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特表2022-552573羊水およびそれに由来する細胞から羊水間葉系幹細胞を得るためのプロセスならびに装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-16
(54)【発明の名称】羊水およびそれに由来する細胞から羊水間葉系幹細胞を得るためのプロセスならびに装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20221209BHJP
A61K 35/50 20150101ALN20221209BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20221209BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
A61K35/50
A61P43/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523150
(86)(22)【出願日】2020-10-16
(85)【翻訳文提出日】2022-05-18
(86)【国際出願番号】 SE2020050993
(87)【国際公開番号】W WO2021076042
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】1930338-7
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】62/923,187
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】2030100-8
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2030101-6
(32)【優先日】2020-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】522154940
【氏名又は名称】アムニオティクス・アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヤン・タルトス
(72)【発明者】
【氏名】ニルス－ビャルネ・ウッズ
(72)【発明者】
【氏名】コーレ・エングキルデ
(72)【発明者】
【氏名】マルクス・ラーション
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC41
4B065BC50
4B065CA44
4C087BB58
4C087ZB21
(57)【要約】
高度な治療用医薬品の製造に使用される、新生児品質および成体組織特異性を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を精製、培養、および選択する方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
満期羊水（ｔｅｒｍ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）から満期羊水間葉系幹細胞（ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ、アログラフト炎症因子１様、カドヘリン関連ファミリーメンバー１、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１、形質膜小胞関連タンパク質、メソテリン、Ｌ１細胞接着分子、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ダブルＣ２ドメインβ、内皮細胞接着分子、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット、カドヘリン１６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、デスモコリン３、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１、ＣＤ７０分子、ＧＤＮＦファミリー受容体α１、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３、クローディン１、新規転写産物、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５、線維芽細胞増殖因子受容体４、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３、ジスフェリン、エフリンＡ１、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１、シナプトタグミン様１、カルシンテニン２、インテグリンサブユニットβ４、小胞関連膜タンパク質８、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ、ＣＤ２４分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２、カドヘリン８、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１、デマチンアクチン結合タンパク質、Ｆ１１受容体、細胞接着分子１、カドヘリン６、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、溶質担体ファミリー６メンバー６、デスモグレイン２、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１、コレシストキニンＡ受容体、オキシトシン受容体、インテグリンサブユニットα３、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１、およびＥＰＨ受容体Ｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ ＭＳＣを選択し、それによって前記ＴＡＦ ＭＳＣを得ることと、を含む、方法。
【請求項2】
ＴＡＦ ＭＳＣを選択することが、ＩＬ１３ＲＡ２、ＣＬＵ、ＴＭＥＭ１１９、ＣＥＭＩＰ、ＬＳＰ１、ＧＰＮＭＢ、ＦＡＰ、ＣＲＬＦ１、ＭＭＥ、ＣＬＭＰ、ＢＧＮ、ＤＤＲ２からなる群から選択されるマーカーの発現が低下したＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
粒子状物質を除去することが、前記ＴＡＦを濾過することおよび遠心分離することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行うことが、前記精製されたＴＡＦ細胞をビトロネクチンベースの基質でコーティングされた表面に接着させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
選択ステップが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記選択ステップが、前記マーカーまたは表面マーカーのうちのいずれかに対する抗体を用いて行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記選択ステップが、前記Ａ群表面マーカーから少なくとも２つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記選択ステップが、前記Ａ群表面マーカーから少なくとも３つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記選択ステップが、前記Ａ群表面マーカーから少なくとも４つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記選択ステップが複数の選別ステップを含み、各選別ステップが、それぞれのＴＡＦ ＭＳＣによって発現されるかまたは発現されないマーカーのセットに応じて、ＴＡＦ ＭＳＣを第１の出力群または第２の出力群に割り当てることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記選択ステップが、Ａ群表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを第１の出力群に割り当てるための第１の選別ステップと、
第２のマーカーのセットを発現する前記第１の出力群から第２の出力群にＴＡＦ ＭＳＣを割り当てるための第２の選別ステップと、を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
満期羊水から満期羊水肺間葉系幹細胞（肺ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記肺ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、ＬＲＲＣ３８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ肺ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ肺間葉系幹細胞を得ることと、を含む、方法。
【請求項13】
肺ＴＡＦ ＭＳＣを選択することが、ＣＤ２４、ＩＴＧＢ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＦＲＡ１、ＣＤ７４、ＦＧＦＲ４、ＨＡＶＣＲ１、およびＯＳＣＡＲからなる群から選択されるマーカーを発現するＭＳＣを除外することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
選択ステップが、前記Ｂ群表面マーカーから少なくとも２つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記選択ステップが、前記Ｂ群表面マーカーから少なくとも３つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項16】
前記選択ステップが、前記Ｂ群表面マーカーから少なくとも４つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１２、１３、１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記選択ステップが、ＣＤ２４８、ＤＤＲ１、およびＬＲＲＣ３８の群から選択される表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記選択ステップが、ＣＤ２４８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記選択ステップが、ＤＤＲ１およびＬＲＲＣ３８の群から選択されるマーカーと組み合わせてＣＤ２４８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記選択ステップが、ＣＤ２４８、ＤＤＲ１、およびＬＲＲＣ３８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
請求項１～１０のいずれか一項に記載に記載の方法によって得ることができる単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞であって、前記細胞が少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する、単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞。
【請求項22】
満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞の単離された集団であって、前記細胞が、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ、アログラフト炎症因子１様、カドヘリン関連ファミリーメンバー１、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１、形質膜小胞関連タンパク質、メソテリン、Ｌ１細胞接着分子、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ダブルＣ２ドメインβ、内皮細胞接着分子、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット、カドヘリン１６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、デスモコリン３、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１、ＣＤ７０分子、ＧＤＮＦファミリー受容体α１、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３、クローディン１、新規転写産物、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５、線維芽細胞増殖因子受容体４、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３、ジスフェリン、エフリンＡ１、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１、シナプトタグミン様１、カルシンテニン２、インテグリンサブユニットβ４、小胞関連膜タンパク質８、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ、ＣＤ２４分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２、カドヘリン８、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１、デマチンアクチン結合タンパク質、Ｆ１１受容体、細胞接着分子１、カドヘリン６、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、溶質担体ファミリー６メンバー６、デスモグレイン２、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１、コレシストキニンＡ受容体、オキシトシン受容体、インテグリンサブユニットα３、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１、およびＥＰＨ受容体Ｂ２を含む群から選択される少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する、単離された集団。
【請求項23】
請求項１８に記載の満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞の単離された集団と、前記ＴＡＦ ＭＳＣのための薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項24】
請求項１２～１６に記載の方法によって得ることができる単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系肺幹細胞であって、前記細胞が、ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現する、単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系肺幹細胞。
【請求項25】
満期羊水（ＴＡＦ）肺間葉系幹細胞の単離された集団であって、前記細胞が少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現する、単離された集団。
【請求項26】
前述の明細書および／または図の１つ以上の特徴を含む、単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞。
【請求項27】
満期羊水から満期羊水腎臓間葉系幹（腎臓ＴＡＦ ＭＳＣ）細胞を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記ＴＡＦ腎臓ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＣＤ２４、ＣＬＤＮ６、ＡＢＣＢ１、ＳＨＩＳＡ９、ＣＲＢ３、ＡＣ１１８７５４．１、ＩＴＧＢ６、ＣＤＨ１、ＬＳＲ、ＥＰＣＡＭ、ＡＪＡＰ１、ＡＮＯ９、ＣＬＤＮ７、ＥＦＮＡ１、ＭＡＬ２、Ｆ１１Ｒ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＦＲＡ１、ＩＧＳＦ３、ＴＮＦ、ＭＭＰ７、ＦＯＬＲ１、ＴＧＦＡ、Ｃ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＤＧＦＢおよびＷＷＣ１からなる群から選択される少なくとも１つのＣ群表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ腎臓ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ腎臓ＭＳＣを得ることと、を含む、方法。
【請求項28】
満期羊水（ＴＡＦ）腎臓間葉系幹細胞（腎臓ＴＡＦ ＭＳＣ）の単離された集団であって、前記腎臓ＴＡＦ ＭＳＣが、ＨＡＶＣＲ１、ＣＤ２４、ＣＬＤＮ６、ＡＢＣＢ１、ＳＨＩＳＡ９、ＣＲＢ３、ＡＣ１１８７５４．１、ＩＴＧＢ６、ＣＤＨ１、ＬＳＲ、ＥＰＣＡＭ、ＡＪＡＰ１、ＡＮＯ９、ＣＬＤＮ７、ＥＦＮＡ１、ＭＡＬ２、Ｆ１１Ｒ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＦＲＡ１、ＩＧＳＦ３、ＴＮＦ、ＭＭＰ７、ＦＯＬＲ１、ＴＧＦＡ、Ｃ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＤＧＦＢおよびＷＷＣ１からなる群から選択される少なくとも１つのＣ群表面マーカーを発現する、単離された集団。
【請求項29】
請求項２８に記載の満期羊水（ＴＡＦ）腎臓間葉系幹細胞の単離された集団を含む、組成物。
【請求項30】
満期羊水から満期羊水皮膚間葉系幹細胞（皮膚ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＮＦＳＦ１８、ＰＣＤＨ１９、ＮＣＡＭ２、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＨＴＲ２Ｂ、ＰＣＤＨ１８、ＳＵＬＦ１、ＭＭＥ、ＡＤＧＲＡ２、ＤＣＳＴＡＭＰ、ＰＤＧＦＲＡ、ＵＮＣ５Ｂ、ＳＣＵＢＥ３、ＣＥＭＩＰ、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＢＤＫＲＢ２、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、およびＳＲＰＸ２からなる群から選択される少なくとも１つのＤ群表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記皮膚ＴＡＦ ＭＳＣを選択することと、
ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを得ることと、を含む、方法。
【請求項31】
満期羊水（ＴＡＦ）皮膚間葉系幹細胞（皮膚ＭＳＣ）の単離された集団であって、前記皮膚ＴＡＦ ＭＳＣが、ＴＮＦＳＦ１８、ＰＣＤＨ１９、ＮＣＡＭ２、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＨＴＲ２Ｂ、ＰＣＤＨ１８、ＳＵＬＦ１、ＭＭＥ、ＡＤＧＲＡ２、ＤＣＳＴＡＭＰ、ＰＤＧＦＲＡ、ＵＮＣ５Ｂ、ＳＣＵＢＥ３、ＣＥＭＩＰ、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＢＤＫＲＢ２、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、およびＳＲＰＸ２からなる群から選択される少なくとも１つのＤ群表面マーカーを発現する、単離された集団。
【請求項32】
請求項２７に記載の満期羊水（ＴＡＦ）皮膚間葉系幹細胞の単離された集団と、前記ＴＡＦ皮膚ＭＳＣのための薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項33】
満期羊水から満期羊水神経間葉系幹細胞（神経ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記ＴＡＦ神経ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＯＳＣＡＲ、Ｃ３、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＫＡＲ、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＬＳＴＮ２、ＴＥＮＭ２、ＳＦＲＰ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＣＬＤＮ１１、ＡＬＤＨ３Ｂ１、およびＩＴＧＢ４からなる群から選択される少なくとも１つのＥ群表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ神経ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ神経ＭＳＣを得ることと、を含む、方法。
【請求項34】
満期羊水（ＴＡＦ）神経間葉系幹細胞（神経ＴＡＦ ＭＳＣ）の単離された集団であって、前記神経ＴＡＦ ＭＳＣが、ＨＡＶＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＯＳＣＡＲ、Ｃ３、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＫＡＲ、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＬＳＴＮ２、ＴＥＮＭ２、ＳＦＲＰ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＣＬＤＮ１１、ＡＬＤＨ３Ｂ１およびＩＴＧＢ４からなる群から選択される少なくとも１つのＥ群表面マーカーを発現する、単離された集団。
【請求項35】
請求項３０に記載の満期羊水（ＴＡＦ）神経間葉系幹細胞の単離された集団と、前記ＴＡＦ神経ＭＳＣのための薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項36】
前述の明細書および／または図の１つ以上の特徴を含む単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞を単離する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高度な治療用医薬品の製造に使用するための新生児品質の組織特異性を有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を精製、培養、および選択するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
羊水は、妊娠中に胎児を取り囲み、保護する液体である。最後の三半期の間、羊水は、部分的に胎児の肺によって、また部分的に胎児の尿によって分泌される。羊水は、経口摂取され、胎児の腸に吸収されて胎児循環に再び入る。満期羊水（ｔｅｒｍ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）は、電解質を含む水で構成されているが、タンパク質、炭水化物、脂質、リン脂質、および尿素も含む。代謝廃棄物に加えて、羊水は、胎児細胞、ならびに摩擦によって皮膚から剥がれ落ちる他の物質、例えば、毛および出生時に赤ん坊の皮膚を覆っている脂性の沈着物である胎脂も含んでいる。羊水と接触している組織界面は、細胞物質を含む羊水の内容物に寄与する。肺は、これらの表面の中で最大であり、ＴＡＦ中に肺サーファクタントも分泌する。口腔および鼻粘膜、眼、ならびに尿路は、羊水と位相接触している非角質化上皮界面を有する他のそのような表面である。
【0003】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ほぼすべての組織に見られ、主に血管周囲のニッチに存在する。当業者によって理解されるように、間葉系幹細胞は、多数の細胞型に分化することができ、組織修復プロセスを指示するための抗炎症、血管新生特性を有する多能性間質細胞であり、そのため、間葉系幹細胞は治療的処置にとって価値あるものとなっている。帝王切開中に採取された満期羊水（ＴＡＦ）には、ＭＳＣを含む多くの貴重な細胞が含まれている。しかしながら、ＭＳＣの抽出および増殖は、ＴＡＦの無菌的採取、処理、ならびにＭＳＣの同定および抽出に関連する困難のために、以前は大規模に行われていなかった。さらに、ＭＳＣの特定の亜集団は、治療薬の製造に使用するのに特に適している可能性がある。以前は、ＭＳＣを得るために、成体骨髄、成体脂肪組織、または胎盤、臍帯、および臍帯血を含む新生児の出生関連組織から供給されるＭＳＣが広く使用されていた。これらの新生児組織からのＭＳＣは、成体供給源に由来するＭＳＣと比較して追加の能力を有し得る。実際、いくつかの研究では、成体由来のＭＳＣと比べて、出生関連組織からのＭＳＣの増殖能、寿命、および分化能の改善等、より優れた生物学的特性が報告されている。しかしながら、これらの新生児ＭＳＣ供給源のいずれも、成人の体内の対応する組織または臓器を有しない。したがって、組織特異性を有する新生児品質のＭＳＣは非常に有益である。さらに、胎児物質の獲得は、乳児への悪影響に関連する場合がある。例えば、臍帯血の採取では、生存率、成長、および細かい運動能力の発達の向上のために、可能な限り多くの臍帯血を乳児に戻す必要があることが示されている。一方、羊水は今日、廃棄される医療廃棄物とみなされている。したがって、そのような未だ活用されていない資源を採取するための倫理的および実践的なインセンティブの両方が明確である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許出願第１４／７７６，４９９号（ＵＳ２０１６／００３０４８９に対応する）
【発明の概要】
【0005】
特定の開示される例は、羊水およびそれに由来する細胞から羊水間葉系幹細胞を得るためのデバイス、細胞、方法、およびシステムに関する。本明細書に記載のデバイス、方法、およびシステムの適用は、特定の細胞または組織の種類に限定されないことが当業者によって理解されるであろう。さらなる例を以下に記載する。
一態様において、本開示は、羊水から羊水間葉系幹細胞を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ間葉系幹細胞（ＴＡＦ ＭＳＣ）を得ることと、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ（ＴＢＣ１Ｄ３Ｋ）、アログラフト炎症因子１様（ＡＩＦ１Ｌ）、カドヘリン関連ファミリーメンバー１（ＣＤＨＲ１）、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４（ＮＫＡＩＮ４）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１（ＡＢＣＢ１）、原形質膜小胞関連タンパク質（ＰＬＶＡＰ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）（ＭＡＬ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ダブルＣ２ドメインβ（ＤＯＣ２Ｂ）、内皮細胞接着分子（ＥＳＡＭ）、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット（ＧＡＢＲＢ１）、カドヘリン１６（ＣＤＨ１６）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子（ＲＨＥＸ）、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１（ＫＣＮＩＰ１）、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、ＧＤＮＦファミリー受容体α１（ＧＦＲＡ１）、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３（ＣＲＢ３）、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、新規転写産物（ＡＣ１１８７５４．１）、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５（ＳＣＮ５Ａ）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３（ＫＣＮＫ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、エフリンＡ１（ＥＦＮＡ１）、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６（ＫＣＮＪ１６）、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１（ＭＡＲＣＨＦ１）、シナプトタグミン様１（ＳＹＴＬ１）、カルシンテニン２（ＣＬＳＴＮ２）、インテグリンサブユニットβ４（ＩＴＧＢ４）、小胞関連膜タンパク質８（ＶＡＭＰ８）、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ（ＧＰＲＣ５Ｃ）、ＣＤ２４分子（ＣＤ２４）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２（ＣＥＬＳＲ２）、カドヘリン８（ＣＤＨ８）、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ１）、デマチンアクチン結合タンパク質（ＤＭＴＮ）、Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、カドヘリン６（ＣＤＨ６）、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２（Ｆ２ＲＬ２）、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１（ＬＹＰＤ１）、溶質担体ファミリー６メンバー６（ＳＬＣ６Ａ６）、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１（ＡＤＧＲＧ１）、コレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ）、オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）、インテグリンサブユニットα３（ＩＴＧＡ３）、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子（ＡＭＩＧＯ２）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１（ＣＥＬＳＲ１）、ＥＰＨ受容体Ｂ２（ＥＰＨＢ２）からなる群から選択されるマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することと、を含む、方法を提供する。
一態様において、本開示は、羊水から羊水間葉系幹細胞を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ間葉系幹細胞（ＴＡＦ ＭＳＣ）を得ることと、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ（ＴＢＣ１Ｄ３Ｋ）、アログラフト炎症因子１様（ＡＩＦ１Ｌ）、カドヘリン関連ファミリーメンバー１（ＣＤＨＲ１）、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４（ＮＫＡＩＮ４）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１（ＡＢＣＢ１）、原形質膜小胞関連タンパク質（ＰＬＶＡＰ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）（ＭＡＬ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ダブルＣ２ドメインβ（ＤＯＣ２Ｂ）、内皮細胞接着分子（ＥＳＡＭ）、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット（ＧＡＢＲＢ１）、カドヘリン１６（ＣＤＨ１６）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子（ＲＨＥＸ）、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１（ＫＣＮＩＰ１）、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、ＧＤＮＦファミリー受容体α１（ＧＦＲＡ１）、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３（ＣＲＢ３）、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、新規転写産物（ＡＣ１１８７５４．１）、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５（ＳＣＮ５Ａ）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３（ＫＣＮＫ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、エフリンＡ１（ＥＦＮＡ１）、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６（ＫＣＮＪ１６）、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１（ＭＡＲＣＨＦ１）、シナプトタグミン様１（ＳＹＴＬ１）、カルシンテニン２（ＣＬＳＴＮ２）、インテグリンサブユニットβ４（ＩＴＧＢ４）、小胞関連膜タンパク質８（ＶＡＭＰ８）、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ（ＧＰＲＣ５Ｃ）、ＣＤ２４分子（ＣＤ２４）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２（ＣＥＬＳＲ２）、カドヘリン８（ＣＤＨ８）、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ１）、デマチンアクチン結合タンパク質（ＤＭＴＮ）、Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、カドヘリン６（ＣＤＨ６）、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２（Ｆ２ＲＬ２）、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１（ＬＹＰＤ１）、溶質担体ファミリー６メンバー６（ＳＬＣ６Ａ６）、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１（ＡＤＧＲＧ１）、コレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ）、オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）、インテグリンサブユニットα３（ＩＴＧＡ３）、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子（ＡＭＩＧＯ２）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１（ＣＥＬＳＲ１）、ＥＰＨ受容体Ｂ２（ＥＰＨＢ２）からなる群から選択されるマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することと、を含む、方法を提供する。
【0006】
