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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-15
(54)【発明の名称】自己細胞療法で免疫療法の非応答者を治療する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20221208BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20221208BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221208BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20221208BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20221208BHJP
C07K 14/73 20060101ALI20221208BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221208BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20221208BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20221208BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20221208BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221208BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221208BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221208BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221208BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20221208BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20221208BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17 Z
C12N15/09 110
C12N15/12
C12N15/85 Z
C07K14/725
C07K14/73
C12N5/10
C12N5/0783
A61K31/711
A61K38/46
A61K31/7105
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K48/00
C07K16/28
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520959
(86)(22)【出願日】2020-10-09
(85)【翻訳文提出日】2022-05-20
(86)【国際出願番号】 US2020055016
(87)【国際公開番号】W WO2021072218
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/913,630
(32)【優先日】2019-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/024,909
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520032608
【氏名又は名称】パクト ファーマ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＣＴ ＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】センニノ， バーバラ
(72)【発明者】
【氏名】ポン， ソンミン
(72)【発明者】
【氏名】マンデル－キャッシュマン， ステファニー
(72)【発明者】
【氏名】フランズソフ， アレックス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC22
4C084NA05
4C084ZB26
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087DA31
4C087NA05
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
改変されたＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて非応答患者におけるがんを治療する方法がここに記載される。
【選択図】図６Ｃ
【選択図】図６Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて非応答患者におけるがんを治療する方法。
【請求項2】
非応答患者からのがん細胞を、そのような患者のためにデザインされ作製されたＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて殺傷する方法。
【請求項3】
非応答患者がチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答しない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
非応答患者が、チェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に対して応答を示さなかった、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
非応答患者が最初はチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答し、次に耐性を発現し、応答を停止したか、又は応答の低下を示した、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
非応答患者がＣＴＬＡ－４結合剤療法に応答しなかった、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＣＴＬＡ－４結合剤療法が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＣＴＬＡ－４結合剤療法がイピリムマブである、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項9】
非応答患者がＰＤ－１軸結合剤療法に応答しなかった、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－１抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
ＰＤ－１軸結合剤療法が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピジリズマブ、及びスパルタリズマブから選択される、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
ＰＤ－１軸結合剤療法が、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブから選択される、請求項９又は請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
非応答患者が免疫療法に応答しない、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項15】
免疫療法ががんワクチン療法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
免疫療法がＴ－ＶＥＣである、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ＮｅｏＴＣＲ生成物が非応答患者からのＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を含み、Ｔ細胞が少なくとも一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項18】
ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一、二、又は三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ及び第二のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ又は第二のｎｅｏＴＣＲの何れかを発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のｎｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のＮｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲから選択される一のｎｅｏＴＣＲを発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
各ｎｅｏＴＣＲが、患者のがんに存在する体細胞コーディング変異に起因するアミノ酸変異を含むネオエピトープに結合する、請求項１７から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項23】
ＮｅｏＴＣＲ生成物中のｎｅｏＴＣＲが、Ｔ細胞ゲノムの内因性ＴＣＲ遺伝子座に存在する、請求項１７から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＮｅｏＴＣＲ生成物が非ウイルス改変法によって産生される、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項25】
ＮｅｏＴＣＲ生成物がＣＲＩＳＰＲを使用して産生される、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項26】
ＮｅｏＴＣＲ生成物が、Ｔ細胞のゲノム中に外因性ＤＮＡ配列を含まない、請求項１７から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項27】
ＮｅｏＴＣＲ生成物のＴ細胞が、患者からのＴ細胞に由来する、請求項１７から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項28】
ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
【請求項29】
ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項31】
ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、請求項２８から３０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項32】
ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、請求項２８から３１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項33】
ポリヌクレオチドが、ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、
ｃ）第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、
請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
ポリヌクレオチドが、目的の外因性配列を更に含む、請求項２８から３３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項35】
目的の外因性配列が、自己細胞療法で有用なタンパク質をコードする、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
ポリヌクレオチドが環状ＤＮＡである、請求項２８から３５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項37】
ポリヌクレオチドが直鎖ＤＮＡである、請求項２８から３６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項38】
ＴＣＲ遺伝子配列が、がん抗原を認識するＴＣＲをコードする、請求項２８から３７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項39】
がん抗原がネオ抗原である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項40】
がん抗原が患者特異的ネオ抗原である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項41】
ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、請求項２８から４０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項42】
ヌクレアーゼを更に含む、請求項２８から４０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項43】
ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項44】
ｓｇＲＮＡを更に含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項45】
ヌクレアーゼが内因性ＴＣＲ遺伝子座を標的とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項46】
ヌクレアーゼがＴＣＲ－アルファ遺伝子座及びＴＣＲ－ベータ遺伝子座を標的とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項47】
第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列が、内因性ＴＣＲ遺伝子座内に位置する、請求項２８から４７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項48】
内因性ＴＣＲ遺伝子座がＴＣＲ－アルファ遺伝子座である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項49】
ポリヌクレオチドが非ウイルス性である、請求項２８から４８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項50】
ポリヌクレオチドが遺伝子療法ベクターである、請求項２８から４９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項51】
ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する可動性リンカーをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するプロテアーゼ切断配列をコードする配列
を含む、組成物。
【請求項52】
環状ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、環状ポリヌクレオチドが、ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
【請求項53】
非応答患者におけるがんを治療する方法であって、ａ）改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与することを含み、ここで、改変された初代細胞が、外因性ヌクレアーゼ及び内因性遺伝子座に組み込まれた非ウイルス性外因性核酸配列を含み、非ウイルス性外因性核酸が、
ｉ． がん性細胞に存在する抗原に結合することができるＴＣＲの少なくとも一部をコードするＴＣＲ遺伝子配列、
ｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｉｉ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｉｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含み、それにより、ヒト患者におけるがんを治療する、方法。
【請求項54】
外因性ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
外因性核酸が、第二のＰ２Ａコード配列の直ぐ下流に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項56】
外因性核酸が、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、請求項５３から５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項57】
外因性核酸が、ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に施される、請求項５３から５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項59】
がんが、メラノーマ、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、及び結腸直腸がんから選択される、請求項５３から５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項60】
非応答患者におけるがんを治療する方法において、ａ）非ウイルス性ポリヌクレオチドのＴ細胞へのヌクレアーゼ媒介導入により導入することによって患者由来のＴ細胞を改変する工程であって、非ウイルス性ポリヌクレオチドが、
ｉ． 細胞の第一の内因性配列と第二の内因性配列とに相同な第一の相同性アームと第二の相同性アーム；
ｉｉ 第一の相同性アームと第二の相同性アームとの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；及び
ｉｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｖ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、工程；及び
ｂ）非ウイルス性ポリヌクレオチドをＴ細胞の内因性遺伝子座に組み換える工程であって、内因性遺伝子座が、非ウイルス性ポリヌクレオチドの第一の相同性アームと第二の相同性アームとに相同な第一の内因性配列と第二の内因性配列とを含む工程；及び
ｃ）改変されたＴ細胞を培養してＴ細胞の集団を産生する工程；及び
ｄ）治療上有効な数の改変されたＴ細胞をヒト患者に投与し、それにより、がんを治療する工程
を含む、方法。
【請求項61】
前記組み換えが、ａ）ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
ｂ）相同性指向修復による内因性遺伝子座への非ウイルス性ポリヌクレオチドの組み換え
を更に含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項63】
第一の相同性アームと第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、請求項６０から６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項64】
非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、請求項６０から６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項65】
治療上有効な数の改変されたＴ細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、請求項６０から６４の何れか一項に記載の方法。
【請求項66】
がんがメラノーマ、肺がん、及び結腸直腸がんから選択される、請求項６０から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項67】
ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、請求項６０から６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項68】
非ウイルス性ポリヌクレオチドが、ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモン配列と第二のヒト成長ホルモン配列は、互いにコドンが異なる、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
患者由来のＴ細胞が、ポリヌクレオチドの導入前に凍結されている、請求項６０から６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項70】
第一の相同性アーム及び第二の相同性アームがそれぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、請求項６０から６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項71】
明細書に記載の任意の方法又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願への相互参照］
この出願は、それぞれがあらゆる目的のためにその全体において出典明示により援用される、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／９１３６３０号、及び２０２０年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／０２４９０９号の優先権の利益を主張する。
この出願は、それぞれがあらゆる目的のためにその全体において出典明示により援用される、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／９１３６３０号、及び２０２０年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／０２４９０９号の優先権の利益を主張する。
【0002】
［分野］
がんの対象に、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を発現するように改変されたＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。幾つかの実施態様では、対象は免疫療法の非応答者（ノンレスポンダー）である。
がんの対象に、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を発現するように改変されたＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。幾つかの実施態様では、対象は免疫療法の非応答者（ノンレスポンダー）である。
【背景技術】
【0003】
がんとがんの進行は免疫抑制に関連している。実際、がん細胞は免疫抑制機能を引き出すために免疫チェックポイント経路を活性化することができる。従って、チェックポイント阻害剤が、共抑制シグナル伝達経路を妨害し、がん細胞の免疫介在性殺傷を促進することにより、患者の抗腫瘍免疫応答を再活性化するために開発された。免疫チェックポイントを標的とするチェックポイント阻害剤は、そのような治療法に応答するがん患者のサブセットに有望である。しかし、全てのがん患者を治療するためのチェックポイント阻害剤の主流の使用は、そのような患者の大きなサブセットでの低い奏効率（一次及び二次抵抗を含む）と免疫関連の有害事象のために採用されていない。実際、腫瘍のおよそ６０－７０％が単剤のチェックポイント阻害剤に応答性ではなく、チェックポイント阻害剤に応答する腫瘍を有している患者は時間の経過と共に耐性を示すようになる（Ｙａｎ等，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０８；９：１７３９）。
【0004】
チェックポイント阻害剤に加えて、広い意味でのがん免疫療法もまたチェックポイント阻害剤の限界に屈する－多くの患者が現在の免疫療法に応答せず、殆どが最終的に再発する。更に、多くの患者は免疫療法の結果として有害事象を経験する。例えば、がんワクチンが有望な免疫療法として探求されてきた；しかし、獲得耐性及び／又は毒性を伴わない腫瘍治療の効果的な手段を提供する開発はがんワクチンの分野での殆どなかった。免疫療法の別の大きな制約は、患者の奏効率を予測し、既存の免疫療法に対する改善を最適化して有効性を高め、獲得された一次耐性を低減させ、有害事象を減少させるためにバイオマーカーが利用できないことである。
【0005】
感染症では、免疫優勢エピトープに対するポリクローナルＴ細胞応答が成功裡の免疫応答を駆動する。がんでは、ウイルス感染症における免疫優勢エピトープと同様に、非同義変異に由来するネオエピトープは、これらの抗原を認識するＴ細胞が中枢性及び末梢性トレランスの機序にさらされないため、潜在的に免疫原性が高い。実際、初期の研究は、非同義変異に由来するネオエピトープがチェックポイント阻害剤療法によって誘導されるＴ細胞応答の第一標的であることを支持しており、複数のがん組織学において養子移入されたＴ細胞療法によって成功裡に標的にされている。しかし、ネオエピトープの免疫優勢と進化、又はこれらのネオエピトープに対するＴ細胞応答のクローン性に関する知識は限られている。更に、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞の存在及び増殖と患者のチェックポイント阻害剤療法に対する臨床反応との相関関係については殆ど知られていない。
【0006】
従って、チェックポイント阻害剤及び他の既存の免疫療法に応答しない患者のためのがんを治療するための治療法を開発する必要がある。ここに開示されるのは、チェックポイント阻害剤及び他の免疫療法に応答しない患者におけるがんの治療のための治療法及びそのような治療法を使用する方法である。
【発明の概要】
【0007】
ここに記載の本発明は、ＮｅｏＴＣＲ生成物を用いるそれを必要とする非応答患者（ノンレスポンダー患者）の方法を提供する。
実施態様１． ＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて非応答患者におけるがんを治療する方法。
実施態様２． 非応答患者からのがん細胞を、そのような患者のためにデザインされ作製されたＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて殺傷する方法。
実施態様３． 非応答患者がチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答しない、実施態様１又は２の方法。
実施態様４． 非応答患者が、チェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に対して応答を示さなかった、実施態様３の方法。
実施態様５． 非応答患者が最初はチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答し、次に耐性を発現し、応答を停止したか、又は応答の低下を示した、実施態様３の方法。
実施態様６． 非応答患者がＣＴＬＡ－４結合剤療法に応答しなかった、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様７． ＣＴＬＡ－４結合剤療法が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、実施態様６の方法。
実施態様８． ＣＴＬＡ－４結合剤療法がイピリムマブである、実施態様６又は実施態様７の方法。
