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特表2022-552870改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するアデノウイルス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-20
(54)【発明の名称】改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するアデノウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/34 20060101AFI20221213BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20221213BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20221213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/34 ZNA
C12N15/861 Z
C12N5/0775
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523434
(86)(22)【出願日】2020-10-20
(85)【翻訳文提出日】2022-06-20
(86)【国際出願番号】 EP2020079494
(87)【国際公開番号】W WO2021078735
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】19204420.4
(32)【優先日】2019-10-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506407062
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート・ウルム
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】コハネック、ステファン
(72)【発明者】
【氏名】クルツケ、リー
(72)【発明者】
【氏名】シュタイナー、ロビン
(72)【発明者】
【氏名】ラバース、オリビア
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃを開示するものであり、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。本発明はさらに、ヒト疾患の治療または予防に使用するための、本開示のアデノウイルスを開示する。本発明はさらに、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする核酸を開示する。本発明はさらに、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）または腫瘍細胞を形質導入するための、本開示によるアデノウイルスの使用を開示する。本発明はさらに、ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法、およびその方法によって得られる形質導入されたＭＳＣを開示する。本発明はさらに、疾患の治療に使用するための、本開示の形質導入されたＭＳＣを開示する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃであって、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する、ヒトアデノウイルス種Ｃ。
【請求項2】
請求項１記載のアデノウイルスであって、前記アデノウイルスはアデノウイルス５型である、アデノウイルス。
【請求項3】
請求項１または２記載のアデノウイルスであって、前記アデノウイルスは、アデノウイルスベクターまたは腫瘍溶解性アデノウイルスである、アデノウイルス。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１つに記載のアデノウイルスであって、前記アデノウイルスは、導入遺伝子を有するものである、アデノウイルス。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１つに記載のアデノウイルスにおいて、前記カプシドは、少なくとも１つの追加のカプシド修飾を有し、前記追加のカプシド修飾は、好ましくは、改変型アデノウイルス繊維タンパク質である、アデノウイルス。
【請求項6】
ヒト疾患の治療または予防に使用するための、請求項１～５のいずれか１つに記載のアデノウイルス。
【請求項7】
ヒトアデノウイルス種Ｃの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする核酸であって、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＩＤ番号：１の配列を有する、核酸。
【請求項8】
請求項７記載の核酸であって、前記核酸は、配列ＩＤ番号：２の配列を有する、核酸。
【請求項9】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）または腫瘍細胞を形質導入するための、請求項１～５のいずれか１つに記載のアデノウイルスの使用。
【請求項10】
請求項９記載の使用において、前記アデノウイルスは、ＭＳＣを形質導入するための形質導入エンハンサーと組み合わせて使用される、使用。
【請求項11】
請求項１０記載の使用において、前記形質導入エンハンサーは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサメトリン、ポリＬ－リジン及びラクトフェリンからなる群から選択される、使用。
【請求項12】
ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記方法は、請求項１～５のいずれか１つに記載のアデノウイルスを複数のＭＳＣに接触させる工程
を有する、方法。
【請求項13】
請求項１２記載の方法において、前記複数のＭＳＣは形質導入エンハンサーとさらに接触されるものであり、前記形質導入エンハンサーは、好ましくは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサメトリン、ポリＬ－リジンおよびラクトフェリンからなる群から選択される、方法。
