(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-14
(54)【発明の名称】細胞外マトリックス足場中の単層細胞パッチ
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20221207BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20221207BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20221207BHJP
A61L 27/18 20060101ALI20221207BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20221207BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20221207BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
A61L27/24
A61L27/22
A61L27/18
A61L27/38
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022522932
(86)(22)【出願日】2020-10-19
(85)【翻訳文提出日】2022-06-15
(86)【国際出願番号】 US2020056327
(87)【国際公開番号】W WO2021077084
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】62/973,695
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591236068
【氏名又は名称】カーネギー－メロン ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＮＥＧＩＥ－ＭＥＬＬＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ファインバーグ，アダム ウォルター
(72)【発明者】
【氏名】シムコ，レイチェル
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C081
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC02
4B029GB09
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC46
4B065CA44
4C081AB11
4C081BA12
4C081BA13
4C081CA271
4C081CD111
4C081CD121
4C081CD171
4C081CD34
4C081DA02
4C081EA06
(57)【要約】
細胞の微細組織カプセル化の方法は、組織足場スタンプを細胞外マトリックス化合物でコーティングすることを含む。方法は、組織足場スタンプを熱応答性基質に置くことと、組織足場スタンプに細胞培養物を播種することとを含む。細胞培養物は、細胞外マトリックス化合物に結合する細胞パッチを形成する。組織足場スタンプ上の単層の境界は細胞間結合のための発現を維持し、ここで、単層の細胞間結合は張力を発現するように構成される。方法は、熱応答性基質を除去することを含む。方法は、溶媒中に微細組織を懸濁させることによって微細組織構造を折り畳むことを含む。折り畳まれた微細組織構造を溶媒から回収し、生体に投与する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の微細組織カプセル化の方法であって、組織足場スタンプを細胞外マトリックス化合物でコーティングすることと、
前記組織足場スタンプを熱応答性基質上に置くことと、
前記組織足場スタンプに細胞培養物を播種することと、
前記細胞培養物を、指定される温度で、前記組織足場スタンプ上でインキュベートすることであって、前記細胞培養物が、前記細胞外マトリックス化合物に結合する細胞パッチを形成する、インキュベートすることと、
前記細胞パッチによって、前記組織足場スタンプ上に単層を形成し、前記単層の境界が、細胞間結合の発現を維持することと、
前記熱応答性基質を除去することと、
前記組織足場スタンプを前記細胞パッチから除去して、前記細胞パッチ周囲に微細組織構造を形成することと、
前記微細組織を溶媒中に懸濁させることによって前記微細組織構造を折り畳むことと、
前記折り畳まれた微細組織構造を溶媒から回収することと、
前記折り畳まれた微細組織構造を生体へ投与することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記組織足場を管構造に形成することと、前記組織足場の管構造に基づいて管形状を含む細胞パッチを形成することと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞パッチが、血管の断片を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
抗体を前記細胞パッチに添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
微細組織構造を生体へ投与することが、前記微細組織構造を注入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞パッチが角膜内皮細胞を含み、前記方法が、前記細胞パッチを角膜に導入することと、
重力を利用して前記細胞パッチと前記角膜との接触を確保することと
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記微細組織構造のサイズが、前記組織足場スタンプのサイズに比例し、前記微細組織構造のサイズが、注射装置の直径の一部である、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記組織足場スタンプが有機ケイ素化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記有機ケイ素化合物がポリジメチルシロキサンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞外マトリックス化合物が、コラーゲンＩＶ、ラミニン、線維芽細胞成長因子タンパク質、および血管内皮成長因子タンパク質のうちの１つまたは複数を含むタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記組織足場スタンプの配置が、前記組織足場スタンプを前記熱応答性基質上にプリンティングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記熱応答性基質がＰＩＰＡＡｍポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記組織足場スタンプが、規則的な形状を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記組織足場スタンプが、２５０μｍ２未満またはそれにほぼ等しい表面寸法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞パッチが１０～１００個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
細胞パッチ中にある細胞間結合の発現および細胞の細胞骨格を維持する細胞単層を含む細胞パッチと、前記細胞パッチ周囲に折り畳まれた微細組織構造であって、細胞パッチと外部環境との間に物的障壁を設けるように構成された細胞外マトリックスを含む微細組織構造と
を含むシステム。
【請求項17】
前記細胞外マトリックスが、コラーゲンＩＶ、ラミニン、線維芽細胞成長因子タンパク質、および血管内皮成長因子タンパク質のうちの１つまたは複数を含むタンパク質を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記微細組織構造が管構造を形成する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項19】
前記単層が細胞１０～１００個を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項20】
前記細胞パッチが筋組織を含み、成長因子を前記細胞外マトリックスに添加して筋組織の血管内部成長を促進する、請求項１６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１８日に出願された米国特許出願シリアル番号第６２／９７３，６９５号についての米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張するものである。
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１８日に出願された米国特許出願シリアル番号第６２／９７３，６９５号についての米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張するものである。
【0002】
政府の権利
本発明は、アメリカ国立衛生研究所から授与された認可番号１ＲＯ１ＥＹ０２４６４２－０１Ａ１の政府支援を用いて行われた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所から授与された認可番号１ＲＯ１ＥＹ０２４６４２－０１Ａ１の政府支援を用いて行われた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
本開示は、微細組織の形成、および生体への微細組織の適用に関する。
【背景技術】
【0004】
細胞を患者へ投与することは、多くの疾患に有望な療法になってきた。しかしながら、単一細胞懸濁液中でデリバリーされた細胞は、修復部位に注入された直後に死ぬことが多く、単一細胞が、損傷したまたは不全の何百万もの細胞から構成される臓器および組織を適切に修復したかも不明である。細胞注射療法の現在の方法は、細胞構造および表現型に変化を与える単一細胞懸濁液中への細胞の酵素放出を用いることを含む。加えて、注入された単一細胞は、物理的注射プロセスから生じるストレスと所望の組織への結合不足との組合せにより、注射直後に死ぬことが多い。
【発明の概要】
【0005】
本明細書に記載のシステムおよび方法は、小型無傷細胞パッチ（例えば、微細組織）の形成および患者の身体への微細組織の適用を可能にする。これらの微細組織を、細胞パッチが培養される基質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質足場（ＥＣＭ））から熱放出させることは、細胞がその構造および表現型を維持するのを可能にし、デリバリー後、細胞に損傷した組織を修復させる。細胞外マトリックスは、培養細胞パッチ（例えば、細胞の単層）を囲み、身体へのデリバリープロセスの物理的ストレスから細胞パッチを保護するように構成される。また、ＥＣＭは、細胞パッチの所望の標的組織への結合（例えば、組織の修復のために）を促進する結合部位も提供する。
【0006】
ＥＣＭは、インビボで細胞パッチに望ましい微環境を再現する封入材料を含むことができる。例えば、ＥＣＭは、天然ＥＣＭと同様の密度、構造、および／または組成になるように構成され、これらの細胞はインビボで囲まれる。ＥＣＭは、インビボで存在するものとより厳密に一致する特有の微環境をもたらし、したがって細胞挙動を調整する能力を改善する。
【0007】
細胞パッチは、細胞単層を含むことができる。単層は、細胞パッチ中の細胞間密着結合のための細胞発現を含むように形成される。比較的大型の基質および長時間の培養時間（例えば、約２４時間）は、密着結合の形成を可能にする。これらの結合は、一般的にインビボで生じ、投与時に細胞パッチがより容易に組織内に受容されることを可能にする。
【0008】
収縮包装された単層は、以下の利点の１つ又は複数を提供する。細胞を足場から放出させる酵素ベースの手法とは対照的に、細胞の生物学的特徴は、インビボ投与用に維持される。細胞は、単層中のその表現型（例えば、密着結合）を維持する。細胞は、上皮（ｅｍｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）のパッチを形成し、かつ／または細胞投与のために維持されうる細胞骨格を構築する。例えば、さまざまな状況において（例えば、心臓、角膜において、または肺修復のために）インビボで導入されるとき、細胞は、後述するように、容易に組織内に取り込まれる。具体的には、細胞間結合は維持される。
【0009】
後述するように、細胞パッチを疾患の治療のために使用することができる。例えば、細胞単層を使用して角膜修復を実施することができる。心臓修復を実施することができる。一部の実施態様では、肺修復を実施することができる。
【0010】
