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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-14
(54)【発明の名称】免疫グロブリン精製ペプチド、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20221207BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20221207BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20221207BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20221207BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221207BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20221207BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C07K16/00
C07K17/00
C07K1/22
G01N33/53 N
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520352
(86)(22)【出願日】2020-10-08
(85)【翻訳文提出日】2022-05-30
(86)【国際出願番号】 US2020054669
(87)【国際公開番号】W WO2021072005
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/912,118
(32)【優先日】2019-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517366013
【氏名又は名称】ノース カロライナ ステート ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100085545
【弁理士】
【氏名又は名称】松井 光夫
(74)【代理人】
【識別番号】100118599
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 博司
(72)【発明者】
【氏名】メネガッティ，ステファノ
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，シンチン
(72)【発明者】
【氏名】ホール，キャロル ケー．
(72)【発明者】
【氏名】リース，ハンナ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA14
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA10
4H045FA74
4H045FA81
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、配列ID番号： 1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を、又は配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、85％、90％又は95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む合成ペプチドを提供する。ペプチドを含む固体支持体、そのようなペプチド及び固体支持体を使用する方法がまた本明細書において記載されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を、又は配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、85％、90％又は95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む合成ペプチド。
【請求項2】
前記ペプチドが、宿主細胞タンパク質(HCP)特異的定量化アッセイによって測定される場合に2.0以上、2.1以上、2.2以上、2.3以上、2.4以上、2.5以上、2.6以上、2.7以上、2.8以上、2.9以上、3.0以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、又は3.5以上、の宿主細胞タンパク質(HCP)の対数減少値(LRV)を有し又は該対数減少値(LRV)を提供するように構成されており、及び任意的に、該ペプチドは少なくとも2.5のHCP LRVを有し又は少なくとも2.5のHCP LRVを提供するように構成されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
前記ペプチドが配列ID番号：1のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項4】
前記ペプチドが配列ID番号：2のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項5】
前記ペプチドが配列ID番号：3のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項6】
前記ペプチドが配列ID番号：4のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項7】
前記ペプチドが配列ID番号：5のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項8】
前記ペプチドが配列ID番号：6のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項9】
前記ペプチドが配列ID番号：7のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項10】
前記ペプチドが配列ID番号：8のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項11】
前記ペプチドが配列ID番号：9のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項12】
前記ペプチドが配列ID番号：10のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項13】
前記ペプチドが配列ID番号：11のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項14】
前記ペプチドが配列ID番号：12のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項15】
前記ペプチドが配列ID番号：13のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項16】
前記ペプチドが配列ID番号：14のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項17】
前記ペプチドが配列ID番号：15のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項18】
前記ペプチドが配列ID番号：16のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項19】
前記ペプチドが配列ID番号：17のアミノ酸配列を含み、任意的に、前記ペプチドがさらに、C末端アミノ酸残基として結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項20】
前記ペプチドが、免疫グロブリン(例えば、ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体)又はそのフラグメントを結合しており、任意的に、前記ペプチドが、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントのFc部分を結合している、請求項１～１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項21】
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントが、ヒトIgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及び／又はIgG4)、IgA、IgE、IgD、及びIgMから選択される１つ以上のものである、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項22】
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントが、非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ウマ、ロバ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、ラクダ、アルパカ等)のIgG、IgA、及びIgMから選択される１つ以上のものである、請求項２０又は２１に記載のペプチド。
【請求項23】
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントが、トリ(例えば、ニワトリ、七面鳥等)のIgYである、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項24】
検出可能な部分(例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、発色基質等)をさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項25】
前記ペプチドが、固体支持体(例えば、クロマトグラフィー樹脂、膜、バイオセンサー、マイクロプレート、ファイバー、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はマイクロ流体デバイス内のチャネル)に結合されており、任意的に、前記ペプチドが、結合性基(例えば、結合性アミノ酸残基の側鎖基)を介して前記固体支持体に結合されている、請求項１～２４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項26】
固体支持体(例えば、クロマトグラフィー樹脂、膜、バイオセンサー、マイクロプレート、ファイバー、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はマイクロ流体デバイス内のチャネル)と、請求項１～２４のいずれか一項に記載のペプチドを含む物品であって、任意的に、前記ペプチドが(例えば、結合性アミノ酸残基の側鎖基を介して)前記固体支持体に共有結合されている、前記物品。
【請求項27】
前記物品が親和性吸着剤である、請求項２６に記載の物品。
【請求項28】
前記物品が再利用可能である、請求項２６又は２７に記載の物品。
【請求項29】
前記ペプチドが、前記固体支持体の1mg当たり約0.01、約0.02、約0.05、約0.1、約0.15、又は約0.2mmolのペプチドから、前記固体支持体1mg当たり約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.65、約0.7、約0.75、又は約0.8mmolのペプチドまでの範囲の密度(mmol／mg)で存在する、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項30】
サンプル中に存在する免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出する方法であって、ペプチドが前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを結合してペプチド結合免疫グロブリンを提供するところの適切な条件下で、前記サンプルを、請求項１～２５のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項２６～２９のいずれか１項に記載の物品と接触させること、並びに、
前記ペプチドを検出し、及び／又は任意的に、検出可能な部分を検出し、それによって免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出すること
を含む、前記方法。
【請求項31】
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを前記ペプチド及び／又は物品から解放することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
サンプル中に存在する免疫グロブリン又はそのフラグメントを精製する方法であって、ペプチドが前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを結合してペプチド結合免疫グロブリンを提供するところの適切な条件下で、前記サンプルを、請求項１～２５のいずれか１項に記載のペプチド又は請求項２６～２９のいずれか１項に記載の物品と接触させること、並びに
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを前記ペプチド及び／又は物品から解放し、それによって、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを前記サンプルから精製すること
を含む、前記方法。
【請求項33】
前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを前記ペプチド及び／又は物品から解放する前に、前記ペプチド結合免疫グロブリンを洗うことをさらに含む、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
上記の接触させる工程、洗う工程、及び／又は解放する工程を１回又は複数回繰り返すことをさらに含み、任意的に、前記物品が再利用可能である、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記解放する工程が、前記免疫グロブリン又はそのフラグメントの少なくとも80％(例えば、少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％若しくは100％、又はそれらの中の任意の値若しくは範囲)の純度を提供する、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記サンプルが、細胞培養液(例えば、上清)、植物抽出物、ヒト血漿、トランスジェニックミルク、及び／又はフィードストックからのものである、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記方法が、宿主細胞タンパク質(HCP)特異的定量化アッセイによって測定される場合に2.0以上、2.1以上、2.2以上、2.3以上、2.4以上、2.5以上、2.6以上、2.7以上、2.8以上、2.9以上、3.0以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、又は3.5以上、の宿主細胞タンパク質(HCP)の対数減少値(LRV)を提供し、任意的に、該方法は、少なくとも2.5のHCP LRVを提供する、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
政府支援の声明
本発明は、国立科学財団(National Science Foundation)によって授与された助成金番号1830272号の下で政府の支援を受けてなされた。該政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立科学財団(National Science Foundation)によって授与された助成金番号1830272号の下で政府の支援を受けてなされた。該政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
本発明は、配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を、又は配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む合成ペプチド、並びにその使用の方法に関する。
【背景技術】
【0003】
モノクローナル抗体(以下、「mAbs」ともいう)は、癌及び免疫障害の為の処置を包含する現在の幾つかの治療戦略のバックボーンを形成する。治療用mAbsは、開発及び製造に非常に費用が掛かる。現在のプラットフォームのバイオ製造プロセスで治療用mAbsを精製する為の技術は、タンパク質A吸着剤に依存して、製品の捕捉工程中に精製及び濃縮を同時に達成する。mAbsに対するその親和性が高い為に(ほとんどの場合、IgG1及びIgG4サブクラスに属する)、タンパク質Aベースの精製により、宿主細胞タンパク質(HCP：host cell protein)の対数除去値(LRV：log removal value)が約2.5～3.0になる(Shukla et al. 2008 Biotechnology Progress 24(3)：615-622)。これらの利点にもかかわらず、タンパク質A吸着剤は幾つかの重要な制限を示す。それらは高価であり(1リットルあたり最大15,000ドル)、洗浄条件における又はフィードストックタンパク質分解酵素の存在下での生化学的安定性が限られており、溶出は低pHで実行される必要があり、及びそれらは、推定IgG3治療薬を捕捉することができない(Hober et al. 207 J. of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 848：40-47；Leblebici et al. 2014 J. of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 962：89-93)。タンパク質Aフラグメント(Protein A fragments)及び凝集したmAbsは毒性が高く且つ免疫原性があり、従って、製品ストリームへのそれらの潜在的な放出が注意深く監される必要がある。タンパク質A媒体(Protein A media)に関連付けられた課題を克服することは、バイオセパレーション技術の革新の主な推進力の1つである。この文脈において、タンパク質リガンドの合成代替物は、徹底的に精査されてきた。
【0004】
バッチ間のばらつきがなく、免疫原性及び病原性成分が少なく、溶出条件が穏やかであり且つコストが低い吸着剤を製造する為に、多くの合成リガンドが研究されてきた。イオン交換クロマトグラフィー(IEC：ion exchange chromatography)のイオン相互作用と電荷相互作用を(HIC：hydrophobic interaction chromatography)に見られる非極性元素への誘引と組み合わせた混合モードリガンド(MMLs：Mixed mode ligands)は、安価に製造でき、且つ広く研究されている(Tong et al．2016 J．of Chromatography A 1429：258-264；Holstein et al．2012 J．of Chromatography A 1233：152-155)。幾つかのMML、例えば、トリアジンベースのMAbSorbent A1P及びA2P、MEP Hypercel、CaptoAdhere並びにCaptoMMCが、商業的に入手可能であり、且つMAb研磨工程においてしばしば使用される。しかしながら、MMLは、タンパク質AのようなアフィニティーリガンドのmAb結合親和性及び選択性を欠いており、従って、捕捉には適していない。
【0005】
本発明は、例えばタンパク質Aのペプチド模倣物として、任意的に免疫グロブリン及び／又はそのフラグメントの精製及び／又は検出において、合成ペプチドリガンド及びそれを使用する方法を提供することによって、当技術分野における欠点を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の一つの観点は、配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を、又は配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む合成ペプチドに向けられている。該ペプチドは、HCP特異的ELISAアッセイによって測定される場合に2.0以上、2.1以上、2.2.以上、2.3以上、2.4以上、2.5以上、2.6以上、2.7以上、2.8以上、2.9以上、3.0以上、3.1以上、3.2以上、3.3以上、3.4以上、又は3.5以上、の宿主細胞タンパク質(HCP：host cell protein)の対数減少値(LRV：logarithmic removal value)を有し得、ここで、任意的に、該ペプチドは少なくとも2.5のHCP LRVを有する。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、免疫グロブリン(例えば、IgG)又はそのフラグメントを結合し、任意的に、該ペプチドは、該免疫グロブリン又はそのフラグメントのFc部分を結合している。