【請求項14】
請求項１２または１３記載の方法によって得られる、形質導入されたＭＳＣ。
【請求項15】
疾患の治療に使用するための請求項１４記載の形質導入されたＭＳＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃに関するものであり、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。本発明はさらに、ヒト疾患の治療または予防に使用するための、本発明のアデノウイルスに関するものである。本発明はさらに、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする核酸に関するものである。本発明はさらに、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）または腫瘍細胞を形質導入するための、本発明のアデノウイルスの使用に関するものである。本発明はさらに、ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法、およびその方法によって得られる形質導入されたＭＳＣに関する。本発明はさらに、疾患の治療に使用するための、本発明の形質導入されたＭＳＣに関する。
【背景技術】
【0002】
アデノウイルスは、アデノウイルス科に属する非エンベロープウイルスである。それらは約３６キロベース（ｋｂ）のサイズの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ。現在、８９の異なるヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）タイプが知られており、種ＡからＧと呼ばれる７つの種に分類されている。ＨＡｄＶ種Ｃは、１型、２型、５型、６型、５７型、および、８９型の６つのタイプを有する。
【0003】
組換えアデノウイルスは、核酸、タンパク質、または、その他の分子を患者の細胞内に導入するために、予防や治療の場面で使用されることがある。しかしながら、例えば、ＨＡｄＶを全身投与した後、腫瘍に効率的に送達することは、いくつかの細胞性および非細胞性の非標的相互作用と隔離機構のために、まだ困難である。
【0004】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は腫瘍組織への自然な移動挙動を示すことから、腫瘍組織へのアデノウイルスの興味深い潜在的な担体である。しかし、アデノウイルスはほとんどの種類の標的細胞に感染する可能性があるが、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を発現しないＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏではほとんどアデノウイルスに感染することがない。
【0005】
そのため、アデノウイルスを医療で使用するための現在の限界を克服する新しいツールおよび方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
第１の態様において、本発明は、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃに関し、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。
【0007】
第２の態様において、本発明は、ヒト疾患を治療または予防するために使用するための本発明のアデノウイルスに関する。
【0008】
第３の態様において、本発明は、ヒトアデノウイルス種Ｃの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする核酸に関し、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＩＤ番号：１の配列を有する。
【0009】
さらなる態様において、本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）または腫瘍細胞を形質導入するための、本発明のアデノウイルスの使用に関するものである。
【0010】
さらなる態様において、本発明は、ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関し、前記方法は、
複数のＭＳＣを本発明のアデノウイルスと接触させる工程
を有する。
複数のＭＳＣを本発明のアデノウイルスと接触させる工程
を有する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる形質導入されたＭＳＣに関するものである。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、疾患の治療に使用するための、本発明の形質導入されたＭＳＣに関する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、ＨＡｄＶ５野生型およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンタンパク質の超可変領域１のアミノ酸配列（図１Ａ）、および、ＨＡｄＶ５野生型、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）、５（ＨＶＲ５）、７（ＨＶＲ７）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。負に帯電したアミノ酸は太字で描かれている。挿入されたリジン残基はイタリック体で示されている。
【図2】図２は、ＨＡｄＶ５野生型およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンタンパク質の超可変領域１をコードするヌクレオチド配列のアラインメントを示したものである。挿入されたリジン残基をコードするヌクレオチドは、大文字で示されている。
【図3】図３は、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３では、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２およびＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）と比較して、銀染色でヘキソンタンパク質が小さく見えることを示している。５ｘ１０９ウイルス粒子をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、銀染色で染色した。
