特表 2022-552786 標的化ＥＰＨＡ３及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-20

(54)【発明の名称】標的化ＥＰＨＡ３及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20221213BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221213BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20221213BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20221213BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221213BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20221213BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221213BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221213BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20221213BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221213BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221213BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20221213BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/0783

C07K16/18

C07K19/00

C07K16/42

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P35/00

A61K35/17 Z

A61K45/00

A61P25/00

A61P43/00 105

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022519779

(86)(22)【出願日】2020-10-09

(85)【翻訳文提出日】2022-05-30

(86)【国際出願番号】 AU2020051090

(87)【国際公開番号】W WO2021068040

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】2019903802

(32)【優先日】2019-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504200892

【氏名又は名称】ザ・カウンシル・オヴ・ザ・クイーンズランド・インスティテュート・オヴ・メディカル・リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】カンナ， ラジヴ

(72)【発明者】

【氏名】マーティンズ， ホセ パウロ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZC412

4C085AA14

4C085AA16

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZB21

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

少なくともＥｐｈＡ３を特異的に認識し得るか、又はＥｐｈＡ３に特異的に結合し得る、抗原結合分子及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。医学的治療及び予防の方法も開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１３～７２及び／若しくは表４～７に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意選択で単離された、ＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項2】

（ａ）配列番号１３～１７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１８～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、配列番号２３～２７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）ポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号２８～３２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号３３～３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号３８～４２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
を含む、請求項１に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項3】

（ａ）ＶＨポリペプチドが、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、及び／又は
（ｂ）ＶＬポリペプチドが、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項２に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項4】

（ａ）配列番号４３～４７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号４８～５２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号５３～５７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＨポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号５８～６２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号６３～６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号６８～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＬポリペプチド
を含む、請求項１に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項5】

（ａ）ＶＨポリペプチドが、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、及び／又は
（ｂ）ＶＬポリペプチドが、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項４に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項6】

ＥｐｈＡ３結合剤が抗体又は抗体断片である、前記の請求項のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項7】

抗体又は抗体断片が、３Ｃ３－１若しくは２Ｄ４－１モノクローナル抗体、又はその断片である、請求項６に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項8】

組換え、ヒト、若しくヒト化抗体、又は抗体断片である、請求項６又は請求項７に記載のＥｐｈＡ３結合剤。

【請求項9】

ＥｐｈＡ３に結合可能な抗原結合分子であって、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み入れた重鎖可変（ＶＨ）領域、及び
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み入れた軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、抗原結合分子。

【請求項10】

ＥｐｈＡ３に結合可能な抗原結合分子であって、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、
配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３
を組み入れた重鎖可変（ＶＨ）領域、
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号６２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３
を組み入れた軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、抗原結合分子。

【請求項11】

配列番号１５３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び
配列番号１５４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、請求項９のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項12】

配列番号１５５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び
配列番号１５６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、請求項１０のいずれか一項に記載の抗原結合分子。

【請求項13】

（ｉ）請求項９～１２のいずれか一項に記載の抗原結合分子、及び（ｉｉ）ＥｐｈＡ３以外の抗原に結合可能な抗原結合分子を含む、抗原結合分子。

【請求項14】

請求項９～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項15】

配列番号１～１２に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項16】

抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１３～１７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１８～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、配列番号２３～２７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）ポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号２８～３２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号３３～３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号３８～４２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項１５に記載のＣＡＲ。

【請求項17】

（ａ）ＶＨポリペプチドが、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、及び／又は
（ｂ）ＶＬポリペプチドが、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１６に記載のＣＡＲ。

【請求項18】

抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４３～４７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号４８～５２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号５３～５７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＨポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号５８～６２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号６３～６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号６８～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＬポリペプチド
を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項１５に記載のＣＡＲ。

【請求項19】

（ａ）ＶＨポリペプチドが、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、及び／又は
（ｂ）ＶＬポリペプチドが、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１８に記載のＣＡＲ。

【請求項20】

抗原結合ドメインが、配列番号１５８に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するリンカーなどのリンカーを含む、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項21】

リーダー配列をさらに含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項22】

リーダー配列が、配列番号１５７に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項２１に記載のＣＡＲ。

【請求項23】

膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項24】

ＣＤ８膜貫通ドメインが、配列番号１５９に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のＣＡＲ。

【請求項25】

細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４～２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項26】

細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１６２に示されるＣＤ３ゼータアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＣＡＲ。

【請求項27】

配列番号１６１に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激ドメイン、及び／又は配列番号１６０に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤ１３７共刺激ドメインなどの、１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１４～２６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項28】

対象におけるがんの治療又は予防に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤、又は請求項９～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子、又は請求項１４～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。

【請求項29】

請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤又は請求項１５～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、単離された核酸。

【請求項30】

請求項２９に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物。

【請求項31】

請求項９～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子又は請求項１４に記載のＣＡＲをコードする、任意選択で単離された、１つ又は複数の核酸。

【請求項32】

請求項３１に記載の１つ又は複数の核酸を含む、１つ又は複数の発現ベクター。

【請求項33】

請求項９～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子、請求項１４に記載のＣＡＲ、請求項３１に記載の１つ若しくは複数の核酸、又は請求項３２に記載の１つ若しくは複数の発現ベクターを含む、細胞。

【請求項34】

請求項２９に記載の核酸及び／又は請求項３０に記載の遺伝子構築物を含む、宿主細胞。

【請求項35】

宿主細胞がＴ細胞であるか、又はＴ細胞を含む、請求項３４に記載の宿主細胞。

【請求項36】

単離されたＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを作製する方法であって、
（ｉ）請求項３４又は請求項３５に記載の宿主細胞を培養するステップ、及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で培養した前記宿主細胞から前記ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを単離するステップ
を含む方法。

【請求項37】

請求項３１に記載の１つ若しくは複数の核酸、又は請求項３２に記載の１つ若しくは複数の発現ベクターを含む細胞を、核酸又は発現ベクターからの抗原結合分子又はＣＡＲの発現に適した条件下で培養することを含む方法。

【請求項38】

（ｉ）請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤、及び／又は
（ｉｉ）請求項１５～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ
に結合する、及び／又はそれに対して産生される、抗体又は抗体断片。

【請求項39】

請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤、請求項１５～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２９に記載の単離された核酸、請求項３０に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項３４若しくは請求項３５に記載の宿主細胞と、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、組成物。

【請求項40】

請求項９～１３のいずれか一項に記載の抗原結合分子、請求項１４に記載のＣＡＲ、請求項３１に記載の１つ若しくは複数の核酸、又は請求項３２に記載の１つ若しくは複数の発現ベクター、又は請求項３３に記載の細胞を含む、組成物。

【請求項41】

薬剤（例えば、チェックポイント阻害剤などの免疫療法剤）を追加的に含む、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

対象におけるがんを治療又は予防する方法であって、請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤、請求項１５～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２９に記載の単離された核酸、請求項３０に記載の遺伝子構築物、請求項３４又は請求項３５に記載の宿主細胞、及び／又は請求項３９に記載の組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるがんを治療又は予防するステップを含む方法。

【請求項43】

対象におけるがんの予防及び／又は治療のための医薬品の製造における、請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤、請求項１５～２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２９に記載の単離された核酸、請求項３０に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項３４若しくは請求項３５に記載の宿主細胞の使用。

【請求項44】

がんが多形性神経膠芽細胞腫であるか又は多形性神経膠芽細胞腫を含む、請求項２８に記載のＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲ、請求項４２に記載の方法、又は請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出する方法であって、請求項１～８及び２８のいずれか一項に記載のＥｐｈＡ３結合剤又は１５～２８のいずれか一項に記載のＣＡＲとＥｐｈＡ３との複合体を形成させて、それによってＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出するステップを含む方法。

【請求項46】

細胞ががん細胞であるか又はがん細胞を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

配列番号１３～１５６及び／若しくは表２～５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたタンパク質。

【請求項48】

配列番号１～１２及び／若しくは表１のいずれか１つに示される核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、単離された核酸。

【請求項49】

（ａ）ＣＭＶ抗原への結合によって活性化されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）ＥｐｈＡ３のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを発現する、ヒトＴ細胞。

【請求項51】

抗原結合ドメインが、重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含むｓｃＦｖである、請求項４９に記載のＴ細胞。

【請求項52】

（ａ）ＣＭＶ抗原に対して特異的であるＴＣＲを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）ＥｐｈＡ３に結合する抗原結合分子とを含むＴ細胞。

【請求項53】

抗原結合分子が、重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含むｓｃＦｖである、請求項５２に記載のＴ細胞。

【請求項54】

抗原結合分子がＣＡＲである、請求項５２又は請求項５３に記載のＴ細胞。

【請求項55】

ＶＨ領域が配列番号１５３に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ領域が配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５１、５３又は５４のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項56】

ＶＨ領域が配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ領域が配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５１、５３又は５４のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項57】

ＣＡＲが、ＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む、請求項４９～５６のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項58】

ＣＡＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメインから選択される共刺激ドメインを含む、請求項４９～５７のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項59】

ＣＭＶ抗原が、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ＩＥ－Ｉ、ｇＢ及びｇＨのうちの１つ以上に由来するペプチドを含む、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項60】

ＣＭＶ抗原が、配列番号１８１～２１１に示されるアミノ酸配列から選択されるペプチドを含む、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項61】

がんの治療に使用するための二重特異性Ｔ細胞集団を調製する方法であって、
（ａ）対象からＰＢＭＣを含む細胞の集団を入手し、前記細胞を処理して、ＣＭＶ抗原に結合するＴＣＲを発現するＴ細胞の部分集団を入手するステップ、
（ｂ）前記細胞の部分集団を処理して、ＥｐｈＡ３のエピトープに結合するＣＡＲをコードするベクターを導入し、それにより、ＣＭＶ抗原に結合するＴＣＲとＥｐｈＡ３のエピトープに結合するＣＡＲとを発現する二重特異性Ｔ細胞の集団を作り出すステップ、及び
（ｃ）二重特異性Ｔ細胞の集団を増大するステップ
を含む方法。

【請求項62】

ＣＡＲが、ＥｐｈＡ３のエピトープに結合する抗原結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

抗原結合ドメインが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

重鎖可変（ＶＨ）領域が、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変（ＶＬ）領域が、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

重鎖可変（ＶＨ）領域が、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変（ＶＬ）領域が、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

膜貫通ドメインが、ＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

共刺激ドメインが、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメインである、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

ステップ（ａ）において細胞を処理することが、Ｔ細胞を、ペプチド特異的Ｔ細胞の増殖を誘導し得るＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性ＣＭＶペプチドエピトープを含む免疫原性ペプチドのプールに曝露させることを含む、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

Ｔ細胞が、ＣＭＶ抗原に対して特異的なＴＣＲを発現し、対象への投与の前にＴ細胞抗原の存在下で増大される、請求項６２～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

ＣＭＶ抗原が、１つ以上のＣＭＶペプチド、又はＣＭＶワクチンを含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

少なくとも１つのＣＭＶペプチドが、ｐｐ５０、ｐ６５、ＩＥ－Ｉ、ｇＢ及びｇＨから選択される、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

少なくとも１つのＣＭＶペプチドが、配列番号１８１～２１１に示されるアミノ酸配列から選択される、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

ペプチドプールが、ＣＭＶ抗原ｐｐ５０、ｐｐ６５、ＩＥ－Ｉ、ｇＢ及びｇＨのそれぞれに由来する少なくとも１つのペプチドエピトープを含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項74】

配列番号１８１～２１１に示されるペプチドプールの中のＣＭＶペプチドエピトープアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、又はそれらの組合せ、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

ペプチドプールが、配列番号１８１～２１１に示されるＣＭＶペプチドエピトープアミノ酸配列のそれぞれを含む、請求項７４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子生物学の分野、より具体的には抗体技術に関する。より詳細には、本発明は、少なくともＥｐｈＡ３を特異的に認識し得るか又はＥｐｈＡ３に特異的に結合し得る、抗体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本発明はまた、医学的治療及び予防の方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

エフリンＡ型受容体３（ＥｐｈＡ３）は、結腸がん、乳がん、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を含む、多岐にわたるヒト固形腫瘍及び白血病に由来する腫瘍細胞で過剰発現されるか、又は異常に発現されることが見出されている。ＧＢＭは、悪性度が非常に高い固形脳腫瘍の一つである。標準治療は、最大限の外科的切除、放射線療法、並びにテモゾロミドによる併用化学療法及びアジュバント化学療法からなる。しかし、最適な治療が行われた場合でも、最初に診断された後の生存期間の中央値は１５カ月未満である（１）。チェックポイント遮断を使用する最近の進歩により、いくつかのヒトがんのアウトカムは改善したが、この治療アプローチ単独に対しては、ＧＢＭは抵抗性であると思われる（２）。それにもかかわらず、ＧＢＭのみならず、より広範にわたるがんに対する新たな治療法の開発が依然として必要である。

【発明の概要】

【0003】

本発明は、ヒト又はヒト化組換え抗ＥｐｈＡ３抗体を範囲に含む抗ＥｐｈＡ３結合剤、及びそれを使用する方法を広く対象とする。本発明の特定の形態は、ＥｐｈＡ３に特異的に結合し得る抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びそれを使用する方法をさらに提供する。

【0004】

広範な形態では、本発明は、本明細書に記載のＥｐｈＡ３モノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲを含む、ＥｐｈＡ３結合剤及びＣＡＲに関する。

【0005】

一態様では、本発明は、配列番号１３～７２及び／若しくは表４～７に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ＥｐｈＡ３結合剤を提供する。

【0006】

一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３結合剤は、
（ａ）配列番号１３～１７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１８～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、配列番号２３～２７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）ポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号２８～３２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号３３～３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号３８～４２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
を含む。

【0007】

そのような実施形態に関して、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を好適に含み、及び／又は、ＶＬポリペプチドは、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を好適に含む。

【0008】

この実施形態の一部及び他の一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３結合剤は、
（ａ）配列番号４３～４７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号４８～５２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号５３～５７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＨポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号５８～６２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号６３～６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号６８～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＬポリペプチド
を含む。

【0009】

この点に関して、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、及び／又はＶＬポリペプチドは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

【0010】

好適には、ＥｐｈＡ３結合剤は、抗体又は抗体断片である。一実施形態では、抗体又は抗体断片は、３Ｃ３－１若しくは２Ｄ４－１モノクローナル抗体、又はその断片である。ある特定の実施形態では、ＥｐｈＡ３結合剤は、組換え、ヒト、若しくはヒト化抗体、又は抗体断片である。

【0011】

別の態様では、本発明は、配列番号１３～７２及び／若しくは表４～７に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に存する。

【0012】

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号１３～１７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１８～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲと、配列番号２３～２７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）ポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号２８～３２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号３３～３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号３８～４２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0013】

そのような実施形態について、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでよく、及び／又はＶＬポリペプチドは、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。

【0014】

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号４３～４７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号４８～５２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号５３～５７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＨポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号５８～６２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号６３～６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号６８～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＬポリペプチド
を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0015】

そのような実施形態について、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでよく、及び／又はＶＬポリペプチドは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。

【0016】

一部の実施形態では、抗原結合ドメインはリンカーを含む。１つの特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１５８に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0017】

好適には、ＣＡＲは、リーダー配列又はシグナルペプチド配列、例えば、配列番号１５７に示されるＣＤ８のリーダー配列若しくはシグナルペプチド配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をさらに含む。

【0018】

ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１５９に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメインを含む。

【0019】

好適には、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0020】

特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６２に示されるＣＤ３アミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0021】

好適には、ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメイン、例えば、配列番号１６１に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激ドメイン、及び／又は配列番号１６０に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤ１３７共刺激ドメインをさらに含む。

【0022】

一部の実施形態では、第１の態様のＥｐｈＡ３結合剤又は第２の態様のＣＡＲは、対象におけるがん、例えば、多形性神経膠芽細胞腫のような固形がんの治療又は予防に使用するためのものである。

【0023】

この点に関して、上記及び本明細書の他の箇所で説明される抗体及び抗原結合分子は、実質的な抗腫瘍活性を示し、特に減少させるのに有効である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、がんを有する対象から腫瘍を実質的に除去する能力を有する。

【0024】

別の態様では、本発明は、上記及び本明細書の他の箇所で説明されるＥｐｈＡ３結合剤及び／又はＣＡＲをコードする、単離された核酸を提供する。

【0025】

なお別の態様では、本発明は、上記及び本明細書の他の箇所で説明される単離された核酸を含む遺伝子構築物に存する。

【0026】

さらに別の態様では、本発明は、上記及び本明細書の他の箇所で説明される核酸及び／又は遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。

【0027】

好適には、宿主細胞はＴ細胞であるか又はＴ細胞を含む。

【0028】

別の態様では、本発明は、単離されたＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを作製する方法であって、（ｉ）第５の態様の宿主細胞を培養するステップ、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）で培養した前記宿主細胞から前記ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを単離するステップを含む方法に存する。

【0029】

なお別の態様では、本発明は、第６の態様の方法によって作製されるＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを提供する。

【0030】

なお別の態様では、本発明は、
（ｉ）第１の態様のＥｐｈＡ３結合剤、及び／又は
（ｉｉ）第２の態様のＣＡＲ
に結合する、及び／又はそれに対して産生される、抗体又は抗体断片に存する。

【0031】

別の態様では、本発明は、第１若しくは第６の態様のＥｐｈＡ３結合剤、第２若しくは第６の態様のＣＡＲ、第３の態様の核酸、第４の態様の遺伝子構築物、及び／又は第５の態様の宿主細胞と、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物を提供する。

【0032】

さらになお別の態様では、本発明は、対象におけるがんを治療又は予防する方法であって、第１若しくは第６の態様のＥｐｈＡ３結合剤、第２若しくは第６の態様のＣＡＲ、第３の態様の核酸、第４の態様の遺伝子構築物、第５の態様の宿主細胞、及び／又は第９の態様の組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるがんを治療又は予防するステップを含む方法に存する。

【0033】

別の態様では、本発明は、対象におけるがんの予防及び／又は治療のための医薬品の製造における、第１又は第６の態様のＥｐｈＡ３結合剤、第２又は第６の態様のＣＡＲ、第３の態様の核酸、第４の態様の遺伝子構築物、及び／又は第５の態様の宿主細胞の使用を提供する。

【0034】

第１、第２、第１０及び第１１の態様に関して、がんは好適には、多形性神経膠芽細胞腫であるか又は多形性神経膠芽細胞腫を含む。

【0035】

別の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出する方法であって、第１の態様のＥｐｈＡ３結合剤又は第２の態様のＣＡＲとＥｐｈＡ３との複合体を形成させて、それによってＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出するステップを含む方法に存する。

【0036】

好適には、本方法は、ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を、ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲと接触させる最初のステップを含む。

【0037】

ある特定の実施形態では、細胞は、がん細胞であるか、又はがん細胞を含む。

【0038】

なお別の態様では、本発明は、配列番号１３～１５６及び／若しくは表４～７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたタンパク質を提供する。

【0039】

本発明のさらになお別の態様は、（ａ）ＣＭＶ抗原への結合によって活性化されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）ＥｐｈＡ３上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とを発現するヒトＴ細胞を提供する。

【0040】

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含むｓｃＦｖである。

【0041】

類似の態様では、本発明は、（ａ）ＣＭＶ抗原に対して特異的であるＴＣＲを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（ｂ）ＥｐｈＡ３に結合する抗原結合分子とを含むＴ細胞を提供する。

【0042】

さらに別の態様では、本発明は、配列番号１～１２及び／若しくは表３のいずれか１つに示される核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、単離された核酸に存する。

【0043】

本明細書を通じて、文脈上別に必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載された整数又は整数の群を含むことを意味するものの、他の整数又は整数の群を除外することを意味しないと理解される。

【0044】

アミノ酸配列の文脈における「から本質的になる」とは、言及されたアミノ酸配列が、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸をさらに含むことを意味する。

【0045】

本明細書で使用する場合、不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書において、単数又は複数の要素又は特徴を指すか又はそれを範囲に含めるために使用され、「１個の（ｏｎｅ）」又は「単一の」要素又は特徴を意味又は定義すると解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞での発現のためのＥｐｈＡ３（Ｐ２９３２０｜２１－５４１）ｐｃＤＮＡ３．４のクローニング戦略。

【図2】ＥｐｈＡ３（Ｐ２９３２０|２１－５４１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析。レーンＭ_１：タンパク質マーカーＴａＫａＲａ（カタログ番号３４５２）；レーンＭ_２：タンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｍ００５２１）；レーン１：還元条件；レーン２ 非還元条件；レーンＰ：陽性対照としてのＭｕｌｔｉｐｌｅ－ｔａｇ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ｍ０１０１）；一次抗体：マウス抗Ｈｉｓ ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、カタログ番号Ａ００１８６）。

【図3】サブクローニングのために選択した親抗体クローン（パネルＡ）。マウスに対して、組換えヒトＥｐｈＡ３タンパク質（ＰＰ２９３２０|２１－５４１）による免疫処置を行った。ハイブリドーマを作製し、ＥｐｈＡ３を発現するＬＫ６３腫瘍細胞を用いたＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳによるＥｐｈＡ３特異性に基づいて、５つの親ハイブリドーマクローンをサブクローニング用に選択した（パネルＢ）。

