特表 2022-551901 新規カンナビノイドシンターゼを使用したカンナビゲロール酸からのカンナビノイドの生合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-14

(54)【発明の名称】新規カンナビノイドシンターゼを使用したカンナビゲロール酸からのカンナビノイドの生合成

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/22 20060101AFI20221207BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221207BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20221207BHJP

   C12N 9/04 20060101ALN20221207BHJP

【ＦＩ】

C12P7/22 ZNA

C12N1/19

C12N15/53

C12N9/04 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022521602

(86)(22)【出願日】2020-10-12

(85)【翻訳文提出日】2022-06-01

(86)【国際出願番号】 SG2020050583

(87)【国際公開番号】W WO2021071438

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】62/913,991

(32)【優先日】2019-10-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507421865

【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティ オブ シンガポール

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ゴー，メイベル ダーリーン コー

(72)【発明者】

【氏名】ユー，ウェン シャン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050DD13

4B050FF01

4B050FF03E

4B050LL01

4B064AC16

4B064AD29

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA72X

4B065AA77X

4B065AA80X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB08

4B065CA05

4B065CA10

4B065CA18

4B065CA44

(57)【要約】

カンナビゲロール酸をカンナビノイドシンターゼオルソログと接触させることによりカンナビノイドを生成させるための方法。カンナビノイドシンターゼオルソログは、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）以外の生物に由来する。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の組み換え細胞であって、上記カンナビノイドシンターゼオルソログをコードする核酸をそのゲノムに含む、組み換え細胞が開示される。カンナビノイドシンターゼオルソログは、組み換え細胞においてその活性型で発現される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上のカンナビノイドを生成させるための方法であって、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）以外の生物に由来するカンナビノイドシンターゼオルソログと接触させるステップを含む、方法。

【請求項2】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニコチアナ・アテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、イネ（インディカ種）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラビドプシス・リラータ亜種リラータ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ）、パエニバシラス ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１）、ストレプトマイセス・イポモエアエ ９１－０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａｅ ９１－０３）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、バチルス・サブティリス １６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、またはファイトフトラ・パラシティカ Ｐ１５６９（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｐ１５６９）に由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、表１および表２に示されるものから選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７、または配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７と７０％以上の同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記生成されるカンナビノイドが、３５８．５ｇ／ｍｏｌ、３７４．５ｇ／ｍｏｌ、または３３０．５ｇ／ｍｏｌの式量を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記生成されるカンナビノイドが、カンナビエルソン酸およびカンナビエルソインを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記生成されるカンナビノイドが、３５８．５ｇ／ｍｏｌの式量を有するいずれのカンナビノイドも含まず、カンナビノイドシンターゼオルソログが、配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７のアミノ酸配列、または配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７と７０％以上の同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で産生される組み換え酵素である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、表１および２に示されるものから選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７、または配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７と７０％以上の同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の組み換え細胞であって、カンナビノイドシンターゼオルソログをコードする核酸をそのゲノムに含み、前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニコチアナ・アテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、イネ（インディカ種）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラビドプシス・リラータ亜種リラータ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ）、パエニバシラス ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１）、ストレプトマイセス・イポモエアエ ９１－０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａｅ ９１－０３）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、バチルス・サブティリス １６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、またはファイトフトラ・パラシティカ Ｐ１５６９（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｐ１５６９）に由来し、前記カンナビノイドシンターゼオルソログが、前記組み換え細胞において活性型で発現される、組み換え細胞。

【請求項12】

前記核酸が、表１および２に示されるものから選択されるカンナビノイドシンターゼオルソログをコードする、請求項１１に記載の組み換え細胞。

【請求項13】

前記核酸が、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７、または配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７と７０％以上の同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むカンナビノイドシンターゼオルソログをコードする、請求項１２に記載の組み換え細胞。

