特表 2022-552178 グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する単一ドメイン抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-15

(54)【発明の名称】グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221208BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221208BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221208BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221208BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20221208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P35/00

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022520820

(86)(22)【出願日】2020-10-02

(85)【翻訳文提出日】2022-06-03

(86)【国際出願番号】 EP2020077754

(87)【国際公開番号】W WO2021064227

(87)【国際公開日】2021-04-08

(31)【優先権主張番号】19201562.6

(32)【優先日】2019-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501497655

【氏名又は名称】マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ジーバーガー ペーター ハー．

(72)【発明者】

【氏名】モスコヴィッツ オレン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA19

4C085BB01

4C085BB24

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、グロボ（ｇｌｏｂｏ）シリーズのグリカン、特にグロボＨに向けて行われた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の分野に関する。より詳細には、本発明は、グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される１つ以上のグリカンを特異的に結合するｓｄＡｂに関する。本発明は、多量体単一ドメイン抗体を含むポリペプチド、および前記抗－グリカンｓｄＡｂｓを含むＴ細胞キメラ抗原受容体も提供する。したがって、本発明は、前記グロボＨおよび／またはＧｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５を過剰発現する細胞に関連するいくつかの型の癌を標的化する、および／または治療するために使用されることができるポリペプチドを提供する。本発明は、前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列、並びに前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む発現ベクターおよび宿主細胞にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであって、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する、ポリペプチド。

【請求項2】

前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、前記単一ドメイン抗体は前記細胞外ヒンジ領域に連結される、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の１０４および１０８に位置する１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸分子。

【請求項7】

請求項６に記載の組換え核酸分子を含むベクター。

【請求項8】

請求項６に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項9】

少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤および／または希釈剤と共に、請求項１、請求項２、請求項４、および請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。

【請求項10】

癌の治療および／または診断に使用のための、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項９に記載の医薬組成物であって、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現する、ポリペプチド、または医薬組成物。

【請求項11】

前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される、請求項１０に記載の使用のためのポリペプチド、または使用のための医薬組成物。

【請求項12】

グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する細胞によって特徴付けられる癌のスクリーニングのための、請求項１、請求項２、請求項４、および請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む診断キット。

【請求項13】

グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、少なくとも２である、請求項１、請求項２、請求項４、および請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記２つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が異なる、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記２つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が同一である、請求項１３に記載のポリペプチド。

【請求項16】

グロボＨ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、３である、請求項１３～請求項１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１６に記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、グロボ（ｇｌｏｂｏ）シリーズのグリカン、特にグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈに向けて行われた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の分野に関する。より詳細に、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される１つ以上のグリカンを特異的に結合するｓｄＡｂに関する。本発明は、多量体単一ドメイン抗体を含むポリペプチド、および前記抗－グリカンｓｄＡｂｓを含むＴ細胞キメラ抗原受容体も提供する。したがって、本発明は、前記グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈおよび／またはＧｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５を過剰発現する細胞に関連するいくつかの型の癌を標的化する、および／または治療するために使用されることができるポリペプチドを提供する。本発明は、前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列、並びに前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む発現ベクターおよび宿主細胞にも関する。

【0002】

［発明の背景］
グロボ（Ｇｌｏｂｏ）シリーズグリカンは、セラミドがＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃの基本構造を有するグリカンに結合している中性スフィンゴ糖脂質のグループを含む。一般的には、これらのグリカンは、原形質膜に保持され、脂質ラフトにクラスター化する。このグリカンファミリーの内因性機能は、ほとんど知られていない。しかしながら、それらの発現は、発生の初期段階で起こり、細胞の接触および接着を仲介すると考えられている。重要なことに、これらのグリカンの変化は、分化の間中ずっと、および腫瘍形成中に観察される。このファミリーの２つの注目すべき六糖メンバーは、時期特異的な胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）およびグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈである（図２）。これらのグリカンは、共通の前駆体、ＳＳＥＡ－３（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃ）を共有するが、末端単糖が異なり、ＳＳＥＡ－４の場合はβ３－結合Ｎ－アセチルノイラミン酸であり、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈの場合はα２－結合Ｌ－フコースである。

【0003】

ＳＳＥＡ－４は、多くの幹細胞型で、誘導された多能性幹細胞で、胚性癌細胞で、乳癌細胞で、および成人において最も攻撃的で一般的な脳腫瘍を形成する悪性神経膠腫細胞で発現される。結果として、ＳＳＥＡ－４に対する抗体は、癌ワクチンにおけるＳＳＥＡ－４の標的化を支持する可能性がある。

【0004】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈは、化学式Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→Ｏ－Ｃｅｒを有する六糖である。グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ発現は、例えば、子宮内膜癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、および乳癌などのいくつかの上皮癌で明らかにされており、正常組織においては、乳房、結腸、食道、小腸、前立腺、直腸、精巣、および子宮頸部に中程度に存在するが、内腔境界で頂端上皮細胞にのみ存在する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，２００８）は、グリカンアレイによって、正常なドナーおよび乳癌患者の両方がＳＳＥＡ－３に対する高レベルの抗体を発現したが、乳癌患者が正常なドナーよりもはるかに高いレベルのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈに対する抗体を発現したことを明らかにした。ＳＳＥＡ－３またはグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈのいずれかが正常組織において発見される可能性のある部位は、免疫細胞に一般的に接近できないと考えられる領域にあるため、ＳＳＥＡ－３およびグロボ（ＧｌｏｂｏＨ）の両方は、癌ワクチンにとって魅力的な標的になる。

【0005】

しかしながら、ほとんどの炭水化物抗原は、免疫系によって許容されることが多く、その結果として、炭水化物抗原によって誘導される免疫原性は制限される。さらに、特定の免疫原に対する抗体の産生は、一般的に、２つの型のリンパ球、すなわち、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞との間の協同的な相互作用を伴う。グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ単独ではヘルパーＴ細胞を活性化することができず、このことは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈの免疫原性が低いことにも起因する。したがって、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ単独での免疫付与は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の低力価、および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）へのクラススイッチの失敗、並びに非効果的な抗体親和性成熟をしばしばもたらす。最近、適切なアジュバントを添加することにより、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを含む、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈに対する抗体を誘導することができると実証されている。したがって、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈは、癌ワクチンの有望な治療標的である。このアプローチは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および肺癌を含む、種々の癌に対する様々な段階で臨床試験において試験されている。

【0006】

ヒトにおける抗多糖応答がＩｇＭおよびＩｇＧ_１型によって明らかに支配され、一方、ラクダ科動物からの重鎖抗体がＩｇＧ_２およびＩｇＧ_３クラスに属することを示す以前の研究によって、グリカンに反応して単一ドメイン抗体の生成の欠如は支持される（Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０）。さらに、多糖とタンパク質における個々の結合部位との間の相互作用は一般的に弱く、結合強度および特異性は、多糖とオリゴマー多糖結合タンパク質との間のポリマー相互作用によって増強されることが知られている。ＶＨＨは、本質的に厳密に単量体の結合剤であるため、この点においてＶＨＨは多糖の結合にはあまり適していない。したがって、当業者は、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに対して、軽鎖を欠く免疫グロブリンを高めることは非常に困難であると当業者は想定するだろう。

【0007】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈに対する従来の抗体は、癌の診断および治療に有望であることが示されているが（ＷＯ２０１５／１４３１２３Ａ）、より優れた抗グロボ（ＧｌｏｂｏＨ）抗体が、いまだに必要とされる。使用目的のために、モノクローナル抗体、および好ましくは単一ドメイン抗体が必要とされる。グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈまたはグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈの断片などのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズスフィンゴ糖脂質を特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはＶＨＨ）は、当該抗体を作製する試みが行われているが、今までのところ当技術分野において開示されていない。

【0008】

特許出願ＷＯ２０１５／１４３１２３Ａは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ陽性癌を予防する、または治療するための従来の抗グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ抗体、およびこれらの抗体を含む医薬組成物を開示する。しかしながら、これらの抗体は、化学的不安定性を与えうるＣＤＲ配列を有し、そのことは、これらの抗体を、更なる生産のスケールアップおよび臨床研究にとって、望ましくないものにする。

【0009】

国際特許出願ＷＯ２０１８／０５４３５３Ａは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを結合し、高発現製造条件下で起こる可能性がある望ましくない修飾および大きな凝集体形成に対する安定性を高めるために設計されたＣＤＲ配列を有する治療用ヒト従来型モノクローナル抗体を開示する。

【0010】

従来の哺乳類ＩｇＧ抗体とは対照的に、ｓｄＡｂは重鎖のみを含み、軽鎖を欠いている。単一ドメイン抗体の抗原結合ドメインは、ＶＨＨまたはナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（登録商標）と呼ばれる。ＶＨＨは、従来の抗体に比べていくつかの一般的な利点を有する。第一に、それらは、サイズがわずか１３～１５ｋＤａであり、従来のＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）より約１０分の１小さい。それらは、混雑した細胞環境においてさえ、エピトープにさらに良く接近することができ、組織、器官、および動物にさらに良く侵入することができる。

【0011】

それらは、従来の抗体と比較して、はるかに高い化学的（例えば、最大８Ｍ尿素）および熱安定性（最大８３℃）、およびより長い貯蔵寿命を有する。
したがって、本発明の目的は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、並びにＧｂ３（グロボトリアオース）、Ｇｂ４（グロボテトラオース）、およびＧｂ５（グロボペンタオースＧｂ５）などのグロボ（ｇｌｏｂｏ）シリーズグリカンを特異的に結合する単一ドメイン抗体を提供することである。

【0012】

この目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらに有利な特徴、態様および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図面、および実施例から明らかである。

【0013】

［本発明の簡単な説明］
本出願は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する。

【0014】

いくつかの実施形態において、グロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択された少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する。ある種の実施形態において、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドは、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する。

【0015】

特定の実施形態において、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドは、本明細書に開示されるような少なくとも一つの単一ドメイン抗体、および前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体に連結された少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、抗癌ペプチド、細胞溶解性ペプチド、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース、ジニトロフェニル、血清安定化分子、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、アジピン酸ジスクシンイミジル、ヒトＦｃ抗体断片からなる群から選択される。より具体的な実施形態において、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドは、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカン、および、修飾システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される少なくとも一つの溶解性ペプチドを結合する。さらにより具体的な実施形態において、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、および少なくとも一つの単一ドメイン抗体に連結された少なくとも一つの溶解性ペプチドをさらに含む、グロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～６３、１４２～１５６、１７９～２２６から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0016】

本発明は、本明細書に開示される少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドにも向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合し、並びに少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される。前記細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のモジュールまたは要素を表す。本明細書に開示されるキメラ抗原受容体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグロボ－シリーズグリカンを特異的に認識するＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために使用されることができる。したがって、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、癌の治療において使用されることができ、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現する。

【0017】

本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドも提供し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する。さらに、本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体であり、および、少なくとも一つのヒト化単一ドメイン抗体に連結された少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、前記少なくとも一つのヒト化単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する。本発明にしたがって、少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される。

【0018】

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸分子、および前記組換え核酸分子を含むベクターも提供する。本発明における組換え核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も、本明細書において提供される。

【0019】

さらに、本発明は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤および／または希釈剤と共に、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する本発明のポリペプチドの治療有効量を含み、および少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む、医薬組成物にも関する。

【0020】

本発明は、癌の治療および／または診断における本発明のポリペプチドの使用、または本発明に係る医薬組成物の使用も提供し、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。言い換えると、本発明は、癌の治療および／または診断における本発明のポリペプチドの使用、または本発明に係る医薬組成物の使用を提供し、ここで、前記癌は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する細胞によって特徴付けられる。

【0021】

本発明は、癌の治療および／または診断における本発明のポリペプチドの使用、または本発明に係る医薬組成物の使用も提供し、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌、から選択される。

【0022】

本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドを含む診断用キットも提供し、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメインであり、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する細胞によって特徴付けられる癌のスクリーニングのために、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する。

【0023】

本発明の更なる実施形態は、上述のようなポリペプチドを提供し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、少なくとも２である。２つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が異なる、または配列が同一である。

【0024】

本発明の特定の実施形態は、上述のようなポリペプチドを提供し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、３である。本発明の特定の実施形態は、上述のようなポリペプチドを提供し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、３であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0025】

［発明の詳細な説明］
定義
腫瘍関連抗原（ＴＡＣＡｓ）および型
癌細胞は、癌細胞表面の炭水化物構造の異常なレベル、および型を示すことで、正常細胞と区別されることができる。これらの炭水化物構造は、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡｓ）として知られている。ＴＡＣＡｓは、抗がんワクチンの設計のために有望な標的と見なされた。残念ながら、炭水化物単独では、癌治療に重要であるＴ細胞依存性免疫応答を誘導することができないため、低い免疫原性を引き起こすことのみ可能である。

【0026】

スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬｓ）は、スフィンゴ脂質セラミドを含む脂質尾部に結合されたグリカン構造で構成される複合脂質のグループを表す。スフィンゴ糖脂質の基本構造は単糖であり、一般的にグルコースまたはガラクトースであり、単糖はセラミド分子に直接結合し、結果的に、それぞれグルコシルセラミド（グルコセレブロシド；ＧｌｃＣｅｒ）またはガラクトシルセラミド（ガラクトセレブロシド；ＧａｌＣｅｒ）をもたらす。ＧＳＬｓは細胞膜に遍在しており、そこでＧＳＬｓは、シグナル伝達、接着、および細胞分化などの細胞プロセスにおいて、他の機能の間で関与することが知られている。腫瘍細胞または組織において高度に発現される特定のスフィンゴ糖脂質は、特定のモノクローナル抗体によって定義されており、そのことによって、腫瘍における異常なＧＳＬ合成に起因する腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡｓ）として識別される。腫瘍細胞は、ＧＳＬｓで異常なグリコシル化を発現し、前駆体の蓄積につながる不完全な合成、または新しい構造を形成するためのグリカン残基の更なる付加のいずれかを示す。

【0027】

グロボトリオシルセラミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）およびグロボシド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）は、Ｐ血液型システムの基礎を構成するが、ガラクトシルグロボシド（Ｇｂ５Ｃｅｒ）およびシアリルガラクトシルグロボシド（シアリルＧｂ５Ｃｅｒ）は、それぞれステージ特異的胚性抗原－３（ＳＳＥＡ－３）、およびＳＳＥＡ－４としても知られており、ヒト胚性幹細胞を定義するための細胞表面マーカーとして広範囲に使用される。

【0028】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－シリーズＧＳＬは腫瘍においても観察されている：グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ（フコシルＧｂ５Ｃｅｒ）は、例えば、子宮内膜癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、および乳癌などの多くの上皮癌で過剰発現している。

【0029】

本明細書において使用される「グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ」は、式、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→Ｏ－ｃｅｒの六糖に関し、構造：

【0030】

【化1】

を有する。

【0031】

「グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ－陽性癌」は、細胞表面にグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを発現する癌細胞を含む癌に関する。
研究では、癌細胞の表面にグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈの切断型または断片の存在も報告される。当該切断型は、Ｇｂ３（グロボトリアオース）、Ｇｂ４（グロボテトラオース）、およびＧｂ５（グロボペンタオース）である（図２）。

【0032】

「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および一般に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味で互いに交換可能に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、多特異的（またはヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、抗原－結合抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、ｓｃＦｖ断片、ｓｄＡｂｓ、ＶＨＨ）、抗体融合、および合成抗体（または抗体模倣物）を含む。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体であることができ、および／または親和性成熟させることができる。

【0033】

本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、免疫応答を誘発することができる任意の物質として定義される。
本明細書で使用される場合、用語「免疫原性」は、免疫応答を刺激するための免疫原、抗原、またはワクチンの能力を指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体の、またはＴ細胞受容体の抗原結合部位に接触する抗原分子の部分として定義される。
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、結合対（例えば、抗体および抗原）間の相互作用を指す。様々な例において、特異的結合は、約１０^－６モル／リットル、約１０^－７モル／リットル、または約１０^－８モル／リットル、またはそれ以下の親和性定数によって具体化されることができる。

【0035】

「結合親和性」は、一般に、分子の単一結合部位（例えば、抗体）と当該結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原など）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの当該パートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表されることができる。低親和性抗体は、一般に、抗原をゆっくりと結合し、および容易に解離する傾向があるが、一方、高親和性抗体は、一般に、抗原をより速く結合し、より長く結合されたまま残る傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、それらのいずれかは、本発明の目的に使用されることができる。特定の例示的な実施形態を以下に記述する。

【0036】

抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原を結合することができる部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が得られる親抗体ほど強力である必要はないが、抗原を結合する能力は、抗原への抗体結合を評価するために公知の様々な方法のいずれか１つを使用して測定可能でなければならない。

【0037】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、ベクターが連結されている核酸分子に、他の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ある型のベクターは「プラスミド」であり、プラスミドは、付加的なＤＮＡ断片がライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ファージベクターである。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、付加的なＤＮＡ断片は、ウイルスゲノムに結合され得る。ある種のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞において自己複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに挿入される（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ことができ、そのことにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、ベクターが動作可能に連結される遺伝子に、遺伝子の発現を指示することができる。当該ベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」もしくは「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書において、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を、交換可能に使用してもよい。

【0038】

本明細書において交換可能に使用される「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込まれることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびメチル化ヌクレオチドの類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの集合前または後に加えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨げられてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識との結合などによって、合成後にさらに修飾されてもよい。他の型の修飾は、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなど、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ－Ｌ－リジンなど）などの懸垂（ｐｅｎｄａｎｔ）部分を含むもの、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、およびポリヌクレオチドの未修飾形態、を含む。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基などによって置き換えてもよく、標準的な保護基によって保護してもよく、または付加的なヌクレオチドへの付加的な結合を調製するために活性化してもよく、または固体支持体もしくは半固体支持体に結合してもよい。５’末端ＯＨおよび３’末端ＯＨは、リン酸化されることができる、またはアミンもしくは１個から２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分と置換されることができる。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。

