▶ オフィオミクス－インベスティガカオ イー デセンボルヴィメント エン バイオテクノロジア エスエーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-20
(54)【発明の名称】肝移植のための臨床予後マーカー及び分子予後マーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20221213BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20221213BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221213BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20221213BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20221213BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221213BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221213BHJP
G06T 7/00 20170101ALI20221213BHJP
G06V 10/70 20220101ALI20221213BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6876 Z
A61L27/36 100
A61P35/00
A61P1/16
G06T7/00 350B
G06V10/70
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520660
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(85)【翻訳文提出日】2022-04-28
(86)【国際出願番号】 EP2020077757
(87)【国際公開番号】W WO2021064230
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】19201218.5
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522132281
【氏名又は名称】オフィオミクス－インベスティガカオ イー デセンボルヴィメント エン バイオテクノロジア エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】バロッソ，エデュアルド
(72)【発明者】
【氏名】マークス，ヒューゴ，ピント
(72)【発明者】
【氏名】リール，ホセ，ペレイラ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァズ，ジョアナ，カルドソ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C081
5L096
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
4C081AB11
5L096AA06
5L096BA06
5L096GA51
5L096KA04
(57)【要約】
本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法、又は肝移植を受けるようにＨＣＣ患者を割り当てるための方法に関し、前記方法は、ＨＣＣに罹患している患者から得られた肝サンプルにおいて、デルマトポンチン、クラステリン、カルパイン小サブユニット１、Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７及びＳｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２から選択される指標遺伝子の発現レベルを決定する工程、及び前記指標遺伝子の発現レベルを内部コントロール遺伝子の発現レベルと比較し、変数の総腫瘍体積と組み合わせて線形サポートベクターマシンアルゴリズムを使用して肝移植レシピエントのポジティブな予後を予測する工程を含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法であって、－ 決定工程において、ＨＣＣに罹患する患者から得られた肝臓サンプルにおいて、
ａ． クラステリン（ＣＬＵ、遺伝子ＩＤ ＧＣ０８Ｍ０２７５９６）、及び
ｂ． デルマトポンチン（ＤＰＴ、遺伝子ＩＤ ＧＣ０１Ｍ１６８６６４）
を含む指標遺伝子の群のそれぞれの発現レベルを決定する工程、
－ 分類工程において、患者を、前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて肝移植のアウトカムとして良好な予後に割り当てる工程、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記指標遺伝子の群は、ａ． カルパイン小サブユニット１（ＣＡＰＮＳ１、遺伝子ＩＤ ＧＣ１９Ｐ０３６４３４）
ｂ． Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７（ＦＢＸＷ７、遺伝子ＩＤ ＧＣ０４Ｍ１５２３２１）
ｃ． Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２（ＳＰＲＹ２、遺伝子ＩＤ ＧＣ１３Ｍ０８０３３５）
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項3】
前記指標遺伝子は、閾値に対して過剰発現している、請求項１又は２に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項4】
前記指標遺伝子の過剰発現、特にＤＰＴ及び／又はＣＬＵの過剰発現は、良好な予後を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項5】
ａ． ＤＰＴ及びＣＬＵの過剰発現、及びｂ． 総腫瘍体積が１１５ｃｍ３以下であること
は、良好な予後を示す、
請求項１～４のいずれか一項に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項6】
前記指標遺伝子の発現レベルは、ポリメラーゼ連鎖反応によって決定され、前記閾値に対する前記指標遺伝子の発現値は、前記指標遺伝子の閾値サイクル数と内部コントロール遺伝子の閾値サイクル数との差として決定され、ここで前記閾値サイクル数は、産物（前記指標遺伝子及び前記内部コントロール遺伝子）が検出されるＰＣＲサイクル数である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項7】
指標遺伝子の閾値サイクル数の差が、ａ．ＤＰＴについて、ＤＰＴは７より高く、かつ
ｂ．ＣＬＵは、－０．５４より高い場合、
前記指標遺伝子は、過剰発現しているといえる、請求項１～６のいずれか一項に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項8】
患者のサンプルにおける１つ又は複数の前記指標遺伝子の発現レベル、及び／又は腫瘍体積の測定値は、疾患の再発の可能性を反映する値を提供するようにアルゴリズムに組み込まれ、特に前記アルゴリズムは、サポートベクターマシンアルゴリズムであり、より特に前記アルゴリズムは、線形カーネルサポートベクターマシンアルゴリズムである、請求項１又は７に記載のＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法。
【請求項9】
肝移植バイオマーカーの高発現を検出するためのシステムであって、ＤＰＴの発現、並びにＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７及びＳＰＲＹ２から選択される遺伝子の発現、特にＤＰＴ及びＣＬＵの発現を決定するための手段を含む、前記システム。
【請求項10】
ＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するためのバイオマーカーを分析するためのキットにおける、ＤＰＴ及びＣＬＵの発現、並びに任意にＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７及びＳＰＲＹ２から選択される追加のバイオマーカーの発現の増幅及び検出のためのプライマーの使用。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載のとおりの方法に従って患者が良好な予後を有する可能性があると分類されている、以前にＨＣＣと診断されている患者を、肝移植の処置を用いて治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年１０月２日付け欧州特許出願番号第ＥＰ１９２０１２１８．５号の優先権を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、肝細胞癌の治療過程において肝移植を受けることを予定している、或いは検討している患者の予後のための、又はポジティブなアウトカム（ｏｕｔｃｏｍｅ）の可能性を判定するための方法に関する。患者の選択についての現在の基準と比較して、臨床マーカー及び分子マーカーの両方を統合的に適用することで肝移植の可能な候補者の選択を改善することができる。この適用は、肝細胞癌により肝移植が必要とされる患者の選択を改善することに貢献するであろう。
【背景技術】
【0003】
説明
肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ））は、高頻度でみられる疾患であり、死亡率及びクオリティ・オブ・ライフに大きな影響を与える。この多因子病因及び複雑な病因を理解することは、現在の治療法における患者の層別化の情報を与えるため、又は患者のゲノムに最適化した個別化医療を設計するために重要である。肝移植（Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＬＴ））は、肝硬変におけるＨＣＣの最良の治療法であるが、この疾患について不良なアウトカムの可能性が高いため、臓器の利用可能性は限られている。さらに、現在の基準の拡大は、移植に対する需要のさらなる増加につながり、よって移植前リストの待機時間が長くなり、離脱率が増加し、治療意図（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｒｅａｔ）のアウトカムを悪化させると考えられている。臓器が入手できる場合でも、ＬＴの利益はドナーのリスクと釣り合わなければならない。
肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ））は、高頻度でみられる疾患であり、死亡率及びクオリティ・オブ・ライフに大きな影響を与える。この多因子病因及び複雑な病因を理解することは、現在の治療法における患者の層別化の情報を与えるため、又は患者のゲノムに最適化した個別化医療を設計するために重要である。肝移植（Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＬＴ））は、肝硬変におけるＨＣＣの最良の治療法であるが、この疾患について不良なアウトカムの可能性が高いため、臓器の利用可能性は限られている。さらに、現在の基準の拡大は、移植に対する需要のさらなる増加につながり、よって移植前リストの待機時間が長くなり、離脱率が増加し、治療意図（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ－ｔｏ－ｔｒｅａｔ）のアウトカムを悪化させると考えられている。臓器が入手できる場合でも、ＬＴの利益はドナーのリスクと釣り合わなければならない。
【0004】
したがって、ＨＣＣ患者の最適な選択が不可欠である。現在の臨床形態モデル、すなわちミラノ基準（ＭＣ）の逼迫により、優れた候補者、例えば、進行性であるが、今のところ「良性」の疾患経過の後期に発見される腫瘍を有する患者を除外する可能性がある。逆に、ＭＣは、腫瘍挙動の侵襲性が高い形態であることを特徴とする初期のＨＣＣ患者を除外しない場合がある。肝硬変の状況でのＨＣＣ患者における肝移植の最良の候補者の特定は、肝移植（ＬＴ）の候補者の数を潜在的に増加させ、したがってドナープールの需要に影響を与える。
【0005】
