2022-551813 麻疹に対する併用抗ウイルス療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-14

(54)【発明の名称】麻疹に対する併用抗ウイルス療法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20221207BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221207BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221207BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221207BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221207BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 39/21 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20221207BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20221207BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221207BHJP

   C07K 14/115 20060101ALN20221207BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K39/155

A61K39/21

A61P31/14

A61P31/18

A61K47/54

A61K47/60

A61K47/65

C07K14/115

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022515099

(86)(22)【出願日】2020-09-04

(85)【翻訳文提出日】2022-05-02

(86)【国際出願番号】 US2020049473

(87)【国際公開番号】W WO2021046398

(87)【国際公開日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】62/988,286

(32)【優先日】2020-03-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/009,883

(32)【優先日】2020-04-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/895,752

(32)【優先日】2019-09-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501306715

【氏名又は名称】ザ トラスティース オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク

(71)【出願人】

【識別番号】517235188

【氏名又は名称】コーネル ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ポロット、マッテオ

(72)【発明者】

【氏名】モスコーナ、アン

(72)【発明者】

【氏名】アラビ、クリストファー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

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4B065CA44

4C076BB16

4C076BB27

4C076CC06

4C076DD41

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4C076DD70

4C076EE23

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA03

4C085BA57

4C085BB11

4C085CC08

4C085GG04

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA57

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書に記載されているのは、Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドに結合した膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）を含む抗ウイルスペプチド複合体により麻疹又はＨＩＶ感染を治療するペプチド、組成物、及び方法である。また本明細書に記載されているのは、単独で又は本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体と併用して投与することができる可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質、その組成物、及び前記安定化Ｆタンパク質による麻疹感染を予防する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）とＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）とを含む抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項2】

膜局在化部分領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項3】

前記膜局在化部分領域は、コレステロール、トコフェロール、及びパルミチルからなる群から選択される膜局在化部分を含む、請求項２に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項4】

前記膜局在化部分領域は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している、請求項２に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項5】

リンカー領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項6】

前記リンカー領域がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項7】

前記ＰＥＧが４エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ４）である、請求項６に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項8】

前記ＰＥＧが１１エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ１１）である、請求項６に記載のペプチド複合体。

【請求項9】

前記リンカー領域は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している、請求項５に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項10】

膜局在化部分領域及びリンカー領域をさらに含む、請求項１に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項11】

前記リンカー領域は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合しており、前記膜局在化部分領域は、前記リンカー領域に結合している、請求項１０に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項12】

前記リンカー領域がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１１に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項13】

前記ＰＥＧが４エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ４）である、請求項１２に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項14】

前記ＰＥＧが１１エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ１１）である、請求項１２に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項15】

前記抗ウイルスペプチドが、前記ＦＩＰ領域及び前記ＨＲＣペプチド領域の二量体を含む、請求項５～請求項１４のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項16】

前記抗ウイルスペプチドが、前記リンカー領域に結合した第１のＦＩＰ－ＨＲＣペプチド及び前記リンカー領域に結合した第２のＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含む、請求項１５に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項17】

前記ペプチドが、セリン－グリシンリンカーをさらに含む、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項18】

前記セリン－グリシンリンカーが、前記ＦＩＰと前記ＨＲＣペプチドとの間に位置する、請求項１７に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項19】

前記セリン－グリシンリンカーが、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に位置する、請求項１８に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項20】

前記セリン－グリシンリンカーが、前記ＦＩＰ領域と前記ＨＲＣペプチド領域との間に位置し、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＨＲＣペプチド領域のＣ末端に位置する第２のセリン－グリシンリンカーをさらに含む、請求項１９に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項21】

前記セリン－グリシンリンカーが、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む、請求項１７～請求項２０のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項22】

前記ＦＩＰの第１のフェニルアラニン残基が、Ｄ－アミノ酸である、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項23】

前記ペプチドのＮ末端が、ベンジルオキシカルボニル基をさらに含む、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項24】

前記ＦＩＰペプチドが、アミノ酸配列ＦＦＧを含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項25】

前記ＨＲＣペプチドが、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項26】

前記ＨＲＣペプチド複合体が、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮを含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項27】

前記抗ウイルスペプチドが、アミノ酸配列ＦＦＧＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項28】

前記抗ウイルスペプチドが、アミノ酸配列ＦＦＧＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮを含む、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項29】

請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体を含むナノ粒子。

【請求項30】

前記ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する、請求項２９に記載のナノ粒子。

【請求項31】

請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体を含む組成物。

【請求項32】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を含む予防用組成物であって、前記抗麻疹ウイルスペプチド複合体が、麻疹ウイルスの膜融合を防止する、予防用組成物。

【請求項33】

膜融合阻害（ＦＩＰ）ペプチドとＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）とを含むナノ粒子。

【請求項34】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッド（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を、必要としている対象に投与することを含む、感染後の麻疹の予防方法。

【請求項35】

前記抗ウイルスペプチド複合体が、リンカー領域をさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記抗ウイルスペプチド複合体が、膜局在化部分領域をさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記抗ウイルスペプチド複合体が、リンカー領域及び膜局在化部分領域をさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

前記投与が、鼻腔内吸入又は経口吸入を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項39】

前記抗ウイルスペプチド複合体が、ネブライザー、エアロゾル装置、及び吸入器からなる群から選択されるデバイスを介して投与される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記投与が、皮下投与を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項41】

前記対象が、野生型膜融合糖タンパク質を含む麻疹ウイルスに曝露されている、請求項３４に記載の方法。

【請求項42】

前記対象が、Ｎ４６２Ｋ、Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、Ｅ４５５Ｇ、Ｅ１７０Ｇ、Ｇ５０６Ｅ、Ｍ３３７Ｌ、Ｄ５３８Ｇ、Ｇ１６８Ｒ、Ｓ２６２Ｇ、Ａ４４０Ｐ、Ｒ５２０Ｃ、及びＬ５５０Ｐからなる群から選択される膜融合糖タンパク質の１又は複数の変異を含む麻疹ウイルスに曝露されている、請求項３４に記載の方法。

【請求項43】

Ｅ４４５Ｇ変異を含む可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質を含む組換えタンパク質。

【請求項44】

Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇの二重変異を含む可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質を含む組換えタンパク質。

【請求項45】

配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。

【請求項46】

配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。

【請求項47】

請求項４３～請求項４６に記載の組換えタンパク質のいずれか１つを含む免疫原性組成物。

【請求項48】

請求項４７に記載の免疫原性組成物を対象に投与することにより、麻疹曝露の前に麻疹感染を予防する方法。

【請求項49】

請求項４７に記載の免疫原性組成物を対象に投与することにより、麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。

【請求項50】

配列番号１又は２のアミノ酸配列を含み、請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体をさらに含む免疫原性組成物。

【請求項51】

請求項４７に記載の免疫原性組成物を対象に投与し、請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の抗ウイルスペプチド複合体を含む免疫原性組成物をさらに投与することにより、麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。

【請求項52】

配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生する方法。

【請求項53】

配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生する方法。

【請求項54】

配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現する細胞株。

【請求項55】

配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現する細胞株。

【請求項56】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体であって、前記ＨＲＣペプチドはＨＩＶ－ｇｐ４１（Ｃ３４）に由来する、抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項57】

前記ＨＲＣペプチドが、アミノ酸配列ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬを含む、請求項５６に記載の抗ウイルスペプチド複合体。

【請求項58】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を、必要としている対象に投与することを含む、感染後のＨＩＶの予防方法。

【請求項59】

前記ＨＲＣペプチドが、ＨＩＶ－ｇｐ４１（Ｃ３４）に由来する、請求項５８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１９年９月４日に出願された米国特許出願第６２／８９５，７５２号、２０２０年３月１１日に出願された米国特許出願第６２／９８８，２８６号、及び２０２０年４月１４日に出願された米国特許出願第６３／００９，８８３号の利益及び優先権を主張し、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0002】

本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。これらの文献の全体の開示は、参照により本出願に組み込まれる。

【0003】

本開示には、著作権保護の対象となる資料が含まれる。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイル又は記録に記載されている特許文書又は特許開示のいずれかによる複写に異議を唱えるものではないが、それ以外の場合は全ての著作権を留保する。

【0004】

政府の支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金ＮＳ０９１２６３、ＮＳ１０５６９９、ＡＩ１２１３４９、及びＡＩ１１９７６２に基づいて政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0005】

麻疹（はしか）は依然として世界的な健康における課題である。麻疹ワクチンは１９６３年に導入されたが、感染した個人に対するＦＤＡ承認の抗ウイルス治療はない。現在のアプローチは、麻疹ウイルス（「ＭＶ」又は「ＭｅＶ」）が宿主細胞に膜融合して侵入するのを防ぐ能力に限界がある。現在の勧告では、曝露から７２時間以内にワクチン又は免疫グロブリン（ＩＧ）を投与することを推奨している。抗ウイルス化合物は、ウイルスの複製を防止したり、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを阻止したりするなど、ウイルス活性の様々な構成要素を標的にし得る。

【発明の概要】

【0006】

特定の態様では、本明細書に記載の発明は、Ｃ末端ヘプタッドリピート（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）（ＨＲＣ）ペプチド及び膜融合阻害剤ペプチド（ＦＩＰ）の併用を含む抗ウイルスペプチドに関する。予想外に、ＨＲＣ及びＦＩＰの併用は、どちらかのアプローチのみよりも効果的であることから、相乗作用を示した。同時に、この併用により、ＭｅＶの活性化を防ぎ、既に活性化されたウイルスのリフォールディング及び膜融合を阻止する。

【0007】

一態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を提供する。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜局在化部分領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分領域は、コレステロール、トコフェロール、及びパルミチルからなる群から選択される膜局在化部分を含む。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分領域は、ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、さらにリンカー領域を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー領域は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが４エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_４）である。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが１１エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_１１）である。いくつかの実施形態では、前記リンカー領域は、ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜局在化部分領域及びリンカー領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー領域は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合しており、前記膜局在化部分領域は、前記リンカー領域に結合している。いくつかの実施形態では、前記リンカー領域は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが４エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_４）である。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが１１エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_１１）である。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが１２エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_１２）である。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧが１４エチレングリコール単位の長さ（ＰＥＧ_１４）である。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチドが、前記ＦＩＰ領域及び前記ＨＲＣペプチド領域の二量体を含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチドが、前記リンカー領域に結合した第１のＦＩＰ－ＨＲＣペプチド及び前記リンカー領域に結合した第２のＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ペプチドはさらにセリン－グリシンリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーが、前記ＦＩＰと前記ＨＲＣペプチドとの間に位置する。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーはＨＲＣペプチドのＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーが、前記ＦＩＰ領域と前記ＨＲＣペプチド領域との間に位置し、前記ＨＲＣペプチド領域のＣ末端に位置する第２のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体のＦＩＰの最初のフェニルアラニン残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体のＮ末端は、さらにベンジルオキシカルボニル基を含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰペプチドは、アミノ酸配列ＦＦＧを含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチド複合体は、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチドは、アミノ酸配列ＦＦＧＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチドは、アミノ酸配列ＦＦＧＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮを含む。

【0008】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかを含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの間の直径を有する。

【0009】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかを含む組成物を提供する。

【0010】

別の態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を含む予防用組成物であって、前記抗ウイルスペプチド複合体が、麻疹ウイルスの膜融合を防止する、予防用組成物を提供する。

【0011】

別の態様では、本発明は、膜融合阻害（ＦＩＰ）ペプチドとＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）とを含むナノ粒子を提供する。

【0012】

別の態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を、必要としている対象に投与することを含む、感染後の麻疹の予防方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、さらにリンカー領域を含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜局在化部分領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体が、リンカー領域及び膜局在化部分領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記投与が、鼻腔内吸入又は経口吸入を含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体が、ネブライザー、エアロゾル装置、及び吸入器からなる群から選択されるデバイスを介して投与される。いくつかの実施形態では、前記投与が皮下投与を含む。いくつかの実施形態では、前記対象が、野生型膜融合糖タンパク質を含む麻疹ウイルスに曝露されている。いくつかの実施形態では、前記対象が、Ｎ４６２Ｋ、Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、Ｅ４５５Ｇ、Ｅ１７０Ｇ、Ｇ５０６Ｅ、Ｍ３３７Ｌ、Ｄ５３８Ｇ、Ｇ１６８Ｒ、Ｓ２６２Ｇ、Ａ４４０Ｐ、Ｒ５２０Ｃ、及びＬ５５０Ｐからなる群から選択される膜融合糖タンパク質の１又は複数の変異を含む麻疹ウイルスに曝露されている。

【0013】

別の態様では、本発明は、Ｅ４４５Ｇ変異を含む可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質を含む組換えタンパク質を提供する。

【0014】

別の態様では、本発明は、Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇの二重変異を含む可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質を含む組換えタンパク質を提供する。

【0015】

別の態様では、本発明は、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を提供する。

【0017】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の組換えタンパク質のいずれか１つを含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、前記免疫原性組成物を対象に投与することにより、麻疹曝露の前に麻疹感染を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、前記免疫原性組成物を対象に投与することにより、麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0018】

別の態様では、本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含み、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかをさらに含む免疫原性組成物を提供する。

【0019】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に投与すること、及び本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかをさらに投与することによって、麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0020】

別の態様では、本発明は、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生する方法を提供する。

【0021】

別の態様では、本発明は、配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生する方法を提供する。

【0022】

別の態様では、本発明は、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現する細胞株を提供する。

【0023】

別の態様では、本発明は、配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を発現する細胞株を提供する。

【0024】

別の態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体であって、前記ＨＲＣペプチドはＨＩＶ－ＧＰ４１（Ｃ３４）に由来する、抗ウイルスペプチド複合体を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、アミノ酸配列ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬを含む。

【0025】

別の態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド（ＦＩＰ－ＨＲＣ）を含む抗ウイルスペプチド複合体を、必要としている対象に投与することを含む、感染後のＨＩＶの予防方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、ＨＩＶ－ＧＰ４１（Ｃ３４）由来である。

【図面の簡単な説明】

【0026】

本特許又は出願ファイルには、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。ＰＣＴ特許出願の要件に準拠するために、本明細書に示される図の多くは、元々カラーで作成された画像の白黒表示である。

【0027】

【図1】図１は、ＭＶ感染が気道で始まることを示した図である。

【0028】

【図2】図２は、ウイルス血症及びＭＶ病因の放出を示した図である。

【0029】

【図3】図３は、麻疹が重篤な合併症も引き起こし得ることを示した図である。

【0030】

【図4】図４は、ＭＶ脳炎を有するＨＩＶ感染患者のデータを示した図である。

【0031】

【図5】図５は、麻疹ウイルスの概略図を示した図である。

【0032】

【図6】図６は、２人の患者のＭＶ Ｆ遺伝子が同じヌクレオチド変異を含んでいたことを示した図である。

【0033】

【図7】図７は、ＣＮＳへの野生型麻疹ウイルス侵入が厳密に制御されていることを示した図である。

【0034】

【図8】図８は、膜融合複合体分析の方法論を示した図である。

【0035】

【図9A】図９Ａ～図９Ｃは、膜融合のレベルを示した図である。図９Ａ及び図９Ｂは、公知の受容体の存在下で、全てのＦタンパク質が同様のレベルの膜融合を示すことを示した図である。図９Ｃは、Ｆ Ｌ４５４Ｗが公知の受容体の非存在下で膜融合を誘導することを示した図である。

【図9B】図９Ａ～図９Ｃは、膜融合のレベルを示した図である。図９Ａ及び図９Ｂは、公知の受容体の存在下で、全てのＦタンパク質が同様のレベルの膜融合を示すことを示した図である。図９Ｃは、Ｆ Ｌ４５４Ｗが公知の受容体の非存在下で膜融合を誘導することを示した図である。

【図9C】図９Ａ～図９Ｃは、膜融合のレベルを示した図である。図９Ａ及び図９Ｂは、公知の受容体の存在下で、全てのＦタンパク質が同様のレベルの膜融合を示すことを示した図である。図９Ｃは、Ｆ Ｌ４５４Ｗが公知の受容体の非存在下で膜融合を誘導することを示した図である。

【0036】

【図10】図１０は、Ｆタンパク質の２つの熱状態を示した図である。

【0037】

【図11】図１１は、組換えウイルスによって誘導される細胞間膜融合を示した図である。

【0038】

【図12】図１２は、野生型麻疹Ｆウイルス及びＬ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスに感染した９０日齢の脳オルガノイドを示した図である。

【0039】

【図13】図１３は、マウス（受容体なし）からのエクスビボ組織を示した図である。

【0040】

【図14】図１４は、コットンラットにおけるＭＶデータを示した図である。

【0041】

【図15A】図１５Ａ及び図１５Ｂは、マウスにおける生存率データを示した図である。

【図15B】図１５Ａ及び図１５Ｂは、マウスにおける生存率データを示した図である。

【0042】

【図16】図１６は、治療標的としてのウイルス侵入を示した図である。

【0043】

【図17】図１７は、Ｆ糖タンパク質由来ペプチドを示した図である。

【0044】

【図18】図１８は、Ｆ糖タンパク質由来ペプチドがウイルス侵入を阻害することを示した図である。

【0045】

【図19】図１９は、ＨＲＣペプチドの脂質膜に対する標的化を示した図である。

【0046】

【図20】図２０は、Ｆタンパク質に対するＨＲＣペプチドの結合活性の改善を示した図である。

【0047】

【図21】図２１は、ＨＲＣペプチドの脂質膜に対する標的化の別の実施形態を示した図である。

【0048】

【図22A】図２２Ａ及び図２２Ｂは、共役ペプチドがインビボで強力であることを示した図である。使用したモデルは、図２２Ａのコットンラット及び図２２ＢのＳＬＡＭ：ＩＦＮＡＲＫＯマウスである。

【図22B】図２２Ａ及び図２２Ｂは、共役ペプチドがインビボで強力であることを示した図である。使用したモデルは、図２２Ａのコットンラット及び図２２ＢのＳＬＡＭ：ＩＦＮＡＲＫＯマウスである。

【0049】

【図23A】図２３Ａ～２３Ｃは、ＭＶ ＨＲＣ４ペプチドがエクスビボでのウイルス拡散を阻止することを示した図である。

【図23B】図２３Ａ～２３Ｃは、ＭＶ ＨＲＣ４ペプチドがエクスビボでのウイルス拡散を阻止することを示した図である。

【図23C】図２３Ａ～２３Ｃは、ＭＶ ＨＲＣ４ペプチドがエクスビボでのウイルス拡散を阻止することを示した図である。

【0050】

【図24】図２４は、ＭＶ ＨＲＣ４の鼻腔内投与が、Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスによる致死的感染から乳児マウスを保護することを示した図である。

【0051】

【図25】図２５は、ペプチド粒子径がナノモルの範囲内にあることを示した図である。

【0052】

【図26】図２６は、両親媒性構造が自己集合及びナノ粒子形成を促進することを示した図である。

【0053】

【図27】図２７は、ペプチドを保持した脂質膜界面で、ナノ粒子が集合（分散）することを示した図である。

【0054】

【図28】図２８は、ナノ粒子がＨＡＥバリアを通過可能であり、インビボで生物学的に利用可能であることを示した図である。関連する感染部位に到達することにより、これらは麻疹ウイルスの増殖を防ぐ。

【0055】

【図29】図２９は、共役ペプチドが６ｍｇ／ｋｇの鼻腔内投与経路でコットンラットモデルの生体内分布を改善したことを示した図である。

【0056】

【図30】図３０は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）が膜融合タンパク質に結合し、麻疹Ｆタンパク質の膜融合前状態を安定化させる併用戦略を示した図である。

【0057】

【図31】図３１は、アイソボログラム曲線がＦＩＰペプチド及びＨＲＣペプチド間の相乗作用を示すことを示した図である。

【0058】

【図32】図３２は、ＨＲＣ領域にＦＩＰを添加すると抗ウイルス活性が高まることを示した図である。

【0059】

【図33】図３３は、ＦＩＰ及びＨＲＣが同じ構造にある場合、効力は、一緒に加えられた２つの阻害剤の相乗作用を超えることを示した図である。

【0060】

【図34】図３４は、ＦＩＰ及びＨＲＣが同じ構造にある場合、効力は、一緒に加えられた２つの阻害剤の相乗作用を超えることの追加データを示した図である。

【0061】

【図35】図３５は、ＨＲＣ領域にＦＩＰを添加すると抗ウイルス活性が高まることを示した図である。

【0062】

【図36】図３６は、ＨＲＣ領域にＦＩＰを添加すると抗ウイルス活性が高まることの追加データを示した図である。

【0063】

【図37】図３７は生存率を示した図である。

【0064】

【図38】図３８は、様々なＭＶを示した図である。

【0065】

【図39】図３９は、ＭＶ ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤がヒト運動ニューロンのＭＶ野生型感染を阻止することを示した図である。

【0066】

【図40】図４０は、ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤対野生型及びＣＮＳ適応ウイルスを示した図である。

【0067】

【図41】図４１は、ヒト運動ニューロンにおけるＭＶ ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤対ＣＮＳ適応ＭＶを示した図である。

【0068】

【図42A】図４２Ａ及び図４２Ｂは、侵入の工程を示した図である。

【図42B】図４２Ａ及び図４２Ｂは、侵入の工程を示した図である。

【0069】

【図43A】図４３Ａ～図４３Ｃも、侵入の工程を示した図である

【図43B】図４３Ａ～図４３Ｃも、侵入の工程を示した図である

【図43C】図４３Ａ～図４３Ｃも、侵入の工程を示した図である。

【0070】

【図44A】図４４Ａ～図４４Ｃは、Ｈ－Ｆ相互作用がＬ４５４Ｗ Ｆにおいて変えられていることを示した図である。

【図44B】図４４Ａ～図４４Ｃは、Ｈ－Ｆ相互作用がＬ４５４Ｗ Ｆにおいて変えられていることを示した図である。

【図44C】図４４Ａ～図４４Ｃは、Ｈ－Ｆ相互作用がＬ４５４Ｗ Ｆにおいて変えられていることを示した図である。

【0071】

【図45】図４５は、ＭＶ ＨＲＣ４の鼻腔内投与がＩＦＮＡＲ ＫＯマウスを致死的なＭＶ脳炎から保護することを示した図である。

【0072】

【図46】図４６は、多能性幹細胞から増殖され得る様々なオルガノイド及び使用される発生シグナルの概略図を示した図である。

【0073】

【図47A】図４７Ａ～図４７Ｃは、多能性幹細胞から生成された「ミニ脳」を示した図である。図４７Ａは、神経前駆細胞（ＳＯＸ２、赤）及びニューロン（ＴＵＪ１、緑）を含む不均一な領域を有する複雑な形態が認められることを示した図である。図４７Ｂは、パターン化されたネフロンを有する多能性幹細胞から成長した腎臓オルガノイド全体の免疫蛍光画像を示した図である。形成中の糸球体（ＮＰＨＳ１、黄色）、初期近位尿細管（ロータステトラゴノロバス（ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン、ピンク色）、及び遠位尿細管／集合管（Ｅ－カドヘリン、緑色）の有足細胞。図４７Ｃは、基底細胞（緑色）、アクチン細胞骨格（赤色）、及び核（青色）の中間径フィラメントについて染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ヒトａＳＣ由来肺オルガノイドの中央部の３Ｄ再構成を示した図である。

【図47B】図４７Ａ～図４７Ｃは、多能性幹細胞から生成された「ミニ脳」を示した図である。図４７Ａは、神経前駆細胞（ＳＯＸ２、赤）及びニューロン（ＴＵＪ１、緑）を含む不均一な領域を有する複雑な形態が認められることを示した図である。図４７Ｂは、パターン化されたネフロンを有する多能性幹細胞から成長した腎臓オルガノイド全体の免疫蛍光画像を示した図である。形成中の糸球体（ＮＰＨＳ１、黄色）、初期近位尿細管（ロータステトラゴノロバス（ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン、ピンク色）、及び遠位尿細管／集合管（Ｅ－カドヘリン、緑色）の有足細胞。図４７Ｃは、基底細胞（緑色）、アクチン細胞骨格（赤色）、及び核（青色）の中間径フィラメントについて染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ヒトａＳＣ由来肺オルガノイドの中央部の３Ｄ再構成を示した図である。

【図47C】図４７Ａ～図４７Ｃは、多能性幹細胞から生成された「ミニ脳」を示した図である。図４７Ａは、神経前駆細胞（ＳＯＸ２、赤）及びニューロン（ＴＵＪ１、緑）を含む不均一な領域を有する複雑な形態が認められることを示した図である。図４７Ｂは、パターン化されたネフロンを有する多能性幹細胞から成長した腎臓オルガノイド全体の免疫蛍光画像を示した図である。形成中の糸球体（ＮＰＨＳ１、黄色）、初期近位尿細管（ロータステトラゴノロバス（ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン、ピンク色）、及び遠位尿細管／集合管（Ｅ－カドヘリン、緑色）の有足細胞。図４７Ｃは、基底細胞（緑色）、アクチン細胞骨格（赤色）、及び核（青色）の中間径フィラメントについて染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ヒトａＳＣ由来肺オルガノイドの中央部の３Ｄ再構成を示した図である。

【0074】

【図48】図４８は、経時的な麻疹の症例報告数を示した図である。

【0075】

【図49】図４９は、麻疹ウイルスの概略図を示した図である。

【0076】

【図50】図５０は、細胞への麻疹ウイルス侵入を示した図である。

【0077】

【図51】図５１は、細胞への麻疹ウイルス侵入の工程を示した図である。

【0078】

【図52】図５２は、見込みのある治療標的としての麻疹ウイルス侵入を示した図である。

【0079】

【図53】図５３は、麻疹膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）の構造を示した図である。

【0080】

【図54】図５４は、麻疹ウイルスが細胞に侵入するのを防ぐための併用戦略を示した図である。

【0081】

【図55】図５５は、脂質－ペプチド複合体の設計を示した図である。

【0082】

【図56】図５６は、脂質－ペプチド複合体の利点を示した図である。

【0083】

【図57】図５７及び図５８は、脂質－ペプチド構造の例を示した図である。

【図58】図５７及び図５８は、脂質－ペプチド構造の例を示した図である。

【0084】

【図59】図５９及び図６０は、単量体脂質－ペプチド複合体合成の反応スキームを示した図である。

【図60】図５９及び図６０は、単量体脂質－ペプチド複合体合成の反応スキームを示した図である。

【0085】

【図61】図６１は、脂質－ペプチド複合体のリストを示した図である。

【0086】

【図62】図６２は、脂質－ペプチド複合体の精製及び特性データを示した図である。

【0087】

【図63】図６３は、βガラクトシダーゼ相補性に基づく膜融合アッセイのプロセスを示した図である。

【0088】

【図64】図６４は、膜融合アッセイにおける麻疹脂質－ペプチド複合体の阻害活性のデータを示した図である。

【0089】

【図65】図６５は、膜融合アッセイデータからの阻害活性に基づく最良の脂質－ペプチド複合体候補を示した図である。

【0090】

【図66】図６６は、ＭＴＴ細胞毒性アッセイのプロセスを示した図である。

【0091】

【図67】図６７は、ＭＴＴアッセイデータを示した図である。

【0092】

【図68】図６８は、麻疹膜融合タンパク質の熱安定性研究のプロセスを示した図である。

【0093】

【図69】図６９は、麻疹膜融合タンパク質の熱安定性研究からのデータを示した図である。

【0094】

【図70】図７０は、麻疹脂質－ペプチド複合体のＦ安定化特性を示した図である。

【0095】

【図71】図７１は、麻疹脂質－ペプチド複合体のＦ安定化特性に基づく最良の脂質－ペプチド複合体候補を示した図である。

【0096】

【図72】図７２は、膜融合活性化の各段階を定量化することを示した図である。

【0097】

【図73】図７３～図７５は、様々な濃度の異なる脂質－ペプチド複合体の存在下での赤血球（ＲＢＣ）への麻疹ウイルス結合活性を示した図である（図７３：ＨＲＣ；図７４：ＦＩＰ－ＨＲＣ；図７５：ＦＩＰ）。

【図74】図７３～図７５は、様々な濃度の異なる脂質－ペプチド複合体の存在下での赤血球（ＲＢＣ）への麻疹ウイルス結合活性を示した図である（図７３：ＨＲＣ；図７４：ＦＩＰ－ＨＲＣ；図７５：ＦＩＰ）。

【図75】図７３～図７５は、様々な濃度の異なる脂質－ペプチド複合体の存在下での赤血球（ＲＢＣ）への麻疹ウイルス結合活性を示した図である（図７３：ＨＲＣ；図７４：ＦＩＰ－ＨＲＣ；図７５：ＦＩＰ）。