【0007】
本発明の他の観点は、固体支持体(例えば、樹脂)と、本明細書に記載のペプチドを含む物品に向けられている。該ペプチドは、該固体支持体に共有結合されうる。幾つかの実施態様において、該物品は親和性吸着剤である。
【0008】
本発明の更なる観点は、サンプル中に存在する免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出する方法であって、該方法は、ペプチドが前記免疫グロブリン又はそのフラグメントを結合してペプチド結合免疫グロブリンを提供するところの適切な条件下で、該サンプルを、本明細書に記載されたペプチド及び／又は本明細書に記載された物品と接触させること、並びに、該ペプチドを検出し、それによって、免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出することを含む、上記方法に向けられている。
【0009】
本発明の他の観点は、サンプル中に存在する免疫グロブリン又はそのフラグメントを精製する方法であって、ペプチドが該免疫グロブリン又はそのフラグメントを結合してペプチド結合免疫グロブリンを提供するところの適切な条件下で、該サンプルを、本明細書に記載されたペプチド及び／又は本明細書に記載された物品と接触させること、並びに、該免疫グロブリン又はそのフラグメントを該ペプチド及び／又は物品から分離し(例えば、解放し、溶出し等)、それによって該免疫グロブリン又はそのフラグメントを該サンプルから精製することをを含む、上記方法に向けられている。
【0010】
本発明のこれらの観点及び他の観点は、以下に記載されている本発明の説明においてより詳細に扱われる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図1は、AMBER15パッケージを使用したMDシミュレーションによって予測された結合性部位(binding sites)を示す。図(A) WQRHGI(配列ID番号：1)、図(B) HWRGWV(配列ID番号：18)、図(C) MWRGWQ(配列ID番号：2)、図(D) RHLGWF(配列ID番号：3)、及び図(E) ヒトIgG(PDB ID：1FCC)のCH2サブユニットを有するGWLHQR(配列ID番号：4)が描かれている。
【図2A】図２Ａは、ヒトIgG Fcフラグメントについての結合性エネルギー(binding energy)への個々のペプチド残基の寄与が、WQRHGI(配列ID番号：1)についての可変内部誘電率モデル(variable internal dielectric constant model)を用いた陰溶媒(implicit-solvent)MM／GBSAアプローチを使用して得られたことを示す。
【図2B】図２Ｂは、ヒトIgG Fcフラグメントについての結合性エネルギー(binding energy)への個々のペプチド残基の寄与が、MWRGWQ(配列ID番号：2)についての可変内部誘電率モデル(variable internal dielectric constant model)を用いた陰溶媒(implicit-solvent)MM／GBSAアプローチを使用して得られたことを示す。
【図2C】図２Ｃは、ヒトIgG Fcフラグメントについての結合性エネルギー(binding energy)への個々のペプチド残基の寄与が、RHLGWF(配列ID番号：3)についての可変内部誘電率モデル(variable internal dielectric constant model)を用いた陰溶媒(implicit-solvent)MM／GBSAアプローチを使用して得られたことを示す。
【図2D】図２Ｄは、ヒトIgG Fcフラグメントについての結合性エネルギー(binding energy)への個々のペプチド残基の寄与が、GWLHWQR(配列ID番号：19)についての可変内部誘電率モデル(variable internal dielectric constant model)を用いた陰溶媒(implicit-solvent)MM／GBSAアプローチを使用して得られたことを示す。
【図3A】図３Ａは、(i)天然ブロモアルキル官能基をアルキルアミンスペーサーアーム[-*-]で求核置換、(ii)ヨード酢酸による活性化、及び(iii)ペプチドリガンドのコンジュゲーションによるペプチド-WB樹脂の構造の図を示す。
【図3B】図３Ｂは、25℃でのIgG：リガンド結合のITC分析を示す。WQRHGI(配列ID番号：1)の生の滴定データが統合され、そして、ピーク面積がIGG溶液に添加されたリガンドのモル量に正規化された。データが、独立したバインディングモデル(binding model)を使用して適合された。モル比は、タンパク質に対するリガンドの比を示す。ITCを使用して、5.88x10-5Mの有効なKDが見つけられた。
【図5】図５のパネルA～Dは、(パネルA)2分及び(パネルB)5分の滞留時間での吸着剤WQRHGIC(配列ID番号：30)-WorkBeadsの破過曲線(breakthrough curves)、並びに(パネルC)2分及び(パネルD)5分の滞留時間での吸着剤MWRGWQC(配列ID番号：31)-WorkBeadsの破過曲線を示す。
【図6A】図６Ａは、ペプチドリガンド(図６Ａ)MWRGWQ(配列ID番号：2)及びRHLGWF(配列ID番号：3)を使用するCHO細胞培養上清からのIgGの精製から得られるクロマトグラフィー画分のSDS-PAGE分析(還元条件、クーマシー染色(Coomassie staining))を示す。MW，分子量ラダー;FT，フロースルー(flow-through);El1，pH4での最初の溶出；El2，pH2.8での2回目の溶出；IgG HC、IgG重鎖(IgG heavy chain)；IgG LC、IgG軽鎖(IgG light chain)。
【図6B】図６Ｂは、ペプチドリガンド(図６Ｂ)WQRHGI(配列ID番号：1)及びGWLHQR(配列ID番号：4)を使用するCHO細胞培養上清からのIgGの精製から得られるクロマトグラフィー画分のSDS-PAGE分析(還元条件、クーマシー染色(Coomassie staining))を示す。MW，分子量ラダー;FT，フロースルー(flow-through);El1，pH4での最初の溶出；El2，pH2.8での2回目の溶出；IgG HC、IgG重鎖(IgG heavy chain)；IgG LC、IgG軽鎖(IgG light chain)。
【図7A】図７Ａは、0.1mLのWQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads樹脂又はMWRGWQ(配列ID番号：2)-WorkBeads樹脂のいずれかに、0.5mLのフィードストック(CHO-S細胞培養上清中にスパイクされたヒトポリクローナルIgG)を注入することによって得られたクロマトグラムを示す。ラベル付け：FT，PBS、pH 7.4におけるフロースルー(flow-through);W，PBS、pH 7.4における0.1MのNaCl中での洗浄；EL，0.2Mの酢酸ナトリウム、pH4における溶出；R，0.1Mのグリシン、pH2.5における再生。
【図7B】図７Ｂは、WQRHGI(配列ID番号：1)-WB樹脂を使用したCHO細胞培養上清からのIgGの精製から得られたクロマトグラフィー画分のSDS-PAGE分析(還元条件、銀染色)を示す。ラベル付け：MW，分子量ラダー；FT，フロースルー(flow-through);E，pH4での最初の溶出；R，pH2.5での2回目の溶出；IgG HC、IgG重鎖(IgG heavy chain)；IgG LC、IgG軽鎖(IgG light chain)。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本主題が、現在開示されている本主題の代表的な実施態様が示されている添付の実施例を参照して、本明細書の以下により完全に今説明されるであろう。しかしながら、現在開示されている主題は、異なる形態で具体化されることができ、及び、本明細書に記載された実施態様に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、この開示が徹底的且つ完全であり、且つ現在開示されている主題の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【0013】
別段の定義がされない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の発明の詳細な説明において使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、且つ本発明を限定することを意図されるものでない。
【0014】
文脈が別のことを示さない限り、本明細書に記載された本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで使用されることができることが特に意図されている。その上、本発明はまた、本発明の幾つかの実施態様において、本明細書に記載された任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略されることができることを企図する。説明の為に、複合体が成分Ａ、Ｂ及びＣを含むことを本願明細書が述べている場合、Ａ、Ｂ若しくはＣのいずれか、又はそれらの組み合わせを省略し且つ単独で若しくは任意の組み合わせで放棄されることができることが特に意図されている。
【0015】
本明細書に記載されている、全ての刊行物、特許出願、特許、アクセッション番号、及び他の参考文献は、参照によってその全体が本明細書内に組み込まれる。
【0016】
以下の語は、当業者の１人によって十分に理解されると考えられているが、以下の定義は、現在開示されている主題の説明を容易にする為に記載されている。
【0017】
長年の特許法条約に従い、語「1つ(a)」及び「1つ(an)」及び「該(the)」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、1つ又は複数を意味することができる。
【0018】
本明細書において提供されるありとあらゆる例又は例示的な言語(例えば、「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。
【0019】
2つ以上の項目又は条件を説明する際に使用される語「及び／又は」は、全ての名前付き項目又は条件が存在する若しくは適用可能であるところの状況、又は項目又は条件の1つ(又は全て未満)のみが存在する若しくは適用可能であるところの状況を云う。また、本明細書において使用される場合、「及び／又は」は、関連付けられたリストされた項目の１以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、並びに代替的な(「又は」)で解釈される場合の組み合わせの欠如をいい且つそれらを包含する。
【0020】
その上、測定可能な値、例えば、ポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度、を云うときに本明細書において使用される語「約」は、特定の量の±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、又は±0.1％でさえ、の変動を包含することを意味する。
【0021】
本明細書において使用される場合、語「包含する(including)」、「含有する(containing)」及び「によって特徴付けられる」と同義である語「含む(comprising)」は、包括的又は制限がなく、且つ追加の、引用されていない要素及び／又は方法工程を除外しない。「含む(comprising)」は、指定された要素及び／又は工程が存在するが、他の要素及び／又は工程が追加されることができ、且つそれでも関連する主題の範囲内にあることを意味する技術用語である。
【0022】
本明細書において使用される場合、句「からなる(consisting of)」は、特許請求の範囲で指定されていない要素、工程又は成分を除外する。前文の直後ではなく、請求項の本文の条項に「からなる」という句が含まれている場合、その条項に記載されている要素のみが制限される。その他の要素は、全体として請求項から除外されない。
【0023】
本明細書において使用される場合、句「から本質的になる(consisting essentially of)」は、請求項の範囲を、特定の材料又は工程に加えて、特許請求の範囲に記載された主題の基本的及び新規の1以上の特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【0024】
下記の語「含む(comprising)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」、及び「からなる(consisting of)」に関して、これらの３つの語のうちの１つが本明細書において使用される場合、現在開示される主題は、他の用語のいずれかの使用を包含することができる。
【0025】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸」又は「残基」(residue)は、アミノ基、カルボキシル基、及び側鎖官能基(R)を含む分子として定義される。これらのR基が「残基」の骨格炭素に付加される場合、それはペプチドと呼ばれるが、R基をアミド窒素に結合することはペプトイドである。ポリアミド鎖(すなわち、ペプチド及びペプトイド)に沿ったR基の位置とともに、典型的なペプチド骨格に対する別のバリエーションは、α炭素とアミド窒素との間に1以上のメチレン単位を追加することである。β炭素(1つの追加のメチレン単位)、γ炭素(2つの追加のメチレン単位)、又は追加の(δ等)炭素とも呼ばれるこれらの追加された炭素はまた、「アミノ酸」又は「残基」と見なされる。これらの残基の例が表1A～表1Cに見られることができる。
【0026】
【表1A】
【0027】
【表1B】
【0028】
【表1C】
【0029】
本明細書において使用される場合、「天然アミノ酸」又は「タンパク質を構成するアミノ酸」(proteinogenic amino acid)又は「天然残基」(natural residue)又は「タンパク質を構成する残基」(proteinogenic residue)又は「カノニカルアミノ酸」又は「カノニカル残基」(canonical residue)は、以下のアミノの１つとして定義される：アラニン、シトルリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシン。
【0030】
本明細書において使用される場合、「非天然アミノ酸」又は「非タンパク質原生アミノ酸」(non-proteinogenic amino acid)又は「非天然残基」(non-natural residue)又は「非タンパク質原生残基」(non-proteinogenic residue)又は「非カノニカルアミノ酸」又は「非カノニカル残基」(non-canonical residue)は、その側鎖官能基(R)が天然アミノ酸によって特徴づけられるものとは異なるアミノ酸として定義される。
【0031】
本明細書において使用される場合、非タンパク質原生官能基(R)、又は非天然官能基(R)若しくは非カノニカル官能基(R)は、任意の適切な基又は置換基、例えばH、例えば、アルコキシ、メルカプト、アジド、シアノ、カルボキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アリールオキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、置換されたアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、チオエステル、カルバモイル、カルボン酸チオエステル、エーテル、チオエーテル、アミド、アミジノ、サルフェート、スルホキシル、スルホニル、スルホニル、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、ケト、イミン、ニトリル、フォスフェート、チオール、アミジン、オキシム、ニトリル、ジアゾ等で任意的に置換されていてもよい及び／又は官能化されていてもよい、直鎖アルキル及び環状アルキル、アルケニル、並びにアルキニル、を包含するかこれらに限定されない任意の適切な基又は置換基、であり得、これらの語は、以下でさらに説明されるこれらの基の組み合わせを包含する。
【0032】
本明細書において使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列されたポリヌクレオチド配列又はペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸、の整列のウィンドウ全体にわたって不変である程度を云う。「同一性」は、以下に記載されているものを包含するがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算されることができる：Computational Molecular Biology (Lesk，A．M.，ed.) Oxford University Press，New York (1988)；Biocomputing： Informatics and Genome Projects (Smith，D．W.，ed.) Academic Press，New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I (Griffin，A．M.，and Griffin，H．G.，eds.) Humana Press，New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje，G.，ed.) Academic Press (1987)；and Sequence Analysis Primer (Gribskov，M．and Devereux，J.，eds.) Stockton Press，New York (1991)。
【0033】
本明細書において使用される場合、語「パーセント配列同一性」又は「パーセント同一性」(例えば、80％配列同一性)は、2つの配列が最適に整列されている場合の別のポリペプチドと比較して、参照(例えば、「クエリ」(query))ポリペプチドの直鎖ポリペプチド配列中の同一アミノ酸のパーセンテージを云う。
【0034】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アルキル」は、1又は2～10以上又は20以上の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖、又は環状、飽和若しくは不飽和の炭化水素を云う。アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル等を包含するが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、「低級アルキル」は、幾つかの実施態様において、好ましいアルキルのサブセットであり、且つ、1～4個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を云う。低級アルキルの代表的な例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル等を包含するが、これらに限定されない。語「アルキル」又は「低級アルキル」は、特段の指示が無い限り、置換された又は置換されていないアルキル又は低級アルキルの両方を包含することが意図され、これらの基は、ハロ(例えば、ハロアルキル)、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ(それによって、ポリアルコキシ、例えばポリエチレングリコール、を生成する)、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルキルアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、ヘテロシクロlアルキルオキシ(heterocyclolalkyloxy)、メルカプト、アルキル-S(O)m、ハロアルキル-S(O)m、アルケニル-S(O)m、アルキニル-S(O)m、シクロアルキル-S(O)m、シクロアルキルアルキル-S(O)m、アリール-S(O)m、アリールアルキル-S(O)m、ヘテロシクロ-S(O)m、ヘテロシクロアルキル-S(O)m、アミノ、カルボキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、ハロアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、二置換されたアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、ニトロ、又はシアノから選択される基で置換されていてもよく、ここで、m＝0、1、2又は3である。アルキルは飽和又は不飽和であり得、従って、本明細書において使用される場合、語「アルキル」は、アルキル置換基が１1つ以上の不飽和結合(例えば、1つ又は2つの二重結合又は三重結合)を含む場合、アルケニル及びアルキニルを含む。アルキル基は、任意的に、以下に具体的に記載されている直鎖ヘテロアルキル基又はヘテロ環基を形成する為に、１つ以上のヘテロ原子(例えば、O、S及びNR’から独立して選択される1つ以上、2つ以上、又は3つ以上のヘテロ原子、ここで、R’は、任意の適切な置換基、例えばアルキル置換基について直上された置換基、である)を含みうる。
