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特表2022-552774荷電物質を送達する脂質、その製剤、およびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-20
(54)【発明の名称】荷電物質を送達する脂質、その製剤、およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07C 69/732 20060101AFI20221213BHJP
C07C 69/675 20060101ALI20221213BHJP
C07C 59/42 20060101ALI20221213BHJP
C07C 59/105 20060101ALI20221213BHJP
C07C 219/06 20060101ALI20221213BHJP
C07C 219/08 20060101ALI20221213BHJP
C07C 309/67 20060101ALI20221213BHJP
C07C 309/68 20060101ALI20221213BHJP
C07C 309/12 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221213BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20221213BHJP
A61K 47/14 20060101ALI20221213BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20221213BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20221213BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20221213BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20221213BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20221213BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20221213BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20221213BHJP
C07K 2/00 20060101ALN20221213BHJP
【ＦＩ】
C07C69/732 Z CSP
C07C69/675
C07C59/42
C07C59/105
C07C219/06
C07C219/08
C07C309/67
C07C309/68
C07C309/12
A61K31/7088
A61K38/02
A61K47/14
A61K47/18
A61K47/20
A61K9/14
A61K9/127
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/711
A61K47/22
A61K47/24
C12N15/88 Z
C07K2/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022508990
(86)(22)【出願日】2020-08-11
(85)【翻訳文提出日】2022-04-06
(86)【国際出願番号】 CA2020051098
(87)【国際公開番号】W WO2021026647
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】62/885,677
(32)【優先日】2019-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521438102
【氏名又は名称】インテグレイテッド ナノセラピューティクス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＮＡＮＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ２０５， ４４７５ Ｗａｙｂｕｒｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ Ｖ５Ｇ ４Ｘ４ Ｃａｎａｄａ
(71)【出願人】
【識別番号】300066874
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
(74)【代理人】
【識別番号】110002745
【氏名又は名称】弁理士法人河崎特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ザイフマン， ジョシュア
(72)【発明者】
【氏名】チェン， サム
(72)【発明者】
【氏名】タム， ユエン イー
(72)【発明者】
【氏名】シフーリーニ， マルコ エー．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4H006
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA29
4C076AA95
4C076CC50
4C076DD45
4C076DD46
4C076DD49
4C076DD55
4C076FF70
4C084AA13
4C084BA03
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA43
4C084NA13
4C084ZC80
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA43
4C086NA13
4C086ZC80
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB20
4H045AA10
4H045AA40
4H045BA55
4H045EA20
(57)【要約】
本明細書では、生理的ｐＨで正味の電荷を有し、脂質部位に結合している脂質を開示する。脂質部分は、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃを有する２つ以上の結合した炭化水素鎖を有する炭化水素構造からなり、前記鎖の少なくとも１つは、任意にリンカー領域を介して先頭基と結合している。炭化水素鎖は、リンカー領域に結合した鎖の内部炭素における分岐点で互いに結合しており、この分岐点は、電気陰性原子を有する官能基からなる。炭化水素鎖は、それぞれ１～４０個の炭素原子を有し、炭化水素構造の全体が１０～１５０個の炭素原子からなる。さらに有利な形として、炭化水素構造は、カーゴ分子の送達を強化するために、概してフレア状の形状をとることができる。さらに、この脂質を含む送達担体が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ： （化１）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
（式中、Ａは生理的ｐＨで荷電する先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環、または独立して選択された置換されていてもよい単環、二環もしくは三環の炭素環または４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環であり；
Ｚ－Ｌは、式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有し、
直鎖リンカー構造の式ＩＩ：
（化２）
Ｘ１－Ｌｂ
（式中、Ｘ１は任意であり、Ｘ１は、エーテル基、エステル基およびカルバメート基から選択され、
Ｌｂは、式ＩＩＩｃの分枝状の脂質である）、
分岐状のリンカー構造の式ＩＩａ：
【化3】
Ｗが存在する場合、Ｘ１結合、Ｎ－Ｃ（Ｏ）、Ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはＮ－ＯＣ（Ｏ）であり；
Ｗは、Ｄで置換されていてもよく、Ｄは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり；
（Ｘ）ｎが存在する場合、それぞれ独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは任意であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロサイクルであり、Ｔは置換されていてもよく、
Ｂは、Ｇ１およびＧ２を介してＬ１およびＬ２にそれぞれ結合した炭素原子であり；
Ｇ１およびＧ２は、独立してＸ１から選択され、Ｇ１およびＧ２のそれぞれ独立して（Ｇ）ｕに結合していてもよく、Ｇは、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり、ｕは、０～１６であり；
Ｇ３は任意であり、Ｘ１から選択され、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
Ｌ１は、式ＩＩＩｃの分枝状の炭化水素であり；
Ｌ２は、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する炭化水素鎖であるか、または式ＩＩＩｃの構造を有し；
Ｌ３が存在する場合は、水素、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖または分岐炭化水素鎖、または式ＩＩＩｃの構造を有する）、
環構造の式ＩＩｂ：
【化4】
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが、それぞれＧ１、Ｇ２およびＧ３を介して、任意の環内の単一の原子に結合しており、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３のそれぞれが、独立して、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
式ＩＩｂのＬ１および任意のＬ２および／またはＬ３は、式ＩＩＩｃの構造を有する）、
式ＩＩＩｃ：
【化5】
Ｌ１’は、直鎖炭化水素鎖であり、５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、５～１２、５～１０、５～９、６～１２、６～１０、６～９、７～１２、７～１０、または７～９個の炭素原子と０～３のシスまたはトランス二重結合を有しており；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
Ｌ１’’’は、Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３で表され、式中、Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは、０～４であり；
ｐは、１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～４であり；
ｑは、０～２０であり；
各Ｘ１は、それぞれ独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
式中、各ＳおよびＬ１’’’’炭化水素側鎖は、独立して：
（ａ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび１～３０個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子でそれぞれのＸ１の１つに結合している直鎖または分岐状の末端炭化水素鎖、または、
（ｂ）式ＩＩＩｃの分岐状の炭化水素構造であり、
式中、式ＩＩＩｃ中のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の総数は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４または１～３であり；
式中、脂質部分のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の各１つは、ヘテロ原子で置換されていてもよく、ただし、炭化水素鎖において２つ以下のヘテロ原子が置換されている））
の構造を有する分枝状の脂質部分Ｌを含む荷電脂質。
【請求項2】
Ｚ－Ｌが、直鎖リンカー構造の式ＩＩ：（化６）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、式ＩＩＩｃのＬ１’は、５～９個の炭素原子を有し、０～２個のシスまたはトランス二重結合を有し；
式ＩＩＩｃのＧ１は、不存在であるか、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨであり、当該二重結合がシスまたはトランスであり；
式ＩＩＩｃのＬ１’’’’およびＳは、０～５個のシスまたはトランスＣＨ＝ＣＨおよび２～１８個の炭素原子を有する炭化水素から独立して選択され；
式ＩＩＩｃの足場骨格は、ＣＨ２－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｌ１’’’は、８～３０の炭素原子であり；および
ｑは、１～９である）
の構造を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項3】
式Ｉの（Ｖ）ｍが（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、１～２０であり；Ｚ－Ｌが、分枝状リンカー構造の式ＩＩａ：
【化7】
Ｇ１およびＧ２は存在し、それぞれの（Ｇ）ｕに結合しており、ここで（Ｇ）ｕはＣＨ２であり；
Ｇ３－Ｌ３は存在し、ＣＨ３およびＣＨ２ＣＨ３から選択される炭化水素であり、またはＧ３－Ｌ３はＣＨ２Ｘ１Ｌ３であり、Ｌ３は１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖状または分枝状炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩｃの構造を有している）
の構造を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項4】
Ｚ－Ｌが、環構造の式ＩＩｂ：【化8】
の構造を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項5】
環が３または５個の炭素原子を有している、請求項４に記載の荷電脂質。
【請求項6】
少なくともＬ１およびＬ２が存在し、各Ｇ１およびＧ２基を介して環に結合し、当該各Ｇ１およびＧ２基が、Ｇｕに結合していてもよく、ｕが０～１０または０～６である、請求項４または５に記載の荷電脂質。
【請求項7】
Ａが、以下の（ｉ）～（ｉｖ）から一つ選択される：（ｉ）以下の群から選択されるイオン化可能なカチオン性部分：
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【請求項8】
式Ｉの炭化水素構造Ｌが非円筒形である、請求項１～７のいずれか一項に記載の荷電脂質。
【請求項9】
脂質が水溶液中で他の脂質と組み合わせて脂質ナノ粒子を形成し得る、請求項１～８のいずれか一項に記載の荷電脂質。
【請求項10】
小胞を形成する他の脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリンまたは親水性ポリマー－脂質複合体を含んでなる、請求項９に記載の荷電脂質。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の荷電脂質がその脂質二重層または単層中に組み込まれ、核酸、タンパク質またはペプチドであるカーゴ分子または化合物を含む、薬物送達ビークル製剤。
【請求項12】
核酸が、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンチゴミア、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡミミックである、請求項１１に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項13】
カーゴ分子または化合物が、ペプチドである、請求項１１に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項14】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の薬物送達ビークル製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書では、脂質、脂質の製剤、およびそれらの調製方法を提供する。本脂質およびその製剤は、荷電物質の送達に有用であり、核酸やペプチドを含むがこれらに限定されない。
【背景技術】
【0002】
核酸やペプチドなどの荷電物質の細胞内送達は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のような送達システムに組み込むことで容易にする。例えば、イオン化可能な脂質は、ＬＮＰ製造プロセス中に核酸を効率的にカプセル化するための主要な脂質成分である。さらに、イオン化可能なまたはカチオン性脂質は、標的細胞のエンドサイトーシスによって取り込まれた後のエンドソームからの核酸の制御された放出を容易にする。
【0003】
トランスフェクションまたは遺伝子送達活性は、カチオン性脂質などのイオン化可能な脂質の化学構造に依存することが提唱されている（Ｓｅｍｐｌｅ， Ｓ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１０，２８（２）：ｐ．１７２－６）。特に、新油性部分は非円筒形をしていることが望ましい。一例として、イオン化可能な小さな先頭基と、先頭基から外側に広がる炭化水素部分を有する脂質である。
【0004】
現在、単純または便利な方法で調製可能な所望の形状のイオン化可能または荷電脂質の構造が求められている。そのような脂質を提供することができれば、標的細胞への核酸または他の荷電分子の送達に依存する治療方法の臨床開発を大きく前進させる可能性がある。
【0005】
本開示の組成物および方法は、前述の問題に対処すること、および／または当該技術分野でこれまでに記載されたものに対する有用な代替物を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【0006】
本明細書では、荷電物質の送達を容易にする炭化水素構造を有するイオン化可能またはカチオン性脂質を提供する。荷電した物質は、核酸などの負に荷電した物質でも、正に荷電した物質でもよい。本明細書に記載の脂質は、モジュール方式で調製することができ、様々な非円筒形に調製された炭化水素構造を提供し、様々な負または正に荷電した物質の送達を容易にする。
【0007】
本明細書では、生理的ｐＨで正味の電荷を有し、任意のリンカー領域を介して脂質部分に共有結合している先頭基を含む脂質を開示している。脂質部分は、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃを有する２つ以上の連結された炭化水素鎖を有する炭化水素構造からなり、鎖の少なくとも１つは、任意にリンカー領域を介してイオン化可能な先頭基に共有結合している。炭化水素鎖は、任意のリンカー領域を介して先頭基に結合した鎖の内部炭素の分岐点で互いに結合しており、この分岐点は、電気陰性原子を有する本明細書でさらに説明されるＸ１官能基を含む。炭化水素鎖はそれぞれ１～４０または１～３０個の炭素原子を有し、炭化水素構造は全体で１０～１５０個の炭素原子を有する。
【0008】
一つの実施形態によれば、以下を含むカチオン性またはアニオン性脂質を含む荷電脂質が提供される：生理的ｐＨで正味電荷を有し、任意選択のリンカー領域を介して脂質部分に共有結合している先頭基。脂質部分は、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃを有する２つ以上の連結された炭化水素鎖を有する炭化水素構造からなり、前記鎖の少なくとも１つは、リンカー領域を介してイオン化可能な先頭基に共有結合しており、炭化水素鎖は、リンカー領域に結合した炭化水素鎖の内部炭素における分岐点で互いに結合しており、この分岐点はＸ１官能基を含み、Ｘ１官能基は以下から選択される：－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）－、または－Ｃ（Ｒ１）＝ＮＯ－、ここで、炭化水素鎖はそれぞれ１～３０個の炭素原子を有し、炭化水素構造は合計で１０～１５０個の炭素原子を含み、Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環から独立して選択される。
【0009】
一つの実施形態では、２つ以上の連結した炭化水素鎖は、式ＩＩＩの構造を有する。
式ＩＩＩ：
式中、Ｌ１’、Ｌ１’’、Ｌ１’’’およびＬ１’’’’は、１つまたは複数のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を任意に含む、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され、Ｌ１’は、リンカー領域に結合している炭化水素鎖である。
式ＩＩＩ：
【化1】
【0010】
さらなる実施形態では、炭化水素構造は、リンカー領域を介して先頭基に結合した疎水性鎖Ｌ２をさらに含み、Ｌ２は、１～３０個の炭素原子を有し、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を有する炭化水素鎖であるか、または、Ｌ２が式ＩＩＩａの構造を有する。
式ＩＩＩａ：
式中、Ｌ２’、Ｌ２’’、Ｌ２’’’およびＬ２’’’’は、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を含み、Ｌ２’はリンカー領域に結合している。
式ＩＩＩａ：
【化2】
【0011】
さらに別の実施形態では、炭化水素は、リンカー領域を介して先頭基に結合した炭化水素鎖Ｌ３をさらに含み、Ｌ３は、１～３０個の炭素原子を有し、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を有するか、または、式ＩＩＩａの構造を有する。
式ＩＩＩａ：
式中、Ｌ３’、Ｌ３’’、Ｌ３’’’およびＬ３’’’’は、１以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を任意で含む１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され、Ｌ３’は、リンカー領域に結合している。
式ＩＩＩａ：
【化3】
【0012】
さらなる実施形態では、脂質は、Ｘ１リンカーを介してＬ１に結合した１～１０個の側鎖Ｓをさらに含んでいてもよく、各側鎖は、１～３０個の原子を有し、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を有するか、または式ＩＩＩｂの構造を有する。
式ＩＩＩｂ：
式中、Ｓ１’、Ｓ１’’、Ｓ１’’’およびＳ１’’’’は、独立して、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から選択され、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を含み、Ｓ１’はＬ１の炭素に結合している。
式ＩＩＩｂ：
【化4】
【0013】