実施態様９． 非応答患者がＰＤ－１軸結合剤療法に応答しなかった、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様１０． ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－１抗体である、実施態様９の方法。
実施態様１１． ＰＤ－１軸結合剤療法が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピジリズマブ、及びスパルタリズマブから選択される、実施態様９又は実施態様１０の方法。
実施態様１２． ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、実施態様９の方法。
実施態様１３． ＰＤ－１軸結合剤療法が、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブから選択される、実施態様９又は実施態様１２の方法。
実施態様１４． 非応答患者が免疫療法に応答しない、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様１５． 免疫療法ががんワクチン療法である、実施態様１４の方法。
実施態様１６． 免疫療法がＴ－ＶＥＣである、実施態様１４又は実施態様１５の方法。
実施態様１７． ＮｅｏＴＣＲ生成物が非応答患者からのＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を含み、Ｔ細胞が少なくとも一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１－１６の何れか一の方法。
実施態様１８． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一、二、又は三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１７の方法。
実施態様１９． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１８の方法。
実施態様２０． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ及び第二のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ又は第二のｎｅｏＴＣＲの何れかを発現する、実施態様１８の方法。
実施態様２１． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のｎｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のＮｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲから選択される一のｎｅｏＴＣＲを発現する、実施態様１８の方法。
実施態様２２． 各ｎｅｏＴＣＲが、患者のがんに存在する体細胞コーディング変異に起因するアミノ酸変異を含むネオエピトープに結合する、実施態様１７－２１の何れか一の方法。
実施態様２３． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のｎｅｏＴＣＲが、Ｔ細胞ゲノムの内因性ＴＣＲ遺伝子座に存在する、実施態様１７－２２の何れか一の方法。
実施態様２４． ＮｅｏＴＣＲ生成物が非ウイルス改変法によって産生される、実施態様１－２３の何れか一の方法。
実施態様２５． ＮｅｏＴＣＲ生成物がＣＲＩＳＰＲを使用して産生される、実施態様１－２４の何れか一の方法。
実施態様２６． ＮｅｏＴＣＲ生成物が、Ｔ細胞のゲノム中に外因性ＤＮＡ配列を含まない、実施態様１７－２５の何れか一の方法。
実施態様２７． ＮｅｏＴＣＲ生成物のＴ細胞が、患者からのＴ細胞に由来する、実施態様１７－２６の何れか一の方法。
実施態様２８． ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様２９． ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、実施態様２８の組成物。
実施態様３０． ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、実施態様２８又は２９の組成物。
実施態様３１． ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様２８－３０の何れかの組成物。
実施態様３２． ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、実施態様２８－３１の何れかの組成物。
実施態様３３． ポリヌクレオチドが、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、
ｃ）第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、実施態様３２の組成物。
実施態様３４． ポリヌクレオチドが、目的の外因性配列を更に含む、実施態様２８－３３の何れかの組成物。
実施態様３５． 目的の外因性配列が、自己細胞療法で有用なタンパク質をコードする、実施態様３４の組成物。
実施態様３６． ポリヌクレオチドが環状ＤＮＡである、実施態様２８－３５の何れかの組成物。
実施態様３７． ポリヌクレオチドが直鎖ＤＮＡである、実施態様２８－３６の何れかの組成物。
実施態様３８． ＴＣＲ遺伝子配列が、がん抗原を認識するＴＣＲをコードする、実施態様２８－３７の何れかの組成物。
実施態様３９． がん抗原がネオ抗原である、実施態様３８の組成物。
実施態様４０． がん抗原が患者特異的ネオ抗原である、実施態様３８の組成物。
実施態様４１． ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、実施態様２８－４０の何れかの組成物。
実施態様４２． ヌクレアーゼを更に含む、実施態様２８－４０の何れかの組成物。
実施態様４３． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様４２の組成物。
実施態様４４． ｓｇＲＮＡを更に含む、実施態様４３の組成物。
実施態様４５． ヌクレアーゼが内因性ＴＣＲ遺伝子座を標的とする、実施態様４２の組成物。
実施態様４６． ヌクレアーゼがＴＣＲ－アルファ遺伝子座及びＴＣＲ－ベータ遺伝子座を標的とする、実施態様４２の組成物。
実施態様４７． 第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列が、内因性ＴＣＲ遺伝子座内に位置する、実施態様２８－４７の何れかの組成物。
実施態様４８． 内因性ＴＣＲ遺伝子座がＴＣＲ－アルファ遺伝子座である、実施態様４７の組成物。
実施態様４９． ポリヌクレオチドが非ウイルス性である、実施態様２８－４８の何れかの組成物。
実施態様５０． ポリヌクレオチドが遺伝子療法ベクターである、実施態様２８－４９の何れかの組成物。
実施態様５１． ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する可動性リンカーをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するプロテアーゼ切断配列をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様５２． 環状ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、環状ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様５３． 非応答患者におけるがんを治療する方法であって、
ａ）改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与することを含み、ここで、改変された初代細胞が、外因性ヌクレアーゼ及び内因性遺伝子座に組み込まれた非ウイルス性外因性核酸配列を含み、非ウイルス性外因性核酸が、
ｉ． がん性細胞に存在する抗原に結合することができるＴＣＲの少なくとも一部をコードするＴＣＲ遺伝子配列、
ｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｉｉ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｉｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含み、それにより、ヒト患者におけるがんを治療する、方法。
実施態様５４． 外因性ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様５３の方法。
実施態様５５． 外因性核酸が、第二のＰ２Ａコード配列の直ぐ下流に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を含む、実施態様５３又は５４の方法。
実施態様５６． 外因性核酸が、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様５３－５５の何れかの方法。
実施態様５７． 外因性核酸が、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、実施態様５６の方法。
実施態様５８． 改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇（lymphodepletion）レジメンが患者に施される、実施態様５３－５７の何れかの方法。
実施態様５９． がんが、メラノーマ、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、及び結腸直腸がんから選択される、実施態様５３－５８の何れかの方法。
実施態様６０． 非応答患者におけるがんを治療する方法において、
ａ）非ウイルス性ポリヌクレオチドのＴ細胞へのヌクレアーゼ媒介導入により導入することによって患者由来のＴ細胞を改変する工程であって、非ウイルス性ポリヌクレオチドが、
ｉ． 細胞の第一の内因性配列と第二の内因性配列とに相同な第一の相同性アームと第二の相同性アーム；
ｉｉ 第一の相同性アームと第二の相同性アームとの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；及び
ｉｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｖ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、工程；及び
ｂ）非ウイルス性ポリヌクレオチドをＴ細胞の内因性遺伝子座に組み換える工程であって、内因性遺伝子座が、非ウイルス性ポリヌクレオチドの第一の相同性アームと第二の相同性アームとに相同な第一の内因性配列と第二の内因性配列とを含む工程；及び
ｃ）改変されたＴ細胞を培養してＴ細胞の集団を産生する工程；及び
ｄ）治療上有効な数の改変されたＴ細胞をヒト患者に投与し、それにより、がんを治療する工程
を含む、方法。
実施態様６１． 前記組み換えが、
ａ）ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
ｂ）相同性指向修復による内因性遺伝子座への非ウイルス性ポリヌクレオチドの組み換え
を更に含む、実施態様６０の方法。
実施態様６２． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、実施態様６０又は６１の方法。
実施態様６３． 第一の相同性アームと第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、実施態様６０－６２の何れかの方法。
実施態様６４． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様６０－６３の何れかの方法。
実施態様６５． 治療上有効な数の改変されたＴ細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、実施態様６０－６４の何れかの方法。
実施態様６６． がんがメラノーマ、肺がん、及び結腸直腸がんから選択される、実施態様６０－６５の何れかの方法。
実施態様６７． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様６０－６６の何れかの方法。
実施態様６８． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモン配列と第二のヒト成長ホルモン配列は、互いにコドンが異なる、実施態様６７の方法。
実施態様６９． 患者由来のＴ細胞が、ポリヌクレオチドの導入前に凍結されている、実施態様６０－６８の何れかの方法。
実施態様７０． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームがそれぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、実施態様６０－６９の何れかの方法。
実施態様７１． ここに記載の任意の方法又は組成物。
実施態様１． ＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて非応答患者におけるがんを治療する方法。
実施態様２． 非応答患者からのがん細胞を、そのような患者のためにデザインされ作製されたＮｅｏＴＣＲ生成物を用いて殺傷する方法。
実施態様３． 非応答患者がチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答しない、実施態様１又は２の方法。
実施態様４． 非応答患者が、チェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に対して応答を示さなかった、実施態様３の方法。
実施態様５． 非応答患者が最初はチェックポイント阻害剤療法又は免疫療法に応答し、次に耐性を発現し、応答を停止したか、又は応答の低下を示した、実施態様３の方法。
実施態様６． 非応答患者がＣＴＬＡ－４結合剤療法に応答しなかった、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様７． ＣＴＬＡ－４結合剤療法が抗ＣＴＬＡ－４抗体である、実施態様６の方法。
実施態様８． ＣＴＬＡ－４結合剤療法がイピリムマブである、実施態様６又は実施態様７の方法。
実施態様９． 非応答患者がＰＤ－１軸結合剤療法に応答しなかった、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様１０． ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－１抗体である、実施態様９の方法。
実施態様１１． ＰＤ－１軸結合剤療法が、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピジリズマブ、及びスパルタリズマブから選択される、実施態様９又は実施態様１０の方法。
実施態様１２． ＰＤ－１軸結合剤療法が抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、実施態様９の方法。
実施態様１３． ＰＤ－１軸結合剤療法が、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブから選択される、実施態様９又は実施態様１２の方法。
実施態様１４． 非応答患者が免疫療法に応答しない、実施態様１－５の何れか一の方法。
実施態様１５． 免疫療法ががんワクチン療法である、実施態様１４の方法。
実施態様１６． 免疫療法がＴ－ＶＥＣである、実施態様１４又は実施態様１５の方法。
実施態様１７． ＮｅｏＴＣＲ生成物が非応答患者からのＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋ Ｔ細胞を含み、Ｔ細胞が少なくとも一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１－１６の何れか一の方法。
実施態様１８． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一、二、又は三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１７の方法。
実施態様１９． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が、一のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変されている、実施態様１８の方法。
実施態様２０． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ及び第二のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ又は第二のｎｅｏＴＣＲの何れかを発現する、実施態様１８の方法。
実施態様２１． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のＴ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のｎｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲを発現するように改変され、各Ｔ細胞が第一のｎｅｏＴＣＲ、第二のＮｅｏＴＣＲ、及び第三のｎｅｏＴＣＲから選択される一のｎｅｏＴＣＲを発現する、実施態様１８の方法。
実施態様２２． 各ｎｅｏＴＣＲが、患者のがんに存在する体細胞コーディング変異に起因するアミノ酸変異を含むネオエピトープに結合する、実施態様１７－２１の何れか一の方法。
実施態様２３． ＮｅｏＴＣＲ生成物中のｎｅｏＴＣＲが、Ｔ細胞ゲノムの内因性ＴＣＲ遺伝子座に存在する、実施態様１７－２２の何れか一の方法。
実施態様２４． ＮｅｏＴＣＲ生成物が非ウイルス改変法によって産生される、実施態様１－２３の何れか一の方法。
実施態様２５． ＮｅｏＴＣＲ生成物がＣＲＩＳＰＲを使用して産生される、実施態様１－２４の何れか一の方法。
実施態様２６． ＮｅｏＴＣＲ生成物が、Ｔ細胞のゲノム中に外因性ＤＮＡ配列を含まない、実施態様１７－２５の何れか一の方法。
実施態様２７． ＮｅｏＴＣＲ生成物のＴ細胞が、患者からのＴ細胞に由来する、実施態様１７－２６の何れか一の方法。
実施態様２８． ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様２９． ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、実施態様２８の組成物。
実施態様３０． ポリヌクレオチドの第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、実施態様２８又は２９の組成物。
実施態様３１． ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様２８－３０の何れかの組成物。
実施態様３２． ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、実施態様２８－３１の何れかの組成物。
実施態様３３． ポリヌクレオチドが、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、
ｃ）第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、実施態様３２の組成物。
実施態様３４． ポリヌクレオチドが、目的の外因性配列を更に含む、実施態様２８－３３の何れかの組成物。
実施態様３５． 目的の外因性配列が、自己細胞療法で有用なタンパク質をコードする、実施態様３４の組成物。
実施態様３６． ポリヌクレオチドが環状ＤＮＡである、実施態様２８－３５の何れかの組成物。
実施態様３７． ポリヌクレオチドが直鎖ＤＮＡである、実施態様２８－３６の何れかの組成物。
実施態様３８． ＴＣＲ遺伝子配列が、がん抗原を認識するＴＣＲをコードする、実施態様２８－３７の何れかの組成物。
実施態様３９． がん抗原がネオ抗原である、実施態様３８の組成物。
実施態様４０． がん抗原が患者特異的ネオ抗原である、実施態様３８の組成物。
実施態様４１． ＴＣＲ遺伝子配列が患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である、実施態様２８－４０の何れかの組成物。
実施態様４２． ヌクレアーゼを更に含む、実施態様２８－４０の何れかの組成物。
実施態様４３． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様４２の組成物。
実施態様４４． ｓｇＲＮＡを更に含む、実施態様４３の組成物。
実施態様４５． ヌクレアーゼが内因性ＴＣＲ遺伝子座を標的とする、実施態様４２の組成物。
実施態様４６． ヌクレアーゼがＴＣＲ－アルファ遺伝子座及びＴＣＲ－ベータ遺伝子座を標的とする、実施態様４２の組成物。
実施態様４７． 第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列が、内因性ＴＣＲ遺伝子座内に位置する、実施態様２８－４７の何れかの組成物。
実施態様４８． 内因性ＴＣＲ遺伝子座がＴＣＲ－アルファ遺伝子座である、実施態様４７の組成物。
実施態様４９． ポリヌクレオチドが非ウイルス性である、実施態様２８－４８の何れかの組成物。
実施態様５０． ポリヌクレオチドが遺伝子療法ベクターである、実施態様２８－４９の何れかの組成物。
実施態様５１． ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置する可動性リンカーをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するプロテアーゼ切断配列をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様５２． 環状ポリヌクレオチドを含む非応答患者におけるがんの治療のための組成物であって、環状ポリヌクレオチドが、
ａ）第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
ｂ）第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
ｃ）ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列；
ｄ）Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；及び
ｅ）第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、組成物。
実施態様５３． 非応答患者におけるがんを治療する方法であって、
ａ）改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与することを含み、ここで、改変された初代細胞が、外因性ヌクレアーゼ及び内因性遺伝子座に組み込まれた非ウイルス性外因性核酸配列を含み、非ウイルス性外因性核酸が、
ｉ． がん性細胞に存在する抗原に結合することができるＴＣＲの少なくとも一部をコードするＴＣＲ遺伝子配列、
ｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｉｉ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｉｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含み、それにより、ヒト患者におけるがんを治療する、方法。
実施態様５４． 外因性ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様５３の方法。
実施態様５５． 外因性核酸が、第二のＰ２Ａコード配列の直ぐ下流に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を含む、実施態様５３又は５４の方法。
実施態様５６． 外因性核酸が、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様５３－５５の何れかの方法。
実施態様５７． 外因性核酸が、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモンシグナル配列と第二のヒト成長ホルモンシグナル配列は、互いにコドンが異なる、実施態様５６の方法。
実施態様５８． 改変された初代細胞の治療上有効な集団をヒト患者に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇（lymphodepletion）レジメンが患者に施される、実施態様５３－５７の何れかの方法。
実施態様５９． がんが、メラノーマ、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、及び結腸直腸がんから選択される、実施態様５３－５８の何れかの方法。
実施態様６０． 非応答患者におけるがんを治療する方法において、
ａ）非ウイルス性ポリヌクレオチドのＴ細胞へのヌクレアーゼ媒介導入により導入することによって患者由来のＴ細胞を改変する工程であって、非ウイルス性ポリヌクレオチドが、
ｉ． 細胞の第一の内因性配列と第二の内因性配列とに相同な第一の相同性アームと第二の相同性アーム；
ｉｉ 第一の相同性アームと第二の相同性アームとの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；及び
ｉｉｉ． ＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第二のＰ２Ａコード配列であって、互いにコドンが異なる同じアミノ酸配列をコードする第一のＰ２Ａコード配列と第二のＰ２Ａコード配列、
ｉｖ． Ｐ２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列；
ｖ． 第二のＰ２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列
を含む、工程；及び
ｂ）非ウイルス性ポリヌクレオチドをＴ細胞の内因性遺伝子座に組み換える工程であって、内因性遺伝子座が、非ウイルス性ポリヌクレオチドの第一の相同性アームと第二の相同性アームとに相同な第一の内因性配列と第二の内因性配列とを含む工程；及び
ｃ）改変されたＴ細胞を培養してＴ細胞の集団を産生する工程；及び
ｄ）治療上有効な数の改変されたＴ細胞をヒト患者に投与し、それにより、がんを治療する工程
を含む、方法。
実施態様６１． 前記組み換えが、
ａ）ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
ｂ）相同性指向修復による内因性遺伝子座への非ウイルス性ポリヌクレオチドの組み換え
を更に含む、実施態様６０の方法。
実施態様６２． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第二のＰ２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ遺伝子配列を更に含む、実施態様６０又は６１の方法。
実施態様６３． 第一の相同性アームと第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、実施態様６０－６２の何れかの方法。
実施態様６４． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、第一のＰ２Ａコード配列とＴＣＲ遺伝子配列との間に位置するヒト成長ホルモンシグナル配列を更に含む、実施態様６０－６３の何れかの方法。
実施態様６５． 治療上有効な数の改変されたＴ細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、実施態様６０－６４の何れかの方法。
実施態様６６． がんがメラノーマ、肺がん、及び結腸直腸がんから選択される、実施態様６０－６５の何れかの方法。
実施態様６７． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体である、実施態様６０－６６の何れかの方法。
実施態様６８． 非ウイルス性ポリヌクレオチドが、