【0035】
本明細書において使用される場合、「アルケニル」は、その中にある2つの炭素原子間に少なくとも1つの二重結合を含む上記されたアルキル基を云う。
【0036】
本明細書において使用される場合、「アルキニル」は、その中にある2つの炭素原子間に少なくとも1つの三重結合を含む上記されたアルキル基を云う。
【0037】
本明細書において使用される場合、「アルキレン」は、一方の末端水素が除かれて二価の置換基を形成する上記されたアルキル基を云う。
【0038】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「ヘテロ環基」(Heterocyclic group)又は「ヘテロシクロ」(heterocyclo)は、脂肪族(例えば、完全に若しくは部分的に飽和したヘテロ環)又は芳香族(例えば、ヘテロアリール)の単環式若しくは二環式環系を云う。単環系は、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から独立して選択される1、2、3又は4個のヘテロ原子を含む任意の5又は6員環によって例示される。該5員環は0～2個の二重結合を有し、且つ該6員環は0～3個の二重結合を有する。単環系の代表的な例は、アゼチジン、アゼピン、アジリジン、ジアゼピン、1,3-ジオキソラン、ジオキサン、ジチアン、フラン、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、イソチアゾール、イソアゾリン、イソチアゾリジン、イソキサゾール、イソキサゾリン、イソキサゾリジン、モルホリン、オキサジアゾール、オキサジアゾリン、オキサジアゾリジン、オキサゾール、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピペラジン、ピペリジン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、テトラジン、テトラゾール、チアジアゾール、チアジアゾリン、チアジアゾリジン、チアゾール、チアゾリン、チアゾリジン、チオフェン、チオモルホリン、チオモルホリンスルホン、チオピラン、トリアジン、トリアゾール、トリチアン等を含むが、これらに限定されない。二環系は、本明細書において定義されているアリール基に、本明細書において定義されているシクロアルキル基に、又は本明細書において定義されている別の単環系に融合された上記の単環式環系のいずれかによって例示される。二環系の代表的な例は、例えば、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンゾチオピラン、ベンゾジオキシン、1,3-ベンゾジオキソール、シンノリン、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、ナフチリジン、イソベンゾフラン、イソベンゾチオフェン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、フタラジン、プリン、ピラノピリジン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、キナゾリン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、チオピラノピリジン等を含むが、これらに限定されない。これらの環は、その四級化誘導体を包含し、及び、任意的に、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルコキシ、シクロアルコキシ、シクロアルキルアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、ヘテロシクロアルキルオキシ、メルカプト、アルキル-S(O)m、ハロアルキル-S(O)m、アルケニル-S(O)m、アルキニル-S(O)m、シクロアルキル-S(O)m、シクロアルキルアルキル-S(O)m、アリール-S(O)m、アリールアルキル-S(O)m、ヘテロシクロ-S(O)m、ヘテロシクロアルキル-S(O)m、アミノ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、ハロアルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、シクロアルキルアルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、二置換されたアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホンアミド、尿素、アルコキシアシルアミノ、アミノアシルオキシ、ニトロ、又はシアノ
から選択される基で置換されていてもよく、ここで、m＝0、1、2又は3である。
から選択される基で置換されていてもよく、ここで、m＝0、1、2又は3である。
【0039】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アリール」は、1以上の芳香環を有する単環式炭素環式環系又は二環式炭素環式縮合環系を云う。アリールの代表的な例は、アズレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、テトラヒドロナフチル等を包含する。語「アリール」は、特段の指示が無い限り、置換された又は置換されていないアリールの両方を包含することが意図されており、及び、これらの基は、上記のアルキル及び低級アルキルに関連して記載された同じ基で置換されうる。
【0040】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アリールアルキル」は、本明細書において定義されているアルキル基を介して親分子部分に付加されている、本明細書において定義されているアリール基を云う。アリールアルキルの代表的な例は、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、2-ナフト-2-イルエチル等を包含するが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアリール」は、上記のヘテロシクロに関連して記載されている通りである。
【0042】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アルコキシ」は、オキシ基、すなわち-O-、を介して親分子部分に付加されている、本明細書において定義されているアルキル又は低級アルキル基(従って、置換バージョン、例えばポリアルコキシ、を包含する)を云う。アルコキシの代表的な例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、2-プロポキシ、ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等を包含するが、これらに限定されない。
【0043】
本明細書において使用される場合、「ハロ」は、任意の適切なハロゲン原子、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を包含するハロゲン原子、を云う。
【0044】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アルキルチオ」は、本明細書において定義されているチオ部分を介して親分子部分に付加されている、本明細書で定義されるようなアルキル基を云う。
【0045】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アルキルアミノ」は-NHR基を意味し、ここで、Rはアルキル基である。
【0046】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アリールアルキルアミノ」は-NHR基を意味し、ここで、Rはアリールアルキルである。
【0047】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「二置換されたアミノ」は-NRaRb基を意味し、ここで、Ra及びRbは独立して、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキルの群から選択される。
【0048】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アシルアミノ」は-NRaRb基を意味し、ここで、Raは本明細書において定義されているアシル基であり、及び、Rbは、水素原子、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキルの群から選択される。
【0049】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アシルオキシ」は-OR基を意味し、ここで、Rは、本明細書において定義されているアシル基である。
【0050】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「エステル」は-C(O)OR基を云い、ここで、Rは、任意の適切な置換基、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール、である。
【0051】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アミド」は-C(O)NRaRb基又は-N(Ra)C(O)Rb基を云い、ここで、Ra及びRbは、任意の適切な置換基、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール、である。
【0052】
本明細書において使用される場合、「スルホキシル」は式-S(O)Rの化合物を云いここで、Rは、任意の適切な置換基、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール、である。
【0053】
本明細書において使用される場合、「スルホニル」は式-S(O)(O)Rの化合物を云い、ここで、Rは、任意の適切な置換基、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール、である。
【0054】
本明細書において使用される場合、「スルホネート」は式-S(O)(O)ORの化合物を云い、ここで、Rは、任意の適切な置換基、例えば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール、である。
【0055】
本明細書において使用される場合、「スルホン酸」は、式-S(O)(O)OHの化合物を云う。
【0056】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「スルホンアミド」は-S(O)2NRaRb基を云い、ここで、Ra及びRbは、任意の適切な置換基、例えば、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールである。
【0057】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「尿素」は-N(Rc)C(O)NRaRb基を云い、ここで、Ra、Rb及びRcは、任意の適切な置換基、例えば、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールである。
【0058】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アルコキシアシルアミノ」は-N(Ra)C(O)ORb基を云い、ここで、Ra、Rbは、任意の適切な置換基、例えば、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールである。
【0059】
本明細書において単独で又は他の基の一部として使用される場合、「アミノアシルオキシ」は-OC(O)NRaRb基を云い、ここで、Ra及びRbは、任意の適切な置換基、例えば、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールである。
【0060】
本明細書において使用される場合、「固体支持体」は、任意の適切な支持体、例えば、未使用若しくは化学的に修飾された(例えば、架橋された)天然材料(例えば、アガロース及びセファロース)、合成有機材料(例えば、有機ポリマー、例えばポリメタクリレート又はポリエチレングリコール)、金属及び金属酸化物(例えば、チタン、チタニア、ジルコニウム及びジルコニア)、無機材料(例えば、シリカ)、並びにそれらの複合体(composites thereof)を包含する任意の適切な支持体、を包含しうる。固体支持体は、任意の適切な形状又は形態、例えば、フィルム、レセプタクル(receptacle)、例えばマイクロタイタープレートウェル(microtiter plate well)(例えば、その床及び／又は壁)、チャネル、例えばマイクロ流体デバイス中のチャネル、多孔性又は非多孔性粒子(例えば、天然ポリマー若しくは合成ポリマー、無機材料、例えばガラス若しくはシリカ、膜及び不織布膜、並びにそれらの複合材料等から形成されたビーズ)、例えばクロマトグラフィーカラム充填用の多孔性又は非多孔性粒子、繊維、マイクロ粒子、ナノ粒子(例えば、磁性ナノ粒子)等を包含する任意の適切な形状又は形態、を包含しうるが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂、膜、バイオセンサー、マイクロビーズ、磁気ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、及び／又はマイクロプレートである。幾つかの実施態様において、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂、例えば、セファロース系樹脂(例えば、WORKBEADS(商標)樹脂)、ポリメタクリレート系樹脂(例えば、TOYOPEARL(登録商標)樹脂、シリカ系樹脂で、アルミナ、チタニア、又はガラス系樹脂、であるが、これらに限定されない。
【0061】
本明細書において使用される場合、「結合性基」(linking group)は、任意の適切な反応性基、例えば、アルケン、アルキン、アルコール、アジド、チオール、セレニル、ホスホノ、カルボン酸、ホルミル、ハロゲン化物又はアミン基、でありうる。結合性基は、親分子(例えば、ペプチド)によって直接的に、又は介在するリンカー基(例えば、脂肪族、芳香族、又は一緒にされた脂肪族／芳香族基、例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル若しくはアルキルアリールアルキル基等)によって表示されうる。幾つかの実施態様において、結合性基は、アミノ酸又はその一部(例えば、アミノ酸の側鎖基)でありうる。例えば、幾つかの実施態様において、結合性基は、システイン及び／又はシステインのチオール及び／又はリジン及び／又はリジンのアミンでありうる。
【0062】
本発明のペプチドは、米国特許出願公開公報第2016／0075734号明細書及び／又は米国特許第10,266,566号明細書に記載されているものを含むがこれらに限定されない既知の技術に従って調製されうる。
【0063】
語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体のフラグメント(例えば、Fab、Fv、一本鎖Fv(scFv)、Fcフラグメント及びFdフラグメント)、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、並びに、抗体の一部と非抗体タンパク質とを含む融合タンパクを包含する。抗体は、他の様々な形態、例えば、Fv、Fab及び(Fab')2、及び二官能性(bi-functional)(すなわち、二重特異性(bi-specific))ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia等，1987を参照)及び単一鎖中の形態を包含する他の様々な形態、を包含する様々な形態で存在することができる(Huston et al.，1988及びBird et al.，1988を参照，該文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に取り込まれる)。一般的に、Hood et al.，1984及びHunkapiller & Hood，1986を参照。該抗体は、幾つかの実施態様において、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、合成蛍光分子等で検出可能に標識化されることができる。該抗体は、幾つかの実施態様において、他の部分、例えば特異的結合対のメンバー、例えばビオチン又はアビジン(ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー)、にさらにコンジュゲーションされることができる。Fab'、Fv、F(ab')2、及び抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント(例えば、少なくとも1つのパラトープ(paratope)を含む任意の抗体フラグメント)もまた、これらの語に包含される。本明細書において使用される場合、語「Fcフラグメント」は、免疫グロブリンのFc部分を含む任意のタンパク質又は化合物、例えばFc融合タンパク質、を包含する。
【0064】
本明細書において使用される場合、語「宿主細胞タンパク質」(HCP：host cell protein)は、所望の標的(例えば、免疫グロブリン又はそのフラグメント)以外の生物(例えば、細菌、哺乳動物、又は鳥類)の任意の内因性細胞タンパク質を云う。従って、本発明の方法において、HCPは、望ましくないオフターゲット(off-target)及び／又は不純物である内因性タンパク質である。HCPは、サンプル(例えば、細胞培養液(例えば、上澄み)、植物抽出物、及び／又は体液)中に自然に含まれうるか、又はサンプル中に存在する単離された及び／又は精製されたHCPでありうる。
【0065】
本明細書において使用される場合、語「対数減少」(LR：logarithmic reduction)及び「対数減少値」(LRV：logarithmic reduction value)は、プロセス及び／又は方法、例えば本発明の方法、において、汚染物質(例えば、除染)及び／又は不純物の減少の測定を云う。該LRVは、精製方法の使用前後の汚染物質(例えば、望ましくないオフターゲットタンパク質(non-desired off-target proteins)、例えば、宿主細胞タンパク質(HCP))の濃度の比の常用対数として定義され、ここで、1の増分は、10分の1の濃度の減少に対応する。従って、1ログの減少(すなわち、LRV＝1.0)は、適用された方法の前の汚染物質濃度の90％の減少に対応し、2ログの減少(すなわち、LRV＝2.0)は、99％の減少に対応する。
【0066】
本明細書において使用される場合、標的－リガンド複合体に関する語「解離定数」(dissociation constant)すなわち「KD」は、遊離標的とリガンド結合標的との間の比を云う。具体的には、該解離定数は、標的がリガンドに可逆的に結合する傾向を表す平衡定数である。該解離定数が小さいほど、標的(target)とリガンドとの間の相互作用がより強くなる。幾つかの実施態様において、該標的はタンパク質であり、及び、該リガンドは、標的(例えば、タンパク質)と複合体を形成することができるペプチド、例えば本発明のペプチド、である。
【0067】
