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特表2022-552261変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するためのＱＰＴ操作に基づく組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-15
(54)【発明の名称】変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物およびタバコ製品を作製するためのＱＰＴ操作に基づく組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20221208BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20221208BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20221208BHJP
A01H 5/12 20180101ALI20221208BHJP
A24B 13/02 20060101ALI20221208BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29
A01H6/82 ZNA
A01H5/00 A
A01H5/12
A24B13/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022521240
(86)(22)【出願日】2020-10-09
(85)【翻訳文提出日】2022-05-19
(86)【国際出願番号】 US2020055105
(87)【国際公開番号】W WO2021072288
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/913,357
(32)【優先日】2019-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517453405
【氏名又は名称】アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】チー ドン
(72)【発明者】
【氏名】クディシプディ チェンガルラヤン
(72)【発明者】
【氏名】シェン ヤンシン
【テーマコード（参考）】
2B030
4B043
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB02
2B030AD08
2B030CA14
2B030CB02
2B030CD12
4B043BB01
4B043BB28
(57)【要約】
本開示は、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに該タバコ植物からのタバコ製品の作製に関する、組成物および方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、タバコ植物またはその部分であって、該タバコ植物が、同等の条件下で生育および加工された場合の、該１つまたは複数の変異アレルを有しない対照タバコ植物由来の葉のニコチンレベル未満のニコチンレベルを含む葉を生成する、該タバコ植物またはその部分。
【請求項2】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子がＱＰＴ１ａである、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項3】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子がＱＰＴ１ｂである、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項4】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子がＱＰＴ２ａである、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項5】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子がＱＰＴ２ｂである、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項6】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項7】
前記少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一または類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項8】
前記タバコ植物および対照タバコ植物が、同じタバコ品種のものである、請求項１～７のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項9】
前記葉が乾燥葉である、請求項１～８のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項10】
前記タバコ植物が、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも２つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項11】
前記タバコ植物が、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも３つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項12】
前記タバコ植物が、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも４つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項13】
前記タバコ植物が、同等の条件下で生育および加工された場合の、前記１つまたは複数の変異アレルを有しない対照タバコ植物由来の葉のニコチンレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％未満のニコチンレベルを含む葉を生成することができる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項14】
前記タバコ植物が、同等の条件下で生育および加工された場合の、前記対照タバコ植物由来の葉の総アルカロイドレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％未満の総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項15】
前記タバコ植物が、同等の条件下で生育および加工された場合の、前記対照タバコ植物由来の葉の総アルカロイドレベルの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる、請求項１４に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項16】
前記１つまたは複数の変異アレルが、プロモーター、５’ＵＴＲ、第１のエクソン、第１のイントロン、第２のエクソン、第２のイントロン、第３のエクソン、３’ＵＴＲ、ターミネーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列領域中に変異を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項17】
前記１つまたは複数の変異アレルが、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異タイプを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項18】
前記１つまたは複数の変異アレルが、以下：ＱＰＴタンパク質切断、翻訳不可能なＱＰＴ遺伝子転写物、非機能的なＱＰＴタンパク質、ＱＰＴ遺伝子中の未成熟終止コドン、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を結果としてもたらす、請求項１～１７のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項19】
前記１つまたは複数の変異アレルが、野生型ＱＰＴ遺伝子と比べて１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項20】
前記１つまたは複数の変異アレルが、ホモ接合、ヘテロ接合、およびヘテロアレルからなる群から選択される接合状態を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項21】
前記１つまたは複数の変異アレルが、前記ＱＰＴ遺伝子の少なくとも１つにおいてホモ接合またはヘテロアレルである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項22】
前記１つまたは複数の変異アレルが、前記ＱＰＴ遺伝子の少なくとも３つにおいてホモ接合またはヘテロアレルである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項23】
前記１つまたは複数の変異アレルが、前記ＱＰＴ遺伝子の４つ全てにおいてホモ接合またはヘテロアレルである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項24】
前記少なくとも２つのＱＰＴ遺伝子が、ＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ２ｂである、請求項１０に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項25】
前記タバコ植物が、乾燥重量で０．１５％未満、０．１２５％未満、０．１％未満、０．０８％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、および０．０１％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む葉を生成することができる、請求項１～２４のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項26】
前記タバコ植物が、乾燥重量で１％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、および０．２％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる、請求項１～２５のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項27】
前記タバコ植物が、２～０．０５、１．９～０．０５、１．８～０．０５、１．７～０．０５、１．６～０．０５、１．５～０．０５、１．４～０．０５、１．３～０．０５、１．２～０．０５、１．１～０．０５、１．０～０．０５、０．９～０．０５、０．８～０．０５、０．７～０．０５、０．６～０．０５、０．５～０．０５、０．４～０．０５、０．３～０．０５、０．２～０．０５、０．１５～０．０５、または０．１～０．０５ ｐｐｍの総ＴＳＮＡレベルを含む乾燥葉を生成することができる、請求項１～２６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか一項に記載のタバコ植物の集団。
【請求項29】
請求項１～８または１０～２８のいずれか一項に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
【請求項30】
熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥プロセスによって作製される、請求項２９に記載の乾燥タバコ材料。
【請求項31】
請求項２９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
【請求項32】
前記乾燥タバコ材料が、重量で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、請求項３１に記載のタバコブレンド物。
【請求項33】
前記乾燥タバコ材料が、体積で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、請求項３１に記載のタバコブレンド物。
【請求項34】
請求項２９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
【請求項35】
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、請求項３４に記載のタバコ製品。
【請求項36】
無煙タバコ製品である、請求項３４に記載のタバコ製品。
【請求項37】
前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、請求項３６に記載のタバコ製品。
【請求項38】
請求項２９に記載の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照および配列表の組込み
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／９１３，３５７号の優先権を主張する。４９，９４９バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり、２０２０年１０月９日に作成された「Ｐ３４７３６ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／９１３，３５７号の優先権を主張する。４９，９４９バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり、２０２０年１０月９日に作成された「Ｐ３４７３６ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
【0002】
分野
本開示は、アルカロイドおよびニコチンレベルをモジュレートするためのタバコ遺伝子操作を提供する。
本開示は、アルカロイドおよびニコチンレベルをモジュレートするためのタバコ遺伝子操作を提供する。
【背景技術】
【0003】
背景
ニコチンは、商用タバコ栽培品種において総アルカロイドの９０～９５％より多くを通常占める、主なアルカロイドである。残りのアルカロイド画分は、主として、３つの追加のアルカロイド：ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンで構成されている。低減したニコチンレベルを有するタバコ植物は、様々なニコチン生合成遺伝子および転写調節因子をモジュレートすることによって、変化しかつ一貫しない結果を伴って達成されている。タバコ葉においてニコチンレベルを低減させる新たな技術について、必要性がある。
ニコチンは、商用タバコ栽培品種において総アルカロイドの９０～９５％より多くを通常占める、主なアルカロイドである。残りのアルカロイド画分は、主として、３つの追加のアルカロイド：ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンで構成されている。低減したニコチンレベルを有するタバコ植物は、様々なニコチン生合成遺伝子および転写調節因子をモジュレートすることによって、変化しかつ一貫しない結果を伴って達成されている。タバコ葉においてニコチンレベルを低減させる新たな技術について、必要性がある。
【発明の概要】
【0004】
概要
本開示は、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに、該タバコ植物からのタバコ製品の作製を提供する。
本開示は、変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに、該タバコ植物からのタバコ製品の作製を提供する。
【0005】
一局面では、本開示は、ＱＰＴ１ａ（ｇ９８６５４）、ＱＰＴ１ｂ（ｇ８２２１０）、ＱＰＴ２ａ（ｇ８２２１１）、およびＱＰＴ２ｂ（ｇ９８６５５）からなる群から選択される少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、タバコ植物またはその部分を提供し、該タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、該１つまたは複数の変異アレルを有しない対照タバコ植物由来の葉のニコチンレベル未満のニコチンレベルを含む葉を生成することができる。
【0006】
別の局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも２つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。
【0007】
さらなる局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも３つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。
【0008】
別の局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも４つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。
【0009】
一局面では、本開示は、単一ｑｐｔ変異体、二重ｑｐｔ変異体、三重ｑｐｔ変異体、および四重ｑｐｔ変異体からなる群から選択されるタバコ植物を提供する。
【0010】
一局面では、本開示は、表１１Ａおよび１１Ｂに列記されるようなタバコ植物を提供する。別の局面では、本開示は、自殖または表１１Ａおよび１１Ｂにおける別の植物との交雑のいずれかからの、表１１Ａおよび１１Ｂにおけるタバコ植物の子孫植物を提供する。
【0011】
別の局面では、本開示は、単一ｑｐｔ変異体または二重ｑｐｔ変異体を生じるように表１１Ａおよび１１Ｂに列記されるｑｐｔ変異アレルの様々な組み合わせを含む、タバコ植物を提供する。
【0012】
本開示は、開示されるタバコ植物、株、品種、またはハイブリッドからの植物材料を含む、乾燥タバコ、タバコブレンド物、タバコ製品をさらに提供する。
【0013】
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４は、ＴＮ９０参照ゲノム由来の、それぞれ、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂの例示的なゲノム配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４は、ＴＮ９０参照ゲノム由来の、それぞれ、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂの例示的なゲノム配列を示す。
【0014】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～８は、ＴＮ９０由来の、それぞれ、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂの例示的なｃＤＮＡ配列を示す。
【0015】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１２は、ＴＮ９０由来の、それぞれ、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂの例示的なポリペプチド配列を示す。
【0016】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、例となるガイドＲＮＡ配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】タバコゲノムにおけるＱＰＴ遺伝子の遺伝子マップ。
【図2】ＴＮ９０の根における４つのＱＰＴ遺伝子のＲＮＡ発現。ＲＰＫＭ＝１００万個のマップされた読み取り当たりの、１キロベースの転写物当たりの読み取り。
【図3】断片分析によって同定されるような、ノックアウトインデルを含む候補タバコカルスの図示。上のパネルは、ＴＮ９０候補カルス＃４４からのＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ２ｂ両方の断片分析結果を示す。下のパネルは、Ｋ３２６候補カルス＃１３９からのＱＰＴ２ｂの断片分析結果を示す。非改変のＱＰＴ遺伝子断片は、影付きであり、編集されたＱＰＴ遺伝子断片は、影付きで、かつ黒い星で印をつけている。