【図4-1】ＥｐｈＡ３に対して作製したモノクローナル抗体は異なる結合効率を有する。サブクローン上清を、ＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びＦＡＣＳ（パネルＢ）によってＥｐｈＡ３結合効率に関してスクリーニングした。

【図4-2】ＥｐｈＡ３に対して作製したモノクローナル抗体は異なる結合効率を有する。サブクローン上清を、ＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びＦＡＣＳ（パネルＢ）によってＥｐｈＡ３結合効率に関してスクリーニングした。

【図4-3】ＥｐｈＡ３に対して作製したモノクローナル抗体は異なる結合効率を有する。サブクローン上清を、ＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びＦＡＣＳ（パネルＢ）によってＥｐｈＡ３結合効率に関してスクリーニングした。

【図5】ＥｐｈＡ３は神経膠腫細胞株上に発現される。培養したＵ８７細胞株、Ｄ２７０細胞株及びＵ２５１細胞株上での、３Ｃ３－１抗ＥｐｈＡ３を使用したフローサイトメトリー分析。

【図6】３Ｃ３－１ ｓｃＦｖ結合領域とＣＤ２８ζ又は４－１ＢＢζシグナル伝達ドメインとを有する、（上）ｐＤ２１０９－ＦＡ３０１＿Ｉｒｅｓ－ＲＦＰ ＣＡＲ構築物、及び（下）ｐＤ２１０９－ＦＡ３０２＿Ｉｒｅｓ－ＲＦＰ ＣＡＲ構築物の略図。

【図7】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＣＡＲ Ｔ断片（５４６ｂｐ）をまたぐ配列のＲＴ－ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動。順方向プライマー－ＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡ及び逆方向プライマー－ＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＧＧＣＡＣプライマー。

【図8】構築物ＦＡ３０１及びＦＡ３０２（ＲＦＰレポーター）及びｐＤ２１０９（ＧＦＰレポーター）に対して作製されたＥｐｈＡ３－ＣＡＲレンチウイルスによるＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入。

【図9】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＥｐｈＡ３－ＣＡＲの表面発現。細胞に対して、（左）ＦＡ３０１レンチウイルス及び（右）ＦＡ３０２レンチウイルスによる形質導入を行い、プレートに結合したＥｐｈＡ３－ｈｉｓタンパク質とともにインキュベートした。ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ表面発現を決定するために、細胞をαＥｐｈＡ３一次Ａｂの存在下又は非存在下で染色し、その後にαＨｉｓタグＡｂによって染色した。

【図10】ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＥｐｈＡ３によって活性化される。ＦＡ３０１及びＦＡ３０２により形質導入を行ったＪｕｒｋａｔ細胞を、プレートに結合した漸増濃度のＥｐｈＡ３タンパク質とともにインキュベートした。細胞をＦＡＣｓによってＣＤ６９発現に関して染色し、ＣＡＲを発現するＲＦＰ陽性のレベルをＲＦＰ陰性細胞と比較した。

【図11】ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＥｐｈＡ３を発現する腫瘍細胞株によって活性化される。ＦＡ３０１により形質導入を行ったＪｕｒｋａｔ細胞を、Ｌｋ６３細胞とともに１：１０の比（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＡＲ：Ｌｋ６３）でインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣｓによってＣＤ６９発現に関して染色し、ＲＦＰ陽性細胞でのレベルをＲＦＰ陰性細胞と比較した。

【図12】ＣＭＶにより増大させたＴ細胞に対して、ｐＤ２１０９レンチウイルス及びＦＡ３０１レンチウイルスによる形質導入を行った。３日後にＦＡＣＳによって形質導入効率を決定した。

【図13】ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の共刺激ドメインのインビトロ比較。（Ａ）末梢血単核細胞をＣＤ３／２８^＋ビーズを使用して刺激して（ポリクローナル性増大）、細胞に対してＥｐｈＡ３レンチウイルスＦＡ３０５－ＢＢζ又はＦＡ３０６－２８ζによる形質導入を行い、１２日間培養した。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を対照として維持した。ＣＡＲ発現を、抗マウスＩｇＧ（ＣＡＲ）の表面発現及びＦＡＣＳによる分析によって判定した。（Ｂ）ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能の特性決定。ＣＡＲにより形質導入を行ったＴ細胞を、ＬＫ６３（ＥｐｈＡ３＋）標的細胞とともに一晩インキュベートして、細胞内ＴＮＦを使用して機能を調べた。

【図14】ＣＡＲ Ｔ細胞の作製。末梢血単核細胞を、ＣＤ３／２８^＋ビーズ（ポリクローナル性増大）又は複数のＣＭＶ抗原に由来する２６種のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞ペプチドエピトープのプールを使用して刺激した。これらの細胞に対してＥｐｈＡ３レンチウイルスにより形質導入を行い、１４日間培養した。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を対照として維持した。ＣＡＲの発現及びＣＭＶ特異性を、抗マウスＩｇＧ（ＣＡＲ）及びＨＬＡ複合体－ＣＭＶに対するペプチド四量体（ＶＴＥ及びＥＬＫ）に関するＦＡＣＳ分析によって判定した。

【図15】ポリクローナル性ＣＭＶ特異的Ｔ細胞における、ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞エフェクター機能及び細胞傷害性の比較。（Ａ）ＣＡＲにより形質導入を行ったＴ細胞を、ＬＫ６３（ＥｐｈＡ３＋）標的細胞とともに一晩インキュベートし、細胞内ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＣＤ１０７ａの細胞表面動員を使用して機能を調べた。

【図16】ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性の特性決定。（Ａ）ＥｐｈＡ３－ＣＡＲを発現するＴ細胞がＥｐｈＡ３＋腫瘍を特異的に除去する能力を、Ｕ２５１（ＥｐｈＡ３＋）及びＵ８７（ＥｐｈＡ３－）神経膠腫細胞株のリアルタイム標的誘発性細胞溶解によって測定した。（Ｂ及びＣ）Ｕ２５１標的細胞株を使用する、１：１、５：１及び１０：１のエフェクター・標的比でのポリクローナル性ＣＭＶ特異的ＥｐｈＡ３－ＣＡＲのＲＴＣＡ分析。

【図17-1】ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＢＭの異種移植モデルにおいて強力な抗ＧＢＭ応答を媒介する。（Ａ）実験設計の略図。ＮＲＧマウスに対して、ルシフェラーゼを発現する神経膠腫細胞株Ｕ２５１（ＥｐｈＡ３＋）又はＵ８７（ＥｐｈＡ３－）を、側腹に皮下移植した（異所性モデル）。腫瘍サイズを測定するか又はバイオルミネセンスによって決定した。腫瘍がおよそ２５ｍｍ^２に達した時点で、マウスにＥｐｈＡ３－ＣＡＲ、ＮＴ（非形質導入）Ｔ細胞又はＣＡＲ１９（非特異的ＣＡＲ Ｔ細胞）を静脈内投与した。第１７日に採取した血液における（Ｂ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のパーセンテージ、並びに（Ｃ）Ｋｉ６７発現、の代表的なＦＡＣＳプロット分析。

【図17-2】ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＢＭの異種移植モデルにおいて強力な抗ＧＢＭ応答を媒介する。（Ｄ）腫瘍退縮に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の影響を判定するために、Ｕ２５１腫瘍量を毎週決定した。（Ｅ）Ｕ２５１及びＵ８７担持マウスにおけるＣＡＲ ＥｐｈＡ３治療の比較。（Ｆ）Ｕ２５１（左）及びＵ８７（右）発光腫瘍異種移植マウスのインビボイメージング。（Ｇ）ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ治療又は対照細胞（ＮＴ又はＣＡＲ１９）の投与を受けたマウスに関するＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。

【発明を実施するための形態】

【0047】

［配列の簡単な説明］
配列番号１ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
配列番号２ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
配列番号３ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
配列番号４ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
配列番号５ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
配列番号６ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
配列番号７ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
配列番号８ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
配列番号９ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
配列番号１０ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列
配列番号１１ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列
配列番号１２ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列
配列番号１３ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１４ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１５ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１６ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１７ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１８ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１９ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号２０ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号２１ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号２２ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号２３ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号２４ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号２５ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号２６ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号２７ クローン３Ｃ３－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号２８ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号２９ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号３０ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号３１ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号３２ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号３３ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号３４ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号３５ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号３６ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号３７ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号３８ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号３９ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号４０ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号４１ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号４２ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号４３ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号４４ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号４５ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号４６ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号４７ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号４８ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号４９ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号５０ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号５１ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号５２ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号５３ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号５４ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号５５ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号５６ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号５７ クローン２Ｄ４－１ 重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号５８ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号５９ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号６０ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号６１ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号６２ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号６３ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号６４ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号６５ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号６６ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号６７ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号６８ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号６９ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号７０ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号７１ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号７２ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号７３ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号７４ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号７５ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号７６ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号７７ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号７８ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号７９ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号８０ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号８１ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号８２ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号８３ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号８４ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号８５ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号８６ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号８７ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号８８ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号８９ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号９０ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号９１ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号９２ クローン３Ｃ３－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号９３ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号９４ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号９５ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号９６ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号９７ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号９８ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号９９ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１００ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１０１ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１０２ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１０３ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１０４ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１０５ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１０６ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１０７ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１０８ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１０９ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１１０ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１１１ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１１２ クローン３Ｃ３－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１１３ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１１４ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１１５ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１１６ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１１７ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１１８ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１１９ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１２０ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１２１ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１２２ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１２３ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１２４ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１２５ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１２６ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１２７ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１２８ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１２９ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１３０ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１３１ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１３２ クローン２Ｄ４－１ ＨＦＲ４アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１３３ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１３４ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１３５ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１３６ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１３７ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ１アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１３８ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１３９ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１４０ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１４１ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１４２ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ２アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１４３ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１４４ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１４５ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１４６ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１４７ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ３アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１４８ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｈｏｔｈｉａ）
配列番号１４９ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（ＡｂＭ）
配列番号１５０ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｋａｂａｔ）
配列番号１５１ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（Ｃｏｎｔａｃｔ）
配列番号１５２ クローン２Ｄ４－１ ＬＦＲ４アミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
配列番号１５３ クローン３Ｃ３－１ 重鎖アミノ酸配列
配列番号１５４ クローン３Ｃ３－１ 軽鎖アミノ酸配列
配列番号１５５ クローン２Ｄ４－１ 重鎖アミノ酸配列
配列番号１５６ クローン２Ｄ４－１ 軽鎖アミノ酸配列
配列番号１５７ ＣＤ８シグナルペプチド配列
配列番号１５８ スペーサー／リンカーアミノ酸配列
配列番号１５９ ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通アミノ酸配列
配列番号１６０ ４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメイン
配列番号１６１ ＣＤ２８共刺激ドメイン
配列番号１６２ ＣＤ３－ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
配列番号１６３ ＩＲＥＳ核酸配列
配列番号１６４ Ｍ＿Ｃａｙｅｎｎｅ ＲＦＰアミノ酸配列
配列番号１６５ ヒトＥｐｈＡ３アミノ酸配列（前駆体）
配列番号１６６ ヒトＥｐｈＡ３成熟アミノ酸配列
配列番号１６７ ヒトＥｐｈＡ３細胞外ドメインアミノ酸配列
配列番号１６８ ヒトＥｐｈＡ３膜貫通ドメインアミノ酸配列
配列番号１６９ ヒトＥｐｈＡ３細胞質ドメインアミノ酸配列
配列番号１７０ ヒトＥｐｈＡ３ Ｅｐｈリガンド結合ドメインアミノ酸配列
配列番号１７１ ヒトＥｐｈＡ３フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインアミノ酸配列
配列番号１７２ ヒトＥｐｈＡ３フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインアミノ酸配列
配列番号１７３ ヒトＥｐｈＡ３プロテインキナーゼドメインアミノ酸配列
配列番号１７４ ヒトＥｐｈＡ３ステライルαモチーフアミノ酸配列

【0048】

［発明の詳細な説明］
本発明は、少なくとも一部には、ＥｐｈＡ３を対象とするモノクローナル抗体の作製、及びその後の、これらのモノクローナル抗体の結合ドメインに基づくキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の作出に基づく。これらのモノクローナル抗体は、がん、例えば多形性神経膠芽細胞腫の治療及び／又は予防に特に好適である可能性がある。さらに、これらのＣＡＲを発現するＴ細胞は、がんを有する対象における養子免疫療法にも好適である可能性がある。

【0049】

本発明は、既知の抗ＥｐｈＡ３抗体と比較して新規及び／又は改善された特性を有する新規ＥｐｈＡ３結合分子に関する。一態様では、本発明は、配列番号１３～７２及び／若しくは表２～５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む新規ＥｐｈＡ３結合分子を提供する。

【0050】

ＥｐｈＡ３
エフリンＡ型受容体３（ＥｐｈＡ３。例えば、ＥＰＨ受容体Ａ３、ＥＰＨ様キナーゼ４、ヒト胚キナーゼ、チロシン－プロテインキナーゼＴＹＲＯ４、及びチロシン－プロテインキナーゼ受容体ＥＴＫ１とも呼ばれる）としては、完全長ＥｐｈＡ３タンパク質、並びにその断片、バリアント及び誘導体を含む、すべての既知及び天然性のＥｐｈＡ３分子が挙げられる。ＥｐｈＡ３としては、哺乳動物ＥｐｈＡ３、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９３２０（配列番号１６５に示される）によって特定されるヒトＥｐｈＡ３が挙げられるが、これには限定されない。ヒトでは、ＥｐｈＡ３は、ＥＰＨＡ３遺伝子（ＥＴＫ、ＥＴＫ１、ＨＥＫ、及びＴＹＲＯ４としても知られる）によってコードされる。ＥｐｈＡ３の機能は、例えば、Ｂｏｙｄら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６７（５）：３２６２～３２６７に記載されており、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ＥｐｈＡ３は、近傍細胞表面に存在する膜結合エフリンファミリーリガンドに乱交雑性に結合して、隣接細胞への接触依存的な双方向性シグナル伝達を導く受容体型チロシンキナーゼとして機能する、約１１０ｋＤａの１回通過Ｉ型膜貫通タンパク質である。

【0051】

配列番号１６５のＮ末端の２０個のアミノ酸がシグナルペプチドを構成し、そのため成熟型のＥｐｈＡ３（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシングの後）は、配列番号１６６に示されるアミノ酸を有する。配列番号１６５の位置２１～５４１は細胞外ドメインを形成し（配列番号１６７）、位置５４２～５６５は膜貫通ドメインを形成し（配列番号１６８）、位置５６６～９８３は細胞質ドメインを形成する（配列番号１６９）。細胞外ドメインは、Ｅｐｈリガンド結合ドメイン（配列番号１７０に示される、配列番号１６５の位置２９～２０７）と、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（それぞれ配列番号１７１及び１７２に示される、配列番号１６５の位置３２５～４３５及び配列番号１６５の位置４３６～５３１）とを含む。細胞質ドメインは、プロテインキナーゼドメイン（配列番号１７３に示される、配列番号１６５の位置６２１～８８２）を含む。細胞質ドメインはまた、ステライルαモチーフ（ＳＡＭ）（配列番号１７４に示される、配列番号１６５の位置９１１～９７５）も含む。

【0052】

ＥｐｈＡ３成熟アミノ酸配列：
MDCQLSILLLLSCSVLDSFGELIPQPSNEVNLLDSKTIQGELGWISYPSHGWEEISGVDEHYTPIRTYQVCNVMDHSQNNWLRTNWVPRNSAQKIYVELKFTLRDCNSIPLVLGTCKETFNLYYMESDDDHGVKFREHQFTKIDTIAADESFTQMDLGDRILKLNTEIREVGPVNKKGFYLAFQDVGACVALVSVRVYFKKCPFTVKNLAMFPDTVPMDSQSLVEVRGSCVNNSKEEDPPRMYCSTEGEWLVPIGKCSCNAGYEERGFMCQACRPGFYKALDGNMKCAKCPPHSSTQEDGSMNCRCENNYFRADKDPPSMACTRPPSSPRNVISNINETSVILDWSWPLDTGGRKDVTFNIICKKCGWNIKQCEPCSPNVRFLPRQFGLTNTTVTVTDLLAHTNYTFEIDAVNGVSELSSPPRQFAAVSITTNQAAPSPVLTIKKDRTSRNSISLSWQEPEHPNGIILDYEVKYYEKQEQETSYTILRARGTNVTISSLKPDTIYVFQIRARTAAGYGTNSRKFEFETSPDSFSISGESSQVVMIAISAAVAIILLTVVIYVLIGRFCGYKSKHGADEKRLHFGNGHLKLPGLRTYVDPHTYEDPTQAVHEFAKELDATNISIDKVVGAGEFGEVCSGRLKLPSKKEISVAIKTLKVGYTEKQRRDFLGEASIMGQFDHPNIIRLEGVVTKSKPVMIVTEYMENGSLDSFLRKHDAQFTVIQLVGMLRGIASGMKYLSDMGYVHRDLAARNILINSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEAAYTTRGGKIPIRWTSPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVLWEVMSYGERPYWEMSNQDVIKAVDEGYRLPPPMDCPAALYQLMLDCWQKDRNNRPKFEQIVSILDKLIRNPGSLKIITSAAARPSNLLLDQSNVDITTFRTTGDWLNGVWTAHCKEIFTGVEYSSCDTIAKISTDDMKKVGVTVVGPQKKIISSIKALETQSKNGPVPV
［配列番号１６５］

【0053】

本明細書において、「ＥｐｈＡ３」は、任意の種に由来するＥｐｈＡ３を指し、ＥｐｈＡ３のアイソフォーム、断片、バリアント（突然変異体を含む）、又は任意の種に由来する相同体を含む。

【0054】

本明細書で使用する場合、タンパク質の「断片」、「バリアント」、又は「相同体」は、任意選択で、参照タンパク質（例えば、参照アイソフォーム）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するとして特徴付けることができる。一部の実施形態では、参照タンパク質の断片、バリアント、アイソフォーム及び相同体は、参照タンパク質によって発揮される機能を発揮する能力によって特徴付けることができる。

【0055】

「断片」とは、タンパク質のアミノ酸配列の１００％未満を構成する、参照タンパク質のセグメント、ドメイン、部分又は領域を一般に指す。「バリアント」とは、参照タンパク質のアミノ酸配列に比して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失又は他の改変を含むが、参照タンパク質のアミノ酸配列に対してかなり高い程度の配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を保持するアミノ酸配を有するタンパク質を一般に指す。「アイソフォーム」とは、参照タンパク質の種と同じ種によって発現される参照タンパク質のバリアントを一般に指す。「相同体」とは、参照タンパク質の種と比較して異なる種によって産生される参照タンパク質のバリアントを一般に指す。相同体にはオルソログが含まれる。

【0056】

断片は、任意の長さ（アミノ酸の数による）であり得るが、任意選択で、参照タンパク質（すなわち、断片の由来であるタンパク質）の長さの少なくとも２０％であることができ、参照タンパク質の長さの５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つである最大の長さを有することができる。ＥｐｈＡ３の断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０アミノ酸又は最長で約６００アミノ酸のうちの１つである最小の長さを有することができ、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０アミノ酸又は最長で約６００アミノ酸のうちの１つである最大の長さを有することができる。

【0057】

一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３は、哺乳動物に由来するＥｐｈＡ３（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、又はヒト）及び／又は齧歯動物（例えば、ラット又はマウス）のＥｐｈＡ３）である。ＥＰｈＡ３のアイソフォーム、断片、バリアント又は相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する未成熟又は成熟ＥｐｈＡ３アイソフォームのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するとして特徴付けることができる。

【0058】

アイソフォーム、断片、バリアント、又は相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に好適なアッセイによる分析によって決定した場合に参照ＥｐｈＡ３の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、バリアント、又は相同体であり得る。例えば、ＥｐｈＡ３のアイソフォーム、断片、バリアント、又は相同体は、例えば、ＥｐｈＡ５との会合を示すか、又はキナーゼ活性を保持し得る。

【0059】

一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３は、配列番号１６５又は１６６に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３の断片は、配列番号１６７、１７０、１７１、１７２のうちの１つ、又はそれらの組合せに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

【0060】

ＥｐｈＡ３は、プロテインチロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーのメンバーであり、悪性黒色腫、神経膠芽細胞腫、肺がん及び乳がんを含む種々のヒトがんで、異常に発現されることが知られている。ＥｐｈＡ３の発現増加は、腫瘍細胞増殖、血管新生、及び浸潤を促進するおそれがある。

【0061】

標的分子上の目的の領域
本発明の抗原結合分子は、特に目的となるＥｐｈＡ３の領域を標的化するように特別に設計した。予想される抗原性、機能及び安全性に関する分析の後に、標的化しようとするＥｐｈＡ３領域を２ステップアプローチで選択した。続いて、ＥｐｈＡ３の標的領域に対して特異的な抗体を、特異的モノクローナル抗体を生じさせるための免疫原としての標的領域に対応するペプチド、及び天然状態のＥｐｈＡ３に結合可能な抗体を同定するための後続のスクリーニングを使用して調製した。このアプローチは抗体エピトープに対する制御をもたらす。