【0039】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、必ずしもそうではないが、一般的に長さが約２００ヌクレオチド未満であり、短く、一般的に一本鎖である、合成ポリヌクレオチドを一般的に指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも同様に、および完全に適用可能である。

【0040】

「グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」または「グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグロボ－シリーズグリカンを結合するｓｄＡｂ」は、ｓｄＡｂが標的グリカンを結合することにより診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性を有するグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５グロボから選択されるグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合するｓｄＡｂを指す。「グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」または「グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを結合するｓｄＡｂ」は、ｓｄＡｂがグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを結合することにより診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性を有するグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを結合するｓｄＡｂを指す。「Ｇｂ３結合単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」または「Ｇｂ３を結合するｓｄＡｂ」は、ｓｄＡｂがＧｂ３を結合することにより診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性を有するＧｂ３を結合するｓｄＡｂを指す。「Ｇｂ４結合単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」または「Ｇｂ４を結合するｓｄＡｂ」は、ｓｄＡｂがＧｂ４を結合することにより診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性を有するＧｂ４を結合するｓｄＡｂを指す。「Ｇｂ５結合単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」または「Ｇｂ５を結合するｓｄＡｂ」は、ｓｄＡｂがＧｂ５を結合することにより診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性を有するＧｂ５を結合するｓｄＡｂを指す。

【0041】

「完全長抗体」、「無傷抗体」または「全抗体」は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書において互いに交換可能で使用される。

【0042】

「抗体断片」は、全長抗体の場合と同じ抗原を結合することができる全長抗体の一部を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖなど）、単一ドメイン抗体；抗体断片から形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0043】

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）の可変ドメインは、同様の構造を一般的に有する。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であってもよい。特に、本明細書に開示される単一ドメイン抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、重鎖のアミノ末端ドメインを指す。

【0044】

用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列において広く異なり、当該特定の抗原のための各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つの部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、４つのＦＲ領域をそれぞれ含み、主にベータシート構造を採用し、３つのＣＤＲによって接続され、そのことは、ループ接続を形成し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖からのＣＤＲと近接して結合し、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，免疫学的興味におけるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（１９９１））。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。

【0045】

本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列において超可変である、および／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインにおける各領域を指す。一般的に、天然抗体は、６つのＨＶＲを有する４つの鎖を含み、６つのＨＶＲのうちの３つは重鎖可変ドメイン、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）において、および３つは軽鎖可変ドメイン、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）において存在する。単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインにおいて３つのＨＶＲのみを含む。ＨＶＲは、超可変ループからの、および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。別段の指示がない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基など）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１に従って本明細書において番号付けされる。

【0046】

本明細書において使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、最高の配列変動性を有する、および／または抗原認識に関与する、可変ドメインにおける超可変領域内の領域を指す。一般的に、天然抗体は、６つのＣＤＲを有する４つの鎖を含み６つのＣＤＲのうちの３つは重鎖可変ドメイン、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）において、および３つは軽鎖可変ドメイン、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）において存在する。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０～５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９～９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１～３５、Ｈ２のアミノ酸残基５０～６５、およびＨ３のアミノ酸残基９５～１０２に存在する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。例えば、本明細書に開示されるような単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠くため、ＣＤＲ－Ｈ１またはＣＤＲ１、ＣＤＲ－Ｈ２またはＣＤＲ２、およびＣＤＲ－Ｈ３またはＣＤＲ３のみを含む。

【0047】

「天然抗体」は、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）を有し、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれ、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）を有し、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれ、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、当該定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのうちのいずれかの型に割り当てられてもよい。

【0048】

本明細書に使用される「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、可能な変異抗体（例えば、自然に発生し、またはモノクローナル抗体の産生中に発生し、一般的に少量存在している変異を含む変異抗体）を除いて、同一であり、および／または同じエピトープを結合する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を一般的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基に対して向けられる。したがって、用語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。

【0049】

「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

【0050】

「ヒト化抗体」は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸配列、およびヒトＦＲからのアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。ある実施形態において、ヒト化抗体は、単一ドメイン抗体を実質的に含み、ここで、すべての、または実質的にすべてのＣＤＲは、非ヒト抗体のものに対応し、すべての、または実質的にすべてのＦＲは、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けている抗体を指す。

【0051】

「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。

【0052】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列におけるサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１にあるようなサブグループである。

【0053】

本明細書で使用される「多価抗体」は、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体である。多価抗体は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般的に、天然配列のＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体ではない。

【0054】

「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、各部位が異なる結合特異性を有する抗体である。多特異性抗体は、全長抗体、または抗体断片であることができ、異なる結合部位は、それぞれ異なる抗原に結合し得るか、または異なる結合部位は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。

【0055】

「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ抗体断片」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、ここで、Ｃ末端ポリペプチド配列は、無傷抗体のパパイン消化によって得られるものである。Ｆｃ領域は、天然の、または変異型のＦｃ配列を含み得る。

【0056】

「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメインおよび第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２つの同一の「Ｆａｂ」断片、および残留「Ｆｃ」断片を生成し、「Ｆｃ」という名前は、容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として架橋抗原の能力があるＦ（ａｂ’）２断片を生じさせる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、Ｆａｂ’断片間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も、当技術分野で知られている。

【0057】

「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、緊密に会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、例えばｓｃＦｖにおいて自然に共有結合することができる。この構成において、この領域は、各可変ドメインの３つのＨＶＲが、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を明確にするために相互作用するということである。まとめると、６つのＨＶＲまたはそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、一般的に結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。

【0058】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメイン、およびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このことは、ｓｃＦｖが所望の抗原結合構造を形成することを可能にする。

【0059】

「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖における２つのドメイン間で対形成することを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは他の鎖の相補的ドメインと対形成することを強いられ、２つの抗原結合部位を作成する。

【0060】

「裸（Ｎａｋｅｄ）抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射性標識に結合されていない抗体を指す。
「単離された」抗体は、自然環境の成分から同定され、および分離され、および／または回収されているものである。当該自然環境の汚染物質成分は、抗体のための研究利用、診断的または治療的用途を妨げることになる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含んでもよい。通常、単離された抗体は、少なくとも一つの精製ステップによって調製されるだろう。

【0061】

本明細書で使用される用語「実質的に類似」、「実質的に同じ」、「同等」、または「実質的に同等」は、２つの数値（例えば、１つは試験抗体に関連する数値、もう一つは参照抗体に関連する数値）の間の十分に高度な類似性を指し、例えば、当業者は、２つの値の間の差が、前記値（例えば：Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の関連の中で、生物学的および／または統計的有意性がほとんどない、または全くないとみなすであろう。前記２つの値の間の差は、参照／比較（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）分子の値の関数として、例えば、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。

【0062】

本明細書で使用される「実質的に異なる」は、２つの数値（一般的に、１つは分子に関連する数値、もう一つは参照分子に関連する数値）の間の十分に高度な違いを指し、例えば、当業者は、２つの値の間の差が、前記値（例えば：Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の関連の中で、統計的有意性があるとみなすであろう。前記２つの値の間の差は、参照／比較分子の値の関数として、例えば、約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、約４０％より大きい、および／または約５０％より大きい。

【0063】

本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合する。

【0064】

本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する（表４）。好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有する（表４）。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の更に他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の更なる実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明の他の更なる実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
前記配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８（ｓｄＡｂまたはＶＨＨ）は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈグリカンに対して免疫化されているアルパカ（ビクーニャ パコス（Ｖｉｃｕｇｎａ Ｐａｃｏｓ））の重鎖抗体に由来する。

【0065】

本発明は、前記ポリペプチドをコードすることができる組換え核酸分子、並びに前記組換え核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞にも関する。
単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ１９９４００４６７８Ａ１に開示される。明確な理由のために、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体に由来する可変ドメインを、本明細書において、４本鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨまたはｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）と呼ぶ。当該ＶＨＨ分子を、ラクダ科の種で、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、およびグアナコで産生される抗体に由来することができる。ラクダ科以外の種は、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を生産し得る。

【0066】

本発明の一態様によると、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠き、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体として知られる天然に存在する単一ドメイン抗体、または前記可変ドメインの変異体である。

【0067】

ｓｄＡｂは約１３～１５ｋＤａであるため、ＩｇＧ分子のほぼ１０分の１の大きさである。ｓｄＡｂは単一のポリペプチドであり、保存中および利用中の両方で非常に安定であり、そのことは、抗原－結合タンパク質の完全性は、昇温、凍結－融解サイクル、ｐＨの変化、またはイオン強度、ＵＶ－照射、有害な化学物質および同様の物を含みうる保存および／または利用条件下で維持されることを意味する。さらに、ｓｄＡｂは、プロテアーゼの作用に耐性がり、従来の抗体に該当しない。さらに、本発明に係る単一ドメイン抗体は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、高収率で生成することが容易であり、適切に折りたたまれ、および機能的である。さらに、アルパカ、またはより一般的にはラクダ科動物において生成された抗体は、抗体ライブラリーの使用を介して、またはラクダ科動物以外の哺乳類の免疫化によって、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で生成された抗体によって認識されるもの以外のエピトープを認識するであろう（ＷＯ２００５０４４８５８Ａ１）。結果として、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、またはＧｂ５に対するｓｄＡｂは、従来の抗体よりもより効率的に標的抗原と相互作用し得、それによって、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、またはＧｂ５をはるかに高い効率で発現する細胞によって特徴付けられる癌の検出または治療を可能にする。ｓｄＡｂは、例えば腔や溝などの異常なエピトープに結合することが知られているため（ＷＯ ２００５０４４８５８Ａ１）、当該抗体の親和性は治療的治療に適し得る。

【0068】

したがって、一般的に、単一ドメイン抗体は、（一般的な）構造を有するアミノ酸配列として定義されることができ、

【0069】

【化2】

【0070】

ここで、ＦＲ１からＦＲ４は、フレームワーク領域１からフレームワーク領域４をそれぞれ指し、ＣＤＲ１からＣＤＲ３は、相補性決定領域１から相補性決定領域３をそれぞれ指す。

【0071】

したがって、本発明に係る「単一ドメイン抗体」は、ＦＲ１～ＦＲ４およびＣＤＲ１－ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列、またはそれらの変異体配列を含み、並びにグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズスフィンゴ脂質に対する単一ドメイン抗体の結合特異性は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列によって与えられる。

【0072】

本発明において開示される単一ドメイン抗体のＦＲ１～ＦＲ４およびＣＤＲ１～ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～１２６、１５７～１７７である。ＦＲ領域およびＣＤＲ領域における注釈は、カバット（Ｋａｂａｔ）による特有のナンバリングシステムに基づく。

【0073】

したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドにも向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記単一ドメイン抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２、１５７～１５９、またはそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８１、１６０～１６２、またはそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～９０、１６３～１６５、またはそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0074】

本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記単一ドメイン抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで：
（ａ）ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４～７２、１５７～１５９、から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～８１、１６０～１６２、から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～９０、１６３～１６５、から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0075】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈは本発明に係る主要な標的である。標的に対する単一ドメイン抗体は、１０^－６Ｍを超える親和性で前記標的に結合することができる単一ドメイン抗体を意味する。

【0076】

標的は、前記主要な標的の断片でもあり得る。したがって、標的は、前記標的の断片でもあり、免疫応答を誘発することができる。標的は、前記標的の断片であり、全長標的に対して産生される単一ドメイン抗体に結合することができる。主要な標的グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈの好ましい断片は、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５である。

【0077】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるスフィンゴ糖脂質への単一ドメイン抗体の結合は、好ましくは高い親和性で起こり、一般的に、単一ドメイン抗体とグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズ標的グリカンとの間の結合の解離定数は、１０^－５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は、１０^－６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は、１０^－７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は、１０^－８Ｍ未満である。あるいは、単一ドメイン抗体とグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈとの間の結合の解離定数は、１０^－５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は、１０^－６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は、１０^－７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は、１０^－８Ｍ未満である。あるいは、単一ドメイン抗体とＧｂ３との間の結合の解離定数は、１０^－５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は、１０^－６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は、１０^－７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は、１０^－８Ｍ未満である。あるいは、単一ドメイン抗体とＧｂ４との間の結合の解離定数は、１０^－５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は、１０^－６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は、１０^－７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は、１０^－８Ｍ未満である。あるいは、単一ドメイン抗体とＧｂ５との間の結合の解離定数は、１０^－５Ｍ未満であり、より好ましくは、解離定数は、１０^－６Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、解離定数は、１０^－７Ｍ未満であり、最も好ましくは、解離定数は、１０^－８Ｍ未満である。

【0078】

「変異体配列」
本発明の一態様によると、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグリカンに結合するポリペプチドは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグリカンに結合する全長ポリペプチドの変異体配列であり得る。本発明の一態様によると、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグリカンに結合するポリペプチドは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグリカンに結合する全長ポリペプチドの配列を含み得る。

【0079】

本発明の一態様によると、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択されるグリカンに結合するポリペプチドに含まれる単一ドメイン抗体は、完全な単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂまたはＶＨＨ）またはその変異体配列であり得る。

【0080】

本明細書で使用される場合、本発明における変異体配列は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含んでもよく、これは、参照ポリペプチドとも呼ばれる未修飾の親ポリペプチドと比較して、本発明のポリペプチドの機能的特徴を実質的に変えない。

【0081】

本発明に係る変形体配列は、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコなどの他のラクダ科の種に存在する配列であり得る。
親配列と比較した変異体配列におけるアミノ酸の欠失数または置換数は、好ましくは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０アミノ酸である。

【0082】

変異体配列が配列同一性を示す場合、それは、親配列との例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える配列同一性など、高い配列同一性を示す変異体配列を意味し、好ましくは、親配列の類似の特性、すなわち親和性によって特徴付けられ、前記同一性は以下に記述されるように計算される。

【0083】

「配列同一性」の割合は、参照配列の全長における「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」にわたって２つの最適に整列された核酸またはポリペプチド配列を比較することによって決定される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に整列された後の参照配列と変異体配列との間の最適な配列を指し、ここで、比較ウィンドウ内の変異体核酸またはポリペプチド配列は、最適な配列のために、参照配列（参照配列は、付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、一般的に５～１５パーセント、または１０～１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一性割合は、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を得て、一致する位置の数を参照配列の位置の総数（すなわち、アミノ酸またはヌクレオチドの全長）で割り、結果に１００を掛けることによって配列同一性の割合を得る。２つの核酸またはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が上述のように最適に整列されたときに同じである場合、「同一」であると言われる。

【0084】

あるいは、変異体配列は、以下の式：
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＡｓｎによって置換されるＳｅｒ；
Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕのいずれかによって置換されるＡｒｇ；
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌのいずれかによって置換されるＬｅｕ；
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＴｈｒのいずれかによって置換されるＰｒｏ；
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、およびＧｉｎのいずれかによって置換されるＴｈｒ；
Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、およびＰｒｏのいずれかによって置換されるＡｌａ；
Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕのいずれかによって置換されるＶａｌ；
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＳｅｒのいずれかによって置換されるＧｌｙ；
Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕのいずれかによって置換されるＩｌｅ；
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕのいずれかによって置換されるＰｈｅ；
Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕのいずれかによって置換されるＴｙｒ；
Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｉｎ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇのいずれかによって置換されるＨｉｓ；
Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇのいずれかによって置換されるＧｌｎ；
Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、およびＳｅｒのいずれかによって置換されるＡｓｎ；
Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇのいずれかによって置換されるＬｙｓ；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＡｓｎのいずれかによって置換されるＡｓｐ；
Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇのいずれかによって置換されるＧｌｕ；
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒのいずれかによって置換されるＭｅｔ
に従って、親配列の任意の位置数で許容される置換から生じる任意のアミノ酸配列であり得る。

【0085】

本明細書で使用される変異体は、各フレームワーク領域ＦＲおよび各相補性決定領域ＣＤＲが、参照配列における対応する領域と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性を示す配列であることもできる。この場合において、配列同一性は、ＦＲ１変異体対ＦＲ１参照、ＣＤＲ１変異体対ＣＤＲ１参照、ＦＲ２変異体対ＦＲ２参照、ＣＤＲ２変異体対ＣＤＲ２参照、ＦＲ３変異体対ＦＲ３参照、ＣＤＲ３変異体対ＣＤＲ３参照、ＦＲ４変異体対ＦＲ４参照について上述のように決定される。

【0086】

他の実施形態において、上記の抗原－結合タンパク質またはその変異体のいずれかをコードする組換え核酸配列も、本発明の一部である。
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上のポリペプチドをコードする組換え核酸分子を提供する。

【0087】

したがって、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１（表４）の１つ以上に記載の核酸配列、またはそれらの変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１に記載の核酸配列、またはその変異体を含む組換え核酸分子を提供する。

【0088】

さらに、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１の１つ以上に記載される１つ以上の組換え核酸分子またはそれらの変異体を含む宿主細胞を提供する。特に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載の１つ以上の組換え核酸分子、またはその変異体を含む細胞を提供する。

【0089】

別の態様において、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、配列同一性の割合は、上述のように決定される。これらの値は、限定的であることを意図されておらず、列挙される割合間の増分は、本開示の一部として具体的に想定される。具体的には、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性を共有する。より具体的には、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも８５％の配列同一性を共有する。更により具体的には、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも９０％の配列同一性を共有する。更により具体的には、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも９５％の配列同一性を共有する。更により具体的には、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子およびその変異体を提供し、ここで、当該変異体組換え核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のいずれかに対して、少なくとも９８％の配列同一性を共有する。

【0090】

任意の当該配列に相補的なポリヌクレオチドまたは核酸分子も、本開示に含まれる。核酸分子は、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、およびＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含み、１対１の方法でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子を含む。付加的なコード配列または非コード配列は、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結してもよいが、連結する必要はない。