合成ペプチドが、本発明の実施態様に従って提供される。本発明のペプチドは、配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施態様において、本発明のペプチドは、配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)、GWLHQR(配列ID番号：4)、MWRAWQ(配列ID番号：5)、MWRWQ(配列ID番号：6)、MWRGFQ(配列ID番号：7)、GWRGWQ(配列ID番号：8)、WQRHGL(配列ID番号：9)、WQRHGV(配列ID番号：10)、WQRHAI(配列ID番号：11)、WNRHGI(配列ID番号：12)、RMWGWN(配列ID番号：13)WHRLQG(配列ID番号：14)、WHRGQL(配列ID番号：15)、HWRGWW(配列ID番号：16)又はHWRGLQ(配列ID番号：17)のアミノ酸配列を有する。幾つかの実施態様において、本発明のペプチド(例えば、配列ID番号：1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を有するペプチド)は、N末端アミノ酸残基及び／又はC末端アミノ酸残基としてそれぞれ、Ｎ末端で及び／又はＣ末端で結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)を含む。結合性アミノ酸残基の側鎖基が固体支持体の部分と反応して共有結合を形成しうる故に、該結合性アミノ酸残基(例えば、システイン残基又はリジン残基)は、該ペプチドを固体支持体に結合(例えば、コンジュゲーション)する為に使用されうる。例えば、システイン残基について、該システイン残基のチオールと固体支持体の部分(例えば、エポキシド、ハロゲン化アルキル、マレイミド等)との反応が使用されて、ペプチドを該固体支持体に付着させうる、又は、リジン残基について、該リジン残基の第一級アミンと該固体支持体の部分(例えば、エポキシド、ハロゲン化アルキル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル等)との反応が使用されて、ペプチドを該固体支持体に不着させうる。
【0068】
本発明のペプチドは、HCP特異的ELISAアッセイによって測定される場合に2以上(例えば、約2.0以上、約2.1以上、約2.2以上、約2.3以上、約2.4以上、約2.5以上、約2.6以上、約2.7以上、約2.8以上、約2.9以上、約3.0以上、約3.1以上、約3.2以上、約3.3以上、約3.4以上、又は約3.5以上)の宿主細胞タンパク質(HCP)対数減少値(LRV)を有する、提供する及び／又は提供するように構成されうる、及び／又は代表的な細胞培養液(細胞培養収穫物)において行われた分離からのクロマトグラフィー画分の質量分析による定量的プロテオミクスプロファイルを有する、提供する及び／又は提供するように構成されうる。幾つかの実施態様において、本発明のペプチドは、少なくとも2.5のHCP LRVを有する、提供する及び／又は提供するように構成される。幾つかの実施態様において、本発明のペプチドは、少なくとも2.7のHCP LRVを有する、提供する及び／又は提供するように構成される。宿主生物由来のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド(例えば、DNA及び／又はRNA)について、本発明のペプチドは、少なくとも約2以上のLRV(例えば、約2以上、約2.5以上、約3以上、約3.5以上、約4以上、又は約4.5以上)を有しうる、提供しうる及び／又は提供するように構成されうる、ここで、該ペプチドは、約4のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドＬLRVを有する、提供する及び／又は提供するように構成される。
【0069】
幾つかの実施態様において、本発明のペプチドは、免疫グロブリン(例えば、ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体)又はそのフラグメントを結合する。該免疫グロブリンは、そのような抗体のポリクロナール抗体若しくはポリクロナール抗体又はそれらのフラグメントでありうる。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、免疫グロブリン又はそのフラグメントのFc部分を結合する。例えば、本発明のペプチドは、Fc融合タンパク質(例えば、IgGのFcフラグメントに天然に結合されたものとして組換え発現されたタンパク質)のFc部分に結合しうる。
【0070】
本発明のペプチドが結合しうる例示的な免疫グロブリン又はそのフラグメントは、ヒトIgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3及び／又はIgG4)、IgA、IgE、IgD及び／又はIgM；非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ウマ、ロバ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、ラクダ、アルパカ等)のIgG、IgA及び／又はIgM；及び／又はトリ(例えば、ニワトリ、七面鳥等)のIgYを包含するが、これらに限定されない。
【0071】
本発明のペプチドは、検出可能な部分を含みうる。本明細書において使用される場合、「検出可能な部分」は、ペプチドを検出する為に使用されることができる任意の部分、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、発色基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン及び／又は抗体を包含する任意の部分、を包含するが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、ペプチドの一部(例えば、アミノ酸及び／又はアミノ酸の側鎖)であり、及び／又は、検出可能な部分は、ペプチドの一部に付着されている部分である。幾つかの実施態様において検出可能な部分は、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、核酸配列、又は蛍光部分である。幾つかの実施態様において、ペプチドは光親和的に標識化され得、任意的に、光反応性基、例えばベンゾフェノン基、をペプチドに結合することによって標識化されうる。
【0072】
固体支持体と本発明のペプチドとを含む物品が、本発明の幾つかの実施態様に従って提供される。幾つかの実施態様において、固体支持体は、本発明のペプチドを含み得、任意的に、該ペプチドは、該固体支持体の表面に(例えば、共有結合的に及び／又は非共有結合的に)付着されうる。幾つかの実施態様において、同じであってもよく又は異なっていてもよい本発明の1以上のペプチドが、固体支持体に(例えば、該固体支持体の表面に)結合されうる。幾つかの実施態様において、同じペプチドの1以上(例えば、1以上、5以上、10以上、20以上、50以上、100以上、200以上、又は500以上)のコピーが、単一の固体支持体に(例えば、該固体支持体の表面上に)結合される。例示的な固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂、膜、バイオセンサー、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット及び／又はマイクロプレートを包含するが、これらに限定されない。幾つかの実施態様において、該固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂、例えばTOYOPEARL(登録商標)樹脂、である。幾つかの実施態様において、該固体支持体は、ポリマー樹脂、例えばアガロース樹脂又はメタクリルポリマー樹脂、であり、任意的に、該ポリマー樹脂は、ペプチドを結合する(例えば、官能基、例えばヒドロキシル基又はアミン基、を使用してペプチドを結合する)ように構成されうる。幾つかの実施態様において、ペプチドは、固体支持体に(例えば、固体支持体の表面に)共有的に結合される。本発明の物品は、親和性吸着剤でありうる。
【0073】
本発明の物品は、該固体支持体(mmol／mg)の1mg当たり約0.01、約0.02、約0.05、約0.1、約0.15、又は約0.2mmolのペプチド～該固体支持体(mmol／mg)の1mg当たり約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.65、約0.7、約0.75、又は約0.8mmolのペプチドの範囲で、ペプチドの密度を有する。幾つかの実施態様において、本発明の物品は、該固体支持体(mmol／mg)の1mg当たり約0.01、約0.02、約0.05、約0.1、約0.15、約0.2、約0.25、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、約0.65、約0.7、約0.75、又は約0.8mmolのペプチドの密度で、本発明のペプチドを含む。
【0074】
幾つかの実施態様において、ペプチドは、共有結合を介して固体支持体に付着されている。共有結合を形成する為に使用されうる結合性基は、ペプチドの任意の部分に付着されうる。幾つかの実施態様において、結合性基は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に付着されている。幾つかの実施態様において、結合性基は、ペプチドのC末端に付着されている。幾つかの実施態様において、該結合性基は、-OH、-NH2、-NHR″、-OR″,-O-NH2、-O-R″-SH、-O-NH-R″-SH、-O-R″-S-SH、-NH-R″-S-SH、-O-NH-R″-S-SH、エーテル、チオエーテル、チオエステル、カルバメート、カルボナート、アミド、エステル、第２級アミン若しくは第３級アミン、又はアルキルから選択され得、ここで、R′′はアルキルである。固体支持体への付着により、該結合性基の１以上の原子(例えば、水素原子)及び／又は１以上の官能基が該結合性基から除去され、該ペプチドを該固体支持体に結合させ得、それによって、P-Z-R′によって表される連結性部分(linking moiety)及び構造を提供し、ここで、Pはペプチドであり、Zは連結性部分であり、及びR′は固体支持体である。幾つかの実施態様において、Zは、-O-、-NH-、-O-NH-、-O-R″-S-、-O-NH-R″-S-、-O-R″-S-S-、-NH-R″-S-S-、-O-NH-R″-S-S-、エーテル、チオエーテル、チオエステル、カルバメート、カルボナート、アミド、エステル、アミン(例えば、第２級アミン／第３級アミン、例えば、任意的に、還元的アミノ化カップリング反応によって任意に得られる第２級アミン／第３級アミン)、アルキル(例えば、メタセシスカップリング反応(metathesis coupling reaction)によって得られる)、アルケニル、フォスフォジエステル、フォスホエーテル、オキシム、イミン、ヒドラゾン、アセタール、ヘミアセタール、セミカルバゾン、ケトン、ケテン、アミナール、ヘミアミナール、エナミン、エノール、ジスルフィド、スルホンから選択され得、ここで、R′′はアルキルである。幾つかの実施態様において、ペプチドは、米国特許出願公開第2016／0075734号明細書及び／又は米国特許第10,266,566号明細書に記載されている方法で固体支持体に付着されうる。
【0075】
幾つかの実施態様において、本発明の物品は再利用可能である。本発明の物品は、再利用後にその結合能力の約20％(例えば、約15％、約10％、約5％等)を超えて失うこと無しに、100回以上、150回以上、又は200回以上使用されうる。幾つかの実施態様において、本発明の物品は、消毒後にその結合性能力(Binding capacity)の20％(例えば、15％、10％、5％等)を超えて失うこと無しに、0.5Mの水酸化ナトリウムで少なくとも100回、少なくとも150回、又は少なくとも200回消毒されうる。本明細書において使用される場合、「結合性能力」は、所与の体積のペプチド及び／又は本発明の物品によって結合される標的(例えば、免疫グロブリン)の量を云う。
【0076】
幾つかの実施態様に従うと、サンプル中の免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出する方法が提供され、該方法は、適切な条件下で、サンプルを、本発明のペプチドと接触させること、ここで、該ペプチドは、該免疫グロブリン又はそのフラグメントを結合する；並びに、該ペプチド及び／又は該ペプチドに関連付けられた(例えば、結合された)検出可能な部分を検出し、それによって該免疫グロブリン又はそのフラグメントを検出すること、及び任意的に、該ペプチドは、該サンプル中に存在する又は該サンプルから単離される、を含みうる。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、固体支持体に結合される。幾つかの実施態様において、該ペプチドを検出することは、該ペプチドの一部である及び／又はそれに付着されている検出可能な部分を検出することを含む。
【0077】
幾つかの実施態様において、サンプル中に存在する免疫グロブリン又はそのフラグメントを精製する方法が提供され、該方法は、サンプルを本発明のペプチドと接触させること；該ペプチドから免疫グロブリン又はそのフラグメントを分離すること(例えば、解放すること(releasing)、溶出すること等)、それによって、該免疫グロブリン又はそのフラグメントを該サンプルから精製することを含む。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、固体支持体に結合される。
【0078】
該サンプルは、免疫グロブリン又はそのフラグメントを含み得、任意的に、該免疫グロブリン又はフラグメントは、溶液(例えば、水性溶液)中で遊離であり、且つ、１つ以上の不純物(例えば、宿主細胞タンパク質、脂質等)を含みうる。幾つかの実施態様において、該サンプルは、細胞培養液(例えば、上清)、植物抽出物、体液(例えば、ヒト血液及び／又は血漿、トランスジェニックミルク等)、及び／又はフィードストック(例えば、細胞フィードストック)であり、及び／又は、細胞培養液(例えば、上清)、植物抽出物、体液(例えば、ヒト血液及び／又は血漿、トランスジェニックミルク等)、及び／又はフィードストック(例えば、細胞フィードストック)から得られる。細胞培養液は、複数の細胞、例えば、哺乳動物細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO：Chinese hamster ovary)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK：human embryonic kidney)293細胞)、細菌細胞、及び／又は酵母細胞(例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞)、を包含しうるが、これらに限定されない。
【0079】
本発明の方法における接触工程は、免疫グロブリン又はそのフラグメントがペプチドに結合される及び／又は固定化されるように、適切な条件下で実施されうる。該接触工程は、適切な条件下で、該標的がペプチドに結合され及び／又は固定化されるように、該ペプチドを標的と一緒にするか、又は十分に近接させる為に実施される。該免疫グロブリン又はフラグメントは、共有結合的に及び／又は非共有結合的に該ペプチドに結合されうる。幾つかの実施態様において、該標的免疫グロブリン又はフラグメントは、親和性吸着を介してペプチドに結合されうる。該接触工程の間、該免疫グロブリン又はフラグメントはペプチドに結合されてよく、及び、該サンプル中の不純物(例えば、HCP)は該ペプチドに結合されなくてもよい。幾つかの実施態様において、サンプルは、本発明の複数の物品(例えば、本発明のペプチドを含む固体支持体)に接触され、及び、1つ以上の不純物は、ペプチドに結合せず、及び／又は複数の物品を通って流れ、それによって、該標的(例えば、免疫グロブリン又はフラグメント)を不純物(例えば、HCP)から少なくとも部分的に分離する。
【0080】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、標的(例えば、免疫グロブリン)結合に続いて本発明の物品を洗浄することを含み、それは、1以上の不純物を除去しうる。幾つかの実施態様において、該物品を洗浄することにより、物品及び／又はペプチドに非特異的に吸着される1以上の不純物が除去される。免疫グロブリン又はフラグメントをペプチド及び／又は物品から分離する(例えば、放出する)前に、洗浄が実施されうる。
【0081】
本発明の方法は、免疫グロブリン又はフラグメントをペプチド及び／又は物品から分離する(例えば、解放する、溶出する等)ことを含み得、それによって、単離された免疫グロブリン又はフラグメントを提供する。該免疫グロブリン又はフラグメントを該ペプチド及び／又は物品から分離すること又は解放することは、溶出工程を含みうる。幾つかの実施態様において、該免疫グロブリン又はフラグメントを該ペプチド及び／又は物品から分離すること又は解放することは、該免疫グロブリン又はフラグメントを該ペプチド及び／又は物品から溶出することを含む。免疫グロブリン又はフラグメントをペプチド及び／又は物品から溶出することは、免疫グロブリン又はフラグメントがペプチドから分離され又は解放されるように、ペプチド－免疫グロブリン相互作用を破壊する為に適した水性緩衝液に接触することを含みうる。ペプチド－免疫グロブリン相互作用を破壊する為に適した水性緩衝液は、相互作用を破壊する為に十分な濃度の化合物(例えば、塩)を含み得、及び／又は相互作用を破壊する為に十分なｐＨを有しうる。
【0082】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、免疫グロブリン又はそのフラグメントを単離及び／又は精製する為に使用されうる、直列又は並列のいずれかで、１以上のアフィニティークロマトグラフィー工程を含みうる。
【0083】
本発明の方法はさらに、分離工程後に、単離された免疫グロブリン又はフラグメントの量及び／又は純度を決定することを含みうる。HCP特異的ELISAは、を使用して、単離された免疫グロブリン又はフラグメントを含む組成物(例えば、溶出された画分)中のHCPの量を決定する為に使用されうる。初期サンプル中のHCPの量と比較した組成物中のHCPの濃度の比較が、単離された免疫グロブリン又はフラグメントの量及び／又は純度を決定する為に、任意的に、単離された免疫グロブリン又はフラグメントにHCP LRVを提供する為に、使用されうる。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、単離された免疫グロブリン又はフラグメントを含む組成物を提供し、該組成物は、該組成物の1mL当たり約0、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.5、又は約2mgのHCPの範囲～該組成物の1mL当たり約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、又は約5mgのHCPのHCP濃度を有しうる。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、単離された免疫グロブリン又はフラグメントを含む組成物を提供し、及び該組成物は、該組成物の1mL当たり約0、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、又は約5mgのHCPのHCP濃度を有しうる。
【0084】
本発明の方法は、分離工程後に少なくとも80％の単離された免疫グロブリン又はそのフラグメントの純度を提供しうる。幾つかの実施態様において、分離工程後に、該単離された免疫グロブリン又はそのフラグメントの純度は、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約97.1％、少なくとも約97.2％、少なくとも約97.3％、少なくとも約97.4％、少なくとも約97.5％、少なくとも約97.6％、少なくとも約97.7％、少なくとも約97.8％、少なくとも約97.9％、少なくとも約98％、少なくとも約98.1％、少なくとも約98.2％、少なくとも約98.3％、少なくとも約98.4％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.6％、少なくとも約98.7％、少なくとも約98.8％、少なくとも約98.9％、少なくとも約99％、少なくとも約99.1％、少なくとも約99.2％、少なくとも約99.3％、少なくとも約99.4％、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.6％、少なくとも約99.7％、少なくとも約99.8％、少なくとも約99.9％、若しくは約100％、又はその中の任意の値若しくは範囲、である。幾つかの実施態様において、分離工程後に、該単離された免疫グロブリン又はそのフラグメントの純度は少なくとも約97％であり、及びLRVは少なくとも約2.5である。幾つかの実施態様において、分離工程後に、該免疫グロブリン又はそのフラグメントの純度は少なくとも約98.1％であり、及びLRVは少なくとも約2.7である。本発明の該ペプチドは、化合物、例えば天然及び組換抗体(キメラを包含する組換抗体)、(例えば、Fc融合タンパク質)、遺伝子操作されたマルチボディ(engineered multibodies)、及びそれらの組み合わせ、例えば二価抗体とラクダ免疫グロブリン、及びモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との両方、を含むところの任意のタイプの抗体又はFc-フラグメント又はFc融合タンパク質に結合する為に、集める為に、精製する為に、固体表面上に固定化する為に使用されうる。該抗体は、任意の種類の起源のもの、例えば、哺乳動物(ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、ラクダ、アルパカ等)、鳥類(鶏、七面鳥等)、サメ等を包含するあらゆる種類の起源のもの、上記されたフラグメント、キメラ及びそれらの組み合わせを包含する含むあらゆる種類の起源のもの、でありうる。抗体は、任意の種類の免疫グロブリン、例えば、IgG、IgA、IgE、IgD、IgM、IgY(鳥類)等を包含する任意の種類の免疫グロブリン、を包含しうるが、これらに限定されるものでない。
