特表 2022-552008 ＣＡＲ ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子とその製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-14

(54)【発明の名称】ＣＡＲ ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子とその製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20221207BHJP

   C07D 295/135 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221207BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 33/10 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221207BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20221207BHJP

   C07D 295/13 20060101ALI20221207BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

C07D295/135

A61K9/14

A61K9/127

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/10

A61K31/713

A61K31/7088

A61K48/00

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/10

A61P33/10

A61P31/16

A61P35/00

A61P19/02

A61P9/00

A61P25/00

A61P37/02

C07D295/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523023

(86)(22)【出願日】2020-10-19

(85)【翻訳文提出日】2022-06-14

(86)【国際出願番号】 US2020056255

(87)【国際公開番号】W WO2021077067

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/916,942

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ミッチェル

(72)【発明者】

【氏名】マーガレット ビリンズリー

(72)【発明者】

【氏名】ネイサン シン

(72)【発明者】

【氏名】カール エイチ．ジューン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA30

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC27

4C076CC34

4C076CC35

4C076DD63

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4C076EE23

4C076FF34

4C084AA13

4C084MA05

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4C084MA43

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA01

4C084ZA36

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4C084ZB26

4C084ZB33

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4C084ZB39

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA43

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA36

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB26

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZB39

(57)【要約】

本発明は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、及び／又は治療薬を、細胞などの選択された標的に送達するための、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又はその組成物に関する。すなわち様々な態様において本発明はまた、前記ＬＮＰ又はその組成物を使用して、それを必要とする被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法も提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種のｍＲＮＡ分子と式（Ｉ）の構造を有する少なくとも１種の化合物又はその塩とを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）：

【化1】

［ここで、Ａ₁及びＡ₂は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）、Ｎ、Ｓ、及びＰからなる群から独立して選択され；
ここで、各Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃、Ｌ₄、Ｌ₅、及びＬ₆は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、及びＮ（Ｒ₁₉）からなる群から独立して選択され；
ここで、各Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ_3a、Ｒ_3b、Ｒ_4a、Ｒ_4b、Ｒ_5a、Ｒ_5b、Ｒ_6a、Ｒ_6b、Ｒ_7a、Ｒ_7b、Ｒ_8a、Ｒ_8b、Ｒ_9a、Ｒ_9b、Ｒ_10a、Ｒ_10b、Ｒ_11a、Ｒ_11b、Ｒ_12a、Ｒ_12b、Ｒ_13a、Ｒ_13b、Ｒ_14a、Ｒ_14b、Ｒ_15a、Ｒ_15b、Ｒ₁₆、Ｒ₁₇、Ｒ₁₈、及びＲ₁₉は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、置換－（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、アリール、置換アリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、及びスルホキシからなる群から独立して選択され；
ここで、Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰからなる群から選択され；
ここで、各Ｒ₂₀及びＲ₂₁は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、及びスルホキシからからなる群から独立して選択され；
ここで、各Ｚ'及びＺ”は、それぞれ独立して、０、１、又は２で表される整数であり；そして
ここで、各ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、又は５で表される整数であり；及び
ここで、ｍＲＮＡ分子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする］。

【請求項2】

式（Ｉ）の構造を有する化合物が、以下からなる群から選択される構造を有する化合物である、請求項１に記載のＬＮＰ：

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

［ここで、各Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、及びＲ₅は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、及びエステルからなる群から独立して選択され；
ここで、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑは、それぞれ独立して０～２５の整数であり；そして
ここで、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、及び５で表される整数である］。

【請求項3】

式（Ｉ）の構造を有する化合物が、以下からなる群から選択される構造を有する化合物である、請求項１に記載のＬＮＰ：

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

［ここで、各Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、及びＲ₅は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、及びエステルからなる群から独立して選択され；そして
ここで、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑは、それぞれ独立して０～２５の整数である］。

【請求項4】

式（Ｉ）の構造を有する化合物がイオン化可能脂質である、請求項１に記載のＬＮＰ。

【請求項5】

前記ｍＲＮＡ分子が、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入されている、請求項１に記載のＬＮＰ。

【請求項6】

前記ＬＮＰが、式（Ｉ）の構造を有する化合物又はその塩を約１ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項１に記載のＬＮＰ。

【請求項7】

前記ＬＮＰが、式（Ｉ）の構造を有する化合物又はその塩を約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項６に記載のＬＮＰ。

【請求項8】

前記ＬＮＰが少なくとも１種のヘルパー脂質をさらに含む、請求項１に記載のＬＮＰ。

【請求項9】

前記ＬＮＰが、少なくとも１種のヘルパー脂質を約０．０１ｍｏｌ％～約９９．９ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項８に記載のＬＮＰ。

【請求項10】

前記ＬＮＰが、少なくとも１種のヘルパー脂質を約０．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項９に記載のＬＮＰ。

【請求項11】

前記ヘルパー脂質が、リン脂質、コレステロール脂質、ポリマー、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載のＬＮＰ。

【請求項12】

前記リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）又はその誘導体、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）又はその誘導体、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）又はその誘導体、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）又はその誘導体、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項13】

前記ＬＮＰが、リン脂質を約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項14】

前記コレステロール脂質がコレステロール又はその誘導体である、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項15】

前記ＬＮＰが、コレステロール脂質を約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項16】

前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体である、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項17】

前記ＬＮＰが、ポリマーを約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む、請求項１１に記載のＬＮＰ。

【請求項18】

前記ＬＮＰが、核酸分子、アジュバント、治療薬、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のＬＮＰ。

【請求項19】

前記核酸分子が治療薬である、請求項１８に記載のＬＮＰ。

【請求項20】

前記核酸分子がＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項１８に記載のＬＮＰ。

【請求項21】

前記核酸分子が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、アンタゴミール、アンチセンス分子、ガイドＲＮＡ分子、クリスパーガイドＲＮＡ分子、ペプチド、治療用ペプチド、標的化核酸、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載のＬＮＰ組成物。

【請求項22】

前記ｍＲＮＡが１種以上の抗原をコードする、請求項２１に記載のＬＮＰ。

【請求項23】

前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、インフルエンザ抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２２に記載のＬＮＰ。

【請求項24】

前記核酸分子がプロモーター又は調節配列を含む、請求項１８に記載のＬＮＰ。

【請求項25】

ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせが、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入されている、請求項１８に記載のＬＮＰ。

【請求項26】

請求項１に記載の少なくとも１種のＬＮＰを含む組成物。

【請求項27】

前記組成物がワクチンである、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

請求項１に記載のＬＮＰ又はその組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、ＣＡＲをコードする少なくとも１種のｍＲＮＡ分子を、それを必要とする被験体に送達する方法であって、前記ＬＮＰ又はその組成物が、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を標的に送達する、方法。

【請求項29】

前記標的が、免疫細胞、Ｔ細胞、常在Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、癌性細胞、疾患又は障害に関連する細胞、疾患又は障害に関連する組織、脳組織、中枢神経系組織、肺組織、頂端表面組織、上皮細胞、内皮細胞、肝臓組織、腸組織、結腸組織、小腸組織、大腸組織、糞便、骨髄、マクロファージ、脾臓組織、筋肉組織、関節組織、腫瘍細胞、病変組織、リンパ節組織、リンパ循環、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記方法が、ＬＮＰ又はその組成物の単回投与を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記方法が、ＬＮＰ又はその組成物の複数回投与を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記ＬＮＰ又はその組成物が、皮内送達経路、皮下送達経路、筋肉内送達経路、脳室内送達経路、髄腔内送達経路、経口送達経路、静脈内送達経路、気管内送達経路、腹腔内送達経路、子宮内送達経路、及びこれらの任意の組合わせからなる群から選択される送達経路によって投与される、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記ＬＮＰ又はその組成物が、少なくとも１種の核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせをさらに含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項34】

前記核酸分子が治療薬である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記核酸分子がＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記核酸分子が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、アンタゴミール、アンチセンス分子、ガイドＲＮＡ分子、クリスパーガイドＲＮＡ分子、ペプチド、治療用ペプチド、標的化核酸、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記ｍＲＮＡが１種以上の抗原をコードする、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、インフルエンザ抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記方法が、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、インフルエンザ感染、癌、関節炎、心臓病、心血管疾患、神経障害又は疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、胎児性疾患、胎児の発育に影響を与える遺伝性疾患、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを治療又は予防する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記核酸分子がプロモーター又は調節配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項41】

ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせが、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入されている、請求項３３に記載の方法。

【請求項42】

前記ＬＮＰ組成物がワクチンである、請求項２８に記載の方法。

【請求項43】

請求項１８に記載のＬＮＰ又はその組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、ＣＡＲをコードする少なくとも１種のｍＲＮＡ分子、及び少なくとも１種の核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせを、それを必要とする被験体に送達する方法であって、前記ＬＮＰ又はその組成物が、前記ｍＲＮＡ分子、及び前記核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせを標的に送達する、方法。

【請求項44】

前記標的が、免疫細胞、Ｔ細胞、常在Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、癌性細胞、疾患又は障害に関連する細胞、疾患又は障害に関連する組織、脳組織、中枢神経系組織、肺組織、頂端表面組織、上皮細胞、内皮細胞、肝臓組織、腸組織、結腸組織、小腸組織、大腸組織、糞便、骨髄、マクロファージ、脾臓組織、筋肉組織、関節組織、腫瘍細胞、病変組織、リンパ節組織、リンパ循環、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記方法が遺伝子送達方法である、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

請求項１に記載のＬＮＰ又はその組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／９１６，９４２号の優先権及び利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する声明
本発明は、国立癌研究所によって授与されたＲ０１－ＣＡ－２２６９８３の下で、及び国立衛生研究所によって授与されたＤＰ２ ＴＲ００２７７６の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。

【0003】

発明の背景
ＦＤＡに承認された癌治療であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の生成は、患者のＴ細胞を改変して、癌を標的とするＣＡＲ膜貫通タンパク質を発現させ、それらを患者に再注入することに依存している。ＣＡＲの発現を誘導するために、臨床応用のための現在の製造プロセスは、ウイルスベースの細胞工学操作に依存している。ウイルスを使用してＴ細胞を工学操作すると、Ｔ細胞表面に永続的なＣＡＲが発現が得られる。これは強力であるが、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連する有害な副作用（すなわちサイトカインストーム、神経毒性）を増幅する可能性がある。さらに、製造ミスも永続的であり、致命的な結果につながる可能性がある。従って臨床研究者は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡがＴ細胞に送達されるｍＲＮＡベースのＣＡＲ Ｔ細胞産生の研究を開始した。これは、Ｔ細胞上で一時的に発現されるＣＡＲをもたらし、望ましくない毒性の副作用を軽減する手段として有望な結果を示している。

【0004】

ただしＴ細胞は、明らかにトランスフェクトすることが難しい。従って、ｍＲＮＡをＴ細胞に送達するために、最も一般的に利用される方法は電気穿孔法（ＥＰ）である。ＥＰは電気パルスを使用して細胞膜の細孔を開き、細胞と共に溶液中のあらゆるもの（この場合はｍＲＮＡ）がサイトゾルに入ることを可能にする。ＥＰはｍＲＮＡを細胞に取り込むのに有効であるが、Ｔ細胞に対して毒性を示しやすく、ゲノム発現の変化を引き起こす可能性があり、インビボでの翻訳の可能性はない。

【0005】

２０１７年、ＦＤＡは、ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞療法が高率の持続的寛解を誘導する能力があるため、これを再発性又は難治性の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に承認した（Liu Y et al., 2017, Drugs of Today, 53:597-608; Maude SL et al., 2014, N Engl J Med., 371:1507-1517）。同じ年に、この治療法は、大多数の患者で完全な寛解を誘導することも示されたため、再発又は難治性の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療に承認された（Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; Yip A et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:161）。これらの成功以来、慢性リンパ芽球性白血病（Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733）、神経膠芽腫（Brown CE et al., 2016, N Engl J Med, 375:2561-2569）、及び難治性多発性骨髄腫（Berdeja JG et al., 2017, J Clin Oncol, 35）を含む他の癌の治療のための多くのＣＡＲ Ｔ細胞療法が開始されたが、まだＦＤＡの承認は受けていない。これらの自己療法の開発は、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するためのエクスビボ細胞工学操作に依存している。この形態の癌免疫療法を創成するために、患者のＴ細胞が採取され、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するように改変され、患者に再注入されている。膜貫通型ＣＡＲ構築物は、Ｔ細胞が癌性Ｂ細胞を標的にして結合して、アポトーシスを誘導し、こうして患者自身の免疫系を使用して癌を根絶することを可能にする（Benmebarek M et al., 2019, Int J Mol Sci, 20:1283）。

【0006】

このプロセスにより、大多数の患者に永続的な寛解を誘導する強力なＣＡＲ Ｔ細胞が得られるが（Maude SL et al., 2014, N Engl J Med, 371:1507-1517; Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; Yip A et al., 2018, Nat Rev Drug Discov;17:161）、この治療法は、患者の免疫応答に起因する深刻な有害作用と、ウイルスの形質導入及び産生エラーに関連する潜在的なリスクを有する（N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; June CH et al., 2015, Sci Transl Med, 7; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Fesnak AD et al., 2016, Nat Rev Cancer, 16: 566-581; Vormittag P et al., 2018, Curr Opin Biotechnol, 53:164-181; Ruella M et al., 2018, Nat Med., 24:1499-1503）。治療を受けている成人患者のほぼ７０％で発生することがわかっている即時反応（Hartsell A et al., 2019, Biol Blood Marrow Transplant., 25:S336-S337）には、マクロファージ活性化症候群、神経毒性、及びサイトカインストームなどがある（Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25: 1702-1708; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Zheng PP et al., 2019, Trends Immunol, 40:274-278）。初期の有害事象のいくつかは抗ＩＬ－６受容体抗体で軽減される可能性があるが（Maude SL et al., 2014, N Engl J Med, 371:1507-1517）、長期的な影響も同様に深刻な場合がある。癌性Ｂ細胞を標的とした後、持続するＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞は、すべてのＣＤ１９陽性細胞の排除をもたらし、これがＢ細胞形成不全と低ガンマグロブリン血症を引き起こす可能性がある（Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Dotti G et al., 2014, Immunol Rev, 257:107-126; Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178）。これらの毒性の懸念に加えて、ＦＤＡが承認したものを含む継続的な発現を伴うＣＡＲ Ｔ細胞は、最も一般的にはウイルス形質導入を介して産生され、これはまた毒性の挿入型突然変異誘発に対する安全性の懸念も与える（Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733; June CH et al., 2015, Sci Transl Med, 7; Fesnak AD et al., 2016, Nat Rev Cancer, 16:566-581; Vormittag P et al., 2018, Curr Opin Biotechnol, 53:164-181; Dotti G et al., 2014, Immunol Rev; 257:107-126）。さらに、永続的な改変は、産生エラーの場合に致命的な結果をもたらす可能性がある。ある例では、エクスビボのＣＡＲ Ｔ細胞の工学操作中に単一の癌性Ｂ細胞が偶発的に形質導入されたため、患者の死を招いた（Ruella M et al., 2018, Nat Med, 24:1499-1503）。全体として、これらの悪影響はこの強力な治療法に関連するリスクを浮き彫りにし、より安全なＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＣＡＲ Ｔ細胞産生法の改善に関する研究の動機付けとなっている。

【0007】

ウイルスで工学操作されたＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連する上記の課題（すなわち、神経毒性、サイトカインストーム、低ガンマグロブリン血症などの有害な副作用）を克服するための１つの可能性のある解決策は、ｍＲＮＡトランスフェクションを利用してＣＡＲ発現を誘導することである。ｍＲＮＡは、ゲノムの組み込みなしで翻訳されるため、ＣＡＲの一過性発現を可能にする（Riley RS et al., 2019, Nat Rev Drug Discov, 18:175-196）。さらに、インビトロ転写（ＩＶＴ）されたｍＲＮＡのカスタマイズ可能な構造は、それがトランスフェクションと翻訳を最大化するように設計されることを可能にする（Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902）。

【0008】

ｍＲＮＡ誘導ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、ＡＬＬ、メラノーマ、ホジキンリンパ腫などのさまざまな癌に関する過去の研究で検証されており、ＣＡＲ Ｔ細胞を安定して発現するのと同じくらい効果的に、短期間の疾患負荷を軽減することが示されている（Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551; Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; Rabinovich PM et al., 2006, Hum Gene Ther, 17: 1027-1035; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070; Tasian SK et al., 2017, Blood, 129:2395-2407; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120; Yoon SH et al., 2009, Cancer Gene Ther, 16:489-497）。この可能性を考えると、ｍＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、とりわけ結腸直腸癌やＢ細胞リンパ腫を含む癌に対して多数の臨床試験が進行中である（Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756）。これらの過去の研究では、ＣＡＲの発現は通常１週間未満しか持続しないことが確認されており、これが、再投与なしで長期的な治療効果を提供するｍＲＮＡ誘導療法の能力を制限している（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120）。しかし、これはまた、より少ないオンターゲット効果、腫瘍外効果を引き起こす可能性があり、より低い毒性を提供することが示されている（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:112-120）。

【0009】

さらに、Ｔ細胞に送達されるｍＲＮＡの量は、Ｔ細胞上のＣＡＲ発現のレベルに影響を及ぼし、調整可能な毒性を可能にすることが示され、ｍＲＮＡベースのＣＡＲ発現が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法に関連するサイトカイン放出などの副作用を軽減する手段を提供する可能性があることを示している（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061）。過去の研究では、さまざまな癌におけるｍＲＮＡ誘導ＣＡＲ Ｔ細胞療法が検証されており、ＣＡＲ Ｔ細胞を安定して発現するのと同じくらい効果的に短期間の疾患負荷を軽減することが示されている（Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551; Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; Rabinovich PM et al., 2006, Hum Gene Ther, 17: 1027-1035; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070; Tasian SK et al., 2017, Blood, 129:2395-2407; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120; Yoon SH et al., 2009, Cancer Gene Ther, 16:489-497）。この可能性を考慮して、ｍＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞療法では、とりわけ結腸直腸癌やＢ細胞リンパ腫を含む癌に関する多数の臨床試験が進行中である（Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756）。

【0010】

しかし、裸のｍＲＮＡは急速に分解し、細胞膜を容易に通過できないため、Ｔ細胞に機能的に取り込まれるための送達方法が必要である。現在、Ｔ細胞を含むさまざまな細胞にｍＲＮＡを有効に送達するために、電気穿孔法（ＥＰ）が臨床的に使用されている（Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115）が、これにはいくつかの欠点がある。ＥＰ中に発生する膜破壊は、細胞内容物の喪失と細胞毒性のリスクを伴うが、均一な送達のための、細胞全体の一貫した膜浸透が保証できない。このため、生存率が低下し、生存細胞集団の挙動の変化をもたらし得る（DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Dullaers M et al., 2004, Mol Ther, 10:768-779; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070）。従って、この核酸送達方法が引き起こす潜在的なリスクを理解するために、電気穿孔後のトランス遺伝子の長期発現と細胞内の挙動をさらに研究する必要がある（Lambricht L et al., 2016, Expert Opin Drug Deliv, 13: 295-310; Nickoloff JA et al., 1995, Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols Methods in Molecular Biology, 273-280）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

従って、当技術分野では、様々な疾患又は障害の治療のために、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を細胞に送達するための改良された組成物及び方法が必要とされている。本発明は、この満たされていないニーズを満たすものである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

（発明の簡単な要約）
１つの態様において、本発明は一部は、少なくとも１種のｍＲＮＡ分子と式（Ｉ）の構造を有する少なくとも１種の化合物又はその塩とを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する：

【化1】

【0013】

いくつかの実施態様において、Ａ₁及びＡ₂は、独立して、Ｃ、Ｃ（Ｈ）、Ｎ、Ｓ、又はＰである。いくつかの実施態様において、各Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃、Ｌ₄、Ｌ₅、及びＬ₆は、独立して、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、各Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ_3a、Ｒ_3b、Ｒ_4a、Ｒ_4b、Ｒ_5a、Ｒ_5b、Ｒ_6a、Ｒ_6b、Ｒ_7a、Ｒ_7b、Ｒ_8a、Ｒ_8b、Ｒ_9a、Ｒ_9b、Ｒ_10a、Ｒ_10b、Ｒ_11a、Ｒ_11b、Ｒ_12a、Ｒ_12b、Ｒ_13a、Ｒ_13b、Ｒ_14a、Ｒ_14b、Ｒ_15a、Ｒ_15b、Ｒ₁₆、Ｒ₁₇、Ｒ₁₈、及びＲ₁₉は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、置換－（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、アリール、置換アリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、又はスルホキシである。

【0014】

いくつかの実施態様において、Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、又はＰである。いくつかの実施態様において、各Ｒ₂₀及びＲ₂₁は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、又はスルホキシである。

【0015】

いくつかの実施態様において、各Ｚ'及びＺ”は、独立して、０、１、又は２で表される整数である。いくつかの実施態様において、各ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、独立して、０、１、２、３、４、又は５で表される整数である。

【0016】

様々な実施態様において、ｍＲＮＡ分子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。

【0017】

いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、以下の構造を有する化合物である：

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【0018】

いくつかの実施態様において、各Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、及びＲ₅は、独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、又はエステルである。

【0019】

いくつかの実施態様において、各ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑは、独立して、０～２５の整数である。いくつかの実施態様において、各ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、独立して、０、１、２；３、４、又は５で表される整数である。

【0020】

いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、以下の構造を有する化合物である：

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【0021】

いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の構造を有する化合物はイオン化可能脂質である。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ分子は、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入されている。

【0022】

いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、式（Ｉ）の構造を有する化合物又はその塩を約１ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、式（Ｉ）の構造を有する化合物又はその塩を約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。

【0023】

いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも１種のヘルパー脂質をさらに含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも１種のヘルパー脂質を約０．０１ｍｏｌ％～約９９．９ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも１種のヘルパー脂質を約０．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。

【0024】

いくつかの実施態様において、ヘルパー脂質は、リン脂質、コレステロール脂質、ポリマー、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0025】

いくつかの実施態様において、リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）又はその誘導体、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）又はその誘導体、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）又はその誘導体、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）又はその誘導体、又はこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、リン脂質を約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。

【0026】

いくつかの実施態様において、コレステロール脂質はコレステロール又はその誘導体である。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、コレステロール脂質を約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。

【0027】

いくつかの実施態様において、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体である。いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、ポリマーを約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の濃度範囲で含む。

【0028】

いくつかの実施態様において、ＬＮＰは、少なくとも１つの核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。１つの実施態様において、核酸分子は治療薬である。

【0029】

いくつかの実施態様において、核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。いくつかの実施態様において、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、アンタゴミール （antagomir）、アンチセンス分子、ガイドＲＮＡ分子、クリスパー（CRISPR）ガイドＲＮＡ分子、ペプチド、治療用ペプチド、標的化核酸、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0030】

いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは１種以上の抗原をコードする。いくつかの実施態様において、抗原は、少なくとも１つのウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、インフルエンザ抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、又はこれらの任意の組み合わせを含む。

【0031】

いくつかの実施態様において、核酸分子はプロモーター又は調節配列を含む。

【0032】

いくつかの実施態様において、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組み合わせは、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入される。