ａ）第一のＰ２Ａコード配列と第一のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第一のヒト成長ホルモンシグナル配列；及び
ｂ）第二のＰ２Ａコード配列と第二のＴＣＲ遺伝子配列との間に位置する第二のヒト成長ホルモンシグナル配列
を更に含み、第一のヒト成長ホルモン配列と第二のヒト成長ホルモン配列は、互いにコドンが異なる、実施態様６７の方法。
実施態様６９． 患者由来のＴ細胞が、ポリヌクレオチドの導入前に凍結されている、実施態様６０－６８の何れかの方法。
実施態様７０． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームがそれぞれ約６００塩基長から約１０００塩基長である、実施態様６０－６９の何れかの方法。
実施態様７１． ここに記載の任意の方法又は組成物。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【0009】
【図2A】図２Ａ－２Ｄは、抗ＰＤ－１療法に応答する患者における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＰＢＭＣからのネオエピトープ特異的Ｔ細胞の単離を示している。図２Ａは、患者＃１に対する経時的な腫瘍測定とサンプル収集を示す。
【図2B】図２Ｂは、患者＃１における経時的なネオエピトープ特異的Ｔ細胞のランドスケープ分析を示す。下のパネルは、ｍＲＮＡ発現とスクリーニングされたネオ抗原の予測されたＨＬＡ結合親和性を示す。ネオエピトープは異なるパターンのバーで強調表示され、変異した遺伝子名、点変異を伴うネオエピトープの配列が点変異に下線を付して示され、ＨＬＡが上部に示されている。単離されたＴ細胞のネオエピトープ特異性を示すために、同じパターンコードが上のパネルで使用されている。上の五つのパネルは、ＴＩＬ及びＰＢＭＣにおけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞の経時的進化を示している。小さな各ボックスは一個の単離したＴ細胞を表し、クロスは１０個の単離したＴ細胞に相当する。破線の各ボックスは、異なるネオエピトープ特異的Ｔ細胞クローン型を表している。単離したＴ細胞の数は、プロットするために端数切り上げ法を使用して１０００００のＣＤ８＋Ｔ細胞に正規化する。検証したＴ細胞クローン型のみを示す。
【0010】
【0011】
【図4A】図４Ａ－４Ｉは、抗ＰＤ－１に応答しない患者におけるＴＩＬ及びＰＢＭＣからのネオエピトープ特異的Ｔ細胞の単離とｎｅｏＴＣＲ抗腫瘍活性を示す。図４Ａ－４Ｃは、それぞれ患者＃３、＃４、及び＃５に対するネオエピトープ特異的Ｔ細胞のランドスケープである。下のパネルは、ｍＲＮＡ発現とスクリーニングされたネオ抗原の予測されたＨＬＡ結合親和性を示す。ネオエピトープは異なるパターンのバーで強調表示され、変異した遺伝子名、点変異が赤でマークされたネオエピトープの配列、及びＨＬＡが上部に示されている。患者＃５におけるネオエピトープに対する予測されたＨＬＡ結合親和性は、発現が負であると見なされるため、矢印で強調表示している。単離されたＴ細胞のネオエピトープ特異性を示すために、同じパターンコードが上のパネルで使用される。小さな各ボックスは、一個の単離したＴ細胞を表している。各色は、異なるネオエピトープ特異的Ｔ細胞クローン型を表している。単離したＴ細胞の数は、プロットするために端数切り上げ法を使用して１０００００のＣＤ８＋Ｔ細胞に正規化する。検証したＴ細胞クローン型のみを示す。
【図4B】上記
【図4C】上記
【図4D-4E】図４Ｄ－４Ｆは、自己（それぞれＭ４８５、Ｍ４８６及びＭ４８８）又はミスマッチ（Ｍ２０２）細胞株と共培養した際の、それぞれ患者＃３、＃４、＃５からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋遺伝子編集Ｔ細胞における４－１ＢＢのアップレギュレーションを示す（ｎ＝３）。
【図4F-4G】図４Ｇ－４Ｉは、自己細胞株及びミスマッチ対照におけるそれぞれ患者＃３、＃４、＃５からのｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞による特異的標的細胞殺傷を示す（患者＃３及び＃５に対して（Ｐ：Ｔ）比５：１、ｎ＝４、患者＃４に対してＰ：Ｔ比１０：１、ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図４Ｄ、４Ｅ、４Ｇ、及び４Ｈにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。多重比較のための調整を伴わない同じ検定を図４Ｆ及び４Ｉで使用した。（ｎ）は生物学的複製物の数を示す。平均値±ＳＤが示される。全てのＴ細胞生成物は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋遺伝子編集Ｔ細胞を含む。
【図4H-4I】上記
【0012】
【図5A】図５Ａ－５Ｄは、抗ＰＤ－１に応答した患者において単離されたネオエピトープ特異的ＴＣＲの抗腫瘍活性を示している。健康なドナーＴ細胞を遺伝子改変して、患者＃１（図５Ａ及び５Ｂ）及び患者＃２（図５Ｃ及び５Ｄ）からの単離ｎｅｏＴＣＲで内因性ＴＣＲを置き換え、これらのｎｅｏＴＣＲの抗腫瘍活性を特徴付けるために使用した。図５Ａは、自己（Ｍ４８９）又はミスマッチ（Ｍ２０２）細胞株と共培養した際の、患者＃１からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋遺伝子編集Ｔ細胞における４－１ＢＢのアップレギュレーションを示す（ｎ＝３）。
【0013】
【図6A】図６Ａ－６Ｄは、自己細胞株との共培養時の患者＃１からのネオエピトープ特異的ＴＣＲによって誘導される活性化、サイトカイン分泌、細胞傷害性、及び増殖を示す。患者＃１からのキャプチャーされたｎｅｏＴＣＲを発現するように遺伝子改変された健康なドナーＴ細胞を、自己（Ｍ４８９）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２）と共培養した。図６Ａは、共培養後のＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞における４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、及びＣＤ１０７ａのアップレギュレーションである。メラノーマ細胞株を、Ｔ細胞との共培養の２４時間前に通常の培地又はＩＦＮγを含む培地で前処理した（ｎ＝３）。図６Ａのグラフは、Ｍ２０２－ＩＦＮγ、Ｍ２０２＋ＩＧＮγ、Ｍ４８９－ＩＦＮγ、及びＭ４８９＋ＩＦＮγの４プレックスプロットである（各４プレックスの順序でＭ４８９－ＩＦＮγ及びＭ４８９＋ＩＦＮγが右の二つのバーである順序で示される）。
【図6D】図６Ｄは、自己メラノーマ細胞株（Ｍ４８５、上のパネル）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２、下のパネル）との２４、４８及び７２時間の共培養時のＫｉ６７平均蛍光強度によって測定されたＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞の増殖（ｎ＝３）である。１時間ごとの測定の各セットを、トリプレックスバーとして示す；バーの左から右への順序は２４時間、４８時間、及び７２時間である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図ａ、ｂ及びｃにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図６Ｄにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。（ｎ）は生物学的複製物の数を示す。平均値±ＳＤが示される。全てのＴ細胞生成物は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋遺伝子編集Ｔ細胞を含む。
【0014】
【図7A】図７Ａ－７Ｄは、自己細胞株との共培養時の患者＃２からのネオエピトープ特異的ＴＣＲによって誘導される活性化、サイトカイン分泌、細胞傷害性、及び増殖を示す。患者＃２からのキャプチャーされたｎｅｏＴＣＲを発現するように遺伝子改変された健康なドナーＴ細胞を、自己（Ｍ４９０）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２）と共培養した。図７Ａは、共培養後のＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞における４－１ＢＢ及びＯＸ－４０のアップレギュレーションである。メラノーマ細胞株を、Ｔ細胞との共培養の２４時間前に通常の培地又はＩＦＮγを含む培地で前処理した（ｎ＝３）。図７Ａのグラフは、Ｍ２０２－ＩＦＮγ、Ｍ２０２＋ＩＧＮγ、Ｍ４８９－ＩＦＮγ、及びＭ４８９＋ＩＦＮγの４プレックスプロットである（各４プレックスの順序でＭ４８９－ＩＦＮγ及びＭ４８９＋ＩＦＮγが右の二つのバーである順序で示される）。
【図7D】自己メラノーマ細胞株（Ｍ４９０、上のパネル）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２、下のパネル）との２４、４８及び７２時間の共培養時のＫｉ６７平均蛍光強度によって測定されたＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞の増殖（ｎ＝３）である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図７Ａ－７Ｃにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図７Ｄにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。図７Ｄの１時間ごとの測定値の各セットを、トリプレックスバーとして示す；バーの左から右への順序は２４時間、４８時間、７２時間である。（ｎ）は生物学的複製物の数を示す。平均値±ＳＤが示される。全てのＴ細胞生成物は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋遺伝子編集Ｔ細胞を含む。
【0015】
【図8A】図８Ａ－８Ｆは、抗ＰＤ－１への応答がない患者からのネオエピトープ特異的ＴＣＲによって誘導される活性化、サイトカイン分泌、及び増殖を示している。患者＃３（図８Ａ－８Ｃ）、＃４（図８Ｄ－８Ｅ）及び＃５（図７Ｆ）からのキャプチャーされたｎｅｏＴＣＲを発現するように遺伝子改変された健康なドナーＴ細胞を、自己（それぞれＭ４８５、Ｍ４６８及びＭ４８８）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２）と共培養した。図８Ａは、培養後の患者＃３からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞における４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、及びＣＤ１０７ａのアップレギュレーションである。メラノーマ細胞株を、Ｔ細胞との共培養の２４時間前に通常の培地又はＩＦＮγを含む培地で前処理した（ｎ＝３）。図８Ａのグラフは、Ｍ２０２－ＩＦＮγ、Ｍ２０２＋ＩＧＮγ、Ｍ４８９－ＩＦＮγ、及びＭ４８９＋ＩＦＮγの４プレックスプロットである（各４プレックスの順序でＭ４８９－ＩＦＮγ及びＭ４８９＋ＩＦＮγが右の二つのバーである順序で示される）。
【図8C】図８Ｃは、自己メラノーマ細胞株（Ｍ４８５、上のパネル）又はミスマッチ細胞株（Ｍ２０２、下のパネル）との２４、４８及び７２時間の共培養時のＫｉ６７平均蛍光強度によって測定された患者＃３からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞の増殖（ｎ＝３）である。図８Ｃの１時間ごとの測定の各セットを、トリプレックスバーとして示す；バーの左から右への順序は２４時間、４８時間、７２時間である。
【図8D】図８Ｄは、共培養後の患者＃４からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞における４－１ＢＢ及びＯＸ－４０のアップレギュレーションである。メラノーマ細胞株を、Ｔ細胞との共培養の２４時間前に通常の培地又はＩＦＮγを含む培地で前処理した（ｎ＝３）。図８Ｄのグラフは、Ｍ２０２－ＩＦＮγ、Ｍ２０２＋ＩＧＮγ、Ｍ４８９－ＩＦＮγ、及びＭ４８９＋ＩＦＮγの４プレックスプロットである（各４プレックスの順序でＭ４８９－ＩＦＮγ及びＭ４８９＋ＩＦＮγが右の二つのバーである順序で示される）。
【図8E-8F】図８Ｅは、共培養後２４時間でのサイトカイン放出である（ｎ＝３）。図８Ｆは、共培養後の患者＃５からのＣＤ８＋ｎｅｏＴＣＲ＋Ｔ細胞における４－１ＢＢのアップレギュレーションである。メラノーマ細胞株を、Ｔ細胞との共培養の２４時間前に通常の培地又はＩＦＮγを含む培地で前処理した（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｎｅｏ１２、図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。図８Ｆのグラフは、Ｍ２０２－ＩＦＮγ、Ｍ２０２＋ＩＧＮγ、Ｍ４８９－ＩＦＮγ、及びＭ４８９＋ＩＦＮγの４プレックスプロットである（各４プレックスの順序でＭ４８９－ＩＦＮγ及びＭ４８９＋ＩＦＮγが右の二つのバーである順序で示される）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ｖｓ Ｍ２０２、図ｃにおける多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定。（ｎ）は生物学的複製物の数を示す。平均値±ＳＤが示される。全てのＴ細胞生成物は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋遺伝子編集Ｔ細胞を含む。
【0016】
【0017】
【0018】
【図11】図１１は、陰性対照（「Ｎｅｏ１２」）に曝露された場合、非応答患者からの腫瘍細胞（レジェンドに示される「自己腫瘍細胞」）が抗腫瘍因子／シグナル（４－１ＢＢ、Ｏｘ４０、Ｋｉ６７、ＩＮＦγ、ＴＮＦα、及びＣＤ１０７）のアップレギュレーションを誘発しないことを示している。しかし、非応答患者が自身の腫瘍ネオ抗原に基づいてデザインされたＮｅｏＴＣＲ生成物（「ＴＣＲ２１２」と呼ばれるＴＣＲ３６及び「ＴＣＲ２１３」と呼ばれるＴＣＲ３７）に曝露されると、抗腫瘍因子／シグナルがアップレギュレーションされ、発現した。異なる患者からの腫瘍細胞（ＴＣＲ２１２及びＴＣＲ２１３ ＮｅｏＴＣＲ生成物とミスマッチ）は追加の対照となり、抗腫瘍因子／シグナルのアップレギュレーションを示さなかった。
【0019】
【図12A-12B】図１２Ａ－１２Ｃは、ＮｅｏＴＣＲ生成物を作製するために使用できるＮｅｏＥＴＣＲカセットと遺伝子編集方法の例を示している。図１２Ａは、ネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクト（ｎｅｏＴＣＲ）をＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用される一般的なターゲティング戦略を表す概略図を示す。図１２Ｂ及び１２Ｃは、ＮｅｏＴＣＲをＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用されるネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクトのデザインを示し、カセットは、シグナル配列（「ＳＳ」）、プロテアーゼ切断部位（「Ｐ」）、及び２Ａペプチド（「２Ａ」）と共に示される。図１２Ｂは、標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ、上のパネル）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、切断部位は矢印で示される）、及びｎｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む環状プラスミドＨＲ鋳型（下のパネル）を示しており、これは、組み込み前は左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」と「ＲＨＡ」）間に位置している。
【発明を実施する形態】
【0020】
本開示は、ＮｅｏＴＣＲ生成物を、非応答患者を治療するために使用することができるという発見に基づいている。
【0021】
［定義］
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。
【0022】
ここに記載の発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを含むことが理解される。「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味しうる。
【0023】
ここで使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、値がどのように測定され又は決定されるかに、すなわち、測定系の制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、技術分野の慣行に従って、３又は３を超える標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に生物システム又はプロセスに関して、この用語は、値の一桁分以内、例えば、値の５倍以内又は２倍以内を意味しうる。
【0024】
ここで使用される「チェックポイント阻害剤」は、所定のタイプの免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）及びがん細胞のサブセットによって作製される所定のタンパク質をブロックするタイプの薬物を意味する。所定の免疫細胞及びがん細胞によって作製されるこのようなタンパク質は、免疫応答を抑えるのに役立ち、Ｔ細胞ががん細胞を殺すのを防ぎうる。従って、これらのタンパク質がチェックポイント阻害剤によってブロックされると、Ｔ細胞は所定のがん細胞を殺すことができる。チェックポイント阻害剤は免疫療法であり、該用語はここで使用される場合相互に排他的ではない。
【0025】
「がん」及び「腫瘍」という用語は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、「がん」又は「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。該用語は、更に、典型的には未制御の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を参照し又は記述するために使用される。がんは、限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、ファロピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器、尿管、尿道、子宮、及び膣、又はその組織若しくは細胞型から選択される器官を含む、様々な細胞型、組織、又は器官を罹患させうる。がんには、肉腫、癌腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが含まれる。がんの例には、限定されないが、ここに記載されているものが含まれる。「がん」又は「腫瘍」及び「増殖性障害」という用語は、ここで使用される場合、相互に排他的ではない。
【0026】
ここで使用される「ＣＴＬＡ－４結合剤」とは、ＣＴＬＡ－４に結合し、ＰＤ－１と、Ｂ７－１及び／又はＢ７－２などのその結合パートナーの一又は複数との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し、又は妨害する分子を意味する。幾つかの実施態様では、ＣＴＬＡ－４結合剤は、ＣＴＬＡ－４のその結合パートナーの一又は複数への結合を阻害する分子である。幾つかの実施態様では、ＣＴＬＡ－４結合剤は、ＣＴＬＡ－４のＢ７－１及び／又はＢ７－２への結合を阻害する。例えば、ＣＴＬＡ－４結合剤には、抗ＣＴＬＡ－４抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＣＴＬＡ－のＢ７－１及び／又はＢ７－２との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し、又は妨害する他の分子が含まれる。幾つかの実施態様では、ＣＴＬＡ－４結合剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。特定の実施態様では、ＣＴＬＡ－４結合剤はイピリムマブである。
【0027】
ここで使用される「デキストラマー」は、その同族ＮｅｏＴＣＲに特異的に結合する多量体化されたネオエピトープ－ＨＬＡ複合体を意味する。
【0028】
ここで使用される「内因性」は、通常は、細胞又は組織において発現される核酸分子又はポリペプチドを指す。
【0029】
ここで使用される「外因性」は、細胞内に内因的には存在しない核酸分子又はポリペプチドを指す。従って、「外因性」という用語は、外来、異種、及び過剰発現された核酸分子及びポリペプチドなど、細胞内で発現される任意の組み換え核酸分子又はポリペプチドを包含するであろう。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞に存在しない核酸を意味する；例えば、外因性核酸は、配列、位置（position）／位置（location）、又はその両方によって内因性の対応物とは異なりうる。明確にするために、外因性核酸は、その天然の内因性対応物と比較して同じ又は異なる配列を有しうる；それは、遺伝子工学によって細胞自体又はその前駆細胞に導入され得、任意選択的に、非天然プロモーター又は分泌配列などの代替制御配列に連結されうる。
【0030】
ここで使用される「免疫療法」又は「がん免疫療法」は、免疫系を活性化又は抑制することによってがんなどの疾患を治療するようにデザインされた治療法を意味する。免疫療法は、免疫応答を誘発させ若しくは増幅させ（すなわち、活性化免疫療法）、又は免疫応答を低減させ若しくは抑制するように（すなわち、抑制免疫療法）デザインすることができる。チェックポイント阻害剤は免疫療法であり、該用語はここで使用される場合は相互に排他的ではない。
【0031】
「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」は、例えば、体細胞変異から生じ、「非自己」として認識される、新しく形成された抗原決定基を指す。「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」を生じさせる変異には、フレームシフト又は非フレームシフトインデル、ミスセンス又はナンセンス置換、スプライス部位変化（例えば、選択的スプライシングされた転写物）、ゲノム再編成又は遺伝子融合、何らかのゲノム又は発現変化、又は何らかの翻訳後修飾が含まれうる。
【0032】
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ」は、例えば、遺伝子編集法によってＴ細胞中に導入されるネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を意味する。ここで使用される場合、「ＴＣＲ遺伝子配列」という用語は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子配列を指す。
【0033】
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ細胞」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲを発現するように精密改変された一又は複数の細胞を意味する。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。所定の実施態様では、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が投与される患者からの自己細胞である。「ＮｅｏＴＣＲ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１ Ｔ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１細胞」という用語は、ここでは交換可能に使用される。幾つかの実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ細胞は、例えば、Ｔ細胞のゲノムに、如何なる外因性ＤＮＡ配列も含まない。
【0034】
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ生成物」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む薬学的製剤を意味する。ＮｅｏＴＣＲ生成物は、自己の精密ゲノム改変されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。標的ＤＮＡを介した非ウイルス精密ゲノム改変アプローチを使用して、内因性ＴＣＲの発現が排除され、腫瘍排他的ネオエピトープを標的とする末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離された患者特異的ＮｅｏＴＣＲによって置換される。所定の実施態様では、得られた改変ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、天然配列、天然発現レベル、及び天然ＴＣＲ機能のＮｅｏＴＣＲをその表面に発現する。ＮｅｏＴＣＲ外部結合ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの配列は、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離されたＴＣＲから未改変である。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子発現の調節は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子カセットがゲノムに組み込まれている場所の上流に位置する天然の内因性ＴＣＲプロモーターによって駆動される。このアプローチにより、ＮｅｏＴＣＲ発現の天然レベルが、未刺激の抗原活性化Ｔ細胞状態で観察される。幾つかの実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、例えば、Ｔ細胞のゲノムに、如何なる外因性ＤＮＡ配列も含まない。
【0035】
各患者向けに製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物は、その同じ患者の末梢血から個別に単離されたｎｅｏＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からクローン化された単一のネオエピトープ（ｎｅｏＥ）特異的ＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変された自己ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の定まった用量を表す。
【0036】
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物」は、ゲノム改変がウイルス媒介法を使用して実施されることを除き、ＮｅｏＴＣＲ生成物と同じ定義を有する。
【0037】
ここで使用される「非応答患者」は、それぞれの治療に応答しなかったため、あるいは最初は応答したが耐性を発現し、時間の経過と共にそれぞれの治療に対して応答を停止したか、応答の低下を示したため、がんがチェックポイント阻害剤及び／又は免疫療法に応答しないがん患者を指す。非応答患者には、チェックポイント阻害剤及び／又は免疫療法に対して応答がないか、部分的にしか応答しない患者が含まれる。
【0038】