別の態様において、本開示は、本開示による方法によって得ることができる単離された細胞を提供し、該細胞は、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ（ＴＢＣ１Ｄ３Ｋ）、アログラフト炎症因子１様（ＡＩＦ１Ｌ）、カドヘリン関連ファミリーメンバー１（ＣＤＨＲ１）、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４（ＮＫＡＩＮ４）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１（ＡＢＣＢ１）、形質膜小胞関連タンパク質（ＰＬＶＡＰ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）（ＭＡＬ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ダブルＣ２ドメインβ（ＤＯＣ２Ｂ）、内皮細胞接着分子（ＥＳＡＭ）、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット（ＧＡＢＲＢ１）、カドヘリン１６（ＣＤＨ１６）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子（ＲＨＥＸ）、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１（ＫＣＮＩＰ１）、ＣＤ７０分子（ＣＤ７０）、ＧＤＮＦファミリー受容体α１（ＧＦＲＡ１）、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３（ＣＲＢ３）、クローディン１（ＣＬＤＮ１）、新規転写産物（ＡＣ１１８７５４．１）、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５（ＳＣＮ５Ａ）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３（ＫＣＮＫ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、エフリンＡ１（ＥＦＮＡ１）、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６（ＫＣＮＪ１６）、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１（ＭＡＲＣＨＦ１）、シナプトタグミン様１（ＳＹＴＬ１）、カルシンテニン２（ＣＬＳＴＮ２）、インテグリンサブユニットβ４（ＩＴＧＢ４）、小胞関連膜タンパク質８（ＶＡＭＰ８）、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ（ＧＰＲＣ５Ｃ）、ＣＤ２４分子（ＣＤ２４）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２（ＣＥＬＳＲ２）、カドヘリン８（ＣＤＨ８）、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ１）、デマチンアクチン結合タンパク質（ＤＭＴＮ）、Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、カドヘリン６（ＣＤＨ６）、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２（Ｆ２ＲＬ２）、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１（ＬＹＰＤ１）、溶質担体ファミリー６メンバー６（ＳＬＣ６Ａ６）、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１（ＡＤＧＲＧ１）、コレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ）、オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）、インテグリンサブユニットα３（ＩＴＧＡ３）、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子（ＡＭＩＧＯ２）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１（ＣＥＬＳＲ１）、ＥＰＨ受容体Ｂ２（ＥＰＨＢ２）を含む群から選択される表面マーカーを発現する。
【0007】
特定の例において、満期羊水から満期羊水間葉系幹細胞（ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ、アログラフト炎症因子１様、カドヘリン関連ファミリーメンバー１、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１、形質膜小胞関連タンパク質、メソテリン、Ｌ１細胞接着分子、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ダブルＣ２ドメインβ、内皮細胞接着分子、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット、カドヘリン１６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、デスモコリン３、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１、ＣＤ７０分子、ＧＤＮＦファミリー受容体α１、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３、クローディン１、新規転写産物、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５、線維芽細胞増殖因子受容体４、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３、ジスフェリン、エフリンＡ１、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１、シナプトタグミン様１、カルシンテニン２、インテグリンサブユニットβ４、小胞関連膜タンパク質８、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ、ＣＤ２４分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２、カドヘリン８、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１、デマチンアクチン結合タンパク質、Ｆ１１受容体、細胞接着分子１、カドヘリン６、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、溶質担体ファミリー６メンバー６、デスモグレイン２、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１、コレシストキニンＡ受容体、オキシトシン受容体、インテグリンサブユニットα３、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１、およびＥＰＨ受容体Ｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ、アログラフト炎症因子１様、カドヘリン関連ファミリーメンバー１、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１、形質膜小胞関連タンパク質、メソテリン、Ｌ１細胞接着分子、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ダブルＣ２ドメインβ、内皮細胞接着分子、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット、カドヘリン１６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、デスモコリン３、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１、ＣＤ７０分子、ＧＤＮＦファミリー受容体α１、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３、クローディン１、新規転写産物、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５、線維芽細胞増殖因子受容体４、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３、ジスフェリン、エフリンＡ１、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１、シナプトタグミン様１、カルシンテニン２、インテグリンサブユニットβ４、小胞関連膜タンパク質８、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ、ＣＤ２４分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２、カドヘリン８、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１、デマチンアクチン結合タンパク質、Ｆ１１受容体、細胞接着分子１、カドヘリン６、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、溶質担体ファミリー６メンバー６、デスモグレイン２、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１、コレシストキニンＡ受容体、オキシトシン受容体、インテグリンサブユニットα３、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１、およびＥＰＨ受容体Ｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
【0008】
いくつかの例において、ＴＡＦ ＭＳＣを選択することは、ＩＬ１３ＲＡ２、ＣＬＵ、ＴＭＥＭ１１９、ＣＥＭＩＰ、ＬＳＰ１、ＧＰＮＭＢ、ＦＡＰ、ＣＲＬＦ１、ＭＭＥ、ＣＬＭＰ、ＢＧＮ、ＤＤＲ２からなる群から選択されるマーカーの発現が低下したＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。粒子状物質を除去することは、ＴＡＦを濾過することおよび遠心分離することを含み得る。精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行うことは、精製されたＴＡＦ細胞をビトロネクチンベースの基質でコーティングされた表面に接着させることを含み得る。選択ステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して行うことができる。選択ステップは、マーカーまたは表面マーカーのうちのいずれかに対する抗体を用いて行うことができる。選択ステップは、Ａ群表面マーカーから少なくとも２つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、Ａ群表面マーカーから少なくとも３つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、Ａ群表面マーカーから少なくとも４つのマーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、複数の選別ステップを含んでもよく、各選別ステップは、それぞれのＴＡＦ ＭＳＣによって発現されるかまたは発現されないマーカーのセットに応じて、ＴＡＦ ＭＳＣを第１の出力群または第２の出力群に割り当てることを含む。
【0009】
いくつかの例において、選択ステップは、Ａ群表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを第１の出力群に割り当てるための第１の選別ステップと、第２のマーカーのセットを発現する第１の出力群から第２の出力群にＴＡＦ ＭＳＣを割り当てるための第２の選別ステップとを含み得る。
【0010】
特定の例において、満期羊水から満期羊水肺間葉系幹細胞（肺ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、肺ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、ＬＲＲＣ３８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ肺ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ肺間葉系幹細胞を得ることと、を含み得る。
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、肺ＴＡＦ ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、ＬＲＲＣ３８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ肺ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ肺間葉系幹細胞を得ることと、を含み得る。
【0011】
肺ＴＡＦ ＭＳＣの選択は、ＣＤ２４、ＩＴＧＢ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＦＲＡ１、ＣＤ７４、ＦＧＦＲ４、ＨＡＶＣＲ１、およびＯＳＣＡＲからなる群から選択されるマーカーを発現するＭＳＣを除外することを含み得る。選択ステップは、Ｂ群表面マーカーから少なくとも２つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、Ｂ群表面マーカーから少なくとも３つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、Ｂ群表面マーカーから少なくとも４つの表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、ＣＤ２４８、ＤＤＲ１、およびＬＲＲＣ３８の群から選択される表面マーカーを発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、ＣＤ２４８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、ＤＤＲ１およびＬＲＲＣ３８の群から選択されるマーカーと組み合わせてＣＤ２４８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。選択ステップは、ＣＤ２４８、ＤＤＲ１、およびＬＲＲＣ３８を発現するＴＡＦ ＭＳＣを選択することを含み得る。いくつかの例において、単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞は、上記の方法によって得ることができ、該細胞は、少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現する。
【0012】
いくつかの例において、満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞の単離された集団は、ＴＢＣ１ドメインファミリーメンバー３Ｋ、アログラフト炎症因子１様、カドヘリン関連ファミリーメンバー１、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ相互作用４、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１、形質膜小胞関連タンパク質、メソテリン、Ｌ１細胞接着分子、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１、ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２（遺伝子／偽遺伝子）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ダブルＣ２ドメインβ、内皮細胞接着分子、Ａ型γアミノ酪酸受容体β１サブユニット、カドヘリン１６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、デスモコリン３、ヘモグロビン化および赤血球細胞増殖の調節因子、カリウム電位依存性チャネル相互作用タンパク質１、ＣＤ７０分子、ＧＤＮＦファミリー受容体α１、Ｃｒｕｍｂｓ細胞極性複合体成分３、クローディン１、新規転写産物、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット５、線維芽細胞増殖因子受容体４、カリウム２細孔ドメインチャネルサブファミリーＫメンバー３、ジスフェリン、エフリンＡ１、カリウム内向き整流チャネルサブファミリーＪメンバー１６、膜結合ＲＩＮＧ－ＣＨ型フィンガー１、シナプトタグミン様１、カルシンテニン２、インテグリンサブユニットβ４、小胞関連膜タンパク質８、Ｇタンパク質結合受容体クラスＣグループ５メンバーＣ、ＣＤ２４分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体２、カドヘリン８、グルタミン酸受容体相互作用タンパク質１、デマチンアクチン結合タンパク質、Ｆ１１受容体、細胞接着分子１、カドヘリン６、凝固因子ＩＩトロンビン受容体様２、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、溶質担体ファミリー６メンバー６、デスモグレイン２、接着Ｇタンパク質共役型受容体Ｇ１、コレシストキニンＡ受容体、オキシトシン受容体、インテグリンサブユニットα３、Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体１、およびＥＰＨ受容体Ｂ２を含む群から選択される少なくとも１つのＡ群表面マーカーを発現し得る。
【0013】
いくつかの例において、組成物は、上記の満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞の単離された集団と、ＴＡＦ ＭＳＣのための薬学的に許容される担体とを含み得る。上記の方法によって得ることができる単離された満期羊水（ＴＡＦ）間葉系肺幹細胞は、ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現し得る。特定の例において、満期羊水（ＴＡＦ）肺間葉系幹細胞の単離された集団は、少なくとも１つのＢ群表面マーカーを発現し得る。
【0014】
いくつかの例において、満期羊水から満期羊水腎臓間葉系幹（腎臓ＴＡＦ ＭＳＣ）細胞を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ腎臓ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＣＤ２４、ＣＬＤＮ６、ＡＢＣＢ１、ＳＨＩＳＡ９、ＣＲＢ３、ＡＣ１１８７５４．１、ＩＴＧＢ６、ＣＤＨ１、ＬＳＲ、ＥＰＣＡＭ、ＡＪＡＰ１、ＡＮＯ９、ＣＬＤＮ７、ＥＦＮＡ１、ＭＡＬ２、Ｆ１１Ｒ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＦＲＡ１、ＩＧＳＦ３、ＴＮＦ、ＭＭＰ７、ＦＯＬＲ１、ＴＧＦＡ、Ｃ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＤＧＦＢおよびＷＷＣ１からなる群から選択される少なくとも１つのＣ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ腎臓ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ腎臓ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ腎臓ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＣＤ２４、ＣＬＤＮ６、ＡＢＣＢ１、ＳＨＩＳＡ９、ＣＲＢ３、ＡＣ１１８７５４．１、ＩＴＧＢ６、ＣＤＨ１、ＬＳＲ、ＥＰＣＡＭ、ＡＪＡＰ１、ＡＮＯ９、ＣＬＤＮ７、ＥＦＮＡ１、ＭＡＬ２、Ｆ１１Ｒ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＦＲＡ１、ＩＧＳＦ３、ＴＮＦ、ＭＭＰ７、ＦＯＬＲ１、ＴＧＦＡ、Ｃ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＤＧＦＢおよびＷＷＣ１からなる群から選択される少なくとも１つのＣ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ腎臓ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ腎臓ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