【0033】

別の態様において、本発明はまた、一部は、本明細書に記載の少なくとも１種のＬＮＰを含む組成物に関する。１つの実施態様において、組成物はワクチンである。

【0034】

別の態様において、本発明はまた、一部は、ＣＡＲをコードする少なくとも１種のｍＲＮＡ分子を、それを必要とする被験体に送達する方法に関する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本明細書に記載の１種以上のＬＮＰ又はその組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を標的に送達する。

【0035】

いくつかの実施態様において、標的は、免疫細胞、Ｔ細胞、常在Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、癌性細胞、疾患又は障害に関連する細胞、疾患又は障害に関連する組織、脳組織、中枢神経系組織、肺組織、頂端表面組織（apical surface tissue）、上皮細胞、内皮細胞、肝臓組織、腸組織、結腸組織、小腸組織、大腸組織、糞便、骨髄、マクロファージ、脾臓組織、筋肉組織、関節組織、腫瘍細胞、病変組織、リンパ節組織、リンパ循環、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0036】

いくつかの実施態様において、この方法は、ＬＮＰ又はその組成物の単回投与を含む。いくつかの実施態様において、この方法は、ＬＮＰ又はその組成物の複数回投与を含む。

【0037】

いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、皮内送達経路、皮下送達経路、筋肉内送達経路、脳室内送達経路、髄腔内送達経路、経口送達経路、静脈内送達経路、気管内送達経路、腹腔内送達経路、子宮内送達経路、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される送達経路によって投与される。

【0038】

いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、少なくとも１種の核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせをさらに含む。

【0039】

いくつかの実施態様において、この方法は、少なくとも、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、インフルエンザ感染、癌、関節炎、心臓病、心血管疾患、神経障害又は疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、胎児性疾患、胎児の発育に影響を与える遺伝性疾患、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種を治療又は予防する。

【0040】

１つの実施態様において、ＬＮＰ組成物はワクチンである。

【0041】

別の態様において、本発明はまた、一部は、ＣＡＲをコードする少なくとも１種のｍＲＮＡ分子、及び少なくとも１種の核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの任意の組合わせを、それを必要とする被験体に送達する方法に関する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本明細書に記載の１種以上のＬＮＰ又はその組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、ｍＲＮＡ分子及び核酸分子、アジュバント、治療薬、又はこれらの組み合わせを、標的に送達する。すなわち、様々な実施態様において、この方法は遺伝子送達方法である。

【0042】

別の態様において、本発明はまた、一部は、それを必要とする被験体の疾患又は障害を予防又は治療する方法に関する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本発明に記載の１種以上のＬＮＰ又はその組成物を被験体に投与することを含む。
本発明の好適な実施態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、本発明で現在好適とされる実施態様が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施態様の正確な構成及び手段に限定されないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】図１Ａ～図１Ｃを含む図１は、ＬＮＰ製剤及びＣＡＲ ｍＲＮＡを充填したＬＮＰの概略図を示す。図１Ａは、マイクロ流体混合によってＬＮＰを生成するために使用される構成要素の概略図と、結果として得られるＬＮＰの予想される構造を示す。図１Ｂは、動的光散乱を使用して直径が約７０ｎｍであることを示すＣ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）ＬＮＰの代表的な試料のサイズ（ｚ平均）分布を示す。エラーバーは、３つの試料の標準偏差を表す。図１Ｃは、Ｔ細胞中でＣＡＲ発現を誘導し、腫瘍細胞を標的化して癌性細胞を排除するＣＡＲ ｍＲＮＡを充填したＬＮＰの略図を示す。

【図2】図２Ａ～図２Ｃを含む図２は、この試験でスクリーニングされた脂質のライブラリーを作成するために使用される、代表的なエポキシド末端アルキル鎖と代表的なポリアミンコアとを示す。脂質はマイケル（Michael）付加化学によって作成された。本明細書に記載の発明は、この図で名前が付けられているＣ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）である。図２Ａは、イオン化可能脂質ライブラリーを生成するために使用される脂質テールの代表的な構造を示す。図２Ｂは、イオン化可能脂質ライブラリーを生成するために使用されるアミンコアの代表的な構造を示す。図２Ｃは、過剰な脂質テールをアミンコアと反応させてイオン化可能脂質を合成するために使用される、マイケル付加反応化学の概略図を示す。

【図3】図３Ａ～図３Ｅを含む図３は、さまざまな条件下での代表的なルシフェラーゼ発現を示す。バックグラウンドを差し引いた未処理の細胞に対して正規化された結果。図３Ｂ、図３Ｄ、及び図３Ｅの場合、ｎ＝３。図３Ａは、３０ｎｇ／６０，０００細胞の用量のＬＮＰライブラリーとリポフェクタミンで４８時間処理した後の、ジャーカット細胞の代表的なルシフェラーゼ発現を示し、ＬＮＰが最高性能であることを示している。結果は未処理の細胞に対して正規化され、バックグラウンドを差し引いた。リポフェクタミンに対する対応のあるスチューデントＴ検定で ^*＝ｐ＜０．０５、ｎ＝４。図３Ｂは、最高のＬＮＰ製剤を決定するために、５つの上位性能ＬＮＰ製剤で処理されたジャーカット細胞の代表的なルシフェラーゼ発現を示す。結果は未処理の細胞に対して正規化され、バックグラウンドを差し引いた。Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）と他の各製剤との間のテューキーの多重比較検定（Tukey's multiple comparison test）において ^*＝ｐ＜０．０５。図３Ｃは、５つの上位性能ＬＮＰ製剤の代表的な直径（ｚ平均）、多分散度指数、及びｍＲＮＡ濃度（±標準偏差）を記載している表を示す。図３Ｄは、３０ｎｇ／６０，０００細胞のＣ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）で２４時間処理されたジャーカット細胞における経時的なルシフェラーゼ発現が、タンパク質の一過性発現を確認したことを示す。結果は２４時間での発現に対して正規化され、バックグラウンドを差し引かれた。図３Ｅは、リポフェクタミン又はＣ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）を使用して３０ｎｇ ｍＲＮＡ／６０，０００細胞で４８時間処理したジャーカット細胞の代表的な生存率を示し、Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）ＬＮＰに関連する毒性が最小であることを示す。

【図4】図４Ａ～図４Ｃを含む図４は、さまざまな条件下での代表的なルシフェラーゼ発現を示す。図４Ａ及び図４Ｃの場合、ルシフェラーゼ発現は最も低い処理（７５ｎｇ／６０，０００細胞）に正規化され、生存率はバックグラウンドを差し引いた無処理に正規化された。ｎ＝３。図４Ａは、粗Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）ＬＮＰで２４時間処理された初代Ｔ細胞の代表的なルシフェラーゼ発現と生存率を示す。図４Ｂは、ルシフェラーゼｍＲＮＡを封入した粗及び精製Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）ＬＮＰについて、ＬＮＰ ｐＫａを決定するためのＴＮＳアッセイの代表的な結果を示す。ｐＫａは、最大ＴＮＳ蛍光値の半分に対応するｐＨとして計算された。図４Ｃは、粗又は精製Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）で処理された初代Ｔ細胞の代表的なルシフェラーゼ発現と生存率を示し、毒性の増加なしでルシフェラーゼ発現が増加したことを示す。対応のあるスチューデントのＴ検定で ^*＝ｐ＜０．０５。

【図5】図５Ａ～図５Ｄを含む図５は、ＣＡＲ Ｔ細胞の代表的な結果を示す。図５Ａは、フローサイトメトリーを使用して評価された初代Ｔ細胞でのＣＡＲの表面発現が、純粋なＣ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）及びＥＰ処理群では、粗Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）と比較して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として評価された発現の増加を明らかにしたことを示す代表的な結果を示している。図５Ｂは、未処理対照に対して正規化された代表的なＭＦＩ値の比較を示す。図５Ｃは、バックグラウンドを差し引いた処理に対して正規化された各群で処理された初代Ｔ細胞の代表的な生存率を示す（ｎ＝３）。図５Ｄは、さまざまなエフェクター対標的比でＮａｌｍ６及びＣＡＲ Ｔ細胞を４８時間、同時プレーティングした代表的な結果を示す。ｎ＝３ウェル。

【図6】図６は、イオン化可能脂質ライブラリーを生成するために使用されるアミンコアの代表的な名前付き構造を示す。

【図7】図７は、各ＬＮＰ製剤の代表的な直径（ｚ平均）、ＰＤＩ、及びｍＲＮＡ濃度を示しており、ＬＮＰ製剤全体でのＬＮＰサイズ、単分散性、及び同様のｍＲＮＡ負荷の範囲が狭いことを示す。

【図8】ルシフェラーゼｍＲＮＡを封入した粗及び精製Ｃ１４－４（Ｃ１４－４９４とも呼ばれる）ＬＮＰの特性の代表的な比較を示す。平均ｎ＝３＋と±標準偏差。

【図9】図９Ａと図９Ｂを含む図９は、スクリーニングされた異なるモル比％を有する代表的なライブラリーＡ製剤と、イオン化可能脂質（例えばＣ１４－４９４）がＬＮＰに組み込まれても、まだすべてイオン化可能であることを示すデータとを示す。本試験では「Ｓ２」製剤を賦形剤の標準Ｃ１４－４９４製剤として設定した。図９Ａは、代表的なライブラリーＡ製剤の代表的な製造パラメーターをモル比で表したものである。図９Ｂは、ライブラリーＡ製剤の代表的なｐＫａ比を示す。ＴＮＳアッセイを使用したライブラリーＡのｐＫａは、すべてがまだイオン化可能であることを示した

【図10】図１０は、モル比％が異なる代表的なライブラリーＡ製剤の代表的な製造パラメーターを示す。これらの代表的な製剤の選択は、ライブラリーＡのスクリーニングの結果に基づいて選択された。

【図11】図１１は、両方のライブラリーの代表的な正規化され送達有効性を示す。１より大きい値（破線）は、陽性対照よりも送達有効性が向上していることを示す。

【図12】図１２は、ライブラリーＡ製剤の代表的な正規化された細胞生存率を示す。破線は１００％の生存率を示す。

【図13】図１３は、ライブラリーＢ製剤の代表的な正規化された細胞生存率を示す。破線は１００％の生存率を示す。

【図14】図１４Ａ及び図１４Ｂを含む図１４は、賦形剤組成物の代表的なｍＲＮＡ送達及び生存率を示す：インビトロのライブラリー。ジャーカットは３０ｎｇ／６０，００００細胞で２４時間処理された。ライブラリーＡは、比較のためにオレンジ色で示され、ライブラリーＢは青色で示されている。図１４Ａは、代表的なｍＲＮＡ送達賦形剤組成物を示す：インビトロのライブラリー。図１４Ｂは、代表的な生存率送達賦形剤組成物を示す：インビトロのライブラリー。

【図15】図１４は、Ｂ１０とリポフェクタミンについての相対的なルシフェラーゼ活性を示す代表的な結果を示す。

【図16】図１６Ａ及び図１６Ｂを含む図１６は、さまざまな濃度／用量のさまざまな代表的な製剤について代表的な発光（luminescence）と生存率の結果を示す。ジャーカットは、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを用いて２４時間処理された（「Ｓ２」製剤は、賦形剤の標準的なＣ１４－４９４製剤として設定された）。^*発光及び毒性について０ｎｇに対して正規化された－すべての処理群について図１６Ａ及び図１６Ｂにグラフ化された値は、未処理群に対して正規化された値である。より詳しくは、各処理群の発光及び毒性の読み値は、発光の尺度であった。各処理の生の値（発光）を、処理を行わなかった細胞群で測定された生の値（発光）で割った。従って、グラフ化された値は、未処理の細胞と比較した送達又は毒性を表す。このため、実験ごとに異なるバックグラウンド発光を要因として取り除くことができた。さらに、この実験は、３つの別々のジャーカット細胞集団／継代で３つの別々の時間に完了し（３つの生物学的繰り返し）、各実験で、細胞を３つのウェルにプレーティングした（３つの技術的繰り返し）。従って、結果が再現可能（生物学的繰り返し）で信頼性が高い（技術的繰り返し）ことを保証している。図１６Ａは、さまざまな濃度のさまざまな代表的な製剤の代表的な発光の結果を示す。図１６Ｂは、さまざまな濃度のさまざまな代表的な製剤の代表的な生存率の結果を示す。

【図17】図１７Ａ～図１７Ｃを含む図１７は、代表的な賦形剤組成物を示す：患者Ａ、患者Ｂ、及び患者Ｃについてエクスビボ。図１７Ａは、代表的な賦形剤組成物を示す：患者Ａについてエクスビボ。図１７Ｂは、代表的な賦形剤組成物を示す：患者Ｂについてエクスビボ。図１７Ｃは、代表的な賦形剤組成物を示す：患者Ｃについてエクスビボ。

【発明を実施するための形態】

【0044】

詳細な説明
本発明は、様々な標的（例えば細胞）へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡの送達のための、脂質及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又はこれらの組成物に関する。様々な実施態様において、本発明は、少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物を使用して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ、並びに様々な核酸分子、アジュバント、及び／又は治療薬を様々な標的（例えば細胞）に送達する方法に関する。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、少なくとも１種のイオン化可能脂質、及び少なくとも１種のヘルパー脂質を含む。特定の実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体における様々な疾患又は障害を予防又は治療するための、少なくとも１種のイオン化可能脂質とＣＡＲをコードする少なくとも１種のｍＲＮＡ分子とを含むＬＮＰ又はその組成物を提供する。

【0045】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。

【0046】

本明細書で使用される以下の各用語は、このセクションでそれに関連する意味を有する。

【0047】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例えば「要素」とは、１つの要素又は複数の要素を意味する。

【0048】

量、持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」は、指定された値からの±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味するが、そのような変動は、開示された方法を実行するのに適切であるためである。

【0049】

「アルキル」は、炭素原子及び水素原子のみからなる直鎖又は分岐炭化水素鎖ラジカルを指し、これは飽和又は不飽和（すなわち、１つ以上の二重及び／又は三重結合を含む）であり、１～２４個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₂₄アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₈アルキル）、又は１～６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₆アルキル）を有し、これは分子の残りの部分に単一結合により結合しており、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソプロピル）、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）、３－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、エテニル、プロップ－１－エニル、ブト－１－エニル、ペント－１－エニル、ペンタ－１，４－ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどである。特に他に明記しない限り、アルキル基は任意選択的に置換される。「アルキル」という用語は、それ自体で、又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、指定された炭素原子の数を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味し（すなわち、Ｃ_1-6は１～６個の炭素原子を意味する）、直鎖、分枝鎖、又は環状置換基を含む。

【0050】

本明細書で使用される「置換アルキル」という用語は、上記で定義されるように、ハロゲン、－ＯＨ、アルコキシ、－ＮＨ₂、－Ｎ（ＣＨ₃）₂、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、トリフルオロメチル、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ₁－Ｃ₄）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ₂、－ＳＯ₂ＮＨ₂、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ₂、及び－ＮＯ₂からなる群から選択される１、２、又は３つの置換基、好ましくはハロゲン、－ＯＨ、アルコキシ、－ＮＨ₂、トリフルオロメチル、－Ｎ（ＣＨ₃）₂、及び－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、より好ましくは、ハロゲン、アルコキシ及び－ＯＨから選択される置換基から選択される１つ又は２つの置換基、により置換されたアルキルを意味する。置換アルキルの例には、特に限定されるものではないが、２，２－ジフルオロプロピル、２－カルボキシシクロペンチル、及び３－クロロプロピルが含まれる。

【0051】

「アルキレン」又は「アルキレン鎖」は、分子の残りの部分を、炭素と水素のみからなるラジカル基に連結する直鎖又は分岐二価炭化水素鎖を指し、このラジカル基は、飽和又は不飽和（すなわち、１つ以上の二重結合（アルケニレン）及び／又は三重結合（アルキニレン）を含む）であり、例えば１～２４個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₂₄アルキレン）、１～１５個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₅アルキレン）、１～１２個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキレン）、１～８個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₈アルキレン）、１～６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₆アルキレン）、２～４個の炭素原子（Ｃ₂－Ｃ₄アルキレン）、１～２個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₂アルキレン）、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどを有する。アルキレン鎖は、単結合又は二重結合を介して分子の残りの部分に結合し、単結合又は二重結合を介してラジカル基に結合している。分子の残りの部分及びラジカル基へのアルキレン鎖の結合点は、鎖内の１つの炭素又は任意の２つの炭素を介することができる。本明細書で特に明記しない限り、アルキレン鎖は任意選択的に置換され得る。

【0052】

「シクロアルキル」又は「炭素環式環」は、炭素原子と水素原子のみからなる安定な非芳香族単環式又は多環式炭化水素ラジカルを指し、これは、３～１５個の炭素原子、好ましくは３～１０個の炭素原子を有する縮合又は架橋環系が含むことができ、及びこれは飽和又は不飽和であり、単結合によって分子の残りの部分に結合している。単環式ラジカルには、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。多環式ラジカルには、例えばアダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７－ジメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタニルなどが含まれる。特に明記しない限り、シクロアルキル基は任意選択的に置換される。

【0053】

「シクロアルキレン」は二価のシクロアルキル基である。本明細書で特に明記しない限り、シクロアルキレン基は、任意選択的に置換することができる。

【0054】

本明細書で使用される「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、記載された数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳからなる群から選択される１つ又は２つのヘテロ原子とからなる安定な直鎖又は分岐鎖アルキル基を意味し、ここで、窒素及び硫黄原子は任意選択的に酸化され得、窒素ヘテロ原子は任意選択的に四級化され得る。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の残りの部分とそれが結合している断片との間、及びヘテロアルキル基の最も遠位の炭素原子に結合しているものを含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置することができる。例としては、－Ｏ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₃、－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＯＨ、－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＮＨ－ＣＨ₃、－ＣＨ₂－Ｓ－ＣＨ₂－ＣＨ₃、及び－ＣＨ₂ＣＨ₂－Ｓ（＝Ｏ）－ＣＨ₃が含まれる。例えば、－ＣＨ₂－ＮＨ－ＯＣＨ₃又は－ＣＨ₂－ＣＨ₂－Ｓ－Ｓ－ＣＨ₃のように、最大２つのヘテロ原子が連続している場合がある。

【0055】

「ヘテロシクリル」又は「複素環」は、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択される１～６個のヘテロ原子とからなる安定な３～１８員の非芳香族環ラジカルを指す。本明細書で特に明記しない限り、ヘテロシクリルラジカルは、単環式、二環式、三環式、又は四環式環系であり得、これは、縮合又は架橋環系が含むことができ；及びヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素、又は硫黄原子は、任意選択的に酸化され得；及び窒素原子は任意選択的に四級化することができ；及びヘテロシクリルラジカルは部分的又は完全に飽和されていてもよい。そのようなヘテロシクリルラジカルの例には、特に限定されるものではないが、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソ－チオモルホリニル、及び１，１－ジオキソ－チオモルホリニルが含まれる。特に明記しない限り、ヘテロシクリル基は任意選択的に置換され得る。

【0056】

本明細書で使用される「芳香族」という用語は、１つ以上の多価不飽和環を有し、芳香族特性を有する、すなわち（４ｎ＋２）個の非局在化π電子を有する炭素環又は複素環を指し、ここで、ｎは整数である

【0057】

本明細書で使用される「アリール」という用語は、単独で又は他の用語と組み合わせて使用され、特に明記しない限り、１つ以上の環（典型的には１つ、２つ又は３つの環）を含む炭素環式芳香族系を意味し、ここで、そのような環はぶら下がって結合され得（例えばビフェニル）、又は縮合され得る（例えばナフタレン）。例としては、フェニル、アントラシル、ナフチルが含まれる。好ましいのはフェニル及びナフチルであり、最も好ましいのはフェニルである。

【0058】

本明細書で使用される「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、及びＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むアリール基を指し；ここで、窒素及び硫黄原子は任意選択的に酸化され得、窒素原子は任意選択的に四級化され得る。ヘテロアリール基は、置換又は非置換であり得る。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和している１つ以上の環を含み得る。例としては、テトラヒドロキノリン、２，３－ジヒドロベンゾフリル、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンズイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが含まれる。

【0059】

非芳香族複素環の例には、単環式基、例えばアジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリン、ピラゾリジン、ジオキソラン、スルホラン、２，３－ジヒドロフラン、２，５－ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、チオファン、ピペリジン、１，２，３，６－テトラヒドロピリジン、１，４－ジヒドロピリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ピラン、２，３－ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキサン、ホモピペラジン、ホモピペリジン、１，３－ジオキセパン、４，７－ジヒドロ－１，３－ジオキセピン、及びヘキサメチレンオキシドが含まれる。

【0060】

ヘテロアリール基の例には、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（特に２－及び４－ピリミジニル）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（特に２－ピロリル）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（特に３－及び５－ピラゾリル）、イソチアゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、１，３，４－トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、及び１，３，４－オキサジアゾリルが含まれる。

【0061】

多環式複素環の例には、インドリル（特に３－、４－、５－、６－、及び７－インドリル）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（特に１－及び５－イソキノリル）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル、シノリニル、キノキサリニル（特に２－及び５－キノキサリニル）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８－ナフチリジニル、１，４－ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５－ナフチリジニル、ベンゾフリル（特に３－、４－、５－、６－、及び７－ベンゾフリル）、２，３－ジヒドロベンゾフリル、１，２－ベンズイソキサゾリル、ベンゾチエニル（特に３－、４－、５－、６－、及び７－ベンゾチエニル）、ベンゾキサゾリル、ベンゾチアゾリル（特に２－ベンゾチアゾリル及び５－ベンゾチアゾリル）、プリニル、ベンズイミダゾリル（特に２－ベンズイミダゾリル）、ベンズトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル、及びキノリジジニルが含まれる。

【0062】

前述のヘテロシクリル及びヘテロアリール部分のリストは代表的なものであり、限定的ではないことを意図している。

【0063】

本明細書で使用される「アミノアリール」という用語は、アミノ部分を含むアリール部分を指す。このようなアミノ部分は、特に限定されるものではないが、一級アミン、二級アミン、三級アミン、マスクされたアミン、又は保護されたアミンが含み得る。そのような三級アミン、マスクされたアミン、又は保護されたアミンは、一級アミン又は二級アミン部分に変換され得る。さらにアミン部分は、特に限定されるものではないが、化学反応性を含むアミン部分と同様の化学的特性を有するアミン様部分を含み得る。

【0064】

本明細書で使用される「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、及び「アルキルチオ」という用語は、これらの通常の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、硫黄原子を介して分子に連結されたアルキル基を指す。

【0065】

本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、単独で又は他の用語と組み合わせて使用され、特に明記しない限り、酸素原子を介して分子の残りの部分に接続された、上記で定義された指定数の炭素原子を有するアルキル基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ（イソプロポキシ）、及びより高い同族体及び異性体がある。（Ｃ₁－Ｃ₃）アルコキシ、特にエトキシ及びメトキシが好ましい。

【0066】

本明細書で使用される「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子、好ましくはフッ素、塩素、又は臭素、より好ましくはフッ素又は塩素を意味する。