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的で、以下の用語を下記で定義する。
他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的で、以下の用語を下記で定義する。
【0019】
例えば、全ての特許および刊行物を含む本明細書において引用されるいずれの参考文献も、参照することによりその全体が組み込まれる。
【0020】
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含んでもよい。
【0021】
「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、示される数値より１０％上および下に境界を広げることによって、その範囲を加減する。
【0022】
本明細書において使用される場合、「未満」、「より多い」、「少なくとも」、「最大で」、「およそ」、「より下」、「より上」、および「約」などの句は、一連の数値と組み合わせて使用される場合、一連の中のどの数値も修飾する。例えば、「１％、２％、または３％未満」という表現は、「１％未満、２％未満、または３％未満」と等価である。
【0023】
本明細書において使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）種からの植物を指す。
【0024】
タバコにおけるニコチン生合成は、酵素アスパラギン酸オキシダーゼ１（ＡＯ１）および（ＡＯ２）によるアスパラギン酸からα－イミノコハク酸への変換を含む。そこから、α－イミノコハク酸は、キノリン酸合成酵素（ＱＳ）によってキノリン酸に変換される。次いで、キノリン酸は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＱＰＴ１）およびＱＰＴ２によってニコチン酸モノヌクレオチドに変換される。次いで、ニコチン酸モノヌクレオチドは、ニコチンの直接の前駆体としてタバコによって使用され得る。
【0025】
ＱＰＴ酵素は、酵素分類システム下でＥＣ２．４．２．１９として分類される。ニコチアナ・タバカムにおいて、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂと呼ばれる４つの遺伝子が、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードしている。表８Ａは、ＴＮ９０植物におけるこれら４つのＱＰＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質配列を列記する。本開示は、ＱＰＴ遺伝子を編集して、葉の品質を維持しながら低減したニコチンレベルを有するｑｐｔ変異体植物を作製するために使用される、組成物および方法を記載する。
【0026】
本明細書において使用される場合、「ＱＰＴ１ａ」または「ＱＰＴ１ａ遺伝子」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるような、ＴＮ９０における例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコ中の遺伝子座を指す。
【0027】
本明細書において使用される場合、「ＱＰＴ１ｂ」または「ＱＰＴ１ｂ遺伝子」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるような、ＴＮ９０における例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコ中の遺伝子座を指す。
【0028】
本明細書において使用される場合、「ＱＰＴ２ａ」または「ＱＰＴ２ａ遺伝子」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるような、ＴＮ９０における例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコ中の遺伝子座を指す。
【0029】
本明細書において使用される場合、「ＱＰＴ２ｂ」または「ＱＰＴ２ｂ遺伝子」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるような、ＴＮ９０における例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコ中の遺伝子座を指す。
【0030】
本明細書において使用される場合、変異は、遺伝子によりコードされる産物の発現または活性を低減する、阻害する、または排除するために遺伝子に導入される、遺伝性の遺伝子改変を指す。そのような改変は、遺伝子の任意の配列領域中、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域中にあり得る。一局面では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種中に存在する天然の多型ではない。本明細書において使用される場合、「変異アレル」は、変異を含む、遺伝子座からのアレルを指す。
【0031】
本明細書において使用される場合、「ｑｐｔ変異体」は、１つまたは複数のＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異を含むタバコ植物を指す。ｑｐｔ変異体は、単一変異体、二重変異体、三重変異体、または四重変異体であり得る。本明細書において使用される場合、単一、二重、三重、または四重のｑｐｔ変異体は、それぞれ、１つ、２つ、３つ、または４つのＱＰＴ遺伝子中に改変を有する変異体を指す。ｑｐｔ変異体はまた、１つまたは複数のＱＰＴ遺伝子におけるホモ接合変異体、ヘテロ接合変異体、またはヘテロアレル変異体の組み合わせであり得る。
【0032】
本明細書において使用される場合、遺伝子名または遺伝子座名は、大文字で表記され、かつイタリック体で示され、例えば、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂである。タンパク質またはポリペプチドの名称は、イタリック体にされずに大文字で表記され、例えば、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂである。変異体名（遺伝子もしくは遺伝子の群中の一般的な変異を参照するか、または特定の変異アレルを参照するかのいずれかについて）は、小文字およびイタリック体で示され、例えば、ｑｐｔ、ｑｐｔ１ａ、ｑｐｔ１ｂ、ｑｐｔ２ａ、およびｑｐｔ２ｂである。
【0033】
一局面では、本開示は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む、タバコ植物またはその部分を提供し、該タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、該１つまたは複数の変異アレルを有しない対照タバコ植物由来の葉のニコチンレベル未満のニコチンレベルを含む葉を生成することができる。一局面では、単一ｑｐｔ変異体タバコ植物が提供される。別の局面では、単一ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、単一ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、８０％より少ない、９０％より少ない、または９５％より少ないレベルのニコチンを含む。さらなる局面では、単一ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、単一ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％のレベルのニコチンを含む。
【0034】
別の局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも２つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。一局面では、二重ｑｐｔ変異体タバコ植物が提供される。別の局面では、二重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、二重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、８０％より少ない、９０％より少ない、または９５％より少ないレベルのニコチンを含む。さらなる局面では、二重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、二重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％のレベルのニコチンを含む。
【0035】
さらなる局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも３つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。一局面では、三重ｑｐｔ変異体タバコ植物が提供される。別の局面では、三重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、三重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、８０％より少ない、９０％より少ない、または９５％より少ないレベルのニコチンを含む。さらなる局面では、三重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、三重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％のレベルのニコチンを含む。
【0036】
別の局面では、タバコ植物は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂからなる群から選択される少なくとも４つのＱＰＴ遺伝子中に１つまたは複数の変異アレルを含む。一局面では、四重ｑｐｔ変異体タバコ植物が提供される。別の局面では、四重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、四重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、８０％より少ない、９０％より少ない、または９５％より少ないレベルのニコチンを含む。さらなる局面では、四重ｑｐｔ変異体タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の、四重ｑｐｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％のレベルのニコチンを含む。
【0037】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、単一ｑｐｔ変異体、二重ｑｐｔ変異体、三重ｑｐｔ変異体、または四重ｑｐｔ変異体である。別の局面では、タバコ植物は、表１１Ａおよび１１Ｂに列記される１つまたは複数のｑｐｔ変異アレルを含む。表１１Ａおよび１１Ｂに列記されるｑｐｔ変異アレルのどの組み合わせもまた、単一ｑｐｔ変異体、二重ｑｐｔ変異体、三重ｑｐｔ変異体、または四重ｑｐｔ変異体を生じるために提供される。変異した遺伝子座の各々は、ホモ接合もしくはヘテロ接合のいずれかであり得るか、またはヘテロアレルの組み合わせを含む。別の局面では、タバコ植物は、表１１Ａおよび１１Ｂに列記される各個々の株について示されるようなｑｐｔ変異体遺伝子型の組み合わせを含む。
【0038】
一局面では、タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、対照タバコ植物由来の葉のニコチンレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％未満のニコチンレベルを含む葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、対照タバコ植物のニコチンレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％のニコチンレベルを含む葉を生成することができる。
【0039】
別の局面では、タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、対照タバコ植物由来の葉の総アルカロイドレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％未満の総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、対照タバコ植物の総アルカロイドレベルの１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～９５％の総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる。
【0040】
さらなる局面では、タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、対照タバコ植物由来の葉の総アルカロイドレベルの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる。
【0041】
一局面では、変異体ｑｐｔアレルは、プロモーター、５’ＵＴＲ、第１のエクソン、第１のイントロン、第２のエクソン、第２のイントロン、第３のエクソン、第３のイントロン、第４のエクソン、第４のイントロン、第５のエクソン、第５のイントロン、第６のエクソン、第６のイントロン、第７のエクソン、第７のイントロン、第８のエクソン、３’ＵＴＲ、ターミネーター、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＱＰＴ配列領域中に変異を含む。別の局面では、変異体ｑｐｔアレルは、表８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ、および８Ｇに列記されるＱＰＴゲノム配列領域中に変異を含む。
【0042】
別の局面では、変異体ｑｐｔアレルは、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異タイプを含む。一局面では、変異体ｑｐｔアレルは、ヌルアレルまたはノックアウトアレルである。
【0043】
一局面では、変異体ｑｐｔアレルは、以下：ＱＰＴタンパク質切断、翻訳不可能なＱＰＴ遺伝子転写物、非機能的なＱＰＴタンパク質、ＱＰＴ遺伝子中の未成熟終止コドン、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を結果としてもたらす。
【0044】
別の局面では、変異体ｑｐｔアレルは、野生型ＱＰＴ遺伝子と比べて１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む。
【0045】
一局面では、ｑｐｔ変異体は、ホモ接合、ヘテロ接合、およびヘテロアレルからなる群から選択される接合状態を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つのＱＰＴ遺伝子においてホモ接合またはヘテロアレルである。一局面では、ｑｐｔ変異体は、少なくとも１つのＱＰＴ遺伝子においてホモ接合またはヘテロアレルである。一局面では、ｑｐｔ変異体は、少なくとも２つのＱＰＴ遺伝子においてホモ接合またはヘテロアレルである。一局面では、ｑｐｔ変異体は、少なくとも３つのＱＰＴ遺伝子においてホモ接合またはヘテロアレルである。一局面では、ｑｐｔ変異体は、少なくとも４つのＱＰＴ遺伝子においてホモ接合またはヘテロアレルである。
【0046】
一局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａ中に少なくとも１つの変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ｂ中に少なくとも１つの変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ２ａ中に少なくとも１つの変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ２ｂ中に少なくとも１つの変異を含む。
【0047】
一局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａおよびＱＰＴ１ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａおよびＱＰＴ２ａ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａおよびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ１ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ｂおよびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。
【0048】
一局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、およびＱＰＴ２ａ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、およびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。
【0049】
別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂ中に変異を含む。
【0050】
一局面では、タバコ植物は、乾燥重量で０．１５％未満、０．１２５％未満、０．１％未満、０．０８％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、および０．０１％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む葉を生成することができる。
【0051】
別の局面では、タバコ植物は、乾燥重量で１％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、および０．２％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含む葉を生成することができる。
【0052】
さらなる局面では、タバコ植物は、２～０．０５、１．９～０．０５、１．８～０．０５、１．７～０．０５、１．６～０．０５、１．５～０．０５、１．４～０．０５、１．３～０．０５、１．２～０．０５、１．１～０．０５、１．０～０．０５、０．９～０．０５、０．８～０．０５、０．７～０．０５、０．６～０．０５、０．５～０．０５、０．４～０．０５、０．３～０．０５、０．２～０．０５、０．１５～０．０５、または０．１～０．０５百万分率（ｐｐｍ）の総ＴＳＮＡレベルを含む乾燥葉を生成することができる。
【0053】
一局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、５０またはそれ以上、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、および９５またはそれ以上からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、類似の条件において生育および乾燥させた場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、改変を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、類似の条件において生育させた場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、改変を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
【0054】
一局面では、タバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、または８０％より少ないレベルのニコチンを含み、対照植物は、改変を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。
【0055】