後述するように、単層は、単一細胞の手法に関する他の利点をもたらす。例えば、内皮および／または上皮は、細胞投与のための障壁である。投与される細胞単層は泡沫細胞パッチであるため、内皮はパッチを取り込ませる。一部の実施態様では、細胞パッチは、細胞のドームとして結合し、平らになり、経時的に内皮と一体化する。加えて、単層細胞は、パッチから他の内皮へ移動するが、これは個々の細胞が適用されるときには起こらない。個々の細胞は結合しにくい。したがって単層は、単一細胞に比べて生存率が高くなる。細胞間結合は、細胞シグナリングに影響を与えて細胞接着をこのやり方で促進することができ、細胞表現型が維持され、生存率が高くなる。
【0011】
一部の実施態様では、細胞追加材料を細胞外マトリックスに添加してパターニングを促進する。例えば、特定の位置にデリバリーする（例えば、標的デリバリー）ために抗体を添加することができる。一部の実施態様では、収縮包装されるマトリックスに成長因子（例えば、筋細胞にはｐｂＧＦ）を添加することができる。これは、例えば、筋細胞に必要な血管内部成長を強化することができる。一部の実施態様では、この手法は、バリデーションのための標識化を含む。例えば、細胞追跡因子（例えば、細胞質染料）を使用することができる。
【0012】
一部の実施態様では、異なる形状の足場が可能である。正方形に加えて、管が産生してチューブが生成されうる。これは、血管の断片および／または内皮細胞の連鎖の成長を促進することができる。一部の実施態様では、異なる種類の収縮包装された細胞を混合することが可能である。
【0013】
収縮包装した細胞を使用してさまざまな病気の治療が可能である。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載するものには、低細胞密度による角膜失明に罹患している患者に細胞を注入することが含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載するものには、既存の内皮を除去する必要なく細胞密度を増加することができるミクロ単層の注入が含まれる。
【0014】
一部の実施形態において、本明細書に記載するものには、密度によって進行する角膜失明の軽減を助ける必要がある小口径を通って注入されうる角膜内皮細胞ミクロ単層の統合が含まれる。
【0015】
一部の実施形態において、本明細書に記載するものには、細胞外マトリックス収縮包装細胞（ＳＨＥＬＬ）技術によって作製できる細胞集合体の配列が含まれるが、該技術において、熱放出に際して、細胞集合体はその細胞間結合を維持することができ、注射針を通って組織内に注入されるのに十分小さなサイズに収縮できる。
【0016】
一部の実施形態において、本明細書に記載するものには、注射後に注射を受けた眼を休ませ、細胞集合体が角膜内皮に取り込ませることを要するインビボ注入プロセスが含まれる。一部の実施形態において、本明細書に記載するものには、単層中の細胞の維持を助けることができ、単層中の細胞の細胞骨格を維持でき、その細胞間結合と共に統合を改善できる、細胞外マトリックスＳＨＥＬＬ足場の合成が含まれる。
【0017】
一態様では、細胞の微細組織カプセル化の方法は、組織足場スタンプを細胞外マトリックス化合物でコーティングすることを含む。方法は、組織足場スタンプを熱応答性基質に置くことを含む。方法は、組織足場スタンプに細胞培養物を播種することを含む。方法は、指定される温度で組織足場スタンプ上の細胞培養物をインキュベートすることを含み、ここで、細胞培養物は、細胞外マトリックス化合物に結合する細胞パッチを形成する。方法は、細胞パッチによって、単層の境界が細胞間結合のための発現を維持する組織足場スタンプ上に単層を形成することを含む。方法は、熱応答性基質を除去することを含む。方法は、組織足場スタンプを細胞パッチから除去して、細胞パッチ周囲に微細組織構造を形成することを含む。方法は、微細組織を溶媒中に懸濁させることによって微細組織構造を折り畳むことを含む。方法は、折り畳まれた微細組織構造を溶媒から回収することを含む。方法は、折り畳まれた微細組織構造を生体に投与することを含む。
【0018】
一部の実施態様では、方法は、組織足場を管構造に形成することを含む。一部の実施態様では、方法は、組織足場の管構造に基づいて管形状を成す細胞パッチを形成することを含む。
【0019】
一部の実施態様では、細胞パッチは、血管の断片を含む。一部の実施態様では、方法は、抗体を細胞パッチに添加することを含む。一部の実施態様では、微細組織構造を生体に投与することは、微細組織構造を注入することを含む。一部の実施態様では、細胞パッチは、角膜内皮細胞を含む。方法は、細胞パッチを角膜に導入し、重力を利用して細胞パッチと角膜との接触を確保することを含む。
【0020】
一部の実施態様では、微細組織構造のサイズは、組織足場スタンプのサイズに比例し、ここで、微細組織構造のサイズは、注射装置の直径の一部である。一部の実施態様では、組織足場スタンプは、有機ケイ素化合物を含む。一部の実施態様では、有機ケイ素化合物は、ポリジメチルシロキサンを含む。一部の実施態様では、細胞外マトリックス化合物は、コラーゲンＩＶ、ラミニン、線維芽細胞成長因子タンパク質、および血管内皮成長因子タンパク質のうちの１つまたは複数を含むタンパク質を含む。
【0021】
一部の実施態様では、組織足場スタンプの配置は、組織足場スタンプを熱応答性基質上にプリントすることを含む。一部の実施態様では、熱応答性基質は、ＰＩＰＡＡｍポリマーを含む。一部の実施態様では、組織足場スタンプは、規則的な形状を形成する。一部の実施態様では、組織足場スタンプは、２５０μｍ２未満またはほぼ同等の表面寸法を含む。一部の実施態様では、細胞パッチは、１０～１００個の細胞を含む。
【0022】
一般的態様において、システムは、細胞パッチ中にある細胞間結合のための発現および細胞の細胞骨格を維持する細胞単層を含む細胞パッチを含む。システムは、細胞パッチ周囲で折り畳まれた微細組織構造であって、細胞パッチと外部環境との間に物的障壁を設けるように構成された細胞外マトリックスを含む微細組織構造を含む。
【0023】
一部の実施態様では、細胞外マトリックスは、コラーゲンＩＶ、ラミニン、線維芽細胞成長因子タンパク質、および血管内皮成長因子タンパク質のうちの１つまたは複数を含むタンパク質を含む。一部の実施態様では、微細組織構造は、管構造を形成する。一部の実施態様では、単層は、細胞１０～１００個を含む。一部の実施態様では、細胞パッチは筋組織を含む。一部の実施態様では、成長因子を細胞外マトリックスに加えて、筋組織の血管内部成長を促進する。
【0024】
これらのシステムおよび方法の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および提示する説明の中で記述する。これらのシステムおよび方法のその他の特徴、目的、および利点は、明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
本明細書に記載の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、放出時に折り畳む幾何学的形状の配列を含む。例えば、ＥＣＭは、長さおよび幅にマイクロメートルの寸法ならびに厚さにナノメートルの寸法を有する１つまたは複数のパターン化された形状を形成することができる。いくつかの例では、配列中の幾何学的形状は、２Ｄ微細組織、特に細胞単層の形成を可能にする細胞を培養するために使用できる細胞外マトリックスタンパク質を含む。次いで、これらの微細組織は、それらが形成されたら、基質から放出されうる。一部の実施態様では、微細組織は、熱的に放出される。放出時、これらの微細組織は、ＥＣＭが培養細胞周囲に外層を形成するように自発的に折り畳み、培養細胞は、その微細組織構造および表現型を保持する。次いで、折り畳まれた微細組織を、例えば、注射針を通しての注射によって投与して、組織を修正または置き換えることができる。微細組織は、インビボおよびインビトロの応用例である。例えば、微細組織は、小口径の針を通って注射されうる角膜内皮細胞微細組織の形成を助ける。
【0027】
本明細書に記載の方法およびシステムは、注射後に細胞が高い生存能力、細胞間結合、および細胞骨格構造を維持することを可能にし、同時に細胞に、細胞接着を促進することができる細胞－ＥＣＭ相互作用をももたらすＥＣＭタンパク質の薄層中のマイクロ単層細胞パッチ（例えば、μ単層）のカプセル化を含む。インビトロでの結果は、ＣＥ細胞が改変ＥＣＭ基質上に単層を形成し、２４時間以内に密着結合を構築し、組織化されたＦ－アクチン細胞骨格構造を形成したことを確認し、該組織化されたＦ－アクチン細胞骨格構造は、熱放出および注射プロセスを通じて保たれていた。酵素的に放出された単一細胞と比較した場合、注入された収縮包装μ単層は、後述するように、ＣＥ単層密度を顕著に増加する。
【0028】
加えて、収縮包装μ単層は、インビトロ単層およびエクスビボ角膜の両方に３時間以内に結合され、記載のカプセル化方法が、単一細胞ＣＥ注入の臨床治験で最近使用されているプロトコルを用いて適用されうることを示す。例えば、健常なウサギの眼を利用するインビボのウサギ研究は、多数の収縮包装μ単層が健常ＣＥに取り込まれたことを示した。一般的に、若年の健常ウサギＣＥ中の細胞は、接触阻止され、極度に高い密度にある。したがって、収縮包装μ単層が、そのような組織内で一体化できた場合、非常に低い細胞密度での損傷または罹患ＣＥへの取り込みが非常に高い割合で生じる。
【0029】
一般的に、ＥＣＭはタンパク質、グリコサミノグリカンおよび他の生体分子の線維ネットワークを含む。ＥＣＭは、例えば、構造支柱、成長因子隔離、接着および機械的シグナリングのネットワーク、ならびに他の多数の機能を与える細胞周囲の骨格を形成する。ＥＣＭは、微細組織の培養細胞の機能に好適な環境またはニッチとして機能することができる。例えば、成体幹細胞ニッチは、幹細胞の多能性状態の維持を助ける特異ＥＣＭタンパク質構造、組成物、支持細胞集団ならびに一組の可溶性および不溶性シグナリング分子を含む。ＥＣＭは、天然ＥＣＭではなく、人工的に製造されたタンパク質基質である。ＥＣＭタンパク質の選択は、以下でさらに詳述するように、製造される細胞培養物に基づいて選択される。
【0030】
いくつかの例では、２Ｄ培養細胞は、典型的には、ＥＣＭタンパク質でプレコーティングされたまたは媒体中に補給される血清に含まれるＥＣＭタンパク質でコーティングされた硬組織培養処置ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上で成長する。そのようなＥＣＭタンパク質が、細胞のＴＣＰＳへの接着および後続する増殖を可能にする一方で、多くの初代細胞タイプは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経るような老化により表現型が変化するようになる前に限られた時間だけ通過できる。合成および／または天然ヒドロゲルを使用する３Ｄ培養は、化学力学的環境を変えてインビボ条件をより良好に再現することによって、これらの制限のうちのいくつかを対処することができ、広範囲の細胞タイプの培養に有効だった。しかしながら、これらのヒドロゲルは、典型的には構造が等方性であり、基底膜などのＥＣＭ富化構造を再現せず、インビボ環境における錯体とは典型的に異なる組成（例えば、コラーゲン、フィブリン、マトリゲル、ＰＥＧ）を有する。さらに、２Ｄまたは３Ｄのいずれにおいても、これらの細胞の通過は、細胞－マトリックスおよび細胞－細胞の接着を分裂させて単一細胞懸濁液を生成する酵素およびカルシウムキレート剤の使用を要することが多い。再度播種したとき、細胞は、細胞が置かれる新しい環境内に細胞マトリックスおよび細胞間接着を再構築するためにエネルギーを消費しなければならない。ＥＣＭは、（ｉ）天然ＥＣＭ構造をより良好に疑似する所定のＥＣＭ中に細胞をカプセル化し、（ｉｉ）細胞－マトリックス間および細胞間接着を最小限に分裂することによって、インビボで見出される細胞微環境を疑似するように構成される。
【0031】
化学力学的微環境を調整するために細胞を少なくとも部分的にカプセル化するために使用できるＥＣＭナノ足場が形成される。表面開始集合体（ＳＩＡ）の適応を用いて、組織化ＥＣＭタンパク質の明確なナノ足場を自立構造に形成する。これらのＥＣＭナノ足場の放出前に細胞を接着することによって、細胞を、組織化タンパク質マトリックス層中にカプセル化（例えば、収縮包装）する。一部の実施態様では、ＥＣＭナノ足場は、約７５μｍの横寸法および約５０ｎｍの厚さの細胞規模のサイズで改変する。一部の実施態様では、ＳＩＡ手法を用いて、天然細胞周囲マトリックスの主要タンパク質組成を表すフィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン（ＬＡＭ）、フィブリノゲン（ＦＩＢ）およびコラーゲンタイプＩＶ（Ｃｏｌ ＩＶ）のうちの１つまたは複数を含む所定のＥＣＭ中にさまざまな細胞タイプをカプセル化することができる。長期目標は、これらのＥＣＭナノ足場およびカプセル化方法が、梗塞を起こした心筋層に見られるような他の点で罹患したマトリックス環境における細胞の生存および機能の統合を助けることによって治療用細胞の送達を強化することである。
【0032】