【請求項14】

前記核酸が、配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７のアミノ酸配列、または配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７と７０％以上の同一性を有する配列を含むカンナビノイドシンターゼオルソログをコードする、請求項１３に記載の組み換え細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景技術
カンナビノイドの生合成経路は、徹底的な調査の対象となっている。カンナビノイド生合成経路における様々な酵素のクローニングおよび発現が、いくつかの研究グループにより達成されている。たとえば、Δ^１－テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ、すなわちカンナビノイドシンターゼの構造および機能が解明されている。Ｓｈｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１２， ４２３（１）：９６－１０５を参照されたい。

【0002】

２つのカンナビノイド、カンナビジオール酸およびΔ^９－テトラヒドロカンナビノール酸の生合成は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において異種発現によりアサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）および他の生物からのカンナビノイド生合成経路の酵素を発現することにより、達成されている。たとえば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２０１９， ５６７（７７４６）：１２３－１２６およびＺｉｒｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７， ２５９：２０４－２１２を参照されたい。これらなどの研究は、異種性の系においてカンナビノイド生合成経路を構築することが可能であることを確立している。

【0003】

特異的かつ高い収率でカンナビノイドを合成するためのさらなる酵素および方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

カンナビノイドを生成させるための方法が開示される。本方法は、カンナビゲロール酸を、カンナビノイドシンターゼオルソログと接触させるステップを含む。カンナビノイドシンターゼオルソログは、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）以外の生物、たとえばオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニコチアナ・アテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ノカエア・カエルレセンス（Ｎｏｃｃａｅａ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）（Ｔｈｌａｓｐｉ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｍｅｘｉｃａｎｕｍ）、イネ（インディカ種）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラビドプシス・リラータ亜種リラータ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ）、パエニバシラス ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１）、ストレプトマイセス・イポモエアエ ９１－０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａｅ ９１－０３）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、バチルス・サブティリス １６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、およびファイトフトラ・パラシティカ Ｐ１５６９（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｐ１５６９）に由来する。

【0005】

また、それぞれがそれらのゲノムにカンナビノイドシンターゼオルソログをコードする核酸を含むサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の組み換え細胞であって、カンナビノイドシンターゼオルソログが、先行する段落に列挙された生物のいずれかに由来し、カンナビノイドシンターゼオルソログが、上記組み換え細胞においてその活性型で発現される、組み換え細胞が提供される。

【0006】

１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明および実施例に記載する。他の特性、目的、および利点は、詳述した説明、図面、また添付の特許請求の範囲から明らかであろう。

【0007】

以下の本発明の説明は、添付の図面を表す。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、基質としてのカンナビゲロール酸（「ＣＢＧＡ」）から形成され得るカンナビノイド産物を示す。カンナビエルソン酸（「ＣＢＥＡ」）の分子式および式量は、それぞれＣ_２２Ｈ_３０Ｏ_５および３７４．５である。カンナビエルソイン（脱カルボキシル化ＣＢＥＡ）の分子式および式量は、それぞれＣ_２１Ｈ_３０Ｏ_３および３３０．５である。示される他の全ての化合物の分子式および式量は、それぞれＣ_２２Ｈ_３０Ｏ_４および３５８．５である。ＣＢＣＡ＝カンナビクロメン酸、ＣＢＴＡ＝カンナビシトラン酸（ｃａｎｎａｂｉｃｉｔｒａｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＢＤＡ＝カンナビジオール酸、ＴＨＩＣＡ＝テトラヒドロイソカンナビノール酸、ＴＨＣＡ＝テトラヒドロカンナビノール酸、およびＣＢＬＡ＝カンナビシクロール酸。

【図2A】図２Ａは、カンナビノイドシンターゼオルソログの１８の反応セットの代表的な全イオンクロマトグラムを示す。各反応セットは、分析のため１．７分を採用した。

【図2B】図２Ｂは、１８の反応セットのうちの９つ、すなわちセット１－３、７－９、１３－１５に加えられたＣＢＧＡの存在を示す質量電荷比“（ｍ／ｚ”）＝３５９．５で得たカンナビノイドシンターゼオルソログの１８の反応セットの代表的な抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を示す。