【0067】

本明細書で使用される「置換された」という用語は、少なくとも１つの水素原子が、水素ではない原子、例えば、特に限定されるものではないが：ハロゲン原子、例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ；オキソ基（＝Ｏ）；ヒドロキシル基（－ＯＨ）；アルコキシ基（－ＯＲ^a、ここでＲ^aはＣ₁－Ｃ₁₂アルキル又はシクロアルキルである）；カルボキシル基（－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^a又は－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^a、ここでＲ^aはＨ、Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル、又はシクロアルキルである）；アミン基（－ＮＲ^aＲ^b、ここでＲ^aとＲ^bはそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル、又はシクロアルキルである）；Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル基；及びシクロアルキル基への結合によって置換されている、上記の基（例えば、アルキル、シクロアルキル、又はヘテロシクリル）のいずれかを意味する。いくつかの実施態様において、置換基は、Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル基である。別の実施態様において、置換基はシクロアルキル基である。別の実施態様において、置換基は、フルオロなどのハロ基である。別の実施態様において、置換基はオキソ基である。別の実施態様において、置換基はヒドロキシル基である。別の実施態様において、置換基はアルコキシ基である。別の実施態様において、置換基はカルボキシル基である。別の実施態様において、置換基はアミン基である。

【0068】

本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、ナノメートルスケール、１マイクロメートル未満の粒子サイズを有する粒子を指す。例えば、ナノ粒子は約５０ｎｍまでの粒子サイズを有し得る。別の例では、ナノ粒子は約１０ｎｍまでの粒子サイズを有し得る。別の例では、ナノ粒子は約６ｎｍまでの粒子サイズを有し得る。本明細書で使用される「ナノ粒子」は、特に限定されるものではないが、ナノクラスター、ナノベシクル、ミセル、ラメラ形状の粒子、ポリマーソーム、デンドリマー、及び当業者に公知の様々な他の小製品の他のナノサイズ粒子を含む、多くのナノ粒子を指す。ナノ粒子の形状と組成は、球、ロッド、ワイヤー、ディスク、ケージ、コアシェル構造、及び他の多くの形状を生成するように、特定の結晶面の成長を選択的に促進することにより、原子の凝縮中に誘導され得る。ナノカプセルの範囲内にある実体の定義及び理解は、当業者に公知であり、そのような定義は、参照により、及び本出願の主題の一般的な性質を理解する目的で、本明細書に組み込まれる。

【0069】

本明細書で使用される「核酸」は、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドで構成されているかどうか、及びホスホジエステル結合、又はホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、又はスルホン結合、及びそのような結合の組み合わせなどの修飾結合で構成されているかどうかにかかわらず、任意の核酸を含むことを意味する。核酸という用語はまた、生物学的に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸も具体的に含む。「核酸」という用語は、通常、大きなポリヌクレオチドを指す。

【0070】

「単離された」とは、自然の状態から変化又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形で存在することができるか、又は、例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。

【0071】

「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離された核酸セグメント又は断片、すなわち、通常はその断片に隣接する配列、すなわちそれが自然に存在するゲノム内の断片に隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。この用語はまた、核酸、すなわちＲＮＡ又はＤＮＡ、又はタンパク質に自然に付随する、細胞内でそれに自然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸にも適用される。従ってこの用語は、例えば、ベクターに、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルスに、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡに組み込まれるか、又は、他の配列とは無関係に別個の分子として（すなわち、ＰＣＲ又は制限酵素消化によって生成されたｃＤＮＡ、又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡ又はＲＮＡを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡ又はＲＮＡも含む。

【0072】

ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と一致するか、又は停止コドンをコードする、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。従ってコード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質輸出シグナル配列中のアミノ酸残基）のコドンを含むヌクレオチド残基を含み得る。

【0073】

本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。

【0074】

本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸として定義される。

【0075】

「コードする」とは、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又は定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける、他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、及びそれから生じる生物学的特性を指す。従って、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列リストに記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると言うことができる。

【0076】

「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって又はインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、当技術分野で公知のすべてのもの、例えばコスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含まれた）ＲＮＡ、及び組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などが含まれる。

【0077】

「相同」とは、２つのポリペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、［（２つの配列が共有する一致する位置又は相同位置の数）／（比較された位置の数）］×１００という関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有している。一般に、比較は、２つの配列が整列されたて最大の相同性を与えるときに行われる。

【0078】

「免疫原」とは、免疫応答を生成するために体内に導入される任意の物質を指す。その物質は、タンパク質などの物理的な分子でも、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスなどのベクターによってコードされてもよい。

【0079】

本発明の文脈において、一般的に存在するヌクレオシド（Ｎ－グリコシド結合を介してリボース又はデオキシリボース糖に結合した核酸塩基）について以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシチジン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。

【0080】

特に他に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という用語はまた、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含み得る程度に、イントロンを含み得る。

【0081】

特に他に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。さらに、ヌクレオチド配列は、細胞内の翻訳機構によって翻訳され得る修飾ヌクレオシドを含み得る。

【0082】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。従って、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解して単量体の「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有するている。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用されるポリヌクレオチドには、特に限定されるものではないが、組換え手段、すなわち組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、通常のクローニング技術、及びＰＣＲ（商標）などを使用して、及び合成手段を含む当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれる。

【0083】

特定の例において、本発明のポリヌクレオチド又は核酸は「核酸」であり、これは少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む核酸を指す。「修飾ヌクレオシド」とは、修飾を有するヌクレオシドを指す。例えばＲＮＡでは、１００を超える異なるヌクレオシド修飾が特定されている（Rozenski, et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197）。

【0084】

本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質又はペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用されるこの用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指し、タンパク質には多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はこれらの組み合わせが含まれる。

【0085】

本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ法を使用することによって生成されるポリペプチドとして定義される。

【0086】

本明細書で使用される「組換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源からＤＮＡの断片を結合することによって生成されるＤＮＡとして定義される。

【0087】

本明細書で使用される「組換えＲＮＡ」という用語は、異なる供給源からＲＮＡの断片 を結合することによって生成されるＲＮＡとして定義される。

【0088】

本明細書で使用される「同一」という用語は、同一である２つ以上の配列又は部分配列を指す。

【0089】

さらに、本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、比較ウィンドウ、又は比較アルゴリズム又は手動アライメントと目視検査により指定された領域上で、最大の対応のために比較及び整列されたときに同じである連続単位のあるパーセントを有する２つ以上の配列を指す。ほんの一例として、指定された領域で連続する単位が約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、又は約９５％同一である場合、２つ以上の配列は「実質的に同一」であり得る。そのようなパーセントは、２つ以上の配列の「パーセント同一性」を説明する。配列の同一性は、少なくとも約７５～１００連続単位の長さの領域、約５０連続単位の長さの領域、又は指定されていない場合は配列全体にわたって存在する可能性がある。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。

【0090】

本明細書で使用される用語「変種（variant）」は、それぞれ参照核酸配列又はペプチド配列とは配列が異なるが、参照分子の本質的な生物学的特性を保持する核酸配列又はペプチド配列である。核酸変種の配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えないかもしれないし、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び末端切断をもたらすかもしれない。ペプチド変種の配列の変化は、通常、限定的又は保存的であるため、参照ペプチドと変種の配列は全体的に非常に類似しており、多くの領域において同一である。変種及び参照ペプチドは、任意の組み合わせにおける１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なる可能性がある。核酸又はペプチドの変種は、対立遺伝子変種などの天然に存在するものであり得るか、又は天然に存在することが知られていない変種であり得る。天然に存在しない核酸及びペプチドの変種は、突然変異誘発技術又は直接合成によって作製することができる。様々な実施態様において、変種配列は参照配列と、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８９％、少なくとも８８％、少なくとも８７％、少なくとも８６％、少なくとも８５％同一である。

【0091】

本明細書で使用される「断片」は、その標的、すなわち抗原結合領域に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。免疫グロブリンの定常領域のいくつかが含まれ得る。

【0092】

本明細書で使用される「結合」という用語は、リンカーの官能基と別の分子との間の化学反応から形成される結合又は化学部分を指す。そのような結合には、特に限定されるものではないが、共有結合及び非共有結合が含まれ得るが、そのような化学部分には、特に限定されるものではないが、エステル、炭酸塩、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド結合、及びオリゴヌクレオチド結合が含まれ得る。加水分解的に安定な結合とは、結合が水中で実質的に安定であり、特に限定されるものではないが、おそらく無期限でさえある長期間、生理学的条件下を含む有用なｐＨ値で、水と反応しないことを意味する。加水分解的に不安定又は分解性の結合は、結合が水中又は例えば血液を含む水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定又は分解可能な結合は、結合が１つ以上の酵素によって分解される可能性があることを意味する。ほんの一例として、ＰＥＧ及び関連するポリマーは、ポリマー主鎖中に、又はポリマー主鎖とポリマー分子の１つ以上の末端官能基との間のリンカー基中に分解性結合を含み得る。このような分解性結合には、特に限定されるものではないが、ＰＥＧカルボン酸又は活性化ＰＥＧカルボン酸と、生物学的活性物質上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合が含まれ、このようなエステル基は生理学的条件下で加水分解されて、生物学的活性物質を放出する。他の加水分解性結合には、特に限定されるものではないが、炭酸塩結合；アミンとアルデヒドの反応から生じるイミン結合；アルコールとリン酸基の反応によって形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステル結合；特に限定されるものではないが、ＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基及びペプチドのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合；特に限定されるものではないが、ポリマーの末端にあるホスホルアミダイト基、及びオリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれる。

【0093】

本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、タンパク質又は機能的ＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ）をコードする核酸分子を指す。遺伝子は、５'又は３'非翻訳領域、イントロン、リボソーム結合部位、プロモーター又はエンハンサー領域、又は他の関連及び／又は調節配列領域などの最終的なタンパク質又はＲＮＡ産物をコードしない領域を含むことができる。

【0094】

「遺伝子発現」及び「発現」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ＤＮＡ配列などの遺伝子からの遺伝可能な情報が、タンパク質又はＲＮＡなどの機能的遺伝子産物にされるプロセスを指す。

【0095】

本明細書で使用される「プロモーター」又は「調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの例ではこの配列はコアプロモーター配列であり得、他の例ではこの配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば組織特異的な方法で遺伝子産物を発現するものであり得る。

【0096】

「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列は隣接しており、必要な場合、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合させる。

【0097】

抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の他の種からのその抗原に結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体が抗体の特異的分類を変えることはない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、異なる対立遺伝子型の抗原にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性は、それ自体が抗体の特異的分類を変えることはない。場合によっては「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、その相互作用が、化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体はタンパク質一般にではなく、特定のタンパク質構造を認識し結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体を含む反応において、エピトープＡ（又は遊離の非標識Ａ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識Ａの量が減少する。

【0098】

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は代わりに「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義する刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。１つの態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。１つの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義されるように、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。１つの態様において、共刺激分子は、４ １ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ３、及び／又はＣＤ２８から選択される。１つの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ融合タンパク質を含む。１つの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ融合タンパク質を含む。１つの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ融合タンパク質を含む。１つの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、を含むキメラ融合タンパク質を含む。１つの態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。１つの態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、ここでリーダー配列は、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に、任意選択的にｓｃＦｖドメインから切断される。

【0099】

抗体又はその抗体断片を含むＣＡＲ組成物の一部は、抗原結合ドメインが、例えば単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びヒト化抗体を含む隣接するポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。１つの態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは抗体断片を含む。１つの実施態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。

【0100】

本明細書で使用される「抗原」又は「Ａｇ」という用語は、適応免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、又は特定の免疫原性コンピテント細胞の活性化、あるいはその両方を含む場合がある。熟練した技術者は、事実上すべてのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換え又はゲノムのＤＮＡ又はＲＮＡに由来する可能性がある。熟練した技術者は、適応免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡ又はＲＮＡが、従って、その用語が本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに当業者は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみ抗原がコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、特に限定されるものではないが、複数の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、及びこれらのヌクレオチド配列が様々な組み合わせで配置されて所望の免疫応答を誘導することは、容易に明らかである。さらに当業者は、抗原が「遺伝子」によってコード化される必要が全くないことを理解するであろう。抗原を合成して生成することができるか、又は生物学的試料から誘導することができることは容易に明らかである。そのような生物学的試料には、特に限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞、又は生体液が含まれ得る。

【0101】

本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、抗原特異的適応免疫応答を増強する任意の分子として定義される。

【0102】

「疾患」とは、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことである。

【0103】

対照的に動物の「障害」は、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、動物の健康状態は、障害がない場合よりも好ましくないものである。治療せずに放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるわけではない。

【0104】

本明細書で使用される「癌」は、細胞の異常な増殖又は分裂を指す。一般に、癌細胞の増殖及び／又は寿命は、その周囲の正常な細胞及び組織の増殖及び／又は寿命を超えており、協調していない。癌は、良性、前悪性、又は悪性の可能性がある。癌は、口腔（例えば口、舌、咽頭など）、消化器系（例えば食道、胃、小腸、結腸、直腸、肝臓、胆管、膀胱、膵臓など）、呼吸器系（例えば喉頭、肺、気管支など）、骨、関節、皮膚（例えば基底細胞、扁平上皮細胞、髄膜腫など）、乳房、生殖器系（例えば子宮、卵巣、前立腺、精巣など）、泌尿器系（例えば膀胱、腎臓、尿管など）、目、神経系（例えば脳など）、内分泌系（例えば甲状腺など）、及び造血系（例えばリンパ腫、骨髄腫、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病など）を含むさまざまな細胞や組織で発生する、

【0105】

本明細書で使用される「有効量」は、治療的又は予防的利益を提供する量を意味する。

【0106】

本明細書で使用される「治療的」という用語は、治療及び／又は予防を意味する。治療効果は、疾患又は障害状態の少なくとも１つの兆候又は症状の抑制、減少、寛解、又は根絶によって得られる。

【0107】

「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床家によって求められている組織、システム、又は被験体の生物学的又は医学的応答を誘発する対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されたときに、治療されている障害又は疾患の１つ以上の徴候又は症状の発症を予防するか、又はある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、治療される被験体の疾患及びその重症度、並びに年齢、体重などによって異なる。

【0108】

「患者」、「被験体」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、インビトロ又はインサイチュにかかわらず、本明細書に記載の方法に応答しやすい任意の動物若しくはその細胞又は任意の多細胞生物若しくはその細胞を指す。特定の非限定的な実施態様において、患者、被験体、又は個人はヒトである。特定の非限定的な実施態様において、患者、被験体、又は個人は胎児である。特定の非限定的な実施態様において、患者、被験体、又は個体は胚である。

【0109】

本明細書で使用される「調節する」という用語は、未治療であること以外では同一である被験者の応答のレベルと比較して、被験体における応答のレベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナル又は応答を混乱させ及び／又は影響を及ぼし、それにより、被験体、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。

【0110】

本明細書で使用される用語としての疾患を「治療する」とは、被験体が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。

【0111】

本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、又は形質導入された細胞である。細胞は、１次被験体細胞及びその子孫を含む。

【0112】

本明細書で使用される「転写制御下」又は「作動可能に連結された」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び配向にあることを意味する。

【0113】

「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。特に限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが当技術分野で公知である。従って「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移動を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈すべきである。ウイルスベクターの例には、特に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。

【0114】

「任意選択的な」又は「任意選択的に」（例えば、任意選択的に置換される）とは、その後に記載される事象又は状況が発生する場合と発生しない場合があり、その記載には、前記事象又は状況が発生する場合と、それが発生しない場合とが含まれることを意味する。例えば「任意選択的に置換されたアルキル」は、アルキルラジカルが置換されてもされなくてもよく、その記載が、置換されたアルキルラジカルと置換を持たないアルキルラジカルの両方を含むことを意味する。

【0115】

範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、具体的に開示されたすべての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値を有すると見なすべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などなどの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを具体的に開示していると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0116】

説明
本発明は一部は、新規脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又はその組成物が、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子をＴ細胞に、高い効率と低い毒性で送達するという発見に関する。従って、いくつかの態様において、本発明はまた、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ並びに様々な核酸分子、アジュバント、及び／又は治療薬を様々な標的（例えば細胞、組織など）に、少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物を使用して送達するための方法に関する。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、少なくとも１種のイオン化可能脂質及び少なくとも１種のヘルパー脂質を含む。特定の実施態様において、本発明は、少なくとも１種のＬＮＰ、又は少なくとも１種のｍＲＮＡ分子及び少なくとも１種のＬＮＰを含むその組成物を使用して、それを必要とする被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供する。

【0117】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）とその組成物
本発明は一部は、少なくとも１種のｍＲＮＡ分子と少なくとも１種の脂質を含む新規脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に関する。１つの態様において、本発明は一部は、本発明の少なくとも１種のＬＮＰを含む組成物に関する。従って、様々な態様において本発明は、一部は、少なくとも１種のｍＲＮＡ分子と少なくとも１つの脂質を含む新規のＬＮＰ組成物に関する。

【0118】

様々な実施態様において、脂質はイオン化可能脂質である。様々な実施態様において、脂質は、式（Ｉ）の構造を有する化合物又はその塩である：

【化16】

【0119】

いくつかの実施態様において、Ａ₁は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）、Ｎ、Ｓ、又はＰである。いくつかの実施態様において、Ａ₂は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）、Ｎ、Ｓ、又はＰである。

【0120】

いくつかの実施態様において、Ｌ₁は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、Ｌ₂は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、Ｌ₃は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、Ｌ₄は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、Ｌ₅は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。いくつかの実施態様において、Ｌ₆は、Ｃ、Ｃ（Ｈ）₂、Ｃ（Ｈ）（Ｒ₁₉）、Ｏ、Ｎ（Ｈ）、又はＮ（Ｒ₁₉）である。

【0121】

いくつかの実施態様において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ_3a、Ｒ_3b、Ｒ_4a、Ｒ_4b、Ｒ_5a、Ｒ_5b、Ｒ_6a、Ｒ_6b、Ｒ_7a、Ｒ_7b、Ｒ_8a、Ｒ_8b、Ｒ_9a、Ｒ_9b、Ｒ_10a、Ｒ_10b、Ｒ_11a、Ｒ_11b、Ｒ_12a、Ｒ_12b、Ｒ_13a、Ｒ_13b、Ｒ_14a、Ｒ_14b、Ｒ_15a、Ｒ_15b、Ｒ₁₆、Ｒ₁₇、Ｒ₁₈、又はＲ₁₉は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、置換－（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－シクロアルキニル、アリール、置換アリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、置換－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"－エステル、－Ｙ（Ｒ₂₀）_z'（Ｒ₂₁）_Z"、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、又はスルホキシである。

【0122】

様々な実施態様において、Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、又はＰである。

【0123】

いくつかの実施態様において、Ｒ₂₀又はＲ₂₁は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、エステル、＝Ｏ、－ＮＯ₂、－ＣＮ、又はスルホキシである。

【0124】

いくつかの実施態様において、ｚ'は、０、１、２、又は３で表される整数である。いくつかの実施態様において、ｚ”は、０、１、２、又は３で表される整数である。

【0125】

いくつかの実施態様において、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、又はｘは、０～２５の整数である。様々な実施態様において、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、又はｘは、０、１、２、３、４、又は５で表される整数である。

【0126】

いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、以下の構造を有する化合物である：

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

【化21】

【化22】

【0127】

従って、様々な実施態様において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、又はＲ₅は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシカルボニル、線状アルコキシカルボニル、分岐アルコキシカルボニル、アミド、アミノ、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノアリール、アミノアセテート、アシル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシアリール、アルコキシ、カルボキシル、カルボキシレート、又はエステルである。

【0128】

いくつかの実施態様において、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、又はｑは、０～２５の整数である。いくつかの実施態様において、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、又はｘは、０、１、２、３、４、及び５で表される整数である。

【0129】

いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の構造を有する化合物は、以下の構造を有する化合物である：

【化23】

【化24】

【化25】

【化26】

【化27】

【化28】

【化29】

【化30】

【0130】

様々な実施態様において、ｍＲＮＡ分子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ分子は、式（Ｉ）の構造を有する化合物内に封入される。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ分子は、式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する化合物内に封入される。

【0131】

様々な実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．１ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上の脂質を含む。

【0132】

例えばいくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５．５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１２ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３７ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約６０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約７０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約８０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９０ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９５．５ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９９ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９９．９ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１００ｍｏｌ％の濃度の式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する１種以上の化合物を含む。

【0133】

様々な実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、少なくとも１つのヘルパー化合物をさらに含む。いくつかの実施態様において、ヘルパー化合物は、ヘルパー脂質、ヘルパーポリマー、又はこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、ヘルパー脂質は、リン脂質、コレステロール脂質、ポリマー、カチオン性脂質、中性脂質、荷電脂質、ステロイド、ステロイド類似体、ポリマー結合脂質、安定化脂質、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0134】

様々な実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．０１ｍｏｌ％～約９９．９ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．１ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．１ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５ｍｏｌ％～約９５ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．５ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２．５ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％の濃度範囲の１種以上のヘルパー化合物を含む。

【0135】

例えばいくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．０１ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．１ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約０．５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１．５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２．５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１２ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１６ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約２５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約３７ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４６．５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約４７ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約５０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約６０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約６３ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約７０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約８０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９０ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９５．５ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約９９ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、約１００ｍｏｌ％の濃度の１種以上のヘルパー化合物を含む。

【0136】

いくつかの実施態様において、リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はその誘導体、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）又はその誘導体、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）又はその誘導体、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）又はその誘導体、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）又はその誘導体、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0137】

例えばいくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲のリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲のリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約１０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の濃度範囲のリン脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約１６ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の濃度範囲のリン脂質を含む。

【0138】

いくつかの実施態様において、コレステロール脂質は、コレステロール又はその誘導体である。例えばいくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲のコレステロール脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の濃度範囲のコレステロール脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約２０ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％の濃度範囲のコレステロール脂質を含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約４７ｍｏｌ％の濃度のコレステロール脂質と約１６ｍｏｌ％の濃度のＤＯＰＥを含む。

【0139】

いくつかの実施態様において、ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体である。例えばいくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約０ｍｏｌ％～約１００ｍｏｌ％の濃度範囲のポリマーを含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の濃度範囲のポリマーを含む。いくつかの実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は約０．５ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％の濃度範囲のポリマーを含む。

【0140】

本明細書で使用される「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、又はｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫより低くなるとカチオン性（プロトン化）になるが、より高いｐＨ値で次第により中性になる脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、脂質は負に荷電した核酸と結合することができる。特定の実施態様において、カチオン性脂質は、ｐＨ低下に対して正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。

【0141】

いくつかの実施態様において、カチオン性脂質は、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を帯びるいくつかの脂質種のいずれかを含む。そのような脂質には、特に限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれる。さらに、本発明で使用することができるカチオン性脂質の多くの市販の調製物が利用可能である。これらには、例えばLIPOFECTIN（登録商標）（GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.からのＤＯＴＭＡ及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（GIBCO/BRLからのＮ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；及びTRANSFECTAM（登録商標）（Promega Corp., Madison, Wis.からのエタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）が含まれる。以下の脂質はカチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正電荷を帯びている：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。

【0142】

１つの実施態様において、カチオン性脂質はアミノ脂質である。本発明において有用な適切なアミノ脂質には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものが含まれる。代表的なアミノ脂質には、特に限定されるものではないが、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）が含まれる。

【0143】

「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指す。代表的な中性脂質には、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。

【0144】

例示的な中性脂質には、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）－マレイミド－ＰＥＧ、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）－マレイミド－ＰＥＧ２０００、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、及び１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）が含まれる。１つの実施態様において、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。