【0091】

核酸分子は、天然の配列（すなわち、抗体または抗体の一部をコードする内因性配列）を含み得る、または当該配列の変異体を含み得る。
核酸変異体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに特異的に結合するコードされたポリペプチドの免疫反応性が、参照の天然免疫反応性ポリペプチドと比較して実質的に異ならないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。コードされたポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書に記述されるように評価され得る。いくつかの実施形態において、核酸変異体は、参照の天然の単一ドメイン抗体、またはその一部をコードする核酸配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％の同一性、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％の同一性を示し、ここで、配列同一性の割合は、上述のように決定される。これらの値は、限定的であることを意図されておらず、および列挙される割合間の増分は、本開示の一部として具体的に想定される。

【0092】

本開示における組換え核酸分子を、化学合成、組換え法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書において詳細に説明される必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、本明細書において提供される配列、および市販のＤＮＡ合成装置を使用することができる。組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクターに挿入することができ、次に、ベクターを、本明細書でさらに記述されるように、複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入してもよい。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ－交配（ｍａｔｉｎｇ）またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入されることによって形質転換される。導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター（例えば、プラスミドなど）として細胞内に維持されることができる、または宿主細胞ゲノムに統合されることができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている方法によって宿主細胞から単離されることができる。

【0093】

適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節配列などの様々な成分を含むことができる。ベクターは、抗体可変ドメインの異なるベクターへの続くクローニングを可能にするように構築され得る。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得る、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用することを意図される宿主細胞に従って異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有し得、および／またはベクターを含むクローンを選択することに使用されることができるマーカーのための遺伝子を保有し得る。適切な例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（例えば、ｐＢＳ ＳＫ^＋、など）および当該誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、およびシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など、を含む。これらの、および多くの他のクローニングベクターは、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、およびインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの商用ベンダーから入手可能である。

【0094】

さらに、本発明は、本明細書に開示される単一ドメイン抗体またはその変異体のいずれかをコードする核酸配列を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含む宿主細胞も想定する。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主細胞で複製可能でなければならないことを暗示する。ベクター成分は、一般的に、次の、単一配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つ以上を含み得るが、これらに限定されない。発現（すなわち、翻訳）のために、１つ以上の翻訳制御要素、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなども通常必要とされる。

【0095】

目的の組換え核酸分子を含むベクター、および／または組換え核酸分子自体を、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション、微粒子銃、照射、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合など）を含む、いくつかの適切な方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。特定の手順の選択は、宿主細胞の特徴にしばしば依存するであろう。

【0096】

適切な発現システムは、細菌または酵母における恒常的および誘導的発現システム、例えば、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびレンチウイルス、などのウイルス発現システム、または昆虫もしくは哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションを含む。特に好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質のクローニングおよび発現のためのｐＥＴ発現ベクター（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））である。ｐＥＴシステムにおいて、標的遺伝子は、強力なバクテリオファージＴ７転写および任意に翻訳シグナルの制御下で、ｐＥＴプラスミドでクローン化され、発現は、宿主細胞においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの供給源を提供することによって誘導される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、非常に選択的であり、および活性があるので、完全に誘導されると、ほとんど全ての細胞の供給源が標的遺伝子発現に変換され、所望の生成物は、誘導の数時間後に全細胞タンパク質の５０％以上を含むことができる。ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ベクターは、潜在的なペリプラズム局在化のためのＮ末端ｐｅｌＢシグナル配列、さらに任意のＣ－末端ヒス・タグ（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）（登録商標）配列を有する。

【0097】

適切な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカスラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、などを含む。適切な動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などを含む。特に好ましくは、アークティック エクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞である。抗原結合タンパク質のクローニング、発現および／または精製を、バキュロウイルス感染昆虫細胞系を含む、当業者によって知られている技術に従って行うことができる。

【0098】

［単一ドメイン抗体の機能化］
単一ドメイン抗体の任意の多価性および多重特異性に加えて、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ）の重要な利点は、単一のＤＮＡプラスミドでエフェクター分子と一緒に容易にクローン化され、および発現される能力である。これらの拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）は、抗原結合自体以外の幅広い適用においてｓｄＡｂｓの使用を可能にする。単一ドメインの性質のおかげで、ｓｄＡｂｓは、分子工学または生物化学工学を通じて、様々なエフェクター機能を容易に備えることができる。適切なエフェクター分子は、例えば、抗体依存性細胞毒性の活性化、寄生虫および癌細胞膜の溶解、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）／インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）イメージング、および診断など、のような多くの異なる機能を有する。本発明において特に好ましいエフェクター分子は、抗癌ペプチド、溶解性ペプチド、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース、ジニトロフェニル、血清安定化分子、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、アジピン酸ジスクシンイミジル、ヒトＦｃ抗体断片である。

【0099】

したがって、本発明の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体、または前記可変ドメインの変異体、を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、
ここで、エフェクター分子は、抗癌ペプチド、溶解性ペプチド、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース、ジニトロフェニル、血清安定化分子、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、アジピン酸ジスクシンイミジル、ヒトＦｃ抗体断片、からなる群から選択される。

【0100】

具体的には、エフェクター分子は、好ましくは、単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。さらに、エフェクター分子は、好ましくは、リンカーを用いて単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。好ましいリンカーは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、ＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）、およびＧＧＧＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、を含む群から選択される。好ましくは、酵素制限部位に対応する２つのアラニンおよび２つのアミノ酸「ＸＸ」の配列を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であることができる「短い接続配列」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：ＡＡＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。

【0101】

「抗癌ペプチド」は、植物、動物、および他の生物において、それらの抗菌活性のために最初に発見された発見されたペプチドである。これらのペプチドは、膜相互作用を通じて細菌および癌細胞を殺すことができる。細菌細胞またはガン細胞と、健康な哺乳類細胞との間の違いは、膜の電荷において明らかにされる。細菌細胞および癌細胞の両方は、全体的に負に帯電された膜を有する。細菌細胞の膜と癌細胞の膜との間の類似性のために、膜破壊が起こり、細胞死を誘導するメカニズムも類似していると考えられる。抗癌活性を有する抗菌ペプチドの例は、ＬＬ－３７、ラクトフェリシン、または血小板第４因子（ＰＦ４）のＣ－末端である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）および抗癌ペプチドは、好ましくはリンカーを用いて結合されて発現し、リンカーは、好ましくは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎユニットの異なる反復、または配列ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳの異なる反復である。好ましいリンカーは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、およびＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）である。より具体的には、リンカーおよび抗癌ペプチドは、ｓｄＡｂのＣ末端に連結される。さらに、酵素制限部位に対応する２つのアラニンおよび２つのアミノ酸「ＸＸ」の配列を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であることができる「短い接続配列」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：ＡＡＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、好ましくは、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。

【0102】

本発明に係る「溶解性ペプチド」は、修飾システイン欠失タキプレシン（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）－Ｉ（ＫＷＦＲＶＹＲＧＩＹＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、ＢＭＡＰ２８Ａ（ＧＧＬＲＳＬＧＲＫＩＬＲＡＷＫＫＹＧＰＩＩＶＰＩＩＲＩＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）、ポリビア（Ｐｏｌｙｂｉａ）－ＭＰ１（ＩＤＷＫＫＬＬＤＡＡＫＱＩＬ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）を含む。

【0103】

タキプレシン－Ｉは、カブトガニから分離された抗菌ペプチドであり、細胞膜を透過する能力を用いて、さまざまな種類の細菌の増殖を阻害する。以前に報告されたシステインを欠く線状タキプレシン類似体（システイン欠失タキプレシン、ＣＤＴ、ＫＷＦＲＶＹＲＧＩＹＲＲＲ－ＣＯＮＨ２）を初めとして、Ｗａｎｇらの研究（Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．２０１４）は、ＣＤＴからの２つのＣ末端アルギニン残基の除去が、抗菌活性を保持するが、溶血性が減少し、治療薬に望まれる選択性を有するペプチド（［ｄｅｓ－Ａｒｇ^{１２，１３}］ＣＤＴ）をもたらすことを示す。本明細書で使用される場合、修飾システイン欠失タキプレシン－Ｉは、配列ＫＷＦＲＶＹＲＧＩＹＲを指す。

【0104】

ポリビア－ＭＰ１は、既知の抗がん特性を有するブラジルのハチ毒（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｗａｓｐ ｖｅｎｏｍ）からの溶解性ペプチドである。ポリビア－ＭＰ１で実施されたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究は、急性細胞傷害、膨張、および膜の破壊または膜貫通孔の形成を介した破裂の結果としての壊死によって引き起こされた殺傷の証拠を提供する。

【0105】

ＢＭＡＰ－２８は、カテリシジンファミリーのウシ抗菌ペプチドであり、ヒト腫瘍細胞株および活性化されているが休止していないヒトリンパ球において、膜透過性および死を誘導する。

【0106】

Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース（αＧａｌ）およびジニトロフェニル（ＤＮＰ）は、単一ドメイン抗体に存在しない断片結晶化可能（Ｆｃ）領域に関係なく、抗体依存性細胞傷害を成功裏に開始することができる。確かに、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース（αＧａｌ）およびジニトロフェニル（ＤＮＰ）は、腫瘍細胞に対して天然に産生された抗体を動員することができる。このようにして標的化された細胞は、免疫系によって異物として認識され、破壊のマークが付けられる。腫瘍細胞に対する内因性抗体の動員は、２つの抗体エフェクターメカニズムである補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による破壊を可能にする。

【0107】

【化3】

【0108】

したがって、本発明の好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される少なくとも一つの溶解性ペプチドである。

【0109】

本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、溶解性ペプチドは、リンカーを用いて単一ドメイン抗体のＣ末端に結合される。好ましいリンカーは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、およびＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）を含む群から選択される。好ましくは、短い接続配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：ＡＡＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。

【0110】

本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、溶解性ペプチドは、リンカーを用いて単一ドメイン抗体のＣ末端に結合される。好ましいリンカーは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、およびＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）を含む群から選択される。好ましくは、短い接続配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：ＡＡＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。

【0111】

本発明の更に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～６３、１４２～１５６、１７９～２２６から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0112】

本発明の更に特に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、溶解性ペプチドは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、およびＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）を含む群から選択されるリンカーを用いて単一ドメイン抗体のＣ末端に結合され、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～６３、１４２～１５６、１７９～２２６から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。好ましくは、短い接続配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：ＡＡＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結される。

【0113】

言い換えると、本発明の更に特に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、更に、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、溶解性ペプチドは、ＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＳＡＡ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８：ＧＧＧＧＳＥＡＡＡＫＧＧＧＧＳ）、およびＳＲＧＳ＿リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８：ＳＲＧＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＧＧＳＧ）を含む群から選択されるリンカーを用いて単一ドメイン抗体のＣ末端に結合され、ここで、短い接続配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７：、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であることができる）は、リンカー配列の前に単一ドメイン抗体のＣ末端に連結され、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～６３、１４２～１５６、１７９～２２６から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0114】

ｓｄＡｂは、Ｆｃ領域を欠くため、Ｆｃ受容体－依存性エフェクター機能自体を誘導することはできない。しかしながら、ヒトＦｃ抗体断片は、新生児Ｆｃ受容体またはＦｃＲｎと相互作用する能力を回復するために単一ドメイン抗体に連結され、または融合されることができる。ｓｄＡｂ－Ｆｃ融合コンストラクトの重要な利点は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃ受容体依存性エフェクター機能の導入である。様々なヒトおよびマウス抗体サブクラスのＦｃ領域（ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｓｄＡｂに遺伝的に融合されている。ｓｄＡｂのＦｃ抗体断片への連結または融合は、血清半減期を大幅に増加させ、親和性効果を通じて標的抗原結合を高めるという利点もある。

【0115】

単一ドメイン抗体の安定化
ｓｄＡｂの半減期を延長するための別の戦略は、ｓｄＡｂを、長寿命血清タンパク質に、またはこれらの長寿命タンパク質を標的とする構成単位に結合することである。血清アルブミンの長い血清半減期は、例えば、細胞取り込み後に異化作用から逃れる能力に起因する。他のアプローチは、ｓｄＡｂをアルブミン結合ｓｄＡｂに融合することからなる。

【0116】

したがって、本発明は、対象の１つ以上の血清タンパク質に対して向けられるある種の抗体（例えば、単一ドメイン抗体）をさらに含むポリペプチドにも関し、抗体は、前記ポリペプチドの循環において有意に延長された半減期を有する。血清タンパク質は、対象の血清またはその断片に見られる任意の適切なタンパク質であり得る。本発明の一態様において、血清タンパク質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスフェリン、またはフィブリノーゲンである。例えば、標的抗原の効果的な治療および／または区画化に必要な半減期などの使用目的に応じて、抗体を上記の血清タンパク質の１つに対して向けることができる。

【0117】

単一ドメイン抗体に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞療法
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞膜貫通ドメインに連結される抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはｓｄＡｂ）を含む人工的に構成されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドを指し、これは、次に、Ｔ細胞内シグナル伝達または活性化ドメインに連結され、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の連結は、ヒンジ領域を介して起こる。ＣＡＲのドメイン、または他の機能的もしくは構造的配列、例えば、膜貫通ドメイン、または細胞内活性化もしくはシグナル伝達ドメインは、前記ＣＡＲの要素またはモジュールと呼ばれる。

【0118】

ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣ非拘束性方法において、選択された標的に向けてＴ細胞特異性およびＴ細胞反応性を向け再指示（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）することができる。

【0119】

ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原認識モジュールは、エクトドメインとも呼ばれ、通常ｓｃＦｖであり、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激ドメイン、および細胞質活性化ドメイン、例えば、ＣＤ３－ゼータ（ｚｅｔａ）またはＦｃＲγ細胞内シグナル伝達ドメインなど、に連結される。しかしながら、ｓｃＦｖは、必ずしも効率的に折りたたまれるとは限らず、凝集する傾向がある可能性がある。対照的に、重鎖のみの抗体（ＶＨＨまたはｓｄＡｂ）の可変領域は、従来のｓｃＦｖに匹敵する親和性を有する小さく安定した単一ドメイン抗体断片である。

【0120】

癌治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞を開発することにおける主な困難は、標的となる抗原の欠如である（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。癌を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞標的として提案されるほとんどの抗原は、特定の癌の種類に限定されており、大多数の癌の癌特異的抗原に関する限られた情報は、不適切なＣＡＲ Ｔ細胞療法を提供する。

【0121】

したがって、本発明の特定の利点の態様は、様々な癌で発現され、および抗グリカンＣＡＲ Ｔ細胞を操作するために使用されることができるグロボ（Ｇｌｏｂｏ） Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、またはＧｂ５などのグロボ－シリーズグリカンを特異的に標的とするＣＡＲを提供することであり、ＣＡＲは、その後、いくつかの異なる癌を治療するために使用されることができる。

【0122】

したがって、本発明の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される。前記ポリペプチドは、Ｔ細胞キメラ抗原受容体であり、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインは、Ｎ－末端からＣ－末端の方向でキメラ抗原受容体に含まれる。

【0123】

言い換えると、本発明の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、並びに、Ｎ－末端からＣ－末端の方向で、少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結される。

【0124】

より具体的には、本発明の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、並びに、少なくとも一つの細胞外ＣＤ８－アルファヒンジ領域、少なくとも一つのＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＤ３－ゼータ細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される。

【0125】

本発明の更なる実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0126】

本発明の更に好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化されることも開示される。

【0127】

本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子にも向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、並びに少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される。さらに、本発明は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むベクター、および宿主細胞を提供し、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、並びに少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される。

【0128】

本発明のより好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、癌の治療における使用のために、細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現する。

【0129】

本発明のより好ましい実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、癌の治療における使用のために、細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現し、ここで、癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0130】

キメラ抗原受容体のヒンジ領域は、通常、ヒトＣＤ８－アルファ鎖（ＷＯ２０１６０１９３００ Ａ１の例示的なＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、またはＵＳ ２０１６０３０３１６６ Ａ１に記載の断片）に由来する。

【0131】

キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、原形質膜を通過し、および細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインとを連結する。膜貫通ドメインの例は、ヒトＣＤ２８（例示的な配列：ＵＳ ２０１６０３０３１６６ Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の残基１５３～１７９）、ＣＤ８－アルファ（ＷＯ２０１６０１９３００ Ａ１の例示的な配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）が含むが、これらに限定されない。

【0132】

細胞内活性化ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。より具体的には、細胞外ドメインが標的のグロボ（Ｇｌｏｂｏ） Ｈシリーズグリカンと結合すると、細胞外活性化ドメインは細胞の活性化に必要なシグナルを伝達する。細胞内活性化ドメインは、通常、ヒトＣＤ３－ゼータ（ＷＯ２０１６０１９３００ Ａ１の例示的な配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）である。

【0133】

本明細書で使用される「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）は、記憶細胞の増殖、生存および／または発達を増強するＣＡＲの部分を指す。本発明のＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８（ＷＯ２０１６０１９３００ Ａ１の例示的な配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＷＯ２０１６０１９３００ Ａ１の例示的な配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびＩＣＯＳ（ＷＯ２０１６０１４５５３Ａ１の例示的な配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３）などの共刺激ドメインを含むことができる。

【0134】

キメラ抗原受容体を構築するための方法は、先行技術、例えば、ＵＳ ２０１６０３０３１６６ Ａ１、ＷＯ２０１６０１４５５３ Ａ１、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ２０１８などに記載されている。

【0135】

さらに、本発明は、遺伝子操作されたキメラ抗原受容体Ｔ－細胞（ＣＡＲ Ｔ－細胞）を生成するための方法も記載し、以下の方法を含む：
ａ）少なくとも一つの単一ドメイン抗体を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを生成すること、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン、キメラ抗原受容体における少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインを結合し、ここで、単一ドメイン抗体は、細胞外ヒンジ領域に連結される、
ｂ）対象の血液から除去されたＴ細胞をトランスフェクションすること、
ｃ）グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に認識するＣＡＲ Ｔ細胞を生成するためにＴ細胞において機能的ＣＡＲを生成するＣＡＲコンストラクトを発現させること。