さらなる実施形態では、脂質は、Ｘ１リンカーを介してＬ２に結合した１～１０個の側鎖Ｓをさらに含んでいてもよく、各側鎖は、１～３０個の原子を有し、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を有するか、または、式ＩＩＩｂの構造を有する。
式ＩＩＩｂ：
式中、Ｓ２’、Ｓ２’’、Ｓ２’’’およびＳ２’’’’は、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を含み、Ｓ２’がＬ２の炭素に結合している。
式ＩＩＩｂ：
【化5】
【0014】
さらなる実施形態では、脂質は、Ｘ１リンカーを介してＬ３に結合した１～１０個の側鎖Ｓをさらに含み、各側鎖は、１～３０個の原子を有し、任意にシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を有するか、または式ＩＩＩｂの構造を有する。
式ＩＩＩｂ：
式中、Ｓ３’、Ｓ３’’、Ｓ３’’’およびＳ３’’’’は、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ結合を含み、Ｓ３’がＬ３の炭素に結合している。
式ＩＩＩｂ：
【化6】
【0015】
代替の実施形態では、Ｘ１の１つ以上の部位は生分解性である。
【0016】
さらに別の実施形態では、少なくともリンカー領域を介して先頭基に結合した炭化水素鎖が、その内部炭素原子に結合したヒドロキシ基、アミノ基、および／またはアミド基から選択される１つ以上の反応性基を有する脂質に由来し、炭化水素構造中の少なくとも１つの他の炭化水素鎖がアシル脂質に由来する。炭化水素構造の足場炭素鎖として機能し、炭化水素構造の少なくとも１つの他の炭化水素鎖はアシル脂質に由来し、Ｘ１結合は足場炭素鎖上の反応性基とアシル鎖のカルボン酸との反応によって形成される。
【0017】
さらなる実施形態では、脂質はジヒドロキシ脂質である。
先頭基は、５．０～９．０の間のｐＫａ、または５．５～８．０の間のｐＫａを脂質に付与してもよい。代替的な実施形態では、先頭基は、式Ｉの構造を有する。
先頭基は、５．０～９．０の間のｐＫａ、または５．５～８．０の間のｐＫａを脂質に付与してもよい。代替的な実施形態では、先頭基は、式Ｉの構造を有する。
【0018】
さらなる実施形態では、炭化水素構造に結合したリンカー領域は、式ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有する。
さらなる実施形態では、炭化水素構造は、非円筒形である。
さらなる実施形態では、脂質は、水溶液中で他の脂質と組み合わせて、脂質ナノ粒子に形成することができる。
さらなる実施形態では、他の小胞を形成する脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリン、または親水性ポリマーと脂質の結合体を含む。
さらに、前記実施形態のいずれか１つに記載の脂質をその脂質二重層または単層に組み込んで、核酸またはペプチドを含むドラッグデリバリー担体製剤を提供する。
一つの実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンタゴミル、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡミミックである。
さらなる実施形態では、炭化水素構造は、非円筒形である。
さらなる実施形態では、脂質は、水溶液中で他の脂質と組み合わせて、脂質ナノ粒子に形成することができる。
さらなる実施形態では、他の小胞を形成する脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリン、または親水性ポリマーと脂質の結合体を含む。
さらに、前記実施形態のいずれか１つに記載の脂質をその脂質二重層または単層に組み込んで、核酸またはペプチドを含むドラッグデリバリー担体製剤を提供する。
一つの実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンタゴミル、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはｍｉＲＮＡミミックである。
【0019】
さらなる実施形態では、ドラッグデリバリー担体製剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。
さらに、そのような脂質を調製するための便利な方法が提供される。
このような実施形態は、目的の分子の送達に使用するための荷電脂質の炭化水素構造を調製する方法を含み、この方法は以下を含む：
（ｉ）その内部炭素上に反応性基を有する炭化水素鎖を提供する工程であって、当該反応性基は、Ｏ、Ｐ、Ｎおよび／またはＳから選択される原子を含む工程；および
（ｉｉ）炭化水素鎖を１つまたは複数の反応性基を介して１つ以上のアシル鎖に結合させて炭化水素構造を生成する工程であって、当該炭化水素構造は非円筒形である。
さらに、そのような脂質を調製するための便利な方法が提供される。
このような実施形態は、目的の分子の送達に使用するための荷電脂質の炭化水素構造を調製する方法を含み、この方法は以下を含む：
（ｉ）その内部炭素上に反応性基を有する炭化水素鎖を提供する工程であって、当該反応性基は、Ｏ、Ｐ、Ｎおよび／またはＳから選択される原子を含む工程；および
（ｉｉ）炭化水素鎖を１つまたは複数の反応性基を介して１つ以上のアシル鎖に結合させて炭化水素構造を生成する工程であって、当該炭化水素構造は非円筒形である。
【0020】
一つの実施形態では、反応性基はアシル鎖のそれぞれの１つと結合してそれぞれのＸ１結合を形成する。
さらに、前記方法で製造された脂質を提供する。
さらに、前記方法で製造された脂質を提供する。
【0021】
さらに、式Ｉの構造を有する分枝状の脂質部分Ｌを含む荷電脂質を提供する。
式Ｉ：
（化７）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
式中、Ａは生理的ｐＨで荷電する先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環、または独立して選択された置換されていてもよい単環、二環もしくは三環の炭素環または４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環であり；
Ｚ－Ｌは、以下の式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有する。
直鎖リンカー構造の式ＩＩ：
（化８）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、Ｘ１は、エーテル基、エステル基およびカルバメート基から選択され、
Ｌｂは、式ＩＩＩｃの分枝状の脂質である。
式Ｉ：
（化７）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
式中、Ａは生理的ｐＨで荷電する先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環、または独立して選択された置換されていてもよい単環、二環もしくは三環の炭素環または４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環であり；
Ｚ－Ｌは、以下の式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有する。
直鎖リンカー構造の式ＩＩ：
（化８）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、Ｘ１は、エーテル基、エステル基およびカルバメート基から選択され、
Ｌｂは、式ＩＩＩｃの分枝状の脂質である。
【0022】
分岐状のリンカー構造の式ＩＩａ：
Ｗは任意であり、
Ｗが存在する場合、Ｘ１結合、Ｎ－Ｃ（Ｏ）、Ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはＮ－ＯＣ（Ｏ）であり；
Ｗは、Ｄで置換されていてもよく、Ｄは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり；
（Ｘ）ｎが存在する場合、それぞれ独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは任意であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロサイクルであり、Ｔは置換されていてもよい。
Ｂは、Ｇ１およびＧ２を介してＬ１およびＬ２にそれぞれ結合した炭素原子であり；
Ｇ１およびＧ２は、独立してＸ１から選択され、Ｇ１およびＧ２のそれぞれ独立して（Ｇ）ｕに結合していてもよく、Ｇは、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり、ｕは、０～１６であり；
式中、Ｇ３は任意であり、Ｘ１から選択され、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
Ｌ１は、式ＩＩＩｃの分枝状の炭化水素であり；
Ｌ２は、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する炭化水素鎖であるか、または式ＩＩＩｃの構造を有し；
Ｌ３が存在する場合は、水素、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖または分岐炭化水素鎖、または式ＩＩＩｃの構造を有する。
【化9】
Ｗが存在する場合、Ｘ１結合、Ｎ－Ｃ（Ｏ）、Ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはＮ－ＯＣ（Ｏ）であり；
Ｗは、Ｄで置換されていてもよく、Ｄは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり；
（Ｘ）ｎが存在する場合、それぞれ独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは任意であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロサイクルであり、Ｔは置換されていてもよい。
Ｂは、Ｇ１およびＧ２を介してＬ１およびＬ２にそれぞれ結合した炭素原子であり；
Ｇ１およびＧ２は、独立してＸ１から選択され、Ｇ１およびＧ２のそれぞれ独立して（Ｇ）ｕに結合していてもよく、Ｇは、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり、ｕは、０～１６であり；
式中、Ｇ３は任意であり、Ｘ１から選択され、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
Ｌ１は、式ＩＩＩｃの分枝状の炭化水素であり；
Ｌ２は、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する炭化水素鎖であるか、または式ＩＩＩｃの構造を有し；
Ｌ３が存在する場合は、水素、１～２０個の炭素原子と０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖または分岐炭化水素鎖、または式ＩＩＩｃの構造を有する。
【0023】
環構造の式ＩＩｂ：
式中、曲線は環を表し、ＥおよびＫは環の構造を部分的に構成する原子を表し、その環は３～８個の環原子を有する置換または非置換の環であり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが、それぞれＧ１、Ｇ２およびＧ３を介して、任意の環内の単一の原子に結合しており、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３のそれぞれが、独立して、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
式中、式ＩＩｂのＬ１および任意のＬ２および／またはＬ３は、式ＩＩＩｃの構造を有する。
【化10】
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが、それぞれＧ１、Ｇ２およびＧ３を介して、任意の環内の単一の原子に結合しており、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３のそれぞれが、独立して、（Ｇ）ｕに結合していてもよく；
式中、式ＩＩｂのＬ１および任意のＬ２および／またはＬ３は、式ＩＩＩｃの構造を有する。
【0024】
式ＩＩＩｃ：
式中、Ｌ骨格は、Ｌ１’－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－［ＣＨ２］ｑ－ＣＨ３で表され、Ｌ骨格の炭素原子の総数は、１０～３０個であり；
Ｌ１’は、直鎖炭化水素鎖であり、５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、５～１２、５～１０、５～９、６～１２、６～１０、６～９、７～１２、７～１０、または７～９個の炭素原子と０～３のシスまたはトランス二重結合を有しており；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
Ｌ１’’’は、Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３で表され、式中、Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは、０～４であり；
ｐは、１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～４であり；
ｑは、０～２０であり；
各Ｘ１は、それぞれ独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
式中、各ＳおよびＬ１’’’’炭化水素側鎖は、独立して：
（ａ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび１～３０個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子でそれぞれのＸ１の１つに結合している直鎖または分岐状の末端炭化水素鎖、または、
（ｂ）式ＩＩＩｃの分岐状の炭化水素構造であり、
式中、式ＩＩＩｃ中のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の総数は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４または１～３個であり；
式中、脂質部分のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の各１つは、ヘテロ原子で置換されていてもよい。ただし、炭化水素鎖において２つ以下のヘテロ原子が置換されている。
【化11】
Ｌ１’は、直鎖炭化水素鎖であり、５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、５～１２、５～１０、５～９、６～１２、６～１０、６～９、７～１２、７～１０、または７～９個の炭素原子と０～３のシスまたはトランス二重結合を有しており；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
Ｌ１’’’は、Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３で表され、式中、Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは、０～４であり；
ｐは、１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～４であり；
ｑは、０～２０であり；
各Ｘ１は、それぞれ独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
式中、各ＳおよびＬ１’’’’炭化水素側鎖は、独立して：
（ａ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび１～３０個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子でそれぞれのＸ１の１つに結合している直鎖または分岐状の末端炭化水素鎖、または、
（ｂ）式ＩＩＩｃの分岐状の炭化水素構造であり、
式中、式ＩＩＩｃ中のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の総数は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４または１～３個であり；
式中、脂質部分のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の各１つは、ヘテロ原子で置換されていてもよい。ただし、炭化水素鎖において２つ以下のヘテロ原子が置換されている。
【0025】
別の実施形態では、式ＩのＺ－Ｌは、式ＩＩ（直鎖状リンカー構造）の構造を有する：
（化１２）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、式ＩＩＩｃのＬ１’は、５～９個の炭素原子を有し、０～２個のシスまたはトランス二重結合を有し；
式中、式ＩＩＩｃのＧ１は、不存在であるか、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨであり、当該二重結合がシスまたはトランスであり；
式中、式ＩＩＩｃのＬ１’’’’およびＳは、０～５個のシスまたはトランスＣＨ＝ＣＨおよび２～１８個の炭素原子を有する炭化水素から独立して選択され；
式ＩＩＩｃの足場骨格は、ＣＨ２－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｌ１’’’は、８～３０の炭素原子であり；および
式中、ｑは、１～９である。
（化１２）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、式ＩＩＩｃのＬ１’は、５～９個の炭素原子を有し、０～２個のシスまたはトランス二重結合を有し；
式中、式ＩＩＩｃのＧ１は、不存在であるか、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨであり、当該二重結合がシスまたはトランスであり；
式中、式ＩＩＩｃのＬ１’’’’およびＳは、０～５個のシスまたはトランスＣＨ＝ＣＨおよび２～１８個の炭素原子を有する炭化水素から独立して選択され；
式ＩＩＩｃの足場骨格は、ＣＨ２－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｌ１’’’は、８～３０の炭素原子であり；および
式中、ｑは、１～９である。
【0026】
別の実施形態では、式Ｉの（Ｖ）ｍは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、１～２０であり；
Ｚ－Ｌは、式ＩＩａの構造（分枝状リンカー構造）を有する。
式中、Ｗは、エーテル、エステルまたはカルバメート基（任意の方向）であり、Ｄは不存在であり、（Ｘ）ｎは（ＣＨ２）ｎであり、ｎは１～１０である。
Ｇ１およびＧ２は存在し、それぞれの（Ｇ）ｕに結合しており、ここで（Ｇ）ｕはＣＨ２であり；
Ｇ３－Ｌ３は存在し、ＣＨ３およびＣＨ２ＣＨ３から選択される炭化水素であり、またはＧ３－Ｌ３はＣＨ２Ｘ１Ｌ３であり、Ｌ３は１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖状または分枝状炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩｃの構造を有している。
Ｚ－Ｌは、式ＩＩａの構造（分枝状リンカー構造）を有する。
【化13】
Ｇ１およびＧ２は存在し、それぞれの（Ｇ）ｕに結合しており、ここで（Ｇ）ｕはＣＨ２であり；
Ｇ３－Ｌ３は存在し、ＣＨ３およびＣＨ２ＣＨ３から選択される炭化水素であり、またはＧ３－Ｌ３はＣＨ２Ｘ１Ｌ３であり、Ｌ３は１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖状または分枝状炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩｃの構造を有している。
【0027】
さらなる実施形態において、式ＩのＺ－Ｌは、式ＩＩｂの構造を有する。
環構造の式ＩＩｂ：
式中、曲線は環を表し、ＥとＫは環の構造を部分的に構成する原子を表し、この環は３から６個の環原子を有する置換または非置換の炭素環である。
一つの実施形態では、環は、３または５個の炭素原子を有している。さらなる実施形態において、少なくともＬ１およびＬ２が存在し、各Ｇ１およびＧ２基を介して環に結合し、式中、それぞれのＧ１およびＧ２基は、Ｇｕに結合していてもよく、ｕは０～１０または０～６である。
環構造の式ＩＩｂ：
【化14】
一つの実施形態では、環は、３または５個の炭素原子を有している。さらなる実施形態において、少なくともＬ１およびＬ２が存在し、各Ｇ１およびＧ２基を介して環に結合し、式中、それぞれのＧ１およびＧ２基は、Ｇｕに結合していてもよく、ｕは０～１０または０～６である。
【0028】
式Ｉにおける先頭基Ａは、以下の（ｉ）～（ｉｖ）から一つ選択することができる。
（ｉ）以下の群から選択されるイオン化可能なカチオン性部分
（ｉｉ）以下の群から選択される、恒久的に荷電した部分
（ｉｉｉ）以下の群から選択されるイオン化可能なアニオン性部分
（ｉｖ）以下の群から選択される双性イオン部分
（ｉ）以下の群から選択されるイオン化可能なカチオン性部分
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【0029】
一つの実施形態において、式Ｉの炭化水素構造Ｌは、非円筒形である。
さらなる実施形態では、脂質は、水溶液中で他の脂質と組み合わせて脂質ナノ粒子を形成することが可能である。一つの実施形態において、他の小胞形成脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリンまたは親水性ポリマー－脂質複合体を含む。
さらに、その脂質二重層または単層中に組み込まれ、核酸、タンパクまたはペプチドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の脂質を含む薬物送達担体製剤を提供する。
さらなる実施形態では、脂質は、水溶液中で他の脂質と組み合わせて脂質ナノ粒子を形成することが可能である。一つの実施形態において、他の小胞形成脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリンまたは親水性ポリマー－脂質複合体を含む。
さらに、その脂質二重層または単層中に組み込まれ、核酸、タンパクまたはペプチドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の脂質を含む薬物送達担体製剤を提供する。
【0030】
一つの実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンチゴミア、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡミミックである。
一つの実施形態では、薬物送達担体は、荷電ペプチドを含んでいる。
さらなる実施形態では、薬物送達担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
本明細書に記載の実施形態に限定されない。
一つの実施形態では、薬物送達担体は、荷電ペプチドを含んでいる。