【0062】

本発明の抗原結合分子は、それらが結合するＥｐｈＡ３の領域を参照することによって定義することができる。本発明の抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３の目的の特定領域に結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合分子は、アミノ酸の連続した配列（すなわち、アミノ酸の一次配列）からなるＥｐｈＡ３の直鎖状エピトープに結合することができる。一部の実施形態では、抗原結合分子は、アミノ酸配列のうちのアミノ酸の不連続配列からなるＥｐｈＡ３の立体構造エピトープに結合することができる。

【0063】

一部の実施形態では、抗原結合分子はＥｐｈＡ３に結合する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３の細胞外領域（例えば、配列番号１６７に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、Ｅｐｈリガンド結合ドメインのドメイン（例えば、配列番号１７０に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの一方又は両方に結合する（例えば、配列番号１７１及び１７２に示される領域）。

【0064】

抗体が結合するペプチド／ポリペプチドの領域は、Ｘ線結晶解析、抗体抗原複合体の任意の分析、ペプチドスキャニング、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素－重水素交換分析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、及びタンパク質分解に基づく「保護」法を含む、当技術分野で周知の様々な方法を使用して、当業者によって決定され得る。そのような方法は、例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５～１５６に記載されており、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0065】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、本明細書に記載の抗体クローン３Ｃ３－１又は２Ｄ４－１のうちの１つのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む抗体が結合するＥｐｈＡ３の領域と同じＥｐｈＡ３の領域、又はそれに重なるＥｐｈＡ３の領域に結合することが可能である。

【0066】

本明細書で使用する場合、「単離された」とは、その天然状態から取り出されたか、又は他の方法で人為的操作を受けた材料、例えば、ＥｐｈＡ３結合分子を意味する。単離された材料は、その天然状態でそれに通常付随する成分を実質的若しくは本質的に含まなくてもよく、又はその天然状態でそれに通常付随する成分とともに人工的な状態となるように操作されてもよい。単離された材料は、組換え形態、化学合成形態、強化された形態、精製又は部分的に精製された形態であり得る。

【0067】

本明細書で使用する場合、「タンパク質」とはアミノ酸ポリマーのことであり、ここでアミノ酸としてはＤ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、天然及び／又は非天然アミノ酸が挙げられる。本明細書で典型的に使用する場合、「ペプチド」とは、５０個以下の連続したアミノ酸を含むタンパク質のことである。本明細書で典型的に使用する場合、「ポリペプチド」とは、５０個を上回る連続したアミノ酸を含むタンパク質のことである。「タンパク質」という用語は、糖タンパク質及びリポタンパク質などのタンパク質含有分子も範囲に含むが、それらに限定されないことも理解される必要がある。

【0068】

一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、配列番号１６５、１６６、１６７、１７０、１７１、又は１７２のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるポリペプチドに結合することができる。

【0069】

抗原結合分子が所与のペプチド／ポリペプチドに結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウエスタンブロット）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２０１２） ９０７：４１１～４４２を参照）、又はバイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら、（２０１５）Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ ２０（４）：４９８～５０７を参照）による分析を含む、当業者に周知の方法によって分析し得る。

【0070】

抗原結合分子が、参照アミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドに結合することが可能である実施形態では、ペプチド又はポリペプチドは、参照アミノ酸配列の一方又は両方の末端に、１つ以上のさらなるアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、参照アミノ酸配列の一方又は両方の末端に、例えば、１～５個、１～１０個、１～２０個、１～３０個、１～４０個、１～５０個、５～１０個、５～２０個、５～３０個、５～４０個、５～５０個、１０～２０個、１０～３０個、１０～４０個、１０～５０個、２０～３０個、２０～４０個、又は２０～５０個のさらなるアミノ酸を含む。

【0071】

一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３のアミノ酸配列の文脈において、参照配列の一方又は両方の末端（すなわち、Ｎ末端及びＣ末端）に付与されるさらなるアミノ酸（複数可）は、参照配列の末端における位置に対応する。一例を挙げると、抗原結合分子が、配列番号３の配列、及び配列番号３のＣ末端にさらなる２つのアミノ酸を含むペプチド又はポリペプチドに結合することが可能である場合、さらなる２つのアミノ酸は両方とも、配列番号１６５の位置５４２及び５４３に対応するバリンであり得る。

【0072】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、本明細書に記載の抗体クローン３Ｃ３－１又は２Ｄ４－１のうちの１つのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む抗体が結合するペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。

【0073】

抗原結合分子
本発明は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能な抗原結合分子を提供する。

【0074】

「抗原結合分子」とは、標的抗原に結合することが可能な分子を指し、それらが該当する標的分子への結合を呈する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに抗体断片を範囲に含む。

【0075】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＥｐｈＡ３結合分子は、抗体又は抗体断片である。本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリンタンパク質であるか、又はそれを含む。「免疫グロブリン」という用語には、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＥ、並びにその抗原結合断片を含む、哺乳動物免疫グロブリン遺伝子複合体の任意の抗原結合性タンパク質産物が含まれる。「免疫グロブリン」という用語には、天然性か又は人為的介入（例えば、組換えＤＮＡ技術による）によって作製されるかにかかわらず、組換え性、キメラ性若しくはヒト化されているか、又は他の様式で改変若しくはバリアントアミノ酸残基、配列及び／若しくはグリコシル化を含む、免疫グロブリンが含まれる。

【0076】

一般に、抗体及び抗体断片は、ポリクローナル性又はモノクローナル性であり得る。特定の実施形態では、抗体又は抗体断片は、図１に提示されるモノクローナル抗体のうちの１つ（又はその断片）、例えば、３Ｃ３－１若しくは２Ｄ４－１モノクローナル抗体、又はその断片である。

【0077】

本発明はまた、本明細書に記載のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片も、その範囲に含む。あるいは、本発明のＥｐｈＡ３結合剤は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及び／又はｓｃＦａｂ抗体を含み得る。そのようなｓｃＦｖは、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号、又はＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによる論文、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３にそれぞれ記載される方法に従って調製することができ、これらは参照によって本明細書に組み入れられる。本発明はまた、複数のｓｃＦｖを含む多価組換え抗体断片、いわゆるダイアボディ、トリアボディ及び／又はテトラボディ、並びに二量化活性化デミボディ（例えば、国際公開第２００７／０６２４６６号）も含むことを想定している。一例を挙げると、そのような抗体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８；又はＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ、２００９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５６２：１７７～９３に記載された方法に従って調製することができ、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0078】

また、抗体又は抗体断片をコードする核酸を適切な宿主細胞において発現させることによって、抗体を組換え合成抗体又は抗体断片として産生させ得ることも理解されるであろう。組換え抗体の発現及び選択の手法の非限定的な例は、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹの第１７章、及びＺｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒら、２００９、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２２ １６９に提示されている。

【0079】

典型的には、抗体は、それぞれが相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３アミノ酸配列を含む各々の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ又はＶＬ）及び重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ又はＶＨ）、並びに各々の軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）及び重鎖定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３）を含む。したがって、抗体は、６つのＣＤＲ（重鎖可変領域に３つ、及び軽鎖可変領域に３つ）を一般に含む。この６つのＣＤＲが相伴って、標的抗原に結合する抗体の部分である抗体のパラトープを規定する。

【0080】

本発明の抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の配列を使用して、設計及び調製することができる。また、抗体の抗原結合領域、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片を使用／用意することもできる。「抗原結合領域」とは、所与の抗体が特異的である標的に結合することが可能な、抗体の任意の断片である。

【0081】

Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、各ＣＤＲの両側にフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、これはＣＤＲにとっての足場となる。Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｖ_Ｈ領域は以下の構造を含む：Ｎ末端－［ＨＣ－ＦＲ１］－［ＨＣ－ＣＤＲ１］－［ＨＣ－ＦＲ２］－［ＨＣ－ＣＤＲ２］－［ＨＣ－ＦＲ３］－［ＨＣ－ＣＤＲ３］－［ＨＣ－ＦＲ４］－Ｃ末端、及び、Ｖ_Ｌ領域は以下の構造を含む：Ｎ末端－［ＬＣ－ＦＲ１］－［ＬＣ－ＣＤＲ１］－［ＬＣ－ＦＲ２］－［ＬＣ－ＣＤＲ２］－［ＬＣ－ＦＲ３］－［ＬＣ－ＣＤＲ３］－［ＬＣ－ＦＲ４］－Ｃ末端。

【0082】

ＣＤＲの同定及び番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ （Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１～９１７（１９８７））、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔを含む、任意の既知のＣＤＲ番号付け方式に従って行うことができる。

【0083】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能な抗原結合分子のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能な抗原結合分子のＦＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能な抗原結合分子のＣＤＲ及びＦＲを含む。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合することが可能な抗原結合分子のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0084】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、本明細書に詳細に記載されるＥｐｈＡ３結合抗体（すなわち、抗ＥｐｈＡ３抗体クローン３Ｃ３－１又は２Ｄ４－１）のＶＨ／ＶＬ領域であるか、又はそれに由来する、Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

【0085】

ＣＤＲアミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号１３～７２及び／又は表２～５に示されている。ＣＤＲの同定及び番号付けは、ａｂＹｓｉｓバージョン３．４．１及びＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して行った。本発明による抗体は、１つ、２つ若しくは３つのＶ_ＬＣＤＲアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくはＣＤＲ３）並びに／又は１つ、２つ、若しくは３つのＶ_ＨＣＤＲアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくはＣＤＲ３）、例えば、配列番号１３～７２及び／又は表２～５に示されるものを含み得る。

【0086】

一部の実施形態では、ＥｐｈＡ３結合剤は、
（ａ）配列番号１３～１７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１８～２２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号２３～２７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）ポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号２８～３２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号３３～３７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号３８～４２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）ポリペプチド
を含む。

【0087】

そのような実施形態に関して、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５３に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一なアミノ酸配列を好適に含み、及び／又は、ＶＬポリペプチドは、配列番号１５４に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一なアミノ酸配列を好適に含む。

【0088】

代替的な実施形態では、ＥｐｈＡ３結合剤は
（ａ）配列番号４３～４７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号４８～５２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号５３～５７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＨポリペプチド、及び／又は
（ｂ）配列番号５８～６２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１と、配列番号６３～６７のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ２と、配列番号６８～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するＣＤＲ３とを含む、ＶＬポリペプチド
を含む。

【0089】

この点に関して、ＶＨポリペプチドは、配列番号１５５に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、及び／又は、ＶＬポリペプチドは、配列番号１５６に示されるアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。

【0090】

本明細書に詳細に記載される抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲ及びＦＲは、ＬｅＦｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２７：５５～７７に記載された、国際ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）情報システム（ＬｅＦｒａｎｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、（２０１５） ４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３～２２）に従って以下に定義される。一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（１）又は（２）によるＶＨ領域を含む：
（１）（３Ｃ３－１）以下のＣＤＲ：
配列番号１６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、
配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、
配列番号２７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
又はＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ２若しくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＨ領域。
（２）（２Ｄ４－１）以下のＣＤＲ：
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、
配列番号５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、
配列番号５７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３、
又はＨＣ－ＣＤＲ２、ＨＣ－ＣＤＲ２若しくはＨＣ－ＣＤＲ３のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＨ領域。

【0091】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（３）又は（４）によるＶＨ領域を含む：
（３）（３Ｃ３－１）以下のＦＲ：
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１、
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２、
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３、
配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
又はＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３若しくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＨ領域。
（４）（２Ｄ４－１）以下のＦＲ：
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ１、
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ２、
配列番号１４７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ３、
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＦＲ４、
又はＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３若しくはＨＣ－ＦＲ４のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＨ領域。

【0092】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、上記の（１）及び（２）のうちの１つによるＣＤＲと、上記の（３）又は（４）によるＦＲとを含むＶＨ領域を含む。

【0093】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（５）又は（６）のうちの１つによるＶＨ領域を含む：
（５）（１）によるＣＤＲと（３）によるＦＲとを含むＶＨ領域。
（６）（２）によるＣＤＲと（４）によるＦＲとを含むＶＨ領域。

【0094】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（７）又は（８）によるＶＬ領域を含む：
（７）（３Ｃ３－１）以下のＣＤＲ：
配列番号３２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３、
又はＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ２若しくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＬ領域。
（８）（２Ｄ４－１）以下のＣＤＲ：
配列番号６２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３、
又はＬＣ－ＣＤＲ２、ＬＣ－ＣＤＲ２若しくはＬＣ－ＣＤＲ３のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＬ領域。

【0095】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（９）又は（１０）によるＶＬ領域を含む：
（９）（３Ｃ３－１）以下のＦＲ：
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１、
配列番号１０２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２、
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３、
配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
又はＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３若しくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＬ領域。
（１０）（２Ｄ４－１）以下のＦＲ：
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ１、
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ２、
配列番号１４７のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ３、
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＦＲ４、
又はＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３若しくはＬＣ－ＦＲ４のうちの１つ若しくは複数において１つ若しくは２つ若しくは３つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、そのバリアント
を組み入れたＶＬ領域。

【0096】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、上記の（１）及び（２）のうちの１つによるＣＤＲと、上記の（３）又は（４）によるＦＲとを含むＶＬ領域を含む。

【0097】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（１１）又は（１２）のうちの１つによるＶＨ領域を含む：
（１１）（７）によるＣＤＲと（９）によるＦＲとを含むＶＨ領域。
（１２）（８）によるＣＤＲと（１０）によるＦＲとを含むＶＨ領域。

【0098】

抗体の抗原結合領域のＶＨ領域及びＶＬ領域は、相伴ってＦｖ領域を構成する。一部の実施形態では、本発明による抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合するＦｖ領域を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態では、ＦｖのＶＨ領域及びＶＬ領域は、リンカー領域によって接合された単一のポリペプチド、すなわち単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として提供される。

【0099】

一部の実施形態では、本発明は、本発明の単離された抗体及びＣＡＲの断片を提供する。

【0100】

本発明の断片は、本明細書に記載される方法によって作製することができる。あるいは、断片を、プロテイナーゼ、例えばｅｎｄｏＬｙｓ－Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ－Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ－Ｃ及びＶ８－プロテアーゼを用いた抗体又はＣＡＲタンパク質の消化によって作製することもできる。消化された断片を、当技術分野で周知のクロマトグラフィー手法によって精製することができる。

【0101】

本発明の特定の実施形態は、本発明のＥｐｈＡ３抗原結合分子の免疫原性断片を提供する。「免疫原性」とは、ヒト、マウス又はウサギなどの動物への投与後に免疫応答を誘発し得ることを意味する。免疫応答には、Ｂリンパ球及び／若しくはＴリンパ球、ＮＫ細胞、顆粒球、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫細胞、並びに／又は抗体、サイトカイン及びケモカインなどの分子を含む、免疫系の先天性及び／又は適応性部門の産生、活性化又は刺激が含まれ得るが、これらには限定されない。

【0102】

抗体断片には、Ｆａｂ及びＦａｂ’２断片、ダイアボディ、トリアボディ、二重特異性抗体及び単鎖抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）が含まれるが、これらには限定されない。一部の実施形態では、抗体断片は、例えば配列番号１３～７２に示される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくはＣＤＲ３のアミノ酸配列、又は例えば配列番号１５３～１５６に示される、Ｖ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌアミノ酸配列の、少なくとも一部分を含み得る。好ましい抗体断片は、少なくとも１つの軽鎖可変領域ＣＤＲの全体、及び／又は少なくとも１つの重鎖可変領域ＣＤＲの全体を含む。

【0103】

一部の実施形態では、本明細書中に提供されるＥｐｈＡ３結合剤は、組換え、ヒト、若しくはヒト化抗体、又は抗体断片である。本明細書で広く使用する場合、「ヒト化」抗体には、非ヒト「外来」種から得られた改変抗体または抗体断片を含む、完全又は少なくとも部分的にヒト起源である抗体が含まれ得る。一部の実施形態では、抗体及び抗体断片を、「外来」抗体に対する有害な免疫応答を誘発することなく、同じ又は別の「外来」種において生じたか又はそれから派生した１つの種に投与可能であるように改変することができる。相補性決定領域（ＣＤＲ）又は可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン）を含むようなヒト抗体又は非ヒト抗体断片を、ヒト抗体の足場又は骨格に「グラフト」して、「ヒト化」抗体又は抗体断片を作製することができる。一部の実施形態では、ヒト又は非ヒトのＣＤＲ又はＶ_Ｌ及びＶ_Ｌドメインに、ヒト抗体定常領域を組換えによってグラフトすることができる。

【0104】

一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、免疫グロブリン重鎖定常配列の１つ以上の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常配列は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＭの重鎖定常配列であるか、又はそれに由来する。

【0105】

一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、ヒト免疫グロブリンＧ１定常領域配列（ＩＧＨＧ１：ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８５７、ｖ１、配列番号１７５）である。配列番号１７５の位置１～９８は、ＣＨ１領域を形成する（配列番号１７６）。配列番号１７５の位置９９～１１０は、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間のヒンジ領域を形成する（配列番号１７７）。配列番号１７５の位置１１１～２２３は、ＣＨ２領域を形成する（配列番号１７８）。配列番号１７５の位置２２２～３３０は、ＣＨ３領域を形成する（配列番号１７９）。

【0106】

免疫グロブリン重鎖定常領域ガンマ１
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK［配列番号１７５］

【0107】

一部の実施形態では、ＣＨ１領域は、配列番号１７６の配列、又は配列番号１７６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる。

【0108】

一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、免疫グロブリン軽鎖定常配列の１つ以上の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、ヒト免疫グロブリンラムダ定常領域配列（ＩＧＬＡ；ＣＡ）、例えば、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、又はＩＧＬＣ７である。一部の実施形態では、ＣＬ領域は、配列番号１８０の配列、又は配列番号１８０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる。

【0109】

免疫グロブリンラムダ定常領域
MRPGTGQGGLEAPGEPGPNLRQRWPLLLLGLAVVTHGLLRPTAASQSRALGPGAPGGSSRSSLRSRWGRFLLQRGSWTGPRCWPRGFQSKHNSVTHVFGSGTQLTVLSQPKATPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLMNDFYPGILTVTWKADGTPITQGVEMTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWRSRRSYSCQVMHEGSTVEKTVAPAECS
［配列番号１８０］

【0110】

免疫グロブリンカッパ定常領域
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
［配列番号２１２］

【0111】

抗体の抗原結合領域のＶＬ領域及び軽鎖定常（ＣＬ）領域、並びにＶＨ領域及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）は、相伴って、Ｆａｂ領域を構成する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ（例えば、Ｃ_κ又はＣ_λ）を含むＦａｂ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨ及びＣＨ１を含む（例えば、ＶＨ－ＣＨ１融合ポリペプチド）。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨ及びＣＬを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ－ＣＬ融合ポリペプチド）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨ及びＣＬを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ－ＣＬ融合ポリペプチド）、並びにＶＬ及びＣＨを含むポリペプチド（例えば、ＣＬ－ＣＨ１融合ポリペプチド）を含み、すなわち、一部の実施形態では、Ｆａｂ領域はＣｒｏｓｓＦａｂ領域である。一部の実施形態では、Ｆａｂ又はＣｒｏｓｓＦａｂのＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ領域は、リンカー領域によって接合された単一のポリペプチドとして、すなわち、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）又は単鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ（ｓｃＣｒｏｓｓＦａｂ）として提供される。

【0112】

一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合するＦａｂ領域を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0113】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合する全抗体を含むか、又はそれからなる。本明細書で使用する場合、「全抗体」とは、免疫グロブリン（Ｉｇ）の構造と実質的に同様である構造を有する抗体を指す。様々な種類の免疫グロブリン及びそれらの構造については、例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＣａｖａｃｉｎｉ、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２０１０） １２５（２０２）： Ｓ４１～Ｓ５２に記載されており、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0114】

Ｇ型の免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含む、約１５０ｋＤａの糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端の順に、重鎖は、ＶＨに続いて、３つの定常ドメインを含む重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ３、及びＣＨ３）を含み、同様に軽鎖は、ＶＬに続いてＣＬを含む。重鎖に応じて、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ｌｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭとして分類することができる。軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）であり得る。

【0115】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合分子は、ＥｐｈＡ３に結合する、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0116】

好適には、ＥｐｈＡ３結合剤は、ＥｐｈＡ３タンパク質のエピトープに結合する。本明細書で一般的に使用する場合、「エピトープ」は、タンパク質のアミノ酸の連続的又は不連続的な配列を含む抗原性タンパク質断片であり、ここでエピトープは、免疫系の要素、例えば抗体又は他の抗原受容体によって認識又は結合される。

【0117】

本発明はまた、本明細書中に開示されるＥｐｈＡ３結合剤のバリアントも含む。一実施形態では、バリアントは、配列番号１３～７２のいずれか１つに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むＥｐｈＡ３結合剤であり、これは本明細書においてＣＤＲ「バリアント」と称される。別の実施形態では、バリアントは、配列番号１５３～１５６のいずれか１つのＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む。