【0015】
特定の例において、満期羊水（ＴＡＦ）腎臓間葉系幹細胞（腎臓ＴＡＦ ＭＳＣ）の単離された集団は、ＨＡＶＣＲ１、ＣＤ２４、ＣＬＤＮ６、ＡＢＣＢ１、ＳＨＩＳＡ９、ＣＲＢ３、ＡＣ１１８７５４．１、ＩＴＧＢ６、ＣＤＨ１、ＬＳＲ、ＥＰＣＡＭ、ＡＪＡＰ１、ＡＮＯ９、ＣＬＤＮ７、ＥＦＮＡ１、ＭＡＬ２、Ｆ１１Ｒ、Ｌ１ＣＡＭ、ＧＦＲＡ１、ＩＧＳＦ３、ＴＮＦ、ＭＭＰ７、ＦＯＬＲ１、ＴＧＦＡ、Ｃ３、ＴＮＦＳＦ１０、ＰＤＧＦＢおよびＷＷＣ１からなる群から選択される少なくとも１つのＣ群表面マーカーを発現し得る。
【0016】
組成物は、上記のような満期羊水（ＴＡＦ）腎臓間葉系幹細胞の単離された集団を含み得る。
いくつかの例において、満期羊水から満期羊水皮膚間葉系幹細胞（皮膚ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＮＦＳＦ１８、ＰＣＤＨ１９、ＮＣＡＭ２、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＨＴＲ２Ｂ、ＰＣＤＨ１８、ＳＵＬＦ１、ＭＭＥ、ＡＤＧＲＡ２、ＤＣＳＴＡＭＰ、ＰＤＧＦＲＡ、ＵＮＣ５Ｂ、ＳＣＵＢＥ３、ＣＥＭＩＰ、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＢＤＫＲＢ２、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、およびＳＲＰＸ２からなる群から選択される少なくとも１つのＤ群表面マーカーを発現する細胞として集団から皮膚ＴＡＦ ＭＳＣを選択することと、
ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
いくつかの例において、満期羊水から満期羊水皮膚間葉系幹細胞（皮膚ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＴＮＦＳＦ１８、ＰＣＤＨ１９、ＮＣＡＭ２、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＨＴＲ２Ｂ、ＰＣＤＨ１８、ＳＵＬＦ１、ＭＭＥ、ＡＤＧＲＡ２、ＤＣＳＴＡＭＰ、ＰＤＧＦＲＡ、ＵＮＣ５Ｂ、ＳＣＵＢＥ３、ＣＥＭＩＰ、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＢＤＫＲＢ２、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、およびＳＲＰＸ２からなる群から選択される少なくとも１つのＤ群表面マーカーを発現する細胞として集団から皮膚ＴＡＦ ＭＳＣを選択することと、
ＴＡＦ皮膚ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
【0017】
特定の例において、満期羊水（ＴＡＦ）皮膚間葉系幹細胞（皮膚ＭＳＣ）の単離された集団は、ＴＮＦＳＦ１８、ＰＣＤＨ１９、ＮＣＡＭ２、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ２４８、ＤＤＲ２、ＨＴＲ２Ｂ、ＰＣＤＨ１８、ＳＵＬＦ１、ＭＭＥ、ＡＤＧＲＡ２、ＤＣＳＴＡＭＰ、ＰＤＧＦＲＡ、ＵＮＣ５Ｂ、ＳＣＵＢＥ３、ＣＥＭＩＰ、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＢＤＫＲＢ２、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、およびＳＲＰＸ２からなる群から選択される少なくとも１つのＤ群表面マーカーを発現し得る。組成物は、上記の満期羊水（ＴＡＦ）皮膚間葉系幹細胞の単離された集団と、ＴＡＦ皮膚ＭＳＣのための薬学的に許容される担体とを含み得る。
【0018】
いくつかの例において、満期羊水から満期羊水神経間葉系幹細胞（神経ＴＡＦ ＭＳＣ）を得るための方法は、
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ神経ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＯＳＣＡＲ、Ｃ３、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＫＡＲ、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＬＳＴＮ２、ＴＥＮＭ２、ＳＦＲＰ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＣＬＤＮ１１、ＡＬＤＨ３Ｂ１、およびＩＴＧＢ４からなる群から選択される少なくとも１つのＥ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ神経ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ神経ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
ＴＡＦ接着細胞を継代して、ＴＡＦ神経ＭＳＣを含む細胞の集団を得ることと、
ＨＡＶＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＯＳＣＡＲ、Ｃ３、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＫＡＲ、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＬＳＴＮ２、ＴＥＮＭ２、ＳＦＲＰ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＣＬＤＮ１１、ＡＬＤＨ３Ｂ１、およびＩＴＧＢ４からなる群から選択される少なくとも１つのＥ群表面マーカーを発現する細胞として集団からＴＡＦ神経ＭＳＣを選択し、それによってＴＡＦ神経ＭＳＣを得ることと、を含み得る。
【0019】
いくつかの例において、満期羊水（ＴＡＦ）神経間葉系幹細胞（神経ＴＡＦ ＭＳＣ）の単離された集団は、ＨＡＶＣＲ１、ＡＣＫＲ３、ＯＳＣＡＲ、Ｃ３、ＳＩＲＰＢ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＣＣＫＡＲ、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＬＳＴＮ２、ＴＥＮＭ２、ＳＦＲＰ１、ＰＩＫ３ＩＰ１、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＣＬＤＮ１１、ＡＬＤＨ３Ｂ１およびＩＴＧＢ４からなる群から選択される少なくとも１つのＥ群表面マーカーを発現し得る。組成物は、上記の満期羊水（ＴＡＦ）神経間葉系幹細胞の単離された集団と、ＴＡ 神経ＭＳＣのための薬学的に許容される担体と、を含み得る。
特定の態様において、本開示は、前述の記載および／または図の１つ以上の特徴を含む満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞およびＴＡＦ間葉系幹細胞を含む組成物を単離するための方法および装置を提供する。
特定の態様において、本開示は、前述の記載および／または図の１つ以上の特徴を含む満期羊水（ＴＡＦ）間葉系幹細胞およびＴＡＦ間葉系幹細胞を含む組成物を単離するための方法および装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＭＳＣ亜集団の精製、培養および選択のステップを示すフロー図である。
【図2】羊水を採取するための方法を示す図である。
【図3】一例による羊水を濾過するための装置の概略斜視図である。
【図4】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図5】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図6】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図7】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図8】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図9】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図10】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図11】一例による羊水を濾過するための装置の概略側面図である。
【図13】一例による羊水を濾過するための方法のフローチャートである。
【図14】一例によるＭＳＣ組織特異性スコアの計算ステップを示すフローチャートである。
【図15】５％および１５％の閾値を表すＭＳＣ組織特異性スコアを示すグラフの一例である。
【図16】１５％パーセンタイルを超える組織優先データを含む、組織優先データおよび組織低優先データを示すグラフの一例である。
【図17A】誘発性肺線維症のラットを処理するためにＴＡＦ肺ＭＳＣを使用することの効果を実証する例示的な試験の結果を示す。
【図17B】誘発性肺線維症のラットを処理するためにＴＡＦ肺ＭＳＣを使用することの効果を実証する例示的な試験の結果を示す。
【図17C】誘発性肺線維症のラットを処理するためにＴＡＦ肺ＭＳＣを使用することの効果を実証する例示的な試験の結果を示す。
【図17D】誘発性肺線維症のラットを処理するためにＴＡＦ肺ＭＳＣを使用することの効果を実証する例示的な試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
好ましい実施例の詳細な説明
新生児品質および成体組織特異性を有するＭＳＣ亜集団を精製、培養、および選択する方法を図１に要約し、以下に詳述する。本明細書に開示される実施例は、羊水由来細胞を採取する、精製する、単離する、増殖させる、分化させる、および成熟させるための装置および方法に関する。本明細書に開示される実施例は、特定のタイプの羊水由来細胞の採取に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術は、異なる細胞および組織に広く適用可能である。
新生児品質および成体組織特異性を有するＭＳＣ亜集団を精製、培養、および選択する方法を図１に要約し、以下に詳述する。本明細書に開示される実施例は、羊水由来細胞を採取する、精製する、単離する、増殖させる、分化させる、および成熟させるための装置および方法に関する。本明細書に開示される実施例は、特定のタイプの羊水由来細胞の採取に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術は、異なる細胞および組織に広く適用可能である。
【0022】
羊水採取
羊水は、参照によりその内容全体が組み込まれる米国特許出願第１４／７７６，４９９号（ＵＳ２０１６／００３０４８９に対応する）に記載された方法に従って、満期羊水（ＴＡＦ）を生成するために採取され得る。具体的には、図２は、本発明の例示的な例による、羊水採取の方法３００の一例のブロック図である。方法３００は、任意の数の追加または代替のタスクを含み得ることを理解されたい。図３に示されるタスクは、図示の順序で行われる必要はなく、方法３００は、本明細書に詳細に記載されていない追加の機能を有するより包括的な手順またはプロセスに組み込まれ得る。
羊水は、参照によりその内容全体が組み込まれる米国特許出願第１４／７７６，４９９号（ＵＳ２０１６／００３０４８９に対応する）に記載された方法に従って、満期羊水（ＴＡＦ）を生成するために採取され得る。具体的には、図２は、本発明の例示的な例による、羊水採取の方法３００の一例のブロック図である。方法３００は、任意の数の追加または代替のタスクを含み得ることを理解されたい。図３に示されるタスクは、図示の順序で行われる必要はなく、方法３００は、本明細書に詳細に記載されていない追加の機能を有するより包括的な手順またはプロセスに組み込まれ得る。
【0023】
図２に示されるように、方法３００は、例えば、帝王切開中に、妊娠している母親の子宮壁３０１に切開を行うことを含み得る。ステップ３０１は、標準的な医師のメスによって行われ得る。図２にも示されるように、方法３００は、ステップ３０１で作成された子宮壁の切開を通して羊水採取器３０２を挿入することを含み得る。方法３００はまた、ステップ３０２の羊水採取器を使用して羊膜３０３を貫通することを含む。ステップ３０３はまた、絨毛膜を貫通することを含み得る。一態様において、先端は１０ｃｍの深さまで挿入される。いくつかの例において、先端は約３ｃｍ～約３０ｃｍの深さまで挿入される。いくつかの例において、先端は、約４ｃｍ、約５ｃｍ、約６ｃｍ、約７ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１１ｃｍ、約１２ｃｍ、約１３ｃｍ、約１４ｃｍ、約１５ｃｍ、約１６ｃｍ、約１７ｃｍ、約１８ｃｍ、約１９ｃｍ、約２０ｃｍ、約２１ｃｍ、約２２ｃｍ、約２３ｃｍ、約２４ｃｍ、約２５ｃｍ、約２６ｃｍ、約２７ｃｍ、約２８ｃｍ、または約２９ｃｍの深さまで挿入される。
【0024】
方法３００はさらに、ステップ３０２の羊水採取器を使用して羊膜嚢から羊水３０４を採取することを含む。ステップ３０４は、羊水採取器の入口バルブを開くこと等によって、羊水を羊水採取器の採取チャンバに移送するためにサイフォンを開始することを含み得る。ステップ３０４はまた、羊水採取器の採取チャンバを羊水採取器の入口の下に配置することを含み得る。ステップ３０４はまた、羊水の移送を開始するために、羊水採取器の出口に負圧源をすることを含み得る。ステップ３０４は、利用可能な羊水を実質的にすべて回収するために羊水採取器の入口を再配置することを含み得る。
【0025】
最後に、方法３００は、羊膜嚢から羊水採取器９０５を除去することを含む。ステップ９０５は、羊水採取器の入口バルブを閉じることを含み得る。一例において、採取された物質中に血液は見えない。ステップ９０５はまた、さらなる使用／処理のために採取システムを空にし、デバイス全体の外部を滅菌することを含み得る。一例において、外部は、７０％エタノールを使用して滅菌され、その結果、例えば、本発明による細胞物質の単離のため、および流体貯蔵のための層流ベンチ設定等の任意の後処理ステップで滅菌が維持され得る。
【0026】
一例において、羊水採取手技は１分未満で行われる。一例において、羊水採取手技は１～２分で行われる。一例において、羊水採取手技は３分以内に行われる。一例において、方法は、例えば、手術創への羊水の漏出を防ぎ、視界および物理的アクセスを改善することにより、帝王切開の標準的な外科的手技と比較して単純化される。一例において、胎児の皮膚はデバイス先端の影響を受けない。
【0027】
精製
満期羊水（ＴＡＦ）は、胎脂を除去するために満期羊水を濾過することによって精製される。「満期羊水」という用語は、本開示において本明細書および他の場所で使用されるが、本開示の方法、プロセス、およびデバイスは、満期羊水だけでなく、すべての羊水に適用され得ることを理解されたい。満期羊水は、例えば、閉鎖式カテーテルに基づくシステムを使用して、満期帝王切開分娩で採取された羊水であり得る。本明細書の目的のために、「満期羊水」は、妊娠３７週以降の計画帝王切開で、または満期に近い計画帝王切開で、例えば妊娠３６週後に採取された羊水であり得る。好ましくは、満期羊水は、妊娠３７週以降の計画帝王切開で採取される。
満期羊水（ＴＡＦ）は、胎脂を除去するために満期羊水を濾過することによって精製される。「満期羊水」という用語は、本開示において本明細書および他の場所で使用されるが、本開示の方法、プロセス、およびデバイスは、満期羊水だけでなく、すべての羊水に適用され得ることを理解されたい。満期羊水は、例えば、閉鎖式カテーテルに基づくシステムを使用して、満期帝王切開分娩で採取された羊水であり得る。本明細書の目的のために、「満期羊水」は、妊娠３７週以降の計画帝王切開で、または満期に近い計画帝王切開で、例えば妊娠３６週後に採取された羊水であり得る。好ましくは、満期羊水は、妊娠３７週以降の計画帝王切開で採取される。
【0028】
図３は、一例による羊水を濾過するための装置１００の概略図である。羊水は、間葉系幹細胞等の胎児または羊膜嚢に由来する羊膜細胞を含む。羊水はまた、毛および胎脂等、摩擦によって皮膚から剥がれ落ちた他の物質も含んでいる。羊膜細胞以外の物質は、本明細書では粒子状物質と称され、胎便、血餅等を含む場合もある。粒子状物質は、２０μｍより大きいすべてのものとみなすことができる。濾過の目的のために、３０μｍまたは５０μｍより大きいすべてのものを粒子状物質として扱うことが特に有利である場合がある。任意選択的に、標的の羊膜細胞よりも大きいすべてものは粒子状物質として扱うことができる。したがって、羊水は一般に、羊膜細胞と粒子状物質の混合物を含む。装置１００は、羊水から粒子状物質を濾過するためのフィルタ１０１と、フィルタ１０１を囲むチャンバ１０２とを備える。チャンバ１０２は、流体入口１０３および流体出口１０４を備える。フィルタ１０１を囲むチャンバ１０２は、フィルタ１０１がチャンバ１０２を取り巻く環境からチャンバによって隔離されており、そのため、チャンバ１０２内の羊水と該環境との間に流体連通がないと解釈されるべきである。したがって、チャンバ１０２を通る流体連通は、図３の例において、流体入口１０３および流体出口１０４を介して制御される。フィルタ１０１は、流体入口１０３と流体出口１０４との間でチャンバ１０２の内側に取り付けられている。図１２は、図１２に示されるような円形チャンバ１０２およびフィルタ１０１の断面Ａ－Ａの一例を示している。しかしながら、チャンバ１０２およびフィルタ１０１は、異なる用途への最適化のために様々な形状を有し得ることを理解されたい。装置１００は、流体入口１０３と羊水サンプル供給源２０１（図４に示される）との間に密閉接続を形成するように配置された入口コネクタ１０５を備える。図４は、そのような羊水の供給源２０１の概略例を示している。流体入口１０３に接続され、流体入口１０３と羊水の供給源２０１との間に直接的に密閉接続を提供するように構成された入口コネクタ１０５を有することにより、汚染物質への曝露を最小限に抑え、羊水の効率的な無菌処理を提供する。これにより、羊膜細胞を得ることが容易になり、改善された品質基準での濾過後処理が可能となる。したがって、無菌医薬品の製造プロセスが容易になる。例えば、界面活性剤分子の調製が容易になり得る。装置１００は、移植後の生着期の改善等の、羊膜幹細胞の機能の改善を提供する。そのような改善されたプロセスは、チャンバ１０２で囲まれたフィルタ１０１と、チャンバ１０２の流体入口１０３と羊水サンプル供給源２０１との間に密閉接続を形成するように配置された入口コネクタ１０５とを有することによって可能になる。羊膜幹細胞を細菌およびウイルス等の汚染物質に曝露するリスクが、そのようにして低減される。酸素への曝露も最小限に抑えられ、幹細胞の機能に悪影響を与える可能性のある酸素フリーラジカルの形成を減少させる。