さらなる実施形態では、薬物送達担体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
本明細書に記載の実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1A】図１Ａは、脂質部分Ｌ中の１つの炭化水素鎖に、任意にリンカー基を介して結合する単純な先頭基（Ｈ）を有していても良い、本開示によって包含されるアミノ脂質を表している。先頭基に結合する脂質鎖は、ヒドロキシ脂質に由来し、そのヒドロキシ脂質由来の１つまたは複数の追加の脂質鎖に結合している。これらの脂質鎖は、さらにアシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖に結合している。
【図1B】図１Ｂは、脂質部分Ｌ内の２つの炭化水素に、任意にリンカー基を介して結合する先頭基を有する、本開示に包含されるアミノ脂質を描写している。先頭基に結合する２つの炭化水素は、ヒドロキシ脂質に由来する。ヒドロキシ脂質に由来する２つの脂質鎖のそれぞれは、ヒドロキシ脂質に由来する別のそれぞれの脂質鎖に結合し、これらの脂質には、さらに、アシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖が結合している。
【図2A】図２Ａは、培養したルシフェラーゼ発現２２Ｒｖ１細胞で評価したアミノ脂質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を示す。細胞を本開示のイオン化可能脂質およびルシフェラーゼｓｉＲＮＡを１．０（左のバー）、０．３（中央のバー）および０．１μｇ／ｍＬ（右のバー）の濃度で脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で処理した。発光レベルは処理後に測定された。ＬＮＰに組み込まれたイオン化可能な脂質は、２－（ジメチルアミノ）エチル（±）－シン－９，１０－ジリノレオキシステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００１）、３－（ジエチルアミノ）プロピル（±）－シン－９，１０－ジリノレオキシステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００２）、３－（ジメチルアミノ）プロピル（±）－シン－９，１０－ジリノレオキシステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００３）、２－（ジエチルアミノ）エチル（±）－シン－９，１０－ジリノレオキシステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００４）、３－（ジメチルアミノ）プロピル（１２Ｒ）－リノレオキシオリン酸（ＩＮＴ－Ａ００５）、３－（ジエチルアミノ）プロピル（シン－９，１０，１２Ｒ）－トリリノレオキシステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００６）、３－（ジエチルアミノ）プロピル（±）シン－９，１０－ビス（２－ヘキシルデカノイルオキシ）ステアリン酸（ＩＮＴ－Ａ００７）等がある。
【図2B】図２Ｂは、培養した２２Ｒｖ１細胞において、１μｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ濃度でのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアミノ脂質の活性を示している。発光レベルは処理後１６～２４時間に測定し、相対的な発光を最高（左）から最低（右）にランク付けしている。
【図3】図３は、マウスのＦＶＩＩモデルで評価したアミノ脂質のｉｎ ｖｉｖｏでの活性を示している。本開示のカチオン性脂質およびＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を、Ｃ５７ＢＩ／６野生型マウスの尾静脈から注射し、注射後に血漿中のＦＶＩＩのレベルを測定した。マウスに０．０３（左のバー）、０．１（中央のバー）および０．３ｍｇ／ｋｇ（右のバー）の用量でＬＮＰ－ｓｉＲＮＡを注射した。ＬＮＰに組み込まれたカチオン性脂質は、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３およびＩＮＴ－Ａ００７であった。
【発明を実施するための形態】
【0032】
荷電物質を送達するために使用される脂質の構造
本明細書に記載の脂質は、先頭基Ａと、後述する炭化水素構造を有する脂質部位Ｌとを有する。先頭基Ａは、生理的ｐＨで荷電しており、いくつかの実施形態ではイオン化可能であるが、恒久的な荷電基も同様に本開示に含まれる。先頭基Ｈは、生理的ｐＨにおいて他の荷電基を含むことができるが、生理的ｐＨにおいて正味の全体的に正または負の電荷を有する。荷電脂質は、１価または多価であり得る。
脂質部分Ｌは、一般に、炭化水素構造内に追加の炭化水素鎖または基を共役させるための足場として機能する炭素鎖を有する炭化水素構造で構成される。別の有利な実施形態では、脂質部分Ｌは、官能基を有するヒドロキシまたは他の脂質に由来する炭化水素鎖から少なくとも部分的に構成され、炭化水素構造の足場成分として機能する。ヒドロキシ脂質は、アシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖に結合することができる。
本明細書に記載の脂質は、先頭基Ａと、後述する炭化水素構造を有する脂質部位Ｌとを有する。先頭基Ａは、生理的ｐＨで荷電しており、いくつかの実施形態ではイオン化可能であるが、恒久的な荷電基も同様に本開示に含まれる。先頭基Ｈは、生理的ｐＨにおいて他の荷電基を含むことができるが、生理的ｐＨにおいて正味の全体的に正または負の電荷を有する。荷電脂質は、１価または多価であり得る。
脂質部分Ｌは、一般に、炭化水素構造内に追加の炭化水素鎖または基を共役させるための足場として機能する炭素鎖を有する炭化水素構造で構成される。別の有利な実施形態では、脂質部分Ｌは、官能基を有するヒドロキシまたは他の脂質に由来する炭化水素鎖から少なくとも部分的に構成され、炭化水素構造の足場成分として機能する。ヒドロキシ脂質は、アシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖に結合することができる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「足場炭素鎖」は、本明細書に記載されるような官能基（例えば、「Ｘ１官能基」、「Ｘ１結合」または本明細書で使用される他の同様の規則）を介して脂質部分Ｌ内の別の炭化水素鎖と共有結合することによってそのような足場機能を与える炭素鎖をいう。一例において、Ｘ１官能基は、基中の原子として、または任意に基中の唯一の原子としてＮ、Ｏ、ＳまたはＰなどの電気陰性原子を有する基を含み、足場炭素鎖を別の足場炭素鎖を含む１以上の炭化水素鎖に共有結合させることを提供するものである。適切なＸ１官能基の例はエステルであるが、エーテルおよびカルバメート基を含む他の基が当業者によって容易に想定され得る。
【0034】
足場炭素鎖は、本明細書に記載されるようなヒドロキシル基を有する前駆体脂質に由来してもよい。このような脂質は、一般にヒドロキシ脂質と呼ばれ、天然に存在するか、または実験室で合成することができる。エステル基を作るためには、例えば、炭化水素鎖のヒドロキシル基を、縮合反応により別の炭化水素鎖上のカルボン酸と反応させることができる。ただし、様々な異なる合成経路が想定されるため、本明細書では、炭化水素構造の調製方法は、特に限定されるものではない。
足場としてのヒドロキシ化脂質に由来する荷電脂質の構造例を図１Ａおよび図１Ｂに示す。脂質部分（Ｌ）は、脂質部分（Ｌ）内の１、２または３個の炭化水素基を介して先頭基Ａに連結されていてもよい。
足場としてのヒドロキシ化脂質に由来する荷電脂質の構造例を図１Ａおよび図１Ｂに示す。脂質部分（Ｌ）は、脂質部分（Ｌ）内の１、２または３個の炭化水素基を介して先頭基Ａに連結されていてもよい。
【0035】
図１Ａは、脂質部分Ｌ内の１つの炭化水素に、任意にリンカー基を介して結合する単純な先頭基（Ａ）を有する、本開示によって包含される荷電脂質を表している。本実施形態における第１の脂質鎖は、ヒドロキシ－脂質に由来する。ヒドロキシ－脂質は、ヒドロキシ－脂質に由来する１つ以上の追加の脂質鎖に結合していてもよい。さらに、これらの脂質鎖は、アシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖に結合している。
【0036】
図１Ｂは、脂質部分Ｌ中の２つの炭化水素に、任意にリンカー基を介して結合する先頭基（Ａ）を備えて調製される、本開示に含まれる荷電脂質を表している。この例では、先頭基に結合する２つの炭化水素は、ヒドロキシ脂質に由来する。次に、２つの脂質のそれぞれは、ヒドロキシ脂質に由来する別のそれぞれの脂質に結合し、これらの脂質には、アシル脂質に由来する１つまたは複数の炭化水素鎖がさらに結合している。
しかしながら、図１は、単に選択された実施形態の例示であり、いかなる方法においても限定的に解釈されるべきではないことが理解されよう。例えば、足場炭素鎖は、代替的に、脂肪酸アミン、脂肪酸アミドおよび／または分枝脂肪酸エステルから合成され得る。
しかしながら、図１は、単に選択された実施形態の例示であり、いかなる方法においても限定的に解釈されるべきではないことが理解されよう。例えば、足場炭素鎖は、代替的に、脂肪酸アミン、脂肪酸アミドおよび／または分枝脂肪酸エステルから合成され得る。
【0037】
本開示の一例では、脂質は、生理的ｐＨで正味の正または負の電荷を有する先頭基を含み、リンカー領域（本明細書では「リンカー」とも呼ばれる）を介して脂質部分に共有結合し、脂質部分は、２以上の連結炭化水素鎖を有する炭化水素構造を含み、任意でシスまたはトランスＣ＝Ｃ、その鎖の少なくとも１つは、リンカー領域を介してイオン化可能な先頭基に結合しており、炭化水素鎖は、リンカー領域に結合した鎖の内部炭素における分岐点で互いに結合しており、この分岐点は、Ｘ１官能基を含み、Ｘ１官能基は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）－、または－Ｃ（Ｒ１）＝ＮＯ－から選択され、炭化水素鎖はそれぞれ１～３０個の炭素原子を有し、炭化水素構造は、合計で１０～１５０個の炭素原子からなり、Ｒ１は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環から選択される。
【0038】
さらなる実施形態では、荷電脂質の炭化水素構造は、非円筒形である形状を有する。多くのリン脂質は、グリセロール骨格に結合した炭化水素鎖（２つの脂肪酸鎖によって形成される）を有し、一般に円筒形である親油性成分を形成している。しかしながら、特定の実施形態では、本明細書に記載の炭化水素構造は、「フレア状」構造（「円錐台状」形状とも呼ばれる）、すなわち、炭化水素構造は、その長さに沿った任意の点において、先頭基の最大直径の少なくとも１．２倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍である直径を有することを形成する。このような形状は、核酸やその他の荷電分子を細胞に導入しやすくなるという点で有利である。
【0039】
別の実施形態では、荷電脂質の炭化水素構造は、３つ以上の炭化水素鎖を有し、３つ以上の炭化水素鎖の各々は、前記Ｘ１結合を介してその内部炭素で別の鎖に結合している。別の実施形態では、脂質部分は、２～２０または３～１８の共役炭化水素鎖を有する炭化水素構造を有する。一つの実施形態における炭化水素構造は、フレア状の非円筒構造を形成する連結炭化水素鎖の格子またはマトリックスとして記述することができる。接続点は、各生分解性官能基であってもよく、または接続点の少なくとも１、２、３、４または５が、患者への投与後に生体内で測定して、生分解性であると言える。
【0040】
様々な先頭基が考えられるが、一例では、先頭基は、末端アミン基のようなイオン化可能なアミノ基から構成される。一つの実施形態では、先頭基は、リン酸基を含んでいない。別の実施形態では、アミンは、一級、二級、三級または四級アミンである。第四級アミンが先頭基で利用される場合、先頭基内の他のイオン化可能な基の有無に応じて、脂質はイオン化できない可能性がある。別の実施形態では、先頭基は非双性イオン性である。
【0041】
Ｌの炭化水素構造における炭化水素鎖を連結するＸ１結合の各々は、同一であっても異なっていてもよい。すなわち、各Ｘ１は、上記に挙げたＸ１結合基から独立して選択することができる。
一つの実施形態では、Ｘ１結合は、ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および－Ｏ－から選択される。さらなる別の実施形態において、Ｘ１結合は、生分解性である任意の共有結合である。Ｘ１結合はまた、ｐＨ感受性であってもよく、これは、開裂が周囲の溶液のｐＨに依存することを意味する。
一つの実施形態では、Ｘ１結合は、ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、および－Ｏ－から選択される。さらなる別の実施形態において、Ｘ１結合は、生分解性である任意の共有結合である。Ｘ１結合はまた、ｐＨ感受性であってもよく、これは、開裂が周囲の溶液のｐＨに依存することを意味する。
【0042】
さらなる実施形態では、炭化水素構造は、１つ以上のヒドロキシ脂質と１つ以上のアシル脂質から生成され、１つ以上のヒドロキシ脂質は、前記１つ以上のアシル脂質を共役させるための足場炭素鎖として機能する。
さらなる実施形態では、脂質は、５．０～９．０の間、または５．５～８．５の間、または５．０～８．０の間の見かけのｐＫａを有する。
さらにさらなる実施形態では、上記の荷電脂質（例えば、カチオン性またはイオン化可能な脂質）は、リポソームを含むがこれに限定されない脂質ナノ粒子に配合することができる。
さらなる実施形態では、脂質は、５．０～９．０の間、または５．５～８．５の間、または５．０～８．０の間の見かけのｐＫａを有する。
さらにさらなる実施形態では、上記の荷電脂質（例えば、カチオン性またはイオン化可能な脂質）は、リポソームを含むがこれに限定されない脂質ナノ粒子に配合することができる。
【0043】
さらなる実施形態では、荷電脂質は、式Ｉの構造を有する。
式Ｉ：
（化１９）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
式中、Ａは生理的ｐＨで荷電する先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環、または独立して選択された置換されていてもよい単環、二環または三環の炭素環または４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環であり；
Ｚ－Ｌは、以下の式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有する。
式Ｉ：
（化１９）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
式中、Ａは生理的ｐＨで荷電する先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環、または独立して選択された置換されていてもよい単環、二環または三環の炭素環または４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環であり；
Ｚ－Ｌは、以下の式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有する。
【0044】
式ＩＩは、直鎖状リンカー構造である。
（化２０）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；および
Ｌｂは、以下の式ＩＩＩｃの分岐状の脂質である。
（化２０）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；および
Ｌｂは、以下の式ＩＩＩｃの分岐状の脂質である。
【0045】
本開示の別の例では、荷電脂質は、アミノ脂質であり、以下の式Ｉａを有する。
式Ｉａ：
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロサイクルであり；
ここで、任意選択で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの１つは、不存在であり（孤立電子対）、または水素であり；
Ｖの各出現は、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６である。
式ＩのＺ－Ｌまたは式Ｉａのアミノ脂質のＺ－Ｌ１は、以下に表される式ＩＩ、式ＩＩａまたは式ＩＩｂで表すことができる。
式Ｉａ：
【化21】
ここで、任意選択で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの１つは、不存在であり（孤立電子対）、または水素であり；
Ｖの各出現は、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｍは、１～１０または２～６である。
式ＩのＺ－Ｌまたは式Ｉａのアミノ脂質のＺ－Ｌ１は、以下に表される式ＩＩ、式ＩＩａまたは式ＩＩｂで表すことができる。
【0046】
式ＩＩ：
（化２２）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、一つの実施形態におけるＸ１は、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；および
Ｌｂは、式ＩＩＩ、ＩＩＩａまたはＩＩＩｃの分岐状脂質である。
（化２２）
Ｘ１－Ｌｂ
式中、Ｘ１は任意であり、一つの実施形態におけるＸ１は、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；および
Ｌｂは、式ＩＩＩ、ＩＩＩａまたはＩＩＩｃの分岐状脂質である。
【0047】
式ＩＩａ：
式中、Ｗは任意であり、
Ｗは、存在する場合、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＮＣ（Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
式中、Ｗは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であるＤで置換されていてもよく；
（Ｘ）ｎの各出現は、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－、または独立して選択された、４～１２の環原子を有する置換されていてもよい単環、二環、または三環炭素環またはヘテロ原子環であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは、任意であって、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロ環であり；
Ｂは、任意にＧ１を介して、Ｌ１に共有結合した炭素、酸素、窒素原子であり；任意にそれぞれのＧ２およびＧ３基を介して、独立して選択されたＬ２および／またはＬ３に任意に付加的に結合し；
Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－から独立して選択され、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３の各々が独立して任意に先行し、（Ｇ）ｕに結合しており、Ｇは独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｕは０～１０である；
【化23】
Ｗは、存在する場合、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＮＣ（Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
式中、Ｗは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であるＤで置換されていてもよく；
（Ｘ）ｎの各出現は、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－、または独立して選択された、４～１２の環原子を有する置換されていてもよい単環、二環、または三環炭素環またはヘテロ原子環であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは、任意であって、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロ環であり；
Ｂは、任意にＧ１を介して、Ｌ１に共有結合した炭素、酸素、窒素原子であり；任意にそれぞれのＧ２およびＧ３基を介して、独立して選択されたＬ２および／またはＬ３に任意に付加的に結合し；
Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－から独立して選択され、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３の各々が独立して任意に先行し、（Ｇ）ｕに結合しており、Ｇは独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）－であり、ｕは０～１０である；
【0048】
式ＩＩｂ：
式中、Ｗは任意であり；
Ｗが存在する場合、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＮＣ（Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
ここで、Ｗは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロ環であるＤで置換されていてもよく；
ここで、曲線は環を表し、ＥおよびＫは、環の構造を部分的に形成する任意の原子を表し、この環は４～１２個の環原子を有する置換もしくは非置換の単環、二環、もしくは三環の炭素環または単環、二環、もしくは三環のヘテロ原子環であり；
式Ｉａおよび式Ｉｂ中のＬ２およびＬ３は、任意に水素原子または１～４０個の炭素原子を有し、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩａ（後述）の構造を有するものであり；
ここで、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のうちの２つは、任意に、曲線で表される環内の単一の原子に結合しており；
上記式のＬ、Ｌｂ、Ｌ１および任意にＬ２および／またはＬ３は、すぐ下に記載される式ＩＩＩの構造を有する脂質部分である。あるいは、脂質部分は、後述の式ＩＩＩａまたは式ＩＩＩｃを含む構造を含む。
【化24】
Ｗが存在する場合、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＮＣ（Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
ここで、Ｗは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロ環であるＤで置換されていてもよく；
ここで、曲線は環を表し、ＥおよびＫは、環の構造を部分的に形成する任意の原子を表し、この環は４～１２個の環原子を有する置換もしくは非置換の単環、二環、もしくは三環の炭素環または単環、二環、もしくは三環のヘテロ原子環であり；