ＥＣＭナノ足場は、いずれの接着細胞タイプと共に使用することができ、ＰＤＭＳスタンプ上でインキュベートする前に、細胞表面マーカー用の抗体をＥＣＭタンパク質溶液中で混合する場合、非接着細胞にさえも及びうる。例えば、細胞タイプには、接着細胞タイプを含む肝細胞を挙げることができる。例えば、細胞タイプには、非接着細胞タイプであるキラーＴ細胞を挙げることができ、ＥＣＭ中で細胞表面マーカー抗体と合わせられる。これらの細胞タイプは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、およびミクロ接触プリンティングされうる任意のＥＣＭタンパク質と共に使用することができる。
【0033】
図１Ａは、収縮包装および注射注入する角膜内皮カプセル化細胞パッチ（例えば、細胞単層）用の例示的方法１００を示す。表面開始アセンブリー技術を用いて、熱応答性ポリマーＰＩＰＡＡｍ上で２００マイクロメートル（μｍ）×２００μｍ×５ナノメートル（ｎｍ）のＥＣＭ足場を改変する。次いで、試料および細胞を４０℃に加熱した後、正方形の上に細胞を播種し、約２４時間培養する。約２４時間後、試料を温かい媒体ですすぎ、室温まで冷却して、ＰＩＰＡＡｍの溶解および細胞パッチ（例えば、角膜内皮細胞）のミクロンサイズの単層の収縮包装／放出を引き起こす。
【0034】
方法１００は、以下の各実施形態のために実施することができる。
【0035】
ＥＣＭ足場の生成
ＥＣＭ足場を、細かい変更（例えば、収縮包装紙）を加えた前述の表面開始アセンブリーを介して生成した。簡単に言えば、２００μｍ×２００μｍの平方形の特徴を有するように設計された１センチメートル（ｃｍ）×１ｃｍのＰＤＭＳスタンプを、標準ソフトリソグラフィー技術によって作製した。スタンプを５０％のエタノール中で６０分間超音波処理し、窒素流の下で乾燥し、工程１１０に示すように、５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶ（ＣＯＬ４）および５０μｇ／ｍＬのラミニン（ＬＡＭ）の５０：５０混合物と共に６０分間インキュベートした。５０％のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識化ＣＯＬ４または５０％のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３標識化ＬＡＭのいずれかを使用してタンパク質を視覚化した。インキュベーション後、スタンプを滅菌水ですすぎ、窒素流の下で乾燥し、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）（２％高分子量、Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）がコーティングされた２５ｍｍのガラスカバースリップと３０分間等角接触させて、工程１２０に示すように正方形の移動を確保した。ＰＤＭＳカバースリップ上にミクロ接触プリンティングされたＥＣＭ正方形を対照として使用した。スタンプの除去時、レーザー走査共焦点顕微鏡法を使用して、移動させたＥＣＭ正方形の質を決定した（Ｎｉｋｏｎ ＡＺＩ００）。
ＥＣＭ足場を、細かい変更（例えば、収縮包装紙）を加えた前述の表面開始アセンブリーを介して生成した。簡単に言えば、２００μｍ×２００μｍの平方形の特徴を有するように設計された１センチメートル（ｃｍ）×１ｃｍのＰＤＭＳスタンプを、標準ソフトリソグラフィー技術によって作製した。スタンプを５０％のエタノール中で６０分間超音波処理し、窒素流の下で乾燥し、工程１１０に示すように、５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶ（ＣＯＬ４）および５０μｇ／ｍＬのラミニン（ＬＡＭ）の５０：５０混合物と共に６０分間インキュベートした。５０％のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識化ＣＯＬ４または５０％のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３標識化ＬＡＭのいずれかを使用してタンパク質を視覚化した。インキュベーション後、スタンプを滅菌水ですすぎ、窒素流の下で乾燥し、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）（２％高分子量、Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）がコーティングされた２５ｍｍのガラスカバースリップと３０分間等角接触させて、工程１２０に示すように正方形の移動を確保した。ＰＤＭＳカバースリップ上にミクロ接触プリンティングされたＥＣＭ正方形を対照として使用した。スタンプの除去時、レーザー走査共焦点顕微鏡法を使用して、移動させたＥＣＭ正方形の質を決定した（Ｎｉｋｏｎ ＡＺＩ００）。
【0036】
実施形態例：ウシ角膜内皮細胞培養物
ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥＣ）を単離し、前述のとおりに培養した（ｒｅｆ ＥＢＭおよび膨張紙）。簡単に言うと、角膜を眼球（Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚ）から摘出し、４００μＬのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを有するセラミック製１２ウェルスポットプレート中で内皮側を上にして２０分間インキュベートした。次いで細胞を、ゴム製スパチュラを使用して角膜から慎重に擦り取り、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、５ｍＬの培地（ＰＯで指定され、５０ｋＰａのＰＤＭＳでコーティングされたＴ－２５フラスコ（ＣＯＬ４でプレコーティングされた）中で培養した１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／ＡｍｐｈＢおよび０．５％のゲンタマイシンを有する低グルコースＤＭＥＭ）中で再懸濁した。眼球５０個を一度に入手し、５個のＴ－２５フラスコに播種するために使用した。細胞をコンフルエントになるまで培養し、Ｐ２のコンフルエントで一度に使用されるまで１：３に分割した。
ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥＣ）を単離し、前述のとおりに培養した（ｒｅｆ ＥＢＭおよび膨張紙）。簡単に言うと、角膜を眼球（Ｐｅｌ Ｆｒｅｅｚ）から摘出し、４００μＬのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを有するセラミック製１２ウェルスポットプレート中で内皮側を上にして２０分間インキュベートした。次いで細胞を、ゴム製スパチュラを使用して角膜から慎重に擦り取り、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、５ｍＬの培地（ＰＯで指定され、５０ｋＰａのＰＤＭＳでコーティングされたＴ－２５フラスコ（ＣＯＬ４でプレコーティングされた）中で培養した１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／ＡｍｐｈＢおよび０．５％のゲンタマイシンを有する低グルコースＤＭＥＭ）中で再懸濁した。眼球５０個を一度に入手し、５個のＴ－２５フラスコに播種するために使用した。細胞をコンフルエントになるまで培養し、Ｐ２のコンフルエントで一度に使用されるまで１：３に分割した。
【0037】
ＥＣＭ足場中の収縮包装ＢＣＥＣμ単層
パターニングされたカバースリップ（２５ｍｍ）を、３５ｍｍのペトリ皿の底に真空グリースで固定し、これを５２℃に設定した乾燥ブロック上に置いた。これにより、カバースリップは（３０分以内に）４０℃に達し保持される。ウシＣＥＣを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを有する培養フラスコから放出し、遠心分離し、１５ｍＬの遠心分離管中、細胞１５０，０００個／ｍＬの密度で再懸濁した。管を４５℃に設定した乾燥ブロック中に約５分間、または細胞溶液が４０℃にちょうど達するまで置き、２ｍＬの細胞懸濁液を各３５ｍｍ皿に添加した後、即座にインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に入れた。細胞を正方形の上で２４時間培養して、２００μｍの正方形上に小さな単層を形成させた。２４時間後、インキュベーターから試料を取り出し、３７℃の媒体で２回すすぎ、２ｍＬの新鮮な温かい媒体を加え、試料を室温まで冷却させた。温度が３２℃未満まで低下したら、ＰＩＰＡＡｍが溶解し、足場＋μ単層を放出した。放出工程はＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣｏｏｌＳｎａｐ ｃａｍｅｒａを使用して記録された。放出後、足場＋μ単層を、さらなる実験で使用する前に１５０ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。ＰＤＭＳカバースリップ上に播種したＣＥＣを対照として使用した。
パターニングされたカバースリップ（２５ｍｍ）を、３５ｍｍのペトリ皿の底に真空グリースで固定し、これを５２℃に設定した乾燥ブロック上に置いた。これにより、カバースリップは（３０分以内に）４０℃に達し保持される。ウシＣＥＣを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを有する培養フラスコから放出し、遠心分離し、１５ｍＬの遠心分離管中、細胞１５０，０００個／ｍＬの密度で再懸濁した。管を４５℃に設定した乾燥ブロック中に約５分間、または細胞溶液が４０℃にちょうど達するまで置き、２ｍＬの細胞懸濁液を各３５ｍｍ皿に添加した後、即座にインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に入れた。細胞を正方形の上で２４時間培養して、２００μｍの正方形上に小さな単層を形成させた。２４時間後、インキュベーターから試料を取り出し、３７℃の媒体で２回すすぎ、２ｍＬの新鮮な温かい媒体を加え、試料を室温まで冷却させた。温度が３２℃未満まで低下したら、ＰＩＰＡＡｍが溶解し、足場＋μ単層を放出した。放出工程はＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣｏｏｌＳｎａｐ ｃａｍｅｒａを使用して記録された。放出後、足場＋μ単層を、さらなる実験で使用する前に１５０ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。ＰＤＭＳカバースリップ上に播種したＣＥＣを対照として使用した。
【0038】
収縮包装ＢＣＥＣの免疫染色：Ｃａ２およびＭｇ２（ＰＢＳ＋＋）を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた収縮包装μ単層を、小口径の針を通してガラスカバースリップ上に注入し、約１５分間定着させ、その後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）中で１５分間固定した。試料をＰＢＳ＋＋で２回慎重に洗浄し、ＤＡＰＩ１：１００希釈液、マウス抗－ＺＯ－１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１００希釈液およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の３：２００希釈液と共にインキュベートした。試料をＰＢＳ＋＋で２回、５分間すすぎ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス二次抗体の１：１００希釈液と共に約２時間インキュベートした。試料をＰＢＳ＋＋で２回、５分間すすぎ、Ｐｒｏ－Ｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するガラススライド上に乗せ、次いでＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像化した。
【0039】
収縮包装ＢＣＥＣ注射後の生存率
遠心分離後、収縮包装μ単層またはＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ放出単一細胞を２００μＬの培養基中で再懸濁し、２８０針に引き入れ、ペトリ皿中に注入し、ＰＢＳ＋＋中の２μＭのカルセインＡＭおよび４μＭのＥｔｈＤ－１（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像化し、一試料当たり５枚の画像および一タイプ当たり３個の試料を使用した。生存細胞および死滅細胞の数を手動で計数した。生存細胞の数を死滅細胞で割り、ＥＣＭ足場包装細胞と酵素的に放出された細胞の両方の％生存率を決定した。
遠心分離後、収縮包装μ単層またはＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ放出単一細胞を２００μＬの培養基中で再懸濁し、２８０針に引き入れ、ペトリ皿中に注入し、ＰＢＳ＋＋中の２μＭのカルセインＡＭおよび４μＭのＥｔｈＤ－１（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像化し、一試料当たり５枚の画像および一タイプ当たり３個の試料を使用した。生存細胞および死滅細胞の数を手動で計数した。生存細胞の数を死滅細胞で割り、ＥＣＭ足場包装細胞と酵素的に放出された細胞の両方の％生存率を決定した。