「ＰＤ－１軸結合剤」という用語は、ＰＤ－１シグナル伝達軸でのシグナル伝達から生じるＴ細胞機能障害を除去するように、ＰＤ－１軸結合パートナーとその結合パートナーの一又は複数との相互作用を阻害し、その結果、Ｔ細胞機能（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞殺傷）を回復し又は増強する分子を指す。ここで使用される場合、ＰＤ－１軸結合剤という用語には、ＰＤ－１結合剤、ＰＤ－Ｌ１結合剤、及びＰＤ－Ｌ２結合剤が含まれる。
【0039】
「ＰＤ－１結合剤」という用語は、ＰＤ－１とその結合パートナーの一又は複数、例えばＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する分子を指す。幾つかの実施態様では、ＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１のその結合パートナーの一又は複数への結合を阻害する分子である。幾つかの実施態様では、ＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。例えば、ＰＤ－１結合剤には、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する他の分子が含まれる。幾つかの実施態様では、ＰＤ－１結合剤は、機能障害性Ｔ細胞をより機能障害にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ようにＰＤ－１を介したシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して負の共刺激シグナルを低減する。幾つかの実施態様では、ＰＤ－１結合剤は抗ＰＤ－１抗体である。特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はニボルマブである。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はペムブロリズマブである。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はセミプリマブである。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はピジリズマブである。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はＡＭＰ－２２４である。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はＭＥＤ１－０６８０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）である。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はスパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）である。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）である。別の特定の実施態様では、ＰＤ－１結合剤はＢＧＢ－１０８（ＢｅｉＧｅｎｅ）である。
【0040】
「ＰＤ－Ｌ１結合剤」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーの一又は複数、例えば、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する分子を指す。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１結合剤は、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１結合剤は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１結合剤には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－１、Ｂ７－１などのその結合パートナーの一又は複数とのＰＤ－Ｌ１の相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する他の分子が含まれる。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１結合剤は、機能障害性Ｔ細胞をより機能障害にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ようにＰＤ－Ｌ１を介したシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して負の共刺激シグナルを低減する。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ１結合剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。特定の実施態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブである。特定の実施態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアベルマブである。特定の実施態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はデュルバルマブである。別の特定の実施態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ）である。別の特定の実施態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＭＳＢ００１５７１８Ｃである。
【0041】
「ＰＤ－Ｌ２結合剤」という用語は、ＰＤ－Ｌ２とその結合パートナーの何れか一又は複数、例えばＰＤ－１との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する分子を指す。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ２結合剤は、ＰＤ－Ｌ２のその結合パートナーの一又は複数への結合を阻害する分子である。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ２結合剤は、ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を阻害する。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ２結合剤には、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１などの何れか一又は複数の結合パートナーとの相互作用から生じるシグナル伝達を減少させ、遮断し、阻害し、抑止し又は妨害する他の分子が含まれる。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ２結合剤は、機能障害性Ｔ細胞をより機能障害にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ようにＰＤ－Ｌ２を介したシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して負の共刺激シグナルを低減する。幾つかの実施態様では、ＰＤ－Ｌ２結合剤はイムノアドヘシンである。
【0042】
「薬学的製剤」は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態であり、製剤が投与される対象に許容できないほど毒性がある追加の成分を含まない調製物を指す。明確にするために、ＮｅｏＴＣＲ生成物において使用される量のＤＭＳＯは許容できないほど毒性があるとは考えられない。
【0043】
治療の目的での「対象」、「患者」、又は「個体」とは、ヒト、家畜及び農場動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等々を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0044】
ここで使用される「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を意味する。
【0045】
ここで使用される「ＴＩＭ３結合剤」は、ＴＩＭ３に結合し、ＴＩＭ３のガレクチン－９、ホスファチジルセリン、ＨＭＧＢ１、及びＣＥＡＣＡＭ１又はＴＩＭ－３に結合する別のタンパク質への結合をブロックする分子を意味する。
【0046】
「治療する（Treat）」、「治療（Treatment）」、及び「治療すること（treating）」は互換的に使用され、ここで使用される場合、臨床結果を含む有益な又は望ましい結果を得ることを意味する。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理的帰結の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明のＮｅｏＴＣＲ生成物は、増殖性障害（例えば、がん）の発症を遅らせるために、又はそのような疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0047】
ここで使用される「腫瘍抗原」は、正常又は非腫瘍性細胞と比較して腫瘍細胞上に独特に又は差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。所定の実施態様では、腫瘍抗原は、抗原認識受容体を介して免疫応答を活性化し又は誘導することができるか、あるいは受容体－リガンド結合を介して免疫応答を抑制することができる腫瘍によって発現される任意のポリペプチドを含む。
【0048】
「２Ａ」及び「２Ａペプチド」は、ここでは交換可能に使用され、真核細胞での翻訳中にペプチドの切断を媒介することができる１８－２２アミノ酸長のウイルスの自己切断型ペプチドのクラスを意味する。
【0049】
２Ａペプチドクラスの四種のよく知られたメンバーは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａである。Ｔ２Ａペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａにおいて最初に同定された。Ｐ２Ａペプチドは、ブタのテッショウウイルス－１ ２Ａで最初に同定された。Ｅ２Ａペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルスで最初に同定された。Ｆ２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルスで最初に同定された。
【0050】
２Ａペプチドの自己切断メカニズムは、リボソームが２ＡのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップした結果である。具体的には、２Ａペプチドは、立体障害の形成とリボソームスキッピングに必要なＣ末端保存配列を有している。リボソームスキッピングは、次の三つの選択肢の一つをもたらしうる：１）スキッピングが成功し、翻訳が再開し、二つの切断タンパク質（Ｃ末端プロリンを除く完全な２Ａペプチドに結合する２Ａタンパク質の上流とＮ末端で一つのプロリンに結合する２Ａタンパク質の下流）が生じ；２）スキッピングは成功するが、リボソームの脱落により翻訳が中断され、２Ａの上流のタンパク質のみが生じ；あるいは３）スキッピングが失敗し、翻訳が継続する（すなわち、融合タンパク質）。
【0051】
［ＮｅｏＴＣＲ生成物］
幾つかの実施態様では、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲは、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図１２Ａ－１２Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変された同じがん患者からの自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。言い換えれば、腫瘍特異的であるＮｅｏＴＣＲが、がん患者において同定され、ついでそのようなＮｅｏＴＣＲがクローン化され、ついでクローン化されたＮｅｏＴＣＲががん患者のＴ細胞に挿入される。次に、ＮｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞が、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持する形で増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１生成物（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）を生じる。幾つかの実施態様では、例えば、ここで提供される精密ゲノム改変の結果として、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、例えば、Ｔ細胞のゲノムに、如何なる外因性ＤＮＡ配列も含まない。
幾つかの実施態様では、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲは、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図１２Ａ－１２Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変された同じがん患者からの自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。言い換えれば、腫瘍特異的であるＮｅｏＴＣＲが、がん患者において同定され、ついでそのようなＮｅｏＴＣＲがクローン化され、ついでクローン化されたＮｅｏＴＣＲががん患者のＴ細胞に挿入される。次に、ＮｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞が、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持する形で増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１生成物（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）を生じる。幾つかの実施態様では、例えば、ここで提供される精密ゲノム改変の結果として、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、例えば、Ｔ細胞のゲノムに、如何なる外因性ＤＮＡ配列も含まない。
【0052】
これらの「幼若」又は「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、改善された生着能及び注入後の長期持続性を与えると記述される。従って、「幼若」Ｔ細胞表現型から有意に構成されるＮｅｏＴＣＲ生成物の投与は、生着可能性の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化を通して、身体全体の腫瘍細胞を根絶する利益をがん患者にもたらす可能性がある。
【0053】
エクスビボでの作用機序研究を、がん患者のＴ細胞で製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物でまた実施した。Ｔ細胞殺傷活性、増殖、及びサイトカイン産生の抗原特異性によって測定される、同等の遺伝子編集効率及び機能的活性が観察され、ここに記載の製造方法が、出発物質としてがん患者からのＴ細胞を用いて生成物を作製することに成功したことを実証している。
【0054】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物の製造方法は、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種のエレクトロポレーションを含み、各種がゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを各ゲノム遺伝子座にターゲティングする特異性は、以前に文献において高度に特異的であると記載されている。ＮｅｏＴＣＲ生成物の包括的な試験を、それぞれＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調査するインビトロ及びインシリコ分析で実施した。健康なドナーからの複数のＮｅｏＴＣＲ生成物又は同等の細胞生成物を、ディープシークエンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価し、選択されたヌクレアーゼが高度に特異的であるという公表された証拠を裏付けた。
【0055】
精密ゲノム改変法の更なる態様は、安全性について評価されている。精密ゲノム改変後のゲノム不安定性の証拠は、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）又は標準的ＦＩＳＨ細胞遺伝学による複数のＮｅｏＴＣＲ生成物の評価では見出されなかった。ＮｅｏＴＣＲ配列のゲノムへのオフターゲット組み込みはどこにも検出されなかった。細胞生成物にＣａｓ９が残っている証拠は見出されなかった。
【0056】
ＮｅｏＴＣＲ生成物と精密ゲノム改変法の包括的な評価は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が患者への注入後に十分に許容されることを示している。
【0057】
ここに記載のゲノム改変アプローチは、固形及び液性腫瘍を有する患者のための個別化された養子細胞治療法のための特注のＮｅｏＴＣＲ Ｔ細胞（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）の非常に効率的な作製を可能にする。更に、改変手法はＴ細胞での使用に限定されず、ナチュラルキラー細胞及び造血幹細胞を含む他の初代細胞型にも成功裡に適用されている。
【0058】
チェックポイント阻害剤に応答性の固形腫瘍は、より多い体細胞遺伝子変異数を抱える可能性が高く（腫瘍排他的ネオ抗原の発現をもたらし）、腫瘍はより高いＣＤ８ Ｔ細胞浸潤性を示し、及び／又は既存の高ＰＤ－Ｌ１腫瘍発現を示すことを示唆する証拠が増加している（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）。これらの特徴のそれぞれは、これらの腫瘍の内因性免疫原性の可能性が高いこと、つまり、その患者の免疫系が、チェックポイント阻害剤療法の開始前に有意なＴ細胞免疫応答を開始した可能性があることを表している（Ｌａｗｒｅｎｃｅ等，２０１３）；（Ｔｕｍｅｈ等，２０１４）；（Ｗａｒｇｏ等，２０１７）。腫瘍の次世代ディープシークエンシングの適用と内因性腫瘍標的Ｔ細胞応答の免疫学的分析は、がん免疫療法の利益、腫瘍遺伝子変異数、及びネオ抗原特異的Ｔ細胞の既存の集団の間の関係についての説得力のある証拠を提供した。これらの腫瘍排他的変異（ネオ抗原）を抱える腫瘍細胞を特異的に認識して殺傷するＴ細胞のネオ抗原特異的集団は、臨床的利益を引き起こす効果的ながん免疫療法の主要なメディエーターであると提案されている（Ｔｒａｎ等，２０１７）（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）。
【0059】
ネオエピトープを標的とする養子ＴＣＲ－Ｔ細胞療法は、上述の制限を克服する可能性がある。ＮｅｏＴＣＲ生成物は、患者の個人的な内因性Ｔ細胞がん免疫応答から同定され単離された天然配列の自己ＮｅｏＴＣＲで改変された新規の養子ＴＣＲ－Ｔ細胞療法である。がん病理の「ドライバー」変異を含む、各患者の創始者（トランカル）変異を最初は表す腫瘍特異的ゲノム変化は、数が増え、後期悪性腫瘍の「ブランチ」又は「パッセンジャー」変異として時間と共に多様化する。これらの蓄積された腫瘍特異的変異スペクトラムは、各がん患者における免疫認識のための標的の特有の個人シグネチャー（個人ネオ抗原）を表している。これらの個人及び腫瘍排他的ネオ抗原（ネオエピトープ又はｎｅｏＥ特異的Ｔ細胞）を標的とするＴ細胞は、これらの腫瘍特異的変異を発現しない健康な細胞を無視しながら、腫瘍細胞を排他的に標的にして殺傷する可能性がある。このように、各患者の免疫系は腫瘍に関与し、適切に活用される場合、適切に調整された内因性免疫応答が腫瘍を根絶することが示されている。
【0060】
全てのがんは根底にある創始者又はトランカル変異によって引き起こされるため、トランカルネオエピトープを標的とするＮｅｏＴＣＲ生成物は、あらゆるがん患者の治療の可能性がある。ＮｅｏＴＣＲ生成物の養子個別化細胞療法は、腫瘍排他的ネオ抗原（ｎｅｏＥ）を既に認識する天然に生じるＮｅｏＴＣＲを発現するように、個体自身のＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞を改変することを含む。従って、これらのＮｅｏＴＣＲは、既存の変異標的化ＣＤ８ Ｔ細胞に由来する天然配列であり、各患者における腫瘍排他的ｎｅｏＥ標的を認証する独自の単離技術によって末梢血からキャプチャーされる。製造方法では、同じ患者のロイコパックから新たに得られたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞が、「天然」自己Ｔ細胞機能を再構成し、選択プロセスを通して自己患者の予測される抗原との相互作用が検証されている形で一つのＮｅｏＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変される。従って、がんの参加者への臨床的利益は、エクスビボで改変された、腫瘍変異を標的とした自己ＮｅｏＴＣＲ細胞の単回投与から生じ、よって、一部は根治的治療の選択肢がない患者に迅速で持続性のある反応を引き起こす可能性を提供する。
【0061】
ＮｅｏＴＣＲ生成物の薬理学的評価により、ここに記載のエクスビボ製造方法を用いて産生されたＮｅｏＴＣＲ細胞は、同族ネオ抗原発現腫瘍細胞との接触で、強力な抗原特異的殺傷性、エフェクターサイトカイン分泌、及び増殖活性を有していることが実証された。更に、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、バルクＴ細胞及び単一細胞セクレトーム分析によって示されるように、強力な多機能エフェクタータンパク質分泌応答で標的腫瘍細胞に応答することが示されている。観察された多機能Ｔ細胞エフェクター表現型は、血液悪性腫瘍患者に注入された多機能ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察されるものと同様の形で、ＮｅｏＴＣＲ生成物をがん患者に注入した際の臨床的利益の可能性に寄与することが予測される。
【0062】
ＮｅｏＴＣＲ生成物は、ここに記載のエクスビボ製造方法の結果としてメモリー幹細胞（ＴＭＳＣ）及びセントラルメモリー（ＴＣＭ）Ｔ細胞表現型を含む。これらの「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、血液悪性腫瘍の患者の改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のマウスモデル及び臨床試験において、改善された生着能と注入後の長期持続性をもたらすと記載されている。従って、「より幼若の」Ｔ細胞表現型から有意になるＮｅｏＴＣＲ生成物の投与は、生着能の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化により、全身の腫瘍細胞を根絶することにより、がん患者に利益をもたらす可能性がある。
【0063】
がん患者からのＴ細胞で製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物を用いてエクスビボでの作用機序研究をまた実施した。Ｔ細胞殺傷活性、増殖、及びサイトカイン産生の抗原特異性によって測定される、同等の遺伝子編集効率及び機能的活性が観察され、ここに記載の製造方法が、出発物質としてがん患者由来のＴ細胞を用いて生成物を作製することに成功していることを証明している。
【0064】
ＮｅｏＴＣＲ生成物製造方法は、それぞれの種がゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種のエレクトロポレーションを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを各ゲノム遺伝子座にターゲティングする特異性は、以前に文献に高度に特異的であると記載されている。ＮｅｏＴＣＲ生成物の包括的試験をインビトロ及びインシリコ分析で実施し、ＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑをそれぞれ使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調査した。複数のＮｅｏＴＣＲ生成物と健康なドナーからの同等の細胞生成物を、ディープシークエンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価したが、選択されたヌクレアーゼが高度に特異的であるという公表された証拠を裏付けている。
【0065】
精密ゲノム改変法の更なる態様を安全性について評価した。標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）又は標準的ＦＩＳＨ細胞遺伝学による複数のＮｅｏＴＣＲ生成物の評価では、精密ゲノム改変後のゲノム不安定性の証拠は見出されなかった。ＮｅｏＴＣＲ配列のゲノムへのオフターゲット組み込みはどこにも検出されなかった。細胞生成物に残留Ｃａｓ９の証拠は見出されなかった。
【0066】
所定の実施態様では、化学療法プレコンディショニングレジメンが、ＮｅｏＴＣＲ生成物の投与の前に、非応答患者に施されうる。
【0067】
従って、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者のためのがん治療における新しい発展をもたらす。
【0068】
［チェックポイント阻害剤］
チェックポイント阻害剤は、がんの治療向けに過去数年にわたって承認されてきている；しかし、それらは費用がかかり、患者に毒性をもたらす場合があり、患者のがんの大部分がこれらのチェックポイント阻害剤に応答しない。例えば、メラノーマと肺がんの約２０－５０％が免疫療法に有意に応答するが、他のものは応答しない。
チェックポイント阻害剤は、がんの治療向けに過去数年にわたって承認されてきている；しかし、それらは費用がかかり、患者に毒性をもたらす場合があり、患者のがんの大部分がこれらのチェックポイント阻害剤に応答しない。例えば、メラノーマと肺がんの約２０－５０％が免疫療法に有意に応答するが、他のものは応答しない。
【0069】
更に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－２及びＰＤ－Ｌ２を標的とするチェックポイント阻害剤（「ＰＤ－１軸」及び「ＰＤ－１軸結合剤」）が広く探求されており、他のチェックポイント阻害剤と同様に、大部分のがんにおいて毒性と有効性の欠如に苦しんでいる（選択チェックポイント阻害剤での乳がんの臨床試験の要約について表１を参照のこと）。診断を使用して奏効率を予測することはできるが（例えば、治療前の腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１発現が、抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１療法に対する奏効率を予測するために使用されている）、ＰＤ－Ｌ１（＋）腫瘍の患者の大部分はＰＤ－１経路遮断には応答せず、奏効率を精確に予測する過去に開示された診断法は存在しない。
【0070】