式Ｉａおよび式Ｉｂ中のＬ２およびＬ３は、任意に水素原子または１～４０個の炭素原子を有し、任意に１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃ二重結合を有する炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩａ（後述）の構造を有するものであり；
ここで、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３のうちの２つは、任意に、曲線で表される環内の単一の原子に結合しており；
上記式のＬ、Ｌｂ、Ｌ１および任意にＬ２および／またはＬ３は、すぐ下に記載される式ＩＩＩの構造を有する脂質部分である。あるいは、脂質部分は、後述の式ＩＩＩａまたは式ＩＩＩｃを含む構造を含む。
【0049】
式ＩＩＩ：
式中、Ｌ１’、Ｌ１’’、Ｌ１’’’およびＬ１’’’’は、１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃを任意に含む、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選択され；
Ｘ１は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
式ＩＩＩは、任意に、それぞれが独立して、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から選択され、任意に１以上のシスもしくはトランスＣ＝Ｃまたはステロールを含み、少なくとも１つのＳであるＸ１結合を介してＬ１’、Ｌ１’’、Ｌ１’’’および／またはＬ’’’’の炭素原子に結合している１～１０の側鎖Ｓから構成される。
【化25】
Ｘ１は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、またはＣ（Ｒ１）＝ＮＯ－であり；
式ＩＩＩは、任意に、それぞれが独立して、１～３０個の原子を有する炭化水素鎖から選択され、任意に１以上のシスもしくはトランスＣ＝Ｃまたはステロールを含み、少なくとも１つのＳであるＸ１結合を介してＬ１’、Ｌ１’’、Ｌ１’’’および／またはＬ’’’’の炭素原子に結合している１～１０の側鎖Ｓから構成される。
【0050】
荷電脂質（例えば、イオン化可能な脂質）は、エナンチオマーの混合物であってもよいし、単一の光学異性体を含んでもよい。上述のように、Ｘ１基は生分解性であることができ、被験者への投与後に切断され得る。限定されるものではないが、エステル結合は、患者への投与後にエステラーゼによって加水分解され、それによって脂質から炭化水素鎖を遊離させることが可能である。酵素によって、またはｐＨ変化によって加水分解されることが可能な他の基も、同様に本開示に含まれる。しかしながら、Ｘ１基は、同様に非生分解性基であり得ることが理解されよう。
【0051】
一つの実施形態では、脂質は、生体適合性アルコールに可溶であり、それによって、送達担体への組み込みおよび核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンチゴミル、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡミミックまたは遺伝子編集物質などの共封入が容易となる。
【0052】
先頭基（Ａ）
脂質は、１つ以上の炭化水素鎖に共有結合した先頭基（本明細書では「Ａ」と表記する）を有するものとして便宜上表されることが多い。任意で、先頭基Ａは、リンカー領域によって炭化水素鎖に結合される。適切な先頭基およびリンカー領域は、以下の記載のとおりである。
一つの実施形態では、先頭基は、イオン化可能、恒久荷電、または双性イオンである部位から選択される。先頭基は、ｐＨ７．４（生理的ｐＨ）を含む特定のｐＨ値または範囲において、正または負の電荷を脂質に与えてもよい。これらの各カテゴリーに分類される置換基の例は、以下の通りである。
脂質は、１つ以上の炭化水素鎖に共有結合した先頭基（本明細書では「Ａ」と表記する）を有するものとして便宜上表されることが多い。任意で、先頭基Ａは、リンカー領域によって炭化水素鎖に結合される。適切な先頭基およびリンカー領域は、以下の記載のとおりである。
一つの実施形態では、先頭基は、イオン化可能、恒久荷電、または双性イオンである部位から選択される。先頭基は、ｐＨ７．４（生理的ｐＨ）を含む特定のｐＨ値または範囲において、正または負の電荷を脂質に与えてもよい。これらの各カテゴリーに分類される置換基の例は、以下の通りである。
【0053】
（ｉ）イオン化可能なカチオン性部分：
（ｉｉ）恒久的に荷電した部分：
（ｉｉｉ）イオン化可能なアニオン性部分：
または、
（ｉｖ）双極イオン性部分：
【化26】
【化27】
【化28】
（ｉｖ）双極イオン性部分：
【化29】
【0054】
通常、脂質の先頭基Ａは比較的小さく、生理的ｐＨで荷電する。非限定的な一つの実施形態では、かかる先頭基は、末端イオン化可能なアミン基からなるが、リン酸基や硫酸基などの基も本明細書では含まれる。別の実施形態では、先頭基は、イオン化可能な脂質に５～８の間の見かけのｐＫａ、またはイオン化可能な脂質に５．５～７．５のｐＫａを付与する末端イオン化可能なアミン基を有する。アミノ基のｐＫａは、先頭基内の隣接する原子の影響を受ける可能性があることが理解されよう。硫酸塩またはリン酸塩を含む先頭基は、脂質に全体的に負の電荷を付与することがある。
【0055】
アミン基は、一級、二級、三級アミン基のいずれであってもよい。先頭基は、例えば、同一または異なる２個または３個のアミノ基をさらに含んでいてもよい。
【0056】
一つの実施形態では、先頭基のアミン部分は、以下の式を有する。
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキルまたは複素環；ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つは不存在（孤立電子対）、または水素である。
【化30】
【0057】
先頭基が正に荷電しているこれらの実施形態では、この基が負の電荷を付与し、したがって電荷中性の脂質をもたらす可能性があるため、この基はリン酸基を有さない。しかしながら、脂質の全体的な電荷が生理的ｐＨにおいて正である場合には、そのような基が先頭基に含まれていてもよい。
【0058】
任意で、先頭基は、患者への脂質またはその製剤の投与後の血中滞留性を改善するポリマーを含む親水性ポリマーに共役される。このような親水性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
当業者には理解されるように、先頭基が荷電している場合、脂質は塩として存在し得る。薬学的に許容される塩が、本開示の範囲内に含まれる。
当業者には理解されるように、先頭基が荷電している場合、脂質は塩として存在し得る。薬学的に許容される塩が、本開示の範囲内に含まれる。
【0059】
任意のリンカー領域
イオン化可能なアミン基に加えて、脂質は、１、２または３つの脂質鎖（そのうちの少なくとも１つは足場炭素鎖である）に共有結合できる１または複数の電気陰性原子を有する領域を含んでいてもよい。脂質中のそのような領域は、リンカー領域、または単に「リンカー」と呼ぶことができ、炭化水素鎖が先頭基に直接連結されてもよいため、任意である。
リンカーの化学構造は、先頭基に結合する脂質鎖の数にもよるが、その構造内にエステル、エーテル、グリセリドリンカー、グリセリドリンカーの誘導体、または炭素原子もしくはヘテロ原子からなる多員環を含む環状リンカーを含むことができる。
イオン化可能なアミン基に加えて、脂質は、１、２または３つの脂質鎖（そのうちの少なくとも１つは足場炭素鎖である）に共有結合できる１または複数の電気陰性原子を有する領域を含んでいてもよい。脂質中のそのような領域は、リンカー領域、または単に「リンカー」と呼ぶことができ、炭化水素鎖が先頭基に直接連結されてもよいため、任意である。
リンカーの化学構造は、先頭基に結合する脂質鎖の数にもよるが、その構造内にエステル、エーテル、グリセリドリンカー、グリセリドリンカーの誘導体、または炭素原子もしくはヘテロ原子からなる多員環を含む環状リンカーを含むことができる。
【0060】
先頭基に結合するリンカー領域は、以下の式を有することができる。
式中、（Ｖ）ｍ－Ｚは、一端が先頭基Ａに、他端が炭化水素領域であるＬ１に結合したリンカー領域を表す。
式中の部分Ｚ－Ｌ１が一緒になって、上記の式ＩＩ、式ＩＩａまたは式ＩＩｂで表すことができる。
【化31】
式中の部分Ｚ－Ｌ１が一緒になって、上記の式ＩＩ、式ＩＩａまたは式ＩＩｂで表すことができる。
【0061】
任意で、リンカー領域は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの血中滞留性を向上させるポリマーを含む親水性ポリマーに結合する。
【0062】
当業者には理解されるように、ヘッドリンカー基の様々な異なる組み合わせが本開示によって包含される。リンカー領域は、そこに結合している炭化水素鎖の数によって特徴付けられることがある。あるいは、リンカーは、直鎖状、分枝状、または環状として記載されてもよい。 各カテゴリーの例は、以下に提供される。
【0063】
単一の炭化水素鎖を付着させるリンカー領域を有する先頭基の一例を以下に示すが、これらに限定されない。
【化32】
【0064】
２つの炭化水素鎖を結合するリンカー領域を有する先頭基の一例を以下に提供するが、これらに限定されない。
【化33】
【0065】
３つの炭化水素鎖を付着させるリンカー領域を有する先頭基の一例を以下に提供するが、これらに限定されない。
【化34】
【0066】
また、リンカー領域は、直鎖状、分岐状、環状と記載することもできる。直鎖状、分岐状、および環状のリンカー領域の例は、それぞれ、上記に記載された式ＩＩ、ＩＩａ、およびＩＩｂに記載されている。
【0067】
脂質部分Ｌ
脂質部分Ｌは、直接またはリンカー領域を介して先頭基に結合した炭化水素構造内に１、２または３つの炭化水素鎖を含むことができる。１つの炭化水素鎖のみが先頭基またはリンカー領域に結合しているそれらの実施形態において、追加の炭化水素側鎖Ｓは、Ｌ１の内部炭素に結合していてもよい。
したがって、少なくとも、１つの実施形態において、先頭基は、式ＩＩＩの構造を有する脂質部分であるＬ１と、またはリンカーを介して結合している。
脂質部分Ｌは、直接またはリンカー領域を介して先頭基に結合した炭化水素構造内に１、２または３つの炭化水素鎖を含むことができる。１つの炭化水素鎖のみが先頭基またはリンカー領域に結合しているそれらの実施形態において、追加の炭化水素側鎖Ｓは、Ｌ１の内部炭素に結合していてもよい。
したがって、少なくとも、１つの実施形態において、先頭基は、式ＩＩＩの構造を有する脂質部分であるＬ１と、またはリンカーを介して結合している。
【0068】
式ＩＩＩ：
式中、Ｌ１’、Ｌ１’’、Ｌ１’’’およびＬ１’’’’は、１～３０個の原子、または１～２０個の原子を有する炭化水素鎖から独立して選ばれ、任意に１以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃを含み；および
Ｘ１は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、または－Ｃ（Ｒ１）＝ＮＯ－である。
任意で、先頭基は、リンカーを介して、脂質部分であるＬ２、またはさらなるＬ３脂質部分をそこに結合していてもよい。任意のＬ２およびＬ３脂質部分は、それぞれ独立して、１～３０個の原子または１～２０個の原子を有する炭化水素鎖、１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃを含んでいてもよく、またはステロールから選択することができる。Ｌ２および／またはＬ３は、下記式ＩＩＩａの脂質であってもよい。
【化35】
Ｘ１は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、－ＮＲ１－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）－、－Ｎ（Ｒ１）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ－Ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｎ＝Ｃ（Ｒ１）、－ＯＮ＝Ｃ（Ｒ１）、または－Ｃ（Ｒ１）＝ＮＯ－である。
任意で、先頭基は、リンカーを介して、脂質部分であるＬ２、またはさらなるＬ３脂質部分をそこに結合していてもよい。任意のＬ２およびＬ３脂質部分は、それぞれ独立して、１～３０個の原子または１～２０個の原子を有する炭化水素鎖、１つ以上のシスまたはトランスＣ＝Ｃを含んでいてもよく、またはステロールから選択することができる。Ｌ２および／またはＬ３は、下記式ＩＩＩａの脂質であってもよい。
【0069】
式ＩＩＩａ：
式中、Ｌｎ’はリンカーに共有結合している。
式ＩＩＩａの命名法によれば、ＬがＬ２であるときｎは２であり、ＬがＬ３であるときｎは３である。例えば、Ｌ２炭化水素の場合、式ＩＩＩａは、以下の命名法を採用する。
【化36】
式ＩＩＩａの命名法によれば、ＬがＬ２であるときｎは２であり、ＬがＬ３であるときｎは３である。例えば、Ｌ２炭化水素の場合、式ＩＩＩａは、以下の命名法を採用する。
【0070】
【化37】
【0071】
例えば、Ｌ１は、Ｘ１結合を介してＬ１’、Ｌ１’’’またはＬ１’’’’のいずれか１つに結合した側鎖Ｓ１’を有していてもよい。追加の側鎖Ｓ１’’、Ｓ１’’’またはＳ１’’’’は、Ｌ１または任意のＳ１側鎖の炭素に結合していてもよい。さらなる例において、Ｌ２が上記式ＩＩＩａの構造を有する場合、Ｌ２は、Ｌ２’、Ｌ２’’’またはＬ２’’’’のいずれか１つに結合した側鎖Ｓ２’を有していてもよい。追加の側鎖Ｓ２’’、Ｓ２’’’およびＳ２’’’’は、Ｌ２の炭素または任意のＳ２側鎖に結合していてもよい。同様に、Ｌ３が存在し、上記の式ＩＩＩａを有する場合、Ｌ３’、Ｌ３’’’またはＬ３’’’’のいずれか１つに結合した側鎖Ｓ３’を有していてもよい。追加の側鎖Ｓ３’’、Ｓ３’’’およびＳ３’’’’は、Ｌ３または任意のＳ３側鎖の炭素に結合していてもよい。
【0072】
本開示によって包含される構造を有する脂質の例は、表１（下記）に描かれている。表１に示される構造Ａ～Ｆは、追加のＳ炭化水素鎖への足場付着点を提供するＸ１分岐点を有する単一の炭化水素に付着したリンカーを有する先頭基を含む。表１に示される構造Ｇ～Ｊは、２つの炭化水素、Ｌ１およびＬ２を結合するリンカーを有する先頭基を含む。構造Ｋ～Ｍとして描かれた脂質は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の３つの炭化水素への結合点を持つリンカーを有する。
【0073】
以下の注釈付き構造Ａは、Ｌ１のＸ１結合および疎水性領域を描写するために本明細書の式ＩＩＩで使用される規則を例示している。Ｘ１の存在は、構造中の他のＸ１から独立して選択されることが理解されよう。説明したように、Ｘ１基は、電気陰性原子を有する任意の適切な官能基を含む。
示された例は、Ｌ１の炭素に結合した側鎖Ｓを有する上記式ＩＩＩによる単一のＬ１脂質炭化水素鎖（Ｌ１’、Ｌ１’’、およびＬ１’’’）を有するアミノ脂質である。
示された例は、Ｌ１の炭素に結合した側鎖Ｓを有する上記式ＩＩＩによる単一のＬ１脂質炭化水素鎖（Ｌ１’、Ｌ１’’、およびＬ１’’’）を有するアミノ脂質である。
【0074】
構造Ａ（ＩＮＴ－Ａ００１）：
上記の構造Ａ（ＩＮＴ－Ａ００１）に見られるように、Ｌ１’、Ｌ１’’およびＬ１’’’は一緒になって、ジヒドロキシ脂質に由来する直鎖炭化水素骨格（本明細書では「足場炭素鎖」と呼ぶ）を形成している。この炭化水素鎖Ｌ１’－Ｌ１’’－Ｌ１’’’は、Ｘ１結合を介してＬ１’－Ｌ１’’－Ｌ１’’’のＬ１’’炭素に結合し、第２のＳ「側鎖」炭化水素鎖が第２のＸ１結合を介してＬ１’’’’に結合する。この構造では、Ｘ１結合は両方ともエステル基である。しかしながら、上述のように、Ｘ１官能基は、Ｏ、Ｎ、Ｐおよび／またはＳ原子を含む様々な官能基から独立して選択することができる。
【化38】
【0075】
１、２または３つの炭化水素鎖に結合する先頭基内のリンカー領域を有する脂質の例を、以下の表１に示す。示された各脂質について、式ＩＩＩのＬ１の置換基Ｌ１’／Ｌ’’／Ｌ’’’／Ｌ’’’’が提供され、さらにＬ２およびＬ３炭化水素鎖が提供されていてもよい。また、式ＩＩａまたはＩＩｂによって定義される先頭基およびリンカー領域の構造も提供される。それぞれの場合において、Ｘ１基は、炭化水素鎖を互いに連結して、相互連結した炭化水素格子構造を形成するエステルである。以下の構造から分かるように、Ｌの相互接続された炭化水素構造は、一般的にフレア状または円錐台状の形状を形成する。
【0076】
表１：フレア状炭化水素構造を形成する１、２または３つの炭化水素鎖Ｌ１、Ｌ２およびＬ３に結合したリンカー領域を有する選択的アミノ脂質
【表1】
【0077】
脂質部分を説明するための代わりとなる構造は、式ＩＩＩｃである：
式ＩＩＩｃ：
式中、Ｌ骨格は、Ｌ１’－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－［ＣＨ２］ｑ－ＣＨ３で表され、Ｌ骨格の総炭素原子数は１０～３０であり；
Ｌ１’は、直鎖炭化水素鎖であり、２～２０、３～２０、４～２０、５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、５～１２、５～１０、５～９、６～１２、６～１０、６～９、７～１２、７～１０、または７～９個の炭素原子と０～３個のシスまたはトランス二重結合を有するものであり；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
Ｌ１’’’は、Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３で表され；
Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは０～４であり；
ｐは１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～６または１～４であり；
ｑは、０～２０または０～１０または１～５であり；
各Ｘ１は、上記の任意の適切なＸ１基であるか、または独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
各ＳおよびＬ１’’’’炭化水素側鎖は、独立して：
（ｃ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび１～３０個または２～１８個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子でそれぞれのＸ１の１つに結合する直鎖または分岐した終止炭化水素鎖；または
（ｄ）式ＩＩＩｃの分岐構造であり、
式中、式ＩＩＩｃにおけるＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の合計数は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４または１～３個であり、
ここで、脂質部分におけるＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖のそれぞれは、ヘテロ原子で置換されていてもよく、ただし、炭化水素鎖に置換されているヘテロ原子は４、３または２個以下である。
式ＩＩＩｃ：
【化39】
Ｌ１’は、直鎖炭化水素鎖であり、２～２０、３～２０、４～２０、５～２０、６～２０、７～２０、８～２０、５～１２、５～１０、５～９、６～１２、６～１０、６～９、７～１２、７～１０、または７～９個の炭素原子と０～３個のシスまたはトランス二重結合を有するものであり；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
Ｌ１’’’は、Ｇ１－ＣＨ－ＣＨ２－ＣＨ３で表され；
Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは０～４であり；
ｐは１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～６または１～４であり；
ｑは、０～２０または０～１０または１～５であり；
各Ｘ１は、上記の任意の適切なＸ１基であるか、または独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
各ＳおよびＬ１’’’’炭化水素側鎖は、独立して：
（ｃ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび１～３０個または２～１８個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子でそれぞれのＸ１の１つに結合する直鎖または分岐した終止炭化水素鎖；または
（ｄ）式ＩＩＩｃの分岐構造であり、
式中、式ＩＩＩｃにおけるＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の合計数は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４または１～３個であり、
ここで、脂質部分におけるＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖のそれぞれは、ヘテロ原子で置換されていてもよく、ただし、炭化水素鎖に置換されているヘテロ原子は４、３または２個以下である。
【0078】
Ｘ１エステル基は、以下に例示するように、カルボニル基の位置に対してどのような向きであってもよい。
一つの実施形態では、式ＩＩＩｃの炭素原子の総数は、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０または５０個を超えない。
別の実施形態では、式ＩＩＩｃの構造は、先頭基またはリンカー領域に隣接する領域から炭化水素構造上の遠位炭素原子まで決定されるように、非円錐形またはフレア状である。前述のように、このような構造は、脂質が送達担体中に配合される場合、カーゴ分子の送達を容易にする。
【化40】
別の実施形態では、式ＩＩＩｃの構造は、先頭基またはリンカー領域に隣接する領域から炭化水素構造上の遠位炭素原子まで決定されるように、非円錐形またはフレア状である。前述のように、このような構造は、脂質が送達担体中に配合される場合、カーゴ分子の送達を容易にする。
【0079】
足場炭素鎖
一つの実施形態では、足場機能を提供するＬ１、Ｌ２および／またはＬ３脂質部分の骨格炭化水素鎖は、側鎖Ｓに連結するための官能基を有する脂肪酸に由来する。これは、Ｏ、Ｎ、Ｐおよび／またはＳから選ばれる原子を有する基で置換された脂肪酸を含む。このような基により、側鎖と足場を構成するＬ１、Ｌ２および／またはＬ３の骨格炭素の結合を容易にする。
一つの実施形態では、足場機能を提供するＬ１、Ｌ２および／またはＬ３脂質部分の骨格炭化水素鎖は、側鎖Ｓに連結するための官能基を有する脂肪酸に由来する。これは、Ｏ、Ｎ、Ｐおよび／またはＳから選ばれる原子を有する基で置換された脂肪酸を含む。このような基により、側鎖と足場を構成するＬ１、Ｌ２および／またはＬ３の骨格炭素の結合を容易にする。
【0080】
例えば、Ｌ１、Ｌ２および／またはＬ３は、炭素鎖上の任意の位置に結合したヒドロキシ基を有する脂肪酸であるヒドロキシ脂肪酸（ＨＦＡ）から由来してもよい。ＨＦＡは、β－ヒドロキシ脂肪、ω－ヒドロキシ脂肪酸、もしくは任意の（ω－１）－ヒドロキシ脂肪酸、または炭素骨格の内部炭素に反応性官能基を有する他の任意のＨＦＡであってもよいが、これらに限定されない。ＨＦＡは飽和でも不飽和でもよい。２つ以上のヒドロキシ官能基が炭素鎖上にも存在することができる。