【図4】図４は、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の表面電荷が、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１に比べ、著しく高いことを示す。ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、およびＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１の２ｘ１０１１ウイルス粒子を一晩透析し、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムで精製し、ゼータサイザーナノ－ＺＳで測定した。結果は、平均±標準偏差で示される（ｎ＝５～６）。＊＊＊ｐ≦０．０００５。
【図5】図５は、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３が、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１に比べて、第Ｘ因子（ＦＸ）によるＣＡＲ陰性細胞への形質導入が著しく少ないことを示している。２ｘ１０４ ＳＫＯＶ－３細胞をＦＸ（＋ＦＸ）（８μｇ／ｍｌ）またはＦＸなし（ｗ／ｏ ＦＸ）で処理し、２ｘ１０７ウイルス粒子（ｐＭＯＩ １０００）に感染させて７２時間培養し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現について分析した。結果は、平均±標準偏差で示される（ｎ＝１４～１５）。＊＊＊ｐ≦０．０００５。
【図6】図６は、スカベンジャー受容体によるＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の取り込みがＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）と比較して著しく減少していることを示す。１ｘ１０５Ｊ７７４．Ａ１細胞は、必要に応じて、ポリイノシン酸（Ｐｏｌｙ－（Ｉ））（３０μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、続いて２ｘ１０８ウイルス粒子（ｐＭＯＩ ２０００）に感染させて、さらに２１時間培養し、採取した後、ＤＮＡ分離とｑＰＣＲ分析が行われた。結果は平均±標準偏差で示される（ｎ＝６）。＊＊ｐ≦０．００５。
【図7】図７は、ＦＸ結合を切断したＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ベクター粒子が天然ＩｇＭによる中和から逃れることを示している。ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）、ＨＡｄＶ５－ΔＦＸまたはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３をＰＢＳまたはＡｄ－ｎａｉｖｅの、異なるドナーまたはマウス系統の、ヒルジン化（ｈｉｒｕｄｉｎｉｚｅｄ）ヒトまたはマウス血漿サンプルとともに２Ｅ６ ＶＰ／μｌの割合で３７℃、１０分間培養した。その後、Ａ５４９細胞にｐＭＯＩを１，０００で形質導入した。細胞によるｅＧＦＰの発現は、導入後２４時間後にフローサイトメトリーにより分析した。結果は、平均±標準偏差で示される（ｎ＝７～１２）。＊＊＊ｐ≦０．０００５。
【図8】図８は、第Ｘ因子の存在下で、ＭＳＣによるＨＡｄＶ５－コード化治療用タンパク質ＴＳＧ－６の有意に増強された分泌を示す。ＭＳＣに、ＴＳＧ－６発現アデノウイルスベクターＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６の非存在下、または存在下で、異なるｐＭＯＩを形質導入し、導入７２時間後に細胞培養上清中のＴＳＧ－６濃度をＥＬＩＳＡで定量化した（ｎ＝１）。
【図9】図９は、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を用いた場合、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）と比較して、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入が改善または維持されることを示す。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３とＨＡｄＶ５を用いて、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ、ＭｉａＰａＣａ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、およびＡ５４９細胞にｐＭＯＩが３００と１０００で形質導入を行った。形質導入の２４時間後、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。結果は平均±標準偏差で示される（ｎ＝３）。＊ｐ≦０．０５。
【図10】図１０は、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）とエンハンサーとのプレインキュベーション、またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の利用によって、ＭＳＣの形質導入が有意に促進されたことを示す。ＭＳＣは、ＨＡｄＶ５（それぞれのエンハンサーとプレインキュベーションしたもの、またはしないもの）またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３によって、ｐＭＯＩが１０００で形質導入された。導入の７２時間後、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析した。結果は、平均±標準偏差で示される（ｎ＝３）。＊ｐ≦０．０５。
