを測定すること、新たな汚染源を検出することができないこと、およびより免疫原性の高いタンパク質へのバイアスを含む、いくつかの重要な制限を有する（Ｆｅｎｇｑｉａｎｇ Ｗａｎｇ，Ｄａｉｓｙ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，＆ Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｓｈａｍｅｅｍ，Ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ，２８ ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ３２－３８（２０１５）、Ｊｕｄｉｔｈ Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｂｙ ＥＬＩＳＡｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ２３６７－２３７９（２０１４））。別の厄介な問題は、ＥＬＩＳＡが典型的には、産生株とは実質的に異なるＨＣＰプロファイルを有し得る治療用タンパク質を欠く細胞株（ヌル株）から生成される抗原に依存していることである。さらに、治療用タンパク質と共精製し、多く存在するＨＣＰ（Ｎａｂｉｌａ Ａｂｏｕｌａｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３０ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＰＲＯＧＲＥＳＳ １１１４－１１２４（２０１４）、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｅ．Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，１１１ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ９０４－９１２（２０１３）、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｅ．Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１１３ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ １２６０－１２７２（２０１５）を参照されたいは、非線形応答を示し得る。試料中のＨＣＰ濃度がヌル株よりもはるかに高く、それを認識することができる抗体が不十分な場合、汚染物質の過小評価につながる可能性がある。さらに、すべてのタンパク質が免疫原性ではなく、結果として関連する抗体を欠くため、すべてのＨＣＰをＥＬＩＳＡによって検出できるわけではない。規制当局はこれらの制限を認識しており、現在では、広範囲にわたる薬物産生の前に特定の汚染物質を検出することができる直交的な方法を期待している。実際に、補完的なＨＣＰ検出方法は、より良い監視のためだけでなく、かかる技術が提供され得るプロセス開発の実質的な改善のために、現在、日常的に採用されている（Ｖｉｋｔｏｒ Ｈａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｔｉｃｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ａ ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，１６１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ２１４－２３８（２０１８）、Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｎ Ｖａｌｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＣＨＯ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，５３ ＣＵＲＲＥＮＴ ＯＰＩＮＩＯＮ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １４４－１５０（２０１８）、およびＭａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｓｃｈｅｎａｕｅｒ，Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｃ．Ｆｌｙｎｎ ＆ Ａｎｄｒｅｗ Ｍ．Ｇｏｅｔｚｅ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４２８ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １５０－１５７（２０１２））。

【0137】

１Ｄ／２Ｄ－ＰＡＧＥおよび質量分析ベースの分析技術を含む多くの補完的な分析アプローチが、ＨＣＰを監視するために採用されている（Ｊｕｌｉｔａ Ｋ．Ｇｒｚｅｓｋｏｗｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｎｏｎ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，１２１６ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ａ ４９０２－４９１２（２００９）、Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４ ＭＡＢＳ ２４－４４（２０１２）、Ｍｉ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ－ＤＩＧＥ）：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０５ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ３０６－３１６（２０１０））。タンデム質量分析と結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）はまた、ＨＣＰ不純物の同定および定量化の両方の手段を同時に提供することができ、ＥＬＩＳＡアッセイを補完する主要な直交方法として登場した。しかしながら、質量分析ベースの方法の大きな課題は、質量分析計自体が、圧倒的で高度に濃縮された抗体原薬と混合した場合に、低濃度のＨＣＰを検出する能力を欠くことである。低ｐｐｍレベルのＨＣＰと高存在量の治療抗体との間の広いダイナミックレンジ（６桁を超える）の問題を克服するために、１つの戦略は、分離効率を増加させるために、データ依存的取得またはデータ非依存的取得に加えて、２Ｄ－ＬＣおよびイオン移動度などの別の次元の分離を追加することによって、質量分析の前に共溶出ペプチドを分解することである。１つの研究では、Ｅｃｋｅｒらは、データ非依存的取得を伴ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、一桁のｐｐｍレベルのＨＣＰの同定を報告し、彼らはまた、ヌル株由来のＨＣＰの質量、保持時間および断片イオンを含むライブラリーを確立した。この方法は感度がよいが、特定の産物とのみ共発現されるＨＣＰを失う可能性がある（Ｄａｗｎ Ｍ Ｅｃｋｅｒ，Ｓｕｓａｎ Ｄａｎａ Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｈｏｗａｒｄ Ｌ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｒｋｅｔ，７ ＭＡＢＳ ９－１４（２０１４））。別の研究は、２Ｄ－ＨＰＬＣを使用して１０～５０ｐｐｍのＨＣＰを同定できることを示した（Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４ ＭＡＢＳ ２４－４４（２０１２）、Ｄｏｎａｌｄ Ｅ．Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｏｗａｒｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｒａｎｃｅ，９ ＭＡＢＳ ６５４－６６３（２０１７））。しかしながら、２Ｄ－ＬＣのサイクル時間は非常に長く、この方法は低レベルのＨＣＰ（＜１０ｐｐｍ）の分析には感度が十分ではない可能性がある。さらに、これは一般に、新規汚染物質の同定を妨げ、その有用性を低減させる（ただし、この欠点を制限し得る代替案がある）（Ｖｅｒｏｎｉｋａ Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｅｒｃｉｓｅ，４６３ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １－６（２０１４）、Ｓｉｍｉｏｎ Ｋｒｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ Ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄａｔａ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，８９ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ５２９４－５３０２（２０１７））。

【0138】

多次元クロマトグラフィーはまた、ＨＣＰトリプシン消化ペプチドを治療用タンパク質のものからより良好に分離することによって感度を改善することが示されている（Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕら、上記参照、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ．Ｓｃｈｅｎａｕｅｒら、上記参照、Ｇ．Ｊｏｕｃｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｖｅｒｓｕｓ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ＣＨＯ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，９４２－９４３ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ｂ １２６－１３３（２０１３、Ｑｉｎｇｃｈｕｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，６ ＭＡＢＳ ６５９－６７０（２０１４）、Ａｍｙ Ｆａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄａｔａ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＬＣ－ＭＳＥ，８７ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ９１８６－９１９３（２０１５）、Ｆｅｎｇ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ２Ｄ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ １０－ｐｐｍ Ｌｅｖｅｌ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，９０ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １３３６５－１３３７２（２０１８）、Ｒｅｇｉｎａ Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｓ Ｔｗｏ Ｎｏｖｅｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ＨＣＰ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，９１ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ９７１６－９７２３（２０１９）を参照されたい）。例えば、高ｐＨオフライン分画を低ｐＨ逆相クロマトグラフィーと組み合わせて、試料の複雑性を大幅に低減することができる。しかしながら、オフラインおよびオンラインの多次元クロマトグラフィーの両方は、治療用タンパク質からの干渉を完全に否定することはできず、試料スループットを大幅に低減させる可能性があり、それらを産生中の日常的な分析には適していない。イオン移動度は、ＨＣＰ分析にはめったに使用されないが、試料スループットを低減させることなく追加の分離を提供する可能性がある（Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕら、上記参照）。

【0139】

他の戦略は、親和性精製、限定的な消化で試料マトリックス中の抗体を除去することによるか、またはポリクローナル抗体を使用してＨＣＰを捕捉することによる、ＨＣＰを濃縮するための試料マトリックス調製に焦点を当てている（Ｌｉｈｕａ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓａｍｐｌｅ ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＰｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，８９ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ５４３６－５４４４（２０１７）、Ｊｅｎｎｙ Ｈｅｉｄｂｒｉｎｋ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＣＰｓ）ｉｎ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ＨＣＰ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ，２８ ＲＡＰＩＤ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ８５５－８６０（２０１４）、Ｊａｍｅｓ Ａ Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｖｉａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｓ，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，７ ＭＡＢＳ １１２８－１１３７（２０１５）。治療用タンパク質の除去は、ＨＣＰの検出を数桁改善することができるが、結果にバイアスがかかるか、または意図せずに試料から除去するＨＣＰをリスクがある。

【0140】

既存の方法についての主要な課題のうちの１つは、ＨＣＰと薬物との間の広いダイナミックレンジ（５～８桁）を有する試料マトリックス中の低濃度のＨＣＰ（例えば、０．０１～１０ｐｐｍ）を検出する能力が欠如している可能性があり、それは分析においてＨＣＰシグナルが抑制される可能性がある。

【0141】

何千ものＨＣＰを測定および監視する能力は、取得するデータの量を比例的に増加させる。情報を使用して重要なＨＣＰを決定し、それによってリスク管理のための改善された基盤を作成することができれば、大きな利点がある。かかるＨＣＰのライブラリーの開発は、社内のＨＣＰスクリーニング、バイオ医薬プロセスにおける不純物の調節および監視、ならびに創薬のためのより新しい標的の発見に有利であり得る。ＨＣＰライブラリーを使用して、ライブラリーに存在することが確認されたものと、タンデム質量スペクトルおよびタンパク質同一性を比較することによって、原薬中の、または精製プロセスを通して低存在量ＨＣＰの同一性を検証することもできる。そのような多数のＨＣＰから得られた質量、保持時間、および断片イオンから、将来の分析のためのＤＩＡライブラリーを構築することができる。

【0142】

既存の方法の限界を考慮して、ＨＣＰの同定のための効果的で効率的な方法が開発された。

【0143】

別段の記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料をこれから説明する。言及されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0144】

用語「１つの（ａ）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解される必要があり、用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるように、標準的な変化を可能にすると理解される必要があり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。

【0145】

いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「宿主細胞タンパク質」という用語は、宿主細胞に由来するタンパク質を含み、所望の目的のタンパク質とは無関係であり得る。宿主細胞タンパク質は、製造プロセスに由来するプロセス関連不純物であり得、細胞基質由来、細胞培養物由来、および下流由来の３つの主要なカテゴリーを含み得る。細胞基質由来の不純物は、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない。細胞培養物由来の不純物は、誘導剤、抗生物質、血清、および他の培地成分を含むが、これらに限定されない。下流由来の不純物は、酵素、化学的および生化学的処理試薬（例えば、シアノゲン臭化物、グアニジン、酸化剤および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、および他の浸出可能物を含むが、これらに限定されない。

【0146】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。一態様において、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０であり得る。

【0147】

いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法を提供する。一態様において、試料マトリックスは、培養された細胞培養液（ＣＣＦ）、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）、プロセス性能認定（ＰＰＱ）、下流処理における任意のステップ、原薬（ＤＳ）、または最終的に製剤化された産物を含む医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。別の態様において、試料マトリックスは、浄化、クロマトグラフィー精製、ウイルス不活性化、または濾過の下流プロセスの任意のステップから選択され得る。他の一態様において、医薬品は、診療所、輸送、保存、または取り扱いにおける製造された医薬品から選択され得る。

【0148】

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の宿主細胞タンパク質の種類は、少なくとも２つであり得る。