さらなる局面では、タバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異アレルを含み、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、ベルベリンブリッジ酵素様（ＢＢＬ）、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を直接抑制する、トランスジーンまたは変異をさらに含む。
【0056】
一局面では、タバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異アレルを含み、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中に１つまたはそれ以上の変異をさらに含む。Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）；およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、またはその両方中に１つまたは複数の変異をさらに含む。
【0057】
一局面では、タバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異アレルを含み、Ｎｉｃ１遺伝子座（または、ＷＯ／２０１９／１４０２９７として公開されている、２０１９年１月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１３３４５におけるようなＮｉｃ１ｂ遺伝子座）のＥＲＦ遺伝子中に変異をさらに含む。ＷＯ／２０１８／２３７１０７もまた参照されたい。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つもしくはそれ以上の遺伝子中に１つまたは複数の変異をさらに含む。Ｋａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、または６つ全ての遺伝子中に１つまたは複数の変異をさらに含む。
【0058】
遺伝子型、環境、受精、および耕種学的実施を含む様々な要因が、タバコアルカロイドレベルに影響を及ぼす（例えば、ニコチン産生は、摘心、傷、および草食動物による損傷によって刺激される）。キューバシガータバコ品種の系統において最初に見出された低アルカロイド形質が、一連の戻し交雑を通じてシガレット品種に導入された。その後、低アルカロイドのタバコ生殖質は、栽培品種Ｂｕｒｌｅｙ２１の遺伝的背景に登録された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０））。低アルカロイドＢｕｒｌｅｙ２１（ＬＡ ＢＵ２１）株を用いた遺伝学的研究により、２つの非連鎖の遺伝子座が、タバコ葉におけるニコチンレベルに寄与することが示された。これらの２つの遺伝子座は、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２と称される。ＬＡ ＢＵ２１におけるｎｉｃ１およびｎｉｃ２（それぞれ、ニコチン１およびニコチン２と同じ）変異は、半優性である。それらは、ニコチンレベルに対して用量依存的な効果を示し、ｎｉｃ１の効果は、ｎｉｃ２の効果よりも約２．４倍強い。Ｎｉｃ２遺伝子座の分子的特徴が、報告されている。ｎｉｃ２変異は、エチレン応答因子（ＥＲＦ）ファミリー由来の転写因子遺伝子のクラスター、例えば、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８の欠失を含有することが示された（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０））。
【0059】
タバコにおいて総アルカロイド含有量を低減することは、多くの利益を有し得る。それは、バイオマス資源としてのタバコの価値を増加させ得る。タバコ植物におけるニコチンアルカロイドの増加は、昆虫および草食動物から植物を保護する上で重要な役割を果たす可能性がある。
【0060】
昆虫防御におけるアルカロイドの役割と一貫して、ＬＡ ＢＵ２１は、昆虫損傷に対して極めて感受性であると報告された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０））。低い総アルカロイドパーセンテージ（およそ０．２０％）を有する熱風乾燥タバコの同質遺伝子株をその「正常な」反復親（総アルカロイドは１．８５～２．７０％）と比較したさらなる研究は、低アルカロイド株における収率、グレード指数、総Ｎ、および還元糖含有量が、正常な熱風乾燥栽培品種におけるよりも低かったことを報告した（Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６（３）：４１６－１８（１９７６））。
【0061】
本明細書において使用される場合、タバコの「低アルカロイド品種」は、総アルカロイド（乾燥重量で測定）を、１つまたは複数の遺伝子改変を除いて実質的に類似の遺伝的背景の対照タバコ品種における総アルカロイドレベルの２５％未満のレベルまで低減する、１つまたは複数の遺伝子改変を含むタバコ品種を指す。非限定的な例として、ＫＹ１７１が、低アルカロイド品種ＬＡ ＫＹ１７１に対する対照として働き得る。
【0062】
一局面では、本開示は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、および０．００５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む、ｑｐｔ変異体タバコ植物またはその部分を提供し、該タバコ植物は、乾燥させた場合に、５０またはそれ以上、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、および９５またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、そのようなｑｐｔ変異体タバコ植物は、０．０２％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥させた場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、そのようなタバコ植物は、０．０１％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥させた場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
【0063】
一局面では、本開示はまた、非トランスジェニック変異を含むタバコ植物またはその部分を提供し、該非トランスジェニック変異は、タバコ植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルを、類似の生育条件において生育させた場合の対照植物のニコチンレベルの１％より下、２％より下、５％より下、８％より下、１０％より下、１２％より下、１５％より下、２０％より下、２５％より下、３０％より下、４０％より下、５０％より下、６０％より下、７０％より下、または８０％より下まで低減し、該タバコ植物は、乾燥させた場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、該対照植物は、非トランスジェニック変異を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。
【0064】
一局面では、タバコ植物は、ランダム変異誘発および標的指向性変異誘発からなる群から選択されるアプローチにより導入される、ｑｐｔ変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択される標的指向性変異誘発アプローチにより導入される。
【0065】
特に定めない限り、タバコ植物、品種、栽培品種、または株についての本明細書において言及されるアルカロイドもしくはニコチンレベル（もしくは別の葉の化学もしくは特性の特徴）の測定値または葉グレード指数値は、例えば、単一の植物の複数の葉の平均、または単一の品種、栽培品種、もしくは株由来のタバコ植物の集団からの平均測定値を含む、平均測定値を指す。
【0066】
特に定めない限り、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心後に葉番号３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において摘心後に測定される。本明細書において使用される場合、２つの植物（例えば、変異体植物 対 対照植物）からの葉の間の比較が言及される時はいつでも、比較が、他の要因からではなく、遺伝子型の違いによる効果を示すことができるように、同じかまたは同等の茎上の位置および発達ステージからの葉が意図される。実例として、野生型対照植物の葉３は、ｑｐｔ変異体植物の葉３と比較するための参照点として意図される。一局面では、少なくとも１つのｑｐｔ変異を含むタバコ植物は、同じタバコ品種の対照タバコ植物と比較される。
【0067】
タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、代替的な方法で測定することもできる。一局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、ニコチンまたはアルカロイド（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）の最も高いレベルを有する葉において摘心後に測定される。一局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベルは、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される連続する葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する葉において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する３つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。
【0068】
本明細書において使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、葉番号１は、摘心後の最も若い葉（上部）であり、最も高い葉番号は、最も古い葉（下部）に割り当てられる。
【0069】
平均測定値（例えば、アルカロイドもしくはニコチンレベルまたは葉のグレード付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコ葉の集合物は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０といった任意のサイズであり得る。産業上承認される標準的なプロトコールに従って平均測定値またはグレード指数値が決定される。
【0070】
本明細書において使用される場合、「摘心」は、タバコ植物が栄養成熟に近くかつ生殖生長の開始時期にある時の、茎頂分裂組織、花、および数枚までの隣接する葉を含む、茎の頂部の除去を指す。典型的には、タバコ植物は、つぼみステージ（花が現れ始めた直後）において摘心される。例えば、温室または野外生育のタバコ植物は、５０％の植物が少なくとも１つの開いた花を有する時に摘心され得る。タバコ植物の摘心は、頂芽優勢の喪失を結果としてもたらし、かつアルカロイド産生の増大も誘導する。
【0071】
そうではないと示さない限り、タバコ植物のニコチンもしくはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから２週間後に測定される。代替として、他の時点を使用することもできる。一局面では、タバコ植物のニコチンもしくはアルカロイドレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約１、約２、約３、約４、または約５週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約３、約５、約７、約１０、約１２、約１４、約１７、約１９、または約２１日後に測定される。
【0072】
本明細書において使用される場合、「類似の生育条件」または「同等の生育条件」は、生育のためおよび２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間の意味のある比較を行うための類似の環境条件および／または耕種学的実施であって、環境条件および耕種学的実施のいずれも、２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間に観察される任意の差異に寄与せず、かつ該差異の説明とならないような、類似の環境条件および／または耕種学的実施を指す。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、ならびに栄養物（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。耕種学的実施としては、例えば、種まき、切取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、切落し（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植、摘心、および吸枝が挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９）、ｐｐ ７０－１０３のＣｈａｐｔｅｒ ４Ｂおよび４Ｃを参照。
【0073】
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコ中の主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム中のアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコ中の他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン－ｎ－オキシド、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、およびその他が挙げられる。
【0074】
アルカロイドレベルは、当技術分野において公知の方法により、例えば、気体－液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量化により、アッセイされ得る。例えば、ニコチンアルカロイドレベルは、キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を備えた気体－液体クロマトグラフィーを使用する方法のためのＣＯＲＥＳＴＡ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ．７、１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ ＴＣ １２６Ｎ ３９４ Ｅ．；Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００：８２６－３５（１９９２）も参照）に基づくＧＣ－ＦＩＤ法により測定され得る。
【0075】
特にそうではないと示さない限り、アルカロイドおよびニコチンレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、ならびにＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３、１９９９において刊行（およびＶｏｌ．７４、Ｎｏ．４、Ｊａｎｕａｒｙ ７、２００９において補正）されたＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を使用して測定される。代替的に、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：７９－８１（１９６９）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。簡潔に述べれば、タバコの試料を乾燥させ、粉砕し、抽出した後に、総アルカロイドおよび還元糖の分析を行うことができる。方法では次に、脱色のために酢酸／メタノール／水抽出および木炭が用いられる。総アルカロイドの決定は、有色複合体を形成するための芳香族アミンの存在下でのニコチンアルカロイドとの塩化シアノゲンの反応に基づき、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。特に定めない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）に基づく。
【0076】
一局面では、タバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、タバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
【0077】
本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉グレード指数値に対して負の影響を有さずに変化したニコチンレベルを有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。タバコグレードは、葉の茎上の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、熟度、感触、弾性、光沢（葉の呈色の強度および深さ、ならびに輝きに関する）、吸湿性（周囲の水分を吸収および保持するタバコ葉の能力）、ならびに緑色の特徴または色合いが挙げられるがそれに限定されない要因に基づいて評価される。葉グレードは、例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにより刊行されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅ（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）を使用して決定され得る。例えば、１９９０年１１月５日（５５ Ｆ．Ｒ．４０６４５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ３１ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９３）；１９８９年３月２７日（５４ Ｆ．Ｒ．７９２５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｅ－Ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ １１，１２，１３，１４ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９２）；１９６５年１月８日（２９ Ｆ．Ｒ．１６８５４）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｅｅｄｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ４１）；１９６３年１２月８日（２８ Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８ Ｆ．Ｒ．１１９２６）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｏｈｉｏ Ｃｉｇａｒ－Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ４２，４３，ａｎｄ ４４）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９７１年４月に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｏｒｇｉａ ａｎｄ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｓｈａｄｅ－Ｇｒｏｗｎ Ｃｉｇａｒ－Ｗｒａｐｐｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ６２）を参照。ＵＳＤＡグレード指数値は、産業上承認されたグレード指数にしたがって決定され得る。例えば、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２：３９－４０（１９８８）；Ｌｅｇａｃｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃５２３２６７８２６－５２３２６７８３３、Ｊｕｌｙ １、１９８８、Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｏｓｅｄ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ）；およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｔｅｒｎ．、１９２：５５－５７（全ての以上の参考文献は参照することにより全体が組み込まれる）を参照。一局面では、ＵＳＤＡグレード指数は、受領された連邦政府のグレードの０～１００の数値表現であり、全ての茎上の位置の加重平均である。より高いグレード指数はより高い品質を指し示す。代替的に、葉グレードは、ハイパースペクトルイメージングを介して決定され得る。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（公開日２０１１年３月１０日；参照することにより全体が組み込まれる）を参照。