【0118】

好適には、ＥｐｈＡ３結合剤は、ＥｐｈＡ３タンパク質に結合することが可能な、ＣＤＲのうちの少なくとも１つ又は他のバリアント（複数可）を含む。

【0119】

特定の実施形態では、バリアントは、参照タンパク質（例えば、参照アイソフォーム）、例えば、配列番号１３～１５６のうちいずれか１つに示されるもののアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書中に開示されるタンパク質「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、又は異なるアミノ酸によって置換されているかであり得る。いくつかのアミノ酸を、ペプチドの生物活性を変化させずに置換又は欠失させ得ること（保存的置換）は、当技術分野において十分理解されている。一部の実施形態では、参照タンパク質の断片、バリアント、アイソフォーム及び相同体は、参照タンパク質によって発揮される機能を発揮する能力によって特徴付けることができる。

【0120】

保存的アミノ酸置換は当技術分野において公知であり、これには、ある特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した極性アミノ酸の別の酸性／負に荷電した極性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）による置換、非極性側鎖を有するアミノ酸の非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）による置換、塩基性／正に荷電した極性アミノ酸の別の塩基性／正に荷電した極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）による置換、極性側鎖を有する非荷電アミノ酸の極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）による置換、β分枝側鎖を有するアミノ酸のβ分枝側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、及びＶａｌ）による置換、芳香族側鎖を有するアミノ酸の芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）による置換などであり得る。

【0121】

各々のタンパク質及び核酸の間の配列関係を記載するために本明細書において一般的に使用される用語には、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的な同一性」が含まれる。各々の核酸／タンパク質はそれぞれ、（１）核酸／タンパク質で共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみ、及び（２）核酸／タンパク質の間で違いのある１つ以上の部分を含むという理由から、配列の比較は、典型的には、配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、局所的な配列類似性領域を同定し、比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」とは、参照配列と比較される、典型的には少なくとも６個、９個又は１２個の連続した残基である概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、各々の配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウのアラインメントを行うために最適な配列アラインメントは、アルゴリズム（参照によって本明細書に組み入れられる、ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によって、又は選択された様々な方法のいずれかによる検査及びいずれかにより生成される最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い相同性パーセンテージをもたらすもの）によって、実施することができる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されているような、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照することもできる。配列解析の詳細な考察は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ，１９９５～２０１５）のＵｎｉｔ １９．３に見出すことができる。

【0122】

「配列同一性」という用語は、標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮し、比較ウィンドウにわたって配列が同一である範囲を考慮して、正確なヌクレオチド一致又はアミノ酸一致の数を含むように、本明細書ではその最も広い意味で使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を得た上で、一致する位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算して、その結果を１００倍することによって配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン２．５、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから販売）によって計算される「一致パーセンテージ」を意味することが理解されるであろう。

【0123】

本明細書中に開示される抗体、抗体断片又はそのバリアントの誘導体も提供される。

【0124】

本明細書で使用する場合、「誘導体」抗体、抗体断片又はそのバリアントは、例えば、他の化学的部分とのコンジュゲーション又は複合体化によって、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化）によって、化学修飾（例えば、架橋、アセチル化、ビオチン化、酸化又は還元など）によって、標識（例えば、フルオロフォア、酵素、放射性同位元素）とのコンジュゲーションによって、及び／又は当技術分野において理解されるであろう追加のアミノ酸配列を含めることによって、改変されている。

【0125】

この点に関して、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な方法については、当業者は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５～２０１５）の第１５章を参照されたい。

【0126】

追加のアミノ酸配列には、融合タンパク質を作り出す融合パートナーアミノ酸配列が含まれ得る。一例を挙げると、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／又は精製を助けることができる。非限定的な例には、金属結合（例えば、ポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光性タンパク質配列（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ）、エピトープタグ、例えばｍｙｃ、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンタグが含まれる。

【0127】

本発明の単離されたタンパク質（例えば、ＥｐｈＡ３抗体、抗体断片及びＣＡＲ）、バリアント、断片及び／又は誘導体は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、及びペプチド断片を生成するためのタンパク質分解切断を含むがそれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段によって作製することができる。

【0128】

化学合成は、固相合成及び液相合成を含む。そのような方法は当該技術分野で周知であるが、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥＳ、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ編（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の第９章及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． ＮＹ ＵＳＡ １９９５～２００８）の第１５章に提供された化学合成の例が参照される。この点に関して、国際公開第９９／０２５５０号及び国際公開第９７／４５４４４号も参照される。

【0129】

好ましい一実施形態では、本発明のＥｐｈＡ３抗体、抗体断片及び／又はＣＡＲタンパク質は、組換えタンパク質である。

【0130】

組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、特にセクション１６及びセクション１７、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ ＵＳＡ １９９５～２００８）、特に第１０章及び第１６章、及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ ＵＳＡ １９９５～２００８）、特に第１章、第５章及び第６章に記載されるような標準的なプロトコールを使用して、当業者によって好都合に調製することができる。

【0131】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明はまた、本発明の抗原結合分子又はポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。

【0132】

したがって、本発明の関連する態様は、配列番号１３～７２に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0133】

ＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞特異性及び反応性を選択した標的に対して非ＭＨＣ拘束的な様式で再指向させるその能力が挙げられる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識してそれ故に腫瘍回避の主要な機構を迂回する能力を与える。その上、Ｔ細胞で発現される場合、ＣＡＲは有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体化しない。ＣＡＲの構造及び操作については、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）に総説されている。ＣＡＲは、細胞膜アンカー領域（膜貫通ドメインとしても知られる）及びシグナル伝達領域と連結された抗原結合領域を含む。任意選択のヒンジ領域は、抗原結合領域と細胞膜アンカー領域との分離をもたらすことが可能であり、可動性リンカーとして作用し得る。本発明のＣＡＲは、本発明によるポリペプチドを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる抗原結合性領域を含む。

【0134】

細胞膜アンカー領域は、ＣＡＲの抗原結合性領域とシグナル伝達領域との間に設けられ、抗原結合領域が細胞外腔にあり、シグナル伝達領域が細胞内にあるように、ＣＡＲを発現する細胞の細胞膜へのＣＡＲのアンカリングをもたらす。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、又はＣＤ２８のうちの１つの膜貫通領域アミノ酸配列を含むか、又はそれに由来する。好適には、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３－ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ及びそれらの任意の組合せから選択される膜タンパク質に由来する。一部の特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメインに由来することができ、これは一般に優れた受容体安定性をもたらす。本明細書で使用する場合、参照アミノ酸配列に「由来する」領域は、参照配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５９に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0135】

本明細書に記載のキメラ受容体の膜貫通ドメイン（すなわち、細胞膜アンカー領域）は、当技術分野で公知の任意の形態であり得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書で使用されるキメラ受容体における使用に適合する膜貫通ドメインは、天然起源タンパク質から得ることができる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成性の非天然起源タンパク質セグメント（例えば、細胞膜中で熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメント）であり得る。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第７，０５２，９０６号及び国際出願ＰＣＴ公開第２０００／０３２７７６号を参照のこと）。この目的のために、膜貫通ドメインが疎水性αヘリックスを含んでもよい。

【0136】

任意の細胞内又は細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ζ又はＦｃεＲ１γ）、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞のリン酸化及び活性化のための、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むものを、本明細書に記載のキメラ受容体を構築するために使用することができる。「ＩＴＡＭ」とは、本明細書で使用する場合、多くの免疫細胞で発現されるシグナル伝達分子の尾部に一般に存在する保存されたタンパク質モチーフである。抗原認識の後に、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるＴ細胞シグナル伝達構成要素は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ζのものである。これにより、抗原が結合した後に、活性化シグナルがＴ細胞に伝達される。しかし、ＣＤ３－ζ細胞質シグナル伝達ドメインから完全にコンピテントな活性化シグナルはもたらされないことがあり、追加の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書で以下に記載されるものを利用してもよいことは理解されるであろう。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するために、キメラ性ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢ／ＣＤ１３７をＣＤ３－ζとともに使用することができ、又はこの３つすべてを一緒に使用することもできる。したがって、本発明のＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン（例えば、配列番号１６１）、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７共刺激ドメイン（例えば、配列番号１６０）及びＣＤ３－ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号１６２）を含むことができる。

【0137】

また、ＣＡＲのシグナル伝達領域は、標的タンパク質への結合時にＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化を助長するように、共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列を含んでもよい。宿主細胞（例えば、免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞が、サイトカインの産生及び分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、並びに／又は細胞傷害性を増加又は減少させるように誘導することができる。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインが、本明細書に記載のキメラ受容体における使用に適し得る。共刺激シグナル伝達ドメインの種類（複数可）は、キメラ受容体が発現される免疫細胞の種類（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ効果）などの要因に基づいて選択される。換言すれば、「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞内でシグナル伝達を媒介してエフェクター機能などの免疫応答を誘導する、タンパク質の少なくとも一部分を指す。本明細書に記載のキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達して、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球などの免疫細胞によって媒介される応答を調節する、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。

【0138】

キメラ受容体における使用のための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであってよく、これには、限定はされないが、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ－Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ａｌｐｈａ／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、０Ｘ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、及び任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、及びＮＫＧ２Ｃが含まれる。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）若しくはＣＤ２、又はこれらの任意のバリアントである。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ（例えば、配列番号１６０）及び／又はＣＤ２８（例えば、配列番号１６１）に由来する。

【0139】

また、共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるような、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメインのうちいずれかのバリアントも、本開示の範囲に含まれる。さらに、キメラ受容体が、複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれ以上）を含み得ることも想定している。一部の実施形態では、キメラ受容体は、２つ又はそれ以上の同一の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つのコピーを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、異なる共刺激タンパク質、例えば、本明細書に記載の共刺激タンパク質のうちの任意の２つ又はそれ以上に由来する、２つ又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。場合によっては、ＣＡＲは、異なる細胞内シグナル伝達経路の共刺激をもたらすように操作される。例えば、ＣＤ２８共刺激に関連するシグナル伝達は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）経路を優先的に活性化し、一方、４－１ＢＢ媒介性シグナル伝達は、ＴＮＧ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）アダプタータンパク質を経由する。このため、ＣＡＲのシグナル伝達領域は、複数の共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列を含有することが時にある。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ３０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７のうちの１つ以上の細胞内ドメインのアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれに由来するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、１つ以上の共刺激配列を含む。

【0140】

任意選択のヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの分離をもたらすことができ、可動性リンカーとして作用することができる。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１に由来し得る。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれに由来するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

【0141】

本発明のＣＡＲは、例えば、当技術分野において公知である、第１世代、第２世代、第３世代又は第４世代（すなわち、普遍的サイトカイン媒介性死滅のために再指向化されたＴ細胞（ＴＲＵＣＫ）に関連する）ＣＡＲであると考え得ることが想定される。第１世代ＣＡＲは、典型的には、抗体由来ｓｃＦｖを、ヒンジ及び膜貫通ドメインを経由して、Ｔ細胞受容体のＣＤ３－ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに接合させる。第２世代ＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加のドメイン（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、又はＩＣＯＳ）を組み入れる。第３世代ＣＡＲは、典型的には、ＴＣＲ ＣＤ３－ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメインを含有する。第３世代共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３－ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ－１０又は０Ｘ４０の組合せを含み得る。したがって、本発明のＣＡＲは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に通常由来するエクトドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、ＣＤ３－ζ及び／又は共刺激分子に由来する１つ（第１世代）、２つ（第２世代）、又は３つ（第３世代）のシグナル伝達ドメインを有するエンドドメインとを含有し得る。

【0142】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、第４世代ＣＡＲとしても知られる、サイトカイン活性のために再指向化されたＴ細胞（例えば、ＴＲＵＣＫ）に関連する。ＴＲＵＣＫは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター活性を誘発するため、加えて、標的化組織（例えば、ＥｐｈＡ３を発現する腫瘍組織）に蓄積するトランスジェニックサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）を産生及び放出させるための媒体として使用される、ＣＡＲ再指向化Ｔ細胞である。トランスジェニックサイトカインは、ＣＡＲが標的に結合すると恒常的に生成又は放出される。ＴＲＵＣＫ細胞は、種々の治療用サイトカインを標的部位に配することができる。これは標的化部位に治療濃度を生じさせ、これらの同じサイトカインの全身毒性を回避することができる。

【0143】

本発明のＣＡＲは、好適には、ＥｐｈＡ３に対する抗原特異性を有する。「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答を誘発する」という語句は、本明細書で使用する場合、抗原に対するＣＡＲの結合が免疫応答を誘発するように、ＣＡＲが抗原に特異的に結合して抗原を免疫学的に認識することができることを意味する。特定の理論にも機構にも拘束されないが、ＥｐｈＡ３に対する抗原特異的応答を誘発することによって、本明細書に記載のＣＡＲは、以下のいずれかのうちの１つ以上を提供すると考えられる：ＥｐｈＡ３を発現するがん細胞の標的化及び破壊、がん細胞の減少又は排除、腫瘍部位（複数可）への免疫細胞の浸潤の助長、並びに抗がん反応の強化／拡張。

【0144】

本発明の一実施形態は、本明細書に記載のモノクローナル抗体のうちの１つの抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、例えば図１に提示されたものを提供する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＥｐｈＡ３に特異的に結合する３Ｃ３又は２Ｄ４モノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含む。この点に関して、本発明の好ましい実施形態は、３Ｃ３又は２Ｄ４の抗原結合ドメインの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。

【0145】

抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含み得る。本発明の一実施形態では、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む。この点に関して、抗原結合ドメインは、配列番号１３～１７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１８～２２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号２３～２７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域のうちの１つ以上を含み得る。代替的な一実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号４３～４７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号４８～５２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号５３～５７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域のうちの１つ以上を含む。好ましくは、重鎖は、配列番号１３～２７若しくは配列番号４３～５７又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列から選択される、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域のすべてを含む。

【0146】

本発明の一実施形態では、軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域、及び軽鎖ＣＤＲ３領域を含む。この点に関して、抗原結合ドメインは、配列番号２８～３２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号３３～３７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号３８～４２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域のうちの１つ以上を含む。代替的な一実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号５８～６２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６３～６７のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号６８～７２のいずれか１つ又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３領域のうちの１つ以上を含む。好ましくは、軽鎖は、配列番号２８～４２若しくは配列番号５８～７２又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列から選択される、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域のすべてを含む。

【0147】

抗原結合ドメインの重鎖可変領域は、配列番号１５３若しくは１５５又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になることができる。抗原結合ドメインの軽鎖可変領域は、配列番号１５４若しくは１５６又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になることができる。したがって、本発明の一実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１５３若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５４若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。代替的な一実施形態では、抗原結合ドメインは、配列番号１５５若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１５６若しくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、抗原結合ドメインは、配列番号１５３と１５４の両方若しくは配列番号１５５と１５６の両方又はそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0148】

本発明の一実施形態では、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、スペーサー又はリンカー配列によって接合され得る。リンカーは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態では、リンカーは、配列番号１５８に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になることができる。

【0149】

さらに、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結して、及び抗原結合ドメインをそのエンドドメインから空間的に隔てる、さらなるスペーサー又はリンカー配列を含むことができる。可動性スペーサー又はヒンジ領域は、ＥｐｈＡ３結合を可能にするために、抗原結合ドメインを様々な向きに配向させることを可能にする。一例を挙げると、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインもまた、本明細書に記載のキメラ受容体における使用に適合性がある。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２とを接続するヒンジドメインである。したがって、さらなるスペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、若しくはＣＤ８ストーク若しくはヒンジ、又はそれらの組合せを含み得る。

【0150】

抗原結合ドメインは、リーダー配列又はシグナルペプチド配列をさらに含み得ることを想定している。リーダー配列は、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する（例えば、重鎖可変領域に隣接して位置する）ペプチド配列（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５又は約３０アミノ酸長）であることができ、これはタンパク質を分泌経路に導く。リーダー配列は、当技術分野において公知である任意の好適なリーダー配列、例えば、ＣＤ８、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）受容体、ＣＤ２８、マウスカッパ鎖及びＣＤ１６に由来するものを含むことができる。一実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８リーダー配列である。この点に関して、抗原結合ドメインは、配列番号１５７又はそれに対して少なくとも７０％７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるリーダー配列を含み得る。本発明の一実施形態では、リーダー配列は細胞の表面でのＣＡＲの発現を助長するものの、発現されたＣＡＲにおけるリーダー配列の存在は、ＣＡＲが機能するためには必要ではない。したがって、細胞表面にＣＡＲが発現されれば、リーダー配列はＣＡＲから切断されてもよい。そのため、本発明の一実施形態では、ＣＡＲはリーダー配列を欠く。

【0151】

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、通常、スペーサー及び／又はヒンジ領域並びに膜貫通ドメインを介して、細胞内又は細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むか又はそれが会合するエンドドメインと融合している。ＣＡＲが標的抗原に結合した場合、これは標的抗原が発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。エンドドメインは、シグナル伝達に関与するＣＡＲの部分であり、このようにして、１つ若しくは複数の共刺激ドメイン及び／又は１つ若しくは複数の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0152】

本発明の範囲には、本明細書に記載のＣＡＲの機能的部分が含まれる。ＣＡＲを参照して使用される「機能的部分」という用語は、本発明のＣＡＲの任意の部分又は断片を指し、その部分又は断片は、それが一部分であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物活性を保持している。機能的部分は、親ＣＡＲと類似する程度、同じ程度又はより高い程度で、標的細胞を認識するか、又は疾患を検出、治療若しくは予防する能力を保持しているＣＡＲの部分を範囲に含む。親ＣＡＲを基準にすると、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上を含み得る。

【0153】

機能的部分は、追加のアミノ酸を、その部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又は両方の末端に含むことができ、この追加のアミノ酸は親ＣＡＲのアミノ酸配列には見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞を認識するか、がんを検出するか、がんを治療又は予防するといったことを妨げない。さらに望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＣＡＲの生物活性と比較して、生物活性を強化する。

【0154】

本発明の範囲には、本明細書に記載のＣＡＲの機能的バリアントが含まれる。「機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対して実質的又は著しい配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、この機能的バリアントは、バリアントとなった元のＣＡＲの生物活性を保持している。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似する程度、同じ程度又はより高い程度で、標的細胞を認識する能力を保持している、本明細書に記載のＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを範囲に含む。親ＣＡＲを基準にすると、機能的部分は、例えば、アミノ酸配列に関して、親ＣＡＲに対して少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９８％、約９９％又はそれ以上同一であり得る。

【0155】

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。代替的又は追加的に、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的なアミノ酸置換を有する、親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合に、非保存的なアミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性を妨げないか又は阻害しないことが好ましい。非保存的なアミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性が親ＣＡＲと比べて増加するように、機能的バリアントの生物活性を強化し得る。

【0156】

本発明の実施形態のＣＡＲ（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、任意の長さであることができ、すなわち、ＣＡＲ（又はその機能的部分若しくは機能的バリアント）が、その生物活性（例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において疾患細胞を検出する能力、又は哺乳動物において疾患を治療若しくは予防する能力など）を保持するという条件で、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上のアミノ酸長であり得る。

【0157】

また、本発明によるＣＡＲを含む細胞も提供される。本発明によるＣＡＲは、ＣＡＲを発現する免疫細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ ＮＫ細胞を生成させるために使用することができる。免疫細胞へのＣＡＲの操作は、インビトロでの培養中に行うことができる。

【0158】

本発明のＣＡＲの抗原結合領域は、任意の好適な形式、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂなどで提供することができる。

【0159】

核酸及びベクター
本発明は、本発明による抗原結合分子、ポリペプチド又はＣＡＲをコードする、１つ又は核酸又は核酸を提供する。

【0160】

一部の実施形態では、核酸は、例えば、他の核酸、又は天然起源の生物材料から、精製又は単離される。一部の実施形態では、核酸（複数可）は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むか又はそれからなる。

【0161】

それ故に、別の態様では、本発明は、本明細書中に開示される単離されたタンパク質（例えば、抗体及びＣＡＲタンパク質。その断片、バリアント及び誘導体を含む）をコードするか、又はそれをコードする核酸配列に対して相補的である、単離された核酸を想定している。

【0162】

本発明の単離されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中に提供される完全な核酸配列（例えば、配列番号１～１２を参照）のうちの１つ以上から直ちに推定することができるが、それらには限定されない。

【0163】

本態様は、前記単離された核酸の断片、バリアント及び誘導体、例えば、本明細書に以前に記載されたものも含む。

【0164】

「核酸」という用語は、本明細書で使用する場合、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを表す。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡが含まれる。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ及び自己触媒ＲＮＡが含まれる。また、核酸が、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであってもよい。核酸は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ塩基を含むヌクレオチドを典型的には含むヌクレオチド配列を含む。しかし、ヌクレオチド配列は、イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシン及び／又はチオウリジンなどの、ただしこれらに限定されない他の塩基を含んでもよい。

【0165】

したがって、特定の実施形態では、単離された核酸はｃＤＮＡである。

【0166】

「ポリヌクレオチド」は、８０個又はそれ以上の連続したヌクレオチドを有する核酸であり、一方、「オリゴヌクレオチド」は、８０個未満の連続したヌクレオチドを有する。

【0167】

「プローブ」は、好適には、例えば、ノーザンブロット法又はサザンブロット法において相補的配列を検出する目的で標識された、一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。

【0168】

「プライマー」は、通常、好ましくは１５～５０個の連続したヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、これは、相補的な核酸「テンプレート」にアニーリングして、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又はシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標）の作用によって、テンプレート依存的な様式で伸長されることが可能である。