【0145】

いくつかの実施態様において、組成物は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質を含む。

【0146】

「ステロイド」は、以下の炭素骨格を含む化合物である：

【化31】

【0147】

特定の実施態様において、ステロイド又はステロイド類似体はコレステロールである。これらの実施態様のいくつかにおいて、カチオン性脂質のモル比。

【0148】

「陰イオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電している脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他の陰イオン性修飾基が含まれる。

【0149】

「ポリマー結合脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を指す。ポリマー結合脂質の例は、ペグ化脂質である。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知であり、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧ）などが含まれる。

【0150】

特定の実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、ポリエチレングリコール－脂質（ペグ化脂質）である追加の安定化脂質を含む。適切なポリエチレングリコール－脂質には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが含まれる。代表的なポリエチレングリコール－脂質には、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及びＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧが含まれる。１つの実施態様において、ポリエチレングリコール－脂質は、Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）₂₀₀₀）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。１つの実施態様において、ポリエチレングリコール－脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。別の実施態様において、ＬＮＰ又はその組成物は、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２'，３'－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメート、又は２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートを含む。

【0151】

特定の実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ又はその組成物中に約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ又はその組成物中に約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ又はその組成物中に約１ｍｏｌ％又は約２．５ｍｏｌ％で存在する。

【0152】

「脂質ナノ粒子」という用語は、１種以上の脂質、例えば式（Ｉ）～（ＸＶ）の脂質を含む、ナノメートルのオーダー（例えば１～１，０００ｎｍ）の少なくとも１つの寸法を有する粒子を指す。

【0153】

様々な実施態様において、ＬＮＰは、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍの平均直径を有する

【0154】

いくつかの実施態様において、本発明のＬＮＰは実質的に無毒である。従って、様々な実施態様において、本発明のＬＮＰ組成物は実質的に無毒である。

【0155】

様々な実施態様において、本明細書に記載されるＬＮＰは、目的の組織に容易に輸送される。例えばいくつかの実施態様において、本明細書に記載される脂質又はＬＮＰは、細胞膜を通って細胞に容易に輸送される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＬＮＰは、細胞膜を通って細胞に効率的に輸送される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＬＮＰは、増強された効率で細胞膜を通って細胞に輸送される。

【0156】

従って、様々な実施態様において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、目的の組織に容易に輸送される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、細胞膜を通って細胞に容易に輸送される。様々な実施態様において、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物は、細胞膜を通って効率的に細胞に輸送される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、細胞膜を通って増強された効率で細胞に輸送される。

【0157】

様々な態様において、本発明の組成物は、１種以上の核酸分子、１種以上のアジュバント、１種以上の治療薬、又はそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施態様において、１種以上の核酸分子、１種以上のアジュバント、１種以上の治療薬、又はそれらの組み合わせは、式（Ｉ）の構造を有する化合物に封入される。いくつかの実施態様において、１種以上の核酸分子、１種以上のアジュバント、１種以上の治療薬、又はそれらの組み合わせは、式（Ｉ）～（ＸＶ）の構造を有する化合物に封入される。いくつかの実施態様において、１種以上の核酸分子、１種以上のアジュバント、１種以上の治療薬、又はそれらの組み合わせは、ＬＮＰに封入される。

【0158】

様々な実施態様において、組成物は１種以上の核酸分子を含む。１つの実施態様において、核酸分子はＤＮＡ分子である。１つの実施態様において、核酸分子はＲＮＡ分子である。いくつかの実施態様において、核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。このような核酸の例には、特に限定されるものではないが、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、アンタゴミール（antagomir）、アンチセンス分子、ガイドＲＮＡ分子、クリスパーガイドＲＮＡ分子、ペプチド、治療用ペプチド、標的化核酸、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0159】

１つの実施態様において、ｍＲＮＡはルシフェラーゼをコードする。

【0160】

様々な実施態様において、核酸分子は治療薬である。いくつかの実施態様において、治療薬は、単離された核酸である。様々な実施態様において、単離された核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。様々な実施態様において、単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンタゴミール、アンチセンス分子、又はクリスパーガイドＲＮＡ分子である。１つの実施態様において、単離された核酸分子は、治療用ペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、治療薬は、標的化核酸を阻害するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、又はアンチセンス分子である。

【0161】

１つの実施態様において、組成物は、プロモーター又は調節配列を含む。１つの実施態様において、核酸は、核酸が核酸の発現を指示することができるように、プロモーター又は調節配列を含む。従って１つの実施態様において、本発明の代謝物ベースのポリマー又はポリマー粒子を含む組成物は、発現ベクターを含み、本発明は、目的の細胞又は組織中の外因性ＤＮＡの同時発現を伴う、目的の細胞又は組織への外因性ＤＮＡの導入のための方法を含む。

【0162】

１つの実施態様において、核酸分子はｍＲＮＡである。１つの実施態様において、組成物はｍＲＮＡを含む。１つの実施態様において、組成物はＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡを含む。様々な実施態様において、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡを含む組成物は、単離されたｍＲＮＡに対する特定の利点を有し、例えば安定性の増加、自然免疫原性の低下又は欠如、及び翻訳の増強を含む。

【0163】

１つの実施態様において、ｍＲＮＡはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。

【0164】

１つの実施態様において、ＲＮＡは修飾されたＲＮＡである。別の実施態様において、本発明の修飾ＲＮＡ中の残基の０．１％～１００％が修飾されている。別の実施態様において、残基の０．１％が修飾されている。別の実施態様において、修飾残基の割合は０．２％である。別の実施態様において、割合は０．３％である。別の実施態様において、割合は０．４％である。別の実施態様において、割合は０．５％である。別の実施態様において、割合は０．６％である。別の実施態様において、割合は０．８％である。別の実施態様において、割合は１％である。別の実施態様において、割合は１．５％である。別の実施態様において、割合は２％である。別の実施態様において、割合は２．５％である。別の実施態様において、割合は３％である。別の実施態様において、割合は４％である。別の実施態様において、割合は５％である。別の実施態様において、割合は６％である。別の実施態様において、割合は８％である。別の実施態様において、割合は１０％である。別の実施態様において、割合は１２％である。別の実施態様において、割合は１４％である。別の実施態様において、割合は１６％である。別の実施態様において、割合は１８％である。別の実施態様において、割合は２０％である。別の実施態様において、割合は２５％である。別の実施態様において、割合は３０％である。別の実施態様において、割合は３５％である。別の実施態様において、割合は４０％である。別の実施態様において、割合は４５％である。別の実施態様において、割合は５０％である。別の実施態様において、割合は６０％である。別の実施態様において、割合は７０％である。別の実施態様において、割合は８０％である。別の実施態様において、割合は９０％である。別の実施態様において、割合は１００％である。

【0165】

別の実施態様において、割合は５％未満である。別の実施態様において、割合は３％未満である。別の実施態様において、割合は１％未満である。別の実施態様において、割合は２％未満である。別の実施態様において、割合は４％未満である。別の実施態様において、割合は６％未満である。別の実施態様において、割合は８％未満である。別の実施態様において、割合は１０％未満である。別の実施態様において、割合は１２％未満である。別の実施態様において、割合は１５％未満である。別の実施態様において、割合は２０％未満である。別の実施態様において、割合は３０％未満である。別の実施態様において、割合は４０％未満である。別の実施態様において、割合は５０％未満である。別の実施態様において、割合は６０％未満である。別の実施態様において、割合は７０％未満である。

【0166】

別の実施態様において、所定のヌクレオシド（すなわち、ウリジン、シチジン、グアノシン、又はアデノシン）の残基の０．１％が修飾されている。別の実施態様において、修飾された所定のヌクレオチドの割合は０．２％である。別の実施態様において、割合は０．３％である。別の実施態様において、割合は０．４％である。別の実施態様において、割合は０．５％である。別の実施態様において、割合は０．６％である。別の実施態様において、割合は０．８％である。別の実施態様において、割合は１％である。別の実施態様において、割合は１．５％である。別の実施態様において、割合は２％である。別の実施態様において、割合は２．５％である。別の実施態様において、割合は３％である。別の実施態様において、割合は４％である。別の実施態様において、割合は５％である。別の実施態様において、割合は６％である。別の実施態様において、割合は８％である。別の実施態様において、割合は１０％である。別の実施態様において、割合は１２％である。別の実施態様において、割合は１４％である。別の実施態様において、割合は１６％である。別の実施態様において、割合は１８％である。別の実施態様において、割合は２０％である。別の実施態様において、割合は２５％である。別の実施態様において、割合は３０％である。別の実施態様において、割合は３５％である。別の実施態様において、割合は４０％である。別の実施態様において、割合は４５％である。別の実施態様において、割合は５０％である。別の実施態様において、割合は６０％である。別の実施態様において、割合は７０％である。別の実施態様において、割合は８０％である。別の実施態様において、割合は９０％である。別の実施態様において、割合は１００％である。

【0167】

別の実施態様において、修飾される所定のヌクレオチドの割合は、８％未満である。別の実施態様において、割合は１０％未満である。別の実施態様において、割合は５％未満である。別の実施態様において、割合は３％未満である。別の実施態様において、割合は１％未満である。別の実施態様において、割合は２％未満である。別の実施態様において、割合は４％未満である。別の実施態様において、割合は６％未満である。別の実施態様において、割合は１２％未満である。別の実施態様において、割合は１５％未満である。別の実施態様において、割合は２０％未満である。別の実施態様において、割合は３０％未満である。別の実施態様において、割合は４０％未満である。別の実施態様において、割合は５０％未満である。別の実施態様において、割合は６０％未満である。別の実施態様において、割合は７０％未満である。

【0168】

別の実施態様において、本発明のＬＮＰに封入されたＲＮＡは、同じ配列を有する単離されたＲＮＡ分子よりも効率的に細胞内で翻訳される。別の実施態様において、ＬＮＰに封入されたＲＮＡは、標的細胞によって翻訳される増強された能力を示す。別の実施態様において、翻訳は、その修飾されていない対応物と比較して２倍増強される。別の実施態様において、翻訳は３倍増強される。別の実施態様において、翻訳は５倍増強される。別の実施態様において、翻訳は７倍増強される。別の実施態様において、翻訳は１０倍増強される。別の実施態様において、翻訳は１５倍増強される。別の実施態様において、翻訳は２０倍増強される。別の実施態様において、翻訳は５０倍増強される。別の実施態様において、翻訳は１００倍増強される。別の実施態様において、翻訳は２００倍増強される。別の実施態様において、翻訳は５００倍増強される。別の実施態様において、翻訳は１０００倍増強される。別の実施態様において、翻訳は２０００倍増強される。別の実施態様において、係数は１０～１０００倍である。別の実施態様において、係数は１０～１００倍である。別の実施態様において、係数は１０～２００倍である。別の実施態様において、係数は１０～３００倍である。別の実施態様において、係数は１０～５００倍である。別の実施態様において、係数は２０～１０００倍である。別の実施態様において、係数は３０～１０００倍である。別の実施態様において、係数は５０～１０００倍である。別の実施態様において、係数は１００～１０００倍である。別の実施態様において、係数は２００～１０００倍である。別の実施態様において、翻訳は、他の任意の有意な量又は量の範囲だけ増強される。

【0169】

特定の実施態様において、ｍＲＮＡは、病態生理学的経路を活性化せず、送達のほぼ直後に非常に効率的に翻訳し、数日間続くインビボでの連続的なタンパク質産生のためのテンプレートとして役立つ（Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953）。特定の例において、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡによってコードされる抗原は、単離されたｍＲＮＡによってコードされる抗原と比較して、抗原特異的抗体産生のより大きな産生を誘導する。

【0170】

１つの実施態様において、核酸分子は抗原をコードする。１つの実施態様において、核酸分子は複数の抗原をコードする。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは１種以上の抗原をコードする。１つの実施態様において、治療薬は抗原である。

【0171】

様々な実施態様において、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、インフルエンザ抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、又はこれらの任意の組み合わせを含む。１つの実施態様において、本発明は、アジュバントをコードする核酸分子を含む。

【0172】

１つの実施態様において、抗原は核酸分子の核酸配列によってコードされる。特定の実施態様において、核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、これらの変種、これらの断片、又はこれらの組み合わせを含む。１つの実施態様において、核酸配列は、修飾された核酸配列を含む。例えば１つの実施態様において、抗原をコードする核酸配列は、本明細書の他の場所で詳細に説明されているように、ＲＮＡを含む。特定の例において、核酸配列は、ペプチド結合によって抗原に連結されているリンカー又はタグ配列をコードする追加の配列を含む。

【0173】

特定の実施態様において、核酸分子によってコードされる抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、又は哺乳類からの、タンパク質、ペプチド、これらの断片、又はこれらの変種、又はこれらの組み合わせを含む。例えば特定の実施態様において、抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、又は喘息に関連している。別の実施態様において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エボラ、肺炎球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、デング熱、結核、マラリア、ノロウイルス、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連している。特定の実施態様において、抗原は、２つ以上の異なる生物のアミノ酸配列に基づくコンセンサス配列を含む。特定の実施態様において、抗原をコードする核酸配列は、組成物が送達される生物における有効な翻訳のために最適化されている。

【0174】

１つの実施態様において、抗原は、抗原が腫瘍に対する適応免疫応答を誘導するように、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原を含む。１つの実施態様において、抗原は、抗原が腫瘍に対する適応免疫応答を誘導するように、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原の断片を含む。特定の実施態様において、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原は、宿主タンパク質の突然変異変種である。

【0175】

従って１つの実施態様において、組成物は抗原を含む。１つの実施態様において、組成物は、抗原をコードする核酸配列を含む。例えば特定の実施態様において、組成物は、抗原をコードするＲＮＡを含む。抗原は、特に限定されるものではないが、被験体の適応免疫応答を誘導するポリペプチド、ペプチド、又はタンパク質を含む任意の分子又は化合物であり得る。

【0176】

１つの実施態様において、抗原が、抗原従って病原体に対する適応免疫応答を誘導するように、抗原は病原体に関連するポリペプチド又はペプチドを含む。１つの実施態様において、抗原が病原体に対する適応免疫応答を誘導するように、抗原は病原体に関連するポリペプチド又はペプチドの断片を含む。

【0177】

特定の実施態様において、抗原は、本明細書に記載の抗原のアミノ酸配列と実質的に相同であり、元のアミノ酸配列の免疫原性機能を保持するアミノ酸配列を含む。例えば特定の実施態様において、抗原のアミノ酸配列は、元のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。

【0178】

ウイルス抗原
１つの実施態様において、抗原は、ウイルス抗原、又はその断片、又はその変種を含む。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、以下の科の１つからのウイルスに由来する：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤビリダエ、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、又はトガウイルス科。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、パピローマウイルス、例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－Ｉ）、毛細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペス１（経口ヘルペス）、単純ヘルペス２（生殖器ヘルペス）、帯状疱疹ウイルス（水痘帯状疱疹、別名水痘ポックス）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えばヒトＣＭＶ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、足口病ウイルス、チクングニアウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、又は癌を引き起こすウイルスに由来する。

【0179】

肝炎抗原
１つの実施態様において、抗原は、肝炎ウイルス抗原（すなわち肝炎抗原）、又はその断片、又はその変種を含む。特定の実施態様において、肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及び／又はＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）由来の抗原又は免疫原を含む。特定の実施態様において、肝炎抗原は、全長タンパク質又は全長タンパク質の免疫原性断片である。

【0180】

１つの実施態様において、肝炎抗原はＨＡＶ由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＡＶキャプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、これらの断片、これらの変種、又はこれらの組み合わせを含む。

【0181】

１つの実施態様において、肝炎抗原はＨＣＶ由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわちコアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えばＥ１及びＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えばＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、及びＮＳ５ｂ）、これらの断片、これらの変種、又はこれらの組み合わせを含む。

【0182】

１つの実施態様において、肝炎抗原はＨＤＶ由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、その断片、又はその変種を含む。

【0183】

１つの実施態様において、肝炎抗原はＨＥＶ由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＥＶキャプシドタンパク質、その断片、又はその変種を含む。

【0184】

１つの実施態様において、肝炎抗原はＨＢＶ由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされるＨＢＶタンパク質、これらの断片、これらの変種、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施態様において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、これらの断片、これらの変種、又はこれらの組み合わせを含む。

【0185】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
１つの実施態様において、抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、又はその断片、又はその変種を含む。例えば特定の実施態様において、抗原は、子宮頸癌、直腸癌、及び／又は他の癌を引き起こすＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、及び５８由来の抗原を含む。１つの実施態様において、抗原は、尖圭コンジローマを引き起こし、頭頸部癌の原因であることが知られているＨＰＶタイプ６及び１１由来の抗原を含む。例えば特定の実施態様において、ＨＰＶ抗原は、任意のＨＰＶタイプからのＨＰＶ Ｅ６又はＥ７ドメイン、又はその断片又は変種を含む。

【0186】

ＲＳＶ抗原
１つの実施態様において、抗原は、ＲＳＶ抗原、又はその断片、又はその変種を含む。例えば特定の実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ Ｆ」、「ＲＳＶ Ｆタンパク質」、及び「Ｆタンパク質」とも呼ばれる）、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で保存されている。特定の実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ Ｆタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ａ₂株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ Ｆタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。特定の実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の単量体、二量体、又は三量体、あるいはこれらの断片又は変種である。本発明によれば、特定の実施態様において、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前形態又は融合後形態である。

【0187】

１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ Ｇ」、「ＲＳＶ Ｇタンパク質」、及び「Ｇタンパク質」とも呼ばれる）、又はその断片若しくは変種を含む。ヒトＲＳＶＧタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢの間で異なる。１つの実施態様において、抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ Ｇタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３、又はこれらの断片若しくは変種由来のＲＳＶＧタンパク質を含む。

【0188】

別の実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、又はその断片若しくは変種を含む。例えば１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ ＮＳ１タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ ＮＳ２タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ Ｎタンパク質、又はその断片若しくは変種である。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶホスホタンパク質（「Ｐ」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ Ｐタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶマトリックスタンパク質（「Ｍ」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ Ｍタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。

【0189】

さらに別の実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ ＳＨタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶマトリックスタンパク質２－１（「Ｍ２－１」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ Ｍ２－１タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶマトリックスタンパク質２－２（「Ｍ２－２」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ Ｍ２－２タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば、１つの実施態様において、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ Ｌタンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。

【0190】

インフルエンザ抗原
１つの実施態様において、抗原は、インフルエンザ抗原、又はその断片、又はその変種を含む。インフルエンザ抗原は、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して、哺乳動物で適応免疫応答を誘発することができるものである。特定の実施態様において、抗原は、全長翻訳産物血球凝集素（ＨＡ）０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、これらの変種、これらの断片、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施態様において、インフルエンザ血球凝集素抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１、インフルエンザＡ血清型Ｈ２、又はインフルエンザＢの１つ以上の株に由来する。

【0191】

１つの実施態様において、インフルエンザ抗原は、それに対して免疫応答が誘導され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して有効であり得る少なくとも１種の抗原性エピトープを含む。特定の実施態様において抗原は、無傷のインフルエンザウイルスに存在する免疫原性部位及びエピトープの全レパートリーを提供し得る。

【0192】

いくつかの実施態様において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１ＨＡ、Ｈ２ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、Ｈ５ＨＡ、又はＢＨＡ抗原を含む。特定の実施態様においてインフルエンザ抗原は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質、核タンパク質、Ｍ２エクトドメイン－核タンパク質（Ｍ２ｅ－ＮＰ）、これらの変種、これらの断片、又はこれらの組み合わせを含む。

【0193】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
１つの実施態様において、抗原は、ＨＩＶ抗原、又はその断片、又はその変種を含む。

【0194】

特定の実施態様において、ＨＩＶ抗原は、エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質、又はその断片若しくは変種を含む。例えば特定の実施態様において、ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又はこれらの組み合わせから選択されるＥｎｖタンパク質を含む。

【0195】

特定の実施態様において、ＨＩＶ抗原は、ｎｅｆ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、又はこれらの断片若しくは変種のうちの少なくとも１つを含む。

【0196】

ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶの任意の株に由来し得る。例えば特定の実施態様において、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ群Ｍ、Ｎ、Ｏ、及びＰ、並びにサブタイプＡ、ＨＩＶサブタイプＢ、ＨＩＶサブタイプＣ、ＨＩＶサブタイプＤ、サブタイプＥ、サブタイプＦ、サブタイプＧ、サブタイプＨ、サブタイプＪ、又はサブタイプＫ由来の抗原を含む。１つの実施態様において、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ－Ｒ３Ａ株（Ｒ３Ａ－Ｅｎｖ）由来のＥｎｖ、又はその断片若しくは変種を含む。

【0197】

寄生虫抗原
特定の実施態様において、抗原は、寄生虫抗原、又はその断片若しくは変種を含む。特定の実施態様において寄生虫は、原生動物、蠕虫、又は外部寄生虫である。特定の実施態様において、蠕虫（すなわち、ワーム）は、扁形動物（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、又は回虫（例えば、ぎょう虫）である。特定の実施態様において、外部寄生虫は、シラミ、ノミ、ダニ（tick）、及びダニ（mite）である。

【0198】

特定の実施態様において、寄生虫は、以下の疾患を引き起こす任意の寄生虫である：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャガス病、肝吸虫症、コクリオマイア症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコッカス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、眠り病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病、及び鞭虫症。

【0199】

特定の実施態様において、寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ヒツジバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、フックワーム、リーシュマニア、イヌシタムシ、肝吸虫、ロア糸状虫、ウェステルマン肺吸虫、蠕虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラズマゴンディ、トリパノソーマ、鞭虫、又はバンクロフト糸状虫である。

【0200】

マラリア抗原
１つの実施態様において、抗原は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原又はＰＦ免疫原）、又はその断片、又はその変種を含む。例えば１つの実施態様において、抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫由来の抗原を含む。１つの実施態様において、マラリアを引き起こす寄生虫は熱帯熱マラリア原虫である。

【0201】

いくつかの実施態様において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ；ＬＳＡ１；ＴＲＡＰ；ＣｅｌＴＯＳ；及びＡｍａ１の１つ以上を含む。免疫原は、全長又は全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。

【0202】

細菌抗原
１つの実施態様において、抗原は、細菌抗原、又はその断片若しくは変種を含む。特定の実施態様において、細菌は以下の門のいずれかからのものである：アシドバクテリア、放線菌、アクウィフェクス、バクテロイデス、カルディセリクム、クラミジア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、クリシオゲネス、シアノバクテリア、デフェリバクター、デイノコッカス－サーマス、ディクチオグロムス、エルシミクロビア、フィブロバクター、ファーミキューテス、フソバクテリア、ゲンマティモナス、レンティスファエラ、ニトロスピラ、プランクトミケス、プロテオバクテリア、スピロヘータ、シネルギステス、テネリクテス、サーモデスルフォバクテリア、テルモトガ、及びベルコミクロビウム。

【0203】

特定の実施態様において、細菌はグラム陽性菌又はグラム陰性菌である。特定の実施態様において、細菌は好気性細菌又は嫌気性細菌である。特定の実施態様において、細菌は独立栄養細菌又は従属栄養細菌である。特定の実施態様において、細菌は、中温菌、中性菌、極限環境微生物、好酸性菌、好アルカリ菌、好熱菌、好冷菌、好塩菌、又は好濃菌である。

【0204】

特定の実施態様において、細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染性菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、破傷風菌である。 特定の実施態様では、細菌は、マイコバクテリア、破傷風菌、ペスト菌、炭疽菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、又はクロストリジウム・ディフィシルである。