分子バイオマーカーは、腫瘍の生物学的挙動に関する関連情報を提供することができる。しかし、現時点では、患者のＨＣＣ分子バイオマーカーを扱った研究はほとんどないため、移植するための患者の適切な選択を可能にする利用可能な合意に基づく予後バイオマーカーはない。腫瘍の形態に基づく基準は良好／不良な予後の患者を部分的にしか識別できないため、本発明者らは、予後に影響を与える遺伝子又は遺伝子シグネチャーに焦点を当てることが重要であると提案する。これらのうち、予後が良好なＨＣＣ患者で発現する遺伝子（すなわち、アップレギュレーションが良好なアウトカムをもたらす遺伝子）は、ＬＴの恩恵を受ける可能性が高い患者の亜群を選択するために現在受け入れられている基準を補足することができる。もちろん、負の予測遺伝子にはまた、病気が再発する可能性のある患者を特定できるため、重要な役割がある。
【0006】
デルマトポンチン（Ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ（ＤＰＴ））
ＤＰＴは、ＴＲＡＭＰ（チロシンリッチ酸性マトリックスタンパク質）（遺伝子ＩＤ ＧＣ０１Ｍ１６８６６４）とも呼ばれ、細胞－マトリックス相互作用及びマトリックス集合において機能することができる細胞外マトリックスタンパク質である。このタンパク質は様々な組織に存在し、間葉細胞（線維芽細胞、及び筋線維芽細胞）及びマクロファージで発現すると考えられている。この分子は、細胞外マトリックス集合、細胞接着、及び創傷治癒に重要である。この分子はまた、コラーゲン原線維形成を加速し、インビボでの細胞外マトリックスの微小環境におけるデコリンとの相互作用を通じてＴＧＦ－ｂｅｔａの挙動を改変する。ＤＰＴは、デコリンＴＧＦ－ｂｅｔａ１複合体の形成を阻害し、ＴＧＦ－ｂｅｔａに対する細胞応答を増加させることができ、かつその生物学的活性を高めることができる。さらに、ＤＰＴは、ビタミンＤ受容体の下流標的として同定されている。ビタミンＤ受容体は、次いで１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の下流のシグナル伝達を媒介して、ＨＣＣに対して抗増殖効果を発揮する。ＤＰＴは、細胞接着性及び腫瘍浸潤性と相関している。ＤＰＴの強力な発現は、口腔がん及び骨の巨大細胞腫瘍の転移抑制と関連している。ＤＰＴのダウンレギュレーションは、ＴＧＦ－ｂｅｔａ１及びその他の潜在的なメカニズムとの可能な相互作用を介して、ＨＣＣの発がん及び進行に関連している。ＤＰＴの発現レベルは、健康な肝臓よりもＨＣＣ組織内で有意に低くなっている。
ＤＰＴは、ＴＲＡＭＰ（チロシンリッチ酸性マトリックスタンパク質）（遺伝子ＩＤ ＧＣ０１Ｍ１６８６６４）とも呼ばれ、細胞－マトリックス相互作用及びマトリックス集合において機能することができる細胞外マトリックスタンパク質である。このタンパク質は様々な組織に存在し、間葉細胞（線維芽細胞、及び筋線維芽細胞）及びマクロファージで発現すると考えられている。この分子は、細胞外マトリックス集合、細胞接着、及び創傷治癒に重要である。この分子はまた、コラーゲン原線維形成を加速し、インビボでの細胞外マトリックスの微小環境におけるデコリンとの相互作用を通じてＴＧＦ－ｂｅｔａの挙動を改変する。ＤＰＴは、デコリンＴＧＦ－ｂｅｔａ１複合体の形成を阻害し、ＴＧＦ－ｂｅｔａに対する細胞応答を増加させることができ、かつその生物学的活性を高めることができる。さらに、ＤＰＴは、ビタミンＤ受容体の下流標的として同定されている。ビタミンＤ受容体は、次いで１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の下流のシグナル伝達を媒介して、ＨＣＣに対して抗増殖効果を発揮する。ＤＰＴは、細胞接着性及び腫瘍浸潤性と相関している。ＤＰＴの強力な発現は、口腔がん及び骨の巨大細胞腫瘍の転移抑制と関連している。ＤＰＴのダウンレギュレーションは、ＴＧＦ－ｂｅｔａ１及びその他の潜在的なメカニズムとの可能な相互作用を介して、ＨＣＣの発がん及び進行に関連している。ＤＰＴの発現レベルは、健康な肝臓よりもＨＣＣ組織内で有意に低くなっている。
【0007】
カルパイン小サブユニット１（Ｃａｌｐａｉｎ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ １（ＣＡＰＮＳ１））
プロテアーゼのファミリーであるカルパインは、細胞接着分子及び細胞骨格成分の構造を変化させるか、又は細胞内シグナル伝達経路に干渉することによって、細胞の移動及び浸潤に関与している。その制御サブユニットであるＣＡＰＮＳ１及びＣＡＰＮ４は、カルパイン活性に重要な役割を果たし得る。悪性内皮細胞におけるＣＡＰＮＳ１のノックダウンは、拡散する能力を低下させることができるが、ＣＡＰＮＳ１のアップレギュレーションは、動物のＨＣＣ切除後の腫瘍サイズ、数、及びα－フェトプロテイン（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ））レベルの増加と相関している。
プロテアーゼのファミリーであるカルパインは、細胞接着分子及び細胞骨格成分の構造を変化させるか、又は細胞内シグナル伝達経路に干渉することによって、細胞の移動及び浸潤に関与している。その制御サブユニットであるＣＡＰＮＳ１及びＣＡＰＮ４は、カルパイン活性に重要な役割を果たし得る。悪性内皮細胞におけるＣＡＰＮＳ１のノックダウンは、拡散する能力を低下させることができるが、ＣＡＰＮＳ１のアップレギュレーションは、動物のＨＣＣ切除後の腫瘍サイズ、数、及びα－フェトプロテイン（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ））レベルの増加と相関している。
【0008】
クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ（ＣＬＵ））
ＣＬＵ遺伝子シャペロンによりコードされるタンパク質であり（ＣＬＵ，遺伝子ＩＤ ＧＣ０８Ｍ０２７５９６）、細胞質型と分泌型の両方がある。ＥＩＦ３Ｉとの複合体を形成したＣＬＵは、Ａｋｔ経路を活性化し、次いでＨＣＣ細胞の転移を促進する。
ＣＬＵ遺伝子シャペロンによりコードされるタンパク質であり（ＣＬＵ，遺伝子ＩＤ ＧＣ０８Ｍ０２７５９６）、細胞質型と分泌型の両方がある。ＥＩＦ３Ｉとの複合体を形成したＣＬＵは、Ａｋｔ経路を活性化し、次いでＨＣＣ細胞の転移を促進する。
【0009】
Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７（Ｆ－ｂｏｘ ａｎｄ ＷＤ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ７（ＦＢＸＷ７）、遺伝子ＩＤ ＧＣ０４Ｍ１５２３２１）
Ｓｅｌ１０、ｈＣＤＣ４、又はｈＡｇｏとも呼ばれる遺伝子である「Ｆボックス及びＷＤリピートドメイン含有タンパク質７（ＦＢＸＷ７）」は、ＳＣＦ Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質認識成分として機能するＦボックスタンパク質のファミリーのメンバーをコードする。ＦＢＸＷ７タンパク質は、重要な腫瘍抑制因子であり、ヒトのがんで最もよく一般に脱調節されたユビキチン－プロテアソーム系タンパク質のうちの１つである。ＦＢＸＷ７は、サイクリンＥ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｍｃｌ－１、ｍＴＯＲ、Ｊｕｎ、Ｎｏｔｃｈ、及びＡＵＲＫＡなどの腫瘍性タンパク質のプロテアソーム媒介性分解を制御する。この遺伝子の変異は、卵巣がん及び乳がんの細胞株で検出され、これはヒトのがんの病因におけるこの遺伝子の潜在的な役割を示唆している。インビトロの研究では、ＦＢＸＷ７を肝細胞癌の予後マーカーとして使用できることが示され、ＦＢＸＷ７の発現レベルが低いとＨＣＣ患者の生存の低下に関連していることが示された。このようにＦＢＸＷ７は、ＨＣＣの進行に重要な役割を果たす。つまりＦＢＸＷ７は、Ｎｏｔｃｈ１シグナル経路を介してＨＣＣ細胞の移動及び浸潤を阻止する。
Ｓｅｌ１０、ｈＣＤＣ４、又はｈＡｇｏとも呼ばれる遺伝子である「Ｆボックス及びＷＤリピートドメイン含有タンパク質７（ＦＢＸＷ７）」は、ＳＣＦ Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質認識成分として機能するＦボックスタンパク質のファミリーのメンバーをコードする。ＦＢＸＷ７タンパク質は、重要な腫瘍抑制因子であり、ヒトのがんで最もよく一般に脱調節されたユビキチン－プロテアソーム系タンパク質のうちの１つである。ＦＢＸＷ７は、サイクリンＥ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｍｃｌ－１、ｍＴＯＲ、Ｊｕｎ、Ｎｏｔｃｈ、及びＡＵＲＫＡなどの腫瘍性タンパク質のプロテアソーム媒介性分解を制御する。この遺伝子の変異は、卵巣がん及び乳がんの細胞株で検出され、これはヒトのがんの病因におけるこの遺伝子の潜在的な役割を示唆している。インビトロの研究では、ＦＢＸＷ７を肝細胞癌の予後マーカーとして使用できることが示され、ＦＢＸＷ７の発現レベルが低いとＨＣＣ患者の生存の低下に関連していることが示された。このようにＦＢＸＷ７は、ＨＣＣの進行に重要な役割を果たす。つまりＦＢＸＷ７は、Ｎｏｔｃｈ１シグナル経路を介してＨＣＣ細胞の移動及び浸潤を阻止する。
【0010】
Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２（ＳＰＲＹ２、遺伝子ＩＤ ＧＣ１３Ｍ０８０３３５）
４つのホモログのＳＰＲＹ１～４を含むショウジョウバエＳｐｒｙ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｐｒｙ（ｄＳＰＲＹ））遺伝子ファミリーは、ＨＣＣ発がんに関連するＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の負のフィードバックループに関与していると考えられている。特に、ＳＰＲＹ２は、受容体型チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ））シグナル伝達を調節し、かつＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を抑制することにより、成長因子媒介性の細胞増殖、移動、及び分化に拮抗する。このタンパク質は、血管新生、細胞増殖、浸潤、移動、及び細胞質分裂など、がんの発生に関与する不可欠な経路の重要な調節因子である。
４つのホモログのＳＰＲＹ１～４を含むショウジョウバエＳｐｒｙ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｐｒｙ（ｄＳＰＲＹ））遺伝子ファミリーは、ＨＣＣ発がんに関連するＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の負のフィードバックループに関与していると考えられている。特に、ＳＰＲＹ２は、受容体型チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＲＴＫ））シグナル伝達を調節し、かつＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を抑制することにより、成長因子媒介性の細胞増殖、移動、及び分化に拮抗する。このタンパク質は、血管新生、細胞増殖、浸潤、移動、及び細胞質分裂など、がんの発生に関与する不可欠な経路の重要な調節因子である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
上記の最先端技術に基づいて、本発明の目的は、全てのＨＣＣ患者の中からＬＴの最良の候補を正確に選択するのに役立つ分子マーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
分子マーカーは、腫瘍の挙動及び侵襲性を予測できる必要がある。この目的は、本明細書の特許請求の範囲によって達成され、さらなる有利な実施形態が全体として本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、検証セットにおける再発に応じた選択された遺伝子の発現差異のＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す図である。再発あり（Ｒ：左）と再発なし（ｎｏＲ：右）。ウィルコクソン（マン－ホイットニー）検定（信頼水準＝０．９５）。
【図2】図２は、ＤＰＴ発現及び腫瘍再発に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す図である。曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ））は０．７７である。ΔＣｔカットオフ値が７に選択され、８４％の感度及び６３％の特異度に対応する。