【0169】

一実施形態では、核酸バリアントは、本発明の単離されたタンパク質のバリアントをコードする。

【0170】

別の実施形態では、核酸バリアントは、本発明の単離された核酸との間で、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％又は８５％、及びさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。

【0171】

特定の一実施形態では、本態様の単離された核酸は、（ａ）（ｉ）配列番号１３～１５６及び表１によるものといった、本明細書に記載の抗体及び／又は単離されたＣＡＲタンパク質のセグメント、ドメイン、部分又は領域（そのバリアント又は誘導体を含む）をコードする、核酸、並びに（ｂ）任意選択で１つ以上の追加の核酸配列からなる。この点に関して、追加の核酸配列は、単離された核酸配列の５’末端及び／又は３’末端にあることができる異種核酸配列であることができるが、ただしそれには限定されない。

【0172】

本発明はまた、コドン配列の冗長性を利用することなどによって改変された核酸も想定している。より詳細な例では、特定の生物又は細胞種における核酸の発現を最適化するためにコドン使用法を改変することができる。

【0173】

本発明は、本発明の核酸における修飾プリン（例えば、イノシン、メチルイノシン及びメチルアデノシン）及び修飾ピリミジン（例えば、チオウリジン及びメチルシトシン）の使用を、さらに提供する。

【0174】

本発明の単離された核酸を、標準的なプロトコール、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＮＹ、１９９５～２００８）の第２章及び第３章に記載されたものを使用して好都合に調製し得ることは、当業者には理解されるであろう。

【0175】

さらに別の実施形態では、相補的核酸は、高ストリンジェンシー条件下で本発明の核酸とハイブリダイズする。

【0176】

「ハイブリダイズ及びハイブリダイゼーション」は、本明細書において、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを生成する、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対形成を表すために使用される。相補的ヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列は、塩基対形成を通じて生じる。

【0177】

「ストリンジェンシー」とは、本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーション中の温度、イオン強度条件、並びにある特定の有機溶媒及び／又は界面活性剤の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間に要求される相補性のレベルが高くなる。

【0178】

「ストリンジェントな条件」とは、相補的塩基を高い頻度で有する核酸のみがハイブリダイズする条件を指す。

【0179】

ストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲書の第２．９章及び第２．１０章に記載されているような条件である。当業者はまた、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために様々な要因を操作し得ることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーを最適化することは、高度なハイブリダイゼーションを保証するのに役立ち得る。

【0180】

相補的ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドがマトリックス（好ましくはニトロセルロースなどの合成膜）上に固定化されるステップ、ハイブリダイゼーションのステップ、並びに典型的には標識プローブ又は他の相補的核酸を使用する検出のステップを含む、ブロット手法によって同定し得る。サザンブロット法は相補的なＤＮＡ配列を同定するために使用され、ノーザンブロット法は相補的なＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロット法及びスロットブロット法は、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド配列を同定するために使用されることができる。そのような技術は当業者に周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、前掲書の２．９．１～２．９．２０頁に記載されている。そのような方法によれば、サザンブロット法は、ＤＮＡ分子をゲル電気泳動によってサイズに従って分離し、サイズ分離されたＤＮＡを合成膜に移行させて、膜結合ＤＮＡを相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることを含む。ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の相補的核酸を同定する場合には、代替的なブロット法のステップ、例えば、プラーク又はコロニーハイブリダイゼーションのプロセスが使用される。この手順の他の典型的な例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）の第８章から第１２章に記載されている。

【0181】

固定化された核酸にハイブリダイズした標識核酸を検出するための方法は、当業者に周知である。そのような方法には、オートラジオグラフィー、化学発光、蛍光及び比色検出が含まれる。

【0182】

核酸はまた、核酸配列増幅手法を使用して、単離し、検出し、及び／又は組換えＤＮＡ技術に供することができる。

【0183】

熱的及び等温的方法の両方をカバーする適切な核酸増幅手法は、当業者に周知であり、これには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ－ｂレプリカーゼ増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）及びヘリカーゼ依存増幅が含まれるが、これらには限定されない。

【0184】

本明細書で使用する場合、「増幅産物」は、核酸増幅によって生成される核酸産物を指す。

【0185】

核酸増幅手法には、当技術分野で周知のような、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及び競合ＰＣＲなどの特定の定量的及び半定量な手法が含まれ得る。

【0186】

一部の実施形態では、核酸は、核酸の送達及び発現を助長する遺伝子構築物中に存在し得る。一部の実施形態では、本発明は、本発明による１つ又は複数の核酸を含む１つ又は複数のベクターを提供する。

【0187】

したがって、なお別の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の単離された核酸、又は（ｉｉ）それに対して相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸を含む遺伝子構築物を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）中の１つ以上の調節配列に作動可能に連結又は接続されている。

【0188】

好適には、遺伝子構築物は、当技術分野でよく理解されているように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母又は細菌人工染色体の形態にあるか、又はその遺伝子構成要素を含む。遺伝子構築物は、細菌又は他の宿主細胞における単離された核酸の維持及び増殖、組換えＤＮＡ技術による操作、並びに／又は本発明の核酸若しくはコードされるタンパク質の発現に適していてもよい。

【0189】

宿主細胞発現の目的のために、遺伝子構築物は発現構築物であり得る。好適には、発現構築物は、発現ベクター中の１つ以上の追加の配列に作動可能に連結された本発明の核酸を含む。「ベクター」は、本明細書で使用する場合、外因性核酸を細胞内に移入するための媒体として使用される核酸分子である。ベクターは、細胞内で核酸を発現させるためのベクターであってもよい。「発現ベクター」は、自己複製する染色体外ベクター、例えばプラスミド、又は宿主ゲノム中に組み込まれるベクターのいずれであってもよい。この点に関して、ベクターは、細胞がＥｐｈＡ３特異的ＣＡＲ又はＥｐｈＡ３結合剤を発現するように、本発明の核酸を宿主細胞、例えばＴ細胞に導入することができる。この目的のために、ベクターは、理想的には、Ｔ細胞において高レベルの発現を持続することができるべきである。

【0190】

そのようなベクターは、発現させようとする配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含み得る。ベクターはまた、終止コドン及び発現エンハンサーを含んでもよい。

【0191】

「作動可能に連結された」とは、前記追加のヌクレオチド配列（複数可）（例えば、調節核酸配列）が、好ましくは転写を開始、調節又は他の方法で制御するために、本発明の核酸に対して配置されていることを意味する。典型的には、選択された核酸配列及び調節核酸配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）は、核酸配列の発現が調節配列の影響下又は制御下に置かれる（それによって発現カセットを形成する）ように、共有結合性に連結されている。

【0192】

調節核酸配列は、発現のために使用される宿主細胞に一般に適切であると考えられる。多数の種類の適切な発現ベクター及び好適な調節配列が、様々な宿主細胞について当技術分野で知られている。

【0193】

典型的には、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれ得るが、それらには限定されない。

【0194】

当技術分野で知られているような構成的又は誘導的プロモーターが本発明によって想定される。

【0195】

好適なベクターには、プラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンベースのベクター、及び人工染色体が含まれる。

【0196】

特定の実施形態では、発現ベクターは、１つ以上のウイルス送達システム、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターであるか、又はそれを含む。

【0197】

一部の実施形態では、ベクターは、真核生物ベクター、例えば、真核生物細胞におけるベクターからのタンパク質の発現に必要なエレメントを含むベクターであってよい。一部の実施形態では、ベクターは、例えば、タンパク質発現を推進させるためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はＳＶ４０プロモーターを含む、哺乳動物ベクターであってもよい。

【0198】

さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子又は遺伝子構築物によって形質転換された宿主細胞を提供する。

【0199】

発現に好適である宿主細胞は、原核又は真核であり得る。例えば、好適な宿主細胞には、哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、バキュロウイルス発現系を伴うか又は伴わずに利用される昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））、植物細胞（例えば、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、フェオダクチラム・トリコルムツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））又は細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）が含まれるが、これらには限定されない。宿主細胞（原核生物であるか又は真核生物であるかを問わない）への遺伝子構築物の導入は、当技術分野で周知であり、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５～２００９）に、特に第９章及び第１６章に記載されている。

【0200】

ＣＡＲ発現細胞
本開示はまた、本開示によるＣＡＲを含むか又は発現する細胞も提供する。また、本開示によるＣＡＲをコードする核酸を含むか又は発現する細胞も提供される。Ｔ細胞へのＣＡＲの操作は、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞の増大中に起こるような、形質導入及び発現のためのインビトロでの培養中に行われてもよい。ＣＡＲを発現させるために免疫細胞を操作するための方法は当業者に公知であり、例えば、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒｅ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ， （２０１６） ３：１６０１５に記載されており、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。「少なくとも１つの細胞」は、複数の細胞、例えば、そのような細胞の集団を範囲に含むことが理解されよう。

【0201】

本開示によるＣＡＲを含むか又は発現する細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物は、ヒト、又は非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、又は他の齧歯動物（齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、飼い牛（ウシ、例えば、乳牛、又はウシ目（Ｂｏｓ）の任意の動物）、ウマ（ウマ目（Ｅｑｕｉｄａｅ）の任意の動物を含む）、ロバ、及び非ヒト霊長動物）であり得る。

【0202】

一部の実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものであるか、又はヒト対象から入手されたものであり得る。ＣＡＲ発現細胞を対象の治療に使用しようとする場合、細胞は、ＣＡＲ発現細胞によって治療しようとする対象からのものであってもよく（すなわち、細胞は自己性であってもよい）、又は細胞は異なる対象から入手してもよい（すなわち、細胞は同種性であってもよい）。

【0203】

特定の実施形態では、細胞は免疫細胞であるか又は免疫細胞を含む。細胞は、造血系由来の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、又は単球であってもよい。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、若しくは自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、又はそれらの前駆体であってもよい。細胞は、例えば、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、又はＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲα又はＴＣＲβ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４、又はＣＤ８を発現してもよい。

【0204】

好適には、免疫細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））を含むＴ細胞であるか又はそれを含む。この点に関して、本態様のＴ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の混合集団であってもよい。

【0205】

ＣＡＲ Ｔ細胞の使用には、それが全身投与可能であり、原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両方に自動誘導されるという利点がある（Ｍａｎｚｏら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０１５） Ｒ６７～７３を参照）。

【0206】

一部の実施形態では、細胞は、抗原特異的Ｔ細胞である。この種の実施形態では、「抗原特異的」Ｔ細胞は、Ｔ細胞が特異的である抗原に応答してＴ細胞の特定の機能的特性を示す細胞、又は前記抗原を発現する細胞である。一部の実施形態では、特性は、エフェクターＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞に関連する機能的特性である。

【0207】

一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、以下の特性の１つ以上を示し得る：例えばＴ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性、増殖、ＩＦＮ－γ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ－２発現、ＴＮＦ発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュライシン発現、及び／又はＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現、例えばＴ細胞が特異的である抗原又はその抗原を含む／発現する細胞に応答してのもの。抗原特異的Ｔ細胞は、適切なＭＨＣ分子によって提示された場合にそのＴ細胞が特異的である抗原のペプチドを認識することができるＴＣＲを含む。抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞であってもよい。

【0208】

一部の実施形態では、Ｔ細胞が特異的である抗原は、ウイルス、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リンパ球絨毛膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の、ペプチド又はポリペプチドであってもよい。

【0209】

有利には、本発明の単離されたＣＡＲは、患者の既存の免疫レパートリーに関係なく、ＥｐｈＡ３に対する特異性を有する大量のＴ細胞（細胞１０^８個～１０^１０個／患者を上回る）を生成させることができる、迅速で信頼性があるアプローチである、ＣＡＲ遺伝子導入に利用することができる。例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入では、活性化前のＴ細胞を用いて４８時間しか培養する必要がない場合がある。さらに、大量の自己Ｔ細胞を、白血球アフェレーシス又は対象由来の血液試料からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離によって入手することができる。このようにして、注入用の１０^８～１０^９個の形質転換又はトランスフェクトされたＴ細胞を数日で操作することが可能である。

【0210】

したがって、本発明の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、養子移入によって、ＥｐｈＡ３に関連する疾患、障害又は状態、例えばがんの治療に使用することができる。この目的のために、Ｔ細胞は、典型的には、遺伝子組換え細胞の養子移入に用いるために、ドナー対象を含む対象から採取した生体試料から単離される。

【0211】

好ましくは、本発明のＣＡＲ（例えば、図４－１～４－３に示されるようなＣＡＲ）によって形質導入又は形質転換されたＴ細胞は、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞及びエフェクターメモリー細胞の混合物を含有する。

【0212】

代替的な実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）であるか、又はそれに由来するものである。したがって、この目的のために、宿主細胞は、分化すると本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞を生成する、遺伝子改変幹細胞であってもよい。

【0213】

一部の実施形態では、宿主細胞、例えばＴ細胞は、サイトカイン、ケモカイン及び／又はその受容体を発現するように遺伝子操作される。

【0214】

この目的のために、ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞傷害性及び特異性を強化し、腫瘍免疫抑制を逃れ、宿主拒絶反応を回避し、及びその治療半減期を延長する、いくつかの方法で設計することができる。例えば、ＴＲＵＣＫ（普遍的サイトカイン死滅のために再指向化されたＴ細胞（Ｔ－ｃｅｌｌｓ Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｌｌｉｎｇ））Ｔ細胞は、ＣＡＲを保有しながら、腫瘍死滅を促進するＩＬ－１２などのサイトカインも発現及び放出するように設計されている。これらの細胞は、腫瘍環境に局在化した後にＣＡＲの活性化によって分子ペイロードを放出するように設計されているため、これらのＣＡＲＴ－細胞は「アーマードＣＡＲ」（ａｒｍｏｕｒｅｄ ＣＡＲ）と呼ばれることもある。例示的なサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－３．ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、リンホタクチン、及びＴＧＦ－βが含まれる。

【0215】

「自動推進式」又は「ホーミング」ＣＡＲＴ－細胞は、そのＣＡＲに加えて、ケモカイン受容体を発現するように操作されている。ある種のケモカインは腫瘍においてアップレギュレートされるため、ケモカイン受容体を組み入れることにより、腫瘍への移動及び養子Ｔ細胞による浸潤を助け、それによってＣＡＲ Ｔ細胞の特異性及び機能性の両方を強化することができる。普遍的ＣＡＲ Ｔ細胞もＣＡＲを保有するものの、内因性ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）及びＭＨＣ（主要組織適合性複合体）タンパク質を発現しないように設計されている。この２つのタンパク質を養子縁組Ｔ細胞療法のシグナル伝達レパートリーから取り除くことで、それぞれ移植片対宿主病及び拒絶反応を予防することができる。さらに、アーマードＣＡＲＴ細胞は、腫瘍免疫抑制及び腫瘍誘発性のＣＡＲ Ｔ細胞機能低下を回避する能力を持つことから、この名前が付けられた。これらの特定のＣＡＲ Ｔ細胞はＣＡＲを保有し、チェックポイント阻害剤を発現しないように設計することもできる。あるいは、これらのＣＡＲ Ｔ細胞を、チェックポイントのシグナル伝達を阻止するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共投与することもできる。抗ＰＤＬ１抗体の投与は、ＣＡＲ ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）の死滅能力を有意に回復させた。ＰＤ１－ＰＤＬ１及びＣＴＬＡ－４－ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル伝達経路が研究されているが、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３、ＩＤＯ－１、２Ｂ４、及びＫＩＲを含む、他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とするアーマードＣＡＲ－Ｔを設計することも可能である。ＴＩＬの他の細胞内阻害物質には、ホスファターゼ（ＳＨＰ１）、ユビキチンリガーゼ（すなわち、ｃｂｌ－ｂ）、及びキナーゼ（すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ）が含まれる。また、ＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍が分泌するサイトカインの影響から保護するか、又はその影響に対して抵抗性にするタンパク質又は受容体を発現するように操作することもできる。例えば、二重陰性型のＴＧＦ－β受容体による形質導入を受けたＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）は、リンパ腫が分泌するＴＧＦ－βによる免疫抑制に対して抵抗性である。これらの形質導入細胞は、対応する対照と比較して、インビボで顕著に増加した抗腫瘍活性を示した。

【0216】

なお別の態様では、本発明は、本明細書に記載の単離されたタンパク質（例えば、単離されたＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲ）を生産する方法であって、（ｉ）本明細書に以前に記載された事前に形質転換された宿主細胞を培養するステップ、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において培養した前記宿主細胞から前記タンパク質を単離するステップ、を含む方法を提供する。

【0217】

組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）、特にセクション１６及び１７、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５～２００９）、特に第１０章及び第１６章、並びにＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５～２００９）、特に第１章、第５章及び第６章に記載された標準的なプロトコールを使用して、当業者が好都合に調製することができる。

【0218】

関連する一態様では、本発明は、単離されたＥｐｈＡ３結合剤又は前述の局面の方法によって製造されるＣＡＲを提供する。

【0219】

さらなる一態様では、本発明は、
（ｉ）前述の第１の態様のＥｐｈＡ３結合剤、及び／又は
（ｉｉ）前述の第２の態様のＣＡＲ
（その断片、バリアント及び誘導体を含む）
に結合する、及び／又はそれに対して産生される、抗体又は抗体断片に存する。

【0220】

好適には、前記抗体又は抗体断片は、前記単離されたＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲに特異的に結合する。好ましくは、前記抗体又は抗体断片は、本明細書に記載のＣＤＲ、Ｖ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインの完全又は部分的なアミノ酸配列（例えば、配列番号１３～１５６）に特異的又は選択的に結合するか、又はそれを認識する。この点に関して、本態様の抗体又は抗体断片は、試料中のその特定のＣＤＲ、Ｖ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインを有するＣＡＲを発現するＴ細胞を検出又は単離する方法における使用に好適であり得る。この目的のために、本発明の抗体及び抗体断片は、本明細書に記載の単離されたＥｐｈＡ３結合剤及びＣＡＲのアフィニティークロマトグラフィー精製に特に好適であり得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、前掲書の第９．５章に記載されているアフィニティークロマトグラフィー手順を参照することができる。

【0221】

抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、ネイティブ又は組換えであり得る。抗体の生産、精製及び使用に適用可能である周知のプロトコールは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、前掲書の第２章、及びＨａｒｌｏｗ， Ｅ． ＆ Ｌａｎｅ， Ｄ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８に記載されており、これらは両方とも参照によって本明細書に組み入れられる。

【0222】

一般に、本発明の抗体は、本発明の単離されたタンパク質、断片、バリアント、又は誘導体に結合するか、又はそれとコンジュゲートする。例えば、抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。そのような抗体は、例えば、本発明の単離タンパク質、断片、バリアント又は誘導体を、マウス又はウサギが含まれ得る生産種に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を生産する方法は、当業者に周知である。使用し得る例示的なプロトコールは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、前掲書及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、１９８８、前掲書に記載されている。

【0223】

モノクローナル抗体は、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５による論文に記載されている標準的な方法を使用して、又は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、前掲書に記載されているその最近の変法により、本発明の単離されたタンパク質、断片、バリアント又は誘導体の１つ以上を接種された生産種に由来する脾臓若しくは他の抗体産生細胞を不死化することによって生産することができる。

【0224】

ＣＭＶ特異的Ｔ細胞
ある特定の態様では、ＭＶエピトープ（例えば、表１にリスト化されているＣＭＶエピトープ）を含むペプチドを認識するＴＣＲ（例えば、αβＴＣＲ又はγδＴＣＲ）を発現するＣＭＶ特異的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞）が、本明細書中に提供される。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明のＴ細胞は、表１にリスト化されているＣＭＶエピトープを含むペプチドを認識するＴ細胞である。

【0225】

【表1】

【0226】

この種の一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、上記及び／又は本明細書の他の箇所に記載されるような、ＥｐｈＡ３に結合する抗原結合分子をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書中に提供されるＴ細胞は、上記及び本明細書の他の場所で記載されるようなＣＡＲを発現するように操作することができる。一例を挙げると、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞は、ＥｐｈＡ３結合性ＣＡＲをさらに含む。

【0227】

一部の態様では、本明細書に記載のＣＭＶエピトープの１つ以上を認識するＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の生成、活性化、及び／又は増殖誘導の方法が、本明細書中に提供される。一部の実施形態では、ＣＴＬを含む試料（例えば、ＰＢＭＣ試料）を単離し、本明細書に開示される免疫原性ペプチドのプールに曝露させて、刺激されたＣＴＬを採取する。好ましくは、免疫原性ペプチドのプールは、表１に示されるＣＭＶペプチドエピトープアミノ酸配列のそれぞれから本質的になる。ある特定の実施形態では、曝露された試料を少なくとも１４日間インキュベートする。一部のそのような実施形態では、曝露された試料を、第０日にＩＬ－２１とともにインキュベートする。好ましくは、曝露された試料を、第２日にＩＬ－２とともにインキュベートする。より好ましい実施形態では、曝露された試料のインキュベーションは、３日ごとのＩＬ－２の添加を含む。