【図11】図１１は、エンハンサーをプレインキュベーションしたＨＡｄＶ５ｗｔの使用、またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔの使用による、ＭＳＣにおけるアデノウイルス複製の改善を示す。ＭＳＣは、３００および１０００のｐＭＯＩを有するＨＡｄＶ５ｗｔ（それぞれのエンハンサーとプレインキュベーションされているかどうかに関係なく）またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔによって感染した。感染後２４、４８、７２、９７時間で、ＭＳＣによって産生された感染性アデノウイルス粒子が定量化された。結果は、生物学的２連（ｎ＝１）の平均±標準偏差で示される。
【図12】図１２は、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３とエンハンサーを組み合わせることで、ｅＧＦＰの発現が増強されることを示す。ＭＳＣは、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３（それぞれのエンハンサーとプレインキュベートしたもの、またはしないもの）によって、１００、３００、６００、９００、１０００または１００００のｐＭＯＩで形質導入された。ｅＧＦＰ発現は、形質導入の７２時間後にフローサイトメトリーで分析した。結果は、２人のドナー（それぞれ生物学的３連）の平均±標準偏差（ｎ＝２）で示される。
【図13】図１３は、ＭＳＣの形質導入がＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動を阻害しないことを示す。増強分子と組み合わせたＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）を用いて、またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を用いて、非形質導入、または形質導入されたＭＳＣの移動は、Ｂｏｙｄｅｎ－Ｃｈａｍｂｅｒ－Ａｓｓａｙで分析された。移動アッセイを開始してから１８時間後に、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色した。移動した細胞は、ＤＡＰＩで染色した核を数えることで定量化した。結果は、平均±標準偏差で示される。
【図14】図１４は、ＨＡｄＶ５野生型とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１のアミノ酸配列のアラインメントを示したものである。挿入されたリジン残基は太字で示されている。さらに挿入されたアミノ酸はイタリック体で示されている。
【図15】図１５は、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－Ｍ３）を使用した場合、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ－５）と比較していくつかの腫瘍細胞株の形質導入が改善または維持されること、およびＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ（ＨＡｄＶ－５－ΔＣＡＲ）と比較してＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－ΔＣＡＲ－Ｍ３）を使用すると複数の腫瘍細胞株の形質導入が改善することを示す。特定のアデノウイルスベクターを用いて、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ、ＭｉａＰａＣａ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２およびＡ５４９細胞を１０００のｐＭＯＩで形質導入した。形質導入の２４時間後、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。結果は、平均±標準偏差で示される（ｎ＝９）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0014】
第１の態様において、本発明は、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃに関し、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。
【0015】
ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）種Ｃは、６つのタイプ、すなわち、１、２、５、６、５７、８９型を有する。全てのアデノウイルス種Ｃプロトタイプを表す完全なヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録され、入手が可能である：ＨＡｄＶ－Ｃ１（ＡＣ＿００００１７．１）、ＨＡｄＶ－Ｃ２（ＡＣ＿０００００７．１）、ＨＡｄＶ－Ｃ５（ＡＣ＿０００００８．１）、ＨＡｄＶ－Ｃ６（ＦＪ３４９０９６．１）、ＨＡｄＶ－Ｃ５７（ＨＱ００３８１７．１）およびＨＡｄＶ－Ｃ８９（ＭＨ１２１０９７．１）。
【0016】
アデノウイルスは正二十面体形状のカプシドを有する。カプシドの外殻は、ヘキソン、ペントンベース、および繊維の３種類の主要なタンパク質を有する。この３種類のカプシドタンパク質が、アデノウイルスの感染初期に必要な活動の大部分に寄与している。アデノウイルスのヘキソンタンパク質は、カプシドの外殻の大部分を占め、２４０個のホモ三量体を形成して、ウイルスゲノムや関連タンパク質を含むウイルスの大部分をカプシド化する。繊維タンパク質は正２０面体の１２個の頂点からそれぞれ突出しており、ペントンベースは各繊維タンパク質の底部に位置している。
【0017】
アデノウイルスヘキソンタンパク質は、ＨＶＲ１～ＨＶＲ７に指定された７つの超可変領域（ＨＶＲ）を有する。本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は、改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は、配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。換言すると、改変型ＨＶＲ１領域は、配列ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱ（配列ＩＤ番号：１）を有する。配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列は、野生型配列の１３の連続するアミノ酸残基、すなわちＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥ（配列ＩＤ番号：６）にわたるアミノ酸を４つの連続するリジン残基で置き換えることによってＨＡｄＶ５型ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１の野生型アミノ酸配列から誘導されたものである。改変型ＨＶＲ１領域により、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質はそれぞれの野生型アデノウイルスヘキソンタンパク質と異なっている。