【0136】

本発明のＣＡＲを含み、発現し得る遺伝子組換えＴ細胞は、Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、記憶Ｔ細胞（例えば、セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）、エフェクター記憶細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または治療に関連する子孫を生じさせることができる多能性胚性／誘導性幹細胞を含むが、これらに限定されない。実施形態において、遺伝子組換え細胞は、自家細胞である。例として、本発明における個々のＴ－細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^－、ＣＤ４^－／ＣＤ８^＋、ＣＤ４^－／ＣＤ８^－、またはＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋であり得る。Ｔ－細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^－細胞およびＣＤ４^－／ＣＤ８^＋細胞の混合集団、または単一クローンの集団であり得る。本発明のＣＤ４^＋Ｔ－細胞は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で標的抗原を発現する細胞（すなわち、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈシリーズグリカンを発現する癌細胞）と共培養されると、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦａおよび他のＴ細胞エフェクターサイトカインを産生し得る。本発明のＣＤ８^＋Ｔ－細胞は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で標的細胞（すなわち、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈシリーズグリカンを発現する癌細胞）をと共培養されると、抗原－特異的標的細胞を溶解させ得る。

【0137】

最後に、本発明は、癌を有する対象を治療するための方法も記載し、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、前記癌を有する対象に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に認識するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を投与することを含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、本明細書に開示されるような、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体、少なくとも一つの細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激ドメイン、および少なくとも一つの細胞内活性化ドメインを含む機能的ＣＡＲポリペプチドを、前記癌を有する対象を治療するために有効量で発現する。

【0138】

単一ドメイン抗体のヒト化
本発明における変異配列は、ヒト化されているグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、ＧＢ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグリカンを特異的に結合する単一ドメイン抗体を含み得る。ｓｄＡｂのヒト化は、投与時にヒト個体における望ましくない免疫反応の可能性をさらに減らすことを目的としている。本発明の一実施形態は、アルパカ抗体に基づかれる改変された単一ドメイン抗体に関し、ここで、標的に対するドメインの天然の親和性に影響を及ぼさないｓｄＡｂのアミノ酸残基は、ヒトに対するｓｄＡｂ免疫原性を低下させるように改変される。

【0139】

より具体的には、本発明は、ヒトへの投与のために改変されたｓｄＡｂ、およびヒトの疾患の治療における当該「ヒト化された」ｓｄＡｂの使用に関する。本発明に係る単一ドメイン抗体をヒト化することは、単一ドメイン抗体が典型的な特徴を失うことなく、すなわち、ヒト化が、結果として生じる単一ドメイン抗体の、さらに、結果として生じる単一ドメイン抗体を含むポリペプチドの抗原結合能力にそれほど影響を与えることなく、ヒトコンセンサス配列に見られるようなヒト対応物によって、アルパカアミノ酸の一つ以上を置換するステップを含む。当該方法は、当業者に知られている。

【0140】

アルパカ単一ドメイン抗体、またはより一般的にはラクダ科単一ドメイン抗体のヒト化は、単一のポリペプチド鎖において限られた量のアミノ酸の導入、および突然変異誘発が必要である。

【0141】

したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ヒト化単一ドメイン抗体である。

【0142】

一般に、ヒト化単一ドメイン抗体は、ＥＰ１６８７３３８ Ｂ１に記載されているように、アルパカ単一ドメイン抗体において、以下の残基のいずれかを、単独で、または組み合わせてのいずれかで置換することによって得られ：
ＦＲ１ 位置１、５、１１、２８、および３０で特徴アミノ酸、
ＦＲ２ 位置４４および４５で特徴アミノ酸、
ＦＲ３ 位置７４、７５、７６、８３、８４、９３および９４で特徴アミノ酸、
ＦＲ４ 位置１０３、１０４、１０８および１１１で特徴アミノ酸：
ここで、番号付けは、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に従う。

【0143】

ＦＲ１、ＦＲ３、ＦＲ４の残基のヒト化は、単一ドメイン抗体の機能および安定性に最小限の影響を与えることになるが、一方、位置４４および４５でＦＲ２の変異は、単一ドメイン抗体を安定化さえするであろう（Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９）。しかしながら、ＥＰ １６８７３３８ Ｂ１は、ＦＲ４でＱ１０８Ｌの突然変異誘発が、大腸菌における生産レベルの低下をもたらしうることを報告する。位置１０８は、ラクダ類のＶＨＨに溶媒暴露されるが、ヒト抗体において、この位置はＶＨ－ＶＬ界面で埋もれる。極性非荷電Ｇｌｎの代わりに非極性疎水性Ｌｅｕの導入は、分子の固有の折り畳み／安定性に劇的な影響を与えることができる。ＦＲ２の位置３７位および４７位にある単一ドメイン抗体特徴残基は、抗原相互作用の完全性に大きな影響を与えるため、ヒト化することはできない（Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ｌａ．，２００９）。

【0144】

表１は、ＵＳ ７８０７１６２ Ｂ２に記載されるように、本発明のアルパカｓｄＡｂの特徴残基、および最も密接に関連しているヒトＶＨドメインＶＨ３の対応する位置でのアミノ酸残基を報告する。この表は、本明細書に開示されるアルパカ単一ドメイン抗体の位置１０３および１１１での特徴アミノ酸が、ヒトＶＨ３の最も一般的な残基と同じであることを示す。

【0145】

したがって、本発明の更なる実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される。

【0146】

したがって、ヒト化ポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ポリペプチドは、そこからの望ましくない免疫応答を予期せずに、および更なるヒト化の負担なしに、ヒトに直接投与され得る。本発明は、前記ヒト化ポリペプチドをコードすることができる組換え核酸にも関する。

【0147】

本発明の好ましい実施形態は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドであり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、並びに前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、エフェクター分子は、抗癌ペプチド、溶解性ペプチド、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース、ジニトロフェニル、血清安定化分子、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、アジピン酸ジスクシンイミジル、ヒトＦｃ抗体断片からなる群から選択される。本発明のより好ましい実施形態は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドであり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、並びに前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、エフェクター分子は、修飾システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドである。

【0148】

【表1】

【0149】

医薬組成物
「医薬組成物」は、有効成分の生物学的活性が効果的であるようにし、製剤が投与される対象に毒性のある追加の成分を含まない形態の製剤を指す。

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」、「生理学的に耐容可能な」およびその文法的変形は、交換可能に使用され、材料は、例えば、吐き気、めまい、胃の不調、および同様のものなどの、望ましくない生理学的効果を生成することなく、哺乳動物に、または哺乳動物に対して投与することができることを示す。

【0151】

医薬組成物は、効果的な方法で単一ドメイン抗体を含む本発明のポリペプチドの投与を容易にするように設計される。
「薬学的に許容可能なビヒクル」は、それが投与される対象に対して無毒である、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能なビヒクルは、緩衝液、安定剤、または防腐剤を含むが、これらに限定されない。

【0152】

適切なビヒクルまたは賦形剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、グルコース、粉末糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、デンプン、アカシアガム、キサンタンガム、グアーガム、タラガム、メスキートガム、フェヌグリークガム、ローカストビーンガム、ガッティガム、トラガカントガム、イノシトール、モラセス、マルトデキストリン、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）殻の粘液、ビーガム、カラマツアラボガラクタン、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、カオリン、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、アルギネート、ゼラチン、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、例えば、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）９４１、カルボポール９８０、カルボポール９８１などのカルボポールのようなポリアクリル酸、および例えば、ファーマガム（Ｐｈａｒｍａｇｕｍ）（商標）（ＳＰＩ ファーマグループ（Ｐｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ）；ニューキャッスル、デラウェア州）などのガムベース、および同様のものを含むが、これらに限定されない。典型的には、本発明の組成物は、約１０重量％から約９０重量％のビヒクル、賦形剤、またはそれらの組み合わせを含む。

【0153】

好ましくは、医薬組成物は、約０．００１重量％から約９０重量％、好ましくは約０．０１重量％から約７５重量％、より好ましくは約０．１重量％から５０重量％、さらにより好ましくは約０．１重量％から１０重量％の本発明のポリペプチドを含み、残りは適切な医薬ビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤からなる。

【0154】

医薬組成物は、粉末に、顆粒に、錠剤に、カプセルに、懸濁液に、エマルションに、シロップに、経口剤形に、外用製剤に、坐剤に、または例えば、通常の方法でエアロゾル化されるなど、無菌注射溶液の形態で、それぞれ製剤化されることができる。製剤化される場合、医薬組成物は、希釈剤または賦形剤、例えば、一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤など、を使用して調製されることができる。

【0155】

医薬組成物において、経口投与のための固体調製物は、錠剤、ピル、粉末、顆粒、またはカプセルであってもよい。固体調製物は、賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤は、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、またはゼラチンであってもよい。さらに、固体調製物は、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどをさらに含んでもよい。医薬組成物において、経口投与のための液体調製物は、最良の懸濁液、溶液、エマルション、またはシロップであってもよい。液体製剤は、水または流動パラフィンを含んでもよい。液体製剤は、賦形剤に関して、例えば、湿潤剤、甘味料、芳香剤または防腐剤を含んでもよい。非経口投与の目的のために、本発明のポリペプチドを含む組成物は、好ましくは蒸留水に溶解され、ｐＨは、好ましくは約６から８に調整される。

【0156】

非経口投与のための本発明の組成物における有用な調製物は、無菌の水性および非水性溶媒、懸濁液およびエマルションも含む。有用な非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射可能な有機エステルを含む。

【0157】

本発明の実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドを含む医薬組成物であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する。

【0158】

本発明の他の実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含み、および、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含む医薬組成物であり、ここで、エフェクター分子は、抗癌ペプチド、溶解性ペプチド、Ｌ－ラムノース、ガラクトース－α－１，３－ガラクトース、ジニトロフェニル、血清安定化分子、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、アジピン酸ジスクシンイミジル、ヒトＦｃ抗体断片からなる群から選択される。

【0159】

本発明の他の特定の実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含み、および、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含む医薬組成物であり、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドである。

【0160】

本発明のより特定の実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含み、および、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含む医薬組成物であり、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９～６３、１４２～１５６から選択される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する。

【0161】

本発明の更なる実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含む医薬組成物であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される。わずかに言い換えると、本発明の一実施形態は、少なくとも一つの薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、および／または希釈剤と共に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つのヒト化単一ドメイン抗体を含むある種のポリペプチドを含む医薬組成物である。

【0162】

癌に対する単一ドメイン抗体の使用
本発明の他の実施形態は、癌の治療および／または診断における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチド、または、前記ポリペプチドを含む医薬組成物に向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現する。

【0163】

本発明の他の実施形態は、癌の治療および／または診断における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチド、またはその変異体、または、前記ポリペプチドを含む医薬組成物に関し、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合しここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現し、ここで、癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0164】

さらに、本発明の一態様は、癌の治療および／または診断における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドに向けられ、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ－シリーズグリカンを発現する。本発明の一実施形態をわずかに言い換えると、癌の治療および／または診断における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つのヒト化単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドに関し、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0165】

さらに、本発明の一態様は、癌の治療および／または診断における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含む医薬組成物に向けられ、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0166】

本発明の好ましい実施形態は、癌の治療および／または診断における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む医薬組成物であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0167】

本発明の更により好ましい実施形態は、癌の治療における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む医薬組成物であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、および前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0168】

本発明の更により好ましい実施形態は、癌の治療における使用のための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む医薬組成物であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、および前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、エフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0169】

本発明の更なる実施形態は、癌の治療における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0170】

本発明の他の更なる実施形態は、癌の治療における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および、少なくとも一つの細胞外ＣＤ８－アルファヒンジ領域、少なくとも一つのＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＤ３－ゼータ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0171】

本発明の更なる実施形態は、癌の治療における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および、少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0172】

本発明の他の更なる実施形態は、癌の治療における使用のための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドに向けられ、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、Ｇｌｏｂｏ（グロボ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、および、少なくとも一つの細胞外ＣＤ８－アルファヒンジ領域、少なくとも一つのＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＤ３－ゼータ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0173】

更に本明細書に記載されるのは、癌の治療のための方法であり、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、本明細書に開示される治療有効量のポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を前記癌に罹患している患者に投与することを含む。

【0174】

具体的には、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する治療有効量のポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、および、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する。

【0175】

更に本明細書に記載されるのは、癌の治療のための方法であり、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、本明細書に開示される治療有効量のポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0176】

具体的には、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される。

【0177】

さらに、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、カバット ナンバリング（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）にしたがって、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0178】

より具体的には、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、および前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここでエフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドである。

【0179】

更により具体的には、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む治療有効量の医薬組成物を、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化され、および前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここでエフェクター分子は、システイン欠失タキプレシン－Ｉ、ＢＭＡＰ２８Ａ、ポリビア－ＭＰ１を含む群から選択される溶解性ペプチドであり、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0180】

更に、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結される。

【0181】

更に、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、および少なくとも一つの細胞外ＣＤ８－アルファヒンジ領域、少なくとも一つのＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＤ３－ゼータ細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結される。

【0182】

更により具体的には、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0183】

更に、癌の治療のための方法が記載され、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現し、方法は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含む治療有効量のグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを、前記癌に罹患している患者に投与することを含み、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞外ヒンジ領域、少なくとも一つのＣＡＲ膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＡＲ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＡＲ細胞内活性化ドメインを更に含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、および少なくとも一つの細胞外ＣＤ８－アルファヒンジ領域、少なくとも一つのＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、少なくとも一つのＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、および少なくとも一つのＣＤ３－ゼータ細胞内活性化ドメインをさらに含み、ここで、単一ドメイン抗体は、ＣＡＲ細胞外ヒンジ領域に連結され、ここで、前記癌は、脳癌、肝臓癌、胆管癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、および結腸直腸癌から選択される。

【0184】

更なる実施形態は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する癌細胞によって特徴付けられる癌を診断する方法を記載し、次のステップを含む：
ａ）本明細書に開示されるように、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）シリーズグリカンに特異的に結合するポリペプチドと試料を接触させること
ｂ）前記試料への前記ポリペプチドの結合を検出すること
ｃ）ステップｂ）で検出された結合を標準と比較すること、ここで、前記試料に関連する結合の違いは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する癌細胞によって特徴付けられる癌の特徴である。

【0185】

「疾患」は、本明細書に記載される物質／分子または方法を用いて治療から利益を得るであろう任意の状態である。
「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」は、例えば癌などのある程度の異常な細胞増殖に関連する疾患を指す。

【0186】

「癌」および「癌性」は、典型的には細胞増殖性疾患によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を指す、または記載する。癌は、一般的に、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むことができるが、これらに限定されない。癌のより具体的な例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、白血病および他のリンパ増殖性疾患、および様々な型の頭頸部癌を含むことができる。

【0187】

「腫瘍」は、悪性か良性かに関わらず、全ての腫瘍性細胞の成長および増殖、および全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」、および「腫瘍」は、本明細書で言及される通り相互に排他的ではない。

【0188】

「転移」は、個人の体内の原発部位から他の場所へ、癌および／または腫瘍が広がることを指す。
「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療される個人の疾患の自然な経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理学の過程の間のいずれかで実施されることができる。治療における望ましい結果は、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患における任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移を防止すること、進行速度を低下させること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善を含むことができるが、これらに限定されない。例えば、治療は、癌の発展を遅らせる、または進行を遅らせるために、抗グロボＨ抗体を含む治療有効量の医薬製剤を、患者へ投与することを含むことができ、ここで、前記癌の癌細胞は、癌細胞の表面に、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する。

【0189】

「医薬製剤」は、有効成分の生物学的活性を有効にし、製剤が投与される対象に対して毒性のある追加の成分を含まない形態の調製物を指す。
「薬学的に許容可能な担体」は、医薬製剤が投与される対象に対して無毒である、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含むが、これらに限定されない。

【0190】

「治療有効量」は、例えば、対象の疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）または疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療する、または予防するために、所望の治療結果、または予防結果を達成するための有効成分、または薬剤（例えば、製剤）の量を指す。癌の場合、治療薬の治療有効量は、癌細胞の数を減らす、原発腫瘍サイズを減らす、末梢組織への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍の成長をある程度阻害する、および／または癌に関連する一つ以上の兆候をある程度緩和する量である。薬物が癌細胞の成長を予防し得る、および／または既存の癌細胞を殺し得る範囲で、薬物は細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。癌治療の場合、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での有効性は、例えば、生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、および／または生活の質を評価することによって測定されることができる。

【0191】

「個体」または「対象」とは、家畜（例えば、牛、羊、猫、犬、および馬など）、霊長類の動物（例えば、ヒト、並びにサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、を含むが、これらに限定されない、哺乳動物を指す。

【0192】

「抗癌治療薬」は、癌の治療に有用な薬剤を指す。例示的な抗癌治療薬は、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法において使用される薬剤、抗－血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、および癌を治療するための他の薬剤、抗－ＣＤ２０抗体、血小板由来成長因子阻害剤、ＣＯＸ－２阻害剤、インターフェロン、サイトカイン、一つ以上の標的に結合するアンタゴニスト（例えば、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２）、他の生物活性物質および有機化学物質、並びにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

【0193】

癌の診断のための単一ドメイン抗体の使用
本発明の更なる実施形態は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する細胞の検出のための診断キットであり、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含み、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体である。グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに結合している前記ポリペプチドだけでなく、キットは、抗原－結合細胞の標識および／または検出および／または定量化に必要な試薬をさらに含み得る。

【0194】

わずかに言い換えると、本発明は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する細胞によって特徴づけられる癌のスクリーニングのための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体、または前記可変ドメインの変異体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含む診断キットにも向けられる。

【0195】

本発明の他の態様は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現することによって特徴づけられる癌のスクリーニングのための、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ポリペプチドを含む診断キットであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記少なくとも一つの単一ドメイン抗体は、ＦＲ１の位置１、５、１１、２８および３０、ＦＲ２の位置４４および４５、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ＦＲ４の位置１０４および１０８に位置する一つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、ヒト化される。