【0149】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックスは、目的のタンパク質をさらに含み得る。本明細書で使用する場合、「タンパク質」または「目的のタンパク質」という用語は、共有結合で連結されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、概して「ポリペプチド」として当技術分野において既知である、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成の非天然に存在する類似体、関連する天然に存在する構造変異体、ならびにそれらの合成の非天然に存在する類似体からなるポリマーを指す。「合成のペプチドまたはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成方法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能的な生体分子を形成するために、１つ以上のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、生物治療薬タンパク質、研究または治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに二重特異性抗体のうちのいずれかを含み得る。別の例示的な態様において、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞、およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物治療薬タンパク質およびそれらの産生を論じる最近のレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ１４７－１７６（２０１２））を参照されたい。一態様において、タンパク質は、修飾、付加物、および他の共有結合で連結された部分を含む。それらの修飾、付加物、および部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖類）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、および他の色素などを含む。タンパク質は、組成および溶解性に基づいて分類され得、したがって、球状タンパク質および線維状タンパク質などの単純タンパク質；ヌクレオタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、およびリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質；ならびに一次由来タンパク質および二次由来タンパク質などの誘導タンパク質を含み得る。一態様において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

【0150】

「抗体」という用語は、本発明で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。本発明の異なる実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（もしくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

【0151】

「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、完全な抗体分子から、抗体可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質分解消化、または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を使用して、得ることができる。そのようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成し得る。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変および／もしくは定常ドメインを適切な構成へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。

【0152】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの完全なままの抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、線形抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態において、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態において、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、および／または抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、かつ／またはそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的または追加的に、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド連結によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。

【0153】

「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上または同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、概して、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性より少なくとも１～２、または３、または４桁低く、逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的上（例えば、同じまたは異なるタンパク質上）であり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現し得る。

【0154】

典型的な二重特異性抗体は、それぞれが３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメイン、ならびに免疫グロブリン軽鎖を有し、その免疫グロブリン軽鎖は抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能であり、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されたエピトープのうちの１つ以上と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能であり、かつ重鎖のうちの１つもしくは両方が１つもしくは両方のエピトープと結合可能である。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を保有するもの（ＩｇＧ様）と、Ｆｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分けることができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧおよびＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、これらに限定されないが、トリオマブ、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワンもしくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、またはκλ－体などの異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、またはドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ２６５－３１０（２０１４））が挙げられる。

【0155】

ｂｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的コンジュゲーション、および組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝子アプローチであるが、これらに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、以下の特許出願に開示されているものが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、および２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体の製造中のいくつかのステップで存在し得る。このようなホモ二量体不純物の検出は、通常の液体クロマトグラフィー法を使用して実施する場合、ホモ二量体不純物の存在量が少なく、これらの不純物が主な種と共溶出するため、手つかずの質量分析を使用して実施する場合、困難である可能性がある。

【0156】

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」または「Ｍａｂ」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。そのような分子は通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）、三重特異性抗体およびＫＩＨ三重特異性などの追加の特異性を有する抗体は、本明細書に開示される系および方法によって対処することができる。

【0157】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能または既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において既知の多種多様な技術を使用して調製され得る。

【0158】

いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。一態様において、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０であり得る。

【0159】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックス中の目的のタンパク質の種類は、少なくとも２つであり得る。一態様において、少なくとも２つの目的のタンパク質のうちの１つは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、または抗体－薬物複合体であり得る。いくつかの他の実施形態において、少なくとも２つの目的のタンパク質のうちの１つの濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質の種類は、２つである。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質の種類は、３つである。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質の種類は、５つである。

【0160】

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の２つ以上の目的のタンパク質は、トラップタンパク質、キメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、またはペプチドホルモンから選択され得る。

【0161】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックスは、共製剤であり得る。

【0162】

いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、哺乳類細胞から精製され得る。哺乳類細胞は、ヒト起源または非ヒト起源のものであり得、初代上皮細胞（例えば、角化細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）、確立された細胞株およびそれらの株（例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞およびＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞、またはそれらの誘導体）、任意の組織または器官由来の線維芽細胞（以下を含むがこれらに限定されない。心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃腺、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓、ならびに線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１株（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、またはそれらの派生物）を含み得る。

【0163】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮することを含み得る。

【0164】

本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって担持される化学混合物が、固定した液体または固相の周囲または上を流れるとき化学的存在物の差分分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）および順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。疎水性相互作用、親水性相互作用、およびイオン性相互作用がそれぞれ優勢な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、およびＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうちの２つ以上の組み合わせを採用し得る。迅速分離液体クロマトグラフィー（ｒａｐｉｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＲＲＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＦＬＣ）およびナノ液体クロマトグラフィー（ｎＬＣ）などのいくつかのタイプの液体クロマトグラフィーを、質量分析計とともに使用することができる。クロマトグラフィーの方法および原理のさらなる詳細については、Ｃｏｌｉｎら（ＣＯＬＩＮ Ｆ．ＰＯＯＬＥ ＥＴ ＡＬ．，ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＡＮＤ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＡＴＩＯＮ（２０１７））を参照されたい。

【0165】

いくつかの例示的な実施形態において、クロマトグラフィー支持体は、液体クロマトグラフィー支持体であり得る。本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体によって担持される化学混合物が、固定した液体または固相の周囲または上を流れるとき化学的存在物の差分分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。液体クロマトグラフィーの非限定的な例としては、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、または疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。

【0166】

本明細書で使用される場合、「イオン交換クロマトグラフィー」は、全体として目的の分子および／もしくはクロマトグラフィー材料上、または局所的に目的の分子の特定の領域および／もしくはクロマトグラフィー材料上のいずれかで、それぞれのイオン電荷の差に基づいて２つの物質が分離される任意の方法を含む分離を含み得、したがって、陽イオン交換材料または陰イオン交換材料のいずれかを採用し得る。イオン交換クロマトグラフィーは、目的の分子の局所電荷とクロマトグラフィー材料の局所電荷との間の差に基づいて分子を分離する。詰められたイオン交換クロマトグラフィーカラムまたはイオン交換膜デバイスは、結合溶出モード、フロースルー、またはハイブリッドモードで操作することができる。平衡緩衝液または異なるｐＨおよび／または導電性を有する別の緩衝液でカラムまたは膜デバイスを洗浄した後、産物回収は、イオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合するように溶出緩衝液のイオン強度（例えば、導電性）を増加させることによって達成され得る。ｐＨを変化させ、それによって溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成する別の方法であり得る。導電性またはｐＨの変化は、徐々に（勾配溶出）または段階的（ステップ溶出）であり得る。次いで、次の使用前に、カラムを再生し得る。陰イオン性または陽イオン性置換基は、クロマトグラフィーのための陰イオン性または陽イオン性支持体を形成するために、マトリックスに結合され得る。陰イオン性交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）および四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン性置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸塩（Ｐ）およびスルホン酸塩（Ｓ）が挙げられる。セルロースイオン交換媒体または支持体は、ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ－２３（商標）、ＣＭ－３２（商標）、およびＣＭ－５２（商標）を含み得、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ． Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能であり、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースおよびロクロス結合イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ－、ＱＡＥ－、ＣＭ－、およびＳＰ－ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ－、Ｑ－、ＣＭ－、およびＳ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ならびにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ファーストフロー、ならびにＣａｐｔｏ（商標）Ｓは、すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ－６５０ＳまたはＭ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ－６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール－メタクリル酸コポリマーは、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．から入手可能であり、またはＮｕｖｉａ ＳおよびＵＮＯＳｐｈｅｒｅ（商標）ＳはＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．から、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＳはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡから入手可能である。

【0167】

本明細書で使用される場合、用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂」は、フェニル、オクチル、またはブチル化学物質で共有結合的に修飾され得る固相を含み得る。疎水性の特性を使用して、分子を互いに分離し得る。この種類のクロマトグラフィーにおいて、フェニル、オクチル、ヘキシル、またはブチルなどの疎水性基を固定カラムに結合させ得る。表面に疎水性アミノ酸側鎖を有するカラムを通過する分子は、カラムの疎水性基と相互作用して結合することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂または支持体の例としては、Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐｈｅｎｙｌ ６５０－Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）が挙げられる。

【0168】

本明細書で使用される場合、用語「混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）」または「多様式クロマトグラフィー」は、溶質が２つ以上の相互作用モードまたはメカニズムを介して固定相と相互作用するクロマトグラフィー方法を含む。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、および順相クロマトグラフィー（ＮＰ）に代わるまたは補完するツールとして使用され得る。疎水性相互作用、親水性相互作用、およびイオン性相互作用がそれぞれ優勢な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、およびＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうちの２つ以上の組み合わせを採用し得る。混合モードクロマトグラフィー媒体は、単一モードクロマトグラフィーによって再現することができない特有の選択性を提供し得る。混合モードクロマトグラフィーはまた、親和性ベースの方法と比較して、潜在的なコスト削減、より長いカラム寿命、および動作の柔軟性を提供し得る。いくつかの例示的な実施形態において、混合モードクロマトグラフィー媒体は、直接またはスペーサーを介して、場合によってはベースマトリックスと表記される有機または無機の支持体に連結された混合モードリガンドからなり得る。支持体は、本質的に球状の粒子などの粒子、モノリス、フィルタ、膜、表面、キャピラリーなどの形態であり得る。いくつかの特定の例示的な態様において、支持体は、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン、アルギン酸塩などの架橋炭水化物材料などの天然ポリマーから調製され得る。高い吸着容量を得るために、支持体は多孔性であり得、次いで、リガンドは外部表面および細孔表面に結合される。かかる天然ポリマー支持体は、逆懸濁ゲル化などの標準的な方法に従って調製され得る（Ｓｔｅｌｌａｎ Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，７９ ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ（ＢＢＡ）－ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＳ ＩＮＣＬＵＤＩＮＧ ＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ３９３－３９８（１９６４）は、参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、支持体は、架橋合成ポリマー、例えば、スチレンまたはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの合成ポリマーから調製され得る。かかる合成ポリマーは、標準的な方法に従って産生され得、例えば、Ｅｄｕａｒｄｏ Ｖｉｖａｌｄｏ－Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，３６ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＆ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ９３９－９６５（１９９７）を参照されたい。多孔質天然または合成ポリマー支持体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎなどの商業的供給源からも入手可能である。

【0169】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスを親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮することを含み得る。

【0170】

本明細書で使用される場合、「親和性クロマトグラフィー」は、クロマトグラフィー材料に対するそれらの親和性に基づいて２つの物質が分離される任意の方法を含む分離を含み得る。親和性クロマトグラフィー支持体の非限定的な例には、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、結合分子が提起された抗原を含む親和性支持体、およびＦｃ結合タンパク質を含む親和性支持体が挙げられるが、これらに限定されない。親和性クロマトグラフィー樹脂は、樹脂上、例えば、アガロースもしくはセファロースなどの上に、プロテインＡ、プロテインＧ、結合分子が提起された抗原、またはＦｃ結合タンパク質を固定することによって形成され得る。プロテインＡ樹脂には、いくつかの商業的供給源がある。プロテインＡ樹脂の非限定的な例としては、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ならびにＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｒｏＳｅｐ ＨＣ、ＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ、およびＰｒｏＳｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓが挙げられる。