【0098】

【図76】図７６は、麻疹脂質－ペプチド複合体のインビボ有効性の概略図を示した図である。

【0099】

【図77】図７７は、麻疹脂質－ペプチド複合体のインビボ有効性のデータを示した図である。

【0100】

【図78】図７８は、麻疹脂質－ペプチド複合体の粒子径測定データを示した図である。

【0101】

【図79】図７９は、脂質－ペプチド複合体間の相互作用の概略図を示した図である。

【0102】

【図80】図８０は、アイソボログラム分析からのデータを示した図である。

【0103】

【図81】図８１は、アイソボログラム分析の定量化を示した図である。

【0104】

【図82】図８２は、麻疹膜融合阻害複合体の作用機序の概略図を示した図である。

【0105】

【図83】図８３は、異なる脂質－ペプチド複合体の様々な設計の概略図を示した図である。

【0106】

【図84】図８４は、インビボ有効性データを示した図である。

【0107】

【図85A】図８５Ａ～図８５Ｃは、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示した図である。

【図85B】図８５Ａ～図８５Ｃは、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示した図である。

【図85C】図８５Ａ～図８５Ｃは、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示した図である。

【0108】

【図86】図８６は、ＦＩＰ－ＨＲＣが麻疹Ｆを膜融合前状態で安定させることを示した図である。

【0109】

【図87】図８７は、ＭｅＶペプチドのＦ安定化特性を示した図である。

【0110】

【図88】図８８～図９０は、可溶性Ｆに対するＭｅＶペプチドの安定化特性を示した図である。

【図89】図８８～図９０は、可溶性Ｆに対するＭｅＶペプチドの安定化特性を示した図である。

【図90】図８８～図９０は、可溶性Ｆに対するＭｅＶペプチドの安定化特性を示した図である。

【0111】

【図91】図９１は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＦ活性化を防ぐことを示した図である（Ｆリフォールディングを防ぐＨＲＣとは全く異なるメカニズム）。

【0112】

【図92】図９２は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭｅＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示した図である。

【0113】

【図93】図９３は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭｅＶ Ｆ発現細胞を標的とすることを実証する３つの異なる実験からのデータを示した図である。

【0114】

【図94】図９４は、ＭｅＶペプチドの安定化特性を示した図である。

【0115】

【図95】図９５は、ＭｅＶペプチドの細胞毒性を示した図である。

【0116】

【図96】図９６は、ＨＲＣ＋ＦＩＰ複合体のアイソボログラム分析からの相乗作用データを示した図である。

【0117】

【図97】図９７は、麻疹ＨＲＣに由来する１２個のアミノ酸を含むＦＩＰ－ＨＲＣの効力を示した図である。

【0118】

【図98】図９８は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＢＧ５０５（ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）株）の阻害データを示した図である。

【0119】

【図99】図９９は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＢ４１（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示した図である。

【0120】

【図100】図１００は、様々脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用した１６０５５（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示した図である。

【0121】

【図101】図１０１は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＭＮ（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示した図である。

【0122】

【図102】図１０２は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の阻害データを示した図である。

【0123】

【図103】図１０３は、様々な脂質－ペプチド複合体を使用したマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の阻害データを示した図である。

【0124】

【図104A】図１０４Ａ及び図１０４Ｂは、ＣＮＳ適応ウイルスからのＦタンパク質内の置換の位置を示した図である。

【図104B】図１０４Ａ及び図１０４Ｂは、ＣＮＳ適応ウイルスからのＦタンパク質内の置換の位置を示した図である。

【0125】

【図105A】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105B】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105C】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105D】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105E】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105F】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105G】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105H】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【図105I】図１０５Ａ～図１０５Ｉは、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示した図である。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。

【0126】

【図106A】図１０６Ａ～図１０６Ｄは、ＣＮＳ適応ＭｅＶバリアントが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドに効率的に広がることを示した図である。

【図106B】図１０６Ａ～図１０６Ｄは、ＣＮＳ適応ＭｅＶバリアントが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドに効率的に広がることを示した図である。

【図106C】図１０６Ａ～図１０６Ｄは、ＣＮＳ適応ＭｅＶバリアントが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドに効率的に広がることを示した図である。

【図106D】図１０６Ａ～図１０６Ｄは、ＣＮＳ適応ＭｅＶバリアントが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドに効率的に広がることを示した図である。

【0127】

【図107A】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107B】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107C】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107D】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107E】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107F】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107G】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【図107H】図１０７Ａ～図１０７Ｈは、Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドでの追加の変異がＦタンパク質の膜融合前状態を安定させるという、示された変異を有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示した図である。

【0128】

【図108】図１０８は、感受性の高いＣＤ１５０×ＩＦＮＡＲＫＯ ＣＮＳにおけるＬ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスの拡散の阻害を示した図である。

【0129】

【図109A】図１０９Ａ及び図１０９Ｂは、野生型ＭｅＶと比較したマウス脳切片培養におけるＭｅＶ Ｆ Ｌ４５４Ｗによるインターフェロン刺激遺伝子の誘導を示した図である。

【図109B】図１０９Ａ及び図１０９Ｂは、野生型ＭｅＶと比較したマウス脳切片培養におけるＭｅＶ Ｆ Ｌ４５４Ｗによるインターフェロン刺激遺伝子の誘導を示した図である。

【0130】

【図110A】図１１０Ａ及び図１１０Ｂは、膜融合阻害剤の存在下でのヒト脳オルガノイドの感染を示した図である。

【図110B】図１１０Ａ及び図１１０Ｂは、膜融合阻害剤の存在下でのヒト脳オルガノイドの感染を示した図である。

【0131】

【図111A】図１１１Ａ及び図１１１Ｂは、膜融合タンパク質変異体ＭｅＶに感染した脳オルガノイドにおける宿主抗ウイルス遺伝子の誘導を示した図である。

【図111B】図１１１Ａ及び図１１１Ｂは、膜融合タンパク質変異体ＭｅＶに感染した脳オルガノイドにおける宿主抗ウイルス遺伝子の誘導を示した図である。

【0132】

【図112】図１１２は、脳オルガノイド及びＢｒａｉｎＳｐａｎアトラス間の遺伝子レベルのＲＰＫＭ値の相関ヒートマップを示した図である。

【0133】

【図113】図１１３は、Ｌ４５４Ｗ感染時に差次的に発現する遺伝子のＫＥＧＧパスウェイ分析を示した図である。

【0134】

【図114】図１１４は、Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅ膜融合タンパク質変異体ウイルス集団のウイルス対立遺伝子の縦断的分析（ＬＡＶＡ）プロットを示した図である。

【0135】

【図115】図１１５は、Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ膜融合タンパク質変異体ウイルス集団のＬＡＶＡプロットを示した図である。

【0136】

【図116】図１１６は、野生型膜融合タンパク質ウイルス集団のＬＡＶＡプロットを示した図である。

【0137】

【図117A】図１１７Ａ～図１１７Ｅは、以下（Ａ）～（Ｅ）を示した図である。（Ａ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、１ｍＭのＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールなしの二量体）の有無にかかわらず、４℃又は５５℃で示された時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆをマウスの膜融合前特異的抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元ゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、α－ＭＶ－Ｆ－ＨＲＣビオチン（１：１０００）とインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体を二次抗体として使用した（ｐｂｓで１：１０００）。（Ｂ）（Ａ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇを、４℃、２５℃、又は３７℃で１週間インキュベートした。（Ａ）に記載されているように免疫沈降を実施した。（Ｄ）可溶性ＭｅＶ－ＦＷＴ又はＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、ＦＩＰ－ＨＲＣ、市販のＦＩＰ、ＦＩＰ二量体、又は３ｇ（１ｍＭ）の有無に関わらず、４℃又は５５℃で６０又は１２０分間インキュベートした。（Ｅ）（Ｄ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

【図117B】図１１７Ａ～図１１７Ｅは、以下（Ａ）～（Ｅ）を示した図である。（Ａ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、１ｍＭのＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールなしの二量体）の有無にかかわらず、４℃又は５５℃で示された時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆをマウスの膜融合前特異的抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元ゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、α－ＭＶ－Ｆ－ＨＲＣビオチン（１：１０００）とインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体を二次抗体として使用した（ｐｂｓで１：１０００）。（Ｂ）（Ａ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇを、４℃、２５℃、又は３７℃で１週間インキュベートした。（Ａ）に記載されているように免疫沈降を実施した。（Ｄ）可溶性ＭｅＶ－ＦＷＴ又はＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、ＦＩＰ－ＨＲＣ、市販のＦＩＰ、ＦＩＰ二量体、又は３ｇ（１ｍＭ）の有無に関わらず、４℃又は５５℃で６０又は１２０分間インキュベートした。（Ｅ）（Ｄ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

【図117C】図１１７Ａ～図１１７Ｅは、以下（Ａ）～（Ｅ）を示した図である。（Ａ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、１ｍＭのＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールなしの二量体）の有無にかかわらず、４℃又は５５℃で示された時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆをマウスの膜融合前特異的抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元ゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、α－ＭＶ－Ｆ－ＨＲＣビオチン（１：１０００）とインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体を二次抗体として使用した（ｐｂｓで１：１０００）。（Ｂ）（Ａ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇを、４℃、２５℃、又は３７℃で１週間インキュベートした。（Ａ）に記載されているように免疫沈降を実施した。（Ｄ）可溶性ＭｅＶ－ＦＷＴ又はＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、ＦＩＰ－ＨＲＣ、市販のＦＩＰ、ＦＩＰ二量体、又は３ｇ（１ｍＭ）の有無に関わらず、４℃又は５５℃で６０又は１２０分間インキュベートした。（Ｅ）（Ｄ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

【図117D】図１１７Ａ～図１１７Ｅは、以下（Ａ）～（Ｅ）を示した図である。（Ａ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、１ｍＭのＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールなしの二量体）の有無にかかわらず、４℃又は５５℃で示された時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆをマウスの膜融合前特異的抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元ゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、α－ＭＶ－Ｆ－ＨＲＣビオチン（１：１０００）とインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体を二次抗体として使用した（ｐｂｓで１：１０００）。（Ｂ）（Ａ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇを、４℃、２５℃、又は３７℃で１週間インキュベートした。（Ａ）に記載されているように免疫沈降を実施した。（Ｄ）可溶性ＭｅＶ－ＦＷＴ又はＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、ＦＩＰ－ＨＲＣ、市販のＦＩＰ、ＦＩＰ二量体、又は３ｇ（１ｍＭ）の有無に関わらず、４℃又は５５℃で６０又は１２０分間インキュベートした。（Ｅ）（Ｄ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

【図117E】図１１７Ａ～図１１７Ｅは、以下（Ａ）～（Ｅ）を示した図である。（Ａ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、１ｍＭのＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールなしの二量体）の有無にかかわらず、４℃又は５５℃で示された時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆをマウスの膜融合前特異的抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ還元ゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、α－ＭＶ－Ｆ－ＨＲＣビオチン（１：１０００）とインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体を二次抗体として使用した（ｐｂｓで１：１０００）。（Ｂ）（Ａ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）可溶性ＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇを、４℃、２５℃、又は３７℃で１週間インキュベートした。（Ａ）に記載されているように免疫沈降を実施した。（Ｄ）可溶性ＭｅＶ－ＦＷＴ又はＭｅＶ－ＦＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇは、ＦＩＰ－ＨＲＣ、市販のＦＩＰ、ＦＩＰ二量体、又は３ｇ（１ｍＭ）の有無に関わらず、４℃又は５５℃で６０又は１２０分間インキュベートした。（Ｅ）（Ｄ）で説明した実験のＷＢバンドの定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実施した。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。

【発明を実施するための形態】

【0138】

５０年以上前にワクチンが導入されたにも関わらず、麻疹（はしか）は依然として世界的な健康における課題である。感染した個人に対するＦＤＡ承認の抗ウイルス治療はなく、現在のアプローチは、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）が宿主細胞に膜融合して侵入するのを防ぐ能力に限界がある。本明細書に開示される発明の対象は、一実施形態では、異なる作用形態を標的とする２つの既存のＭｅＶ抗ウイルスアプローチの併用に関する。第１のアプローチは、ＨＲＣ由来ペプチドを使用してＭｅＶ膜融合タンパク質（Ｆ）の末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）領域を標的化することを含み、これにより、感染中のウイルス膜融合に必要な構造的再配列を妨害する（例えば、リフォールディングを防ぐ）。第２のアプローチは、膜融合阻害剤ペプチド（ＦＩＰ）を使用してＭｅＶ ＦのヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）領域を標的化することを含み、これにより、膜融合し得ない膜融合前状態でＭｅＶ Ｆを安定化する（例えば、図５２～図３２を参照）。この併用アプローチは、いくつかのインビトロ、エクスビボ、及びインビボモデルでいずれかのみのアプローチよりも効果的であることが実証されている。同時に、この併用により、ＭｅＶの活性化を防ぎ、既に活性化されたウイルスのリフォールディング及び膜融合を阻止する。

【0139】

さらに、本明細書に開示される発明の対象は、一実施形態では、感染時のウイルス膜融合に必要な構造的再配列を干渉するＨＲＣ由来ペプチドを使用して、ＭｅＶ ＦのＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）領域を標的とすることによって、及び事前に活性化された状態でＭｅＶ Ｆを安定化する膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）を使用して、ＭｅＶ ＦのヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）領域をターゲットにすることによって、麻疹ウイルスと細胞膜との膜融合及び細胞への侵入を防ぐための２つの抗ウイルス法の併用に関する。この技術は、インビトロ、エクスビボ、及びインビボで、両方のアプローチの併用がいずれかのアプローチのみよりも効果的であることを示している。

【0140】

本発明は、呼吸経路又は皮下経路のいずれかによる投与のための麻疹抗ウイルスペプチドに関する。本発明はまた、侵入を防ぐために異なるメカニズムによって作用する２つの別個のペプチドドメインの併用に関する。（１）Ｆタンパク質が活性化されて標的細胞膜に挿入されると発生するウイルス侵入のＦリフォールディング工程に重要な、麻疹Ｆタンパク質のヘプタッドリピートに相補的なペプチドドメイン（「ＨＲＣ」）。このリフォールディングは、ウイルスと細胞膜との膜融合及び侵入を引き起こすものであり、したがって、ＨＲＣペプチドがＦタンパク質に結合することによってそれをブロックすると、ウイルスの侵入及び感染が防止される。（２）Ｆタンパク質の異なる領域（例えば、ＨＲＢ領域）に結合し、事前に活性化された立体構造でＦタンパク質を安定化させ、膜融合コンピテント状態へのＦの活性化を防ぐペプチドドメイン（「ＦＩＰ」）。Ｆタンパク質が膜融合コンピテント状態に活性化されていない場合、侵入の後続の工程は起こらない。（１）及び（２）の併用により、膜融合前立体構造でＦタンパク質を膜融合コンピテントとならないように最初に安定化し、次に、膜融合するように活性化されたＦタンパク質に対して、リフォールディング及び膜融合を防止するペプチドが得られる。この併用の有効性は、インビトロ及びインビボで研究されており、どちらのアプローチのみでも著しく向上される。

【0141】

引用文献：
１． Ｐｌｅｍｐｅｒ ＲＫ， Ｓｎｙｄｅｒ ＪＰ． Ｍｅａｓｌｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ－ｃａｎ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｍａｋｅ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ． ２００９ Ａｕｇ； １０（８）： ｐｐ． ８１１－２０．
２．Ｗｏｏ ＴＭ． Ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ－ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ． ２０１６ Ｍａｒ； ３０（２）： ｐｐ． １７３－８２．
３．Ｗｅｌｓｃｈ ＪＣ， Ｔａｌｅｋａｒ Ａ， Ｍａｔｈｉｅｕ Ｃ， Ｐｅｓｓｉ Ａ， Ｍｏｓｃｏｎａ Ａ， Ｈｏｒｖａｔ Ｂ， Ｐｏｒｏｔｔｏ Ｍ． Ｆａｔａｌ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｂｒａｉｎ－ｐｅｎｅｔｒａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１３ Ｄｅｃ； ８７（２４）： ｐｐ． １３７８５－９４．
４．Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ Ｔ， Ｆｕｋｕｄａ Ｙ， Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｒ， Ｋｕｒｏｄａ Ｄ， Ｋｕｂｏｔａ Ｍ， Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ Ｙ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ， Ｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ， Ｋｏｈｄａ Ｄ， Ｐｌｅｍｐｅｒ ＲＫ， Ｙａｎａｇｉ Ｙ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１８ Ｍａｒ； １１５（１０）： ｐｐ． ２４９６－５０１．

【0142】

抗ウイルスペプチド複合体
特定の態様では、本発明は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む抗ウイルスペプチド複合体を提供する。

【0143】

麻疹ウイルスは、モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属に属するパラミクソウイルスである。直径１００～３００ｎｍの多形性ウイルスである。麻疹ゲノムは６つの遺伝子からなり、それぞれがＮ（ヌクレオカプシド）、Ｐ（リンタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）、Ｆ（膜融合タンパク質）、Ｈ（血球凝集素）、及びＬ（巨大タンパク質）と称される単一の構造タンパク質をコードしている。これらの遺伝子の１つであるリンタンパク質（Ｐ）遺伝子は、２つの非構造タンパク質（Ｖ及びＣ）もコードしている。核タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて、野生型麻疹ウイルスの異なる遺伝的系統が存在する。

【0144】

膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）
いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰは、アミノ酸配列フェニルアラニン－フェニルアラニン－グリシン（ＦＦＧ）を含む膜融合阻害ペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰは、アミノ酸配列フェニルアラニン－フェニルアラニン－グリシン（ＦＦＧ）からなる膜融合阻害ペプチドである。いくつかの実施形態では、麻疹ＦＩＰの最初のフェニルアラニン残基はＤ－アミノ酸であり、２番目のフェニルアラニン残基及びグリシン残基はＬ－アミノ酸（すなわち、Ｄ－ＦＦＧ）である。Ｄ－アミノ酸は、アミノ基の立体中心の炭素αがＤ配置を有するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰのＮ末端は、図５３に示されるようなベンジルオキシカルボニル基をさらに含む（つまり、Ｚ－Ｄ－ＦＦＧ）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰは、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰは、ＦＩＰのＣ末端にあるセリン－グリシンリンカー（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ、Ｄ－ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ、Ｚ－Ｄ－ＧＳＧＳＧ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰはＭｅＶ ＦのＨＲＢ領域に結合して、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを防ぐ。

【0145】

Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチド
いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドは、麻疹ウイルスＦタンパク質に由来する。前記ＨＲＣペプチドは、麻疹株間で保存されており、任意の麻疹株Ｆタンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、麻疹ウイルスＦタンパク質由来のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドは、麻疹ウイルス株Ｂ３に由来する。いくつかの実施形態では、前記麻疹ウイルス由来のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドは、麻疹ウイルス株Ｇ９５４に由来する。麻疹ウイルスゲノムのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列並びにそれらにコードされるタンパク質は、例えば、当業者に公知のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋ及びＶｉＰＲ（ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ）で公に入手可能であるが、これらに限定されない。

【0146】

いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、麻疹ウイルスＦタンパク質由来のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、麻疹ウイルス由来のＦタンパク質Ｃ末端ヘプタッドリピートペプチドの４５０位～４８５位の残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含む。いくつかの実施形態では前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲからなる。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、麻疹ウイルス由来のＦタンパク質Ｃ末端ヘプタッドリピートペプチドの４５０位～４６２位の残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮを含む。いくつかの実施形態では前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮからなる。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、麻疹ウイルス由来のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドの４５０位～４６３位、４６４位、４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、又は４８４位の残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、長さがＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ及びＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ間のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、当該ＨＲＣペプチド（例えば、ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ、ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ）のＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む。

【0147】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科、オルソレトロウイルス（Ｏｒｔｈｏｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ）亜科に属するレンチウイルスである。遺伝的特徴及びウイルス抗原の違いに基づいて、ＨＩＶはタイプ１及びタイプ２（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）に分類される。ＨＩＶゲノムには、外核膜のタンパク質（ＭＡ、ｐ１７）、キャプシドタンパク質（ＣＡ、ｐ２４）、ヌクレオカプシド（ＮＣ、ｐ７）、及びより小さな核酸安定化タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子が含まれている。ｇａｇリーディングフレームの後には、酵素プロテアーゼ（ＰＲ、ｐ１２）、逆転写酵素（ＲＴ、ｐ５１）、及びＲＮａｓｅ Ｈ（ｐ１５）又はＲＴ＋ＲＮａｓｅ Ｈ（共にｐ６６）及びインテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３２）をコードするｐｏｌリーディングフレームが続く。ｐｏｌ遺伝子に隣接して、ｅｎｖリーディングフレームが続き、そこから２つの外被糖タンパク質ｇｐ１２０（表面タンパク質、ＳＵ）及びｇｐ４１（膜貫通タンパク質、ＴＭ）が誘導される。構造タンパク質に加えて、ＨＩＶゲノムはいくつかの調節タンパク質をコードする。Ｔａｔ（トランスアクチベータータンパク質）及びＲｅｖ（ＲＮＡスプライシングレギュレーター）は、ＨＩＶ複製の開始に必要であるが、他の調節タンパク質Ｎｅｆ（負の調節因子）、Ｖｉｆ（ウイルス感染因子）、Ｖｐｒ（ウイルスタンパク質ｒ）、及びＶｐｕ（ウイルスタンパク質ｕ）は、ウイルス複製、ウイルス発芽、及び病因に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、前記Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドは、ＨＩＶ－１ウイルスｇｐ４１タンパク質に由来する。前記ｇｐ４１ ＨＲＣペプチドは、ＨＩＶ株間で保存されており、任意のＨＩＶ－１株ｇｐ４１に由来し得る。いくつかの実施形態では、前記ｇｐ４１ ＨＲＣペプチドは、その内容が参照により全体が本明細書に援用されるＰｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｅｎｄｏｗ Ｎａｔｕｒａｌ Ｆｕｓｉｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１２， ７（５）： ｅ３６８３３に記載されている「Ｃ３４」ペプチドである。ＨＩＶ－１ウイルスゲノムのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列並びにそれらにコードされるタンパク質は、例えば、当業者に公知のデータベースであるロスアラモス国立研究所（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＧｅｎＢａｎｋ及びＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）で公に入手可能であるが、これらに限定されない。

【0148】

いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、ＨＩＶ－ｇｐ４１（「Ｃ３４」ペプチドとしても公知）に由来する。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、ＨＩＶ－ｇｐ４１の１１７位～１５０位の残基を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬを含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、アミノ酸配列ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬからなる。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣは、ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記ＨＲＣペプチドは、当該ＨＲＣペプチド（例えば、ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ）のＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲを含むＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲからなるＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド結合は、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間及び前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬ、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰの最初のフェニルアラニン残基は、Ｄ－アミノ酸である（すなわち、Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体のＮ末端は、さらにベンジルオキシカルボニル基を含む（すなわち、Ｚ－Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを本明細書に記載のリンカー及び膜局在化部分に結合させるために使用するＣ末端システイン残基を含む（例えば、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－Ｃ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬ－Ｃ、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ）。

【0150】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＤＶＧＴＮを含むＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮからなるＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド結合は、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間及び前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰの最初のフェニルアラニン残基は、Ｄ－アミノ酸である（すなわち、Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体のＮ末端は、さらにベンジルオキシカルボニル基を含む（すなわち、Ｚ－Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを本明細書に記載のリンカー及び膜局在化部分に結合させるために使用するＣ末端システイン残基を含む（例えば、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－Ｃ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－Ｃ、ＦＦＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ）。

【0151】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬを含むＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びアミノ酸配列ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬからなるＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド結合は、１又は複数のセリン－グリシンリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、前記セリン－グリシンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧからなる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰペプチドと前記ＨＲＣペプチドとの間及び前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にセリン－グリシンリンカーを含む（例えば、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ、ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧに対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰの最初のフェニルアラニン残基は、Ｄ－アミノ酸である（すなわち、Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体のＮ末端は、さらにベンジルオキシカルボニル基を含む（すなわち、Ｚ－Ｄ－ＦＦＧ－・・・）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、前記ＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを本明細書に記載のリンカー及び膜局在化部分に結合させるために使用するＣ末端システイン残基を含む（例えば、ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－Ｃ、ＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－Ｃ、ＦＦＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ、又はＦＦＧ－ＧＳＧＳＧ－ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ－ＧＳＧＳＧ－Ｃ）。

【0152】

理論に拘束されることを意図せずに、ウイルスタンパク質がリフォールディングして膜融合後状態に到達する能力（すなわち、細胞に侵入する）は、タンパク質のＮ末端及びＣ末端に局在する２つの相補的なヘプタッドリピート（ＨＲ）領域（それぞれＨＲＮ及びＨＲＣ）間の相互作用に依存する。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ領域及びＨＲＣ領域を含む抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合タンパク質の膜融合前状態を安定化する（例えば、可逆的に結合し、膜融合タンパク質が依然として膜融合前状態にあることを示す、図７４を参照）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ領域及びＨＲＣ領域を含む抗ウイルスペプチド複合体は、麻疹膜融合タンパク質を膜融合前状態で安定化する。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ領域及びＨＲＣ領域を含む抗ウイルスペプチド複合体は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を膜融合前状態で安定化する。

【0153】

本明細書に記載されるように、前記グリシンセリンリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＧＳＧを含む。より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。一実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）ｎ、Ｇ（ＳＧ）ｎ、又はＳ（ＧＳ）ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0154】

リンカー
いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、さらにリンカーを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、生体適合性、溶解性、及び低い免疫原性又は抗原性という立証された特性に基づく成分である。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。ＰＥＧは、エチレングリコール単位の繰り返しで構成される化合物を指す。ペプチドのＰＥＧへの共有結合は、ＰＥＧ化として知られ、当技術分野で周知である。例えば、Ｔｕｒｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．， ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｄｒｕｇｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５ （２０１６， ４６０－４７５）（その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。ＰＥＧリンカー化合物は、ＰＥＧ部分及び／又はペプチドに結合した官能基結合を介してペプチドに結合することができる。生物学的に活性な分子への直鎖状ＰＥＧポリマー及び分枝状ＰＥＧポリマーを含むＰＥＧの共有結合は、結合部位として生物学的に活性な分子のアミノ基を使用して達成され得る。生物学的に活性な分子への直鎖状ＰＥＧポリマー及び分枝状ＰＥＧポリマーを含むＰＥＧの共有結合は、結合部位として生物学的に活性な分子のチオール基を使用して達成され得る。あるいは、生物学的に活性な分子自体を官能基（例えば、アミン、チオール）を含むように修飾して、直鎖状ＰＥＧポリマー及び分枝状ＰＥＧポリマーの結合部位を提供することができる。

【0155】

いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは二官能性である。二官能性ＰＥＧリンカー化合物は２つの官能基を有するため、各官能基を介して、本明細書に記載の抗ウイルスペプチドなどの２つの生物学的に活性な分子に結合して、２つの抗ウイルスペプチドを含む複合体を生成することができる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体の２つの抗ウイルスペプチドは同じである（すなわち、ホモ二価複合体）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体の２つの抗ウイルスペプチドは異なる（すなわち、ヘテロ二価複合体）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、例えば、限定されないが、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の官能基を有する分岐及び／又は多官能基を有し得る。そのような多価ＰＥＧリンカーは、各官能基を介して、本明細書に記載の抗ウイルスペプチドなどの複数の生物学的に活性な分子に結合して、複数の抗ウイルスペプチド、例えば、限定されないが、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗ウイルスペプチドを含む複合体を生成することができる。いくつかの実施形態では、前記多価抗ウイルスペプチド複合体の抗ウイルスペプチドは同じである（すなわち、ホモ多価複合体）。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体の抗ウイルスペプチドは異なる（すなわち、ヘテロ多価複合体）。本発明の多価抗ウイルスペプチド複合体は、ＦＩＰペプチド及びＨＲＣペプチドの様々な組み合わせを含み得る（例えば、限定されないが、図８３）。例えば、一実施形態では、前記多価抗ウイルスペプチド複合体は、ＦＩＰ－ＨＲＣ複合体を含み、分岐ＰＥＧリンカーにさらに結合し、任意選択的に本明細書に記載の膜局在化部分をさらに含む。ＦＩＰ－ＨＲＣ複合体は、同じでも異なっていてもよい。別の実施形態では、前記多価抗ウイルスペプチド複合体は、分岐ＰＥＧリンカーに結合し、ＨＲＣペプチドにさらに結合し、任意選択的に膜局在化部分をさらに含む複数のＦＩＰを含む。いくつかの実施形態では、前記多価抗ウイルスペプチド複合体は、分岐ＰＥＧリンカーに結合した複数のＦＩＰを含み、任意選択的にさらに膜局在化部分を含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、０～５０グリコール単位を有する。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、４グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_４）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、５グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_５）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、６グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_６）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、７グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_７）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、８グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_８）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、９グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_９）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１０グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１０）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１１グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１１）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１２グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１２）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１３グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１３）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１４グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１４）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１５グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１５）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１６グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１６）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１７グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１７）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１８グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１８）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、１９グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１９）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２０グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２０）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２１グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２１）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２２グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２２）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２３グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２３）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２４グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２４）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２５グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２５）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２６グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２６）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２７グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２７）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２８グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２８）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、２９グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_２９）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３０グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３０）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３１グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３１）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３２グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３２）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３３グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３３）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３４グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３４）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３５グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３５）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、３６グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_３６）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、５０グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_５０）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、４～１２グリコール単位を有する。いくつかの実施形態では、前記リンカーは、４～２４グリコール単位を有する。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、平均分子量が約５０００ＤａのポリエチレングリコールポリマーであるＰＥＧ５０００である。ＰＥＧ５０００は、約１１４グリコール単位を含むため、いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、約１１４グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_１１４）。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、平均分子量が約４０，０００ＤａのポリエチレングリコールポリマーであるＰＥＧ４０，０００である。ＰＥＧ４０，０００は、約９１０グリコール単位を含むため、いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧリンカーは、約９１０グリコール単位を有する（すなわち、前記リンカーはＰＥＧ_９１０）。

【0157】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、任意選択的にＰＥＧリンカーに結合した２つのＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化1】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
Ｌは１又は複数の官能基結合であり、並びに
ＰはＰＥＧ部分であり、ｎはグリコール単位数であり、ｎ＝０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）ｎ、Ｇ（ＳＧ）ｎ、又はＳ（ＧＳ）ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0158】

いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数の硫化物部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、１又は複数のチオール部分に由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分はシステインに由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のチオール部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のシステイン部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数のピロリジンジオン部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のピロリジンジオン部分は、１又は複数のマレイミド部分に由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のピロリジンジオン部分は、ＰＥＧに結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のマレイミド部分は、ＰＥＧに結合している。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記１又は複数のチオール部分を前記１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合した前記１又は複数のチオール部分を、前記ＰＥＧに結合した１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にある１又は複数のシステイン部分を、前記ＰＥＧに結合した１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。

【0159】

いくつかの実施形態では、非結合ＦＩＰ－ＨＲＣペプチドのＣ末端システイン残基はチオールで終結する（一般構造「Ｒ－ＳＨ」、ＲはＦＩＰ－ＨＲＣペプチド）。チオールとマレイミドとの間のクロスカップリング反応は、２つの成分を結合して硫化物を形成する（一般構造「Ｒ１－Ｓ－Ｒ２」、Ｒ１はＦＩＰ－ＨＲＣペプチド、Ｒ２はＰＥＧリンカー）。

【化2】

【0160】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化3】

を含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化4】

を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、任意選択的にＰＥＧリンカーに結合した２つのＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化5】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、並びに
式中、ｎ＝０～５０である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0163】

膜局在化部分／アンカー
いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを含み、膜局在化部分（本明細書ではアンカーとも称される）をさらに含む。膜局在化部分は、標的治療部位に局在化するペプチドの能力を高める任意の成分である。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分は疎水性であり（又はそうでなければ抗ウイルスペプチド複合体の疎水性を増加させる）、脂質膜にペプチドを局在化及び／又は挿入する傾向を増加させる（例えば、図５６を参照）。いくつかの実施形態では、前記膜局在部分は脂質である。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分は、コレステロール、トコフェロール、又はパルミチルである。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分は、前記抗ウイルスペプチドのＣ末端に結合している（図６１及び６４を参照）。いくつかの実施形態では、前記膜局在化部分はリンカー（例えば、ＰＥＧ４又はＰＥＧ１１）に結合され、前記リンカーは前記ペプチドのＣ末端に結合される（図６１及び６４を参照）。本発明の膜局在化部分は、前記膜局在化部分及び／又はペプチドに結合した官能基結合を介してペプチドに結合し得る。生物学的に活性な分子への膜局在化部分の共有結合は、結合部位として生物学的に活性な分子のアミノ基を使用して達成され得る。あるいは、生物学的に活性な分子自体を官能基を含むように修飾して、膜局在化部分への結合部位を提供することができる。

【0164】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、任意選択的にＰＥＧリンカーに結合され、膜局在化部分に結合したＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化6】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
Ｌは１又は複数の官能基結合であり、
ＰはＰＥＧ部分であり、ｎはグリコール単位数であり、ｎ＝０～５０であり、並びにＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0165】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化7】

を含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化8】

を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化9】

を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化10】

を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化11】

を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化12】

を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜局在化部分リンカーに結合したＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化13】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
Ｌは１又は複数の官能基結合であり、並びに
ＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0172】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化14】

を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化15】

を含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、Ｌは、

【化16】

を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化17】

を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化18】

を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化19】

を含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数の硫化物部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、１又は複数のチオール部分に由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分はシステインに由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のチオール部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のシステイン部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数のアミド部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のアミド部分は、１又は複数のブロモアミドに由来する。いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数のエステル部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のエステル部分は、１又は複数のブロモエステルに由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のアミド、ブロモアミド、エステル、又はブロモエステル部分は、ＭＬＭに結合している。いくつかの実施形態では、前記ＭＬＭはＰＥＧリンカーに結合され、ＰＥＧリンカーは、１又は複数のアミド、ブロモアミド、エステル、又はブロモエステル部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは、１又は複数のチオール部分を１又は複数のブロモアミド又はブロモエステル部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合した１又は複数のチオール部分を、前記ＭＬＭ又はＰＥＧリンカーに結合した１又は複数のブロモアミド又はブロモエステル部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にある１又は複数のシステイン部分を、前記ＭＬＭ又はＰＥＧリンカーに結合した１又は複数のブロモアミド又はブロモエステル部分に結合することによって形成される。

【0179】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、任意選択的にＰＥＧリンカーに結合され、膜局在化部分に結合されたＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化20】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
式中、ｎ＝０～５０であり、ＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化21】

を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化22】

を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化23】

を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、膜局在化部分リンカーに結合したＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化24】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、並びに
ＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0184】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化25】

を含む。

【0185】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化26】

を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化27】

を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、それぞれ任意選択的にＰＥＧリンカーに結合され、膜局在化部分に結合した２つのＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化28】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
Ｌは１又は複数の官能基結合基であり、
ＰはＰＥＧ部分であり、ｎはグリコール単位数であり、ｎ＝０～５０であり、並びにＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0188】

いくつかの実施形態では、前記官能基結合基は、

【化29】

を含む。

【0189】

いくつかの実施形態では、前記官能基結合基は、

【化30】

を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、前記官能基結合基は、

【化31】

を含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、前記官能基結合基は、

【化32】

を含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化33】

を含む。

【0193】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化34】

を含む。

【0194】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化35】

を含む。

【0195】

いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数の硫化物部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、１又は複数のチオール部分に由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分はシステインに由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数の硫化物部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のチオール部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合している。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のシステイン部分は、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは１又は複数のピロリジンジオン部分を含む。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のピロリジンジオン部分は、１又は複数のマレイミド部分に由来する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のピロリジンジオン部分は、１又は複数のＰＥＧに結合しており、これにより、例えば、エステル又はアミド結合を介して分岐リンカーにそれぞれ結合され得る。いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧ分岐リンカー部分は、例えばエーテル結合を介してＭＬＭに結合する。いくつかの実施形態では、前記１又は複数のマレイミド部分は、前記１又は複数のＰＥＧ又はＰＥＧ分岐リンカー部分に結合している。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記１又は複数のチオール部分を前記１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端に結合した前記１又は複数のチオール部分を、前記１又は複数のＰＥＧ又はＰＥＧ分岐リンカー部分に結合した前記１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。いくつかの実施形態では、Ｌは、前記ＨＲＣペプチドのＣ末端にある前記１又は複数のシステイン部分を前記１又は複数のＰＥＧ又はＰＥＧ分岐リンカー部分に結合した前記１又は複数のマレイミド部分に結合することによって形成される。

【0196】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、それぞれ任意選択的にＰＥＧリンカーに結合され、膜局在化部分に結合された２つのＦＩＰ－ＨＲＣペプチドを含み、前記複合体は以下の式を有する：

【化36】

式中、［ＦＩＰ］は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチドを含み、
Ｇは、本明細書に記載のＧＳＧＳＧリンカーを含み、Ｇ基のいずれか１つに対するＸ＝０又は１、
［ＨＲＣ］は、本明細書に記載のＣ末端ヘプタッドリピートペプチドを含み、
式中、ｎ＝０～５０であり、並びに
ＭＬＭは膜局在化部分である。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはトコフェロールである。いくつかの実施形態では、ＭＬＭはパルミチルである。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは１１である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。いくつかの実施形態では、ｎは２４である。いくつかの実施形態では、より短い又はより長いグリシンセリンリンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、グリシンセリンリンカーは、式（ＧＳ）_ｎ、Ｇ（ＳＧ）_ｎ、又はＳ（ＧＳ）_ｎを有し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０である。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化37】

を含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化38】

を含む。

【0199】

いくつかの実施形態では、ＭＬＭは、

【化39】

を含む。

【0200】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを単量体形態で含む（「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}」、図６４を参照）。

【0201】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを単量体形態で含み、前記ペプチドのＣ末端に結合した脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む（「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｃｈｏｌ」、図６４を参照）。

【0202】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを単量体形態で含み、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む（「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４－ｃｈｏｌ」、図６４を参照）。

【0203】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを二量体形態で含みペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む。（「［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－ｃｈｏｌ」、図６４を参照）

【0204】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）及びＣ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ペプチドを二量体形態で含み、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ１１）をさらに含む（「［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_１１］_２」、図６４を参照）。

【0205】

抗ウイルスペプチド複合体ナノ粒子
特定の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体を含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれか複数を含む複数のナノ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子は、前記抗ウイルスペプチド複合体で構成され、他の膜融合性又は天然脂質（例えば、１－パルミトイル－２－オレオイル－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ））をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子径は、医薬組成物での送達に適している。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子は、徐放性局所遅延型送達に使用されるヒドロゲルにカプセル化されている。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子の直径は、吸入、鼻腔内投与、又は肺への直接注入に適している（例えば、吸入器、エアロゾル装置、又はネブライザーを介した送達を使用）。

【0206】

いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体を水溶液に入れると、ペプチドの疎水性領域（例えば、膜局在化部分）が会合して疎水性コアを形成するようにナノ粒子に自己集合し、一方で、ペプチドの親水性領域（例えば、ＦＩＰ－ＨＲＣペプチド）は、外側に延伸する（例えば、図２６を参照）。いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子が宿主細胞膜などの脂質二重層に接近すると、疎水性領域（例えば、膜局在化部分）が脂質膜と相互作用する一方で、親水性領域（例えば、ＦＩＰ－ＨＲＣペプチド）が水溶液に面するので、前記ナノ粒子の会合は解消される（例えば、図２７を参照）。

【0207】

可溶性安定化麻疹Ｆタンパク質
これまでは、呼吸器合胞体ウイルスＦワクチン候補の場合のように、膜融合前状態を維持するためにジスルフィド結合で操作されない限り、可溶性Ｆは常に膜融合後状態に反転していた。本明細書には、膜融合前状態で可溶性Ｆタンパク質を安定化させる麻疹Ｆの変異が記載されている。ヒトパラインフルエンザウイルス３型野生型（ＷＴ）Ｆタンパク質及び麻疹野生型（ＷＴ）Ｆタンパク質の両方が、細胞質内ドメイン及び膜貫通ドメインの除去を伴う可溶性形態で生成されると、フォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）が三量体のオリゴマー化を維持するためにＣ末端で追加された場合でも、膜融合後状態でフォールディングされる。野生型麻疹Ｆタンパク質が、ＦＩＰ－ＨＲＣ－ＰＥＧ１１－二量体などであるがこれに限定されない、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体が添加された培地で発現される場合、野生型Ｆタンパク質はその膜融合前状態を維持する。いくつかの実施形態では、可溶性Ｆタンパク質は、配列番号１又は配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、可溶性Ｆタンパク質は、配列番号１又は配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、可溶性Ｆタンパク質は、配列番号１又は配列番号２に対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＭＧＬＫＶＮＶＳＡＩＦＭＡＶＬＬＴＬＱＴＰＴＧＱＩＨＷＧＮＬＳＫＩＧＶＶＧＩＧＳＡＳＹＫＶＭＴＲＳＳＨＱＳＬＶＩＫＬＭＰＮＩＴＬＬＮＮＣＴＲＶＥＩＡＥＹＲＲＬＬＲＴＶＬＥＰＩＲＤＡＬＮＡＭＴＱＮＩＲＰＶＱＳＶＡＳＳＲＲＨＫＲＦＡＧＶＶＬＡＧＡＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨＱＳＭＬＮＳＱＡＩＤＮＬＲＡＳＬＥＴＴＮＱＡＩＥＡＩＲＱＡＧＱＥＭＩＬＡＶＱＧＶＱＤＹＩＮＮＥＬＩＰＳＭＮＱＬＳＣＤＬＩＧＱＫＬＧＬＫＬＬＲＹＹＴＥＩＬＳＬＦＧＰＳＬＲＤＰＩＳＡＥＩＳＩＱＡＬＳＹＡＬＧＧＤＩＮＫＶＬＥＫＬＧＹＳＧＧＤＬＬＧＩＬＥＳＲＧＩＫＡＲＩＴＨＶＤＴＥＳＹＦＩＶＬＳＩＡＹＰＴＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＳＹＮＩＧＳＱＥＷＹＴＴＶＰＫＹＶＡＴＱＧＹＬＩＳＮＦＤＥＳＳＣＴＦＭＰＥＧＴＶＣＳＱＮＡＬＹＰＭＳＰＬＬＱＥＣＬＲＧＳＴＫＳＣＡＲＴＬＶＳＧＳＦＧＮＲＦＩＬＳＱＧＮＬＩＡＮＣＡＳＩＬＣＫＣＹＴＴＧＴＩＩＮＱＤＰＤＫＩＬＴＹＩＡＡＤＨＣＰＶＶＥＶＮＧＶＴＩＱＶＧＳＲＲＹＰＤＡＶＹＬＨＲＩＤＬＧＰＰＩＳＬＥＲＬＤＶＧＴＮＬＧＮＡＩＡＫＬＥＤＡＫＥＬＬＥＳＳＤＱＩＬＲＳＭＫＧＬＳＳＴＳ（配列番号１）。

【0208】

いくつかの実施形態では、前記可溶性Ｆタンパク質は、任意選択的に、タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ部位（イタリック体で示される）、リンカー（太字で示される）、フォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）ドメイン（二重下線で示される）、及び６×Ｈｉｓタグ（太字のイタリック体で示される）を含む。

【化40】

（配列番号２）。

【0209】

特定の態様では、本発明は、操作されたジスルフィド結合を必要とせずに安定化タンパク質をもたらす１又は複数の変異を含む可溶性麻疹Ｆタンパク質を含む組換えポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記変異はＥ４５５Ｇである。いくつかの実施形態では、１又は複数の変異はＥ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇである。特定の態様では、本発明の技術は、これらの組換えポリペプチドをコードする核酸を提供する。

【0210】

いくつかの実施形態では、前記変異Ｅ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号３又は配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、前記変異Ｅ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号３又は配列番号４からなる。いくつかの実施形態では、安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号３又は配列番号４に対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、４５５位のアミノ酸はＧである。

【化41】

（配列番号３）。

【0211】

いくつかの実施形態では、前記変異Ｅ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、任意選択的に、タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ部位（イタリック体で示される）、リンカー（太字で示される）、フォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）ドメイン（二重下線で示される）、及び６×Ｈｉｓタグ（太字のイタリック体で示される）を含む。

【化42】

（配列番号４）。

【0212】

いくつかの実施形態では、前記二重変異体Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号５又は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、前記二重変異体Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号５又は配列番号６からなる。いくつかの実施形態では、二重変異体Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、配列番号５又は配列番号６に対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１７０位のアミノ酸はＧであり、４５５位のアミノ酸はＧである。

【化43】

（配列番号５）。

【0213】

いくつかの実施形態では、前記二重変異Ｅ１７０Ｇ及びＥ４５５Ｇを含む安定化可溶性Ｆタンパク質は、任意選択的に、タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ部位（イタリック体で示される）、リンカー（太字で示される）、フォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）ドメイン（二重下線で示される）、及び６×Ｈｉｓタグ（太字のイタリック体で示される）を含む。

【化44】

（配列番号６）。

【0214】

特定の態様では、本発明は、組換え発現に適した本発明の可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）のいずれか１つをコードする核酸を含む細胞を提供する。特定の態様では、本発明は、組換え発現に適した本発明の可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）のいずれか１つをコードするクローン由来の細胞集団を提供する。特定の態様では、本発明は、組換え発現に適した本発明の可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）のいずれか１つをコードする細胞の安定したプールを提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、又は他の任意の適切な発現系における最適な発現のためにコドン最適化されている。

【0215】

当業者は、本発明の可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）の組換え発現時、分泌経路に向かう新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在するシグナルペプチド（場合により、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドと称される）は、最終的な組換えタンパク質から切断され得ることを理解する。いくつかの実施形態では、したがって、前記組換え可溶性Ｆタンパク質は、２５位のアミノ酸から始まるそれ以降のアミノ酸を含む（すなわち、シグナルペプチドＭＧＬＫＶＮＶＳＡＩＦＭＡＶＬＬＴＬＱＴＰＴＧＱは前記組換えタンパク質から切断される）。

【0216】

特定の態様では、本発明は、膜融合前状態で麻疹Ｆタンパク質を産生するための方法を提供する。特定の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかを含む培地中で、本発明の可溶性Ｆタンパク質のいずれか１つ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）を発現する細胞株の培養により、膜融合前状態で安定化可溶性Ｆタンパク質を産生することを提供する。

【0217】

組換えタンパク質を産生するための様々な発現系が当技術分野で公知であり、原核生物（例えば、細菌）、植物、昆虫、酵母、及び哺乳動物の発現系が含まれる。適切な細胞株は、目的の分子を産生するために、本発明の可溶性Ｆタンパク質のコード配列を含む核酸で形質転換、形質導入、又はトランスフェクトすることができる。宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で少なくとも１つの調節配列に連結され得るそのような核酸配列を含む発現ベクターは、当技術分野で公知の方法を介して導入することができる。当業者は、発現ベクターの設計は、トランスフェクトされる宿主細胞の選択及び／又は発現される所望のタンパク質の種類及び／又は量などの要因に依存し得ることを理解する。非コードＤＮＡ領域のプロモーター領域の上流又は下流に見られる配列であるエンハンサー領域もまた、発現を最適化するのに重要であることが当技術分野で公知である。必要に応じて、原核生物宿主がプラスミドＤＮＡの導入に利用される場合など、ウイルス源からの複製起点を使用してもよい。一方で、真核生物では、染色体の統合はＤＮＡ複製の一般的なメカニズムである。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションの場合、細胞のごく一部が導入されたＤＮＡをゲノムに組み込んでもよい。利用される発現ベクター及びトランスフェクション法は、組込みイベントの成功に寄与する要因となり得る。目的のタンパク質を安定して増幅及び発現させるために、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを真核細胞（哺乳動物細胞など）のゲノムに安定して組み込むことにより、トランスフェクトされた遺伝子を安定して発現させる。選択可能なマーカー（例えば、抗生物質又は薬物に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的のタンパク質をコードする遺伝子を安定して発現するクローンを同定及び選択するために、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入してもよい。目的の遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が薬物の存在下で生存する薬物選択によって同定され得る。選択可能なマーカーの遺伝子が組み込まれていない細胞は死滅する。生存細胞は、所望のタンパク質分子の産生についてスクリーニングされ得る。

【0218】

挿入配列の発現を調節する、又は所望の特定の方法で核酸を修飾及び処理する宿主細胞株もまた選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化及び他の翻訳後修飾）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要である場合がある。異なる宿主細胞株は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。したがって、適切な宿主系又は細胞株を選択して、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にすることができる。よって、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用してもよい。

【0219】

培養される宿主細胞に関して、様々な培養パラメーターを使用することができる。哺乳動物細胞の適切な培養条件は当技術分野で周知である（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＷＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８３， ５６（２）： ２２１－２３４）か、当業者が決定することができる（例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， Ｄ． ａｎｄ Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ｅｄｓ． （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）を参照）。細胞培養条件は、選択した宿主細胞の種類によって異なる場合がある。市販の培地を利用可能である。

【0220】

本発明の可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）は、本発明の可溶性Ｆタンパク質を発現する発現構築物でトランスフェクトされたものを含む、ポリペプチドを発現する任意のヒト又は非ヒト細胞から精製することができる。タンパク質の回収、単離、及び／又は精製のために、細胞培養培地又は細胞溶解物を遠心分離して、粒子状細胞及び細胞片を除去する。所望のポリペプチド分子は、適切な精製技術によって、汚染された可溶性タンパク質及びポリペプチドから単離又は精製される。タンパク質の非限定的な精製方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカなどの樹脂又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックス（登録商標）Ｇ－７５などのセファロースを使用したゲルろ過、免疫グロブリン汚染物質を除去するためのプロテインＡセファロースクロマトグラフィーなどが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ又はプロテイナーゼＫ）などの他の添加剤を使用して、精製中のタンパク質分解を阻害してもよい。炭水化物を選択できる精製手順、例えば、イオン交換ソフトゲルクロマトグラフィー、又はより酸性の画分が収集される陽イオン又は陰イオン交換樹脂を使用するＨＰＬＣも使用できる。

【0221】

組成物
いくつかの実施形態では、抗ウイルスペプチド複合体は、抗ウイルスペプチド複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物で投与される。いくつかの実施形態では、前記安定化Ｆタンパク質は、抗ウイルスペプチド複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物で投与される。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、スプレー、エアロゾル、ゲル、溶液、乳濁液、又は懸濁液の形態である。

【0222】

前記組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体と共に哺乳動物に投与される。典型的には、いくつかの実施形態において、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤において使用され、これはいくつかの実施形態において、製剤を等張にし得るものである。

【0223】

特定の実施形態において、前記抗ウイルスペプチド複合体は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれか１つ及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物として提供される。特定の実施形態において、前記安定化Ｆタンパク質は、本明細書に記載の安定化Ｆタンパク質のいずれか１つ及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物として提供される。特定の実施形態において、前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。当技術分野で公知の他の適切な薬学的に許容される担体が考慮される。適切な担体及びその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８であり、より好ましくは約７～約７．５である。前記製剤はまた、凍結乾燥粉末を含み得る。さらなる担体には、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、リポソーム、又は微粒子の形態である。例えば、投与経路及び投与される抗ウイルスペプチド複合体の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい可能性があることは、当業者には明らかであろう。

【0225】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又はカプセル化材料などの、身体の１つの器官又は部分から他の器官又は部分への対象の医薬品の運搬又は輸送に関与する製薬上許容される材料、組成物、又はビヒクルを意味する。各担体は、前記製剤の他の成分と適合性があり、患者に害を及ぼさないという意味で許容される。薬学的に許容される担体として役立つことができる材料のいくつかの例には、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖、コーンスターチやジャガイモデンプンなどのデンプン、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど）、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバターや坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油、ブチレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチルやラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び製剤に使用される他の非毒性適合物質が含まれる。「担体」という用語は、適用を容易にするために有効成分が組み合わされる、天然又は合成の有機又は無機成分を意味する。前記医薬組成物の成分はまた、所望の医薬効率を実質的に損なう相互作用がないような方法で、本発明の化合物と互いに混合することができる。前記組成物はまた、等張性剤、防腐剤、界面活性剤、及び二価カチオン、好ましくは亜鉛などの追加の薬剤を含み得る。

【0226】

前記組成物はまた、賦形剤、又は抗ウイルスペプチド複合体組成物を安定化するための薬剤、例えば、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、アミノ酸（例えば、グリシン又はプラリンなど）、又は炭水化物を含み得る。抗ウイルスペプチド複合体組成物の製剤化に有用なバルクタンパク質には、アルブミンが含まれる。抗ウイルスペプチド複合体の製剤化に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、又はグルコースが挙げられるが、これらに限定されない。

【0227】

界面活性剤はまた、前記組成物に含まれるペプチド又はタンパク質の可溶性及び不溶性の凝集及び／又は沈殿を防止するために使用され得る。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、及びオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用した溶液エアロゾルが好ましい。したがって、抗ウイルスペプチド複合体又は安定化Ｆタンパク質を含む製剤はまた、エアロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって引き起こされる抗ウイルスペプチド複合体又は安定化Ｆタンパク質の表面誘導凝集を低減又は防止できる界面活性剤を含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類及びアルコール類、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類などの様々な従来の界面活性剤を使用することができる。それらの量は、一般に、製剤の０．００１重量％～４重量％の範囲内である。本発明の目的のために特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０である。当技術分野で公知の追加の薬剤もまた、組成物に含めてもよい。

【0228】

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物及び剤形は、有効成分が崩壊する速度、又は前記組成物の性質が変化する速度を低下させる１又は複数の化合物をさらに含む。いわゆる安定剤又は防腐剤には、アミノ酸、抗酸化剤、ｐＨ緩衝液、又は塩緩衝液が含まれ得るが、これらに限定されない。抗酸化剤の非限定的な例には、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、ブチル化ヒドロキシアニソール及びシステインが挙げられる。防腐剤の非限定的な例には、メチル又はプロピルのｐ－ヒドロキシ安息香酸塩及び塩化ベンザルコニウムなどのパラベンが挙げられる。アミノ酸の追加の非限定的な例には、グリシン又はプロリンが挙げられる。

【0229】

本発明はまた、二価カチオンの有無に関わらずプロリン又はグリシンを含むアミノ酸を使用することによる中性ｐＨ又は中性ｐＨ未満での抗ウイルスペプチド複合体を含む液体溶液の安定化（熱的又は機械的に誘発された阻害剤タンパク質の可溶性又は不溶性の凝集及び／又は沈殿を防止又は最小限にすること）により、室温で安定しているか医薬品の投与に適した透明又はほぼ透明な溶液が得られることを教示する。

【0230】

一実施形態では、前記組成物は、単一単位又は複数単位の剤形の医薬組成物である。本発明の単一単位又は複数単位の剤形の医薬組成物は、予防的又は治療的に有効な量の１又は複数の組成物（例えば、本発明の化合物、又は他の予防的若しくは治療的薬剤）、典型的には、１又は複数のビヒクル、担体、又は賦形剤、安定剤、及び／又は防腐剤を含む。好ましくは、ビヒクル、担体、賦形剤、安定剤、及び防腐剤が、薬学的に許容される。

【0231】

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物及び剤形は、無水医薬組成物及び剤形を含む。本発明の無水医薬組成物及び剤形は、無水又は低水分含有成分及び低水分又は低湿度条件を使用して調製され得る。製造、包装、及び／又は貯蔵中に水分及び／又は湿度との実質的な接触が予想される場合、ラクトース及び一級又は二級アミンを含む少なくとも１つの有効成分を含む医薬組成物及び剤形は、好ましくは無水である。無水医薬組成物は、その無水性が維持されるように調製及び保存されるものとする。したがって、無水組成物は、適切な製剤キットに含めることができるように、水への曝露を防ぐことが公知である材料を使用して包装されることが好ましい。適切な包装の例には、密閉されたホイル（箔）、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック、及びストリップパックが挙げられるが、これらに限定されない。

【0232】

適切なビヒクルは、製薬分野の当業者に周知であり、適切なビヒクルの非限定的な例には、グルコース、スクロース、デンプン、ラクトース、ゼラチン、米、シリカゲル、グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、プロピレングリコール、水、ステアリン酸ナトリウム、エタノール、及び当技術分野で周知の同様の物質が挙げられる。生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液も液体ビヒクルとして使用することが可能である。特定のビヒクルが医薬組成物又は剤形への組み込みに適しているかどうかは、剤形が患者に投与される方法及び剤形中の特定の有効成分を含む、当技術分野で周知の様々な要因に依るが、これらに限定されない。医薬ビヒクルは、石油、動物、植物由来又は合成によるピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのものを含む、水及び油などの無菌液体であり得る。

【0233】

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。下気道内の投与経路の例には、経口又は鼻腔吸入（例えば、下気道内に明示的に沈着するのに充分に小さい粒子の吸入）が含まれるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、前記医薬組成物又は単一単位剤形は、無菌であり、対象、好ましくは動物対象、より好ましくは哺乳動物対象、そして最も好ましくはヒト対象への投与に適した形態である。

【0234】

本発明の剤形の組成、形状、及び種類は、通常、それらの用途に応じて変化すると考えられる。剤形の非限定的な例には、粉末、溶液、エアロゾル（例えば、スプレー、定量又は非定量噴霧器、定量吸入器（ＭＤＩ）を含む経口又は鼻吸入器）、懸濁液を含む患者への粘膜投与に適した液体剤形（例えば、水性又は非水性液体懸濁液、水中油型乳濁液、又は油中水型液体乳濁液）、溶液、及び下気道投与に適した液体剤形を提供するために再構成可能な無菌固体（例えば、結晶性又はアモルファス固体）が挙げられる。粉末又は顆粒の形態の製剤は、例えば、ミキサー、流動床装置、又は噴霧乾燥装置を使用して、従来の方法で上記の成分を使用して調製され得る。

【0235】

本発明はまた、量を示すアンプル又は小袋などの密閉された容器に包装され得る医薬組成物を提供する。一実施形態では、前記医薬組成物は、患者の下気道への投与に適した送達装置において、乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され得る。前記医薬組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１又は複数の単位剤形を含み得るパック又はディスペンサー装置で提示され得る。前記パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサー装置には、投与手順を添付してもよい。

【0236】

これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体及び、任意選択的に１又は複数の補助成分と会合させる工程を含む。通常、製剤は、本発明の化合物を液体担体又は細かく分割された固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製される。

【0237】

投与に適した本発明の製剤は、粉末、顆粒の形態、水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、水中油型又は油中水型液体乳濁液として、エリキシル又はシロップとして、トローチ（ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤を使用）、及び／又はうがい薬などであってもよく、それぞれが、有効成分として本発明の化合物（例えば、抗ウイルスペプチド複合体）の所定量を含む。

【0238】

本明細書の液体組成物は、送達装置と共にそれ自体で使用されてもよく、又はそれらは、例えば噴霧乾燥の方法によって調製される抗ウイルスペプチド複合体を含む薬学的に許容される製剤の調製に使用され得る。Ｍａａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００１， １， ２８３－３０２に開示された医薬品投与のためのタンパク質の噴霧凍結乾燥の方法が、本明細書において援用される。別の実施形態では、本明細書の液体溶液は、凍結噴霧乾燥され、噴霧乾燥された生成物は、個人の下気道に投与された時に治療上有効である分散性抗ウイルスペプチド複合体含有粉末として回収される。

【0239】

本発明の化合物及び医薬組成物は、併用療法で使用されてもよく、すなわち、前記化合物及び医薬組成物は、１又は複数の他の所望の治療又は医療処置と同時に、それ以前に、又はその後に投与され得る。併用レジメンで使用する治療法（治療法又は手順）の特定の組み合わせは、所望の治療法及び／又は手順の適合性、及び達成される所望の治療効果を考慮に入れるであろう。使用される治療法は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得ることも理解されよう（例えば、本発明の化合物は、別の抗ウイルス剤と同時に投与され得る）。

