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特表2022-552015蝸牛細胞を標的とする遺伝子治療

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-14

(54)【発明の名称】蝸牛細胞を標的とする遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

A61K 48/00 20060101AFI20221207BHJP

A61P 27/16 20060101ALI20221207BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20221207BHJP

C12N 15/864 20060101ALI20221207BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20221207BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20221207BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00 ZNA

A61P27/16

A61K35/76

C12N15/864 100Z

C12N15/12

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523048

(86)(22)【出願日】2020-10-19

(85)【翻訳文提出日】2022-05-16

(86)【国際出願番号】 US2020056385

(87)【国際公開番号】W WO2021077115

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/923,398

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチインスティチュートアットネイションワイドチルドレンズホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】マイヤー，キャスリンクリスティーン

(72)【発明者】

【氏名】ベイ，カリム

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA34

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA34

(57)【要約】

本開示は、最適化された遺伝子治療ベクターを使用して蝸牛内の特定の細胞型を標的とする方法に関する。具体的には、本開示は、蝸牛細胞を特異的に標的とするための遺伝子治療ベクター、ならびに聴覚障害および聴覚消失関連障害を治療する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、前記導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを投与することを含み、前記遺伝子治療ベクターが、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法を使用して前記対象に投与される、方法。

【請求項2】

前記蝸牛細胞が内有毛細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

対象における聴覚消失または聴覚消失関連障害を治療する方法であって、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを前記対象に投与することを含み、前記遺伝子治療ベクターが、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法を使用して投与される、方法。

【請求項4】

前記聴覚消失関連障害が、ワーデンブルグ症候群（ＷＳ）、鰓弓耳腎スペクトラム障害、神経線維腫症２（ＮＦ２）、スティックラー症候群、アッシャー症候群Ｉ型、アッシャー症候群ＩＩ型、アッシャー症候群ＩＩＩ型、ペンドレッド症候群、ジャーベル・ランゲニールセン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、レフサム病、アルポート症候群、聴覚喪失－ジストニア－視神経細胞障害症候群、またはモーア・トラネジャーグ症候群である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記対象が聴覚消失または聴覚消失関連障害を患っている、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

【請求項7】

前記導入遺伝子が、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）、ガレクチン－１（配列番号１９）、またはガレクチン－３（配列番号２１）をコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記導入遺伝子が、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）、ガレクチン－１（配列番号１９）、またはガレクチン－３（配列番号２１）に対するｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記遺伝子治療ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴもしくはＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記遺伝子治療ベクターが髄腔内送達を使用して投与され、前記方法が、前記遺伝子治療ベクターの投与後に前記対象をトレンデレンブルグ体位に置くことをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子治療ベクターが、前記ベクターを前記脳脊髄液に直接適用する送達方法を使用して投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達するための組成物であって、前記組成物が、前記導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを含み、組成物が、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法のために配合される、組成物。

【請求項13】

前記蝸牛細胞が内有毛細胞である、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

対象における聴覚消失または聴覚消失関連障害を治療するための組成物であって、前記組成物が、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを含み、前記組成物が、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法のために配合される、組成物。

【請求項15】

【請求項16】

前記対象が聴覚消失または聴覚消失関連障害を患っている、請求項１２または１３に記載の組成物。

【請求項17】

【請求項18】

【請求項19】

前記導入遺伝子が、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）、ガレクチン－１（配列番号１９）またはガレクチン－３（配列番号２１）に対するｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記遺伝子治療ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴもしくはＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体である、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記組成物が対象への髄腔内送達のために配合され、前記対象が前記組成物の投与後にトレンデレンブルグ体位に置かれる、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ベクターを前記脳脊髄液に直接適用する送達方法を使用する投与のために配合される、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達するための薬剤の調製のための遺伝子治療ベクターの使用であって、前記遺伝子治療ベクターが前記導入遺伝子をコードし、そこで、前記薬剤が、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法を使用して前記対象に投与するために配合される、使用。

【請求項24】

前記蝸牛細胞が内有毛細胞である、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

対象における聴覚消失または聴覚消失関連障害を治療するための薬剤の調製のための遺伝子治療ベクターの使用であって、前記遺伝子治療ベクターが導入遺伝子をコードし、前記薬剤が、静脈内送達、髄腔内送達、または脳脊髄液にアクセスする任意の送達方法のために配合される、使用。

【請求項26】

【請求項27】

前記対象が聴覚消失または聴覚消失関連障害を患っている、請求項２３または２４に記載の使用。

【請求項28】

【請求項29】

前記導入遺伝子が、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）、ガレクチン－１（配列番号１９）またはガレクチン－３（配列番号２１）をコードする、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項30】

前記導入遺伝子が、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）に対するｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項31】

前記遺伝子治療ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴもしくはＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、またはそれらの誘導体である、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項32】

前記薬剤が髄腔内送達のために配合され、前記対象が前記薬剤の投与後にトレンデレンブルグ体位に置かれる、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項33】

前記薬剤が前記ベクターを前記脳脊髄液に直接適用する送達方法のために配合される、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、以下、５４８８２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：８１，０３７バイト、作成：２０２０年１０月１９日のように特定される、コンピュータ可読形態の配列表を含む。

【0002】

本開示は、最適化された遺伝子治療ベクターを使用して蝸牛内の特定の細胞型を標的とする方法に関する。具体的には、本開示は、蝸牛細胞を特異的に標的とするための遺伝子治療ベクター、ならびに聴覚障害および聴覚関連障害を治療する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

聴覚消失は世界中で一般的な感覚障害であり、言語習得前の聴覚喪失の多くは遺伝的原因によるものである。遺伝性聴覚消失に関連する３００を超える遺伝子座、および１００を超える原因遺伝子も特定されている。したがって、遺伝子治療は聴覚消失のための魅力的な治療法である。しかし、成人の哺乳類の蝸牛の感覚細胞は自己複製能力を欠いており、侵襲的な投与方法がこれらの細胞への損傷を増大させる可能性がある。

【0004】

人間の内耳は、体の中で最も密度の高い骨に包まれ、頭蓋底の奥深くに位置する、小さな３次元的に複雑な液体で満たされた構造である。音からの音響エネルギーは、鼓膜および中耳の耳小骨鎖の振動を介して蝸牛の体液に伝達され、基底膜に沿って進行する波を生成する。蝸牛の長さおよび基底膜の硬さにより、可聴周波数の区別が可能になる。これは次に、有毛細胞、コルチ器に位置する特殊な感覚細胞によるメカノトランスダクションの活性化につながり、機械的刺激を電気的脱分極に変える。次に、内有毛細胞（ＩＨＣ）によって開始された電気信号は、聴覚神経を構成するらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）によって処理され、最終的に側頭葉の聴覚皮質でデコードされる１。