【0171】

一態様において、親和性クロマトグラフィー材料は、試料マトリックスを充填する前に、適切な緩衝液で平衡化され得る。この平衡化に続いて、試料マトリックスをカラム上に充填し得る。一態様において、親和性クロマトグラフィー材料の充填に続いて、適切な洗浄緩衝液を使用して、親和性クロマトグラフィー材料を１回または複数回洗浄し得る。いくつかの特定の態様において、洗浄からのフロースルーを収集し得る。特定の態様において、洗浄からのフロースルーを、さらに処理し得る。任意選択で、異なる緩衝液を採用した洗浄を含む他の洗浄を、カラムを溶出する前に採用し得る。洗浄からのフロースルーを収集し、さらに処理し得る。親和性クロマトグラフィー材料はまた、適切な溶出緩衝液を使用して溶出され得る。溶出液を、当業者に周知の技術を使用して監視し得る。例えば、ＯＤ２８０での吸光度を追跡し得る。次いで、目的の溶出画分を、さらなる処理のために調製し得る。

【0172】

一態様において、コスモトロピック塩溶液を、親和性クロマトグラフィー樹脂と接触する前に、目的のタンパク質を含む試料マトリックスに補充し得る。コスモトロピック塩溶液は、少なくとも１つのコスモトロピック塩を含む。最適なコスモトロピック塩の例としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、コスモトロピック塩は、硫酸アンモニウムであり、別の態様において、コスモトロピック塩は、硫酸ナトリウムであり、別の態様において、コスモトロピック塩は、クエン酸ナトリウムである。コスモトロピック塩は、約０．３Ｍ～約１．１Ｍの濃度でコスモトロピック塩溶液中に存在する。一実施形態において、コスモトロピック塩は、約０．５Ｍの濃度でコスモトロピック塩溶液中に存在する。

【0173】

いくつかの例示的な実施形態において、濃縮ステップは、クロマトグラフィー支持体から得られた試料を処理することをさらに含み得る。

【0174】

いくつかの例示的な実施形態において、処理は、加水分解剤を試料に添加してペプチドを産生することを含み得る。本明細書で使用される場合、用語「加水分解剤」は、タンパク質の消化を実施し得る多数の種々の剤のうちの任意の１つまたは組み合わせを意味する。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテアーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、熱溶解素、パパイン、プロナーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素消化を実施し得る加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例は、エタノールおよびアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、およびオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化のための利用可能な技術を論じる最近のレビューについては、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ ＆ Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、タンパク質またはポリペプチドにおいて、配列特異的な様式でペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能な収集物を生成し得る。

【0175】

タンパク質に対する加水分解剤の配合比および消化に必要な時間は、タンパク質の消化を得るために適切に選択され得る。酵素対基質の比が不適切に高い場合、それは、非特異的な切断（すべてのタンパク質／ペプチドを個々のアミノ酸に分解する可能性がある）を引き起こす可能性があり、それによって、タンパク質を同定する能力を制限し、配列カバレッジを低減させる可能性がある。一方、低いＥ／Ｓの比は、長い消化を必要とし、したがって試料準備時間が長くなる。酵素対基質比は、約１：０．５～約１：５００の範囲であり得る。

【0176】

本明細書で使用される場合、用語「消化」は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤、例えば、酵素消化または非酵素消化を使用して、試料中のタンパク質の消化を実施するためのいくつかのアプローチがある。

【0177】

試料中のタンパク質の消化のための広く受け入れられている方法の１つは、プロテアーゼの使用を伴う。多くのプロテアーゼが利用可能であり、それらのそれぞれは、特異性、効率、および最適な消化条件に関して独自の特徴を有する。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両方を指し、ペプチド内の非末端または末端アミノ酸で切断するプロテアーゼの能力に基づいて分類される。あるいは、プロテアーゼはまた、触媒作用のメカニズムで分類される、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびメタロプロテアーゼ、システイン、セリン、およびスレオニンプロテアーゼの６つの異なるクラスを指す。「プロテアーゼ」および「ペプチダーゼ」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合を加水分解する酵素を指す。

【0178】

宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させること以外に、本方法は、任意選択で、宿主細胞タンパク質を低減させるためのステップ、宿主細胞タンパク質をアルキル化するためのステップ、宿主細胞タンパク質を緩衝させるためのステップ、および／または試料マトリックスを脱塩するためのステップを含み得る。これらのステップは、所望により任意の適切な方法で達成され得る。

【0179】

いくつかの例示的な実施形態において、処理は、タンパク質還元剤を試料に添加することを含み得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元のために使用される剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、またはそれらの組み合わせである。

【0180】

いくつかの例示的な実施形態において、処理は、タンパク質アルキル化剤を試料に添加することを含み得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語は、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、および４－ビニルピリジン、またはこれらの組み合わせである。

【0181】

いくつかの例示的な実施形態において、処理は、アルキル化剤、還元剤、加水分解剤、またはそれらの組み合わせからなる群からの１つ以上を添加することを含み得る。これらの剤の試料への添加は、多様であり得る。添加は、試料を剤に添加することによって、または剤を試料に添加することによって実施され得る。

【0182】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料マトリックスをクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮することを含み得る。本明細書で使用される場合、「分画」という用語は、試料マトリックス中に存在する宿主細胞タンパク質を消化することから得られる様々なペプチドを分離するプロセスを含み得る。このプロセスは、複雑な生物学的試料マトリックスからペプチドを単離するための基盤として、ペプチドのｐＩ、疎水性、金属結合能力、露出したチオール基の含有量、サイズ、電荷、形状、溶解性、安定性、および沈降速度、様々なイオン基と結合する能力、ならびに基質に対する親和性などの様々な一般的性質に基づいてペプチドを分画することができる適切なペプチド分画技術を使用してペプチドを分離することを含み得る。ペプチドはまた、それらの細胞の位置に基づいて分離することができ、それにより、細胞質タンパク質、核タンパク質、および膜タンパク質を抽出することができる。

【0183】

いくつかの例示的な実施形態において、分画は、サイズベースの分画であり得る。一態様において、サイズベースの分画は、ゲル電気泳動を使用することによって実施され得る。ゲル電気泳動の詳細は、Ｚａｉｆａｎｇ Ｚｈｕ，Ｊｏａｎｎ Ｌｕ ＆ Ｓｈａｏｒｏｎｇ Ｌｉｕ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ，７０９ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ ２１－３１（２０１２）において見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。さらなる原理および基礎は、ＳＡＭＥＨ ＭＡＧＤＥＬＤＩＮ，ＧＥＬ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＢＡＳＩＣＳ （２０１２）において見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。

【0184】

一態様において、サイズベースの分画は、透析を使用することによって実施され得る。透析は、分子カットオフ膜フィルタまたは一連の膜フィルタを使用して実施され得る。透析はまた、透析カセットを使用して実施され得る。かかる透析方法の１つの例は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセットを使用することを含み得る。カセット設計は、表面積体試料体積の比を最大化し、優れた試料回収を可能にする。

【0185】

一態様において、サイズベースの分画は、キャピラリー電気泳動を使用することによって実施され得る。キャピラリー電気泳動に関する最近の傾向および進歩は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｖｏｅｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ，９０ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １４６４－１４８１（２０１８）およびＭａｒｉａ Ｒａｍｏｓ－Ｐａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ，３９ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ １１１－１２５（２０１７）において見出すことができ、それらは参照により本明細書に組み込まれる。さらなる原理および基本は、Ｈａｒｒｙ Ｗｈａｔｌｅｙ，Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＦＯＲＥＮＳＩＣ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ ２１－５８において見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。

【0186】

一態様において、サイズベースの分画は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して実施され得る。「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」または「ゲル濾過」という語句は、溶液中の分子のサイズに従って分子を選別することができる液体カラムクロマトグラフィー技術を含む。本明細書で使用される場合、「ＳＥＣクロマトグラフィー樹脂」または「ＳＥＣクロマトグラフィー媒体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、所望の産物から不純物を（例えば、二重特異性抗体産物に対するホモ二量体汚染物質）分離するＳＥＣにおいて使用される任意の種類の固相を含み得る。樹脂の体積、使用されるカラムの長さおよび直径、ならびに動的容量および流量は、処理される流体の体積、本発明のプロセスに供される流体中のタンパク質の濃度などのいくつかのパラメータに依存し得る。各ステップのこれらのパラメータの決定は、十分に当業者の平均的なスキルの範囲内である。サイズ排除クロマトグラフィーについての簡単な実用的レビューは、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ａ ｂｒｉｅｆ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｕｍｂ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，１５０ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ８１－８５（２０１８）およびＧｌｏｒｉａ Ｂｒｕｓｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：Ａ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖｉｅｗ，８１ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＡ ３－２３（２０１７）において見出すことができ、それらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。ＳＥＣのさらなる原理および基礎は、Ｐａｕｌａ Ｈｏｎｇ，Ｓｔｅｐｈａｎ Ｋｏｚａ ＆ Ｅｄｏｕａｒｄ Ｓ．Ｐ．Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，３５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＆ ＲＥＬＡＴＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ２９２３－２９５０（２０１２）において見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｓｉｚｅ－ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅｓ，２４ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ Ｓ６０－Ｓ６１（２０１３）において示されるサイズ排除クロマトグラフィーの新しい方法は、本方法にも使用され得、それは参照により本明細書に組み込まれる。

【0187】

一態様において、サイズベースの分画は、フィールドフロー分画を使用して実施され得る。フィールドフロー分画（ＦＦＦ）は、主に層流マイクロ流体フロー内の超分子、タンパク質およびバイオ粒子（直径＜１００μｍ）の不均一混合物を分離するために採用される「ソフトインパクト」溶出技術の部類である。ＦＦＦの概要は、Ｍｅｓｓａｕｄらによる論文（Ｆａｔｈｉ Ａ．Ｍｅｓｓａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｎ ｆｉｅｌｄ－ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３４ ＰＲＯＧＲＥＳＳ ＩＮ ＰＯＬＹＭＥＲ ＳＣＩＥＮＣＥ ３５１－３６８（２００９））で提供されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＦＦＦのさらなる技術は、Ｔ．Ｋｏｗａｌｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｅｌｄ－Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，３６ ＣＲＩＴＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷＳ ＩＮ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １２９－１３５（２００６）およびＢａｒｂａｒａ Ｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｅｌｄ－ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ，６３５ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ １３２－１４３（２００９）において見出すことができ、それらは各々参照により本明細書に組み込まれる。

【0188】

いくつかの例示的な実施形態において、分画は、疎水性ベースの分画であり得る。一態様において、サイズベースの分画は、逆相クロマトグラフィーを使用して実施され得る。逆相クロマトグラフィーは、タンパク質の疎水性に基づいてタンパク質の分離を可能にする最も広く使用されるクロマトグラフィーモードである。分離は、極性移動相と疎水性（非極性）固定相との間の分析物の分配係数に基づいている。ペプチドの場合、極性が高いペプチドが最初に溶出し、一方、極性が低いペプチドは、固体シリカ支持体の周囲に「液体様」層を形成する疎水性基とより強く相互作用する。ＲＰＬＣは、勾配溶出、水性試料との適合性、および保持機構の汎用性での使いやすさのためにペプチド分離に広く適用されており、ｐＨ、有機改質剤、または添加剤によって分離の変化をもたらすことができる。一態様において、サイズベースの分画は、ｐＨ勾配クロマトグラフィーを使用して実施され得る。