【0078】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの１つまたは複数のタバコ芳香化合物を含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育させた場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたは複数のタバコ芳香化合物を含む。
【0079】
本明細書において使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味および芳香と関連付けられる化合物である。これらの化合物としては、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブラノイドおよびラブダノイドジテルペン、ならびに糖エステルが挙げられるがそれに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー連結質量分析が挙げられるがそれに限定されない当技術分野における任意の公知の代謝物プロファイリング方法により測定され得る。Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、ＷｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＫａｈｌ編、（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ ２８、２０１３）を参照。
【0080】
本明細書において使用される場合、「還元糖」は、遊離のまたは潜在的に遊離のアルデヒドまたはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減することおよび「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することにより、シガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。還元糖は、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの知覚的影響を改変することにより、煙の風味の均衡を取る。糖含有量とアルカロイド含有量との逆の関係性が、タバコ品種にわたり、同じ品種内において、および栽培条件により引き起こされる同じ植物株内において報告されている。還元糖レベルは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。銅ネオクプロインが試料に添加され、溶液が加熱される。銅ネオクプロインキレートは糖の存在下で還元されて有色複合体を結果としてもたらし、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。
【0081】
一局面では、タバコ植物は、１つまたは複数のQPT遺伝子座からQPT酵素活性を低減または除去する１つまたは複数のQPT遺伝子座における１つまたは複数の天然に存在しない変異アレルを含む。一局面では、これらの変異アレルは、より低いニコチンレベルを結果としてもたらす。変異体ｑｐｔアレルは、ランダムまたは標的指向性変異誘発アプローチを含む当技術分野において公知の任意の方法により導入され得る。
【0082】
そのような変異誘発方法としては、エチルメチルスルフェート（ＥＭＳ）（ＨｉｌｄｅｒｉｎｇおよびＶｅｒｋｅｒｋ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ、ｐｐ ３１７－３２０、１９６５）またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７－２０３、１９７１；およびＰｏｅｈｌｍａｎ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ）、１９８７を参照）、トランスポゾンタグ付加（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８４；米国特許第４，７３２，８５６号および米国特許第５，０１３，６５８号）を用いる種子の処理の他に、Ｔ－ＤＮＡ挿入方法論（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８３；米国特許第５，１４９，６４５号）が挙げられるがそれに限定されない。ＥＭＳ誘導変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、中性子衝撃は二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または除去することを含む。タバコ遺伝子中に存在し得る変異の種類としては、例えば、点変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコーディング領域中に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域、およびイントロン、または非翻訳領域中の変異もまた望ましいことがある。
【0083】
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されるＰＣＲ産物の選択的なエンドヌクレアーゼ消化を使用する、化学的に誘導される変異のためのスクリーニングの迅速かつ自動化可能な方法、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）もまた本開示に応用可能である。ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５－４５７を参照。遺伝子発現に影響するまたは遺伝子の機能に干渉する変異は、当技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体を結果としてもたらす。保存された残基中の変異は、タンパク質の機能の阻害において特に効果的であり得る。一局面では、タバコ植物は、本明細書に記載の１つまたは複数のQPT遺伝子中のナンセンス（例えば、終止コドン）変異を含む。
【0084】
変異を同定する時、内因性参照ＤＮＡ配列は、同じ品種のタバコに由来するべきであることが理解されるであろう。例えば、変異を含む改変タバコ植物が品種ＴＮ９０からである場合には、内因性参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）からの相同配列ではなく、内因性ＴＮ９０配列でなければならない。同様に、変異を含む改変タバコ細胞がＴＮ９０細胞である場合には、内因性参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）由来のタバコ細胞からの相同配列ではなく、内因性ＴＮ９０配列でなければならない。
【0085】
一局面では、本開示はまた、商業的に許容される葉品質を維持しながら変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。この株は、精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびそれらの組み合わせを介して１つまたは複数のQPT遺伝子中に変異を導入することにより産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照）。例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（７）：３９７－４０５（２０１３）を参照。
【0086】
変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を介してもよい。スクリーニングおよび選択の方法論の例としては、サザン解析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物の検出のためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性の検出のための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが挙げられるがそれに限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用され得る。参照される全ての技術を行うための方法は公知である。
【0087】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼにより変異誘発または編集される。
【0088】
本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性の植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０ヌクレオチドの標的指向性変異誘発、または内因性の植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一局面では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８およびその断片からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。別の局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１２からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【0089】
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それは次に、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスにより修復される。次に、切断された部位において配列改変が行われ、それは、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を結果としてもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組込みを含み得る。一局面では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集して、ドナーポリヌクレオチドを用いるＨＲを介して植物ゲノム中の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド超を変異させる工程を含む。一局面では、提供される変異は、ヌクレアーゼを使用するゲノム編集により引き起こされる。別の局面では、提供される変異は、非相同末端結合または相同組換えにより引き起こされる。
【0090】
一般的に微生物において同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的な消化を結果としてもたらす高い活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する特有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作型は、典型的には、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４～４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作より困難であり得、その理由は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識と切断機能が単一ドメインにおいて絡み合っているからである。特有の配列を認識しかつ向上したヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作製するために変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特別の方法が使用されている。
【0091】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために二本鎖ＤＮＡの任意の長さと言ってよい長さのストレッチを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガーアレイに融合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的なＤＮＡ切断ドメインから構成される単量体から二量体を形成する。
【0092】
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～４個のジンクフィンガーアレイから構成される。標的ＤＮＡへの部位特異的な結合に寄与するジンクフィンガ∞－ヘリックスの開始に対して－１、＋２、＋３、および＋６の位置のアミノ酸を変更およびカスタマイズして、特定の標的配列に適合させることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を有するＺＦＮを生成する。ＺＦＮ用の標的配列を選択するための規則は当技術分野において公知である。
【0093】
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、Ｃ末端領域を有する２つのＺＦＮは、切断部位の対向するＤＮＡ鎖（５～７ｂｐだけ分離されている）に結合することが必要とされる。２－ＺＦ－結合部位がパリンドロームの場合、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＺＦＮからの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働くように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
【0094】
いかなる科学理論によっても限定されないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法の１つを使用して原理的に再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは理論的に、ほぼすべての遺伝子配列を標的指向するように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、およびＭｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。
【0095】
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化して標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働く一対のＴＡＬＥＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
【0096】
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥタンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の様々な植物細菌性病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。キサントモナス病原体は、感染の間に宿主植物細胞中にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは核に移動し、そこで宿主ゲノム中の特定の遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列を認識してそれに結合する。ＴＡＬＥは、３３～３４アミノ酸の１３～２８個のリピートモノマーから構成される中心のＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、位置１２および１３における超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮはそれぞれ、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを優先的に認識し、ＲＶＤのモジュレーションは、連続するＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによる特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。
【0097】
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインの他に、変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントが、切断特異性および切断活性を向上させるために設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および空間的配置を有する標的ゲノム中の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。
【0098】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係性は、設計可能なタンパク質を可能とする。ＤＮＡ Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７－１２２．；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２；およびｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照。
【0099】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＦｏｋＩベースの方法のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するために相補的塩基対形成を使用するＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼに基づく。
【0100】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の部分であり、配列依存的な方式で外来ＤＮＡを切断することによりウイルスなどの侵入性核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端における２つの隣接リピートの間のスペーサーとして公知の侵入性ＤＮＡの短い断片の組込みにより獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入性ＤＮＡとのその後の遭遇の間に転写され、約４０ｎｔの長さの低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と合わさってＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化およびガイドする。これは侵入性ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして公知の相同的二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断のための必要条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５－ＮＧＧ－３、より低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流のいわゆる「シード配列」により提供され、これはＲＮＡと標的ＤＮＡとの間でマッチしなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はＣａｓ９と類似の方式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。