【図2C】図２Ｃは、ｍ／ｚ＝３５７．５を有するカンナビノイドの生成を示した１８の反応セットの代表的なＥＩＣを示す。

【図3A】図３Ａは、１８のカンナビノイドシンターゼオルソログのグループの全イオンクロマトグラフを示す。各反応セットは、１．７分を採用した。

【図3B】図３Ｂは、１８の反応セットのうちの９つ、すなわちセット１－３、７－９、１３－１５に加えたＣＢＧＡの存在を示すｍ／ｚ＝３５９．５で得たカンナビノイドシンターゼオルソログの１８の反応セットの代表的なＥＩＣを示す。

【図3C】図３Ｃは、ｍ／ｚ＝３５７．５を有するカンナビノイドの生成を呈した１８の反応セットの代表的なＥＩＣを示す。

【図4】図４は、ｍ／ｚ＝３５７．２０７１を有するカンナビノイドを生成したカンナビノイドシンターゼオルソログの代表的なクロマトグラムを示す。各反応セットは、分析するために１５．７０分を採用した。列１、２、および４のクロマトグラムは、ＣＢＧＡを陽性カンナビノイドシンターゼオルソログとインキュベートした際のピークの存在を示し、このピークは、カンナビノイドシンターゼオルソログの非存在下で行った対照実験（列３）で見出されるピークよりも６５倍大きい。

【図5】図５は、ｍ／ｚ＝３７３．２０２０を有するカンナビノイドを生成したカンナビノイドシンターゼオルソログの代表的なクロマトグラムを示す。各反応セットは、分析するために１５．７０分を採用した。列２～４のクロマトグラムは、ＣＢＧＡを陽性カンナビノイドシンターゼオルソログとインキュベートした際のピークの存在を示し、このピークは、カンナビノイドシンターゼオルソログの非存在下で行った対照実験（列１）で見出されるピークよりも１２０倍大きい。

【図6】図６は、ｍ／ｚ＝３２９．２１２２を有するカンナビノイドを生成したカンナビノイドシンターゼオルソログの代表的なクロマトグラムを示す。各反応セットは、分析するために１５．７０分を採用した。列１、２、および４のクロマトグラムは、ＣＢＧＡを陽性カンナビノイドシンターゼオルソログとインキュベートした際のピークの存在を示し、このピークは、カンナビノイドシンターゼオルソログの非存在下で行った対照実験（列３）で見出されるピークよりも３００倍大きい。

【発明を実施するための形態】

【0009】

ＣＢＧＡからのカンナビノイドの生合成を触媒する酵素が開示される。カンナビノイドシンターゼとして以前には知られていないこれら酵素は、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）以外の生物に由来する。これら酵素は、その活性型で、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において組み換え技術により発現され得る。

【0010】

カンナビノイドを生成させるための上記に要約された方法は、ＣＢＧＡをアサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）に由来しないカンナビノイドシンターゼオルソログと接触させるステップを必要とする。カンナビノイドシンターゼオルソログの供給源は、限定するものではないが、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ニコチアナ・アテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔｅ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、イネ（インディカ種）（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｄｉｃａ）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｊａｐｏｎｉｃａ）、アラビドプシス・リラータ亜種リラータ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ）、パエニバシラス ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ａｌｏｅ－１１）、ストレプトマイセス・イポモエアエ ９１－０３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｐｏｍｏｅａｅ ９１－０３）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ． ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、バチルス・サブティリス １６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、およびファイトフトラ・パラシティカ Ｐ１５６９（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｐ１５６９）であり得る。

【0011】

カンナビノイドシンターゼオルソログは、限定するものではないが、以下の表１および２に示されるものであり得る。例示的なカンナビノイドシンターゼオルソログは、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７のアミノ酸配列、または配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７と７０％以上（たとえば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）の同一性を有する配列を有し得る。