【0189】

いくつかの例示的な実施形態において、逆相クロマトグラフィーは、ナノＬＣを使用する低ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー分離を含み得る。一態様において、逆相クロマトグラフィーは、高ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー分離を含み得る。特定の態様において、逆相クロマトグラフィーは、低ｐＨ逆相液体クロマトグラフィーに直交する高ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー分離を含み得る。トップダウンプロテオミクスのための高ｐＨおよび低ｐＨ逆相液体クロマトグラフィーを使用したそのような２次元分離の概要は、Ｚｈｅ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｐＨ ａｎｄ ｌｏｗ－ｐＨ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，４２７ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ４３－５１（２０１８）において見出すことができる。

【0190】

いくつかの例示的な実施形態において、分画は、電荷ベースの分画であり得る。別の態様において、電荷ベースの分画は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して実施され得る。特定の態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり得る。別の特定の態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。

【0191】

いくつかの例示的な実施形態において、分画は、ｐＩベースの分画であり得る。一態様において、電荷ベースの分画は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して実施され得る。特定の態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーであり得る。別の特定の態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーであり得る。一態様において、電荷ベースの分画は、等電点電気泳動法によって行うことができる。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、タンパク質の分離を提供することができ、タンパク質は、分子の正味電荷がゼロ（例えば、等電位点、ｐＩ）になるまで、ｐＨ勾配の存在下で、電場の影響下でそれらの電荷に従って移動することができる。分離は、弱酸および弱塩基として振る舞うアミノ酸および露出した荷電残基の組成に応じてみなすことができる。タンパク質の移動は、電気泳動の基本原理に従うが、ｐＩ値に近い値での移動が減速することによって、ｐＨ勾配の存在下で移動性は変化する。ＩＥＦの概要は、Ｐｅｒｇａｎｄｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｇｎａ Ｍｅｌｉｓｓａ Ｐｅｒｇａｎｄｅ ＆ Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｃｏｌｏｇｎａ，Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｐｏｉｎｔ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，５ ＰＲＯＴＥＯＭＥＳ ４（２０１７）による論文で提供されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＩＥＦのさらなる技術は、Ｆｉｎｄｌｅｙ Ｃｏｒｎｅｌｌ，Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３０ ＴＨＥ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴ ＲＥＶＩＥＷＳ １２３－１３０（２００９）、Ｔｏｍａｓｚ Ｂａｃｚｅｋ，Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐＩ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ａｎｄ ＺｉｐＴｉｐ ｐｉｐｅｔｔｅ ｔｉｐｓ，３４ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ８５１－８６０（２００４）、Ｃ．Ｆ．Ｉｖｏｒｙ，Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７７７－１７９３（２０００）、Ｇ．Ｂ．Ｓｍｅｊｋａｌ，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｓｅｒ： Ａ ｄｉｖｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｑｕｅｒ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ，４ ＢＲＩＥＦＩＮＧＳ ＩＮ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ ７６－８１（２００５）、およびＤａｖｉｄ Ｇａｒｆｉｎ，Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｎ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥ １，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ １９７－２６８（２００３）において見出すことができ、それらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。

【0192】

ｐＩベースの分画のさらなる改善は、Ｓｕｂｈａｓｈｉｎｉ Ｓｅｌｖａｒａｊｕ ＆ Ｚｉａｄ Ｅｌ Ｒａｓｓｉ，Ｌｉｑｕｉｄ－ｐｈａｓｅ－ｂａｓｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，ｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ－Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ２００８－２０１１，３３ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ ７４－８８（２０１１）で説明されている方法などの分画ステップに使用され得る。

【0193】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。

【0194】

いくつかの例示的な実施形態において、特徴付けることは、分画ステップから得られたペプチドを同定することを含み得る。ペプチドの同定は、ポリペプチド断片化に由来する質量スペクトルを、タンパク質のインシリコ消化から生成される理論的質量スペクトルと比較することによってさらに実施され得る。次いで、タンパク質にペプチド配列を割り当てることによって、タンパク質の推論を達成する。

【0195】

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、検出および／または特徴付けのためにポリペプチドまたはペプチドが溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、および検出器の３つの主要な部分を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを作成することである。分析物の原子、分子、またはクラスターを気相に移動させ、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）または別々のプロセスを介してイオン化し得る。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

【0196】

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

【0197】

本明細書で使用される場合、用語「タンデム質量分析」は、質量選択および質量分離の複数の段階を使用することによって、試料マトリックス分子についての構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、試料マトリックス分子を気相に移動させ、完全なままイオン化し得ること、ならびにそれらを、第１の質量選択ステップの後、何らかの予測可能で制御可能な方法で崩壊するように誘導し得ることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳ^ｎは、まず、前駆体イオン（ＭＳ^２）を選択して単離し、断片化し、一次断片イオン（ＭＳ^３）を単離し、断片化し、二次断片（ＭＳ^４）を単離することによって、意味のある情報を得ることができるか、または断片化イオン信号が検出可能である限り、実施され得る。タンデムＭＳは多種多様な分析装置の組み合わせで成功裏に実行されている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、および速度だけでなく、サイズ、コスト、および可用性などの多くの異なる要因によって決定され得る。タンデムＭＳ方法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペースおよびタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間内で、またはタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、および少なくとも２つの非捕獲質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで産物イオンがｍ／ｚ分離およびデータ取得のために別の分析器に伝達されるように設計され得る。タンデムインタイムにおいては、イオン源において産生された質量分析イオンは、同じ物理デバイスにおいて捕捉、分離、断片化、およびｍ／ｚ分離され得る。

【0198】

質量分析計によって同定されたペプチドは、完全なままのタンパク質およびそれらの翻訳後修飾の代理の代表物として使用され得る。実験および理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることによってそれらをタンパク質の特徴付けに使用し得、後者は、タンパク質配列データベースにおける可能性のあるペプチドから生成される。特徴付けには、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の位置特定もしくは翻訳後修飾の同定、または比較可能性分析、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0199】

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベースにおけるすべての可能性のある配列に対して解釈されていないＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティクスツールを指す。そのようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２１２５４７６０）またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。

【0200】

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結し得る。別の例示的な実施形態において、質量分析計は、ナノ液体クロマトグラフィーに連結し得る。一態様において、液体クロマトグラフィーにおいてタンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合性であり得る移動相であり得る。特定の態様において、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、アセトニトリル、水、ギ酸、揮発性酸、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0201】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、高電場非対称波形イオン移動度分光法を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「高電場非対称波形イオン移動度分光法」もしくは「ＦＡＩＭＳ」または「微分移動度分光法」もしくは「ＤＭＳ」は、強電界および弱電界でのその挙動によって気相イオンを分離する大気圧イオン移動度技術を含み得る。ＦＡＩＭＳデバイスは、エレクトロスプレーイオン化と容易にインタフェース接続することができ、プロテオミクス研究において液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析（ＭＳ）との間の追加の分離モードとして実装されている。ＦＡＩＭＳ分離は、ＬＣおよびＭＳの両方に直交し得、複雑な試料中のペプチドの検出を改善するためのオンライン分画手段として使用され得る。ＦＡＩＭＳは、化学ノイズをフィルタリングすることによって、ダイナミックレンジを改善し、それに伴ってイオンの検出限界を改善し得る。ＦＡＩＭＳを使用して、干渉イオン種を除去し、タンデムＭＳによる同定に最適なペプチド電荷状態を選択することもできる。質量分析ベースのプロテオミクスのためのＦＡＩＭＳの使用に関するレビューは、ＳｗｅａｒｉｎｇｅｎおよびＭｏｒｉｔｚによって公開された論文（Ｋｒｉｓｔｉａｎ Ｅ Ｓｗｅａｒｉｎｇｅｎ ＆ Ｒｏｂｅｒｔ Ｌ Ｍｏｒｉｔｚ，Ｈｉｇｈ－ｆｉｅｌｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｗａｖｅｆｏｒｍ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，９ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５０５－５１７（２０１２））において見出すことができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＦＡＩＭＳの詳細については、以下のいくつかのレビューにおいて見出すことができる。Ｒｏｇｅｒ Ｇｕｅｖｒｅｍｏｎｔ，Ｈｉｇｈ－ｆｉｅｌｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｗａｖｅｆｏｒｍ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１０５８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ａ ３－１９（２００４）、Ａｌｅｘａｎｄｒｅ Ａ．Ｓｈｖａｒｔｓｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｅｌｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｗａｖｅｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｄｉｐｏｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｉｏｎ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ？，１１０ ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ ２１９６６－２１９８０（２００６）、Ｂｅａｔａ Ｍ．Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ ＆ Ｚｏｌｔａｎ Ｍｅｓｔｅｒ，Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｆｉｅｌｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｗａｖｅｆｏｒｍ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＩＭＳ） ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＤＭＳ），１３２ ＴＨＥ ＡＮＡＬＹＳＴ ８４２（２００７）、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。ＫｏｌａｋｏｗｓｋｉおよびＭｅｓｔｅｒによるＦＡＩＭＳの一般的なレビュー、Ｎａｚａｒｏｖおよびその同僚によるＦＡＩＭＳの一連の理論的および実践的な調査（Ｎａｚａｒｏｖ，Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ，２８５ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ １４９－１５６（２００９））、Ｂｒａｄｌｅｙ Ｂ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ａｓ ａ ｐｒｅ－ｆｉｌｔｅｒ ｆｏｒ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２９８ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ４５－５４（２０１０）、Ｅｖｇｅｎｙ Ｖ．Ｋｒｙｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｖｅｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８１ ＲＥＶＩＥＷ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ ０２４１０１（２０１０）、Ｂｒａｄｌｅｙ Ｂ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，１６ ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ５７－７１（２０１０）、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｌ．Ｃｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｐｒｅｆｉｌｔｅｒｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＤＭＳ－ＭＳ），２９１ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ １０８－１１７（２０１０）、Ｂｒａｄｌｅｙ Ｂ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，１６ ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ５７－７１（２０１０）およびＳｈｖａｒｔｓｂｕｒｇによる本（ＡＬＥＸＡＮＤＲＥ Ａ．ＳＨＶＡＲＴＳＢＵＲＧ，ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＩＯＮ ＭＯＢＩＬＩＴＹ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ＮＯＮＬＩＮＥＡＲ ＩＯＮ ＴＲＡＮＳＰＯＲＴ ＡＮＤ ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＯＦ ＦＡＩＭＳ（２００９））、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる。

【0202】

市販または適合した質量分析計およびＦＡＩＭＳセル／システム／デバイスのいずれも、宿主細胞タンパク質の特徴付けに利用し得る。ＦＡＩＭＳセルは、サイズが変更し得、長さ６５ｍｍ、幅２０ｍｍ、および分析ギャップ２ｍｍの「フルサイズ」セル（ＦＳ－ＦＡＩＭＳ）、および長さ１５ｍｍ、幅５ｍｍ、および分析ギャップ０．３８ｍｍの「４分の１サイズ」セル（ＱＳ－ＦＡＩＭＳ）であり得る。使用されるＦＡＩＭＳデバイスは、Ｉｏｎａｌｙｔｉｃｓによるｃ－ＦＡＩＭＳまたはＳｉｏｎｅｘによるｐ－ＦＡＩＭＳであり得る。Ｏｗｌｓｔｏｎｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．から入手した、ＵｌｔｒａＦＡＩＭＳ Ａ１およびＬｏｎｅｓｔａｒ Ｇａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの小型化されたチップベースのＦＡＩＭＳシステムも使用し得る。各デバイスの両方のチップは、チップの面全体にわたって曲がりくねった形状を作成する２つの交互にかみ合う電極で構成され、各列は、異なる平面ＦＡＩＭＳチャネルである。Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦＡＩＭＳ Ｐｒｏ（商標）インタフェースも本方法に使用できる。