【0005】

コルチ器には、２つのクラスの感覚有毛細胞が含まれている。音によって運ばれる機械的情報を神経構造に伝達される電気信号に変換する内有毛細胞（ＩＨＣ）、ならびに複雑な聴覚機能に必要なプロセスである、蝸牛応答を増幅および調整する外有毛細胞（ＯＨＣ）である。内耳の他の潜在的な標的には、らせん神経節ニューロン、隣接する蓋膜の維持に重要ならせん板縁の柱状細胞、および保護機能を有し、新生児の初期段階まで有毛細胞への分化転換を誘発することができる支持細胞が含まれる。

【0006】

内耳は、液体で満たされた空間にアクセスするのが困難である。血液迷路バリアを含む、内有毛細胞へのアクセスには重大な物理的および拡散バリアがあり、したがって、内耳への治療薬の全身送達は制限されている。血液迷路は、ウイルスベクターおよび他の遺伝子治療試薬などの大きな分子の分布を遅らせる可能性がある。さらに、バリアの破壊は、有毛細胞の基底外側表面を浸すリンパ周囲空間への高カリウムの漏出につながる可能性があり、ニューロンはこれらの細胞を慢性的に脱分極させ、細胞死につながる可能性がある。さらに、内リンパと外リンパとの間の密着結合の破れは、蝸牛内電位の低下につながる可能性があり、それは、有毛細胞における感覚伝達の推進力を低下させ、したがって、蝸牛感度の低下および聴覚閾値の上昇をもたらす。（Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＪＡｓｓｏｃＲｅｓＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１８（５）：６４９－６７０，２０１７を参照されたい）。

【0007】

遺伝子治療のための有毛細胞への直接アクセスは、蝸牛管へのベクター注射によって達成され得るとの仮説が立てられている。ただし、蝸牛管への直接注射は、管内の繊細な高カリウム内リンパ液を変化させ、それによって蝸牛内電位を破壊し、感覚細胞の損傷および不可逆的な聴覚消失を引き起こす可能性がある。蝸牛管、鼓室階、および前庭階を取り巻く外リンパで満たされた空間には、中耳から卵円窓膜または正円窓膜（ＲＷＭ）を介してアクセスできる。内耳への唯一の非骨開口部であるＲＷＭは、多くの動物モデルで比較的簡単にアクセスでき、この経路を使用したウイルスベクターの投与は十分に許容されている（Ａｓｋｅｗｅｔａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．７（２９５）：２９５ｒａ１０８，２０１５、Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．２４（１）：１７－２５，２０１６、Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．；１２５（１１）：２５５７，２０１）。

【0008】

アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、ワクシニアウイルスなどのウイルス遺伝子治療ベクターは蝸牛で試験されており、これらのベクターは一過性または次善の遺伝子導入のみをもたらした（Ｆｕｋｕｉ＆Ｒａｐｈｅａｌ，ＨｅａｒＲｅｓ．２９７：９９－１０５，２０１３）。現在までのところ、アデノウイルスのみが臨床プログラムに進んでいる（Ｌｕｅｂｋｅｅｔａｌ．Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ：８７－９８，２００９）。異なる投与経路を介したインビボ内耳注射のＡＡＶ血清型に関する以前の研究は、特にＲＷＭ注射を介した外有毛細胞（ＯＨＣ）の標的化の難しさを浮き彫りにし（Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．１２（４）：７２５－３３，２００５）、遺伝性聴覚喪失のマウスモデルにおける聴覚の部分的な救済のみをもたらした（Ａｋｉｌｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．７５（２）：２８３－９３，２０１２、Ａｓｋｅｗｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｃｅＴｒａｎｓ．Ｍｅｄ．７：２９５ｒａ１０８、２０１５、Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．ＭｏｌＴｈｅｒ．２４（１）：１７－２５、２０１６）。ＡＡＶベクターＡｎｃ８０Ｌ６５は、正円窓膜への注射を介して投与された場合、ＯＨＣを高効率で形質導入することが示された（Ｌａｎｄｅｇｇｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３５（３）：２８０－２８４，２０１７）。

【0009】

特に、遺伝子治療ベクターを蝸牛内の内有毛細胞に標的化することには多くの困難がある。例えば、蝸牛には非常に少数の内有毛細胞がある。さらに、有毛細胞は増殖せず、有毛細胞の最終的な数は発生の初期に到達し、その数は後年に増加することはない。

【0010】

現在、聴覚消失の生物学的治療はない。現在の最先端の治療は、聴覚神経を刺激する音の増幅および埋め込まれた電極に焦点を当てている。これらの戦略は、限られた患者集団の機能の部分的な回復を提供するが、自然な聴力の回復には近づかない。したがって、蝸牛細胞に侵襲的または損傷を与えない、蝸牛内のコルチ器の関連する細胞型に遺伝子治療ベクターを送達する方法の開発が必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ａｈｍｅｄｅｔａｌ．，ＪＡｓｓｏｃＲｅｓＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１８（５）：６４９－６７０，２０１７

【非特許文献2】Ａｓｋｅｗｅｔａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．７（２９５）：２９５ｒａ１０８，２０１５

【非特許文献3】Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．２４（１）：１７－２５，２０１６

【非特許文献4】Ｃｈｉｅｎｅｔａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．；１２５（１１）：２５５７，２０１

【非特許文献5】Ｆｕｋｕｉ＆Ｒａｐｈｅａｌ，ＨｅａｒＲｅｓ．２９７：９９－１０５，２０１３

【非特許文献6】Ｌｕｅｂｋｅｅｔａｌ．Ａｄｖ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ：８７－９８，２００９

【非特許文献7】Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒ．１２（４）：７２５－３３，２００５

【非特許文献8】Ａｋｉｌｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．７５（２）：２８３－９３，２０１２

【非特許文献9】Ｌａｎｄｅｇｇｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３５（３）：２８０－２８４，２０１７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本開示は、蝸牛の特定の細胞型を標的とする遺伝子治療ベクターを提供する。これらの遺伝子治療ベクターは、蝸牛内の細胞に導入遺伝子を送達するのに有用である。本開示は、静脈内送達、鼓室内送達もしくは髄腔内送達などの全身送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法を使用して、遺伝子治療ベクターを投与することを含む、聴覚消失を治療する方法を提供する。特定の細胞型を標的とする遺伝子治療法は、聴覚消失の治療について利点を有する。

【0013】

「聴覚消失」という用語は「聴覚障害」という用語と交換可能であり、これらの用語は、聴力検査によって通常の聴覚の閾値レベルを下回っていると判断された聴覚を指す。

【0014】

本開示は、対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを対象に投与することを含み、遺伝子治療ベクターが、静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達を使用して対象に投与される、方法を提供する。例えば、開示された方法は、内有毛細胞、外有毛細胞、神経節細胞、支持細胞、ダイテルス細胞、柱状細胞および／または上皮細胞などの蝸牛細胞に導入遺伝子を送達することをもたらす。