【0029】
図３は、入口コネクタ１０５が、第１の密閉接続部１１４で流体入口１０３に接続された管１０５を含む例を示している。入口コネクタ１０５は、圧力嵌め接続、接着剤、クランプ、または他の固定要素を用いて、流体入口１０３と密閉接続を形成することができる。図４に概略的に示されるような別の例において、入口コネクタ１０５は、例えば、成形または他の材料形成技術によって単一の部品として形成されることによって、別個の固定要素を伴わない、流体入口１０３の連続的な延在部である。図３および４は、羊水を含む容器またはバッグ２０１等のサンプル供給源２０１と密閉接続を形成するように構成された第２のコネクタ１１５を示している。第２のコネクタ１１５は、解放可能な圧力嵌め接続、クランプ、もしくはそれらの組み合わせ、または他の解放可能な固定要素を備え得る。チャンバ１０２、フィルタ１０１、流体入口１０３、流体出口１０４、および入口コネクタ１０５は、滅菌パッケージ内のキットとして、例えば使い捨てキットとして提供され得る。そのようなキット、すなわち装置１００は、このようにして羊膜幹細胞を濾過して得る、容易で改善されたプロセスを提供する。よって、使用において、羊水は、流体入口１０３から流体出口１０４に流れるときにフィルタ１０１を通過する。その結果、粒子状物質がフィルタ１０１上に堆積され、羊膜細胞を含む羊水が流体出口１０４を通って流れる。図１２の例に見られるように、フィルタ１０１は、その周縁部１１６の周りでチャンバ１０２の内壁１１３に接続され得る。これにより、羊水が、濾過されることなく、入口１０３から出口１０４へと通過するのを回避する。フィルタ１０１は、チャンバ１０２内でのフィルタ１０１の折り曲げまたは湾曲が回避されるように、張力をかけるか、または他の方法で支持することができる。これにより、フィルタ１０１の領域全体にわたって定義されたメッシュ径または細孔系を維持し、ひいては定義された濾過特性を維持する。定義されたメッシュ径または細孔系を維持することは、フィルタ１０１を目詰まりさせるリスクも低減する。その結果、長期的性能を向上させることができる。
【0030】
装置１００は、出口と、装置１００の下流にある遠心分離機または他の羊膜細胞処理機器等の羊膜細胞受容デバイス２０２との間に密閉接続を形成するように、出口５ コネクタ１０６を備え得る。図４は、そのようなデバイス２０２の概略例を示している。これにより、汚染物質への曝露が最小限に抑えられ、濾過後の処理ステップで羊水の効率的な無菌処理が可能になる。図３は、出口コネクタ１０６が、第１の密閉接続部１１７で流体出口１０４に接続された管１０６を含む例を示している。出口コネクタ１０６は、圧力嵌め接続、接着剤、クランプ、または他の固定要素を用いて、流体出口１０４と密閉接続を形成することができる。図４に概略的に示されるような別の例において、出口コネクタ１０６は、例えば、成形または他の材料形成技術によって単一の部品として形成されることによって、別個の固定要素を伴わない、流体出口１０４の連続的な延在部である。図３および４は、遠心分離機２０２等の、装置１００の下流にある羊膜細胞処理デバイスと密閉接続を形成するように構成された第２のコネクタ１１８を示している。第２のコネクタ１１８は、圧力嵌め接続、クランプ、それらの組み合わせ、または他の解放可能な固定要素を備え得る。したがって、第２のコネクタ１１８と、例えば遠心分離機２０２との間の接続は、繰り返し接続および切断され得、また、そのような手順において密閉接続を維持するために再密閉可能である。チャンバ１０２、フィルタ１０１、流体入口１０３、流体出口１０４、入口コネクタ１０５、および出口コネクタ１０６は、滅菌パッケージ内のキットとして、例えば使い捨てキットとして提供され得る。そのようなキット、すなわち装置１００は、このようにして羊膜幹細胞を濾過および処理する、容易で改善されたプロセスを提供する。装置１００は、羊水を加圧して流体入口１０３から流体出口１０４に流すように配置されたポンプ１２２、１２３を備え得る。これにより、羊水のより効果的な濾過が可能になる。より大きな体積をより短い時間で濾過することができる。
【0031】
図６は、フィルタ１０１を通して示された矢印の方向に羊水を吸引するように、ポンプ１２２が流体出口１０４に接続された例を示している。ポンプ１２２は、フィルタ１０１を通して羊水を押し出すように、流体入口１０３に配置されてもよい。ポンプ１２２は、流体入口１０３、流体出口１０４、入口コネクタ１０５、または出口コネクタ１０６と一体化された、小型の手動ポンプであり得る。
【0032】
図７は、羊水を加圧して流体入口１０３から流体出口１０４に流すようにポンプ１２３が配置された、後により詳細に記載する別の例を示している。チャンバ１０２は、流体入口１０３と流体出口１０４との間に配置された導管１１９を備え得る。チャンバ１０２内の圧力は、導管１１９を通る流体および／または気体連通に応じて可変であり得る。したがって、フィルタ１０１を通る羊水の流れは、用途に応じて最適化することができ、例えば、フィルタ１０１を通る流量は、導管１１９を介してチャンバ１０２内の圧力を変化させることによって増加または減少させることができる。
【0033】
図５は、導管１１９がチャンバ１０２と連通している例を示す。コネクタまたはバルブ要素等のアクセスポート１２０は、流体もしくは気体が、チャンバ１０２から排出されること、および／またはチャンバ１０２内に注入されることを可能にするように作動させて、その中の圧力に影響を与えることができる。導管１１９は、図５において流体出口１０３とフィルタ１０１との間に配置されているが、別の例において、導管１１９は、流体入口１０３とフィルタ１０１との間に配置されてもよい。以下に記載する図５は、チャンバ１０２と連通している導管１１９のさらなる例を示す。図７に例示されるように、ポンプ１２３は、導管１１９と連通して配置され得る。これは、チャンバ１０２内の流れおよび関連する濾過プロセスの最適化を容易にする。図７の例において、導管１１９は、チャンバ１０２の上流空洞１０８およびチャンバ１０２の下流空洞１０９と可変連通している、すなわち、フィルタ１０１は、チャンバ１０２を上流空洞１０８と下流空洞１０９とに分割するように配置され得る。図７では、導管１１９は、上流空洞１０８および下流空洞１０９の両方に接続されている。ポンプ１２３は、羊水を加圧して、上流空洞１０８から下流空洞１０９に流すように、または下流空洞１０９から上流空洞１０８に流すように構成されている。後者の場合は、例えば、フィルタ１０１の目詰まりまたは閉塞を解消するために、瞬間的な逆流が所望される状況において有利であり得る。このような場合、図７に概略的に示されるように、バルブ１２０、１２０’、１２１、１２１’は、所望の流れ方向を提供するように操作される。例えば、逆流の場合、バルブ１２０および１２１’は開いていてもよく、バルブ１２０’および１２１は閉じていてもよい。通常の濾過モードでは、バルブ１２１、１２１’は開いていてもよく、バルブ１２０、１２０’は閉じていてもよい。上流空洞１０８は、そのような濾過モードでバルブ１２０’を開くことによっても加圧され得る。
【0034】
フィルタ１０１は、図８に概略的に示されるように、第１のフィルタ要素１０１ａと、第１のフィルタ要素１０１ａと流体出口１０４との間に配置された第２のフィルタ要素１０１ｂとを備え得る。第２のフィルタ要素１０１ｂは、第１のフィルタ要素１０１ａのメッシュ径または細孔系よりも小さいメッシュ径または細孔系を有し得る。これにより、徐々に小さくなる寸法の粒子状物質を効果的に濾過することができる。したがって、フィルタの閉塞のリスクが低減される。これにより、羊水のより信頼性が高い、堅牢な濾過プロセスが可能になる。より広いサイズ範囲の粒子状物質を含む羊水の改善された濾過も提供される。さらに、目詰まりした細孔で幹細胞が失われないため、羊水中の幹細胞のより大きな画分を得ることができる。図８では２つのフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂであるが、徐々に減少する寸法の粒子状物質の効果的な濾過のために、流体入口１０３から流体出口１０４への流体の流れの方向にメッシュ径または細孔系が徐々に減少する任意の複数のフィルタ要素が、チャンバ１０２内に順番に配置され得ることを理解されたい。第１および第２のフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂは、図８の例に概略的に示されるように、流体入口１０３から流体出口１０４への羊水の流れの方向に沿って距離（ｄ）だけ離れていてもよい。第１および第２のフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂの間の羊水の動きは、場合によっては濁流を伴う可能性があり、第１および第２のフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂ上における粒子の望ましくない蓄積のリスクをさらに低減し得る。
【0035】
フィルタ１０１は、２０～２０００μｍの範囲のメッシュ径を有するメッシュを含み得る。別の例において、フィルタ１０１は、１００～５００μｍの範囲のメッシュ径を有するメッシュを含む。これにより、羊水から粒子状物質の特に効果的な濾過が可能になる。再び図８に戻ると、第１のフィルタ要素１０１ａは、５００～１０００μｍの範囲のメッシュ径を有するメッシュを含み得、第２のフィルタ要素１０１ｂは、３０～１５０μｍの範囲のメッシュ径を有するメッシュを含み得る。このようにして、第１のフィルタ要素１０１ａが、より大きな細片を除去することができ、続いて、第２のフィルタ要素１０１ｂでより小さな粒子が除去される。これにより、目詰まりのリスクがさらに最小限に抑えられるため、様々なサイズの粒子状物質の特に効果的な濾過と、より長期間にわたる増加した量の信頼性の高い濾過とが可能になる。前述のように、任意の複数のフィルタ要素をチャンバ１０２内に連続して配置することができる。
【0036】
図９は、チャンバ１０２内に配置された３つのフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃを示している。いくつかの例において、図６のフィルタ要素１０１ｂおよび図９のフィルタ要素１０１ｃ等の、チャンバ１０２の最も下流に配置された最小のメッシュ径または細孔系を有するフィルタ要素は、単一の羊膜細胞または１０細胞よりも小さい羊膜細胞塊のみがフィルタ１０１を通過するような寸法のメッシュ径または細孔系を有し得る。そのような例における最小のメッシュ径または細孔系は、約３０μｍであり得る。フィルタ１０１は、ナイロンメッシュ等のメッシュを含み得る。フィルタ１０１は、流体入口１０３から流体出口１０４への羊水の流れの方向にフィルタ１０１を通る可変細孔径を有する多孔質材料を含み得る。すなわち、羊水は、フィルタ１０１を通って出口１０４に向かう方向に流れ、かつ細孔径が次第に小さくなるため、より大きな細片は、入口１０３に最も近いフィルタ１０１の表面で除去される一方で、より小さなサイズの粒子は、フィルタのより深いところで除去される。前述のように、チャンバ１０２は、上流空洞１０８および下流空洞１０９を含み得る。上流および下流空洞１０８、１０９は、例えば、成形プロセスにおいて、または他の材料形成技術によって、チャンバ１０２を形成するための一体部品として形成され得る。上流および下流空洞１０８、１０９は、別個のユニットとして形成され、次いで、密閉接続を形成するように、例えば、接着剤または溶接によって互いに接続されてもよい。フィルタ１０１は、そのような溶接プロセスと同時にもしくはその後に、または前述の接着剤によって取り付けることができる。
【0037】
図９に概略的に示されるように、上流および下流空洞１０８、１０９は、密閉接続を形成するように、接続要素１１０で互いに解放可能に接続可能であり得る。これにより、例えばフィルタ１０１を交換するために、チャンバ１０２を開くことができる。したがって、フィルタ１０１は、チャンバ１０２に解放可能に接続可能であり得、例えば、フィルタ要素１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃは、図７のチャンバ１０２に解放可能に接続可能であり得る。これにより、異なる細孔径もしくはメッシュ径のフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃ、または異なる数のそのようなフィルタ要素をチャンバ１０２に取り付けることができるため、異なる用途への容易なカスタマイズが可能になる。
【0038】
接続要素１１０は、上流および下流空洞１０８、１０９と密閉接続を形成するように構成され、上流および下流空洞１０８、１０９の周縁部の周りに延在する環状ガスケットを備えることができる。フィルタ１０１は、特定の羊水サンプルに合わせて調整することができる異なる細孔径を有する、異なる数のフィルタ要素１０１ａ、１０１ｂ、１０１ｃのカートリッジを含むことができる。例えば、羊水の濁度および白濁の程度（粒子サイズおよび不透明度の両方における胎脂のレベル）の評価は、適切なフィルタカートリッジを使用する指標となり得る。羊水サンプルを比較するための添付のチャートは、どのフィルタカートリッジを使用するかを示すことができる。上流空洞１０８および／または下流空洞１０９は、漏斗形状であり得る。図３～９は、上流および下流空洞１０８、１０９の両方が漏斗形状である例を示している。図１１は、下流空洞１０９のみが漏斗形状である例を示している。漏斗形状を有することは、フィルタ１０１および装置１００を通る所望の対称ベクトルに沿って羊水の流れを導くために有利であり得る。上流空洞１０８および／または下流空洞１０９は、フィルタ１０１と本質的に平行に、すなわち、流体入口１０３から流体出口１０４への羊水の流れの方向に対して垂直に配置されたチャンバ壁１１１ａ、１１１ｂを含み得る。図１０は、上流および下流空洞１０８、１０９のチャンバ壁１１１ａ、１１１ｂが、フィルタ１０１と本質的に平行に配置された例を示している。これにより、十分なフィルタ面積を維持しながら、チャンバ１０２の内側の空間を最小化し、例えば、界面活性剤分子を妨害し得る空気を導入するリスクを最小限に抑え、感染のリスクを低減し、羊膜細胞における活性酸素種の有害な形成を減少させる。チャンバ１０２、および／または入口コネクタ１０５、および／または出口コネクタ１０６は、フタル酸エステル不含のＰＶＣ材料から形成することができる。これにより、羊膜細胞等の医薬品出発物質と接触するのに好適な装置を提供する。
【0039】
装置１００は、チャンバ１０２の内壁１１３から延在するように配置された突起１１２を備え得る。図１１および１２は、そのような突起１１２の例を、それぞれ、断面側面図で、および断面Ａ－Ａを通して示している。突起１１２は、フィルタ１０１が、内壁１１３に向かって湾曲および折り曲がり始めた場合に、フィルタ１０１に支持を提供する。したがって、フィルタ１０１が内壁１１３から離れた突起１１２によって支持され得るため、そのような場合でもフィルタ１０１のメッシュまたは細孔を通る流れが依然として可能である。すなわち、突起１１２は、流量制限のリスクをさらに抑えることができ、効率的で堅牢な信頼性の高い濾過を提供する。
【0040】
図１３は、粒子状物質および羊膜細胞を含む羊水を濾過する方法３００のフローチャートである。方法３００は、チャンバ１０２の流体入口１０３と羊水サンプル供給源２０１との間に密閉接続を形成すること３０１を含む。方法３００は、チャンバ１０２の流体入口１０３から流体出口１０４への羊水の流れを提供することによって、チャンバ１０２で囲まれたフィルタ１０１に羊水を通過させること３０２を含む。これにより、粒子状物質がフィルタ１０１上に堆積され、羊膜細胞を含む羊水が出口１０４を通って流れる。したがって、方法３００は、上記で装置１００および図３～１２に関連して記載したような有利な利点を提供する。方法３００は、高品質の羊膜細胞サンプルを得るために、羊水の効果的かつ無菌的な濾過を提供する。
【0041】
一実施形態において、ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることは、濾過、遠心分離等の当該技術分野で既知の任意の方法を適用することによって行うことができる。ＴＡＦは、２０μｍ以上の細孔径を有するフィルタを通して濾過することができる。フィルタは、酢酸セルロース、硝酸セルロース（コロジオン）、ポリアミド（ナイロン）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、およびポリテトラフルオロエチレン（テフロン）を含むがこれらに限定されない任意の合成材料から作製することができる。一実施形態において、粒子状物質の除去は、装置１００を適用することによって行われる。
【0042】
接着選択
当業者に既知の様々な用語が、本明細書全体を通して使用されており、今後も使用される。例えば、細胞表面マーカーの文脈における「発現する、発現、および／または発現すること」という用語は、細胞の表面上の特定のマーカーの存在を示し、該表面マーカーが細胞によって生成されていることを意味する。表面マーカーの発現は、異なる細胞集団間で選択するために使用することができ、例えば、表面マーカーの発現を正に選択することは、別の細胞集団と比較して特定の表面マーカーをより強く発現する細胞集団の選択を意味する。逆に、細胞表面マーカーの発現を負に選択することは、別の細胞集団と比較して特定の表面マーカーをより弱く発現する細胞集団の選択を意味する。
当業者に既知の様々な用語が、本明細書全体を通して使用されており、今後も使用される。例えば、細胞表面マーカーの文脈における「発現する、発現、および／または発現すること」という用語は、細胞の表面上の特定のマーカーの存在を示し、該表面マーカーが細胞によって生成されていることを意味する。表面マーカーの発現は、異なる細胞集団間で選択するために使用することができ、例えば、表面マーカーの発現を正に選択することは、別の細胞集団と比較して特定の表面マーカーをより強く発現する細胞集団の選択を意味する。逆に、細胞表面マーカーの発現を負に選択することは、別の細胞集団と比較して特定の表面マーカーをより弱く発現する細胞集団の選択を意味する。