ＰＤ－１軸結合剤に加えて、他のチェックポイント阻害剤は、同じ主要な制限（limitations-primarily）、毒性及び効力の欠如（無応答及び獲得耐性）を示す。チェックポイント阻害剤には、限定されないが、ＰＤ－１結合剤、ＰＤ－Ｌ１結合剤、ＰＤ－Ｌ２結合剤、ＣＴＬＡ－４結合剤、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ３）結合剤、Ｔリンパ球マーカー（限定されないが、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、ＴＩＭ－３（ここに記載）、Ｔ細胞活性化のＩｇサプレッサーを含むＶドメイン（ＶＩＳＴＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｂ７－Ｈ３、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ－Ｌ）、ＣＤ２７／ＣＤ７０を含む）、及びグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、マクロファージマーカー（限定されないが、ＣＤ４７／シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）及びインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を含む）、ナチュラルキラー細胞マーカー（限定されないが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ及びキラー免疫グロブリン様受容体ファミリー（ＫＩＲ）を含む）、並びに免疫系ががん細胞を殺傷し及び／又はがん細胞の増殖を止め若しくは遅らせるのを止めるタンパク質をブロックする他の薬剤が含まれる。
【0071】
所定のＰＤ－１軸結合剤には、限定されないが、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、並びにＰＤ－１に結合する他のモノクローナル抗体が含まれる。所定のＰＤ－Ｌ１軸結合剤には、限定されないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、並びにＰＤ－Ｌ１に結合するその他のモノクローナル抗体が含まれる。ここで検討されるように、これらの薬剤の一つの制約は、免疫系が患者の幾つかの正常細胞及び器官を攻撃することを可能にし、それが深刻な副作用をもたらすことが示されていることである。これらの薬剤の追加の副作用には、限定されないが、肺、腸、肝臓、腎臓、ホルモン産生腺、又は他の器官の深刻な問題が含まれる。
【0072】
所定のＣＴＬＡ－４結合剤には、イピリムマブ並びにＣＴＬＡ－４に結合する他のモノクローナル抗体が含まれる。ＰＤ－１軸結合剤と同様に、ＣＴＬＡ－４結合剤は、深刻で生命を脅かす副作用を引き起こし、全てのがん及びがんを患う全ての患者の治療に効果的である訳ではない。
【0073】
所定のＴＩＭ－３結合剤には、ＴＩＭ－３に結合するモノクローナル抗体が含まれる。ＰＤ－１軸結合剤と同様に、ＴＩＭ－３結合剤は、深刻で生命を脅かす副作用を引き起こす場合があり、全てのがん及びがんを患う全ての患者の治療に効果的である訳ではない。
【0074】
治療に応答しないか（無応答又は部分応答）又は治療に対する獲得耐性を構築する（すなわち、集合的に、非応答患者）ためにチェックポイント阻害剤に応答しないがん（及びがんを有する患者）を治療するための治療法が必要であることは明らかである。更に、応答（例えば、全奏効率（ＯＲＲ）及び全生存（ＯＳ）率）を増強しかつ改善するための治療法がまた必要である。
【0075】
従って、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者のためのがん治療法の新しい発展をもたらす。
【0076】
［がん免疫療法］
がん免疫療法、すなわち、チェックポイント阻害剤が分類されるより広いクラスの治療法は、がんの治療のためにここ数年にわたって承認されてきている；しかし、それらは費用がかかり、患者に毒性をもたらす可能性があり、患者のがんの大部分がこれらのチェックポイント阻害剤に応答しない。例えば、がん免疫療法には、限定されないが、ここに記載のチェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ療法、がんワクチン、及びサイトカイン療法（すなわち、薬学的製剤に製剤化されるサイトカイン及び修飾体、誘導体、及びそれらの融合タンパク質）が含まれる。腫瘍のおよそ６０－７０％が単剤チェックポイント阻害剤に応答せず、チェックポイント阻害剤に応答する腫瘍を有している患者は時間の経過と共に耐性になる（Ｙａｎ等，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０８；９：１７３９）。
がん免疫療法、すなわち、チェックポイント阻害剤が分類されるより広いクラスの治療法は、がんの治療のためにここ数年にわたって承認されてきている；しかし、それらは費用がかかり、患者に毒性をもたらす可能性があり、患者のがんの大部分がこれらのチェックポイント阻害剤に応答しない。例えば、がん免疫療法には、限定されないが、ここに記載のチェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ療法、がんワクチン、及びサイトカイン療法（すなわち、薬学的製剤に製剤化されるサイトカイン及び修飾体、誘導体、及びそれらの融合タンパク質）が含まれる。腫瘍のおよそ６０－７０％が単剤チェックポイント阻害剤に応答せず、チェックポイント阻害剤に応答する腫瘍を有している患者は時間の経過と共に耐性になる（Ｙａｎ等，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０８；９：１７３９）。
【0077】
がん免疫療法の低い奏効率と高い耐性率に基づいて、治療に応答しないか（無応答又は部分応答）又は治療に対する獲得耐性を構築する（すなわち、集合的に、非応答患者）ために免疫療法に応答しないがん（及びがんを有する患者）を治療するための治療法が必要であることは明らかである。更に、応答（例えば、全奏効率（ＯＲＲ）及び全生存（ＯＳ）率）を増強しかつ改善するための治療法がまた必要である。
【0078】
従って、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者のためのがん治療法における新しい発展をもたらす。
【0079】
［遺伝子編集法］
所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞を改変する方法、例えば、改変されたＴ細胞又は改変されたヒト幹細胞を含む。所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＨＳＣに由来する細胞、又は樹状／抗原提示細胞を改変する方法を含む。所定の実施態様では、そのような改変はゲノム編集を含む。例えば、限定ではないが、そのようなゲノム編集は、一又は複数の内因性遺伝子座、例えば、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を標的とするヌクレアーゼを用いて達成することができる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、内因性標的配列に一本鎖ＤＮＡニック又は二本鎖ＤＮＡ切断を生成しうる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ゲノムのコーディング部分又は非コーディング部分、例えば、エクソン、イントロンを標的としうる。所定の実施態様では、ここで考えられるヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、切断活性の効率を高めるために、例えば、アミノ酸置換及び／又は欠失の導入により、それ自体が改変されうる。
所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞を改変する方法、例えば、改変されたＴ細胞又は改変されたヒト幹細胞を含む。所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＨＳＣに由来する細胞、又は樹状／抗原提示細胞を改変する方法を含む。所定の実施態様では、そのような改変はゲノム編集を含む。例えば、限定ではないが、そのようなゲノム編集は、一又は複数の内因性遺伝子座、例えば、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を標的とするヌクレアーゼを用いて達成することができる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、内因性標的配列に一本鎖ＤＮＡニック又は二本鎖ＤＮＡ切断を生成しうる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ゲノムのコーディング部分又は非コーディング部分、例えば、エクソン、イントロンを標的としうる。所定の実施態様では、ここで考えられるヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、切断活性の効率を高めるために、例えば、アミノ酸置換及び／又は欠失の導入により、それ自体が改変されうる。
【0080】
所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が、ヒト細胞を改変するために使用される。所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼと、Ｃａｓヌクレアーゼを内因性標的配列に動員する一又は複数のＲＮＡ、例えば、単一のガイドＲＮＡとを含む。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼとＲＮＡは、例えば、異なるベクター又は組成物を使用して別々に、又は例えば、ポリシストロニックコンストラクト又は単一タンパク質－ＲＮＡ複合体で一緒に、細胞に導入される。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９又はＣａｓ１２ａである。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、限定されないが、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）又は髄膜炎菌（Neisseria menengitidis）を含む細菌種から得られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の追加の例は当該技術分野で知られている。それが教示する全てについて出典明示によりここに援用される、Ａｄｌｉ，Ｍａｚｈａｒ．“Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．”Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ．９，１ １９１１（２０１８）を参照のこと。
【0081】
所定の実施態様では、ゲノム編集は、免疫応答を調節する一又は複数のゲノム遺伝子座で行われる。所定の実施態様では、遺伝子座には、限定されないが、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座、ＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）、及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）が含まれる。
【0082】
所定の実施態様では、ゲノム編集は、非ウイルス送達系を使用して実施される。例えば、リポフェクションの存在下での核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入し、その後、細胞（又はその子孫）を標的組織に注入するか、又は全身的に注入することによって達成されうる。
【0083】
所定の実施態様では、ゲノム編集は、ウイルス送達系を使用して実施される。所定の実施態様では、ウイルス法には、標的組み込み（限定されないが、ＡＡＶを含む）とランダム組み込み（限定されないが、レンチウイルスアプローチを含む）が含まれる。所定の実施態様では、ウイルス送達は、ヌクレアーゼの組み込みなしに達成されるであろう。そのような実施態様では、ウイルス送達系は、Ｌｅｎｔｉｆｌａｓｈ又は別の同様の送達系でありうる。
【0084】
［相同組み換え鋳型］
所定の実施態様では、本開示は、相同組み換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞の内因性遺伝子座に導入して組み換えることにより、細胞のゲノム編集をもたらす。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は直鎖状である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は環状である。所定の実施態様では、環状ＨＲ鋳型は、プラスミド、ミニサークル、又はナノプラスミドでありうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームを含む。所定の実施態様では、相同性アームは、約３００塩基から約２０００塩基でありうる。例えば、各相同性アームは１０００塩基でありうる。所定の実施態様では、相同性アームは、細胞の第一の内因性配列及び第二の内因性配列に相同でありうる。所定の実施態様では、内因性遺伝子座はＴＣＲ遺伝子座である。例えば、第一の内因性配列及び第二の内因性配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子座又はＴＣＲベータ遺伝子座内にある。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はＴＣＲ遺伝子配列を含む。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は腫瘍特異的である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、その内容が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７に記載された方法を使用して同定され取得されうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲアルファ遺伝子配列とＴＣＲベータ遺伝子配列を含む。
所定の実施態様では、本開示は、相同組み換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞の内因性遺伝子座に導入して組み換えることにより、細胞のゲノム編集をもたらす。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は直鎖状である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は環状である。所定の実施態様では、環状ＨＲ鋳型は、プラスミド、ミニサークル、又はナノプラスミドでありうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームを含む。所定の実施態様では、相同性アームは、約３００塩基から約２０００塩基でありうる。例えば、各相同性アームは１０００塩基でありうる。所定の実施態様では、相同性アームは、細胞の第一の内因性配列及び第二の内因性配列に相同でありうる。所定の実施態様では、内因性遺伝子座はＴＣＲ遺伝子座である。例えば、第一の内因性配列及び第二の内因性配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子座又はＴＣＲベータ遺伝子座内にある。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はＴＣＲ遺伝子配列を含む。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、患者特異的ＴＣＲ遺伝子配列である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は腫瘍特異的である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、その内容が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７に記載された方法を使用して同定され取得されうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲアルファ遺伝子配列とＴＣＲベータ遺伝子配列を含む。
【0085】
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はポリシストロニックポリヌクレオチドである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、可動性ポリペプチド配列をコードする配列（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は２Ａペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ）を含む。ＨＲ鋳型核酸及びその細胞を改変する方法に関する追加の情報は、その内容が出典明示によりここに援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８２３０号に見出すことができる。
【0086】
［治療方法］
ここに開示されるＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者を治療するために使用することができる。
ここに開示されるＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者を治療するために使用することができる。
【0087】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者に、そのような患者が以前にチェックポイント阻害剤で治療された後に、投与することができる。
【0088】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、チェックポイント阻害剤未経験の非応答患者に投与することができる。
【0089】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、チェックポイント阻害剤と同時に非応答患者に投与することができる。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、チェックポイント阻害剤と共に逐次的に非応答患者に投与されうる。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ抗体である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はイピリムマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はニボルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はセミプリマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ１結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はアテゾリズマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はアベルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はデュルバルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ２結合剤である。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、標準治療である任意の他の化学療法剤、又は疾患、年齢、病歴、及び医師が考慮するその他の要因などの要因に基づいてそのような患者を治療するための他の許容可能な薬剤と組み合わせて、非応答患者に投与することができる。
【0090】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者に、そのような患者が以前に免疫療法で治療された後に、投与することができる。
【0091】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、免疫療法と同時に非応答患者に投与することができる。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、免疫療法と共に逐次的に非応答患者に投与することができる。所定の実施態様では、免疫療法はがんワクチンである。所定の実施態様では、免疫療法は、サイトカイン療法（すなわち、薬学的製剤に製剤化されるサイトカイン及び修飾体、誘導体、及びそれらの融合タンパク質）である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮｅｏＴＣＲ生成物以外の細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法はインターフェロンである。所定の実施態様では、免疫療法はインターロイキンである。所定の実施態様では、免疫療法は、腫瘍溶解性ウイルス療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮＫ細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮｅｏＴＣＲ生成物以外のＴ細胞療法である。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、標準治療である任意の他の化学療法剤、又は疾患、年齢、病歴、及び医師が考慮するその他の要因などの要因に基づいてそのような患者を治療するための他の許容可能な薬剤と組み合わせて、非応答患者に投与することができる。
【0092】
所定の実施態様では、有効量のＮｅｏＴＣＲ生成物は、ＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、単回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、複数回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、二回以上の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、二回の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、三回の投与でＩＶ投与により送達される。
【0093】
がんの非限定的な例には、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽頭がん、メラノーマ、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫、及び様々な癌腫（前立腺がん及び小細胞肺がんを含む）が含まれる。適切な癌腫には、限定されないが、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨肉腫、膵管腺癌、小細胞及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮がん、気管支肺胞がん、上皮腺癌、及びそれらの肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞腫、胆管細胞がん、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、基底細胞がん、汗腺がん、乳頭がん、皮脂腺がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び重鎖病、乳房腫瘍、例えば乳管及び小葉腺癌、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌、子宮及び卵巣上皮がん、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びびまん性）形質細胞腫、急性及び慢性白血病、悪性メラノーマ、軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫を含む腫瘍学の分野で知られている任意のものが更に含まれる。所定の実施態様では、新生物は、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、及び咽頭がんから選択される。所定の実施態様では、本開示の幼若Ｔ細胞及びそれを含む組成物は、一般的な治療的介入が受け入れられない血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）又は卵巣がんを治療し及び／又は予防するために使用することができる。
【0094】
所定の実施態様では、新生物は固形がん又は固形腫瘍である。所定の実施態様では、固形腫瘍又は固形がんは、神経膠芽腫、前立腺腺癌、腎臓乳頭細胞がん、肉腫、卵巣がん、膵臓腺癌、直腸腺癌、結腸腺癌、食道がん、子宮体部類内膜がん、乳がん、皮膚メラノーマ、肺腺癌、胃腺癌、頸部及び子宮頸部がん、腎臓明細胞がん、精巣胚細胞腫瘍、及び侵攻性Ｂ細胞リンパ腫から選択される。
【0095】
対象は、進行形態の疾患を有する可能性があり、その場合、治療目的は、疾患進行の緩和又は逆転、及び／又は副作用の改善を含みうる。対象は、既に治療された状態の病歴を有する可能性があり、その場合、治療目的は、典型的には、再発のリスクの減少又は遅延を含むであろう。
【0096】
治療に適したヒト対象は、典型的には、臨床基準によって区別することができる二種の治療群を含む。「進行した疾患」又は「高腫瘍負荷」の対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍量に基づいて検出できる腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、超音波検査、マンモグラム、又はＸ線による；陽性の生化学的又は病理組織マーカーだけでは、この集団を特定するには不十分である）。薬学的組成物は、これらの対象に、その状態を緩和する目的で、抗腫瘍応答を誘発するために投与される。理想的には、結果として腫瘍量の減少が起こるが、何らかの臨床的改善が利点を構成する。臨床的改善には、進行のリスク又は速度の低下あるいは腫瘍の病理的帰結の低下が含まれる。
【0097】
［組成物及び製造品］
ＮｅｏＴＣＲ生成物は、製造品と組み合わせて使用されうる。そのような製造品は、増殖性障害（例えば、がん）の予防又は治療に有用でありうる。製造品の例には、限定されないが、容器（例えば、注入バッグ、ボトル、貯蔵容器、フラスコ、バイアル、注射器、チューブ、及びＩＶ溶液バッグ）、及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書が含まれる。容器は、ＮｅｏＴＣＲ生成物内のＮｅｏＴＣＲ細胞の貯蔵及び保存に受け入れられる任意の材料で作製されうる。所定の実施態様では、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルでありうる。例えば、容器は、ＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグでありうる。ラベル又は添付文書は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が、選択された状態及び端緒の患者を治療するために使用されることを示している。ＮｅｏＴＣＲ生成物は自己細胞から作製され、患者特異的な個別化された治療剤として設計されているため、患者はＮｅｏＴＣＲ生成物の容器上で特定される。
ＮｅｏＴＣＲ生成物は、製造品と組み合わせて使用されうる。そのような製造品は、増殖性障害（例えば、がん）の予防又は治療に有用でありうる。製造品の例には、限定されないが、容器（例えば、注入バッグ、ボトル、貯蔵容器、フラスコ、バイアル、注射器、チューブ、及びＩＶ溶液バッグ）、及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書が含まれる。容器は、ＮｅｏＴＣＲ生成物内のＮｅｏＴＣＲ細胞の貯蔵及び保存に受け入れられる任意の材料で作製されうる。所定の実施態様では、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルでありうる。例えば、容器は、ＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグでありうる。ラベル又は添付文書は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が、選択された状態及び端緒の患者を治療するために使用されることを示している。ＮｅｏＴＣＲ生成物は自己細胞から作製され、患者特異的な個別化された治療剤として設計されているため、患者はＮｅｏＴＣＲ生成物の容器上で特定される。