【0015】

本開示はまた、遺伝性聴覚消失、加齢性聴覚消失、または傷害もしくは疾患に関連する聴覚消失などの聴覚消失を治療する方法であって、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを対象に投与することを含み、遺伝子治療ベクターが、静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達を使用して投与される、方法を提供する。提供される方法は、遺伝子変異によって引き起こされた聴覚消失または損傷によって引き起こされた聴覚消失を治療する。

【0016】

例えば、本開示は、ワーデンブルグ症候群（ＷＳ）、鰓弓耳腎スペクトラム障害、神経線維腫症２（ＮＦ２）、スティックラー症候群、アッシャー症候群Ｉ型、アッシャー症候群ＩＩ型、アッシャー症候群ＩＩＩ型、ペンドレッド症候群、ジャーベル・ランゲニールセン症候群、ビオチニダーゼ欠乏症、レフサム病、アルポート症候群、聴覚喪失－ジストニア－視神経細胞障害症候群、またはモーア・トラネジャーグ症候群などの聴覚消失関連障害を患っている対象を治療する方法を提供する。

【0017】

本開示はまた、対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達するための組成物であって、組成物が、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを含み、組成物が、静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達を使用して投与するために配合される、組成物を提供する。例えば、開示された組成物は、内有毛細胞、外有毛細胞、神経節細胞、支持細胞、ダイテルス細胞、柱状細胞および／または上皮細胞などの蝸牛細胞に導入遺伝子を送達する。

【0018】

本開示はまた、遺伝性聴覚消失、加齢性聴覚消失、または傷害もしくは疾患に関連する聴覚消失などの聴覚消失を治療するための組成物であって、組成物が、導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを含み、組成物が、静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達のために配合される、組成物を提供する。提供される組成物は、遺伝子変異によって引き起こされた聴覚消失または損傷によって引き起こされた聴覚消失を治療するのに有用である。

【0019】

例えば、本開示は、ワーデンブルグ症候群（ＷＳ）、鰓弓耳腎スペクトラム障害、神経線維腫症２（ＮＦ２）、スティックラー症候群、アッシャー症候群Ｉ型、アッシャー症候群ＩＩ型、アッシャー症候群ＩＩＩ型、ペンドレッド症候群、ジャーベル・ランゲニールセン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、レフサム病、アルポート症候群、聴覚喪失－ジストニア－視神経細胞障害症候群、またはモーア・トラネジャーグ症候群などの聴覚消失関連疾患を患っている対象を治療するための組成物を提供する。

【0020】

本開示はまた、対象の蝸牛細胞に導入遺伝子を送達するための薬剤の調製のための導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターの使用であって、遺伝子治療が導入遺伝子をコードし、薬剤が静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達のために配合される、使用を提供する。例えば、開示された遺伝子治療ベクターの使用は、内有毛細胞、外有毛細胞、神経節細胞、支持細胞、ダイテルス細胞、柱状細胞および上皮細胞などの蝸牛細胞への導入遺伝子の送達をもたらす。

【0021】

本開示はまた、遺伝性聴覚消失、加齢性聴覚消失、または傷害もしくは疾患に関連する聴覚消失などの聴覚消失を治療するための薬剤の調製のための遺伝子治療ベクターの使用であって、対象に導入遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターを投与することを含み、薬剤が、静脈内（ＩＶ）送達、鼓室内送達、髄腔内送達、またはベクターを脳脊髄液に直接適用するために使用される任意の他の送達方法などの全身送達のために配合される、使用を提供する。例えば、開示された遺伝子治療ベクターは、遺伝子変異によって引き起こされた聴覚消失または損傷によって引き起こされた聴覚消失を治療するための薬剤の調製のために使用することができる。

【0022】

【0023】

目的の任意の導入遺伝子を蝸牛細胞に送達するための、開示された方法、組成物および使用。導入遺伝子は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であるか、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどの目的の遺伝子の発現を阻害、抑制、または沈静化する核酸である。例示的な導入遺伝子は、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１７２．２；配列番号２）、オトフェルリン（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４００４．６；配列番号６）、ペンドリン（ＳＬＣ２６Ａ）（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００６７１６０２５．３；配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＧ１）（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２４９；配列番号１０）、アクチビンＡもしくはインヒビン（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１９２；配列番号１２）、フォリスタチン（ＦＳＴ）（配列番号１４）、ガレクチン－１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２３０５．４；配列番号１９）、またはガレクチン－３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ００６７８０．１；配列番号２０）をコードするポリヌクレオチドである。さらに、導入遺伝子は、本明細書の表１、表２、表３、表４または表５に記載されている遺伝子の野生型ヌクレオチド配列である。

【0024】

開示された方法、組成物または使用のいずれかにおいて、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶＲＨ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＴＴまたはＡｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、およびそれらの誘導体である。

【0025】

開示された方法のいずれにおいても、遺伝子治療ベクターは、ＣＢプロモーター（配列番号１）、Ｐ５４６プロモーター（配列番号１６）、ＣＭＶプロモーター（配列番号１７またはＭｙｏ７Ａプロモーター（配列番号１８）を含む。

【0026】

さらに、開示された方法、組成物または使用のいずれかにおいて、遺伝子治療ベクター、組成物または薬剤は、髄腔内送達を使用して投与され、対象は、遺伝子治療ベクター、組成物または薬剤の投与後にトレンデレンブルグ体位に置かれる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本開示で試験されたＡＡＶベクターの概略図を提供する。

【図2】ベクターの髄腔内注射後の蝸牛へのＧＦＰ導入遺伝子の送達を示している。蝸牛の矢状凍結切片は、ＤＡＰＩおよびＧＦＰで染色される。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、参照用にのみ提供される。

【図3】ＡＡＶベクターの髄腔内注射後、４匹の異なるマウス（ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＦ、ｓｈｘ２ＩＴ－２Ｆ、ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＥ、およびｓｈｘ２ＩＴ－ＬＦＬＲ）の蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【図4】ＡＡＶベクターの髄腔内注射後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供し、マウスの蝸牛の異なる領域が示される。

【図5】ＡＡＶベクターの髄腔内注射後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチンの染色を提供する。

【図6】ＤＡＰＩおよびＧＦＰの髄腔内注射後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。この場合のカットは、蝸牛の様々な領域全体の標的化を視覚化できるように、様々な方向に向けられている。

【図7】髄腔内注射後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。この場合のカットは、蝸牛の様々な領域全体の標的化を視覚化できるように、様々な方向に向けられている。

【図8】髄腔内注射後のマウスの蝸牛前庭におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチンの染色を提供する。

【図9】傷害の原因となるノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチン（ファロイジン）の染色を提供し、ノイズへの曝露の直後にＡＡＶを注射した。番号が付けられたセクションは、より高い倍率で画像化された領域である。

【図10】傷害の原因となるノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチン（ファロイジン）の染色を提供し、ノイズへの曝露の直後にＡＡＶを注射した。１とラベル付けされたセクションは、より高い倍率で画像化された蝸牛の領域である。