【0040】
間質模倣体上の収縮包装ＢＣＥＣおよび単ＢＣＥＣの播種
自己圧縮コラーゲンＩ膜を前述のとおりに調製した。簡単に言うと、６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩゲル溶液を製造業者の指示にしたがって調製し、ガラスカバースリップの上部の直径９ｍｍのシリコーン環型中にピペット注入した。ゲルを湿潤インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に３時間入れて、それ自体の重量下で圧縮した。次いでゲルをバイオフード中で完全に乾燥した後、ＰＢＳ中で再水和し、極薄コラーゲンＩ間質模倣体を形成した。収縮－ｗ包装ＢＣＥＣμ単層を、スタンプしたカバースリップとコラーゲンＩ膜の１：１比で膜上に播種した。対照として、フラスコ中で培養したＢＣＥＣおよびＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して単一細胞懸濁液中に酵素的に放出されたＢＣＥＣを、コラーゲンＩ膜上に播種した。最良のシナリオ事例として全ての正方形が全単層を有していた場合、播種した対照細胞の数は、１つのスタンプＥＣＭ足場試料から播種されたと考えられる細胞の数と等しかった。２００μｍの正方形を占める細胞の平均数は３０個であり、したがって、１スタンプ当たり細胞３０個×１６００正方形であり、１試料当たり細胞約４８，０００個を意味する。したがって、１試料当たり細胞５０，０００個を対照に播種した。６時間および２４時間の時点で、試料を培地から取り除き、固定し、核ＺＯ－１（密着結合タンパク質）およびＦ－アクチンのために染色した。
自己圧縮コラーゲンＩ膜を前述のとおりに調製した。簡単に言うと、６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩゲル溶液を製造業者の指示にしたがって調製し、ガラスカバースリップの上部の直径９ｍｍのシリコーン環型中にピペット注入した。ゲルを湿潤インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に３時間入れて、それ自体の重量下で圧縮した。次いでゲルをバイオフード中で完全に乾燥した後、ＰＢＳ中で再水和し、極薄コラーゲンＩ間質模倣体を形成した。収縮－ｗ包装ＢＣＥＣμ単層を、スタンプしたカバースリップとコラーゲンＩ膜の１：１比で膜上に播種した。対照として、フラスコ中で培養したＢＣＥＣおよびＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して単一細胞懸濁液中に酵素的に放出されたＢＣＥＣを、コラーゲンＩ膜上に播種した。最良のシナリオ事例として全ての正方形が全単層を有していた場合、播種した対照細胞の数は、１つのスタンプＥＣＭ足場試料から播種されたと考えられる細胞の数と等しかった。２００μｍの正方形を占める細胞の平均数は３０個であり、したがって、１スタンプ当たり細胞３０個×１６００正方形であり、１試料当たり細胞約４８，０００個を意味する。したがって、１試料当たり細胞５０，０００個を対照に播種した。６時間および２４時間の時点で、試料を培地から取り除き、固定し、核ＺＯ－１（密着結合タンパク質）およびＦ－アクチンのために染色した。
【0041】
簡単に言うと、試料をＰＢＳ＋＋で２回すすぎ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００と共に４％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋中）中で１５分間固定した。試料をＰＢＳ＋＋で５分間、２回すすぎ、５滴のＮｕｃＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０分間インキュベートした。試料をＰＢＳ＋＋で１回すすぎ、マウス抗－ＺＯ－１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１００希釈液およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または６３３ファロイジンの３：２００希釈液を用いて２時間インキュベートした。試料をＰＢＳ＋＋で５分間、３回すすぎ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス二次抗体の１：１００希釈液を用いて２時間インキュベートした。試料をＰＢＳ＋＋で５分間、３回すすぎ、Ｐｒｏ－Ｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉ－ｆａｄｅを使用してガラススライド上に乗せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡で画像化した。
【0042】
収縮包装ＣＥＣ対ウシ単ＣＥＣのインビトロ統合
低密度老化ＣＥを模倣するために、２５，０００ＰＳウシ細胞を上記のコラーゲンＩ間質模倣体上にコンフルエントになるまで播種し、「老齢」単層を形成した。収縮包装μ単層および単ＢＣＥＣを前述のとおりに調製し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間標識化し、遠心分離し、細胞５０，０００個／試料と同等に希釈し、「老齢」単層上に注射した。頂部に細胞が注入されない「老齢」単層は対照として機能した。試料を、上述のとおりに３、７および１４日目に染色されて固定した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点を使用して各試料上に１０個の無作為なスポットを撮像し、細胞密度を手動で計数した（例えば、細胞核）。核の数を画像領域で割り、１画像当たりの細胞／ｍｍ２を得た。各画像の細胞密度を平均することによって各試料の細胞密度を決定し、３または４つの試料の細胞密度を平均することによって各試料タイプの平均細胞密度を決定した。収縮包装μ単層の経時的な外部成長を調べるために、中心の共焦点像および個々の収縮包装μ単層（３日目、ｎ＝３３、７日目、ｎ＝３７、１４日目、ｎ＝４０）を回収し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒチャネルを二値黒白画像に変換した。次いで各試料タイプの二値画像をＺスタックに変換し、Ｈｅａｔ ＭａｐによってＺスタックプラグイン（ｌｏｇ１０なしの相対値）を介して分析してＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒの平均画素密度を決定した。
低密度老化ＣＥを模倣するために、２５，０００ＰＳウシ細胞を上記のコラーゲンＩ間質模倣体上にコンフルエントになるまで播種し、「老齢」単層を形成した。収縮包装μ単層および単ＢＣＥＣを前述のとおりに調製し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間標識化し、遠心分離し、細胞５０，０００個／試料と同等に希釈し、「老齢」単層上に注射した。頂部に細胞が注入されない「老齢」単層は対照として機能した。試料を、上述のとおりに３、７および１４日目に染色されて固定した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点を使用して各試料上に１０個の無作為なスポットを撮像し、細胞密度を手動で計数した（例えば、細胞核）。核の数を画像領域で割り、１画像当たりの細胞／ｍｍ２を得た。各画像の細胞密度を平均することによって各試料の細胞密度を決定し、３または４つの試料の細胞密度を平均することによって各試料タイプの平均細胞密度を決定した。収縮包装μ単層の経時的な外部成長を調べるために、中心の共焦点像および個々の収縮包装μ単層（３日目、ｎ＝３３、７日目、ｎ＝３７、１４日目、ｎ＝４０）を回収し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒチャネルを二値黒白画像に変換した。次いで各試料タイプの二値画像をＺスタックに変換し、Ｈｅａｔ ＭａｐによってＺスタックプラグイン（ｌｏｇ１０なしの相対値）を介して分析してＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒの平均画素密度を決定した。
【0043】
収縮包装ウシＣＥＣのインビトロ統合のライブイメージング
ライブイメージングのために、コラーゲンＩ間質模倣体上の「老齢」単層を先ずＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ橙色を用いて３０分間インキュベートして、既存の単層と上述のようにＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色で標識化した注入細胞との間を識別した。１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＨＥＰＥ緩衝Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を単層に添加し、上述のように調製した収縮包装μ単層を３０Ｇ針に通して試料の頂部に注射した。試料を、３７℃に設定した温度チャンバを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点上に３０分間置いて、細胞を定着させた。Ｄｅｆｉｎｉｔｅ Ｆｏｃｕｓシステムを使用して、一ｚスタックのタイムラプスシリーズを４８時間の間、毎時間得た。
ライブイメージングのために、コラーゲンＩ間質模倣体上の「老齢」単層を先ずＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ橙色を用いて３０分間インキュベートして、既存の単層と上述のようにＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色で標識化した注入細胞との間を識別した。１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するＨＥＰＥ緩衝Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を単層に添加し、上述のように調製した収縮包装μ単層を３０Ｇ針に通して試料の頂部に注射した。試料を、３７℃に設定した温度チャンバを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点上に３０分間置いて、細胞を定着させた。Ｄｅｆｉｎｉｔｅ Ｆｏｃｕｓシステムを使用して、一ｚスタックのタイムラプスシリーズを４８時間の間、毎時間得た。
【0044】
ウサギＣＥＣ単離、培養および収縮包装
ウサギの眼球をＰｅｌ Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから氷上で受け取った。角膜を眼球から摘出し、ＣＥおよびデスメ膜を手動で鉗子を用いて剥き、Ｄｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１．５時間、３７℃でインキュベートし、デスメ膜からウサギＣＥ細胞（ＲＣＥＣ）を外した。次いでＲＣＥＣをピペットで慎重に上下し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆｌ２、１０％ＦＢＳ、０．５％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で希釈し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１０ｍＬの培地中で再懸濁し、ＰＯで指定し、細胞収率に応じてフラスコ１個当たり１５～２５個の眼に相当するＣＯＬ４コーティングされたＴ－２５フラスコを培養した。ＲＣＥＣをコンフルエントになるまで培養し、１：２に分割し、Ｐ１またはＰ２でコンフルエントになったら全ての実験で使用した。ＲＣＥＣμ単層を上述のとおりに以下の修正を加えて収縮包装した：ＥＣＭ足場（同じ１ｃｍ×１ｃｍのＰＤＭＳスタンプを使用）を１８ｍｍのガラスカバースリップ上にスタンプし、過剰の播種領域を有することを回避し、コンフルエントに達したら細胞約５０，０００個／試料の完全被覆率を依然として実現するように一試料当たりに播種される必要のある細胞の数を減らした。カバースリップを真空グリースによってＮｕｎｃ ＩＶＦ中心ウェル皿（内径２０ｍｍのウェル）の底に固定し、細胞を細胞１５０，０００個／ｍＬで再懸濁し、１ｍＬのＲＣＥＣを一試料ごとに播種した。