【0240】

本発明はまた、本発明の医薬組成物の１又は複数の成分で満たされた１又は複数の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。任意選択的にそのような容器に関連付けられるのは、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり、この通知は、ヒトへの投与ための製造、使用、又は販売の当局による承認を反映している。

【0241】

本発明は、麻疹又はＨＩＶ感染症の治療に適した抗ウイルスペプチド複合体（例えば、ＦＩＰ－ＨＲＣペプチド）を含む剤形を提供する。剤形は、例えば、スプレー、エアロゾル、ナノ粒子、リポソーム、又は当業者に公知の他の形態として製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｓｕｐｒａ； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｈｏｗａｒｄ Ｃ．， Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ； ７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｏｃｔ． １， １９９９）を参照。

【0242】

本発明はまた、麻疹感染を治療又は予防するのに適した安定化Ｆタンパク質を含む剤形を提供する。剤形は、例えば、スプレー、エアロゾル、ナノ粒子、リポソーム、又は当業者に公知の他の形態として製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｓｕｐｒａ； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｈｏｗａｒｄ Ｃ．， Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ； ７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｏｃｔ． １， １９９９）を参照。

【0243】

通常、感染症／障害の急性期治療に使用される剤形は、同じ疾患の慢性期治療に使用される剤形よりも、含有する１又は複数の有効成分を大量に含む場合がある。さらに、予防的及び治療的に有効な剤形は、異なる条件間で異なり得る。例えば、治療上有効な剤形は、既存の麻疹又はＨＩＶ感染を治療することを意図する場合に適切な抗ウイルス作用を有する抗ウイルスペプチド複合体を含み得る。他方、異なる有効量は、麻疹又はＨＩＶ感染に対する予防（例えば、ワクチン）として本発明のペプチドを使用することを意図する場合に適切な免疫原性作用を有する抗ウイルスペプチド複合体を含み得る。治療上有効な剤形は、既存の麻疹感染症を治療することを意図する場合に適切な抗ウイルス作用を有する安定化Ｆタンパク質を含み得る。他方、異なる有効量は、麻疹感染に対する予防（例えば、ワクチン）として本発明の安定化Ｆタンパク質を使用することを意図する場合に適切な免疫原性作用を有する安定化Ｆタンパク質を含み得る。本発明に含まれる特定の剤形が互いに異なり、当業者には容易に明らかになるこれら及び他の方法。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ； ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （２００３）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｈｏｗａｒｄ Ｃ． Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ； ７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｏｃｔ． １， １９９９）、及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ， Ｊ． ＆ Ｊ．Ｃ． Ｂｏｙｌａｎ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８を参照。

【0244】

医薬組成物又は剤形のｐＨはまた、１又は複数の有効成分の送達及び／又は安定性を改善するために調整され得る。同様に、溶媒担体の極性、そのイオン強度、又は張性を調整して、送達を改善してもよい。ステアリン酸塩などの化合物を医薬組成物又は剤形に添加して、送達を改善するために１又は複数の有効成分の親水性又は親油性を有利に変更することもできる。これに関して、ステアリン酸塩はまた、製剤の脂質ビヒクルとして、乳化剤又は界面活性剤として、及び送達増強剤又は浸透増強剤として役立ち得る。有効成分の異なる塩、水和物、又は溶媒和物を使用して、得られる組成物の特性をさらに調整してもよい。

【0245】

組成物は、免疫化に適した組成物を生成するための技術を使用して、適切な担体及びアジュバントとともに製剤化され得る。前記組成物は、例えば、ミョウバン、ポリＩＣ、ＭＦ－５９、スクアレンベースのアジュバント、又は免疫化に適したリポソームベースのアジュバントなどのアジュバントを含み得る。

【0246】

いくつかの実施形態では、前記組成物及び方法は、宿主の免疫寛容及び誘導された抗体の放出のメカニズムを調節することができる任意の適切な薬剤又は免疫調節を含む。特定の実施形態において、免疫調節剤は、麻疹Ｆタンパク質又はＨＩＶ－１エンベロープに対する抗体を含む免疫応答を誘導するために、対象の免疫応答の一過性の調節に充分な時間及び量で投与される。

【0247】

治療法
一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、感染の発生又は増悪を防ぐために、ＭＶへの曝露後に開始される予防医療に関する。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ＭＶに接触した又はＭＶに接触した疑いのある対象の予防に関する。一実施形態では、前記対象に、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体又はその医薬組成物を含む曝露後予防薬を投与することができる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、麻疹感染の予防薬として、麻疹ウイルスに由来するＨＲＣペプチドに結合したＦＩＰを含む。本発明は、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかを使用することを企図している。いくつかの実施形態では、ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、単量体形態である（例えば、「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}」、図６４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、単量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合した脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む（「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｃｈｏｌ」、図６４を参照）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、単量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ_４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む（「ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４－ｃｈｏｌ」、図６４を参照）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、二量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ_４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む（「［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－ｃｈｏｌ、図６４を参照）。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、二量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ４）をさらに含む（「［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_１１］_２」、図６４を参照）。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、ナノ粒子の形態で投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、鼻腔内スプレー又は当技術分野で公知の他の任意の適切な方法を介して鼻腔内に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、注射器又は当技術分野で公知の他の適切な方法を介して皮下投与することができる。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、流行性耳下腺炎などのＭＶ以外のパラミクソウイルスの曝露後予防に適応及び適用することができる。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ウイルス膜融合を阻害することによる、あらゆるウイルスの曝露後予防アプローチに関する。

【0248】

一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、感染の発生又は増悪を防ぐために、ＨＩＶへの曝露後に開始される予防医療に関する。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ＨＩＶに接触した又はＨＩＶに接触した疑いのある対象の予防に関する。一実施形態では、前記対象に、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体又はその医薬組成物を含む曝露後予防薬を投与することができる。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、ＨＩＶ感染の予防薬として、ＨＩＶ－ｇｐ４１（「Ｃ３４」）に由来するＨＲＣペプチドに結合したＦＩＰを含む。いくつかの実施形態では、前記抗ウイルスペプチド複合体は、ＭＶ感染の予防薬としても使用され得る、ＨＩＶ－ｇｐ４１（「Ｃ３４」）に由来するＨＲＣペプチドに結合したＦＩＰを含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、単量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合した脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、単量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ_４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、二量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ_４）及び脂質（例えば、コレステロール）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＦＩＰ結合ＨＲＣペプチドは、二量体形態であり、前記ペプチドのＣ末端に結合したリンカー（例えば、ＰＥＧ_４）をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、ナノ粒子の形態で投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、鼻腔内スプレー又は当技術分野で公知の他の任意の適切な方法を介して鼻腔内に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、注射器又は当技術分野で公知の他の適切な方法を介して皮下投与することができる。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ウイルス膜融合を阻害することによる、あらゆるウイルスの曝露後予防アプローチに関する。

【0249】

いくつかの実施形態では、前記対象が、野生型膜融合糖タンパク質を含む麻疹ウイルスに曝露されている。いくつかの実施形態では、前記対象が、Ｎ４６２Ｋ、Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、Ｅ４５５Ｇ、Ｅ１７０Ｇ、Ｇ５０６Ｅ、Ｍ３３７Ｌ、Ｄ５３８Ｇ、Ｇ１６８Ｒ、Ｓ２６２Ｇ、Ａ４４０Ｐ、Ｒ５２０Ｃ及びＬ５５０Ｐからなる群から選択される膜融合糖タンパク質の１又は複数の変異を含む麻疹ウイルスに曝露されている（例えば、図１０４参照）。

【0250】

本明細書に開示される化合物又は化合物の組み合わせ、又は医薬組成物は、任意の適切な手段によって、細胞、哺乳動物、又はヒトに投与することができる。投与方法の非限定的な例には、特に、（ａ）カプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ、又は他のそのような形態での投与を含む、経口経路による投与、（ｂ）眼内、鼻腔内、耳介内、直腸、膣、尿道内、経粘膜、口腔内、又は経皮などの非経口経路を介した投与（水性懸濁液、油性製剤などとして、又は点滴、スプレー、坐剤、軟膏、軟膏剤などとしての投与を含む）、（ｃ）皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、眼窩内、被膜内、脊髄内、胸骨内などを含む注射による投与（輸液ポンプ送達を含む）、（ｄ）腎臓又は心臓領域への直接注射などによる、例えば、デポー植え込みによる局所投与、（ｅ）局所投与（本明細書に開示される化合物又は化合物の組み合わせを生体組織と接触させるために当業者によって適切であるとみなされる場合）、（ｆ）エアロゾル化、噴霧化、及び粉末化された製剤を含む、吸入による投与、並びに（ｇ）植え込みによる投与が挙げられる。

【0251】

当業者には容易に明らかであるように、投与される有効なインビボ用量及び特定の投与様式は、年齢、体重、及び治療される種、並びに本明細書に開示される化合物又は化合物の組み合わせが使用される特定の用途に応じて変化する。有効な用量レベル、すなわち、所望の結果を達成するために必要な用量レベルの決定は、当業者が日常的な薬理学的方法を使用して達成し得る。通常、製品のヒトでの臨床応用は、より低い用量レベルで開始され、所望の効果が達成されるまで用量レベルが増加される。あるいは、許容可能なインビトロ研究を使用して、確立された薬理学的方法を使用する本発明の方法によって同定された組成物の有用な用量及び投与経路を確立することができる。インビボ研究からの有効な動物用量（例えば、コットンラットでは６ｍｇ／ｋｇ、図２２及び図８４を参照）は、当技術分野で公知の変換方法を使用して適切なヒト用量に変換することができる（例えば、Ｎａｉｒ ＡＢ， Ｊａｃｏｂ Ｓ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｄｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｙ． ２０１６ Ｍａｒ；７（２）：２７を参照）。

【0252】

予防法
理論に拘束されることなく、本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体は、膜融合前状態で可溶性麻疹Ｆタンパク質を安定化させる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗ウイルスペプチド複合体は、麻疹膜融合前Ｆタンパク質に対する免疫応答を促進するためのワクチンとして、可溶性麻疹Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）と共に使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗ウイルスペプチド複合体は、麻疹に対する防御免疫応答を誘発するために、可溶性麻疹Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）と共に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗ウイルスペプチド複合体のいずれか１つ及び可溶性麻疹Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）のいずれか１つを含む免疫原性組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ウイルスペプチド複合体はまた、麻疹ウイルスに感染した対象の予防的治療として、可溶性麻疹Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）と共に使用され得る。

【0253】

いくつかの実施形態では、前記安定化可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号３、４、５、又は６）は、麻疹膜融合前Ｆタンパク質に対する免疫応答を促進するためのワクチンとして使用され得る（すなわち、本明細書に記載された抗ウイルスペプチド複合体なしで）。いくつかの実施形態では、前記安定化可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号３、４、５、又は６）は、麻疹に対する防御免疫応答を誘発するために投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の安定化可溶性Ｆタンパク質（例えば、配列番号３、４、５、又は６）のいずれか１つを含む免疫原性組成物を投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法を提供する。

【0254】

いくつかの実施形態では、安定化Ｆタンパク質は、単独で、又は本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかと併用して投与される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ウイルスペプチド複合体は、麻疹ウイルスに感染した対象の予防的治療として、可溶性麻疹Ｆタンパク質（例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６）と共に使用され得る。

【0255】

いくつかの実施形態では、本発明は、免疫応答の誘導、例えば、麻疹ウイルス又はＨＩＶに対する抗体の誘導のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記抗体は広義には中和抗体である。いくつかの実施形態では、前記方法は、麻疹Ｆタンパク質又はＨＩＶ－１エンベロープに対する抗体を誘導する。いくつかの実施形態では、前記方法は、安定化Ｆタンパク質及び／又は本明細書に記載の抗ウイルスペプチド複合体のいずれかを含む組成物を使用する。いくつかの実施形態では、前記方法は、アジュバントの投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、野生型膜融合糖タンパク質を含む麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ４６２Ｋ、Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、Ｅ４５５Ｇ、Ｅ１７０Ｇ、Ｇ５０６Ｅ、Ｍ３３７Ｌ、Ｄ５３８Ｇ、Ｇ１６８Ｒ、Ｓ２６２Ｇ、Ａ４４０Ｐ、Ｒ５２０Ｃ、及びＬ５５０Ｐからなる群から選択される膜融合糖タンパク質の１又は複数の変異を含む麻疹ウイルスに対する免疫応答を誘導するための組成物及び方法を提供する（例えば、図１０４を参照）。

【実施例】

【0256】

本発明のより完全な理解を容易にするために、以下に実施例を提示する。以下の実施例は、本発明を作成及び実施する例示的な形態を示している。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示された特定の実施形態に限定されず、これらは、同様の結果を得るために代替の方法を利用できるので、例示のみを目的とする。

【0257】

実施例１
ＭｅＶ感染は、図１に示されるように気道で起こり得る。肺胞マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）は、ＭｅＶ受容体シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ、ＣＤ１５０とも呼ばれる）を発現する主要な標的である。ＭｅＶ受容体結合タンパク質ヘマグルチニン（Ｈ）がＣＤ１５０に付着すると、これらの細胞が感染し、気管支関連リンパ組織及び／又は流入領域リンパ節にウイルスが感染する。ウイルスはＣＤ１５０を発現するＢリンパ球及びＴリンパ球で増殖し、結果としてウイルス血症が起こる。接着結合タンパク質（ＰＶＲＬ４又はネクチン４）もＭｅＶ受容体として機能するが、呼吸器上皮細胞の基底外側表面に見られ、疾患後期のウイルス感染に関係している。ウイルス血症及びＭｅＶ病因の放出を図２に示す。麻疹はまた、図３に示されるように、重篤な合併症を引き起こし得る。これらの合併症のいくつかは中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼす。麻疹封入体脳炎（ＭＩＢＥ）及び亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）は、どちらも麻疹感染の致命的な合併症である。ＭＩＢＥは、ウイルス感染から１～９か月後に発生する場合がある。ＳＳＰＥは感染から数年後に現れることもある。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ＭＩＢＥ及びＳＳＰＥ中枢神経系合併症からの臨床分離株に重点を置いている。一実施形態では、急性麻疹脳炎（ＡＭＥ）は、ＭｅＶの別の合併症である。これまで、ＳＳＰＥの発生率は１：１０００００例と考えられていたが、最近のデータは、生後１年の子供の感染は６００回の感染ごとに１例となり得ることを示している（Ｗｅｎｄｏｒｆ， Ｋ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ２０１７， ６５（２）， ２２６－２３２）。ＭＩＢＥは、重度の免疫不全患者における麻疹の致命的なＣＮＳ症状である。ＭｅＶ脳炎のＨＩＶ感染患者のデータを図４に示す。患者８は１年前に多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ）を受けていた。報告の時点で、患者１及び患者８は生存していた。全患者は最終的に死亡に至った（未発表のデータ、私信、Ｄｉａｎａ Ｈａｒｄｉｅ）。

【0258】

（ＭＶの病理：中枢神経系の合併症）
ＣＮＳには公知のＭＶ受容体がないため、長年の問題は、麻疹がＣＮＳにどのように感染して広がるかということである。パラミクソウイルスの膜融合複合体が本明細書に記載されている。ＣＮＳ臨床分離株も記載されている。したがって、ここで検討する別の問題は、麻疹膜融合複合体がＣＮＳにどのように適応するかである。Ｆタンパク質及びＨタンパク質を含む麻疹ウイルスの概略図を図５に示す。本明細書に開示される発明の対象はまた、図４に示されるように、患者１及び患者６からの臨床分離配列からのデータに関する。

【0259】

一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、２００９年／２０１０年の南アフリカ（ＳＡ）流行時にＭＩＢＥに罹患した患者のＣＮＳから採取された神経病原性ＭｅＶ分離株の膜融合複合体の特性評価に関する。ＭｅＶ配列は、南アフリカでの麻疹流行中に陽性ＭｅＶＰＣＲを介してＭＩＢＥと診断された２人のＨＩＶ感染患者の死後の脳組織から分離された。ウイルスゲノム配列決定は、両方の場合において、ＭｅＶＦ遺伝子が図６に示されるのと同様に、４５４位（Ｌ４５４Ｗ）でロイシンからトリプトファンへの置換をもたらしたヌクレオチド変異を含むことを明らかにした。最初の患者は２７歳の女性で、急性麻疹の３か月後にＭＩＢＥを発症した。注目すべきことに、この患者の脳から分離されたウイルスに存在するＬ４５４Ｗ変異は、患者の急性ＭＶ感染中に得られた初期の血液試料からのウイルスには存在していなかった。２番目の患者は３４歳の女性で、急性ＭｅＶ感染の３週間後に典型的なＭＩＢＥ症状を発症した。図７に示されるように、ＣＮＳへの野生型麻疹ウイルス侵入は厳密に制御されている。野生型ＭｅＶは、侵入工程にネクチン４又はＣＤ１５０受容体を必要とする。したがって、ＳＳＰＥ及びＭＩＢＥのＭｅＶ株がＣＮＳにどのように侵入し、拡散するかという問題が生じる。

【0260】

本明細書に開示される発明の対象の一実施形態では、２００９年／２０１０年のＳＡ流行時にＭＩＢＥに罹患した患者のＣＮＳから採取された神経病原性ＭｅＶ分離株の膜融合機構を特性評価したところ、もう１つの問題は、この単一のアミノ酸変異が麻疹膜融合複合体をどのように変化させるかということであった。ウイルスゲノム配列決定により、両方の場合において、ＭｅＶ Ｆ遺伝子が同じヌクレオチド変異を含み、その結果、４５４位（Ｌ４５４Ｗ）でロイシンからトリプトファンへの置換が生じたことが明らかになった。膜融合複合体分析の方法論を図８に示す。Ｌ４５４Ｗヌクレオチド変異がＭＶ膜融合機構の活性を変化させるかどうかが問題となった。

【0261】

（ＣＮＳ適応膜融合機構：膜融合するための受容体会合の要件の変更）
図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、公知の受容体の存在下で、全てのＦタンパク質が同様のレベルの膜融合を示す。図９Ｃに示されるように、Ｆ Ｌ４５４Ｗが公知の受容体の非存在下で膜融合を誘導する。

【0262】

（Ｌ４５４Ｗ変異はＦを不安定化するのか？）
野生型ＭｅＶ Ｆ及びＣＮＳ適応ＭｅＶ Ｆの熱安定性が本明細書に開示されている。示されたＭＶ Ｆ（ｘ軸）を発現する細胞を３２℃で一晩インキュベートした後、示された時間（Ｔ）で置いた。次に、細胞を、ＭｅＶ Ｆの膜融合前又は膜融合後の状態に対してｍＡｂと共に４℃でインキュベートした。ｙ軸の値は、相対発光単位（ＲＬＵ）を表す。Ｆ Ｌ４５４Ｗは、野生型Ｆよりも熱安定性が低い。２つの状態の表現を図１０に示す。ＣＮＳ由来のＦを保有するウイルスは、ＭｅＶ受容体を欠く細胞に広がり得る。図１１に示されるように、組換えウイルスによって誘導される細胞間膜融合を示す。ＭＩＢＥ由来のＦ Ｌ４５４Ｗは、公知のＭｅＶ受容体の非存在下でも膜融合を媒介できる。野生型Ｆに対するＭＶ Ｆ Ｌ４５４Ｗの膜融合活性の増加は、安定性の低下と相関している。ＭＶ Ｆ Ｌ４５４Ｗは、Ｈとは無関係に膜融合を促進できる。

【0263】

（Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスは、野生型ウイルスよりも病原性が高いのか？）
この問題を解くために使用するモデルには、ヒトの脳オルガノイド、マウス及びコットンラットのエクスビボ組織が含まれるが、これらに限定されない。ＭｅＶがコットンラットに感染し、ウイルス力価を評価できる。野生型ウイルスによる致死的な感染をもたらすＣＤ１５０受容体のトランスジェニック乳児マウスモデルもある。

【0264】

図１２に示されるように、９０日齢の脳オルガノイドを、野生型麻疹Ｆウイルス及びＬ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスに感染させた。図１３は、マウス（受容体なし）からのエクスビボ組織を示した図である。野生型対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染では、ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養において野生型ウイルスよりも優れている。ＩＦＮＡＲ ＫＯマウスの脳からの小脳切片を、５０００ＰＦＵ／切片のＥＧＦＰを有する野生型ウイルスに４日間感染させた。落射蛍光顕微鏡で観察した２４時間又は９６時間の感染に関連する赤色蛍光（スケールバー＝ ５００μｍ）。器官型脳培養（ＯＢＣ）におけるＬ４５４Ｗ Ｆ播種を有するＭｅＶ。ＩＦＮＡＲ ＫＯマウス脳の小脳切片を、ＭｅＶ－ＩＣ３２３－Ｌ４５４Ｗ Ｆ ＥＧＦＰ（緑色蛍光）と、ｔｄｔｏｍａｔｏ（赤色蛍光）を有する野生型ウイルスとで、５０００ＰＦＵ／切片で４日間感染させた。落射蛍光顕微鏡で観察した２４時間（図１３Ａ）又は７２時間（図１３Ｂ）の感染に関連する緑色蛍光及び赤色蛍光（スケールバー＝ ５００μｍ）。

【0265】

図１４は、コットンラットにおけるＭｅＶウイルスデータを示した図である。図１５Ａ及び図１５Ｂは、マウスにおける生存率データを示した図である。図１６は、治療標的としてのウイルス侵入を示した図である。図１７に示されるように、Ｆ糖タンパク質由来ペプチドは、図１８に示されるようにウイルス侵入を阻害する。図１９は、ＨＲＣペプチドの脂質膜に対する標的化を示した図である。図２０は、Ｆタンパク質に対するＨＲＣペプチドの結合活性の改善を示した図である。図２１は、ＨＲＣペプチドの脂質膜に対する標的化の別の実施形態を示した図である。図２２Ａ及び図２２Ｂは、共役ペプチドがインビボで強力であることを示した図である。使用したモデルは、図２２Ａのコットンラット及び図２２ＢのＳＬＡＭ：ＩＦＮＡＲＫＯマウスである。投与経路は、６ｍｇ／ｋｇの投与量で鼻腔内である。図２３Ａ～２３Ｃは、ＭｅＶ ＨＲＣ４ペプチドがエクスビボでのウイルス拡散を阻止することを示した図である。使用したモデルは、Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスに感染したマウス（ＣＤ１５０なし）のエクスビボ組織である。図２４は、ＭｅＶ ＨＲＣ４の鼻腔内投与が、Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスによる致死的感染から乳児マウスを保護することを示した図である。

【0266】

表１～表３は、ペプチドの非限定的な例を提示する。

【0267】

表１に、ペプチド及びその修飾のリストを示す：^ａ（アミノ酸残基は一文字コードで表される。Ａｃ：アセチル化Ｎ末端、ＧＳＧＳＧ：５つのアミノ酸を含むリンカー、Ｄ－ＦＦＧ：Ｄ－アミノ酸は最初のフェニルアラニン残基に使用されている。Ｚ－Ｄ－ＦＦＧ：Ｚは、Ｄ－ＦＦＧ配列のＮ末端に結合したカルボベンゾキシである。）、^ｂ（ＦＩＰ：膜融合阻害ペプチド、ＨＲＣ４５０－４８５：麻疹ＨＲＣ由来の４５０番目のアミノ酸から始まり４８５番目のアミノ酸で終わるペプチド配列）、^ｃ（Ｐｅｇ：ポリエチレングリコール、Ｃｈｏｌ：コレステロール）、^ｄ（ペプチド：ＨＲＣ４５０－４８５／ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５／ＦＩＰ）。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0268】

表２に、膜融合アッセイにおけるＦＩＰ、ＨＲＣ、及びＦＩＰ－ＨＲＣペプチド（顕著なペプチド）の阻害活性を示す。βガラクトシダーゼ相補性に基づく膜融合アッセイを行った。簡潔には、ネクチン－４及びオメガレポーターサブユニット（標的細胞）で一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、ウイルス糖タンパク質（Ｈ及びＦ）とアルファレポーターサブユニット（エフェクター細胞）とを共発現する細胞と共に、膜融合阻害剤ペプチドの存在下又は非存在下で示された期間インキュベートした。ペプチド非存在下では、標的細胞とエフェクター細胞との膜融合により、発光に基づくキットであるＧａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ（商標）β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国）を使用して定量化されたβ－ガラクトシダーゼ活性が再構成される。ペプチドの存在下では、膜融合が低下し、その結果、βガラクトシダーゼ活性も低下する。データは、少なくとも３つの独立した実験からのものである。

【表2】

【0269】

表３に、膜融合アッセイにおけるＦＩＰ、ＨＲＣ、及びＦＩＰ－ＨＲＣペプチド（拡張版）の阻害活性を示す。上述したように、βガラクトシダーゼ相補性に基づく膜融合アッセイを行った。簡潔には、ネクチン－４又はＣＤ１５０のいずれか及びオメガレポーターサブユニット（標的細胞）で一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、ウイルス糖タンパク質（Ｈ及びＦ）とアルファレポーターサブユニット（エフェクター細胞）とを共発現する細胞と共に、膜融合阻害剤ペプチドの存在下又は非存在下で示された期間インキュベートした。ペプチド非存在下では、標的細胞とエフェクター細胞との膜融合により、発光に基づくキットであるＧａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ（商標）β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国）を使用して定量化されたβ－ガラクトシダーゼ活性が再構成される。ペプチドの存在下では、膜融合が低下し、その結果、βガラクトシダーゼ活性も低下する。データは３つの独立した実験からのものである（＊＝９回の複製、§＝６回の複製、及び°＝５回の複製を除く）。

【表3-1】

【表3-2】

【0270】

（ペプチド結合は溶液中で自己会合を誘発する）
図２５は、ペプチド粒子径がナノモルの範囲内にあることを示す。図２６は、両親媒性構造が自己集合及びナノ粒子形成を促進することを示す。図２７は、ペプチドを保持した脂質膜界面で、ナノ粒子が集合（分散）することを示す。図２８は、ナノ粒子がＨＡＥバリアを通過可能であり、インビボで生物学的に利用可能であることを示す。関連する感染部位に到達することにより、これらは麻疹ウイルスの増殖を防ぐ。図２９は、共役ペプチドが６ｍｇ／ｋｇの鼻腔内投与経路でコットンラットモデルの生体内分布を改善したことを示す。図３０は、膜融合阻害ペプチド（ＦＩＰ）が膜融合タンパク質に結合し、麻疹Ｆタンパク質の膜融合前状態を安定化させる併用戦略を示す。図３１は、ＦＩＰペプチド及びＨＲＣペプチド間の相乗作用を示すアイソボログラム曲線を示す（コンビナトリアル薬物検査：２つの異なる化合物による同時治療）。図３２は、ＨＲＣ領域にＦＩＰを添加すると抗ウイルス活性が高まることを示す。図３３及び図３４に示されるように、ＦＩＰ及びＨＲＣが同じ構造にある場合、効力は、一緒に加えられた２つの阻害剤の相乗作用を超える。図３５及び図３６は、ＨＲＣ領域にＦＩＰを添加すると抗ウイルス活性が高まることを示す。

【0271】

ＭＶ ＩＣ３２３ｅＧＦＰに対するペプチド抗ウイルスアプローチの概要：
・ ウイルス原液：ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ，Ｐ３（ＡＬａ）力価：２×１０６ＰＦＵ／ｍＬ
・ ペプチド原液：ペプチドＭｅＶ ＨＲＣ ４濃度：５０ｍｇ／ｍＬ
・ 治療用量約１ｍｇ／ｋｇ又は約０．１ｍｇ／ｋｇ、感染前２４時間又は６時間
・ マウス：ＳＬＡＭ ＩＦＮＡＲ ＫＯ（３．５～４週齢）
・ 鼻腔内感染（５μＬ／鼻孔→１０μＬ／マウス）
・ 感染量＝４×ＬＤ５０
・ ２０．０００ＰＦＵ／マウス

【0272】

図３７は、生存率を示す。ＳＬＡＭ ＩＦＮＡＲ ＫＯマウスの生存期間は３．５週間であった。図３８は、様々なＭｅＶを示している。図３９は、ＭＶ ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤がヒト運動ニューロンのＭｅＶ野生型感染を阻止することを示す。感染日数：８日。緑色蛍光はＭｅＶ感染を示し、ウイルス感染に正比例している。

【0273】

ＭｅＶ ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤は、運動ニューロンにおけるウイルスの拡散を阻止する。ポリメラーゼ阻害剤に関する情報は、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６ Ａｐｒ ２０１４：Ｖｏｌ． ６， Ｉｓｓｕｅ ２３２， ｐｐ． ２３２に記載されている。図４０は、ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤対野生型及びＣＮＳ適応ウイルスを示す。図４１は、ヒト運動ニューロンにおけるＭｅＶ ＨＲＣ４ペプチド及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤対ＣＮＳ適応ＭＶを示す。経時的に、ポリメラーゼ阻害剤の活性は低下した。