【0205】

結核菌抗原
１つの実施態様において、抗原は、結核菌抗原（すなわち、ＴＢ抗原又はＴＢ免疫原）、又はその断片、又はその変種を含む。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えばＡｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂに由来し得る。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、及びＥｓｘＷに由来し得る。

【0206】

真菌抗原
１つの実施態様において、抗原は、真菌抗原、又はその断片若しくは変種を含む。特定の実施態様において、真菌は、アスペルギルス種、ブラストミセス・デルマチチディス、カンジダ酵母（例えば、カンジダ・アルビカンス）、コクシジオイデス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フサリウム種、ヒストプラズマ・カプスラタム、ケカビ、ニューモシスチス肺炎菌、スポロトリックス・シェンキイ、エキセロヒラム、又はクラドスポリウムである。

【0207】

腫瘍抗原
特定の実施態様において、抗原は、例えば腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原を含む。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性障害抗原」、又は「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。特定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、特に限定されるものではないが、原発性又は転移性黒色腫、中皮腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンスリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、及び腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などを含む癌から得られる。

【0208】

腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。１つの実施態様において、本発明の腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫原的に認識される１種以上の抗原性癌エピトープを含む。抗原の選択は、本発明の組成物によって治療又は予防される特定の種類の癌に依存するであろう。

【0209】

腫瘍抗原は当技術分野で公知であり、例えば神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（survivin）、及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、及びメソテリンを含む。

【0210】

１つの実施態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１種以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能し得る多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、特に限定されるものではないが、組織特異抗原、例えば黒色腫のＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＧＰ１００、並びに前立腺癌の前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が含まれる。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌－胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫の標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いた受動免疫療法の標的として使用されているが、あまり成功していない。

【0211】

本発明で言及される腫瘍抗原のタイプはまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に固有のものではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下では、正常細胞にも発現される。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こる可能性がある。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できない場合、胎児の発育中に正常細胞で発現される抗原であり得るか、又は正常細胞では通常非常に低いレベルで存在するが、腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される抗原であり得る。

【0212】

ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えばＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、及び腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；ＣＥＡなどの過剰発現した胚性抗原；過剰発現した癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する独特の腫瘍抗原；例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；及びウイルス抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡ、並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが含まれる。

【0213】

好適な実施態様において、抗原は、特に限定されるものではないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＭＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲなどを含む。

【0214】

特定の実施態様において、核酸分子は、抗原に対する適応免疫応答を誘導する抗原をコードする。特定の実施態様において、治療薬は、抗原に対する適応免疫応答を誘導する抗原である。

【0215】

本明細書に記載の抗原又はアジュバントをコードするヌクレオチド配列は、代わりに、元のヌクレオチド配列に関する配列変化、例えば、結果として生じるポリヌクレオチドが本発明によるポリヌクレオチドコードするという条件で、１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失を含むことができる。従って本発明の範囲は、本明細書に記載のヌクレオチド配列に実質的に相同であり、目的の抗原又はアジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0216】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が、本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、有利には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する場合、本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列と「実質的に相同」である。抗原をコードするヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列は、典型的には、例えば保存的又は非保存的置換を導入することによって、ヌクレオチド配列に含まれる情報に基づいて、抗原の生産生物から単離することができる。可能な修飾の他の例には、配列中の１つ以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端への１つ以上のヌクレオチドの付加、又は任意の末端又は配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失が含まれる。２つのポリヌクレオチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を使用して決定される。

【0217】

１つの実施態様において、本発明は、抗原をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。１つの実施態様において、構築物は、複数の抗原をコードする複数のヌクレオチド配列を含む。例えば特定の実施態様において、構築物は、１つ以上、２つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、又は２０以上の抗原をコードする。１つの実施態様において、本発明は、アジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。１つの実施態様において、構築物は、抗原をコードする第１のヌクレオチド配列とアジュバントをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0218】

１つの実施態様において、組成物は、それぞれが１種以上の抗原をコードする複数の構築物を含む。特定の実施態様において、組成物は、１つ以上、２つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、又は２０以上の構築物を含む。１つの実施態様において、組成物は、抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第１の構築物と、アジュバントをコードするヌクレオチド配列を含む第２の構築物を含む。

【0219】

別の特定の実施態様において、構築物は、翻訳制御要素に作動可能に結合されている。構築物は、本発明のヌクレオチド配列の発現のための作動可能に結合された調節配列を組み込むことができ、従って発現カセットを形成する。

【0220】

１つの実施態様において、本発明の組成物は、インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡを含む。例えば特定の実施態様において、本発明の組成物は、抗原をコードするＩＶＴ ＲＮＡを含み、ここで、抗原は適応免疫応答を誘導する。特定の実施態様において、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍特異的抗原、又は腫瘍関連抗原のうちの少なくとも１つである。しかしながら本発明は、特定の抗原又は抗原の組み合わせに限定されない。

【0221】

例えば、１つの実施態様において、組成物は、ＬＮＰ内に封入された、抗原をコードする核酸分子を含む。特定の例において、ＬＮＰは、核酸分子の細胞取り込みを増強する。

【0222】

１つの態様において、核酸分子は、抗原をコードするＩＶＴ ＲＮＡである。従って、１つの実施態様において、本発明の組成物は、抗原をコードするＩＶＴ ＲＮＡを含む。１つの実施態様において、本発明の組成物は、複数の抗原をコードするＩＶＴ ＲＮＡを含む。１つの実施態様において、本発明の組成物は、アジュバントをコードするＩＶＴ ＲＮＡを含む。１つの実施態様において、本発明の組成物は、１種以上の抗原及び１種以上のアジュバントをコードするＩＶＴ ＲＮＡを含む。

【0223】

１つの実施態様において、組成物は、アジュバントをコードする核酸分子を含む。従って、１つの実施態様において、組成物はアジュバントを含む。１つの実施態様において、アジュバントをコードする核酸分子は、ＩＶＴ ＲＮＡである。１つの実施態様において、アジュバントをコードする核酸分子はＲＮＡである。

【0224】

例示的なアジュバントには、特に限定されるものではないが、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列が削除されたＩＬ－１５を含み、任意選択的にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む）が含まれる。有用なアジュバントとなり得る他の遺伝子には、以下をコードする遺伝子が含まれる：ＭＣＰ－Ｉ、ＭＩＰ－Ｉａ、ＭＩＰ－Ｉｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－Ｉ、ＶＬＡ－Ｉ、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、変異体型ＩＬ－１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－Ｉ、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－Ｉ、Ａｐ－Ｉ、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、抗ＣＴＬＡ４－ｓｃ、抗ＬＡＧ３－Ｉｇ、抗ＴＩＭ３－Ｉｇ及びこれらの機能的断片。

【0225】

いくつかの実施態様において、組成物は、カチオン性脂質と、中性脂質、荷電脂質、ステロイド、及びポリマー結合脂質（例えばペグ化脂質）から選択される１つ以上の賦形剤とをさらに含む。いくつかの実施態様において、核酸分子は、脂質ナノ粒子の脂質部分、又は脂質ナノ粒子の脂質部分の一部又はすべてによって包まれた水性空間に封入され、こうして、宿主生物又は細胞のメカニズム、例えば有害な免疫応答によって誘導される酵素分解又は他の望ましくない効果からそれを保護する。

【0226】

１つの実施態様において、組成物は、１つ以上のカチオン性脂質、及び１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質には、中性脂質とペグ化脂質が含まれる。

【0227】

１つの実施態様において、組成物はカチオン性脂質を含む。本明細書で使用される「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、又はｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫより低くなるとカチオン性（プロトン化）になるが、より高いｐＨ値では次第により中性になる脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、脂質は負に荷電した核酸と結合することができる。特定の実施態様において、カチオン性脂質は、ｐＨ低下により正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。

【0228】

特定の実施態様において、カチオン性脂質は、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を帯びるいくつかの脂質種のいずれかを含む。そのような脂質には、特に限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれる。さらに、本発明で使用することができるカチオン性脂質の多くの市販の調製物が利用可能である。これらには、例えばLIPOFECTIN（登録商標）（GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.からのＤＯＴＭＡ及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；LIPOFECTAMINE（登録商標）（GIBCO/BRLからのＮ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；及びTRANSFECTAM（登録商標）（Promega Corp., Madison, Wis.からのエタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）が含まれる。以下の脂質はカチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正電荷を帯びている：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。

【0229】

１つの実施態様において、カチオン性脂質はアミノ脂質である。本発明において有用な適切なアミノ脂質には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものが含まれる。代表的なアミノ脂質には、特に限定されるものではないが、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）が含まれる。

【0230】

特定の実施態様において、カチオン性脂質は、組成物中に約３０～約９５ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、カチオン性脂質は、組成物中に約３０～約７０ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、カチオン性脂質は、組成物中に約４０～約６０ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、カチオン性脂質は、組成物中に約５０ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、組成物はカチオン性脂質のみを含む。

【0231】

特定の実施態様において、組成物は、粒子の形成中に粒子の形成を安定化させる１つ以上の追加の脂質を含む。適切な安定化脂質には、中性脂質及び陰イオン性脂質が含まれる。

【0232】

「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指す。代表的な中性脂質には、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。

【0233】

例示的な中性脂質には、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）－マレイミド－ＰＥＧ、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）－マレイミド－ＰＥＧ２０００、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアリオイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ステアロイルオレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、及び１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）、及びＳＭが含まれる。１つの実施態様において、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。

【0234】

いくつかの実施態様において、組成物は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質を含む。

【0235】

様々な実施態様において、組成物は、ステロイド又はステロイド類似体をさらに含む。「ステロイド」は、以下の炭素骨格を含む化合物である：

【化32】

【0236】

特定の実施態様において、ステロイド又はステロイド類似体はコレステロールである。これらの実施態様のいくつかでは、カチオン性脂質のモル比。

【0237】

「陰イオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電している脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他の陰イオン性修飾基が含まれる。

【0238】

特定の実施態様において、組成物は、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ₁）を含む。特定の実施態様において、組成物は、コレステロールなどのステロールを含む。

【0239】

いくつかの実施態様において、組成物はポリマー結合脂質を含む。「ポリマー結合脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を指す。ポリマー結合脂質の例は、ペグ化脂質である。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知であり、１（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧ）などが含まれる。

【0240】

特定の実施態様において、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール－脂質（ペグ化脂質）である追加の安定化脂質を含む。適切なポリエチレングリコール－脂質には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが含まれる。代表的なポリエチレングリコール－脂質には、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及びＰＥＧ－ｓ－ＤＭＧが含まれる。１つの実施態様において、ポリエチレングリコール－脂質は、Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）₂₀₀₀）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。１つの実施態様において、ポリエチレングリコール－脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧである。別の実施態様において、ＬＮＰは、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば４－Ｏ－（２'，３'－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメート、又は２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートを含む。様々な実施態様において、カチオン性脂質とペグ化脂質とのモル比は、約１００：１～約２５：１の範囲である。

【0241】

特定の実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ中に約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ中に約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の量で存在する。１つの実施態様において、追加の脂質は、ＬＮＰ中に約１ｍｏｌ％又は約１．５ｍｏｌ％で存在する。

【0242】

特定の実施態様において、核酸分子は、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。

【0243】

様々な実施態様において、組成物は、１種以上のトランスフェクション試薬を含む。別の実施態様において、トランスフェクション試薬は、脂質ベースのトランスフェクション試薬である。別の実施態様において、トランスフェクション試薬は、タンパク質ベースのトランスフェクション試薬である。別の実施態様において、トランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミンベースのトランスフェクション試薬である。別の実施態様において、トランスフェクション試薬はリン酸カルシウムである。別の実施態様において、トランスフェクション試薬は、Lipofectin（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）、又はTransIT（登録商標）である。別の実施態様において、トランスフェクション試薬は、当技術分野で公知の他の任意のトランスフェクション試薬である。

【0244】

別の実施態様において、トランスフェクション試薬はリポソームを形成する。別の実施態様において、リポソームは、細胞内安定性を増加させ、取り込み効率を増加させ、そして生物学的活性を改善する。別の実施態様において、リポソームは、細胞膜を構成する脂質と同様の方法で配置された脂質から構成される中空の球状小胞である。これらは、別の実施態様において、水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、直径が０．０５～数ミクロンの範囲のサイズである。別の実施態様において、リポソームは、ＲＮＡを生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる。

【0245】

様々な実施態様において、本発明の組成物は、１種以上の核酸分子が付着している又は１種以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えばエステル）であり、一般に水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする一群の有機化合物を指す。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）「単純脂質」、これには油脂とワックスが含まれる；（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」；及び（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。

【0246】

特定の実施態様において、組成物は、ＬＮＰを、目的の細胞、細胞集団、組織、又はこれらの任意の組み合わせに標的化することができる１つ以上の標的化部分を含む。例えば１つの実施態様において、標的化部分は、ＬＮＰを細胞表面上に見られる受容体に向けるリガンドである。

【0247】

特定の実施態様において、組成物は、１つ以上の内在化ドメインを含む。例えば、１つの実施態様において、組成物は、細胞に結合してＬＮＰの内在化を誘導する１つ以上のドメインを含む。例えば１つの実施態様において、１つ以上の内在化ドメインは、細胞表面に見られる受容体に結合して、受容体を介するＬＮＰの取り込みを誘導する。特定の実施態様において、ＬＮＰは、インビボで生体分子に結合することができ、ここで、ＬＮＰに結合した生体分子は、細胞表面受容体によって認識されて内在化を誘導することができる。例えば１つの実施態様において、ＬＮＰは全身性ＡｐｏＥに結合し、これは、ＬＮＰ及び関連する荷物（cargo）（例えば、１種以上の核酸分子、１種以上の治療薬、又はこれらの任意の組み合わせ）の取り込みをもたらす。

【0248】

ＲＮＡは、合成的に生成されたプラスミドＤＮＡテンプレートを使用するインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの目的のＤＮＡは、ＰＣＲによって適切なプライマーとＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロｍＲＮＡ合成用のテンプレートに直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、又は任意の他の適切なＤＮＡの供給源であり得る。１つの実施態様において、インビトロ転写のための所望のテンプレートは、適応免疫応答を誘導することができる抗原であり、本明細書の他の場所に記載されるように、例えば病原体又は腫瘍に関連する抗原を含む。１つの実施態様において、インビトロ転写のための所望のテンプレートは、適応免疫応答を増強することができるアジュバントである。

【0249】

１つの実施態様において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然のＤＮＡ配列に由来する場合がある。１つの実施態様において、ＤＮＡは、遺伝子の一部の目的の全長遺伝子である。遺伝子は、５'及び／又は３'非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部又はすべてを含み得る。遺伝子は、エクソンとイントロンを含み得る。１つの実施態様において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、ヒト遺伝子である。別の実施態様において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５'及び３'ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。別の実施態様において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌を含む病原性又は共生生物由来の遺伝子である。別の実施態様において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５'及び３'ＵＴＲを含む、細菌、ウイルス、寄生虫、及び真菌を含む病原性又は共生生物に由来する。あるいはＤＮＡは、天然に存在する生物では通常は発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒に連結される遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結されるＤＮＡの部分は、単一の生物又は複数の生物に由来することができる。

【0250】

ＰＣＲのＤＮＡ源として使用できる遺伝子には、生物の適応免疫応答を誘導又は増強するポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。好ましい遺伝子は、短期間の治療に、又は投与量若しくは発現された遺伝子に関して安全性の懸念がある場合に、有用な遺伝子遺伝子である。

【0251】

様々な実施態様において、プラスミドは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロ転写のためのテンプレートを生成するために使用される。

【0252】

安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造もまた使用され得る。ＲＮＡは好ましくは５'及び３'ＵＴＲを有する。１つの実施態様において、５'ＵＴＲは、長さが０～３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に追加される５'及び３'ＵＴＲ配列の長さは、特に限定されるものではないが、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲ用のプライマーの設計を含む異なる方法によって変更することができる。このアプローチを使用して当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するために必要とされる５'及び３'のＵＴＲの長さを修飾することができる。

【0253】

５'及び３'ＵＴＲは、目的の遺伝子の天然に存在する内因性の５'及び３'ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列を前進プライマー及び逆進プライマーに組み込むことによって、又はテンプレートの任意の他の修飾によって追加することができる。目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を修飾するのに役立つ。例えば３'ＵＴＲ配列のＡＵに富む要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させる可能性があることが知られている。従って３'ＵＴＲは、当技術分野でよく知られているＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように選択又は設計することができる。

【0254】

１つの実施態様において、５'ＵＴＲは、内因性遺伝子のコザック配列を含むことができる。あるいは、上記のように目的の遺伝子に内因性ではない５'ＵＴＲがＰＣＲによって追加されている場合、コンセンサスコザック配列は５'ＵＴＲ配列を追加することによって再設計することができる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために、すべてのＲＮＡにとって必要なわけではないようである。多くのｍＲＮＡに対するコザック配列に対する要件は当技術分野で公知である。別の実施態様において、５'ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来し得る。別の実施態様において、様々なヌクレオチド類似体を３'又は５'ＵＴＲで使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。

【0255】

遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの合成を可能にするには、転写される配列の上流のＤＮＡテンプレートに、転写プロモーターを付加する必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が前進プライマーの５'末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。１つの好適な実施態様において、プロモーターは、本明細書の他の場所に記載されているように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、特に限定されるものではないが、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。

【0256】

好適な実施態様において、ｍＲＮＡは、細胞内のｍＲＮＡのリボソーム結合、翻訳の開始、及びｍＲＮＡの安定性を決定する５'末端及び３'ポリ（Ａ）テールの両方にキャップを有する。環状ＤＮＡテンプレート、例えばプラスミドＤＮＡでは、ＲＮＡポリメラーゼが、真核細胞での発現には適さない長いコンカテマー生成物を生成する。３'ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、通常サイズのｍＲＮＡをもたらし、これは、転写後にポリアデニル化される時、真核生物のトランスフェクションに有効である。

【0257】

線状ＤＮＡテンプレートでは、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３'末端をテンプレートの最後の塩基を超えて拡張できる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。

【0258】

ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡテンプレートに組み込む従来の方法は、分子クローニングである。ただし、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドの不安定にする可能性があり、これは、組換え能のない細菌細胞をプラスミドの増殖に使用することで改善することができる。

【0259】

ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）や酵母ポリＡポリメラーゼなどのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、インビトロ転写後にさらに拡張できる。１つの実施態様において、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増加させると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。さらに、３'末端への異なる化学基の結合はｍＲＮＡの安定性を高めることができる。このような結合は、修飾された／人工のヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含み得る。例えばＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体はＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。

【0260】

５'キャップオンは、ｍＲＮＡ分子に安定性も提供する。好適な実施態様において、この方法によって生成されたＲＮＡは５'ｃａｐ１構造を含む。このようなｃａｐ１構造は、ワクシニアキャッピング酵素及び２'－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素（CellScript, Madison, WI）を使用して生成することができる。あるいは５'キャップは、当技術分野で公知の本明細書に記載されている技術を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。

【0261】

抗原又はアジュバントをコードする核酸配列は、当該分野で公知の組換え方法、例えば遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、同じものを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、又は同じものを含む細胞や組織から直接分離することによって、標準的な技術を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に生成することができる。

【0262】

核酸は、多くの種類のベクターにクローン化することができる。例えば核酸は、特に限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むベクターにクローン化することができる。特に関心のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、配列決定ベクター、及びインビトロ転写用に最適化されたベクターが含まれる。

【0263】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散システム、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースのシステム、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。

【0264】

非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）のために脂質配合物の使用が企図されている。別の態様において、核酸は脂質と結合され得る。脂質に結合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結合した連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質含有液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組合わされ、脂質に懸濁液として含まれ、ミセルを含むか又は複合体を形成し、あるいは脂質と結合され得る。脂質、脂質／ＲＮＡ、又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、二層構造でミセルとして又は「崩壊した」構造で存在し得る。これらはまた、単に溶液中に散在し、サイズ又は形状が均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、天然に存在する脂質又は合成脂質である可能性のある脂肪性物質である。例えば脂質には、細胞質に自然に存在する脂肪滴や、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。

【0265】

使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Sigma, St. Louis, MOから入手することができる。リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、K & K Laboratories (Plainview, NY)から入手できる。コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）はCalbiochem-Behringから入手できる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から入手することができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される様々な単一及び多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重膜と内部水性媒体とを備えた小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は自己再配列した後に、閉じた構造を形成し、水と溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉する（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとるか、脂質分子の不均一な凝集体として単に存在する可能性がある。リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。

【0266】

ＬＮＰワクチン
本発明の１つの態様において、本明細書に記載の組成物はワクチンである。組成物がワクチンとして有用であるためには、組成物は、細胞、組織、又は哺乳動物（例えばヒト）において抗原に対する適応免疫応答を誘導しなければならない。特定の例において、ワクチンは哺乳動物で防御免疫応答を誘導する。本明細書で使用される「免疫原性組成物」は、抗原（例えばペプチド又はポリペプチド）、抗原をコードする核酸、抗原又は細胞成分を発現又は提示する細胞、又はこれらの組み合わせを含み得る。特定の実施態様において、組成物は、本明細書に記載の任意のペプチド抗原の全部又は一部、又はその免疫原的に機能の同等物を含むか又はコードする。別の実施態様において、組成物は、追加の免疫刺激剤又はそのような薬剤をコードする核酸を含む混合物である。免疫刺激剤には、特に限定されるものではないが、追加の抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞、又はアジュバントが含まれる。別の実施態様において、１つ以上の追加の薬剤は、任意の組み合わせで、抗原又は免疫刺激剤に共有結合している。特定の実施態様において、抗原性組成物は、ＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸に結合しているか又はそれを含む。

【0267】

本発明の文脈において、「ワクチン」という用語は、動物への接種時に免疫を誘導する物質を指す。

【0268】

本発明のワクチンは、核酸及び／又は細胞成分の組成が異なり得る。非限定的な例において、抗原をコードする核酸はまた、アジュバントと共に配合され得る。もちろん、本明細書に記載の様々な組成物は、追加の成分をさらに含み得ることが理解されよう。例えば、１つ以上のワクチン成分は、脂質、リポソーム、又は脂質ナノ粒子に含まれ得る。別の非限定的な例において、ワクチンは、１種以上のアジュバントを含み得る。本発明のワクチン及びその様々な成分は、本明細書に開示されるか又は本開示の観点から当業者に公知と思われる任意の方法によって、調製及び／又は投与することができる。

【0269】

抗原の発現による免疫の誘導は、抗原に対する宿主の免疫系の全部又は一部の応答を、インビボ又はインビトロで観察することによって検出することができる。

【0270】

例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を検出する方法はよく知られている。生体内に侵入した異物は、ＡＰＣの作用によりＴ細胞やＢ細胞に提示される。ＡＰＣによって提示された抗原に抗原特異的に応答するＴ細胞は、抗原による刺激によって細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球又はＣＴＬとも呼ばれる）に分化する。その後、これらの抗原に刺激された細胞は増殖する。このプロセスは、本明細書ではＴ細胞の「活性化」と呼ばれる。従ってポリペプチド又はペプチド又はこれらの組み合わせのエピトープによるＣＴＬ誘導は、ポリペプチド又はペプチド又はこれらの組み合わせのエピトープをＡＰＣによってＴ細胞に提示し、ＣＴＬの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、ＡＰＣは、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球、及びＮＫ細胞を活性化する作用がある。