【0098】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器を含みうる。
【0099】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）第一の容器と同じＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。場合によっては、第一の容器及び第二の容器と同じＮｅｏＴＣＲ生成物を含む追加の容器が準備され作製されうる。場合によっては、異なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む組成物を含む追加の容器がまた、上述の容器と組み合わせられうる。
【0100】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
【0101】
製造品は、１）二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
【0102】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）場合によっては、組成物がその中に含まれる第三の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第三の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一及び第二のＮｅｏＴＣＲ生成物は異なるＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一及び第二のＮｅｏＴＣＲ生成物は同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。
【0103】
製造品は、１）三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
【0104】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては、組成物がその中に含まれる第四の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第四の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二及び第三のＮｅｏＴＣＲ生成物は異なるＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一、第二及び第三のＮｅｏＴＣＲ生成物は同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、及び第三のＮｅｏＴＣＲ生成物の二つが同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。
【0105】
製造品は、１）四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
【0106】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては、組成物がその中に含まれる第五の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第五の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二、第三、及び第四のＮｅｏＴＣＲ生成物は、異なるＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、及び第四のＮｅｏＴＣＲ生成物は、同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、及び第四のＮｅｏＴＣＲ生成物のうち二つが同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、及び第四のＮｅｏＴＣＲ生成物のうち三つが同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。
【0107】
製造品は、１）五以上のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
【0108】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第四の容器；５）第五のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第五の容器；６）場合によっては、第六以上のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第六以上の追加の容器；及び７）場合によっては、組成物がその中に含まれる追加の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、追加の容器を含みうる。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物の容器の全てが、異なるＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物の容器の全てが、同じＮｅｏＴＣＲ生成物である。所定の実施態様では、患者の腫瘍サンプル中の検出可能なＮｅｏＴＣＲの利用可能性、患者に対する複数のＮｅｏＴＣＲ生成物の必要性及び／又は要望、及び一又は複数の容器を必要としうるかそれから利益を得うる何れか一のＮｅｏＴＣＲ生成物の利用可能性に基づいて、五以上の容器内に同じ又は異なるＮｅｏＴＣＲ生成物の任意の組み合わせが存在しうる。
【0109】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器を含みうる。
【0110】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては第四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第四の容器を含みうる。
【0111】
製造品は、１）ＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては第五のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第五の容器を含みうる。
【0112】
製造品は、一のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、三のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、四のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、五のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる容器を含みうる。
【0113】
製造品は、１）一のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。製造品は、１）二のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）一のＮｅｏＴＣＲ生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。上の例において、一又は複数の追加のＮｅｏＴＣＲ生成物を含む第三及び／又は第四の容器が製造品に含まれうる。加えて、一又は複数の追加のＮｅｏＴＣＲ生成物を含む第五の容器が製造品に含まれうる。
【0114】
更に、ここに記載のＮｅｏＴＣＲ生成物の任意の容器は、複数の投与時点のために、及び／又は患者のための適切な用量に基づいて、二、三、又は四の別個の容器に分割できる。
【0115】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物はキットで提供される。キットには、非限定的な例として、添付文書、ラベル、ＮｅｏＴＣＲ生成物の使用説明書、注射器、廃棄説明書、投与説明書、チューブ、針、及びＮｅｏＴＣＲ生成物を適切に管理するために臨床医が必要とするその他のものを含めることができる。
【0116】
非応答患者を治療するために使用される、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲ生成物は、その使用のための薬学的製剤に製剤化される。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。
【0117】
所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、以前にチェックポイント阻害剤による治療を受けた非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、チェックポイント阻害剤未経験の非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、チェックポイント阻害剤による治療を同時に受ける非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、チェックポイント阻害剤による治療を逐次的に受ける非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。
【0118】
所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、以前に免疫療法による治療を受けた非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、免疫療法に未経験である非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、免疫療法と同時に治療を受ける非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。所定の実施態様では、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物のラベルは、免疫療法による治療を逐次的に受ける非応答患者を治療するためのインストラクションを提供する。
【0119】
また提供されるのは、患者におけるがんを治療する方法である。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従って、チェックポイント阻害剤に対する非応答者として患者を特定することと、ＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従ってチェックポイント阻害剤に対する非応答者として患者を特定することと、患者がチェックポイント阻害剤未経験である場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従ってチェックポイント阻害剤に対する非応答者として患者を特定することと、患者が以前にチェックポイント阻害剤を投与された場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従ってチェックポイント阻害剤に対する非応答者として患者を特定することと、患者が現在チェックポイント阻害剤による治療を受けている場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ抗体である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はイピリムマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１軸結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－１結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はペムブロリズマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はニボルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はセミプリマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ１結合剤である。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はアテゾリズマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はアベルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はデュルバルマブである。所定の実施態様では、チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ２結合剤である。
【0120】
また提供されるのは、ＮｅｏＴＣＲ生成物と場合によっては免疫療法を用いて患者におけるがんを治療する方法である。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従って免疫療法に対する非応答者として患者を特定することと、ＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従って免疫療法に対する非応答者として患者を特定することと、患者が免疫療法に未経験である場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従って免疫療法に対する非応答者として患者を特定することと、患者が以前に免疫療法を受けたことがある場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、この方法は、当該技術分野で知られている方法に従って免疫療法に対する非応答者として患者を特定することと、患者が現在免疫療法による治療を受けている場合はＮｅｏＴＣＲ生成物で患者を治療することとを含む。所定の実施態様では、免疫療法はがんワクチンである。所定の実施態様では、免疫療法は、サイトカイン療法（すなわち、薬学的製剤に製剤化されるサイトカイン及び修飾体、誘導体、及びそれらの融合タンパク質）である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮｅｏＴＣＲ生成物以外の細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法はインターフェロンである。所定の実施態様では、免疫療法はインターロイキンである。所定の実施態様では、免疫療法は、腫瘍溶解性ウイルス療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮＫ細胞療法である。所定の実施態様では、免疫療法は、ＮｅｏＴＣＲ生成物以外のＴ細胞療法である。所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、標準治療である任意の他の化学療法剤、あるいは疾患、年齢、病歴、及び医師が考慮するその他の要因などの要因に基づいてそのような患者を治療するために許容可能な薬剤などと組み合わせて、非応答患者に投与することができる。
【0121】
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物は、免疫療法に応答しなかった非応答患者を治療するためのインストラクションを含むキットで提供される。
【0122】
［治療用組成物及び製造方法］
ここに記載されるように、ＮｅｏＴＣＲ生成物の優良製造規範（ＧＭＰ）製造のためのプラスミドＤＮＡ媒介精密ゲノム改変法を開発した。患者特異的ｎｅｏＴＣＲの標的組み込みを、プラスミドＤＮＡによってコードされた、個別化されたｎｅｏＴＣＲ遺伝子カセットと共にＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）で電気穿孔することによって、達成した。ｎｅｏＴＣＲに加えて、ＮｅｏＴＣＲコンストラクトを、それらをｎｅｏＴＣＲベクターに組み込んだ後、上記のようにＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）で電気穿孔することにより挿入した。
ここに記載されるように、ＮｅｏＴＣＲ生成物の優良製造規範（ＧＭＰ）製造のためのプラスミドＤＮＡ媒介精密ゲノム改変法を開発した。患者特異的ｎｅｏＴＣＲの標的組み込みを、プラスミドＤＮＡによってコードされた、個別化されたｎｅｏＴＣＲ遺伝子カセットと共にＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）で電気穿孔することによって、達成した。ｎｅｏＴＣＲに加えて、ＮｅｏＴＣＲコンストラクトを、それらをｎｅｏＴＣＲベクターに組み込んだ後、上記のようにＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボ核タンパク質（ＲＮＰ）で電気穿孔することにより挿入した。
【0123】
ＮｅｏＴＣＲ生成物は、臨床製造方法を使用して医薬品に製剤化されうる。この方法では、ＮｅｏＴＣＲ生成物はＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグで凍結保存される。患者の必要性に応じて、一又は複数のバッグが各患者のために現場に出荷されうる。この生成物は、その患者の腫瘍細胞の表面に排他的に提示される内因性ＨＬＡ受容体の一つと複合体を形成したネオエピトープを標的とする一又は複数の自己ｎｅｏＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変されている、アフェレーシス由来の患者自己ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞で構成されている。
【0124】
最終生成物は、５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン、及びＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅを含むであろう。最終細胞生成物は、全有核ＮｅｏＴＣＲ細胞（ｃＧＭＰ製造）、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（ＵＳＰ）、０．０２－０．０８Ｍのカプリル酸ナトリウム及びトリプトファン酸ナトリウム（ＵＳＰ）中のＨＡＳ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（ＵＳＰ等級材料でｃＧＭＰ製造）を含むであろう。
【0125】
［組成物及びベクター］
本開示の主題は、ここに開示される細胞（例えば、免疫応答性細胞）を含む組成物を提供する。
本開示の主題は、ここに開示される細胞（例えば、免疫応答性細胞）を含む組成物を提供する。
【0126】
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。所定の実施態様では、ここに開示される核酸組成物は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含む。また提供されるのは、そのような核酸組成物を含む細胞である。
【0127】
所定の実施態様では、核酸組成物は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲに作用可能に連結されているプロモーターを更に含む。所定の実施態様では、核酸組成物はここに開示されるＮｅｏＴＣＲコンストラクトに作用可能に連結されているプロモーターを更に含む。
【0128】
所定の実施態様では、プロモーターは内因性又は外因性である。所定の実施態様では、外因性プロモーターは、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター及びメタロチオネインプロモーターから選択される。所定の実施態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。所定の実施態様では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－１２プロモーター、ｐ４０プロモーター、及びＢｃｌ－ｘＬプロモーターから選択される。
【0129】
組成物及び核酸組成物は、当該技術分野で知られている方法によって又はここに記載されるように、対象に投与され、及び／又は細胞に送達されうる。細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡコンストラクトで実質的に均質な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。所定の実施態様では、ＤＮＡコンストラクトを細胞に導入するために、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの何れか）が用いられる。非ウイルスベクターもまた使用されうる。
【0130】
可能な形質導入方法には、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ等（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による、プロデューサー細胞との細胞の直接共培養、あるいは例えば、Ｘｕ等（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３－２３０；及びＨｕｇｈｅｓ等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、ウイルス上清のみ、又は適切な成長因子及びポリカチオンを含むか又は含まない濃縮ベクターストックを用いた培養がまた含まれる。
【0131】
他の形質導入ウイルスベクターを使用して細胞を改変することができる。所定の実施態様では、選択ベクターは、高い感染効率と安定した組み込み及び発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ等，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照のこと）。使用できる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルスが含まれる（また、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ等，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ，１９９５のベクターを参照）。レトロウイルスベクターは特に十分に開発されており、臨床現場で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ等，米国特許第５３９９３４６号）。
【0132】
非ウイルスアプローチをまた細胞の遺伝子改変に用いることができる。例えば、リポフェクションの存在下での核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を投与することにより、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入し、その後、細胞（又はその子孫）を標的組織に注入するか、又は全身的に注入することによって達成することができる。
【0133】
ポリヌクレオチド治療法は、任意の適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から方向付けられ、任意の適切な哺乳動物調節エレメント又はイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節されうる。例えば、所望されるならば、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に方向付けることが知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を方向付けることができる。使用されるエンハンサーには、限定されないが、組織特異的又は細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが含まれうる。あるいは、ゲノムクローンが治療用コンストラクトとして使用される場合、調節は、同族調節配列によって、又は所望されるならば、上記のプロモーター又は調節エレメントの何れかを含む異種源由来の調節配列によって媒介されうる。
【0134】
得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。
【0135】
［キット］
本開示の主題は、対象における免疫応答を誘導し、及び／又は増強し、及び／又はがん若しくは病原体感染を治療し、及び／又は予防するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、有効量の本開示の細胞又はそれを含む薬学的組成物を含む。所定の実施態様では、キットは滅菌容器を含み；そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で知られている他の適切な容器形態でありうる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに適した他の材料で作製されうる。所定の非限定的な実施態様では、キットは、本開示のＨＲ鋳型をコードする単離された核酸分子を含む。
本開示の主題は、対象における免疫応答を誘導し、及び／又は増強し、及び／又はがん若しくは病原体感染を治療し、及び／又は予防するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、有効量の本開示の細胞又はそれを含む薬学的組成物を含む。所定の実施態様では、キットは滅菌容器を含み；そのような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で知られている他の適切な容器形態でありうる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに適した他の材料で作製されうる。所定の非限定的な実施態様では、キットは、本開示のＨＲ鋳型をコードする単離された核酸分子を含む。
【0136】
所望されるならば、細胞及び／又は核酸分子は、がん又は病原体又は免疫不全を有するか又は発症するリスクのある対象に細胞又は核酸分子を投与するためのインストラクションと共に提供される。インストラクションは一般にがん又は病原体感染の治療及び／又は予防のための組成物の使用に関する情報を含む。所定の実施態様では、インストラクションは、次のうちの少なくとも一を含む：治療薬の説明；新生物、病原体感染、又は免疫不全あるいはそれらの症状の治療又は予防のための投与スケジュール及び投与；注意；警告；適応症；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；及び／又は参考文献。インストラクションは、容器（存在する場合）に直接に印刷され、又は容器に貼付されるラベルとして、又は容器内に若しくは容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カード、又はフォルダーとして印刷されうる。得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。
【0137】
ここに開示される実施態様の範囲から逸脱することなく、適切な均等物を使用して、ここに記載される方法の他の適切な変更及び適応化を行うことができることは、当業者なら直ぐに分かるであろう。ここで所定の実施態様を詳細に説明したが、例示のみを目的として含まれ、限定を意図するものではない、次の実施例を参照することにより、実施態様はより明確に理解されるであろう。本開示の範囲は、前述の明細書ではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって示され、従って、特許請求の範囲の意義及び均等の範囲内に入るあらゆる変更がここに含まれることが意図される。
【実施例】
【0138】