【0274】

ＭｅＶ ＨＲＣ４ペプチドは、最高濃度でのみウイルスの拡散を阻止する。図４２Ａ及び図４２Ｂ並びに図４３Ａ～図４３Ｃは、侵入の工程を示す。図４４Ａ～図４４Ｃは、Ｈ－Ｆ相互作用がＬ４５４ＷＦにおいて変えられていることを示した図である。図４５は、ＭｅＶ ＨＲＣ４の鼻腔内投与がＩＦＮＡＲ ＫＯマウスを致死的なＭｅＶ脳炎から保護することを示す。図４６は、多能性幹細胞から増殖され得る様々なオルガノイド及び使用される発生シグナルの概略図を示す。図４７Ａ～図４７Ｃは、多能性幹細胞から生成された「ミニ脳」を示す。図４７Ａは、神経前駆細胞（ＳＯＸ２、赤）及びニューロン（ＴＵＪ１、緑）を含む不均一な領域を有する複雑な形態が認められることを示す（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。図４７Ｂは、パターン化されたネフロンを有する多能性幹細胞から成長した腎臓オルガノイド全体の免疫蛍光画像を示す。形成中の糸球体（ＮＰＨＳ１、黄色）、初期近位尿細管（ロータステトラゴノロバス（ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン、ピンク色）、及び遠位尿細管／集合管（Ｅ－カドヘリン、緑色）の有足細胞。図４７Ｃは、基底細胞（緑色）、アクチン細胞骨格（赤色）、及び核（青色）の中間径フィラメントについて染色され、共焦点顕微鏡によって画像化された、ヒトａＳＣ由来肺オルガノイドの中央部の３Ｄ再構成を示す。

【0275】

（曝露後予防）
一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、感染の発生を防ぐために、ＭｅＶへの曝露後に開始される予防医療に関する。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ＭｅＶに接触した又はＭｅＶに接触した疑いのある対象の予防に関する。一実施形態では、前記対象に、ＨＲＣ４ペプチドナノ粒子などのＨＲＣペプチドナノ粒子からなる曝露後予防薬を投与することができる。一実施形態では、対象に、ＦＩＰ結合ＨＲＣ４ペプチドナノ粒子などのＦＩＰ結合ペプチドからなる曝露後予防薬を投与することができる。一実施形態では、前記曝露後予防薬は、鼻腔内スプレー又は当技術分野で公知の他の適切な方法を介して鼻腔内に投与することができる。一実施形態では、前記曝露後予防薬は、注射器又は当技術分野で公知の他の適切な方法を介して皮下投与することができる。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、流行性耳下腺炎などのＭｅＶ以外のパラミクソウイルスの曝露後予防薬に適応及び適用することができる。一実施形態では、本明細書に開示される発明の対象は、ウイルス膜融合を阻害することによる、あらゆるウイルスの曝露後予防アプローチに関する。

【0276】

実施例２
図４８～図８３は、少なくとも１つの膜融合阻害ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのリンカー、及び膜局在化部分から構成される特定の脂質－ペプチド複合体を含む、本発明のさらなる実施形態を記載している。いくつかの実施形態では、膜融合阻害ペプチドは、麻疹膜融合阻害ペプチド又は麻疹ＨＲＣ由来ペプチドである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧリンカーは、４～２４回反復されるか又は連結される。他の実施形態では、膜局在化部分は、コレステロール、トコフェロール、又はパルミチルである。これらの脂質－ペプチド複合体のさらなる実施形態は、単量体又は二量体を含むか、脂質を含むか又は含まない場合がある。βガラクトシダーゼ相補性に基づく膜融合アッセイ、ＭＴＴ細胞毒性アッセイ、熱安定性アッセイ、及びＦ安定化アッセイからのインビトロ及びインビボ生物学的試験データは、麻疹膜融合阻害複合体が感染を阻害することを示している。

【0277】

実施例３
図８４～図９３は、さらに本発明を説明している。図８４は、インビボ有効性データを示す。ＭｅＶ由来ペプチドの鼻腔内投与は、コットンラットをＭＶ感染から保護する。コットンラット（ｎ＝４）を、ＭｅＶ「ＷＴＦｂ」株に鼻腔内感染させた。治療薬を、感染の２４時間前及び１２時間前に、１００μＬ（５ｍｇ／ｋｇ用量のペプチド）で鼻腔内に投与した。感染の４日後に動物を安楽死させた。肺ホモジネートのＭｅＶ滴定は、［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－コレステロールが最も強力な阻害剤であることを示した。［ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－コレステロールは、未治療の動物と比較してウイルス力価を低下させる。

【0278】

図８５は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭｅＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示す。フローサイトメトリー：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－ｃｈｏｌペプチドの局在。ＭｅＶ Ｆを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ペプチド（１μＭ）とともに３７℃で６０分間インキュベートした。Ｆタンパク質及びＨＲＣ－ＦＩＰペプチドは、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑色、ｘ軸）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤色、ｙ軸）で染色した。３つの別々の実験の典型。コレステロールを有するＦＩＰ－ＨＲＣの場合、ＨＲＣシグナルはＦシグナル（Ａ）に正比例し、ＦＩＰ－ＨＥＣがＦ発現細胞に誘導されることを示唆している。ＦＩＰ単独（コレステロールなし）では、ＨＲＣをＦ発現細胞に局在化するが、ＨＲＣシグナルは低くなる（Ｂ）。脂質存在下でＦＩＰが欠落している場合（Ｃ）、ＨＲＣはＦ発現細胞に特異的に局在していない。

【0279】

図８６は、ＦＩＰ－ＨＲＣが麻疹Ｆを膜融合前状態で安定させることを示す。ＦＩＰ、ＨＲＣ、及びＦＩＰ－ＨＲＣペプチドの存在下でのＭｅＶ Ｆ野生型の熱安定性。ＭｅＶ Ｆ（「ＷＴ」）を発現する２９３Ｔ細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を示されたペプチドの濃度を増加させながら、５５℃で１０分間置いた。続いて、細胞を膜融合前立体構造特異的マウスｍＡｂ（７７．４）とともに４℃でインキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８と結合した二次抗体抗マウスを検出に使用した。染色された細胞は、セルアナライザーのハイコンテンツ画像システムを使用して識別した。ｙ軸の値は、未処置の細胞と比較した陽性細胞の割合（％）を示し、立体構造抗体結合の割合を表す（膜融合前状態のＦの割合を反映している）。
これらの値は、３回の実験の結果の平均（±ＳＥ）である。［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－コレステロールペプチドは、膜融合前状態でＦを安定化させるのに最も効果的である。

【0280】

図８７は、示されたペプチドの存在下でのＭｅＶ Ｆ（ＷＴ）の熱安定性を示している。膜融合前エピトープが５５℃で１０分間インキュベートされていない試料の５０％（「安定濃度５０」又はＳＣ５０）及び９０％（「安定濃度９０」又はＳＣ９０）である濃度。これらの値は、少なくとも３回の実験の結果の平均（±ＳＥ）である。［ＦＩＰ－ＨＲＣ_{４５０－４８５}－ｐｅｇ_４］_２－ｃｈｏｌは最も効果的なＦ安定剤である。

【0281】

図８８～図９０は、可溶性Ｆに対するＭｅＶペプチドの安定化特性を示す。図８８を参照すると、細胞に２つの可溶型ＭｅＶ Ｆをトランスフェクトした。野生型Ｆ及び変異体Ｅ４５５Ｇ（膜融合前状態で本質的に安定化）を使用した。次に、細胞を、示されたペプチドの有無に関わらずインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、膜融合前立体構造特異的マウスｍＡｂ（７７．４）又は抗ヒスチジン（ＨＩＳ）抗体のいずれかを使用して、上清液のアリコートを免疫沈降させた。抗ＨＲＣポリクローナル抗体を検出に使用した。［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］ ２－ｐｅｇ１１ペプチドは、野生型（ＷＴ）可溶性Ｆを安定化する（レーン１対レーン２を参照し、レーン５の安定したＥ４５５Ｇ Ｆと比較）。図８９を参照すると、細胞に３つの可溶型ＭｅＶ Ｆをトランスフェクトした。野生型Ｆ、変異体Ｅ４５５Ｇ、二重変異体Ｅ１７０Ｇ Ｅ４５５Ｇ（両方の変異体は、細胞上で膜貫通タンパク質として発現される場合、膜融合前状態で本質的に安定化される）を使用した。次に、細胞を、示されたペプチドの有無に関わらず３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、各組み合わせの上清液の３つのアリコートを、４℃、４５℃、又は５５℃のいずれかに３０分間移行した。次に、各試料を４℃に移し、膜融合前立体構造特異的マウスｍＡｂ（７７．４）のいずれかを使用して免疫沈降させた。抗ＨＲＣポリクローナル抗体を検出に使用した。［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］２－ｐｅｇ１１ペプチドは、４５℃及び５５℃の両方で全ての可溶性Ｆタンパク質を安定化する。Ｅ４５５Ｇ変異及びＥ１７０Ｇ Ｅ４５５Ｇ変異を有する変異体可溶性Ｆは、［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］２－ｐｅｇ１１非存在下でも、膜融合前状態で３７℃で安定している。

【0282】

図９０は、ウエスタンブロットを示す。麻疹ウイルス（ＭｅＶ）膜融合タンパク質（Ｆ）野生型（ＷＴ）、Ｅ４５５Ｇ、又はＥＧ１７０－Ｅ４５５Ｇ に可溶型を発現する２９３Ｔ細胞を、１μＭの示されるペプチドあり（＋）又はなし（－）で２４時間培養した。培養細胞からの上清液を収集し、４℃、４５℃、又は５５℃で３０分間インキュベートした。次に、各試料を４℃に移し、膜融合前エピトープを認識する膜融合前立体構造特異的マウスｍＡｂ（７７．４）のいずれかを使用して免疫沈降させた。（Ａ）沈殿物を抗ＭｅＶ Ｆ ＨＲＣを使用したウエスタンブロット分析に供した。（Ｂ）ウエスタンブロット分析によって検出された免疫沈降ＭＶ Ｆタンパク質の濃度（デンシメトリー）測定。タンパク質含有量は、［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］２－ｐｅｇ１１の存在下でＭｅＶ Ｆ ＷＴに正規化した（ｎ＝３、平均±標準誤差）。［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］２－ｐｅｇ１１ペプチドは、４５℃及び５５℃の両方で全ての可溶性Ｆタンパク質を安定化する。Ｅ４５５Ｇ変異及びＥ１７０Ｇ－Ｅ４５５Ｇ変異を有する変異体可溶性Ｆは、［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－］２－ｐｅｇ１１非存在下でも、膜融合前状態で３７℃で安定している。

【0283】

図９１は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＦ活性化を防ぐことを示す（Ｆリフォールディングを防ぐＨＲＣとは異なるメカニズム）。Ｈ－ＨＮ Ｔ１９３Ａ（ＭｅＶストーク（ｓｔａｌｋ）領域とＨＰＩＶ３ヘッド（ｈｅａｄ）領域を備えたキメラ結合タンパク質で、シアル酸受容体に結合するがＭｅＶ Ｆをトリガーする）及びＭｅＶ Ｆ（Ｓ２６２Ｒ、容易に活性化されるＦ）を共発現する細胞の単層を、４℃でのシアル酸受容体保有赤血球（ＲＢＣ）に結合させた。３７℃に移行時、示される化合物又はペプチド（１μＭ）を含む培地を６０分間添加した。次に、１０ｍＭのザナミビル（Ｚａｎａｍｉｖｉｒ）を添加して、可逆的に結合した（すなわち、Ｆ挿入ではなくＨ－ＨＮによってのみ結合した）ＲＢＣを放出した。ＨＮ－受容体相互作用によって可逆的に結合される（橙色）、Ｆ挿入によって不可逆的に結合される（青色）、又は膜融合した（白色）ＲＢＣを定量化した。縦軸の値は、３連の実験の結果の平均（±ＳＥ）である。［ＨＲＣ４５０－４８５－ｐｅｇ４］２－ｃｈｏｌは、標的細胞へのＦ挿入後の膜融合を阻止する（不可逆的に結合、青色）。［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－ｐｅｇ４］２－ｃｈｏｌは、膜融合前状態で阻止する（可逆的に結合、橙色）。３Ｇは、Ｆを膜融合前状態で安定化させる小分子ですある（可逆的に結合したＲＢＣ、橙色）。ザナミビルは、３７℃のインキュベーションの開始時に添加されると全てのＲＢＣを放出した。

【0284】

図９２及び図９３は、ＦＩＰ－ＨＲＣがＭｅＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示す。図９２は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－ｐｅｇ４］２－ｃｈｏｌペプチドの局在を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、ペプチド（１μＭ）とともに３７℃で６０分間インキュベートした。Ｆタンパク質及びＨＲＣ－ＦＩＰペプチドは、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑色）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤色）で染色した。マージ画像は、共局在を示している。図９３は、３つの別々の実験からのＦＩＰ－ＨＲＣがＭｅＶ Ｆ発現細胞を標的としていることを示す。

【0285】

図９４は、示されたペプチドの存在下でのＭｅＶ Ｆ（ＷＴ）の熱安定性を示している。膜融合前エピトープが５５℃で１０分間インキュベートされていない試料の５０％（「安定濃度５０」又はＳＣ５０）及び９０％（「安定濃度９０」又はＳＣ９０）である濃度。これらの値は、少なくとも３回の実験の結果の平均（±ＳＥ）である。［ＦＩＰ－ＨＲＣ４５０－４８５－ｐｅｇ４］２－ｃｈｏｌは最も効果的なＦ安定剤である。

【0286】

図９５は、ＭｅＶペプチドの細胞毒性を示す。ＭｅＶペプチドの細胞毒性は、市販のＭＴＴアッセイを使用して２９３ＴＨＥＫ細胞培養で評価した。このペプチドには毒性がない。

【0287】

図９６は、相乗作用を示している。ＨＲＣ＋ＦＩＰのアイソボログラム分析。対角線は相加作用の線である。この線の下方、線上、又は上方にある点で表される実験データポイントは、それぞれ相乗作用、相加作用、又は拮抗作用を示す。赤色の点線は、同じ２つの成分の異なる比率でのＦＩＰ及びＨＲＣの寄与から生成された曲線である。青色の点は、ＩＣ５０濃度でのＦＩＰ－ＨＲＣ－ＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ－ＤｉｍｅｒにおけるＨＲＣ－４及びＦＩＰ－ＰＥＧ４－Ｃｈｏｌ－Ｄｉｍｅｒの寄与を表している。データは３つの実験からのものである。この表は、アイソボログラム分析の結果を示している。

【0288】

図９７は、麻疹ＨＲＣに由来する１２個のアミノ酸を含むＦＩＰ－ＨＲＣの効力を示す。麻疹Ｆに由来するＨＲＣペプチドを使用する代わりに、ヒトパラインフルエンザ３（ＨＰＩＶ３）Ｆに由来するＨＲＣペプチドを使用した。このペプチドを、ＶＩＫＩと呼ばれた。ＶＩＫＩペプチドは、ＨＰＩＶ３及びニパウイルスに対して非常に効果的であるが、麻疹では弱い阻害剤である。図９７は、ペプチドのＩＣ５０及びＩＣ９０を示している。ＦＩＰ－ＶＩＫＩ ＨＲＣ－ＰＥＧ４－ＣＨＯＬ－ＤＩＭＥＲは、ＦＩＰ－ＭＶ ＨＲＣ－ＰＥＧ４－ＣＨＯＬ－ＤＩＭＥＲよりも顕著に効力が低い。これは、効力がアミノ酸配列と相関していることを示している。改変ＦＩＰ－ＭｅＶ ＨＲＣ （ＦＩＰ－ＭｅＶ ＨＲＣ－Ｍｏｄ－ＰＥＧ４－ＣＨＯＬ－ＤＩＭＥＲ）は、麻疹ＨＲＣに由来する１２個のアミノ酸を含むＦＩＰ－ＨＲＣである。麻疹ＨＲＣ領域からの１２アミノ酸（ａａ）を含むＦＩＰ－ＭｅＶ ＨＲＣは、ＦＩＰ－ＶＩＫＩよりも効力がある。

【0289】

実施例４ ― ＦＩＰ－ＨＩＶ ＨＲＣ
（血清中和アッセイ）
シュードウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ）エンベロープ（ｅｎｖ）及びＮＬ－Ｌｕｃ－ＡＭベクターを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）試薬を使用して２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。培地を１６時間後に交換し、上清を分注し、３２時間後に－８０℃で凍結する。ウイルス滴定はＴＺＭ－ＢＬ細胞で設定され、ルシフェラーゼが１秒あたり１００，０００カウントとなる希釈を見つける。血清を解凍し、５６℃で１時間熱不活性化する。使用されない試料は－２０℃で保存する。ＴＺＭ－ＢＬ細胞を、感染の１６時間前に、不透明な白血球培養プレートに１×１０４細胞／ウェルの濃度で播種する。血清を解凍し、最高速度で１０分間スピンダウンする。血清を最初に１：５に希釈し、Ｓｐｉｎ－Ｘ（登録商標）（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））フィルターチューブを通して最高速度で１０分間回転させる。（これは精製ＩｇＧでは行わない）。

【0290】

血清は、それぞれ１：４のさらなる５段階で段階的に希釈する。対照阻害剤は、６段階で１：５に段階希釈する。希釈した血清及び対照阻害剤をプレインキュベーションプレートに移す。各動物の血清を専用のプレートに移す（ウェルあたり１１０μＬ）。各プレートには、少なくとも２つのウイルスコントロールウェル及び１つのバックグラウンドウェルが含まれ、この時点では培地のみである。次に、偽型ウイルスを解凍し、２，０００，０００ＣＰＳとなるように所定の濃度に希釈し、培地を受けるバックグラウンドウェルを除く全てのウェルに添加する（１１０μＬ）。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次に、プレインキュベーション混合物を細胞と合わせる。各ウェルには、２回の複製に充分な量が含まれている（１００μＬのプレインキュベーション混合物から１００μＬの細胞まで）。感染から１６時間後、培地を細胞から吸引し、必要に応じて交換してもよい。感染後３日目の培地を細胞から吸引し、５０μＬのＧｌｏ－Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各ウェルに添加する。アッセイプレートを－８０℃で少なくとも２時間凍結する。アッセイプレートを解凍し、各ウェルをマルチチャンネルピペットで混合する。等量（５０μＬ）のＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各ウェルに添加し、ルシフェラーゼカウントを検出する。各アッセイプレート内のバックグラウンドウェルからのカウントをサンプルデータから差し引き、カウントを阻害率（％）としてプロットし、ウイルスコントロールウェルを１００％増殖に設定する。

【0291】

（偽型ウイルストランスフェクションプロトコル）
プロトコルは、Ｔ１７５フラスコでの３０ｍＬトランスフェクション用である。Ｔ７５フラスコの場合、各量を半分にカットする。トランスフェクションの１日前：２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）をＴ１７５フラスコに約７０％コンフルエンスまで播種する。注記：完全にコンフルエントなＴ１７５フラスコを１：３に分割すると、目的の細胞濃度が得られる。トランスフェクション当日：注記：このトランスフェクションは、１６時間の終夜インキュベーションに近づけるために、１日の遅い時間に実施するのが最善である。１．５ｍＬのＥＣバッファー（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅキット－ＱＩＡＧＥＮ社、３０１４２７）を１５ｍＬ組織培養チューブに添加する。１２μｇのＤＮＡをＥＣバッファーに添加する。偽型ウイルスの場合、１２μｇのエンベローププラスミド及び１２μｇのバックボーンベクター（ＮＬ－Ｌｕｃ）を添加する。注記：試験したほとんどのエンベロープは、１：１のエンベロープ：バックボーントランスフェクションとして最も感染性があるが、ケースバイケースで理想的な比率（比率においていずれかのプラスミドの５倍以下）を経験的に決定することにより、低力価エンベロープを高めることができる。注記：ＮＬ－Ｌｕｃ－ＡＭバックボーンは、標準ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－（ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ、＃３４１８）よりも感染性の高い偽型ウイルスを生成することが一貫して証明されている。１００μＬのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅキット）を添加し、回旋により穏やかに混合する。室温で５分間インキュベートする。１２０μＬのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅキット）を添加し、回旋により穏やかに混合する。室温で１０分間インキュベートする。２９３Ｔフラスコから細胞株培地を静かに吸引する。１０ｍＬの細胞株培地（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉａ）（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ））を１５ｍＬチューブのＤＮＡ複合体にすばやく添加する。注記：ＥｆｆｅｃｔｅｎｅでＯｐｔｉ－Ｍｅｍを使用する必要はないと報告されている。ＤＮＡ複合体を含む細胞株培地をチューブからすばやく取り除き、２９３Ｔフラスコに静かに加える。注記：２９３Ｔ細胞はフラスコにしっかりと付着していないー細胞の上に培地を直接ピペッティングしないこと。フラスコを３７度で一晩インキュベートする。トランスフェクション後１日目：注記：朝一番に洗浄を行う。２９３Ｔ細胞フラスコから培地を静かに吸引する。３０ｍＬの新しい細胞株培地（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉａ）をフラスコに静かに加える。注記：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション法は細胞に対して毒性がないと報告されているー予防措置として偽型ウイルスをトランスフェクトする際に培地を交換する。トランスフェクション後２日目：注記：高い力価が報告された場合は、一日の終わりに細胞の回収を行う。回収は３日目に延期する可能性もまたある。フラスコから５０ｍＬチューブにウイルス上清を取り除く。試料を１６００ｒｐｍで１０分間回転させる。注記：この時点では、クライオチューブ（ＶＷＲ、＃６６０２１－９９６）にラベルを付してもよい。ステリフリップ（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＳＣＧＰ００５２５）又は同等品を介してウイルス上清を滅菌ろ過する。注記：この工程は、残っている細胞片を取り除くために行われるが、フィルター上にウイルスが捕捉される場合があると報告されている。低力価ウイルスの場合、本工程を省略してもよい。ウイルス上清を各１ｍＬのクライオチューブにすばやく分注する。直ちに試料を－８０℃の冷凍庫に置く。注記：ウイルスが細胞なしで室温に長く留まるほど、力価は低くなる。一度に１又は２以上のウイルスに対してこの回収を実施することは推奨されない。分注は氷上でも行ってもよい。

【表4】

【0292】

図９８～図１０３は、様々なウイルスの阻害データを示している。図９８は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＢＧ５０５（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示す。図９９は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＢ４１（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示す。図１００は、様々脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用した１６０５５（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示す。図１０１は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用したＭＮ（ＨＩＶ－１株）の阻害データを示す。図１０２は、様々な脂質－ペプチド複合体並びに陽性及び陰性対照を使用した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の阻害データを示す。図１０３は、様々な脂質－ペプチド複合体を使用したマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の阻害データを示す。

【0293】

実施例５ ― 脳における感染及び拡大な麻疹ウイルスウイルス膜融合複合体の分子的特徴
（要約）
膜融合タンパク質（Ｆ）に単一のアミノ酸変化を有する麻疹ウイルス（ＭｅＶ）分離株（Ｌ４５４Ｗ）が、ＭｅＶ中枢神経系（ＣＮＳ）感染で死亡した患者で同定された。この変異がＣＮＳの野生型ウイルスよりも健康上の利点をもたらし、それによってこれらの患者の病気に寄与するかどうかを分析した。マウスの器官型脳培養（ＯＢＣ）及びヒト脳オルガノイドを使用して、Ｆにおける特定のＣＮＳ適応変異が、自然免疫応答の増強に関連して、エクスビボでのウイルスの拡散を増大させることを示す。脳組織におけるウイルスの拡散は、Ｆを標的とする阻害性ペプチドによって阻止され、これはＦがＣＮＳ内の播種に関与しているという見解を支持している。ＭｅＶ Ｆの単一の変異は、膜融合複合体を変化させてウイルスをより神経病原性にし、自然免疫応答に直面しても脳組織で増殖可能にする。

【0294】

（緒言）
安全かつ効果的な麻疹ウイルス（ＭｅＶ）ワクチンが利用可能であるにもかかわらず、ＭｅＶは根絶されておらず、２０１０年以降、世界中で毎年１００，０００～１４０，０００人が死亡している（Ｍｏｓｓ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｎ， ２０１２； Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。ワクチン接種によるＭｅＶの根絶は、一つにはワクチンの安全性に対する不当な親の懸念に関連することが多いワクチン接種率の低さによって妨げられている（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。また、ワクチンは弱毒生ウイルスであり、重度の免疫不全である人々には使用できない。麻疹は世界的に再燃しつつあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックにより小児期の定期的なワクチン接種率が低下し、より脆弱な個人が感染にさらされる場合があるため、悪化する可能性がある。

【0295】

ＭｅＶは最初の感染時に、気道内の活性化されたＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）を発現する免疫細胞に感染し、それによって免疫系へのアクセスを獲得する（Ｔａｔｓｕｏ， Ｏｎｏ， Ｔａｎａｋａ， ＆ Ｙａｎａｇｉ， ２０００）。流入領域リンパ節に到達した後、前記ウイルスはＣＤ１５０発現リンパ球で増殖し、そこからウイルス血症を引き起こす。感染後期に、ＭｅＶはこれらの細胞の基底外側膜に発現されるネクチン４を介して呼吸器上皮細胞に感染し、この部位からＭｅＶは宿主の気道から放出されて伝染し得る（Ｍuｈｌｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｎｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。

【0296】

ＭｅＶは、感染の急性期から数日～数年後に致命的な合併症を引き起こす場合がある（Ａｌｌｅｎ， ＭｃＱｕａｉｄ， ＭｃＭａｈｏｎ， Ｋｉｒｋ， ＆ ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， １９９６； Ｂｕｃｈａｎａｎ ＆ Ｂｏｎｔｈｉｕｓ， ２０１２； Ｈｏｓｏｙａ， ２００６）， ｗｈｅｎ ｉｔ ｉｎｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ （ＣＮＳ）。ごく一部の症例では、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）が最初の感染から数年後に発症する。ＳＳＰＥは、超変異ＭｅＶゲノムＲＮＡ及びウイルス転写産物に関連する脳の持続感染並びに不完全なウイルス粒子集合を特徴とする（Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｓｃｈｍｉｄ， Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＆ Ｕｄｅｍ， １９８８； Ｒｉｍａ ＆ Ｄｕｐｒｅｘ， ２００５； Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。麻疹封入体脳炎（ＭＩＢＥ）は、野生型（ＷＴ）ウイルスに感染してから数週間～数か月後に免疫不全患者に発生し、まれに、使用されなくなった旧型の弱毒化ＭｅＶワクチンで発生していた（Ｂａｌｄｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｂｕｃｈａｎａｎ ＆ Ｂｏｎｔｈｉｕｓ， ２０１２； Ｈｕｇｈｅｓ， Ｊｅｎｎｅｙ， Ｎｅｗｔｏｎ， Ｍｏｒｒｉｓ， ＆ Ｋｌａｐｐｅｒ， １９９３）．ＭＩＢＥは、細胞表面の受容体と会合する必要なしに膜融合を媒介するウイルス膜融合複合体と関連している場合があり、高膜融合性ＭｅＶ膜融合複合体と称される（Ｈａｒｄｉｅ， Ａｌｂｅｒｔｙｎ， Ｈｅｃｋｍａｎｎ， ＆ Ｓｍｕｔｓ， ２０１３； Ｃ． Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。現在まで、ＭｅＶ感染及びＣＮＳでの拡散を支配するメカニズムは十分に理解されていないものの、ＣＮＳ浸潤にはウイルス膜融合（Ｆ）タンパク質が必要であると思われるため、膜融合阻害剤の標的となり得る（Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８； Ｍａｋｈｏｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍ． Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｙｏｕｎｇ ＆ Ｒａｌｌ， ２００９）。

【0297】

ＭｅＶによる細胞の感染は、細胞表面受容体への付着から始まり、ウイルス表面でのＭｅＶ受容体結合（Ｈ）及び（Ｆ）タンパク質の協調作用によって侵入が媒介される。したがって、ＭｅＶのＨ／Ｆ複合体は、宿主細胞への侵入を促進するウイルス膜融合機構を構成する（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｄｕｔｃｈ， ２０１２； Ｈａｒｒｉｓｏｎ， ２００８）。感染した細胞は、Ｆを細胞内で切断される前駆体（Ｆ０）として合成して、３つのＮ末端Ｆ２サブユニットとジスルフィド結合を介して結合する３つのＣ末端Ｆ１サブユニットで構成される膜融合前Ｆ複合体を生成する。新たなウイルス粒子は、ウイルス膜の外面に準安定立体構造で速度論的に捕捉されたこの三量体Ｆ構造を提示する（Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。Ｆは、標的細胞表面侵入受容体（すなわち、野生型株の場合はＣＤ１５０又はネクチン４）によるＨ糖タンパク質の会合時に膜融合活性化のために刺激される（Ｍuｈｌｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｎｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｔａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００）．受容体の会合後、Ｈは膜融合前のＦタンパク質をトリガーして構造転移を起こし、その疎水性膜融合ペプチドを宿主細胞膜に挿入するように伸長する。次に、Ｆは安定した膜融合後の６ヘリックスバンドル構造にリフォールディングし、これによりウイルス及び標的細胞膜が共に膜融合孔を形成開始する。Ｆタンパク質がリフォールディングしてこの膜融合後状態に到達する能力は、タンパク質のＮ末端及びＣ末端に局在する２つの相補的なヘプタッドリピート（ＨＲ）領域（それぞれＨＲＮ及びＨＲＣ）間の相互作用に依存する。この膜融合工程は、これらのＨＲ領域に対応するペプチドによって阻害され得る（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。