ウサギの眼球をＰｅｌ Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから氷上で受け取った。角膜を眼球から摘出し、ＣＥおよびデスメ膜を手動で鉗子を用いて剥き、Ｄｉｓｐａｓｅ（１Ｕ／ｍＬ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１．５時間、３７℃でインキュベートし、デスメ膜からウサギＣＥ細胞（ＲＣＥＣ）を外した。次いでＲＣＥＣをピペットで慎重に上下し、培地（ＤＭＥＭ／Ｆｌ２、１０％ＦＢＳ、０．５％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で希釈し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１０ｍＬの培地中で再懸濁し、ＰＯで指定し、細胞収率に応じてフラスコ１個当たり１５～２５個の眼に相当するＣＯＬ４コーティングされたＴ－２５フラスコを培養した。ＲＣＥＣをコンフルエントになるまで培養し、１：２に分割し、Ｐ１またはＰ２でコンフルエントになったら全ての実験で使用した。ＲＣＥＣμ単層を上述のとおりに以下の修正を加えて収縮包装した：ＥＣＭ足場（同じ１ｃｍ×１ｃｍのＰＤＭＳスタンプを使用）を１８ｍｍのガラスカバースリップ上にスタンプし、過剰の播種領域を有することを回避し、コンフルエントに達したら細胞約５０，０００個／試料の完全被覆率を依然として実現するように一試料当たりに播種される必要のある細胞の数を減らした。カバースリップを真空グリースによってＮｕｎｃ ＩＶＦ中心ウェル皿（内径２０ｍｍのウェル）の底に固定し、細胞を細胞１５０，０００個／ｍＬで再懸濁し、１ｍＬのＲＣＥＣを一試料ごとに播種した。
【0045】
収縮包装ウサギＣＥＣのエクスビボ統合
ウサギの眼球３個を１２ウェルプレート中に角膜を上にして入れた。収縮包装ＲＣＥＣμ単層を上述のとおりに調製した。エクスビボの眼当たりに２つのμ単層の試料を調製し、１００μＬのＤＭＥＭ／Ｆｌ２中に再懸濁した。３０－Ｇインスリン用注射筒を使用して全１００μＬを引き上げ、前眼房中で見えるようになるまで針を角膜の中心に挿入し、５０μＬの懸濁液を注入した。これにより、細胞５０，０００個に相当する細胞が前眼房中に注入された。針を所定の位置で数秒間保持して媒体および細胞が注射部位の外に戻らないことを確保した。注射は、実体立体顕微鏡の下で見て、前眼房に充填される媒体のピンク色は目で見ることができ、成功裏の注射を示す。眼を反転させ、角膜を下にして、加湿インキュベーター中の５％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、眼球を、４℃で２４時間、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）中に置いた。２４時間後、眼をＰＢＳですすぎ、角膜を摘出し、５分間、３回すすいだ。次いで角膜を、ＣＥ面を下にして、２滴のＮｕｃＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウス抗ＺＯ－１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２：１００希釈液およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の３：２００希釈液を含有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で、室温にて２時間インキュベートした。次いで角膜をＰＢＳ中で５分間、３回すすぎ、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス二次抗体の２：１００希釈液を有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で２時間インキュベートし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点で画像化する前にＰＢＳ中で保存した。
ウサギの眼球３個を１２ウェルプレート中に角膜を上にして入れた。収縮包装ＲＣＥＣμ単層を上述のとおりに調製した。エクスビボの眼当たりに２つのμ単層の試料を調製し、１００μＬのＤＭＥＭ／Ｆｌ２中に再懸濁した。３０－Ｇインスリン用注射筒を使用して全１００μＬを引き上げ、前眼房中で見えるようになるまで針を角膜の中心に挿入し、５０μＬの懸濁液を注入した。これにより、細胞５０，０００個に相当する細胞が前眼房中に注入された。針を所定の位置で数秒間保持して媒体および細胞が注射部位の外に戻らないことを確保した。注射は、実体立体顕微鏡の下で見て、前眼房に充填される媒体のピンク色は目で見ることができ、成功裏の注射を示す。眼を反転させ、角膜を下にして、加湿インキュベーター中の５％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、眼球を、４℃で２４時間、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）中に置いた。２４時間後、眼をＰＢＳですすぎ、角膜を摘出し、５分間、３回すすいだ。次いで角膜を、ＣＥ面を下にして、２滴のＮｕｃＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウス抗ＺＯ－１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２：１００希釈液およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ファロイジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の３：２００希釈液を含有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で、室温にて２時間インキュベートした。次いで角膜をＰＢＳ中で５分間、３回すすぎ、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス二次抗体の２：１００希釈液を有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で２時間インキュベートし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点で画像化する前にＰＢＳ中で保存した。
【0046】
収縮包装ＣＥＣのインビボ注射および統合
収縮包装ＲＣＥＣμ単層を、１つの細かな修正を加えて上述のとおりに調製した：５μＬのＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＯを有する媒体１ｍＬ中で細胞を３０分間インキュベートした後、新鮮な媒体で３回、１０分間のすすぎを行うことによってＥＣＭナノ足場上に播種する前日に、細胞をＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＯで標識化した。注射用に十分な用量を確保するために過剰数のμ単層試料を調製した（１６）。収縮包装μ単層を放出し、合計３００μＬで１．５ｍＬ微小遠心管の１本の管の中で再懸濁させた。体重が約２．５ｋｇの健常な無傷ＣＥを有するニュージーランドホワイト系ウサギ雌３羽を、この試験に使用した。ウサギをケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、イソフルオレンを用いてウサギを３時間鎮静作用下に維持した。ウサギ番号１を５０μＬ（細胞約１００，０００個）で右眼（ＯＤ）に注射した。ウサギ番号２は、先ず１００μＬで右眼に注射したが、ほとんどの容量が角膜の外へ戻り、そのため追加の５０μＬを第２の位置へ注射し、全ての細胞が成功裏に前眼房中に留まった場合、約３００，０００の細胞が注入されるようにした。ウサギ番号３は、通常の右眼より小さかったため、左眼に１００μＬまたは細胞約２００，０００個を注射した。注射の直後、各ウサギを、注射した側の眼を下に向けて３時間置き、細胞の定着を確保した。７日目に、ウサギをケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射により麻酔し、次いで３９０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのフェニトインナトリウムを含有するユーサゾル（Ｅｕｔｈａｓｏｌ）溶液（１ｍＬ／１．８ｌｂｓ）で耳静脈注射により安楽死させた。眼を即座に除核し、１００μＬの２％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）を硝子体内注射した。
収縮包装ＲＣＥＣμ単層を、１つの細かな修正を加えて上述のとおりに調製した：５μＬのＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＯを有する媒体１ｍＬ中で細胞を３０分間インキュベートした後、新鮮な媒体で３回、１０分間のすすぎを行うことによってＥＣＭナノ足場上に播種する前日に、細胞をＶｙｂｒａｎｔ ＤｉＯで標識化した。注射用に十分な用量を確保するために過剰数のμ単層試料を調製した（１６）。収縮包装μ単層を放出し、合計３００μＬで１．５ｍＬ微小遠心管の１本の管の中で再懸濁させた。体重が約２．５ｋｇの健常な無傷ＣＥを有するニュージーランドホワイト系ウサギ雌３羽を、この試験に使用した。ウサギをケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、イソフルオレンを用いてウサギを３時間鎮静作用下に維持した。ウサギ番号１を５０μＬ（細胞約１００，０００個）で右眼（ＯＤ）に注射した。ウサギ番号２は、先ず１００μＬで右眼に注射したが、ほとんどの容量が角膜の外へ戻り、そのため追加の５０μＬを第２の位置へ注射し、全ての細胞が成功裏に前眼房中に留まった場合、約３００，０００の細胞が注入されるようにした。ウサギ番号３は、通常の右眼より小さかったため、左眼に１００μＬまたは細胞約２００，０００個を注射した。注射の直後、各ウサギを、注射した側の眼を下に向けて３時間置き、細胞の定着を確保した。７日目に、ウサギをケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）の筋肉注射により麻酔し、次いで３９０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのフェニトインナトリウムを含有するユーサゾル（Ｅｕｔｈａｓｏｌ）溶液（１ｍＬ／１．８ｌｂｓ）で耳静脈注射により安楽死させた。眼を即座に除核し、１００μＬの２％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）を硝子体内注射した。
【0047】
次いで眼球を２％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）中に浸漬し、４℃で２４時間固定した。２４時間後、眼をＰＢＳですすぎ、角膜を摘出し、５分間で３回すすいだ。次いで角膜を、ＣＥを下に向けて、２滴のＮｕｃＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびマウス抗ＺＯ－１抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の２：１００希釈液を含有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で２時間、室温にてインキュベートした。次いで角膜を５分間、ＰＢＳ中で３回すすぎ、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス二次抗体の２：１００希釈液を有する１ｍＬのＰＢＳ＋＋上で２時間インキュベートし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点で画像化する前にＰＢＳ中で保存した。
【0048】
実施形態例：心臓組織の細管ＥＣＭ構造
一態様において、細管内皮部分は、ＰＩＰＡＡｍ（感熱性ポリマー）上のマイクロパターン化フィブロネクチン長方形上で内皮細胞を培養することによって生成される。ＰＩＰＡＡｍの溶解後、細管部分が放出され、これを培養心臓組織内に取り入れて原始血管網を作製することができる。フィブロネクチン長方形は、ＰＩＰＡＡｍ上にスタンプされる。内皮細胞は、３つの異なるスタンプパターン上に播種され、異なる播種密度で長方形上にコンフルエント単層を形成する。熱制御を利用して内皮細管をＰＩＰＡＡｍ表面から放出する。
一態様において、細管内皮部分は、ＰＩＰＡＡｍ（感熱性ポリマー）上のマイクロパターン化フィブロネクチン長方形上で内皮細胞を培養することによって生成される。ＰＩＰＡＡｍの溶解後、細管部分が放出され、これを培養心臓組織内に取り入れて原始血管網を作製することができる。フィブロネクチン長方形は、ＰＩＰＡＡｍ上にスタンプされる。内皮細胞は、３つの異なるスタンプパターン上に播種され、異なる播種密度で長方形上にコンフルエント単層を形成する。熱制御を利用して内皮細管をＰＩＰＡＡｍ表面から放出する。
【0049】
細管内皮部分は、心臓血管疾患（ＣＶＤ）の治療のために構成されている。ＣＶＤは、大きな世界的懸念であり、世界中で主要な死因である。ＣＶＤとしては、心筋梗塞、心不全、および先天性心臓欠損が挙げられ、身体全体の組織への血液の供給を行う心臓の能力低下につながりうる。組織工学における近年の進歩により、胚幹細胞または人工多能性幹細胞由来の心筋細胞と組み合わせて線維芽細胞から三次元心臓組織が作製された。これらの培養心臓組織は、心臓の損傷部位を「パッチ」するために潜在的に使用されうる。しかしながら、心臓は、線維芽細胞および心筋細胞に加えて、複数の細胞型が存在する極度に複雑な臓器である。本明細書に記載の細胞パッチは、血管組織の供給を提供するように構成されている。