【0203】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。

【0204】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をプロテインＡクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。

【0205】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。

【0206】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、タンデム質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。一態様において、タンデム質量分析計は、空間的にタンデムであるか、または時間的にタンデムであり得る。

【0207】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、液体クロマトグラフィーシステムに連結された質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。一態様において、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステム（ｎＬＣ）であり得る。

【0208】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。一態様において、ＦＡＩＭＳに使用される担体ガスは、揮発性化学修飾剤を含み得る。特定の態様において、揮発性化学修飾剤は、イソプロパノールまたは塩化メチレンであり得る。

【0209】

特定の例示的な一実施形態において、ＦＡＩＭＳデバイスを、ＭＳと組み合わせて使用し得る。別の特定の例示的な実施形態において、ＦＡＩＭＳデバイスを、ＬＣおよびＭＳと組み合わせて使用し得る。

【0210】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施し、ＬＣ－ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付けることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得る。

【0211】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも、少なくとも約２０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、少なくとも約２０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１０５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１１０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１１５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１２０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１５５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１６０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１６５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１８０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１８５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１９０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１９５％多い宿主細胞タンパク質、または少なくとも約２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。

【0212】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも、少なくとも約２０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、少なくとも約２０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１０５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１１０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１１５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１２０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１５５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１６０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１６５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１８０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１８５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１９０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１９５％多い宿主細胞タンパク質、または少なくとも約２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。

【0213】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得、本方法は、濃縮ステップを含むが分画ステップを含まない方法よりも約２０％～２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、約２０％～約３０％多い宿主細胞タンパク質、約３０％～約４０％多い宿主細胞タンパク質、約４０％～約５０％多い宿主細胞タンパク質、約５０％～約６０％多い宿主細胞タンパク質、約６０％～約７０％多い宿主細胞タンパク質、約７０％～約８０％多い宿主細胞タンパク質、約８０％～約９０％多い宿主細胞タンパク質、約９０％～約１００％多い宿主細胞タンパク質、約１００％～約１５０％多い宿主細胞タンパク質、または約１００％～約２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。

【0214】

いくつかの例示的な実施形態において、試料中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、試料をクロマトグラフィー支持体と接触させ、分画ステップを実施することによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮するためのステップを含み得、本方法は、分画ステップを含むが濃縮ステップを含まない方法よりも約２０％～２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、約２０％～約３０％多い宿主細胞タンパク質、約３０％～約４０％多い宿主細胞タンパク質、約４０％～約５０％多い宿主細胞タンパク質、約５０％～約６０％多い宿主細胞タンパク質、約６０％～約７０％多い宿主細胞タンパク質、約７０％～約８０％多い宿主細胞タンパク質、約８０％～約９０％多い宿主細胞タンパク質、約９０％～約１００％多い宿主細胞タンパク質、約１００％～約１５０％多い宿主細胞タンパク質、または約１００％～約２００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。

【0215】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、を含み得る。クロマトグラフィー支持体は、液体クロマトグラフィー支持体であり得る。上で説明したように、液体クロマトグラフィー支持体は、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーを含み得る。

【0216】

本明細書で使用される場合、「非変性消化条件」または「天然条件」は、タンパク質変性を引き起こさない条件を含み得る。タンパク質変性は、ペプチド結合の破裂がなく、分子の三次元形状をその天然の状態から変化させるプロセスを指し得る。タンパク質変性は、カオトロピック剤などのタンパク質変性剤を使用して実施し得る。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、および疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨げることによって、系のエントロピーを増加させる。非変性条件についての非限定的な例としては、水または緩衝剤が挙げられる。使用される水は、蒸留および／または脱イオン化され得る。いくつかの例示的な実施形態において、溶媒は、ＨＰＬＣグレードであり得る。緩衝液の非限定的な例には、酢酸アンモニウム、トリス塩酸塩、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。一態様において、緩衝液の濃度は最大で１Ｍであり得る。

【0217】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、を含み得る。

【0218】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物をプロテインＡ親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、を含み得る。

【0219】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、親和性クロマトグラフィー支持体からフロースルーを収集する工程と、を含み得る。

【0220】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、質量分析計を使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。タンデム質量分析計は、空間的にタンデムあるか、または時間的にタンデムであり得る。一態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結され得る。別の態様において、質量分析計は、ナノ液体クロマトグラフィーシステムに連結され得る。一態様において、液体クロマトグラフィーにおいてタンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合性であり得る移動相であり得る。特定の態様において、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、アセトニトリル、水、ギ酸、揮発性酸、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、本方法は、特徴付けのためにＦＡＩＭＳデバイスを使用することをさらに含み得る。

【0221】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成すること、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮することを含み得、本方法は、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触さることを含まない方法よりも、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９００％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９７５％多い宿主細胞タンパク質、または少なくとも約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、本方法は、特徴付けのためにＦＡＩＭＳデバイスを使用することをさらに含み得る。

【0222】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成すること、混合物をクロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮することを含み得、本方法は、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触さることを含まない方法よりも、約５０％～約１００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、約５０％～約１００％多い宿主細胞タンパク質、約５０％～約５００％多い宿主細胞タンパク質、約１００％～約５００％多い宿主細胞タンパク質、約１００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質、または約５００％～約１０００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、クロマトグラフィー支持体は、親和性クロマトグラフィー支持体であり得る。一態様において、本方法は、特徴付けのためにＦＡＩＭＳデバイスを使用することをさらに含み得る。

【0223】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、ＦＡＩＭＳを使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。

【0224】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。一態様において、ＦＡＩＭＳデバイスに使用される担体ガスは、揮発性化学修飾剤を含み得る。一態様において、揮発性化学修飾剤は、イソプロパノールであり得る。別の態様において、ＦＡＩＭＳデバイスを、ＭＳと組み合わせて使用し得る。別の特定の態様において、ＦＡＩＭＳデバイスを、ＬＣおよびＭＳと組み合わせて使用し得る。別の特定の態様において、ＦＡＩＭＳ－ＭＳは、ＬＣと連結され得る。

【0225】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、宿主細胞タンパク質を有する試料マトリックスを非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって、該混合物中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、ｎＬＣ－ＦＡＩＭＳ－ＭＳを使用して、宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。

【0226】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて試料を形成することによって、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、宿主細胞タンパク質を有する試料を非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、ＦＡＩＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得、本方法は、ＦＡＩＭＳを含まない方法よりも、少なくとも約１５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、少なくとも約１５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１６％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１７％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１８％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約１９％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２１％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２２％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２３％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２４％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２６％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２７％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２８％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約２９％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３１％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３２％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３３％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３４％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３６％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３７％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３８％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３９％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４１％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４２％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４３％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４４％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４６％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４７％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４８％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４９％多い宿主細胞タンパク質、または少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0227】

いくつかの例示的な実施形態において、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、混合物を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させて試料を形成することによって、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、宿主細胞タンパク質を有する試料を非変性消化条件に供して混合物を形成する工程と、ＦＡＩＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得、本方法は、ＦＡＩＭＳを含まない方法よりも、少なくとも約１５％～約６０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0228】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）試料を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｂ）ＦＡＩＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得る。

【0229】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）試料を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｂ）ＦＡＩＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得、本方法は、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。一態様において、本方法は、少なくとも約３０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約３５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約４５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約５５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約６５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約７５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約８５％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９０％多い宿主細胞タンパク質、少なくとも約９５％多い宿主細胞タンパク質、または少なくとも約１００％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0230】

いくつかの例示的な実施形態において、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、（ａ）試料を親和性クロマトグラフィー支持体と接触させることによって試料中の宿主細胞タンパク質を濃縮する工程と、（ｂ）ＦＡＩＭＳを使用して宿主細胞タンパク質のうちの少なくとも１つを特徴付ける工程と、を含み得、本方法は、ステップ（ｂ）を含まない方法よりも、少なくとも約３０％～約７５％多い宿主細胞タンパク質を特徴付けることができる。

【0231】

本方法は、前述のタンパク質、宿主細胞タンパク質、クロマトグラフィー支持体、質量分析、分画法のうちのいずれにも限定されず、宿主細胞タンパク質を特徴付けるための方法は、任意の適切な手段によって行われ得ることが理解される。

【0232】

本明細書で提供される方法ステップの数字および／または文字を用いた連続したラベル付けは、方法またはその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味するものではない。

【0233】

特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文、および学術論文を含む様々な公表文献が、本明細書全体で引用される。これらの引用された文献のそれぞれは、参照により、その全体がすべての目的のために、本明細書に組み込まれる。

【0234】

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0235】

（Ａ）Ａｂ１を含む調製物について同定されたＨＣＰの数
材料。脱イオン水は、ＭｉｌｌｉＰａｋ Ｅｘｐｒｅｓｓ２０フィルタ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）とともに設置されたＭｉｌｌｉ－Ｑ一体型浄水システムによって提供された。酢酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）、酢酸および重炭酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）、Ｐｒｏｍｅｇａの再懸濁緩衝液で供給される配列決定グレードの改変トリプシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの超高純度１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの超高純度１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、配列決定グレード）、Ｆｉｓｈｅｒのアセトニトリル（最適条件ＬＣ／ＭＳグレード）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈの氷酢酸、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのヨードアセトアミド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈのジチオトレトール（ＤＴＴ）、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒの尿素（超高純度）、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ８．４、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ抗体精製樹脂、およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈの酢酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）。ＨＣＰについて分析した調製物は、抗体Ａｂ１を含んだ。

【0236】

データ分析。ペプチドについてのデータベース検索は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔマウスタンパク質データベースに対して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に埋め込まれたＳＥＱＵＥＳＴおよびＭＡＳＣＯＴを使用して実施された。検索パラメータは次のとおりである。前駆体イオン質量については２０ｐｐｍの公差、イオントラップによって分析した断片イオン質量については０．５Ｄａの公差である。データベース検索中にトリプシンが指定された。メチオニン酸化（＋１６Ｄａ）を可変修飾として設定した。偽発見率（ＦＤＲ）は、標的デコイ戦略を使用して決定され、ペプチド同定については１％、タンパク質同定については５％に設定され、タンパク質ごとに最低１つの特有のペプチドが検出された（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓ．Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｏｎｅ Ｈｏｕｒ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，１３ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＆ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ３３９－３４７（２０１３））。