【0298】

数人の患者において、ＨＲＣドメインに変異を有するＦタンパク質を保有するＭｅＶの分離株で、ＣＮＳ感染が観察されている（Ａｙａｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。インビボでの他の器官におけるいくつかの変異ウイルスの増殖が損なわれた（Ｓ． Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ＭＩＢＥにより死亡した２人の患者から回収されたウイルス配列には、準安定Ｆに熱不安定性を与えるＬ４５４Ｗ変異（Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）を有するＦが含まれていた。本発明者らは、このＦ変異が標的細胞への侵入に影響を与えることを既に示した。緑色蛍光タンパク質を発現し、Ｌ４５４Ｗ Ｆ（ＭｅＶ－ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗ）を保有する組換えＭｅＶ（ＩＣ３２３株）は、公知のＭｅＶ受容体を欠く細胞に拡散する。細胞間膜融合アッセイでは、Ｌ４５４Ｗ変異のみを保有するＦは、Ｈタンパク質とは無関係に膜融合を媒介する（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。対照的に、他の高膜融合性ウイルスは、膜融合のためにＨタンパク質に依存する（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。

【0299】

ＭＩＢＥ患者で同定されたＦ Ｌ４５４Ｗ変異は、ＣＮＳで新たに発生した可能性があるか（Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、野生型（ＷＴ）ウイルス集団に存在し、ＣＮＳで正の選択を受けた可能性がある。このウイルスの起源は特定できず、このＦを有するＣＮＳ分離株が他の組織に感染し得るかどうかは不明である。ある報告では、Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは、特定の膜融合阻害剤の選択圧下で出現する場合があり（Ｈａ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）、この神経病原性Ｆタンパク質を保有するウイルスがＣＮＳの外で見つかる可能性があることを示している。最近の研究では、本発明者らは、Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは、コットンラットの肺で野生型よりもよく増殖し、ＭｅＶ ＣＮＳ感染の乳児ｈＣＤ１５０ｔｇマウスモデルでは１０倍致命的であり、野生型ＭｅＶよりも速くマウスＣＮＳに到達することを示した（Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。しかしながら、この変異と脳内の変化した膜融合複合体の観察された影響の理由は解明されていない。

【0300】

この一連の実験では、ＣＮＳ適応膜融合複合体を保有するＭｅＶが、ＣＮＳ感染の２つのエクスビボモデル（マウス器官型脳培養及びヒト脳オルガノイド）での増殖と拡散の点で野生型ＭｅＶと異なるかどうかを検討した。脳炎の場合に観察される高膜融合性バリアントは、これらのモデルでは野生型よりも効率的に拡散する。感染はいかなる公知の麻疹受容体を必要とせず、感染の程度は、膜融合前状態でのＭｅＶ Ｆ（野生型又は変異体）の安定性と逆相関する。ウイルスの拡散は、Ｆのリフォールディングを阻害する膜融合阻害剤によって阻止される。自然免疫応答が誘導されるが、ウイルスの拡散を阻止するものではない。上記のエクスビボモデルにおけるウイルスの進化は、ＣＮＳ適応のためのＭｅＶ膜融合複合体の機能要件を強調している。

【0301】

（結果）
（Ｆ糖タンパク質Ｌ４５４Ｗを保有する麻疹ウイルスは細胞培養で安定しない）
本発明者ら及び他の研究者らは、患者から分離された又は実験室環境で生成された神経病原性麻疹株に関連するＭｅＶ Ｆ糖タンパク質（Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、及びＮ４６２Ｋ）の変異について既に記述している（Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９； Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。これらの変異は、Ｆタンパク質の膜融合前準安定状態に熱安定性の低下をもたらした。安定性の変化の分子決定因子を探索するために、これらの変異を、Ｆタンパク質の膜融合前立体構造（ＭｅＶ Ｆ； ＰＤＢ ５ＹＸＷ； Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）及び膜融合後立体構造（ＨＰＩＶ３ Ｆ； ＰＤＢ １ＺＴＭ； Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）のＸ線構造にマッピングした（図１０４）。３つの変異（Ｌ４５４Ｗ、Ｔ４６１Ｉ、及びＮ４６２Ｋ）は全てＨＲＣドメイン内にある。膜融合前の構造に基づいて、Ｌ４５４Ｗ変異は、同じプロトマー内のＴ３１４及び／又は隣接するプロトマー内のＬ４５７で立体障害を引き起こす可能性がある。Ｔ４６１Ｉ変異及びＮ４６２Ｋ変異は、ＨＲＣドメインの秩序だったαヘリックス領域で発生する。これらの残基のインシリコ変異は、隣接するプロトマーとの立体衝突を引き起こすであろう。最も注目すべきことに、これらの３つの変異は、膜融合前立体構造のヘッド領域とストーク領域とが接触するＨＲＣドメインの部分で発生する。この接合部での相互作用は、膜融合前状態を安定させるために重要である可能性が高く、その結果、以前のデータが示唆するように（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、この領域の変異はＭｅＶ－Ｆ膜融合前の構造の安定性の低下につながり得るだろう。

【0302】

ＭｅＶ Ｆ Ｌ４５４Ｗは、２つの別々の臨床例で見いだされた。この変異は膜融合タンパク質の安定性を低下させ、公知の受容体の非存在下であってもＭｅＶがベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）に広がることを可能にする高膜融合性の表現型を生じさせる。このような変異がウイルスの適合性に与える影響を評価するために、Ｆ Ｌ４５４Ｗを保有するＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰの組換え感染性クローンを生成し、３７℃又は３２℃のいずれかでＶｅｒｏ－ＣＤ１５０細胞で組換えウイルスを増殖させた（温度が低いほど、Ｆタンパク質をその膜融合前状態で安定させる（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５））。逆遺伝学によってＬ４５４Ｗ Ｆを保有する組換えウイルスを生成するこのプロセス（ルーチンであると予想されるプロセス）の過程で、予期しない一連の変異が出現した。両方のウイルス調製物について、力価は低いままであり、通常５．１０６ＰＦＵ／ｍＬを超える野生型ウイルス原液と比較して、３２℃で２×１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬ、３７℃で約５×１０５ＰＦＵ／ｍＬに達した。本発明者らは、変異体のウイルス力価は３７℃で野生型ウイルスと比較して著しく低下することを以前に指摘した（Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。これはＬ４５４Ｗ変異を含むＦタンパク質は、細胞培養におけるウイルス増殖に有害であることを示唆している。３継代後、同じ初期プラスミドからレスキューされたが異なる温度で増殖したこれら２つのウイルス原液の次世代配列決定は、両方のＦタンパク質にさらなる変異を示した。配列の１００％に存在するＬ４５４Ｗに加えて、Ｇ５０６Ｅ変異は３２℃で対立遺伝子頻度が約３６％で出現し、Ｅ４５５Ｇ変異は３７℃で対立遺伝子頻度が約２２％で出現した。Ｅ４５５Ｇ変異は図１０４で観察可能であるが、Ｇ５０６は利用可能な結晶構造において解像されていない。Ｌ４５４Ｗ Ｆバリアントの不安定性は、細胞培養におけるこれら２つの新しい変異の出現に有利であると仮定した。これらの予期しない突然変異は、以下で説明するように、注目に値する調査手段を提示した。

【0303】

（公知の受容体の非存在下での脳組織における野生型ウイルスに対するＭｅＶ－ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗの増殖）
Ｌ４５４Ｗ Ｆを有するＭｅＶウイルスはＣＮＳから単離されているため、脳感染症の２つのモデル（マウス及びヒト）によく適応すると仮定した。この変異は、脳内で正の選択圧下にあると仮定した。以前に、ＩＦＮＡＲ１ノックアウト（ＫＯ）マウスのマウス小脳器官型脳培養（ＯＢＣ）を使用して、ウイルス感染を評価し、ＣＮＳに存在する４つの細胞タイプ（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）においてタイプ１のＩＦＮ応答に関連する効果の非存在下で拡散した。ヒトＣＤ１５０Ｆ１導入遺伝子を発現するマウスの海馬及び小脳ＯＢＣは、野生型ウイルスの感染及び拡散を維持するが（Ｊ． Ｃ． Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、公知のＭｅＶ受容体の非存在下では、野生型ウイルスは拡散しない（Ｆｅｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９； Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。図１０５Ａ～図１０５Ｄに示される実験において、ＯＢＣは、公知の麻疹受容体を「発現しない」ＩＦＮＡＲ１ＫＯマウスに由来する。野生型ウイルス（増強緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰを発現する）は９６時間にわたって拡散できなかった（図１０６Ａ及び１０６Ｂ）。図１０５Ｃ及び図１０５Ｄにおいて、ＩＦＮＡＲ１ＫＯマウスのＯＢＣに、異なる蛍光タンパク質（赤色蛍光タンパク質、ｔｄＴｏｍａｔｏ）及びＭｅＶ－ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗ（培養で出現したさらなるＧ５０６Ｅ変異を保有）を発現する５０００ＰＦＵの野生型ウイルスを同時感染させた。感染を、２４時間（図１０５Ｃ）及び９６時間（図１０５Ｄ）でモニタリングした。野生型ウイルスは（予想どおり）組織内で効率的に拡散しなかったが、Ｌ４５４Ｗ（ＥＧＦＰ）を保有するウイルスが感染して拡散し、Ｇ５０６Ｅ変異対立遺伝子頻度が約３６％から約７０％に増加し、このＦにおける変異に対する強い正の選択圧を示した。

【0304】

（膜融合を阻止すると、全てのバリアントの拡散が阻害される）
ＭｅＶワクチン株感染研究は、Ｆタンパク質機能への干渉がＣＮＳ内での拡散を止めることが可能であることを示唆している（Ｍａｋｈｏｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。本発明者らは、ＭｅＶ Ｆ由来の二量体コレステロール結合膜融合阻害ペプチド（ＨＲＣ４と称され、Ｆを介した膜融合を阻止する）が、コットンラット及びマウスにおいて、インビボ、エクスビボ、及びインビトロで野生型ＭｅＶの感染を阻止することを以前に示した（Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， ２０１９； Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。「ウイルスへの曝露後」のＯＢＣ組織におけるウイルス播種を阻止するＨＲＣ４ペプチドの有効性を図１０５Ｅ～１０５Ｇで評価した。ここで使用されるＯＢＣは、公知のＭｅＶ受容体のいずれも発現しないＩＦＮＡＲ１ＫＯから得た（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。

【0305】

実験終了時にＯＢＣに存在するウイルス量を反映するＭｅＶＮＲＮＡコピーの量は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して定量化した。図１０５Ｆは、未処理試料のウイルス量と比較して、１００ｎＭのＨＲＣ４ペプチドで感染後に処理された培養物におけるウイルス量の有意な２対数の減少（＊＊ｐ＝０．００８、マン・ホイットニーのＵ検定）及び１０ｎＭで処理された群におけるＭｅＶＮＲＮＡコピー数の４倍の有意な減少（＊ｐ＝０．０３、マン・ホイットニーのＵ検定）を示す。低濃度の膜融合阻害剤で処理した群では、ウイルス量の有意な変動は観察されなかった。ＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗウイルスが組織に侵入し、感染から４日後に培養全体に広範な膜融合領域を形成した（図１０５Ｇ）。ＨＲＣ４ペプチド（１００ｎＭ又は１０ｎＭのいずれか）は、同じ期間にわたってＭｅＶ－ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗの拡散を阻止する（図１０５Ｇ）。使用した最高濃度（１００ｎＭ）では、単離された単一の感染細胞のみが観察された。低濃度（１０ｎＭ）は部分的に阻害性であり、限局性の播種領域がいくつか観察され（図１０５Ｇ）、低濃度（１０ｎＭ未満）と未処理組織の間に有意差は認められなかった（図１０５Ｆ）。膜融合阻害剤は感染の２４時間後に添加されたため、これらの結果は、ＨＲＣ４ペプチドが３次元ＣＮＳ組織での細胞から細胞への拡散を阻止することを示しており、脳組織でのＭｅＶの播種は膜融合タンパク質の機能に依存することを示唆している。ヒトＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）受容体を発現するＩＦＮＡＲ１ＫＯマウスからのＯＢＣを使用して、ＣＮＳでのウイルス拡散を増強した場合でも、最高濃度のペプチドは、少なくとも野生型ウイルスと同様にＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗの播種を阻止した（図１０８）。

【0306】

（免疫コンピテントなＯＢＣにおけるＬ４５４Ｗ保有ウイルスの進化）
完全にコンピテントなマウスＣＮＳの存在下でＬ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ又はＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅのいずれかの二重集団を保有する２つのウイルスのウイルス進化を評価するために、野生型マウスからＯＢＣを導出した。Ｃ５７ＢＬ／６乳児マウスのＯＢＣは、ＭｅＶ野生型及びＬ４５４ＷＦウイルス（追加のＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ又はＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅのいずれか）に感染させた。このモデルでは野生型ウイルスが拡散しないことを観察していたが（Ｆｅｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）、その結果をここで確認した。対照的に、Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは両方とも、Ｃ５７ＢＬ／６ ＯＢＣで効率的に拡散し、７日後に同様のレベルの感染を示した（図１０５Ｈ）。７日後、トランスクリプトーム、ウイルスの進化、及びウイルスＲＮＡの定量化を評価するために、ＯＢＣを配列決定の目的で溶解した。Ｃ５７ＢＬ／６ ＯＢＣでは、Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは、野生型ウイルスに感染したＯＢＣ（拡散が最小限）と比較して、強いインターフェロンシグナル伝達に関連する遺伝子発現パターンを誘導した。この場合、遺伝子パターンは非感染ＯＢＣと区別できなかった（図１０９を参照、差次的遺伝子発現分析用）。この強力な自然免疫応答にも関わらず、減少したもののＬ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスの拡散は停止しなかった（図１０５Ｉを参照）。次に、これらのＯＢＣのウイルス配列を分析して、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ及びＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅの変異が保存されているかどうかを判断した。配列分析は、補足資料のＬＡＶＡプロット（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９ｂ）に示されている。ＬＡＶＡプロット＃１は、４つの試料（ＣＭ００５～ＣＭ００８）のＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅと１つの試料（ＣＭ０１７）のＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇの対立遺伝子頻度を示している。Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅインプットウイルスの二重変異体の対立遺伝子頻度は約３６％（ウイルス調製物で観察）で、エクスビボ組織で７日後に９７％、８９％、９６％、７８％に上昇した。Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇの場合、インプットウイルスの二重変異体の対立遺伝子頻度は約２２％であり、エクスビボからの配列では二重変異体は約４％に減少した。

【0307】

（ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドの感染：ＣＮＳ適応変異体対野生型ウイルス）
ＣＮＳモデリングをヒトの神経組織に拡張するために、ｈｉＰＳＣ（２人の別々のドナー、１人の男性及び１人の女性、それぞれＦＡ１０及びＦＡ１１）を脳オルガノイドに分化させた（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， ２０１４）。９０日齢のオルガノイドは野生型又はＬ４５４ＷＦを保有するウイルスに感染させた。このモデルでのウイルス拡散の変化が単に個々の突然変異に起因するのではなくＦの特性に関連しているかどうかを分析するために、オルガノイドをまた、変異Ｎ４６２Ｋ（ハムスターの脳で効率的に増殖することが既に見いだされている実験室適応変異）及びＴ４６１Ｉ（既にＳＳＰＥの症例で見いだされている）を有するＦを保有するＭｅＶに感染させた（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。これらの変異は図１０４に記載されている。感染を１０日間にわたってモニタリングし、蛍光をモニタリングすることによって拡散を評価した（図１０６Ａ及び図１１０は１０日目に撮影した写真を示す）。感染が等量のウイルスで行われたことを確認するために、ヒト脳オルガノイドの感染に使用された接種材料を、図１０６Ｂ及び図１１０に示すように、ＣＤ１５０を発現するベロ細胞（Ｖｅｒｏ－ＣＤ１５０）で並行して評価した。全てのウイルス力価は同様であり（ＰＦＵ／ｍＬ）、Ｌ４５４Ｗ変異体はわずかに低かった。Ｖｅｒｏ－ＣＤ１５０では、全てのウイルスが３日以内に細胞単層を効率的に拡散及び破壊した（データは示していない）。１０日後、トランスクリプトームを評価し、オルガノイド感染中のウイルスの進化をモニタリングし、ウイルスＲＮＡを定量化するために、感染及び非感染ヒト脳オルガノイドをＲＮＡ配列決定の目的で溶解した（図１０７Ｃ、図１０７Ｄ、図１１２、及び補足資料を参照）。

【0308】

Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは、野生型Ｆを保有するウイルスよりもヒトの脳オルガノイドにおいてより効率的に拡散し（図１０６Ａ及び図１０６Ｃ）、感染の２４時間後に添加されたＨＲＣ４膜融合阻害剤によって効率的に阻止された（図１１０）。Ｔ４６１Ｉ変異Ｆ（ＳＳＰＥ患者由来）を保有するウイルスも脳オルガノイドに拡散した。対照的に、Ｎ４６２Ｋ Ｆを保有するウイルスは、野生型ウイルスと比較して拡散の中程度の増加しか示さなかった（図１０６Ａ及び図１０６Ｃ）。

【0309】

図１０６Ｄでは、ヒト脳オルガノイドにおいて、非感染細胞又は感染細胞（野生型ウイルス又はＬ４５４Ｗ Ｆタンパク質を保有するウイルスのいずれか）間の差次的遺伝子発現を比較した。Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するＭｅＶは、ＭｅＶ野生型（ＷＴ）よりも数倍高い１００万リードあたりのリード数（ＲＰＭ）で存在した（図１０６Ｄ）。Ｌ４５４Ｗ Ｆを保有するウイルスは、野生型ウイルス及び対照試料に感染したオルガノイドと比較して、インターフェロンシグナル伝達に関連する遺伝子発現パターンを誘導した（ｐ＝２．６×１０－１７、差次的遺伝子発現分析については図１１０を参照）。インターフェロン応答は特定のＦ変異とは無関係にウイルス数と相関しているように見えるため、この応答はウイルス増殖の違いの結果である可能性が高いと思われる（図１１１は、図１０６Ａに示す全てのＭｅＶバリアントによる感染との差次的発現を示す）。ヒト脳オルガノイドの両方のセットについて、最も高い遺伝子レベルの発現係数は、以前に言及されたように（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）、最も若い胎児の発達段階（妊娠後８～１３週間）及び扁桃体に由来する脳組織（図１１２）と相関した。２つのヒト脳オルガノイド感染シリーズに共通する差次的に発現される遺伝子の経路分析は、強いインターフェロン応答がヒト脳オルガノイドにおける麻疹感染によって誘発されることを明らかにした（図１１３）。

【0310】

次に、２つのウイルス集団（Ｌ４５４Ｗ－Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ及びＬ４５４Ｗ－Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅ）が、マウスの器官型脳切片と同様にこのモデルで進化したかどうかを検討した。配列分析はＬＡＶＡプロットで表示される。Ｌ４５４Ｗ－Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅ集団の場合、脳オルガノイドから出現するウイルス配列は、ウイルス原液の対立遺伝子頻度が約３６％からＦＡ１０では約９６％及びＦＡ１１脳オルガノイドでは約７８％に増加したＦタンパク質のＧ５０６Ｅ変異体で顕著であった（図１１４のＦＡ１０のデータを参照）。２番目のウイルス原液（Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇを有する、二重変異体は２２％の対立遺伝子頻度で存在）を使用して、２番目の脳オルガノイドセット（ＦＡ１１ ｉＰＳＣに由来）に感染させた。Ｌ４５４Ｗ変異は維持され、Ｅ４５５Ｇ Ｆの対立遺伝子頻度はオルガノイドで約２％に減少した（図１１５を参照）。野生型ウイルスは顕著な変化を示さなかった（図１１６を参照）。

【0311】

（Ｌ４５４Ｗ Ｆバックグラウンドのさらなる変異は、Ｆタンパク質の膜融合前状態を安定させる）
マウス及びヒトの両方の組織で、ＦにおけるＧ５０６Ｅの正の選択及びＥ４５５Ｇの負の選択が観察された。２つの追加の変異のこの異なる選択の理由を理解するために、示されたＦタンパク質のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を使用して、単独及びＬ４５４Ｗとの組み合わせの両方で追加の変異を保有するＦの機能特性を評価した。Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅ変異を保有するＦは、機能アッセイにおいて野生型Ｆよりも有意に不安定であったが、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇを保有するＦは野生型Ｆよりも安定していた（図１０８Ａ及び図１０８Ｂ）。神経病原性バリアントの特徴は、公知のウイルス受容体なしで膜融合する能力であり、この表現型は依然として存在していた。Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅ Ｆは、いずれの公知の受容体（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ又はネクチン４）なしで膜融合を媒介できる。しかしながら、オルガノイドの増殖中に頻度が劇的に減少したＥ４５５Ｇ変異を有する、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆは、公知の受容体なしでは膜融合を媒介しない。

【0312】

図１０７Ａ及び図１０７Ｂの結果に基づいて、次に、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆを保有する同種のウイルス集団が、器官型脳切片及び脳オルガノイドモデルで野生型ウイルスのように挙動するかどうか、及びＥ４５５Ｇがこれらの神経組織で負の選択圧を受けるかどうかを検討した。したがって、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５ＧＦタンパク質又はＥ４５５ＧＦタンパク質のいずれかを保有する２つの新たなウイルスの生成を試み、エクスビボでの脳組織での増殖と拡散を分析した。二重変異体Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆを保有する組換えウイルスは、Ｖｅｒｏ－ＣＤ１５０の野生型ウイルスと同様に増殖した。しかしながら、単一変異したＥ４５５Ｇ Ｆを保有する組換えウイルスは回収できず、培養に有害であることが示唆された。二重変異体が脳において有利であるかどうかを決定するために、図１０５Ｄのように、ＯＢＣにおいて、野生型（ＷＴ）（赤色）及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ（緑色）Ｆ保有ウイルスと同時感染させた。図１０７Ｅは、感染後９６時間のウイルス拡散の程度を示している。図１０５Ｄに示された結果とは明らかに対照的に（Ｌ４５４Ｗウイルスが組織全体に侵入し、野生型感染が制限された場合）、同時感染により、野生型（ＷＴ）ウイルスとＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇウイルスの両方で同様の（制限された）拡散が発生した。

【0313】

ヒト脳オルガノイドにおけるＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇウイルスの表現型を確認するために、９０日齢のオルガノイドに感染させた（図１０７Ｆ～図１０７Ｈ）。感染を１０日間にわたってモニタリングした。図１０７Ｆは、１０日目のウイルス拡散の蛍光量を示している。意図した量のウイルス（５０００ＰＦＵ／ウェル）で感染が確実に行われるようにするために、ヒト脳オルガノイドの感染に使用される接種材料を、図１０７Ｇに示すようにＶｅｒｏ－ＣＤ１５０で並行して評価した。Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆ保有ウイルスは、１０日後にＦＡ１０及びＦＡ１１ ｈｉＰＳＣ由来の脳オルガノイドの両方で限定的な広がりを示したが（図１０７Ｆ）、Ｖｅｒｏ－ＣＤ１５０では２日以内に細胞単層が広がり破壊された（図１０７Ｇ）。１０日後、トランスクリプトームを評価し、オルガノイド感染中のウイルスの進化をモニタリングし、ウイルスＲＮＡを定量化し、ウイルスの進化を評価するために、感染及び非感染ヒト脳オルガノイドをＲＮＡ配列決定の目的で溶解した（図１０７Ｈ、図１１１、図１１３を参照）。Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇからの感染のウイルスゲノムの量は、野生型ウイルスで観察されたものと同様であり（図１０６）、１０日後も二重変異は安定したままであった（ＬＡＶＡプロット＃５を参照）。これらの知見を確認するために、別の脳オルガノイドのセットをｈｉＰＳＣＦＡ１１から分化させた。合計９つのウェルを、１０００ＰＦＵ／ウェルの野生型、Ｌ４５４Ｗ Ｆ（混合集団Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ）、及びＬ４５４５／Ｅ４５５ＧＦを保有するウイルスに感染させた。感染から２０日後、脳オルガノイドを溶解し、ウイルス配列決定のためにＲＮＡを抽出した。データはＬＡＶＡプロット＃６に示されている。野生型ウイルスは、３つの試料全てで対立遺伝子頻度が約３０％のＰ遺伝子（Ｒ７７Ｃ）にのみ変化を認めた。１つの試料のＬ４５４ＷＦ保有ウイルス（混合集団Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ）は、Ｅ４５５Ｇ変異を完全に排除した。２番目の試料ではＥ４５５Ｇは約２４％に留まり、３番目の試料はＥ４５５Ｇを欠失し、約２３％の頻度で追加の変異（Ｄ５３８Ｇ）を獲得した。二重変異体Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇは、有意な変化なしに安定したままであり、脳オルガノイドにうまく広がることができない。

【0314】

Ｇ５０６ＥのようなＦ安定化変異が必ずしもＣＮＳ適応を干渉しないという知見に照らして、そのような表現型のエビデンスをインビボで検索した。ＦのＬ４５４Ｗ変異に関する最初の文献の時点で分離された患者のウイルス（Ｈａｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）は、Ｆタンパク質（Ｍ３３７Ｌ）に追加の変異を有していた。Ｆの膜融合及び安定性に対するＭ３３７Ｌの効果を、単独及びＬ４５４Ｗとの組み合わせの両方で評価した（図１０７Ａ及び図１０７Ｂ）。発現されたＭ３３７ＬＦは、受容体の非存在下では膜融合を媒介せず、その膜融合前状態は野生型Ｆよりも安定していた。Ｍ３３７Ｌ／Ｌ４５４Ｗ Ｆは、受容体の非存在下で膜融合を促進し、野生型Ｆよりも有意に熱安定性が低かった。インビボでの進化は、異なる変異残基を介して、Ｇ５０６Ｅによって引き起こされたものと同様の機能変化をもたらした。このパターンは、ＣＮＳ固有の適応パターンを反映している。

【0315】

（検討）
南アフリカのＭｅＶの流行では、８人のＨＩＶ感染患者がＭｅＶＣＮＳ症状で死亡した（Ａｌｂｅｒｔｙｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。１つのＣＮＳ適応膜融合複合体（Ｈ及びＦで構成される）の特性を特性評価した（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ＭＩＢＥ患者の中枢神経系からのＭｅＶの膜融合複合体配列は、Ｆが公知の侵入受容体なしで活性化されるように変更される。２人の別々の患者からの分離株のＦタンパク質は、４５４位（Ｌ４５４Ｗ）に１つの特定のアミノ酸変化を含み、異型付着タンパク質との膜融合を媒介するＦの能力を高め、Ｆの熱安定性を著しく低下させる（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。

【0316】

予想外に有益な変異のセットは、逆遺伝学によってＬ４５４ＷＦを保有する組換えウイルスを生成する技術的プロセスから偶然に出現した。３７℃で実施した標準的な方法では、Ｌ４５４Ｗ Ｆ又はＬ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆのいずれかを保有するウイルスの混合集団が発生した。Ｆを安定させるためにウイルス産生の温度を３２℃に下げると、Ｌ４５４Ｗ及びＬ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅの両方を含む集団が得られた。Ｅ４５５はＨＲＣドメインに位置しているが（図１０４を参照）、残基Ｇ５０６は膜貫通ドメインにあり、ＭｅＶ Ｆの利用可能な結晶構造では分解されない。荷電残基を膜貫通ドメインに配置すると、タンパク質の折り畳み及び活性に劇的な影響を与える可能性があるが、この変異はエクスビボモデルで正の選択を受けた。私たちのデータは、ＨＲＣ変異Ｅ４５５ＧがＦの安定性を高め、Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆ（Ｌ４５４Ｗとは対照的に）が膜融合を媒介するために受容体へのＨ（ＭｅＶ受容体結合タンパク質）の会合を必要とすることを示している。したがって、この２番目のＨＲＣドメイン変異は、Ｈ受容体相互作用の要件を付与する。Ｇ５０６Ｅ膜貫通ドメイン変異は、Ｆの安定性をわずかに回復させたが、二重変異体Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６ Ｆは、野生型よりも安定性が低く、公知の受容体の非存在下で膜融合を媒介する。技術的プロセスの結果として生じたものの、これらの代償性変異は、公知の受容体なしで膜融合可能なウイルスがＣＮＳで正の選択を受けているという直接的なエビデンスを提示した。

【0317】

Ｔ４６１Ｉタンパク質及びＮ４６２ＫＦタンパク質を保有するウイルスは、細胞培養及びエクスビボの両方で遺伝的に安定しているように見えるが（データは示さず）、Ｎ４６２Ｋ Ｆを保有するウイルスは、驚くべきことに、人間の脳オルガノイドで予期されるほどには増殖しなかった。二重変異体Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６Ｅは、両方の培養条件に適合する「バランス」に達していると見られる。ヒトパラインフルエンザウイルス３型について観察したように（Ｉｋｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、細胞培養における臨床検体からのウイルスの単離は、ウイルスの進化に選択圧を提供し、臨床株の本来の特徴を曖昧にする可能性がある。臨床試料の直接配列は、これらの細胞株アーチファクトの発生を回避する（Ｉｋｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。コンセンサスＦ（ＳＳＰＥ Ｆ）に５つのアミノ酸変化（Ｇ１６８Ｒ、Ｅ１７０Ｇ、Ｓ２６２Ｇ、Ａ４４０Ｐ、Ｒ５２０Ｃ、Ｌ５５０Ｐ）を有していたＳＳＰＥ症例からのウイルスについて以前に説明した（Ａｎｇｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。ＳＳＰＥ Ｆは、野生型Ｆよりも熱安定性が低く、公知の受容体の非存在下で膜融合を媒介できた。変異の影響を個別に評価したところ、変異だけでは膜融合特性を付与できないことが判明した。変異のいくつかは、膜融合前Ｆの安定性を増加させた（例えば、Ｅ１７０Ｇ）が、他の変異はそれを減少させた（例えば、Ｓ２６２Ｇ）。完全にＣＮＳに適応したＳＳＰＥ Ｆにつながるインビボ進化が臨床例で起こったのではないかと推測する。