【0018】
改変型ＨＶＲ１領域は、配列ＩＤ番号：１のＮ末端またはＣ末端に位置する追加のアミノ酸を有することもできる。典型的には、改変型ＨＶＲ１領域は、配列ＩＤ番号：１のＣ末端に位置し、それぞれの野生型アミノ酸に対応する５つの追加のアミノ酸を有する。
【0019】
本発明は、改変型ＨＶＲ１領域を有する改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質において、前記改変型ＨＶＲ１領域が配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列を有し、それにより改善された特性を有するアデノウイルスをもたらすという発見に基づくものである。重要なことは、ＨＶＲ１領域の他の類似の修飾では、改善された特性が観察され得なかったことである。
【0020】
本発明者らは、それぞれがヘキソンタンパク質に異なるタイプの改変型ＨＶＲ１領域を有する、６つの改変型（変異型）アデノウイルスベクターを作製することに着手した（図１Ｂ）。すべての変異体は、ウイルス粒子の表面負電荷を減少させる目的で設計された。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３と名付けられた変異体は、配列ＩＤ番号：１の配列を有する改変型ＨＶＲ１領域を有する（図１Ａ）。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の改変型ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域の完全な配列は、ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ（配列ＩＤ番号：４３）である。
【0021】
本発明者らは、ＨＶＲ１領域の特定の改変が、変異ウイルスベクターの産生を実行不可能にすることを見出した。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６と名付けられた変異ベクターの産生は、実現不可能であった。
【0022】
さらに、それぞれヘキソンタンパク質に異なるタイプの改変型ＨＶＲ１領域を有するＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９（図１４）と名付けたさらに３つの改変型（変異）アデノウイルスベクターの産生も不可能であることが判明した。
【0023】
さらに本発明者らは、負に帯電したＨＶＲ１ループを削除すると（変異型ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１）、ウイルス粒子の負の表面電荷がわずかに減少するのみであることを見出した。変異型ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２の場合、４つのアスパラギン酸をリジンに置換すると、さらに負の表面電荷が減少した。しかし、興味深いことに、配列ＩＤ番号：１の改変型ＨＶＲ１領域を有するＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３は、ＨＡｄＶ５野生型、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２と比較して、負の表面電荷が有意に減少していることが示された。
【0024】
驚くべきことに、本発明者らはさらに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３が、ＨＡｄＶ５野生型、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２と比較して、ヒト血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を介したＣＡＲ陰性細胞の形質導入の有意な減少を示すことを見いだした。ＦＸのＨＡｄＶ５への結合は、肝細胞の形質導入を媒介するため、粒子の隔離を誘発する。これは、ＨＡｄＶの全身投与後に、例えば腫瘍に効率的にＨＡｄＶを送達するための大きな障害の１つである。本発明のアデノウイルスは、この障害を克服している。一方、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２は、ＨＶＲ１領域の修飾がＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３と類似しているにもかかわらず、ＦＸ結合の減少は見られなかった。
【0025】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３へのＦＸの結合が有意に減少し、それによってＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の肝細胞の形質導入が減少したことは、予想外の発見であった。Ａｌｂａら（Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００９）によると、ＦＸとＨＡｄＶ５カプシドの相互作用は、アデノウイルスヘキソンタンパク質のＨＶＲ５およびＨＶＲ７との結合を介して行われるとのことである。また、ＦＸとアデノウイルスのヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、ＨＶＲ７との相互作用も報告されている。一方、ＨＶＲ１がＦＸの結合に果たす役割は知られておらず、期待もされていなかった。したがって、アデノウイルスヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域の修飾がＦＸ結合に影響を与えるというのは、驚くべき発見である。重要なことは、ＦＸ結合に影響を与えるためには、ＨＶＲ１領域の修飾の種類が決定的であるということである。このことは、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２は、ＨＶＲ１領域の修飾がＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３と類似しているにもかかわらず、ＦＸ結合の減少を示さなかったという事実により明らかである。