【図11】傷害の原因となるノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチン（ファロイジン）の染色を提供し、ノイズへの曝露の直後にＡＡＶを注射した。番号が付けられたセクションは、より高い倍率で画像化された領域である。

【図12】傷害の原因となるノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびアクチン（ファロイジン）の染色を提供し、ノイズへの曝露の直後にＡＡＶを注射した。番号が付けられたセクションは、より高い倍率で画像化された領域である。

【図13】ノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびｍｙｏ７Ａの染色を提供し、ノイズへの曝露２４時間後にＡＡＶを髄腔内注射した。

【図14】ノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびｍｙｏ７Ａの染色を提供し、ノイズへの曝露２４時間後にＡＡＶを髄腔内注射した。番号が付けられたセクションは、より高い倍率で画像化された領域である。

【図15】ノイズに曝露された複数のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびｍｙｏ７Ａの染色を提供し、ノイズに曝された直後（０ｈｐｉ）または２４時間（２４ｈｐｉ）にＡＡＶを髄腔内注射した。

【図16】ノイズに曝露されたマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供し、ノイズに曝露された直後（０ｈｐｉ）にＡＡＶを注射した。この写真は、２４ｈｐｉのＩＴ注射マウスの最適な曝露で画像化されている。この写真は、２４ｈｐｉの最適な曝露での画像化が０ｈｐｉを過剰曝露するため、２４ｈｐｉの髄腔内注射動物のＧＦＰ発現が０ｈｐｉの髄腔内注射動物よりも低いことを示している。

【図17】蝸牛神経のヘマトキシリンおよびエオシン染色を提供する。略語は、コルチ器の構造の位置を示している。ＳＬ＝らせん板縁、ＴＭ＝蓋膜、ＯＨＣ＝外有毛細胞、ＩＨＣ＝内有毛細胞、ＢＭ＝基底膜。

【図18】ＡＡＶの静脈内注射後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【図19】ＡＡＶの静脈内注射後の複数のマウスからの蝸牛におけるＤＡＰＩ、ＧＦＰおよびＭｙｏＤの染色を提供する。各パネルは、異なるマウスからの蝸牛の画像である（上の行は１０倍、下の行は２０倍である）

【図20】ノイズによる損傷なしにＡＡＶを静脈内注射した後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【図21】ノイズによる損傷なしにＡＡＶを静脈内注射した後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【図22】ノイズによる損傷なしにＡＡＶを静脈内注射した後のマウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【図23】ノイズによる損傷に曝露されたが、ＡＡＶの静脈内注射を受けなかった対照マウスの蝸牛におけるＤＡＰＩおよびＧＦＰの染色を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本開示は、聴覚消失障害を治療するために蝸牛を標的とするためのＡＡＶ遺伝子治療の最適化を提供する。本明細書で提供されるデータは、ＡＡＶ９ベクターの投与に焦点を合わせているが、本開示は、蝸牛細胞を特異的に標的とするプロモーターを含む任意の遺伝子治療ベクターを使用することを企図し、これらの最適化されたベクターは、静脈内（ＩＶ）送達または髄腔内送達または脳脊髄液（ＣＳＦ）にアクセスする任意の他の送達を使用して投与される。例えば、データは、髄腔内注射を介して脳脊髄液に直接注射されたＡＡＶ９が、蝸牛の内有毛細胞における導入遺伝子の発現を標的とするのに効果的であることを示した。したがって、髄腔内注射は、遺伝子治療ベクターを蝸牛に送達するために、特に遺伝子治療ベクターを内有毛細胞に送達するために使用することができる。

【0029】

遺伝子治療ベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５個のヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さであり、ウイルス自体またはその誘導体を指すように使用することができる。この用語は、他に特定されない限り、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶの血清型は、各々特定のクレードと関連しており、そのメンバーは血清学的および機能的類似性を共有している。したがって、ＡＡＶはクレードによって称されてもよい。例えば、ＡＡＶ９配列は「クレードＦ」配列と呼ばれる（Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４））。本開示は、特定のクレード、例えばクレードＦ内の任意の配列の使用を企図する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１２ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ－１３ゲノムの一部は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ＡＡＶ－Ｂ１ゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＡＡＶベクターである。Ａｎｃ８０の配列は、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｉｎｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：１０５６－１０６８，２０１５、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅｅｔａｌ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６０１６３、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＴ２３５８０４－ＫＴ２３５８１２に提供されている。

【0030】

ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と結合した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連キャプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。

【0031】

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染はサイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。天然のＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部またはすべては、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含有する遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと置き換えられ得る。いくつかの場合において、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。

【0032】

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、野生型ＡＡＶウイルスまたはウイルス粒子を指す。「ＡＡＶ」、「ＡＡＶウイルス」、および「ＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では交換的に使用される。「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えＡＡＶウイルス、または組換え感染性のカプセル化ウイルス粒子を指す。「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶウイルス」、および「ｒＡＡＶウイルス粒子」という用語は、本明細書では交換的に使用される。

【0033】

「ｒＡＡＶゲノム」という用語は、修飾されている天然のＡＡＶゲノムに由来するポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、天然のｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を除去するために修飾されている。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは内因性５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムが由来するＡＡＶ血清型とは異なるＡＡＶ血清型からのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって５’末端および３’末端に隣接した目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、「遺伝子カセット」を含む。

【0034】

「ｓｃＡＡＶ」という用語は、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。「ｓｓＡＡＶ」という用語は、一本鎖ゲノムを含むｒＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶウイルス粒子を指す。

【0035】

本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態において、導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶＩＴＲを含む。導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、遺伝子カセットを形成するために標的細胞内で機能的である転写制御要素（プロモーター、エンハンサーおよび／またはポリアデニル化シグナル配列を含むが、これらに限定されない）に作動可能に連結されている。プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢ）、Ｐ５４６プロモーター、およびＭｙｏ７Ａプロモーターである。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなど）を含むが、これらに限定されない追加のプロモーターが本明細書で企図される。

【0036】

さらに、本明細書では、ＣＭＶプロモーター配列、ＣＢプロモーター配列、Ｐ５４６プロモーター配列、Ｍｙｏ７Ａプロモーター配列、および転写促進活性を示すＣＭＶ（配列番号１７）、ＣＢ（配列番号１）、Ｍｙｏ７Ａ（配列番号１８）、またはＰ５４６（配列番号１６）配列のヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のプロモーター配列が提供される。

【0037】

転写制御要素の他の例は、組織特異的制御要素、例えば、ニューロン内での特異的発現を可能にするか、または星状細胞内での特異的発現を可能にするプロモーターである。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターもまた、企図される。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞中で発現されたときに導入遺伝子ＲＮＡ転写物のプロセシングを容易にするためのイントロン配列を含んでもよい。このようなイントロンの一例は、ＳＶ４０イントロンである。

【0038】

「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の組み立ておよびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。「産生」という用語は、パッケージング細胞によるｒＡＡＶ（感染性のカプセル化されたｒＡＡＶ粒子）を産生するプロセスを指す。