【0085】
幾つかの実施態様において、抗体又はFcフラグメント(その融合タンパク質を包含するFcフラグメント)は、生体流体中、例えば、血液又は血液画分(例えば、血液血清、血漿)、卵黄及び／又はアルブミン、組織又は細胞増殖培地、組織溶解物又はホモジネート等の中、で運ばれる。
【0086】
幾つかの実施態様に従うと、同じものを含む液体組成物(例えば、サンプル)からの抗体又は抗体Fcフラグメントを結合する方法であって、該方法は、本発明の固体支持体とペプチドとを含む物品を用意すること；抗体又はFcフラグメント又はFc融合タンパク質が該ペプチドに結合するように、該組成物を該物品に接触させること；及び、該液体組成物を該物品から分離すること、ここで、該抗体又はFcフラグメント又はFc融合タンパク質が該物品に結合し；任意的に、(しかし、幾つかの実施態様において、好ましくは)該物品を洗って、該物品に非特異的に結合したHCPを除去すること；及び任意的に、(しかし、幾つかの実施態様において、好ましくは)該抗体又はFcフラグメント又はFc融合タンパク質を該物品から分離すること(例えば、溶出すること)、それによって、単離された及び／又は生成された形態で、該抗体又は抗体Fcフラグメントを用意することを含む上記方法が提供される。
【0087】
本発明の方法は、タンパク質Aを使用するものと同様の方法で、又は当業者に明らかであるその変形によって、実施されうる。例えば、接触工程及び分離工程は、連続的に(例えば、カラムクロマトグラフィーによって)実行されることができ、その後、既知の技術に従って、分離工程が、(例えば、溶出によって)実行されることができる。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、米国特許出願公開第2016／0075734号明細書及び／又は米国特許第10,266,566号明細書に記載されている1以上の工程を含む。
【0088】
幾つかの実施態様において、免疫グロブリン又はそのフラグメント(例えば、抗体又はFcフラグメント又はFc融合タンパク質)が集められるべきところの液体組成物及び／又はサンプルが生体流体を含む場合、該液体組成物はさらに、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含みうる。。幾つかの実施態様において、本発明のペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。
【0089】
下記の実施例は、本明細書で提供される粒子及び組成物の特定の態様を説明する為にのみ提供されており、従って、特許請求される発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【0090】
実施例
【0091】
以下の実施例は、例示的な実施態様を提供する。以下の実施例の或る観点は、本発明者等が実施態様の実施において十分に機能することが見出された又は企図された技術及び手順に関して開示されている。本開示及び当技術分野における一般的なレベルの技能に照らして、当業者は、以下の実施例が単なる例示を意図するものであり、現在主張されている主題の範囲から逸脱すること無しに、多数の変化、修正及び変更を採用されることができる。
【0092】
実施例1：mAb精製の為の新規ペプチドタンパク質A模倣物の同定
合成的に製造されたペプチドが、診断の為の特異的に結合する生体認識部分(specifically-binding biorecognition moieties)(Liu et al．2015 Talanta 136：114-127；Pavan and Berti 2012 Analytical and Bioanalytical Chemistry 402：3055-3070；Hussain et al．2013 Biosensors 3：89-107)、治療薬(Fosgerau and Hoffman 2015 Drug Discovery Today 20(1)：122-128)、及びタンパク質精製(Menegatti et al．2013 Pharmaceutical Bioprocessing 1(5)：467-485)として研究されてきた。様々なタンパク質治療薬、例えば、ヒト抗体、血液タンパク質、ホルモン、酵素を包含する様々なタンパク質治療薬、を対象とした多数のペプチドリガンドが、過去20年間に開発されてきた。ペプチドベースの吸着剤で得られた、結合容量値(Binding capacity values)、生成物の回収率及び純度は、ペプチドがタンパク質リガンドの信頼できる代替品であることを示す。IgG結合性ペプチドリガンドHWRGWV(配列ID番号：18)は広範囲に特徴付けられている(Yang et al．2006 J．of ペプチド Research 66：120-137；Yang et al．2009 J．of Chromatography A 1216(6)：910-918)。最適化された1.6のHCP LRVのこのリガンド(Naik et al．2011 J．of Chromatography A 1218：1691～1700)は、様々な複雑な供給源(complex sources)からモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、例えば、細胞培養液(Naik et al．2011)、植物抽出物(Naik et al．2012 J．of Chromatography A 1260：61-66)、ヒト血漿(Liu et al．2012 J．of Chromatography A 1262：169-179；Menegatti et al．2012 J．of Separation Science 35：3139-3148；Menegatti et al．2016 J．of Chromatography A 1445：93-104)、及びトランスジェニックミルク(Menegatti et al．2012)を包含する様々な複雑な供給源、を回収するのに効果的であることを示している。HWRGWV(配列ID番号：18)ベースの吸着剤の最適化に関する最近の研究において、樹脂が吸着剤1mL当たり91.5mg以下のIgGの結合能力を有する(Menegatti et al．2016)。HWRGWVの変異体(配列ID番号：18)がまた、タンパク質分解酵素に対する耐性を確保する為に非天然アミノ酸を使用して開発されている。とりわけ、変異体Ac-HWCitGWV(Ac-：アセチル化されたN末端，Cit：シトルリン；配列ID番号：20)は、最適化された結合性条件及び洗浄条件で、2.07のHCP LRVを提供した。これは、HWRGWV HWRGWV (配列ID番号：18)のアミノ酸組成と配列とを最適化することにより、有意に高い結合選択性を有する新規なリガンドをもたらすことができることを示す。
合成的に製造されたペプチドが、診断の為の特異的に結合する生体認識部分(specifically-binding biorecognition moieties)(Liu et al．2015 Talanta 136：114-127；Pavan and Berti 2012 Analytical and Bioanalytical Chemistry 402：3055-3070；Hussain et al．2013 Biosensors 3：89-107)、治療薬(Fosgerau and Hoffman 2015 Drug Discovery Today 20(1)：122-128)、及びタンパク質精製(Menegatti et al．2013 Pharmaceutical Bioprocessing 1(5)：467-485)として研究されてきた。様々なタンパク質治療薬、例えば、ヒト抗体、血液タンパク質、ホルモン、酵素を包含する様々なタンパク質治療薬、を対象とした多数のペプチドリガンドが、過去20年間に開発されてきた。ペプチドベースの吸着剤で得られた、結合容量値(Binding capacity values)、生成物の回収率及び純度は、ペプチドがタンパク質リガンドの信頼できる代替品であることを示す。IgG結合性ペプチドリガンドHWRGWV(配列ID番号：18)は広範囲に特徴付けられている(Yang et al．2006 J．of ペプチド Research 66：120-137；Yang et al．2009 J．of Chromatography A 1216(6)：910-918)。最適化された1.6のHCP LRVのこのリガンド(Naik et al．2011 J．of Chromatography A 1218：1691～1700)は、様々な複雑な供給源(complex sources)からモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、例えば、細胞培養液(Naik et al．2011)、植物抽出物(Naik et al．2012 J．of Chromatography A 1260：61-66)、ヒト血漿(Liu et al．2012 J．of Chromatography A 1262：169-179；Menegatti et al．2012 J．of Separation Science 35：3139-3148；Menegatti et al．2016 J．of Chromatography A 1445：93-104)、及びトランスジェニックミルク(Menegatti et al．2012)を包含する様々な複雑な供給源、を回収するのに効果的であることを示している。HWRGWV(配列ID番号：18)ベースの吸着剤の最適化に関する最近の研究において、樹脂が吸着剤1mL当たり91.5mg以下のIgGの結合能力を有する(Menegatti et al．2016)。HWRGWVの変異体(配列ID番号：18)がまた、タンパク質分解酵素に対する耐性を確保する為に非天然アミノ酸を使用して開発されている。とりわけ、変異体Ac-HWCitGWV(Ac-：アセチル化されたN末端，Cit：シトルリン；配列ID番号：20)は、最適化された結合性条件及び洗浄条件で、2.07のHCP LRVを提供した。これは、HWRGWV HWRGWV (配列ID番号：18)のアミノ酸組成と配列とを最適化することにより、有意に高い結合選択性を有する新規なリガンドをもたらすことができることを示す。
【0093】
本研究において、以前の研究で開発され且つ検証されたペプチド検索アルゴリズム(Xiao et al．2015 J．of Chemical Theory and Computation 1～1740-752；Xiao et al．2018 ACS Sensors 3：1024-1031；Xiao et al．2017 J．of Chemical Theory and Computation 13(11)：5709-5720；Xiao et al．2015 J．of Biomolecular Structure an Dynamics 33(1)：14-27；Xiao et al．2016 J．of Computational Chemistry 37(27)：2433-2435；Xiao et al．2016 Proteins： Structure, Function and Bioinformatics 84(5)：700-711)が、IgGに対してより高い結合選択性を有するHWRGWVの配列変異体(配列ID番号：18)を設計する為に使用された。最初に、IgG-HWRGWV(配列ID番号：18)複合体の構造が、その結合部位のトポロジー的特性及び物理化学的特性を特定する為に解析された。その後、Autodockプログラムが、より可能性の高い代替の結合性部位(alternative，more-likely binding sites)を特定する為に使用された。次に、ペプチド設計アルゴリズムが、代替のIgG結合性部位におけるHWRGWV(配列ID番号：18)の60,000の配列変異体(配列ID番号：18)をスクリーニングする為に使用された。IgG-HWRGWV(配列ID番号：18)複合体の知識に基づいて、ペプチド電荷(－1～＋3)と疎水性(最大2つの芳香族アミノ酸)とを固定するように配列変化が制限された。該変異体は、「Γスコア」に従ってランク付けされ、それは、標的への各変異体の結合内部エネルギー(静電、ファンデルワールス、溶媒和等)と、結合コンフォメーションにおけるその安定性を測定する。モンテ・カルロ(MC：Monte Carlo)メトロポリスアルゴリズムが、新規なペプチド配列を受け入れるか又は拒否し、それによって、ペプチド配列を最高のΓスコアを有するものに進化させる為に使用された。最後に、最も高いΓスコアを有する10個のペプチド変異体の結合性エネルギーが、各ペプチド-タンパク質複合体の少なくとも3つの独立した明示的溶媒原子分子動力学(MD：molecular dynamics)シミュレーションを実行することによって評価された。該MDシミュレーションは、探索アルゴリズム(search algorithm)によって返される立体配置(configuration)から開始され、ペプチド及びタンパク質の柔軟性を可能にして、平衡配位(equilibrium 立体配置)に進化できるようにする。該探索アルゴリズムは、予測される結合性エネルギーが低い、WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)、及びGWLHQR(配列ID番号：4)の4つの変異体を返す。選択されたリガンドが選択的であることを確認する為に、分子ドッキングを介して14個のHCPのパネルに対して4つの配列がイン・シリコ(in silico)でスクリーニングされるところの第2のセットの研究が実施された。MDシミュレーションとHCPへのドッキングとの組み合わされた結果は、イン・ビトロ(in vitro)で確認され、RHLGWF(配列ID番号：3)が非選択的であり、且つGWLHQR(配列ID番号：4)が予想よりも低いIgG収量を有することを示した。
【0094】
計算及び初期の競合的結合性研究において最高の性能を示した配列WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)が、更なる実験的評価の為に選択された。これらのリガンドは、アガロースベースのWorkBeads樹脂にコンジュゲーションされ、そして、次に、それらの静的結合性強度(static binding strength)と容量(KD(固体)及びQ最大)、動的結合性容量(dynamic binding capacity)(DBC10％)、並びにIgGをCHO細胞培養液から精製する為の能力に関して実験的に評価された。WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads樹脂及びMWRGWQ(配列ID番号：2)-WorkBeads樹脂は、KD(固体)(それぞれ、3.2x10-6M及び8.14x10-6)、Qmax(52.6及び57.5mg／mL)並びにDBC10％(43.8及び55.3mg／mL、5分間の滞留時間)は、前の作業でHWRGWV(配列番号18)-Workbeads樹脂で測定された対応する値と同様であった。WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads樹脂及びMWRGWQ(配列ID番号：2)-WorkBeads樹脂は、KD(固体)(それぞれ、3.2x10-6M及び8.14x10-6)、Q最大(52.6及び57.5mg／mL)並びにDBC10％(5分間の滞留時間で、43.8及び55.3mg／mL)の値を示し、それらは、以前の作業で、HWRGWV(配列ID番号：18)-Workbeads樹脂で測定された対応する値と同様であった。それでも、WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeadsは、クロマトグラフィープロトコルの最適化を最小限に伴って、著しく高い値のHCP LRV 2.7を与えた。イン・シリコ(in silico)設計を更に裏付ける為に、アルゴリズムによってキーバインダーとして示された残基を、異なる機能を有するアミノ酸で置き換えることによって、WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)の変異体のアンサンブル(ensemble)が構築された。得られた配列変異体のほとんど全てが貧弱なIgG結合性を示し、それによってアミノ酸による結合性のエネルギーのイン・シリコ(in silico)分解をサポートした。まとめると、これらの結果は、mAb治療薬のプラットフォーム精製プロセスにおける捕捉工程のタンパク質Aに対する有効な代替物としてペプチドWQRHGI(配列ID番号：1)を示す。
【0095】
塩化ナトリウム、グリシン、ヨード酢酸(IAA)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、N,N'-ジメチルホルムアミド(DMF)、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質濃度アッセイ、及び銀クエストシルバーステインキット(Silver Quest Silver Stain kit)はFisher(Pittsburgh，PA)から購入された。4～20％のBis-Tris Mini-PROTEANゲルは、BioRad Bio Safe coomassie(Hercules，CA)から購入され、Precision Protein Plus Dual Color protein standardを備えたBio-Rad TetraCellにおいて実行され、そして、BioRad Bio Safe coomassie (Hercules，CA)又は前述のSilver Quest silver stain kitを使用して染色された。塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS：phosphate buffered saline)、β-メルカプトエタノール、トリエチルアミン、エタンジチオール、アニソール、及びチオアニソールは、Sigma Aldrich(St．Louis，Missouri)からのものであった。
【0096】
トリフルオロ酢酸(TFA)、Fmoc保護されたアミノ酸、ピペリジン、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、及びヘキサウロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム(HATU：Hexauorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium)は、Chem Impex(Wood Dale，Illinois)から購入された。二塩基性リン酸ナトリウム(Sodium phosphate di-basic)及びメタノールは、VWR／Amresco(Solon，Ohio)から購入された。クロマトグラフィー実験は、Waters 2695分離プラットフォームにおいて実施された。マイクロボアPEEKカラム長さ30mm、内径2.1mmは、VICI Precision Sampling(Baton Rouge．Louisiana，USA)から購入された。IgGは、Athens Research & Technology(Athens，Georgia，USA)から購入された。(CHO：Chinese hamster ovary)細胞培養上清は、NC State UniversityのBiomanufacturing Training and Education Center(BTEC)によって親切に提供された。CHO HCP ELISAアッセイは、Cygnus Technologies(Southport，NC)から購入された。Workbeads 40 TREN樹脂は、BioWorks(Uppsala，Sweden)から購入された。精製されたペプチドリガンドは、Genscript(Piscataway，NJ)によって合成された。
【0097】