【0043】
上記および本明細書の他の場所に説明されるように、ＴＡＦは様々な前駆細胞型を含む。特定の例において、特定の前駆細胞型は、接着選択を介して単離および増殖され得る。例えば、ビトロネクチン基質であるＳｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｍｅｒｃｋ、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）、ＩＩ－ＳＣ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ、ＣＬＳ３５３５－１ＥＡ）をコーティングとして使用して、幹細胞培養のためのより生体内に似た環境を作成することができ、それによってＴＡＦ由来の前駆細胞の成熟を制限し、可塑性を維持する。Ｓｙｎｔｈｅｍａｘは、ヒト前駆細胞／幹細胞および他の成体幹細胞型の血清または無血清増殖のための、動物成分不含の、合成の、柔軟なビトロネクチンベースのペプチド基質である。当業者は、ビトロネクチンベースのペプチド基質が、ビトロネクチンの特定のペプチド配列等のビトロネクチンタンパク質の一部を含み得ることを理解するであろう。あるいは、無傷のビトロネクチンタンパク質が使用されてもよい。Ｓｙｎｔｈｅｍａｘビトロネクチン基質は、当該技術分野で既知の細胞培養において一般的に使用される生物学的コーティングおよび／またはフィーダー細胞層に代わる、合成の、異種成分不含の代替品を提供する。簡単に説明すると、標準的な組織培養処理フラスコを、約０．２ｍＬのＳｙｎｔｈｅｍａｘ／ｃｍ２（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングして２μｇ／ｃｍ２の表面密度を得、３７℃で約１時間、０．５時間、２時間、４時間、８時間、もしくは８時間超、または室温で約２時間、１時間、４時間、８時間、もしくは８時間超、任意選択的に除去および交換される余剰溶液とともにインキュベートすることができる。特定の例において、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘは、約１～５μｇ／ｃｍ２、例えば２μｇ／ｃｍ２、０．１～１０μｇ／ｃｍ２、０．５～４μｇ／ｃｍ２、１～３μｇ／ｃｍ２、または約１．５～２．５μｇ／ｃｍ２の表面密度でコーティングされ得る。
【0044】
他の実施形態において、接着選択は、例えば、コラーゲン、フィブロネクチンでコーティングされた表面を使用して行うことができる。あるいは、接着選択は、組織培養処理されたプラスチックを含むコーティングされていない表面を使用して行うことができる。
【0045】
ＴＡＦ液から精製された細胞を、予熱した異種成分不含の細胞培養培地に穏やかに再懸濁することができ、次いで、細胞懸濁液をＳｙｎｔｈｅｍａｘでコーティングされたフラスコに添加する。培地は、フラスコに添加した後の様々な時点で、例えば、約２時間～１６８時間、１２時間～９６時間、２４時間～７２時間、３６時間～６０時間、４２時間～５６時間、または４８時間後に交換することができ、その後、約毎日、１日置き、３日置き、５日置き、１週間に１回、２週間に１回、または２週間に１回未満交換することができる。使用済み培地の繰り返し除去を通して、付着していない細胞を除去することができ、それにより、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ処理表面への付着親和性によってＭＳＣを選択する。細胞は、一定期間、例えば、約４日間、７日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１８日間、２１日間、２８日間、または２１日より長く培養することができる。任意選択的に、いくつかの例において、細胞を低酸素条件下で培養することができ、低酸素プライミングにより、増殖中の細胞代謝を変化させ、酸化ストレスに対する耐性を高め、それによって、生着、虚血性微小環境での生存、および移植されたＭＳＣの血管新生の可能性を改善し得る。培養後、形成されたＰ０コロニー（コロニー形成単位－ＣＦＵ）を解離して、プールすることができるプールした後、残りの細胞は、主に非組織特異的ＭＳＣであり得る。特定の例において、プールされたＰ０細胞を、予熱した異種成分不含の細胞培養培地に穏やかに再懸濁し、継代のためにＳｙｎｔｈｅｍａｘを含まない組織培養処理フラスコに再播種することができる。プールされた細胞は、約１００～１００００細胞／ｃｍ２、５００～８０００細胞／ｃｍ２、１０００～５０００細胞／ｃｍ２、または約２０００～４０００細胞／ｃｍ２の播種密度で播種され得る。培地は、約１日、２日、４日、または５日以上ごとに交換することができる。約２日、４日、７日、または８日以上等の一定期間後、細胞を解離して回収することができる。後述するように、さらに選択的なＭＳＣ単離を達成することができる。
【0046】
バイオマーカーの同定
ＴＡＦ－ＭＳＣと脂肪組織または骨髄に由来する成体型ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルをＲＮＡｓｅｑによって比較すると、ＴＡＦ－ＭＳＣは、成体型ＭＳＣに存在するいくつかの遺伝子をより多く発現し、他の遺伝子をより少なく発現する傾向がある。陽性および陰性の両方のＴＡＦ－ＭＳＣ特異的新生児細胞表面マーカーの同定により、抗体およびアプタマー等のリガンドまたは他の選択技術を使用して、さらに分化した、前駆細胞としての重要性が低い細胞から新生児品質のＭＳＣを選別することができる。
ＴＡＦ－ＭＳＣと脂肪組織または骨髄に由来する成体型ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルをＲＮＡｓｅｑによって比較すると、ＴＡＦ－ＭＳＣは、成体型ＭＳＣに存在するいくつかの遺伝子をより多く発現し、他の遺伝子をより少なく発現する傾向がある。陽性および陰性の両方のＴＡＦ－ＭＳＣ特異的新生児細胞表面マーカーの同定により、抗体およびアプタマー等のリガンドまたは他の選択技術を使用して、さらに分化した、前駆細胞としての重要性が低い細胞から新生児品質のＭＳＣを選別することができる。
【0047】
組織関連細胞を他のＭＳＣから識別する細胞表面マーカーは、組織特異性スコアアルゴリズムを利用したバイオインフォマティクスプロセスを介して解明することができる。ＭＳＣ組織特異性スコアアルゴリズムの一例を図１４に示す。組織特異性は、類似性スコアとしても知られる「組織転写類似性」と、遺伝子セットスコアとしても知られる「組織特異的遺伝子発現プログラム」の２つの要素の組み合わせとして測定でされ得る。特定の例において、類似性スコアは、各ＭＳＣ組織の参照サンプル（例えば、胎児肺ＭＳＣサンプル）に対する平均スピアマン相関であり得る。例において、遺伝子セットスコアは、組織特異的遺伝子セットにおける遺伝子の平均発現であり得る。図１４に示すように、特定の例において、Ｚ変換を用いて類似性スコアおよび遺伝子セットスコアを正規化して、実数または複素数の配列である入力値を複素周波数領域表現に変換した後、それらを組み合わせ、各スコアに等しい重みを割り当て、Ｚ変換を用いて合わせた値を変換すると、得られる出力はＭＳＣ組織特異性スコアである。ＭＳＣ組織特異性スコアは、平均入力サンプルと比較して、所与の組織に事実上特異的なサンプルの標準偏差がいくつあるかを測定することにより、入力サンプル間の相対的な組織特異性を評価する。例えば、ＭＳＣ組織特異性スコアは、平均的なクローンと比較して、クローンサンプルが肺表現型等の組織特異的な表現型をどの程度有するように見えるかを示し得る。そのようなアプローチにより、正規分布関数を使用して上位Ｘ％のパーセンタイルスコアを特定することが可能であり、これは事実上、関連する組織に最も組織特異的なクローンの上位Ｘ％である。
【0048】
一例において、所与の組織について、組織優先的クローンは、上位Ｘ％のパーセンタイルスコアに属する任意のクローンとして定義することができ、この場合、Ｘは、約１、５、１０、１５、および２０等の約０．１～２５の下限、および約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０等の約３０～７５の上限を有する範囲内の任意のパーセンテージである。ＴＡＦ－ＭＳＣ組織特異性の優先順位付けの結果の一例を図１５に示しており、１５％および５％の閾値が明らかである。組織特異的クローンに優先順位を付け、次いで候補表面マーカー遺伝子を同定することができる。各組織について、組織優先群と組織低優先群の２つの群を定義することができる。好適な分析プログラム、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇのＤＥｓｅｑ２を使用して、この決定を行うことができる。組織優先群は、スコアが上位１５％パーセンタイルのクローンを含み得る。組織低優先群は、下位Ｙ％のパーセンタイルにクローンを含み得、この場合、Ｙは、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６５等の約２５～７０の下限、および約８０、８５、９０、９５、または９９等の７５～９９．９の上限を有する範囲内の任意のパーセンテージである。図１６は、腎臓組織に関するそのような分析の一例を示している。次に、組織優先群と組織低優先群との間で差次的に発現される遺伝子を同定することができる。最後に、差次的発現の結果は、表面マーカー遺伝子情報で注釈を付けることができる。
【0049】
特定の例において、組織特異的細胞表面マーカーを同定するために、平均的なクローンと比較して、優先的クローンの発現のＺ倍を超える増加（Ｚは少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、１２倍、１５倍、またはさらにはそれ以上の発現の倍増）（ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ）、および約５００を超える、例えば、約１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、５０００、またはさらにそれ以上を超える等のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）を有する表面マーカー遺伝子を選択して、上位の組織特異的マーカー候補、例えば、ほぼ上位５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、１００またはそれ以上の、例えば、後述の表３～６に示され、後にさらに詳細に記載されるもの等を得ることができる。好適なｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅおよびＴＰＭ値は、良好なマーカーの有無に応じて、組織型特異性に応じてさらに変化し得る。
【0050】
接着選択および継代後、表面マーカーを同定するための上記の組織特異性アルゴリズムを適用すると、ＴＡＦ－ＭＳＣ細胞は、下の表１に示すような様々な同定された表面マーカーを発現し得、これは非組織特異的ＴＡＦ ＭＳＣを示唆する。当業者は、そのような表面マーカーが様々な表面密度で存在し得、他の細胞型と比較して上方制御または下方制御され得ることを理解するであろう。したがって、そのような表面マーカーは、特定の細胞型を同定および単離するために使用され得る。場合によっては、下の表１に列挙される表面マーカーは、他のＭＳＣ細胞型と比較して、特に骨髄または脂肪組織に由来する成体ＭＳＣと比較して、ＴＡＦ ＭＳＣで平均して少なくとも８倍高度に発現する可能性がある。表１の作製に使用された閾値は以下のとおりである：Ｘは１５％として選択され、Ｙは５０％として選択され、Ｚは８倍として選択され、３０００超のＴＰＭが選択された。当業者は、表１および本明細書のすべての表に使用される番号付けは、同定されたマーカーの総数を示すためにのみ使用されるのであって、ある特定のマーカーが別のマーカーと比較してより強く発現することおよび／または好ましいことを示すものではないことを理解するであろう。
【表1-1】
【表1-2】
【0051】
当業者によって理解されるように、表１から特定のマーカーを、または表１から２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のマーカーの組み合わせを選択することにより、表１に列挙されるマーカーの好適な組み合わせを使用して成体ＭＳＣからＴＡＦ－ＭＳＣを分離することができる。特定の例において、ＴＡＦ ＭＳＣは、成体ＭＳＣと比較して、前述のマーカー、例えば、ＴＢＣ１Ｄ３Ｋおよび／またはＡＩＦ１Ｌおよび／またはＣＤＨＲ１および／またはＮＫＡＩＮ４および／またはＡＢＣＢ１および／またはＰＬＶＡＰの任意の組み合わせのより強い発現、例えば８倍以上のより強い発現の組み合わせを同定することによって、より特異的に同定することができる。マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の２倍以上、４倍以上、または６倍以上の発現等のより強い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0052】
成体ＭＳＣと比較してＴＡＦ－ＭＳＣの表面でより強く発現し得る上記の表面マーカー（陽性マーカー）とは対照的に、特定の例において、表２の以下の表面マーカー（陰性マーカー）は、他の細胞型と比較してＴＡＦ－ＭＳＣ上でより弱く発現し、例えば、成体ＭＳＣに対する前述のマーカーの任意の組み合わせの１／８倍以下の発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）等であり得る：ＩＬ１３ＲＡ２、ＣＬＵ、ＴＭＥＭ１１９、ＣＥＭＩＰ、およびＬＳＰ１。陰性マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の発現が１／２倍以下、１／４倍以下、または１／６倍以下等のより弱い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0053】
２つ以上のこれらの陰性マーカーの組み合わせを使用して、ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に単離することもできる。さらに、当業者はまた、上記の閾値のうちのいずれか等で、陰性マーカーおよび陽性マーカーの両方を含む組み合わせもまた、ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に単離するのに有効であり得ることを認識するであろう。
【表2】
【0054】
マーカーベースの選択
羊水は、均質な液体中に不均質な細胞を含む。したがって、マーカーベースの選択が必要になる場合がある。マーカーベースの選択の一例は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用によるものである。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＴＡＦ－ＭＳＣの細胞集団を精製するために使用することができ、たとえ標的細胞型が非常に低レベルの同定マーカー発現する場合、および／またはマーカー密度の違いに基づいて分離が必要な場合であっても、ＦＡＣＳは所望の細胞集団の非常に高い純度を可能にする。ＦＡＣＳは、サイズ、粒度、および蛍光に基づいて個々の細胞の精製を可能にする。当業者によって理解されるように、ＦＡＣＳを使用して、ある細胞表面マーカーを別の細胞集団よりも多く発現する特定の細胞集団を選択することができ、その逆も可能である。精製方法のいくつかの例において、パニング、補体枯渇および磁気ビーズ分離等のバルク精製方法を、ＦＡＣＳと組み合わせて、またはＦＡＣＳの代替として使用することができる。簡単に説明すると、ＦＡＣＳによって目的の細胞を精製するために、最初に、所望の細胞集団上の特定の表面マーカーを認識する蛍光タグ付きモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）でそれらを染色する。染色されていない細胞の陰性選択も分離を可能にし得る。いくつかの例による細胞のＧＭＰ生産の場合、ＦＡＣＳは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｔｙｔｏ（登録商標）等のクローズドシステムのソーティング技術を使用して実行することができる。サンプルは、使い捨ての完全密閉ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏカートリッジ内で汚染のない状態に保つことができる。さらに、濾過された空気は、非常に低い圧力（＜３ＰＳＩ）でマイクロチャネルを通してマイクロチップに細胞を送り込むことができる。しかしながら、マイクロチャネルに入る前に、潜在的な細胞凝集体をフィルタシステムによって抑止することができ、スムーズな選別プロセスを保証する蛍光検出システムは、細胞の所定の蛍光パラメータに基づいて目的の細胞を検出することができる。標的細胞の蛍光および散乱光の特徴に基づいて、マイクロチャネル内に位置するソートバルブによってそれらの方向を変えることができる。精製方法の特定の例では、染色およびそれによる選別の成功は、同定マーカーの選択およびｍＡｂの選択に大きく依存し得る。選別パラメータは、純度および収率の要件に応じて調節することができる。従来の液滴選別機とは異なり、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏによって選別された細胞は、高圧または帯電を経験しなくてもよく、また減圧されなくてもよい。したがって、そのような穏やかな選別アプローチは、細胞の高い生存率および機能性をもたらし得る。あるいは、他のマーカーベースの選択技術が当業者に既知であり得る。それらには、磁気活性化細胞選別、マイクロ流体ベースの選別、浮力活性化細胞選別、マスサイトメトリー等が含まれるが、これらに限定されない。