【0039】

ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、それぞれアデノ随伴ウイルスの複製タンパク質およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。

【0040】

ＡＡＶについての「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶに対する様々なこのようなヘルパーウイルスは、当該技術分野において既知である。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含し得るが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ起源の多数のアデノウイルスは既知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン－バールウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらはＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手可能である。

【0041】

「ヘルパーウイルス機能）」とは、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされている機能を指す。本明細書中に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列をトランスでプロデューサー細胞に提供することによるものを含む多数の方法で提供され得る。

【0042】

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐＤＮＡを欠く。本明細書に企図されるｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲ）内のＡＡＶＤＮＡは、ＡＡＶ血清型Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７ｍｂ、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－ＲＨ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４、およびＡＡＶ－Ｂ１ならびにそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスを導出するのに好適な任意のＡＡＶ血清型からであり得る。上記されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。キャプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。本明細書における修飾キャプシドもまた企図され、グリコシル化および脱アミド化などの種々の翻訳後修飾を有するキャプシドを含む。アスパラギンまたはグルタミン側鎖を脱アミド化してアスパラギン残基をアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸残基に変換すること、およびグルタミンをグルタミン酸またはイソグルタミン酸に変換することは、本明細書に提供されるｒＡＡＶキャプシドにおいて企図される。例えば、Ｇｉｌｅｓｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２６（１２）：２８４８－２８６２（２０１８）を参照されたい。本明細書における修飾キャプシドもまた、治療を必要とする罹患組織および臓器にｒＡＡＶを指向させる標的化配列を含むと企図される。

【0043】

本明細書で提供されるＤＮＡプラスミドは、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を用いて感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染を許容することができる細胞に導入され得る。パッケージングされるべきｒＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶを産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶ粒子の産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。様々な実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えｒＡＡＶの送達を増強するために修飾され得る。キャプシドタンパク質に対する修飾は、一般的に当該技術分野において既知である。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＵＳ２００５／００５３９２２およびＵＳ２００９／０２０２４９０を参照されたい。

【0044】

パッケージング細胞を生成する方法は、ｒＡＡＶの産生に必要な成分をすべて安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）は、細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ｒＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されてもよい。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させられ得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の非限定的な例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

【0045】

ｒＡＡＶ粒子産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，１９８８Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌｅｔａｌ．（１９９３）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．（１９９６）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ粒子産生に関する文書の部分を特に強調する。

【0046】

感染性ｒＡＡＶ粒子を産生するパッケージング細胞が、本明細書でさらに提供される。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）であり得る。

【0047】

本開示のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ（例えば、感染性キャプシド形成したｒＡＡＶ粒子）も本明細書で提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐＤＮＡが存在しない。ｒＡＡＶゲノムは自己相補的（ｓｃ）ゲノムであり得る。ｓｃゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｃＡＡＶと称される。ｒＡＡＶゲノムは一本鎖（ｓｓ）ゲノムであり得る。一本鎖ゲノムを有するｒＡＡＶは、本明細書中でｓｓＡＡＶと称される。

【0048】

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、ＳｃｈｅｎｐｐａｎｄＣｌａｒｋ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，６９４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含み得る。

【0049】

ｒＡＡＶを含む組成物もまた提供される。組成物は、目的のポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。組成物は、目的とする異なったポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。いくつかの実施形態においては、ｒＡＡＶはｓｃＡＡＶまたはｓｓＡＡＶである。

【0050】

本明細書で提供される組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容される１つ以上の賦形剤を含む。許容される賦形剤は、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸塩、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸塩、もしくは他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎなどの非イオン性界面活性剤、ポロキサマー１８８などのコポリマー、プルロニック（登録商標）（例えば、プルロニックＦ６８）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される組成物は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、またはイオキシランなどの非イオン性の低浸透圧性化合物または造影剤を含有する薬学的に許容される水性賦形剤を含むことができ、非イオン性の低浸透圧性化合物を含有する水性賦形剤は、以下の特性：約１８０ｍｇｌ／ｍＬ、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇ水の蒸気圧浸透圧法による重量オスモル濃度、約２７３ｍＯｓｍ／Ｌの容量オスモル濃度、２０℃で約２．３ｃｐのおよび３７℃で約１．５ｃｐの絶対粘度、ならびに３７℃で約１．１６４の比重、のうちの１つ以上を有することができる。例示的な組成物は、約２０～４０％の非イオン性低浸透圧性化合物、または約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物を含む。例示的な組成物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のポロキサマー１８８、および約２５％～約３５％の非イオン性低浸透圧性化合物中に配合されたｓｃＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス粒子を含む。別の例示的組成物は、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８中に配合されたｓｃＡＡＶを含む。

【0051】

投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。本明細書で企図される投薬量には、約１×１０^７ｖｇ、約１×１０^８ｖｇ、約１×１０^９ｖｇ、約５×１０^９ｖｇ、約６×１０^９ｖｇ、約７×１０^９ｖｇ、約８×１０^９ｖｇ、約９×１０^９ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇ、約２×１０^１０ｖｇ、約３×１０^１０ｖｇ、約４×１０^１０ｖｇ、約５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇ、約１．１×１０^１１ｖｇ、約１．２×１０^１１ｖｇ、約１．３×１０^１１ｖｇ、約１．２×１０^１１ｖｇ、約１．３×１０^１１ｖｇ、約１．４×１０^１１ｖｇ、約１．５×１０^１１ｖｇ、約１．６×１０^１１ｖｇ、約１．７×１０^１１ｖｇ、約１．８×１０^１１ｖｇ、約１．９×１０^１１ｖｇ、約２×１０^１１ｖｇ、約３×１０^１１ｖｇ、約４×１０^１１ｖｇ、約５×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ、約１×１０^１３ｖｇ、約１．１×１０^１３ｖｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ、約１．３×１０^１３ｖｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ、約２×１０^１３ｖｇ、約２．５×１０^１３ｖｇ、約３×１０^１３ｖｇ、約３．５×１０^１３ｖｇ、約４×１０^１３ｖｇ、約４．５×１０^１３ｖｇ、約５×１０^１３ｖｇ、約６×１０^１３ｖｇ、約１×１０^１４ｖｇ、約２×１０^１４ｖｇ、約３×１０^１４ｖｇ、約４×１０^１４ｖｇ、約５×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１６ｖｇ、またはそれ以上の合計ウイルスゲノムが含まれる。約１×１０^９ｖｇから約１×１０^１０ｖｇ、約５×１０^９ｖｇから約５×１０^１０ｖｇ、約１×１０^１０ｖｇから約１×１０^１１ｖｇ、約１×１０^１１ｖｇから約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇ約１×１０^１５ｖｇ、約１×１０^１２ｖｇから約１×１０^１４ｖｇ、約１×１０^１３ｖｇから約６×１０^１４ｖｇ、および約６×１０^１３ｖｇから約１．０×１０^１４ｖｇ、２．０×１０^１４ｖｇ、３．０×１０^１４ｖｇ、５．０×１０^１４の投薬量も企図されている。ここで例示されている１つの用量は１．６５×１０^１１ｖｇである。