【0237】

実施例１．採取された細胞培養液中のＨＣＰ
採取された細胞培養液を乾燥させ、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で再構成した。試料を１０ｍＭのジチオスレイトールで還元し、５０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、還元された試料を１５ｍＭのヨードアセトアミドで、暗所で１時間アルキル化した。アルキル化後、試料を分子量カットオフフィルタを用いて１００ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換し、トリプシン（１：２０ｗ／ｗの酵素：基質比）で、暗所で３７℃で一晩消化した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって消化を停止した。次いで、得られたトリプシン消化ペプチドを、逆相液体クロマトグラフィーによって分離し、続いて、オンライン質量分析を行った。まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（商標）１００トラップカラム（Ｃ１８、７５μｍのＩＤ、２ｃｍのベッド長、３μｍの粒径、１００Åの孔径）でトリプシン消化ペプチドを濃縮および脱塩し、次いで、０．１％のギ酸（移動相Ａ）を含有する水および０．１％のギ酸（移動相Ｂ）を含有する８０％のアセトニトリル／２０％の水を使用して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ固定相（Ｃ１８、１．７μｍの粒径、１３０Åの孔径）が充填されたＮｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（３６０μｍのＯＤ、７５μｍのＩＤ、１０μｍの先端ＩＤ、２５ｃｍのベッド長）でそれらを分離することによって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１２００を使用して分離を行った。ペプチドを、最初の１０分間、６％移動相Ｂで保持された勾配プロファイルを使用して分離し、次いで、次の１２０分間にわたって、６％から５０％の移動相Ｂに増加させた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突性解離（ＨＣＤ）を有するＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計で実施された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｑ－ＯＴ－ｑＩＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））。

【0238】

いずれの処理もしていないＨＣＣＦ中の同定されたＨＣＰの数は、１２７９であった（図１を参照されたい）。さらに、いずれの処理もしていないＨＣＣＦ中の同定された特有のペプチドの総数は、５６７５であった。

【0239】

実施例２．プロテインＡ枯渇を使用して特徴付けられたＨＣＰ
２．１ プロテインＡクロマトグラフィー
タンパク質試料を乾燥させ、ＤＰＢＳ中に再懸濁した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラム中に充填し、５カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ８．４）で平衡化した。タンパク質試料を各カラム上にピペット処理し、室温で４分間インキュベーションした。ＨＣＰフロースルーを収集し、保存した。各カラムを３カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ８．４）で洗浄し、ＨＣＰ溶出液をフロースルーと合わせた。収集したＨＣＰ溶出液を５０ｍＭの酢酸アンモニウムに緩衝液交換した。

【0240】

２．２ ＨＣＰ分析
ＨＣＰ溶出液を、実施例１に示されるように、それらを分析する前に処理した。

【0241】

プロテインＡクロマトグラフィーを使用して同定されたＨＣＰの数は、１９０６であった（図１を参照されたい）。さらに、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して同定されたＨＣＣＦ中の特有のペプチドの総数は、９２４５であった。

【0242】

実施例３．分画法を使用して特徴付けられたＨＣＰ
Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｈｉｇｈ ｐＨ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔをこのステップに使用した（図２を参照されたい）。

【0243】

３．１ スピンカラムのコンディショニング
カラムの底部から保護用の白い先端を取り外して廃棄し、カラムを２．０ｍＬの試料チューブに入れた。チューブを５０００×ｇで２分間遠心分離して溶液を除去し、樹脂材料を充填し、液体を廃棄した。上部スクリューキャップを取り外し、カラムに３００μＬのＡＣＮ（Ｆｉｓｈｅｒ）を充填し、キャップを交換し、スピンカラムを２．０ｍＬの試料チューブに戻し、５０００×ｇで２分間遠心分離した。ＡＣＮを廃棄し、洗浄ステップを報告した。次いで、ＡＣＮ洗浄について前述したように、スピンカラムを０．１％のＴＦＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回で２回洗浄した。

【0244】

３．２ ＨＣＣＦの分画
溶出溶液を表１に従って示すとおりに調製した。採取された細胞培養液由来の１００μｇのタンパク質を、３００μＬの０．１％のＴＦＡ溶液中に添加した。スピンカラムを新しい２．０ｍＬの試料チューブに入れ、試料溶液をカラム上に充填した。上部キャップを交換した後、試料チューブを３０００×ｇで２分間遠心分離した。「フロースルー」画分を収集した。次いで、カラムを新しい２．０ｍＬの試料チューブに入れ、［３００］μＬの水をカラムに添加し、再び遠心分離して、「洗浄」画分を収集した。次いで、カラムを新しい２．０ｍＬの試料チューブに入れ、［３００］μＬの適切な溶出溶液を添加し、３０００×ｇで２分間遠心分離し、画分を収集した。このステップを、新しい２．０ｍＬ試料チューブ中の表１からの適切な溶出溶液を使用して、残りのステップの勾配画分について繰り返した。真空遠心分離（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器）を使用して、各試料チューブについて液体内容物を蒸発させて乾燥させた。乾燥試料を、ＬＣ－ＭＳ分析の前に、適切な体積の０．１％のギ酸（ＦＡ）中に再懸濁した。

【0245】

３．３ ＨＣＰ分析
実施例１に示すとおり、分析の前に、各画分を処理した。分画法によって同定されたＨＣＰの数は、２０２３であった（図３を参照されたい）。さらに、分画法を使用して同定されたＨＣＣＦ中の特有のペプチドの総数は、１１７５０であった。

【0246】

（表１）

【0247】

実施例４．プロテインＡ枯渇および分画法を使用して特徴付けられたＨＣＰ
４．１ プロテインＡクロマトグラフィー
プロテインＡクロマトグラフィーは、実施例２に記載の方法を使用して実施された。

【0248】

フロースルー中のタンパク質を１０ｍＭのジチオスレイトールで還元し、５０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、還元された試料を１５ｍＭのヨードアセトアミドで、暗所で１時間アルキル化した。アルキル化後、試料を分子量カットオフフィルタを用いて１００ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換し、トリプシン（１：２０ｗ／ｗの酵素：基質比）で、暗所で３７℃で一晩消化した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって消化を停止した。次いで、得られたトリプシン消化ペプチドを分画ステップに供した。

【0249】

４．２ 分画ステップ
得られたトリプシン消化ペプチドを実施例３に記載のとおりに分画した。

【0250】

４．３ ＨＣＰ分析
ステップ４．２から得られた分画ペプチドを、逆相液体クロマトグラフィー、続いてオンライン質量分析を使用して、各々分離に供した。まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（商標）１００トラップカラム（Ｃ１８、７５μｍのＩＤ、２ｃｍのベッド長、３μｍの粒径、１００Åの孔径）でトリプシン消化ペプチドを濃縮および脱塩し、次いで、０．１％のギ酸（移動相Ａ）を含有する水および０．１％のギ酸（移動相Ｂ）を含有する８０％のアセトニトリル／２０％の水を使用して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ固定相（Ｃ１８、１．７μｍの粒径、１３０Åの孔径）が充填されたＮｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（３６０μｍのＯＤ、７５μｍのＩＤ、１０μｍの先端ＩＤ、２５ｃｍのベッド長）でそれらを分離することによって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１２００を使用して分離を行った。ペプチドを、最初の１０分間、６％移動相Ｂで保持された勾配プロファイルを使用して分離し、次いで、次の１２０分間にわたって、６％から５０％の移動相Ｂに増加させた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突性解離（ＨＣＤ）を有するＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計で実施された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｑ－ＯＴ－ｑＩＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））。

【0251】

本方法によって同定されたＨＣＰの数（プロテインＡおよび分画ステップを伴う）は、３１９５であった（図４を参照されたい）。さらに、改変された方法（プロテインＡおよび分画ステップを有する）を使用して同定されたＨＣＣＦ中の特有のペプチドの総数は、２３１３３であった。

【0252】

実施例５．通常の消化を使用して特徴付けられたＨＣＰ
５．１ 試料の調製
Ａｂ１を、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．４）中、１：２０の基質の濃度になるように混合物に添加したトリプシンで消化した。

【0253】

５．２ ＨＣＰ分析
得られた消化物を、実施例１に概説される方法を使用して、ＨＣＰについて分析した。本方法によって同定されたＨＣＰの数は７であり（図５を参照されたい）、同定された特有のペプチドの総数は、９であった。

【0254】

実施例６．天然消化を使用して特徴付けられたＨＣＰ
６．１ 試料の調製
Ａｂ１を、試料を乾燥させ、２５ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中に再懸濁させることによって処理した。試料を、トリプシン（１：４００ｗ／ｗの酵素：基質比）で、最終ｐＨ約７．４で、３７℃で一晩消化した。試料を３ｍＭのジチオスレイトールで還元し、９０℃で１０分間インキュベーションした。試料を約０．２％のギ酸に酸性化し、１５０００×ｇで２分間遠心分離した。上清をＬＣ／ＭＳ分析に使用した。

【0255】

６．２ ＨＣＰ分析
得られた消化物を、実施例１に概説される方法を使用して、ＨＣＰについて分析した。本方法によって同定されたＨＣＰの数は２０であり（図５を参照されたい）、同定された特有のペプチドの総数は、３７であった。

【0256】

実施例７．プロテインＡ枯渇、続いて天然消化を使用して特徴付けられたＨＣＰ
実施例２に記載の方法を使用して、プロテインＡクロマトグラフィー枯渇後に実験６．１からの消化物を生成された。フロースルーを収集し、上記のとおりに分析した。この方法（天然消化およびプロテインＡクロマトグラフィー）によって同定されたＨＣＰの数は、１３２であり（図６を参照されたい）、同定された特有のペプチドの総数は、４２４であった。

【0257】

実施例８．プロテインＡ枯渇を使用して特徴付けられたＨＣＰ
８．１ プロテインＡクロマトグラフィー
タンパク質試料を乾燥させ、ＤＰＢＳ中に再懸濁した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラム中に充填し、５カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ８．４）で平衡化した。タンパク質試料を各カラム上にピペット処理し、室温で４分間インキュベーションした。ＨＣＰフロースルーを収集し、保存した。各カラムを３カラム体積のＤＰＢＳ（ｐＨ８．４）で洗浄し、ＨＣＰ溶出液をフロースルーと合わせた。収集したＨＣＰ溶出液を５０ｍＭの酢酸アンモニウムに緩衝液交換した。

【0258】

８．２ ＨＣＰ分析
ＨＣＰ溶出液を乾燥させ、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中に再構成した。試料を１０ｍＭのジチオスレイトールで還元し、５０℃で３０分間インキュベーションした。次いで、還元された試料を１５ｍＭのヨードアセトアミドで、暗所で１時間アルキル化した。アルキル化後、試料を分子量カットオフフィルタを用いて１００ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換し、トリプシン（１：２０ｗ／ｗの酵素：基質比）で、暗所で３７℃で一晩消化した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって消化を停止した。次いで、得られたトリプシン消化ペプチドを、逆相液体クロマトグラフィーによって分離し、続いて、オンライン質量分析を行った。まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（商標）１００トラップカラム（Ｃ１８、７５μｍのＩＤ、２ｃｍのベッド長、３μｍの粒径、１００Åの孔径）でトリプシン消化ペプチドを濃縮および脱塩し、次いで、０．１％のギ酸（移動相Ａ）を含有する水および０．１％のギ酸（移動相Ｂ）を含有する８０％のアセトニトリル／２０％の水を使用して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ固定相（Ｃ１８、１．７μｍの粒径、１３０Åの孔径）が充填されたＮｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（３６０μｍのＯＤ、７５μｍのＩＤ、１０μｍの先端ＩＤ、２５ｃｍのベッド長）でそれらを分離することによって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ－ｎＬＣ１２００を使用して分離を行った。ペプチドを、最初の１０分間、６％移動相Ｂで保持された勾配プロファイルを使用して分離し、次いで、次の１２０分間にわたって、６％から５０％の移動相Ｂに増加させた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、ＭＳ／ＭＳ実験のためのペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突性解離（ＨＣＤ）を有するＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計で実施された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｑ－ＯＴ－ｑＩＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））。