【0228】

一部の実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、健常ドナーに由来する。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、免疫不全のドナーに由来する。一部のそのような実施形態では、ドナーは、免疫抑制療法を受けている。一部の実施形態では、ドナーは、実質臓器移植のレシピエントである。さらなる実施形態では、ドナーは、抗ウイルス療法を受けている。

【0229】

一部の実施形態では、ＣＴＬを含む試料（例えば、ＰＢＭＣ試料）を、クラスＩ ＭＨＣ複合体上に本明細書に記載のＣＭＶエピトープを含むペプチドを提示するＡＰＣと培地でインキュベートする。この種の好適なＡＰＣの調製は、例えば、国際出願ＰＣＴ公開第２０１９／２２０２０９号に記載されており、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ＡＰＣは、Ｔ細胞が入手された対象に対して自己性であってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞を含有する試料を、本明細書中に提供されるＡＰＣとともに２回以上インキュベートする。一部の実施形態では、Ｔ細胞を、少なくとも１つのサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１の存在下でＡＰＣとともにインキュベートする。ＡＰＣを使用してＴ細胞の増殖を誘導するための例示的な方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００１７７２３号に記載されており、これは参照によって本明細書に組み入れられる。

【0230】

ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞によるバイオマーカーの発現を、フローサイトメトリーなどの任意の適切な方法によって評価することもできる。一部の実施形態では、ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞を、ＣＭＶ特異的ペプチドによって刺激して、フローサイトメトリーによって選別する。好ましくは、ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞は、参照によって本明細書に組み入れられる、国際出願ＰＣＴ公開第２０１９／２２０２０９号に記載のプロトコールに従って、刺激及び／又は表面染色を受ける。一部の実施形態では、ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞は、ＣＤ１０７ａに特異的な１つ以上の抗体とともにインキュベートされ、その後、フローサイトメトリーによって選別される。一部の実施形態では、ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞は、細胞内サイトカインに結合する１つ以上の抗体、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及び／又はＴＮＦに特異的な抗体とともにインキュベートされる。一部の実施形態では、ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞は、細胞内サイトカインに対する抗体とともにインキュベートされ、続いてフローサイトメトリーによって選別される。

【0231】

一部の実施形態では、本方法は、ドナー対象からＴ細胞を含む試料を入手する（例えば、ドナー対象からＰＢＭＣ試料を入手する）ことをさらに含む。一部の実施形態では、自己Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）を、試料から単離する。一部の実施形態では、試料は大部分が又は完全に同種Ｔ細胞で構成される。

【0232】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％が、ＣＤ１０７ａを発現する。

【0233】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％が、ＩＦＮ－γを発現する。

【0234】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％が、ＴＮＦを発現する。

【0235】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％が、ＩＬ－２を発現する。

【0236】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ－γを発現する。

【0237】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ及びＴＮＦを発現する。

【0238】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ及びＩＬ－２を発現する。

【0239】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦを発現する。

【0240】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を発現する。

【0241】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＴＮＦ及びＩＬ－２を発現する。

【0242】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２を発現する。

【0243】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２を発現する。

【0244】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２を発現する。

【0245】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、及びＴＮＦを発現する。

【0246】

一部の実施形態では、試料中のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％が、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２を発現する。

【0247】

本明細書中に開示される方法の一部の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）は、複数のＣＭＶ抗原に由来する複数のペプチドエピトープに対する反応性を示す。この点に関して、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％は、複数のＣＭＶエピトープに対して反応性である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）は、表１に示されるＣＭＶペプチドエピトープアミノ酸配列のうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せに対して反応性である。一部の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）は、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ＩＥ－Ｉ、ｇＢ、ｇＨのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せに対して反応性である。

【0248】

Ｔ細胞バイオマーカーの発現及び／又はＣＭＶ反応性は、本明細書中に開示される方法のいずれかによる、例えば、免疫原性ＣＭＶペプチドエピトープのプールへの曝露による、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）増殖の前又は後のいずれかに測定及び／又は分析することができる。

【0249】

一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性及びバイオマーカー発現は、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）の刺激の前に定量化される。代替的又は追加的に、ＣＭＶ反応性及びバイオマーカー発現は、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）の刺激の後に定量化してもよい。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＣＤ１０７ａを発現する試料中のＴ細胞のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＦＮ－γを発現する試料中のＴ細胞のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＴＮＦを発現する試料中のＴ細胞のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＬ－２を発現する試料中のＴ細胞のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、複数のバイオマーカー（例えば、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２のうちの２つ又はそれ以上、好ましくは４つすべて）を発現するＴ細胞のパーセンテージとして測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２を発現する試料中のＴ細胞のパーセンテージを定量化することによって算出される。Ｔ細胞は、ＣＭＶ反応性のパーセンテージの定量化の前又は後のいずれかに、試料（例えば、ＰＢＭＣ試料又はＴ細胞を含有する試料）から単離されてもよい。したがって、一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、大部分がＴ細胞で構成される試料中の所望の特性（複数可）を有するＴ細胞のパーセンテージである。

【0250】

一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＣＤ１０７ａを発現する試料中のＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＦＮ－γを発現する試料中のＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＴＮＦを発現する試料中のＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＬ－２を発現する試料中のＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、複数のバイオマーカー（例えば、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２のうちの２つ又はそれ以上、好ましくは４つすべて）を発現するＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージとして測定される。ＣＤ８＋リンパ球は、ＣＭＶ反応性パーセンテージの定量化の前又は後のいずれかに、試料（例えば、ＰＢＭＣ試料又はＣＤ８＋リンパ球の試料）から単離されてもよい。したがって、一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、大部分がＣＤ８＋リンパ球で構成される試料中の所望の特性（複数可）を有するＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージである。

【0251】

一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＣＤ１０７ａを発現する試料中のＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＦＮ－γを発現する試料中のＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＴＮＦを発現する試料中のＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、ＩＬ－２を発現する試料中のＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージを定量化することによって測定される。一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、複数のバイオマーカー（例えば、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２のうちの２つ又はそれ以上、好ましくは４つすべて）を発現するＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージとして測定される。ＣＤ３＋リンパ球は、ＣＭＶ反応性パーセンテージの定量化の前又は後のいずれかに、試料（例えば、ＰＢＭＣ試料又はＣＤ３＋リンパ球の試料）から単離されてもよい。したがって、一部の実施形態では、ＣＭＶ反応性は、大部分がＣＤ３＋リンパ球で構成される試料中の所望の特性（複数可）を有するＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージである。

【0252】

本発明の最も好ましい実施形態のいくつかでは、Ｔ細胞はその表面にＥｐｈＡ３抗原結合分子を提示する。例えば、Ｔ細胞は、その表面にＥｐｈＡ３結合ＣＡＲを提示してもよい。

【0253】

Ｔ細胞は、対象にとって自己性であってもよく、又は自己性でなくてもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、対象に投与される前に、細胞バンクに保存される。一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、対象に対して同種である。

【0254】

医薬組成物
さらになお別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＥｐｈＡ３結合剤、本明細書に記載のＣＡＲ、本明細書に記載の単離された核酸、本明細書に記載の遺伝子構築物、及び／又は本明細書に記載の宿主細胞と、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物を提供する。

【0255】

一部の態様では、ＥｐｈＡ３ ＣＡＲを発現若しくは提示するＣＭＶ特異的ＣＴＬを含む組成物（例えば、医薬組成物）、又は医薬担体とともに製剤化されたその調製、及びそのような医薬組成物を投与する方法が、本明細書中に提供される。

【0256】

「薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤」とは、全身投与において安全に使用し得る固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。

【0257】

一部の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、インビトロ又はインビボで組成物に対する免疫学的応答を調節又は強化する免疫学的又は薬学的薬剤を広く指す。例えば、アジュバントは、時間経過とともに抗原の存在を増加させ、抗原提示細胞抗原の吸収を助け、マクロファージ及びリンパ球を活性化し、サイトカインの産生を支持し得る可能性がある。免疫応答を変化させることによって、アジュバントは、免疫相互作用性薬剤又は調製物の用量を減らすことを可能にして、投薬の有効性又は安全性を高める可能性がある。例えば、アジュバントは、Ｔ細胞の枯渇を防ぎ、特定の免疫相互作用性薬剤又は調製物の有効性又は安全性を高める可能性がある。アジュバントの例としては、免疫調節タンパク質、アジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＰＩ－０１００、リピドＡ及びその修飾体（例えば、一リン酸化リピドＡ）、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｑｕｉｌ－Ａ、及びトレハロースジミコレートが挙げられるが、これらには限定されない。

【0258】

これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本明細書に記載の薬剤を、担体及び任意選択で１つ以上の付属成分と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、本明細書に記載の薬剤を液体担体、又は細かく分割した固体担体、又はその両方と均一にかつ密接に会合させ、続いて必要に応じて産物を成形することによって調製される。

【0259】

非経口投与に適する本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の１つ以上の薬剤を、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、又は懸濁剤若しくは増粘剤を含有し得る、１つ以上の薬学的に許容できる無菌の等張性水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液若しくは乳濁液、又は使用直前に滅菌注射液又は分散液に再構成することができる滅菌粉末との組合せで含む。

【0260】

特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、モルト、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油（オリーブ油など）、合成油、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水、並びに塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩などの塩類、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩などの有機酸、並びにパイロジェンフリー水を含む群から選択することができる。本発明の医薬組成物中に採用され得る好適な水性及び非水性担体のさらなる例としては、水、エタノール、及びそれらの適切な混合物、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。

【0261】

選択される投与経路にかかわらず、好適な水和形態で使用し得る本発明の薬剤、及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知である従来の方法によって医薬的に許容できる剤形として製剤化される。

【0262】

薬学的に許容できる担体、希釈剤及び賦形剤を記載している有用な文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｎ．Ｊ． ＵＳＡ， １９９１）であり、これは参照によって本明細書に組み入れられる。

【0263】

治療用途
本開示の態様は、対象におけるがんの治療における、本明細書に記載の抗原結合剤、及び／又は細胞の使用に特に関する。

【0264】

したがって、本開示は、対象におけるがんを治療又は予防する方法であって、本明細書に記載のＥｐｈＡ３結合剤、又は本明細書に記載のＥｐｈＡ３に対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む少なくとも１つのＴ細胞、若しくは本明細書に記載の組成物の治療有効量を対象に投与して、それによって対象におけるがんを治療又は予防するステップを含む方法を提供する。

【0265】

本明細書で一般的に使用する場合、「がん」、「腫瘍」、「悪性」及び「悪性腫瘍」という用語は、発がん、腫瘍マーカーの発現、腫瘍抑制因子の発現若しくは活性の喪失及び／又は異常性若しくは異常な細胞表面マーカーの発現と関連する１つ以上の遺伝子変異又は他の遺伝子変化を含む異常性又は異常な分子表現型をしばしば伴う、異常性又は異常な細胞増殖、分化及び／又は遊走によって特徴付けられる、疾患若しくは状態、又はその疾患に関連する細胞若しくは組織を指す。

【0266】

がんには、限定されないが、肉腫、がん腫、リンパ腫、白血病、芽球腫などのすべての主要ながん形態を含む、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓ／ａｌｐｈａｌｉｓｔのＮＣＩ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｄｅｘに記載されているような、任意の侵襲性又は潜在的に侵襲性であるがん、腫瘍又は他の悪性腫瘍が含まれ得る。これらには、乳がん、肺腺がんを含む肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん及び前立腺がんを含む生殖器系のがん、脳及び神経系のがん、頭頸部がん、結腸がん、結腸直腸がん及び胃がんを含む胃腸系のがん、肝臓がん、腎臓がん、黒色腫及び皮膚がんなどの皮膚がん、リンパ系がん及び骨髄単球系がんを含む血球系がん、膵臓がん及び下垂体がんなどの内分泌系がん、骨がん及び軟組織がんを含む筋骨格系がんが含まれ得るが、これらに限定はされない。特定の実施形態では、がんは、多形性膠芽腫などの固形がんである。好適には、がんは、ＥｐｈＡ３を発現する、例えば、過剰発現する。

【0267】

がんを治療する方法は、予防処置的、予防的又は治療的であることができ、哺乳動物、特にヒトにおけるがんの治療に好適である。本明細書で使用する場合、「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、がん及び／又はその症状が少なくとも発生し始めた後に、がんの症状を少なくとも改善する、治療的介入、一連の手順又はプロトコールを指す。がんの治療又は緩和は、がんの進行を防ぐため、例えば、状態の悪化を防ぐため、又はより重篤な疾患状態の発生の速度を遅らせるために有効であり得る。本明細書で使用する場合、「予防すること」、「予防する」又は「予防」は、がん又はその症状の発生若しくは進行を予防するため、抑制するため又は遅らせるために、がん及び／又はがんの症状の発生前に開始される治療的介入、一連の手順又はプロトコールを指す。

【0268】

一部の実施形態では、Ｔ細胞の１回の用量あたり約１×１０^５～約１×１０^８個のＴ細胞が対象に投与される。一部の実施形態では、Ｔ細胞の１回の用量あたり約１×１０^６～約１×１０^７個のＴ細胞が対象に投与される。一部の実施形態では、１×１０^６個、１×１０^７個、１．５×１０^７個、又は２×１０^７個のＴ細胞（例えば、ＣＴＬ）が対象に投与される。複数の用量が対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、自己ＣＴＬ）の初回用量が投与され、Ｔ細胞（例えば、自己ＣＴＬ）の１回以上の追加用量が、例えば、治療の経過に沿って用量を増加させながら投与される。一部の実施形態では、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、又は１０回以上の用量が投与される。対象は、初回用量と同じ又は異なる追加の投与量を投与されてもよい。例えば、低い用量が投与された後に、より高い用量が投与されてもよい。用量は、毎日、週２回、毎週、隔週、１カ月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、又は６カ月毎に１回投与されてもよい。一部の実施形態では、対象は、Ｔ細胞（例えば、同種ＣＴＬ）投与の結果として、いかなる有害作用も経験しない。

【0269】

「治療有効量」という用語は、特定の薬剤、例えば、ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲの、その薬剤で治療される対象において所望の効果を達成するのに十分な量を記載する。例えば、これは、がんの転移及び再発を含む、がん又はがんに関連する疾患、障害又は状態を軽減、緩和及び／又は予防するために必要な、本明細書に記載の１つ以上のＥｐｈＡ３結合剤及び／又はＣＡＲを含む組成物の量であることが可能である。一部の実施形態では、「治療有効量」は、がんの症状を軽減又は除去するのに十分な量である。他の実施形態では、「治療有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、がんの成長、再発及び／又は転移を減少又は防止するのに有効な量である。

【0270】

理想的には、薬剤の治療有効量は、対象において大きな細胞傷害作用を引き起こすことなく所望の結果を誘導するために十分な量である。がんを減少、緩和及び／又は予防するために有用な薬剤の有効量は、治療される対象、任意の関連する疾患、障害及び／又は状態（例えば、任意の関連する転移の数及び位置）の種類及び重症度、並びに治療用組成物の投与の様式に依存すると考えられる。

【0271】

本態様の方法は、上記に挙げたものに加えて１つ以上のさらなるがん治療も含み得ることが理解されるであろう。そのようながん治療には、薬物療法、化学療法、抗体、核酸及び他の生体分子療法、放射線療法、手術、栄養療法、リラクゼーション又は瞑想療法及び他の自然療法又はホリスティック療法が含まれ得るが、これらには限定されない。一般に、薬物、生体分子（例えば、抗体、阻害性核酸、例えばｓｉＲＮＡ）又は化学療法剤は、本明細書において「抗がん治療剤」又は「抗がん剤」と呼ばれる。

【0272】

一部の実施形態では、対象に、抗がん化合物も投与される。例示的な抗がん化合物としては、アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））、アリトレチノイン（パンレチン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ）（登録商標））、アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））、ベキサロテン（タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（登録商標））、ボルテゾミブ（ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（登録商標））、ボスチニブ（ボシュリフ（Ｂｏｓｕｌｉｆ）（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標））、カボザンチニブ（コメトリク（Ｃｏｍｅｔｒｉｑ）（商標））、カルフィルゾミブ（カイプロリス（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）（商標））、セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標））、エルロチニブ塩酸塩（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））、エベロニムス（アフミトール（Ａｆｍｉｔｏｒ）（登録商標））、エキセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））、フルベストラント（ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（登録商標））、イマチニブメシル酸塩（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（商標））、ラパチニブジシトラート（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））、レトロゾール（フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））、ニロチニブ（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標））、オファツムマブ（アーゼラ（Ａｒｚｅｒｒａ）（登録商標））、パニツムマブ（ヴェクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（登録商標））、パゾパニブ塩酸塩（ヴォトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（登録商標））、ペルツズマブ（ペイジェタ（Ｐｅｉｊｅｔａ）（商標））、プララトレキサート（フォロチン（Ｆｏｌｏｔｙｎ）（登録商標））、レゴラフェニブ（スチバーガ（Ｓｔｉｖａｒｇａ）（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））、ロミデプシン（イストダックス（Ｉｓｔｏｄａｘ）（登録商標））、ソラフェニブトシル酸塩（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））、スニチニブリンゴ酸塩（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））、タモキシフェン、テムシロリムス（トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（登録商標））、トレミフェン（フェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）（登録商標））、トシツモマブ及び１３１Ｉ－トシツモマブ（ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））、トレチノイン（ベサノイド（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）（登録商標））、バンデタニブ（カプレルサ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）（登録商標））、ベムラフェニブ（ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（登録商標））、ボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（登録商標））、及びＺｉｖ－アフリベルセプト（ザルトラップ（Ｚａｌｔｒａｐ）（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0273】

一部の実施形態では、対象に、化学療法剤も投与される。そのような化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミドなど、アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど、アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなど、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチルメラミン、アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）、カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びバイゼレシン合成類似体を含む）、クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど、ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなど、抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ（１，１）及びカリケアマイシンオメガ（１，１））など、ジネマイシンＡを含むジネマイシン、ビスホスホネート、例えばクロドロネートなど、エスペラミシン、並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン系抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など、葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど、プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど、ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど、アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど、抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど、葉酸補充剤、例えばフォリン酸など、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォミチン、エリプチニウム酢酸塩、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミニン、マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサマイトシンなど、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラミン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ多糖複合体、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン、トリコテシン（特にＴ－２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセル、クロラムブシル、ゲムシタビン、６－チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなど、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ－１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロン酸、イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイド、例えばレチノイン酸など、カペシタビン、並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられるが、これらには限定されない。

【0274】

一部の実施形態では、対象に、免疫療法剤も投与される。免疫療法は、対象の免疫系を利用して状態を治療又は予防する治療、例えば、がんワクチン、サイトカイン、標的特異的抗体の使用、Ｔ細胞療法、及び樹状細胞療法を指す。