【図5A】図５は、総腫瘍体積（ｔｏｔａｌ ｔｕｍｏｕｒ ｖｏｌｕｍｅ（ＴＴＶ））が１１５ｃｍ３を超える（Ａ）、低分化（Ｂ）、又は微小血管浸潤（Ｃ）の患者におけるＤＰＴ発現による無病生存を示す図である。
【図5B】図５は、総腫瘍体積（ｔｏｔａｌ ｔｕｍｏｕｒ ｖｏｌｕｍｅ（ＴＴＶ））が１１５ｃｍ３を超える（Ａ）、低分化（Ｂ）、又は微小血管浸潤（Ｃ）の患者におけるＤＰＴ発現による無病生存を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明者らは、ＬＴの肝硬変ＨＣＣ患者を選択するための臨床基準を改良し、集団における選択されたバイオマーカーの役割を評価した。本発明者らは、ミラノ基準の現在の絶対的な臨床基準を超える患者の亜群におけるＬＴの最良の候補を特に決定するために現在の臨床マーカーの役割を検証して、腫瘍の生物学に正確に対処するために臨床的及び分子的な特徴の両方を統合した。
【0015】
公開リポジトリの臨床データ、ＨＣＣの分子予後バイオマーカーの主題に関する系統的レビュー、及び発明者が利用できる社内の臨床データを使用して、可能性のある候補遺伝子のセットを識別した。本発明者らは、予後値を用いて単一遺伝子の変化を識別し、それらを組み合わせて予測多変量シグネチャーにした。系統的レビューにより、ＬＴ後の予後情報を提供すると想定されたＨＣＣの進行に関連する遺伝子を識別することができ、結果としてＬＴの患者選択に貢献した。
【0016】
本発明者らは、本明細書において、ＤＰＴ、ＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７、及びＳＰＲＹ２が、ＬＴ後にＨＣＣの再発有りの患者と無しの患者とにおいて発現差異を示すことを実証している。さらに、ＤＰＴ及びＣＬＵは、ＬＴ後のＨＣＣの再発がない、したがってポジティブな予後の患者の亜群を、単独で又は組み合わせて効果的に識別する。
【0017】
「遺伝子発現」又は「発現」という用語、或いは「遺伝子産物」という用語は、核酸（ＲＮＡ）の生成又はペプチド若しくはポリペプチドの生成のプロセス、及びその産物のいずれか、又は両方を指すことができ、それらはまた、ポリペプチド産物を生成するためのそれぞれの転写及び翻訳、又は遺伝子情報のプロセシングを調節する任意の中間プロセスを指す。「遺伝子発現」という用語はまた、ＲＮＡ遺伝子産物、例えば、調節性ＲＮＡ又は構造（例えば、リボソーム）ＲＮＡの転写及びプロセシングに適用することができる。発現したポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。発現は、転写及び翻訳のレベル、すなわちｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物の両方でアッセイすることができる。
【0018】
本発明の文脈における「良好な予後」という用語は、ＬＴ後５年間にＨＨＣ疾患の再発がないことを指す。良好な予後は、実施例において患者の生存との直接的な関連によって測定され、したがって、全生存（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ（ＯＳ））又は無病生存（ｄｉｓｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ（ＤＦＳ））はほぼ同意義である。
【0019】
本発明の文脈における「サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ），ＳＶＭ」、「線形カーネルＳＶＭ」、又は「ＳＶＭアルゴリズム」という用語は、データの分類、及び／又は回帰分析の実行を可能にする教師ありの機械学習モデルを指す。これは、サポートベクターネットワークと呼ばれることもあり、本発明の文脈では、バイナリ線形分類アルゴリズムの一形態として使用される。本発明の文脈において、アルゴリズムは訓練工程を使用し、サンプルをあるカテゴリ又は別のカテゴリ、例えば、５年での生存又は生存なしに割り当てるモデルを構築するように、患者データのサンプルが遺伝子発現レベル又は腫瘍体積測定値を含むがこれらに限定されない変数のセットに関連づけられる。
【0020】
一態様では、本発明は、ＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法に関する。この態様の代替では、本発明は、肝移植によるＨＣＣの治療の方法に関する。別の代替の態様では、本発明は、ＨＣＣ患者を、肝移植を受けることから利益を得る可能性がより高いか、又はより低いかの異なる群に、言い換えれば、誰が疾患の再発なしにＬＴ後のより長い全生存を示すかの異なる群に層別化するための方法に関する。
【0021】
本発明のこの態様による方法は、決定工程を含み、肝臓サンプルにおける遺伝子バイオマーカー、又は指標遺伝子の発現レベル（特にｍＲＮＡレベル）（本明細書では指標遺伝子発現レベルともいう）は、ＨＣＣに罹患する患者から得られ、前記指標遺伝子は：
ａ． デルマトポンチン
ｂ． クラステリン
ｃ． カルパイン小サブユニット１
ｄ． Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７
ｅ． Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２
を含む一覧から選択される。
ａ． デルマトポンチン
ｂ． クラステリン
ｃ． カルパイン小サブユニット１
ｄ． Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７
ｅ． Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２
を含む一覧から選択される。
【0022】
特定の実施形態では、指標遺伝子はＣＬＵ又はＤＰＴである。
【0023】
本発明のこの第１の態様の代替では、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のための肝移植のアウトカムを予測するための方法であって、前記方法は：
－ 決定工程において、ＨＣＣに罹患する患者から得られた肝臓サンプル中のＣＬＵ及びＤＰＴを含む指標遺伝子の群のそれぞれの発現レベルを決定する工程、
－ 分類工程において、患者を、前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、肝移植のアウトカムとして良好な予後に割り当てる工程、
を含む。
－ 決定工程において、ＨＣＣに罹患する患者から得られた肝臓サンプル中のＣＬＵ及びＤＰＴを含む指標遺伝子の群のそれぞれの発現レベルを決定する工程、
－ 分類工程において、患者を、前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、肝移植のアウトカムとして良好な予後に割り当てる工程、
を含む。
【0024】
特定の実施形態では、指標遺伝子の群は：
－ カルパイン小サブユニット１
－ Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７
－ Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２
のうちの少なくとも１つをさらに含む。
－ カルパイン小サブユニット１
－ Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７
－ Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２
のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0025】
特定の実施形態では、前記指標遺伝子のいずれの過剰発現は、良好な予後を示す。
【0026】
特定の実施形態では、ＤＰＴ及び／又はＣＬＵの発現の過剰発現は、良好な予後を示す。
【0027】
特定の実施形態では、指標遺伝子は、閾値に対して過剰発現される。代替的な実施形態では、指標遺伝子の発現レベルは、各疾患のアウトカムのサブセットのために代表的な患者から選択されたコントロールサンプルと比較される。
【0028】
特定の実施形態では、指標遺伝子の発現レベルは、サンプル中に存在する指標遺伝子をコードするｍＲＮＡのレベルに感度を有する定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって決定される。本発明によって特定される目的の指標遺伝子領域を増幅する特定のプライマーは、表６に提供され、これらは本発明によって提供される方法に従って指標遺伝子の発現レベルを決定するために特に使用することができる。グローバルＲＮＡシーケンシングは、本発明に従って使用する遺伝子発現レベルを生成することができる代替の方法である。
【0029】
指標遺伝子の発現レベルは、内部コントロール遺伝子、特にハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較することができる。特定の実施形態では、指標遺伝子の発現レベルは、リボソームタンパク質Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）（遺伝子ＩＤ ２３５２１）の発現レベルと比較される。他の可能性には、ＧＡＤＰＨ及び／又はＴＢＰなどの他のハウスキーピング遺伝子、又は遺伝子の組み合わせが含まれる。
【0030】
特定の実施形態において、指標遺伝子の発現レベルは、ＰＣＲによって決定される。閾値に対する指標遺伝子の発現値は、前記指標遺伝子の閾値サイクル数と内部コントロール遺伝子の閾値サイクル数との差として決定される。閾値サイクル数は、産物（前記指標遺伝子及び前記内部コントロール遺伝子）が検出されるＰＣＲのサイクル数である。
【0031】
特定の実施形態では、以下の計算を使用して、指標遺伝子の発現レベルを反映する値を生成する：
標的の量＝ΔＣｔ
ΔＣｔ（Ｒ）＝Ｃｔ（Ｒ中のＤＰＴ）－Ｃｔ（Ｒ中の参照遺伝子）
ΔＣｔ（ｎｏｎＲ）＝Ｃｔ（ｎｏｎＲのＤＰＴ）－Ｃｔ（ｎｏｎＲの参照遺伝子）
式中、Ｒは疾患の再発を伴うサンプルであり、ｎｏｎＲは疾患の再発を伴わないサンプルである。
標的の量＝ΔＣｔ
ΔＣｔ（Ｒ）＝Ｃｔ（Ｒ中のＤＰＴ）－Ｃｔ（Ｒ中の参照遺伝子）
ΔＣｔ（ｎｏｎＲ）＝Ｃｔ（ｎｏｎＲのＤＰＴ）－Ｃｔ（ｎｏｎＲの参照遺伝子）
式中、Ｒは疾患の再発を伴うサンプルであり、ｎｏｎＲは疾患の再発を伴わないサンプルである。
【0032】
特定の実施形態では、指標遺伝子はＤＰＴであり、その閾値は、７より高い遺伝子発現の差、又はΔＣｔである。
【0033】
特定の実施形態では、指標遺伝子はＣＬＵであり、その閾値は、－０．５４より高い遺伝子発現の差、又はΔＣｔである。
【0034】
特定の実施形態において、指標遺伝子の閾値サイクル数の差は、それを超える場合に遺伝子が過剰発現しているといわれ：
ＤＰＴの発現レベルのΔＣｔ値は、ＤＰＴが７より高く、ＣＬＵの発現レベルのΔＣｔ値は、－０．５４より高いことである。
ＤＰＴの発現レベルのΔＣｔ値は、ＤＰＴが７より高く、ＣＬＵの発現レベルのΔＣｔ値は、－０．５４より高いことである。
【0035】
本明細書で提供される閾値は、本発明による遺伝子発現レベルの分類に有用とされるΔＣｔ値の例である。これらの閾値は、ハウスキーピング遺伝子を参照して遺伝子の発現を反映している。正の値を持つ遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング参照遺伝子よりも多く発現され、負の発現値は、その遺伝子がハウスキーピング参照遺伝子よりも少なく発現されることを示す。指標遺伝子の過剰発現は、不良な予後の患者を良好な予後の患者から分離するためのΔＣｔ閾値を超える発現として定義される。
【0036】
特定の実施形態では、１１５ｃｍ３以下の総腫瘍体積の決定を伴うＤＰＴの過剰発現は、良好な予後を示している。
【0037】
特定の実施形態では、１１５ｃｍ３以下の総腫瘍体積の決定を伴うＣＬＵの過剰発現は、良好な予後を示している。
【0038】
特定の実施形態では、例えば、ＣＬＵ、ＤＰＴの発現レベル及び腫瘍体積の複数の患者因子又は変数を使用して、患者のアウトカムを予測する。本発明のこの態様の特定の実施形態では、特定の閾値を超える予測指標遺伝子であるＣＬＵ及びＤＰＴの発現レベルは良好な予後を示す。関連の実施形態では、指標遺伝子発現及びＨＣＣ腫瘍体積≦１１５ｃｍ３の追加の非遺伝的変数は、良好な予後を示している。
【0039】
特定の実施形態において、患者サンプル中の１つ又は複数の指標遺伝子の発現レベル、及び／又は腫瘍体積の測定値は、疾患の再発の可能性を反映する値を提供するためにアルゴリズムに組み込まれ、特に前記アルゴリズムは、サポートベクターマシンアルゴリズムであり、より特に前記アルゴリズムは、線形カーネルサポートベクターマシンアルゴリズムである。