【0196】

上記のように、本発明における単一ドメイン抗体は、検出可能な標識であるエフェクター分子に連結された場合、診断目的に使用されることができる。
本発明における単一ドメイン抗体を結合する、使用する、および検出するための適切な検出可能な標識および技術は、当業者に明らかであり、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン、並びにランタニドシリーズからのＥｕまたは他の金属などの蛍光金属など）、リン光性分子、化学発光分子または生物発光分子（例えば、ルミナル、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰ、およびその類似体など）、放射性同位体、金属、金属キレート、または金属カチオン、または他の金属、またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）診断およびイメージングのために特に適している金属カチオン、並びに発色団および酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ－Ｖ－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ－グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－ＶＩ－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなど）を含むが、これらに限定されない。

【0197】

したがって、本発明の更なる実施形態は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを細胞の表面に発現する細胞によって特徴づけられる癌のスクリーニングのための、少なくとも一つの単一ドメイン抗体、または前記可変ドメインの変異体、を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドを含む診断キットであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、前記単一ドメイン抗体に連結される少なくとも一つのエフェクター分子を更に含み、ここで、エフェクター分子は、蛍光分子、リン光性分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、および発色団を含む群から選択される。

【0198】

多量体単一ドメイン抗体を含むポリペプチド
本発明の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、少なくとも２である。

【0199】

少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含む当該ポリペプチドは、ｓｄＡｂ４６三量体で示されるように、標的に対する親和性がより高いという利点を有する（図２３）。

【0200】

本発明の特定の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、少なくとも２であり、ここで、二つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が異なる。

【0201】

本発明のより特定の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、少なくとも２であり、ここで、二つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が同一である。

【0202】

本発明の更により特定の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、３であり、ここで、二つ以上の単一ドメイン抗体は、配列が同一である。

【0203】

本発明の更により特定の実施形態は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含むグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合するポリペプチドであり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、軽鎖を天然に欠く、および定常領域１を天然に欠く重鎖抗体の可変ドメイン、または前記可変ドメインの変異体であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合し、ここで、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、およびＧｂ５から選択される少なくとも一つのグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを結合する単一ドメイン抗体の数は、３であり、ここで、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0204】

単一ドメイン抗体は、当技術分野で知られる方法または任意の将来の方法を使用して、本明細書に開示されるグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合し、および２つ以上の単一ドメイン抗体を含むポリペプチドのいずれかを形成するために結合され得る。単一ドメイン抗体は、非共有結合的に（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせ、抗体／タグの組み合わせを使用する）または共有結合的に結合され得る。それらは、アミノ酸残基を有機誘導体化剤と反応させることによる化学的架橋によっても融合され得る。

【0205】

あるいは、単一ドメイン抗体は、ＤＮＡレベルで遺伝的に融合され得る。単一ドメイン抗体を結合する１つの方法は、単一ドメイン抗体コード配列を直接的に、またはペプチドリンカーを介してのいずれかで連結することによる遺伝的経路を介することである。例えば、単一ドメイン抗体のＣ末端は、次の単一ドメイン抗体のＮ末端に連結され得る。この連結方法は、トリ－、テトラ－、等の機能的コンストラクトの構築および生成のために追加の単一ドメイン抗体を連結するために拡張されることができる。さらに、単一ドメイン抗体は、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（例えば、Ｓｍｉｔｈ ＤＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＳ，Ｇｅｎｅ １９８８；Ｔｕｄｙｋａ Ｔ，Ｓｋｅｒｒａ Ａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００８に記載される）、およびマイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｍｔＤｏｄ由来の足場タンパク質ドデシン使用するドデカマー（Ｂｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０２０；ＣＡ３０７６７９１Ａ１）を介して二量体を形成するために連結されることができる。
［図面の説明］

【図面の簡単な説明】

【0206】

【図1】グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを特異的に結合する本発明のアルパカｓｄＡｂｓの開発のために使用される手順のスキームを示す。

【図2】グロボシリーズグリカン グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ４の構造を示す。

【図3】グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ上のＣＲＭ１９７キャリアタンパク質の負荷（ｌｏａｄ）を評価するための電気泳動ブロットを示す。

【図4】ネイティブグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンへの血清抗体の結合を示す。０週目（赤）および７週目（青、最終週）からの免疫化アルパカ血清のフローサイトメトリーの結果は、グロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する乳がん細胞（ＭＣＦ－７）に結合できる抗体の生成を示す。

【図5】グリカンアレイの印刷パターンを示す。グリカンは、エポキシ被覆されたスライドに３回印刷された。各色は、ある特定のグリカン型を示す。対照およびオリゴ糖は、グリッドに隣接して表示され、およびガラクトース、６×ヒス（Ｈｉｓ）－タグ付けされたｓｄＡｂ、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ、および様々な型のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を含む。凡例：対照；ＰＢ、緩衝液；ＦＳ８、ガラクトース；Ｃ６、ラムノース；２ヒス（Ｈｉｓ）タグ、６×ヒス（Ｈｉｓ）特異的抗体のためのｓｄＡｂ対照（Ａｔｔｏ ６４７９）；２９７、Ｆｕｃ（ａ１－２）Ｇａｌ（ｂ１－３）ＧａｌＮＡｃ（ｂ１－３）Ｇａｌ（ａ１－４）Ｇａｌ（ｂ１－４）Ｇｌｃ（ｂ１－１）アミノペンタノール－グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ；２２１、Ｇｌｃ（ａ１－４）ＧａｌＮａｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ－６－ＰＥｔＮ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）Ｍａｎ（ａ１－４）ＧｌｃＮ（ａ１－６）Ｉｎｏ（１－Ｐ）ホスホチオヘキサノール－ＧＰＩ；２２２、ＧａｌＮａｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ－６－ＰＥｔＮ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）］Ｍａｎ（ａ１－４）ＧｌｃＮ（ａ１－６）Ｉｎｏ（１－Ｐ）ホスホチオヘキサノール－ＧＰＩ２９（Ｔ．ゴンディ（ｇｏｎｄｉｉ））；２２３、ＧａｌＮａｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ－６－ＰＥｔＮ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）］Ｍａｎ－２－ＰＥｔＮ（ａ１－４）ＧｌｃＮ（ａ１－６）Ｉｎｏ（１－Ｐ）ホスホチオヘキサノール－ＧＰＩ３２（哺乳類）；２２４、ＧａｌＮａｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）］Ｍａｎ（ａ１－４）ＧｌｃＮ（ａ１－６）Ｉｎｏ（１－Ｐ）ホスホチオヘキサノール－ＧＰＩ３７（非天然）；２２８、ＧｌｃＮ（ａ１－６）Ｉｎｏ（１－Ｐ）ホスホチオヘキサノール－ＧＰＩ疑似二糖；２２５、Ｇｌｃ（ａ１－４）ＧａｌＮＡｃ（ｂ１－４）Ｍａｎ（ａ１－１）アミノペンタノール－ＧＰＩ部分構造（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）；２２６、Ｇｌｃ（ａ１－４）ＧａｌＮＡｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－１）アミノペンタノール－ＧＰＩ部分構造；２２７、Ｇｌｃ（ａ１－４）ＧａｌＮＡｃ（ｂ１－４）［Ｍａｎ－６－ＰＥｔＮ（ａ１－２）Ｍａｎ（ａ１－６）］Ｍａｎ（ａ１－１）アミノペンタノール－ＧＰＩ部分構造；１７２、Ｇａｌ（ｂ１－３）ＧａｌＮＡｃ（ｂ１－３）Ｇａｌ（ａ１－４）Ｇａｌ（ｂ１－４）Ｇｌｃ（ｂ１－１）アミノペンタノール－ＧＢ５（アミノリンカー）；１７４、Ｇａｌ（ａ１－４）Ｇａｌ（ｂ１－４）Ｇｌｃ（ｂ１－１）アミノペンタノール－ＧＢ３（アミノリンカー）；３７１、ＧｌｃＮＡｃ（ｂ１－３）Ｇａｌ（ａ１－４）Ｇａｌ（ｂ１－４）Ｇｌｃ（ｂ１－１）アミノペンタノール；１１、Ｇａｌ（ｂ１－４）Ｇｌｃ（ｂ１－１）アミノヘキサノール－ラクトース（アミノリンカー）；位置Ｄ２～Ｄ１０、Ｅ３、Ｆ４～Ｆ６は、９６プレート上のストック化合物の位置を示し、これは、各サンプルの位置を個別化するためにプリンティングロボットによって使用される。

【図6】合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）ＨおよびＧｂ５に対する免疫化アルパカにおける免疫応答が数週間ごとに徐々に増加することを示すグリカンアレイ結果の定量化を示す。

【図7】様々なグロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリー合成グリカンに対する血清抗体の特異的結合を示す血清検査のための７週目（最終週）のグリカンアレイ画像（図解入りの構造）を示す。黒の星印は、対照グリカン構造を表す。

【図8】グリカンアレイによる親和性溶出抗体のグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合の分析を示す。グラフのバーは、空の（赤）およびグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ被覆されたビーズ（青）から溶出された抗体の平均蛍光強度を表す。結果は、親和性精製抗体の特異性を示し、親和性精製抗体は、その後、ｓｄＡｂを分離するためにゲル電気泳動にかけられた。

【図9】親和性精製抗体におけるゲル電気泳動分離を示す。緑の矢印は、更なるトリプシン消化および質量分析のためにゲルから抽出された１３ｋＤａ ｓｄＡｂ（ＶＨＨ）を示す。

【図10】選択された単一ドメイン抗体配列の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え体発現を示す。Ａ）ｓｄＡｂ４６を発現するように設計されたアークティック エクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）からの細胞抽出物の様々な精製ステップおよび洗浄ステップの後に得られた試料のゲルエレクトロポレーション。アークティック エクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の沈殿物（Ｐ）および溶解物（Ｌ）、フロースルー（ＦＴ）、洗浄画分１および洗浄画分２（Ｗ１およびＷ２）、ニッケル－ＮＴＡ後の溶出液（Ｅ）、および最終ｓｄＡｂ生成物（ｓｄＡｂ）を示す。矢印は、最終洗浄ステップおよび高純度のｓｄＡｂ試料の存在を示す。Ｂ）下のパネルは、ｓｄＡｂ４６のＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーを示し、１４ｋＤａタンパク質と相関して、高収率（５０ｍＡＵ）および高溶出量での発現を示す（矢印）。

【図11】精製されたｓｄＡｂの合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈへの結合を示す。合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈグリカンを、Ｃ１表面プラズモン共鳴チップに固定化し、様々なｓｄＡｂの結合を試験した。試験された様々なｓｄＡｂの中で、ｓｄＡｂ３７（図１１）を示す。ＳｄＡｂ４６は、平均５４ｎＭの親和性を有し最高値を示した。

【図12】精製されたｓｄＡｂの合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈへの結合を示す。合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈグリカンを、Ｃ１表面プラズモン共鳴チップに固定化し、様々なｓｄＡｂの結合を試験した。試験された様々なｓｄＡｂの中で、ｓｄＡｂ４６（図１２）を示す。ＳｄＡｂ４６は、平均５４ｎＭの親和性を有し最高値を示した。

【図13】精製されたｓｄＡｂの合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈへの結合を示す。合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈグリカンを、Ｃ１表面プラズモン共鳴チップに固定化し、様々なｓｄＡｂの結合を試験した。試験された様々なｓｄＡｂの中で、ｓｄＡｂ６２（図１３）を示す。ＳｄＡｂ４６は、平均５４ｎＭの親和性を有し最高値を示した。

【図14A】癌細胞を発現する天然のグロボファミリーグリカンへの精製ｓｄＡｂｓの結合を示す。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を、グロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリーグリカンを発現する癌細胞（ＭＣＦ－７）への様々なｓｄＡｂｓの結合を試験するために行った（上のパネル）。陽性の結果を、共焦点顕微鏡法を使用して更に検証した（下のパネル）。市販の抗グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ抗体ＶＫ９を陽性対照として使用し、二次抗体のみを、二次抗体の非特異的結合を除外するために使用した（右下のパネル）。

【図14B】癌細胞を発現する天然のグロボファミリーグリカンへの精製ｓｄＡｂｓの結合を示す。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を、グロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリーグリカンを発現する癌細胞（ＭＣＦ－７）への様々なｓｄＡｂｓの結合を試験するために行った（上のパネル）。陽性の結果を、共焦点顕微鏡法を使用して更に検証した（下のパネル）。市販の抗グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ抗体ＶＫ９を陽性対照として使用し、二次抗体のみを、二次抗体の非特異的結合を除外するために使用した（右下のパネル）。

【図15】発現され、および精製されたｓｄＡｂｓのＭＣＦ－７癌細胞への結合レベルを示すＦＡＣＳ結果のグラフ表示を示す。

【図16】ＦＡＣＳ結合分析によって試験された様々なグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンの結合特異性を示す。様々な癌細胞へのｓｄＡｂｓの特異的結合は、分析された癌細胞の表面でのグロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリーグリカンの発現レベルの違いにより異なる。ｓｄＡｂ６２の特異性を、様々なグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンを発現する癌細胞株で試験した。結果は、ＨＥＫ２９３腎臓細胞での明確なＧｂ３発現による結合集団サイズの違い（黒い曲線）を示す。

【図17】グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合ｓｄＡｂｓの精製を示す。ＳｄＡｂを、シャッフル細胞（ＳＨｕｆｆｌｅ ｃｅｌｌｓ）（登録商標）で発現させ、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）細胞溶解によって抽出し、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。ａ）ｓｄＡｂ４６の精製中に採取された試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ゲルを、ページブルータンパク質染色溶液（ＰａｇｅＢｌｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて染色した。Ｍは、ページルーラー プレステインド タンパク質ラダー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ）１０～１８０ｋＤａを示す。ＦＴは、フロースルーを示す。Ｗ１は、洗浄１画分を示す。Ｗ２は、洗浄２画分を示す。ｂ）ＳＥＣクロマトグラムは、タンパク質の溶出を検出する２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。ハイロード（ＨｉＬｏａｄ） １６／６００スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（Ｓ７５）プレップグレード（ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ）カラムを、ＦＰＬＣシステムで使用した。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに使用される画分を示す。

【図18A】飽和移動差核磁気共鳴（ＳＴＤ ＮＭＲ）によって分析された、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのｓｄＡｂ４６への結合エピトープおよび結合構造を示す。ａ）ｓｄＡｂ４６とグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈとの相互作用を反映するＳＴＤ ＮＭＲ実験を示す。上から下へ：（１）グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈの参照スペクトル。磁化移動を示す孤立信号を、太字で強調する。（２）６０μＭ ｓｄＡｂ４６の存在下での４ｍＭグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのＳＴＤスペクトル。（３）１１０μＭ ｓｄＡｂ４６の存在下での４ｍＭＧｂ５のＳＴＤスペクトル。（４）４ｍＭグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのＳＴＤスペクトル。ＦｕｃおよびＧａｌ３アノマープロトンの観測を可能にするために、残留水信号を抑制しなかった。

【図18B】飽和移動差核磁気共鳴（ＳＴＤ ＮＭＲ）によって分析された、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのｓｄＡｂ４６への結合エピトープおよび結合構造を示す。ｂ）４秒の単一飽和時間からのｓｄＡｂ４６に結合されたグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈの結合エピトープを示す。示されていないプロトンのＳＴＤ増幅定数は、信号重複のために利用できていない。ＳＴＤ ＮＭＲ実験を、６００ＭＨｚおよび２７７Ｋで得た。ＸＸＸ＝１００～６７％、ＸＸ＝６７～３３％、Ｘ＝３３～０％を示す。

【図18C】飽和移動差核磁気共鳴（ＳＴＤ ＮＭＲ）によって分析された、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのｓｄＡｂ４６への結合エピトープおよび結合構造を示す。ｃ）ｓｄＡｂ４６を使用した場合および使用しない場合のグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのＮＯＥ上昇率対６００ＭＨｚおよび２９８Ｋでの混合時間（ｍｓ）を示す。曲線はピラノース内（Ｆｕｃ－ＣＨ_３／Ｆｕｃ－Ｈ５）およびピラノース間（Ｆｕｃ－Ｈ１／Ｇａｌ５－Ｈ２）部分の結合性を表す。ｓｄＡｂ対炭水化物比は１：１６．４である。Ｉ）グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈ＋ｓｄＡｂ４６、Ｆｕｃ－ＣＨ_３／Ｆｕｃ－Ｈ５、ＩＩ）：グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈ＋ｓｄＡｂ４６、Ｆｕｃ－Ｈ１／Ｇａｌ５－Ｈ２、ＩＩＩ）グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈフリー、Ｆｕｃ－ＣＨ_３／Ｆｕｃ－Ｈ５、ＩＶ）グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈフリー、Ｆｕｃ－Ｈ１／Ｇａｌ５－Ｈ２である。

【図19A】３価のｓｄＡｂ４６融合タンパク質の生成および精製を示す。ａ）分子クローニング戦略の略図を示す。細胞溶解性ペプチドＴＡＣＨＹの発現を排除するために突然変異誘発ＰＣＲを行い、終止コドン（^＊）を挿入した。ｂ）ＰＣＲ産物（左）および制限酵素消化産物（右）のアガロースゲル電気泳動を示す。Ｌは、１ｋｂＤＮＡラダーを示す。

【図19B】３価のｓｄＡｂ４６融合タンパク質の生成および精製を示す。ｃ）シャッフル（ＳＨｕｆｆｌｅ）細胞におけるｓｄＡｂ４６トリマーコンストラクトの発現試験を示す。ＩＰＴＧ誘導前（ｐｒｅ）およびＩＰＴＧ誘導後（ｐｏｓｔ）の細菌沈殿物におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ｄ）ｓｄＡｂ４６トリマーコンストラクトの溶解度試験を示す。超音波処理による細胞溶解後の沈殿物および溶解物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ｅ）～ｆ）ＦＰＬＣを使用したｓｄＡｂ４６トリマー封入体のＮｉ^２＋－ＮＴＡ精製を示す。クロマトグラムをｅ）に示し、インプット（ｉｎｐｕｔ）、フロースルー（ＦＴ）、および溶出画分１～４のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像をｆ）に示す。Ｍは、ページルーラー プレステインド タンパク質ラダー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ）１０～１８０ｋＤａを示す。