【0259】

プロテインＡクロマトグラフィーを使用して同定されたＨＣＣＦ中のＡｂ１のＨＣＰの数は、１７５９であり（図７を参照されたい）、特有のペプチドの総数は、７０８６であった。

【0260】

実施例９．プロテインＡ枯渇およびＦＡＩＭＳデバイスを使用して特徴付けられたＨＣＰ
実施例８で実施したプロテインＡクロマトグラフィーからのフロースルー中のタンパク質をペプチドに消化し、以下に記載のシステムを使用して分析した。

【0261】

ＦＡＩＭＳが使用可能な実験では、ＦＡＩＭＳデバイスをナノ電気スプレー源と質量分析計との間に配置したことを除いて、設定は上記の実施例に記載と同じであった。ＦＡＩＭＳ分離は、以下の設定を用いて実施された。内側電極温度＝１００℃（注記されている場合を除く）、外側電極温度＝１００℃、ＦＡＩＭＳキャリアガス流量＝４．６Ｌ／分、ＤＶを有する非対称波形＝－５０００Ｖ、入口プレート電圧＝２５０Ｖ、およびＣＶ整定時間＝２５ｍｓ。ＦＡＩＭＳキャリアガスはＮ_２のみであり、イオン分離ギャップは１．５ｍｍである。注記されたＣＶをＦＡＩＭＳ電極に適用した。外部ステッピングまたは単一のＣＶ実験では、選択したＣＶを分析全体を通じてすべてのスキャンに適用した。内部ＣＶステッピング実験では、選択した各ＣＶを順次調査スキャンおよびＭＳ／ＭＳサイクル（１秒）に適用した。ＭＳ／ＭＳ ＣＶを、対応する調査スキャンからの適切なＣＶと常に対にした。

【0262】

ＦＡＩＭＳデバイスの使用と組み合わせてプロテインＡクロマトグラフィーを使用して同定されたＨＣＣＦ中のＡｂ１のＨＣＰの数は、２６４１であり（図７を参照されたい）、特有のペプチドの総数は、１０６０６であった。

【0263】

実施例１０．天然消化およびプロテインＡクロマトグラフィーを使用して特徴付けられたＨＣＰ
１０．１ プロテインＡクロマトグラフィー
Ａｂ１試料を、実施例２に記載の方法を使用して、プロテインＡクロマトグラフィー枯渇を使用して精製した。フロースルーを収集し、以下に記載のとおりに消化した。

【0264】

１０．２ 天然消化
Ａｂ１を、試料を乾燥させ、２５ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中に再懸濁させることによって処理した。試料を、トリプシン（１：４００ｗ／ｗの酵素：基質比）で、最終ｐＨ約７．４で、３７℃で一晩消化した。試料を３ｍＭのジチオスレイトールで還元し、９０℃で１０分間インキュベーションした。試料を約０．２％のギ酸に酸性化し、１５０００×ｇで２分間遠心分離した。上清をＬＣ／ＭＳ分析に使用した。

【0265】

この方法（天然消化およびプロテインＡクロマトグラフィー）によって同定されたｍＡｂ１のＨＣＰの数は、１４６であり（図８を参照されたい）、同定された特有のペプチドの総数は、３６３であった。

【0266】

実施例１１．天然消化、プロテインＡクロマトグラフィーおよびＦＡＩＭＳを使用して特徴付けられたＨＣＰ
実施例９に記載のＦＡＩＭＳデバイスを使用して、実施例１０からの上清も分析した。

【0267】

ＦＡＩＭＳデバイスの使用と組み合わせた後の天然消化条件を使用した方法を使用して同定されたＨＣＰの数は、２１４であり（図８を参照されたい）、特有のペプチドの総数は、５０５であった。

【0268】

（Ｂ）Ａｂ１を含む調製物について同定されたＨＣＰの数
化学物質。氷酢酸、尿素、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸（ＦＡ）、アセトニトリル、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ１０×、カルシウムなし、マグネシウムなし）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手し、一方で、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。再懸濁緩衝液を有する配列決定グレードの改変トリプシンはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５および８．０）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手し、ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体標準物ＲＭ８６７１はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ）から購入した。

【0269】

プロテインＡ枯渇。原薬をＤＰＢＳに緩衝液交換し、ｐＨ８．４に調整した。１ｍＬのプロテインＡカラムを５カラム体積のＤＰＢＳで平衡化した。原薬をプロテインＡカラムに添加し、室温で４分間インキュベーションした。各カラムを３カラム体積のＤＰＢＳで洗浄し、溶出液およびフロースルーを収集した。フロースルーおよび溶出液を、３０００ｇおよび５℃で遠心分離することによって、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ｋＤａ遠心フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で５０ｍＭの酢酸アンモニウムに緩衝液交換した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。各試料由来のタンパク質を真空中で乾燥させたか、または－８０℃で保存した。

【0270】

標準的な消化。乾燥した原料物質試料を、８Ｍの尿素／１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中に再構成した。タンパク質を１０ｍＭのＤＴＴで還元し、５０℃で３０分間インキュベーションした。試料を室温に冷却し、１５ｍＭのＩＡＭで、暗所で１時間アルキル化した。混合物を、製造業者の指示に従って、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ｋＤａ遠心フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１００ｍＭの酢酸アンモニウムに緩衝液交換した。３７℃で、一晩トリプシン（１：２０のトリプシン：基質比）でタンパク質分解消化を行った。消化を、０．２％のＦＡに酸性化することによってクエンチした。

【0271】

天然消化。天然消化の詳細な説明は、Ｈｕａｎｇら２０１７、上記参照によって提供される。簡単に述べると、試料を乾燥させ、２５ｍＭのｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中に再懸濁した。次いで、試料を、トリプシン（１：４００ｗ／ｗの酵素：基質比）で、最終ｐＨが約７．４で、３７℃で一晩消化した。続いて、試料を３ｍＭのＤＴＴで還元し、９０℃で１０分間インキュベーションした。試料を約０．２％のＦＡに酸性化し、１５０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、ＬＣ－ＭＳ^２分析に使用した。

【0272】

ナノＬＣ－ＭＳ^２。約１μｇの消化されたタンパク質を、Ｅａｓｙ－ｎＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、Ｃ１８カラム（ＢＥＨ Ｃ１８ 粒子［１．７μｍ、１３０Å、Ｗａｔｅｒｓ］が充填されたＮｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＰｉｃｏＦｒｉｔ カラム、３６０μｍのＯＤ、７５μｍのＩＤ、１０μｍの先端ＩＤ、２５ｃｍのベッド長）に注入した。移動相Ａは水中の０．１％のＦＡを含有し、移動相Ｂは８０％アセトニトリル／２０％水中の０．１％ＦＡを含有した。直線ＬＣ勾配は以下のように設定された。０～１０分：６％Ｂ、１３０分：５０％Ｂ、１４０～１５５分：１００％Ｂ。ＦＡＩＭＳ Ｐｒｏインタフェース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計で溶出液を分析した。プロテインＡ枯渇および天然消化物が試料中のペプチドのダイナミックレンジを低減させるため、標準的なプロテオミクスＭＳ設定を実装した（例として、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓ．Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｏｎｅ Ｈｏｕｒ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，１３ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＆ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ ３３９－３４７（２０１３）を参照されたい）。簡単に述べると、Ｏｒｂｉｔｒａｐ中、調査スキャンを１秒のサイクルタイムで実施した。ＭＳスキャンは、ｍ／ｚ範囲が３６０～１６００であり、解像度が６０Ｋであり、ＡＧＣ標的が５Ｅ５であり、最大注入時間が５０ｍｓであった。ＨＣＤ断片化は、３０％の正規化された衝突エネルギーでＭＳサイクル間で実施され、続いてイオントラップ中で分析された。ＭＳ^２スキャンは、ｍ／ｚ範囲が１００～２０００であり、ＡＧＣ標的が１Ｅ４であり、最大注入時間が３５ｍｓであった。動的排除期間を単一反復カウントで３０秒に設定し、＋２～＋８の電荷状態を有する前駆体のみを分析した。ＦＡＩＭＳ Ｐｒｏインタフェースの動作は、Ｈｅｂｅｒｔらによって説明されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓ．Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｈｏｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｗｉｔｈ ＦＡＩＭＳ ｏｎ ａ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，９０ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ９５２９－９５３７（２０１８））。簡潔に述べると、ＦＡＩＭＳ電極温度を１００℃に設定し、ＦＡＩＭＳキャリアガス流量は４．７Ｌ／分Ｎ_２であり、ＤＶを有する非対称波形は－５０００Ｖであり、入口プレート電圧は２５０Ｖであり、ＣＶ整定時間は２５ｍｓであり、ＣＶを－５０Ｖ、－６５Ｖ、および－８５Ｖに設定した。実験に使用しない場合、ＦＡＩＭＳ ＰｒｏインタフェースをＭＳから取り外した。

【0273】

データ分析。ペプチドおよびタンパク質同定のためのデータベース検索は、一般的な汚染物質を含むＳｗｉｓｓＰｒｏｔマウスタンパク質データベースに対して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に埋め込まれたＳＥＱＵＥＳＴおよびＭａｓｃｏｔを使用して実施された。質量公差は、Ｏｒｂｉｔｒａｐによって分析された前駆体イオン質量については２０ｐｐｍ、イオントラップによって分析された断片イオン質量については０．５Ｄａであった。データベース検索中にトリプシンが指定された。メチオニン酸化（＋１６Ｄａ）を可変修飾として設定し、システインカルバミドメチル化を通常（アルキル化）消化物の固定修飾として設定した。偽発見率（ＦＤＲ）は、標的デコイ戦略を使用して決定され、ペプチド同定については１％、タンパク質同定については５％に設定され、タンパク質ごとに最低２つの特有のペプチドが検出された。

【0274】

ＬＣ－ＭＳ^２によるＨＣＰ分析の主要な課題の１つは、薬物溶液（ＤＳ）中の治療用タンパク質と比較して、ＨＣＰの濃度が非常に低いことである（約１～１００ｎｇのＨＣＰ／ｍｇ産物）。トリプシン消化ペプチドは、処理されたタンパク質にかかわらず、質量分析計において事実上同じ挙動を示し、治療用タンパク質はＤＳ中に圧倒的に豊富であるため、ＨＣＰ由来のトリプシン消化ペプチドは、典型的な分析中のシグナル抑制およびバックグラウンドの増加に苦しむ。ＤＳ中の治療用タンパク質とともに共溶出する１ｐｐｍのＨＣＰ汚染物質を検出するために、質量分析計は、現在の質量分析計が達成することができるものを超える、６桁にわたるダイナミックレンジを必要とする。この感度要件により、試料の消化、クロマトグラフィー／分離、および機器分析を含む、典型的なプロテオミクスワークフローのすべてのステップが最適化される必要がある。しかしながら、感度の増加は分析の単一の側面に過ぎないため、リソースおよび試料スループットも考慮する必要がある。ＨＣＰ検出を改善するためのいくつかの方法を比較して、複雑性と、速度と、分析深度との間のバランスを達成するための推奨事項を作成した。ＨＣＰプロトコルを最適化しながら広範囲に比較可能なデータセットを生成するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体標準物（ＮＩＳＴｍＡｂ）を使用したが、結果は、試験した他の治療用タンパク質と同じ傾向を示した（データは示されていない）。