【0012】

上述の方法は、３５８．５ｇ／ｍｏｌ、３７４．５ｇ／ｍｏｌ、または３３０．５ｇ／ｍｏｌの式量を有するカンナビノイドを生成し得る。特定の方法では、３５８．５ｇ／ｍｏｌ、３７４．５ｇ／ｍｏｌ、および３３０．５ｇ／ｍｏｌの式量を有するカンナビノイドが、それぞれ生成される。

【0013】

別の方法は、カンナビエルソン酸およびカンナビエルソインを生成する。この方法の一例は、カンナビエルソン酸およびカンナビエルソインの両方を含むカンナビノイドを生成するが、この産物は３５８．５ｇ／ｍｏｌの式量を有するカンナビノイドを全く含まない。この例示的な方法では、カンナビノイドシンターゼオルソログは、配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７のアミノ酸配列、または配列番号６７、７７、９７、もしくは１２７と７０％以上の同一性を有する配列を含む。

【0014】

上述の方法では、カンナビノイドシンターゼオルソログは、組み換え酵素であり得る。組み換え酵素は、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で産生され得る。具体的な方法は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で産生される組み換え酵素を特徴とする。

【0015】

また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の組み換え細胞が、カンナビノイドシンターゼオルソログをコードする核酸をそのゲノムに含むことが上述されている。このオルソログは、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）以外の生物に由来する。カンナビノイドシンターゼオルソログの例示的な供給源は、上記に列挙されており、以下の表１および２に示されている。

【0016】

組み換え細胞は、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７、または、配列番号７、１６、２３、３１、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、１１７、および１２７と７０％以上（たとえば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）の同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むカンナビノイドシンターゼオルソログをコードする核酸を含み得る。

【0017】

さらに詳述することなく、当業者は、本明細書中の開示に基づき、本開示を完全な度合いまで利用できることが考えられる。よって以下の具体的な実施例は、単なる説明と解釈すべきであり、いかなる方法であっても本開示の残りを限定すべきではない。本明細書中記載される全ての刊行物は、その全体が参照により組み込まれている。

【0018】

実施例
実施例１：見込みのあるカンナビノイドシンターゼの同定および調製
その配列に基づき、ＴＨＣＡシンターゼは、ベルベリン架橋ＦＡＤ依存性酵素として分類され得る。利用可能な配列データベースの検索を通して、ベルベリン架橋ＦＡＤ依存性酵素としてＵｎｉＰｒｏｔデータベースにて注記されている２３２の関連する遺伝子を同定した。言い換えると、２３２の遺伝子は、見込みのあるカンナビノイドシンターゼオルソログであった。

【0019】

各遺伝子配列を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質発現に関してコドン最適化し、合成し、ｐＹＥＳ２－ＣＴベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にクローニングした。これらベクターを、化学的な処置を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１細胞に別々に形質転換し、ＳＣ－ＵＲＡグルコース選択プレート上にて３０℃で２日間増殖させた。各プレート由来の３つの単一のコロニーを採取し、ＳＣ－ＵＲＡグルコース選択プレート上にて複製し、３０℃で２日間インキュベートした。複製したコロニーを、１０ｍＬのＳＣ－ＵＲＡグルコース培地において３０℃で１６時間増殖させた。次に、細胞を回収し、５ｍＬのＳＣ－ＵＲＡガラクトース培地に再懸濁し、タンパク質発現のため３０℃で１６時間増殖させた。１６時間後に、細胞を再度回収し、－２０℃で保存した。また、カンナビノイドシンターゼオルソログを全く担持しない細胞を、上述のように調製して陰性対照として扱った。

【0020】

細胞を、１ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ユニットのリチカーゼを伴う１００ｍＭのクエン酸塩バッファー（ｐＨ５．５）４００μＬに再懸濁した。細胞を、振とうさせながら３７℃で１時間インキュベートした。１グラムのガラスのビーズを懸濁液に添加し、細胞を、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して、ひびを入れて開けた。細胞片を１４，８００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離することにより除去した。