【0318】

ＦのＬ４５４Ｗ変異が最初に同定された臨床試料の１つのディープシーケンシングにより、Ｆタンパク質に他のいくつかの変異が存在することが明らかになった。Ｆタンパク質（Ｍ３３７Ｌ）の１つのさらなる変異は、Ｌ４５４Ｗのそれと同様の対立遺伝子頻度を有し、Ｍ３３７Ｌ／Ｌ４５４Ｗを保有するＦタンパク質は、Ｌ４５４Ｗ／Ｇ５０６変異を保有するＦの膜融合表現型と一致した、これは脳オルガノイドで観察されたものと同様のＦ機能に対するインビボウイルス進化を示している。これらの結果は、同様に不安定で受容体に依存しないＦに達する様々な変異が、ＣＮＳで正の選択を受け得ることを示唆している。Ｍ３３７Ｌ変異をＭｅＶ Ｆの膜融合前構造にマッピングした。この変異は、Ｌ２５６及びＬ２５７と疎水性相互作用を形成して、ＭｅＶ Ｆの膜融合前立体構造を安定化させ得るものであった。Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆを保有するウイルスは、実験で回収に成功し、野生型ウイルスと同様に挙動した。脳オルガノイドの感染は限定的であり（野生型ウイルスに関して）、本明細書に示された２つの別々の実験の１０～２０日のスパンでは、変異の負の選択を受けなかった。より長い感染は、Ｅ４５５Ｇ変異の排除又はは追加の変異の導入をもたらし得た可能性がある。いくつかの試みにもかかわらず、純粋にＥ４５５Ｇ Ｆを保有するウイルスは回収できず、Ｅ４５５ＧＦの安定性の向上は適合性に悪影響を与え得ることが判明した。

【0319】

（図の説明文）
図１０４Ａは、ＣＮＳ適応ウイルスからのＦタンパク質内の置換の位置を示す。（Ａ）膜融合ペプチド（ＦＰ）ドメイン、Ｎ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＮ）ドメイン、Ｃ末端ヘプタッドリピート（ＨＲＣ）ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び細胞質（ＣＴ）ドメインを示すＭｅＶ Ｆの概略図。（Ｂ）膜融合前（左、ＭｅＶ Ｆ； ＰＤＢ ５ＹＸＷ）立体構造及び膜融合後（右、ＨＰＩＶ３ Ｆ； ＰＤＢ １ＺＴＭ）立体構造のリボン図。Ｆタンパク質構造における５つの置換（Ｍ３３７Ｌ、Ｌ４５４Ｗ、Ｅ４５５Ｇ、Ｔ４６１Ｉ、及びＮ４６２Ｋ）を示す。

【0320】

図１０５は、野生型（ＷＴ）対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルスのエクスビボ感染を示す。ＣＮＳ適応ウイルスは、器官型脳培養（ＯＢＣ）において野生型（ＷＴ）ウイルスよりも優れている。（Ａ及びＢ）ＩＦＮＡＲＫＯマウス脳からのＯＢＣは、ＥＧＦＰを保有する５０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／切片のＷＴウイルスに感染させた（緑色蛍光）。（Ｃ及びＤ）ＩＦＮＡＲＫＯマウス脳からのＯＢＣは、５０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／切片でｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光）及びＭｅＶ－ＩＣ３２３－Ｌ４５４Ｗ Ｆ ＥＧＦＰ（緑色蛍光）を保有するＷＴウイルスに同時感染させた。９６時間にわたってモニタリングした。写真は２４時間（Ｃ）及び９６時間（Ｄ）時点で撮影した。スケールバー＝５００μｍ。（Ｅ及びＧ）ＭｅＶ Ｆ由来の膜融合阻害剤ペプチド（ＨＲＣ４）は、ＯＢＣにおけるＬ４５４Ｗ Ｆを保有するＭｅＶの播種を阻害する。ＩＦＮＡＲＫＯマウス脳のＯＢＣを、ＭｅＶ－ＩＣ３２３－Ｌ４５４Ｗ Ｆ ＥＧＦＰに５０００ＰＦＵ／切片で４日間感染させた。ＯＢＣは、最初の感染から２４、４８、及び７２時間後にＨＲＣ４膜融合阻害ペプチドを添加することにより、示された濃度で処理するか、未処理のままとした（ＮＴ対照）。（Ｅ）手順の概略図。（Ｆ）感染後４日目に器官型切片から全ＲＮＡを回収し、ＭｅＶＮ遺伝子発現のレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。結果を、５匹の異なるマウスからの培養物の平均±標準偏差として表す（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ［マン・ホイットニーのＵ検定］）。（Ｇ）感染に関連する緑色蛍光は、示された濃度（スケールバー＝５００μｍ）で処理されたＯＢＣにおいて落射蛍光顕微鏡によって４ｄｐｉで観察された。（Ｈ）完全に免疫コンピテントなＯＢＣにおけるＬ４５４Ｗ Ｆ感染を有するエクスビボウイルス。Ｃ５７／ＢＬ６マウス脳からのＯＢＣは、１０００ＰＦＵ／切片で７日間、Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルス（１つはＦに追加のＥ４５５Ｇを、もう１つはＦにＧ５０６Ｅを有する両方のウイルス調製物を使用）に感染させた。写真は、示されているように感染の４日後に撮影した。（Ｉ）ＷＴ及びＩＦＮＡＲＫＯのＯＢＣにおけるＬ４５４Ｗ保有ウイルス増殖。ＷＴ又はＩＦＮＡＲＫＯマウス脳からのＯＢＣを、１０００ＰＦＵ／切片ＭｅＶ－ＩＣ３２３－Ｌ４５４ＷＦＥＧＦＰに７日間感染させた。感染後４日目にＯＢＣから全ＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＭｅＶＮ遺伝子発現のレベルを定量化した。結果を、少なくとも５匹の異なるマウスからの培養物の平均±標準偏差として表す（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１［マン・ホイットニーのＵ検定］）。

【0321】

図１０６は、ＣＮＳ適応ＭｅＶバリアントが、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来の脳オルガノイドに効率的に広がることを示す。（Ａ）９０日齢のヒト脳オルガノイドの２つの別々のセット（２つのｈｉＰＳＣであるＦＡ１０及びＦＡ１１に由来）を、示されたＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質を保有する組換えＭｅＶウイルス（ＥＧＦＰ又はｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質のいずれか）に感染させた。各ウイルスについて、それぞれ２～４個のオルガノイドを含む３つの別々のウェルに感染させた（５，０００ＰＦＵ／ウェル）。脳オルガノイドを経時的にモニタリングした。ここで示されている蛍光は１０日後の感染を反映している。バー＝１０００μｍ。（Ｂ）感染に使用した接種材料のウイルス力価は、ＶｅｒｏＣＤ１５０でＰＦＵ／ｍＬ（ｌｏｇ）として評価した。（Ｃ）感染後１０日目にヒト脳オルガノイドから全ＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＭｅＶＮ遺伝子発現のレベルを定量化した。（Ｄ）脳オルガノイドにおけるＷＴ対Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルス感染のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析（３つの別々の実験からのデータ）。非感染脳オルガノイド及びＭｅＶに感染した脳オルガノイドの７つの複製（ｎ＝６：非感染、ｎ＝５：ＷＴ、ｎ＝２：Ｌ４５４Ｗ Ｆ保有ウイルス）の転写プロファイルを作成した。各試料のＭｅＶのＲＰＭ値は、各ヒートマップの下に示されている。生のカウント数を全試料にわたって正規化し、差次的発現分析を実施した。Ｌ４５４Ｗ及び非感染の間で調整されたｐ値が最も低い５０個の遺伝子がヒートマップに示され、各遺伝子の平均正規化カウントに対する各サンプルのｌｏｇ２倍の変化で色分けされている。

【0322】

図１０７は、示された変異を保有するＭｅＶ膜融合（Ｆ）タンパク質の膜融合活性及び熱安定性を示す。（Ａ）示されたＭｅＶＦタンパク質及びＭｅＶ ＷＴ血球凝集素（Ｈ）を共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞（公知の麻疹受容体なし）との間の細胞間膜融合を、βガラクトシダーゼ補完アッセイによって評価した。Ｙ軸の値は、３回の独立した実験の結果の相対発光単位（ＲＬＵ）平均（標準誤差、ＳＥを含む）として表される。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１（２元配置分散分析）。（Ｂ）ネクチン４又はＣＤ１５０の存在下又は受容体なしでの野生型Ｆと比較した、示された変異を保有するＭｅＶ Ｆタンパク質（ＩＣ３２３）の膜融合活性の割合（％）。（Ｃ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示された変異を保有するＭｅＶ Ｆタンパク質でトランスフェクトし、３７℃で２４時間インキュベートし、次に示された時間（Ｘ軸）で５５℃に昇温した。Ｙ軸の値は、示されたＦタンパク質に結合する膜融合前立体構造特異的抗体の割合（％）を表す（０時間での野生型Ｆタンパク質との比較）。これらの値は、３回の独立した実験の平均である。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１（２元配置分散分析の結果は図４Ｄに要約されている）。（Ｄ）０時間（１００％）での野生型Ｆと比較して、膜融合前エピトープの割合を５０％（ＴＳ５０）及び１０％（ＴＳ１０）に減少させる５５℃での時間（分）。データは、３回の実験±ＳＥの平均である。（Ｅ）ＩＦＮＡＲＫＯマウス脳からのＯＢＣは、５０００ＰＦＵ／切片でｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光）及びＭｅＶ－ＩＣ３２３－Ｌ４５４Ｗ／Ｅ４５５Ｇ Ｆ ＥＧＦＰ（緑色蛍光）を保有するＷＴウイルスに同時感染させた。９６時間にわたってモニタリングした。写真は９６時間時点で撮影した。スケールバー＝５００μｍ。（Ｆ）９０日齢のヒト脳オルガノイドの２つの別々のセット（２つのｈｉＰＳＣであるＦＡ１０及びＦＡ１１に由来）を、Ｌ４５４５Ｗ／Ｅ４５５ＧＦタンパク質を保有する組換えＭｅＶウイルスに感染させた。２～４個のオルガノイドを含む３つの別々のウェルに感染させた（５，０００ＰＦＵ／ウェル）。脳オルガノイドを経時的にモニタリングした。ここで示されている蛍光は１０日後の感染を反映している。バー＝１０００μｍ。（Ｇ）感染に使用したウイルス接種材料のウイルス力価は、ＶｅｒｏＣＤ１５０でＰＦＵ／ｍＬ（ｌｏｇ）として評価した。写真は２日後の感染の程度を示している（ＰＦＵ／ウェルが示されている）。（Ｈ）感染後１０日目にヒト脳オルガノイドから全ＲＮＡを回収し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＭｅＶＮ遺伝子発現のレベルを定量化した。

【0323】

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４． Ａｎｇｉｕｓ， Ｆ．， Ｓｍｕｔｓ， Ｈ．， Ｒｙｂｋｉｎａ， Ｋ．， Ｓｔｅｌｉｔａｎｏ， Ｄ．， Ｅｌｅｙ， Ｂ．， Ｗｉｌｍｓｈｕｒｓｔ， Ｊ．， Ｆｅｒｒｅｎ， Ｍ．， Ｌａｌａｎｄｅ， Ａ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｂ３ Ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ２００９－２０１０ Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｓｈｏｗｓ Ｔｈａｔ Ｈｙｐｅｒｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ９３．
５． Ａｖｉｌａ， Ｍ．， Ａｌｖｅｓ， Ｌ．， Ｋｈｏｓｒａｖｉ， Ｍ．， Ａｄｅｒ－Ｅｂｅｒｔ， Ｎ．， Ｏｒｉｇｇｉ， Ｆ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ－Ｓｃｈａｕｌｉｅｓ， Ｊ．， Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ， Ａ．， Ｐｌｅｍｐｅｒ， Ｒ．Ｋ．， ａｎｄ Ｐｌａｔｔｅｔ， Ｐ． （２０１４）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ Ｆ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８８， ２９５１－２９６６．
６． Ａｙａｔａ， Ｍ．， Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｋ．， Ｔａｋｅｄａ， Ｍ．， Ｏｈｇｉｍｏｔｏ， Ｓ．， Ｋａｔｏ， Ｓ．， Ｓｈａｒｍａ， Ｌ．Ｂ．， Ｔａｎａｋａ， Ｍ．， Ｋｕｗａｍｕｒａ， Ｍ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｏｇｕｒａ， Ｈ． （２０１０）． Ｔｈｅ Ｆ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｓａｋａ－２ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｓｕｂａｃｕｔｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８４， １１１８９－ １１１９９．
７． Ｂａｌｄｏｌｌｉ， Ａ．， Ｄａｒｇeｒｅ， Ｓ．， Ｃａｒｄｉｎｅａｕ， Ｅ．， Ｖａｂｒｅｔ， Ａ．， Ｄｉｎａ， Ｊ．， ｄｅ Ｌａ Ｂｌａｎｃｈａｒｄｉeｒｅ， Ａ．， ａｎｄ Ｖｅｒｄｏｎ， Ｒ． （２０１６）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ－ｂｏｄｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ （ＭＩＢＥ） ｉｎ ａ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１， ４３－４６．
８． Ｂａｔｔｌｅｓ， Ｍ．Ｂ．， Ｌａｎｇｅｄｉｊｋ， Ｊ．Ｐ．， Ｆｕｒｍａｎｏｖａ－Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ， Ｐ．， Ｃｈａｉｗａｔｐｏｎｇｓａｋｏｒｎ， Ｓ．， Ｃｏｓｔｅｌｌｏ， Ｈ．Ｍ．， Ｋｗａｎｔｅｎ， Ｌ．， Ｖｒａｎｃｋｘ， Ｌ．， Ｖｉｎｋ， Ｐ．， Ｊａｅｎｓｃｈ， Ｓ．， Ｊｏｎｃｋｅｒｓ， Ｔ．Ｈ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １２， ８７－９３．
９． Ｂｕｃｈａｎａｎ， Ｒ．， ａｎｄ Ｂｏｎｔｈｉｕｓ， Ｄ．Ｊ． （２０１２）． Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｅｑｕｅｌａｅ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９， １０７－１１４．
１０． Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ．， Ｓｃｈｍｉｄ， Ａ．， Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ．Ｄ．， ａｎｄ Ｕｄｅｍ， Ｓ．Ａ． （１９８８）． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｉｒａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｃａｕｓｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｕｂａｃｕｔｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２， １３８８－１３９７．
１１． Ｃｈａｎｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｄｕｔｃｈ， Ｒ．Ｅ． （２０１２）． Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｔｒｙ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｓ ｔｏ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｅｎｄ． Ｖｉｒｕｓｅｓ ４， ６１３－６３６．
１２． Ｃｏｓｂｙ， Ｓ．Ｌ．， ａｎｄ Ｂｒａｎｋｉｎ， Ｂ． （１９９５）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４， １３５－１３９．
１３． Ｄｅｌｈａｙｅ， Ｓ．， Ｐａｕｌ， Ｓ．， Ｂｌａｋｑｏｒｉ， Ｇ．， Ｍｉｎｅｔ， Ｍ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｆ．， Ｓｔａｅｈｅｌｉ， Ｐ．， ａｎｄ Ｍｉｃｈｉｅｌｓ， Ｔ． （２００６）． Ｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０３， ７８３５－７８４０．
１４． Ｄｅｌｐｅｕｔ， Ｓ．， Ｓａｗａｔｓｋｙ， Ｂ．， Ｗｏｎｇ， Ｘ．－Ｘ．， Ｆｒｅｎｚｋｅ， Ｍ．， Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ．， ａｎｄ ｖｏｎ Ｍｅｓｓｌｉｎｇ， Ｖ． （２０１７）． Ｎｅｃｔｉｎ－ ４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｇｏｖｅｒｎ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ａ Ｎｅｗ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｔｈｅ Ｓｑｕｉｒｒｅｌ Ｍｏｎｋｅｙ （Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１， ｅ０２４９０－１６．
１５． Ｄｅｖａｕｘ， Ｐ．， Ｈｏｄｇｅ， Ｇ．， ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ， Ｍ．Ｂ．， ａｎｄ Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ． （２００８）． Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ－ ｏｒ Ｃ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ： ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２， ５３５９－５３６７．
１６． Ｄｅｖａｕｘ， Ｐ．， Ｈｕｄａｃｅｋ， Ａ．Ｗ．， Ｈｏｄｇｅ， Ｇ．， Ｒｅｙｅｓ－ｄｅｌ Ｖａｌｌｅ， Ｊ．， ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ， Ｍ．Ｂ．， ａｎｄ Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ． （２０１１）． Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｕｎａｂｌｅ Ｔｏ Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ ＳＴＡＴ１ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｃａｎｎｏｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｉｎ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５， ３４８－３５６．
１７． Ｅｓｏｌｅｎ， Ｌ．Ｍ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒ．Ｔ．， Ｖａｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍｏｅｎｃｈ， Ｔ．Ｒ．， Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇｈ， Ｓ．Ｌ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｄ．Ｅ． （１９９５）． Ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｆａｔａｌ ｍｅａｓｌｅｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６， ２４７８－２４８１．
１８． Ｆｅｒｒｅｎ， Ｍ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ． （２０１９）． Ｍｅａｓｌｅｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ： Ｔｏｗａｒｄｓ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｖｉｒｕｓｅｓ １１．
１９． Ｆｒｅｎｚｋｅ， Ｍ．， Ｓａｗａｔｓｋｙ， Ｂ．， Ｗｏｎｇ， Ｘ．Ｘ．， Ｄｅｌｐｅｕｔ， Ｓ．， Ｍａｔｅｏ， Ｍ．， Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ．， ａｎｄ ｖｏｎ Ｍｅｓｓｌｉｎｇ， Ｖ． （２０１３）． Ｎｅｃｔｉｎ－４－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｐｒｅａｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｔｒａｃｈｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７， ２５２６－２５３４．
２０． Ｇｅｎｅｒｏｕｓ， Ａ．Ｒ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｏ．Ｊ．， Ｔｒｏｙａｎｏｖｓｋｙ， Ｒ．Ｂ．， Ｍａｔｅｏ， Ｍ．， Ｎａｖａｒａｔｎａｒａｊａｈ， Ｃ．Ｋ．， Ｄｏｎｏｈｕｅ， Ｒ．Ｃ．， Ｐｆａｌｌｅｒ， Ｃ．Ｋ．， Ａｌｅｋｈｉｎａ， Ｏ．， Ｓｅｒｇｅｅｖａ， Ａ．Ｐ．， Ｉｎｄｒａ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｔｒａｎｓ－ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｎｅｃｔｉｎｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃａｒｇｏ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １３２．
２１． Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｄ．Ｅ．， Ｌｉｎ， Ｗ．－Ｈ．， ａｎｄ Ｐａｎ， Ｃ．－Ｈ． （２０１２）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ， ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ３６， ６４９－６６２．
２２． Ｈａ， Ｍ．Ｎ．， Ｄｅｌｐｅｕｔ， Ｓ．， Ｎｏｙｃｅ， Ｒ．Ｓ．， Ｓｉｓｓｏｎ， Ｇ．， Ｂｌａｃｋ， Ｋ．Ｍ．， Ｌｉｎ， Ｌ．－Ｔ．， Ｂｉｌｉｍｏｒｉａ， Ｄ．， Ｐｌｅｍｐｅｒ， Ｒ．Ｋ．， Ｐｒｉｖe， Ｇ．Ｇ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｄ． （２０１７）． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｈａｔ Ｃｏｎｆｅｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ－ｄ－Ｐｈｅ－ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ ａｎｄ ４－Ｎｉｔｒｏ－２－ Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ Ａｍｉｎｏ－Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ９１．
２３． Ｈａｒｄｉｅ， Ｄ．Ｒ．， Ａｌｂｅｒｔｙｎ， Ｃ．， Ｈｅｃｋｍａｎｎ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｍｕｔｓ， Ｈ．Ｅ．Ｍ． （２０１３）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅａｓｌｅｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ （ＭＩＢＥ）． Ｖｉｒｏｌ． Ｊ． １０， ２８３．
２４． Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｃ． （２００８）． Ｖｉｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５， ６９０－６９８．
２５． Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ， Ｔ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｒ．， Ｋｕｒｏｄａ， Ｄ．， Ｋｕｂｏｔａ， Ｍ．， Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ， Ｙ．， Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｓ．，
２６． Ｔｓｕｍｏｔｏ， Ｋ．， Ｋｏｈｄａ， Ｄ．， Ｐｌｅｍｐｅｒ， Ｒ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒｍ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１５， ２４９６－２５０１．
２７． Ｈｏｓｏｙａ， Ｍ． （２００６）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ： ｄｉｒｅｃｔ ｖｉｒａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ？ Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ４５， ８４１－８４２．
２８． Ｈｕｇｈｅｓ， Ｉ．， Ｊｅｎｎｅｙ， Ｍ．Ｅ．， Ｎｅｗｔｏｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｋｌａｐｐｅｒ， Ｐ．Ｅ． （１９９３）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ． Ａｒｃｈ． Ｄｉｓ． Ｃｈｉｌｄ． ６８， ７７５－７７８．
２９． Ｉｋｅｔａｎｉ， Ｓ．， Ｓｈｅａｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｆｅｒｒｅｎ， Ｍ．， Ｍａｋｈｓｏｕｓ， Ｎ．， Ａｑｕｉｎｏ， Ｄ．Ｂ．， ｄｅｓ Ｇｅｏｒｇｅｓ， Ａ．， Ｒｉｍａ， Ｂ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｆｉｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ Ａｒｅ Ｌｏｓｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． ＭＢｉｏ ９．
３０． Ｊａｎｓｅｎ， Ｖ． ａ． Ａ．， Ｓｔｏｌｌｅｎｗｅｒｋ， Ｎ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｈ．Ｊ．， Ｒａｍｓａｙ， Ｍ．Ｅ．， Ｅｄｍｕｎｄｓ， Ｗ．Ｊ．， ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ｊ． （２００３）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｉｎ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１， ８０４．
３１． Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｅ．Ｍ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐａｌｅｒｍｏ， Ｌ．Ｍ．， Ｈａｒｄｉｅ， Ｄ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１５）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｆｕｓｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｓ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ． ＭＢｉｏ ６．
３２． Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｄ．Ｍ．， Ｂａｒｎｅｙ， Ｓ．， Ｌａｍｂｅｒｔ， Ａ．Ｌ．， Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｋ．， Ｍｅｄｉｎａｓ， Ｒ．， Ｄａｖｉｓ， Ｄ．Ｅ．， Ｂｕｃｙ， Ｔ．， Ｅｒｉｃｋｓｏｎ， Ｊ．， Ｍｅｒｕｔｋａ， Ｇ．， ａｎｄ Ｐｅｔｔｅｗａｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６）． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ （Ｆ） ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｆｕｓｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３， ２１８６－２１９１．
３３． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｊ．Ａ． （２０１４）． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９， ２３２９－２３４０．
３４． Ｌｅｍｏｎ， Ｋ．， ｄｅ Ｖｒｉｅｓ， Ｒ．Ｄ．， Ｍｅｓｍａｎ， Ａ．Ｗ．， ＭｃＱｕａｉｄ， Ｓ．， ｖａｎ Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ， Ｇ．， Ｙuｋｓｅｌ， Ｓ．， Ｌｕｄｌｏｗ， Ｍ．， Ｒｅｎｎｉｃｋ， Ｌ．Ｊ．， Ｋｕｉｋｅｎ， Ｔ．， Ｒｉｍａ， Ｂ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｅａｒｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ａｆｔｅｒ ａｅｒｏｓｏｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ７， ｅ１００１２６３．
３５． Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｖ．Ｈ．Ｊ．， Ｓｉｎｎ， Ｐ．Ｌ．， Ｈｏｄｇｅ， Ｇ．， Ｍｉｅｓｔ， Ｔ．， Ｄｅｖａｕｘ， Ｐ．， Ｏｅｚｇｕｅｎ， Ｎ．， Ｂｒａｕｎ， Ｗ．， ＭｃＣｒａｙ， Ｐ．Ｂ．， ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ， Ｍ．Ｂ．， Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２００８）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｂｌｉｎｄ ｔｏ ｉｔｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｍａｉｎｓ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ｂｕｔ ｃａｎｎｏｔ ｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｉｓ ｎｏｔ ｓｈｅｄ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１８， ２４４８－２４５８．
３６． Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｖ．Ｈ．Ｊ．， Ｈｏｄｇｅ， Ｇ．， Ｒｅｙｅｓ－Ｄｅｌ Ｖａｌｌｅ， Ｊ．， ＭｃＣｈｅｓｎｅｙ， Ｍ．Ｂ．， ａｎｄ Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ． （２０１０）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｌｉｎｄ ｔｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ （ＳＬＡＭ； ＣＤ１５０） ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４， ３４１３－３４２０．
３７． Ｌｉｎ， Ｊ．－Ｙ．， Ｋｕｏ， Ｒ．－Ｌ．， ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｈ．－Ｉ． （２０１９ａ）． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ １０， ３８７．
３８． Ｌｉｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｓｈｅａｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｍａｋｈｓｏｕｓ， Ｎ．， ａｎｄ Ｇｒｅｎｉｎｇｅｒ， Ａ．Ｌ． （２０１９ｂ）． ＬＡＶＡ： ａ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ａｌｌｅｌｅｓ． ＢｉｏＲｘｉｖ ２０１９．１２．１７．８７９３２０．
３９． Ｌｕｏ， Ｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｓｔａｎｏｎ， Ｒ．， Ｎｅｒｙ， Ｊ．Ｒ．， Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｊ．Ａ．， ａｎｄ Ｅｃｋｅｒ， Ｊ．Ｒ． （２０１６）． Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｂｒａｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １７， ３３６９－３３８４．
４０． Ｍａｋｈｏｒｔｏｖａ， Ｎ．Ｒ．， Ａｓｋｏｖｉｃｈ， Ｐ．， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ｅ．， Ｇｅｃｈｍａｎ， Ｌ．Ａ．， Ｇｅｒａｒｄ， Ｎ．Ｐ．， ａｎｄ Ｒａｌｌ， Ｇ．Ｆ． （２００７）． Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ－１ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓ－ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｐｒｅａｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６２， ２３５－２４４．
４１． Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｈｕｅｙ， Ｄ．， Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｅ．， Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， ＤｅＶｉｔｏ， Ｉ．， Ｔａｌｅｋａｒ， Ａ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｎｉｅｗｉｅｓｋ， Ｓ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１５）． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８９， １１４３－１１５５．
４２． Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｆｅｒｒｅｎ， Ｍ．， Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｅ．， Ｄｕｍｏｎｔ， Ｃ．， Ｒｙｂｋｉｎａ， Ｋ．， Ｈａｒｄｅｒ， Ｏ．， Ｓｔｅｌｉｔａｎｏ， Ｄ．， Ｍａｄｅｄｄｕ， Ｓ．， Ｓａｎｎａ， Ｇ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ－ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｏｕｔｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ９３：ｅ０１８６２－１８．
４３． Ｍｏｓｓ， Ｗ．Ｊ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｄ．Ｅ． （２０１２）． Ｍｅａｓｌｅｓ． Ｌａｎｃｅｔ ３７９， １５３－１６４．
４４． Ｍuｈｌｅｂａｃｈ， Ｍ．Ｄ．， Ｍａｔｅｏ， Ｍ．， Ｓｉｎｎ， Ｐ．Ｌ．， Ｐｒuｆｅｒ， Ｓ．， Ｕｈｌｉｇ， Ｋ．Ｍ．， Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｖ．Ｈ．Ｊ．， Ｎａｖａｒａｔｎａｒａｊａｈ， Ｃ．Ｋ．， Ｆｒｅｎｚｋｅ， Ｍ．， Ｗｏｎｇ， Ｘ．Ｘ．， Ｓａｗａｔｓｋｙ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｅｃｔｉｎ－４ ｉｓ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４８０， ５３０－５３３．
４５． Ｎｏｙｃｅ， Ｒ．Ｓ．， Ｂｏｎｄｒｅ， Ｄ．Ｇ．， Ｈａ， Ｍ．Ｎ．， Ｌｉｎ， Ｌ．－Ｔ．， Ｓｉｓｓｏｎ， Ｇ．， Ｔｓａｏ， Ｍ．－Ｓ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｄ． （２０１１）． Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ＰＶＲＬ４ （ｎｅｃｔｉｎ ４） ｉｓ ａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ７， ｅ１００２２４０．
４６． Ｐｅｒｒｙ， Ｒ．Ｔ．， Ｍｕｒｒａｙ， Ｊ．Ｓ．， Ｇａｃｉｃ－Ｄｏｂｏ， Ｍ．， Ｄａｂｂａｇｈ， Ａ．， Ｍｕｌｄｅｒｓ， Ｍ．Ｎ．， Ｓｔｒｅｂｅｌ， Ｐ．Ｍ．， Ｏｋｗｏ－Ｂｅｌｅ， Ｊ．－Ｍ．， Ｒｏｔａ， Ｐ．Ａ．， ａｎｄ Ｇｏｏｄｓｏｎ， Ｊ．Ｌ． （２０１５）． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｍｅａｓｌｅｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ － ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ， ２０００－２０１４． ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ． Ｍｏｒｔａｌ． Ｗｋｌｙ． Ｒｅｐ． ６４， １２４６－１２５１．
４７． Ｐｌｅｍｐｅｒ， Ｒ．Ｋ．， Ｄｏｙｌｅ， Ｊ．， Ｓｕｎ， Ａ．， Ｐｒｕｓｓｉａ， Ａ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｌ．－Ｔ．， Ｒｏｔａ， Ｐ．Ａ．， Ｌｉｏｔｔａ， Ｄ．Ｃ．， Ｓｎｙｄｅｒ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｓ， Ｒ．Ｗ． （２００５）． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４９， ３７５５－３７６１．
４８． Ｐｒｕｓｓｉａ， Ａ．Ｊ．， Ｐｌｅｍｐｅｒ， Ｒ．Ｋ．， ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ， Ｊ．Ｐ． （２００８）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７， １３５７３－１３５８３．
４９． Ｑｉａｎ， Ｘ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｈ．Ｎ．， Ｓｏｎｇ， Ｍ．Ｍ．， Ｈａｄｉｏｎｏ， Ｃ．， Ｏｇｄｅｎ， Ｓ．Ｃ．， Ｈａｍｍａｃｋ， Ｃ．， Ｙａｏ， Ｂ．， Ｈａｍｅｒｓｋｙ， Ｇ．Ｒ．， Ｊａｃｏｂ， Ｆ．， Ｚｈｏｎｇ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｂｒａｉｎ－Ｒｅｇｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｎｉ－ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＺＩＫＶ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ． Ｃｅｌｌ １６５， １２３８－１２５４．
５０． Ｒｉｍａ， Ｂ．Ｋ．， ａｎｄ Ｄｕｐｒｅｘ， Ｗ．Ｐ． （２００５）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ． Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１１， １３２－１４７．
５１． Ｓａｔｏ， Ｙ．， Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｈａｓｈｉｇｕｃｈｉ， Ｔ．， Ｙａｎａｇｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｏｈｎｏ， Ｓ． （２０１８）． Ｃｅｌｌ－ｔｏ－Ｃｅｌｌ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｒｅａｄ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｓ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ９２：ｅ０２１６６－１７．
５２． Ｓｃｈｍｉｄ， Ａ．， Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ， Ｐ．， Ｃａｔｔａｎｅｏ， Ｒ．， Ｂａｃｚｋｏ， Ｋ．， ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ， Ｖ．， ａｎｄ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， Ｍ．Ａ． （１９９２）． Ｓｕｂａｃｕｔｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｉｓ ｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｉｎｇ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８， ９１０－９１５．
５３． Ｓｉｍｏｎｓ， Ｅ．， Ｆｅｒｒａｒｉ， Ｍ．， Ｆｒｉｃｋｓ， Ｊ．， Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ， Ｋ．， Ａｎａｎｄ， Ａ．， Ｂｕｒｔｏｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｒｅｂｅｌ， Ｐ． （２０１２）． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ２０１０ ｇｌｏｂａｌ ｍｅａｓｌｅｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｇｏａｌ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｄａｔａ． Ｌａｎｃｅｔ ３７９， ２１７３－２１７８．
５４． Ｓｕｎ， Ａ．， Ｐｒｕｓｓｉａ， Ａ．， Ｚｈａｎ， Ｗ．， Ｍｕｒｒａｙ， Ｅ．Ｅ．， Ｄｏｙｌｅ， Ｊ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｌ．－Ｔ．， Ｙｏｏｎ， Ｊ．－Ｊ．， Ｒａｄｃｈｅｎｋｏ， Ｅ．Ｖ．， Ｐａｌｙｕｌｉｎ， Ｖ．Ａ．， Ｃｏｍｐａｎｓ， Ｒ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４９， ５０８０－５０９２．
５５． Ｔａｔｓｕｏ， Ｈ．， Ｏｎｏ， Ｎ．， Ｔａｎａｋａ， Ｋ．， ａｎｄ Ｙａｎａｇｉ， Ｙ． （２０００）． ＳＬＡＭ （ＣＤｗ１５０） ｉｓ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４０６， ８９３－８９７．
５６． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｍ．， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｋ．， Ａｂｅ， Ｙ．， Ｋｏｄａｍａ， Ｅ．Ｎ．， Ｎａｂｉｋａ， Ｒ．， Ｏｉｓｈｉ， Ｓ．， Ｏｈａｒａ， Ｓ．， Ｓａｔｏ， Ｍ．， Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｙ．， Ｆｕｊｉｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｅｐｔａｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１， ｅ０１６２８２３．
５７． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ， Ｙ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．Ｏ．， Ｉｋｅｇａｍｅ， Ｓ．， Ｋｏｇａ， Ｒ．， ａｎｄ Ｙａｎａｇｉ， Ｙ． （２０１３）． Ｍｕｔａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｐｒｅａｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｓｕｃｋｌｉｎｇ ｈａｍｓｔｅｒｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８７， ２６４８－２６５９．
５８． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｏｈｎｏ， Ｓ．， Ｓｈｉｒｏｇａｎｅ， Ｙ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．Ｏ．， Ｋｏｇａ， Ｒ．， ａｎｄ Ｙａｎａｇｉ， Ｙ． （２０１５）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｐｒｅａｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ， ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｕｓｉｎｇ ｓｔｒｏｎｇ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８９， ２７１０－２７１７．
５９． Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， Ｔａｌｅｋａｒ， Ａ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐｅｓｓｉ， Ａ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１３）． Ｆａｔａｌ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｂｒａｉｎ－ｐｅｎｅｔｒａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８７， １３７８５－１３７９４．
６０． Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， Ｌｉｏｎｎｅｔ， Ｃ．， Ｔｅｒｚｉａｎ， Ｃ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｇｅｒｌｉｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ． （２０１７）． Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ： Ａ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ＣＮＳ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ７， ｅ２６０５．
６１． Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， Ｃｈａｒｖｅｔ， Ｂ．， Ｄｕｓｓｕｒｇｅｙ， Ｓ．， Ａｌｌａｔｉｆ， Ｏ．， Ａｕｒｉｎｅ， Ｎ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｇｅｒｌｉｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ． （２０１９）． Ｔｙｐｅ Ｉ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｄｒｉｖｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｔｏ Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ９３：ｅ００６１８－１９．
６２． Ｙｏｕｎｇ， Ｖ．Ａ．， ａｎｄ Ｒａｌｌ， Ｇ．Ｆ． （２００９）． Ｍａｋｉｎｇ ｉｔ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎａｐｓｅ： ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｓｐｒｅａｄ ｉｎ ａｎｄ ａｍｏｎｇ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３０， ３－３０．