【0040】
特定の実施形態では、指標遺伝子の発現レベル、及び腫瘍サイズの変数は、予測アルゴリズムで使用され、特に機械学習アルゴリズム、より特に、線形カーネルサポートベクターマシン（ＳＶＭ）学習アルゴリズムで使用され、これらは患者を、良好な予後、特にＬＴ後の次の５年間の良好な予後である可能性が高いか、又は低いかのサブセットに分類する。
【0041】
実施例に示されているデータは、ＣＬＵの過剰発現をこのコホートにおけるＣｔ範囲が２７．３６～４０．５に分類し、ＤＰＴの場合は３３．４９～３５．６９に分類した。コントロールと比較したＣｔの変化量として表示され（デルタ又はΔＣｔとも呼ばれる）、－０．５４がＣＬＵの過剰発現の有用な閾値であると決定した。同様に、ΔＣｔ閾値が７であることは、患者サンプルにおけるＤＰＴ発現の有用な閾値として同定された。また、腫瘍体積が１１５ｃｍ３より小さいことはまた、良好な予後を示すことがわかった。腫瘍体積の値は、患者の肝臓内に含まれる全ての腫瘍の合計を指し、腫瘍体積を定義するために使用できる有用な方法は、コンピュータ断層撮影及び磁気共鳴画像から選択することができる。
【0042】
患者のアウトカムの分類を支援するために、本発明のこの態様で特定されるような閾値は、患者の値を２値化するために特に使用することができる。実施例５で示されるデータは、ＣＬＵ、ＤＰＴ、及び腫瘍体積の有用な閾値を実証する。発現レベル又は体積がこれを下回るサンプルは０に割り当てられ、測定値が閾値を超えるサンプルはスコアが１に割り当てられる。得られたスコアがＬＴ後の患者のアウトカムを示す分類システムを作成するために、この実施例では、患者のコホートからの２値形式の多変量データをＳＶＭアルゴリズムに組み込むことが実行される。
【0043】
特定の実施形態では、決定工程には、ＤＰＴの発現と、ＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７及びＳＰＲＹ２から選択される遺伝子の発現、特にＤＰＴ及びＣＬＵの発現を決定することを含む。
【0044】
特定の実施形態では、ＣＬＵ又はＤＰＴ単独の過剰発現は、良好な予後を示す。特定の実施形態では、本発明によって提供されるような指標遺伝子の発現レベル、総腫瘍体積（ｔｏｔａｌ ｔｕｍｏｕｒ ｖｏｌｕｍｅ（ＴＴＶ））、又はその２つの組み合わせに基づく予測分類は、ミラノ基準での評価など追加の予後予測因子と組み合わされる。実施例のデータは、ＣＬＵの発現レベルが、ミラノ基準外に分類されるＨＣＣ患者のサブセットにおいて、疾患のアウトカムを正確に予測できることを実証する。
【0045】
１９９６年にＭａｚｚａｆｅｒｒｏによって導入されたミラノ基準（Ｍａｚｚａｆｅｒｒｏら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９６ Ｍａｒ １４；３３４（１１）：６９３－９）では、ＨＣＣの成人に対する移植を次のとおり制限する：（１）単一腫瘍の径が５ｃｍ未満であること、（２）腫瘍病巣が３個以下で、それぞれが３ｃｍを超えないこと、（３）血管浸潤がないこと、（４）肝外関与がないことである。
【0046】
さらに、本発明は、肝移植バイオマーカーの高発現を検出するシステムに関する。このシステムは、ＤＰＴの発現、及びＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７及びＳＰＲＹ２から選択される遺伝子の発現、特にＤＰＴ及びＣＬＵの発現を決定する手段を含む。
【0047】
別の態様では、本発明は、ＨＣＣの治療のための肝移植のアウトカムを予測するために、バイオマーカーを分析するためのキットにおける、ＤＰＴ及びＣＬＵの発現、並びに任意にＣＬＵ、ＣＡＰＮＳ１、ＦＢＸＷ７及びＳＰＲＹ２から選択される追加のバイオマーカーの発現の増幅及び検出のためのプライマーの使用を包含する。
【0048】
さらに、本発明は、上記の態様及び実施形態のいずれか１つに規定されるとおりの方法に従って、患者が良好な予後である可能性が高いと分類されている過去にＨＣＣと診断された患者を肝移植の処置を用いて治療する方法を含む。
【実施例】
【0049】
実施例１：分子予後バイオマーカーの研究
本発明者らは、形態的特徴に基づく現在のいくつかの選択基準の性能を分析し、これらが良好な候補を除外し、かつ不良な候補を誤って含める可能性があることを示した。本発明者らは、移植後のＨＣＣ予後の推定バイオマーカーとして以前に同定された遺伝子を試験した。遺伝子ＤＰＴ及びＣＬＵは、単独で、又は組み合わせて、ＨＣＣのＬＴ後の再発の可能性が非常に低い患者の亜群を効果的に識別することが可能であった。
本発明者らは、形態的特徴に基づく現在のいくつかの選択基準の性能を分析し、これらが良好な候補を除外し、かつ不良な候補を誤って含める可能性があることを示した。本発明者らは、移植後のＨＣＣ予後の推定バイオマーカーとして以前に同定された遺伝子を試験した。遺伝子ＤＰＴ及びＣＬＵは、単独で、又は組み合わせて、ＨＣＣのＬＴ後の再発の可能性が非常に低い患者の亜群を効果的に識別することが可能であった。
【0050】
実施例２：肝細胞癌の分子予後マーカー
肝切除（ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＲ））におけるバイオマーカーを用いた研究を、重要な情報がＬＲを受けた患者のコホートにおいて得られるため解析に含めた。単一遺伝子とは異なり、シグネチャー間の重複は文献上珍しく、遺伝子シグネチャーは再現性がない場合が多い。そのため、本発明者らは特に、遺伝子シグネチャーではなく、単一遺伝子のバイオマーカーに着目した。さらに、バイオマーカーの多くは元の研究の設定外ではさらなる試験及び検証がなされていないため、現在の研究においてそれらを使用することは、少なくとも外部検証の努力を表している。
肝切除（ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＲ））におけるバイオマーカーを用いた研究を、重要な情報がＬＲを受けた患者のコホートにおいて得られるため解析に含めた。単一遺伝子とは異なり、シグネチャー間の重複は文献上珍しく、遺伝子シグネチャーは再現性がない場合が多い。そのため、本発明者らは特に、遺伝子シグネチャーではなく、単一遺伝子のバイオマーカーに着目した。さらに、バイオマーカーの多くは元の研究の設定外ではさらなる試験及び検証がなされていないため、現在の研究においてそれらを使用することは、少なくとも外部検証の努力を表している。
【0051】
本発明者らは、以下のデータを検索した：データの種類（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質）、予後情報、関与する特定の遺伝子、良好又は不良の予後遺伝子、変化の種類（過剰発現、ダウンレギュレーション、高／低メチル化、変異）、患者サンプル及び統計データ及び著者の観察。
【0052】
実施例３：試験的セット（ｐｉｌｏｔ ｓｅｔ）
この第１の群を、文献調査を通して特定されたより良好な予後に関連するバイオマーカーをより適切にトリミングし、また早期再発に関連する推定バイオマーカーの数をさらに減らすために実行した。最初に提案された２０人の患者（実施例６、サンプル収集を参照）から、より高齢の症例に属する第１のサンプルからのＲＮＡ抽出が困難なため、９人の追加の患者を試験セットに含めた。３人の患者からのサンプルは、サンプルが不適当であるため使用されなかった。したがって、試験的セットは２６人の患者からなった（再発のないＭＣを超えた６人の患者；再発のあるＭＣを超えた７人の患者；再発のないＭＣ内の７人の患者；再発のあるＭＣ内の６人の患者）。ＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを得てＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。最後に、評価した遺伝子の発現差異は、臨床データと相関した。表１は、ＭＣ内又はＭＣを超える再発に応じた試験セットの結果を示す。
この第１の群を、文献調査を通して特定されたより良好な予後に関連するバイオマーカーをより適切にトリミングし、また早期再発に関連する推定バイオマーカーの数をさらに減らすために実行した。最初に提案された２０人の患者（実施例６、サンプル収集を参照）から、より高齢の症例に属する第１のサンプルからのＲＮＡ抽出が困難なため、９人の追加の患者を試験セットに含めた。３人の患者からのサンプルは、サンプルが不適当であるため使用されなかった。したがって、試験的セットは２６人の患者からなった（再発のないＭＣを超えた６人の患者；再発のあるＭＣを超えた７人の患者；再発のないＭＣ内の７人の患者；再発のあるＭＣ内の６人の患者）。ＲＮＡ抽出後、ｃＤＮＡを得てＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。最後に、評価した遺伝子の発現差異は、臨床データと相関した。表１は、ＭＣ内又はＭＣを超える再発に応じた試験セットの結果を示す。
【0053】
【表1】
【0054】
ＭＣ内の患者では、クラステリン（ＣＬＵ、ｐ＝０．０９）、ＣＡＰＮＳ１（ｐ＝０．０５）、及びＦＢＸＷ７（ｐ＝０．０４）が再発に応じて有意な発現差異を有した。ＭＣ外の患者では、クラステリン（ｐ＝０．０２）、デルマトポンチン（ｐ＝０．０６）、及びＳＬＣ１６Ａ４（ｐ＝０．０８）もまた再発に応じて有意な発現差異を有した。クラステリンは全再発を識別する最も優れたマーカーであった（ｐ＝０．０１）。次に、試験的研究の選択基準に合格した選択されたバイオマーカーＣＡＰＮＳ１、ＤＰＴ、ＣＬＵ、及びＦＢＸＷ７のサブセットを検証セットに適用した。さらに、発明者はＳＰＲＹ２を、他の２つの群では有意ではなかったにもかかわらず、試験的セットの「ミラノ基準内」の群ではｐ値は有意差がボーダーラインレベル（ｐ＝０．１３）であったため、この検証セットのさらなる下流分析のために含めた。群「全基準」で有意差がボーダーラインレベルのｐ値（ｐ＝０．１４）を示す他の遺伝子であるＭＵＣ１５は、検証セットで試験される遺伝子の群に含めなかった。この除外は、非常に低い発現レベルに関連する可能性が高いＲＴ－ｑＰＣＲにおけるその機能の低下（Ｃｔが高すぎ、サンプル破損が頻繁）のためである。
【0055】
実施例４：検証セット（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｅｔ）
１９９２年９月から２０１４年２月の間にＨＣＣのためにＬＴの対象にされた３０１人の患者の完全な集団が考慮された。包含及び除外基準（実施例６、研究の集団を参照）によれば、組織学的にＨＣＣが確認された合計２７５人の患者をこの分析で特定した。除外された４４人の患者のうち、３２人は周術期死亡があり、１２人は残存及び／又は肝外疾患を有した。以前に試験的セットに含まれていた患者（２６）も、並びにＬＴ後５年未満の患者（３８）も除外した。最初の研究の集団は１６７人の患者からなった。３３人の患者（１９．７％）では、広範な腫瘍壊死（１４／１６７；８．３％）、品質の低いＲＮＡ抽出（１２／１６７；７．２％）、又はホルマリン固定パラフィン包埋組織が利用できないため（７／１６７；４．２％）、サンプル分析は不可能であった。その結果、ＬＴ後５年未満の２０人の追加患者が追加され、検証セットは合計１５４人の患者となった。患者のサンプルが分子マーカーについて分析された患者の総数は１８０人であった。試験的セット（ｎ＝２６）、検証セット（ｎ＝１５４）、及び全体の集団（ｎ＝１８０）の一般的な特性を表２に示す。
１９９２年９月から２０１４年２月の間にＨＣＣのためにＬＴの対象にされた３０１人の患者の完全な集団が考慮された。包含及び除外基準（実施例６、研究の集団を参照）によれば、組織学的にＨＣＣが確認された合計２７５人の患者をこの分析で特定した。除外された４４人の患者のうち、３２人は周術期死亡があり、１２人は残存及び／又は肝外疾患を有した。以前に試験的セットに含まれていた患者（２６）も、並びにＬＴ後５年未満の患者（３８）も除外した。最初の研究の集団は１６７人の患者からなった。３３人の患者（１９．７％）では、広範な腫瘍壊死（１４／１６７；８．３％）、品質の低いＲＮＡ抽出（１２／１６７；７．２％）、又はホルマリン固定パラフィン包埋組織が利用できないため（７／１６７；４．２％）、サンプル分析は不可能であった。その結果、ＬＴ後５年未満の２０人の追加患者が追加され、検証セットは合計１５４人の患者となった。患者のサンプルが分子マーカーについて分析された患者の総数は１８０人であった。試験的セット（ｎ＝２６）、検証セット（ｎ＝１５４）、及び全体の集団（ｎ＝１８０）の一般的な特性を表２に示す。
【0056】