【0050】
図１Ｂは、内皮細管部分を形成するための方法１０５を示す。内皮細管部分は、三次元で生成され、培養心臓コンストラクトに取り入れることができる。これは、損傷した心臓を修復する能力をより高く有しうる成長可能な組織工学によって作製された移植片のサイズを拡大させると考えられる。最も有効な３Ｄ内皮細管部分を作製するためのマイクロパターン化された長方形の寸法およびＨＵＶＥＣの濃度は、下記のように決定した。フィブロネクチン長方形を、感熱性ポリマーであるポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）上にマイクロパターン化した。次いで内皮細胞を、これらのフィブロネクチン長方形上で培養し、組織血管系に見られる重要な細胞間結合成分である密着結合を形成させた。次いでフィブロネクチンおよび内皮細胞からなる細管部分を、ＰＩＰＡＡｍ溶解後に放出した。
【0051】
図１Ｂに示すように、工程１１５で、ＰＥＭＳスタンプを標識化フィブロネクチン中でコーティングし、次いで乾燥する。工程１２５で、ＰＤＭＳスタンプを、スタンプ側を下にしてＰＩＰＡＡｍコーティングガラスカバースリップ上に置き、ＥＣＭコーティングされたスタンプを接合させる。工程１３５で、スタンプを除去した後にＨＵＶＥＣをカバースリップ上に播種し、３７℃で２４時間接着させる。工程１４５で、室温の媒体をカバースリップに添加し、感熱性ＰＩＰＡＡｍを溶解させる。工程１５５で、ＥＣＭ長方形が放出され、細胞周囲に包装される。これらの各工程については、引き続き、詳述していく。
【0052】
ガラスカバースリップ上へのＰＤＭＳおよびＰＩＰＡＡｍのスピンコーティング
ガラスカバースリップを５０％ｖ／ｖエタノール溶液中で超音波処理して一切の微粒子を除去した。次いで窒素スプレーガンを使用してカバースリップを乾燥し、大型ペトリ皿に入れた。これらのカバースリップをスピンコーティングするために使用したＰＤＭＳは、１：１０比のＳｙｌｇａｒｄ １８４と硬化剤を使用することによって調製した。次いで、この溶液を均一になるまで混合し、真空チャンバに入れ、４５分間消泡した。次いで２００μＬのＰＤＭＳ液滴をカバースリップの中心に位置し、カバースリップをスピンコータに加えた。カバースリップを２０００ｒｐｍで２分間スピンコーティングした。ＰＤＭＳでコーティングされたカバースリップを摂氏６５℃で４時間硬化した。完了したら、カバースリップを、さらに使用するまで保存した。
ガラスカバースリップを５０％ｖ／ｖエタノール溶液中で超音波処理して一切の微粒子を除去した。次いで窒素スプレーガンを使用してカバースリップを乾燥し、大型ペトリ皿に入れた。これらのカバースリップをスピンコーティングするために使用したＰＤＭＳは、１：１０比のＳｙｌｇａｒｄ １８４と硬化剤を使用することによって調製した。次いで、この溶液を均一になるまで混合し、真空チャンバに入れ、４５分間消泡した。次いで２００μＬのＰＤＭＳ液滴をカバースリップの中心に位置し、カバースリップをスピンコータに加えた。カバースリップを２０００ｒｐｍで２分間スピンコーティングした。ＰＤＭＳでコーティングされたカバースリップを摂氏６５℃で４時間硬化した。完了したら、カバースリップを、さらに使用するまで保存した。
【0053】
ＨＵＶＥＣの培養
ＨＵＶＥＣを液体窒素室から取り出し、水浴中で解凍させ、１０ｍＬの培養基と合わせ、ペレットに沈降させ、次いで吸引しさらに培養基と合わせて１０６細胞／ｍＬの濃度に達させた。次いで細胞を、細胞５０００個／ｃｍ２の濃度で１７５ｃｍ２のフラスコ中へ配分した。細胞が約８０％のコンフルエントに達するまで（この時点で実験に使用した）、培地を一日おきに入れ替えた。
ＨＵＶＥＣを液体窒素室から取り出し、水浴中で解凍させ、１０ｍＬの培養基と合わせ、ペレットに沈降させ、次いで吸引しさらに培養基と合わせて１０６細胞／ｍＬの濃度に達させた。次いで細胞を、細胞５０００個／ｃｍ２の濃度で１７５ｃｍ２のフラスコ中へ配分した。細胞が約８０％のコンフルエントに達するまで（この時点で実験に使用した）、培地を一日おきに入れ替えた。
【0054】
フィブロネクチンを使用したコーティングカバースリップ上へのスタンプ
先ず５０μｇ／ｍＬの非標識化フィブロネクチン溶液を作製することによってフィブロネクチンを調製した。これは、３．８ｍＬの脱イオン水と０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ非標識化フィブロネクチンとを合わせることによって行った。ここから、９００μＬの５０μｇ／ｍＬ非標識化フィブロネクチン溶液、９２．５μＬの脱イオン水、および７．５μＬの６６７μｇ／ｍＬ標識化６３３－フィブロネクチンを合わせることによって１０％の標識化フィブロネクチン溶液を作製した。
先ず５０μｇ／ｍＬの非標識化フィブロネクチン溶液を作製することによってフィブロネクチンを調製した。これは、３．８ｍＬの脱イオン水と０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ非標識化フィブロネクチンとを合わせることによって行った。ここから、９００μＬの５０μｇ／ｍＬ非標識化フィブロネクチン溶液、９２．５μＬの脱イオン水、および７．５μＬの６６７μｇ／ｍＬ標識化６３３－フィブロネクチンを合わせることによって１０％の標識化フィブロネクチン溶液を作製した。
【0055】
ＰＤＭＳスタンプを、５０％エタノール溶液および５０％蒸留水／脱イオン水で充填されたビーカーに添加した。このビーカーを超音波発生装置に、少なくとも３０分間入れた。次いで滅菌ピンセットを使用してスタンプを個別に拾い上げ、窒素ガンを使用して乾燥した。次いでスタンプを滅菌ペトリ皿に入れ、フィブロネクチンのコーティングを待った。次いで工程１１５に示すように、３００μＬのフィブロネクチン溶液を、スタンプを上に向けた各ＰＤＭＳスタンプ上にピペット注入した。ピペットを使用して、ＰＤＭＳスタンプの四隅全範囲にフィブロネクチンを広げ、少なくとも１時間スタンプをコーティングさせた。
【0056】
この１時間の終わり近くで、ＰＤＭＳでコーティングされたカバースリップを、蓋をクリーナー内部の皿の下に位置して、ＵＶＯクリーナーに１５分間入れた。１５分後すぐに、ペトリ皿をバイオフード中に入れ、滅菌を維持した。ピンセットを使用して、各カバースリップを、６ウェル培養プレートのそれ自体のウェル中に入れた。
【0057】
ＰＤＭＳスタンプを脱イオン水の皿の中で個別にかき混ぜることによって洗浄し、次いで別の脱イオン水の皿の中でさらにもう１回洗浄した。次いで、窒素ガンを使用してスタンプを乾燥し、次いで、工程１２５に示すように、良好な接触を確保するために第２の鉗子ペアを使用して、スタンプを、スタンプ面を下にして、ＰＤＭＳでコーティングされたカバースリップ上にひっくり返した。スタンプを軽くたたいてカバースリップとの良好な接触を確保した。次いで移したパターンが壊れないようにねじらずに、スタンプをカバースリップから持ち上げた。次いで保存目的のために、カバースリップを１Ｘ ＰＢＳ中に浸漬した。
【0058】
ＰＩＰＡＡｍでコーティングされたカバースリップをスタンプするプロトコルは、上記プロトコルとは特定の工程においてのみ異なる。これは、ＵＶＯ処置中にペトリ皿の蓋を取ることと、保存目的でＰＢＳを使用しないこととを含む。一般的に、スタンプは、少なくとも４５分間から最長２４時間までカバースリップ上に残す。
【0059】
ＰＤＭＳスタンプカバースリップ上への播種
工程１３５に示すように、スタンプしたカバースリップのＰＢＳを吸引し、次いで細胞１５０，０００個／ｃｍ２、細胞３００，０００個／ｃｍ２、および細胞４５０，０００個／ｃｍ２のＨＵＶＥＣ濃度で播種した。
工程１３５に示すように、スタンプしたカバースリップのＰＢＳを吸引し、次いで細胞１５０，０００個／ｃｍ２、細胞３００，０００個／ｃｍ２、および細胞４５０，０００個／ｃｍ２のＨＵＶＥＣ濃度で播種した。
【0060】
ＰＩＰＡＡｍスタンプカバースリップ上への播種
一態様において、工程１３５で、ヒートブロックを７０％のエタノールでスプレーし、バイオフードに入れた。左側を摂氏５２℃に、右側を摂氏４５℃に設定した。スタンプＰＩＰＡＡｍカバースリップを、真空グリースを使用してそれ自体のペトリ皿の底に固定した。次いでペトリ皿をヒートブロックの左側に置いた。各カバースリップは２ｍＬの流体を必要とする。意図した実験細胞濃縮物を１５ｍＬの管に加え、約５分間または摂氏３８～４０℃の温度が達成されるまでヒートブロックの右側に配置した。カバースリップは、摂氏３８～４０℃の温度に達した。次いで２ｍＬの細胞溶液を各カバースリップに添加し、即座にインキュベーターに入れて、ＰＩＰＡＡｍを尚早に溶解させると考えられる一切の温度低下を防止した。
一態様において、工程１３５で、ヒートブロックを７０％のエタノールでスプレーし、バイオフードに入れた。左側を摂氏５２℃に、右側を摂氏４５℃に設定した。スタンプＰＩＰＡＡｍカバースリップを、真空グリースを使用してそれ自体のペトリ皿の底に固定した。次いでペトリ皿をヒートブロックの左側に置いた。各カバースリップは２ｍＬの流体を必要とする。意図した実験細胞濃縮物を１５ｍＬの管に加え、約５分間または摂氏３８～４０℃の温度が達成されるまでヒートブロックの右側に配置した。カバースリップは、摂氏３８～４０℃の温度に達した。次いで２ｍＬの細胞溶液を各カバースリップに添加し、即座にインキュベーターに入れて、ＰＩＰＡＡｍを尚早に溶解させると考えられる一切の温度低下を防止した。
【0061】
基質を熱放出して内皮細管を形成する
工程１４５で、ＰＩＰＡＡｍは、顕微鏡下で室温の培地を皿に加えるプロセスを通して熱放出された。培地を吸引して細胞を固定し、カルシウムおよびマグネシウムを有する１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、さらにもう１回吸引して細胞が吸引されないことを確認し、次いでフード中で４％のホルムアルデヒドを添加し、３０分待ち、この時点で、溶液を注意深く吸引し、細胞を１ｘＰＢＳ中に浸漬し、次いで保存する。
工程１４５で、ＰＩＰＡＡｍは、顕微鏡下で室温の培地を皿に加えるプロセスを通して熱放出された。培地を吸引して細胞を固定し、カルシウムおよびマグネシウムを有する１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、さらにもう１回吸引して細胞が吸引されないことを確認し、次いでフード中で４％のホルムアルデヒドを添加し、３０分待ち、この時点で、溶液を注意深く吸引し、細胞を１ｘＰＢＳ中に浸漬し、次いで保存する。
【0062】
カバースリップは一次ＺＯ－１抗体（５：２００比）であり、次いで１ｘ ＰＢＳで３回（間に３０分刻みの時間が入る）洗浄した。次いでカバースリップをＤＡＰＩ（１：１００比）、４８８ファロイジン（３：２００比）、および二次ヤギ抗マウス５５５（５：２００比）で染色した。ＺＯ－１抗体は、細胞間の密着結合のために染色する。これらの密着結合は、細胞のコンフルエントの程度が高い指標であり、内皮細管部分の形成において重要である。
【0063】
図２を参照して、画像２００ａ～ｃは、以下の寸法を有するＰＤＭＳコーティングされたカバースリップ上にスタンプされたフィブロネクチンを示す。画像２００ａ中、寸法は、２００×１０μｍ長方形を含む。画像２００ｂ中、寸法は、２００×２０μｍ長方形を含む。画像２００ｃ中、寸法は、２００×３０μｍ長方形を含む。これらの各画像のスケールバーは５０μｍである。これらの例は、マイクロパターン化フィブロネクチン長方形をＰＩＰＡＡｍ基質上に正確にパターン化することが可能であることを示す。
【0064】
図３は、異なる細胞濃度で２００×１０μｍのスタンプＰＤＭＳコーティングされたカバースリップに播種されたＨＵＶＥＣの画像３００ａ～ｃを示す。画像３００ａは、細胞１５０，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。画像３００ｂは、細胞３００，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。画像３００ｃは、細胞４５０，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。ここで、各画像のスケールバーは５００μｍである。一般的に、異なる播種濃度のヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して、マイクロパターン化フィブロネクチン長方形に結合して２４時間以内にその上にコンフルエント単層を作製する内皮細胞の能力を評価した。ＨＵＶＥＣの播種濃度が増加するに従い、長方形間の間隙を埋める内皮細胞が増加した。これは、長方形が１０μｍの短距離（２００×１０μｍのパターン）のみによって分離されたスタンプで特に顕著だった。しかしながら、より高い細胞濃度により、長方形は区別ができなくなり、２００×１０μｍの長方形は、高濃度のＨＵＶＥＣで播種するには密集し過ぎであることを示す。
【0065】