【0271】

樹状細胞（ＤＣ）をＡＰＣとして使用してＣＴＬの誘導作用を評価する方法は、当技術分野でよく知られている。ＤＣは、ＡＰＣの中で強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣである。本発明の方法において、ポリペプチド又はペプチド又はこれらの組み合わせのエピトープは、最初にＤＣによって発現され、次にこのＤＣはＴ細胞と接触させられる。ＤＣとの接触後の目的の細胞に対する細胞傷害性作用を有するＴ細胞の検出は、ポリペプチド又はペプチド又はこれらの組み合わせのエピトープが、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を有することを示す。さらに、誘導された免疫応答は、固定化ペプチド又はペプチドの組み合わせを運ぶ抗原提示細胞の存在下で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの抗ＩＦＮ－ガンマ抗体を使用して視覚化することにより、ＣＴＬによって産生及び放出されるＩＦＮ－ガンマを測定することによって試験することもできる。

【0272】

ＤＣとは別に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もまたＡＰＣとして使用することができる。ＣＴＬの誘導は、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下でＰＢＭＣを培養することによって増強されることが報告されている。同様にＣＴＬは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とＩＬ－７の存在下でＰＢＭＣを培養することによって誘導されることが証明されている。

【0273】

これらの方法によりＣＴＬ誘導活性を有することが確認された抗原は、ＤＣ活性化作用とそれに続くＣＴＬ誘導活性を有する抗原である。さらに、ＡＰＣによる抗原の提示により細胞障害性を獲得したＣＴＬは、抗原関連障害に対するワクチンとしても使用できる。

【0274】

抗原の発現による免疫の誘導は、抗原に対する抗体産生の誘導を観察することによってさらに確認することができる。例えば、抗原をコードする組成物で免疫された実験動物において抗原に対する抗体が誘導される場合、及び抗原関連の病状がこれらの抗体によって抑制される場合、組成物は免疫を誘導すると判定される。

【0275】

抗原の発現による免疫の誘導は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を観察することによってさらに確認することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は標的細胞を溶解することもできるが、主にＣＴＬや抗体生成などの他のタイプの免疫応答の誘導に役立つ。ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプのタイプは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔ調節性、又はＴ濾胞ヘルパー（Ｔ_fh）細胞として特徴付けることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞供給の各サブタイプは、特定のタイプの免疫応答に役立つ。本発明にとって特に関心のあるのは、Ｔ_fhサブタイプが高親和性抗体の生成に役立つことである。

【0276】

医薬用ＬＮＰ組成物
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているか又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、有効成分を担体又は１種以上の他の付属成分と結合させ、次に、必要な又は所望の場合、生成物を所望の単回又は複数回投与単位に成形又は包装する工程を含む。

【0277】

本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの医療向け投与に適した医薬組成物に向けられているが、当業者は、そのような組成物が一般にあらゆる種類の動物への投与に適していることを理解するであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物を修飾することはよく理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、もしあれば、通常の実験でそのような修飾を設計及び実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される被験体には、特に限定されるものではないが、ヒト及び他の霊長類、非ヒト霊長類、及び哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌなどの商業的に関連する哺乳動物が含まれる。

【0278】

本発明の方法において有用な医薬組成物は、眼、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、頬側、静脈内、側脳室内、皮内、筋肉内、皮下、脳室内、髄腔内、気管内、腹腔内、子宮内送達、又は別の投与経路、又はこれらの任意の組み合わせに適した製剤で、調製、包装、又は販売され得る。他の企図される製剤には、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含む再密封された赤血球、及び免疫原性ベースの製剤が含まれる。

【0279】

本発明の医薬組成物は、単位用量として又は複数の単位用量として、バルクで調製、包装、又は販売することができる。本明細書で使用される「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に被験体に投与される有効成分の投与量、又はそのような投与量の便利な割合、例えば、そのような投与量の半分又は３分の１に等しい。

【0280】

本発明の医薬組成物中の有効成分、医薬的に許容し得る担体、及び任意の追加の成分の相対量は、治療される被験体の本体、サイズ、及び状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、組成物は０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。

【0281】

有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１種以上の追加の医薬活性物質をさらに含み得る。

【0282】

本発明の医薬組成物の制御放出又は徐放性製剤は、従来の技術を使用して作成することができる。

【0283】

本明細書で使用される医薬組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破裂を特徴とする任意の投与経路、及び組織の破裂を介する医薬組成物の任意の投与経路を含む。従って、非経口投与には、特に限定されるものではないが、組成物の注射による、外科的切開による組成物の適用による、組織貫通性の非外科的創傷による組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が含まれる。いくつかの実施態様において非経口投与は、特に限定されるものではないが、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、子宮内送達、筋肉内、皮内、胸骨内注射、腫瘍内、静脈内、側脳室内投与、及び腎臓の透析注入技術を含む。

【0284】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、無菌水又は無菌等張食塩水などの医薬的に許容し得る担体と組み合わされた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装、又は販売することができる。注射可能な製剤は、防腐剤を含むアンプル又は複数回投与容器などの単位剤形で調製、包装、又は販売することができる。非経口投与用の製剤には、特に限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、及び移植可能な徐放性又は生分解性の製剤が含まれる。そのような製剤は、特に限定されるものではないが、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含む１種以上の追加の成分をさらに含み得る。非経口投与用の製剤の１つの実施態様において、有効成分は、適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で復元するための乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）形態で提供された後、復元された組成物が非経口投与される。

【0285】

医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液又は溶液の形態で、調製、包装、又は販売することができる。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って調製することができ、有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加の成分を含むことができる。このような無菌の注射可能な製剤は、例えば水又は１，３ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒を使用して調製することができる。他の許容し得る希釈剤及び溶媒には、特に限定されるものではないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドが含まれる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、有効成分を微結晶形態で、リポソーム調製物で、又は生分解性ポリマー系の成分として含むものが含まれる。徐放又は移植用の組成物は、医薬的に許容し得るポリマー又は疎水性材料、例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含み得る。

【0286】

本発明の医薬組成物は、頬側口腔を介する肺投与に適した製剤で調製、包装、又は販売することができる。そのような製剤は乾燥粒子を含むことができ、この乾燥粒子は有効成分を含み、約０．５～約７ナノメートル、好ましくは約１～約６ナノメートルの範囲の直径を有する。そのような組成物は、粉末を分散させるために噴射剤の流れを向けることができる乾燥粉末貯蔵器を含む装置を使用して、又は密封された容器内の低沸点噴射剤に溶解又は懸濁された有効成分を含む装置などの自己噴射溶媒／粉末分配容器を使用して、投与するための乾燥粉末の形態であることが便利である。好ましくは、そのような粉末は、粒子の重量の少なくとも９８％が０．５ナノメートルを超える直径を有し、粒子の数の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。より好ましくは、粒子の重量の少なくとも９５重量％が１ナノメートルを超える直径を有し、粒子の数の少なくとも９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖などの固体微粉末希釈剤を含み、単位剤形で便利に提供される。

【0287】

低沸点噴射剤は、一般に大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に噴射剤は組成物の５０～９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、有効成分は組成物の０．１～２０％（ｗ／ｗ）を構成することができる。噴射剤はさらに、液体非イオン性又は固体陰イオン性界面活性物質、又は固体希釈剤（好ましくは、有効成分を含む粒子と同じオーダーの粒子サイズを有する）などの追加の成分を含み得る。

【0288】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、無菌水又は無菌等張食塩水などの医薬的に許容し得る担体と組み合わされた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装、又は販売することができる。注射可能な製剤は、防腐剤を含むアンプル又は複数回投与容器などの単位剤形で調製、包装、又は販売することができる。非経口投与用の製剤には、特に限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、及び移植可能な徐放性又は生分解性の製剤が含まれる。そのような製剤は、特に限定されるものではないが、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含む１種以上の追加の成分をさらに含み得る。非経口投与用の製剤の１つの実施態様において、有効成分は、適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で復元するための乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）形態で提供された後、復元された組成物が非経口投与される。

【0289】

医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液又は溶液の形態で、調製、包装、又は販売することができる。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って調製することができ、有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加の成分を含むことができる。このような無菌の注射可能な製剤は、例えば水又は１，３ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒を使用して調製することができる。他の許容し得る希釈剤及び溶媒には、特に限定されるものではないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油、例えば合成モノグリセリド又はジグリセリドが含まれる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、有効成分を微結晶形態で、リポソーム調製物で、又は生分解性ポリマー系の成分として含むものが含まれる。徐放又は移植用の組成物は、医薬的に許容し得るポリマー又は疎水性材料、例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含み得る。

【0290】

本明細書で使用される「追加の成分」には、特に限定されるものではないが、以下のうちの１つ以上が含まれる：賦形剤；界面活性物質；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；香味剤；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；及び医薬的に許容し得る高分子又は疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0291】

本発明の治療用化合物又は組成物は、疾患又は障害を患っているか又は発症するリスクがある（又は発症しやすい）被験体に、予防的に（すなわち、疾患又は障害を予防するために）又は治療的に（すなわち、疾患又は障害を治療するために）投与することができる。このような被験体は、標準的な臨床的方法を使用して特定することができる。本発明の文脈において、予防的投与は、疾患又は障害が予防されるかあるいはその進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床症状が現れる前に行われる。医学分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡率又は罹患率の負担を軽減するあらゆる活動を包含する。予防は、一次、二次、三次の予防レベルで行われ得る。一次予防は病気の発症を回避し、二次及び三次レベルの予防は、疾患の進行と症状の出現を防ぎ、並びに機能を回復することにより、すでに確立された疾患の悪影響を減らし、疾患に関連する合併症を減らすことを目的とした活動を含む。

【0292】

送達方法
１つの態様において、本発明は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、治療薬、又はこれらの任意の組み合わせを目的の標的に送達するための方法を提供する。そのような標的の例には、特に限定されるものではないが、免疫細胞、Ｔ細胞、常在Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、癌性細胞、疾患又は障害に関連する細胞、疾患又は疾患に関連する組織、脳組織、中枢神経系組織、肺組織、頂端表面組織、上皮細胞、内皮細胞、肝臓組織、腸組織、結腸組織、小腸組織、大腸組織、糞便、骨髄、マクロファージ、脾臓組織、筋肉組織、関節組織、腫瘍細胞、疾患組織、リンパ節組織、リンパ循環、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0293】

様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又は組成物を投与することを含む。例えばいくつかの実施態様において、本発明は、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を送達する本発明のＬＮＰ又はその組成物、核酸分子、治療薬、又はこれらの任意の組み合わせを、細胞に送達するための方法を含む。そのような細胞の例には、特に限定されるものではないが、Ｔ細胞、常在Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、癌性細胞、疾患又は障害に関連する細胞、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0294】

１つの態様において、本発明はまた、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子を、それを必要とする被験体に送達するための方法を開示する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物を、被験体に投与することを含む。

【0295】

１つの態様において、本発明はまた、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、並びに核酸分子、アジュバント、及び／又は治療薬を、それを必要とする被験体に送達するための方法を開示する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物を対象に投与することを含む。様々な実施態様において、この方法は、ｍＲＮＡ分子並びに核酸分子、アジュバント、及び／又は治療薬を、被験体の細胞、組織、又はその両方に送達する本発明のＬＮＰ又はその組成物を含む。

【0296】

１つの態様において、この方法は遺伝子送達法である。

【0297】

１つの実施態様において、この方法は、本発明のＬＮＰ組成物を使用する一過性トランスフェクションの形態として、目的の標的（例えば細胞、組織など）に導入することができる本明細書に記載のＩＶＴ ＲＮＡを含む。

【0298】

１つの実施態様において、この方法は、組成物の単回投与を含む。１つの実施態様において、この方法は、組成物の複数回投与を含む。

【0299】

いくつかの実施態様において、組成物は、皮内送達経路、皮下送達経路、筋肉内送達経路、脳室内送達経路、髄腔内送達経路、経口送達経路、静脈内送達経路、気管内送達経路、腹腔内送達経路、子宮内送達経路、又はこれらの任意の組み合わせによって投与される。

【0300】

いくつかの実施態様において、本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物の治療有効量を投与することを含む、目的の標的（例えば細胞、組織など）への、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子、核酸分子、治療薬、又はこれらの任意の組み合わせの送達のための方法は、多くの異なる方法、例えば商業的に入手可能な方法のいずれかと同時に行われ、この商業的に入手可能な方法には、特に限定されるものではないが、電気穿孔法（Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)）、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Harvard Instruments, Boston, Mass.）、又はGene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、マルチポレーター（Multiporator）（Eppendort, Hamburg Germany）、TransIT（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Mirus, Madison WI）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド媒介トランスフェクション、又は「遺伝子銃」（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）などの微粒子銃送達システムが含まれる。

【0301】

特定の例において、コードするｍＲＮＡを送達することによってタンパク質を発現させることは、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、又はウイルスベクターを使用する方法に比べて多くの利点がある。ｍＲＮＡトランスフェクション中、所望のタンパク質のコード配列が細胞に送達される唯一の物質であるため、プラスミド骨格、ウイルス遺伝子、及びウイルスタンパク質に関連するすべての副作用を回避できる。さらに重要なことに、ＤＮＡベース及びウイルスベースのベクターとは異なり、ｍＲＮＡはゲノムに組み込まれるリスクがなく、タンパク質の生産はｍＲＮＡの送達直後に開始される。例えば、コードするｍＲＮＡのインビボ注入から１５～３０分以内に、高レベルの循環タンパク質が測定されている。特定の実施態様において、タンパク質ではなくｍＲＮＡを使用することにも多くの利点がある。循環中のタンパク質の半減期は短いことが多いため、タンパク質治療には頻繁な投与が必要であるが、ｍＲＮＡは数日間の継続的なタンパク質生産のテンプレートを提供する。タンパク質の精製には問題があり、悪影響を引き起こす凝集体やその他の不純物が含まれている可能性がある（Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265）。

【0302】

宿主細胞中のｍＲＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ、例えばノーザンブロッティング及びＲＴ－ＰＣＲ；例えば、免疫原性手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって又は本明細書に記載のアッセイによって、本発明の範囲内にある薬剤を同定して、特定のペプチドの有無を検出するなどの「生化学的」アッセイが含まれる。

【0303】

治療法
本発明は、ＣＡＲをコードする１種以上のｍＲＮＡ分子を含む本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物の有効量を投与することを含む、被験体において適応免疫応答を誘導する方法を提供する。様々な態様において、本発明は、１種以上のＬＮＰとＣＡＲをコードする１種以上のｍＲＮＡ分子とを含む少なくとも１種のＬＮＰ組成物の有効量を投与することを含む、被験体において適応免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は、核酸分子、治療薬、又はこれらの任意の組合わせをさらに含む。いくつかの実施態様において、核酸分子は１種以上の抗原をコードする。

【0304】

１つの実施態様において、この方法は、抗原に関連する感染症、癌、又は疾患若しくは障害に対する免疫を、被験体に提供する。従って本発明は、抗原に関連する感染症、癌、又は疾患若しくは障害を治療又は予防する方法を提供する。例示的な抗原及び関連する感染症、疾患、及び腫瘍は、本明細書の他の場所に記載されている。

【0305】

例えば、この方法は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、関節炎、心臓病、心血管疾患、神経障害又は疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、胎児性疾患、胎児の発育に影響を与える遺伝性疾患、又は癌を、投与される組成物の抗原のタイプに応じて、治療又は予防するために使用され得る。

【0306】

以下は、開示された方法及び組成物によって治療することができる癌の非限定的な例である：急性リンパ芽球性；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂癌；基底細胞癌；胆管癌、肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系の異型奇形／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚性腫瘍；小脳星状細胞腫；脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上胚葉腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中分化の松果体実質腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽細胞；視覚経路及び視床下部神経膠腫；脳及び脊髄腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、消化管；中枢神経系の異型奇形／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚性腫瘍；中枢神経系リンパ腫；小脳星状細胞腫大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸癌；脊索腫、小児期；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；食道癌；ユーイングファミリーの腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼の癌、眼内黒色腫；眼の癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（胃）癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；胚細胞腫瘍、頭蓋外；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児脳幹；神経膠腫、小児脳星状細胞腫；神経膠腫、小児視覚経路及び視床下部；有毛細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞（肝臓）癌；組織球症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚経路神経膠腫；眼内黒色腫；膵島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄性；白血病、慢性リンパ性；白血病、慢性骨髄性；白血病、有毛細胞；唇癌及び口腔癌；肝臓癌；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、エイズ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞；リンパ腫、非ホジキンリンパ腫；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫；髄芽腫；黒色腫；黒色腫、眼内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；潜在性原発を伴う転移性頸部扁平上皮癌；口腔癌；多発性内分泌腺腫症症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；真菌症；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔及び副鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；中咽頭癌；骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣の低悪性度腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、膵島細胞腫瘍；パピローマ症；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；褐色細胞腫；中分化の松果体実質腫瘍；松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；腎盂及び尿管、移行上皮癌；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；肉腫、ユーイング肉腫；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚癌（非黒色腫）；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌、潜在性原発性、転移性を伴う頸部扁平上皮癌；胃（胃）癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；咽喉癌；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺癌；腎盂及び尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍、妊娠；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンストレームマクログロブリン血症；及びウィルムス腫瘍。

【0307】

１つの実施態様において、組成物は、感染症、疾患、心臓病、心血管疾患、神経障害又は疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、又は抗原に関連する癌を有する被験体に投与される。１つの実施態様において、組成物は、感染症、疾患、心臓病、心血管疾患、神経障害又は疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、又は抗原に関連する癌を発症するリスクのある被験体に投与される。例えば、組成物は、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫などと接触するリスクがある被験体に投与することができる。１つの実施態様において、組成物は、遺伝的要因、環境的要因などにより、癌を発症する可能性が高い被験体に投与される。

【0308】

いくつかの実施態様において、組成物は、皮内送達経路、皮下送達経路、筋肉内送達経路、脳室内送達経路、髄腔内送達経路、経口送達経路、静脈内送達経路、気管内送達経路、腹腔内送達経路、子宮内送達経路、又はこれらの任意の組み合わせによって投与される。。

【0309】

別の実施態様において、抗原をコードするＲＮＡを含む本発明の組成物は、同じ配列を有する未修飾のインビトロで合成されたＲＮＡ分子よりも有意に適応性の高い免疫応答を誘導する。別の実施態様において、組成物は、その未修飾の対応物よりも２倍大きい適応免疫応答を示す。別の実施態様において、適応免疫応答は３倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は５倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は７倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は１０倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は１５倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は２０倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は５０倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は１００倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は２００倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は５００倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は１０００倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は２０００倍上昇している。別の実施態様において、適応免疫応答は、別の倍数の差だけ上昇している。

【0310】

別の実施態様において、「有意により大きな適応免疫応答を誘導する」とは、適応免疫応答の検出可能な上昇を指す。別の実施態様において、この用語は、適応免疫応答の倍数の上昇を指す（例えば、上に列挙された倍数の上昇の１つ）。別の実施態様において、この用語は、ＲＮＡを含む本発明の組成物が、同じ種の単離されたＲＮＡ分子よりも低い用量又は頻度で投与しても、有効な適応免疫応答を誘導することができることを指す。別の実施態様において、この上昇は、ＲＮＡを含む本発明の組成物が、単回投与の使用により投与して、有効な適応免疫応答を誘導することができるようなものである。

【0311】

別の実施態様において、ＲＮＡを含む本発明の組成物は、同じ配列を有する単離されたインビトロで合成されたＲＮＡ分子よりも有意に小さい自然免疫原性を示す。別の実施態様において、ＲＮＡを含む本発明の組成物は、その単離された対応物より２倍小さい自然免疫応答を示す。別の実施態様において、自然免疫原性は３倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は、５倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は７倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は１０倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は１５倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は２０倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は５０倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は１００倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は２００倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は５００倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は１０００低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は２０００倍低下している。別の実施態様において、自然免疫原性は、別の倍数の差だけ低下している。

【0312】

別の実施態様において、「有意に小さい自然免疫原性を示す」とは、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。別の実施態様において、この用語は、自然免疫原性の倍数の減少を指す（例えば、上に列挙された倍数の低下の１つ）。別の実施態様において、この用語は、ＲＮＡを含む本発明の組成物の有効量が、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく、投与され得るような低下を指す。別の実施態様において、この用語は、ＲＮＡを含む本発明の組成物が、組換えタンパク質の産生を検出可能に低下させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与され得るような低下を指す。別の実施態様において、低下は、ＲＮＡを含む本発明の組成物が、組換えタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与され得るようなものである。

【0313】

１つの実施態様において、本発明は一部は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法に関連する。様々な実施態様において、この方法は、治療有効量の本発明の少なくとも１種のＬＮＰ又はその組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、組成物は、核酸分子、治療薬、又はこれらの組み合わせを目的の標的（例えば細胞、組織など）に送達する。

【0314】

１つの実施態様において、この方法は、１種以上の抗原及び１種以上のアジュバントをコードする１種以上の核酸分子を含む組成物を投与することを含む。１つの実施態様において、この方法は、１種以上の抗原をコードする第１の核酸分子と１種以上のアジュバントをコードする第２の核酸分子とを含む組成物を投与することを含む。１つの実施態様において、この方法は、１種以上の抗原をコードする１種以上の核酸分子を含む第１の組成物を投与し、１種以上のアジュバントをコードする１種以上の核酸分子を含む第２の組成物を投与することを含む。

【0315】

特定の実施態様において、この方法は、複数の抗原、アジュバント、又はこれらの組み合わせをコードする複数の核酸分子を被験体に投与することを含む。

【0316】

特定の実施態様において、本発明の方法は、投与後少なくとも数日間、本明細書に記載される抗原又はアジュバントの持続的発現を可能にする。しかしながら、特定の実施態様において、核酸が被験体ゲノムに組み込まれていないため、特定の実施態様においてこの方法は一過性の発現も提供する。

【0317】

特定の実施態様において、この方法は、本明細書に記載の抗原又はアジュバントの安定した発現を提供するＲＮＡを投与することを含む。いくつかの実施態様において、ＲＮＡの投与は、自然免疫応答をほとんど又は全く引き起こすことなく、有効な適応免疫応答を誘導する。

【0318】

治療方法における本発明の組成物の投与は、当技術分野で公知の方法を使用していくつかの異なる方法で達成することができる。１つの実施態様において、本発明の方法は、例えば経腸又は非経口投与を含む被験体の全身投与を含む。特定の実施態様において、この方法は組成物の皮内送達を含む。別の実施態様において、この方法は組成物の静脈内送達を含む。いくつかの実施態様において、この方法は組成物の筋肉内送達を含む。１つの実施態様において、この方法は組成物の皮下送達を含む。１つの実施態様において、この方法は組成物の吸入を含む。１つの実施態様において、この方法は組成物の鼻腔内送達を含む。

【0319】

本発明の組成物は、単独で、又は別の薬剤と組み合わせて、被験体に投与することができることが理解されよう。

【0320】

従って、本発明の治療方法及び予防方法は、本発明の方法を実施するために、本明細書に記載の抗原、アジュバント、又はこれらの組み合わせをコードする医薬組成物の使用を包含する。本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与することができる。１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物において本発明の化合物の濃度が１０ｎＭ～１０μＭになる用量の投与を想定している。