【0052】

ｒＡＡＶによって標的蝸牛膜細胞に形質導入する方法が提供されている。蝸牛細胞には、内有毛細胞、外有毛細胞、神経節細胞、支持細胞、ダイテルス細胞、柱状細胞、および上皮細胞が含まれる。

【0053】

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による機能性ポリペプチドの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、標的細胞へのＣＬＮ６ポリヌクレオチドの投与／送達を指すように使用される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチドまたはＲＮＡの持続的発現をもたらす。したがって、本開示は、髄腔内もしくはＩＶ送達、またはそれらの任意の組み合わせによって、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドをコードするｒＡＡＶを対象に投与／送達する方法を提供する。髄腔内送達は、脳または脊髄のくも膜の下の空間への送達を指す。いくつかの実施形態において、髄腔内投与は槽内投与による。

【0054】

聴覚消失に関連する障害
本開示は、聴覚消失を治療する方法を提供する。伝音聴覚消失は、外耳および／または中耳の耳小骨の異常に起因する。感音聴覚消失は、内耳構造（すなわち、蝸牛神経または聴覚神経）の機能不全に起因する。混合性聴覚消失は、伝音性聴覚消失と感音聴覚消失との組み合わせである。中枢聴覚機能障害は、第８脳神経、聴性脳幹もしくは大脳皮質のレベルでの損傷または機能障害に起因する。

【0055】

遺伝性聴覚消失は、症候群および非症候群の両方の症例を含むメンデルの法則、または遺伝的要因および環境要因の両方を含む複雑な遺伝に細分類される。症候性聴覚消失の遺伝的原因の要約を表１に示す。非症候性聴覚消失の遺伝的原因の要約を表２および表３に示す。Ｘ連鎖非症候性聴覚消失の要約を表４に示す（ＳｈｅａｒｅｒＡＥ，ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄＭＳ，ＳｍｉｔｈＲＪＨ．ＨｅｒｅｄｉｔａｒｙＨｅａｒｉｎｇＬｏｓｓａｎｄＤｅａｆｎｅｓｓＯｖｅｒｖｉｅｗ．１９９９Ｆｅｂ１４［Ｕｐｄａｔｅｄ２０１７Ｊｕｌ２７］．Ｉｎ：ＡｄａｍＭＰ，ＡｒｄｉｎｇｅｒＨＨ，ＰａｇｏｎＲＡ，ｅｔａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（Ｒ）［インターネット］．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；１９９３－２０１９を参照されたい）。

【表1-1】

【表1-2】

【表2-1】

【表2-2】

【表3-1】

【表3-2】

【表4】

【0056】

ミトコンドリアＤＮＡ病原性多様体は、カーンズ・セイヤー症候群などのまれな神経筋症候群、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソードを伴うミトコンドリア脳筋症（ＭＥＬＡＳ）、不規則な赤色線維を伴う心筋てんかん（ＭＥＲＲＦ）、ならびに運動失調および色素性網膜炎を伴う神経原性の脱力（ＮＡＲＰ）から、糖尿病、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの一般的な状態に至るまでの、聴覚消失を伴う様々な疾患に関与している。例えば。糖尿病患者の聴覚消失に関連する典型的な病原性多様体は、ＭＴＴＬ１およびＭＥＬＡＳの３２４３ＡからＧへの移行である。聴覚消失に関連するミトコンドリアＤＮＡ変異の要約を表５に示す。（ＳｈｅａｒｅｒＡＥ，ＨｉｌｄｅｂｒａｎｄＭＳ，ＳｍｉｔｈＲＪＨ．ＨｅｒｅｄｉｔａｒｙＨｅａｒｉｎｇＬｏｓｓａｎｄＤｅａｆｎｅｓｓＯｖｅｒｖｉｅｗ．１９９９Ｆｅｂ１４［Ｕｐｄａｔｅｄ２０１７Ｊｕｌ２７］．Ｉｎ：ＡｄａｍＭＰ，ＡｒｄｉｎｇｅｒＨＨ，ＰａｇｏｎＲＡ，ｅｔａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（Ｒ）［インターネット］．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；１９９３－２０１９を参照されたい。）

【表5】

【0057】

開示された方法のいずれかにおいて、必要としている対象の聴覚消失を治療するステップは、対象の聴力の改善、または対象の聴力障害の改善もしくは低減をもたらす。本明細書に記載の治療方法が聴覚消失または聴覚障害を改善または低減するかどうかを決定するための試験には、聴覚系の機能的状態を客観的に決定する生理学的試験、個人が聴覚情報をどのように処理するかを主観的に決定する聴力検査が含まれる。生理学的試験には、聴性脳幹反応試験（ＢＡＥＲ、ＢＳＥＲとも呼ばれるＡＢＲ）が含まれ、これは、刺激（例えば、カチッという音）を使用して、第８脳神経および聴性脳幹に由来し、表面電極で記録される電気生理学的反応を引き起こす。ＡＢＲの「波Ｖ検出閾値」は、神経学的に正常な個人の１５００～４０００Ｈｚ領域の聴覚過敏と最もよく相関し、ＡＢＲは、低周波数（＜１５００Ｈｚ）の感度を評価しない。

【0058】

聴覚定常応答（ＡＳＳＲ）試験は、客観的な統計ベースの数学的検出アルゴリズムを使用して、聴覚の閾値を検出および定義する。ＡＳＳＲは、広帯域または周波数固有の刺激を使用して取得でき、重度から高度の範囲で聴力閾値の微分を提供することができる。ＡＳＳＲ試験は、ＡＢＲが提供しない周波数固有の情報を提供するために頻繁に使用される。５００、１０００、２０００、および４０００Ｈｚの試験周波数が一般的に使用される。

【0059】

誘発耳音響放射（ＥＯＡＥ）は、蝸牛内で発生する音であり、マイクおよびトランスデューサーを備えたプローブを使用して外耳道で測定される。ＥＯＡＥは、主に広い周波数範囲にわたる蝸牛の外有毛細胞の活動を反映しており、４０～５０ｄＢＨＬよりも優れた聴覚感度を有する耳に存在する。イミタンス試験（ティンパノメトリー、音響反射閾値、音響反射減衰）は、中耳圧、鼓膜の可動性、耳管機能、および中耳骨の可動性を含む末梢聴覚系を評価する。