図４は、異なる細胞濃度で２００×２０μｍのスタンプＰＤＭＳコーティングされたカバースリップに播種されたＨＵＶＥＣの画像４００ａ～ｃを示す。画像４００ａは、細胞１５０，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。画像４００ｂは、細胞３００，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。画像４００ｃは、細胞４５０，０００個／ｃｍ２の濃度を示す。画像４００ａ～ｃ中、スケールバーは５００μｍである。画像３００ａ～ｃとは対照的に、細胞濃度の増加に従い、隣接する長方形間により多くのスペース（２００×２０μｍ）を有するが、重なりは最小限であり、長方形はその区別可能な形状を維持する。細胞は非常にコンフルエントであり、これは、インビボでの微小血管系の内膜の有効化を助けるアスペクトである。
【0066】
図５Ａ～５Ｃのそれぞれは、異なる細胞濃度で２００×１０μｍのスタンプＰＤＭＳコーティングされたカバースリップに播種されたＨＵＶＥＣの共焦点像５００ａ～ｃを示す。図５Ａの画像５００ａは、細胞１５０，０００個／ｃｍ２の細胞濃度を示す。図５Ｂの画像５００ｂは、細胞３００，０００個／ｃｍ２の細胞濃度を示す。図５Ｃは、細胞４５０，０００個／ｃｍ２の細胞濃度を示す。カバースリップを、密着結合の染色のために、ＤＡＰＩ（青色）、ファロイジン（緑色）、およびＺＯ１－抗体（赤色）で染色した。スタンプフィブロネクチンは、画像５００ａおよび５００ｃ中でより暗い色度（例えば、マゼンタ）で見ることができる。各画像５００ａ～ｃ中、スケールバーは５０μｍである。
【0067】
前述したように、密着結合は、組織血管系中の内皮細胞間に存在する重要な結合成分である。密着結合が、マイクロパターン化長方形上に播種されたＨＵＶＥＣ中に存在するかを決定するために、ＺＯ－１を標的とする抗体を使用する。この抗体は、密着結合のマーカーである。図５Ａの画像５００ａに示すように、最低の播種密度を有する試料において、非常に低いレベルのＺＯ－１が観察された。これは、低密度の播種試料中の低い細胞間接触に起因する。細胞境界間の密着結合は、図５Ｂの画像５００ｂ中の高密度単層中で容易に識別できる。「一次抗体なし」の対照は、ＺＯ－１密着結合に対する抗体の特異性を実証するために図５Ｃの画像５００ｃに示す。画像５００ｃ中の染色している密着結合の欠乏は、染色しているＺＯ－１抗体が画像５００ｂ中で有効だったことを示す。
【0068】
図６Ａ～６Ｂは、異なる細胞濃度で２００×２０μｍのスタンプＰＤＭＳコーティングされたカバースリップに播種されたＨＵＶＥＣの共焦点像６００ａ～ｂを示す。図６Ａの画像６００ａは、細胞１５０，０００個／ｃｍ２の細胞濃度を示す。図６Ｂの画像６００ｂは、細胞４５０，０００個／ｃｍ２の細胞濃度を示す。カバースリップを、密着結合の染色のために、ＤＡＰＩ（青色）、ファロイジン（緑色）、およびＺＯ１－抗体（赤色）で染色した。各画像６００ａ～ｂ中、スケールバーは５０μｍである。画像６００ａ～ｂの両方の濃度のＨＵＶＥＣは非常にコンフルエントである。これは、染色している密着結合の高い存在率によってみることができる。細胞濃度の増加にもかかわらず、細胞は依然としてその明確な長方形のパターニングを維持することができる。
【0069】
図７は、細胞３００，０００個／ｃｍ２の細胞濃度でコーティングされた２００×２０μｍのスタンプＰＤＭＳ上に播種されたＨＵＶＥＣの放出前および放出後の時間帯を表す画像７００ａ～ｆを示す。マイクロパターン化長方形上に播種されたＨＵＶＥＣが放出されうるかを試験するために、本発明者らは、２００×２０μｍの長方形をＰＩＰＡＡｍコーティングされたカバースリップ上にパターン化し、その上にＨＵＶＥＣを播種した。ＨＵＶＥＣを放出する前に、長方形上に播種されたＨＵＶＥＣは、高いコンフルエント度およびマイクロパターン化長方形への特異的結合を実証した。各画像７００ａ～ｆは、同じカバースリップを表す。画像７００ａ～ｆ中、スケールバーは５００μｍである。画像７００ａで見られるように、長方形の角は全て、輪郭がはっきりしており、フィブロネクチンスタンプの完全なコーティングの観点から播種がいかに効果的であったかを示す。画像７００ｃ～ｆ中のＰＩＰＡＡｍ放出後、ＨＵＶＥＣは、その個々のパターンを維持することができ、カーリングの兆候を示し、三次元において円筒様部分を形成できたことが示唆しうる。
【0070】
図８は、放出され、染色され、画像化された、細胞３００，０００個／ｃｍ２の細胞濃度で２００×２０μｍのスタンプＰＤＭＳコーティングされたカバースリップ上に播種されたＨＵＶＥＣの画像８００ａ～ｄを示す。各画像８００ａ～ｄは、同じカバースリップを表す。カバースリップをＤＡＰＩ（暗）、ファロイジン（明）で染色した。画像８００ａ～ｃは、１０×倍率で撮影する。画像８００ｄは、２０×倍率で撮影する。各画像のスケールバーは５０μｍである。放出された細管部分の共焦点像は、放出された長方形は、その個々の部分を維持し、管状構造を形成することを示す。これらの構造は、各画像８００ａ～ｄにおいて若干内側にカールするように見える。
【0071】
一態様において、前述の画像に基づいて、最適な細胞濃度の例は、細胞約３００，０００個／ｃｍ２である。一般的に、細胞４５０，０００個／ｃｍ２は、３つ全てのマイクロパターン化寸法において高過ぎた。２００×２０μｍのマイクロパターン化長方形は、マイクロパターン化長方形からはみ出して伸展する傾向にある２００×１０μｍのサイズに比べて最もコンフルエントな細胞を有する。
【0072】
実施形態例：角膜内皮細胞の包装μ単層
ＣＥは、角膜後面に並ぶ細胞の単層であり、過剰の流体を間質から前房へ送り出すことによって適度な角膜の厚さおよび透明度の維持に関与する。ＣＥの細胞は、細胞周期のＧＩ期で停止され、したがって疾患、外傷、または正常な老化による損傷を修復するために複製できない。結果として、細胞が死滅したとき、残りの細胞は肥大化して単層の統合およびポンプ機能を維持し、細胞密度が低下するようになる。細胞密度が細胞約５００個／ミリメートル（ｍｍ）２未満に低下すると、ＣＥはもはや適切な機能を果たすことができなくなり、過剰の流体が角膜実質中に蓄積し、結果として角膜失明になる。ＣＥの構造（細胞単層）、機能（障壁／流体ポンピング）、および位置（前房に隣接）は、より複雑な組織と比べて細胞注射療法にとって理想的な標的にする。さらに、動物モデルおよび臨床試験は、ＣＥ修復のための前房への注入が、細胞保持の欠乏、生存能力およびＣＥへの統合に悩まされ、所望の結果を達成するために、多数の細胞およびＲＯＣＫ阻害物質Ｙ－２７６３２などの小分子の注入を必要とすることを示した。しかしながら、特にＣＥ細胞の細胞間結合および細胞骨格構造が、接触抑制を通して成熟した非増殖性単層状態の細胞シグナリング、機能および維持に必要とされることが示されたため、最良の結果でもその再生能力が限定される。
ＣＥは、角膜後面に並ぶ細胞の単層であり、過剰の流体を間質から前房へ送り出すことによって適度な角膜の厚さおよび透明度の維持に関与する。ＣＥの細胞は、細胞周期のＧＩ期で停止され、したがって疾患、外傷、または正常な老化による損傷を修復するために複製できない。結果として、細胞が死滅したとき、残りの細胞は肥大化して単層の統合およびポンプ機能を維持し、細胞密度が低下するようになる。細胞密度が細胞約５００個／ミリメートル（ｍｍ）２未満に低下すると、ＣＥはもはや適切な機能を果たすことができなくなり、過剰の流体が角膜実質中に蓄積し、結果として角膜失明になる。ＣＥの構造（細胞単層）、機能（障壁／流体ポンピング）、および位置（前房に隣接）は、より複雑な組織と比べて細胞注射療法にとって理想的な標的にする。さらに、動物モデルおよび臨床試験は、ＣＥ修復のための前房への注入が、細胞保持の欠乏、生存能力およびＣＥへの統合に悩まされ、所望の結果を達成するために、多数の細胞およびＲＯＣＫ阻害物質Ｙ－２７６３２などの小分子の注入を必要とすることを示した。しかしながら、特にＣＥ細胞の細胞間結合および細胞骨格構造が、接触抑制を通して成熟した非増殖性単層状態の細胞シグナリング、機能および維持に必要とされることが示されたため、最良の結果でもその再生能力が限定される。
【0073】
この実施形態は、図１Ａに関して記述されたカプセル化の方法によるナノメートル厚のＥＣＭ足場中のＣＥ細胞（ＣＥＣ）のミクロン規模の単層の収縮包装（例えば、カプセル化）を記載している。収縮包装に際して、ミクロン規模の単層（μ単層）は、細胞間結合および細胞骨格構造を有する、よく組織化された単層細胞シートを維持しながら、３００ゲージの針に通して注射するのに十分小さなサイズまで収縮する。インビトロで、収縮包装μ単層は、単一細胞のカプセル化に比べて既存の単層の細胞密度を顕著に増加する。
【0074】
この記述は、収縮包装μ単層をインビボでウサギの眼の前房に注入し、細胞密度を増加するためのＣＥへのインビボ統合を実証する実験結果を説明している。実験は、ＥＣＭ足場中の収縮包装ＣＥＣμ単層が、注射後の細胞の細胞骨格構造、密着結合および生存能力を維持することを示した。
【0075】
ＣＥＣの単層をミクロン規模の寸法で改変するために（μ単層）、ナノメートル厚のＥＣＭ足場中の収縮包装単一細胞（ＳＨＥＬＬと呼ぶ）に修正を加えた。ここで、表面開始アセンブリー技術によってポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）上にパターン化した正方形の寸法は、サイズが約２００μｍ×２００μｍまで増える。足場のサイズ拡大は、より多くの細胞が各足場に接着するのを可能にする。正方形上の細胞の２４時間までの培養時間は、約２４時間まで延長される。ＰＩＰＡＡｍが熱応答性であるため、播種プロセス中に試料および細胞を４０℃まで加熱して、ＰＩＰＡＡｍが溶解しないようにした。
【0076】
図９を参照して、培養細胞単層の例を示す。対照として、画像９００ａに示すように、同じサイズの足場をＰＤＭＳ上にミクロ接触プリンティングした。ＣＥＣは、ＰＤＭＳ上（対照として使用した）および熱応答性ポリマーＰＩＰＡＡｍ上にミクロ接触プリンティングしたＥＣＭ正方形上に単層を形成する。ＰＩＰＡＡｍが溶解したら、ＣＥＣ単層は収縮し、ＥＣＭ正方形中で収縮包装される。２４時間後、ＰＩＰＡＡｍ上に作られたＥＣＭ足場上で培養されたウシＣＥＣ（ＢＣＥＣ）μ単層は、位相差顕微鏡下で見たとき、ＰＤＭＳ上に作られたＥＣＭ足場上で培養されたものと同様の形態を示した。
【0077】
画像９００ｂは、試料が室温まで冷却したら即座に１００秒未満でＣＥＣの放出および収縮包装が生じることを示す。ＰＩＰＡＡｍの溶解および熱放出に際して、μ単層は元の状態のままであり、ＥＣＭ正方形の中で成功裏に収縮包装された。放出されたら、収縮包装されたμ単層を回収し、遠心分離し、２８０針に通して注射し、３０分間定着させた後、μ単層中のＢＣＥＣの構造を調べるために固定および染色を行った。画像９００ｃでみられるように、収縮包装ＢＣＥＣは、境界における連続Ｚ０－１および皮質Ｆ－アクチン構造を示し、細胞が、放出プロセスを通して密着結合および細胞骨格構造を維持していたことを示した。共焦点顕微鏡画像は、注射後、ＣＥＣが細胞骨格構造（Ｆ－アクチン）および密着結合（Ｚ０－１）の両方を維持することを示す。
【0078】
画像９００ｄは、弛緩し始めて元の形状に戻る様子を例示する、注射の３０分後の収縮包装ＣＥＣ単層の３Ｄ投影を含む。画像９００ｄは、放出後、収縮包装μ単層が弛緩し始め、注射から約３０分後に工学的正方形様構造に戻ることを示す。注射後のμ単層中の細胞の生存率を、生存／死滅細胞毒性分析を用いて検査し、酵素的に放出された単一細胞と比較した。画像９００ｅは、対照の単ＣＥＣの代表的な生存／死滅画像を示し、収縮包装ＣＥＣは、両タイプの細胞が生存可能で、存在する死滅細胞は非常に少ないことを示す。共焦点顕微鏡画像は、収縮ｗ－包装μ単層試料中の死滅細胞のみが、μ単層に統合されなかった個々の細胞だったことを示した。
【0079】
生存／死滅データ（ｎ＝３）を、スチューデントｔ－検定を用いて統計的に比較し、単一細胞と２８Ｇ針に通して注射した収縮包装細胞との間で生存率に有意な差は観察されず、両タイプとも９０％を超える生存率を示した。画像９００ｆは、定量化が、単ＣＥＣが９３％超の生存率を有し、収縮包装細胞（μ単層中に統合されていない細胞を含む）が９７％超の生存率を有していたことを決定したことを示す。
【0080】
収縮包装μ単層は、単ＣＥＣと比較して異なる成長特性を示す。細胞注射療法における収縮包装μ単層の潜在的使用を評価するために、主にコラーゲンＩである剥離間質に結合して増殖すると考えられるかを決定した。単ＣＥＣおよび収縮包装μ単層は両方とも、剥離間質模倣体として機能する圧縮コラーゲンＩゲル上に注射した。試料を定着させ、注射の６および２４時間後に染色して、細胞構造および外部成長を観察した。
【0081】
図１０を参照して、画像１０００ａに示すように、注射の６時間後に、単ＣＥＣは大部分が円形であり、観察された伸展は非常に少なかった。Ｆ－アクチンの染色は、細胞の細胞骨格へのフィラメント様構造物の欠乏を示した。加えて、ＺＯ－１は観察されなかった。対照的に、収縮包装μ単層由来のＣＥＣは、細胞境界のＦ－アクチンフィラメントおよび連続ＺＯ－１発現（１０００ａの２つの下の画像）からも明らかなように、その細胞骨格構造および密着結合を維持していた。より具体的には、コラーゲンＩゲル上に再度播種して６時間後、ＣＥＣは、ＥＣＭ足場から成長しながら、Ｚ０－１発現およびＦ－アクチン細胞骨格を維持した。収縮包装ＣＥＣの周囲の細胞もＺ０－１を発現する。対照的に、単ＣＥＣは、Ｆ－アクチン細胞骨格またはＺ０－１発現を確立しなかった。