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供した一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様を実施できることが理解される。
【0139】
実施例１：材料と方法
患者、検体収集及び応答評価。 抗ＰＤ－１療法を単独で又は他の薬剤との併用で受けながら、ＰＢＭＣ及び腫瘍生検を採取することに署名し、インフォームドコンセントに同意した転移性メラノーマの患者を選択した。患者の状態が許せば、追加の生検及びＰＢＭＣサンプルを長期的に採取した。この研究では、マッチド細胞株（ｎ＝５）、ＰＢＭＣ（ｎ＝１１）、及びＴＩＬ（ｎ＝７）を使用した。臨床反応を、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って評価した（Ｗｏｌｃｈｏｋ等 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，７４１２－７４２０（２００９）。患者特性の要約を以下の表２に示す。
患者、検体収集及び応答評価。 抗ＰＤ－１療法を単独で又は他の薬剤との併用で受けながら、ＰＢＭＣ及び腫瘍生検を採取することに署名し、インフォームドコンセントに同意した転移性メラノーマの患者を選択した。患者の状態が許せば、追加の生検及びＰＢＭＣサンプルを長期的に採取した。この研究では、マッチド細胞株（ｎ＝５）、ＰＢＭＣ（ｎ＝１１）、及びＴＩＬ（ｎ＝７）を使用した。臨床反応を、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って評価した（Ｗｏｌｃｈｏｋ等 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，７４１２－７４２０（２００９）。患者特性の要約を以下の表２に示す。
【0140】
ＰＢＭＣ精製、ＴＩＬ増殖、及び細胞株樹立。 ５－２０ｍＬの血液サンプルからのＰＢＭＣを、ＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０チューブ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用したＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）傾斜分離を使用して精製した。精製後、ＰＢＭＣを凍結培地（ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で凍結保存し、液体窒素中に保存した。細胞株及びＴＩＬ培養物を、転移性病変のコア針生検から樹立した。ＴＩＬ培養物は、以前に記載されたように腫瘍断片を使用して樹立し（Ｄｕｄｌｅｙ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２６，３３２－３４２（２００３））、ＣＴＬ Ｃｒｙｏ ＡＢＣ凍結キット（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）又はＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の何れかに凍結保存した。ＴＩＬ培養物は、ベースライン及び治療中の生検から樹立した。細胞株を樹立するために、組織を使い捨てスカルペルで細かく切り刻んで単一細胞懸濁液を作製し、ＤＭＥＭ１０％ヒトＡＢ血清（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）を含む組織培養プレートに維持し、細胞が増殖し始めるまで抗生物質とＬ－グルタミンを補充した。残存線維芽細胞の汚染の証拠がなく、少なくとも１０－１５継代後に細胞株が樹立されると考える。細胞株をベースライン生検からのみ樹立した。
【0141】
細胞株及び細胞培養。 全てのメラノーマ細胞株（Ｍ２０２、Ｍ４９５、Ｍ４８６、Ｍ４８８、Ｍ４８９及びＭ４９０）を、１０％ウシ胎児血清（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）、抗生物質、及びＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ中に維持し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で保った。細胞株は、ショートタンデムリピート分析（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（登録商標）１０システム、Ｐｒｏｍｅｇａ、分析はＬａｒａｇｅｎ社に外部委託）を使用して定期的に認証し、マイコプラズマの存在について試験した（Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ、マイコプラズマ検出キット、Ｌｏｎｚａ）。細胞傷害性研究では、全ての細胞株に、製造メーカーの指示書に従ってＥＦ１ａプロモーター（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の制御下で、核赤色蛍光タンパク質（ｎＲＰＦ）を発現するレンチウイルスベクターをレンチウイルス形質導入し、増殖させ、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ又はＦＡＣＳ ＡＲＩＡ－Ｈ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して選別した。
【0142】
腫瘍体細胞コーディング変異の同定とネオ抗原の選択。 患者の腫瘍生検及びマッチドＰＢＭＣに由来する腫瘍細胞株を全エクソーム解析（ＷＥＳ）に供した。加えて、腫瘍細胞株についてＲＮＡ－シーケンス解析（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を実施した。ＤＮＡ及びＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造元の説明書に従って使用して、細胞株（１００万細胞）及びＰＢＭＣ（１００万－３００万細胞）から単離した。全エクソーム及びＲＮＡシーケンス解析は、ＵＣＬＡのＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＴＣＧＢ）コアにおいて、リード長が２×１５０ｂｐのペアエンドのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ３０００プラットフォームを使用して実施した。全エクソーム解析用のライブラリーを、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ ＳｅｑＣａｐ ＥＺヒトエクソームライブラリーｖ３．０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して作製した。ＲＮＡｓｅｑライブラリー構築にはポリＡ選択を使用した。
【0143】
ネオエピトープ予測及びランク付けを実施した。簡単に説明すると、第一に、ＷＥＳ配列をヒトｈｇ１９リファレンスゲノムに整列させた。ＶａｒＳｃａｎ２とＭｕＴｅｃｔの双方によって同定された体細胞コーディング変異を、潜在的なネオ抗原として保持した。第二に、ＲＮＡ－Ｓｅｑ配列をヒトｈｇ１９にマッピングし、定量し、ＨＩＳＡＴ２とＳｔｒｉｎｇＴｉｅで正規化した。第三に、患者のＰＢＭＣ ＷＥＳから同定されたネオ抗原配列と患者のＨＬＡ型を、ｎｅｔＭＨＣｐａｎでのＨＬＡ－ペプチド結合親和性予測の入力として使用した。最後に、各ＨＬＡに関して上位２％のランク付けの予測結合親和性を持つＨＬＡ－ペプチド複合体を選択し、それらの選択した複合体でＲＮＡ－Ｓｅｑによる発現が確認されたペプチドのみをタンパク質試薬作製に進めた。
【0144】
ＨＬＡ－ペプチド複合体ライブラリーの調製。 ＨＬＡ－ペプチド複合体ライブラリーを、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されるようにして作製した。簡単に説明すると、ＮｅｏＥをコードするＤＮＡ断片を、９６ウェル形式で可溶性ＨＬＡ対立遺伝子をコードする改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。ＤＮＡクローンをサンガーシークエンシングによって検証し、プラスミドをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と複合体化し、製造元の推奨事項を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。分泌されたＮｅｏ－ＨＬＡ複合体を、ＢｉｒＡリガーゼ（ブランド）で酵素的にビオチン化し、ＩＭＡＣ（ブランド）によって清澄化した細胞培養培地から精製した。精製したタンパク質ライブラリーを脱塩クロマトグラフィー（ブランド）でバッファー交換し、タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度で測定した。
【0145】
患者ネオエピトープ特異的Ｔ細胞の同定。 ネオエピトープ特異的Ｔ細胞の同定を、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているようにして実施した。簡単に説明すると、各ネオエピトープ－ＨＬＡエレメントを、ＤＮＡバーコード化し、二つの異なる蛍光ストレプトアビジン（フィコエリトリン－ＰＥ－又はアロフィコシアニン－ＡＰＣ－）によって多量体化した。ＤＮＡバーコードは次の構造に従った：ユニバーサルプライマー１－ＮＮＮＮＮ－バーコード－ＮＮＮＮＮＮ－ユニバーサルプライマー２。バーコード化し蛍光多量体化したネオエピトープ－ＨＬＡエレメントを一緒にプールして、ＰＢＭＣとＴＩＬを染色した。バーコード化し多量体化したネオエピトープ－ＨＬＡライブラリーを患者のＰＢＭＣ又はＴＩＬと共にインキュベートした後、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を行った。二重蛍光標識（ＰＥ＋ＡＰＣ）多量体結合ＣＤ８ Ｔ細胞を、単細胞としてプレートの個々のウェルにソートした。次に、これらのウェルを逆転写及びＰＣＲに供して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びバーコードＤＮＡ配列を増幅させた。次に、配列をＩｌｌｕｍｉｎａのｍｉｎｉ－ｓｅｑマシンによる次世代シークエンシングに供し、ＴＣＲ及びバーコード情報を解読した。
【0146】
非特異的結合事象のために、必ずしも全ての二重蛍光陽性細胞がネオエピトープ特異的であるわけではない。ＤＮＡバーコードを解析すると、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞は主に同じバーコードを持ち、非特異的Ｔ細胞は異なるバーコードを持つであろう。ネオエピトープ特異的Ｔ細胞からＴＣＲ配列を選択し、以下に記載されるように健康なドナーＴ細胞を遺伝子改変するために使用した。
【0147】
相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型の作製。 ＨＤＲ鋳型の作製を、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８２３０（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているようにして実施した。先のステップで単離されたネオエピトープ特異的Ｔ細胞からのＴＣＲペアード可変領域を、ＰＣＲによって増幅し、精製した。精製されたＰＣＲ産物を、患者特異的ＨＤＲ鋳型を作製するために、定常領域と相同性アームと共にアセンブルした。患者特異的ＨＤＲ鋳型を、サンガーシークエンシングとアガロースゲル電気泳動によって検証した。
【0148】
細胞編集とネオエピトープ特異性の検証。 非ウイルス性Ｔ細胞遺伝子編集を、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８２３０（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているようにして実施した。初代ヒトＴ細胞を、磁気親和性選択を使用して、健康なドナーの濃縮白血球アフェレーシスから単離した。単離したＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８粒子で活性化し、４８－７２時間培養した。活性化後、Ｔ細胞を遠心分離し、Ｐ３バッファー（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを標的とするガイドＲＮＡをＣａｓ９タンパク質に複合化することによって形成した。患者特異的ＨＤＲ鋳型とＲＮＰを細胞懸濁液と共に混合し、電気穿孔した後、完全Ｔ細胞培地に移した。クローン化されたＴＣＲのネオエピトープ特異性を確認するために、遺伝子編集Ｔ細胞をネオエピトープ－ＨＬＡデキストラマー（３０ｎＭ、上記のように社内で製造）で染色した。
【0149】
Ｔ細胞機能研究：Ｔ細胞活性化、サイトカイン放出、増殖、脱顆粒、及び細胞傷害性。 Ｔ細胞の活性化、サイトカイン放出、及び増殖を、自己（Ｍ４８５、Ｍ４８６、Ｍ４８８、Ｍ４８９及びＭ４９０）又はミスマッチ（Ｍ２０２）細胞株との共培養時に測定した。簡単に説明すると、メラノーマ細胞（Ｔ細胞増殖及びサイトカイン放出では２５×１０３細胞／ウェル、又はＴ細胞活性化では３０×１０３）を９６ウェルプレートに播種し、培地のみ、又は示されている場合はＩＦＮγ（２０００ＩＵ／ｍＬ、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した培地と共に一晩インキュベートした。次に、メラノーマ細胞を洗浄し、ｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞を、５：１の生成物：標的（Ｐ：Ｔ）で加えた。
【0150】
サイトカイン放出を測定するために、共培養上清を２４時間で収集し、－８０℃で保存した。分析の準備ができたときに、上清を室温で解凍し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＬ６の濃度を、サイトカインビーズアレイ（ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。データは、編集細胞によって正規化されて示される。
【0151】
Ｔ細胞活性化を測定するために、２０－２４時間の共培養後にＴ細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＺｏｍｂｉｅバイオレット（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）ライブ／デッド染色で染色した。インキュベーション後、細胞をネオエピトープ－ＨＬＡデキストラマー－ＰＥ（３０ｎＭ、上で示したように製造）、ついでＣＤ４５－ＦＩＴＣクローンＨＩ３０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＯＸ４０－ＰＥＣｙ７クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５、４－１ＢＢ－ＡＰＣクローン４Ｂ４－１、ＣＤ４－ＢＶ５０１クローンＯＫＴ４、及びＣＤ８－ＢＶ６０５クローンＲＰＡ－Ｔ８（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから）抗体で製造元が推奨する濃度で染色した。
【0152】
Ｔ細胞増殖を測定するために、２４、４８、及び７２時間の共培養後、Ｔ細胞を収集し、洗浄し、ライブ／デッドＮＩＲ蛍光反応性（１：２５０ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ネオエピトープ－ＨＬＡデキストラマー－ＰＥ（３０ｎＭ、上に示したように製造）と、次にＣＤ４－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００クローンＳＫ３（１：４００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＣＤ８－ＢＶ６０５クローンＲＰＡ－Ｔ８（１：５０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、固定／透過処理希釈標準溶液（Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で透過処理し、透過処理バッファー（Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で洗浄し、Ｋｉ６７－ＢＶ４２１クローンＢ５６（１：１００，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で染色した。
【0153】
Ｔ細胞脱顆粒を、自己又はミスマッチ細胞株との１２－１６時間の共培養時に測定した。５０×１０３のメラノーマ細胞を４８ウェルプレートに播種し、培地のみ又はＩＦＮｇ（２０００ＩＵ／ｍＬ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した培地の何れかと共に８時間インキュベートした。インキュベーション後、メラノーマ細胞を洗浄し、推奨濃度でＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ－Ｈ７クローンＨ４Ａ３（ＢＤ）と共に２５０×１０３のｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞を添加した（Ｐ：Ｔ＝５：１）。１時間のインキュベーション後、タンパク質輸送を阻害するために、ブレフェルジンＡとモネシン（ＢＤゴルジプラグ及びＢＤゴルジストップ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を推奨濃度の半分で添加した。細胞を更に１１－１５時間インキュベートした後、ＣＤ１０７ａの表面発現をフローサイトメトリーによって測定した。簡単に説明すると、Ｔ細胞を収集し、Ｚｏｍｂｉｅバイオレットライブ／デッド、ネオエピトープ－ＨＬＡデキストラマー－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＦＩＴＣクローンＨＩ３０、ＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ－Ｈ７クローンＨ４Ａ３ ＢＤ（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、ＣＤ４－ＢＶ５０１クローンＯＫＴ４、及びＣＤ８－ＢＶ６０５クローンＲＰＡ－Ｔ８（両方ともＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）で染色した。
【0154】
全てのフローサイトメトリー染色において、抗体との最後のインキュベーション後、細胞を洗浄し、固定し、フローサイトメトリーが取得されるまで４℃で保存する。特に明記しない限り、全ての染色及び洗浄は染色バッファー（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で実施した。フローサイトメトリーの取得は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。
【0155】
細胞傷害性を測定するために、２５×１０３細胞／ウェルのｎＲＦＰメラノーマ細胞株を９６ウェルプレートに播種し、培地のみ、又は示されている場合はＩＦＮγ（２０００ＩＵ／ｍＬ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した培地の何れかと共に一晩インキュベートした。次に、メラノーマ細胞を洗浄し、ｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞を、１０：１から１：１の範囲のＰ：Ｔ比で添加した。Ｔ細胞の添加後、メラノーマ細胞をリアルタイム生細胞イメージングシステム（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ，Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化し、少なくとも１５０時間追跡した。
【0156】
これらの細胞株における無関係な変異（Ｎｅｏ１２）を標的とするＮｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞を、全ての実験において対照として使用した。全ての機能研究は、サイトカインを補充していないメラノーマ細胞培地で行った。Ｔ細胞活性化、脱顆粒、増殖及びサイトカイン放出は、生物学的に三通り行った。細胞傷害性実験は、特に明記しない限り、生物学的に四通り行った。
【0157】
ソフトウェア。 ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してフローサイトメトリーデータを解析し、データ表現と統計分析にＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用し、円にまとめた視覚化にＲＡＷｇｒａｐｈを使用した。
【0158】
統計。 Ｔ細胞機能研究では、多重比較のためのＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ調整を含む独立ｔ検定を使用して、ネオ－エピトープ特異的ＴＣＲとｎｅｏ１２ＴＣＲ対照の間、又は自己とミスマッチ対照細胞株の間で比較した。
【0159】
実施例２ ＮｅｏＴＣＲ生成物は非応答患者の治療に効果的である
チェックポイント阻害剤療法後に誘導されたネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答を特徴付けるために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を経時的に（長期的に）収集し、患者の腫瘍生検からの増殖腫瘍浸潤リンパ球培養物（ＴＩＬ）及び自己腫瘍細胞株を樹立した。患者特異的ネオエピトープの計算による予測とランク付けのために、腫瘍及び正常組織対照に対して全エクソーム及びＲＮＡシークエンシングを実施した。予測されるネオエピトープがロードされた患者ＨＬＡクラスＩ分子からなるキャプチャー試薬のライブラリーを作製し（Ｐｅｎｇ等 ＡＡＣＲ２０１９を参照）、患者のＰＢＭＣ又はＴＩＬサンプルからネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離した。ひとたび単離されると、単離されたＴ細胞からペアードネオエピトープ特異的ＴＣＲアルファ及びベータ鎖（ＮｅｏＴＣＲ）を、単細胞シークエンシングによって得た。このデータを使用して、各患者の六のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を定義し、患者特異的メラノーマの非同義変異を検出し、得られた推定ネオエピトープの計算による予測を実施した。推定ネオエピトープに、腫瘍によるその発現レベルと、患者自身のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子への予測される結合親和性に基づいて優先順位を付けた。選択後、数十から数百の可溶性推定ネオエピトープ－ＨＬＡクラスＩタンパク質を単鎖三量体技術によって産生した。次に、これらの個別化されたタンパク質ライブラリーをＤＮＡバーコード化し、キャプチャー試薬として使用するために蛍光多量体化した。ひとたび構築されたら、ライブラリーを、患者のＰＢＭＣ又は腫瘍生検から増殖させたリンパ球と共にインキュベートし、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単細胞選別によってキャプチャーした。次に、各推定ネオエピトープ－ＨＬＡ多量体に固有のバーコードを使用して、キャプチャーされたＴ細胞の抗原特異性を解読した（図１Ａ）。
チェックポイント阻害剤療法後に誘導されたネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答を特徴付けるために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を経時的に（長期的に）収集し、患者の腫瘍生検からの増殖腫瘍浸潤リンパ球培養物（ＴＩＬ）及び自己腫瘍細胞株を樹立した。患者特異的ネオエピトープの計算による予測とランク付けのために、腫瘍及び正常組織対照に対して全エクソーム及びＲＮＡシークエンシングを実施した。予測されるネオエピトープがロードされた患者ＨＬＡクラスＩ分子からなるキャプチャー試薬のライブラリーを作製し（Ｐｅｎｇ等 ＡＡＣＲ２０１９を参照）、患者のＰＢＭＣ又はＴＩＬサンプルからネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離した。ひとたび単離されると、単離されたＴ細胞からペアードネオエピトープ特異的ＴＣＲアルファ及びベータ鎖（ＮｅｏＴＣＲ）を、単細胞シークエンシングによって得た。このデータを使用して、各患者の六のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を定義し、患者特異的メラノーマの非同義変異を検出し、得られた推定ネオエピトープの計算による予測を実施した。推定ネオエピトープに、腫瘍によるその発現レベルと、患者自身のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子への予測される結合親和性に基づいて優先順位を付けた。選択後、数十から数百の可溶性推定ネオエピトープ－ＨＬＡクラスＩタンパク質を単鎖三量体技術によって産生した。次に、これらの個別化されたタンパク質ライブラリーをＤＮＡバーコード化し、キャプチャー試薬として使用するために蛍光多量体化した。ひとたび構築されたら、ライブラリーを、患者のＰＢＭＣ又は腫瘍生検から増殖させたリンパ球と共にインキュベートし、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単細胞選別によってキャプチャーした。次に、各推定ネオエピトープ－ＨＬＡ多量体に固有のバーコードを使用して、キャプチャーされたＴ細胞の抗原特異性を解読した（図１Ａ）。
【0160】
ＮｅｏＴＣＲの機能的特徴付けのために、健康なドナー初代ヒトＴ細胞を、内因性ＴＣＲをそれぞれのＮｅｏＴＣＲに置き換えることにより、ＣＲＩＳＰＲベースの非ウイルス精密ゲノム改変を使用してｎｅｏＴＣＲを発現するように改変した（Ｊａｃｏｂｙ等，ＡＡＣＲ ２０１９，Ｓｅｎｎｉｎｏ等，ＡＡＣＲ ２０１９）。次に、これらの遺伝子編集Ｔ細胞を、患者の自己細胞株との共培養実験で使用した。
【0161】
Ｔ細胞応答を、チェックポイント阻害剤療法を受けている転移性メラノーマの五名の患者（ＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、及びＰＴ５）で分析した。二名の患者（ＰＴ１及びＰＴ２）は、治療開始から二年以上継続しているニボルマブ注入に対して長期にわたる部分応答を示しており、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングによって１８フルオロデオキシグルコースを取り込まなかった残存病変のみがあり、患者には活動性メラノーマはなかったことを示唆している。ＰＴ３は、ニボルマブの計画された最初の注入の前に急速に進行した。ＰＴ４は、ペムブロリズマブを４か月間投与された後に進行した。ＰＴ５は、ペンブロリズマブとトール様受容体アゴニスト９（ＴＬＲ９）ＳＤ１０１の腫瘍内注射の併用を受け、ＳＤ１０１注射を受けた皮下部位の退縮と、１７か月間続いた副腎転移の安定状態の後、骨及び腹膜転移の広範な進行が続いた。表２を参照のこと。
【0162】
患者由来のメラノーマ細胞株の全エクソームシークエンシングにより、患者ＰＴ１の２５６２からＰＴ４の３１までの範囲の幅広い変異が同定された（中央値１９３、以下の表３を参照）。抗ＰＤ－１療法に応答した二名の患者は、療法に応答しなかった三名の患者よりも高い変異腫瘍負荷を示した。発現された変異の範囲が広いにもかかわらず、Ｔ細胞によってネオエピトープとして認識される変異の数は、１から５の範囲で、遥かに変動が少なかった（図１Ｂ；表３）。従って、免疫優勢の証拠があった。つまり、変異ネオ抗原に対するＴ細胞応答は、変異の数と線形的に相関していなかったが、抗ＰＤ－１療法への臨床応答のある患者とない患者の両方で、ネオエピトープとして認識されたそれらの限られたセットに焦点が当てられているようである。しかし、（治療に対して臨床応答を示した）患者ＰＴ１及びＰＴ２の血液及び腫瘍から単離されたネオエピトープ特異的Ｔ細胞の単細胞ＴＣＲシークエンシングにより、複数の個別のＴＣＲアルファ及びベータ鎖ペア（ＴＣＲクローン型）、それぞれ１４及び２１のクローン型があることが明らかになった。これは、治療に応答しないそれぞれ二、二、及び一のＴＣＲクローン型があった三名の患者から単離されたネオエピトープ特異的Ｔ細胞とは対照的である（図１Ｂ及び表３）。