【図20A】ｓｄＡｂ４６モノマーおよびｓｄＡｂ４６トリマーの癌細胞への結合を示す。ａ）～ｃ）ＩＭＲ５神経芽腫細胞（陰性対照）およびＭＣＦ７乳癌細胞を、ｓｄＡｂ４６モノマー、ｓｄＡｂ４６トリマー、またはグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的市販抗体ＶＫ９を用いて染色し、続いて抗６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７または抗ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５二次抗体を用いてそれぞれ染色した。ａ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、蛍光標識されたＩＭＲ５細胞（上のパネル）およびＭＣＦ７細胞（下のパネル）の頻度を示す。二次抗体のみの対照を、左側に灰色で示す。左のグラフを、ＶＫ９抗体を用いて得て、右のグラフを、ｓｄＡｂ４６を用いて得る。データは、それぞれ２回または３回行われた３つの独立した実験を表す。

【図20B】ｓｄＡｂ４６モノマーおよびｓｄＡｂ４６トリマーの癌細胞への結合を示す。ａ）～ｃ）ＩＭＲ５神経芽腫細胞（陰性対照）およびＭＣＦ７乳癌細胞を、ｓｄＡｂ４６モノマー、ｓｄＡｂ４６トリマー、またはグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的市販抗体ＶＫ９を用いて染色し、続いて抗６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７または抗ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５二次抗体を用いてそれぞれ染色した。ｂ）ａ）に示されるゲートに基づく陽性細胞の頻度を示す。

【図20C】ｓｄＡｂ４６モノマーおよびｓｄＡｂ４６トリマーの癌細胞への結合を示す。ａ）～ｃ）ＩＭＲ５神経芽腫細胞（陰性対照）およびＭＣＦ７乳癌細胞を、ｓｄＡｂ４６モノマー、ｓｄＡｂ４６トリマー、またはグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的市販抗体ＶＫ９を用いて染色し、続いて抗６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７または抗ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５二次抗体を用いてそれぞれ染色した。ｃ）ＭＣＦ７（左）およびＩＭＲ５（右）の共焦点レーザー走査顕微鏡の撮影画像を示す。赤は抗－６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７または抗－ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５二次抗体によって生成されたシグナルの検出を示す。細胞核を、ＤＡＰＩ（ブルーチャンネル（ＢＬＵＥ ｃｈａｎｎｅｌ）を用いて染色した。ＴＭライトは、透過ライトの画像を示す。白いスケールバーは、２０μｍを示す。

【発明を実施するための形態】

【0207】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、当該実施のための好ましい様式を構成すると見なすことができることは、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更を、開示される具体的な実施形態において行うことができ、更に、本発明の範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

【0208】

本発明の様々な態様における更なる修正および代替的な実施形態は、本明細書を考慮して当業者に明らかであるだろう。結果的に、この明細書は、例示としてのみ解釈されるべきであり、当業者に本発明を実施する一般的な方法を教示することを目的としている。本明細書に示され、および記載される本発明の形態は、実施形態の実施例とされるべきであることが理解されるべきである。要素および材料は、本明細書に説明され、および記載されたものの代わりに使用されてもよく、部分および工程を逆にしてもよく、本発明の特定の特徴を独立して利用してもよく、本発明のこの明細書の利益を得た後、全ては当業者に明らかになるだろう。以下の特許請求の範囲に記載されるように、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される要素に変更を行ってもよい。

【0209】

［実施例］
方法：
アルパカ免疫化のためのＣＲＭ１９７－チオールグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ複合糖質の調製
チオールリンカーを用いて官能基化された１ｍｇのグロボ（ＧｌｏｂｏＨ）を、１２０μｌの水中で、１時間、１５００ｒｐｍで、０．６当量（ｅｑ．）の樹脂結合トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて還元した。樹脂を０．２２μｍシリンジフィルターでろ過することによって除去し、フィルターを、５０μｌの水を用いて５回洗浄した。最後の洗浄を、薄層クロマトグラフィーおよび糖染色によって分析し、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈがフィルター上に残っていないことを確認した。濾液および全ての洗浄画分を合わせて凍結乾燥した。１００ｅｑ．のスクシンイミジル３－（ブロモアセトアミド）プロピオネートを、３０μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、および７５０μｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．４）中に１ｍｇＣＲＭ１９７を有する溶液に撹拌しながら滴下した。１時間後、溶液を、１０，０００ｒｐｍで８分間、平衡化した０．５ｍｌ遠心フィルター（アミコン ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）、ＭＷＣＯ＝１０ｋ）上で、３５０μｌの水を用いて４回洗浄した。最後の洗浄の前に、１０μｌのアリコートを質量分析のために収集した。続いて、溶液を３５０μｌのコンジュゲーションバッファー（ｐＨ８．０で０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４）を用いて洗浄し、フィルターを逆さまにして１，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、新しいチューブに収集した。凍結乾燥され、還元されたＧｌｏｂｏＨを、コンジュゲーションバッファー（ｐＨ８）に戻し、タンパク質溶液に添加した。反応溶液を２４時間ゆっくりと撹拌したままにした。

【0210】

翌日、反応溶液を、３５０μｌの水を用いて３回洗浄した。最後の洗浄の前に、１０μｌのアリコートを、質量分析のために収集した。続いて、溶液を、３５０μｌのコンジュゲーションバッファー（ｐＨ８）を用いて洗浄し、および１５０当量のシステインを、遠心フィルターに直接加えた。１時間インキュベーション後、反応溶液を３５０μｌの水を用いて３回洗浄した。最後の洗浄の前に、１０μｌのアリコートを、質量分析のために収集した。最後に、溶液を、３５０μｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄し、フィルターを逆さまにして１，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、新しいチューブに収集した。コンジュゲーション全体で収集された試料の質量分析後、ＣＲＭ１９７のグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ負荷（以下に示される）を、コンジュゲーション前後の質量ピークの比較によって決定した（図３）。

【0211】

【化4】

【0212】

アルパカ免疫化
大人の雌アルパカを、リン酸緩衝生理食塩水中に１５μｇのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ／用量を含むＣＲＭ１９７－グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ複合糖質を用いて免疫化した。アルパカを、２２Ｇ針を使用して首の基部に沿って皮下注射した。合計６週の免疫期間は、３回目と４回目との注射の間に２週間の空白を含むため、ワクチン接種日は０／７／１４／２８／３５／４２になる。全血抽出を、最後の免疫化から９日後（５１日目）に行った。

【0213】

血清および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
血清分離用の全血（１５０ｍｌ）を、５０ｍｌチューブに収集し、ＲＴで１時間インキュベーションした後、２，０００ｇ／１０分／ＲＴで遠心分離した。血清を、滅菌１５ｍｌチューブに等分し（各７．５ｍｌ）、液体窒素を使用して急速冷凍し、－８０℃でさらに保存した。

【0214】

ＰＢＭＣ分離のために、１００ｍｌの全血を、１０ｍｌのＥＤＴＡ被覆チューブ（ＢＤ バキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（商標））に収集し、１０回反転させた。希釈されていない全血からのＰＢＭＣを、ＵＮＩ－ＳＥＰｍａｘｉ Ｕ１６（ノバメド（ＮＯＶＡＭＥＤ））を使用して、１０００ｇ／３０分／ＲＴで中断せずに遠心分離することにより分離した。ＰＢＭＣ層を、滅菌５０ｍｌチューブに分け、ＰＢＳを用いて洗浄し、４００ｇ／１０分／４ｃで３回遠心分離することによって分離した。最後の２５ｍｌを遠心分離し、１４ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）に溶解した。細胞を、バイアルあたり５^＊１０^７／ｍｌ ＰＢＭＣで１．５ｍｌＲＮＡｓｅフリーチューブに分割し、－８０℃で２４時間、緩慢凍結容器（Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標））に保存し、続いて－８０℃で保存した。

【0215】

合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンへの血清抗体の結合を分析するためのグリカンアレイ
グリカンマイクロアレイは、０．２ｍＭの合成グリカン、および対照として２５０μｇ／ｍＬのＨｉｓ－タグ付きｓｄＡｂを使用して、エポキシ被覆スライドガラスに研究室で印刷された。各スライドは、異なるグリカンの１６個のスポットをそれぞれ含むことを伴う繰り返しのグリカングリッドを含む。印刷パターンを図５に示す。スライドを、１％ＢＳＡを添加されたヘぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（１０ｍＭ ヘぺス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で、１時間、３７℃でブロックした。同時に、同じ緩衝液中に４μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および２０μｇ／ｍＬのｓｄＡｂ溶液を５０μＬ有する溶液を、暗所で、３０℃で、６×Ｈｉｓ特異的抗体（Ａｔｔｏ６４７）の１：５０００希釈液とともにインキュベーションした。ブロックされたスライドを、ＢＳＡを含まないヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を用いて１回、ｄｄＨ_２Ｏを用いて１回洗浄した。全ての液体を取り除くために、スライドを、３００ｇで３分間遠心分離した。スライドをマイクロプレートホルダーに組み立てて、異なるｓｄＡｂで単一グリッドを別々に染色できるようにした。ｓｄＡｂ／抗体混合物を、ウェルにピペットで移し、ｓｄＡｂ－グリカン結合を、暗所の加湿チャンバー内で、３０℃で１時間放置した。ウェルを、０．０５％トゥイ―ン（Ｔｗｅｅｎ）を添加されたヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を用いて３回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏを用いて１回洗浄し、遠心分離によって乾燥させた後、グリカンアレイスキャナーアクソンジェーンピックス（Ｇｌｙｃａｎ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ａｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ）（登録商標）４３００Ａを使用して直接スキャンした。結合を、ジェーンピックスプロ（ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ）７を使用して分析した。

【0216】

ＶＨＨｃＤＮＡライブラリー構築およびハイスループットシーケンシング
ＲＮイージー ミニキット（ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してアルパカＰＢＭＣからＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを、オリゴ－ｄＴプライマーおよびスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して作成した。ＶＨＨ可変領域を、２段階のネステッドＰＣＲでｃＤＮＡから特異的に増幅した。最初のステップにおいて、プライマーＣＡＬＬ００１：ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧ（リーダー配列特異的、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）およびＣＡＬＬ００２：ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ（ＣＨ２特異的、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）を使用した。ゲル精製および６００ｂｐ領域のサイズ選択、続いてミニエリュート クリーンアップ（ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｌｅａｎｕｐ）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））の後、２回目のＰＣＲを、プライマーＶＨＨ＿ｂａｃｋ：ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）およびＶＨＨ＿Ｆｏｒ：ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）を使用してＶＨＨ領域を抽出するために行い、続いて４００ｂｐバンドのゲル抽出を行った。

【0217】

イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑプロトコルに従って、せん断せずに、すなわち、末端修復ステップで開始せずに作成した。各ライブラリーを、イルミナＭｉＳｅｑ機器で２×２５０ｂｐケミストリーでシーケンスし、試料あたり６９０万／６６０万のリードペアを得た。ＢＢマージ（ｍｅｒｇｅ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＢｉｏＩｎｆｏＴｏｏｌｓ／ＢＢＭａｐ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｓｈ／ｂｂｍｅｒｇｅ．ｓｈ）を使用して、順方向および逆方向の読み取りを重ね合わせ、元のＰＣＲ断片を再構築した。

【0218】

アルパカ血清からグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合ＶＨＨ断片を単離するためのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的標準抗体および重鎖のみの抗体の親和性精製
合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ－結合ビーズの調製
チオールリンカーを用いて官能基化された１ｍｇのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを、１２０μｌ水中に０．６当量の樹脂結合ＴＣＥＰを有する溶液を用いて、１時間、１５００ｒｐｍ、ＲＴで還元した。樹脂を、０．２２μｍシリンジフィルターに通してろ過することによって除去し、フィルターを、５０μｌの水を用いて５回洗浄した。最後の洗浄を、薄層クロマトグラフィーおよび糖染色によって分析し、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈがフィルターに残っていないことを確認した。濾液および全ての洗浄画分を合わせて凍結乾燥した。還元されたグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを、製造者の指示に従って１ｍｌのアガロースビーズスルホリンク（ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ）（登録商標）カップリング樹脂（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に結合した。

【0219】

タンパク質Ａ／Ｇビーズを使用したＩｇＧおよび重鎖抗体の分離
従来のＩｇＧおよび重鎖のみの抗体を分離するために、アルパカ血清の試料を解凍し、７．５ｍｌのアリコートを、６７．５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムを用いてｐＨ＝７で希釈し、０．２２ｍｍフィルターを使用してろ過した。３ｍｌのタンパク質Ａ／Ｇ電磁ビーズ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を、２０ｍＭリン酸ナトリウムを用いてｐＨ＝７で事前に洗浄した。その後、これらの試料を、回転させながらＲＴで１時間インキュベーションした。フロースルーを収集後、ビーズを、１００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムを用いてｐＨ＝７で洗浄した。結合した抗体を、３９ｍｌの１００ｍＭクエン酸を用いてｐＨ＝２．７５で、溶出された抗体を中和するために１１ｍｌの１．５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ＝８．８を事前に充填した５０ｍｌチューブに溶出した。溶出試料を合わせて、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）１０ｋＤａを使用してＲＴで濃縮し、５Ｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムを用いてｐＨ＝７．４で一晩透析した。

【0220】

合成グリカン結合ビーズを使用してグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的抗体の単離
グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ－結合ビーズ／空のビーズコントロールカラムを、水を用いて３回、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ＝７で洗浄した。Ａ／Ｇビーズを使用して得られた透析抗体の試料を、その後、透析緩衝液を用いて事前に平衡化された空のビーズカラムおよびＧｌｏｂｏＨ結合ビーズカラムに均等に分配し、１時間ＲＴで回転させた。その後、各カラムからのフロースルーを、更に１時間、ＲＴで、カラム間で切り替えた。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ＝７を用いて両方のカラムからの溶出を行い、ＮａＣｌ濃度を増加させた（１００ｍＭ／５００ｍＭ／１Ｍ／３Ｍ）、続いてｐＨ５．２に調節された２０ｍｍＮａＨ_２ＰＯ_４の最終洗浄ステップを行った。両方のカラムからの各洗浄ステップの７５ｍｌ容量を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）１０ｋＤを使用して濃縮し、パパイン消化緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム／１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ＝７．１）に対して４℃で一晩透析した。

【0221】

ＧｌｏｂｏＨ特異的抗体のパパイン切断
２０ｍｍリン酸ナトリウム／１０ｍｍＥＤＴＡ緩衝液中に親和性精製抗体を有する溶液を、５ｍＭ Ｌ－システイン（シグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加して、１０～２０μｌのパパイン固定化ビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））と共に、３７ｃ／３００ｒｐｍで最大９０分間インキュベーションした。その後、混合物を遠心分離し、上清を、ＶＨＨドメインに対応する１３ｋＤａバンドを抽出するために、４～２０％アクリルアミドＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした（図９）。

【0222】

親和性精製されたＶＨＨ断片の質量分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離からのＶＨＨ断片をゲルから切除し、トリプシンを用いて消化した。結果的に得られたトリプシンペプチドをゲルから抽出し、Ｃ１８ ステイジ チップス（Ｓｔａｇｅ Ｔｉｐｓ）を使用して脱塩した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、アルティメット（Ｕｌｔｉｍａｔｅ） ３０００ ＲＳＬＣａｎｏ システムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ディオネックス社（Ｄｉｏｎｅｘ）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））にオンラインで連結されたオルビタップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ） フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）ＴＭ ルーモス（Ｌｕｍｏｓ）ＴＭ トリブリッド（Ｔｒｉｂｒｉｄ）ＴＭ質量分析（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で行った。溶出ペプチドを、イージ―スプレイソース（ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ ｓｏｕｒｃｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））によってイオン化する。移動相Ａは、水、０．１％ｖ／ｖギ酸からなり、移動相Ｂは、８０％ｖ／ｖアセトニトリルおよび０．１％ｖ／ｖギ酸からなる。ＭＳ１およびＭＳ２の両方のスペクトルに対して高分解能のルーモス（Ｌｕｍｏｓ）機器を使用して、最高速度オプションを用いてデータ依存モードでＭＳデータを得る。ＨＣＤを断片化のために適用した。ＭＳデータのピークリストを、ＭＳ変換を使用して生成した。ハイスループットｃＤＮＡシーケンスライブラリーに対するデータベース検索を、ラボ内で変更されたマスコット（Ｍａｓｃｏｔ）検索エンジン（マトリックス サイエンス社（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ））、並びにラママジック（Ｌｌａｍａ Ｍａｇｉｃ）ｖ１．０のローカルインストールおよびデフォルトパラメーター（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＦｅｎｙｏＬａｂ／ｌｌａｍａ－ｍａｇｉｃ）の組み合わせを使用して行った。

【0223】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカン結合ｓｄＡｂの発現
細菌の形質転換：形質転換用のプラスミドベクター（ｐＥＴ－２２（＋）ｂ）は、Ｃ末端ヒスチジンタグに融合されたｓｄＡｂ配列、ＩＰＴＧ誘導性調節システム、アンピシリン耐性、およびＰｅｌＢペリプラズムシグナル配列を含んだ。ベクターを、製造業者のプロトコルに従って、熱ショック形質転換を使用して、アークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換した。２０ｎｇのＤＮＡを、２０～４０μＬの細菌に加えた。熱ショック後、ＳＯＣ培地で、３７℃で１時間インキュベーションした後、形質転換細胞を、アークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）細胞のためのゲンタマイシン耐性、および所望のｓｄＡｂ配列を有する発現プラスミドのためのアンピシリン耐性を含むＬＢ寒天プレートに広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベーションした。