【0321】

典型的には、本発明の方法で哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る用量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり０．０１μｇ～約５０ｍｇの量の範囲であり、投与される正確な用量は、特に限定されるものではないが、哺乳動物の種類及び治療される病状の種類、哺乳動物の年齢及び投与経路を含む多くの要因により変動するであろう。好ましくは、化合物の投与量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約０．１μｇから約１０ｍｇまで変動するであろう。より好ましくは、投与量は、哺乳動物の体重１キログラムあたり約１μｇから約１ｍｇまで変動するであろう。

【0322】

組成物は、哺乳動物に１日数回の頻度で投与するか、又はより少ない頻度で、例えば１日１回、週１回、２週間に１回、月に１回、又はさらに少ない頻度で、例えば数か月ごとに１回、又は１年に１回以下で投与され得る。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、特に限定されるものではないが、治療される疾患の種類と重症度、哺乳動物の種類と年齢などであるの任意の数の要因に依存するであろう。

【0323】

特定の実施態様において、本発明の組成物又はワクチンの投与は、単回投与によって実施され得るか、又は複数回投与によって追加免疫され得る。

【0324】

１つの実施態様において、本発明は、本明細書に記載の１種以上の抗原又はアジュバントをコードする１つ以上の組成物を投与することを含む方法を含む。特定の実施態様において、この方法は相加効果を有し、組み合わせを投与することの全体的な効果は、各抗原又はアジュバントを投与することの効果の合計にほぼ等しい。別の実施態様において、この方法は相乗効果を有し、組み合わせを投与することの全体的な効果は、各抗原又はアジュバントを投与することの効果の合計よりも大きい。

【0325】

１つの実施態様において、この方法は、例えば皮内投与を含む、被験体への組成物の全身投与を含む。特定の実施態様において、この方法は、被験体に複数回の投与を行うことを含む。別の実施態様において、この方法は、組成物の単回投与を行うことを含み、ここで、単回投与は、適応免疫応答を誘導するのに有効である。

【0326】

実験例
本発明は、以下の実験例を参照してさらに詳細に説明される。これらの例は、例示のみを目的として提供されており、特に明記されていない限り、限定することを意図したものではない。従って本発明は、決して以下の例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるすべての変更態様を包含すると解釈されるべきである。

【0327】

当業者は、さらなる説明なしで、前述の説明及び以下の例示的実施例を使用して、本発明を作成及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の好適な実施態様を具体的に指摘するものであり、本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0328】

実施例１：ｍＲＮＡベースのＴ細胞工学操作のためのイオン化可能脂質ナノ粒子
脂質ベース及びポリマーベースの材料で構成されるナノ粒子（ＮＰ）ベースの送達システムは、機械的及びウイルス細胞工学手法を使用して、直面する課題を克服するための有望な手段を提供する（DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866, Mukalel AJ et al., 2019, Cancer Lett, 458:102-112）。ＮＰには、核酸荷物を安定化し、細胞内送達を補助し、毒性を軽減する能力を含む多くの潜在的な利点がある（Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Fornaguera C et al., 2018, Adv Healthc Mater, 7:1-11; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Islam MA et al., 2015, Biomater Sci, 1519-1533）。細胞へのｍＲＮＡ送達のためのポリマーベースのＮＰについていくつかの研究が行われ、ＥＰと比較して毒性が低下するなどの有望な結果が得られている（CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Olden BR et al., 2018, J Control Release, 282:140-147; Moffett HF et al., 2017, Nat Commun, 8:389; Demoulins T et al., 2016, Biol Med, 12:711-722; Anderson DG et al., 2003, Angew Chem Int Ed Engl, 42:3153-3158）。

【0329】

しかし、イオン化可能脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムは、Alnylam's Onpattro（Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Garber K et al., 2018, Nat Biotechnol, 36:777）の承認を得ており、ＲＮＡ送達の文脈でポリマーよりも臨床的に進歩している。さらに、ＬＮＰはイオン化可能脂質コアを有し、これは生理学的に適切なｐＨで中性を維持するが、エンドソームなどの酸性環境で電荷を蓄積して、最終的にエンドソームの脱出を助け、強力な細胞内核酸送達を引き起こす（Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Fan YN et al., 2018, Biomater Sci Royal Society of Chemistry, 6:3009-3018）。これは、免疫細胞を含むさまざまな細胞タイプで検証されており、毒性は最小限に抑えられており、リンパ球送達に関する過去の研究では、ＬＮＰが市販のリポフェクタミンよりも有効にｍＲＮＡを送達することが明らかになった（Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915）。

【0330】

さらに、ＬＮＰの容易に変更可能な組成により、物理化学的特性を調整して特定の細胞型への取り込みを最大化でき、イオン化可能な特性により、負に荷電した核酸荷物との静電的な複合体形成を可能にする（Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306）。これらの特性により、ＬＮＰは、ヒトＣＡＲ Ｔ細胞工学操作用のＬＮＰプラットフォームの開発に関するこの研究にとって理想的なプラットフォームになっている。

【0331】

本明細書に記載の研究は、新規のイオン化可能脂質Ｃ１４－４を利用し、Ｃ１４－４脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を生成してＴ細胞をトランスフェクトする。データは、Ｃ１４－４ ＬＮＰを使用すると、ＥＰと比較してより低い毒性で、同じ効力のＴ細胞トランスフェクションが得られることを示している。さらに、Ｃ１４－４ ＬＮＰを用いて作成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、癌細胞の死滅に関して、ＥＰで生成されたＣＡＲ Ｔ細胞と同じように機能した。Ｃ１４－４ ＬＮＰのさらなる利点には、患者のＴ細胞の採取と再注入を回避するために、インビボのＴ細胞工学操作に適用できる可能性があること、及び（Ｃ１４－４ ＬＮＰ製剤パラメーターを変更することによって）さらに最適化されて、ｍＲＮＡ送達を強化できる能力がすでに示されていることが含まれる。

【0332】

Ｃ１４－４ ＬＮＰは、ＣＡＲ Ｔ細胞の生成などの臨床製造環境や研究環境の両方で、Ｔ細胞を工学操作するための新しい方法を提供することができる。Ｃ１４－４は、リポフェクタミン（細胞ベースの研究におけるゴールドスタンダードのトランスフェクション試薬）と比較してｍＲＮＡ送達を増強することができたため、ＣＡＲ適用を超えてＴ細胞を研究するために使用することができる。

【0333】

より具体的には、２４個のＬＮＰの多様なライブラリーが生成され（図２Ａ）、特性評価され（図２Ｂ）、不死化ヒトＴ細胞株であるジャーカット細胞へのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達についてスクリーニングされた。イオン化可能脂質は、最初にマイケル付加化学によって合成され、ここで、ポリアミンコアはさまざまな長さの過剰のエポキシド末端アルキル鎖と反応された（図２Ｃ）。ここで、脂質はＴ細胞へのｍＲＮＡ送達について評価された。

【0334】

ＬＮＰを調製するために、イオン化可能脂質をエタノール中で他の３つの賦形剤と組み合わせた：（ｉ）ＬＮＰの安定性と膜融合のためのコレステロール、（ｉｉ）ＬＮＰの二重層構造を強化し、エンドソーム脱出を促進する１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び（ｉｉｉ）凝集と非特異的エンドサイトーシスを低減するＣ１４－ＰＥＧ（Granot Y et al., 2017, Semin Immunol, 34:68-77; Varkouhi AK et al., 2011, J Control Release, 151:220-228; Mui BL et al., 2013, Mol Ther Acids, 2:1-8）。次に、このエタノール相をマイクロ流体デバイスで水相ｍＲＮＡと混合した（図１）。これらの賦形剤とこれらのモル比は、ｍＲＮＡ送達用に以前に最適化されたＬＮＰ製剤に基づいて選択され、これは、一般に（ｉ）リン脂質成分としてのＤＯＰＥ、（ｉｉ）モルパーセントの低下したイオン化可能脂質、及び（ｉｉｉ）濃度が上昇したコレステロール及び脂質－ＰＥＧ、を利用した（Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822）。賦形剤のモル比の変化が物理化学的特性と最終的にＬＮＰの強力な送達に影響を与えるため、成分の比はこれらの実験を通じて一定に保たれた（Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822; Cheng Q et al., 2018, Adv Mater, 30:1805308）。

【0335】

機能的ｍＲＮＡを送達するＬＮＰの能力を評価するために、コード化されたレポータータンパク質としてルシフェラーゼを選択した。このスクリーニングにより、一般的に使用されるトランスフェクション試薬であるリポフェクタミンと比較して、ｍＲＮＡ送達を強化する７つのＬＮＰ製剤が明らかになった（Cardarelli F et al., 2016, Sci Reports, 6:25879）。さらに、ジャーカット細胞（不死化ヒトＴ細胞）へのｍＲＮＡ送達について２４個のＬＮＰをスクリーニングすると、最高のＬＮＰ製剤であるＣ１４－４ ＬＮＰが、その強力な送達と低毒性のためにさらなる開発のために選択された。次に、Ｃ１４－４ ＬＮＰを初代Ｔ細胞のトランスフェクション用に最適化すると、飽和イオン化脂質の精製が、粗生成物よりも改善されたｍＲＮＡ送達が得られることが示された。プラットフォームの翻訳可能性を例示するために、最適化されたＣ１４－４ ＬＮＰを使用して、ＣＡＲ ｍＲＮＡを封入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した（図１Ｃ）。ＥＰベースのｍＲＮＡ送達と比較して、Ｃ１４－４ ＬＮＰは、処理されたＴ細胞で毒性が少なく、トランスフェクトされたＴ細胞で、同様の量の表面ＣＡＲ発現をもたらした。ＡＬＬ細胞との共培養アッセイでは、ＬＮＰで生成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＥＰで生成されたＣＡＲ Ｔ細胞と同じ強力な癌細胞死滅能力を示した。従って、ＬＮＰは、ＣＡＲ Ｔ細胞のｍＲＮＡベースのエクスビボ工学操作の代替戦略として検証された。

【0336】

このデータに基づいて、Ｃ１４－４ ＬＮＰは、ＣＡＲ Ｔ細胞の生成などの臨床製造環境や研究環境の両方で、Ｔ細胞を工学操作するための新しい方法を提供することができる。Ｃ１４－４は、リポフェクタミン（細胞ベースの研究におけるゴールドスタンダードのトランスフェクション試薬）と比較してｍＲＮＡ送達を増強することができたため、ＣＡＲ適用を超えてＴ細胞を研究するために使用することができる。その後の研究では、Ｃ１４－４ ＬＮＰ製剤を最適化して、Ｔ細胞及びＴ細胞株へのｍＲＮＡ送達をさらに強化するための有望な結果が示されている。Ｃ１４－４ ＬＮＰは、ＣＤ－１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡを初代ヒトＴ細胞に、より毒性の低いＥＰと同程度に効果的に送達することも示された。

【0337】

ＬＮＰライブラリーの特性評価
この試験では、イオン化可能脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達について調べた。ＬＮＰが選択されたのは、これらが、インビボ及びエクスビボで広範囲の細胞及び組織標的に対して高い効力と低い毒性で、ｍＲＮＡを細胞内に送達することが示されているためである。最近では、ＬＮＰは広範囲の免疫細胞タイプへの核酸送達に利用されている（Berdeja JG et al., 2017, J Clin Oncol, 35; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306; Midoux P et al., 2014, Expert Rev Vaccines, 14:221-234; Lokugamage MP et al., 2019, Adv Mater, 1902251:1-8）。

【0338】

Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達を具体的に調べるために、最初にマイケル付加化学を介してイオン化可能脂質材料を合成して、２４個の異なるＬＮＰ製剤のライブラリーを生成し、ここで、ポリアミンコアを過剰の様々な長さのエポキシ末端アルキル鎖と反応させた（図２と図５）。このライブラリーの合成された特定のイオン化可能脂質は、以前にＬＮＰに調製され、免疫細胞にｓｉＲＮＡとｍＲＮＡを送達することが示されているイオン化可能脂質の構造類似体である（Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Leuschner F et al., 2012, Nat Biotechnol, 29:1005-1010）。

【0339】

脂質は、広範囲の細胞タイプではなく、具体的にＴ細胞へのｍＲＮＡ送達について評価された。ＬＮＰを調製するために、イオン化可能脂質をエタノール中で他の３つの賦形剤と組み合わせた：（ｉ）ＬＮＰの安定性と膜融合のためのコレステロール、（ｉｉ）ＬＮＰの二重層構造を強化し、エンドソーム脱出を促進するＤＯＰＥ、及び（ｉｉｉ）凝集と非特異的エンドサイトーシスを低減するＣ１４－ＰＥＧ（Granot Y et al., 2017, Semin Immunol, 34:68-77; Varkouhi AK et al., 2011, J Control Release, 151:220-228; Mui BL et al., 2013, Mol Ther Acids, 2:1-8）。次に、このエタノール相をマイクロ流体デバイスで水相ｍＲＮＡと混合した（図１Ａ）。これらの賦形剤とこれらのモル比は、ｍＲＮＡ送達用に以前に最適化されたＬＮＰ製剤に基づいて選択され、これは、一般に（ｉ）リン脂質成分としてのＤＯＰＥ、（ｉｉ）モルパーセントの低下したイオン化可能脂質、及び（ｉｉｉ）濃度が上昇したコレステロール及び脂質－ＰＥＧ、を利用した（Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822）。賦形剤のモル比の変化が物理化学的特性と最終的にＬＮＰの強力な送達に影響を与えるため、成分の比はこれらの実験を通じて一定に保たれた（Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822; Cheng Q et al., 2018, Adv Mater, 30:1805308）。

【0340】

次に、得られたＬＮＰを、動的光散乱（ＤＬＳ）とＡ２６０吸光度測定を使用して、サイズとｍＲＮＡ濃度について特性評価した。ｚ平均測定値として報告されるＬＮＰの直径は、５１．０５～９７．０１ｎｍの範囲で、ＰＤＩは０．３未満であった（図７）。Ａ２６０吸光度として測定されたｍＲＮＡ濃度は、３３．３～４８．３ｎｇ／μＬの範囲のＬＮＰ製剤全体で一貫性を示した。まとめるとこれらの結果は、Ｔ細胞送達のためのこの試験で使用されたｍＲＮＡを封入する２４個の異なるＬＮＰ製剤の調製を確認した。

【0341】

ジャーカット細胞へのｍＲＮＡ送達のためのＬＮＰのスクリーニング
機能的ｍＲＮＡを送達するＬＮＰの能力を評価するために、コード化されたレポータータンパク質としてルシフェラーゼを選択した。ルシフェリンの添加後、ｍＲＮＡから翻訳されたルシフェラーゼタンパク質のみが反応して発光シグナルを生成し、機能的なｍＲＮＡ送達と相関する容易に検出可能な出力を生成する（Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7）。これらの実験で使用されたルシフェラーゼｍＲＮＡは、Ｎ１－メチル－シュードＵ及び５－メチル－Ｃ修飾を利用し、これらは、ｍＲＮＡの翻訳を強化し、ＬＮＰ内にうまく封入されることが示されている（Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svitkin YV et al., 2017, Nucelic Acids Res, 45:6023-6036; Trixl L et al., 2018, WIREs RNA, 10:1-17）。これらの修飾は、ＬＮＰ内のｍＲＮＡ封入、ｍＲＮＡの送達、及び全体的な免疫原性を変化させる可能性があるため、これらの特定のＬＮＰ送達ビヒクルについて最適化された修飾についてのさらなる試験は、将来の研究で検討することができる（Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kariko K et al., 2005, Immunity, 23:165-175; Li J et al., 2017, ACS Nano, 11:2531-2544; Shen X et al., 2018, Nucleic Acids Res, 46:1584-1600; Sahin U et al., 2014, Nat Rev Drug Discovery,13:759-780）。

【0342】

ルシフェラーゼｍＲＮＡの機能的送達は、Ｔ細胞の挙動を研究するために一般的に利用される不死化ヒトＴ細胞の系統であるジャーカット細胞を使用して観察された（Olden BR et al., 2018, J Control Release, 282:140-147; Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8; Cancer P et al., 2018, Nucleic Acid Ther, 28:285-296）。ルシフェラーゼｍＲＮＡを封入したＬＮＰを使用して、３０ｎｇ／６０，０００細胞の濃度でジャーカット細胞を処理した。４８時間後、発光測定によりルシフェラーゼ発現が評価された。ＬＮＰ製剤からの発光測定値は、未処理の細胞群に対して正規化され、インビトロでゴールドスタンダードと広く見なされている一般的に使用されるトランスフェクション試薬である市販のリポフェクタミンと比較した（Cardarelli F et al., 2016, Sci Reports,1-8; Wang T et al., 2018, Molecules, 23）。ライブラリースクリーニングにより、リポフェクタミンよりも有意に高いルシフェラーゼ発現をもたらし、ルシフェラーゼｍＲＮＡをジャーカット細胞に送達する能力の改善を示す７つのＬＮＰ製剤が明らかになった（図３Ａ）。これらの７つのうち、３つの製剤はＣ１２テールを有するイオン化可能脂質を有し、３つはＣ１４－テールを有し、１つはＣ１６テールを有した。ポリアミンコア３、６、及び７は、脂質テールの長さに関係なく、リポフェクタミンと比較してトランスフェクションを強化しなかった。しかし、ポリアミンコア２、４、及び５はすべて、１つの環と追加の酸素のみの類似した構造を有し、ルシフェラーゼの発現が最も高い５つの製剤、つまりＣ１４－４、Ｃ１４－２、Ｃ１４－５、Ｃ１６－２、及びＣ１２－４ ＬＮＰの生成に関与していた。

【0343】

次に、これらの上位５つのＬＮＰ製剤を、広範囲のｍＲＮＡ濃度にわたって比較して、上位のＬＮＰ製剤とジャーカット細胞トランスフェクションに最適なＬＮＰ用量との両方を決定した。結果は、元のライブラリーのスクリーニングからの最高性能のＬＮＰ製剤であるＣ１４－４ ＬＮＰが、上位５つの製剤の中で最も高いルシフェラーゼ発現を誘導することを確認した（図３Ｂ）。このルシフェラーゼ発現の上昇は、２０ｎｇを超える用量で他のすべてのＬＮＰ製剤と比較して有意であり、ジャーカット細胞におけるＣ１４－４ ＬＮＰの最適用量が３０ｎｇであることを示した。Ｃ１４－４ ＬＮＰ製剤の直径は７０．１７ｎｍで濃度は３５．６ｎｇ／μＬであるため、Ｃ１４－４ ＬＮＰの性能の向上は、サイズやｍＲＮＡ濃度の違いを反映していない（図３Ｃ）。ジャーカット細胞に対するＣ１４－４ ＬＮＰの毒性は最小限であり、細胞生存率はリポフェクタミン処理及び未処理の細胞群と同等であり、Ｃ１４－４ ＬＮＰによる処理後に９５％を超える生存率が測定された。

【0344】

さらに、Ｃ１４－４を介して送達されたｍＲＮＡの一過性発現を検証するために、ＬＮＰで処理されたジャーカット細胞におけるルシフェラーゼ発現を９６時間にわたって観察した。結果は、２４時間と比較して４８時間では２３％の発現の低下を、７２時間までに８４％の低下を示し、９６時間までに検出可能な発現はなく（図３Ｄ）、一過性のルシフェラーゼ発現が確認され、その後の実験のための２４時間の時点の使用を教示していた。まとめると、これらの結果は、ｍＲＮＡ送達のトップ製剤としてＣ１４－４ ＬＮＰの選択を認めており、インビトロのＣ１４－４ ＬＮＰの最適化されたトランスフェクション法を提供した。

【0345】

初代ヒトＴ細胞への脂質ナノ粒子媒介ｍＲＮＡ送達
外来診療所で癌免疫療法で使用されたＣＡＲ Ｔ細胞が、採取されたＴ細胞（ＣＤ３＋）を使用して生成されるため、最高性能のＣ１４－４ ＬＮＰを、初代ヒトＴ細胞へのｍＲＮＡ送達に利用し、ジャーカット細胞株を超える翻訳可能性を証明した。ジャーカット細胞株の制限は、それがＣＤ４＋Ｔ細胞のみに由来されることを含むが、初代Ｔ細胞はＣＤ８＋表現型も含む（Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8）。しかし、初代Ｔ細胞はトランスフェクションを達成するために活性化を必要とする（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551）。ＣＤ３及びＣＤ２８抗体で表面がコーティングされた広く臨床的に利用されている磁気ビーズであるダイナビーズは、ＣＡＲ Ｔ臨床試験で使用されているものと同様の方法でＴ細胞の活性化に利用された（Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7; Wang X et al., 2016, Mol Ther Oncolytics, 3:1-7; Lee DW et al., 2015, Lancet, 385:517-528）。単離されたＴ細胞はＣＤ４＋：ＣＤ８＋の１：１の比率で懸濁され、広範囲の濃度でルシフェラーゼｍＲＮＡを封入したＣ１４－４ ＬＮＰで処理された。２４時間後、ルシフェラーゼの発現と細胞生存率を定量化した（図４Ａ）。ＬＮＰは、ｍＲＮＡの用量依存的にＴ細胞中のルシフェラーゼ発現を誘導し、ルシフェラーゼｍＲＮＡがＴ細胞にうまく送達されたことを示した。さらに、わずかな毒性が最高用量でのみ観察され、Ｃ１４－４ ＬＮＰの一次細胞との生体適合性を示している。

【0346】

Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達についてのＣ１４－４の可能性をさらに試験するために、完全に飽和したイオン化可能脂質をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、精製した生成物を利用してＣ１４－４ ＬＮＰを作成した。これらの精製Ｃ１４－４ ＬＮＰを、粗Ｃ１４－４イオン化可能脂質から作成されたＣ１４－４ ＬＮＰと比較して、どの構造が強力なｍＲＮＡ送達に関与しているかを検証した。精製Ｃ１４－４ ＬＮＰのＤＬＳ及びＡ２６０吸光度の特性評価により、直径６５．１９ｎｍ及びｍＲＮＡ濃度２９．８ｎｇ／μＬが明らかになり、これは、粗Ｃ１４－４生成物で作成されたＬＮＰと大きな違いはなかった（図８）。リボグリーン（Ribogreen）アッセイを使用して各製剤がｍＲＮＡを封入する能力を評価すると、粗製剤と精製製剤は、同様の封入効率を有しそれぞれ９２．５％と８６．３％であることが明らかになった。最後に、ＴＮＳアッセイで、２つのＬＮＰ製剤をその表面イオン化すなわちｐＫａを評価した。ｐＫａは、ＬＮＰが５０％プロトン化されるｐＨとして定義され、ｐＨがＬＮＰの表面電荷と安定性にどのように影響するかを示す（Hajj KA et al., 2019, Small,15:1-7）。イオン化可能脂質のｐＫａは７未満であるため、これは酸性のエンドソーム区画で荷電され、封入されたｍＲＮＡが放出される（Hajj KA et al., 2019, Small,15:1-7; Zhang J et al., 2011, Langmuir, 27:9473-9483）。粗Ｃ１４－４ ＬＮＰと精製Ｃ１４－４ ＬＮＰの両方がイオン化可能であることが証明され、精製製剤のｐＫａ値がわずかに高かった（図４Ｂ）。