【0275】

一部の実施形態では、対象に、免疫調節タンパク質も投与される。免疫調節タンパク質の例としては、Ｂリンパ球化学誘引物質（「ＢＬＣ」）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１１（「エオタキシン－１」）、好酸球走化性タンパク質２（「エオタキシン－２」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、１－３０９、細胞間接着分子１（「ＩＣＡＭ－１」）、インターフェロンγ（「ＩＦＮ－γ」）、インターロイキン－１α（「ＩＬ－１α」）、インターロイキン－１β（「ＩＬ－１β」）、インターロイキン１受容体遮断薬（「ＩＬ－１ｒａ」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－４（「ＩＬ－４」）、インターロイキン－５（「ＩＬ－５」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、インターロイキン－６可溶性受容体（「ＩＬ－６ ｓＲ」）、インターロイキン－７（「ＩＬ－７」）、インターロイキン－８（「ＩＬ－８」）、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）、インターロイキン－１１（「ＩＬ－１１」）、インターロイキン－１２のサブユニットベータ（「ＩＬ－１２ ｐ４０」又は「ＩＬ－１２ ｐ７０」）、インターロイキン－１３（「ＩＬ－１３」）、インターロイキン－１５（「ＩＬ－１５」）、インターロイキン－１６（「ＩＬ－１６」）、インターロイキン－１７（「ＩＬ－１７」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＣＰ－１」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ－ＣＳＦ」）、γインターフェロンによって誘導されるモノカイン（「ＭＩＧ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＩＰ－１α」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド４（「ＭＩＰ－１β」）、マクロファージ炎症性タンパク質－１－デルタ（「ＭＩＰ－１δ」）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（「ＰＤＧＦ－ＢＢ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５、「ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）」（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｍａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＴＥＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（「ＴＩＭＰ－１」）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２（「ＴＩＭＰ－２」）、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）、腫瘍壊死因子リンパ毒素－ベータ（「ＴＮＦ－β」）、可溶性ＴＮＦ受容体１型（「ｓＴＮＦＲＩ」）、ｓＴＮＦＲＩＩＡＲ、脳由来神経栄養因子（「ＢＤＮＦ」）、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）、骨形成タンパク質４（「ＢＭＰ－４」）、骨形成タンパク質５（「ＢＭＰ－５」）、骨形成タンパク質７（「ＢＭＰ－７」）、神経成長因子（「ｂ－ＮＧＦ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）、内分泌腺由来血管内皮増殖因子（「ＥＧ－ＶＥＧＦ」）、線維芽細胞増殖因子４（「ＦＧＦ－４」）、角化細胞増殖因子（「ＦＧＦ－７」）、増殖分化因子１５（「ＧＤＦ－１５」）、グリア細胞由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）、成長ホルモン、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（「ＨＢ－ＥＧＦ」）、肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（「ＩＧＦＢＰ－１」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（「ＩＧＦＢＰ－２」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（「ＩＧＦＢＰ－３」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（「ＩＧＦＢＰ－４」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（「ＩＧＦＢＰ－６」）、インスリン様増殖因子１（「ＩＧＦ－１」）、インスリン、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ－ＣＳＦＲ」）、神経成長因子受容体（「ＮＧＦＲ」）、ニューロトロフィン３（「ＮＴ－３」）、ニューロトロフィン４（「ＮＴ－４」）、破骨細胞形成抑制因子（「オステオプロテジェリン」）、血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ－ＡＡ」）、ホスファチジルイノシトール－糖鎖生合成（「ＰＩＧＦ」）、Ｓｋｐ、カリン、Ｆ－ｂｏｘ含有複合体（「ＳＣＦ」）、幹細胞因子受容体（「ＳＣＦＲ」）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（「ＴＧＦα」）、トランスフォーミング増殖因子ベータ－１（「ＴＧＦβ１」）、トランスフォーミング増殖因子ベータ－３（「ＴＧＦβ３」）、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、血管内皮増殖因子受容体２（「ＶＥＧＦＲ２」）、血管内皮増殖因子受容体３（「ＶＥＧＦＲ３」）、ＶＥＧＦ－Ｄ ６Ｃｋｉｎｅ、チロシン－プロテインキナーゼ受容体ＦＩＦＯ（「Ａｘｌ」）、ベータセルリン（「ＢＴＣ」）、粘膜関連上皮性ケモカイン（「ＣＣＬ２８」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（「ＣＴＡＣＫ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＣＸＣＬ１６」）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン５（「ＥＮＡ－７８」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２６（「エオタキシン３」）、顆粒球化学伝達タンパク質２（「ＧＣＰ－２」）、ＧＲＯ、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＨＣＣ－１」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＨＣＣ－４」）、インターロイキン９（「ＩＬ－９」）、インターロイキン１７Ｆ（「ＩＬ－１７Ｆ」）、インターロイキン１８結合タンパク質（「ＩＬ－１８ ＢＰａ」）、インターロイキン２８Ａ（「ＩＬ－２８Ａ」）、インターロイキン２９（「ＩＬ－２９」）、インターロイキン３１（「ＩＬ－３１」）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（「ＩＰ－１０」）、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３（「Ｉ－ＴＡＣ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、Ｌｉｇｈｔ、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド（「リンホタクチン」）、単球走化性タンパク質２（「ＭＣＰ－２」）、単球走化性タンパク質３（「ＭＣＰ－３」）、単球走化性タンパク質４（「ＭＣＰ－４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、マクロファージ遊走阻止因子（「ＭＩＦ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２０（「ＭＩＰ－３α」）。Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１９（「ＭＩＰ－３β」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（「ＭＰＩＦ－１」）、マクロファージ刺激タンパク質アルファ鎖（「ＭＳＰα」）、核小体アセンブリータンパク質１様４（「ＮＡＰ－２」）、分泌型リン酸化タンパク質１（「オステオポンチン」）、肺・活性化制御サイトカイン（「ＰＡＲＣ」）、血小板因子４（「ＰＦ４」）、ストローマ細胞由来因子－１アルファ（「ＳＤＦ－１α」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１７（「ＴＲＣ」）、胸腺発現ケモカイン（「ＴＥＣＫ」）、胸腺間質性リンパポエチン（「ＴＳＬＰ ４－１ＢＢ」）、ＣＤ１６６抗原（「ＡＬＣＡＭ」）、クラスター分化８０（「Ｂ７－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（「ＢＣＭＡ」）、表面抗原分類１４（「ＣＤ１４」）、表面抗原分類３０（「ＣＤ３０」）、表面抗原分類４０（「ＣＤ４０リガンド」）、がん胎児抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）（「ＣＥＡＣＡＭ－１」）、Ｄｅａｔｈ受容体６（「ＤＲ６」）、デオキシチミジンキナーゼ（「Ｄｔｋ」）、１型膜糖タンパク質（「エンドグリン」）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ－３（「ＥｒｂＢ３」）、内皮－白血球接着分子１（「Ｅ－セレクチン」）、アポトーシス抗原１（「Ｆａｓ」）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（「Ｆｌｔ－３Ｌ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１（「ＧＩＴＲ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（「ＨＶＥＭ」）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ－３）、ＩＬ－１ Ｒ４、ＩＬ－１ Ｒｌ、ＩＬ－１０Ｒβ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－２１Ｒ、リソソーム膜タンパク質２（「ＬＩＭＰＩＩ」）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（「リポカリン－２」）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン」）、リンパ管内皮（「ＬＹＶＥ－１」）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（「ＭＩＣＡ」）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（「ＭＩＣＢ」）、ＮＲＧＩ－βＩ、ベータ型血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ Ｒβ」）、血小板内皮細胞接着分子（「ＰＥＣＡＭ－１」）、ＲＡＧＥ、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（「ＴＩＭ－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーＩＯＣ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ３」）、トラピンタンパク質トランスグルタミナーゼ結合ドメイン（「トラピン－２」）、ウロキナーゼ受容体（「ｕＰＡＲ」）、血管細胞接着タンパク質１（「ＶＣＡＭ－１」）、ＸＥＤＡＲ、アクチビンＡ、アグーチ関連タンパク質（「ＡｇＲＰ」）、リボヌクレアーゼ５（「アンジオゲニン」）、アンジオポエチン１、アンジオスタチン、カテプシンＳ、ＣＤ４０、潜在性ファミリータンパク質ＩＢ（「Ｃｒｉｐｔｏ－１」）、ＤＡＮ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（「ＤＫＫ－１」）、Ｅ－カドヘリン、上皮細胞接着分子（「ＥｐＣＡＭ」）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ又はＣＤ９５Ｌ）、Ｆｃｇ ＲＩＩＢ／Ｃ、フォリスタチン、ガレクチン－７、細胞間接着分子２（「ＩＣＡＭ－２」）、ＩＬ－１３ ＲＩ、ＩＬ－１３Ｒ２、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－２ Ｒａ、ＩＬ－２ Ｒｂ、ＩＬ－２３、ＬＡＰ、神経細胞接着分子（「ＮｒＣＡＭ」）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター－１（「ＰＡＩ－１」）、血小板由来成長因子受容体（「ＰＤＧＦ－ＡＢ」）、レジスチン、間質細胞由来因子１（「ＳＤＦ－１β」）、ｓｇｐｌ３０、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（「ＳｈｈＮ」）、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン（「Ｓｉｇｌｅｃ－５」）、ＳＴ２、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（「ＴＧＦβ２」）、Ｔｉｅ－２、トロンボポエチン（「ＴＰＯ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｄ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ４」）、骨髄細胞上に発現される誘発受容体１（「ＴＲＥＭ－１」）、血管内皮増殖因子Ｃ（「ＶＥＧＦ－Ｃ」）、ＶＥＧＦＲ１、アディポネクチン、アジプシン（「ＡＮＤ」）、α－フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、アンジオポエチン様４（「ＡＮＧＰＴＬ４」）、ベータ－２－ミクログロブリン（「Ｂ２Ｍ」）、基底細胞接着分子（「ＢＣＡＭ」）、糖鎖抗原１２５（「ＣＡ１２５」）、がん抗原１５－３（「ＣＡ１５－３」）、がん胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（「ＣＲＰ」）、ヒト上皮成長因子受容体２（「ＥｒｂＢ２」）、フォリスタチン、卵胞刺激ホルモン（「ＦＳＨ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（「ＧＲＯα」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「βＨＣＧ」）、インスリン様成長因子１受容体（「ＩＧＦ－１ ｓＲ」）、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＩＬ－３、ＩＬ－１８ Ｒβ、ＩＬ－２１、レプチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１（「ＭＭＰ－１」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２（「ＭＭＰ－２」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－３（「ＭＭＰ－３」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－８（「ＭＭＰ－８」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９（「ＭＭＰ－９」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１０（「ＭＭＰ－１０」）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１３（「ＭＭＰ－１３」）、神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ－Ｉ」）、エンタクチン（「ニドジェン－１」）、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、オンコスタチンＭ（「ＯＳＭ」）、プロカルシトニン、プロラクチン、前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（「Ｓｉｇｌｅｃ－９」）、ＡＤＡＭ１７エンドペプチダーゼ（「ＴＡＣＥ」）、チログロブリン、メタロプロテイナーゼインヒビター４（「ＴＩＭＰ－４」）、ＴＳＨ２Ｂ４、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（「ＡＤＡＭ－９」）、アンジオポエチン２、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３／酸性ロイシンリッチ核ホスホタンパク質３２ファミリーメンバーＢ（「ＡＰＲＩＬ」）、骨形成タンパク質２（「ＢＭＰ－２」）、骨形成タンパク質９（「ＢＭＰ－９」）、補体成分５ａ（「Ｃ５ａ」）、カテプシンＬ、ＣＤ２００、ＣＤ９７、ケマリン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６Ｂ（「ＤｃＲ３」）、
脂肪酸結合タンパク質２（「ＦＡＢＰ２」）、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（「ＦＡＰ」）、線維芽細胞増殖因子１９（「ＦＧＦ－１９」）、ガレクチン－３、肝細胞増殖因子受容体（「ＨＧＦＲ」）、ＩＦＮ－α／βＲ２、インスリン様増殖因子２（「ＩＧＦ－２」）、インスリン様増殖因子２受容体（「ＩＧＦ－２Ｒ」）、インターロイキン－１受容体６（「ＩＬ－１Ｒ６」）、インターロイキン２４（「ＩＬ－２４」）、インターロイキン３３（「ＩＬ－３３」）、カリクレイン１４、アスパラギンエンドペプチダーゼ（「レグマイン」）、酸化低密度リポタンパク質受容体１（「ＬＯＸ－１」）、マンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）、ネプリライシン（「ＮＥＰ」）、Ｎｏｔｃｈホモログ１、転座関連（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（「Ｎｏｔｃｈ－１」）、腎芽細胞腫過剰発現（「ＮＯＶ」）、オステオアクチビン、プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ－１」）、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ（「ＰＧＲＰ－５」）、セルピンＡ４、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（「ｓＦＲＰ－３」）、トロンボモジュリン、Ｔｏｌｌ様受容体２（「ＴＬＲ２」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（「ＴＲＡＩＬ ＲI」）、トランスフェリン（「ＴＲＦ」）、ＷＩＦ－ｌＡＣＥ－２、アルブミン、ＡＭＩＣＡ、アンジオポエチン４、Ｂ細胞活性化因子（「ＢＡＦＦ」）、糖鎖抗原１９－９（「ＣＡ１９－９」）、ＣＤ１６３、クラステリン、ＣＲＴＡＭ、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＣＸＣＬ１４」）、シスタチンＣ、デコリン（「ＤＣＮ」）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３（「Ｄｋｋ－３」）、デルタ様タンパク質１（「ＤＬＬ１」）、フェツインＡ、ヘパリン結合成長因子１（「ａＦＧＦ」）、葉酸受容体アルファ（「ＦＯＬＲ１」）、フューリン、ＧＰＣＲ関連ソーティングタンパク質１（「ＧＡＳＰ－１」）、ＧＰＣＲ関連ソーティングタンパク質２（「ＧＡＳＰ－２」）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（「ＧＣＳＦＲ」）、セリンプロテアーゼヘプシン（「ＨＡＩ－２」）、インターロイキン－１７Ｂ受容体（「ＩＬ－１７Ｂ Ｒ」）、インターロイキン２７（「ＩＬ－２７」）、リンパ球活性化遺伝子３（「ＬＡＧ－３」）、アポリポタンパク質Ａ－Ｖ（「ＬＤＬ Ｒ」）、ペプシノーゲンＩ、レチノール結合タンパク質４（「ＲＢＰ４」）、ＳＯＳＴ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（「シンデカン－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（「ＴＡＣＩ」）、組織因子経路阻害剤（「ＴＦＰＩ」）、ＴＳＰ－Ｉ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ２」）、ＴＲＡＮＣＥ、トロポニンＩ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（「ｕＰＡ」）、カドヘリン５、２型又はＣＤ１４４としても知られるＶＥ－カドヘリン（血管内皮）（「ＶＥ－カドヘリン」）、ＷＮＴｌ誘導性シグナル伝達経路タンパク質１（「ＷＩＳＰ－１」）、及び核因子κＢの受容体活性化因子（「ＲＡＮＫ」）などがあるが、これらには限定されない。

【0276】

一部の実施形態では、対象に、免疫チェックポイント阻害剤も投与される。免疫チェックポイント阻害は、がん細胞が免疫応答を阻止又はダウンレギュレートするために産生することができるチェックポイントを阻害することを広く指す。免疫チェックポイントタンパク質の例には、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３又はＶＩＳＴＡが含まれるが、これらには限定されない。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に結合して阻害する抗体又はその抗原結合断片であり得る。免疫チェックポイント阻害剤の例としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＳＴＩ－Ａ１１１０、ＴＳＲ－０４２、ＲＧ－７４４６、ＢＭＳ－９３６５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＳＢ－００２０７１８Ｃ、ＡＵＲ－０１２及びＳＴＩ－Ａ１０１０が挙げられるが、これらに限定されない。

【0277】

一部の実施形態では、本明細書中に提供される組成物（例えば、本明細書中に提供されるワクチン組成物）は、がん及び／又はＣＭＶ感染症を予防するために予防的に投与される。一部の実施形態では、ワクチンは、腫瘍細胞の増大を阻害するために投与される。ワクチンは、患者におけるがん細胞又はＣＭＶ感染細胞の検出の前又は後に投与され得る。腫瘍細胞の増大の阻害は、腫瘍細胞の増殖の予防、停止、緩徐化、又は腫瘍細胞の死滅を指すと理解される。一部の実施形態では、本明細書に記載のペプチド、核酸、抗体又はＡＰＣを含むワクチンの投与後に、炎症誘発性応答が誘導される。炎症誘発性免疫応答は、炎症誘発性サイトカイン及び／又はケモカイン、例えば、ＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２の産生を含む。炎症誘発性サイトカイン及びケモカインは、当該技術分野において周知である。

【0278】

併用療法は、後続治療の投与を行う際に、投与された第１の薬剤の治療効果が完全には消失しないように、活性化合物を順次、同時及び別々に、並びに／又は共投与することを含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤とともに製剤化されてもよく、別々の医薬組成物として製剤化されてもよい。

【0279】

「投与すること」又は「投与」とは、特定の選択された経路による、動物対象への、本明細書中に開示される単離されたＥｐｈＡ３結合剤、ＣＡＲ、コードする核酸、遺伝子構築物、細胞又は組成物の導入を意味する。

【0280】

ＥｐｈＡ３結合剤、ＣＡＲ若しくはそのバリアント、又はコードする核酸、遺伝子構築物、若しくは細胞、又はそれらを含む組成物の投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、頭蓋内、経皮、経口、鼻腔内、肛門及び眼内を含む、任意の既知の非経口、局所又は経腸経路によるものであり得るが、これらに限定されない。

【0281】

剤形としては、錠剤、分散液、懸濁液、注射剤、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、座剤、エアゾール、経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形は、この目的のために特別に設計された制御放出デバイス、又はこの様式で追加的に作用するように改変された他の形態のインプラントの注射又は移植も含み得る。治療剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーでこれを被覆することによって生じさせることができる。加えて、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフィアを使用することによっても生じさせることができる。

【0282】

経口又は非経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが予め定められた量の本発明の１つ以上の治療剤を含有するカプセル、サシェ若しくは錠剤などの個別のユニットとして、粉末若しくは顆粒として、又は水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョン若しくは油中水型エマルジョン中の溶液又は懸濁物として提示することができる。そのような組成物は、薬学のいずれの方法によっても調製することができるが、すべての方法は、１つ以上の必要な成分を構成する担体に、上記のような１つ以上の薬剤を会合させるステップを含む。一般に、組成物は、本発明の薬剤を液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と均一かつ密接に混和し、その後、必要に応じて、産物を所望の提示物に成形することによって調製される。

【0283】

別の関連する態様では、本発明は、対象におけるがんの予防及び／又は治療のための医薬品の製造における、本明細書に記載のＥｐｈＡ３結合剤、本明細書に記載のＣＡＲ、本明細書に記載の単離された核酸、本明細書に記載の遺伝子構築物及び／又は本明細書に記載の宿主細胞の使用に存する。

【0284】

一実施形態では、がんは、多形性神経膠芽細胞腫であるか又はそれを含む。

【0285】

標識及びコンジュゲート
さらに別の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出する方法であって、本明細書における前記のＥｐｈＡ３結合分子又はＣＡＲとＥｐｈＡ３との複合体を形成させて、それによってＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を検出するステップを含む方法を提供する。

【0286】

一実施形態では、本方法は、ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞を、本明細書の上記又は他の場所に記載されたＥｐｈＡ３抗原結合分子又はＣＡＲと接触させる最初のステップを含む。

【0287】

したがって、一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、検出可能な部位をさらに含む。

【0288】

ある特定の実施形態では、細胞は、がん細胞であるか、又はがん細胞を含む。

【0289】

したがって、本明細書中に開示されるＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを、がんの医学的診断を補助するために使用し得ることが理解されるであろう。好適には、本方法は、生体試料中に存在する、又は生体試料から入手したがん細胞によって発現される場合などに、ＥｐｈＡ３を検出することを含む。ある特定の実施形態では、生体試料は、ヒトから入手した１つ以上の液体、細胞、組織、臓器又は器官試料を含む病理学的試料であり得る。非限定的な例としては、血液、血漿、唾液、血清、リンパ球、尿、糞便、羊水、頸部試料、脳脊髄液、組織生検、骨髄及び皮膚などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0290】

一部の実施形態では、抗原結合分子は、検出可能部分を含む。例えば、ＥｐｈＡ３抗原結合分子及び／又はＣＡＲは、蛍光標識、リン光標識、発光標識、免疫検出可能標識（例えば、エピトープタグ）、放射性標識、化学標識、核酸標識又は酵素標識を含む。抗原結合分子は、検出可能部分によって共有結合性または非共有結合性に標識され得る。

【0291】

蛍光標識としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン、エオシン、及びＮＤＢ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、希土類のキレート剤（ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、及びサマリウム（Ｓｍ）など）、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４－メチルウンベリフェロン、７－アミノ－４－メチルクマリン、Ｃｙ３、及びＣｙ５が挙げられる。

【0292】

放射性標識としては、ヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１２６、ヨウ素^１３１、ヨウ素^１３３、臭素^７７、テクネチウム^９９ｍ、インジウム^１１１、インジウム^１１３ｍ、ガリウム^６７、ガリウム^６８、ルテニウム^９５、ルテニウム^１０３、ルテニウム^１０５、水銀^２０７、水銀^２０３、レニウム^９９ｍ、レニウム^１０１、レニウム^１０５、スカンジウム^４７、テルリウム^１２１ｍ、テルリウム^１２２ｍ、テルリウム^１２５、ツリウム^１６５、ツリウム^１６７、ツリウム^１６、銅^６７、フッ素^１８、イットリウム^９０、パラジウム^１００、ビスマス^２１７、及びアンチモン^２１１などの放射性同位体が挙げられる。

【0293】

発光標識としては、放射性発光標識、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール）、及び生物発光標識が挙げられる。免疫検出可能標識としては、ハプテン、ペプチド／ポリペプチド、抗体、受容体、及びビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はジゴキシゲニンなどのリガンドが挙げられる。核酸標識としては、アプタマーが挙げられる。酵素標識としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。

【0294】

一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、化学的部分とコンジュゲートされる。化学的部分は、治療効果をもたらすための部分であり得る。抗体－薬物コンジュゲートについては、例えば、Ｐａｒｓｌｏｗら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ． ２０１６ Ｓｅｐ；４（３）：１４に総説されている。一部の実施形態では、化学的部分は、薬物部分（例えば、細胞傷害剤）であり得る。一部の実施形態では、薬物部分は、化学療法剤であり得る。

【0295】

標識は、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）、フルオロフォア（例えば、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、クマリン）、放射性同位元素（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^６７Ｇａ、^１１１Ｉｎ）及び／又は直接可視標識（例えば、金粒子）を含む群から選択し得るが、これらには限定されない。

【0296】

好適には、ＥｐｈＡ３の検出は、ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲと、ＥｐｈＡ３又はＥｐｈＡ３を発現する細胞との検出可能な複合体を形成させるステップを含む。そのようにして形成された複合体を、イムノブロット法、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、表面プラズモン共鳴などのバイオセンサーに基づく検出システム及びＰＥＴイメージングなどのイメージングを含むが、それらには限定されない、当技術分野で公知の任意の技術、アッセイ又は手段によって検出することができる。

【0297】

検出を容易にするために、ＥｐｈＡ３結合剤又はＣＡＲを、本明細書における前記のように直接標識してもよく、又は標識された二次抗体を使用することもできる。標識は、本明細書における前記の通りであり得る。