【0224】

コロニーＰＣＲ：形質転換細胞の単一コロニーを、コロニーＰＣＲで形質転換効率に関して試験した。ＰＣＲ反応ミックスを、１０μＬ反応における２×ＰＣＲ マスター ミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）、０．１μＭの順方向および逆方向プライマー、並びにヌクレアーゼフリー水を使用して、ＰＣＲチューブ内で、氷上で調製した。各形質転換プロトコルの３つのクローンを、１０μＬのピペットチップを用いて採取し、反応ミックス中に直接ピペットで移し、再懸濁した。ＰＣＲ反応を、表２に示される製造業者の推奨の熱サイクリング条件に従って行った。２μＬの６×ＤＮＡローディングダイをＰＣＲ産物に添加し、１％アガロースゲルで分析した。

【0225】

【表2】

【0226】

細菌の保存：成功した形質転換細胞のコロニーを植菌し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加された５ｍＬのＬＢ培地で、３７℃、振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）で一晩培養した。翌朝、７５０μＬの一晩培養物を、７５０μＬの５０％グリセロールと共に混合し、ストックを、－８０℃で保存した。

【0227】

アークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）細胞からのグロボ（ＧｌｏｂｏＨ）ｓｄＡｂの発現および精製：一晩培養物を、形質転換後にＬＢ寒天プレートに陽性クローンを植菌する、または５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加されたＬＢ培地にクライオストックから植菌する、のいずれかによって開始した。スターターを、３７℃振とう機（２５０ｒｐｍ）で一晩インキュベーションした。翌朝、１５０ｍＬまたは１Ｌの主培養物を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを用いて継代培養し、１：１００希釈で一晩培養した。これらの培養物を、ＯＤ６００が０．６に達するまで２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベーションした。５００μＬの各培養物を、誘導されていない試料としての発現試験のために、清潔なマイクロ遠心チューブにピペットで移した。培養物を、２５０ｒｐｍで１２℃振とう器に移し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導し、２４時間インキュベーションした。インキュベーション時間の後、さらに５００μＬの試料を、誘導試料として各培養物に対して採取した。細菌を、６０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって採取し、沈殿物を－２０℃で保存した。発現効率を試験するために、誘導されていない試料および誘導された試料を、ＬＢ培地で、１ｍＬの容量で０．１のＯＤ６００に希釈した。これらの懸濁液を１４０００ｇで５分間遠心分離した。沈殿物を、２０μＬのＰＢＳおよび５μＬの５×ＳＤＳ試料緩衝液に溶解し、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。

【0228】

アークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）細胞の溶解およびグロボ（ＧｌｏｂｏＨ）ｓｄＡｂの精製：ｓｄＡｂプラスミドのＰｅｌＢシグナル配列は、発現したｓｄＡｂの分泌物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズムへ誘導した。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）細胞のペリプラズム画分を得るために、外膜のみが破壊される必要がある。１５０ｍＬの培養物からの沈殿物を解凍し、プロテアーゼ阻害剤ミックスを添加された３００μＬのＰＢＳに再懸濁した。ドライアイスおよび３７℃の水浴を使用して６回の凍結融解サイクル後、試料を３２００ｇ、４℃で１時間遠心分離した。溶解物を、ＭＣＦ－７細胞での結合分析に直接使用した。１Ｌの培養物からの沈殿物を解凍し、プロテアーゼ阻害剤を含む２０ｍＬのリン酸ナトリウム試料緩衝液に再懸濁した。前述のように、凍結融解サイクルを行い、２０ユニットのＤＮＡｓｅＩを試料に添加し、その後、４２０００ｇで、２０分間、４℃で遠心分離した。溶解物を、更なる精製のために直接使用した。

【0229】

ニッケル－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー：親和性精製のために、１ｍＬのニッケル－ＮＴＡビーズをクロマトグラフィーカラムにロードし、２カラム容量（ＣＶ）のｄｄＨ_２Ｏを用いて洗浄し、２ＣＶの試料緩衝液を用いて平衡化した。１Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）細胞から得られた溶解物を、ビーズに添加し、回転下、９０分間、ＲＴでインキュベーションした。その後、フロースルーを収集し、ビーズを、１ＣＶの試料緩衝液、２ＣＶの洗浄緩衝液１、および２ＣＶの洗浄緩衝液２を用いて洗浄した。ｓｄＡｂを、２ＣＶの溶出緩衝液を用いてニッケルビーズから溶出した。試料を、後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、全ての精製および洗浄ステップから採取した。溶出物を、３ｋＤａのサイズ排除限界を伴うアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）遠心フィルターユニットで、３２００ｇで、４℃で濃縮し、濃度を、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）（商標）を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより過程中に測定した。濃度が２．５ｍｇ／ｍＬを超えなかった場合は、溶出物を最終容量が２ｍＬ未満になるように濃縮し、３５００分子量カットオフのスネイクスキン（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ）（商標）透析チューブを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、４℃で一晩透析した。

【0230】

精製手順を実証するためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１０Ａ）
ｓｄＡｂの精製工程を実証するために、手順中に以下の試料を採取した：凍結融解試料の遠心分離後のアークティックエクスプレス（ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）細胞の沈殿物（Ｐ）および溶解物（Ｌ）、フロースルー（ＦＴ）、洗浄画分１および２（Ｗ１およびＷ２）およびニッケル－ＮＴＡ後の溶出液（Ｅ）、および最終ｓｄＡｂ生成物（ｓｄＡｂ）、および／またはＦＰＬＣクロマトグラムに示された他のタンパク質ピーク。試料を、５×ＳＤＳ試料緩衝液を用いて調製し、５分間、９５℃で変性させた。不連続ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）によって記述されるように行い、ゲルを、マイクロ波で急速煮沸後、ページブルー（ＰａｇｅＢｌｕｅ）（商標）タンパク質染色溶液を用いて、１５分間染色した。脱色を、ｄｄＨ_２Ｏを用いて行い、ゲル ドック（Ｇｅｌ Ｄｏｃ）ＥＺ撮像装置を使用して、ゲルを画像化した。

【0231】

サイズ排除クロマトグラフィー（図１０Ｂ）：
サイズ排除を、ＡＫＴＡ（商標）精製機に接続されたハイロード（ＨｉＬｏａｄ）（商標）スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）１６／６００ ７５ｐｇカラムを備えたＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）を使用して行った。透析試料は、２ｍＬのローディングループに注入され、ろ過および脱気されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、流速０．７５ｍＬ／ｍｉｎで実行された。タンパク質ピークを、ＵＶ２８０で測定し、１ｍＬ画分を、９６の深いウェルプレートに収集した。ＳｄＡｂは、７５～８５ｍＬで溶出すると予想されたが、全てのタンパク質含有画分からの試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。ｓｄＡｂ含有画分を合わせ、３ｋＤａカットオフ アミコンズ（Ａｍｉｃｏｎｓ）（登録商標）で、４℃で、３２００ｇで濃縮し、最終濃度を～１ｍｇ／ｍＬにし、更なる分析のために直接使用した、または分割し、液体窒素で凍結し、－８０℃で保存した。

【0232】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲ測定を、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ） Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して行った。７．５μｇの合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを、アミン－カップリング化学によって市販のＣ１センサーチップ（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に固定化した。チップを、０．３％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００を用いて添加された１００ｍＭグリシン－ＮａＯＨ（ｐＨ＝１２）を用いて事前に活性化した。固定化を、接触時間７００秒、流速１５μＬ／分で、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で行った。チップは２つのフロー細胞を含み、そのうちの１つはブランクとして機能し（フロー細胞３）、そのうちの１つはグリカンが固定化された（フロー細胞４）。ＳｄＡｂを、ＳＰＲランニング緩衝液（ヘぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液）で、４℃で一晩透析した。接触、解離時間、流速、および最大試験濃度は、ｓｄＡｂごとに異なり、表３に示される。各ｓｄＡｂを、５つの異なる濃度で試験し、ここで、低濃度は、示された最大濃度の連続１：２希釈である。各結合イベント後の再生のために、２ＭのＭｇＣｌ_２を添加された同じ緩衝液を使用した。センサーグラムを、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ） Ｔ２００制御および評価ソフトウェア（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して分析し、データ分析のために、両方のフロー細胞間の信号差を評価した。平衡解離定数（ＫＤ）を、親和性および速度論的分析によって決定した。親和性分析において、定常状態結合レベルに基づく結合応答を、ｓｄＡｂ濃度に対してプロットし、平衡解離定数を決定した。速度論的パラメーターを、ビアエバリューション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェアを使用して、センサーグラムを１：１結合モデルに適合することによって得た。測定の精度を、ソフトウェアによって評価し、カイ二乗値を表示する。

【0233】

【表3】

【0234】

哺乳動物細胞の培養
全ての細胞を、３７℃で、５％ＣＯ_２で培養した。ＭＣＦ－７細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、２ｍＭグルタミン、および１％非必須アミノ酸を添加されたＤＭＥＭで培養した。それらを、ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）を用いて洗浄し、続いてトリプシン処理して付着細胞を剥離することにより、２～３日ごとに継代した。トリプシン処理を、培地を用いて停止させ、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、トリプシンを除去した。沈殿物を、新鮮な培地に再懸濁し、細胞を、ＭＣＦ－７の場合は１：３／１：４の比率で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合は１：６／１：８の比率で、新しい培養皿に播種した。ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加されたＲＰＭＩ１６４０で培養した。培地を、２～３日ごとにリフレッシュし、細胞を、上述のように１：４の比率で週に１回継代した。

【0235】

凍結アリコートを調製するために、コンフルエントな７５ｃｍ^２培養フラスコから細胞を前述のように収集し、５％ＤＭＳＯを添加された１ｍＬ培地に再懸濁し、－８０℃で、凍結容器内で、１日凍結した。凍結細胞を液体窒素に移した。細胞を、３７℃で２分間迅速に解凍し、すぐに新鮮な培地に再懸濁した。それらをペレット状にしてＤＭＳＯを取り除き、新鮮な培地に再度懸濁し、７５ｃｍ^２の培養フラスコに播種した。

【0236】

癌細胞に結合するｓｄＡｂのフローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳ分析のための最適な設定の確立：フローサイトメトリーでｓｄＡｂｓの癌細胞への結合を分析するために、次のパラメーターを、事前に決定する必要がある：ｓｄＡｂを検出する二次抗体の濃度（Ａｔｔｏ６４７を用いて標識化された抗６×Ｈｉｓタグ）、試験された各細胞株のための、陽性対照として使用される抗－グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ抗体クローンＶＫ９の濃度、前方散乱および側方散乱のためのフローサイトメトリー測定中の電圧、およびＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシアネート）およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）検出器。各フローサイトメトリー分析のために、細胞を、上述の「哺乳動物細胞の培養」で記述されたように、７０～８０％の培養密度で採取した。細胞沈殿物を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁し、条件ごとに０．５ｘ１０^６個の細胞を、１．５ｍＬのエペンドルフチューブに移した。これらを再び、２５０ｇで、５分間ペレット化した後、一方の細胞沈殿物を、ブランク細胞としてＰＢＳで希釈し、もう一方を、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋ＳＹＢＲ（商標）セーフ（Ｓａｆｅ）（ＦＩＴＣチャネルで放出））に再懸濁した。抗－Ｈｉｓ抗体の希釈を調節するために、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでの１：１００、１：５００、１：１０００、１：５０００希釈を試験した。沈殿物を、５０μＬの対応する溶液中に再懸濁し、４５分間、ＲＴでインキュベーションした。同時に、３つの沈殿物を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に５０μＬの５、１０、または２０μｇ／ｍＬＶＫ９を有する溶液中でインキュベーションした。その後、細胞を、遠心分離および５００μＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡでの再懸濁により２回洗浄した。ＶＫ９処理された試料を、抗マウス二次抗体（アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）６３５）を用いて、ＲＴでさらに４５分間染色し、その後前述のように洗浄した。最後の遠心分離ステップ後、染色された細胞沈殿物を、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。全ての試料を、ＦＡＣＳチューブに移し、データ収集を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ装置（ＢＤ）で行った。

【0237】

ＭＣＦ－７細胞を使用したグロボ（ｇｌｏｂｏ）－シリーズグリカンに結合する抗体のスクリーニング
上述のように１５０ｍＬの培養物から得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を、ＭＣＦ－７細胞で直接試験した。この目的のために、細胞を上述のように採取し、試料あたり０．５ｘ１０^６個の細胞を１．５ｍＬチューブに移した。３００ｇで５分間遠心分離した後、細胞沈殿物を、５０μＬの対応する溶解物に再懸濁し、振とう機上で、４５分間、ＲＴでインキュベーションした。さらに、ＰＢＳのみを用いる陰性対照および５μｇ／ｍＬＶＫ９を用いる陽性対照を、すべての実行に含んだ。その後、細胞を２回洗浄し、最後の洗浄ステップの後、ＶＫ９対照を除く全ての沈殿物を、前のステップで決定された抗－Ｈｉｓ抗体溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：１０００）に再懸濁し、さらに４５分間、振とう機上で、ＲＴでインキュベーションした。ＶＫ９染色細胞を、対応する蛍光抗－マウス抗体（アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）６３５）の１：４００希釈液の５０μｌに再懸濁した。さらに２回洗浄後、細胞を、ＰＢＳ中に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の溶液１００μＬで固定し、遠心分離後、沈殿物を、２５０μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。データを、前のステップで決定された設定を使用して記録し、フロージョ（ＦｌｏｗＪｏ）（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。記録された事象は、分析のために単一の無傷細胞のみを選択するようにゲートされた。ゲートを、全ての試料に適用し、ｓｄＡｂ染色細胞のＡＰＣヒストグラムを、陰性対照細胞のＡＰＣヒストグラムと重ね合わせることにより、ピークのシフトによって結合を観察することができた。シフトを定量化し、最も強力な潜在的な結合剤のランク付けをするために、結合剤の正のゲートを定義する追加のゲートを、単一細胞選択において作成した。親ゲート上のＡＰＣ^＋細胞（単一細胞）の頻度を、フロージョ（ＦｌｏｗＪｏ）（登録商標）ソフトウェアを使用して、全てのｓｄＡｂに関して決定した。

【0238】

異なる細胞株での精製ｓｄＡｂのフローサイトメトリー結合分析
上記のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物の結合を試験した後、ｓｄＡｂを同定された陽性結合剤から精製し、ＭＣＦ－７細胞への結合をさらに試験した。手順はスクリーニングにおいて記述されたのと同じであったが、細胞沈殿物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物の代わりに、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬ精製ｓｄＡｂの溶液５０μＬに再懸濁したことが異なる。同じ濃度を使用することにより、異なるｓｄＡｂｓの結合強度を比較した。さらに、同じ結合アッセイを、全てのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）ファミリーグリカンを発現するＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、およびグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを発現しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞で行った。

【0239】

共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）
共焦点顕微鏡を使用してｓｄＡｂのＭＣＦ－７細胞への結合を検証するために、２０，０００個の細胞を、分析の２日前に、染色用に５０～６０％コンフルエントになるように、２４ウェル細胞培養プレートの１２ｍｍカバースリップに播種した。培地を吸引し、細胞を、ＰＢＳを用いて２回リンスした後、４％ＰＦＡで、１０分間、ＲＴで固定した。ＰＦＡを取り除くために、ウェルをＰＢＳで３×５分間洗浄し、その後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１時間ブロックした。１μｇ／μＬの精製ｓｄＡｂの５０μＬを滴下してパラフィルムの一部に置き、細胞が接着したカバースリップを上に置いた。１つのカバースリップを、陰性対照としてウェルに置き、ＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬ ＶＫ９を有する溶液を、陽性対照として使用した。カバースリップを、ｓｄＡｂと共に、ＲＴで、加湿チャンバー内で、１時間インキュベーションした。その後、それらをウェルに戻し、ＰＢＳで３×５分洗浄した。２００μＬのＡｔｔｏ６４７抗－６×Ｈｉｓ抗体（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：５０００）を、細胞に添加し、わずかに振とうしながら、ＲＴで１時間、インキュベーションした。ＶＫ９陽性対照を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中にマウス－ＩｇＧ特異的（アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３５））二次抗体を有する１：４００希釈液で染色した。ＰＢＳを用いてさらに３回洗浄後、１０μＬの封入剤を、顕微鏡用スライドにピペットで移し、染色された細胞を有するカバースリップを上に置いた。スライドを一晩乾燥させ、顕微鏡検査を、翌日、アキシオイメージャー（ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ）．Ｍ２共焦点ＬＳＭ８００（ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ））を使用して行った。分析のパラメーターを、陰性対照、および陽性対照としてのＶＫ９染色に基づいて設定した。

【0240】

【表4-1】

【0241】

【表4-2】

【0242】

【表4-3】

【0243】

【表4-4】

【0244】

【表4-5】

【0245】

【表4-6】

【0246】

【表4-7】

【0247】

【表4-8】

【0248】

【表4-9】

【0249】

【表4-10】

【0250】

【表4-11】

【0251】

【表4-12】

【0252】

【表4-13】

【0253】

【表4-14】

【0254】

【表4-15】

【0255】

【表4-16】

【0256】

【表4-17】

【0257】

組換えグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合単一ドメイン抗体ｓｄＡｂ４６、ｓｄＡｂ５６、およびｓｄＡｂ５９の精製
以前は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ ｓｄＡｂを、合成グリカンを用いてアルパカを免疫化することによって生成した。各遺伝子配列を、タンパク質発現のために商業的に合成されたベクターとして同定し、得た。最強のグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ結合剤を、ＭＣＦ７癌細胞を使用して以前のスクリーニングで決定した。