【0101】
さらに別の局面では、本明細書に提供されるタバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異を含み、かつニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座中の１つまたは複数の変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与するニコチンデメチラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子座中の１つまたは複数の変異（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）をさらに含む（米国特許第８，３１９，０１１号、同第８，１２４，８５１号、同第９，１８７，７５９号、同第９，２２８，１９４号、同第９，２２８，１９５号、同第９，２４７，７０６号を参照）。一局面では、記載されるタバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥させた場合の対照植物と比較して低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。
【0102】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、野生型対照タバコ植物由来の葉のアナバシンレベル未満のアナバシンレベルを含む葉を生成することができる、変異をさらに含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、野生型対照タバコ植物由来の葉のアナバシンレベルの５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％未満のアナバシンレベルを含む葉を生成することができる、変異をさらに含む。
【0103】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の対照タバコ植物からの葉と比較して、２倍より大きいアナタビンレベルの低減を含む葉を生成することができる、さらなる変異を含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の野生型対照タバコ植物からの葉と比較して、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、または１３倍より大きいアナタビンレベルの低減を含む葉を生成することができる、さらなる変異を含む。一局面では、より低いレベルのアナタビンを提供する変異は、米国特許出願公開第２０１４／０２８３１６５号および米国特許出願公開第２０１６／００１０１０３号に記載されている変異である。別の局面では、ｑｐｔ変異体は、ＰＭＴ遺伝子中に変異をさらに含む。さらなる局面では、ｑｐｔ変異体植物は、ＰＭＴ遺伝子の発現または活性を抑制するトランスジーンまたは変異をさらに含む。
【0104】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で生育および加工された場合の、野生型対照タバコ植物由来の葉のノルニコチンレベルの８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、または３５％未満のノルニコチンレベルを提供することができる、変異をさらに含む。
【0105】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、２未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０．０５未満のｐｐｍの総Ｎ－ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）レベルを含む、乾燥葉を生成することができる。
【0106】
別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、２～０．０５、１．９～０．０５、１．８～０．０５、１．７～０．０５、１．６～０．０５、１．５～０．０５、１．４～０．０５、１．３～０．０５、１．２～０．０５、１．１～０．０５、１．０～０．０５、０．９～０．０５、０．８～０．０５、０．７～０．０５、０．６～０．０５、０．５～０．０５、０．４～０．０５、０．３～０．０５、０．２～０．０５、０．１５～０．０５、または０．１～０．０５ ｐｐｍの総ＮＮＮレベルを含む、乾燥葉を生成することができる。
【0107】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、２未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０．０５未満のｐｐｍの総ニコチン由来ニトロソアミンケトン（ＮＮＫ）レベルを含む、乾燥葉を生成することができる。
【0108】
別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、２～０．０５、１．９～０．０５、１．８～０．０５、１．７～０．０５、１．６～０．０５、１．５～０．０５、１．４～０．０５、１．３～０．０５、１．２～０．０５、１．１～０．０５、１．０～０．０５、０．９～０．０５、０．８～０．０５、０．７～０．０５、０．６～０．０５、０．５～０．０５、０．４～０．０５、０．３～０．０５、０．２～０．０５、０．１５～０．０５、または０．１～０．０５ ｐｐｍの総ＮＮＫレベルを含む、乾燥葉を生成することができる。
【0109】
一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、増加したレベルの１つまたは複数の酸化防止剤を提供する、変異またはトランスジーンをさらに含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、内因性遺伝子中に遺伝子改変をさらに含み、かつ、該遺伝子改変を欠いた対照乾燥タバコ葉と比較して、乾燥葉において増加したレベルの１つまたは複数の酸化防止剤をさらに含み、該内因性遺伝子は、酸化防止剤生合成酵素、酸化防止剤の調節性転写因子、酸化防止剤輸送体、酸化防止剤代謝酵素、またはそれらの組み合わせをコードする。さらなる局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、トランスジーンをさらに含み、かつ、該トランスジーンを欠いた対照乾燥タバコ葉と比較して、乾燥葉において増加したレベルの１つまたは複数の酸化防止剤をさらに含み、該トランスジーンは、酸化防止剤生合成酵素、酸化防止剤の調節性転写因子、酸化防止剤輸送体、酸化防止剤代謝酵素、またはそれらの組み合わせをコードするか、または直接モジュレートする。一局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、ＡｔＰＡＰ１、ＮｔＡＮ２、ＮｔＡＮ１、ＮｔＪＡＦ１３、ＮｔＭｙｂ３、コリスミ酸ムターゼ、およびアロゲン酸デヒドラターゼ（ＡＤＴ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を発現する、トランスジーンまたはシスジェニック構築物をさらに含む。別の局面では、ｑｐｔ変異体タバコ植物は、ＷＩＰＯ公開第２０１８／０６７９８５号または米国特許出願公開第２０１８／０１１９１６３号に記載されているように、酸化防止剤を増加させるか、または１つもしくは複数のＴＳＮＡを減少させるための、１つまたは複数のトランスジーンまたは遺伝子改変をさらに含む。
【0110】
一局面では、記載されるタバコ植物は、改変されたタバコ植物である。本明細書において使用される場合、植物の文脈における「改変された」は、ある特定の目的で導入される、かつ天然の多型を超えた遺伝学的変更を含む植物を指す。
【0111】
一局面では、記載されるタバコ植物はシスジェニック植物である。本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物のみを起源とする（すなわち、非植物起源の成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一局面では、提供される植物、植物細胞、または植物ゲノムはシスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、使用準備済みのタバコ株に繋がり得る。別の局面では、提供されるタバコ植物は、非タバコの遺伝材料および配列のいずれも含まない。
【0112】
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」または遺伝子の発現は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
【0113】
一局面では、提供されるタバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異を含み、かつニコチン生合成または輸送に関与する１つまたは複数の遺伝子の発現または活性の低減をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシル－メチオニンシンセターゼ（ＳＡＭＳ）が挙げられるがそれに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウム陽イオンとの縮合段階を触媒するニコチンシンターゼは解明されていないが、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提唱されている。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照。Ａ６２２はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質をコードする。加えて、いくつかの輸送体がニコチンの移行に関与し得る。ＭＡＴＥと命名された輸送体遺伝子がクローニングおよび特徴決定されている（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ １０６：２４４７－５２（２００９））。
【0114】
一局面では、提供されるタバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異を含み、かつ対照タバコ植物と比較して、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異を含み、かつＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を直接的に抑制するトランスジーンをさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、１つまたは複数のｑｐｔ変異を含み、かつＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を抑制するトランスジーンまたは変異をさらに含む。
【0115】
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、Ｇａｌｐａｏタバコ、およびＯｒｉｅｎｔａｌタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。別の局面では、提供されるタバコ植物は、Ｂｕｒｌｅｙタバコ、Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ、およびダークタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。
【0116】
熱風乾燥タバコ（Ｖｉｒｇｉｎｉａまたは「ブライト」タバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ生産のおよそ４０％を占める。熱風乾燥タバコは、乾燥の間に達するゴールデンイエローからディープオレンジの色のため、多くの場合に「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽い、鮮烈な芳香および味を有する。熱風乾燥タバコは、概して、糖分が高くかつ油分が低い。主要な熱風乾燥タバコ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニア、および米国である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１に列記される品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、熱風乾燥タバコ品種のものである。ＷＯ ２００４／０４１００６ Ａ１を参照されたい。さらなる局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群から選択される熱風乾燥タバコ品種におけるものである。
【0117】
（表１）熱風乾燥タバコ品種
【0118】
空気乾燥タバコとしては、「Ｂｕｒｌｅｙ」、「Ｍａｒｙｌａｎｄ」、および「ダーク」タバコが挙げられる。空気乾燥タバコを結びつける共通の因子は、乾燥が主として、熱および湿度の人工的な供給源なしで行われることである。Ｂｕｒｌｅｙタバコは、ライトブラウンからダークブラウンの色であり、油分が高く、かつ糖分が低い。Ｂｕｒｌｅｙタバコは、典型的には、納屋の中で空気乾燥される。主要なＢｕｒｌｅｙ生育国としては、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国が挙げられる。
【0119】
Ｍａｒｙｌａｎｄタバコは、極めてふっくらしており、良好な燃焼特性、低いニコチン、および中立的な芳香を有する。主要なＭａｒｙｌａｎｄ生育国としては、米国およびイタリアが挙げられる。
【0120】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表２に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、Ｂｕｒｌｅｙタバコ品種のものである。さらなる局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、ＴＮ ９０、ＫＴ ２０９、ＫＴ ２０６、ＫＴ２１２、およびＨＢ ４４８８からなる群から選択されるＢｕｒｌｅｙ品種におけるものである。
【0121】
（表２）Ｂｕｒｌｅｙタバコ品種
【0122】
別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表３に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ品種のものである。
【0123】
（表３）Ｍａｒｙｌａｎｄタバコ品種
【0124】
暗色空気乾燥タバコは、主として、暗色空気乾燥タバコにミディアムブラウンからダークブラウンの色および独特の芳香を与えるその乾燥プロセスにより、他のタバコタイプから区別される。暗色空気乾燥タバコは主に、噛みタバコおよび嗅ぎタバコの産生において使用される。一局面では、本明細書において提供される改変タバコ植物または種子は、Ｓｕｍａｔｒａ、Ｊａｔｉｍ、Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｃｕｂａｎｏ、Ｂｅｓｕｋｉ、Ｏｎｅ ｓｕｃｋｅｒ、Ｇｒｅｅｎ Ｒｉｖｅｒ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ太陽乾燥種、およびＰａｒａｇｕａｎ Ｐａｓｓａｄｏ、ならびに前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される、暗色空気乾燥タバコ品種のものである。
【0125】
暗色火力乾燥タバコは、概して、閉鎖乾燥納屋の床上で低燃木の火を用いて乾燥される。暗色火力乾燥タバコは、典型的には、パイプブレンド物、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、および強い味のシガーを作製するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な生育地域は、米国におけるテネシー、ケンタッキー、およびバージニアである。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表４に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される暗色火力乾燥タバコ品種のものである。
【0126】
（表４）暗色火力乾燥タバコ品種
【0127】
Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコは、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、およびルーマニアなどの東地中海地域において典型的に生育されるという事実に起因して、ギリシャ、アロマ、およびトルコタバコとも称される。Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコ品種の小さい植物サイズ、小さい葉サイズ、および特有の芳香特性は、それらが発達してきた乏しい土壌およびストレスが多い気候の条件へのそれらの適合の結果である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表５に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるＯｒｉｅｎｔａｌタバコ品種のものである。
【0128】
（表５）Ｏｒｉｅｎｔａｌタバコ品種
【0129】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表６に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるシガータバコ品種のものである。
【0130】
（表６）シガータバコ品種
【0131】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表７に列記されるタバコ品種、および前述の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるタバコ品種のものである。
【0132】
（表７）他のタバコ品種
【0133】
一局面では、タバコ植物、種子、または細胞は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に列記されるタバコ品種からなる群から選択される品種に由来する。
【0134】
一局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、表１、表２、表３、表４、表５、表６、および表７に列記されるタバコ品種からなる群から選択される品種に本質的に由来するか、またはその遺伝的背景である。
【0135】
熱風乾燥、暗色空気乾燥、Ｂｕｒｌｅｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、暗色火力乾燥、シガー、またはＯｒｉｅｎｔａｌ種の全ての上記の特定の品種は、例示的な目的のためにのみ列記されている。任意の追加の熱風乾燥、暗色空気乾燥、Ｂｕｒｌｅｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、暗色火力乾燥、シガー、またはＯｒｉｅｎｔａｌ品種もまた本出願において想定される。
【0136】
記載されるタバコ植物の集団もまた提供される。一局面では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００～約８０００、約５，０００～約７，６００、約５，０００～約７，２００、約５，０００～約６，８００、約５，０００～約６，４００、約５，０００～約６，０００、約５，０００～約５，６００、約５，０００～約５，２００、約５，２００～約８，０００、約５，６００～約８，０００、約６，０００～約８，０００、約６，４００～約８，０００、約６，８００～約８，０００、約７，２００～約８，０００、または約７，６００～約８，０００個の植物の栽植密度を有する。別の局面では、タバコ植物の集団は、低い～中程度の肥沃度を有する土壌型において存在する。
【0137】