ペプチド設計アルゴリズム：この研究において使用されたペプチド設計アルゴリズムは、既知の「参照リガンド」よりも高い結合性強度を持つペプチド配列を発見できることが以前に証明されており、及び、この研究において、より高い親和でヒトIgGに結合する参照ペプチドHWRGWV(配列ID番号：18)の変異体を生成する為に使用された。HWRGWV(配列ID番号：18)とヒトIgGのFc領域との複合体が、IgGにおけるペプチドの新たな初期結合性部位を特定する為に、ドッキング研究における参照として利用された。配列進化(Sequence evolution)がX1X2X3X4X5X6GSGの形におけるペプチドで行われて、6量体のIgG結合性ペプチド配列を生成した。ペプチドC末端のGSG(Gly-Ser-Gly)三量体が非結合性セグメントとして追加され、クロマトグラフィーサポート上に結合されたときにペプチドリガンドが想定する配向をシミュレートした。この三量体は、結合性シミュレーション中に相互作用しないように規定されていた。シーケンスの変異体の中に、ランダムに選択された1つのアミノ酸が変異されたか、又はペプチド上のランダムに選択された2つのアミノ酸が交換された。配列移動中に選択された正に帯電した、負に帯電した、疎水性、極性、又は他の残基の数は、ペプチド変異体の生化学的機能を微調整する為に制限された。計算アルゴリズムにおいて、2種類の試行「移動」があった：複合体内のペプチドコンフォメーションが固定されている間にペプチド配列変化が移動すること、及びペプチド配列が固定されている間にペプチドコンフォメーション変化が移動すること。標的分子のコンフォメーションが固定された。アミノ酸の側鎖コンフォメーションは、ラヴェルの回転異性体ライブラリー(Lovell's rotamer library)から取得され、そして、結果として得られた各変異体は、最適な立体配置(configuration)を決定する為にエネルギー最小化に付された。次に、標的への各変異体の結合性内部エネルギー(ファンデルワールス、静電、溶媒和等)と結合コンフォメーションにおけるその安定性を測定する「Γスコア」が、AMBER14SB力場(force field)で陰溶媒MM／GBSAアプローチを使用して評価された。モンテカルロメトロポリス(Monte Carlo Metropolis)アルゴリズムが、新しいペプチド変異体を受け入れるか又は拒否し、それによって、該ペプチド配列を最も低いΓスコアを持つものに進化させる為に使用された。10,000回の反復の終わりに、最も低いスコアを有するペプチド変異体が特定された。標的分子IgGについての選択されたペプチド変異体(最も低いΓスコアを有するもの)の結合自由エネルギーは、各ペプチド-タンパク質複合体における100nsの明示的溶媒原子MDシミュレーションの3回の独立した実行によって評価された。MDシミュレーションは、探索アルゴリズムによって返された立体配置から開始され、そして、ペプチド及びタンパク質の柔軟性を可能にして、それらが平衡立体配置に進化できることを可能にする。
【0098】
モデルHCPにおけるペプチドWQRHGI(配列ID番号：1)とMWRGWQ(配列ID番号：2)のドッキング：HCPの選択における推定結合性部位は、創薬可能性評価を使用して、可能性のある結合部位を特定することで見つけられた。本明細書において、タンパク質の「創薬可能性」は、PockDrugを使用して決定された。これらの研究は、小分子又はペプチドリガンドによって標的とされる可能性が最も高いそれらの表面及びポケットを示す。
【0099】
選択されたHCPと、調査された各HCPについての潜在的な結合性部位の数が表2に示されている。この研究において使用された結晶構造のPDB IDが該表中に示されている；残念ながら、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)からのリストされた「問題のある」HCPのクリスタルファイル(crystal files)は、Protein Data Bankにおいて入手可能でない。最も相同的に類似したタンパク質を使用する為に、利用可能な場合に、マウス(Mus musculus)及びラット(Rattus norvegicus)の形態のタンパク質が利用された。タンパク質構造がげっ歯類に利用できなかった場合、ヒトの形態が利用されたか、又はそれを除いて、ショウジョウバエ(drosophila)(キイロショウジョウバエ)(Drosophila melanogaster)が利用された。これらのタンパク質はチャイニーズハムスタータンパク質と相同であり、且つネガティブスクリーニングツールとしてこの機能を果たすことができると規定されていた。各HCPにおける推定結合性部位の数が、下記の表の最後の列にリストされている。
【0100】
【表2】
【0101】
ペプチドWQRHGI (配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)は、ドッキングソフトウェアHADDOCK(High Ambiguity Driven Protein-Protein Docking，v.2.1)を使用して、該表2にリストされたHCPの結晶構造上の推定結合性部位に対してイン・シリコ(in silico)でドッキングされた。結果として得られたHCP：ペプチドドッキングは、共通の接触の割合に基づいて個別的にクラスター化され、ここで、「クラスター」は、85％又はそれよりも良い類似した接触を持つ少なくとも4つの構造のコレクションとして定義された。最も高度に密度が高められたクラスター(the most highly populated clusters)内の選択されたHCP：ペプチド複合体の結合エネルギーは、PRODIGY(PROtein binding energy prediction)ウェブサーバを使用して決定された。次に、ペプチドとHCPとの間で結果として得られた立体配置が、明示的な溶媒アプローチでAMBER15を使用してシミュレートされて、14個のHCPのそれぞれへのペプチド変異体の結合の速度論的プロセスを調べた。
【0102】
ペプチド合成：イン・シリコ(in silico)リガンド探索から得られた配列WQRHGI(配列ID番号：1)、配列MWRGWQ(配列ID番号：2)、配列RHLGWF(配列ID番号：3)及び、配列GWLHQR(配列ID番号：4)、並びに変異体MFRGWQ(配列ID番号：21)、変異体MWRAWQ(配列ID番号：5)、変異体MWRGFQ(配列ID番号：7)、変異体MWRGWN(配列ID番号：22)、変異体(NorL)WRGWQ(NorL：ノルロイシン７；配列ID番号：23)、変異体MGRGWQ(配列ID番号：24)、変異体MW(Cit)GWQ(Cit：シトルリン；配列ID番号：25)、変異体MWRWQ(配列ID番号：6)、変異体MWRGGQ(配列ID番号：26)、変異体GWRGWQ(配列ID番号：8)、変異体WQRHGIC(配列ID番号：30)、変異体WNRHGI(配列ID番号：12)、変異体WQ(Cit)HGI(配列ID番号：27)、変異体WQRAGI(配列ID番号：28)、変異体WQRHAI(配列ID番号：11)、変異体WQRHGL(配列ID番号：9)、変異体FQRHGI(配列ID番号：29)及び変異体WQRHGV(配列ID番号：10)が、Fmoc／tBu戦略に従って、Toyopearl AF-アミノ650M クロマトグラフィー樹脂(アミノ機能密度：0.6mmol／mL，東ソー，東京，日本国)において、Biotage Syro I robotic liquid handler及びペプチド合成スイート(peptide synthesis suite)(Biotage，Charlotte，NC)を使用して合成された。全ての残基は、Fmoc保護されたアミノ酸(Toyopearl樹脂のアミノ機能密度と比較して2.4倍モル過剰)、HATU(2.8倍モル過剰)、及びDIPEA(3倍モル過剰)との3つのカップリングを使用して、乾燥DMF中、12分間、コンジュゲーションされた。Fmoc脱保護は、DMF中の40％ピペリジンを使用して、4分間行われ、続いてDMF中の20％ピペリジンを使用して、室温で15分間行われた。最終的なペプチド脱保護は、90：5：3：2 TFA：チオアニソール：エタンジチオール：アニソールのカクテルを使用して、2時間の酸分解によって実行された。最後に、該樹脂がジクロロメタン中で乾燥されて、20％メタノールで膨潤するまで－20℃で保存された。
【0103】
WorkBeads TREN樹脂におけるペプチドコンジュゲーション：
5mLのWorkBeads TREN樹脂のアリコートが、1.86gのIAA、1.55gのEDC、及びカップリング剤としての1.12gのNHSを使用して、12.75mLの100mM MESバッファー、pH4.5中で活性化された。該反応は、回転させながら、室温で、48時間行われた。この反応の完了を試験する為に、10μLの樹脂が過剰のエタンジチオールとインキュベーションされた。次に、遊離スルフヒドリル基の存在が、エルマンアッセイ(Ellman assay)を使用して試験された；樹脂の表面アミンの67％がヨード活性化されていた。MWRGWQ(配列ID番号：2)が、DMF中の5％体積／体積 TEA中、50mg／mLで、101mgのペプチドを、室温、48時間、暗所、穏やかな攪拌下で、0.4mLの活性化された樹脂とともにインキュベーションされることによってコンジュゲーションされた。WQRHGIC(配列ID番号：30)が、5m MEDTA、pH8を添加した100mMリン酸緩衝液中、50mg／mLで、103mgのペプチドを、室温、48時間、暗所、穏やかな攪拌下で、樹脂とともにインキュベーションされることによってコンジュゲーションされた。未反応のヨードアセチル基が、10％(体積／体積)のTEAを含む2mLのDMF中、5倍過剰の2-メルカプトエタノール(50μL)を使用して飽和された。樹脂がリンスされ、そして、20％体積／体積のエタノール中、4℃で保存された。樹脂上の未反応のヨードアセチル基は、DMF中の5％v／v TEA中の2-メルカプトエタノールを使用して飽和させました。溶液中のコンジュゲートされていない結合ペプチドが、280nmで、UV吸光度によって定量化され、そして、樹脂上のリガンド密度は物質収支を介して決定された。MWRGWQ(配列ID番号：2)-Workbeadsは、ペプチド密度の0.43mmol／mLを有し、一方、WQRHGIC(配列ID番号：30)-Workbeadsは、ペプチド密度の0.110mmol／mLを有していた。該樹脂は、さらに使用するまで、20％メタノール中、4℃で保存された。
5mLのWorkBeads TREN樹脂のアリコートが、1.86gのIAA、1.55gのEDC、及びカップリング剤としての1.12gのNHSを使用して、12.75mLの100mM MESバッファー、pH4.5中で活性化された。該反応は、回転させながら、室温で、48時間行われた。この反応の完了を試験する為に、10μLの樹脂が過剰のエタンジチオールとインキュベーションされた。次に、遊離スルフヒドリル基の存在が、エルマンアッセイ(Ellman assay)を使用して試験された；樹脂の表面アミンの67％がヨード活性化されていた。MWRGWQ(配列ID番号：2)が、DMF中の5％体積／体積 TEA中、50mg／mLで、101mgのペプチドを、室温、48時間、暗所、穏やかな攪拌下で、0.4mLの活性化された樹脂とともにインキュベーションされることによってコンジュゲーションされた。WQRHGIC(配列ID番号：30)が、5m MEDTA、pH8を添加した100mMリン酸緩衝液中、50mg／mLで、103mgのペプチドを、室温、48時間、暗所、穏やかな攪拌下で、樹脂とともにインキュベーションされることによってコンジュゲーションされた。未反応のヨードアセチル基が、10％(体積／体積)のTEAを含む2mLのDMF中、5倍過剰の2-メルカプトエタノール(50μL)を使用して飽和された。樹脂がリンスされ、そして、20％体積／体積のエタノール中、4℃で保存された。樹脂上の未反応のヨードアセチル基は、DMF中の5％v／v TEA中の2-メルカプトエタノールを使用して飽和させました。溶液中のコンジュゲートされていない結合ペプチドが、280nmで、UV吸光度によって定量化され、そして、樹脂上のリガンド密度は物質収支を介して決定された。MWRGWQ(配列ID番号：2)-Workbeadsは、ペプチド密度の0.43mmol／mLを有し、一方、WQRHGIC(配列ID番号：30)-Workbeadsは、ペプチド密度の0.110mmol／mLを有していた。該樹脂は、さらに使用するまで、20％メタノール中、4℃で保存された。
【0104】
ペプチドベースのクロマトグラフィー吸着剤によるIgG結合の測定：初期研究について、35mgのMWRGWQ(配列ID番号：2)-Toyopearl樹脂、RHLGWF(配列ID番号：3)-Toyopearl樹脂、WQRHGI(配列ID番号：1)-Toyopearl樹脂、GWLHQR(配列ID番号：4)-Toyopearl樹脂、及びHWRGWV(配列ID番号：18)-Toyopearl樹脂(対照)が、PBS，pH7.4で平衡化され、膨潤量0.1mLに到達した後、引き続き、0.205mg／mLのCHO細胞培養上清中の1mg／mL IgGと、30分間インキュベーションされた。引き続き、該樹脂がPBSで数回洗われて、非特異的に結合したタンパク質を除去した。溶出が100mMグリシンバッファー pH2.5で行われた。素通り画分(flowthrough fractions)及び溶出画分が集められ、そして、還元条件下でSDSPAGEによって分析された。結果として得られたゲルがクーマシー染色(Coomassie staining)で染色された。さらに、5mgの吸着剤MWRGWQ(配列ID番号：2)-Toyopearl樹脂、MFRGWQ(配列ID番号：21)-Toyopearl樹脂、MWRAWQ(配列ID番号：5)-Toyopearl樹脂、MWRGFQ(配列ID番号：7)-Toyopearl樹脂、MWRGWN(配列ID番号：22)-Toyopearl樹脂、(NorL)WRGWQ(配列ID番号：23)-Toyopearl樹脂、MGRGWQ(配列ID番号：24)-Toyopearl樹脂、MWRWQ(配列ID番号：6)-Toyopearl樹脂、MWRGGQ(配列ID番号：26)-Toyopearl樹脂、GWRGWQ(配列ID番号：8)-Toyopearl樹脂、WQRHGI(配列ID番号：1)-Toyopearl樹脂、WNRHGI(配列ID番号：12)-Toyopearl樹脂、WQRAGI(配列ID番号：28)-Toyopearl樹脂、WQRHAI(配列ID番号：11)-Toyopearl樹脂、WQRHGL(配列ID番号：9)-Toyopearl樹脂、FQRHGI(配列ID番号：29)-Toyopearl樹脂、及びWQRHGV(配列ID番号：10)-Toyopearl樹脂がPBS pH7.4で平衡化され、膨潤量0.1mLに到達した後、引き続き、PBS pH7.4中の1mg／mL IgGと、30分間インキュベーションされた。清サンプル中の非結合IgGの量がブラッドフォードアッセイ(Bradford assay)で定量され、そして、ペプチド変異体によるIgG結合％を決定するために利用された。
【0105】
静的及び動的結合性容量(static and dynamic binding capacity)の測定：MWRGWQ(配列ID番号：2)-Workbeads及びWQRHGIC(配列ID番号：30)-Workbeadsが、バッチ及びブレークスルーバインディング研究によって、静的及び動的結合性容量の観点からそれぞれ特徴付けられた。ペプチドRHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)はそれぞれ、それらの低い選択性及び低い収率の故に、更なる研究の為に選択されなかった。30μLの樹脂のアリコートが、異なる濃度、すなわち、0.5、2、4、6、8及び10mg／mL、のPBS pH7.4中のヒトポリクローナルIgGの200μL溶液中で、4℃で一晩、穏やかに回転させながら個々にインキュベーションされた。樹脂が、遠心分離によってペレット化され、そして、上澄みが除去された。次に、該樹脂は、100μLのPBSで2回洗われ、そして、上清が集められた。結果として得られた画分が一緒にされて、BCAアッセイによって分析され、未結合のIgGを定量し、従って、吸着されたIgGの量を定量化した。結果として得られたデータがラングミュア等温線(Langmuir isotherm)に適合されて、Q最大及びKD(固体)の値を決定した。
【0106】
動的結合性容量(DBC：Dynamic binding capacity)の測定が、Waters 2695ユニットにおいて実行された。MWRGWQ(配列ID番号：2)-Workbeads樹脂及びWQRHGIC(配列ID番号：30)-Workbeads樹脂が、0.1mLのマイクロボアカラム中に湿潤で詰められ、そして、PBS pH7.4で平衡化された。PBS中の20mg／mLのヒトIgGの溶液が、それぞれ2分と5分の滞留時間(RT：residence times)に対応する0.05mL／分及び0.02mL／分でカラムに流された。結合したIgGはグリシンpH2.5で溶出された。ブレークスルー(breakthrough)の研究を通じて、流出液の吸光度が280nmでUV／Vis分光光度法によってモニターされた。DBCは、ブレークスルーカーブ(breakthrough curve)の10％で計算された。
【0107】
等温滴定カロリメトリー(ITC：isothermal titration calorimetry)による溶液中のIgG結合性親和性の測定：IgG：WQRHGI(配列ID番号：1)複合体の結合性自由エネルギーの実験的決定が、Nano ITC Low Volume calorimeter(TA Instruments，New Castle，DE)を使用してITCによって行われた。結合性エンタルピーと親和性とを決定する為の全ての滴定実験が、PBS，pH7.4中の5μLのWQRHGI(配列ID番号：1)の2mg／mL溶液を、PBS，pH7.4中の300mLのポリクローナルIgGの5mg／mL溶液中に繰り返し注入(250秒間隔)することによって、25℃で行われた。全ての溶液が、使用前に0.22μmシリンジフィルターでろ過された。10回の注入が測定毎に実行された。ペプチド希釈からのバックグラウンドエネルギーは、PBS pH7.4中の5μLのWQRHGI(配列ID番号：1)の2mg／mL溶液を10回注入することによって決定された。滴定データが、NanoAnalyze software(TA Instruments)を使用して分析され、そして、独立したフィッティングを使用してプロットされ、それは、結合性親和性(KD(ITC))及び相互作用の化学量論(N)を計算する為に、非競合的な単一サイト結合現象(non-competitive single-site binding phenomenon)に対応するパラメーターを用いて結果のワイズマンプロット(Wiseman plot)をフィッティングする。一定のブランクがまた、IgG基質の希釈熱を説明する為に、フィッティングにおいて利用された。
【0108】
MWRGWQ(配列ID番号：2)は、ITCを介して検査することができなかった。ペプチドMWRGWQ(配列ID番号：2)は、おそらく自己会合特性の故に、pH7.4の緩衝液中に溶解しなかった。MWRGWQ(配列ID番号：2)は強酸性緩衝液中に可溶であることがわかったが、ITCの結果は、酸性溶液と中性溶液との混合熱によって混乱した。ペプチドの結合がまた、低いpHで有意に減少し、結果がさらに複雑になった。MWRGWQ(配列ID番号：2)が溶解している緩衝液のpHを上げる試みがなされたが、pHが5を超えると該ペプチドがゲル化することが見られた。
【0109】
MWRGWQC(配列ID番号：31)-Workbead及びWQRHGIC(配列ID番号：30)-Workbeadを使用したCHO細胞培養液からのIgGの精製：0.1mLの容量の樹脂がPEEKマイクロボアカラム中に充填され、Waters 2695ユニットに取り付けられ、PBS，pH7.4で平衡化された。全てのクロマトグラフィーバッファーは、使用前に互換性のある0.2μmフィルターを通じてろ過された。0.205mg／mLのCHO HCPで細胞培養液中の1mg／mLのヒトポリクローナルIgGの100μLの容量の溶液が0.02mL／分でカラムに注入された(RT：5分)。注入後、該樹脂は、0.2mL／分のPBSで洗われ、そして、続いて0.2mL／分のPBS中の100mM NaClで洗われた。次に、溶出が、0.1Mの酢酸緩衝液 pH4で行われた。酸性洗浄工程が0.1Mのグリシン pH2.5で行われ、まだ結合しているタンパク質を全て除去した。流出液の吸光度が、280nmでのUV／Vis分光光度法によってモニターされた。画分が集められ、そして、中性のpHに調整された。総タンパク質濃度はBCAアッセイによって測定された。収集された全ての画分はまた、還元条件下でSDS PAGEを介して分析された。ゲルは銀染色によって染色され、そして、溶出画分における全体的なIgG純度が、ImageJソフトウェアを使用したデンシトメトリー分析(densitometric analysis)によって決定された。最後に、CHO特異的ELISAキットを使用して供給画分と溶出画分とを分析して、HCPの対数除去値(LRV：log removal value)を決定した。
【0110】