【0275】

実施例１２．ＮＩＳＴｍＡｂを用いた方法の比較および最適化
以前、「天然消化物」を作った、ＨＣＰ分析におけるダイナミックレンジの問題を緩和する単純で効率的な方法は、Ｈｕａｎｇら、上記参照によって報告された。低存在量のＨＣＰを選択的に消化し、比較的大きく安定した抗体をそのままにすることによって、それらは、抗体ペプチドからの干渉を劇的に低減し、したがって、典型的な消化物よりもはるかに多くのＨＣＰを検出した。本発明者らの知見は、これらの結果を裏付けている（図９Ａ）。「通常」トリプシン消化物（すなわち、消化前の還元およびアルキル化を伴うもの）と比較して、「天然」消化物を使用するよりも４倍以上多くのＨＣＰが同定され、特有のペプチドの数が比例的に増加した（表１）。比較のために、本発明者らは、プロテインＡカラムを使用して抗体試料を枯渇させた（図９Ｂ）。プロテインＡ枯渇は、天然消化物よりも効果的な戦略であり、対照試料（通常の消化物）と比較して約１０倍多くのＨＣＰを検出し、特有のペプチドの数が比例的に増加した。しかしながら、両方の手順に利点がある。例えば、天然消化物は、枯渇および消化の両方を必要とするプロテインＡプロトコルよりも試料前調製および出発物質が少なくてすむが、プロテインＡ枯渇は自動化され得、試料分析には追加の機器の時間を必要としないことにも留意される必要がある。

【0276】

（表１）分析で検出されたＨＣＰおよび特有のペプチドの数

【0277】

これらの結果は、ＨＣＰの従来のショットガンプロテオミクス分析と比較してかなりの改善を表すが、上記の実験において検出されたペプチドのほとんどは、依然として目的のタンパク質ではなく抗体由来であった。したがって、天然消化およびプロテインＡ枯渇を組み合わせて試験し、独立してプロテインＡ枯渇または天然消化と比較して、ＤＳからの干渉を低下させることによって、ＨＣＰペプチドシグナルをさらに改善させることができるかどうかを決定した。実際、プロテインＡ枯渇後の天然消化物と天然消化物との比較は、既に効果的な単一方法が提供することができるものを超えて、感度の著しい増加を示している（図９Ｃ）。プロテインＡ枯渇および天然消化の組み合わせから、天然消化物試料中（８４個のＨＣＰが同定された）および通常の消化物試料でのプロテインＡ枯渇（１４４個のＨＣＰが同定された）よりもはるかに多い、精製されたＤＳ試料中の５１１個のＨＣＰが検出された。さらに、結果は非常に相補的であり、以前のＮＩＳＴｍＡｂ分析で検出された９９％を超えるＨＣＰが、プロテインＡ枯渇天然消化物試料でも検出される。これは、これらの枯渇戦略と消化戦略との間のタンパク質同定においてバイアスがほとんどないか、または全くないことを示す。ＨＣＰが治療用タンパク質と共精製される頻度を考慮すると、（Ａｂｏｕｌａｉｃｈら、上記参照、Ｌｅｖｙら（２０１４）、上記参照、およびＬｅｖｙら（２０１８）、上記参照）、プロテインＡ枯渇、または治療用タンパク質を枯渇させるか、もしくはＨＣＰを濃縮する任意の他の方法は、意図せずにＨＣＰを除去する可能性もあるという合理的な懸念が存在する。しかしながら、プロテインＡ枯渇を伴わない分析において検出された実質的にすべてのＨＣＰも、プロテインＡ枯渇試料において検出されたため、いずれの損失よりも上回る感度の増加は、ＨＣＰとプロテインＡまたは治療用タンパク質との間の相互作用に起因する。

【0278】

これらの結果は、ＤＳ由来のバックグラウンド干渉を低減することの重要性を強調する。しかしながら、複数の枯渇方法を組み合わせた後、本研究者らは、プロテインＡ枯渇天然消化物試料において検出された主要なピークはもはや単独のＤＳペプチドではなく、ＨＣＰ、プロテインＡ、トリプシン自己分解および他のペプチドの組み合わせであるため、ＤＳのさらなる除去はもはや有用ではないことを見出した。本質的に、最も豊富なペプチドと最も豊富でないペプチドとの間のダイナミックレンジは、およそ２桁に低減し、したがって、治療用タンパク質のさらなる除去は、ＨＣＰに対する感度を増加させる可能性は低い。しかしながら、この分析はまた、治療用タンパク質が枯渇すると、単一の試料中で５００を超えるタンパク質および数千のペプチド有して、精製されたＤＳ試料がどれほど複雑になるかを示している（表１）。したがって、ペプチドのより良い分離およびより速いＭＳ分析が、分析深度をさらに増加させるのに役立つ可能性が高いと思われる。実際、この戦略は、ほとんどのショットガンプロテオミクス分析においてタンパク質の同定を増加させる可能性が高い。しかしながら、かかる戦略の追加される複雑さを考慮することが重要である。例えば、ＨＣＰ分析のための分画の使用は、以前に論じられている（Ｋｕｆｅｒら、上記参照）。ＤＳの分画は依然として有用であることがわかったが、それは機器の時間のかなりの増加を表し、これは通常の分析では問題である。イオン移動度は、追加の試料調製および機器の時間がなく、分画と同様の利益を達成することができる代替物である（Ｄｏｎｅａｎｕら（２０１５）、上記参照）。

【0279】

実施例１３．ＮＩＳＴｍＡｂを用いた方法の比較および最適化
ＤＳペプチドの分画の代わりに使用できる可能性のある技術として、高電場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）を調査した。ＦＡＩＭＳの概要は、他の場所で詳細に報告されている（Ｈｅｂｅｒｔら（２０１８）、上記参照）。簡潔に述べると、ＦＡＩＭＳセルは、ナノスプレーエミッタと質量分析計転移チューブとの間のインタフェースに存在し、内部は、補償電圧（ＣＶ）が印加され得る円形電極である。これにより、質量分析計に入る前にイオンの気相分離が可能になる。ＣＶを急速に（約２５ミリ秒／転移）変更し得るため、単一の実行の間に複数のＣＶを切り替え、それにより個々のスキャンを簡素化することができる。

【0280】

一例として、図１０に示されるように、ＦＡＩＭＳを伴って、および伴わない同じ試料の実行を考慮する。プロテインＡカラムおよび天然消化などによって治療用タンパク質を枯渇させる試料についてであっても、検出される主要なペプチドの多くは依然として治療用タンパク質からである。これらのペプチドの溶出中の全ＭＳスキャンは、潜在な目的のものであるいくつかのイオンを示した。主なＤＳペプチドイオンは存在量が豊富であるが、一方で、ＨＣＰペプチドであり得、分析の必要性があるが、次のピークが溶出を開始する前にＭＳ^２断片化のために選択されない可能性がある他のいくつかの低存在量のイオンがある。これは、治療用タンパク質が枯渇した試料においてでさえ、しばしばＨＣＰイオンがＤＳペプチドイオンよりも２桁弱いことから、特に懸念される。対照的に、同じ試料を、３つの異なるＣＶを有するＦＡＩＭＳセルを使用して実行する場合、３つの特有の塩基ピーククロマトグラム（ＢＰＣ）を得た。－５０ＶのＣＶでは、ＢＰＣは、ＦＡＩＭＳを伴わない試料の実行と同様であり、全ＭＳスペクトルにおいて同じ主要なＤＳペプチドイオンが観察される。－８５および－６５ＶのＣＶを有するスペクトルでは、ＤＳペプチドイオンは消失し、ＦＡＩＭＳを伴わずに検出されなかったＨＣＰペプチドの分析を可能にする。この例では、ＦＡＩＭＳは、義務的なサイクルまたは追加の試料調製ステップの大幅な増加なしに、基本的に、試料を３つの異なる実行に分画する。

【0281】

ＨＣＰ分析のためのＦＡＩＭＳの主な利点は、試料の複雑性を低減する能力であり、低存在量のペプチドの検出を可能にする。原則として、追加の試料調製または機器の時間を必要とすることなく、他の種類の分画に類似している。さらに、ＦＡＩＭＳのフィルタリング効果に起因するバックグラウンドノイズの低減は、前駆体イオン選択をより良くし、ＭＳ^２スペクトルを改善し、ペプチドＩＤの信頼性を増加させることも可能になる。ＦＡＩＭＳインタフェースは、潜在的に信号を低減させることができるが、シグナルの任意の低減は、バックグラウンドノイズの減少を伴う（すなわち、ほとんどの観察された場合にシグナル対ノイズ比が改善される）。ＦＡＩＭＳの追加は、ＦＡＩＭＳを伴わない試料の実行と比較して、ＨＣＰの同定を約２０％増加させることが見出された（表１および図９Ｄ）。

【0282】

この最適化されたワークフローでは、多数のＨＣＰ（ＦＡＩＭＳを使用するプロテインＡ枯渇天然消化物試料中６０２個）が同定されただけでなく、それは、非常に堅牢であることが見出され、以前に報告された方法とよく一致する。再現性は、ＨＣＰ含有量についてＤＳを解析する場合に特に重要であり、本明細書で説明する技術はかなり再現性があることがわかった（図１１）。例えば、上述の最適化された方法におけるＨＣＰの同定は、複製物試料間で最大でも４％変化する。図１２によって示されるように、異なる技術または試料調製物の間でさえも、著しく広範囲に重複していた。ＦＡＩＭＳを使用せずに検出されたプロテインＡ枯渇天然消化物試料に特有の６３個のタンパク質は、試料をＦＡＩＭＳで１回、およびＦＡＩＭＳなしで１回実行した後に得られた同定を組み合わせることによって、最大数のＨＣＰを得ることができることを示している。これらの結果はまた、文献で報告されたものとよく一致し、最適化されたプロトコルを使用して、Ｈｕａｎｇら、上記参照によって報告された６０個のタンパク質のうち５９個を同定した（図９Ｅ）。複製物とプロトコルとの間のこの一貫性は、バイオ医薬品の製造中のＨＣＰの日常的な分析におけるこれらの技術の使用についての強力な支持を提供する。

【0283】

この多因子アプローチ（図１３に示される）は、まず、プロテインＡカラムで抗体の試料を枯渇させ、次いで、任意の残存抗体を沈殿させながらＨＣＰを特異的に消化し、最後に、ＨＣＰの日常的な分析に必要な単純さおよびハイスループットを維持しながら単一の方法よりも１桁深い分析深度を可能にする高電場非対称波形イオン移動度分光法（ＦＡＩＭＳ）を使用したショットガンプロテオミクスおよび補償電圧（ＣＶ）切り替えを介してスペクトルの複雑性を低減させる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【手続補正書】

【提出日】2022-06-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022551756000001.app

【国際調査報告】