羊水は、均質な液体中に不均質な細胞を含む。したがって、マーカーベースの選択が必要になる場合がある。マーカーベースの選択の一例は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用によるものである。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＴＡＦ－ＭＳＣの細胞集団を精製するために使用することができ、たとえ標的細胞型が非常に低レベルの同定マーカー発現する場合、および／またはマーカー密度の違いに基づいて分離が必要な場合であっても、ＦＡＣＳは所望の細胞集団の非常に高い純度を可能にする。ＦＡＣＳは、サイズ、粒度、および蛍光に基づいて個々の細胞の精製を可能にする。当業者によって理解されるように、ＦＡＣＳを使用して、ある細胞表面マーカーを別の細胞集団よりも多く発現する特定の細胞集団を選択することができ、その逆も可能である。精製方法のいくつかの例において、パニング、補体枯渇および磁気ビーズ分離等のバルク精製方法を、ＦＡＣＳと組み合わせて、またはＦＡＣＳの代替として使用することができる。簡単に説明すると、ＦＡＣＳによって目的の細胞を精製するために、最初に、所望の細胞集団上の特定の表面マーカーを認識する蛍光タグ付きモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）でそれらを染色する。染色されていない細胞の陰性選択も分離を可能にし得る。いくつかの例による細胞のＧＭＰ生産の場合、ＦＡＣＳは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｔｙｔｏ（登録商標）等のクローズドシステムのソーティング技術を使用して実行することができる。サンプルは、使い捨ての完全密閉ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏカートリッジ内で汚染のない状態に保つことができる。さらに、濾過された空気は、非常に低い圧力（＜３ＰＳＩ）でマイクロチャネルを通してマイクロチップに細胞を送り込むことができる。しかしながら、マイクロチャネルに入る前に、潜在的な細胞凝集体をフィルタシステムによって抑止することができ、スムーズな選別プロセスを保証する蛍光検出システムは、細胞の所定の蛍光パラメータに基づいて目的の細胞を検出することができる。標的細胞の蛍光および散乱光の特徴に基づいて、マイクロチャネル内に位置するソートバルブによってそれらの方向を変えることができる。精製方法の特定の例では、染色およびそれによる選別の成功は、同定マーカーの選択およびｍＡｂの選択に大きく依存し得る。選別パラメータは、純度および収率の要件に応じて調節することができる。従来の液滴選別機とは異なり、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏによって選別された細胞は、高圧または帯電を経験しなくてもよく、また減圧されなくてもよい。したがって、そのような穏やかな選別アプローチは、細胞の高い生存率および機能性をもたらし得る。あるいは、他のマーカーベースの選択技術が当業者に既知であり得る。それらには、磁気活性化細胞選別、マイクロ流体ベースの選別、浮力活性化細胞選別、マスサイトメトリー等が含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
組織特異的細胞および使用法
肺ＴＡＦ細胞マーカー
上記で説明したように、ＴＡＦ－ＭＳＣクローン、成体および新生児のＭＳＣ参照物質ならびに胎児線維芽細胞からのＲＮＡｓｅｑデータと、公的に入手可能な発現データセットの分析を使用して、ＴＡＦ－ＭＳＣ細胞を同定および特性評価することができる。例えば、ＴＡＦ－ＭＳＣの亜集団は、それらの発現データ（ＲＮＡｓｅｑ）を新生児の参照サンプルとクラスター化することによって確立され得る。そのような亜集団は、肺ＭＳＣ、尿路ＭＳＣ（本開示では腎臓ＭＳＣとも記載される）、および皮膚ＭＳＣを含むが、これらに限定されない。発現データの各クラスターの高発現および低発現遺伝子の遺伝子リストにより、各クラスターの表面メーカー遺伝子の同定が可能となり得る。このようなデータ比較を使用して、ＴＡＦ細胞の亜集団を、それらの遺伝子発現に基づいて成体ＭＳＣ細胞と比較し（ＲＮＡｓｅｑ）、各クラスターの新生児特異的表面マーカー遺伝子のリストを得た。肺ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、肺ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される好ましい表面マーカーの非排他的なリストを以下に提供する。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの肺ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、肺ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
肺ＴＡＦ細胞マーカー
上記で説明したように、ＴＡＦ－ＭＳＣクローン、成体および新生児のＭＳＣ参照物質ならびに胎児線維芽細胞からのＲＮＡｓｅｑデータと、公的に入手可能な発現データセットの分析を使用して、ＴＡＦ－ＭＳＣ細胞を同定および特性評価することができる。例えば、ＴＡＦ－ＭＳＣの亜集団は、それらの発現データ（ＲＮＡｓｅｑ）を新生児の参照サンプルとクラスター化することによって確立され得る。そのような亜集団は、肺ＭＳＣ、尿路ＭＳＣ（本開示では腎臓ＭＳＣとも記載される）、および皮膚ＭＳＣを含むが、これらに限定されない。発現データの各クラスターの高発現および低発現遺伝子の遺伝子リストにより、各クラスターの表面メーカー遺伝子の同定が可能となり得る。このようなデータ比較を使用して、ＴＡＦ細胞の亜集団を、それらの遺伝子発現に基づいて成体ＭＳＣ細胞と比較し（ＲＮＡｓｅｑ）、各クラスターの新生児特異的表面マーカー遺伝子のリストを得た。肺ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、肺ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される好ましい表面マーカーの非排他的なリストを以下に提供する。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの肺ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、肺ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
【0056】
上記で説明したように、バイオインフォマティクス技術を使用して組織特異的表面マーカーを同定することができ、したがって、表３で特定される表面マーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的クローンでの発現に少なくとも１０倍の増加を有し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）。
【表3】
【0057】
肺ＴＡＦ ＭＳＣの表面でより強く発現し得る上記の表面マーカーとは対照的に、特定の例において、以下の表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ等の他の細胞型と比較して、肺ＴＡＦ ＭＳＣでより弱く発現し得る：ＣＤ２４、ＩＴＧＢ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＦＲＡ１、ＣＤ７４、ＦＧＦＲ４、ＨＡＶＣＲ１、およびＯＳＣＡＲ。当業者によって理解されるように、前述のより弱く発現する表面マーカーのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を使用して、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ等の他の細胞型から肺ＴＡＦ細胞を分離することができる。
【0058】
特定の例において、細胞表面マーカーＣＤ２４８（エンドシアリン）を使用して、ＴＡＦ ＭＳＣの集団から肺ＴＡＦ ＭＳＣを選別することができる。肺ＴＡＦ ＭＳＣの選別に使用できるさらなる表面マーカーは、ＤＤＲ－１（ディスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１）およびＬＲＲＣ３８（ロイシンリッチリピート含有タンパク質３８）を含み、これら３つすべてが分離に有用なマーカーとして抗体によって同定されている。いくつかの例において、エンドシアリン、ＤＤＲ－１、および／またはＬＲＲＣ３８を単独で、または他のマーカーと組み合わせて使用して選別することができる。エンドシアリンをＤＤＲ－１またはＬＲＲＣ３８と組み合わせて選別することができるか、またはＤＤＲ－１およびＬＲＲＣ３８は、エンドシアリンなしで組み合わせることができる。
【0059】
当業者によって理解されるように、表３から特定のマーカーを、または表３から２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のマーカーの組み合わせおよび／またはＣＤ２４８および／またはＤＤＲ－１および／またはＬＲＲ３８を選択することにより、表３に列挙されるマーカーと、ＣＤ２４８、ＤＤＲ－１、およびＬＲＲ３８との好適な組み合わせを使用してＴＡＦ ＭＳＣから肺ＴＡＦ ＭＳＣを分離することができる。特定の例において、肺ＴＡＦ ＭＳＣは、ＴＡＦ ＭＳＣと比較して、前述のマーカー、例えば、ＰＣＤＨ１９および／またはＤＤＲ１および／またはＭＭＥおよび／またはＩＦＩＴＭ１０および／またはＢＧＮおよび／またはＮＯＴＣＨ３および／またはＣＤ２４８および／またはＤＤＲ－１および／またはＬＲＲ３８の任意の組み合わせのより強い発現、例えば１０倍以上のより強い発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）の組み合わせを同定することによって、より特異的に同定することができる。マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の４倍以上、６倍以上、または８倍以上の発現等のより強い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0060】
ＴＡＦ ＭＳＣと比較して肺ＴＡＦ ＭＳＣの表面でより強く発現し得る上記の表面マーカー（陽性マーカー）とは対照的に、特定の例において、以下の表面マーカー（陰性マーカー）は、他の細胞型と比較して肺ＴＡＦ ＭＳＣ上でより弱く発現し、例えば、ＴＡＦ ＭＳＣに対する前述のマーカーの任意の組み合わせの１／８倍以下の発現（任意選択的にＴＰＭ＞５００）等であり得る：ＣＤ２４、ＩＴＧＢ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＦＲＡ１、ＣＤ７４、ＦＧＦＲ４、ＨＡＶＣＲ１、およびＯＳＣＡＲ。陰性マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の発現が１／２倍以下、１／４倍以下、または１／６倍以下等のより弱い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0061】
２つ以上のこれらの陰性マーカーの組み合わせを使用して、肺ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に分離することもできる。さらに、当業者はまた、上記の閾値のうちのいずれか等で、陰性マーカーおよび陽性マーカーの両方を含む組み合わせもまた、肺ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に単離するのに有効であり得ることを認識するであろう。
【0062】
図１７Ａ～１７Ｄは、ＣＤ２４８、ＤＤＲ１、およびＬＲＲＣ３８を含むＭＳＣ杯細胞表面マーカーを発現する、新生児期に選別されたＴＡＦ ＭＳＣ（「ＬＢＸ－ＴＨＸ－００１」と称される）を使用して行われる、治療のための肺ＴＡＦ ＭＳＣの潜在的使用に関する原理証明試験の結果の一例を示す。この試験の目的は、雄ラットのブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおけるＬＢＸ－ＴＨＸ－００１細胞の影響を調査することであった。２つの細胞濃度（２Ｍ細胞／ｋｇおよび５Ｍ細胞／ｋｇ）および細胞用の２種類のビヒクル（ＰＢＳおよびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－１０）を試験した。
【0063】
ブレオマイシンへの曝露後のラット肺における線維症の発症は、文献で十分に裏付けられており、肺線維症の病理とともに異なる治療の効果を研究するために頻繁に使用されるモデルである。注入されるＬＢＸ－ＴＨＸ－００１細胞の数は、可能なヒト治療に適切であるように選択された。したがって、細胞の数は、ラット（８～２０Ｍ細胞／ｋｇ）およびヒト（０．５～２Ｍ細胞／ｋｇ）に関する以前の試験で使用された細胞数を反映するように選択された。
【0064】
３４匹の雄ＳＤラットへのブレオマイシン（１０００Ｕ／ラット）の気管内注入を使用して、ラットに肺線維症を誘発した。最初の週の間、毎日ラットをモニターして体重を測定し、その後、試験が終了するまで週に２回体重を測定した。ブレオマイシンチャレンジ後４日目に、ＬＢＸ－ＴＨＸ－００１細胞を静脈内（ｉｖ）注射により投与した。注入量は１９４～５３５μＬ（最大許容注入量１ｍＬ／ｋｇ）であった。ブレオマイシンの気管内注入に対する反応は、注入後の最初の数日間に体重が減少し、その後回復したモデルに関する以前の経験に基づいて予想されたとおりであった。ブレオマイシン群と処置群との間で体重減少に有意差は認められなかった。
【0065】
図１７Ａ～Ｄに示すように、ブレオマイシンの点滴注入は肺の線維性変化を誘発した。組織病理学的評価は、影響を受けた実質の割合に関して、かつ修正されたアシュクロフトスケールを使用してスコアリングした後の両方で、ブレオマイシン群の病理学的変化を結論付けた。図１７Ａ～Ｄに示すように、ブレオマイシンの４日後にＬＢＸ－ＴＨＸ－００１細胞（２００万細胞／ｋｇ）で処置した群は、ブレオマイシン群と比較して有意に少ない肺の線維化を示した。これは、「影響を受けた実質の割合」の読み取り値を使用した組織病理学的評価（図１７Ａ～Ｂ）および線維症スコアリングのアシュクロフト修正スケール（図１７Ａ～Ｄ）の両方に見られた。終了時（２８日後）のラットの肺には、ヒトＭＳＣを検出することができなかった。
【0066】
腎臓ＴＡＦ細胞マーカー
上記で同定された肺ＴＡＦ ＭＳＣ細胞マーカーと同様に、腎臓ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、腎臓ＴＡＦ ＭＳＣを同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下の表４に示す。肺ＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、表４で特定される表面マーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的腎臓ＴＡＦクローンでの発現が少なくとも１２倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの腎臓ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、腎臓ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
上記で同定された肺ＴＡＦ ＭＳＣ細胞マーカーと同様に、腎臓ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、腎臓ＴＡＦ ＭＳＣを同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下の表４に示す。肺ＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、表４で特定される表面マーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的腎臓ＴＡＦクローンでの発現が少なくとも１２倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの腎臓ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、腎臓ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
【表4】
【0067】
当業者によって理解されるように、表４から特定のマーカーを、または表４から２、３、４、５つ、６つ、もしくはそれ以上のマーカーの組み合わせを選択することにより、表４に列挙されるマーカーの好適な組み合わせを使用してＴＡＦ－ＭＳＣから腎臓ＴＡＦ細胞を分離することができる。特定の例において、腎臓ＴＡＦ ＭＳＣは、ＴＡＦ ＭＳＣと比較して、前述のマーカー、例えばＨＡＶＣＲ１および／またはＣＤ２４および／またはＣＬＤＮ６および／またはＡＢＣＢ１および／またはＳＨＩＳＡ９および／またはＣＲＢ３の任意の組み合わせのより強い発現、例えば１２倍以上のより強い発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）の組み合わせを同定することによって、より特異的に同定することができる。マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の４倍以上、６倍以上、または８倍以上の発現等、より強い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0068】
腎臓ＴＡＦ ＭＳＣの表面でより強く発現し得る上記の表面マーカー（陽性マーカー）とは対照的に、特定の例において、以下の表面マーカー（陰性マーカー）は、他の細胞型と比較して腎臓ＴＡＦ細胞でより弱く発現し、例えば、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞に対する前述のマーカーの任意の組み合わせの１／８倍以下の発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）等であり得る：ＧＲＥＭ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＢＧＮ、ＦＡＰ、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＫＡＲ、ＣＤ２４８。陰性マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の発現が１／２倍以下、１／４倍以下、または１／６倍以下等のより弱い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0069】
２つ以上のこれらの陰性マーカーの組み合わせを使用して、腎臓ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に分離することもできる。さらに、当業者はまた、上記の閾値のうちのいずれか等で、陰性マーカーおよび陽性マーカーの両方を含む組み合わせもまた、腎臓ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に単離するのに有効であり得ることを認識するであろう。
【0070】
皮膚ＴＡＦ細胞マーカー