【0081】
あるいは、Ｌ１、Ｌ２および／またはＬ３は、ヒドロキシル脂肪酸の脂肪酸エステル（ＦＡＨＦＡ）として当該技術分野で知られているＨＦＡの分岐脂肪酸エステルに由来する。これらの脂肪酸エステルは、脂肪酸とＨＦＡとの間の分岐エステル結合を含んでなる。例えば、９－［（９Ｚ）－オクタデセノイルオキシ］オクタデカン酸は、オレイン酸のカルボキシ基と９－ヒドロキシオクタデカン酸のヒドロキシ基との縮合によって得られる脂肪酸エステルである。
【0082】
代替的な実施形態では、Ｌ１、Ｌ２および／またはＬ３は、脂肪酸アミドに由来し、これは、アミン成分としてエタノールアミンから構成されてもよい。さらに、Ｌ１、Ｌ２および／またはＬ３は、脂肪酸アミンに由来してもよい。
【0083】
式ＩＩＩの足場炭素鎖は、上記以外の他の脂肪酸に由来してもよい。加えて、脂肪酸は、順番に、それらの対応するトリグリセリドに由来され得ることが理解される。
式ＩＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂにおいて、Ｌ１’、Ｌ１’’およびＬ１’’’は一緒になって直鎖状炭化水素骨格（本明細書では「足場炭素鎖」という）を形成している。上記式ＩＩＩｃによれば、足場炭素鎖は、Ｌ１’－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－［ＣＨ２］ｑ－ＣＨ３で示され、足場中の炭素原子の総数が１０～３０個である。
式ＩＩＩ、ＩＩＩａおよびＩＩＩｂにおいて、Ｌ１’、Ｌ１’’およびＬ１’’’は一緒になって直鎖状炭化水素骨格（本明細書では「足場炭素鎖」という）を形成している。上記式ＩＩＩｃによれば、足場炭素鎖は、Ｌ１’－Ｌ１’’－Ｇ１－ＣＨ－［ＣＨ２］ｑ－ＣＨ３で示され、足場中の炭素原子の総数が１０～３０個である。
【0084】
製剤
カチオン性またはイオン化可能な脂質は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンタゴマー、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびｍｉＲＮＡミミック、および／または遺伝子編集材料などの核酸を容易にカプセル化することができる。代替的または追加的に、負に荷電しているタンパク質およびアミノ酸を送達担体に組み込むことができる。
カチオン性またはイオン化可能な脂質は、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンタゴマー、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびｍｉＲＮＡミミック、および／または遺伝子編集材料などの核酸を容易にカプセル化することができる。代替的または追加的に、負に荷電しているタンパク質およびアミノ酸を送達担体に組み込むことができる。
【0085】
本明細書に記載される荷電脂質は、核酸以外の他の荷電分子を送達するために使用されてもよい。これには、生物活性剤およびプロドラッグの両方を含む、多種多様な正または負に荷電したペプチド、タンパク質、多糖類または炭水化物が含まれ、以下に記載のものが例示される。
【0086】
本明細書に記載されたカチオン性またはイオン化可能な脂質は、核酸または他の負または正に荷電したカーゴ分子と共にフリー体で投与することができ、またはこれらの成分を送達担体に組み込むことができる。医薬製剤を調製するために、様々な送達システムを使用することができる。荷電脂質および関連する荷電分子がフリー体である場合、薬学的に許容される塩または賦形剤を医薬製剤に含有させることができる。
【0087】
本開示の脂質は、本明細書において「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」と呼ばれる、脂質または他の疎水性成分を含むリポソームまたはポリマーベースシステムなどのナノ粒子への組み込みに特に適合する。
例えば、いくつかの実施形態において、所定の脂質ナノ粒子への装填効率は、６０％～１００％、７０％～１００％、または最も有利には８０％～１００％である。
例えば、いくつかの実施形態において、所定の脂質ナノ粒子への装填効率は、６０％～１００％、７０％～１００％、または最も有利には８０％～１００％である。
【0088】
一つの実施形態では、脂質は、ベシクル形成脂質および任意にステロールを含む脂質製剤成分と混合することによって、リポソームなどの脂質ナノ粒子に担持される。その結果、イオン化可能またはカチオン性脂質を組み込んだ脂質ナノ粒子は、押出成形、エタノール注入およびインライン混合を含むがこれらに限定されない、よく報告されており、当業者に周知の多種多様な製剤方法論を使用して調製することができる。そのような方法は、次のような論文に記載されている。Ｍａｃｌａｃｈｌａｎ， Ｉ． ａｎｄ Ｐ． Ｃｕｌｌｉｓ， “Ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅ－ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”， Ａｄｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２００５． ５３ＰＡ：１５７－１８８、Ｊｅｆｆｓ， Ｌ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， “Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ， Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ”， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ， ２００５， ２２（３）：３６２－７２、およびＬｅｕｎｇ， Ａ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍｉｘｉｎｇ Ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｄｅｎｓｅ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｃｏｒｅ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｃ， Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ， ２０１２， １１６（３４）： １８４４０－１８４５０、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0089】
荷電脂質以外に脂質ナノ粒子に含まれ得る脂質成分としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド等のベシクル形成脂質が挙げられる。また、相転移温度を広げるために、ＬＮＰにコレステロールを含有させてもよい。また、ＬＮＰは、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧなどの親水性ポリマーと共役した脂質を含んでもよい。親水性ポリマーなどの表面安定化官能基は、投与後のナノ粒子のクリアランスを減少させるために望ましい場合がある。ＬＮＰ製剤は、エンドサイトーシスを介した送達担体と標的細胞との融合を促進する融合性脂質も含んでもよい。
【0090】
好適なＬＮＰとしては、公知の方法による押出しによって調製されたリポソーム、または多層状小胞（ＭＬＶ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームの内部空間は、薬物などの内包された薬剤を含んでいてもよく、二層または二重層は、その中に分割されたそのような薬剤を含んでいてもよい。
好適なＬＮＰ送達システムの別の例は、ＳＮＡＬＰという安定な核酸－脂質粒子である。 ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および任意の親水性ポリマー－脂質コンジュゲート、例えばＰＥＧ化脂質および膜融合脂質を伴う核酸を含んでよい。
好適なＬＮＰ送達システムの別の例は、ＳＮＡＬＰという安定な核酸－脂質粒子である。 ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および任意の親水性ポリマー－脂質コンジュゲート、例えばＰＥＧ化脂質および膜融合脂質を伴う核酸を含んでよい。
【0091】
脂質ナノ粒子は、親油性コアから構成されてもよい。例えば、送達担体は、界面活性剤によって安定化された脂質コアからなるナノ粒子であることもできる。ベシクル形成脂質は、安定化剤として利用され得る。別の実施形態における脂質ナノ粒子は、安定化脂質によって囲まれたポリマーナノ粒子コアからなるポリマー－脂質ハイブリッド系である。
ナノ粒子は、代替的に脂質を含まないポリマーから調製することもできる。このようなナノ粒子は、ポリマーシェルに囲まれた薬剤の濃縮コアからなるか、またはポリマーマトリックス中に分散された固体または液体を有していてもよい。
ナノ粒子は、代替的に脂質を含まないポリマーから調製することもできる。このようなナノ粒子は、ポリマーシェルに囲まれた薬剤の濃縮コアからなるか、またはポリマーマトリックス中に分散された固体または液体を有していてもよい。
【0092】
本明細書に記載された脂質は、油滴またはオイルコアを含む薬物送達担体であるエマルションに組み込むこともできる。エマルションは、脂質で安定化することができる。例えば、エマルションは、脂質の単層または二層などの乳化成分によって安定化された油で満たされたコアから構成されることができる。
本明細書で提供される脂質は、ミセルに配合することも可能である。ミセルは、両親媒性脂質またはポリマー成分からなる自己組織化粒子であり、疎水性コアに存在する薬剤の送達のために利用される。
本明細書で提供される脂質は、ミセルに配合することも可能である。ミセルは、両親媒性脂質またはポリマー成分からなる自己組織化粒子であり、疎水性コアに存在する薬剤の送達のために利用される。
【0093】
荷電脂質を配合することができる当業者に既知の薬物送達担体のさらなる部類は、カーボンナノチューブである。
前述の送達担体の調製およびそこに荷電脂質を組み込むための様々な方法が知られており、当業者によって容易に実施することができる。
前述の送達担体の調製およびそこに荷電脂質を組み込むための様々な方法が知られており、当業者によって容易に実施することができる。
【0094】
本開示によって包含されるある種の脂質は、キャリアを含まない系の一部を形成してもよい。そのような実施形態では、負に荷電した分子に関連する脂質は、粒子に自己集合し得る。例としては、ＤＮＡとカチオン性脂質との間の会合であるリポプレックスの形成が挙げられる。そのような製剤は、任意に、薬学的に許容される塩および／または賦形剤を含み得る。
カチオン性またはイオン化可能な脂質を組み込んだ送達担体は、プロドラッグを含む抗癌剤または他の治療剤など、担体に組み込まれた活性剤を含むこともできる。
送達担体は、任意に、アポリポタンパク質などのリポタンパク質を含んでもよい。
カチオン性またはイオン化可能な脂質を組み込んだ送達担体は、プロドラッグを含む抗癌剤または他の治療剤など、担体に組み込まれた活性剤を含むこともできる。
送達担体は、任意に、アポリポタンパク質などのリポタンパク質を含んでもよい。
【0095】
核酸、遺伝物質、タンパク質、ペプチド、その他の荷電粒子の送達
上述したように、本明細書に開示される荷電脂質は、正味の負または正の電荷を有する分子（本明細書では「カーゴ」または「カーゴ分子」とも呼ばれる）の送達担体への組み込みと、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける標的細胞への送達を容易にする。
上述したように、本明細書に開示される荷電脂質は、正味の負または正の電荷を有する分子（本明細書では「カーゴ」または「カーゴ分子」とも呼ばれる）の送達担体への組み込みと、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける標的細胞への送達を容易にする。
【0096】
一つの実施形態では、分子は、核酸などの遺伝物質である。核酸は、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡもしくは直鎖ＤＮＡなどのＤＮＡを含む。核酸の長さは様々であり、５～５０，０００ヌクレオチドの長さの核酸を含むことができる。核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドなど、任意の形態であり得る。一本鎖核酸には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
特に有利な一つの実施形態では、カーゴはｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、内因性細胞機構に取り込まれてｍＲＮＡの分解をもたらし、それによって転写を阻止する。ＲＮＡは容易に分解されるので、送達担体に取り込まれると、そのような分解を低減または防止することができ、それによって標的部位への送達を容易にすることができる。
特に有利な一つの実施形態では、カーゴはｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、内因性細胞機構に取り込まれてｍＲＮＡの分解をもたらし、それによって転写を阻止する。ＲＮＡは容易に分解されるので、送達担体に取り込まれると、そのような分解を低減または防止することができ、それによって標的部位への送達を容易にすることができる。
【0097】
また、遺伝子編集システムを荷電脂質からなる送達担体に組み込むことも可能である。これには、Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集系が含まれる。Ｃａｓ９－ＣＲＩＳＰＲの場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、Ｃａｓ９タンパク質をコードするプラスミドまたはｍＲＮＡと共に、本明細書に記載のカチオン性脂質を含む送達担体に組み込んでもよい。任意で、リボ核タンパク質複合体が、本明細書に記載されるカチオン性脂質を含む送達担体に組み込まれてもよい。同様に、本開示は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮシステムのＤＮＡ結合および切断ドメインをコードする遺伝物質が、イオン化可能またはカチオン性脂質と共に送達担体に組み入れられる実施形態を含む。
【0098】
荷電した脂質は、全体的に荷電したタンパク質やペプチドを送達媒体に取り込むことも容易にすることができる。 これには、直鎖状または非直鎖状ペプチドの両方が含まれる。ペプチドの例としては、細菌／抗生物質ペプチド、真菌ペプチド、無脊椎動物ペプチド、両生類／皮膚ペプチド、毒ペプチド、癌／抗癌剤ペプチド、ワクチンペプチド、免疫／抗炎症ペプチド、脳内ペプチド、内分泌ペプチド、摂食ペプチド、消化管ペプチド、心血管ペプチド、腎臓ペプチド、呼吸ペプチド、アヘンペプチド、神経栄養ペプチド、血液脳ペプチドがある。ペプチドの具体的な例は、上記で提供されている。
【0099】
本明細書に記載の荷電脂質と関連し得るペプチドの特定の例は、インターフェロンおよび他のマクロファージ活性化因子である。これには、リンホカイン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、γ－インターフェロン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、および関連の抗ウイルス剤および殺腫瘍剤；オピオイドペプチドおよび神経ペプチド、これにはエンカファリン、エンドルフィンおよびダイノルフィン、および他の鎮痛剤；例えば降圧剤を含むレニン阻害剤；例えばＣＣＫ、セルレチド、エレドイシンのようなコレシストキニン（ＣＣＫアナログ）、および関連する心血管標的薬およびＣＮＳ標的薬；オキシトシンなどのロイコトリエンおよびプロスタグランジン、ならびに抗炎症、オキシトシドおよび堕胎化合物；エリスロポエチンおよびその誘導体ならびに関連する造血剤；リュープロリド、ブセレリンおよびナファレリンなどのＬＨＲＨアナログならびに関連する下垂体受容体のダウンレギュレーター；副甲状腺ホルモンおよび他の成長ホルモンアナログ；Ｄｎａｓｅ、カタラーゼおよびα－Ｉアンチトリプシンなどの酵素；シクロスポリンなどの免疫抑制剤；ＧＭ－ＣＳＦおよび他の免疫調節剤；およびインスリンが含まれる。
【0100】
投与
特定の実施形態では、遊離または薬物送達担体中に製剤化された、核酸または他の荷電分子に関連する荷電脂質は、患者の状態を治療、予防および／または改善するために投与される。特に、核酸または他の荷電物質と一緒に遊離形態または送達担体中に処方された荷電脂質は、予防、改善または治療の利益を提供し得る。荷電した脂質を含む医薬組成物は、任意の適切な用量で投与される。一つの実施形態では、薬物送達担体中に遊離または製剤化されている脂質は、親側、すなわち、動脈内、静脈内、皮下または筋肉内投与される。他の実施形態では、本明細書に記載される送達担体において遊離形態または製剤化された脂質は、局所的に投与されてもよい。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の遊離形態の脂質または送達担体中に製剤化された脂質は、経口投与されてもよい。さらにさらなる実施形態では、遊離形態の脂質または送達担体中に製剤化された脂質は、エアロゾルまたは粉末分散による肺投与用である。
特定の実施形態では、遊離または薬物送達担体中に製剤化された、核酸または他の荷電分子に関連する荷電脂質は、患者の状態を治療、予防および／または改善するために投与される。特に、核酸または他の荷電物質と一緒に遊離形態または送達担体中に処方された荷電脂質は、予防、改善または治療の利益を提供し得る。荷電した脂質を含む医薬組成物は、任意の適切な用量で投与される。一つの実施形態では、薬物送達担体中に遊離または製剤化されている脂質は、親側、すなわち、動脈内、静脈内、皮下または筋肉内投与される。他の実施形態では、本明細書に記載される送達担体において遊離形態または製剤化された脂質は、局所的に投与されてもよい。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の遊離形態の脂質または送達担体中に製剤化された脂質は、経口投与されてもよい。さらにさらなる実施形態では、遊離形態の脂質または送達担体中に製剤化された脂質は、エアロゾルまたは粉末分散による肺投与用である。
【0101】
本明細書に記載される組成物は、本明細書で使用されるようにヒトまたは非ヒト対象を含む「患者」を含む任意の対象に投与することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の脂質は、患者から得られた幹細胞および培養細胞を含む細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションに使用される。一つの実施形態では、トランスフェクションされた細胞は幹細胞であり、それらを採取元の患者に投与されて戻される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の脂質は、患者から得られた幹細胞および培養細胞を含む細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションに使用される。一つの実施形態では、トランスフェクションされた細胞は幹細胞であり、それらを採取元の患者に投与されて戻される。
【0102】
以下の実施例は、説明のためにのみ示され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0103】
材料および方法
実施例１に記載の有機合成反応について、特に明記しない限り、ＴＨＦ（窒素下でＮａ／ベンゾフェノンから新たに蒸留）、およびＥｔ３Ｎ、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２（窒素下でＣａＨ２から新たに蒸留した）を除き、すべての試薬および溶媒は市販のものを購入し、さらに精製せずに使用した。ＵＳＰグレードのヒマシ油を地元の薬局（Ｌｉｆｅ Ｂｒａｎｄ）で購入し、そのままの状態で使用した。ＮＭＲ化学シフトはδスケールで百万分率（ｐｐｍ）で表され、結合定数Ｊはヘルツ（Ｈｚ）で表される。スペクトルは残留溶媒のシグナルを基準としている。多重度は、「ｓ」（シングレット）、「ｄ」（ダブレット）、「ｔ」（トリプレット）、「ｑ」（カルテット）、「ｑｕｉｎｔ」（クインテット）、「ｓｅｐｔ」（セプテット）、「ｍ」（マルチプレット）と表し、さらに「ａｐｐ」（アパレント）と「ｂｒ」（ブロード）としている。
実施例１に記載の有機合成反応について、特に明記しない限り、ＴＨＦ（窒素下でＮａ／ベンゾフェノンから新たに蒸留）、およびＥｔ３Ｎ、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２（窒素下でＣａＨ２から新たに蒸留した）を除き、すべての試薬および溶媒は市販のものを購入し、さらに精製せずに使用した。ＵＳＰグレードのヒマシ油を地元の薬局（Ｌｉｆｅ Ｂｒａｎｄ）で購入し、そのままの状態で使用した。ＮＭＲ化学シフトはδスケールで百万分率（ｐｐｍ）で表され、結合定数Ｊはヘルツ（Ｈｚ）で表される。スペクトルは残留溶媒のシグナルを基準としている。多重度は、「ｓ」（シングレット）、「ｄ」（ダブレット）、「ｔ」（トリプレット）、「ｑ」（カルテット）、「ｑｕｉｎｔ」（クインテット）、「ｓｅｐｔ」（セプテット）、「ｍ」（マルチプレット）と表し、さらに「ａｐｐ」（アパレント）と「ｂｒ」（ブロード）としている。
【0104】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ステロール、コレステロール同様、中性脂質である１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ－ＤＭＰＥ）を用いて調製した。ＤＳＰＣおよびＰＥＧ－ＤＭＰＥはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバスター、ＡＬ）から購入し、コレステロールはＳｉｇｍａ（セントルイス， ＭＯ）から入手した。
【0105】
ＬＮＰの特性は、粒子径と多分散性（ＰｄＩ）の測定することにより評価した。粒子径と多分散性は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（モルバーン、ＵＫ）を用いた動的光散乱によって測定した。ＬＮＰはＰＢＳで適切な濃度に希釈した。数－重量のサイズおよび分布データが決定に使用され、ＰｄＩ＞０．１５の製剤はそれ以上の研究に使用されなかった。
脂質濃度は、和光化学ＵＳＡ（リッチモンド、ＶＡ）のコレステロールＥ酵素アッセイキットを使用して総コレステロールを測定することにより決定した。
脂質濃度は、和光化学ＵＳＡ（リッチモンド、ＶＡ）のコレステロールＥ酵素アッセイキットを使用して総コレステロールを測定することにより決定した。
【0106】
ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのカプセル化効率は、それぞれＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡまたはＯｌｉｇｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙｓ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バーリントン、ＯＮ）を用いて測定した。簡単に説明すると、ＬＮＰを１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）の存在下または非存在下で３７℃、１０分間インキュベートし、続いてリボグリーン試薬またはオリグリーン試薬を添加した。蛍光強度（Ｅｘ／Ｅｍ：４８０／５２０ｎｍ）を測定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理したサンプルは全核酸を、未処理のサンプルはカプセル化されていない核酸を表す。
タンパク質／ペプチドの定量は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ） またはＣＢＱＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。
タンパク質／ペプチドの定量は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ） またはＣＢＱＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。
【0107】
ＬＮＰシステムの見かけの酸解離定数（ｐＫａ）は、文献に記載された手順に従って決定した（Ｊａｙａｒａｍａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， ２０１２． ５１（３４）： ｐ．８５２９－３３）。簡潔には、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）およびＬＮＰをｐＨ２．５～１１の範囲の緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭＥＳおよび１０ｍＭ酢酸アンモニウム）中で希釈した。ＴＮＳまたは全脂質の最終濃度は６μＭであった。次に、サンプルを混合し、蛍光強度をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５５を使用して測定した（Ｅｘ／Ｅｍ：３２１／４４５ｎｍ）。シグモイドベストフィット分析を適用し、蛍光強度が半値となるｐＨをｐＫａとして測定した。
【0108】
実施例1：イオン化可能な脂質の合成
【化41】
【0109】
一般手順Ａ － ヒドロキシ脂肪酸のエステル化
コンデンサーの付いた丸底フラスコに水酸化脂肪酸（１．００等量）をＭｅＯＨ（０．４～０．５Ｍ）に懸濁させた。濃硫酸（０．０５等量）を上記混合物に加え、得られたものを還流で加熱し、５～１５分で均質となった。１６時間後、残留ＭｅＯＨをロータリーエバポレーターで除去し、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）と飽和水性ＮａＨＣＯ３との間で分配した。 水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機層を水で１回、生理食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、重力濾過し、ロータリーエバポレーター上で濃縮して白色粉末を得、これをさらに精製することなく使用した。
コンデンサーの付いた丸底フラスコに水酸化脂肪酸（１．００等量）をＭｅＯＨ（０．４～０．５Ｍ）に懸濁させた。濃硫酸（０．０５等量）を上記混合物に加え、得られたものを還流で加熱し、５～１５分で均質となった。１６時間後、残留ＭｅＯＨをロータリーエバポレーターで除去し、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）と飽和水性ＮａＨＣＯ３との間で分配した。 水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機層を水で１回、生理食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、重力濾過し、ロータリーエバポレーター上で濃縮して白色粉末を得、これをさらに精製することなく使用した。
【0110】
一般手順Ｂ － ヒドロキシ脂肪酸エステルのアシル化反応
Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；ヒドロキシル当たり１．００等量 ＋追加の０．１０等量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の目的のカルボン酸（ヒドロキシル当たり１．００等量＋追加の０．１０等量）の氷冷ＣＨ２Ｃｌ２（０．３Ｍ）溶液に添加した。その後、氷浴を除去し、得られた混合物を１５分間攪拌した。反応混合物を再び氷浴で冷却し、固体ヒドロキシ脂肪酸（１．００等量）をそこに添加し、続いて４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；ヒドロキシル当たり１．００等量＋追加の０．５０等量）を添加した。反応混合物を１６時間かけて室温まで温め、ヘキサンで希釈し、１０分間撹拌し、その後セライト（登録商標）のパッドで濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して粗混合物を得、そこから所望のアシル化物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；ヒドロキシル当たり１．００等量 ＋追加の０．１０等量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中の目的のカルボン酸（ヒドロキシル当たり１．００等量＋追加の０．１０等量）の氷冷ＣＨ２Ｃｌ２（０．３Ｍ）溶液に添加した。その後、氷浴を除去し、得られた混合物を１５分間攪拌した。反応混合物を再び氷浴で冷却し、固体ヒドロキシ脂肪酸（１．００等量）をそこに添加し、続いて４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；ヒドロキシル当たり１．００等量＋追加の０．５０等量）を添加した。反応混合物を１６時間かけて室温まで温め、ヘキサンで希釈し、１０分間撹拌し、その後セライト（登録商標）のパッドで濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して粗混合物を得、そこから所望のアシル化物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
【0111】
一般手順Ｃ － ペラシル化脂肪酸メチルエステルのケン化反応
アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中のアシル化脂肪酸メチルエステル（１．１０等量）の室温ｔ－ＢｕＯＨ（０．３Ｍ）溶液に水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、１．００等量）を添加し、アシル化脂肪酸メチルエステルを合成した。１６時間撹拌後、反応混合物に塩酸水溶液（２．０Ｍ）を加えてｐＨ≦２に酸性化し、ヘキサンで３回抽出した。合わせた有機抽出物を生理食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗製物を無色オイルとして得た。この粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、所望の脂肪酸を得た。
アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中のアシル化脂肪酸メチルエステル（１．１０等量）の室温ｔ－ＢｕＯＨ（０．３Ｍ）溶液に水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、１．００等量）を添加し、アシル化脂肪酸メチルエステルを合成した。１６時間撹拌後、反応混合物に塩酸水溶液（２．０Ｍ）を加えてｐＨ≦２に酸性化し、ヘキサンで３回抽出した。合わせた有機抽出物を生理食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗製物を無色オイルとして得た。この粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、所望の脂肪酸を得た。
【0112】
一般的手順Ｄ － ペラシル化脂肪酸のアミノアルコールによるエステル化
アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中の脂肪酸（１．００等量）の氷冷ＣＨ２Ｃｌ２（０．２ Ｍ）溶液に、ＤＣＣ（１．１０等量）を添加した。氷浴を除去し、得られたものを１５分間攪拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、純粋なアミノアルコール（１．２０～２．００等量）を加え、続いてＤＭＡＰ（１．２０等量）を加え、反応混合物を１６時間かけて室温に温めた。 濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して粗オイルを得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、所望のペラシル化アミノ脂質を得た。
アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中の脂肪酸（１．００等量）の氷冷ＣＨ２Ｃｌ２（０．２ Ｍ）溶液に、ＤＣＣ（１．１０等量）を添加した。氷浴を除去し、得られたものを１５分間攪拌した。反応混合物を氷浴で再び冷却し、純粋なアミノアルコール（１．２０～２．００等量）を加え、続いてＤＭＡＰ（１．２０等量）を加え、反応混合物を１６時間かけて室温に温めた。 濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して粗オイルを得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、所望のペラシル化アミノ脂質を得た。
【0113】
【化42】
一般的手順Ｂに従って、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のリシノレイン酸メチル（５００ｍｇ、 １．６０ｍｍｏｌ）、リノール酸（５３８ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ、１．２０等量）、ＤＣＣ（３９６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、２．２０等量）およびＤＭＡＰ（２９３ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、１．５０等量）により、無色透明油として表記化合物を得た（８７５ｍｇ、収率９３％）。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．５５－５．２８（ｍ，６Ｈ），４．９０（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４０－２．２１（ｍ，６Ｈ），２．１６－１．９３（ｍ，６Ｈ），１．７２－１．４６（ｍ，８Ｈ），１．４６－１．１８（ｍ，３２Ｈ），１．００－０．８０（ｍ，６Ｈ）．
【0114】
【化43】
一般的手順Ｂに従い、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のジヒドロキシステアリン酸（１．３２ｇ，４．００ｍｍｏｌ）、リノール酸（２．４７ｇ、８．８０ｍｍｏｌ、２．２０等量）、ＤＣＣ（１．８２ｇ、８．８０ｍｍｏｌ、２．２０等量）およびＤＭＡＰ（１．２２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、２．５０等量）から無色透明オイルとして表題化合物を得た（２．６４ｇ、収率７７％）。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２８（ｍ，８Ｈ），５．０４－４．９４（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３５－２．２５（ｍ，６Ｈ），２．１１－２．００（ｍ，８Ｈ），１．６９－１．４７（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0115】
【化44】
一般的手順Ｂに従い、ＣＨ２Ｃｌ２（１８ｍＬ）中でジヒドロキシステアリン酸（２．３１ｇ、７．００ｍｍｏｌ）、（±）－２－ヘキシルデカン酸（３．７７ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、２．１０等量）、ＤＣＣ（３．０３ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、２．１０等量）およびＤＭＡＰ（２．１４ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、２．５０等量）により、無色透明なオイルとして表題化合物（４．２０ｇ、収率７４％）を得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．０６－４．９６（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６９－１．５０（ｍ，１０Ｈ），１．５０－１．１６（ｍ，６４Ｈ），０．９４－０．８４（ｍ，１５Ｈ）．
【0116】
【化45】
一般的手順Ｂに従い、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中でトリヒドロキシステアリン酸（１．０４ｇ、３．００ｍｍｏｌ）、リノール酸（２．６１ｇ、９．３０ｍｍｏｌ、３．１０等量）、ＤＣＣ（１．９２ｇ、９．３０ｍｍｏｌ、３．１０等量）、ＤＭＡＰ（１．２８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、３．５０等量）から無色透明オイルとして表題化合物を得た（２．３３ｇ、収率６８％）。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４９－５．２６（ｍ，１２Ｈ），５．１４－４．８４（ｍ，３Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ），２．３７－２．２１（ｍ，８Ｈ），２．１４－１．９９（ｍ，１２Ｈ），１．９２－１．４７（ｍ，１６Ｈ），１．４７－１．１６（ｍ，５６Ｈ），０．９６－０．８４（ｍ，１２Ｈ）．
【0117】
【化46】
一般的手順Ｃに従い、アシルメチルエステル（５．９７ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、１．１０等量）、水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、４．７０ｍＬ、１．００等量）およびｔ－ＢｕＯＨ（２６ｍＬ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、９５：５：０→９０：１０：０→８５：１２：３ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）後、表題化合物（４．４８ｇ、収率８５％）を無色透明のオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．５５－５．２８（ｍ，６Ｈ），４．９０（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．４３－２．２１（ｍ，６Ｈ），２．１４－１．９６（ｍ，６Ｈ），１．７３－１．４７（ｍ，６Ｈ），１．４６－１．１８（ｍ，３０Ｈ），０．９９－０．８１（ｍ，６Ｈ）．
【0118】
【化47】
一般手順Ｃに従い、ジアシルメチルエステル（１．８８ｇ、２．２０ｍｍｏｌ、１．１０等量）、水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、１．００ｍＬ）およびｔ－ＢｕＯＨ（７ｍＬ）から、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、９５：５：０→９０：１０：０→８５：１２：３ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）後、無色透明オイルとしてＩＮＴ－Ａ００８（１．５０ｇ、収率８９％）を得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２８（ｍ，８Ｈ），５．０４－４．９４（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），２．１２－１．９８（ｍ，８Ｈ），１．７２－１．４６（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0119】
【化48】
一般手順Ｃに従い、トリアシルメチルエステル（２．４１ｇ、２．１２ｍｍｏｌ、１．０５等量）、水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、１．０１ｍＬ）およびｔ－ＢｕＯＨ（７ｍＬ）から、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、９０：１０：０→８０：１７：３ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）後、無色透明なオイルとしてトリアシル化脂肪酸（１．３７ｇ、収率６０％）を得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２６（ｍ，１２Ｈ），５．１４－４．８４（ｍ，３Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ），２．４１－２．２０（ｍ，８Ｈ），２．１４－１．９９（ｍ，１２Ｈ），１．９２－１．４７（ｍ，１６Ｈ），１．４７－１．１６（ｍ，５６Ｈ），０．９６－０．８４（ｍ，１２Ｈ）．
【0120】
【化49】
一般手順Ｃに従い、ジアシルメチルエステル（４．２０ｇ、５．２１ｍｍｏｌ、１．０５等量）、水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、２．４８ｍＬ）およびｔ－ＢｕＯＨ（７ｍＬ）から、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、９５：５：０→９０：１０：０→８５：１２：３ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）後、無色透明なオイルとしてＩＮＴ－Ａ００９（３．１２ｇ、収率７９％）を得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．０９－４．９３（ｍ，２Ｈ），２．４１－２．２３（ｍ，４Ｈ），１．７１－１．５１（ｍ，１０Ｈ），１．５１－１．１５（ｍ，６４Ｈ），０．９５－０．８２（ｍ，１５Ｈ）．
【0121】
【化50】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（５６１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（０．１８ｍＬ、１．２０ｍｍｏｌ、１．２０等量）、ＤＣＣ（２２７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１．１０等量）、ＤＭＡＰ（１４７ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（３．５ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、８８：１０：２→６８：３０：２ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン）により、ＩＮＴ－Ａ００５（６３９ｍｇ、収率９５％）を無色透明なオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．５４－５．２３（ｍ，６Ｈ），４．８９（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７８（ｂｒｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５８－２．４５（ｍ，６Ｈ），２．２９（ｂｒｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ），２．１２－１．９６（ｍ，６Ｈ），１．８３－１．７２（ｍ，２Ｈ），１．６９－１．４７（ｍ，６Ｈ），１．４４－１．１８（ｍ，３０Ｈ），１．０２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），０．９４－０．８４（ｍ，６Ｈ）．
【0122】
【化51】
一般的手順Ｄに従い、カルボン酸（３３６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（０．１２ｍＬ、１．２０ｍｍｏｌ、３．００等量）、ＤＣＣ（９１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１．１０等量）、ＤＭＡＰ（５９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、８８：２０：２→６８：３０：２→４８：５０：２ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン）により、ＩＮＴ－Ａ００１（２５５ｍｇ、収率７０％）を無色透明なオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．０４－４．９４（ｍ，２Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝５．９０Ｈｚ，４Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３９－２．２４（ｍ，９Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．１３－１．９９（ｍ，８Ｈ），１．７０－１．４６（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0123】
【化52】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（３３６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（０．１２ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ、２．００等量）、ＤＣＣ（９１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１．１０等量）、ＤＭＡＰ（５９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、７８：２０：２→６８：３０：２ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン）により、ＩＮＴ－Ａ００２（２７２ｍｇ、収率７１％）を無色透明なオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．０４－４．９４（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ），２．５９－２．４６（ｍ，６Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ），２．１２－１．９９（ｍ，８Ｈ），１．７８（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．７０－１．４６（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0124】