【0026】
より具体的には、４つまたは６つのリジン残基の数を導入するだけでは十分でない場合があることが、本発明者らの知見から判明している。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４では、５つのグルタミン酸残基と１つのアスパラギン酸残基がリジン残基で置換されていた。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４は実行可能ではなかった。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２では、４つのアスパラギン酸残基がリジン残基に置換されていた。しかし、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２はＦＸ結合の減少を示さなかった。
【0027】
本発明者らの発見は、ＦＸ結合の低下が、連続して配置された４つのリジン残基が導入されたＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３についてのみ観察されることを示している。したがって、調査結果は、４つの連続したリジン残基を導入することが必要であることを示している。
【0028】
同様に、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１のように、リジン残基を導入せずにＨＶＲ１領域の１３のアミノ酸のストレッチを削除するだけでは、ＦＸ結合に影響を与えるには十分でないことが、本発明者らの知見から判明した。
【0029】
さらに、本発明者らは、本発明のアデノウイルスがまた、例えば全身性ＨＡｄＶ投与後の腫瘍への効率的なＨＡｄＶ送達するための別の障害、すなわち天然ＩｇＭ抗体による中和を克服することを見出した。ＦＸ結合の減少も示すＨＡｄＶ５－ΔＦＸ粒子は、ヒトとマウスの両方の血漿と培養すると、天然のＩｇＭによってほぼ完全に中和されたので、この発見は予想外であった。しかし、興味深いことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３はＨＡｄＶ５－ΔＦＸと同程度のＦＸ結合の低下を示すにもかかわらず、ヒトまたはマウスの血漿サンプルと培養してもこの効果は観察されなかった。このように、本発明者らは、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の改変型ＨＶＲ１領域によって、ＦＸシールドを欠くベクター粒子が天然のＩｇＭから逃れることを可能にすることを示した。これは、ＨＡｄＶの全身、特に静脈内投与後の別の障壁である赤血球への本発明のアデノウイルスのＩｇＭ媒介結合を防ぐことにもなる。
【0030】
ＨＡｄＶを効率的に全身投与するための別の問題は、クッパー細胞と呼ばれる肝臓に存在するマクロファージである。クッパー細胞は細胞表面にスカベンジャー受容体を持ち、これが負に帯電した分子と結合して捕捉することにより、ＨＡｄＶを取り込ませる。マウスマクロファージによる取り込みは、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の３つの変異ベクターすべてにおいてＨＡｄＶ５野生型に比べて著しく減少したが、その影響はＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３において最も顕著に見られた。
【0031】
まとめると、本発明のアデノウイルスは、これまでに直面したＨＡｄＶの全身投与に関する複数の障壁を克服する。したがって、本発明のアデノウイルスは、全身投与に特に有用である。
【0032】
さらに、本発明のアデノウイルスは、それぞれのＨＡｄＶ野生型と比較して改善されているかまたは類似している腫瘍細胞の形質導入効率を有することがさらに見出された。したがって、本発明のアデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとしての利用にも特に有用である。
【0033】
本明細書で使用される用語「細胞の形質導入」は、アデノウイルスを用いて１つまたは複数の核酸を細胞に導入する工程を意味する。アデノウイルスは、典型的には、適切なパッケージング細胞によって産生された組換えアデノウイルスである。組換えアデノウイルスによる細胞の形質導入の重要な用途は、標的細胞、例えば、遺伝子治療中の患者の標的細胞への１つ以上の遺伝子のウイルス媒介送達である。
【0034】
本明細書で使用される用語「形質導入効率」は、細胞の形質導入後に、アデノウイルスによって正常に形質導入された標的細胞の割合またはパーセンテージを意味する。
【0035】
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、アデノウイルスによって形質導入（感染）される細胞を意味する。
【0036】
本発明の基礎となる研究においてＨＡｄＶ５が使用されたとしても、本発明はＨＡｄＶ５に限定されるものではない。本発明者らの発見は、同様に、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有する全てのＨＡｄＶ種Ｃ型に適用され、ここで、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は、配列ＩＤ番号：１の配列を有する改変型ＨＶＲ１領域を有する。
【0037】
好ましい実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス５型である。アデノウイルス５型は、本明細書では、ＨＡｄＶ５型、ＨＡｄＶ－Ｃ５、ＨＡｄＶ－５またはＨＡｄＶ５とも称される。ＨＡｄＶ５型に基づくウイルスベクターは、遺伝子治療研究において最も一般的に使用されるベクターに属する。これらは、特に癌治療のための腫瘍溶解性アデノウイルスとして、前臨床および臨床の両方で長年にわたって広範囲に研究されてきた。配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列は、ＨＡｄＶ５型ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域の野生型アミノ酸配列の一部に由来するものである。