記載されるタバコ植物からの種子の容器もまた提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有してもよい。例えば、容器は、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００、少なくとも約４０００、もしくはそれ以上、または約１００より多い、約２００より多い、約３００より多い、約４００より多い、約５００より多い、約６００より多い、約７００より多い、約８００より多い、約９００より多い、約１０００より多い、約１５００より多い、約２０００より多い、約２５００より多い、約３０００より多い、約３５００より多い、約４０００個より多い、もしくはそれ以上の種子を含有し得る。代替的に、容器は、少なくとも約１オンス、少なくとも約５オンス、少なくとも約１０オンス、少なくとも約１ポンド、少なくとも約２ポンド、少なくとも約３ポンド、少なくとも約４ポンド、少なくとも約５ポンド、もしくはそれ以上、または約１オンスより多い、約５オンスより多い、約１０オンスより多い、約１ポンドより多い、約２ポンドより多い、約３ポンドより多い、約４ポンドより多い、約５ポンドより多い、もしくはそれ以上の種子を含有し得る。タバコ種子の容器は、当技術分野において利用可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであってもよい。
【0138】
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
【0139】
「乾燥」は、水分を低減し、かつ、タバコ葉に黄金色を与えかつそれによりデンプンが糖に変換されるクロロフィルの分解をもたらす熟成プロセスである。乾燥タバコは、したがって、収穫された緑色の葉と比較してより高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一局面では、提供される緑色の葉のタバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、火力乾燥、空気乾燥、または太陽乾燥を使用して乾燥され得る。例えば、異なる種類の乾燥方法の説明のために、Ｔｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコは、通常、１０％～約２５％の範囲内の水分含有量において数年（例えば、２～５年）にわたり圧縮条件において木製ドラム（例えば、大だる）または段ボール箱中で熟成される。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照。乾燥および熟成されたタバコは次にさらに加工され得る。さらなる加工としては、様々な温度での蒸気の導入ありまたはなしでの真空下でのタバコのコンディショニング、低温殺菌、および発酵が挙げられる。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号；米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号；およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、熟成、および発酵されたタバコはさらに加工（例えば、切断、細断、膨化、またはブレンド）され得る。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照。一局面では、本開示の乾燥タバコ材料は太陽乾燥されている。別の局面では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または火力乾燥されている。
【0140】
本開示のタバコ株、品種またはハイブリッドから得られるタバコ材料は、タバコ製品を作製するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費が意図されるタバコから作製または派生された任意の製品として定義される。
【0141】
提供されるタバコ製品としては、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ（ｃｉｇａｒ ｗｒａｐｐｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ）およびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿潤嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、および噛みタバコ）、フィルム、チュワブル、タブ、成形部分、ゲル、消費可能単位、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、ならびに膨化タバコなどが挙げられるがそれに限定されない。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１９１５４８号を参照。
【0142】
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「ロッド」および「フィラー」を有するタバコ製品を指す。シガレット「ロッド」は、シガレットペーパー、フィルター、プラグラップ（フィルター材料を含有するために使用される）、シガレットペーパー（フィラーを含む）をフィルターに保持するチップペーパー、およびこれらの成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「フィラー」としては、（１）再構成タバコおよび膨化タバコが挙げられるがそれに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ代用品（シガレットペーパー内に巻かれたタバコを伴ってもよいハーブ、非タバコ植物材料および他のスパイスが挙げられるがそれに限定されない）、（３）ケーシング、（４）風味物質、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび代用品に混合され、シガレット中に巻かれる）が挙げられる。
【0143】
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート形態に加工され、かつタバコに似せるように細片に切断された、タバコ塵および他のタバコ屑材料から作製されたタバコフィラーの部分を指す。コストの節約に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との反応を使用する風味発生の加工からシガレットの味に対するその寄与のために非常に重要である。
【0144】
本明細書において使用される場合、「膨化タバコ」は、タバコが「膨らむ」ように好適な気体の膨張を通じて加工されて、低減された密度およびより大きい充填能力を結果としてもたらすタバコフィラーの部分を指す。それは、シガレットにおいて使用されるタバコの重量を低減する。
【0145】
本開示の植物に由来するタバコ製品としてはまた、シガレットと、特にフィルター要素を含む、他の喫煙物品とが挙げられ、喫煙可能材料のロッドがタバコブレンド物内に乾燥タバコを含む。一局面では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される。別の局面では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼されず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、スヌース、および乾燥嗅ぎタバコが挙げられるがそれに限定されない。噛みタバコは、典型的には大きいパウチ様パッケージ中に包装されてプラグまたはツイストにおいて使用される粗く分割されたタバコ葉である。湿潤無煙タバコは、ルース（ｌｏｏｓｅ）形態またはパウチ形態において提供される湿潤の、より微細に分割されたタバコであり、典型的には、丸缶中に包装され、成人タバコ消費者の頬と歯肉との間に置かれるピンチとしてまたはパウチ中で使用される。スヌースは、熱処理される無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口の中に置かれるかまたは経鼻的に使用される微細に粉砕されたタバコである。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される。さらに別の局面では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、ｅ－シガレット、電子的気化デバイスからなる群から選択される。
【0146】
一局面では、本開示のタバコ製品は、ブレンドされたタバコ製品であり得る。別の局面では、本開示のタバコ製品は低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルのノルニコチンを含んでもよい。例えば、そのような製品中のノルニコチン含有量は、３．０ｍｇ／ｇ、２．５ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．５ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、７５０μｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、２５０ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、７５ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ、２５ｐｇ／ｇ、１０ｐｇ／ｇ、７．０ｐｇ／ｇ、５．０ｐｇ／ｇ、４．０ｐｇ／ｇ、２．０ｐｇ／ｇ、１．０ｐｇ／ｇ、０．５ｐｇ／ｇ、０．４ｐｇ／ｇ、０．２ｐｇ／ｇ、０．１ｐｇ／ｇ、０．０５ｐｇ／ｇ、０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不可能であり得る。
【0147】
一局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
【0148】
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有を含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手法を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して、所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手法は、反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、Ｂｕｒｌｅｙ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはＯｒｉｅｎｔａｌ品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
【0149】
記載されるタバコ植物を使用する植物育種プログラムの結果としては、本開示の有用な株、栽培品種、品種、子孫、近交系、およびハイブリッドが挙げられる。本明細書において使用される場合、「品種」という用語は、同じ種の他の植物からそれらを分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが多くの場合に、商業的に販売される。１つまたは複数の特徴的な形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の非常に小さい全体的なバリエーションによりさらに特徴付けられる。「純粋株」品種は、組織または細胞培養技術を使用して単一の親からの自家受粉および選択、または栄養繁殖のいくつかの世代により作製されてもよい。品種は、別の株または品種に本質的に由来し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ（１９６１年１２月２日；１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にＧｅｎｅｖａにおいて改訂）により定義されるように、品種は、（ａ）主に初期品種、または初期品種の遺伝子型もしくは遺伝子型の組み合わせの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現を保持しながら、主に初期品種に由来する品種に由来し、（ｂ）初期品種から明確に区別可能であり、かつ（ｃ）誘導という行為の結果としてもたらされる差異を除いて、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現において初期品種と合致する場合に、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘導された変異体、体細胞繁殖系バリアント、初期品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑、または形質転換により得られ得る。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有すると考えられる。品種から区別されるような「株」は、最も多くの場合に、非商業的に、例えば植物研究において使用される植物の群を表す。株は、典型的には、１つまたは複数の関心対象の形質について個体間の全体的なバリエーションをほとんど示さないが、他の形質について個体間で何らかのバリエーションがあってもよい。
【0150】
一局面では、本開示は、表１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、および１１Ｂのいずれか１つにおいて提供される１つまたは複数のｑｐｔ変異を含むタバコ植物、品種、株、または細胞を提供する。
【0151】
別の局面では、本開示は、表１１Ａおよび１１Ｂのいずれか１つにおいて提供される任意のタバコ植物、品種、または株に由来するタバコ植物、品種、株、または細胞を提供する。
【0152】
一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ６５５、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５６、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５２、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５３、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５４、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５５、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７４９、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ９７１、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５７、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ９７２、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ９７３、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５０、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７９６、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ９７５、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ６６１、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ６６２、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ６６３、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ９７４、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ３５２、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ３５３、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ３５４、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７９７、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７５９、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７９８、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ１０２５、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ３５５、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ３５１、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７４４、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７４６、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７４４、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。一局面では、本開示は、タバコ株１９ＧＨ７６０、およびそれに由来するＦ１もしくはＦ２タバコ植物、または雄性不稔性タバコ植物を提供する。
【0153】
一局面では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法を提供し、方法は
、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたは複数の子孫タバコ植物を産生する工程；（ｂ）表１１Ａおよび１１Ｂに列記されるものから選択されるｑｐｔ変異アレルについて、１つまたは複数の子孫タバコ植物を遺伝型判定する工程；ならびに（ｃ）ｑｐｔ変異アレルを含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む。別の局面では、これらの方法は、選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑する工程をさらに含む。さらなる局面では、これらの方法は、（ｄ）選択された子孫植物をそれ自体または第２のタバコ品種と交雑して、１つまたは複数のさらなる子孫タバコ植物を産生する工程；および（ｅ）低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程をさらに含む。一局面では、選択する工程（ｅ）は、マーカー補助選択を含む。一局面では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を産生する。一局面では、これらの方法は、ｑｐｔ変異アレルを含む単一遺伝子変換を産生する。一局面では、第２のタバコ品種はエリート品種である。別の局面では、これらの方法の遺伝子型判定工程は、１つまたは複数の分子マーカーアッセイを含む。別の局面では、遺伝子型判定は、一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列における挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む多型マーカーを含み得る。