【0082】
画像１０００ｂは、単ＣＥＣ（上の画像）および包装単層（下の画像）の比較を示す。播種から６時間後の細胞の３Ｄ図は、単ＣＥＣと収縮包装ＣＥＣとの間の違いを示す。３Ｄの試料を調べることにより、単ＣＥＣが非常に丸く、細胞間の相互作用が非常に少ないのに対し、収縮包装μ単層は、間質模倣体に直接結合されていた細胞の中心に存在するＥＣＭ足場と共に反転する（１０００ｂ、下）ことが確認された。２４時間後、単ＣＥＣは、ほとんどの間質模倣体を被覆し、多くのＦ－アクチンが細胞体全体の繊維にストレスをかける６時間目のＣＥＣと比較してより画定された細胞骨格構造を有していた。画像１０００ｃは、２４時間の時点で、単ＣＥＣは伸展し始め、ほぼ足場全体を被覆したことを示す。２４時間の時点で、ＣＥＣは既にＥＣＭ足場から成長し、ほぼ完全な単層を形成した。画像１０００ｄ中、核は暗色（陰影付き青色）であり、Ｚ０－１は明色（陰影付き赤色）であり、ＣＯＬ４は陰影付きマゼンタであり、Ｆ－アクチンは陰影付き緑色である。スケールバーは５０μｍであるが、例外として直交図では、スケールバーは２０μｍである。単ＣＥＣは、細胞境界に非常に僅かな不連続ＺＯ－１を示した。対照的に、収縮包装μ単層は、画像１０００ｄに示すように、全ての細胞境界における連続ＺＯ－１と、インビボＣＥＣの構造に酷似している皮質Ｆ－アクチン細胞骨格と、を有していた。ＥＣＭ足場は、画像１０００ｄ中の矢印によって示すように、２４時間後でも見ることができた（右の画像）。
【0083】
収縮包装μ単層は、ＣＥ単層に統合し、インビボで密度を増加する。多くの患者は、疾患ではなく低い細胞密度によって生じる障害のため、角膜移植を必要とし、したがって細胞の注射から恩恵を受けて完全な移植なしで細胞密度をブーストすることができる。したがって、収縮包装ＣＥＣの既存のＣＥ単層中への統合を実施する。低密度ＣＥ単層は、以前の実験で使用したコラーゲンＩゲル間質模倣体上に後期継代ＢＣＥＣを播種することによって形成した。次いで収縮包装μ単層または同等数の単ＣＥＣを、３００針に通してコンフルエントＣＥ単層に注射した。単一細胞およびμ単層の両方の注射に使用したＣＥＣをＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色で標識化し、注射後の細胞と、対照として機能する、いずれの細胞とも注射しなかったＣＥ単層と、を追跡した。注射から３、７および１４日後に、試料を定着させ、染色し、分析した。これらのデータ点それぞれの画像を図１１Ａに格子１１００ａで示す。各時点で、非常に少ない単ＣＥＣが既存の単層中に統合されうる。３日目で、統合された収縮包装μ単層は、ＣＥ単層由来の細胞と比較して非常に高密度に充填されているように見え、依然としてこれらにいくつかの３Ｄ構造を有していた。７日目まで、収縮包装μ単層は、単層中に完全に統合されたが、μ単層由来のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ陽性細胞は、既存の単層由来のものより小さく現れた。画像４００ａを標識化して、対照細胞、単一細胞、および包装細胞を示す。１４日目に、収縮包装μ単層は、既存の単層由来の細胞と同等のサイズにここで見えてきて、単層の統合および密度平衡が達成されたことを示す。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで標識化された単一細胞および収縮包装細胞は、各時点で目に見えた。しかしながら、かなり多くの収縮包装細胞が各時点で存在し、ＥＣＭ足場は、注射から１４日後でも依然として目に見えた。
【0084】
各時点で統合する収縮包装μ単層の共焦点画像は、ヒートマップ表記を用いて定量化した。各統合μ単層のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒシグナルの平均画素密度を算出し、結果を画像１１００ｂに示すヒートマップ中に表示する。これらのヒートマップは、先ず収縮包装ＣＥＣμ単層が、経時的に伸展する高密度に充填されたクラスター中に統合されるという観察を確認する。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで標識化された収縮包装細胞が占める領域のヒートマップは、１４日間にわたって、先ず細胞が密着クラスター中に統合し、次いで細胞が少しずつ伸展していくに従って密度が平衡化し始めることを示す。例えば、３日目では、数は３３であり、７日目では、数は３７であり、１４日目では、数は４０である。
【0085】
収縮包装μ単層がＣＥ単層の細胞密度を増加したかを定量化するために、共焦点像を得、一画像当たりの核を計数し、各時点での各試料タイプの画像領域で割ることによって細胞密度を決定した。一試料当たり１０個の画像を計数して一試料当たりの平均を得、３個または４個のいずれかの個々の試料から一試料タイプ当たりの平均を算出し、結果をグラフ１１００ｃに示す。３日目に、収縮包装μ単層が統合されたＣＥ単層（１７３１±２６７細胞／ｍｍ２）は、対照（１０１６±７５細胞／ｍｍ２）に比べてかなり高い細胞密度を有していたが、単ＣＥＣが統合されたＣＥ単層（１２５３±３１細胞／ｍｍ２）と比較すると有意な差はなかった。７日目には、収縮包装μ単層が統合されたＣＥ単層（１６３１±５８細胞／ｍｍ２）は、対照（９８９±１１細胞／ｍｍ２）と単ＣＥＣが統合された単層（１２２０±５６細胞／ｍｍ２）の両方に比べてかなり高い密度を有していた。同様に、１４日目に、収縮包装μ単層が統合されたＣＥ単層（１５４５±９５細胞／ｍｍ２）は、対照（９９４±１０４細胞／ｍｍ２）と単ＣＥＣが統合された単層（１２２４±６６細胞／ｍｍ２）の両方に比べてかなり高い密度を有していた。収縮包装試料で観察された３日目の細胞密度における大きな標準偏差は、７日目および１４日目には減少し、共焦点像およびヒートマップから定量的に割り出した観察をさらに裏付けた。この継続する統合および平衡化も、３日目から１４日目までの細胞密度に認められる低下を説明するが、ここで、細胞密度全体は必ずしも低下するわけではなく、ＣＥ単層全体にわたってより均一になるだけである。
【0086】
これらの長期の結果は有用であるが、患者の顔を３時間下にしたままにする単一細胞注射のために臨床的に用いた方法が、収縮包装μ単層の注入に十分であると考えられるかを決定するために、収縮包装ＣＥＣの短期統合を理解することも重要だった。図１１Ｂの画像１１００ｄは、収縮包装ＣＥＣの既存単層中への統合のライブ共焦点像由来のタイムラプス画像を示す。３時間で、細胞が結合し、統合し始め、４３時間までに細胞がほぼ完全に単層中に統合される。収縮包装μ単層の統合のライブ共焦点像は、収縮包装細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ緑色で標識化し、ＣＥ単層中の細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ橙色で標識化することによって撮像した。Ｚ－スタックは４８時間の間、毎時間収集し、タイムラプスビデオは補助的ビデオＳ１で見る。注射から３時間後、収縮包装μ単層は、結合し始め、ＣＥ単層の頂部で平らになった。ＣＥ単層細胞は、４８時間にわたって移動し続け、収縮包装μ単層を統合させた。４３時間まで、収縮包装μ単層は、ほぼ完全にＣＥ単層中に統合される。また、このビデオは、収縮包装μ単層中の細胞が、早期時点で、ＣＥ単層細胞に比べて非常に高密度に充填されているという以前の結果も確認した。収縮包装μ単層は、３時間以内にエクスビボのウサギ角膜中への統合を開始する。インビトロのライブ像の結果は、患者が３時間、顔を下にして横たわることが、注射後に収縮包装μ単層が統合するために十分な時間量であると考えられることを示唆するが、インビトロのＣＥ単層は潜在的に、インビボＣＥと比較して、注入された細胞を移動して取り込むための能力がより高い。
【0087】
インビボ試験に移行する前にこれらの結果を確認するための次の工程として、収縮包装ウサギμ単層を、エクスビボのウサギの前眼房に注射し、角膜を下に向けた眼を３時間インキュベートし、その後、眼球を定着させた。定着後、角膜を摘出し、勢いよく３回すすいで全ての未結合細胞を除去し、Ｚ０－１、Ｆ－アクチンおよび核のために染色した。角膜の共焦点像は、角膜全体にわたって結合された多数の収縮包装μ単層を示した。収縮包装μ単層は、図１２の画像１２００に示すように、依然として丸く、中心にＥＣＭ足場と共に集まっていた。共焦点像は、収縮包装細胞が、エクスビボＣＥに統合し始めたことを示し、ＥＣＭ足場が、収縮包装細胞と既存の単層との間にあることが観察される。縦線および横線は、直交図が得られた位置を示す。
【0088】
図１３は、インビボの健常なウサギＣＥに統合された収縮包装μ単層の結果を示す。患者のＣＥ細胞密度を増加するために収縮包装μ単層を使用する実現可能性を試験するために、３羽のニュージーランドホワイトウサギの健常な眼を使用する試験を実施した。ＤｉＯで標識化した収縮包装μ単層を、各ウサギの片眼の前房に注入した。注射した眼の側を下に向けてウサギを３時間置き、収縮包装μ単層を統合させた。次いでウサギを７日間観察した後、屠殺し、除核した。７日目に、３羽のウサギ全ての注射した眼は、透明のままであり、炎症または腫れの外的兆候は見られなかった。画像１３００ａは、７日目のウサギの眼の写真であり、角膜は健常かつ透明のままだったことを示す。除核後、２％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）の注射を介して眼を前房中に定着させ、眼球を２％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ＋＋）中に２４時間浸漬した後、Ｚ０－１および核を介して密着結合について染色した。共焦点顕微鏡画像は、ＤｉＯで標識化された細胞が、３羽のウサギ全ての注射された眼内に存在したことを示し、広域タイルスキャンは、角膜全体に統合された収縮包装μ単層の多数のクラスターを示した。画像１３００ｂは、広域タイルスキャンされた共焦点像は、注射から７日後に、ＤｉＯ（緑色）標識化された収縮包装細胞を有する多くの領域が依然として角膜内に存在することを示す。より高倍率の画像は、収縮包装μ単層の細胞が、健常ウサギＣＥとしっくり統合し、Ｚ０－１がＤｉＯ標識化細胞と天然ウサギＣＥＣとの間の全ての細胞境界に連続的に存在することを示した。画像１３００ｃは、四角によってハイライトされ、ＤｉＯ標識化された収縮包装細胞が健常ウサギＣＥ中に統合され、収縮包装ＣＥＣと天然ＣＥＣとの間に連続密着結合（Ｚ０－１）を示すことを示す１３００ｂの領域を拡大表示した画像を示す。ＥＣＭ足場も、矢印で示すように依然として可視であり、収縮包装ＣＥＣは、ＣＥの上の細胞を有さない単層と同じ面にあり、途切れのない統合を示す。ＥＣＭ足場は依然として可視であり、収縮包装μ単層が統合し、インビボのウサギＣＥの一部になったというさらなる証拠を与えている。
【0089】
図１４は、収縮包装ＣＥＣが健常ウサギ角膜内皮中に統合されその中で局部密度を増加することを例示する画像１４００ａ～ｃおよびグラフ１４００ｄを示す。画像１４００ａ中、健常ウサギ内皮中にある統合された単一細胞は非常に少ない。対照的に、画像１４００ｂでは、多くの収縮包装μ単層が健常ウサギ内皮に統合されている。画像１４００ｃは、統合されたμ単層のクローズアップ画像を示す。ＥＣＭは依然として中央にあるが、完全に統合されたμ単層由来の注入された細胞の細胞体の下にある。グラフ１４００ｄは、同じ視野内での角膜の他の領域と比較した、μ単層が統合された領域の注射後７日目の局部細胞密度の増加を示す。
【0090】
図１５に、細胞をカプセル化するための方法１５００を示す。組織足場スタンプを、細胞外マトリックス化合物でコーティングする（１５１０）。組織足場スタンプを熱応答性基質上に置いた（１５２０）。組織足場スタンプに細胞培養物を播種した（１５３０）。細胞培養物を、指定の温度の組織足場スタンプ上でインキュベートした（１５４０）。細胞培養物は、組織足場スタンプ上に単層を形成し（１５５０）、単層の境界は、細胞間結合の発現を維持し、単層の細胞間結合は、張力を発現するように構成されている。熱応答性基質は、温度を低下させることによって溶解した。組織足場スタンプを細胞パッチから除去し（１５６０）、組織足場スタンプを溶媒中に溶解することによって微細組織構造を形成した。溶媒中に微細組織を懸濁させながら微細組織構造を折り畳み（１５７０）、細胞パッチが細胞外マトリックス化合物を折り畳むことを可能にし、マトリックス化合物の折り畳みも、微細組織構造を折り畳ませた。折り畳まれた微細組織構造を、遠心分離を利用して溶媒から回収した（１５８０）。次いで、折り畳まれた微細組織構造を生体に投与した（１５９０）。
【0091】
多数の例示的実施形態を説明してきた。それにもかかわらず、本明細書に記載の技術の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変を行うことができることは、当業者によって理解されるであろう。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】