【化53】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（４２１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（８８μＬ、０．７５ｍｍｏｌ、１．５０等量）、ＤＣＣ（１１３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１．１０等量）およびＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、７８：２０：２→６８：３０：２ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン）により、ＩＮＴ－Ａ００３（３２３ｍｇ、収率７０％）を無色透明なオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．０４－４．９４（ｍ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｂｒｔ，Ｊ＝５．９０Ｈｚ，４Ｈ），２．３９－２．２５（ｍ，８Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．１３－１．９９（ｍ，８Ｈ），１．８１（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７０－１．４６（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0125】
【化54】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（４２１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（８０μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、１．２０等量）、ＤＣＣ（１１３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１．１０等量）およびＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、７８：２０：２→６８：３０：２ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン）により、ＩＮＴ－Ａ００４（４０６ｍｇ、収率８６％）を無色透明のオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．０５－４．９３（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７８（ｂｒｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．３６－２．２３（ｍ，６Ｈ），２．１２－１．９９（ｍ，８Ｈ），１．６９－１．４５（ｍ，１０Ｈ），１．４４－１．１６（ｍ，４８Ｈ），１．０５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），０．９７－０．８４（ｍ，９Ｈ）．
【0126】
【化55】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（５９５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（０．１３ｍＬ、０．９０ｍｍｏｌ、１．２０等量）、ＤＣＣ（１７０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１．１０等量）、ＤＭＡＰ（１１０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、８５：１５：０→８０：１５：５→７５：２０：５ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）により、ＩＮＴ－Ａ００７（５７７ｍｇ、収率８５％）を無色透明のオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．０６－４．９６（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６０－２．４６（ｍ，６Ｈ），２．３７－２．２３（ｍ，５Ｈ），１．７９（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７０－１．５０（ｍ，１０Ｈ），１．５０－１．１６（ｍ，６４Ｈ），１．０４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ）０．９４－０．８４（ｍ，１５Ｈ）．
【0127】
【化56】
一般手順Ｄに従い、カルボン酸（５６０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、アミノアルコール（８９μＬ、０．０．６０ｍｍｏｌ、１．２０等量）、ＤＣＣ（１１３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、１．１０等量）、ＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、１．２０等量）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、８５：１５：０→８０：１５：５→７５：２０：５ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）により、ＩＮＴ－Ａ００６（４１７ｍｇ、収率６８％）を無色透明なオイルとして得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４９－５．２６（ｍ，１２Ｈ），５．１２－４．８４（ｍ，３Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５９－２．４５（ｍ，６Ｈ），２．３６－２．２１（ｍ，８Ｈ），２．１４－１．９９（ｍ，１２Ｈ），１．９２－１．４７（ｍ，１８Ｈ），１．４７－１．１６（ｍ，５６Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），０．９６－０．８４（ｍ，１２Ｈ）．
【0128】
【化57】
Ｍ． Ｘｉｅ， Ｔ． Ｓ． Ｗｉｄｌａｎｓｋｉ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９６，３７，４４４３の手順に従い、ｎ－ＢｕＬｉ溶液（ヘキサン中１．１５Ｍの６．５２ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ、１．５等量）を、アルゴン下、丸底フラスコ中のメタンスルホン酸イソブチル（１．２２ｇ、８．００ｍｍｏｌ、１．６０等量）の－７８℃の９：１ＴＨＦ／ＤＭＰＵ（１５ｍＬ）溶液に加え、得られた溶液を３０分間攪拌させた。－７８℃下でヨウ化オレイル（１．８９ｇ、５．００ｍｍｏｌ、１．００等量）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液を上記溶液に加え、反応混合物を１６時間加温した。反応混合物を１０％クエン酸水溶液でクエンチし、Ｅｔ２Ｏ（２×１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を水（１×１０ｍＬ）、生理食塩水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーター上で濃縮した。粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（９８：２→９５：５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製し、アルキル化スルホン酸（１．１９ｇ、収率４６％）を無色透明の油として得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．４６－５．２７（ｍ，２Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．１４－３．０５（ｍ，２Ｈ），２．１１－１．９４（ｍ，５Ｈ），１．９４－１．８０（ｍ，２Ｈ），１．５１－１．１８（ｍ，２６Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），０．９０（ｂｒｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【0129】
【化58】
ＯｓＯ４溶液（４％水溶液０．１１ｍＬ、０．０２ｍｍｏｌ、０．０１等量）を、アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中のイソブチル（１０Ｚ）－ノナデセンスルホン酸（７０９ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）およびＮＭＯ（５０％水溶液０．５４ｍＬ、２．６４ｍｍｏｌ、１．５０等量）の室温の４：１＝Ｍｅ２ＣＯ／Ｈ２Ｏ（５．５ｍＬ）溶液に添加した。１６時間撹拌した後、飽和水性ＮａＨＳＯ３を加え、反応混合物を１時間撹拌させ、その時点でＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を水（１×１０ｍＬ）、生理食塩水（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、ジオール（７６８ｍｇ、定量的収率）を白色固体として得て、それをさらに精製せず使用した。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６７－３．６５（ｍ，２Ｈ），３．１４－３．０５（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．９５－１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５８－１．１９（ｍ，２８Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），０．９０（ｂｒｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）．
【0130】
【化59】
アルゴン雰囲気下、丸底フラスコ中の氷冷ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）溶液に固体ＤＣＣ（３８８ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ、２．１０等量）を加え、（±）－２－ヘキシルデカン酸（４８２ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ、２．１０等量）を加えた。その後、氷浴を除去し、得られた混合物を１５分間攪拌した。反応混合物を再び氷浴で冷却し、固体ジヒドロキシスルホン酸（３９１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１．００等量）をそこに加え、続いてＤＭＡＰ（２７３ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ、２．５０等量）を加えた。反応混合物を１６時間かけて室温まで加温し、Ｅｔ２Ｏで希釈し、１０分間撹拌し、続いてセライト（登録商標）のパッドで濾過した。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、９５：５→９０：１０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製して、ジアシル化スルホン酸（５７４ｍｇ、収率７０％）を無色透明の油として得た。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．０８－４．９３（ｍ，２Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６７－３．６５（ｍ，２Ｈ），３．１４－３．０５（ｍ，２Ｈ），２．３８－２．２４（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｓｅｐｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．９５－１．８０（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．１５（ｍ，７４Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），０．９６－０．８３（ｍ，１５Ｈ）．
【0131】
【化60】
テフロン（登録商標）スクリューキャップ付き密閉ガラス管中のジアシル化イソブチルスルホン酸（２５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の室温のＭｅ２ＣＯ（０．９ｍＬ）溶液に、アルゴン下でＮａＩ（８２ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、２．００等量）を添加した。その後、反応混合物を還流で２４時間加熱し、この時点でＭｅ２ＣＯ（３ｍＬ）で希釈し、氷上で２～３時間冷却し、白色沈殿物を集め、氷冷Ｍｅ２ＣＯで洗浄してＩＮＴ－Ａ０１２を白色粉末として得た（２００ｍｇ、収率８４％）。
１Ｈ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：５．１０－４．９３（ｍ，２Ｈ），２．９０（ａｐｐｂｒｓ，２Ｈ），２．４６－２．２２（ｍ，４Ｈ），１．７０－１．１５（ｍ，７６Ｈ），０．９６－０．８３（ｍ，１５Ｈ）．
【0132】
実施例２：核酸を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤
実施例１に記載したように合成した脂質、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６、ＩＮＴ－Ａ００７を核酸とともに脂質ナノ粒子に配合した。実施例のカーゴとしてのＬＮＰに組み込むための核酸は、血液凝固に関与するタンパク質である第ＶＩＩ因子に対するｓｉＲＮＡであった。第ＶＩＩ因子のレベルは、血漿中で発色アッセイによって容易に測定できるため、この因子のｓｉＲＮＡによるダウンレギュレーションを決定するための便利なモデルとなっている。
カチオン性脂質と第ＶＩＩ因子に対するｓｉＲＮＡを組み込んだナノ粒子の見かけのｐＫａ、粒子径、多分散性（ＰＤＩ）、カプセル化効率などの物理化学パラメータを測定し、以下に報告した。以下の結果から、ＬＮＰは核酸のカプセル化および送達に適していることが示された。
実施例１に記載したように合成した脂質、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６、ＩＮＴ－Ａ００７を核酸とともに脂質ナノ粒子に配合した。実施例のカーゴとしてのＬＮＰに組み込むための核酸は、血液凝固に関与するタンパク質である第ＶＩＩ因子に対するｓｉＲＮＡであった。第ＶＩＩ因子のレベルは、血漿中で発色アッセイによって容易に測定できるため、この因子のｓｉＲＮＡによるダウンレギュレーションを決定するための便利なモデルとなっている。
カチオン性脂質と第ＶＩＩ因子に対するｓｉＲＮＡを組み込んだナノ粒子の見かけのｐＫａ、粒子径、多分散性（ＰＤＩ）、カプセル化効率などの物理化学パラメータを測定し、以下に報告した。以下の結果から、ＬＮＰは核酸のカプセル化および送達に適していることが示された。
【0133】
ＬＮＰを調製するために、イオン化可能な脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ－ＤＭＰＥをエタノールに溶解させた。ｓｉＲＮＡは１０～５０ｍＭの酢酸、コハク酸またはクエン酸からなるｐＨ４．０～６．２の緩衝液に溶解させた。場合により、１０～５０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）または２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液を使用した。ＬＮＰは、エタノール中の脂質成分（ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＰＥのモル比５０／１０／３８．５／１．５）と水性緩衝液中の核酸を体積流量比１：３（エタノール対水、複合流量＞１２ｍＬ／ｍｉｎ）で室温で急速に混合することにより調製された。通常、ｓｉＲＮＡ／脂質の比率は０．０５６ｗｔ／μｍｏｌを目標とした。次に、生成物をｐＨ７．４の１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２４時間透析し、残留エタノールを除去し、ｐＨを上昇させた。ＰＢＳは４時間後にリフレッシュした。
【0134】
下記表２に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能脂質は、薬剤送達システムにとって望ましい物理化学特性である高いカプセル化効率と低い多分散性で第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡの組み込みを容易にした。６から７の間の見かけのｐＫａ値を持つ特定のイオン化可能な脂質が、遺伝子サイレンシングを媒介する活性を持つことが以前に報告されていることから、これらのイオン化可能な脂質の見かけのｐＫａ値も測定された（Ｓｅｍｐｌｅ， Ｓ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，２８（２）：ｐ．１７２－６ ａｎｄ Ｊａｙａｒａｍａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，２０１２，５１（３４）：ｐ．８５２９－３３）。
ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－００７はｐＫａ値が６～７の適正範囲にあることを確認した（表２）。
ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－００７はｐＫａ値が６～７の適正範囲にあることを確認した（表２）。
【0135】
表２：イオン化可能な脂質とｓｉＲＮＡを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
これらのデータは、ＬＮＰに核酸を封入するための新規なイオン化可能な脂質の適合性を示している。
【表2】
【0136】
実施例３：培養した２２Ｒｖ１細胞におけるＬＮＰ活性の測定
ルシフェラーゼ発現ヒト前立腺細胞（２２Ｒｖ１）を用いて、イオン化可能な脂質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を評価した。ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例２に記載したように調製した。細胞を０．１～１μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含むＬＮＰで１６～２４時間処理し、Ｇｌｏ－Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させた。等量のＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各サンプルに加え、発光レベルをＳｙｎｅｒｇｙ ＬＸプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて決定した。図２Ａは、種々の処理における発光レベルを示している。一般に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシングにおいて、用量依存的な効果が観察された。図２Ｂは、イオン化可能な脂質Ａ００１～Ａ００７を含む製剤の相対的な活性を示す。この結果は、本開示のイオン化可能な脂質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｓｉＲＮＡを効果的に送達し、遺伝子サイレンシングを誘導できることを示す。Ａ００７は、遺伝子サイレンシングのこのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、１μｇ／ｍＬで最も高い活性であった。
ルシフェラーゼ発現ヒト前立腺細胞（２２Ｒｖ１）を用いて、イオン化可能な脂質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を評価した。ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例２に記載したように調製した。細胞を０．１～１μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡを含むＬＮＰで１６～２４時間処理し、Ｇｌｏ－Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させた。等量のＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各サンプルに加え、発光レベルをＳｙｎｅｒｇｙ ＬＸプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて決定した。図２Ａは、種々の処理における発光レベルを示している。一般に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子のサイレンシングにおいて、用量依存的な効果が観察された。図２Ｂは、イオン化可能な脂質Ａ００１～Ａ００７を含む製剤の相対的な活性を示す。この結果は、本開示のイオン化可能な脂質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｓｉＲＮＡを効果的に送達し、遺伝子サイレンシングを誘導できることを示す。Ａ００７は、遺伝子サイレンシングのこのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、１μｇ／ｍＬで最も高い活性であった。
【0137】
実施例４：マウス第ＶＩＩ因子モデルにおけるＬＮＰ活性の測定
次に、マウスＦＶＩＩモデルを用いて、イオン化可能な脂質の生体内における活性を評価した。その結果、本開示のイオン化可能な脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的に核酸を送達できることが示された。