、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたは複数の子孫タバコ植物を産生する工程；（ｂ）表１１Ａおよび１１Ｂに列記されるものから選択されるｑｐｔ変異アレルについて、１つまたは複数の子孫タバコ植物を遺伝型判定する工程；ならびに（ｃ）ｑｐｔ変異アレルを含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む。別の局面では、これらの方法は、選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑する工程をさらに含む。さらなる局面では、これらの方法は、（ｄ）選択された子孫植物をそれ自体または第２のタバコ品種と交雑して、１つまたは複数のさらなる子孫タバコ植物を産生する工程；および（ｅ）低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程をさらに含む。一局面では、選択する工程（ｅ）は、マーカー補助選択を含む。一局面では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を産生する。一局面では、これらの方法は、ｑｐｔ変異アレルを含む単一遺伝子変換を産生する。一局面では、第２のタバコ品種はエリート品種である。別の局面では、これらの方法の遺伝子型判定工程は、１つまたは複数の分子マーカーアッセイを含む。別の局面では、遺伝子型判定は、一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列における挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む多型マーカーを含み得る。
【0154】
本明細書において使用される場合、「遺伝子座」は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子、またはマーカーが位置する染色体遺伝子座または領域である。「遺伝子座」は、対応する遺伝子座または領域に言及するように、２つの相同染色体によって共有され得る。本明細書において使用される場合、「アレル」は、遺伝子のまたは特定の遺伝子座における代替的な核酸配列（例えば、同じ遺伝子または遺伝子座の他方のアレルとは異なる遺伝子または遺伝子座の核酸配列）を指す。そのようなアレルは、（ｉ）野生型、または（ｉｉ）野生型アレルと比べて１つもしくは複数の変異もしくは編集が変異アレルの核酸配列中に存在する場合には、変異体、とみなすことができる。遺伝子の変異アレルは、野生型アレルと比べて、低減または除去された遺伝子の活性または発現レベルを有し得る。タバコなどの二倍体生物については、第１のアレルが１つの染色体上に存在することができ、第２のアレルが２つ目の相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することができる。植物の１つの染色体上の遺伝子座における１つのアレルが変異アレルであり、植物の相同染色体上のもう１つの対応するアレルが野生型である場合には、植物は、変異アレルについてヘテロ接合であると説明される。しかし、遺伝子座の両方のアレルが変異アレルである場合には、植物は、変異アレルについてホモ接合であると説明される。遺伝子座の変異アレルについてホモ接合の植物は、ヘテロアレルまたはバイアレルの場合には、同じ変異アレルまたは異なる変異アレルを含み得る。
【0155】
本明細書において使用される場合、「移入」または「移入する」は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。
【0156】
本明細書において使用される場合、「交雑される」または「交雑」は、受精（例えば、細胞、種子、または植物）を介して子孫を産生することを意味し、植物の間の交雑（有性）および自家受精（自殖）を含む。
【0157】
本明細書において使用される場合、「戻し交雑」および「戻し交雑する」は、子孫植物がその親の１つに戻して繰り返して交雑される方法を指す。戻し交雑スキームにおいて、「ドナー」親は、移入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（１回もしくは複数回使用される）または「反復」親（２回もしくはそれ以上の回数使用される）は、遺伝子または遺伝子座が移入されている親植物を指す。初期交雑はＦ１世代を生じさせる。「ＢＣ１」という用語は反復親の２回目の使用を指し、「ＢＣ２」は反復親の３回目の使用を指す、などである。一局面では、戻し交雑は繰り返して行われ、連続する戻し交雑世代それぞれの子孫個体は、それ自体が同じ親遺伝子型に対して戻し交雑される。
【0158】
本明細書において使用される場合、「単一遺伝子変換される」または「単一遺伝子変換」は、戻し交雑として公知の植物育種技術を使用して、または遺伝子操作を介して開発される植物を指し、ここで、戻し交雑技術を介してまたは遺伝子操作を介して品種に移入される単一遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的に全てが元通りとされる。
【0159】
本明細書において使用される場合、「エリート品種」は、優れた耕種学的性能のための育種および選択の結果としてもたらされた任意の品種を意味する。
【0160】
本明細書において使用される場合、マーカー補助選択または育種の文脈における「選択する」または「選択」は、ある特定の予め決定された基準に基づく、通常は集団からの所望の個体の採集または選出の行為を指す。
【0161】
本明細書において使用される場合、「形質」という用語は、遺伝子型により影響され得る細胞または生物の１つまたは複数の検出可能な特徴を指す。表現型は、肉眼で、または当技術分野において公知の評価の任意の他の手段により観察可能であり得、該手段は、例えば、顕微鏡法、生化学的分析、ゲノム解析、特定の耐病性についてのアッセイなどである。一部の場合には、表現型は、単一の遺伝子または遺伝子座、例えば、「単一の遺伝子形質」により直接的に制御される。他の場合には、表現型はいくつかの遺伝子の結果である。
【0162】
本明細書において使用される場合、「マーカーアッセイ」は、特定の方法を用いて特定の遺伝子座における多型を検出するための方法、例えば、少なくとも１つの表現型（種子の色、花の色、または他の視覚的に検出可能な形質など）の測定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、一塩基伸長、電気泳動、配列アラインメント、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、マイクロアレイベースの技術、および核酸シークエンシング技術などを意味する。
【0163】
本明細書において使用される場合、「マーカー補助選択」（ＭＡＳ）は、表現型がマーカー遺伝子型に基づいて選択されるプロセスである。「マーカー補助選択育種」は、植物から１つまたは複数の核酸（該核酸は、所望の形質に結びつけられている）を検出すること、および次いで、それらの１つまたは複数の核酸を保有する植物または生殖質を選択することによって、１つまたは複数の植物における所望の１つまたは複数の形質を選択するプロセスを指す。
【0164】
本明細書において使用される場合、「多型」は、集団における１つまたは複数のバリエーションの存在を意味する。多型は、核酸のヌクレオチド配列におけるバリエーションとして、またはタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションとして現れ得る。多型は、１つまたは複数の個体の集団中の１つまたは複数の遺伝子座における核酸配列または核酸特徴の１つまたは複数のバリエーションの存在を含む。バリエーションは、１つもしくは複数のヌクレオチド塩基の変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含み得るが、それに限定されない。多型は、核酸複製におけるランダムなプロセスから、変異誘発を通して、可動ゲノム要素の結果として、コピー数のバリエーションから、ならびに不均等な乗換え、ゲノム重複、および染色体切断など減数分裂のプロセス中、ならびに融合中に生じ得る。バリエーションは、一般的に見出すことができるか、または集団内に低頻度で存在する可能性があり、前者は、一般的な植物育種においてより大きな有用性を有し、後者は、まれであるが重要な表現型バリエーションに関連している可能性がある。有用な多型には、一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列における挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰが含まれ得る。遺伝子マーカー、遺伝子、ＤＮＡ由来配列、ＲＮＡ由来配列、プロモーター、遺伝子の５’非翻訳領域、遺伝子の３’非翻訳領域、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、耐性遺伝子座、サテライトマーカー、トランスジーン、ｍＲＮＡ、ｄｓ ｍＲＮＡ、転写プロファイル、およびメチル化パターンもまた、多型を含み得る。加えて、前記のコピー数の存在、不在、またはバリエーションは、多型を含み得る。
【0165】
本明細書において使用される場合、「ＳＮＰ」または「一塩基多型」は、ゲノム配列中の単一ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が変更されているかまたは可変である時に生じる、配列バリエーションを意味する。「ＳＮＰマーカー」は、ＳＮＰがゲノム上の部位にマッピングされる時に存在する。
【0166】
本明細書において使用される場合、「マーカー」または「分子マーカー」または「マーカー遺伝子座」は、ゲノム上の特定の遺伝子座を特徴付けるのに十分に特有である核酸またはアミノ酸配列を表すために使用される用語である。任意の検出可能な多型形質を、それが差次的に遺伝し、かつ関心対象の表現型形質との連鎖不平衡を示す限り、マーカーとして使用することができる。したがって、各マーカーは、特有のヌクレオチド配列を有するＤＮＡの特定のセグメントの指標である。マップの位置は、特定のマーカーの互いの相対位置の測定値を提供する。形質が所与のマーカーに結びつけられると述べられる場合、その配列が形質に影響を及ぼす実際のＤＮＡセグメントは、概してマーカーと同時分離することが理解される。形質の両側でマーカーが同定される場合には、形質のより正確なかつ明確な位置確認を得ることができる。交雑の子孫におけるマーカーの出現を測定することによって、比較的単純な分子試験により、形質の存在を検出することができ、形質の出現自体は実際に評価することはなく、これは困難であり、かつ時間がかかる場合があるものであり、なぜなら形質の実際の評価は、形質が発現され得るステージまでおよび／または環境条件下で、植物を生育させることを必要とするためである。
【0167】
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当技術分野において公知の技術を使用する遺伝子構築物またはトランスジーンを用いる形質転換により、追加の耕種学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。非限定的に、所望の形質の例は、除草剤抵抗性、有害生物抵抗性、耐病性；高い収率；高いグレード指数値；治癒可能性；乾燥品質；機械的収穫可能性；保持能力；葉品質；高さ、植物成熟度（例えば、早期成熟、早期成熟から中程度成熟、中程度成熟、中程度成熟から後期成熟、もしくは後期成熟）；茎サイズ（例えば、小さい、中程度、もしくは大きい茎）；または植物１つ当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５～１０枚の葉）、中程度（例えば、１１～１５枚の葉）、または多数（例えば、１６～２１枚）の葉）、または任意の組み合わせである。一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物または種子は、１つまたは複数の殺虫タンパク質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からの栄養殺虫タンパク質、例えば、ＶＩＰ３などを発現する１つまたは複数のトランスジーンを含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照）。別の局面では、タバコ植物は、落葉病への抵抗性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫への抵抗性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する移入された形質をさらに含む。
【0168】
本開示はまた、変化したニコチンまたは総アルカロイドレベルを含むがそのようなニコチンレベルの変化を有しない対応する初期タバコ植物の収率と同等の収率を有するｑｐｔ変異タバコ植物を提供する。一局面では、ｑｐｔ変異タバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３４００、１４００～３３００、１５００～３２００、１６００～３１００、１７００～３０００、１８００～２９００、１９００～２８００、２０００～２７００、２１００～２６００、２２００～２５００、および２３００～２４００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。別の局面では、ｑｐｔ変異タバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３５００、１４００～３５００、１５００～３５００、１６００～３５００、１７００～３５００、１８００～３５００、１９００～３５００、２０００～３５００、２１００～３５００、２２００～３５００、２３００～３５００、２４００～３５００、２５００～３５００、２６００～３５００、２７００～３５００、２８００～３５００、２９００～３５００、３０００～３５００、および３１００～３５００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。さらなる局面では、ｑｐｔ変異タバコ植物は、ｑｐｔ変異を除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％の収率を提供する。さらなる局面では、ｑｐｔ変異タバコ植物は、ｑｐｔ変異を除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％の収率を提供する。
【0169】
一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される形質に実質的に影響することなく所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含む。
【0170】
一局面では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、該形質は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される。
【0171】
一局面では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い収率をさらに含む。一局面では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の収率をさらに含む。一局面では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の収率をさらに含む。
【0172】
一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械収穫のために適合されている。別の局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械で収穫される。
【0173】
一局面では、ｑｐｔ遺伝子中に少なくとも１つの変異アレルを含むタバコ植物は、低ニコチン形質を含む。別の局面では、ｑｐｔ遺伝子中に少なくとも１つの変異アレルを含むタバコ植物は、ニコチン非含有形質を含む。別の局面では、ｑｐｔ遺伝子中に少なくとも１つの変異アレルを含むタバコ植物は、低アルカロイド形質を含む。
【0174】
一局面では、提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を予防して、第２の品種の雄性親植物からの花粉が雌性親植物に授精することを可能とし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性植物において形成されることを可能とすることにより産生され得る。雌性植物の自家受粉は、早期の花発達ステージにおいて花を除雄することにより予防され得る。代替的に、花粉形成は、雄性不稔性の形態を使用して雌性親植物において予防され得る。例えば、雄性不稔性は、トランスジーンが小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害する雄性不稔性（ＭＳ）、もしくはトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性により生じ得る。ＭＳを含有する雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がＭＳである局面では、花粉が雄性稔性植物から収穫され、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用されてもよく、結果として生じたＦ１種子が収穫される。
【0175】
植物は、単交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成するために使用され得る。雄性親植物からの花粉は、Ｆ１種子を形成するために、除雄された雌性親植物または雄性不稔性の雌性親植物に手動で移動される。代替的に、単交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性親として使用されて異なる雄性親と交雑される三系交雑が実行され得る。別の代替として、２つの異なる単交雑のＦ１子孫がそれら自体で交雑される二重交雑ハイブリッドが作製され得る。二重交雑ハイブリッドを形成する場合の雌性親の自家受粉を予防するための特定の利点のために自家不和合性が使用され得る。
【0176】
一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は雄性不稔性である。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は細胞質雄性不稔性である。雄性不稔性のタバコ植物は、当技術分野において公知の任意の方法により産生されてもよい。雄性不稔性のタバコを産生する方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７６１ ｐｐに記載されている。
【0177】
一局面では、本開示は、表１１Ａおよび１１Ｂのいずれか１つにおいて提供される１つまたは複数のｑｐｔ変異を含む、雄性不稔性のタバコ植物、品種、または株を提供する。
【0178】
別の局面では、本開示は、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、および１１Ｂのいずれか１つにおいて提供される任意のタバコ植物、品種、または株に由来する、雄性不稔性のタバコ植物、品種、または株を提供する。
【0179】
さらなる局面では、提供されるタバコ部分としては、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストが挙げられるがそれに限定されない。一局面では、提供されるタバコ部分は種子を含まない。一局面では、本開示は、生殖材料ではなく、かつ植物の天然の生殖を媒介しないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示はまた、生殖材料であり、かつ植物の天然の生殖を媒介するタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、光合成を介して維持され得ないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、体細胞性タバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞系列細胞とは異なり、植物生殖を媒介しない。
【0180】
細胞、組織、および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内乳、根、シュート、茎、さや、花、花序、茎、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、がく、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、管束組織からのものであり得る。別の局面では、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。さらなる局面では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の局面では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