【0060】

聴力検査には、行動観察聴力検査（ＢＯＡ）および視覚強化聴力検査（ＶＲＡ）などの行動試験が含まれる。純音聴力検査（空気および骨伝導）では、周波数（またはピッチ）の関数として、個人が純音を「聞く」最低強度を決定することを伴う。２５０（中央のＣに近い）から８０００Ｈｚまでのオクターブ周波数はイヤホンを使用して試験される。強度またはラウドネスはデシベル（ｄＢ）で測定され、２つの音圧の比率として定義される。０ｄＢＨＬは、正常な聴覚の成人の平均閾値であり、１２０ｄＢＨＬは、痛みを引き起こすほど大きな音である。音声受信閾値（ＳＲＴ）および音声弁別が評価される。空気伝導聴力検査の場合、音はイヤホンを通して提示され、閾値は、外耳道、中耳、および内耳の状態によって異なる。骨伝導の場合、聴力検査の音は、乳様突起の骨または額に配置されたバイブレーターを介して提示されるため、外耳および中耳をバイパスし、閾値は内耳の状態によって異なる。追加の試験には、各耳の完全な周波数固有のオージオグラムを作成する条件付き聴力検査、および個人がいつ音を聞くかを示す従来の聴力検査が含まれる。

【0061】

オーディオプロファイルとは、１つのグラフに複数のオージオグラムを記録することを指す。これらのオージオグラムは、異なる時期に１人の個人からのものである可能性があり得るが、多くの場合、通常は常染色体優性の方法で聴覚喪失を分離している同じ家族の異なるメンバーからのものである。同じグラフに年齢とともに多数のオージオグラムをプロットすることにより、これらの家族内で年齢に関連した聴覚消失の進行を理解することができる。

【0062】

導入遺伝子
目的の任意の導入遺伝子を蝸牛細胞に送達することを含む、開示された方法。導入遺伝子は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であるか、あるいはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどの目的の遺伝子の発現を阻害、抑制、または沈静化する核酸である。例示的な導入遺伝子は、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）ｃＤＮＡ（配列番号２）、オトフェルリンｃＤＮＡ（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（ＧＪＢ２）ｃＤＮＡ（配列番号６）、ＳＬＣ２６４ｃＤＮＡ（配列番号８）、フォークヘッドボックスＯ３（ＦＯＸＯ３）ｃＤＮＡ（配列番号１０）、アクチビンＡｃＤＮＡ（配列番号１２）、フォリスタチンｃＤＮＡ（配列番号１４）である。

【0063】

例示的な導入遺伝子は、ヒトアトナール転写因子（配列番号３）、オトフェルリン（配列番号５）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号７）、ペンドリン（配列番号９）、フォークヘッドボックス１（配列番号１１）、アクチビンＡまたはインヒビン（配列番号１３）、フォリスタチン（配列番号１５）、ガレクチン－１（配列番号２０）、およびガレクチン－３（配列番号２２）タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

【0064】

蝸牛で発現されるｍｉＲＮＡｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、開示された最適化された遺伝子治療ベクターに含まれる導入遺伝子として企図されている。

【0065】

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、本明細書で表１、表２、表３、表４または表５で提供される遺伝子のいずれかの野生型核酸配列を含み得る。さらに、本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、以下の、ヒトアトナール転写因子（ＡＴＯＨ１）ｃＤＮＡ（配列番号２）、オトフェルリンｃＤＮＡ（配列番号４）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（ＧＪＢ２）ｃＤＮＡ（配列番号６）、ＳＬＣ２６４ｃＤＮＡ（配列番号８）、フォークヘッドボックス１（ＦＯＸＯ３）ｃＤＮＡ（配列番号１０）、アクチビンＡｃＤＮＡ（配列番号１２）、フォリスタチン（配列番号１４）、ガレクチン－１（配列番号１９）またはガレクチン－３（配列番号２１）ｃＤＮＡのうちの１つのｃＤＮＡ配列を含み得る。例えば、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドには、導入遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。

【0066】

例えば、本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ヒトアトナール転写因子（配列番号３）、オトフェルリン（配列番号５）、ギャップ結合タンパク質ベータ２（配列番号７）、ペンドリン（配列番号９）、フォークヘッドボックス１（配列番号１１）、アクチビンＡまたはインヒビン（配列番号１３）、フォリスタチン（配列番号１５）、ガレクチン－１（配列番号２０、）またはガレクチン－３（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチドを含む。ポリペプチドには、導入遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ所望の活性を保持する、アミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。

【0067】

いくつかの場合では、本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または所望の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。

【0068】

本明細書に提供されるｒＡＡＶゲノムは、いくつかの実施形態で、所望の活性を有するポリペプチドをコードし、かつストリンジェントな条件下で目的の既知の導入遺伝子の核酸配列のいずれか１つまたはその相補体にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む。

【0069】

「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃での０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。

【0070】

投与方法
髄腔内投与が本明細書に例示される。これらの方法は、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで標的細胞を形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子を含むｒＡＡＶウイルス粒子は、患者の耳、脳および／もしくは脊髄に投与または送達される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質、視覚野、小脳、および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、下位運動ニューロンに送達される。ポリヌクレオチドは、内有毛細胞、外有毛細胞、神経節細胞、支持細胞、ダイテルス細胞、柱状細胞および上皮細胞などの蝸牛細胞に送達され得る。

【0071】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、患者は、ｒＡＡＶの投与後トレンデレンベルク体位（頭低位）に保持される（例えば、約５、約１０、約１５または約２０分間）。例えば、患者は、頭低位で、約１度～約３０度、約１５～約３０度、約３０～約６０度、約６０～約９０度、または約９０～約１８０度）傾けられてもよい。

【0072】

脳室内注射の場合、針が頭蓋骨に挿入され、液体が脳脊髄液を含有する空洞に注射される。例えば、脳室内注射は、当技術分野で知られている方法を使用して、臨床的に訓練された外科医によって実施される。

【0073】

本明細書で提供される方法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数用量を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者を含むが、これに限定されない動物）に投与するステップを含む。用量が聴覚消失関連障害の症状の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が聴覚消失関連障害の症状の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、聴覚消失関連障害に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは低減）する用量であり、障害の進行を遅延させるかまたは予防する用量であり、障害の範囲を縮小する用量であり、障害の寛解（部分的もしくは完全な）をもたらす用量であり、ならびに／または、聴力および／または生存を長引かせる用量である。治療前の対象と比較して、または未治療の対象と比較して、本明細書で提供される方法は、安定化、聴覚消失の進行の減少、または張力の改善をもたらす。

【実施例】

【0074】

以下の実施例により特定の実施形態を説明するが、当業者には変形および修飾が発生するであろうことが理解される。したがって、請求項に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。

【0075】

実施例１
ｓｃＡＡＶ９．ＧＦＰの産生
ヒトＧＦＰｃＤＮＡクローンは、Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。ＧＦＰｃＤＮＡのみ、またはＧＦＰｃＤＮＡおよびｓｈＳＯＤ－１ｃＤＮＡを、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）の下で自己相補的ＡＡＶ９ゲノムにさらにサブクローニングした。プラスミド構築物はまた、ＣＢプロモーター（配列番号１）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）キメライントロンなどのイントロン、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上を含んでいた。ＡＡＶ２ＩＴＲ間に挿入されたＧＦＰｃＤＮＡを示すプラスミド構築物の概略図を、ＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰと称して図１に提供する。ＡＡＶ９．ＣＢ．ｓｈＳＯＤ１．ＧＦＰプラスミドには、ＳＶ４０イントロンとＧＦＰｃＤＮＡとの間にヒトＳＯＤ－１ｃＤＮＡが挿入されている。構築物はいずれかのＡＡＶ９ゲノムにパッケージ化された。