【0021】

実施例２：酵素によるアッセイ
見込みのあるカンナビノイドシンターゼオルソログを、以下のように酵素活性について試験した。５５μＬの反応容量で、１ｍｇ／ＬのＣＢＧＡ２．５μＬ、２０ｍＭのＦＡＤ２．５μＬ、および上記のように調製した酵母細胞の上清５０μＬを組み合わせ、大気条件下でインキュベートした。またＣＢＧＡを欠いた対応する対照反応も行った。２４時間後に、反応物を酢酸エチルで３回抽出した。抽出した物質のサンプルを真空乾燥させ、ネガティブイオンモードを使用した質量分析のため、アセトニトリルに再溶解した。各サンプルの、ｍ／ｚ＝３５７．５およびｍ／ｚ＝３７３．５でのＥＩＣを作製し、カンナビノイドの生合成がこれらオルソログにより触媒されたかどうかを決定した。見込みのある反応産物を図１に示す。

【0022】

それぞれの見込みのあるカンナビノイドシンターゼオルソログで、３つの単一の酵母コロニーを採取し、上述のように増殖させた。各コロニーから調製した細胞上清を、６つの部分に分けた。このうち３つの部分を、ＣＢＧＡとインキュベートし、残りの３つの部分を陰性対照反応としてＣＢＧＡとインキュベートしなかった。まとめると、それぞれの見込みのあるオルソログにおいて、９つの反応をＣＢＧＡの存在下で行い、９つの反応物をＣＢＧＡとインキュベートしなかった。

【0023】

ＣＢＧＡとインキュベートしたサンプルは、抽出した物質がｍ／ｚ＝３５７．５および／またはｍ／ｚ＝３７３．５で少なくとも８００，０００の存在量を有するＥＩＣのクロマトグラフのピーク領域を有した場合、カンナビノイド合成で陽性とみなした。見込みのあるカンナビノイドシンターゼオルソログは、合計９つのＣＢＧＡとの反応物のうちの７つが上記の基準を使用して陽性であった場合に、陽性とみなした。これら結果を、以下の表１、ならびに図２Ａ～２Ｃおよび図３Ａ～３Ｃに示す。

【0024】

図２Ａ～２Ｃおよび３Ａ～３Ｃは、Ｒａｐｉｄ－Ｆｉｒｅ／Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ質量分析の代表的なクロマトグラムである。図２Ｃは、ｍ／ｚ ３５７．５でピークの存在を示す代表的なクロマトグラムを示す。図３Ｃは、ｍ／ｚ ３７３．５でピークの存在を比較する代表的なクロマトグラムを示す。

【0025】

【表1】

【0026】

試験した７２のカンナビノイドシンターゼオルソログのうち、２０が、Ｃ_２２Ｈ_３０Ｏ_４（ＭＷ＝３５８．５；ｍ／ｚ ３５７．５）の分子式を有するカンナビノイドの生成を示し、１６のオルソログが、Ｃ_２２Ｈ_３０Ｏ_４（ＭＷ＝３７４．５；ｍ／ｚ ３７３．５）の分子式を有するカンナビノイドの生成を示した。５つのオルソログが、両種類のカンナビノイドの生成を示した。上記の表１を参照されたい。

【0027】

実施例３：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるカンナビノイドシンターゼオルソログの発現
基質としてＣＢＧＡを使用するカンナビノイドシンターゼの活性を示したオルソログをコードする遺伝子を、より大規模なタンパク質発現のためＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系にクローニングした。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＴＨＣＡシンターゼの発現は、以前に示されていた。たとえばＺｉｒｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ． ２０１５， ３７（９）：１８６９－１８７５およびＬａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５， ２１１：６８－７６を参照されたい。