【0163】
続いて、各患者に対するネオエピトープ認識の長期的分析を、入手可能な全ての連続的な血液及び腫瘍サンプルで実施し、単離されたＴＣＲの機能性を、自己メラノーマ細胞株に対して試験した。
【0164】
ＰＴ１は、肺転移における抗ＰＤ－１療法に対して迅速かつ持続性のある抗腫瘍応答を示した（図２Ａ）。シークエンシングにより２５６２の体細胞コーディング変異を同定し、そのうち１０９９がＲＮＡシークエンシングによって発現されると予測された。３つのＨＬＡ型、ＨＬＡ－Ａ０３：０１、Ａ２４：０１、及びＣ１２：０３にわたる１８３の変異をカバーする２４３のネオエピトープ特異的ｐＭＨＣキャプチャー試薬のライブラリーを作製し、複数の長期的な時点に由来するＰＢＭＣ又はＴＩＬからＣＤ８Ｔ細胞をスクリーニングするために使用した。三の変異のみを標的とする１４の異なるＴＣＲクローン型を含んでいた１８６のネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離した。特に、解析された殆どの時点で同じ変異がネオエピトープとして認識され、免疫優勢仮説を裏付けた。表２及び３を参照のこと。１４のネオエピトープ特異的ＴＣＲ（ｎｅｏＴＣＲ）を、異なる時点で一部は広がり又は収縮する異なる量の連続した血液及び腫瘍サンプルで検出した。末梢血採血は５から２０ミリリットルであり、腫瘍生検はコア針生検であり、どの時点でも各コンパートメントの少数のＴ細胞のみを採取したことに留意すべきである。
【0165】
メラノーマからのリンパ節転移における抗ＰＤ－１療法に対して持続性の応答を示したＰＴ２のサンプルで、同様の所見が観察された（図２Ｃ）。この場合、３０８の体細胞コーディング変異のうち、１２６が発現した（表３）。患者特異的ライブラリーは、六のＨＬＡクラスＩによって提示された８０の変異をカバーする１７６のキャプチャー試薬を含んでおり、五の変異を標的とする２９６のネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離した；これらの変異を標的とする２１の異なるｎｅｏＴＣＲクローン型を検証した（図２Ｄ、表３及び４、並びに図３Ａ－３Ｅ）。
【0166】
他方、ＰＴ４、ＰＴ３、及びＰＴ５は、チェックポイント阻害剤に対して僅かな応答しか示さず、非応答患者として分類した。
【0167】
ＰＴ３のメラノーマ細胞株には７１の非同義変異があり、そのうち３３が発現していた。五つのＨＬＡによって提示された３６の変異をカバーする１３２のキャプチャー試薬のライブラリーを調製し、ベースラインの血液及び腫瘍からネオエピトープ特異的Ｔ細胞をキャプチャーするために使用した（表３）。注目すべきことに、幾つかの変異では、シークエンシングによってｍＲＮＡの発現が検出されなかった。ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１によって提示されたＡＣＥＲ３の同じ変異を標的とするＴ細胞の二つの異なるクローン型を血液において同定した（図４Ａ並びに表３及び４）。ＰＴ４のメラノーマ細胞株には全３１の非同義変異があり、そのうち２０が発現していた。ライブラリーには、三つのＨＬＡクラスＩによって提示された７つの変異をカバーする１７のキャプチャー試薬が含まれていた（表３）。ＰＲＥＬＰ及びＭＳＩ２の変異を標的とした腫瘍内の二のネオエピトープ特異的Ｔ細胞（図４Ｂ並びに表３及び４）が同定された。ＰＴ５のメラノーマ細胞株には１９３の非同義変異があり、そのうち６１が発現していた。六のＨＬＡクラスＩによって提示された７１の変異をカバーする１７２のキャプチャー試薬のライブラリーを構築した。四の血液又は腫瘍サンプルのうちの一つでネオエピトープ特異的Ｔ細胞の一つのｎｅｏＴＣＲクローン型が同定され、これはＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１によって提示されるＧＳＴＣＤにおける変異を標的としていた（図４Ｃ並びに表３及び４）。従って、抗ＰＤ－１療法に応答しなかった患者からの変異ネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答はオリゴクローナルであり、血液及び腫瘍サンプルでは経時的に再発性ではなかった。
【0168】
表３は、各患者の変異及び標的とされるネオエピトープの要約を示している。
【0169】
単離されたＴＣＲのネオエピトープ特異性を機能的に試験するために、キャプチャーされた個々のＴ細胞のペアードｎｅｏＴＣＲアルファ及びベータ鎖を配列決定し、非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集法を使用して健康なドナーＴ細胞を遺伝子改変するために使用し、内因性ＴＣＲをネオエピトープ特異的ＴＣＲで置き換えた。この方法では、ＴＣＲ－アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子座の最初のエクソンを標的とするガイドＲＮＡ、完全なｎｅｏＴＣＲベータ鎖と可変ｎｅｏＴＣＲアルファ鎖をコードするＤＮＡ相同性指向修復鋳型、及びＣａｓ９タンパク質を、先に活性化されたＴ細胞に電気穿孔した。相同性指向修復の後、完全に機能的なｎｅｏＴＣＲを、内因性ＴＣＲアルファ調節の制御下でゲノムに組み込んだ。検証ステップとして、得られたｎｅｏＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の抗原特異性を、デキストラマー染色によって確認した（図３Ａ－３Ｅ）。
【0170】
ＰＴ１について、変異したＩＬ８、ＰＵＭ１及びＴＰＰ２遺伝子におけるネオエピトープに特異的な十四（１４）の異なるｎｅｏＴＣＲを特徴付けた。ｎｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞と、患者のベースライン生検（Ｍ４８９）から樹立された細胞株、又は不適合細胞株（Ｍ２０２）との共培養実験を実施した。これらの細胞株に無関係な変異Ｎｅｏ１２を標的とする別の患者から単離されたｎｅｏＴＣＲを陰性対照として使用した。これらの十四（１４）のＮｅｏＴＣＲ生成物のそれぞれは、ＰＴ１の生検から樹立されたマッチド自己メラノーマ細胞株に対して特異的な細胞傷害性を示した（各比較でｐ＜０．０００００１で、１：１の生成物対標的比（Ｐ：Ｔ）を使用した９６時間アッセイにおいてミスマッチ対照ＴＣＲとの共培養におけるメラノーマ細胞株増殖と比較して５０－７５％の腫瘍増殖阻害）。不適合ヒトメラノーマ細胞株に対する細胞傷害性効果は観察されなかった（図５Ｂ及び図６Ｃ）。更に、ＮｅｏＴＣＲ生成物は４－１ＢＢとＯＸ－４０をアップレギュレートしたが、これらは、最近のＴＣＲの関与を反映したＴ細胞の表面マーカーである。１４のｎｅｏＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及びＩＬ６を放出し、患者適合メラノーマ細胞株との共培養時にＴ細胞の脱顆粒及び増殖を示した。この場合も、ＮｅｏＴＣＲ生成物を不適合標的と共培養した場合、非特異的なＴ細胞活性化は観察されなかった。
【0171】
同様に、ＰＴ２から単離された２１のｎｅｏＴＣＲクローン型を、この患者の六のＨＬＡクラスＩによって提示されるＮＡＴ１０、ＡＴＰ１１Ａ、ＨＰ１ＢＰ３、ＰＲＰＰＡＳ２、及びＵＶＳＳＡの点変異を標的とした対応するｎｅｏＴＣＲ Ｔ細胞生成物の作製のために選択した。患者特異的メラノーマ細胞株（Ｍ４９０）との共培養時のＴ細胞活性化、サイトカイン応答、及び細胞傷害性についてこれらのｎｅｏＴＣＲを試験する最初の試みでは、活性が殆ど示されず、これは、この患者のＰＤ－１遮断療法に対する良好な臨床応答を考えると驚くべきことであった。ネオエピトープの提示はＭ４９０細胞株では低い場合があり、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）への前曝露によってアップレギュレートされる必要があるかも知れないという仮説が立てられた。このステップが追加されたとき、この患者から単離された２１のｎｅｏＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢの表面発現のアップレギュレーションをもたらした（図５Ｃ）。ＡＴＰ１１Ａの変異を標的とするＴＣＲ２４、２５、及び２６は、ＩＦＮγ及びＴＮＦαを分泌し、Ｔ細胞増殖を誘導した（図７Ｃ－７Ｄ）。加えて、ＴＣＲ２５はＩＦＮγ前曝露なしでもマッチドメラノーマ細胞株に対して特異的な細胞傷害性を誘導したが、ＴＣＲ２５及びＴＣＲ２６はＩＦＮγ前曝露で細胞傷害性を誘導した（図５Ｄ及び図７Ｂ）。
【0172】
抗ＰＤ－１に対する臨床応答のない三名の患者からのＮｅｏＴＣＲ遺伝子編集Ｔ細胞生成物を、これらの患者からの生検から樹立されたその対応する自己メラノーマ細胞株に対する機能的特異性について分析した（図４Ｄ－４Ｉ及び図８）。患者ＰＴ４、ＰＴ３、及びＰＴ５から単離されたｎｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞は、マッチドメラノーマ細胞株を認識し、共培養時に４－１ＢＢ及びＯＸ４０活性化マーカーをアップレギュレートした（図４Ｄ及び４Ｆ並びに図８Ａ、８Ｄ、及び８Ｆ）。ＰＴ３からのＴＣＲ３６及びＴＣＲ３７、並びにＰＴ４からのＴＣＲ３９もまたＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、及びＩＬ６の分泌と増殖を誘導した（図８Ｂ及び８Ｅ）。全てのｎｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞は、ミスマッチ対照細胞株に影響を与えることなく、対応する自己メラノーマ細胞株に対して特異的な細胞傷害性を示した（ミスマッチ対照ＴＣＲとの共培養におけるメラノーマ細胞株の増殖と比較して３５－１００％の腫瘍増殖阻害、Ｐ：Ｔ ５：１を使用した９６時間アッセイ、各比較に対してｐ＜０．０５）（図４Ｇ－４Ｉ）。
【0173】
図４Ａ－４Ｉに提示されたデータに対する追加の裏付けを図９に示す。図９は、患者特異的ＮｅｏＴＣＲ生成物に応答した非応答患者からのがん細胞死を示している。画像の一番上の列は、非応答患者向けにデザインされたＮｅｏＴＣＲ生成物ががん細胞を殺傷し、またｎｅｏＴＣＲ Ｔ細胞が増殖したことを示している。細胞死がＮｅｏＴＣＲ生成物によるものであったことを示すために、陰性対照を実施し、画像の下の列に示した。下の列の画像では、非応答患者のがん細胞のネオエピトープと相関しないＮｅｏ１２ ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者のがん細胞を殺傷しない。その上、非応答患者のがん細胞がＮｅｏ１２ ＮｅｏＴＣＲ生成物陰性対照と一緒に培養されていた時間が長ければ長いほど、がん細胞はより多く増殖した。
【0174】
表４は、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞の単離をまとめたものである。
【0175】
実施例３ 非応答患者と免疫優勢
ｎｅｏＥ特異的単一Ｔ細胞を単離しキャプチャーするために新規に開発された技術、並びに非ウイルス遺伝子編集を使用して、がん細胞を認識し、抗腫瘍応答を誘導することができるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離し、特徴付けた。天然Ｔ細胞レパートリーの経時的なネオエピトープ免疫優勢及びＴＣＲクローン性をまた研究した。経時的なネオエピトープ免疫優勢及びＴＣＲクローン性は、チェックポイント阻害剤療法に対する抗腫瘍応答を誘導したことが示された。結果は、抗ＰＤ－１に対して良好な応答を示す患者では、限られた数のネオエピトープ－ＨＬＡ複合体（患者１の場合、試験されたｎｅｏＥの２％）を標的とするポリクローナル応答があることを示しており、これらのエピトープの免疫優勢を強調している。
ｎｅｏＥ特異的単一Ｔ細胞を単離しキャプチャーするために新規に開発された技術、並びに非ウイルス遺伝子編集を使用して、がん細胞を認識し、抗腫瘍応答を誘導することができるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離し、特徴付けた。天然Ｔ細胞レパートリーの経時的なネオエピトープ免疫優勢及びＴＣＲクローン性をまた研究した。経時的なネオエピトープ免疫優勢及びＴＣＲクローン性は、チェックポイント阻害剤療法に対する抗腫瘍応答を誘導したことが示された。結果は、抗ＰＤ－１に対して良好な応答を示す患者では、限られた数のネオエピトープ－ＨＬＡ複合体（患者１の場合、試験されたｎｅｏＥの２％）を標的とするポリクローナル応答があることを示しており、これらのエピトープの免疫優勢を強調している。
【0176】
興味深いことに、同じ変異を標的とする異なるＴ細胞クローン型は時間と共に進化し、ＴＣＲ間の機能差を示唆している。
【0177】
非応答患者がｎｅｏＥ特異的Ｔ細胞を保有していることを見出したことは予想外であった。更に、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞を単離し、患者由来のがん細胞を認識し殺傷することができたＮｅｏＴＣＲ生成物を作製することができたことが発見された。これは、ネオエピトープ特異的ＴＣＲを非応答患者から単離することができ、ＮｅｏＴＣＲ生成物などの個別化された養子Ｔ細胞療法に使用できることを示している。
【0178】
実施例４ ＮｅｏＴＣＲ生成物は患者特異的がん細胞を殺傷する
二の患者特異的ＮｅｏＴＣＲ生成物（ＴＣＲ３６（ＴＣＲ２１２とも呼ばれる）及びＴＣＲ３７（ＴＣＲ２１３とも呼ばれる））を、非応答患者のために作製した。陰性対照として、オフターゲットＮｅｏＴＣＲ生成物（Ｎｅｏ１２）を使用した。Ｎｅｏ１２は、この実施例の非応答患者と同じネオエピトープシグネチャーを持たない別の患者に特異的なＮｅｏＴＣＲ生成物である。ＴＣＲ３６及びＴＣＲ３７ＮｅｏＴＣＲ生成物は、両方とも、１）非応答患者の腫瘍細胞の殺傷、２）非応答患者の腫瘍細胞の成長と増殖の防止、及び３）非応答患者の腫瘍の腫瘍細胞コンフルエンシーの低減に効果的であった。陰性対照として、非応答患者の腫瘍細胞のネオエピトープと相関しないＮｅｏ１２ ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者の腫瘍細胞を殺傷せず、非応答患者の腫瘍細胞サンプルにおけるがん細胞の増殖を防げなかった。
二の患者特異的ＮｅｏＴＣＲ生成物（ＴＣＲ３６（ＴＣＲ２１２とも呼ばれる）及びＴＣＲ３７（ＴＣＲ２１３とも呼ばれる））を、非応答患者のために作製した。陰性対照として、オフターゲットＮｅｏＴＣＲ生成物（Ｎｅｏ１２）を使用した。Ｎｅｏ１２は、この実施例の非応答患者と同じネオエピトープシグネチャーを持たない別の患者に特異的なＮｅｏＴＣＲ生成物である。ＴＣＲ３６及びＴＣＲ３７ＮｅｏＴＣＲ生成物は、両方とも、１）非応答患者の腫瘍細胞の殺傷、２）非応答患者の腫瘍細胞の成長と増殖の防止、及び３）非応答患者の腫瘍の腫瘍細胞コンフルエンシーの低減に効果的であった。陰性対照として、非応答患者の腫瘍細胞のネオエピトープと相関しないＮｅｏ１２ ＮｅｏＴＣＲ生成物は、非応答患者の腫瘍細胞を殺傷せず、非応答患者の腫瘍細胞サンプルにおけるがん細胞の増殖を防げなかった。
【0179】
追加の対照を実施した。具体的には、Ｎｅｏ１２、ＴＣＲ３６、及びＴＣＲ３７ ＮｅｏＴＣＲ生成物を、ＴＣＲ３６及びＴＣＲ３７ ＮｅｏＴＣＲ生成物がデザインされ作製された非応答患者以外の患者に由来する腫瘍細胞株と共培養した。示されているように、ＴＣＲ３６及びＴＣＲ３７ ＮｅｏＴＣＲ生成物は患者特異的であり、ミスマッチ腫瘍細胞を殺傷しない。
【0180】
総合すると、患者特異的ＮｅｏＴＣＲ生成物を非応答患者向けに作製することができ、そのようなＮｅｏＴＣＲ生成物は非応答患者のがん細胞の殺傷に効果的であることが示された。
【0181】
従って、ＮｅｏＴＣＲ生成物を、非応答患者のがん細胞を特異的に殺傷することにより、非応答患者を治療するためにデザインし、作製し、及び使用することができる。
【0182】
実施例５ ネオエピトープは非応答患者において検出できる
非応答患者は、しばしば腫瘍遺伝子変異数が少ない。この既知の事実に基づいて、ネオエピトープは、不可能ではないにしても、非応答患者の腫瘍生検において検出することは難しいと予想された。驚いたことに、ここで使用された方法では、非応答患者の腫瘍生検からｎｅｏ－ＴＣＲを検出することができ、患者のがん細胞を殺傷することができたＮｅｏＴＣＲ生成物をそこから作製することができた。
非応答患者は、しばしば腫瘍遺伝子変異数が少ない。この既知の事実に基づいて、ネオエピトープは、不可能ではないにしても、非応答患者の腫瘍生検において検出することは難しいと予想された。驚いたことに、ここで使用された方法では、非応答患者の腫瘍生検からｎｅｏ－ＴＣＲを検出することができ、患者のがん細胞を殺傷することができたＮｅｏＴＣＲ生成物をそこから作製することができた。
【0183】
実施例６ ＮｅｏＴＣＲ生成物の作製
ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているｉｍＰＡＣＴ単離技術によって同定されたネオエピトープ特異的ＴＣＲを使用して、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ鋳型を作製した。これらのＨＲ鋳型を、部位特異的ヌクレアーゼとタンデムで初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトした（図１２Ａ－１２Ｃを参照）。一段階の非ウイルス精密ゲノム改変により、内因性ＴＣＲを、内因性プロモーターによって発現される患者のネオエピトープ特異的ＴＣＲでシームレスに置換した。表面に発現されるＴＣＲは配列が完全に天然である。
ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているｉｍＰＡＣＴ単離技術によって同定されたネオエピトープ特異的ＴＣＲを使用して、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ鋳型を作製した。これらのＨＲ鋳型を、部位特異的ヌクレアーゼとタンデムで初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトした（図１２Ａ－１２Ｃを参照）。一段階の非ウイルス精密ゲノム改変により、内因性ＴＣＲを、内因性プロモーターによって発現される患者のネオエピトープ特異的ＴＣＲでシームレスに置換した。表面に発現されるＴＣＲは配列が完全に天然である。
【0184】
ｎｅｏＴＣＲ－Ｔ細胞ゲノム改変の精度を、オフターゲット組み込みホットスポット又は転座について標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）によって、また次世代シークエンシングベースのオフターゲット切断アッセイによって評価し、意図しない結果の証拠がないことを見出した。
【0185】
図１２Ａ－１２Ｃに示されるように、目的の遺伝子を含むコンストラクトを内因性遺伝子座に挿入した。これは、左右のＨＲアームに隣接する目的の遺伝子のコード配列を含む相同修復鋳型を使用して達成した。ＨＲアームに加えて、目的の遺伝子を、２Ａペプチド、目的の上流の翻訳遺伝子から２Ａペプチドを除去するための２Ａペプチドの上流にあるプロテアーゼ切断部位、及びシグナル配列の間に挟んだ（図１Ｂ）。ゲノムに組み込まれると、目的の発現遺伝子カセットの遺伝子は、単一メッセンジャーＲＮＡとして転写された。メッセンジャーＲＮＡにおけるこの目的の遺伝子の翻訳中に、隣接領域は、自己切断２Ａペプチドによって目的の遺伝子から切り離され、プロテアーゼ切断部位は、翻訳された目的の遺伝子から上流の２Ａペプチドの除去のために切断された（図１Ｃ）。２Ａペプチド及びプロテアーゼ切断部位に加えて、ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙ（ＧＳＧ）リンカーを各２Ａペプチドの前に挿入して、発現カセット内の他のエレメントからの目的の遺伝子の分離を更に促進した。
【0186】
Ｐ２Ａペプチドは、その効率的な切断のため、細胞生成物には他の２Ａペプチドよりも優れていたと判断された。従って、二（２）のＰ２Ａペプチド及びコドン分岐を使用して、Ｐ２Ａペプチドからの目的の遺伝子の何れの末端にも残りのアミノ酸からの何らかの外因性エピトープを導入することなく、目的の遺伝子を発現させた。外因性エピトープを持たない（すなわち、目的の遺伝子の何れの側にも隣接するＰ２Ａペプチドアミノ酸がない）遺伝子編集細胞の利点は、免疫原性が強烈に低下し、遺伝子編集細胞に対して免疫反応を起こす遺伝子編集細胞を含む細胞生成物が患者に注入される可能性が低くなることである。
【0187】
ＰＣＴ／ＵＳ／２０１８／０５８２３０に記載されているように、ＮｅｏＴＣＲをＴ細胞のＴＣＲα遺伝子座に組み込んだ。具体的には、左右のＨＲアームに隣接するＮｅｏＴＣＲコード配列を含む相同修復鋳型を使用した。加えて、内因性ＴＣＲβ遺伝子座を破壊し、ＮｅｏＴＣＲコンストラクトによってコードされるＴＣＲ配列のみを発現させた。一般的な戦略を、環状ＨＲ鋳型並びに直鎖状鋳型を使用して適用した。
【0188】
標的ＴＣＲα遺伝子座（Ｃα）がプラスミドＨＲ鋳型と共に示され、得られた編集配列と下流のｍＲＮＡ／タンパク質生成物が図１２Ｂ及び１２Ｃに示される。標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、切断部位は矢印で示される）が示される（図１２Ａ－１２Ｃ）。ＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む環状プラスミドＨＲ鋳型が、左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」と「ＲＨＡ」）の間に位置する。コドン最適化されたＨＲ鋳型によって導入されたＴＲＡＣの領域が示される（縦縞）。ＴＣＲβ定常ドメインは、ＴＲＢＣ１と機能的に同等であることが示されているＴＲＢＣ２から誘導した。ＮｅｏＴＣＲカセットにおける他のエレメントには次のものが含まれる：２Ａ＝２Ａリボソームスキッピングエレメント（非限定的な例では、カセットで使用される２Ａペプチドは両方ともＰ２Ａ配列であり、コドン分岐と組み合わせて使用され、翻訳産物における何らかの他の形で生じる非内因性エピトープを排除する）；Ｐ＝上流のＴＣＲβタンパク質から２Ａタグを除去する２Ａの上流のプロテアーゼ切断部位（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、フューリンプロテアーゼ切断部位でありうる）；ＳＳ＝シグナル配列（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、ヒト成長ホルモンシグナル配列でありうる）。ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのＨＲ鋳型には、ＴＣＲαガイドＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰの標的となるＴＣＲαゲノム遺伝子座への挿入を方向付ける二つの隣接する相同性アームが含まれる。これらの相同性アーム（ＬＨＡ及びＲＨＡ）は、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのｎｅｏＥ特異的ＴＣＲ配列に隣接している。この実施例において使用されたプロテアーゼ切断部位はフューリンプロテアーゼ切断部位であったが、当業者に知られている任意の適切なプロテアーゼ切断部位を使用することができる。同様に、ＨＧＨがこの実施例のために選択されたシグナル配列であったが、当業者に知られている任意のシグナル配列を、所望の輸送に基づいて選択し、使用することができる。
【0189】
ゲノムに組み込まれると（図１２Ｃ）、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットは、その個々のＴ細胞からの内因性ＴＣＲαポリペプチドの一部をなおも含む（図１２Ｃ）、内因性ＴＣＲαプロモーターから単一メッセンジャーＲＮＡとして転写される。この単一ＮｅｏＴＣＲメッセンジャーＲＮＡのリボソームポリペプチド翻訳中に、ＮｅｏＴＣＲ配列は、Ｐ２Ａペプチドでの自己切断によって内因性のＣＲＩＳＰＲ破壊ＴＣＲαポリペプチドから分離される（図１２Ｃ）。コードされたＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドはまた内因性細胞性ヒトフューリンプロテアーゼによる切断及びＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットに含まれる第二の自己切断Ｐ２Ａ配列モチーフを通して互いに分離される（図１２Ｃ）。ＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドは、多量体構築及びＴ細胞表面へのＮｅｏＴＣＲタンパク質複合体の輸送のために、シグナルリーダー配列（ヒト成長ホルモン、ＨＧＨに由来）によって別々に小胞体に標的化される。フューリンプロテアーゼ切断部位を含めることにより、上流のＴＣＲβ鎖からの２Ａ配列の除去が促進され、ＴＣＲβ機能との潜在的な干渉が減少する。各２Ａの前にｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙリンカーを含めると（図示せず）、三つのポリペプチドの分離が更に促進される。
【0190】
加えて、三つの反復タンパク質配列は、ゲノム安定性を促進するためにＨＲ鋳型内でコドン分岐される。二つのＰ２Ａは、エクスビボ改変Ｔ細胞のゲノム内に導入されたＮｅｏＴＣＲカセット配列の安定性を促進するためにＴＣＲ遺伝子カセット内で、二つのＨＧＨシグナル配列も互いに同様に、互いにコドン分岐される。同様に、ＴＲＡＣエクソン１の再導入された５’末端（縦縞）は、二つの直接リピートの介在配列を除去することにより、カセット全体が経時的に失われる可能性を低減させる。
【0191】
Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを使用して、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットの正確な標的組み込みを確認した。アガロースゲルは、組み込みカセットに特異的なプライマーを使用し、部位がヌクレアーゼ及びＤＮＡ鋳型（ＫＯＫＩとＫＯＫＩＫＯ）の両方で処理された細胞に対してのみ予想されたサイズの生成物を産生するＰＣＲの結果を示しており、部位特異的で正確な組み込みを証明している。
【0192】
更に、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）を使用して、標的組み込みの特異性を確認した。架橋、ライゲーション、及びＮｅｏＴＣＲ挿入断片に特異的なプライマーの使用によって、組み込み部位周辺の配列を取得した。ゲノムにマッピングされたリードを、１０ｋｂ間隔でビニングする。有意なリードデプスが、１４番染色体上の組み込み部位の目的部位周囲でのみ得られ、一般的なオフターゲット挿入部位の証拠がないことが示された。
【0193】
内因性ＴＣＲの抗体染色とｎｅｏＴＣＲのペプチド－ＨＬＡ染色は、改変がＮｅｏＴＣＲの高頻度のノックインをもたらし、一部のＴＣＲ細胞と少しのＷＴ Ｔ細胞が残っていることを明らかにした。ノックインは、外因性プロモーターの非存在下でのｎｅｏＴＣＲ発現によって証明される。同じｎｅｏＴＣＲを使用して改変を複数回実施したところ、同様の結果が得られた。従って、ＮｅｏＴＣＲの効率的且つ一貫した発現と改変されたＴ細胞における内因性ＴＣＲのノックアウトが達成された。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A-3B】
【図3C-3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D-4E】
【図4F-4G】
【図4H-4I】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E-8F】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A-12B】
【図12C】
【国際調査報告】