【0181】
タバコ植物は、無性生殖または栄養繁殖を介してではなく、種子を介して天然に生殖することを当業者は理解する。一局面では、本開示は、タバコ内乳を提供する。別の局面では、本開示は、タバコ内乳細胞を提供する。さらなる局面では、本開示は、ヒトの介入なしでは生殖できない雄性または雌性不稔性タバコ植物を提供する。
【0182】
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～８およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。
【0183】
本明細書において使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定される比較ウインドウにわたる最大の一致のためにアライメントされた場合に同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は多くの場合に保存的アミノ酸置換により異なり、その場合、アミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整されてもよい。
【0184】
本開示は、開示されるタバコ植物からのタバコ材料を含むタバコ製品を産生する方法をさらに提供する。一局面では、方法は、タバコ植物から作製された熟成されたタバコ材料をコンディショニングして、約１２．５％～約１３．５％から約２１％までその水分含有量を増加させ、コンディショニングされたタバコ材料をブレンドして、望ましいブレンド物を産生する工程を含む。一局面では、タバコ製品を産生する方法は、ブレンド物をケーシングまたは風味付けする工程をさらに含む。概して、ケーシングプロセスの間に、ケーシングまたはソース材料をブレンド物に加えて、化学組成の均衡を取ることによりそれらの品質を増強し、かつある特定の所望の風味の特徴を発生させる。ケーシング加工についてのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌ．ＤａｖｉｓおよびＭ．Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９において見出され得る。
【0185】
提供されるタバコ材料はまた、熱処理（例えば、クッキング、トースティング）、風味付け、酵素処理、膨張、および／または乾燥が挙げられるがそれに限定されない方法を使用して加工され得る。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方が、これらの技術を使用して加工され得る。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、Ｂｕｒｌｅｙ、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーの他に、葉全体から茎を取り除く操作（ｗｈｏｌｅ ｌｅａｆ ｓｔｅｍｍｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）からの製品が挙げられる。一局面では、タバコ繊維は、新鮮重を基準にして最大７０％のダークタバコを含む。例えば、タバコは、米国特許出願公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるような加熱、蒸し、および／または低温殺菌段階によりコンディショニングされ得る。
【0186】
提供されるタバコ材料は、発酵に供され得る。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、および同第５，３７２，１４９号を参照。葉の芳香の改良に加えて、発酵は、葉の色および感触のいずれかまたは両方を変化させ得る。また、発酵プロセスの間に、発生ガスが産生され得、酸素が取り込まれ得、ｐＨが変更され得、かつ保持される水の量が変更され得る。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコ、または乾燥および発酵タバコは、口腔製品への組込みの前にさらに加工（例えば、切断、膨化、ブレンド、ミーリング加工、または粉砕）され得る。タバコは、一部の場合には、コポリマーとの混合ならびに任意で香料および他の添加物の前に、４８～５０重量パーセントのオーブン揮発分含有量（ｏｖｅｎ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ）を有するロングカットの発酵乾燥湿潤タバコである。
【0187】
一局面では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一局面では、タバコ繊維は、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するように加工され得る。一局面では、タバコ繊維は７５～１２５マイクロメートルである。別の局面では、タバコ繊維は、７５マイクロメートルまたはそれ未満のサイズを有するように加工される。一局面では、タバコ繊維は、ロングカットのタバコを含み、該タバコは、約１０カット／インチから約１１０カット／インチまでの幅および約０．１インチから約１インチまでの長さにカットまたは細断され得る。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の約７０％が、－２０メッシュ～８０メッシュの間のメッシュサイズを落ちるような粒子サイズの範囲を有し得る。
【0188】
提供されるタバコ材料は、約１０重量％もしくはそれ以上、約２０重量％もしくはそれ以上、約４０重量％もしくはそれ以上、約１５重量％～約２５重量％、約２０重量％～約３０重量％、約３０重量％～約５０重量％、約４５重量％～約６５重量％、または約５０重量％～約６０重量％の総オーブン揮発分含有量を有するように加工され得る。「湿潤」タバコは、典型的には、約４０重量％～約６０重量％（例えば、約４５重量％～約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発分含有量を有するタバコを指すことを当業者は理解する。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発分」は、１１０℃に予め温めた強制送風オーブン中で３．２５時間にわたり試料を乾燥した後の試料の重量損失のパーセンテージを算出することにより決定される。口腔製品は、口腔製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発分含有量とは異なる全体的なオーブン揮発分含有量を有し得る。記載される加工段階は、オーブン揮発分含有量を低減または増加させ得る。
【0189】
本開示が大まかに説明されたが、定めのない限り、例示として提供され、本開示を限定することを目的としない以下の実施例を参照することによって同じことがもっと容易に理解される。
【実施例】
【0190】
実施例１：４つのＱＰＴ遺伝子の発現プロファイリング
ニコチン生合成は、ニコチン酸モノヌクレオチドの形成を含み、これは後に、ニコチンのピリジン環に変換される。ニコチン酸モノヌクレオチドの形成は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）によって触媒される。品種に応じて、ＱＰＴをコードする最大で４つの遺伝子（ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂ）が、タバコ（ニコチアナ・タバカム）ゲノム中に存在する（図１）。表８Ａは、４つのＱＰＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質配列を列記する。表８Ｂおよび８Ｃは、４つのＱＰＴ遺伝子の間のｃＤＮＡおよびタンパク質の配列同一性を提供する。ＴＮ９０の根における４つのＱＰＴ遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、いかなる特定の理論によっても限定されないが、ＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ２ｂが２つの主要なＱＰＴ遺伝子に相当することを支持する（図２）。
ニコチン生合成は、ニコチン酸モノヌクレオチドの形成を含み、これは後に、ニコチンのピリジン環に変換される。ニコチン酸モノヌクレオチドの形成は、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）によって触媒される。品種に応じて、ＱＰＴをコードする最大で４つの遺伝子（ＱＰＴ１ａ、ＱＰＴ１ｂ、ＱＰＴ２ａ、およびＱＰＴ２ｂ）が、タバコ（ニコチアナ・タバカム）ゲノム中に存在する（図１）。表８Ａは、４つのＱＰＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質配列を列記する。表８Ｂおよび８Ｃは、４つのＱＰＴ遺伝子の間のｃＤＮＡおよびタンパク質の配列同一性を提供する。ＴＮ９０の根における４つのＱＰＴ遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、いかなる特定の理論によっても限定されないが、ＱＰＴ２ａおよびＱＰＴ２ｂが２つの主要なＱＰＴ遺伝子に相当することを支持する（図２）。
【0191】
（表８Ａ）４つのタバコＱＰＴ遺伝子の配列
【0192】
（表８Ｂ）Ｃｌｕｓｔａｌ２．１によって決定された４つのタバコＱＰＴ遺伝子の間のｃＤＮＡ配列同一性
【0193】
（表８Ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ２．１によって決定された４つのタバコＱＰＴ遺伝子の間のタンパク質配列同一性
【0194】
（表８Ｄ）ＱＰＴ１ａゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の注釈
【0195】
（表８Ｅ）ＱＰＴ１ｂゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の注釈
【0196】
（表８Ｆ）ＱＰＴ２ａゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の注釈
【0197】
（表８Ｇ）ＱＰＴ２ｂゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の注釈
【0198】
実施例２：ＱＰＴゲノム編集
ＱＰＴノックアウト変異体を、様々なＱＰＴ遺伝子を編集することによって作製する。タバコプロトプラストに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、ゲノム編集技術（ＧＥＴ）タンパク質、および所望の位置でＱＰＴ遺伝子を標的指向する特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするプラスミドをトランスフェクトする。表９は、ＱＰＴ編集に用いられるｇＲＮＡ配列を列記する。
ＱＰＴノックアウト変異体を、様々なＱＰＴ遺伝子を編集することによって作製する。タバコプロトプラストに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、ゲノム編集技術（ＧＥＴ）タンパク質、および所望の位置でＱＰＴ遺伝子を標的指向する特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするプラスミドをトランスフェクトする。表９は、ＱＰＴ編集に用いられるｇＲＮＡ配列を列記する。
【0199】
トランスフェクトされたプロトプラストを、１％アガロースビーズに固定化し、組織培養に供する。カルスが、直径約１ｍｍに生育したら、ＴＯＭ２プレート上に広げる。断片分析を用いて、標的位置における挿入または欠失（インデル）についてカルスをスクリーニングする（図３）。野生型対照と比較してサイズシフトを示す候補を、さらなる培養のために選択する。結果としてのシュートおよび根付いたシュートを、鉢植えにし、標的位置についての次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に供して、正確な欠失した配列を決定する。
【0200】
（表９）ゲノム編集技術において用いられるｇＲＮＡ配列およびそのＱＰＴ標的遺伝子。「Ｙ」は、ｇＲＮＡがそのＱＰＴ遺伝子を標的指向することを表し、「－」は、ｇＲＮＡがそのＱＰＴ遺伝子を標的指向しないことを表す。
【0201】
（表１０Ａ）ＧＥＴを用いたゲノム編集によって作製されたＫ３２６における変異体ｑｐｔアレル。各々の編集された部位（例えば、インデル）の位置は、各ＱＰＴ遺伝子の対応するｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド番号を基準にしている。例えば、株１９ＧＨ７４４は、ＱＰＴ２ｂ中にトリアレル変異を有する。３つのアレルのうちの１つは、ＱＰＴ２ｂ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２６９～２７６に対応する８ヌクレオチドの欠失を有する。２番目のアレルは、ＱＰＴ２ｂ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２７０～２７６に対応する７ヌクレオチドの欠失を有する。３番目のアレルは、ＱＰＴ２ｂ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２６６～２７６に対応する１１ヌクレオチドの欠失を有する。ＳＥＱ ＩＤ番号は、１０個またはそれ以上のヌクレオチドの配列について割り当てられ、示される。
【0202】
（表１０Ｂ）ＧＥＴを用いたゲノム編集によって作製されたＴＮ９０における変異体ｑｐｔアレル。各々の編集された部位（例えば、インデル）の位置は、各ＱＰＴ遺伝子の対応するｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド番号を基準にしている。例えば、株１９ＧＨ７５２は、ＱＰＴ２ｂ中にバイアレル変異を有する。２つのアレルのうちの１つは、ＱＰＴ２ｂ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２６６～２７５に対応する１０ヌクレオチドの欠失を有する。もう１つのアレルは、ＱＰＴ２ｂ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置２６８～２７５に対応する８ヌクレオチドの欠失を有する。ＳＥＱ ＩＤ番号は、１０個またはそれ以上のヌクレオチドの配列について割り当てられ、示される。
【0203】
（表１１Ａ）ＱＰＴ２ａ遺伝子中の得られた例示的な変異アレル
【0204】
（表１１Ｂ）ＱＰＴ２ｂ遺伝子中の得られた例示的な変異アレル
【0205】
実施例３：ＱＰＴ編集株のアルカロイド分析
ゲノム編集されたタバコ植物を、対照と共に、７５ＰＰＭ肥料を含む温室中の１０インチの植木鉢において生育させる。開花ステージに、植物を摘心し、摘心してから２週間後に、植物の上部より３番目、４番目、５番目の葉から葉身試料を収集して、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、およびＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３，１９９９において刊行された（かつＶｏｌ．７４，Ｎｏ．４，Ｊａｎｕａｒｙ ７，２００９において修正された）、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を用いて測定する。
ゲノム編集されたタバコ植物を、対照と共に、７５ＰＰＭ肥料を含む温室中の１０インチの植木鉢において生育させる。開花ステージに、植物を摘心し、摘心してから２週間後に、植物の上部より３番目、４番目、５番目の葉から葉身試料を収集して、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、およびＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３，１９９９において刊行された（かつＶｏｌ．７４，Ｎｏ．４，Ｊａｎｕａｒｙ ７，２００９において修正された）、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を用いて測定する。
【0206】
簡潔に述べると、およそ０．５ｇのタバコを、液体／液体抽出を用いて、内部標準を含有する有機溶媒中に抽出し、水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）を伴うガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する。結果は、そのまままたは乾燥重量ベースのいずれかの重量パーセント（Ｗｔ％）として報告することができる。乾燥重量ベースでデータを報告するには、オーブン揮発性物質（ＯＶ）の決定を必要とする。特に定めない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルもしくは個々のアルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量ベースである（例えば、総アルカロイドパーセントまたはニコチンパーセント）。
【0207】
植物をまた、野外に植え、収穫して、乾燥タバコにおけるアルカロイドおよびＴＳＮＡレベルについて試験する。葉収率および葉グレードの両方もまた、ＱＰＴ編集植物について評価する。さらに、個々のＱＰＴ遺伝子の様々な変異体の組み合わせを生成し、試験する（例えば、単一、二重、三重、または四重）。
【0208】
実施例４：１つまたは複数のＱＰＴ遺伝子中に編集された変異アレルを有するタバコ株の取得
個々のＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子の選択された組み合わせ中に変異を有するタバコ株を、表１０Ａおよび１０Ｂに列記されるタバコ株から取得する。単一、二重、三重、または四重変異体（それぞれ、１つ、２つ、３つ、または４つのＱＰＴ遺伝子中に変異を有する）を、変異していない対照株と交雑し、特定のＱＰＴ変異の組み合わせについて分離子孫植物を選択する。各々の変異した遺伝子は、変異についてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかであり得る。例示的な個々のｑｐｔ変異アレルを、表１１Ａおよび１１Ｂに列記する。
個々のＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子の選択された組み合わせ中に変異を有するタバコ株を、表１０Ａおよび１０Ｂに列記されるタバコ株から取得する。単一、二重、三重、または四重変異体（それぞれ、１つ、２つ、３つ、または４つのＱＰＴ遺伝子中に変異を有する）を、変異していない対照株と交雑し、特定のＱＰＴ変異の組み合わせについて分離子孫植物を選択する。各々の変異した遺伝子は、変異についてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかであり得る。例示的な個々のｑｐｔ変異アレルを、表１１Ａおよび１１Ｂに列記する。
【0209】
実施例５：ｑｐｔ変異を他の遺伝子中の変異と組み合わせることによる総アルカロイドのさらなる低減
総アルカロイドおよび／または選択された個々のアルカロイドをさらに低減するために、ｑｐｔ変異体を、五重ｐｍｔ変異体またはキノリン酸合成酵素（ＱＳ）などの、タバコにおけるアルカロイド生合成に関連した追加の遺伝子中の変異と組み合わせる。簡潔に述べると、遺伝子編集を用いて、選択したｐｍｔまたはＱＳ遺伝子を、所望の変異体背景において変異させる。結果として生じた組み合わされたｐｍｔ／ｐｍｔまたはｑｓ／ｐｍｔ変異体において、乾燥タバコにおけるアルカロイドおよびＴＳＮＡレベルを試験する。葉収率および葉グレードの両方もまた、評価する。
総アルカロイドおよび／または選択された個々のアルカロイドをさらに低減するために、ｑｐｔ変異体を、五重ｐｍｔ変異体またはキノリン酸合成酵素（ＱＳ）などの、タバコにおけるアルカロイド生合成に関連した追加の遺伝子中の変異と組み合わせる。簡潔に述べると、遺伝子編集を用いて、選択したｐｍｔまたはＱＳ遺伝子を、所望の変異体背景において変異させる。結果として生じた組み合わされたｐｍｔ／ｐｍｔまたはｑｓ／ｐｍｔ変異体において、乾燥タバコにおけるアルカロイドおよびＴＳＮＡレベルを試験する。葉収率および葉グレードの両方もまた、評価する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図3-1】
【図3-2】
【配列表】
【国際調査報告】