【0324】

（方法）
ペプチド及び化学薬品。ＭＶ Ｆ由来の膜融合阻害ペプチドについては、既に記述されている（Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。簡潔には、ＭＶ Ｆタンパク質のＣ末端のヘプタッドリピート領域に由来する３６アミノ酸ペプチドを合成した。本研究では、ペプチドの二量体コレステロール結合（ＨＲＣ４）型を使用した。Ｎ－（３－シアノフェニル）－２－フェニルアセトアミド（３Ｇとしても知られている）は、ＺｅｒｅｎｅＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ社（英国）から購入した。３Ｇの純度は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で試験し、９５％を超える純度であることが示された。

【0325】

プラスミド及び試薬。ＭｅＶ ＩＣ３２３ Ｈタンパク質及びＦタンパク質の遺伝子は、コドン最適化、合成され、哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳにサブクローン化された。ネクチン４及びＣＤ１５０をコードするプラスミドは購入した。

【0326】

細胞。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト腎臓上皮）細胞、２９３－３－４６細胞（Ｒａｄｅｃｋｅ ａｎｄ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， １９９５； Ｒａｄｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、Ｖｅｒｏ及びＶｅｒｏ－ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０細胞（アフリカミドリザル腎臓）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ライフテクノロジーズ社（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））及び抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ライフテクノロジーズ社（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））で、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。２９３－３－４６培地及びＶｅｒｏ－ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０培地に１ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を添加した。

【0327】

組換えウイルスの産生及び分析。ＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２）は、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を発現する組換えウイルスである。Ｔ４６１Ｉ、Ｎ４６２Ｋ、及びＬ４５４Ｗの変異を有する全ての変異体は、逆遺伝学を使用してＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰバックグラウンドで生成した（九州大学の柳氏（福岡、日本）から提供されたＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰをコードするプラスミドを使用）。ＭｅＶ ＩＣ３２３－Ｔｄ Ｔｏｍａｔｏは、ＥＧＦＰ発現カセットをｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質をコードする配列に置換することによって生成した。ＭｅＶ ＩＣ３２３組換えウイルスは、以前に説明されたように２９３－３－４６細胞でレスキューした（Ｒａｄｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。Ｌ４５４Ｗを保有するウイルスのウイルス産生は、３７℃又は３２℃のいずれかで実施した。全てのウイルスを、Ｖｅｒｏ－ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０細胞で増殖及び滴定した。

【0328】

構造モデリング。タンパク質相同性サーバーＰｈｙｒｅ２を使用して、野生型（ＷＴ）麻疹ウイルス膜融合糖タンパク質（ＭｅＶ Ｆ）の２０個のモデルを作成した（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。ＭｅＶ Ｆの膜融合前及び膜融合後の状態に対する各モデルの不良な局所形状は、プログラムＸｔａｌＶｉｅｗによって手動で修正した（ＭｃＲｅｅ， １９９９）。結果として得られたモデルは、その後、膜融合前及び膜融合後の状態について、それぞれ５ＥＶＭ及び１ＺＴＭの電子密度に対してＣＮＳ－１．３（Ｂｒuｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）によって改良した。全てのＭＶ－Ｆ変異タンパク質のモデルの作成に同じ方法を用いた。全ての構造図は、ＰｙＭｏｌ （ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）を使用して作成した。

【0329】

β－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）相補性に基づく膜融合アッセイ。β－Ｇａｌ相補性に基づく膜融合アッセイは、以前に説明されたように実施した（Ｊｕｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。簡潔には、上記の構築物及びオメガレポーターサブユニットで一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、ＭＶ Ｆ ＨＲＣ由来の膜融合阻害ペプチドの存在下又は非存在下で、ウイルス糖タンパク質及びアルファレポーターサブユニットを共発現する細胞と共に示された期間インキュベートした（Ｍａｔｈｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。

【0330】

Ｆ立体構造特異的ｍＡｂによる細胞表面染色。ウイルス糖タンパク質構築物で一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）中で３７℃で一晩インキュベートした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を図に示した時間で５５℃に移行した。その後、細胞を、膜融合前の立体構造（１：１，０００）でＭｅＶ Ｆを特異的に検出するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共に、氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ－４８８抗マウス二次抗体（１：５００、ライフテクノロジーズ社）と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１：１０００に希釈した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む氷上で６０分間固定した。プレートを洗浄し、０．０１％アジ化ナトリウムを添加し、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してプレートの画像を作成した。陽性に認識された細胞の割合（％）は、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒを使用して決定した。

【0331】

感染後の器官型小脳培養の準備及び処理。小脳切片は、ＩＦＮＡＲ１ＫＯ（及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０ｔｇ×ＩＦＮＡＲ１ＫＯ）又はＣ５７／ＢＬ６マウスから調製し、他で詳述されるように培養で維持した（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。簡潔には、７日齢のマウスの脳から小脳を分離し、ＭｃＩｌｗａｉｎのティッシュチョッパー（ＷＰＩ－Ｅｕｒｏｐｅ）で切断して、厚さ３５０μｍの漸進的な切片を得た。次に、脳切片を冷Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ（登録商標）－Ａ／５ｇ／Ｌ Ｄ－グルコース／１×キヌレン酸バッファーで分離し、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））細胞培養インサート膜（ミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標））細胞培養インサート、３０ｍｍ、親水性ポリテトラフルオロエチレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））に配置した。続いて、切片を、２５％馬血清、５ｇ／Ｌグルコース、１％ＨＥＰＥＳ（全てサーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及び０．１ｍｇ／Ｌヒト組換えインスリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸ最小必須培地で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。切片化手順の後、培地は毎日交換した。切片化当日、５匹のマウスの切片をＭｅＶ ＩＣ３２３－ＥＧＦＰ－Ｆ Ｌ４５４Ｗウイルス（ＩＦＮＡＲ１ＫＯからの５．１０３ＰＦＵ／切片及びＳＬＡＭ／ ＣＤ１５０ｔｇ×ＩＦＮＡＲ１ＫＯマウスからの１００ＰＦＵ／切片）に感染させた。次に、培養物を、１日目～４日目まで、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地中のＨＲＣ４膜融合阻害剤の段階希釈又はビヒクル（未処理状態「ＮＴ」）のいずれかで毎日処理した。各ウェルの５つの切片のそれぞれの上に、２μＬの１００００ｎＭ、１０００ｎＭ、又は１００ｎＭのＨＲＣ４を添加した。数分後、ペプチドを含む液滴は完全に吸収され、供給媒体を含む系の下部区画に到達した。培養培地（１ｍＬ）の最終濃度は１００ｎＭ、１０ｎＭ、又は１ｎＭであった。各時点で、切片を収集し、ＲＮＡを抽出し、以前に説明されたようにＲＴ－ｑＰＣＲを実施した（Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

【0332】

ヒト脳オルガノイドの分化。脳オルガノイドは、以前に説明されたように（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， ２０１４）、２つのｉＰＳＣ系統（ＦＡ０００００１０及びＦＡ０００００１１、簡便にＦＡ１０及びＦＡ１１と称する）から生成した。簡潔には、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号７９２０）を使用して細胞を単一細胞懸濁液に分離し、４，５００細胞／ウェルで９６ウェル低付着Ｕ字底プレートに、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号１０８２８－０２８）、３％ＥＳ品質のバッチテスト済ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号１０４３９０２４）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号３５０５０－０３８）、１×非必須アミノ酸、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２３３ＦＢ０１Ｍ）、及び５０μＭのＹ－２７６３２を含むＥＢ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ （サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号１１３３０－０３２）に播種した。新鮮な培地に６日目まで１日おきに交換した。６日目に、ＥＢ培地をＮｅｕｒａｌＩｎｄｕｃｔｉｏｎ（ＮＩ）培地に置き換え（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２サプリメント、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、１×ＮＥＡＡ、及び１μｇ／ｍＬヘパリン（シグマアルドリッチ社、カタログ番号Ｈ３１４９））、オルガノイドを６０ｍｍ又は１００ｍｍの低付着プレートに移した。オルガノイドは１１日目～１４日目まで神経上皮組織を形成することができ、培地は１日おきに交換した。１１日目～２４日目に、オルガノイドをマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））液滴でコーティングし、３７℃で３０分間保持することによりゲル化させた。マトリゲルでコーティングしたオルガノイドを、分化培地（１：１ ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）、０．５％Ｎ２サプリメント、２％Ｂ２７サプリメント（ビタミンＡなし）（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号１２５８７０１０）、０．２５％インスリン溶液（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号１２５８５０１４）、５０μＭの２－メルカプトエタノール、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、０．５％ＮＥＡＡ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン）へ、４日間移した。４日後、オルガノイドをビタミンＡを含むＢ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号１７５０４－０４４）を含む分化培地に移した。脳オルガノイドをさらに６０日間培養し、７日ごとに培地を交換し、９０日目又は２７０日目でさらなる実験に使用した。

【0333】

脳オルガノイドＲＮＡ－Ｓｅｑ（ＲＮＡシーケンス）及び分析。非感染脳オルガノイド及び感染脳オルガノイドからのＲＮＡは、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して抽出し、ライブラリーの準備及び配列決定のためにＪＰ Ｓｕｌｚｂｅｒｇｅｒ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒに提出した。ストランド固有のＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、ポリＡエンリッチメントを使用して調製し、ペアエンド２×１００リードを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＮｏｖａＳｅｑ（商標）で配列決定した。品質及びアダプターのトリミング後、Ｋａｌｌｉｓｔｏ（バージョン０．４４．０）（Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）を使用し、ＧＲＣｈ３８を参照ゲノムとして転写産物ライブラリーを行った。

【0334】

脳オルガノイドの発達段階を理解する目的で、ＢｒａｉｎＳｐａｎデータセット（２２０３１４４０）を使用した。ＢｒａｉｎＳｐａｎは、Ｇｅｎｃｏｄｅｖ１０アノテーション（遺伝子注釈）に基づいて正規化されたＲＰＫＭ式の値を提供することから、ｂｏｗｔｉｅ２（２２３８８２８６）を使用してＲ１配列決定リードをヒトゲノムのＧＲＣｈ３７アノテーションにマッピングし、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して遺伝子レベルのＲＰＫＭレベルを定量化した（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。遺伝子は、５３９のＲＮＡ－Ｓｅｑ実験全て（５２４ ＢｒａｉｎＳｐａｎ、１５ ＭｅＶ感染）で１０００を超える任意の遺伝子レベルのＲＰＫＭ合計に基づいてフィルタリングした。Ｒ ｖ３．６．２では、疑似カウントが１のｌｏｇ２変換されたＲＰＫＭ値の全て対全て（ａｌｌ－ｂｙ－ａｌｌ）の相関行列が生成された。非感染ＦＡ１０脳オルガノイド複製１との相関係数が最も高い上位１００個のＢｒａｉｎＳｐａｎサンプルを取得し、ｐｈｅａｔｍａｐ （ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｒａｉｖｏｋｏｌｄｅ／ｐｈｅａｔｍａｐ）を使用して相関係数のヒートマップを生成した。

【0335】

Ｋａｌｌｉｓｔｏ転写産物の存在量及びＲＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、差次的遺伝子発現解析を実施した（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。分析のためのコードは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｒｅｎｉｎｇｅｒ－ｌａｂ／ＭｅＶ－ｂｒａｉｎ－ｏｒｇａｎｏｉｄｓで利用可能である。カウントの少ないフィルタリングは、サンプルあたり平均１カウント未満の遺伝子に対して実施した。バッチ効果及びオルガノイド間の生物学的差異は、交絡因子として設計式に組み込み、ＤＥＳｅｑ２のデフォルトパラメーターを使用して正規化及び差次的発現分析を実施した。Ｆ４５４Ｗと非感染オルガノイドとの間でＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法で調整されたｐ値が最も低い５０個の遺伝子の発現を、Ｒパッケージのヒートマップを使用して生成されたヒートマップにプロットした。棒グラフはＲパッケージのｇｇｐｌｏｔで生成した。ＲパッケージＲｅａｃｔｏｍｅＰＡを使用して、Ｌ４５４ＷとＫＥＧＧ経路の非感染遺伝子との間で差次的に発現する遺伝子（ｐａｄｊ＜０．０００１、絶対値ｌｏｇ２倍変化＞１）の濃縮を評価した（Ｙｕ ａｎｄ Ｈｅ， ２０１６）。

【0336】

ＭｅＶリードの１００万リードあたりのリード数（ＲＰＭ）値を計算するために、デフォルトのパラメーター（２２３８８２８６）でＢｏｗｔｉｅ２を使用して、各サンプルをＮＣ＿００１４９８ＭｅＶ参照配列に対してアラインメントした。ＭｅＶ ＲＰＭ値は、得られたＢＡＭファイル内のマッピングしたリード数を使用して計算した。

【0337】

マウス脳切片のＲＮＡ－Ｓｅｑ。脳切片から抽出されたＲＮＡを、上記のオルガノイドの場合と同様に調製及び配列決定した。リードは、Ｋａｌｌｉｓｔｏ ｖ０．４４（参照）によってマウスリファレンストランスクリプトームｍｍＧＲＣｍ３８に疑似アラインメントした。ＤＥＳｅｑ２で差次的発現解析を行い、バッチ効果を設計式に組み込んだ。発現ヒートマップは、上記の脳オルガノイドと同様に生成した。ＭｅＶＲＰＭは上記のように計算した。

【0338】

脳オルガノイドゲノム特異的ＲＴ－ｑＰＣＲ。ＭｅＶゲノム鎖を標的とする特異的逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、製造元の指示に従って、５００ｎｇの全ＲＮＡで実施した。リバースプライマーとしてヒトＧＡＰＤＨ及びＦＷ５’タグ化ＭｅＶプライマーとしてニパウイルス由来のＴＡＧ配列を有するアンチゲノム鎖のＭｅＶ配列を含む５’－ｇｃａｇｇｇｃａａｔｃｔｃａｃａａｔｃａｇｇＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡ－３’を用いた。得られたｃＤＮＡを１：１０に希釈した。次に、プライマーとしてＭｅＶ Ｒｅｖ ５’－ＴＧＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴ－３’及びＴａｇ ＦＷ ５’－ｇｃａｇｇｇｃａａｔｃｔｃａｃａａｔｃａｇｇ－３’を使用して、以前に説明されたように（Ｉｋｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）ＱＰＣＲを実施した。全ての結果を、ヒトＧＡＰＤＨ偏差に対して正規化した。

【0339】

ｍＮＧＳ及びバリアント呼び出し。ｍＮＧＳを前述のように実施した（Ｉｋｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。簡潔には、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｖｉｒａｌ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して５０μＬのウイルス培養液からＲＮＡを抽出し、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で処理した。ＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びランダムヘキサマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＤＮａｓｅ処理されたＲＮＡから生成し、続いてＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標） Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを介して第二鎖合成を行った。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で精製した。Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴキット（イルミナ社）を使用して２μＬのｃＤＮＡからライブラリーを構築し、１×１９２ｂｐのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑランで配列決定した。

【0340】

シーケンスリードはアダプターであり、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３８を使用して品質を調整した （Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。ＭｅＶ参照ゲノム（ＮＣ＿００１４９８）を使用して、ＬＡＶＡ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｇｒｅｎｉｎｇｅｒ－ｌａｂ／ｌａｖａ）で、１０％を超える頻度と１０倍を超えるカバー度で存在するバリアントを特定した。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ１１．１．４の同じＭｅＶ参照株にシーケンスリードをマッピングすることにより、全てのバリアントを手動で確認した（Ｋｅａｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。マトリックスと膜融合タンパク質との間の遺伝子間領域、及びホモポリマートラクトに存在するこれらの変異体は、分析から除外した。配列決定リードは、ＮＣＢＩ ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ番号ＰＲＪＮＡ５９４９５２で利用可能である。

【0341】

統計分析：マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を、生存率の比較分析に使用した。他の全ての統計的比較は、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して実施した。全て分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアで行った。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの統計分析はＲで行った。

【0342】

（方法セクションの引用文献）
１． Ｂｏｌｇｅｒ， Ａ．Ｍ．， Ｌｏｈｓｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ｕｓａｄｅｌ， Ｂ． （２０１４）． Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ： ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ． Ｏｘｆ． Ｅｎｇｌ． ３０， ２１１４－２１２０．
２． Ｂｒａｙ， Ｎ．Ｌ．， Ｐｉｍｅｎｔｅｌ， Ｈ．， Ｍｅｌｓｔｅｄ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐａｃｈｔｅｒ， Ｌ． （２０１６）． Ｎｅａｒ－ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３４， ５２５－５２７．
３． Ｂｒuｎｇｅｒ， Ａ．Ｔ．， Ａｄａｍｓ， Ｐ．Ｄ．， Ｃｌｏｒｅ， Ｇ．Ｍ．， ＤｅＬａｎｏ， Ｗ．Ｌ．， Ｇｒｏｓ， Ｐ．， Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｒ．Ｗ．， Ｊｉａｎｇ， Ｊ．Ｓ．， Ｋｕｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．， Ｎｉｌｇｅｓ， Ｍ．， Ｐａｎｎｕ， Ｎ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＆ ＮＭＲ ｓｙｓｔｅｍ： Ａ ｎｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ５４， ９０５－９２１．
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５． Ｉｋｅｔａｎｉ， Ｓ．， Ｓｈｅａｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｆｅｒｒｅｎ， Ｍ．， Ｍａｋｈｓｏｕｓ， Ｎ．， Ａｑｕｉｎｏ， Ｄ．Ｂ．， ｄｅｓ Ｇｅｏｒｇｅｓ， Ａ．， Ｒｉｍａ， Ｂ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｆｉｔｎｅｓｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ Ａｒｅ Ｌｏｓｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｈａｎｇｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． ＭＢｉｏ ９．
６． Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｅ．Ｍ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐａｌｅｒｍｏ， Ｌ．Ｍ．， Ｈａｒｄｉｅ， Ｄ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１５）． Ｍｅａｓｌｅｓ ｆｕｓｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｓ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ． ＭＢｉｏ ６．
７． Ｋｅａｒｓｅ， Ｍ．， Ｍｏｉｒ， Ｒ．， Ｗｉｌｓｏｎ， Ａ．， Ｓｔｏｎｅｓ－Ｈａｖａｓ， Ｓ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ｍ．， Ｓｔｕｒｒｏｃｋ， Ｓ．， Ｂｕｘｔｏｎ， Ｓ．， Ｃｏｏｐｅｒ， Ａ．， Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ， Ｓ．， Ｄｕｒａｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｂａｓｉｃ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄａｂｌｅ ｄｅｓｋｔｏｐ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ． Ｏｘｆ． Ｅｎｇｌ． ２８， １６４７－１６４９．
８． Ｋｅｌｌｅｙ， Ｌ．Ａ．， Ｍｅｚｕｌｉｓ， Ｓ．， Ｙａｔｅｓ， Ｃ．Ｍ．， Ｗａｓｓ， Ｍ．Ｎ．， ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｊ．Ｅ． （２０１５）． Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ， ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． １０， ８４５－８５８．
９． Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ， Ｊ．Ａ． （２０１４）． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ９， ２３２９－２３４０．
１０． Ｌａｎｇｍｅａｄ， Ｂ．， ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ｓ．Ｌ． （２０１２）． Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ９， ３５７－３５９．
１１． Ｌｉａｏ， Ｙ．， Ｓｍｙｔｈ， Ｇ．Ｋ．， ａｎｄ Ｓｈｉ， Ｗ． （２０１４）． ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｕｒｐｏｓｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｓｓｉｇｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ． Ｏｘｆ． Ｅｎｇｌ． ３０， ９２３－９３０．
１２． Ｌｏｖｅ， Ｍ．Ｉ．， Ｈｕｂｅｒ， Ｗ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ， Ｓ． （２０１４）． Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＤＥＳｅｑ２． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １５， ５５０．
１３． Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｈｕｅｙ， Ｄ．， Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｅ．， Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， ＤｅＶｉｔｏ， Ｉ．， Ｔａｌｅｋａｒ， Ａ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｎｉｅｗｉｅｓｋ， Ｓ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１５）． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８９， １１４３－１１５５．
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１６． Ｒａｄｅｃｋｅ， Ｆ．， Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ， Ｐ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｈ．， Ｋａｅｌｉｎ， Ｋ．， Ｈｕｂｅｒ， Ｍ．， Ｄoｔｓｃｈ， Ｃ．， Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ， Ｇ．， ａｎｄ Ｂｉｌｌｅｔｅｒ， Ｍ．Ａ． （１９９５）． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ． ＥＭＢＯ Ｊ． １４， ５７７３－５７８４．
１７． Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， Ｔａｌｅｋａｒ， Ａ．， Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ．， Ｐｅｓｓｉ， Ａ．， Ｍｏｓｃｏｎａ， Ａ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， ａｎｄ Ｐｏｒｏｔｔｏ， Ｍ． （２０１３）． Ｆａｔａｌ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｂｒａｉｎ－ｐｅｎｅｔｒａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８７， １３７８５－１３７９４．
１８． Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ．Ｃ．， Ｌｉｏｎｎｅｔ， Ｃ．， Ｔｅｒｚｉａｎ， Ｃ．， Ｈｏｒｖａｔ， Ｂ．， Ｇｅｒｌｉｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｕ， Ｃ． （２０１７）． Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ： Ａ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ＣＮＳ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｏｃ． ７， ｅ２６０５．

【0343】

実施例６ ― 膜融合前状態で安定化された可溶性Ｆタンパク質
図１１７Ａ～図１１７Ｅは、特定の変異であるＥ１０７Ｇ及びＥ４５５Ｇによって及びＦＩＰ－ＨＲＣ（コレステロールを含まない二量体）によって安定化された麻疹膜融合タンパク質に関するデータを示す。膜融合前状態の可溶性Ｆはワクチンとして使用され得る。図１１７Ａ～図１１７Ｅは以下を示す：１）ＦＩＰ－ＨＲＣの存在下で安定化されたＦは、５５℃で最大２時間の膜融合前のインキュベーション状態を維持する；２）安定化されたＦは、３７℃で最大１週間、膜融合前状態を維持する；３）野生型ＦはＦＩＰ－ＨＲＣペプチドによって部分的に安定化される；及び４）ＦＩＰ－ＨＲＣのＦ安定化は、市販のＦＩＰや３ｇなどの市販の安定剤よりも優れている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40-1】

【図40-2】

【図41-1】

【図41-2】

【図42A】

【図42B】

【図43】

【図44A】

【図44B】

【図44C】

【図45】

【図46】

【図47A】

【図47B】

【図47C】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【図81】

【図82】

【図83】

【図84】

【図85A】

【図85B】

【図85C】

【図86】

【図87】

【図88】

【図89】

【図90-1】

【図90-2】

【図91】

【図92】

【図93-1】

【図93-2】

【図94-1】

【図94-2】

【図95】

【図96-1】

【図96-2】

【図97】

【図98】

【図99】

【図100】

【図101】

【図102】

【図103】

【図104】

【図105】

【図106A】

【図106B】

【図106C】

【図106D-1】

【図106D-2】

【図107A】

【図107B】

【図107C】

【図107D】

【図107E】

【図107F】

【図107G】

【図107H】

【図108】

【図109A】

【図109B】

【図110A】

【図110B】

【図111A】

【図111B】

【図112-1】

【図112-2】

【図112-3】

【図112-4】

【図112-5】

【図112-6】

【図112-7】

【図112-8】

【図113】

【図114】

【図115】

【図116】

【図117A】

【図117B】

【図117C】

【図117D】

【図117E】

【配列表】

2022551813000001.app

【国際調査報告】