期待のとおり、ＭＣ内及びＭＣ外の患者がこの第１のセットに均等に分布していたため、試験的セットは検証セットと比較してより侵襲的な腫瘍特性を示した。試験的セットの患者は、より頻繁に血管浸潤、腫瘍サイズの増加、ＴＴＶの増加、及びＭＣ内の患者の割合の低下を有する。全集団では、ドナー年齢の中央値は３８歳であり、ＦＡＰドナーの割合が高いことと一致している（家族性アミロイド多発神経障害（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙに罹患する患者）は生体移植で治療されるが、患者の肝臓は他の患者の治療に利用できるようになる）。ＶＨＣが優勢であり、４６％の患者が感染していた。重要な観察結果は、ＬＴまでの待機時間が短いことであり、中央値は１か月で、平均待機時間は２．２か月（０～１８）に対応する。腫瘍の中央値は１であり、平均２．１７（１～１１）に対応し、最大の腫瘍サイズの中央値は２．７５ｃｍ（平均３．２５ｃｍ，０．３～２０ｃｍまで変動）であった。１２０人（６６．７％）の患者のみがＭＣ内にあり、１５４人（８５．６％）がＴＴＶ＜１１５ｃｍ３内であった。
【0057】
【表2】
【0058】
ＣＡＰＮＳ１、ＤＰＴ、ＣＬＵ、ＦＢＸＷ７、ＳＬＣ１６Ａ４、及びＳＰＲＹ２の発現レベルを検証セットで解析した。多くのサンプルでは、ＳＬＣ１６Ａ４の発現が低すぎて決定できず、この特定のバイオマーカーのさらなる解析は断念した。図１は、ウィルコクソン（マン－ホイットニー）検定を用いて、再発に従う選択された遺伝子の発現差異を示す。
【0059】
カルパイン小サブユニット１（Ｃａｌｐａｉｎ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ １（ＣＡＰＮＳ１））
ＣＡＰＮＳ１は、試験的セットでミラノ基準内の患者の再発に対してわずかな発現差異（ｐ＝０．０５）を示したため検証セットに含めた。その結果、検証セットでは、腫瘍組織におけるＣＡＰＮＳ１の発現レベルは再発によって有意に異なっていた（ＯＲ １．４４８，Ｃ．Ｉ．１．１４０～１．８４０，ｐ＝０．００２）．しかし、ＤＦＳ（ＨＲ １．０７３，Ｃ．Ｉ．０．９７８～１．１７８，ｐ＝０．１３６）、又はＯＳ（ＨＲ １．０１４，Ｃ．Ｉ．０．９１３～１．１２５，ｐ＝０．７９６）のいずれに関して、ハザード比（Ｈａｚａｒｄ Ｒａｔｉｏ）の対応する有意差に反映されなかった。再発のカットオフ値を決定するためにＲＯＣ曲線を使用した。ＡＵＣが０．６３であることから、最適なカットオフ値はデルタＣＴ値が０．２０であると考えられ、感度６５％、及び特異度４５％に相当した。しかしながら、この変数を分類したところ、ＤＦＳ（ｐ＝０．３７８）、又はＯＳ（ｐ＝０．６５５）への影響は認められなかった。このマーカーは、再発との関連性を示すが、その分布により再発患者と非再発患者との間でかなり重複していることがわかった。
ＣＡＰＮＳ１は、試験的セットでミラノ基準内の患者の再発に対してわずかな発現差異（ｐ＝０．０５）を示したため検証セットに含めた。その結果、検証セットでは、腫瘍組織におけるＣＡＰＮＳ１の発現レベルは再発によって有意に異なっていた（ＯＲ １．４４８，Ｃ．Ｉ．１．１４０～１．８４０，ｐ＝０．００２）．しかし、ＤＦＳ（ＨＲ １．０７３，Ｃ．Ｉ．０．９７８～１．１７８，ｐ＝０．１３６）、又はＯＳ（ＨＲ １．０１４，Ｃ．Ｉ．０．９１３～１．１２５，ｐ＝０．７９６）のいずれに関して、ハザード比（Ｈａｚａｒｄ Ｒａｔｉｏ）の対応する有意差に反映されなかった。再発のカットオフ値を決定するためにＲＯＣ曲線を使用した。ＡＵＣが０．６３であることから、最適なカットオフ値はデルタＣＴ値が０．２０であると考えられ、感度６５％、及び特異度４５％に相当した。しかしながら、この変数を分類したところ、ＤＦＳ（ｐ＝０．３７８）、又はＯＳ（ｐ＝０．６５５）への影響は認められなかった。このマーカーは、再発との関連性を示すが、その分布により再発患者と非再発患者との間でかなり重複していることがわかった。
【0060】
デルマトポンチン（Ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ（ＤＰＴ））
ＤＰＴは、ミラノ基準を超えた患者において、再発に対するその発現差異がほぼ有意であったため、検証セットに含めた（ｐ＝０．０６）。ＤＰＴは検証セットにおいて再発との強い関連を示した（ＯＲ １．２８３，Ｃ．Ｉ．１．１０３～１．４９４，ｐ＝０．００１）。ＤＦＳ（ＨＲ １．０４８，Ｃ．Ｉ．０．９７７～１．１２３，ｐ＝０．１９２）又はＯＳ（ＨＲ １．０３６，Ｃ．Ｉ．０．９６１～１．１１６，ｐ＝０．３５７）との関連は当初明らかでなかった。ＲＯＣ曲線解析により、ＡＵＣは０．７７であることがわかり（図２）、デルタＣＴのカットオフ値を７と決定することが可能であり、これは感度８４％、及び特異度６３％に相当した。この値を用いると、ＨＲ値０．４８０（Ｃ．Ｉ．０．２９５～０．７８２、ｐ＝０．００３）がＤＦＳについて観察された。ＯＲについてＨＲは０．５０３（Ｃ．Ｉ．０．３０５～０．８３１、ｐ＝０．００７）であった。強いＤＰＴ発現により再発リスクは約９倍に減少する（ＯＲ ０．１１６，Ｃ．Ｉ．Ｏ．０３７～Ｏ．３６３，ｐ＜０．００１）。
ＤＰＴは、ミラノ基準を超えた患者において、再発に対するその発現差異がほぼ有意であったため、検証セットに含めた（ｐ＝０．０６）。ＤＰＴは検証セットにおいて再発との強い関連を示した（ＯＲ １．２８３，Ｃ．Ｉ．１．１０３～１．４９４，ｐ＝０．００１）。ＤＦＳ（ＨＲ １．０４８，Ｃ．Ｉ．０．９７７～１．１２３，ｐ＝０．１９２）又はＯＳ（ＨＲ １．０３６，Ｃ．Ｉ．０．９６１～１．１１６，ｐ＝０．３５７）との関連は当初明らかでなかった。ＲＯＣ曲線解析により、ＡＵＣは０．７７であることがわかり（図２）、デルタＣＴのカットオフ値を７と決定することが可能であり、これは感度８４％、及び特異度６３％に相当した。この値を用いると、ＨＲ値０．４８０（Ｃ．Ｉ．０．２９５～０．７８２、ｐ＝０．００３）がＤＦＳについて観察された。ＯＲについてＨＲは０．５０３（Ｃ．Ｉ．０．３０５～０．８３１、ｐ＝０．００７）であった。強いＤＰＴ発現により再発リスクは約９倍に減少する（ＯＲ ０．１１６，Ｃ．Ｉ．Ｏ．０３７～Ｏ．３６３，ｐ＜０．００１）。
【0061】
以上のことから、ＤＰＴの過剰発現はＬＴ後に良好な予後であることを示す。ＤＰＴの強い発現を有する患者では、再発のリスクが５倍減少し、無病生存が５０％、かつ全生存が４０％増加した。ＤＰＴの発現は、ＬＴ後の良好な予後の患者を予後不良群から識別することができた。ＣＬＵの発現との可能な相乗効果により、微小血管への浸潤との関連性を見出した。この関連は、細胞外マトリックス集合及び細胞接着の機能に関連し、最終的には微小血管浸潤に影響すると考えられる。これは、ＤＰＴの発現とＨＣＣに対するＬＴ後の予後とを関連づけた最初の報告であり、この遺伝子が独立した良好な予後の予測因子であることを証明したことは初めてである。
【0062】
Ｓｐｒｏｕｔｙ ＲＴＫシグナル伝達拮抗薬２（ＳＰＲＹ２）
このタンパク質は、血管新生、細胞増殖、浸潤、移動、及び細胞質分裂など、がんの発生に関与する不可欠な経路の重要な調節因子である。Ｓｏｎｇら（Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ＆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１２；１１（２）：１７７－１８４）は、肝切除を受けた無作為抽出のＨＣＣ患者２４０人のサンプルを用いて、組織マイクロアレイでのＳＰＲＹ２の発現を調査した。２０７人の患者（８６．３％）は、ＳＰＲＹ２発現のダウンレギュレーションを示し、これは、生存の低下（ｐ＝０．００２）と再発の増加（ｐ＝０．００３）と相関し、ＨＣＣ患者における術後再発の独立予測因子として作用した（ＨＲ＝１．４７；９５％ＣＩ、１．０２～２．０８；ｐ＝０．０３７）。本発明者らの研究は、ＳＰＲＹ２の過剰発現をＨＣＣのためにＬＴに供された患者の集団における再発の増加と相関させる最初の研究である。しかしながら、本発明者らは、再発患者と非再発患者とを効果的に区別することができるカットオフ値を、２つの群の間に有意な重複が存在したため決定することができなかった。したがって、ＳＰＲＹ２の臨床的関連性は、依然としてさらなる研究で試験されるものである。
このタンパク質は、血管新生、細胞増殖、浸潤、移動、及び細胞質分裂など、がんの発生に関与する不可欠な経路の重要な調節因子である。Ｓｏｎｇら（Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ＆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１２；１１（２）：１７７－１８４）は、肝切除を受けた無作為抽出のＨＣＣ患者２４０人のサンプルを用いて、組織マイクロアレイでのＳＰＲＹ２の発現を調査した。２０７人の患者（８６．３％）は、ＳＰＲＹ２発現のダウンレギュレーションを示し、これは、生存の低下（ｐ＝０．００２）と再発の増加（ｐ＝０．００３）と相関し、ＨＣＣ患者における術後再発の独立予測因子として作用した（ＨＲ＝１．４７；９５％ＣＩ、１．０２～２．０８；ｐ＝０．０３７）。本発明者らの研究は、ＳＰＲＹ２の過剰発現をＨＣＣのためにＬＴに供された患者の集団における再発の増加と相関させる最初の研究である。しかしながら、本発明者らは、再発患者と非再発患者とを効果的に区別することができるカットオフ値を、２つの群の間に有意な重複が存在したため決定することができなかった。したがって、ＳＰＲＹ２の臨床的関連性は、依然としてさらなる研究で試験されるものである。
【0063】
ＳＰＲＹ２は、試験的セットにおいて、ミラノ基準内の再発に対していくらかの発現差異を示した（ｐ＝０．１３）。検証セットでは、ＳＰＲＹ２は再発と有意に相関し、ＯＲは１．３４２（Ｃ．Ｉ．１．１０６～１．６２８，ｐ＝０．００３）であった。しかしながら、ＤＦＳ（ＨＲ １．０５０，Ｃ．Ｉ．０．９６２～１．１４５，ｐ＝０．２７３）、又はＯＳ（ＨＲ １．０３０，Ｃ．Ｉ．０．９４３～１．１２５，ｐ＝０．５１４）について関連性は認められなかった。ＡＵＣが０．６８であったことから、最適なカットオフ値はデルタＣＴ値が７．６であると決定され、感度６９％、特異度６５％に相当した。しかし、ＤＦＳ（ＨＲ １．４２０，Ｃ．Ｉ．０．８９７～２．２４８，ｐ＝０．１３４）、又はＯＳ（ＨＲ １．３０５，Ｃ．Ｉ．０．８１４～２．０９４，ｐ＝０．２６９）について関連性は認められなかった。
【0064】
クラステリン
試験的セットでは、ＣＬＵはミラノ基準を超えた患者における再発に対する発現差異を明らかにし（Ｐ＝０．０２）、全セットのサンプルにおいても同様であった（Ｐ＝０．０１）。検証セットでは、ウィルコクソン検定により、ＣＬＵの発現は再発と関連していないようであった（図３６）。しかしながら、ロジスティック回帰分析により、検証セットではＣＬＵの発現が再発と相関することが明らかになった（ＯＲ １．２１９，Ｃ．Ｉ．１．０５９～１．４０３，ｐ＝０．００６）。ウィルコクソン検定は、非常に堅牢な統計的検定であるが、群の間の微妙な違いに感度がないため、本ケースでは、再発群と非再発群の間の微妙な発現差異として反映された。ＤＦＳ（ＨＲ １．０７３，Ｃ．Ｉ．０．９７８～１．１７８，ｐ＝０．１３６）、又はＯＳ（ＨＲ １．０１４，Ｃ．Ｉ．０．９１３～１．１２５，ｐ＝０．７９６）との関連は当初みられなかった。ＲＯＣ曲線を用いてΔＣＴのカットオフ値－０．５４が決定され、ＡＵＣは０．５９に相当した（感度７７％、特異度３５％）。このカットオフでは、ＤＦＳのＨＲは１．５６８であり（Ｃ．Ｉ．０．９５１～２．５８４、ｐ＝０．０７８）、かつＯＳのＨＲは１．５５０であった（Ｃ．Ｉ．０．９２６～２．５９５、ｐ＝０．０９６）。この関連性は弱いと思われるが、多重ロジスティック回帰分析及びコックス回帰分析で試験するのに十分なものであると考えられた。
試験的セットでは、ＣＬＵはミラノ基準を超えた患者における再発に対する発現差異を明らかにし（Ｐ＝０．０２）、全セットのサンプルにおいても同様であった（Ｐ＝０．０１）。検証セットでは、ウィルコクソン検定により、ＣＬＵの発現は再発と関連していないようであった（図３６）。しかしながら、ロジスティック回帰分析により、検証セットではＣＬＵの発現が再発と相関することが明らかになった（ＯＲ １．２１９，Ｃ．Ｉ．１．０５９～１．４０３，ｐ＝０．００６）。ウィルコクソン検定は、非常に堅牢な統計的検定であるが、群の間の微妙な違いに感度がないため、本ケースでは、再発群と非再発群の間の微妙な発現差異として反映された。ＤＦＳ（ＨＲ １．０７３，Ｃ．Ｉ．０．９７８～１．１７８，ｐ＝０．１３６）、又はＯＳ（ＨＲ １．０１４，Ｃ．Ｉ．０．９１３～１．１２５，ｐ＝０．７９６）との関連は当初みられなかった。ＲＯＣ曲線を用いてΔＣＴのカットオフ値－０．５４が決定され、ＡＵＣは０．５９に相当した（感度７７％、特異度３５％）。このカットオフでは、ＤＦＳのＨＲは１．５６８であり（Ｃ．Ｉ．０．９５１～２．５８４、ｐ＝０．０７８）、かつＯＳのＨＲは１．５５０であった（Ｃ．Ｉ．０．９２６～２．５９５、ｐ＝０．０９６）。この関連性は弱いと思われるが、多重ロジスティック回帰分析及びコックス回帰分析で試験するのに十分なものであると考えられた。