【0258】

グリカン結合を検証し、さらに特徴付けるために、最も有望なｓｄＡｂを、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で合成グリカンへのｓｄＡｂの結合について、直ちに、分析した。精製されたｓｄＡｂ３７、ｓｄＡｂ６２、およびｓｄＡｂ６３の凍結アリコートは、すでに入手可能であった。ｓｄＡｂ４６、ｓｄＡｂ５６、およびｓｄＡｂ５９は、最初に精製されなければならなかった。したがって、ｐＥＴ－２８ｂ（＋）－ｓｄＡｂプラスミドを、シャッフル（ＳＨｕｆｆｌｅ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（登録商標）に形質転換し、１Ｌの細菌培養物に増殖させた。タンパク質発現を、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。凝集または多量体化を分析するために、組換えｓｄＡｂは、Ｈｉｓタグ付けされ、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、続くサイズ－排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製された。沈殿物、溶解物、フロースルー（ＦＴ）、洗浄１（Ｗ１）、洗浄２（Ｗ２）、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーからの溶出、およびサイズ－排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のタンパク質含有画分の試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために採取した。図１７ａは、代表的な精製ＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像およびＳＥＣからのクロマトグラムを示す。ｓｄＡｂ４６の理論分子量は１６．８ｋＤａであり、これは観察されたバンドに対応する。精製されたナノボディモノマーは、部分的に溶解したが、大量のタンパク質が、溶解後も沈殿物に残っていた。洗浄緩衝液２は、３０ｍＭのイミダゾールを含み、このことは、すでに、いくつかのナノボディの溶出および生成物の損失を引き起こした。しかしながら、他のタンパク質不純物は残っており、溶出液中にも発見された。その後のサイズ－排除クロマトグラフィーのために、ＰＢＳを用いて事前に洗浄されたハイロード（ＨｉＬｏａｄ）（登録商標）１６／６００スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）（登録商標）７５（Ｓ７５）調製グレードカラムを、ＦＰＬＣシステムで使用した。

【0259】

実施例１：ｓｄＡｂの生成および選択
アルパカの免疫化
アルパカ免疫化のために、合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを、キャリアタンパク質ＣＲＭ１９７（交差反応性材料（Ｃｒｏｓｓ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ－Ｍａｔｅｒｉａｌ）－１９７）に結合させ、これは、ジフテリア毒素の変異型であり、ここで５２位のグリシンのグルタミン酸への単一アミノ酸交換は、タンパク質を無毒にする。アルパカは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを用いて（詳細のために方法のセクションを参照）、３回目と４回目との注射の間の２週間の空白を含む合計６週間の免疫期間で免疫化された。全血を、５１日目に収集した。

【0260】

免疫化されたアルパカにおける免疫応答の評価
免疫化の前（０週目）および終了時（７週目）に収集された血清試料を、天然のグロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリーグリカンへの結合を試験するために使用した。血清試料を、グロボファミリーグリカンを発現することが知られているＭＣＦ－７細胞と直接インキュベーションし、４５分間、ＲＴでインキュベーションした。その後、細胞を、２回洗浄し、ＦＩＴＣ－結合抗－ラマ二次抗体を含む溶液に再懸濁し、さらに４５分間、ＲＴでインキュベーションした。さらに２回の洗浄後、細胞を固定し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。図４に示されるように、７週間免疫化されたアルパカの血清は、乳がん細胞（ＭＣＦ－７）に結合することができる抗体を含んだ。さらに、血清試料を、詳細な方法のセクションで記述されるように、グリカンアレイを使用して試験した。図６は、７週目までの合成グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈに対する免疫化アルパカの免疫応答における週ごとの段階的な増加を示す。図７は、図に示される異なるグロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリー合成グリカンへの血清抗体の特異的結合を示す最後の７週の血清試料を用いて得られたグリカンアレイ画像を示す。

【0261】

ライブラリー構築：
アルパカ血清からのｓｄＡｂドメインの分離
全抗体を、タンパク質Ａ／Ｇ磁気ビーズを使用して、免疫化されたアルパカの血清から単離した。その後、これらの試料を使用して、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ－被覆ビーズ、および未被覆対照ビーズを使用した親和性精製により、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ特異的ｓｄＡｂを分離した。その後、これらの抗体を、グリカンアレイによりグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈへの抗体の結合について試験した。図８は、異なる濃度の塩化ナトリウムで、空の（黒）およびグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈビーズ（灰色）から溶出された抗体試料を用いて得られた平均蛍光強度を示す。最高の蛍光強度は、１００ｍＭ、５００ｍＭ、および１Ｍの塩化ナトリウムを使用して得られた試料で得られ、その後、試料は、パパイン切断後にゲル電気泳動ＳＤＳ－ＰＡＧＥを受け、１３ｋＤａの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を得た。図９は、分解前に、ＮａＣｌ １００ｍＭ、５００ｍＭ、および１Ｍで得られた試料は、従来のＩｇＧ（１５０ｋＤａ）および重鎖のみ抗体（５５ｋＤａ）を含んだことを示す。パパイン消化後、これらの試料は、ＦｃおよびＦａｂ断片（両方とも約２５ｋＤａ）、未消化の抗体断片（約５０ｋＤａ）、および１３ｋＤａの単一ドメイン抗体を含んだ。したがって、ｓｄＡｂは、これらのバンドから抽出され、トリプシン消化後に質量分析を受けた。

【0262】

生物情報分析によるｓｄＡｂ配列の検索
ＶＨＨ可変領域（ｓｄＡｂ）は、方法のセクションで記述されたように、アルパカＰＢＭＣのｃＤＮＡを使用して２段階のネステッドＰＣＲによって特異的に増幅され、その後シーケンシングを受けた。

【0263】

生物情報分析を、親和性精製されたｓｄＡｂの完全長シーケンスを取得するために、ＰＢＭＣ（ｃＤＮＡ）のハイスループットシーケンシングおよび質量分析（ペプチド）（手順は図１に示される）によって得られた２つのライブラリーを比較することにより行った。この目的のために、「ラママジックソフトウェア（Ｌｌａｍａ ｍａｇｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ）」ｖ１．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＦｅｎｙｏＬａｂ／ｌｌａｍａ－ｍａｇｉｃ）、およびタンパク質同定用の検索エンジンであるマスコット（Ｍａｓｃｏｔ）ソフトウェアの社内（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）修正バージョン」を使用した。ソフトウェアの修正版は、ハイスループットシーケンシングの非常に大規模なデータベースとプロテオミクス分析の非常に大規模なデータベースとを比較することができ、ＭＳからの各ペプチド解離スペクトルを得て、ハイスループットシーケンシングによって生成されたオープンリーディングフレームと比較する。

【0264】

この分析は、１０２個の異なるｓｄＡｂ配列の取得を可能にし、３６個が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換え発現、および更なる結合分析による更なる分析のために選択された。

【0265】

実施例２：大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において選択されたｓｄＡｂｓの発現、および更なる分析
選択されたｓｄＡｂ配列を、方法のセクションで詳細に記述されるように、アークティブエクスプレス（ＡｒｃｔｉｖＥｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）細胞（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ））で発現させた。図１０（パネルＡおよびＢ）は、例としてｓｄＡｂ４６を使用して、手順の有効性を示す。その後、単離されたｓｄＡｂを、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ Ｇｂ４およびＧｂ５を低レベルで発現することが知られているＭＣＦ－７細胞への結合について、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、試験した。図１１～図１３は、ｓｄＡｂ３７、ｓｄＡｂ４６、およびｓｄＡｂ６２でのＳＰＲの結果を示す。ＳｄＡｂ４６は、平均５４ｎＭの親和性で、最も高い親和性値を示した。さらに、単離されたｓｄＡｂｓのグロボシリーズグリカン発現細胞への結合を、フローサイトメトリーによって試験した（図１４、１５、１６）。また、これらの実験において、ｓｄＡｂ４６は、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈへの最も高い結合能力を有する抗体であるという結果になった。

【0266】

これらの結果は、単離された単一ドメイン抗体が、癌細胞上に発現される天然のグロボ（ｇｌｏｂｏ）ファミリー構造、並びにＳＰＲチップ上の合成および十分に特徴付けられたグロボ（ｇｌｏｂｏ）Ｈ構造の両方に比較的高い親和性で結合できることを示す。

【0267】

例えば、ｓｄＡｂ６２は、ＭＣＦ－７またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞よりも高い親和性でＨＥＫ２９３細胞（図１６）に結合するという結果になった。この発見は、ｓｄＡｂ６２が、ＨＥＫ２９３によって発現されるグリカンＧｂ３およびＧｂ４を、ＭＣＦ－７によって発現されるがＨＥＫ２９３細胞によっては発現されないグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈよりも高い親和性で結合することを示唆する。

【0268】

実施例３：ＮＭＲは、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨのｓｄＡｂ４６への結合エピトープおよび結合配座を特徴付けする。
飽和移動差核磁気共鳴（ＳＴＤ ＮＭＲ）分光法は、タンパク質と接触している炭水化物部分を調べる、原子分解能でグリカン－タンパク質相互作用を研究するための強力な手法である。

【0269】

結合するためにｓｄＡｂ４６に必要である最小認識モチーフを調査するために、我々は、ＳＴＤ ＮＭＲによってｓｄＡｂ４６結合グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈの結合エピトープをマッピングした。４秒の長い飽和時間が、タンパク質からリガンドへの飽和の正確な磁化移動に、必要であった。Ｆｕｃα（１－２）Ｇａｌβ部分からのほとんど全てのプロトンは、タンパク質から飽和磁化移動を受けたが、信号の重複により、ＳＴＤ増幅定数は、プロトンのサブセットに対してのみ取得された（図１８ａ）。対応する結合エピトープは、Ｆｕｃα（１－２）Ｇａｌβ－モチーフが、タンパク質結合ポケットにあるプロトンと、より密接に接触していることを示唆する（図１８ｂ）。Ｇｂ５は、１１０μＭのｓｄＡｂ４６の存在下で有意なＳＴＤシグナルを示さず、フコースがリガンド認識に必要であることを示唆する。

【0270】

グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－ＨへのｓｄＡｂ４６の結合をさらに支持するために、我々は、ｓｄＡｂ４６の存在下および非存在下でグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈから移動された核オーバーハウザー効果（ｔｒＮＯＥ）を得た。ＮＯＥビルドアップ（ｂｕｉｌｄ－ｕｐ）の著しく速い速度を、ｓｄＡｂ４６の存在下のグロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈで観察し、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）－Ｈのタンパク質への結合をさらに確認した（図１８ｃ）。

【0271】

結論として、ＮＭＲの結果は、選択された単一ドメイン抗体が、明確に定義された合成構造に、およびこれらのエピトープを含む細胞表面に、特異的に結合することを示す。

【0272】

実施例４：ｓｄＡｂ４６トリマーの分子クローニング
ｓｄＡｂ結合を改善するために、次の目的は、ｓｄＡｂ４６の３価型を構築することであった。別のプロジェクトから、ＧＳリンカー、Ｎ末端のＨｉｓタグ、およびＣ末端の溶解性ペプチド（タキプレシン－Ｉ、ＴＡＣＨＹと略される）によって結合された３つのｓｄＡｂ４６ユニットで構成される融合タンパク質をコードする市販の発現プラスミドが利用可能であった。３価のｓｄＡｂ４６コンストラクトが、分子クローニングにより、ＴＡＣＨＹペプチドを除いて生成され、分子クローニングにおいて、ストップコドンがＴＡＣＨＹコード配列の前に挿入される（図１９ａ）。突然変異誘発プライマーを設計し、ＰＣＲ反応を行って、追加の終止コドンを含むＤＮＡ配列を生成した。ＰＣＲ反応を、アガロースゲル電気泳動を使用して確認し、～１５００ｂｐ（予想サイズ：１４４８ｂｐ）のサイズを有する産物を観察した。ＰＣＲ産物およびプラスミドを、同じ制限酵素（ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ）を用いて両方とも消化し、産物を、再びアガロースゲルで泳動した。６５７１ｂｐプラスミドの消化のために、５１９２ｂｐおよび１３８５ｂｐの大きな断片が予想されたが、わずかに大きなバンドが、６０００ｂｐと１５００ｂｐ付近で観察された。それにもかかわらず、上部バンドは、骨格を表すと想定され、抽出され、インサートとして機能する消化されたＰＣＲ産物と共にライゲーションされた。クローニングの成功を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。

【0273】

形質転換後、タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるように、シャッフル（ＳＨｕｆｆｌｅ）細胞で成功裏に発現し、ここで、４６．２ｋＤａの予想されたサイズを有するバンドを観察した（図１９ｂ）。その後、細胞沈殿物を溶解し、ｓｄＡｂ４６トリマーコンストラクトの溶解度を評価したが、残念ながら、トリマーコンストラクトに対応するバンドは、沈殿物試料でのみ観察され、封入体の形成を示唆する溶解物では観察されなかった。これは、元のｓｄＡｂ４６トリマー－ＴＡＣＨＹコンストラクトでも以前に観察された。発現条件（異なるＩＰＴＧ濃度、発現温度、発現期間）を最適化する試みは、ＴＡＣＨＹコンストラクトの溶解性を改善できなかったため、ｓｄＡｂ４６トリマーの封入体分離およびリフォールディングプロトコルを確立することを検討した。単離を、Ｌｉ Ｘｕらによるプロトコルに基づいて行った。（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃ，２０１７）。洗浄ステップ後、無色の沈殿物を得て、これを６Ｍ尿素にほぼ完全に可溶化した。可溶化された封入体を、ヒストラップ（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ）カラムを備えた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）機構を使用して、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ精製によってさらに精製し、５ステップのイミダゾールグラジエントを用いて溶出した。２番目の溶出ステップ（～３９ｍＭイミダゾール）は、ｓｄＡｂ４６トリマーを溶出するのにすでに十分であり、ｓｄＡｂ４６トリマーを、クロマトグラムで観察し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。２８０ｎｍでの最高の吸光度値、～１７０ｍＡＵは、～９７ｍＭのイミダゾール濃度で到達し、より高いイミダゾール濃度は、残りの結合タンパク質の最低限の溶出のみを結果的にもたらした。フロースルーのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、標的タンパク質の大部分が未結合のままであることを示した。これにも関わらず、変性した単一ドメイン抗体の全てがリフォールディングされてはいないが、１．１ｍｇの折り畳みタンパク質を得た。

【0274】

実施例５：３価グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ単一ドメイン抗体の細胞結合
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）結合分析を、グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ発現乳がん細胞株ＭＣＦ７を用いて行った。グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈを発現しない神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ５を、陰性対照として使用した。これらの分析様式は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法によって実行された。

【0275】

フローサイトメトリーについて、細胞を０．４ｍｇ／ｍｌのｓｄＡｂ４６モノマーまたはｓｄＡｂ４６トリマー溶液と共にインキュベーションした。５μｇ／ｍｌの抗－グロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ ＩｇＧ ＶＫ９を陽性対照として使用した。抗ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５および抗６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７を二次抗体として使用した。フローサイトメトリーによって測定された蛍光強度を、二次抗体のみの陰性対照と比較してプロットした。細胞への結合を、二次抗体のみの対照の蛍光強度に基づいて作成された「陽性細胞」ゲートを使用して定量化した（図２０ａ）。予想通り、ＶＫ９結合は、ＭＣＦ７細胞でのみ観察され（７３．４７±４．８３％）、ＩＭＲ５細胞では観察されず（０．０４±０．１３％）、ＭＣＦ７細胞でのグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ発現を確認した（図２０ｂ）。以前のデータと一致して、２つのＭＣＦ７集団はヒストグラムに見られ、異なるグロボ（Ｇｌｏｂｏ）Ｈ発現レベルを示す。わずかなシフトは、ｓｄＡｂ４６モノマー（１．１７±０．７１％）と共に、およびｓｄＡｂ４６トリマー（４．１９±３．９２％）と共にインキュベーションされたＩＭＲ５細胞で観察されたが、ＭＣＦ７細胞は、ｓｄＡｂ（モノマー（曲線Ｉ）の場合、３．６５±０．５１％、およびトリマー（曲線ＩＩ）の場合、５０．５８±２０．８２％）によってより頻繁に結合された。２標本ｔ検定は、ＭＣＦ７への結合の増加は、ＶＫ９および両方のｓｄＡｂコンストラクトにとって重要であることを示した。予想通り、ｓｄＡｂ４６トリマーは、ｓｄＡｂ４６モノマーと比較して改善されたＭＣＦ７結合を示した。

【0276】

共焦点レーザー走査顕微鏡に基づくアッセイ（図２０ｃ）のために、細胞を、ポリ－Ｌ－リジン被覆されたカバースリップに播種し、０．４ｍｇ／ｍｌの単一ドメイン抗体溶液または０．５μｇ／ｍｌのＶＫ９と共にインキュベーションした。抗－ＩｇＧ－Ａｔｔｏ６３５および抗－６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７を、二次抗体として使用し、細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。ＭＣＦ７の二次抗体対照は、どちらの抗体にも蛍光シグナルを示さなかったが、ＩＭＲ５細胞への非特異的な抗－６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７の結合を観察した。予想通り、ＩＭＲ５ではなくＭＣＦ７へのＶＫ９の結合を観察し、フローサイトメトリー実験において検出された２つのＭＣＦ７集団は、顕微鏡検査においても異なる蛍光強度によって区別できた。ｓｄＡｂ４６結合も確認されたが、驚くべきことに、蛍光強度の違いは、モノマーおよびトリマーについて観察されなかった。興味深いことに、２つの型のｓｄＡｂ４６は、主に細胞内で観察されたが、一方、ＶＫ９は、細胞膜上でより強く、どちらかというとパッチとして検出されたように、２つのｓｄＡｂ４６型の染色パターンは、ＶＫ９抗体の染色パターンと異なった。ＩＭＲ５細胞は、抗－６×Ｈｉｓ－ＡＦ６４７によって非特異的に染色されたが、蛍光の増加が、ｓｄＡｂ４６モノマーおよびトリマーで観察され、フローサイトメトリー結果と一致する弱いＮｂ結合を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【配列表】

2022552178000001.app

【国際調査報告】