ペプチドバインダーのイン・シリコ(in silico)探索：上記された方法を使用して、多数の配列が生成され、そして、調査された。突然変異の動きの為に選択されたアミノ酸は、イン・シリコ(in silico)スクリーニングの最初のラウンド中に完全に偏りがなかった。2回目以降のラウンドにおいては、該変異は、下記の配列内の次のアミノ酸の1つだけを有するように制限された：Leu、Val、Ile、Ala、Trp、His、Arg、Lys、Ser、Thr、Asn、Gln、及びGly。これは、疎水性アミノ酸(Leu、Val、Ile、Ala、Trp)の数を制限し、従って、非特異的な疎水性相互作用を減らす為に行われた。正に帯電したアミノ酸(His、Arg、Lys)は、非特異的な静電相互作用及びイオン相互作用に寄与する可能性があり、且つイオン交換様リガンドの発見を防ぐ為に制限された。
【0111】
以前に公開された設計はCH3における結合性部位(binding sites)を意図していた為に、初期の研究とペプチドデザインはIgGのCH3部分の結合部位を使用して実施された。しかしながら、設計が結合の可能性が最も高い領域でのCH3サブユニットの自然な重複の故に、代替部位が後に求められた。IgG鎖CH2及びCH3は、高レベルの相同性と、非常に類似した残基品質(residue qualities)(RMSDのアラインメント：3.16Å及び類似性：39／113、すなわち34.5％)を有している故に、CH2はIgG結合の為の妥当な標的であると見なされた。この目的の為に、次に、CH3部分を使用して発見されたペプチドは、ドッキングされ、そして、原子論的にシミュレートされたが、CH3の代わりにCH2フラグメント上にあった。これらのシミュレーションは、100nsの明示的溶媒モデルにおいて実行され、最後のその10nsはポーズ分析(pose analysis)に使用され、そして次に、4つのリガンド候補の自由エネルギーは、可変内部変数誘電率モデルを使用した陰溶媒MM／GBSAアプローチを使用して計算された。
【0112】
【表3】
【0113】
同定された配列の中から、4つの候補、すなわち、WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)が、更なる評価の為に選択され、それらはそれぞれ、－8.81kcal／モル、－8.59kcal／モル、－8.43kcal／モル及び－15.17kcal／モルの計算された結合性自由エネルギーΔGb(MD)を有することが示された。これらの結合性エネルギーの全ては、上記の表3に詳述されている通り、HWRGWV's(配列ID番号：18)の－8.19kcal／モルよりも低かった。ΔGb(MD)の値は、例えばGWLHQR(配列ID番号：4)についてのΔGb(MD)＝－15.17kcal／molの場合、実験的に測定された値からまだ顕著な偏差があった。これについての1つの理由は、シミュレーション軌道の事後分析の為に使用されるMM／GBSAアプローチが水の影響を無視しており、従って、溶媒和によってもたらされるエンタルピーとエントロピーとの推定値が得られないことである。結合イベントが生じる場合に、それらは、ペプチドからの且つIgGからの水の解離を伴う。このことは水の動きの自由度における増加を結果としてもたらし、それによって、エンタルピーが失われ、エントロピーが増加する。それにもかかわらず、WQRHGI(配列ID番号：1)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)は、明示的な溶媒原子MDシミュレーションから得られた低いΓスコア及び低い値のΔGb(MD)の故に、イン・ビトロ(in vitro)調査の為に選択された。MWRGWQ(配列ID番号：2)は参照配列HWRGWV(配列ID番号：18)に類似しており、従って、更なる実験的評価の為にまた選択された。位置1でHisをMetに置き換えることは特に興味深いものであった。HWRGWV(配列ID番号：18)の発見に関する元の研究において、事実、ライブラリースクリーニングから同定された配列の中で主要な配列相同性の特徴の1つとして、1位(ペプチドN末端)にHisの優勢な存在が強調された。配列WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)とヒトIgG(PDB ID：1FCC)のCH2領域とによって形成される複合体は、図1に報告されている。
【0114】
結合エネルギーへの個々の残留物の寄与がまた、図2においてグラフで示されているように、MM／GBSAアプローチを介する事後分析を伴う明示的な溶媒シミュレーションを使用して計算された。この情報は、IgG-ペプチドの結合及び解離を支配する推進力に関する洞察を提供する。それはまた、様々な残基特性、例えば疎水性、電荷、構造、の相対的な重要性を示し、且つ、イン・ビトロ(in vitro)研究の為の配列変異体の選択ライブラリの我々の選択を通知する為に使用された。
【0115】
ペプチド選択性のイン・シリコ(in silico)評価：組換えソースからmAbを精製する為のアフィニティーリガンドとして利用される場合に、該ペプチドは、数百の分泌型HCP(hundreds of secreted HCPs)を含む複雑な環境において標的IgG分子を認識できなければならない。
【0116】
産業用mAb製造において、確立された主力製品であるチャイニーズハムスター卵巣(CHO：Chinese Hamster Ovary)細胞のセクレトーム(secretome)に関する現在の文献は、タンパク質A吸着剤に供給される清澄化された細胞培養液中に数百から数千のHCP種が存在することを報告する。この文脈において、文献で「問題のある」HCPとして知られているHCPのサブセットによって形成されるCHOセクレトームの一部に大きな注意が集められている。これらの種は、免疫原性応答又はmAb生成物の分解を引き起こす原因のいずれかという点で、患者の健康に脅威をもたらす。バイオマニュファクチャリングの文脈において、これらの種の多くはmAb生成物と共溶出してタンパク質A吸着剤を形成し、それによって後続の研磨工程にそれらの完全な除去の負担を課す。これらの「問題のある」HCPの幾つかは、mAbの臨床試験、プロセスの承認、更には製品の中止さえも遅らせることが報告されている。
【0117】
それ故に、標的IgGに対するペプチドリガンドの結合選択性は、タンパク質A模倣物としてのそれらの有効性にとって重要である。HCP不純物に対するペプチド結合の迅速なイン・シリコ(in silico)評価は、骨の折れる実験的評価の前に、リガンド開発の為の強力な潜在的ツールである。この文脈において、本発明者等は、一連のドッキング研究で使用する為の、WQRHGI(配列ID番号：1)変異体、MWRGWQ(配列ID番号：2)変異体、RHLGWF(配列ID番号：3)変異体及びGWLHQR(配列ID番号：4)変異体の為の標的として、14個の「問題のある」HCPのパネルを選択した。このパネルは、表2に示されているように、幾つかのペルオキシレドキシン、カルボキシペプチダーゼ、エノラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、カテプシン、及びリポタンパク質リパーゼを包含する。タンパク質の為、複数の生物からのこれらの利用可能なPBDエントリは、CHO HCPとの配列相同性及び構造的類似性の観点から分析された。配列相同性は、ExPASyのタンパク質配列アラインメントツールSIMを使用して計算され、一方、構造の類似性が、RCSB PDBタンパク質における比較ツールの柔軟なJava-FATCAT比較方法を使用して計算された。配列ブラスト(Sequence blasting)は、ペルオキシレドキシン(配列同一性68.07％；類似性83.13％)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(配列同一性84.7％；類似性89.5％)、カテプシンB(配列同一性82.7％；類似性)、及びカテプシンD(配列同一性86.8％；類似性92.4％)について、異なる起源生物の複数のタンパク質の間の高い相同性を示した。CHO HCPタンパク質と、選択された非ハムスタータンパク質との間の構造的類似性がまた、ペルオキシレドキシン(89％)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(100％)、カテプシンB(99％)及びカテプシンD(93.8％)についての類似性によって示されている通り、非常に高かった。
【0118】
これらのHCPの結晶構造は、PockDrugを使用して「創薬可能性」(druggability)評価を実行して、直鎖9-merペプチド(X1X2X3X4X5X6GSG)に対応する推定結合性ポケットを特定することによってイン・シリコ(in silico)で分析された。これにより、各HCPのタンパク質表面をプローブして、適切なサイズと形状のペプチド結合、溶媒への曝露、疎水性と親水性のプロファイル、及び水素結合性能力を検索した。各HCPにおける結合性部位の数が表2に記載されている。記載されている全てのタンパク質は、1つ以上4つ以下の推定結合性部位を有していた。
【0119】
推定上の結合性部位においてタンパク質をドッキングする為に、ペプチド変異体WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)の座標ファイル(coordinate files)が、ff14SB力場を使用して、AMBER 14シミュレーションスイートにおいて、明示的な溶媒分子動力学(MD：molecular dynamics)シミュレーションを介して生成された。簡単に説明すると、2fsのタイムステップを使用し、LINCSアルゴリズムを適用して、全ての共有結合を制約し、2,500の水分子を含む周期境界条件のシミュレーションボックス内の全てのペプチドに対して200psのMDシミュレーションが実行された。結果として得られたペプチドのコンフォメーションが、ドッキングソフトウェアHADDOCKを使用して、選択されたHCPの結晶構造における推定結合性部位に対してイン・シリコ(in silico)でドッキングされた。全てのHCP：ペプチドドッキングについての結果として得られたポーズは、一般的な接触の一部(a fraction of common contacts)に基づいてクラスター化された。構造の最大の集団を含むクラスターにおけるペプチド-HCP複合体は、スコアリング関数、すなわちXscore、を使用して分析されて、14個のHCP標的のそれぞれにおいてペプチド変異体の結合性ポーズ(binding poses)の最終セットを選択した。これらは、PRODIGY (PROtein binding energy prediction)のウェブサーバを使用して分析されて、結合エネルギーの対応する値(ΔGb(Xスコア))を計算した。結果は、異なる結合性部位にわたって平均化され、及びHCPに結合するペプチドの結合性エネルギーの結果として得られた値(ΔGb(Xスコア))が表4中にリストされている。シミュレートされたIgG結合と様々なペプチド変異体によるHCP結合性の比較を容易にする為に、グローバルHCPとIgGとの両方について、計算されたタンパク質-ペプチドΔGb(Xスコア)及びKD(Xスコア)の平均値が、表5中の全てのペプチドについて報告される。
【0120】
【表4】
【0121】
【表5】
【0122】
HCPと相互作用するペプチドの予測されたKD(Xスコア)は、IgGについてのKD(Xスコア)よりも少なくとも1桁高かった。明示的な原子シミュレーションがまた、AMBER15パッケージを使用してHCPへのペプチドの結合を予測する為に実行されたが、複数のシミュレーションの結果、結合性部位のいずれも4つのペプチドに対応しないことがわかった。これらの原子論的研究は、ペプチドがかなりの量でHCPに結合しない可能性が高いというドッキングエネルギー予測を確認する。
【0123】
変異体WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)は、IgGについての結合性強度と選択性(ΔGbXスコア；IgG／ΔGbXスコア；HCP)と間の適切なバランスを提供し、それ故に、更なる実験的特徴付けの為に選択された。HCPを使用したドッキング研究において、WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)及びGWLHQR(配列ID番号：4)は、選択した全てのHCPに対して低い結合性親和性を示した。同様に、GWLHQR(配列ID番号：4)は、IgGについて最も低い親和性を有すると予測された。初期ドッキング研究からのHCPへの変異体RHLGWF(配列ID番号：3)の結合についてのKD(Xスコア)に基づいて、RHLGWF(配列ID番号：3)は、IgGについてのその高い結合性強度にもかかわらず、比較的低い選択性を有すると予想された。低結合性エネルギー及びIgGに対する特異的親和性のイン・シリコ(in silico)予測に含まれる、実験的特徴付けの為の変異体WQRHGI's(配列ID番号：1)選択につながった追加の考慮事項。MWRGWQ(配列ID番号：2)が、参照配列HWRGWV(配列ID番号：18)に類似している為に選択された。
【0124】
非競合条件におけるIgG結合性ペプチド変異体WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)についての結合性親和性の特徴付け：候補ペプチドリガンドWQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)が、非競合条件(溶液中の純粋なIgG)におけるIgG結合の実験的評価の為に選択された。システイン誘導体化された配列WQRGHIC(配列ID番号：32)及びMWRGWQC(配列ID番号：31)が合成され、精製され、ヨードアセチル活性化されたTREN WorkBeads(WB)樹脂にコンジュゲーションされた(図3A)。Nano等温滴定熱量測定(ITC：iothermal titration calorimetry)少量KD(ITC)熱量計を使用して溶液中のWQRHGI(配列ID番号：1)をヒトポリクローナルIgGに対して滴定することによって実施された等温滴定熱量測定(ITC)試験により、ペプチドの標的タンパク質IgGへの結合性エネルギーが特異的結合に対して十分に低かったこと(5.88x10-5MのKD(ITC)，それは中庸の親和性を示す)が確認された。簡単に説明すると、PBS中の各ペプチドの2mg／mL溶液の5μL注入を、温度を25℃で一定に維持しながら、PBS中の300mLのポリクローナルIgGの5mg／mL溶液で10回行われた。滴定データがNanoAnalyze(TA Instruments)を使用して分析され、そして、「独立フィッティング」(independent fitting)を使用してプロットされた。これは、結合性親和性と化学量論とを計算する為に、非競合的な単一サイト結合性現象に対応するパラメーターを使用して、結果のワイズマンプロット(Wiseman plot)に適合し、それは、相互作用のIgG(N)当たりの相互作用するペプチドの数として定義される(図3B)。一定のブランクがまた、IgG基質の希釈熱を説明する為にフィッティングにおいて使用された。エネルギーピークの積分により、5.88x10-5MのKD(ITC)とWQRHGI(配列ID番号：1)の化学量論10が返された。
【0125】
固相(3.2x10-6M)において予測されたKD(固体)の値と、ITCを介して得られたKD(ITC)の値(5.88x10-5M)との違いは、ペプチド凝集体の形成を考慮することによって説明されることができる。すなわち、物理的な二量体と三量体であり、それらは、溶液中のペプチド濃度が注入回数とともに増加するにつれて形成された可能性がある。これの証拠は、滴定の終わりに吸熱ピークが現れることである(図3C)。吸熱現象としてのペプチド凝集は、文献において何度も報告されてきている。これらの自己組織化ペプチドダイマー及びトリマーは、ペプチドモノマーと比較してIgGに対する低い親和性を有する可能性がある。これは、イン・シリコ(in silico)研究と比較して、効果的に高いKD(低い親和性)を説明する可能性がある。これは、ペプチドリガンドが常にモノマー状態にあることを前提としている。それはまた、結合性の高いモル濃度を説明する。
【0126】
MWRGWQ(配列ID番号：2)の結合性親和性はITCを使用して調べることができなかった。溶液中の場合、ペプチドMWRGWQ(配列ID番号：2)は、強い自己会合特性を示し、且つ中性ｐＨでゲル化する傾向があったが、より低いpHで溶解されることができた。しかしながら、ペプチドが低いpH溶液中に溶解される場合に、異なるpH溶液の間の混合熱が非常に高く、且つ滴定時のペプチド-ペプチド又はペプチド-IgG結合性エネルギーを、ITC実験における混合熱と区別することが困難になった。
【0127】
等温吸着研究は、WQRGHIC(配列ID番号：32)-WorkBeadsについてのKD(固体)の3.2x10-6及びQmaxの52.6mg IgG／mL樹脂、並びに、MWRGWQC(配列ID番号：31)-WorkBeadsについてのKD(固体)の8.1x10-6及びQmaxの57.5mg IgG／mL樹脂を決定した。これらの結果は、イン・シリコ(in silico)スクリーンを通じて見つけられた配列が実際にIgGの優れた結合剤であることを示す。吸着剤の各30μLアリコートが結合バッファー(PBS，pH7.4)中で平衡化され、200μLのIgG溶液と、0～10mg／mLの範囲で濃度を上げながら、室温で、2.5時間インキュベーションされた。未結合のIgGの量は、Micro BCA Protein Assay Kitを介して上清を分析することによって決定された。樹脂の体積当たりの結合IgGの量(Q)は、物質収支によって決定され、そして、溶液中の非結合IgG(CIgG)の対応する平衡濃度に対してプロットされた。該データはラングミュア等温線モデル(Langmuir isotherm model)に適合し、従って、最大結合性容量(Qmax)と解離定数(KD)の値を提供した。WQRGHIC(配列ID番号：32)-WorkBeads及びMWRGWQC(配列ID番号：31)-WorkBeadsにおけるIgGの吸着等温線が、図4A及び図4Bにそれぞれ報告されている。
【0128】
ラングミュアフィッティング(Langmuir fitting)によって得られたKD(固体)の値(表6)は、WQRHGI(配列ID番号：1)についてITC(図3B)を使用して計算された値よりも低く、固相におけるより強い有効親和性を示す。これは、クロマトグラフィー樹脂において表示された複数のリガンドが単一のIgG標的を結合することができることを考慮することによって説明されることができる。対称的な二量体として、事実、IgGのFc領域は、各リガンドについての少なくとも2つの結合性部位を含む。複数のリガンドによる協同的結合(cooperative binding)は、タンパク質吸着中のより高い結合性強度(「アビディティ」として知られる現象)をもたらす。タンパク質Aと比較してペプチドリガンドの親和性が中程度であるにもかかわらず、Qmaxの値はまた、HWRGWV(配列ID番号：18)を使用した以前の研究で得られた値と十分に比較され(Naik et al．2011 J．of Chromatography A 1218(13)：1691～1700；Kish et al．2013 Industrial and Engineering Chemistry Research 52(26)：8800-8811)、且つ、タンパク質A吸着剤と比較される場合に、妥当である(Hahn et al．2003 Adsorption J．of the Int．Adsorption Society 790：35-51)ことは注目に値する。この高容量は、ペプチドリガンドの高密度に起因し、それは、100ミリ当量／mLで、吸着されたIgG分子毎に複数のリガンド相互作用を可能にする為に十分な高さである可能性があった。
【0129】
【表6】
【0130】
残基毎の変化の限られたライブラリーは、ペプチドとIgG標的との間の結合性エネルギーを減少させることにおけるペプチドWQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)における各残基の重要性を確認した。更に、これらの結果は、図2において見られるように、各残基の相対的重要性のイン・シリコ(in silico)予測を支持した。このことは、ペプチドWQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)の20個の変異体のアンサンブルを設計且つ構築することによって達成された。1～6位における選択された残基が変異された。該ペプチド変異体は、Fmoc／tBuケミストリーを介してToyopearl AF-アミノ-650M樹脂において直接的に合成された。結果として得られた吸着剤が、2mg／mLでヒトIgGの溶液とともに、3.5mLの溶液当たり1mLの樹脂の割合で、室温で30分間、インキュベーションされた。溶液中のIgGの残留濃度(residual concentration)は、上清のブラッドフォード濃度アッセイ(Bradford concentration assay)によって決定されて、樹脂の体積当たりの結合IgGの量を計算する為に利用された；表7は、各配列変異体の、変異体によって結合されたmg IgG／元の配列(WQRHGI(配列ID番号：1)又はMWRGWQ(配列ID番号：2)のいずれか)ｘ100％として定義される結合性％を報告する。このことは、結合性強度を維持し、従って、結合性エネルギーを低減する上での各残基の重要性を示す。