【0065】
Ｆボックス及びＷＤリピート含有タンパク質７（ＦＢＸＷ７）
ＦＢＸＷ７のレベルは、試験的セットにおけるミラノ基準内の患者において、再発に応じて発現差異を示すと思われた（ｐ＝０．０４）。しかし、検証セットではこの差は確認されなかった。ロジスティック回帰では、再発のＯＲは１．２３８（Ｃ．Ｉ．０．８９４～１．０５２、ｐ＝０．５４５）であることが明らかになった。コックス回帰分析では、ＤＦＳのＨＲは１．０２３が得られ（Ｃ．Ｉ．０．９２９～１．１２８、ｐ＝０．６４０）、ＯＳは１．０００（Ｃ．Ｉ．０．９００～１．１１３、ｐ＝０．９９４）が得られた。
ＦＢＸＷ７のレベルは、試験的セットにおけるミラノ基準内の患者において、再発に応じて発現差異を示すと思われた（ｐ＝０．０４）。しかし、検証セットではこの差は確認されなかった。ロジスティック回帰では、再発のＯＲは１．２３８（Ｃ．Ｉ．０．８９４～１．０５２、ｐ＝０．５４５）であることが明らかになった。コックス回帰分析では、ＤＦＳのＨＲは１．０２３が得られ（Ｃ．Ｉ．０．９２９～１．１２８、ｐ＝０．６４０）、ＯＳは１．０００（Ｃ．Ｉ．０．９００～１．１１３、ｐ＝０．９９４）が得られた。
【0066】
実施例５：総集団の分析
本発明者らは、１８０人の患者の全集団を分析した。検証セットで得られた結果を考慮し、腫瘍組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現に対してΔＣＴ値によって測定されたＣＬＵとＤＰＴの発現レベルをこの分析に含めた。
本発明者らは、１８０人の患者の全集団を分析した。検証セットで得られた結果を考慮し、腫瘍組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現に対してΔＣＴ値によって測定されたＣＬＵとＤＰＴの発現レベルをこの分析に含めた。
【0067】
この集団において再発に関連する因子を多重ロジスティック回帰で検定した（表３）。本発明者らは、腫瘍の数、微小血管浸潤及び低分化が、組織学的総腫瘍体積（ＴＴＶ）のように、再発と独立して関連していることを観察した。ＤＰＴ発現を使用すると、再発の予測リスクは５倍を超えて減少したが、ＣＬＵ発現は再発リスクの６１％までの減少が予測された。ただし、両方がモデルに導入された場合、ＤＰＴ発現のみが依然として独立して再発を予測したが（ＯＲ ０．１７８、Ｃ．Ｉ．０．０６３～０．５０７、Ｐ＝０．００１）、ＣＬＵ（ＯＲ ０．７２９、Ｃ．Ｉ．０．０６３～０．５０７、Ｐ＝０．５５４）はそうではなかった。変数「ＤＰＴ発現」と「ＣＬＵ発現」の間の統計的交互作用は、再発をアウトカムの変数として使用して検出されなかった（ｐ＝０．４０２）。ＣＬＵ（ｐ＝０．９４）とＤＰＴ（ｐ＝０．９６０）の両方の発現は、低分化腫瘍との関連はなかった。
【0068】
【表3】
【0069】
ＤＰＴの強い発現は微小血管浸潤の減少と関連していたのに対し（ＯＲ ０．３７０，Ｃ．Ｉ．０．１４０～０．９７９，ｐ＝０．０４５）、ＣＬＵの発現はそうではなかった（ｐ＝０．１７３）。しかし、微小血管浸潤をアウトカムの変数とした場合、ＤＰＴとＣＬＵとの間に相互作用が検出された（ｐ＝０．０３３）、これは、ＤＰＴ発現が低い又は高い腫瘍における微小血管浸潤の発生がＣＬＵの発現と強い相関があることを意味している。本研究では、ＤＰＴの発現が低い患者の２１．２％（１４／６６）が微小血管浸潤を有していた。この亜群では、ＣＬＵが強く発現している場合、微小血管浸潤の発生は４．８％（１／２１）であり、同時にＣＬＵが低く発現している場合は、２８．９％（１３／４５）の患者に微小血管浸潤がみられた（ｐ＝０．０２７）。この相互作用は科学文献では検出されたことがなく、今後の研究で説明されるべきものであり、これらの遺伝子間の関連性を示唆している。
【0070】
【表4】
【0071】
表４は、総集団におけるＤＦＳの多変量コックス回帰分析の結果を示す。微小血管浸潤はＤＦＳの減少と相関する唯一の因子であった。一方、ＤＰＴ及びＣＬＵの強い発現レベルは、正の予測因子として働き、生存の増加と相関していた。ＣＬＵ及びＤＰＴの両方を同時にモデルに導入する場合、ＣＬＵは独立変数ではなくなるが（ＨＲ ０．６００，Ｃ．Ｉ．０．３５１～１．０２６，ｐ＝０．０６２）、ＣＬＵとＤＰＴとの間に統計的相互作用は検出されなかった（ｐ＝０．８２２）。
【0072】
デルマトポンチン（Ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ（ＤＰＴ））
本発明者らは、ＤＰＴの発現が強いか弱いかでＤＦＳを観察した（図３）。ΔＣＴレベルが７を超えるとして定義される強いＤＰＴ発現を示す患者は、５年及び１０年でそれぞれ７０％及び５２．２％のＤＦＳとなった。強いＤＰＴ発現により、ＭＣを超えた患者でも、予後がより良好な患者の亜群を特定することも可能であった（図４）。これは、ＴＴＶ＞１１５ｃｍ３、微小血管浸潤の存在、又は低分化など、他の予後不良基準を示す患者にも適用した（図５Ａ、Ｂ、及びＣ）。最後に、強いＤＰＴ発現を示すＨＣＶ患者の亜群では、５年及び１０年のＤＦＳがそれぞれ７９．２％及び５８．８％であった（図６）。
本発明者らは、ＤＰＴの発現が強いか弱いかでＤＦＳを観察した（図３）。ΔＣＴレベルが７を超えるとして定義される強いＤＰＴ発現を示す患者は、５年及び１０年でそれぞれ７０％及び５２．２％のＤＦＳとなった。強いＤＰＴ発現により、ＭＣを超えた患者でも、予後がより良好な患者の亜群を特定することも可能であった（図４）。これは、ＴＴＶ＞１１５ｃｍ３、微小血管浸潤の存在、又は低分化など、他の予後不良基準を示す患者にも適用した（図５Ａ、Ｂ、及びＣ）。最後に、強いＤＰＴ発現を示すＨＣＶ患者の亜群では、５年及び１０年のＤＦＳがそれぞれ７９．２％及び５８．８％であった（図６）。
【0073】
クラステリン（ＣＬＵ）
ＣＬＵの発現は、組織マイクロアレイを用いて１９８個のＨＣＣ標本で解析した（Ｗａｎｇら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５；６（５）；２９０３－１６）。ＣＬＵタンパク質は、腫瘍細胞の細胞質で主に検出された。多変量コックス回帰分析により、ＣＬＵの過剰発現は、切除後の腫瘍再発の独立した予後因子であることが示された（ＨＲ １．６２８）。また、同じ研究で、ＣＬＵの過剰発現は、インビトロでＨＣＣ細胞の浸潤を有意に促進し、かつインビボで遠隔肺転移を促進するが、ＣＬＵをサイレンシングすることによりインビトロ及びインビボでＨＣＣ細胞の浸潤能が低下することが見出された。ＣＬＵの過剰発現は、前立腺がん、腎細胞がん、胆嚢がん、及び乳がんにおける転移能を増強することができる。
ＣＬＵの発現は、組織マイクロアレイを用いて１９８個のＨＣＣ標本で解析した（Ｗａｎｇら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５；６（５）；２９０３－１６）。ＣＬＵタンパク質は、腫瘍細胞の細胞質で主に検出された。多変量コックス回帰分析により、ＣＬＵの過剰発現は、切除後の腫瘍再発の独立した予後因子であることが示された（ＨＲ １．６２８）。また、同じ研究で、ＣＬＵの過剰発現は、インビトロでＨＣＣ細胞の浸潤を有意に促進し、かつインビボで遠隔肺転移を促進するが、ＣＬＵをサイレンシングすることによりインビトロ及びインビボでＨＣＣ細胞の浸潤能が低下することが見出された。ＣＬＵの過剰発現は、前立腺がん、腎細胞がん、胆嚢がん、及び乳がんにおける転移能を増強することができる。
【0074】
今回のコホートでは、ＣＬＵの過剰発現は再発及び生存との関連を示し、かつＬＴ後の予後が良好な患者を予後不良群から識別することができた。また、ＣＬＵは無病生存（ＤＦＳ）にも重要な影響を及ぼした（図７）。強いＣＬＵの発現を有する患者は、５年生存が６８．９％、１０年生存が５６．１％を示した。ＤＰＴほど顕著ではないが、ＣＬＵ発現値単独は、ミラノ基準を超える患者（Ａ）又はＴＴＶが１１５ｃｍ３を超える患者（Ｂ）など、予後不良の群内で使用した場合、より良好なアウトカムを有する患者を選択することができる。微小血管浸潤（Ｃ）又は低分化（Ｄ）の患者は、明確な傾向が認められたが、ＣＬＵ発現による生存との統計的な有意な関連性はなかった（図８）。ＣＬＵ発現が強いＨＣＶ患者の亜群は、５年及び１０年のＤＦＳがそれぞれ７４％及び６７％であった（図９）。
【0075】
【表5】
【0076】
全生存（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ＯＳ）の多変量コックス回帰分析もまた実施した。エタノール摂取と微小血管浸潤は、独立してＯＳの減少と関連していた。微小血管浸潤は知られている危険因子であるが、エタノール摂取によるＯＳの減少は、対応するＤＦＳの減少を伴わず、エタノール心筋症などエタノール中毒によくみられる関連併存疾患と関係し得る。ＤＰＴとＣＬＵの両方の強い発現は、独立してＯＳの増加と関連していた（表５）。
【0077】
予測力を有する多変量解析の組み合わせ
ＨＣＣのアウトカムに関連する遺伝子の予後力（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｗｅｒ）を強化するために、全ての遺伝子の予測力を組み合わせた多遺伝子モデルを開発し、ＤＰＴとＣＬＵとの間の相乗効果について調査した。この２つの遺伝子を合わせた発現に基づく単純なスコアを使用した。それらのＤＦＳのハザード比は類似していたため、各遺伝子に対して同じポイントであり：両方の遺伝子の弱い発現の場合は０ポイント、１つの遺伝子の強い発現の場合は１ポイント、両方の遺伝子の強い発現の場合は２ポイントである。両方の遺伝子の強い発現は、５年及び１０年でそれぞれ７８％及び６０％の生存と関連しており、遺伝子の組み合わせはＤＰＴ単独又はＣＬＵ単独よりも優れていた（図１０）。このスコアは、ミラノ基準によって除外された患者（図１１Ａ）、ＴＴＶが１１５ｃｍ３を超える患者（図１１Ｂ）、及び低分化腫瘍の患者（図１１Ｃ）のＬＴ後の良好な予後を識別する。この場合も、統計的有意性には達していないが、微小血管浸潤のある患者では生存が増加する傾向が認められた（図１１Ｄ）。結果は、各遺伝子によって個別に得られたものよりも優れている。図１２は、ＴＴＶが１１５ｃｍ３以下と組み合わせたこの単純な構成遺伝子スコアを使用して予測生存を示す。この組み合わせにより、ＬＴ後の予後が非常に良好な患者の群、ＬＴ後の予後は中程度であるが依然として許容できる群、及びＬＴ後の予後が不良な群が特定される。
ＨＣＣのアウトカムに関連する遺伝子の予後力（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｗｅｒ）を強化するために、全ての遺伝子の予測力を組み合わせた多遺伝子モデルを開発し、ＤＰＴとＣＬＵとの間の相乗効果について調査した。この２つの遺伝子を合わせた発現に基づく単純なスコアを使用した。それらのＤＦＳのハザード比は類似していたため、各遺伝子に対して同じポイントであり：両方の遺伝子の弱い発現の場合は０ポイント、１つの遺伝子の強い発現の場合は１ポイント、両方の遺伝子の強い発現の場合は２ポイントである。両方の遺伝子の強い発現は、５年及び１０年でそれぞれ７８％及び６０％の生存と関連しており、遺伝子の組み合わせはＤＰＴ単独又はＣＬＵ単独よりも優れていた（図１０）。このスコアは、ミラノ基準によって除外された患者（図１１Ａ）、ＴＴＶが１１５ｃｍ３を超える患者（図１１Ｂ）、及び低分化腫瘍の患者（図１１Ｃ）のＬＴ後の良好な予後を識別する。この場合も、統計的有意性には達していないが、微小血管浸潤のある患者では生存が増加する傾向が認められた（図１１Ｄ）。結果は、各遺伝子によって個別に得られたものよりも優れている。図１２は、ＴＴＶが１１５ｃｍ３以下と組み合わせたこの単純な構成遺伝子スコアを使用して予測生存を示す。この組み合わせにより、ＬＴ後の予後が非常に良好な患者の群、ＬＴ後の予後は中程度であるが依然として許容できる群、及びＬＴ後の予後が不良な群が特定される。
【0078】
それぞれの個々の遺伝子の以前に示された結果によると、ＤＰＴはＣＬＵと比較した場合に優れた予測力を持っている可能性がある。その結果として、この２つの遺伝子のうち１つだけを強く発現している患者の予後力をより良好にアッセイするために、これらの遺伝子の組み合わせを、スコアを使用せずに評価した（図１３）。
【0079】