【0298】

一部の実施形態では、本明細書中に開示される抗体又は抗体断片を、１つ以上の検出試薬、例えば、これらに限定されないが、酵素、酵素基質（例えば、ルミノール、ＡＭＰＰＤ、ＮＢＴ）、二次抗体及び／又は磁気ビーズなどとともに含む検出キットが提供され得る。

【0299】

別の態様では、本発明は、配列番号１３～１５６及び／若しくは表４～７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、単離されたタンパク質を提供する。

【0300】

最後の一態様では、本発明は、配列番号１～１２及び／若しくは表３のいずれか１つに記載の核酸配列又はそれに対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、単離された核酸を提供する。

【0301】

前述の態様に関して、「対象」という用語は、ヒト、パフォーマンス用動物（ウマ、ラクダ、グレーハウンドなど）、家畜（ウシ、ヒツジ、ウマなど）及び愛玩動物（ネコ及びイヌなど）を含む哺乳動物を含むが、ただしそれらに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0302】

好ましい実施形態を詳細に説明し、実用的な効果を得るために、以下の非限定的な実施例を参照する。

【実施例】

【0303】

実施例１
理論的根拠
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞による養子免疫療法は、血液がんの治療においてかなりの成功を示している^４。これらの飛躍的進展にもかかわらず、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ Ｔ細胞の成功は限定的である。

【0304】

ＣＡＲは、任意の抗体、又は受容体リガンドの腫瘍標的化特異性を利用して、Ｔ細胞の細胞溶解能力を再指向化させる。治療上の価値は、腫瘍活性を得る一方でオフターゲット活性を低くするために、標的となる特定のがんバイオマーカー、又はマーカーの組合せに対する結合領域に、目的に合った操作を行えることにある。ＧＢＭ、及びいくつかの他のがんにおいて、ＥｐｈＡ３は治療標的として同定されている^６。ＥｐｈＡ３はがんで過剰発現され、腫瘍の成長、侵襲性、及び転移と関連がある^６～９。ＥｐｈＡ３は、腫瘍細胞を低分化状態に維持する上で極めて重要であるように思われ、がん性幹細胞（ＣＳＣ）の自己再生を促進する。このため、ＥｐｈＡ３の標的化阻害は、固形がんを治療するための有望な治療アプローチであり、ＣＳＣを標的化することにより、不均一ながん、転移性がん、又は治療に対して抵抗性であると判断されるがんに対しても効果がある可能性がある。

【0305】

ＥｐｈＡ３を標的とする治療用抗体は、現在、再発性の神経膠芽細胞腫患者における臨床的評価が進行中であり、十分な忍容性があるほか、特定のがんコホートにおいて有望な臨床活性が実証されている（１０）。しかし、阻害剤の薬理学的レベルを、特に脳において（１１）達成及び維持するという困難さを考慮した上で、本実施例では、従来の戦略を上回って、脳における標的化された抗腫瘍反応をもたらす可能性がある、ＣＡＲ Ｔ細胞を使用するアプローチを検討した。

【0306】

設計
ＥｐｈＡ３モノクローナル抗体
ヒトＥｐｈＡ３の細胞外ドメイン配列（Ｐ２９３２０、２１～５４１ａａ）を設計し、最適化して、合成した上で、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにサブクローニングした。Ｅｘｐｉ２９３細胞での発現のために、トランスフェクション等級プラスミドのｍａｘｉ調製を行った。クローニング戦略を図１に示す。

【0307】

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、無血清Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地を入れた三角フラスコ内で、８％ ＣＯ_２、３７℃にてオービタルシェイカー上で増殖させた。トランスフェクションの日に、ＤＮＡとトランスフェクション試薬を最適な比で混合し、続いてフラスコに添加した。細胞培養上清を第６日に採取し、精製のためにアフィニティー精製カラムにローディングした。適切な緩衝液による洗浄及び溶出の後に、溶出画分をプールして、緩衝液を最終的な製剤化緩衝液に交換した。精製されたタンパク質を、分子量及び純度の測定のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法によって分析した（図２）。ＢＳＡを標準物質として用いるＢＣＡ（商標）アッセイによって濃度を決定したところ、純度およそ９５％の１．７７ｍｇ／ｍＬのタンパク質が得られ、複数回の凍結－解凍を避けるために複数のアリコートにした上で－８０℃で保存した。

【0308】

３匹のＢＡＬＢ／ｃマウス及び３匹のＣ５７マウスに対して、以下の表に示す免疫処置スケジュールに従って、組換えヒトＥｐｈＡ３タンパク質による免疫処置を行った。

【0309】

【表2】

【0310】

各群のマウスについて、細胞融合及びクローンのプレーティングを電気融合によって行った。各融合による融合細胞のすべてを９６ウェルプレートにプレーティングし、馴化培地を、ＥｐｈＡ３タンパク質を用いるＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。陽性上清は無関係なｈｉｓタグ付加タンパク質に関しては陰性であることがＥＬＩＳＡによって確かめられた。ＥｐｈＡ３特異性に基づいて、５つの親ハイブリドーマクローンをサブクローニング用に選択した。１０種のモノクローナルサブクローン上清を、ＥＬＩＳＡにおいて組換えＥｐｈＡ３とのＥｐｈＡ３結合効率に関して、又はフローサイトメトリーにより、ＥｐｈＡ３を発現する白血病細胞株ＬＫ６３^９とのＥｐｈＡ３結合効率に関してスクリーニングした（図３及び図４－１～４－３）。ハイブリドーマ３Ｃ３－１及び２Ｄ４－１をシークエンシングのために選択し、結合効率がより低いクローン（６Ｃ９－１など）は除外した。

【0311】

シークエンシングのために、３Ｃ３－１及び２Ｄ４－１ハイブリドーマ細胞から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して全ＲＮＡを単離した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを使用し、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマー又は汎用プライマーのいずれかを使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。重鎖及び軽鎖の抗体断片をｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ＲＡＣＥ）によって増幅させた。増幅された抗体断片を標準的なクローニングベクター中に別々にクローニングした。コロニーＰＣＲを行って、正しいサイズのインサート及び表３にリスト化したコンセンサス配列を有するクローンをスクリーニングした。

【0312】

【表3】

【0313】

３Ｃ３－１及び２Ｄ４－１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を表４～７にリスト化している。

【0314】

本発明者らは、様々なＥｐｈＡ３特異的高親和性相補性決定領域（ＣＤＲ）を作製した。これらのユニーク配列はＥｐｈＡ３特異的結合ドメインを形成し、ＣＡＲ Ｔ細胞技術を使用して標的ＥｐｈＡ３に対する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を作製するために、又はＥｐｈＡ３が標的である他の用途のために使用することができる。

【0315】

【表4】

【0316】

【表5】

【0317】

【表6】

【0318】

【表7】

【0319】

結果
神経膠腫細胞株上のＥｐｈＡ３
クローン３Ｃ３－１を使用して、神経膠腫細胞株をＥｐｈＡ３発現に関してスクリーニングした（図５）。Ｕ８７細胞は陰性であったが、Ｄ２７０細胞はある割合でＥｐｈＡ３陽性腫瘍細胞及び陰性腫瘍細胞を示した。Ｕ２５１細胞は大部分がＥｐｈＡ３陽性である。これらの腫瘍細胞株は、不均一な腫瘍（Ｄ２７０）に対する免疫治療アプローチを試験するために、また、ＥｐｈＡ３発現が亢進している特に高悪性度のＧＢＭ（Ｕ２５１）を評価するためにも有益であると考えられる。

【0320】

ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、可動性ペプチドリンカーによって一つに接合された重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）からなる。クローン３Ｃ３－１及び２Ｄ４－１のｓｃＦｖ配列を比較したところ、アラインメントの同一性は４８％未満であり、このことはこれらが別個の配列であることを意味する。これらのｓｃＦｖ配列を使用して、本発明者らの第２世代ＣＡＲ構築物を作り出すためのレンチウイルス発現プラスミドを作製した。手短に述べると、本発明者らは、抗ＥｐｈＡ３ ｓｃＦｖの個々のコード配列を、ヒンジ、ＣＤ８膜貫通領域、及びＣＤ３－ζを有するヒト４－１ＢＢ又はＣＤ２８の細胞質領域と連結した（図６）。これらの配列をｐＤ２１０９（レンチウイルス骨格プラスミド‐ＡＴＵＭ）にサブクローニングして、レンチウイルス発現プラスミドを作製した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト胚性腎臓細胞へのトランスフェクションを介してレンチウイルス粒子を産生させた。リポフェクタミン２０００を使用して、細胞に発現プラスミド（ＦＡ３０１又はＦＡ３０２）及びｐＭＤＬ、ｐＲＥＶ及びｐＶＳＶ－Ｇプラスミドをトランスフェクトした。ｐＤ２１０９を対照として使用した。２９３Ｔ細胞におけるＣＡＲ配列の発現が、ＲＴ－ＰＣＲによって確かめられた（図７）。トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に、ウイルス上清を採取した。

【0321】

【表8】

【0322】

Ｊｕｒｋａｔ細胞株におけるＥｐｈＡ３－ＣＡＲ発現
Ｊｕｒｋａｔ細胞は不死化ヒトＴ細胞株の一つであり、レンチウイルス含有上清の力価を決定するためにこれを使用した。ＣＡＲ構築物はＩｒｅｓ＿ＲＦＰと縦列しているため、表面でのＲＦＰの発現を、形質導入のレポーターとして使用した。このため、Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入を行ってＲＦＰ発現を定量することによって、形質導入効率を決定した。形質導入効率は３２～５８％（１×１０^６個の細胞において）の範囲であり、その結果、力価の範囲は３．２～５．８×１０^５ＩＵ／ｍＬの範囲となった。対照ｐＤ２１０９＿ＧＦＰレンチウイルスの力価は８×１０^４ＩＵ／ｍＬであった（図８）。

【0323】

ＣＡＲ配列及びＲＦＰ配列は両方とも、表面膜発現のためのＣＤ８リーダー配列が頭部にある。それでもなお、ＣＡＲの表面発現及び標的との結合を確かめるために、細胞をＥｐｈＡ３－Ｈｉｓタンパク質とともにインキュベートして、αＨｉｓタグＡｂによって染色した。ＦＡＣＳの結果から、ＥｐｈＡ３－ＣＡＲが表面に発現され、ＲＦＰ高発現を伴う細胞において主としてＥｐｈＡ３に結合することが示されている（図９）。ＣＤ６９はＴ細胞における初期活性化マーカーであり、増殖及びシグナル伝達に関与する。本発明者らは、ＣＤ６９をＪｕｒｋａｔ－ＣＡＲ細胞のＥｐｈＡ３特異的活性化のマーカーとして使用した。ＲＦＰ陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ６９発現は高レベルであるにもかかわらず、結果からは、膜に結合したＥｐｈＡとの相互作用によって（図１０）、又はＬｋ６３細胞（ＥｐｈＡ３陽性腫瘍細胞株）とのインキュベーションによって（図１１）、ＣＡＲ構築物を発現する細胞（ＲＦＰ陽性細胞）では中程度の活性化が起こることが示されている。ＣＤ６９発現のわずかな増加のみが観察されたが、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＡＲにおける活性化マーカーの発現はＣＡＲ機能の有望な指標である。このため、これらの細胞で起こった活性化が低レベルであったのは、形質導入のために使用した感染多重度（ＭＯＩ）が低く、その結果として、細胞あたりの組込みの数が少なかったこと（場合によっては１個のみ）が理由であると推測している。本発明者らは、形質導入のＭＯＩを高める目的でレンチウイルスを濃縮することによって、このことについて今後対処する予定である。

【0324】

ＥｐｈＡ３－ＣＡＲを作製するためのＰＢＭＣ由来のＴ細胞
静脈切開から２４時間以内の密度勾配遠心分離によって、末梢血からＰＢＭＣを収集した。ＰＢＭＣ画分を取り出し、洗浄した上で算定した。Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）によるＣＤ３及びＣＤ２８刺激を介した活性化及び増大によって、ポリクローナルＴ細胞を作製した。以前に記載されたプロトコールを使用して、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞をＰＢＭＣから増大させた^{１０、１１}。手短に述べると、ＰＢＭＣの３分の１を、複数のＣＭＶ抗原に由来する２６種のＴ細胞ペプチドエピトープの特製プールとともに１時間インキュベートし、洗浄した上で残りのＰＢＭＣと混合し、続いてフラスコに細胞２～５×１０^６個／ｃｍ^２の密度で播種した。

【0325】

刺激後の第２日に、ｐＤ２１０９（ＧＦＰレポーター）及びＦＡ３０１（ＲＦＰレポーター）レンチウイルスを使用して、細胞に対して形質導入を行った。細胞を、２～３日毎に添加した組換えＩＬ－２を含有する培地中で培養した。形質導入後の第３日のＦＡＣＳにより、この両方のレンチウイルスの形質導入効率が低いことが明らかになった（図１２）。

【0326】

結論
本発明者らは、ＥｐｈＡ３特異的モノクローナル抗体を首尾良く作製し、それをＣＡＲレンチウイルス構築物におけるｓｃＦｖとして使用した。Ｊｕｒｋａｔ－ＥｐｈＡ３－ＣＡＲはキメラタンパク質を表面に発現し、ＥｐｈＡ３の認識に応じて、初期活性化マーカーをアップレギュレートする。本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＭＶ特異的Ｔ細胞の両方にＥｐｈ－Ａ３－ＣＡＲによる形質導入が可能であることをさらに実証する。

【0327】

実施例２
ウイルス力価及びＴ細胞形質導入効率を改善することを目的として、インサートのサイズを減らすために、構築物からＩＲＥＳ及びＲＦＰレポーター配列を除去した。これらのより小型の構築物ＦＡ３－０５－ＢＢζ及びＦＡ３－０６－２８ζを使用して、４℃、１０，５００ｒｐｍでの４時間の超遠心分離ステップ（ＳＷ ３２ Ｔｉ遠心機）を含めて、前述の通りにレンチウイルスを作製した。ポリクローナルＴ細胞を前述の通りに培養し、第２日に形質導入を行った。ＣＡＲを発現するＴ細胞を、抗マウスＩｇＧ ＡＦ５４６による表面染色によって検出し、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＡＲ形質導入効率は第１２日の時点でも低いままであった。細胞をＣＡＲ＋発現に関して選別し、最長で第２０日まで培養した（図１３のＡ）。

【0328】

本発明者らは次に、これらのＦＡ３－ＣＡＲのインビトロ機能を判定した。形質導入されたＴ細胞を、ＥｐｈＡ３＋腫瘍細胞株の一つであるＬＫ６３によって一晩かけて刺激した。標準的な細胞内染色プロトコールを使用して、本発明者らは、ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞が、４－１ＢＢ（ＦＡ３０５）又はＣＤ２８（ＦＡ３０６）共刺激のいずれの場合にも、Ｔ細胞活性化性及び免疫調節性の分子であるＴＮＦの同等な標的誘発性サイトカイン分泌を起こすことを立証した（図１３のＢ）。

【0329】

Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ社による特製のｐＬＶ－Ｅｆ１ａ発現プラスミド骨格を使用して、ＦＡ３－０６－２８ζ構築物のサイズをさらに縮小した。以後の検討は、このプラスミドを用いて作製したレンチウイルスによる形質導入を行ったＴ細胞を使用して行い、これをＣＡＲ ＥｐＨＡ３ Ｔ細胞と称するものとする。

【0330】

ＣＡＲ ＥｐＨＡ３レンチウイルスを使用して、ポリクローナルＴ細胞（抗ＣＤ３／２８^＋刺激Ｔ細胞）及びＣＭＶ特異的Ｔ細胞に形質導入を行った。ＣＡＲ発現を前述の通りに決定し、ＣＭＶ－ＣＡＲ特異性を、ＨＬＡ複合体‐ＣＭＶに対するペプチド四量体を使用するＦＡＣＳ分析によって決定した（図１４）。ＥｐｈＡ３－ＣＡＲのインビトロ機能を前述の通りに決定した。形質導入されたＴ細胞を、ＬＫ６３細胞によって一晩かけて刺激した。標準的な細胞内染色プロトコールを使用して、本発明者らは、ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＮＦの標的誘発性サイトカイン分泌を起こすことを立証した。刺激後に、ＣＭＶ－ｐｅｐｍｉｘから作製したＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＮＦ、ＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａを含む複数のエフェクター分子を発現し、このことはこれらの細胞がより大きな死滅能力を有する可能性を示唆する（図１５）。ＥｐｈＡ３－ＣＡＲの特異性及び死滅能力の両方を判定するために、本発明者らは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用するリアルタイム細胞傷害アッセイ（ＲＴＣＡ）を行った。このアッセイは、標的細胞の死滅を１００時間の期間にわたって測定する。内因性ＥｐｈＡ３発現を有する神経膠腫細胞株Ｕ２５１を、陽性標的として、陰性対照としてのＥｐｈＡ３陰性神経膠腫細胞Ｕ８７とともに使用した。Ｄａｙらによる以前の研究により、標的としてのこれらの細胞の使用を検証する同所性ＧＢＭモデルにおいて、Ｕ２５１ ＥｐｈＡ３＋グリア細胞株が抗ＥｐｈＡ３（クローンＩＩＩＡ４）抗体に反応することが示されている^１６。ＲＴＣＡアッセイにおいて、標的細胞とＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞とのインキュベーションは、処置１００時間以内に８０％の細胞溶解を誘導し、ＥｐｈＡ３陰性神経膠腫細胞の死滅は全く観察されなかった（図１６のＡ）。標的細胞のＥｐｈＡ３ ＣＡＲ性死滅が、ＲＴＣＡにより、１：１、５：１及び１０：１のエフェクター・標的比で観察された（図１６のＢ）。ＥｐｈＡ３－ＣＭＶ ＣＡＲ Ｔ細胞の死滅能力をＥｐｈＡ３ ＣＡＲと比較するために、本発明者らは、１：１、５：１及び１０：１のＴ細胞：標的Ｕ２５１比を使用するＲＴＣＡを行い、特に１０：１で標的細胞の効率的な死滅を観察し、それはＥｐｈＡ３－ＣＭＶ ＣＡＲ Ｔ細胞でより明白であった（図１６のＣ）。

【0331】

実施例３
ＥＰＨＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞はインビボで強力な抗腫瘍効果を示す
ＣＡＲ ＥｐｈＡ３ Ｔ細胞がグリア細胞株に対して有意なインビトロ細胞傷害性を有することを示した後に、本発明者らは次に、インビボでのそれらの治療能力を評価した。

【0332】

免疫不全ＮＯＤ．Ｒａｇ１ＫＯ．ＩＬ２ＲγｃＫＯ（ＮＲＧ）マウスに対して、ルシフェラーゼを発現する神経膠腫細胞株Ｕ２５１（ＥｐｈＡ３＋）又はＵ８７（ＥｐｈＡ３－）を、側腹に皮下移植した（異所性モデル）（図１７－１のＡ）。腫瘍サイズを測定するか又はバイオルミネセンスによって決定した。第１０日の時点で腫瘍がおよそ２５ｍｍ^２に達したため、マウスに対して、ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞、ＮＴ（非形質導入）Ｔ細胞、又はＣＡＲ１９（非特異的ＣＡＲ Ｔ細胞）Ｔ細胞による、細胞の２回の静脈内注射のうちの初回の注射を行った。血流中ｈＣＤ４５が第１７日に検出され、これは大部分がＣＤ４^＋ ＣＡＲ Ｔ細胞であった（図１７－１のＢ）。その上、ＥｐｈＡ３－ＣＡＲ Ｔ細胞の投与を受けたＵ２５１担持マウスにおいてＫｉ６７の発現増大が観察され、このことから、この治療群におけるこれらのＣＡＲ Ｔ細胞の標的誘発性増殖が示唆された（図１７－１のＣ）。

【0333】

注目されることとして、ＣＡＲ ＥｐｈＡ３ Ｔ細胞による治療は、Ｕ２５１（ＥｐｈＡ３＋）腫瘍を移植されたマウスにおいて完全な応答を誘導し、第３０日までに完全に腫瘍が消失した（図１７－２のＤ及びＦ）。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞又は非特異的Ｔ細胞（ＣＡＲ１９ Ｔ細胞）の投与を受けたマウス、及びＵ８７（ＥｐｈＡ３^－）担持マウスは、腫瘍成長を抑制することができなかった（図１７－２のＤ～Ｇ）。

【0334】

結論
これらのデータは、これらのＣＡＲ Ｔ細胞がＥｐｈＡ３を標的とし、強力な抗腫瘍活性を媒介することを実証する。ＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療は、異所性異種移植ＧＢＭ腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を生じさせる。これらのデータは、ＧＢＭなどのがんに対する新たな治療としてのＥｐｈＡ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の使用を裏付けるものである。

【0335】

［参考文献］
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【0336】

本出願は、２０１９年１０月９日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１９９０３８０２号による優先権を主張し、その内容及び要素はすべての目的のために参照によって本明細書に組み入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【配列表】

2022552786000001.app

【国際調査報告】