【0131】
【表7】
【0132】
結合性強度に悪影響を与えると予測された残基(MWRGWQ(配列ID番号：2)におけるM)又は無視できる程度(MWRGWQ(配列ID番号：2)におけるG)を置換することによって生成された変異体；WQRHGI(配列ID番号：1))におけるQ及びGは、IgG結合の最小の損失を示した。注目に値するのは、Gの削除であり、それは、その計算された寄与と一致して、IgG結合のごくわずかな減少を結果としてもたらした。一方、IgG結合の為に重要であると予測される残基、例えば、WQRHGI(配列ID番号：1)におけるW、MWRGWQ(配列ID番号：2)におけるW1、両方のペプチドにおけるR、及びWQRHGI(配列ID番号：1)におけるH、の置換は、予想通り、IgG収量の主要な損失を結果としてもたらした。特に、シトルリン(Cit)に置き換えると、ペプチド結合が完全に失われる故に、Rによって表示される正電荷は、結合に対して重要であることがわかった。このことは、Cit及びRにおける側鎖官能基は、分子構造と水素結合性能力が非常に似ており、電荷が異なり、Citにおけるウレイル基は中性であり且つRにおけるグアニジル基は中性pHで正に帯電している故に理解可能である。最後に、残基6は、どちらのペプチドとの結合についてのその重要性に関して予測された傾向に従わなかった。結合性親和性を最小限に変化させると予想されたMWRGWQ(配列ID番号：2)におけるQの置換は、IgG収量の大きな損失を引き起こし、一方、WQRHGI(配列ID番号：1)におけるIleの置換は、IgG結合における大きな損失を結果としてもたらすと予想され、取るに足らない損失を結果としてもたらした。
【0133】
IgGの動的結合容量(DBC：dynamic binding capacity)の値は、MWRGWQC(配列ID番号：31)-WorkBeads及びWQRGHIC(配列ID番号：32)-WorkBeadsについて、ブレークスルーアッセイ(breakthrough assay)によって測定され、且つIgGについての他のペプチドリガンドのDBCに匹敵することがわかった。ブレークスルー曲線(breakthrough curves)(図５のパネルA～D)は、PBS中のIgGの20mg／mL溶液を2つの異なる滞留時間(2分及び5分)に対応する2つの異なる流速(0.05及び0.02mL／分)で、WQRGHIC(配列ID番号：32)-WB吸着剤及びMWRGWQC(配列ID番号：31)-WB吸着剤に流すことによって得られた。静的実験において観察されたものと同様に、MWRGWQC(配列ID番号：31)-WorkBeadsはWQRGHIC(配列ID番号：32)-WBよりもわずかに高い結合性能力を示したが、両方ともHWRGWVC(配列ID番号：34)-WorkBeadsと類似していた(表8)。結合性能力に関して、WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)の両方がタンパク質A及び他のIgG結合性リガンドに対して信頼できる代替物であることが証明された。
【0134】
【表8】
【0135】
競合条件におけるIgG結合性ペプチド変異体WQRHGI(配列ID番号：1)、MWRGWQ(配列ID番号：2)、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)の特性付け：該選択された4つの配列変異体は、CHO細胞培養上清からヒトIgGを精製する為のそれらの能力について試験され、及び主にイン・シリコ(in silico)予測を反映していることが分かった。それらはイン・シリコ(in silico)でアンダーパフォーム(underperform)しているように見えたが、RHLGWF(配列ID番号：3)及びGWLHQR(配列ID番号：4)が、IgGを結合するそれらの能力を確認し且つイン・シリコ(in silico)で予測されるそれらの選択性を調べる為に、WQRHGI(配列ID番号：1)及びMWRGWQ(配列ID番号：2)と一緒にこれらの条件において試験された。フィードストックは、ヒトポリクローナルIgGを、清澄化されたヌルCHO-S細胞培養液にスパイクして、1mg／mLのIgG濃度及び0.205mg／mLのCHO HCP濃度を得るように調製された。500μLのアリコートが、静的条件において、30分間各ペプチド吸着剤にロードされた。緩く結合されたタンパク質を除去する為のPBSでの洗浄工程に続いて、0.1Mのグリシンバッファー pH2.5を使用して、最初の溶出工程が実行されて、全ての結合タンパク質を除去した。素通り画分(flowthrough fractions)及び溶出画分がきちんとロードされ、そして、SDS PAGEによって分析された(図6A～図6B)。溶出画分のIgG純度の値は、ゲル上の対応するレーンのデンシトメトリー分析(densitometric analysis)によって決定され、そして、表9において報告されている。該値は、図6A～図6Bに報告されたSDS-PAGEのデンシトメトリー分析によって計算された。
【0136】
【表9】
【0137】
計算的な研究によって予測された通り、ペプチドGWLHQR(配列ID番号：4)及びWQRHGI(配列ID番号：1)は、溶出画分において最高値のIgG純度を返し、高感度の銀染色技術に直面しても、両方とも明らかに100％のIgG純度を返した。これらの結果は、イン・シリコ(in silico)結合性研究によって示された、CHO HCPについてのGWLHQR(配列ID番号：4)及びWQRHGI(配列ID番号：1)の低い結合から無の結合を裏付けている。しかしながら、GWLHQR(配列ID番号：4)ベースの吸着剤は、より低いＩｇＧ収量をもたらし、これは、低い結合性能力を示す。この場合における実験的研究は、IgGの潜在的な結合剤としてGWLHQR(配列ID番号：4)を検証しなかった。このことは、計算探索アルゴリズムがIgGを結合する潜在的なペプチド変異体の数を制限する為に使用される故に、予想されることができる。原子シミュレーションは相対的な結合性エネルギーを結果としてもたらす傾向がある故に、これは完全に予想外の結果ではなかった。不十分なイン・ビトロ(in vitro)結合強度の結果として、GWLHQR(配列ID番号：4)が更に追求されなかった。
【0138】
変異体RHLGWF(配列ID番号：3)は、高いIgG収量をもたらしたが、非常に低いIgG純度(52.28％)をもたらし、従って、更なる研究において追求されなかった。これは、イン・シリコ(in silico)の結果と一致しており、それは、該選択されたパネルにおける大部分のHCPへのこのペプチドの実質的な結合を示した。この結果は、GWLHQR(配列ID番号：4)及びWQRHGI(配列ID番号：1)と比較して、RHLGWF(配列ID番号：3)の疎水性が高いことに起因し、それは、非特異的タンパク質結合を促進する。これらのペプチドの疎水性を定量的に比較する為に、Kyte及びDoolittleによって開発されたアルゴリズム(1982 J．of Molecular Biology 157(1)：105-132)を使用して、それらのハイドロパシーの総平均(GRAVY：Grand Average of Hydropathy)インデックスを計算し、ここで、より高い(又は、より低い負の)スコアは、より高い疎水性を示す。RHLGWF(配列ID番号：3)のGRAVYインデックスは0.4であり、GWLHQR(配列ID番号：4)のGRAVYインデックスは－1.45であり、及び、WQRHGI(配列ID番号：1)のGRAVYインデックスは－0.82であった。一般的に、GRAVYインデックスが高いほど疎水性が高く、それは、非特異的な結合につながる可能性がある。
【0139】
ペプチド変異体MWRGWQ(配列ID番号：2)におけるメチオニンの酸化による樹脂の再利用性の問題により、本発明者等は更なる研究から該配列を排除することになった。このことは、MWRGWQ(配列ID番号：2)がイン・シリコ(in silico)予測に沿ってIgGについて高い結合性選択性を示し、97.82％のIgG純度の値を提供した為に、残念であった。また、GRAVYインデックスが－1.38である場合、MWRGWQ(配列ID番号：2)は、低いHCP結合をより低いGRAVYスコアに結び付ける相関関係をサポートすることにまた留意されたい。しかしながら、メチオニンは、穏やかな酸化剤の存在下でメチオニンスルホキシド(MetO)に酸化される傾向にある；これらは、タンパク質の溶出と吸着剤の再生について利用される酸性環境(pH4及びpH2.5)を包含する。従って、メチオニン含有ペプチドリガンドは、広範囲に再利用することに応じてゆっくりと酸化され、IgG結合親和性を失う可能性がある。このことは、MWRGWQ(配列ID番号：2)樹脂が、数回のクロマトグラフィー精製の実行で確実に再利用できなかった理由を説明し、それは、工業プロセスにおけるその有用性を大幅に制限する。
【0140】
デンシトメトリー分析(100％)によって計算された、WQRHGI(配列ID番号：1)を使用して回収されたIgGの高純度は、2.7のHCP LRV値によって確認され、従って、WQRHGI(配列ID番号：1)がタンパク質Aと同様の精製能力を有することを示す。これは注目に値する結果である。本発明者等の知る限り、WQRHGI(配列ID番号：1)は、小さな合成ペプチドリガンド、例えばHWRGWV(配列ID番号：18)を包含する小さな合成ペプチドリガンド、についてこれまでに報告された中で最高のHCP LRVを示し、それは、1.6の最適化されたLRVを提供した。高い生成物純度は、ペプチドリガンドの高い結合性特異性並びに追加の洗浄工程の結果である。競合する移動相実験において、CHO細胞培養液中のIgGのフィードストック溶液の0.5mLの容量が、WQRHGI(配列ID番号：1)-WB樹脂を充填した0.1mLのカラムに5分間の滞留時間で注入された。溶出バッファーは、pH4では0.2Mの酢酸バッファー、pH2.5では0.1Mのグリシンバッファーのままであった。洗浄工程(PBS中の0.1Mの追加NaCl，pH7.4)は、少量のHCP不純物を除去し、それは、非特異的に結合された不純物を減らす為の高塩洗浄の重要性を示す(図7A)。集められたクロマトグラフィー画分がSDS-PAGEによって分析された(図7B、希釈されたCHO HCPを強調する為に銀染色された)。画分中のIgGの％値(総タンパク質((例えば、IgG＋CHO HCP)に対するIgG濃度の割合として表される)は、SDSゲル中のレーンのデンシトメトリー分析によって計算され、且つ下記の通りである：対照(C)，0.00％：ロード(L)，59.77％；フロースルー(FT：Flowthrough)，0.00％；溶出1(El1)、100.00％；溶出2(El2)，0.00％；IgG 93.30％。
【0141】
前のセクションにおいて報告されたよりも低いリガンド密度を使用して、WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeadsはHi-Trapタンパク質A樹脂で得られたHCPクリアランスの99.7％を提供し、更に、本発明者等のペプチド樹脂はタンパク質Aに対する選択性に匹敵することを示す。リガンド密度が高くなると非特異的相互作用が増加することが多い故に、リガンド密度がWB樹脂の100ミリ当量／mLから35.2ミリ当量／mLに下げられることによって、下げたリガンド密度を有する吸着剤が製造された。結果として得られた吸着剤は、以前と同じCHOフィードストック(0.205mg／mLのCHO HCPと一緒にされた1mg／mLのIgG)に対してチャレンジされた。PBSに吸着させた後、該樹脂はPBSで洗浄され、その後、結合したタンパク質が0.2Mの酢酸緩衝液pH4で溶出された。素通り画分(flowthrough fractions)、溶出画分及び再生画分が集められ、そして、SDS-PAGEによって(図8)及びCHO HCP特異的ELISAによって分析されて、WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeadsによって提供されるHCP LRVと、タンパク質A樹脂によって提供されるHCP LRVとの割合を決定した。高感度銀染色を用いた電気泳動分析により得られた溶出されたIgGの純度が100％として測定された。銀染色が、IgGと共溶出されたタンパク質不純物の存在を拡大する為に採用された。該ゲルのデンシトメトリー分析は、事実、ヒトIgGの重鎖及び軽鎖以外の何らのタンパク質種を検出することができなかった。下記の表10は、総タンパク質(IgG+CHO HCPs)に対するIgGの割合として表されるクロマトグラフィー画分中のIgGの％値を示す。該値は、図8において報告されているSDS-PAGEのデンシトメトリー分析によって計算された。
【0142】
【表10】
【0143】
吸着剤WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeadsがまた再利用可能であることが示された。WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads吸着剤は、CHO細胞培養上清からのIgG精製の繰り返しサイクルでチャレンジされた。具体的には、WQRHGI(配列ID番号：1)-WBが1mg／mLでヒトIgGを含むCHO液と5分間の滞留時間で接触され、PBSで洗浄され、0.2Mの酢酸緩衝液pH4で洗浄して、結合されたIgGを溶出し、0.1Mのグリシンバッファー pH2.8で再生されそして最後に、1％の酢酸で洗浄されるサイクルが4回繰り返された。図9に見られる通り、該樹脂は、4サイクルにわたって結合性性能における何らの低下を示さなかった。
【0144】
複数のタンパク質Aの代替品が利用可能であるが、真の模倣物と呼ばれるほど高いクリアランスを誇るものはない。分子のクラスとして、ペプチドは合成的に合成されることができ、それは、病気の原因となる粒子による汚染の可能性を減らし、そして、バッチ間のばらつきを減らす。利用可能な配列空間の広い範囲で、ペプチドは利用できる多種多様なコンフォメーション及び機能を示す。同様のクリアランス、結合性能力、及び精製品質を備えた幾つかのペプチドリガンドが発明されてきている(Kan et al．2016 J．of Chromatrography A 1466：105-112；Yang et al．2009 J．of Chromatography A 1216(6)：910-918；Lund et al．2012 J．of Chromatography A 1225：158-167；Zhao et al．2014 J．of Chromatography A 1355：107-114；Xue et al．2016 Biochemical Engineering Journal 2017：18-25)が、タンパク質Aと競争する為に十分なプロセスを提供するというとらえどころのない目標は、とらえどころのないままである。非ペプチドリガンド、例えば、Prometic BiosciencesからのトリアジンベースのMabSorbent A1P及びA2P、が存在する(Newcombe et al．2005 J．of Chromatography B 755：37-46；Guerrier et al．2001 J．of Chromatography B 755：37-46)又はGE Healthcare's MEP (Ngo and Khatter，1990 J．Chromatography 510：2841-291)が、プロテインAのHCPクリアランスの頂点に到達したものはない。
【0145】
本明細書においては、ペプチド結合の強度を改善することが以前に示された計算プログラムが、ペプチドHWRGWV(配列ID番号：18)の配列を変異する為に使用された。ペプチドHWRGWV(配列ID番号：18)は、IgGのFc部分にしっかりと且つ特異的に結合することが広く示されてきている。該計算プログラムは、イン・シリコ(in silico)で予測されるIgGに対する親和性が高い幾つかの配列を特定することができた。モンテカルロベースの計算突然変異法(Monte-Carlo based computational mutation method)を使用して、広範囲の計算シーケンス空間(computational sequence space)が調査された。原子医学的MD研究が、ヒトIgGへの4つのペプチドの結合を示す為に実施され、及びこれらの同じペプチドが、一連の「問題のある」(problematic)HCPに対する新規のネガティブスクリーンにおいて試験された。これらの組み合わせられた結果は、これら4つのペプチドのうちの3つがIgGを特異的に結合することを示す。イン・シリコ(in silico)の結果によって通知されたイン・ビトロ(in vitro)研究において、4つの選択された配列のうちの3つは、元のリガンドであるHWRGWV(配列ID番号：18)と比較した場合に、CHO HCP不純物に対して類似しているがわずかに低下した親和性を示した。しかしながら、ネガティブ・イン・シリコ・スクリーン(negative in silico screen)によって予測されるように、4つの選択されたシーケンスのうちの3つは、最初のドッキング研究で選択された「問題のある」(problematic)HCPについて低い平均親和性を示し、且つMDシミュレーション中に結合しなかった。これらの結果は、これらの選択された配列が細胞培養溶液からIgGを効果的に分離できたことを示した。
【0146】
IgG及びコンジュゲーションされたWQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads及びMWRGWQ(配列ID番号：2)-WorkBeadsを使用して実施した研究は、これら2つのリガンドがHWRGWV(配列ID番号：18)と同様の結合性親和性を示すことを示した。それぞれがマイクロモル範囲のKD(固体)値を有していた。樹脂WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeads及びMWRGWQ(配列ID番号：2)-WorkBeadsはまた、以前のHWRGWV(配列ID番号：18)-ベースの樹脂と同様の結合性能力を示し、且つ幾つかのタンパク質A樹脂の結合性能力の範囲である。WQRHGI(配列ID番号：1)-WorkBeadsは、これまでのところ、HCPクリアランスの点でタンパク質A樹脂に代わる最良のペプチドベースのリガンドである。CHOタンパク質の存在下における実験は、細胞培養不純物の減少を予測する為に、本明細書において行われたMDシミュレーションとドッキング研究を検証する。イン・シリコ(in silico)研究によって予測されたように、競合的結合性研究は、配列RHLGWF(配列ID番号：3)が幾つかの不純物を結合したことを示した。GWLHQR(配列ID番号：4)は不純物をほとんど結合しなかったが、それはまた、IgG標的タンパク質を十分に高い収率で結合することもできなかった。しかしながら、MWRGWQ(配列ID番号：2)及びWQRHGI(配列ID番号：1)は、イン・シリコ(in silico)で予測されるように、両方ともIgGを結合することができ、同時にHCPタンパク質を通過させることができた。以前に調査されたHWRGWV(配列ID番号：18)吸着剤と同様の結合性能力を有するWQRHGI(配列ID番号：1)樹脂を使用して、この研究は99％を超えるHCPクリアランスを得ることができた；このことは、合成リガンドの中で前例のないものであり、且つタンパク質Aベースの樹脂でのみ達成可能である。この研究は更に、WQRHGI(配列ID番号：1)樹脂が性能の低下をほとんど伴わずに再利用可能であることを示した。他の標的に特異的に結合できるペプチドリガンドを探す場合に、MDシミュレーション及び問題のある宿主細胞タンパク質に対するドッキング研究とともに標的結合性タンパク質を決定する為のペプチド設計アルゴリズムの使用は有益である可能性がある。ペプチドが高レベルの疎水性又は荷電を示さない限り、或るペプチド配列が特異性を示すかどうかを事前に決定することは困難である。本明細書において記載された計算方法は、結合性標的としてIgGを使用した本実施例の実験結果とよく相関することが示されている。この方法は、2つの高性能樹脂を発見した。そのうちの1つは、タンパク質A HiTrapカラムによって提供されるHCP除去の99.7％を提供することによって、工業標準のタンパク質Aと競合していた。この手順は、既知のペプチドリガンドと、まだ発見されていないバインダーを有するタンパク質の両方に基づいて、他の非常に特異的なリガンドを特定する為の大きな期待を示す。
【0147】
上記されたものは本発明の例示であり、それれを限定するものとして解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、請求項と同等のものが該請求項に包含されるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】