【0347】

次に、粗Ｃ１４－４ ＬＮＰ及び精製Ｃ１４－４ ＬＮＰを、初代Ｔ細胞にｍＲＮＡを送達する能力について比較した。Ｔ細胞は、１：１の比率のＣＤ４＋とＣＤ８＋に懸濁され、Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化された後にＬＮＰで処理された。ルシフェラーゼｍＲＮＡを封入した粗Ｃ１４－４ ＬＮＰ及び精製Ｃ１４－４ ＬＮＰは、２つの濃度でルシフェラーゼの発現と生存率について試験された（図４Ｃ）。両方の濃度で、精製Ｃ１４－４ ＬＮＰは、粗ＬＮＰ製剤と比較してルシフェラーゼ発現が有意に上昇しており、両方の製剤は細胞生存率に最小限の影響しか与えなかった。全体として、毒性を上昇させることなくルシフェラーゼ発現を上昇させることは、精製Ｃ１４－４ ＬＮＰが初代Ｔ細胞ｍＲＮＡ送達のための最高性能の製剤であることを示している。

【0348】

ＬＮＰは、毒性の低い初代Ｔ細胞にＥＰと同じくらい効果的にＣＡＲ ｍＲＮＡを送達する
発光測定を介して、Ｔ細胞への機能的なルシフェラーゼコード化ｍＲＮＡの送達を定量化した後、送達ビヒクルの臨床的に関連する応用として、Ｃ１４－４ ＬＮＰをＣＡＲ ｍＲＮＡ送達に利用した。最初の研究で、一過性のＣＡＲ発現が毒性及びオフターゲット効果に関連する障害を克服する可能性があることが示唆されたため、ｍＲＮＡを用いて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞が多くの臨床試験で利用されてきた（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756）。しかし、これらの研究では、ｍＲＮＡは、電気的に透過性のＴ細胞膜に依存する一般的に使用され強力で毒性のあるトランスフェクション法である電気穿孔法（ＥＰ）を介して、Ｔ細胞に送達された（Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Dullaers M et al., 2004, Mol Ther, 10:768-779; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:1059-1070）。ここで、ＣＤ１９＋ ＣＡＲ ｍＲＮＡを封入しているＣ１４－４ ＬＮＰはＥＰと比較され、毒性を引き起こすことなく機能的なＣＡＲ Ｔ細胞を生成する能力を決定した。

【0349】

ＬＮＰを使用して、同一の４５０ｎｇ／μＬのｍＲＮＡ濃度でＥＰと比較して、１：１のＣＤ４＋：ＣＤ８＋比で初代Ｔ細胞を処理した。得られたＴ細胞集団は、蛍光標識抗体とフローサイトメトリーを使用してＣＤ１９＋ ＣＡＲ発現について分析され、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の観点から定量化された（図５Ａ）。結果として得られた最高のＭＦＩは、ＥＰ及び精製Ｃ１４－４ ＬＮＰを使用して処理されたＴ細胞に由来し、一方、粗Ｃ１４－４ ＬＮＰはより低いＭＦＩを生成した。これらの値をＴ細胞の未処理対照群に対して正規化すると、ＥＰは未処理の細胞よりもＭＦＩの１０倍の増加を示し、精製されたＣ１４－４ ＬＮＰは９．４倍の増加を示したが、粗Ｃ１４－４ ＬＮＰはＭＦＩを４．５倍しか増加させなかった。従って、ルシフェラーゼｍＲＮＡ送達で観察されたように、粗Ｃ１４－４製剤は発現を誘導する効果が、その精製された対応物よりも低かった。ＥＰ処理と比較してＬＮＰ製剤で処理されたＴ細胞の生存率も定量化され（図５Ｃ）、ＥＰと比較してＬＮＰ処理は、毒性を大幅に低下させたことを示している。ルシフェラーゼｍＲＮＡ送達で以前に見られたように、精製されたＬＮＰと粗ＬＮＰは、それぞれ７６％と７８％の同様に高い生存率を有した。これは、ＥＰ処理Ｔ細胞で観察された３１％の生存率とは対照的であり、現在使用されているこのｍＲＮＡ送達プロセスの細胞毒性を強調している。全体として、これらの結果は、エクスビボでのＴ細胞へのｍＲＮＡ送達について、ＥＰよりもＣ１４－４ ＬＮＰを利用することの安全上の利点を強調している。

【0350】

ＥＰ及び精製されたＣ１４－４ ＬＮＰがＴ細胞で同様のＣＤ１９＋ ＣＡＲ発現を誘導するため、２つのｍＲＮＡ送達方法を、共プレート癌細胞死滅アッセイを使用して機能的ＣＡＲ発現について評価した。工学操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞Ｎａｌｍ６と共にプレーティングすることにより、癌細胞の死滅を、Ｎａｌｍ６細胞のみと比較した場合の発光の減少として評価することができる。このアッセイと細胞株の両方が、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能と治療の可能性を実証するために、過去の研究で日常的に利用されてきた（Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Castella M et al., 2019, Mol Ther Methods Clin Dev, 12:134-144; An N et al., 2016, Oncotarget., 7; Li X et al., 2018, Cell Rep, 23:2130-2141; .Pan Y et al., 2018, PNAS, 115:1-6）。ここで、精製されたＣ１４－４ ＬＮＰ又はＥＰを介して送達されたｍＲＮＡで工学操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を、ある範囲のＴ細胞対エフェクター細胞比で比較した。４８時間後、ＥＰ及びＣ１４－４ ＬＮＰ処理群はほぼ同じように機能し、未処理群よりも多くの癌細胞死滅をもたらした（図５Ａ）。従って、精製されたＣ１４－４ ＬＮＰは、ｍＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の現在の送達基準であるＥＰに匹敵するｍＲＮＡ誘導ＣＡＲ Ｔ細胞の生成に成功した。まとめると、これらの結果は、精製されたＣ１４－４ ＬＮＰを、ＥＰと比較して同様の効力と減少したＴ細胞毒性を備えたｍＲＮＡベースのＣＡＲ Ｔ細胞工学操作の方法として検証している。

【0351】

要約すると、本明細書に記載のデータは、Ｔ細胞へのｍＲＮＡ送達に有効な新規イオン化可能脂質と新規ＬＮＰ製剤とを開示している。本発明は一部は、新規のＬＮＰシステムを使用して、Ｔ細胞へのｍＲＮＡの標的化された送達の問題に対処している。本発明は一部は、Ｔ細胞へのｍＲＮＡの強力な送達に利用されてきた、Ｃ１４－４と呼ばれるイオン化可能脂質と、Ｔ細胞へのｍＲＮＡの強力な送達に利用されているそのＬＮＰ製剤（コレステロール、リン脂質、及びＰＥＧ成分を含む）とを開示する。粗脂質と精製された完全飽和脂質の両方が使用された。本明細書に記載の試験はまた、Ｃ１４－４及びＣ１４－４ ＬＮＰ製剤が、低い毒性でＴ細胞にｍＲＮＡを送達する能力を示し、そして現在のゴールドスタンダード試薬であるリポフェクタミンの有効性の増強は、Ｔ細胞が工学操作される方法を変える可能性をＣ１４－４に与えることを示す。これは、本発明が将来の商業的可能性を秘めている臨床分野（例えばＣＡＲ Ｔ治療薬）に適用できるが、これはまた、Ｔ細胞のトランスフェクションが特に難しいため、実験室ベース／研究環境にも適用できる。

【0352】

追加の研究は、おそらく抗体ベースの標的化物質又は他の標的化リガンドを追加して、Ｔ細胞へのインビボのｍＲＮＡ送達のためにこの脂質ナノ粒子を使用するようになっている。賦形剤の比率（リン脂質、コレステロール、ＰＥＧ、及びＣ１４－４のモル比の変化）及びイオン化可能脂質とｍＲＮＡの比率の観点で、ＬＮＰ製剤のさらなる最適化が試験される。このため、新しい賦形剤の導入や、線状の代わりに分岐アルキル鎖を使用するなどのＣ１４－４脂質自体への修飾が行われる可能性がある。さらに、ルシフェラーゼ及びＣＡＲを超える他のｍＲＮＡ荷物が探索される。

【0353】

ここで、これらの実験で使用される材料と方法について説明する。

【0354】

脂質合成
イオン化可能脂質は、マイケル付加化学を使用してエポキシド末端アルキル鎖（Avanti Polar Lipids）をポリアミンコア（Enamine, Monmouth Jct, NJ）と反応させることによって合成された。成分を７倍過剰のアルキル鎖と一緒にして、磁気攪拌棒で８０℃で４８時間混合した。次に、粗生成物をRotavapor R-300（BUCHI, Newark, DE）に移して溶媒を蒸発させ、脂質をエタノールに懸濁した。最後に、最高性能の脂質（Ｃ１４－４）を精製するために、脂質画分をCombiFlash（登録商標） Nextgen 300+クロマトグラフィーシステム（Teledyne ISCO, Lincoln, NE）で分離し、飽和脂質画分を液体クロマトグラフィー－質量分析計を使用して分子量により同定した。

【0355】

ＣＡＲ ｍＲＮＡ合成
既に記載されたように（Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070）、標準的なインビトロ転写法を使用して、ｍＲＮＡを生成した。簡単に説明すると、ＣＤ１９を標的としＣＤ３ゼータ及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを有する第２世代レンチウイルスベクターをコードするプラスミドＤＮＡを一晩線状化し、次に製造業者の説明書に従ってT7 mMessage ULTRAキット（Thermo Fisher）を使用してｍＲＮＡを生成した。次に、ｍＲＮＡをポリＡテール化及びキャップをして、RNeasy miniキット（Qiagen）を使用して精製した。

【0356】

ＬＮＰの調製と特性評価
ＬＮＰを合成するために、ｍＲＮＡを含む水相と、脂質及びコレステロール成分を含むエタノール相とを、前述のようにマイクロ流体デバイスを使用して混合した（Chen D et all., 2012, J Am Chem Soc, 134:6948-6951）。簡単に説明すると、水相は１０ｍＭクエン酸緩衝液と、１ｍｇ／ｍＬのＮ１－メチル－シュードＵと５－メチル－Ｃ置換を有するルシフェラーゼｍＲＮＡ（Trilink Biotechnologies, San Diego, CA）又はＣＡＲ ｍＲＮＡ（上述したように合成された）のいずれかとを使用して調製された。エタノール相を調製するために、イオン化可能脂質、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）、コレステロール（Sigma, St. Louis, MO）、及び脂質固定されたＰＥＧ（Avanti Polar Lipids）成分を、それぞれ３５％、１６％、４６．５％、及び２．５％の設定モル比で一緒にした。Pump33DSシリンジポンプ（Harvard Apparatus, Holliston, MA）を使用して、エタノール相と水相を３：１の比率でマイクロ流体デバイス内で混合した（Chen D et all., 2012, J Am Chem Soc, 134:6948-6951）。混合後、ＬＮＰを１ｘＰＢＳに対して２時間透析した後、０．２２μｍフィルターで滅菌した。次に、Zetasizer Nano（Malvern nstruments, Malvern, UK）で実行された動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、１ｘＰＢＳに懸濁されたＬＮＰの直径（ｚ平均）と多分散度指数（ＰＤＩ）を３重測定で測定した。NanoDrop ND-1000分光光度計（ThermoFisher, Waltham, MA）を使用して、各ＬＮＰ製剤のｍＲＮＡ濃度を得た。

【0357】

最高性能のＬＮＰ製剤のさらなる分析は、ＬＮＰの封入効率とｐＫａをそれぞれ決定するためのQuant-iT Ribogreen (ThermoFisher) 及び６－（ｐ－トルイジニル）ナフタレン－２－スルホン酸（ＴＮＳ）アッセイを含んだ。Quant-iT Ribogreen は前述のように実行した（Heyes J et al., 2005, J Control Release, 107:276-287）。簡単に説明すると、等濃度のＬＮＰをトリトンＸ－１００（Sigma）で処理してＬＮＰを溶解するか、未処理のままで、１０分後、群をＲＮＡ標準とともに９６ウェルプレートに３重測定でプレーティングした。蛍光リボグリーン試薬を製造業者の説明書に従って添加し、得られた蛍光をプレートリーダーで測定した。測定値を標準曲線と比較してＲＮＡ含有量を定量化し、封入効率を計算した。ＬＮＰ ｐＫａを決定するために、ＴＮＳアッセイを使用して、前述のように表面イオン化を測定した（Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7）。１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭクエン酸アンモニウム、及び２０ｍＭ酢酸アンモニウムの緩衝液を、０．５刻みで２～１２の範囲のｐＨ値に達するように調整した。ＬＮＰを、９６ウェルプレートの各ｐＨ調整溶液に３重測定で添加した。次にＴＮＳを各ウェルに添加して、６μＭの最終ＴＮＳ濃度に到達させ、得られた蛍光をプレートリーダーで読み取った。次にｐＫａは、蛍光強度が最大値の５０％になるｐＨ（５０％のプロトン化を反映）として計算された。

【0358】

ジャーカット細胞のｍＲＮＡトランスフェクション
不死化ヒトＴ細胞株（Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8）であるジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）を、Ｌ－グルタミン（ThermoFisher）を有し、１０％胎児牛血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。細胞を９６ウェルプレートのウェルあたり６０，０００細胞で６０μＬの培地中でプレーティングし、直ちに、ＰＢＳでさまざまな濃度に希釈した６０μＬのＬＮＰで処理した。陽性対照比較として使用したLipofectamine MessengerMAXトランスフェクション試薬（ThermoFisher）を、製造業者のプロトコールに従って１０分間ｍＲＮＡと一緒にし、ＬＮＰ群と同じｍＲＮＡ濃度を使用してウェルを処理した。４８時間のインキュベーション後、細胞を３００×ｇで４分間遠心分離し、５０μＬの１×溶解バッファー（Promega, Madison, WI）及び１００μＬのルシフェラーゼアッセイ基質（Promega）に再懸濁した。次に、Infinite M Plexプレートリーダー（Tecan, Morrisville, NC）を使用して、発光を定量化した。各群からの発光シグナルを、未処理の細胞、又は最低濃度の処理群のいずれかに対して正規化し、試薬はあるが細胞のないウェルとして測定したバックグラウンドを差し引いた。細胞毒性を評価するために、ジャーカット細胞を同じ条件下でプレーティングし、６０，０００細胞あたり３０ｎｇのｍＲＮＡでＣ１４－４又はリポフェクタミンのいずれかで処理した。４８時間後、６０μＬのCellTiter-Glo（Promega）を各ウェルに添加し、ＡＴＰ生成に対応する発光をプレートリーダーを使用して定量した。各群からの発光シグナルを未処理の細胞に対して正規化し、バックグラウンドを差し引いた。

【0359】

初代Ｔ細胞のｍＲＮＡトランスフェクション
初代Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、ペンシルベニア大学のヒト免疫学コア（University of Pennsylvania Human Immunology core）から入手し、ＣＤ４：ＣＤ８の１：１の比率で一緒にした。次に、ＬＮＰで処理する細胞を、ビーズと細胞の比率が３：１のHuman Tactivator CD3/CD28 Dynabeads（ThermoFisher）で一晩活性化した。活性化後、細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり６０，０００細胞で６０μＬの培地中でプレーティングし、さまざまなｍＲＮＡ濃度のＬＮＰで処理した。電気穿孔法では、Ｔ細胞を培地で３回洗浄し、１０８細胞／ｍＬで再懸濁し、Ｔ細胞１ｍＬあたり１００μｇのｍＲＮＡの濃度で転写されたｍＲＮＡと混合した。次に、ECM830 Electro Square Wave Porator（Harvard Apparatus BTX）を使用して、細胞を２ｍｍキュベットで電気穿孔した。ルシフェラーゼｍＲＮＡ処理を用いた実験では、上記と同じプロトコールを使用して、４８時間後に発光を、そして２４時間後に毒性を評価した。ＣＡＲ ｍＲＮＡ処理の場合、表面ＣＡＲの発現は、Novartis Pharmaceuticalsから寛大に提供されたＣＤ１９ ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体を使用して検出された。ＣＡＲ ｍＲＮＡ処理の毒性は、CellTiter Gloキットを使用して、上記のように評価した。

【0360】

機能的アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞は、エフェクター対標的の比率を変えて、ＡＬＬ細胞株であるルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ－６細胞と共プレーティングした。共培養で４８時間後、Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（Perkin-Elmer, Waltham, MA）を細胞培養に添加して最終濃度を１５μｇ／ｍＬにし、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、Synergy H4 imager（BioTek, Winooski, VT）を使用して発光を検出し、BioTek Gen5ソフトウェアを使用してシグナルを分析した。特異的溶解パーセントは、エフェクターを含まない標的細胞対照を使用して計算された。

【0361】

実施例２：Ｔ細胞送達のための脂質ナノ粒子の工学操作
賦形剤比に関するＣ１４－４製剤パラメーターのさらなる最適化はすでに開始されている。生成された製剤の２つのライブラリーが添付されている（ライブラリーＡの結果に基づいて、ライブラリーＡと次にライブラリーＢ；ライブラリーＡの代表的な製剤をＡ＃、ライブラリーＢの代表的な製剤をＢ＃と命名する）。どちらもＣ１４－４脂質を使用して作成されたが、新しい製剤のいくつかは、毒性を上昇させることなく、元のＣ１４－４製剤よりもＴ細胞株でｍＲＮＡ送達の増強を示した。

【0362】

イオン化可能なＬＮＰは、核酸を含む治療用高分子の細胞内送達の媒体として大きな有望性を示した（Mukalel A.J., 2019, Cancer Lett, 458:102-112）。ＬＮＰ製剤は多数あるが、これらは一般的な賦形剤を利用している：膜の安定性のためのコレステロール、エンドソーム脱出を助けるリン脂質、免疫原性を低下させるためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である（Reichmuth A.M., 2016, Ther Deliv, 7:319-334）。さまざまな賦形剤の組み合わせは、ＬＮＰの物理化学的特性を大幅に変化させることができ、それによってこれらの送達能力に影響を与える可能性がある（Kauffman K., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306）。この試験の過程で、ＬＮＰの２つのライブラリーがＴ細胞用に設計された（図９及び図１０）。直交ＤＯＥ計画法を使用して製剤が選択されたため、広範囲の成分変動は１６の代表的な製剤のみで観察された。

【0363】

各製剤には、さまざまなモル比率のイオン化可能脂質、コレステロール、ヘルパー脂質、及び脂質結合ＰＥＧが含まれていた。各製剤のｚ平均直径とｐＫａは、それぞれ、動的光散乱法、２－（ｐ－トルイジニル）ナフタレン－６－スルホン酸（ＴＮＳ）アッセイ、及び２６０ｎｍの吸光度測定を使用して決定された。不死化したヒトＴ細胞であるジャーカット細胞を各製剤で４８時間処理し、インビトロでの細胞内送達を評価した。各製剤の細胞毒性は、市販のCell-Titer Gloアッセイによって同様に評価された。

【0364】

最適化された製剤に関するデータを図９及び図１０に示す。各製剤のインビトロ送達効率は、標準的なルシフェラーゼ発現アッセイを使用して評価された。簡単に説明すると、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰが、不死化したヒトＴ細胞であるジャーカット細胞に、６０，０００細胞あたり３０ｎｇのｍＲＮＡ濃度で送達された。４８時間のインキュベーション後、細胞は溶解され、ホタルルシフェリンで処理された。次に、ＬＮＰ媒介トランスフェクションの程度をプレートリーダーで発光強度として測定した。各製剤の細胞毒性は、市販のCell-Titer Gloアッセイを使用して同様に評価された。

【0365】

ライブラリーＡの特性評価により、賦形剤の組成に関連する送達のいくつかの傾向が明らかになった。ライブラリーＡの最適な賦形剤条件により、次世代ライブラリーＢが開発された。ライブラリーＢの製剤は、ライブラリーＡの製剤よりもはるかに優れた封入効率とより大きなｚ平均直径を示し、ライブラリーＢの製剤のいくつかはライブラリーＡの最高性能の製剤より優れており、上記の傾向を支持していた。さらにライブラリーＢのすべての製剤は、４８時間にわたって８０％を超える生存率を示すことが観察された。従って、Ｔ細胞への細胞内送達のための複数の非常に強力なＬＮＰ製剤の開発が報告されている。これらのＬＮＰは、癌免疫療法を含む将来のＴ細胞工学操作用途に使用できる可能性がある。

【0366】

実施例３：ＬＮＰの賦形剤組成物を変更して、ｍＲＮＡをＴ細胞に送達する能力を向上させる（毒性は最小限で）
この例は、代表的なライブラリーＡ及びライブラリーＢの製剤で得られたインビトロ及びエクスビトロ（ex vitro）データを示す。インビトロ試験において、様々な賦形剤濃度（例えば図９Ａ）を有するＣ１４－４９４の１６個の代表的な製剤を含むライブラリーＡが、ルシフェラーゼｍＲＮＡをジャーカット細胞株（不死化ヒトＴ細胞）に送達する能力についてスクリーニングされた。ライブラリーＡの結果に基づいて生成されたライブラリーＢ（例えば図１０）も、ジャーカットでインビトロ試験でスクリーニングされた。さらなるエクスビボ試験は、ライブラリーＡ及びＢの代表的な最高性能の製剤を使用して、初代Ｔ細胞へのルシフェラーゼｍＲＮＡの送達に焦点を当てた。

【0367】

より具体的には、ジャーカットは０ｎｇ／６０，００００細胞で２４時間処理された。ライブラリーＡからのデータに基づいてライブラリーＢに加えられた調整により、より多くの「ヒット」製剤（すなわち、標準製剤Ｓ２よりも高い送達を達成した製剤）がもたらされ、ＬＮＰ製剤全体の毒性が低下した。ＬＮＰ（ルシフェラーゼｍＲＮＡを含む）とのインキュベーションの２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイを使用してルシフェラーゼ活性を測定した（図１４Ａ）。生存率パーセントは、Cell Titer Gloアッセイを使用して同じ時点で測定された（図１４Ｂ）。各バーには３つの生物学的複製物（それぞれ３つの技術的複製物）が含まれており、０ｎｇ処理に対して正規化された。

【0368】

リポフェクタミンの比較（図１５）は、製剤Ｂ１０がこの市販の標準物質を上回っていることを示した。さらに、毒性試験の結果はどちらもジャーカットに対して毒性がないことを示した。

【0369】

さらに、ジャーカットをルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡで２４時間処理して、さまざまな濃度／用量でさまざまな代表的な製剤の発光と生存率を評価した（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。さらに、３つの異なる初代患者Ｔ細胞試料を一晩活性化し、標準物質、Ａ１６、又はＢ１０製剤の投与で処理した（図１７Ａ～図１７Ｃ）。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの送達値は、０ｎｇ処理に対して正規化された。ドナーの変動により、異なる全体的なルシフェラーゼ読み取り値が得られた。さらに、追加の試験は、ＣＡＲ ｍＲＮＡを初代Ｔ細胞に送達するための最高性能のＬＮＰ（製剤Ｂ１０）に注目している。

【0370】

本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施態様を参照して開示されてきたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の別の実施態様及び変更態様が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施態様及び同等の変更態様を含むと解釈されることを意図している。

【図1A】

【図1B-1C】

【図2A-2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B-3C】

【図3D-3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A-5B】

【図5C-5D】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【国際調査報告】