上記で同定された肺および腎臓のＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、皮膚ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、皮膚ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下の表５に示す。表５で特定される皮膚ＴＡＦ ＭＳＣマーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的クローンでの発現が少なくとも１２倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの皮膚ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、皮膚ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
上記で同定された肺および腎臓のＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、皮膚ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、皮膚ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下の表５に示す。表５で特定される皮膚ＴＡＦ ＭＳＣマーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的クローンでの発現が少なくとも１２倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞２０００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの皮膚ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、皮膚ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
【表5】
【0071】
当業者によって理解されるように、表５から特定のマーカーを、または表５から２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のマーカーの組み合わせを選択することにより、表５に列挙されるマーカーの好適な組み合わせを使用してＴＡＦ－ＭＳＣから皮膚ＴＡＦ－ＭＳＣを分離することができる。特定の例において、皮膚ＴＡＦ ＭＳＣは、ＴＡＦ－ＭＳＣと比較して、前述のマーカー、例えば、ＴＮＦＳＦ１８および／またはＰＣＤＨ１９および／またはＮＣＡＭ２および／またはＴＮＦＳＦ４および／またはＣＤ２４８および／またはＤＤＲ２の任意の組み合わせのより強い発現、例えば１２倍以上のより強い発現（任意選択的にＴＰＭ＞２０００）の組み合わせを同定することによって、より特異的に同定することができる。マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の４倍以上、６倍以上、または８倍以上の発現等、より強い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0072】
皮膚ＴＡＦ細胞の表面でより強く発現し得る上記の表面マーカー（陽性マーカー）とは対照的に、特定の例において、以下の表面マーカー（陰性マーカー）は、他の細胞型と比較して皮膚ＴＡＦ細胞上でより弱く発現し、例えば、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞に対する前述のマーカーの任意の組み合わせの１／８倍以下の発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）等であり得る：ＣＤ２４、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＴＧＢ４、ＡＢＣＢ１。陰性マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の発現が１／２倍以下、１／４倍以下、または１／６倍以下等のより弱い発現のより低い閾値で達成され得る。
【0073】
２つ以上のこれらの陰性マーカーの組み合わせを使用して、皮膚ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に分離することもできる。さらに、当業者はまた、上記の閾値のうちのいずれか等で、陰性マーカーおよび陽性マーカーの両方を含む組み合わせもまた、皮膚ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に単離するのに有効であり得ることを認識するであろう。
【0074】
神経ＴＡＦ細胞マーカー
上記で同定された肺、腎臓、および皮膚のＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、神経ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、神経ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下に示す。表６で特定される神経ＴＡＦ ＭＳＣ表面マーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的クローンでの発現が少なくとも３倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの神経ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、神経ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
上記で同定された肺、腎臓、および皮膚のＴＡＦ ＭＳＣマーカーと同様に、神経ＴＡＦ細胞に関連するいくつかの目的の表面マーカーが同定された。例えば、神経ＴＡＦ細胞を同定および分離するために使用される表面マーカーの非排他的なリストを以下に示す。表６で特定される神経ＴＡＦ ＭＳＣ表面マーカーは、平均的なＴＡＦ－ＭＳＣクローンと比較して、優先的クローンでの発現が少なくとも３倍増加し得る（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）。さらに、ＴＡＦの異なるＭＳＣサブタイプの数は限られているため、組織特異的ＭＳＣの選択は、最初に特性評価によって、その後、異なる組織特異的ＭＳＣの組み合わせた（多変量）表面マーカープロファイルを考慮して、材料を段階的に陰性選択／分類することによって行うことができる。当業者は、これらの表面マーカーのそのような任意の組み合わせが、ＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞の一般集団からの神経ＴＡＦ細胞の同定および単離に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの例において、以下の非排他的なリストの表面マーカーは、他のＴＡＦ由来細胞および／またはＴＡＦ－ＭＳＣ細胞等の他の細胞型と比較して、神経ＴＡＦ細胞の表面でより高度に発現し得る。
【表6】
【0075】
当業者によって理解されるように、表６から特定のマーカーを、または表６から２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のマーカーの組み合わせを選択することにより、表６に列挙されるマーカーの好適な組み合わせを使用してＴＡＦ－ＭＳＣから神経ＴＡＦ－ＭＳＣを分離することができる。特定の例において、神経ＴＡＦ ＭＳＣは、ＴＡＦ－ＭＳＣと比較して、前述のマーカー、例えば、ＨＡＶＣＲ１および／またはＡＣＫＲ３および／またはＯＳＣＡＲおよび／またはＣ３および／またはＳＩＲＰＢ１および／またはＳＬＣ６Ａ６の任意の組み合わせのより強い発現、例えば３倍以上のより強い発現（任意選択的にＴＰＭ閾値＞５００）の組み合わせを同定することによって、より特異的に同定することができる。マーカーの組み合わせを使用する場合、同定は、マーカーの各々の２倍以上等のより強い発現のより低い閾値、または６倍以上、８倍以上、もしくは１２倍以上の発現等のより高い閾値で達成され得る。さらに、当業者はまた、上記の閾値のうちのいずれか等で、陰性マーカーおよび陽性マーカーの両方を含む組み合わせもまた、神経ＴＡＦ ＭＳＣをより特異的に分離するのに有効であり得ることを認識するであろう。
【0076】
本明細書に開示されるすべての特徴（任意の添付の別紙、特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法またはプロセスのすべてのステップは、任意の組み合わせで組み合わせることができるが、但し、そのような機能および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除くものとする。本開示は、いずれかの前述の例の詳細に限定されない。本開示は、本明細書（付随する特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示される特徴のうち、任意の新規の１つもしくは任意の新規の組み合わせまで、またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップのうち、任意の新規の１つもしくは任意の新規の組み合わせまで及ぶ。
【0077】
当業者は、いくつかの例において、図示または開示されるプロセスで行われる実際のステップが、図に示されるものとは異なる場合があることを理解するであろう。例に応じて、上記のステップの一部を削除してもよく、他では追加してもよい。例えば、開示されたプロセスで取られる実際のステップまたはステップの順序は、図に示されているものとは異なる場合がある。例に応じて、上記のステップの一部を削除してもよく、他では追加してもよい。さらに、上記で開示された特定の実施例の特徴および属性は、異なる方法で組み合わせて追加の実施例を形成することができ、それらはすべて、本開示の範囲内に含まれる。
【0078】
「できる（ｃａｎ）」、「できる（ｃｏｕｌｄ）」、「してもよい（ｍｉｇｈｔ）」、または「してもよい（ｍａｙ）」等の条件付きの文言は、別途明記されない限り、または使用される文脈内で別様に理解されない限り、一般に、特定の例は特定の機能、要素、またはステップを含むが、他の例はそれらを含まないことを伝えることを意図する。したがって、そのような条件付きの文言は、一般に、機能、要素、またはステップが１つ以上の例にいずれにしても必要であること、あるいは、１つ以上の例が、これらの機能、要素、もしくはステップが任意の特定の例に含まれるか、または実行されるかどうかを、ユーザ入力またはプロンプトの有無にかかわらず、決定するためのロジックを必然的に含むことを暗示することを意図するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等の用語は同義語であり、制限のない様式で包括的に使用され、追加の要素、機能、行為、操作等を除外しない。また、「または」という用語は、その包括的な意味で（排他的な意味ではなく）使用されるため、例えば、要素のリストを接続するために使用される場合、「または」という用語は、リスト内の要素のうち、１つ、いくつか、またはすべてを意味する。同様に、２つ以上の項目のリストに関連して「および／または」という用語は、以下の語の解釈のすべてを包含する：リスト内の項目のいずれか１つ、リスト内のすべての項目、およびリスト内の項目の任意の組み合わせ。さらに、本明細書で使用される「各」という用語は、その通常の意味を有することに加えて、「各」という用語が適用される要素のセットの任意のサブセットを意味することができる。さらに、「ここに」、「上記の」、「以下の」という語、および同様の意味の語は、本明細書で使用される場合、本明細書のいずれか特定の部分ではなく、全体としての本明細書を指す。
【0079】
「Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも１つ」という句等の接続的な文言は、別途明記されない限り、項目、用語等がＸ、Ｙ、またはＺのいずれかであり得ることを伝えるために一般的に使用されるような文脈で理解される。したがって、そのような接続の文言は、一般に、特定の例がＸの少なくとも１つ、Ｙの少なくとも１つ、およびＺの少なくとも１つの存在を必要とすることを暗示することを意図するものではない。
【0080】
本明細書で使用される「ほぼ」、「約」、「一般に」、および「実質的に」という用語等の、本明細書で使用される程度の文言は、記載される値、量、または特性に近く、依然として所望の機能を実行するまたは所望の結果を達成する値、量、または特性を表す。例えば、「ほぼ」、「約」、「一般に」、および「実質的に」という用語は、記載される量の１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、および０．０１％未満内の量を指してもよい。別の例として、特定の例において、「略平行な」および「実質的に平行な」という用語は、正確な平行から１５度、１０度、５度、３度、１度、または０．１度以下だけ逸脱した値、量、または特性を指す。
【0081】
本開示に記載される実施形態に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり得、本明細書で定義される一般原理は、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく他の実施形態に適用され得る。したがって、本開示は、本明細書に示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲を与えられるべきである。本開示の特定の例は、以下に列挙されるか、または将来提示される請求項の組に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【手続補正書】
【提出日】2022-06-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
満期羊水（ｔｅｒｍ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）から満期羊水細胞（ＴＡＦ細胞）を得るための方法であって、満期羊水（ＴＡＦ）を提供することと、
前記ＴＡＦから粒子状物質を除去して精製されたＴＡＦ細胞を得ることと、
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行ってＴＡＦ接着細胞を得ることと、
前記ＴＡＦ接着細胞を継代して、前記ＴＡＦ細胞を含む細胞の集団を得ることと、
少なくともＣＤ２４８である表面マーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ細胞を選択することと、を含む、方法。
【請求項2】
ＴＡＦ細胞を選択することが、ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、ＬＲＲＣ３８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する細胞として前記集団から前記ＴＡＦ細胞を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
選択ステップが、ＤＤＲ１およびＬＲＲＣ３８の群から選択される表面マーカーをさらに発現するＴＡＦ細胞を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
選択ステップが、ＤＤＲ１およびＬＲＲＣ３８をさらに発現するＴＡＦ細胞を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＴＡＦ細胞を選択することが、ＣＤ２４、ＩＴＧＢ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＧＦＲＡ１、ＣＤ７４、ＦＧＦＲ４、ＨＡＶＣＲ１、およびＯＳＣＡＲからなる群から選択されるマーカーを発現する細胞を除外することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
粒子状物質を除去することが、前記ＴＡＦを濾過することおよび遠心分離することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記精製されたＴＡＦ細胞の接着選択を行うことが、前記精製されたＴＡＦ細胞をビトロネクチンベースの基質でコーティングされた表面に接着させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記選択ステップが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記選択ステップが、前記マーカーまたは表面マーカーのうちのいずれかに対する抗体を用いて行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記選択ステップが、請求項２に記載の表面マーカーから少なくとも２つのマーカー、少なくとも３つのマーカー、または少なくとも４つのマーカーを発現するＴＡＦ細胞を選択することを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記選択ステップが複数の選別ステップを含み、各選別ステップが、それぞれのＴＡＦ細胞によって発現されるかまたは発現されないマーカーのセットに応じて、ＴＡＦ細胞を第１の出力群または第２の出力群に割り当てることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記選択ステップが、少なくともＣＤ２４８である表面マーカーを発現するＴＡＦ細胞を第１の出力群に割り当てるための第１の選別ステップと、
第２のマーカーのセットを発現する前記第１の出力群から第２の出力群にＴＡＦ細胞を割り当てるための第２の選別ステップと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる単離された満期羊水（ＴＡＦ）細胞であって、前記細胞が少なくともＣＤ２４８である表面マーカーを発現する、単離された満期羊水（ＴＡＦ）細胞。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる単離された満期羊水（ＴＡＦ）細胞であって、前記細胞が、少なくともＣＤ２４８である表面マーカーを発現し、ＰＣＤＨ１９、ＤＤＲ１、ＭＭＥ、ＩＦＩＴＭ１０、ＢＧＮ、ＮＯＴＣＨ３、ＳＵＬＦ１、ＴＮＦＳＦ１８、ＢＤＫＲＢ１、ＦＬＴ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＮＦＳＦ４、ＵＮＣ５Ｂ、ＦＡＰ、ＣＡＳＰ１、ＤＤＲ２、ＰＣＤＨ１８、およびＣＲＬＦ１からなる群から選択される少なくとも１つの表面マーカーをさらに発現する、単離された満期羊水（ＴＡＦ）細胞。
【請求項15】
満期羊水（ＴＡＦ）細胞の単離された集団であって、前記細胞が少なくともＣＤ２４８である表面マーカーを発現する、単離された集団。
【国際調査報告】