複数の遺伝子をＨＣＣの予測戦略に組み込む第２のアプローチでは、線形カーネルサポートベクターマシン分類アルゴリズムにおいて、２つの遺伝子ＣＬＵ及びＤＰＴの発現レベルの値をＴＴＶと共に使用した。アルゴリズムの性能を評価するためにジャックナイフ戦略を使用した。つまり、アルゴリズムは１つを除く全てのデータポイントを使用して訓練され、この１つを使用して評価し、次いでこのプロセスが全てのデータポイントに対して繰り返され、結果を収集した。テストサンプルを削除した後、残りのデータセットはデータ拡張（ＳＭＯＴＥ）及び正規化（単位分散及びゼロ平均）手順にかけた。これは、バランスの取れた訓練データセットを取得し、かつ最も支配的な分類への過剰適合を防ぎ、かつ全ての特徴が分類特徴空間で同等であることも確認するために実施された。
【0080】
１５４人の患者で構成されるコホートは、３つの変数を使用した多変量アルゴリズムを用いて評価した。変数は、閾値を下回る患者にはその特徴に対して０の値が割り当てられ、閾値を超える患者には１の値が割り当てられる閾値手法を使用して２値化した。閾値の単位はそれぞれの特徴と同じである（遺伝子発現についてはΔＣｔ、腫瘍体積については体積単位）。使用した閾値の値は、ＣＬＵについては－０．５４のΔＣｔ、ＤＰＴについては７のΔＣｔ、ＴＴＶについては１１５ｃｍ３であった。以下の結果は、評価手順の後に得られ、複数の指標遺伝子と腫瘍体積とからのバイナリデータを組み込んだアルゴリズムが、ＨＣＣを治療するためにＬＴ後に疾患の再発を示す可能性のある患者を正確に分類することを実証している（正確度６７％、偽陽性２２％、精度９１％、再現率６４％、図１４、図１５）。分類の精度率は、現在の臨床診療で使用されるミラノ基準内（正確度６９％、偽陽性３６％、精度９２％、再現率７１％、図１６）又はミラノ基準外（正確度６２％、偽陽性１１％、精度８７％、再現率４５％、図１７）としていずれかに分類された患者のサブセットで実行された場合にも良好であり、指標遺伝子発現（並びに腫瘍体積）の閾値に基づくバイナリスコアに基づく患者の分類はＬＴ後の良好なアウトカムの可能性のある患者のサブセットを識別でき、そうでなければ、この処置を受けることから除外することができることを示唆している。
【0081】
例として、患者１は以下の値：ＤＰＴ＝１０．４８、ＣＬＵ＝５．３４、及びＴＴＶ＝１８．０を有し、患者２はＤＰＴ＝４．３９、ＣＬＵ＝０．８４、ＴＴＶ＝５．０有する。次に、これらの値はそれぞれの閾値を使用して２値化され、各変数のバイナリ値が得られる。この変数は、再発の予測を示すバイナリ値を生成するために線形カーネルＳＶＭアルゴリズムにかけられる。このモデルは推定確率を生成することができ、この例では、出力を簡略化するために、結果自体が２値化されて、５０％の確率を上回る値及び下回る値を分離する。結果の解釈は単純であり、再発の発生が予測されるか（Ｒ，０）、又は再発が予測されないか（ＮＲ，１）を単に示すバイナリ値が出力される（表７）。
【0082】
【表6】
【0083】
最後に、不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の問題も検討した。同じ腫瘍の異なる場所からのサンプルが７人の患者で利用可能であった。発現レベルの変動をＣＬＵ及びＤＰＴについてハウスキーピング遺伝子に関して測定し、かつ異なる値が、以前に計算されたカットオフ値により設定された群の移動を引き起こすかどうか（「群の移動（ｇｒｏｕｐ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）」）を測定した。これらのサンプルでは、ＤＰＴの発現レベルにほとんど変化がなく、これらの値に基づいて別の群に移動しなければならない患者はいなかった。一方、ＣＬＵの発現は、腫瘍の不均一性と関連しているようであった。これらの結果は、ＤＰＴの腫瘍内遺伝子発現が均一性である可能性が高いことを示唆している。
【0084】
ＣＡＰＮＳ１
ＨＣＣのＬＴを受けている１９２人の患者を含む研究では、ＣＡＰＮＳ１の過剰発現は、腫瘍の数とサイズ、腫瘍のカプセル化、静脈浸潤、及びｐＴＮＭ病期と有意に関連していた。多変量解析により、ＣＡＰＮ４の発現がＨＣＣ患者の生存の強力な独立した予後因子であることが明らかになった（ＨＲ ４．０６８、Ｃ．Ｉ．２．５２４～６．５５５；ｐ＜０．００１）。本発明者らは、ＣＡＰＮＳ１発現と再発との関連を実証した（ｐ＜０．００１）。しかしながら、ＯＳ又はＤＦＳとの相関は実証されず、ΔＣｔのカットオフ値が再発する患者又は再発しない患者を区別するのに有用であることが証明されなかった。ＣＡＰＮＳ１は、他の識別マーカーとの組み合わせに有望なマーカーである。
ＨＣＣのＬＴを受けている１９２人の患者を含む研究では、ＣＡＰＮＳ１の過剰発現は、腫瘍の数とサイズ、腫瘍のカプセル化、静脈浸潤、及びｐＴＮＭ病期と有意に関連していた。多変量解析により、ＣＡＰＮ４の発現がＨＣＣ患者の生存の強力な独立した予後因子であることが明らかになった（ＨＲ ４．０６８、Ｃ．Ｉ．２．５２４～６．５５５；ｐ＜０．００１）。本発明者らは、ＣＡＰＮＳ１発現と再発との関連を実証した（ｐ＜０．００１）。しかしながら、ＯＳ又はＤＦＳとの相関は実証されず、ΔＣｔのカットオフ値が再発する患者又は再発しない患者を区別するのに有用であることが証明されなかった。ＣＡＰＮＳ１は、他の識別マーカーとの組み合わせに有望なマーカーである。
【0085】
実施例６：材料と方法
分子予後バイオマーカー
予後に関する臨床的要因が特定された後、本発明者らは、ＨＣＣの予後に関してより大きな識別力を有する可能性がある分子バイオマーカーを特定することを目的とした。このため、カレーカブラル病院（Ｃｕｒｒｙ Ｃａｂｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のＣＨＢＰＴとＯｐｈｉｏｍｉｃｓ精密医療社（Ｏｐｈｉｏｍｉｃｓ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）との間で共同研究が確立され、主任研究員にはＪｏｓｅ Ｐｅｒｅｉｒａ Ｌｅａｌ教授が就き、一共同研究員にはＪｏａｎａ Ｃａｒｄｏｓｏ Ｖａｚが就いた。分子バイオマーカーの研究には、ＨＣＣ患者の公的リポジトリ及びＨＣＣのバイオマーカーに関する公開された文献のデータマイニング及びバイオインフォマティクス解析が含まれた。
分子予後バイオマーカー
予後に関する臨床的要因が特定された後、本発明者らは、ＨＣＣの予後に関してより大きな識別力を有する可能性がある分子バイオマーカーを特定することを目的とした。このため、カレーカブラル病院（Ｃｕｒｒｙ Ｃａｂｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のＣＨＢＰＴとＯｐｈｉｏｍｉｃｓ精密医療社（Ｏｐｈｉｏｍｉｃｓ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）との間で共同研究が確立され、主任研究員にはＪｏｓｅ Ｐｅｒｅｉｒａ Ｌｅａｌ教授が就き、一共同研究員にはＪｏａｎａ Ｃａｒｄｏｓｏ Ｖａｚが就いた。分子バイオマーカーの研究には、ＨＣＣ患者の公的リポジトリ及びＨＣＣのバイオマーカーに関する公開された文献のデータマイニング及びバイオインフォマティクス解析が含まれた。
【0086】
データマイニング及びバイオインフォマティクス解析
肝切除及び移植を受けたＨＣＣ患者の公的リポジトリにある分子データのマイニング及びバイオインフォマティクス解析を行った。ＨＣＣ患者に関する利用可能な公開データを、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの発現プロファイリングデータを含む本発明者らの解析パイプラインで再解析した。
肝切除及び移植を受けたＨＣＣ患者の公的リポジトリにある分子データのマイニング及びバイオインフォマティクス解析を行った。ＨＣＣ患者に関する利用可能な公開データを、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの発現プロファイリングデータを含む本発明者らの解析パイプラインで再解析した。
【0087】
肝細胞癌の予後分子マーカー：系統的レビュー
本発明者らは、ＬＴを受けたＨＣＣ患者に関する以前に公開されたバイオマーカーについて文献を調査した。ＬＴ患者におけるデータは乏しく、重要な情報は肝切除を受けた患者のコホートで得ることができるため、ＬＲ（肝切除）におけるバイオマーカーを用いた研究もこの解析に含まれた。ＨＣＣの切除又は移植を受ける患者の予後に対する分子バイオマーカーの役割について利用可能なエビデンスの系統的な文献レビューを実施した。このレビューは、米国アカデミー協会医学研究所の系統的レビューの基準の一般的なガイドラインに従った。このレビューの目的は、ＨＣＣに対してＬＲ又はＬＴを受けた患者の予後における分子バイオマーカーの役割を評価することである。
本発明者らは、ＬＴを受けたＨＣＣ患者に関する以前に公開されたバイオマーカーについて文献を調査した。ＬＴ患者におけるデータは乏しく、重要な情報は肝切除を受けた患者のコホートで得ることができるため、ＬＲ（肝切除）におけるバイオマーカーを用いた研究もこの解析に含まれた。ＨＣＣの切除又は移植を受ける患者の予後に対する分子バイオマーカーの役割について利用可能なエビデンスの系統的な文献レビューを実施した。このレビューは、米国アカデミー協会医学研究所の系統的レビューの基準の一般的なガイドラインに従った。このレビューの目的は、ＨＣＣに対してＬＲ又はＬＴを受けた患者の予後における分子バイオマーカーの役割を評価することである。
【0088】
集団：調査は英語の学術論文に限定し、２００８年１月から２０１６年１０月まで実施した。抄録形式でのみ発表された研究、未発表の研究、査読なしのジャーナルに発表された記事は含まれなかった。動物実験及びインビトロ研究も除外された。ＨＣＣの予後に関連しない分子マーカーの研究も除外された。治療介入：ＨＣＣのための肝切除及び移植。切除を選択する理由は、ＬＴに関する研究の不足のためであった。アウトカム：調査された主なアウトカムは、無病生存、再発及び全生存である。研究の設計：この設定ではランダム化比較試験（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ（ＲＣＴ））及びコントロール試験はまれであるため、データが不足しているため遡及的性質であっても包含することに対してコホート研究が適格であった。レビューには症例シリーズは容認され、症例報告は除外した。経済評価もまた除外した。ＰｕｂＭｅｄ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｋｅｙ、及びＣｏｃｈｒａｎｅのデータベースの調査は、様々な組み合わせで次のキーワード：肝細胞癌、手術、切除、移植、予後、分子及びバイオマーカーを使用して実行した。特定された論文の引用文献は、さらに関連する出版物を探すために使用した。取得したデータには、データの種類（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質）、予後情報、関連する特定の遺伝子、良好又は不良な予後の遺伝子、変化の種類（過剰発現、ダウンレギュレーション、高メチル化及び変異）、患者サンプル、統計データ、及び著者の観察結果が含まれた。バイオマーカーは、予測力、様々なセンター間の引用数、技術を再現する能力、及び利用可能な試薬に従って選択した。上位のバイオマーカーの候補を選択した後、試験的研究を実施した。
【0089】
研究集団
包含基準及び除外基準は、臨床バイオマーカーに関する研究で以前に使用されたものと同じであった。包含基準：肝細胞癌のために肝移植を受けた患者。除外基準：１８歳未満の年齢；肝硬変なし；線維層状組織学的又は肝胆管癌の組織学的な種類；ＨＣＣの組織学的確認の不在；及びさらに、本発明者らの主なアウトカムの尺度は再発／無病生存であったため、本発明者らは、周術期死亡、肝外浸潤及び残存疾患を有する症例を除外した。１９９２年９月から２０１４年２月の間にＨＣＣのためにＬＴを受けた３０１人の患者の完全な集団を考慮した。除外基準を適用した後に得られた２３１人の患者から、発明者は５年を超える追跡調査（フォローアップ）を行った患者のみを含めた。本研究で使用されたサンプルの最終セット（試験的セットと検証セット）には、１８０人の患者が含まれた。試験的セット：試験的セットには、ミラノ基準を超えた再発ありの患者（ｎ＝６）と再発なしの患者（ｎ＝７）、及びミラノ基準内で早期再発ありの患者（ｎ＝６）と再発なしの患者（ｎ＝７）が含まれた。試験的研究における選択基準に合格したバイオマーカーのサブセットは、検証セットを使用して２ラウンドの分析を行った。検証セット：２７５人の患者の初期集団から、以前に試験的セットに含まれていた患者、周術期死亡、肝外浸潤、残存疾患、及びフォローアップが５年未満の患者を除外し、最初に検証セットに含まれた患者は１５４人であった。