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に対するｓｉＲＮＡを含む実施例２に記載のように調製したＬＮＰを、注入量が１０ｍＬ／ｋｇ体重に維なるようにＰＢＳで希釈し、６～８週齢雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（チャールズリバーラボラトリーズ、ウイルミントン、ＭＡ）に尾静脈から静脈内投与（ｓｉＲＮＡ濃度を基準とした）した。投与後２４時間目に動物を安楽死させ、心臓内サンプリングにより血液を採取した。血液サンプルを４℃で一晩凝固させ、血清を分離した後、１２，０００ ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。血清ＦＶＩＩレベルは、製造者のプロトコルに従って、Ｂｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩ発色アッセイ（Ａｎｉａｒａ、Ｍａｓｏｎ、ＯＨ）を使用して決定した。
次に、マウスＦＶＩＩモデルを用いて、イオン化可能な脂質の生体内における活性を評価した。その結果、本開示のイオン化可能な脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで効果的に核酸を送達できることが示された。
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に対するｓｉＲＮＡを含む実施例２に記載のように調製したＬＮＰを、注入量が１０ｍＬ／ｋｇ体重に維なるようにＰＢＳで希釈し、６～８週齢雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（チャールズリバーラボラトリーズ、ウイルミントン、ＭＡ）に尾静脈から静脈内投与（ｓｉＲＮＡ濃度を基準とした）した。投与後２４時間目に動物を安楽死させ、心臓内サンプリングにより血液を採取した。血液サンプルを４℃で一晩凝固させ、血清を分離した後、１２，０００ ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。血清ＦＶＩＩレベルは、製造者のプロトコルに従って、Ｂｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩ発色アッセイ（Ａｎｉａｒａ、Ｍａｓｏｎ、ＯＨ）を使用して決定した。
【0138】
図３は、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００５、またはＩＮＴ－Ａ００７製剤を注射したマウスの残存ＦＶＩＩレベルを示している。これらのイオン化可能な脂質は、遺伝子サイレンシングを媒介する活性を有することが決定された。ＩＮＴ－Ａ００２は、試験した製剤化脂質の中で最も活性が高かった。ＩＮＴ－００２のＥＤ５０は０．１ｍｇ／ｋｇ以下と推定された（ＥＤ５０は５０％の遺伝子抑制を達成するための有効量である）。
【0139】
実施例５：ｍＲＮＡをＬＮＰに含有させた脂質ナノ粒子の製剤化
ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３およびＩＮＴ－Ａ００４を含む製剤のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡ送達能力を評価した。その結果、これらのイオン化可能な脂質は、ｍＲＮＡを効果的に送達できることが示された。
ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＬＮＰを実施例２に記載したように調製した。以下の表３に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、およびＩＮＴ－Ａ００４イオン化可能脂質は、薬物送達システムに望ましい物理化学的特性の両方である高いカプセル化効率および低い多分散性でルシフェラーゼｍＲＮＡの組み込みを容易にする。
ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３およびＩＮＴ－Ａ００４を含む製剤のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡ送達能力を評価した。その結果、これらのイオン化可能な脂質は、ｍＲＮＡを効果的に送達できることが示された。
ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＬＮＰを実施例２に記載したように調製した。以下の表３に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、およびＩＮＴ－Ａ００４イオン化可能脂質は、薬物送達システムに望ましい物理化学的特性の両方である高いカプセル化効率および低い多分散性でルシフェラーゼｍＲＮＡの組み込みを容易にする。
【0140】
表３：イオン化可能な脂質とｍＲＮＡを含むＬＮＰの物理化学パラメータ
【表3】
【0141】
イオン化可能な脂質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を、培養したＨｅｐＧ２細胞で評価した。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例２に記載したように調製した。ＬＮＰを１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で０．１２５～１μｇ／ｍＬに希釈し、ＨｅｐＧ２細胞とともに１６～２４時間インキュベートした。その後、細胞をＧｌｏ－Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させた。各サンプルに等量のＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＬＸプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光レベルを決定した。図４Ａは、様々な処理における発光レベルを示している。ＩＮＴ－Ａ００３製剤は、ｍＲＮＡを送達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその発現を誘導する上で最も活性であった。
【0142】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するために、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例２に記載したように調製した。ＬＮＰをＰＢＳで希釈し、６～８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、ＭＡ）に尾静脈から１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。投与後４時間で、動物を安楽死させ、肝臓を採取した。約１００ｍｇの肝臓を０．５ｍＬのＧｌｏ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。ホモジネートをさらに溶解バッファーで１：４に希釈し、そして希釈したホモジネートの５０μＬを５０μＬ Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加した。発光のレベルは、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＬＸプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して決定した。図４Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達が成功した結果としての発光の相対的レベルを示している。ＩＮＴ－Ａ００２製剤は、ｍＲＮＡを送達し、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡ発現を誘導することにおいて最も高い活性であった。
【0143】
実施例６：アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子のＬＮＰへの製剤化
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む実施例２に記載されたようにＬＮＰを調製した。以下の表４に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能脂質は、薬物送達システムにとって望ましい物理化学特性である、高いカプセル化効率および低い多分散性の両方でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込みを促進させた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む実施例２に記載されたようにＬＮＰを調製した。以下の表４に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能脂質は、薬物送達システムにとって望ましい物理化学特性である、高いカプセル化効率および低い多分散性の両方でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み込みを促進させた。
【0144】
表４：イオン化可能な脂質とアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
【表4】
【0145】
実施例７：ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む脂質ナノ粒子のＬＮＰへの製剤化
アニオン性のカーゴの例として、ヒアルロン酸を使用した。ＬＮＰは、分子量８～１５ｋＤａのＨＡを含む実施例２に記載されたように調製された。下記の表５に示すように、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能な脂質はＨＡの組み込みを容易にした。
アニオン性のカーゴの例として、ヒアルロン酸を使用した。ＬＮＰは、分子量８～１５ｋＤａのＨＡを含む実施例２に記載されたように調製された。下記の表５に示すように、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能な脂質はＨＡの組み込みを容易にした。
【0146】
表５：イオン化可能な脂質とＨＡを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
【表5】
【0147】
実施例８：酸性ペプチドを含む脂質ナノ粒子のＬＮＰへの製剤化
核酸と同様に、正味の負電荷を持つタンパク質やペプチドも、カチオン性のイオン化可能な脂質を用いてＬＮＰに取り込ませることができる。分子量４．２ｋＤａ、予測正味電荷－３の酸性ペプチドを含む実施例２に記載した方法でＬＮＰを調製した。以下の表６に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６、およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能脂質はこの酸性ペプチドの組み込みを容易にした。
核酸と同様に、正味の負電荷を持つタンパク質やペプチドも、カチオン性のイオン化可能な脂質を用いてＬＮＰに取り込ませることができる。分子量４．２ｋＤａ、予測正味電荷－３の酸性ペプチドを含む実施例２に記載した方法でＬＮＰを調製した。以下の表６に示すように、ＩＮＴ－Ａ００１、ＩＮＴ－Ａ００２、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００５、ＩＮＴ－Ａ００６、およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能脂質はこの酸性ペプチドの組み込みを容易にした。
【0148】
表６：イオン化可能な脂質と４．２ｋＤａの酸性ペプチドを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
【表6】
【0149】
実施例９：酸性低分子ペプチドを含む脂質ナノ粒子のＬＮＰへの製剤化
分子量２．０ｋＤａ、予測正味電荷－３の酸性ペプチドを含む実施例２に記載されたようにＬＮＰを調製した。以下の表７に示すように、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能な脂質は、この酸性ペプチドの取り込みを容易にした。
分子量２．０ｋＤａ、予測正味電荷－３の酸性ペプチドを含む実施例２に記載されたようにＬＮＰを調製した。以下の表７に示すように、ＩＮＴ－Ａ００３、ＩＮＴ－Ａ００４、ＩＮＴ－Ａ００６およびＩＮＴ－Ａ００７のイオン化可能な脂質は、この酸性ペプチドの取り込みを容易にした。
【0150】
表７：イオン化可能な脂質と２．０ｋＤａの酸性ペプチドを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
【表7】
【0151】
実施例１０：カチオン性のカーゴを含む脂質ナノ粒子のＬＮＰへの製剤化
カチオン性カーゴの例として塩基性ペプチドを用いた。分子量２．０ｋＤａおよび予測される正味電荷が＋４の塩基性ペプチドを含む実施例２に記載されるようなＬＮＰを調製した。以下の表８に示すように、ＩＮＴ－Ａ００８およびＩＮＴ－Ａ００９のイオン化可能な脂質は、この塩基性ペプチドの組み込みを促進した。
カチオン性カーゴの例として塩基性ペプチドを用いた。分子量２．０ｋＤａおよび予測される正味電荷が＋４の塩基性ペプチドを含む実施例２に記載されるようなＬＮＰを調製した。以下の表８に示すように、ＩＮＴ－Ａ００８およびＩＮＴ－Ａ００９のイオン化可能な脂質は、この塩基性ペプチドの組み込みを促進した。
【0152】
表８：イオン化可能な脂質と２．０ｋＤａ塩基性ペプチドを含むＬＮＰの物理化学的パラメータ
【表8】
【0153】
ここに添付された特許請求の範囲は、上記の特定の実施形態によって制限されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有するすべての可能な実施形態および等価物を含むように解釈されるものとする。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ：（化１）
Ａ－（Ｖ）ｍ－Ｚ－Ｌ
（式中、Ａはイオン化可能、恒久荷電、または双性イオンである先頭基であり；
（Ｖ）ｍは、任意の－（ＣＲ１Ｒ２）ｍ－であり、ｍは、１～１０または２～６であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり；
Ｚ－Ｌは、式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの構造を有し、
Ｌは、炭化水素構造の式ＩＩＩｃ：
【化2】
Ｌ１’は、ヘテロ原子を含まない直鎖炭化水素鎖であり、５～１２個の炭素原子および０～３個のシスまたはトランス二重結合を有しており；
Ｌ１’’は、炭素原子であり；
各Ｘ１は、それぞれ独立して、エーテル、エステルおよびカルバメート基から選択され；
Ｌ１’’’は、足場炭素鎖Ｌの炭素部分骨格であり、Ｇ１－ＣＨ－［ＣＨ２］ｑ－ＣＨ３で表され、式中、Ｇ１は、０～４個の炭素原子の炭化水素鎖であり、１つのシスまたはトランス二重結合を有していてもよく；
ｎは、０～４であり；
ｐは、１～４であり；
ｎ＋ｐは、１～４であり；
ｑは、０～２０であり；
式中、各ＳおよびＬ１’’’’は、炭化水素側鎖であり、それぞれ独立して：
（ａ）０～５個のシスまたはトランスＣ＝Ｃおよび２～３０個の炭素原子を有し、その炭化水素鎖中の任意の炭素原子で各Ｘ１の１つに結合している直鎖または分岐状の末端炭化水素鎖；または、
（ｂ）式ＩＩＩｃの分岐状の炭化水素構造であり、
式中、脂質部分のＬ１’’’’およびＳ炭化水素鎖の各１つは、ヘテロ原子で置換されていてもよく、ただし、炭化水素鎖において２つ以下のヘテロ原子が置換されている）
の部分構造として表され、
直鎖リンカー構造である式ＩＩ：
（化３）
Ｘ１－Ｌｂ
（式中、Ｘ１は任意であり、Ｘ１は、エーテル基、エステル基およびカルバメート基から選択され、
Ｌｂは、式ＩＩＩｃの分枝状の脂質である）、
分岐状のリンカー構造である式ＩＩａ：
【化4】
Ｗが存在する場合、Ｗは、Ｘ１結合、Ｎ－Ｃ（Ｏ）、Ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ、またはＮ－ＯＣ（Ｏ）であり；
Ｗは、Ｄで置換されていてもよく、Ｄは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり；
（Ｘ）ｎが存在する場合、（Ｘ）ｎは、それぞれ独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）ｎ－であり；（Ｘ）ｎのｎは、０～１０であり；Ｔは任意であり、Ｔは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、またはヘテロサイクルであり、Ｔは置換されていてもよく、
Ｂは、Ｇ１およびＧ２を介してＬ１およびＬ２にそれぞれ結合した炭素原子であり；
Ｇ１およびＧ２は、独立してＸ１から選択され；
各Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して、Ｂ－（Ｇ）ｕ－Ｇ１またはＢ－（Ｇ）ｕ－Ｇ２として介在する（Ｇ）ｕ基を介してＢに結合していてもよく；
（Ｇ）ｕは、独立して選択された－（ＣＲ１Ｒ２）ｕ－であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、または複素環であり、ｕは、０～１６であり；
Ｇ３は任意であり、Ｇ３はＸ１から選択され、Ｂ－（Ｇ）ｕ－Ｇ３として介在する（Ｇ）ｕ基を介してＢに結合していてもよく；
Ｌ１は、式ＩＩＩｃの分枝状の炭化水素であり；
Ｌ２は、１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する炭化水素鎖であるか、または式ＩＩＩｃの構造を有し；
Ｌ３が存在する場合、Ｌ３は、水素、１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖または分岐の炭化水素鎖、または式ＩＩＩｃの構造を有する）、
環構造の式ＩＩｂ：
【化5】
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１つが、それぞれＧ１、Ｇ２およびＧ３を介して、任意の環内の単一の原子に結合しており、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３は、それぞれ独立して、Ｇ１－（Ｇ）ｕ－Ｌ１、Ｇ２－（Ｇ）ｕ－Ｌ２またはＧ３－（Ｇ）ｕ－Ｌ３として、介在する（Ｇ）ｕを介してＬ１、Ｌ２およびＬ３のそれぞれ一つに任意に結合しており、
式ＩＩｂのＬ１および任意のＬ２および／またはＬ３は、式ＩＩＩｃの構造を有する）、
Ａ部分は以下の（ｉ）～（ｉｖ）から一つ選択される：
（ｉ）以下の群から選択されるイオン化可能なカチオン性部分：
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【請求項2】
Ｚ－Ｌが、直鎖リンカー構造の式ＩＩ：（化１０）
Ｘ１－Ｌｂ
（式中、式ＩＩＩｃのＬ１’は、５～９個の炭素原子を有し、０～２個のシスまたはトランス二重結合を有し；
式ＩＩＩｃのＧ１は、不存在であるか、ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ＝ＣＨであり、当該二重結合がシスまたはトランスであり；
式ＩＩＩｃのＬ１’’’’が存在する場合、Ｌ１’’’’およびＳは、０～５個のシスまたはトランスＣＨ＝ＣＨおよび２～１８個の炭素原子を有する炭化水素から独立して選択され；および
ｑは、１～９である）
の構造を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項3】
式Ｉの（Ｖ）ｍが（ＣＨ２）ｍであり、ｍが、１～２０であり；Ｚ－Ｌが、分枝状リンカー構造の式ＩＩａ：
【化11】
Ｇ１およびＧ２は存在し、各Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して、Ｂ－（Ｇ）ｕ－Ｌ１またはＢ－（Ｇ）ｕ－Ｌ２として、（Ｇ）ｕを介してＢに結合しており、（Ｇ）ｕは（ＣＨ２）ｕであり；
Ｇ３－Ｌ３は存在し、Ｇ３－Ｌ３は、ＣＨ３およびＣＨ２ＣＨ３から選択される炭化水素であり、またはＧ３－Ｌ３はＣＨ２Ｘ１Ｌ３であり、Ｌ３は１～２０個の炭素原子および０～２個のシスまたはトランス二重結合を有する直鎖状または分枝状炭化水素鎖であるか、式ＩＩＩｃの構造を有する）
を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項4】
Ｚ－Ｌが、環構造の式ＩＩｂ：【化12】
を有する、請求項１記載の荷電脂質。
【請求項5】
環が３または５個の炭素原子を有している、請求項４に記載の荷電脂質。
【請求項6】
少なくともＬ１およびＬ２が存在し、Ｌ１およびＬ２は、それぞれＧ１およびＧ２基を介して環に結合し、当該各Ｇ１およびＧ２基が、介在する（Ｇ）ｕを介して環の原子に任意に結合していてもよく、（Ｇ）ｕが（ＣＨ２）ｕであり、ｕが０～１０または０～６である、請求項４または５に記載の荷電脂質。
【請求項7】
脂質が水溶液中で他の脂質と組み合わせて脂質ナノ粒子を形成し得る、請求項１～６のいずれか一項に記載の荷電脂質。
【請求項8】
他の脂質が、小胞を形成し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、セラミド、スフィンゴミエリンまたは親水性ポリマー－脂質複合体を含む、請求項７に記載の荷電脂質。
【請求項9】
（Ｖ）ｍのＲ１またはＲ２が、それぞれ独立して、単環、二環または三環の炭素環で置換されていても良いシクロアルキルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の荷電脂質。
【請求項10】
（Ｖ）ｍのＲ１またはＲ２が、それぞれ独立して、４～１２個の環原子を有するヘテロ原子環から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の荷電脂質。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の荷電脂質が、その脂質二重層または単層中に組み込まれ、核酸、タンパク質またはペプチドであるカーゴ分子または化合物を含む、薬物送達ビークル製剤。
【請求項12】
核酸が、低分子干渉ＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、プラスミド、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、アンチゴミア、アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡミミックである、請求項１１に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項13】
カーゴ分子または化合物が、ペプチドである、請求項１１に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項14】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含有する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項15】
脂質ナノ粒子の多分散性が、０．１５未満である、請求項１４に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項16】
脂質ナノ粒子のカプセル化効率が、７０％～１００％である、請求項１４または１５に記載の薬物送達ビークル製剤。
【請求項17】
脂質ナノ粒子のカプセル化効率が、８０％～１００％である、請求項１６に記載の薬物送達ビークル製剤。
【国際調査報告】