【0028】

これら遺伝子を、ｐＰＩＣＺＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後標準的な技術を使用してＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムに組み込んだ。得られたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組み込み体を、アガープレートから植菌し、バッフル付きフラスコにおいて、２０ｍＬの緩衝化複合グリセロール培地で、３０℃で４８時間、１９０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。細胞を、遠心分離により回収し、０．５（ｗ／ｖ）％のカザミノ酸および０．０１（ｗ／ｖ）％のリボフラビンを含む２００ｍＬの緩衝化メタノール複合培地に再懸濁した。オルソログタンパク質の発現を、合計１２０時間の間２４時間ごとに１％のメタノールを添加することにより誘導した。

【0029】

細胞を、遠心分離により回収し、バッファーＡ（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０および１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁した。細胞を、Ｍ１１０Ｐ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して溶解した。細胞片を遠心分離により除去し、細胞のライセートを、５ｍＬのＳｔｒｅｐＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、流速１ｍＬ／分で充填した。カラムを２５ｍＬ、すなわち５カラム容量（「ＣＶ」）のバッファーＡで洗浄し、６ＣＶのバッファーＢ（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのデスチオビオチン）で溶出した。２８０ｎｍでの吸光度の増大により同定したタンパク質を含むフラクションを集め、濃縮し、－８０℃で凍結した。

【0030】

５０μＬの反応容量で、精製したカンナビノイドシンターゼを、１５０μＭのＣＢＧＡおよび０．２ｍＭのＦＡＤを含む５０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ８．０）とインキュベートした。反応物を、３０℃で２４～４８時間インキュベートし、次に１６０μＬのアセトニトリルを添加して反応を停止させ、タンパク質を沈殿させた。この混合物（１２０μＬ）を、ネガティブイオンモードのＡｇｉｌｅｎｔ ６５５０ ｉＦｕｎｎｅｌ Ｑ－ＴＯＦ高分解能質量分析計と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを使用する質量分析のため、Ａｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８カラムに注入した。各サンプルに関するｍ／ｚ＝３５７．２０７１、ｍ／ｚ＝３７３．２０２０、およびｍ／ｚ＝３２９．２１２２でのＥＩＣを作製し、見込みのあるカンナビノイドの生合成がオルソログにより触媒されるかどうかを決定した。

【0031】

結果を、図４～６および以下の表２に示す。

【0032】

【表2】

【0033】

スクリーニングした２３２の見込みのあるＣＢＳオルソログのうち、７つのオルソログが、２種類のカンナビノイド、（ｉ）Ｃ_２２Ｈ_３０Ｏ_４の分子式を有する「カンナビジオール酸基」型（ＦＷ＝３５８．５；ｍ／ｚ＝３５７．２０７１、図４参照）、および（ｉｉ）Ｃ_２２Ｈ_３０Ｏ_４の分子式を有するカンナビエルソン酸（ＦＷ＝３７４．５；ｍ／ｚ＝３７３．２０２０、図５参照）の生成を示した。カンナビエルソン酸の脱カルボキシル化産物、すなわちＣ_２１Ｈ_３０Ｏ_２の分子式を有するカンナビエルソイン（ＦＷ＝３３０．５；ｍ／ｚ＝３２９．２１２２、図６参照）もまた観察された。３つのオルソログが、カンナビジオール酸基のカンナビノイドのみを生成した。４つのオルソログが、カンナビエルソン酸およびカンナビエルソインのみを生成した。

【0034】

他の実施形態
本明細書に開示される全ての特性は、任意の組み合わせで組み合わせられ得る。本明細書で開示される各特性は、同じ、同等、または同様の目的に役立つ別の特性と置き換わり得る。よって、他の意味が明示されない限り、開示される各特性は、均等物または同様の特性の一般的なシリーズの単なる一例である。

【0035】

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に解明でき、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合するように本発明の様々な変更および修正を行うことができる。よって、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内にある。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【手続補正書】

【提出日】2022-06-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022551901000001.app

【国際調査報告】