包含基準及び除外基準は、臨床バイオマーカーに関する研究で以前に使用されたものと同じであった。包含基準：肝細胞癌のために肝移植を受けた患者。除外基準：１８歳未満の年齢；肝硬変なし；線維層状組織学的又は肝胆管癌の組織学的な種類；ＨＣＣの組織学的確認の不在；及びさらに、本発明者らの主なアウトカムの尺度は再発／無病生存であったため、本発明者らは、周術期死亡、肝外浸潤及び残存疾患を有する症例を除外した。１９９２年９月から２０１４年２月の間にＨＣＣのためにＬＴを受けた３０１人の患者の完全な集団を考慮した。除外基準を適用した後に得られた２３１人の患者から、発明者は５年を超える追跡調査（フォローアップ）を行った患者のみを含めた。本研究で使用されたサンプルの最終セット（試験的セットと検証セット）には、１８０人の患者が含まれた。試験的セット：試験的セットには、ミラノ基準を超えた再発ありの患者（ｎ＝６）と再発なしの患者（ｎ＝７）、及びミラノ基準内で早期再発ありの患者（ｎ＝６）と再発なしの患者（ｎ＝７）が含まれた。試験的研究における選択基準に合格したバイオマーカーのサブセットは、検証セットを使用して２ラウンドの分析を行った。検証セット：２７５人の患者の初期集団から、以前に試験的セットに含まれていた患者、周術期死亡、肝外浸潤、残存疾患、及びフォローアップが５年未満の患者を除外し、最初に検証セットに含まれた患者は１５４人であった。
【0090】
サンプル収集
カレーカブラル病院の肝胆膵移植センターで肝移植を受けた１８０人の患者について、この患者らの腫瘍標本はホルマリンで固定しパラフィンブロックに保存されていた。選択された全てのブロックについて、経験のある病理学者の監督のもと、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色された切片に対して病理組織学的な特徴付け及び領域の選択が行われた。カレーカブラル病院の医療倫理審査委員会及びＮＯＶＡ医科大学の倫理審査委員会の双方は本研究を承認した。
カレーカブラル病院の肝胆膵移植センターで肝移植を受けた１８０人の患者について、この患者らの腫瘍標本はホルマリンで固定しパラフィンブロックに保存されていた。選択された全てのブロックについて、経験のある病理学者の監督のもと、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色された切片に対して病理組織学的な特徴付け及び領域の選択が行われた。カレーカブラル病院の医療倫理審査委員会及びＮＯＶＡ医科大学の倫理審査委員会の双方は本研究を承認した。
【0091】
ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成
保存されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片（５μｍ）を脱パラフィン化し、マイヤ－（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン・エオシンで対比染色した。全てのサンプルは、病理医の指導のもとマクロ解剖した。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、若干の修正を加え製造元の指示に従い抽出した：５６℃でのプロテイナーゼＫ細胞溶解は一晩実施した。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）の「オンカラム」ＤＮＡ消化手順が含まれた。抽出された各ＲＮＡサンプルは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。
保存されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片（５μｍ）を脱パラフィン化し、マイヤ－（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン・エオシンで対比染色した。全てのサンプルは、病理医の指導のもとマクロ解剖した。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、若干の修正を加え製造元の指示に従い抽出した：５６℃でのプロテイナーゼＫ細胞溶解は一晩実施した。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）の「オンカラム」ＤＮＡ消化手順が含まれた。抽出された各ＲＮＡサンプルは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写した。
【0092】
【表7】
【0093】
定量的リアルタイムＰＣＲ
知られているＦＦＰＥ分解の問題と少量の抽出サンプルのため、標準的な方法ではＲＮＡ濃度と完全性を評価できなかった。そのため、本発明者らは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、高感度なＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、単離されたＲＮＡサンプルの量と質を取得した。プライマーセットは、ＮＣＢＩプライマーＢＬＡＳＴツール（Ｙｅら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１２；１３：１３４）を使用して、６０℃で動作し、増幅産物長は７０～１００ｂｐ（表６）であるように設計し、そしてそれらをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。各サンプルの複製は、テンプレート（１μＬ、０．５～１ｎｇ／μＬ）及びプライマー（それぞれ０．５μＭ）を含む１０μＬの反応混合物においてＳｓｏＦａｓｔ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ試薬（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。サンプルは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）で以下のサイクルプログラムに従って処理した：１２０秒間９８℃、５秒間９８℃及び１５秒間６０℃で５０サイクル。蛍光データ収集は６０℃で行った。データ及び統計解析については、ＲＴ－ｑＰＣＲによる標的遺伝子の相対的な発現差異解析は、２ΔΔＣｔ、又はΔＣｔの方法に基づいて発現の倍数変化を計算した。ここでは、Ｌｉｖａｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５（４）：４０２－８による、キャリブレーター遺伝子のリボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）のＣｔと比較しサイクル閾値（Ｃｔ）として複製の平均定量サイクルを使用し、１を超える値はアップレギュレーションを指し、１未満の値はダウンレギュレーションを示している。疾患の再発のある（Ｒ）及び再発のない（ｎｏｎＲ）サンプルのセットの間のＲＴ－ｑＰＣＲデータを使用する標的遺伝子の発現差異は、統計計算用のＲ言語（Ｔｅａｍ ＲＤＣ、オーストリア、２００９）を使用して実行し、統計的有意性はウィルコクソンの順位和検定（信頼水準＝０．９５）を使用して計算した。
知られているＦＦＰＥ分解の問題と少量の抽出サンプルのため、標準的な方法ではＲＮＡ濃度と完全性を評価できなかった。そのため、本発明者らは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、高感度なＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、単離されたＲＮＡサンプルの量と質を取得した。プライマーセットは、ＮＣＢＩプライマーＢＬＡＳＴツール（Ｙｅら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１２；１３：１３４）を使用して、６０℃で動作し、増幅産物長は７０～１００ｂｐ（表６）であるように設計し、そしてそれらをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入した。各サンプルの複製は、テンプレート（１μＬ、０．５～１ｎｇ／μＬ）及びプライマー（それぞれ０．５μＭ）を含む１０μＬの反応混合物においてＳｓｏＦａｓｔ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ試薬（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。サンプルは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）で以下のサイクルプログラムに従って処理した：１２０秒間９８℃、５秒間９８℃及び１５秒間６０℃で５０サイクル。蛍光データ収集は６０℃で行った。データ及び統計解析については、ＲＴ－ｑＰＣＲによる標的遺伝子の相対的な発現差異解析は、２ΔΔＣｔ、又はΔＣｔの方法に基づいて発現の倍数変化を計算した。ここでは、Ｌｉｖａｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５（４）：４０２－８による、キャリブレーター遺伝子のリボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）のＣｔと比較しサイクル閾値（Ｃｔ）として複製の平均定量サイクルを使用し、１を超える値はアップレギュレーションを指し、１未満の値はダウンレギュレーションを示している。疾患の再発のある（Ｒ）及び再発のない（ｎｏｎＲ）サンプルのセットの間のＲＴ－ｑＰＣＲデータを使用する標的遺伝子の発現差異は、統計計算用のＲ言語（Ｔｅａｍ ＲＤＣ、オーストリア、２００９）を使用して実行し、統計的有意性はウィルコクソンの順位和検定（信頼水準＝０．９５）を使用して計算した。
【0094】
さらに、得られたＲＴ－ｑＰＣＲデータはまた、臨床マーカーについて前述したのと同じ方法を使用して、各候補の標的遺伝子について患者の無病生存と個別に相関させた。連続変数は、四分位範囲（ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ ｒａｎｇｅ：ＩＱＲ）の中央値又は平均及び標準偏差（ＳＤ）として表され、独立したサンプルのｔ検定を使用して比較した。移植患者の目的の人口統計変数は、必要に応じてスチューデントのｔ検定、ピアソンのカイ２乗検定、又はフィッシャーの直接確率検定を使用して比較した。アウトカムの変数は、再発（無病生存）及び死亡（全生存）であった。アウトカムまでの時間は、移植日からイベント日まで、又はイベントを経験しなかった患者の最後のフォローアップ期間の日までを使用して計算した。カプランマイヤー生存曲線は、移植後のアウトカム分析のために作成した。ログランク検定とコックス回帰モデルとを使用して、無病生存と全生存とに対する人口統計変数の効果を調べた。カットオフ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって決定した。多変量解析では、アウトカムのＰ＜０．２０に対して有意な全ての変数を、アウトカムの種類に応じてコックス比例ハザードモデル（Ｔｈｅｒｎｅａｕら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、２０００）又は多重ロジスティック回帰モデルに含めた。有意な変数を保持するために、後退的選択法（ｂａｃｋｗａｒｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を実行した。必要に応じて、個別の層別生存率解析を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合は有意とした。統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２２．０及び２４．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、シカゴ、イリノイ州）を使用して実行した。線形カーネルＳＶＭアルゴリズムは、データ操作及び分類のために以下のパッケージを使用して、Ｐｙｔｈｏｎ３．６．７環境で開発した：ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ（０．２３．２）；ｎｕｍｐｙ（１．１９．１）；ｐａｎｄａｓ（０．２３．４）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】