【0076】

実施例２
くも膜下腔内ＡＡＶ９送達および蝸牛細胞の標的化
マウスは、１．６５×１０^１１ｖｇもしくは３．３×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶ９．ｓｈＳＯＤ１．ＣＢ．ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰのいずれかの髄腔内（ＩＴ）注射を受けた。ｓｃＡＡＶ９．ｓｈＳＯＤ１．ＣＢ．ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８（ＰＢＳ／Ｆ６８と示す）中に配合した。注射の３週間後にマウスを安楽死させた。処理されたマウスの蝸牛を凍結切片化し、ＧＦＰについて染色した。細胞の位置を示すために、切片もＤＡＰＩで染色した。

【0077】

図２～５は、ｓｃＡＡＶ９．ｓｈＳＯＤ１．ＣＢ．ＧＦＰを注射したマウスのデータを示している。図２は、ＩＴ処理した蝸牛の矢状凍結切片におけるＧＦＰの染色である。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は参照として提供されており、注射されたマウス（ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＦＬＲ）からの蝸牛の写真ではない。このデータは、ＩＴ注射後のマウス蝸牛全体での強いＧＦＰ染色を示している。図３は、４匹の異なるマウス（ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＦ、ｓｈｘ２ＩＴ－２Ｆ、ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＥ、ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＦＬＲ）の染色を示している。この図は、注射されたすべてのマウスにおける広範なＧＦＰ発現およびＧＦＰ発現の均一なパターンを示している。コルチ器の細胞は高レベルのＧＦＰを発現する。図４は、ＩＴ注射後にＧＦＰが発現したマウス蝸牛の様々な領域を示している。図５では、ＩＴを注射したマウス（ｓｈｘ２ＩＴ－ＬＥ）の蝸牛の矢状凍結切片を、ＧＦＰとＤＡＰＩに加えてアクチンで染色した。この図は、内有毛細胞（ＩＨＣ）がコルチのいくつかの器官でＧＦＰ導入遺伝子を発現しているため、それらの標的化が成功していることを示している。この図は、ＩＨＣ細胞をはっきりと見るために倍率を拡大するためのズームインを示している。

【0078】

図６～８は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを注射したマウスのデータを示している。ＩＴ注射マウスの蝸牛も、ＧＦＰ発現パターンの異なるビューのために、ビブラトームで冠状方向に切断された。図６および７は、蝸牛内の内有毛細胞が、注射されたマウス（マウス＃２およびマウス＃０）でＧＦＰを強く染色することを示している。これらの図は、ＩＴ注射がＧＦＰ発現の幅広い局在化をもたらすことも示している。図８は、ＩＴを注射したマウスの前庭をＤＡＰＩ、ＧＦＰ、およびアクチンで染色したものである。これらの図は、様々な波長が処理される様々なターン全体の蝸牛全体にわたる内有毛細胞の標的化を示している。

【0079】

実施例３
髄腔内送達およびノイズへの曝露後のマウス蝸牛の形質導入
マウスの内耳の有毛細胞へのストレスは、マウスを１００ｄｂの音圧レベルのノイズに２時間曝露することによって誘発された。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰは、騒音への曝露後、曝露直後（０ｈ．ｐ．ｉ．）または曝露後２４時間（２４ｈ．ｐ．ｉ．）のいずれかで、１回の髄腔内注射（ＩＴ）によってマウスに投与された。マウスに１．６５×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを注射した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８（ＰＢＳ／Ｆ６８と示す）中に配合した。注射の３週間後にマウスを安楽死させた。

【0080】

導入遺伝子の蝸牛発現を調べるために、免疫組織化学分析を行ってＧＦＰタンパク質を視覚化した。臓器組織の断面は、アクチンフィラメントを染色するＤａｐｉ、ＧＦＰ、およびファロイジン、またはミオシン－ＶＩＩａを染色するかｍｙｏ７Ａについて染色した。ｍｙｏ７ａの染色は、有毛細胞を標識するための特定の方法で行った。図９～１２に示すように、内有毛細胞は、ノイズに曝露された直後にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰをＩＴ注射した後、導入遺伝子ＧＦＰを発現した。

【0081】

図１３～１６は、ＧＦＰおよびｍｙｏ７Ａの染色を示し、ノイズに曝露されてから２４時間後にＩＴ注射が行われたときにＧＦＰ発現が検出されたことを示しているが、発現レベルは内有毛細胞で全体的に低かった。ノイズに曝露された直後にＩＴ注射が行われたときのＧＦＰ発現と比較して、ノイズに曝露された後にＩＴ注射が２４時間遅延した場合のＧＦＰ発現は低かった。図１６および１７は、傷害の２４時間後にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを投与すると、ＧＦＰシグナルが弱くなるが、投与を遅らせても内有毛細胞の標的化が行われることを示している。図１６は、２４ｈｐｉＩＴ注射マウスの最適な曝露では画像化された画像である。この写真は、２４ｈｐｉの最適な曝露での画像化が０ｈｐｉを過剰曝露するため、２４ｈｐｉの髄腔内注射動物のＧＦＰ発現が０ｈｐｉの髄腔内注射動物よりも低いことを示している。図１７に示すヘマトキシリンおよびエオシン染色は、内有毛細胞がこの研究で使用されたノイズ傷害プロトコルによって損傷されないことを実証している。

【0082】

実施例４
静脈内注射後のマウス蝸牛の形質導入
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰは、片方の尾静脈注射によって正常なマウスにも投与された。マウスに１．６５×１０^１２ｖｇ／ｋｇのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを注射した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを、１×ＰＢＳおよび０．００１％プルロニックＦ６８（ＰＢＳ／Ｆ６８と示す）中に配合した。注射の３週間後にマウスを安楽死させた。図１８に示すように、ここで提供される予備データは、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰがＧＦＰを蝸牛に送達したが、尾静脈注射を使用して投与した場合、内有毛細胞または脊髄神経節ニューロンを形質導入しなかったことを示している。代わりに、形質導入は血管の周りに残っているようである。

【0083】

その後の研究では、ＰＢＳ／Ｆ６８に配合された１．６５×１０^１２のｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＧＦＰを、正常なマウスに１回の尾静脈注射で投与し、注射の３週間後にマウスを安楽死させた。図１９～２２に示されている免疫組織化学データでは、静脈内注射は健康な蝸牛の内有毛細胞の形質導入をもたらさなかった。図２３は、ノイズによる傷害に曝露された、注射されていない対照マウスからのデータを示している。

【図1】