【0038】
別の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス１型、２型、６型、５７型、または８９型である。
【0039】
好ましい実施形態では、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は、未修飾（野生型）のＨＶＲ５および／またはＨＶＲ７領域を有する。
【0040】
好ましい実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルスベクターまたは腫瘍溶解性アデノウイルスである。
【0041】
本明細書で使用される用語「アデノウイルスベクター」は、複製欠損型アデノウイルスベクターを意味する。アデノウイルスに基づき、異なる複製欠損ベクタータイプが存在する。アデノウイルス（Ａｄ）ベクターは、通常、少なくともＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の欠失を有し、したがって、ヒト細胞において複製欠損性である。産生は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を発現し、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子が染色体に組み込まれているヒト相補性細胞株で行われる。例えば、デルタＥ１ Ａｄベクター（Ｅ１－欠失Ａｄベクターまたは第１世代Ａｄベクターとも呼ばれる）は、実験ツールとして、前臨床研究開発、臨床研究、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種の文脈での製品開発で広く使用されている。このベクター型は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質をコードするＥ１領域を除去することにより、複製欠損にしたものです。さらに、このベクター型にはＥ３領域が欠失されている場合もある。第２世代Ａｄベクターは、Ｅ１遺伝子の欠失（および任意にＥ３領域の欠失）に加えて、Ｅ２遺伝子および／またはＥ４遺伝子の欠失を有する。高容量Ａｄ（ＨＣ－Ａｄ）ベクター（ヘルパー依存性Ａｄベクターとも呼ばれる）では、すべてのウイルスコード配列が目的の導入遺伝子で置き換えられる。
【0042】
アデノウイルスベクターは通常、プロモーター配列の制御下で、タンパク質をコードするＲＮＡ、あるいはタンパク質をコードしないＲＮＡ、例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのノンコーディングＲＮＡをコードするＲＮＡが発現する発現カセットを運ぶ。
【0043】
本明細書で使用される用語「腫瘍溶解性アデノウイルス」は、複製コンピテントアデノウイルスを指す。複製コンピテントアデノウイルスは、主に癌、特に固形癌の治療のために臨床開発されている。これらのウイルスは、腫瘍細胞内で増殖し、腫瘍細胞を破壊する。安全な臨床使用に関しては、腫瘍選択的複製により、非腫瘍性の健康な組織への損傷を低減または防止することが考えられている。そのため、条件付き複製コンピテントアデノウイルスとも呼ばれている。腫瘍選択的活性を達成するために、多くの異なる戦略が追求されてきた。一般的な戦略は、Ｅ１Ａ（デルタ－２４と呼ばれる）のＲｂ結合部位の欠失に関するもので、腫瘍細胞ではアデノウイルスの転写因子Ｅ２Ｆ依存性複製をもたらすが、非腫瘍細胞では起こらないというものであった。他の戦略は、腫瘍または組織特異的な制御プロモーターエレメントを使用して、特定の細胞型に必須のアデノウイルス遺伝子（例えばＥ１Ａ）の発現を制御することに依存するものである。全体として、腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌治療のための有望なツールである。
【0044】
以上のように、本発明のアデノウイルスは、それぞれのＨＡｄＶ野生型と比較して改善されているかまたは類似している腫瘍細胞の形質導入効率を有することが見出された。したがって、本発明のアデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとしての利用に特に有用である。
【0045】
好ましい実施形態では、アデノウイルスは、導入遺伝子を有する。本明細書で使用される用語「導入遺伝子」は、アデノウイルスにとって非天然であり、導入遺伝子を有するアデノウイルスで標的細胞を形質導入することによって標的細胞に送達される遺伝子または遺伝物質を指す。好ましい実施形態では、アデノウイルスは、１つまたはいくつかの導入遺伝子、好ましくは２つまたは３つの導入遺伝子を有する。
【0046】
好ましい実施形態において、カプシドは、少なくとも１つの追加のカプシド修飾を有する。追加のカプシド修飾は、例えば、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質および／またはアデノウイルス繊維タンパク質、ペントン基タンパク質またはマイナーカプシドタンパク質ＩＸなどの異なるアデノウイルスカプシドタンパク質に存在することができる。特性が変化したアデノウイルスを得るために、これらのタンパク質にいくつかの修飾を導入することは知られている。
【0047】
好ましい実施形態では、追加のカプシド修飾は、改変型アデノウイルス繊維タンパク質である。好ましい実施形態において、改変型アデノウイルス繊維タンパク質は、繊維タンパク質をコードするウイルス遺伝子の遺伝子改変による繊維タンパク質のＣＡＲ結合部位の切除のために、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）結合を欠いている。ＣＡＲ結合の欠損により、ＨＡｄＶの赤血球への結合が阻害されるため、特に静脈内投与時に赤血球によるウイルス粒子の封じ込めを防止することができる。したがって、配列ＩＤ番号：１の配列を有する改変型ＨＶＲ１領域を有する改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質と、ＣＡＲ結合を欠く改変型アデノウイルス繊維タンパク質の両方を用いることにより、肝細胞との非標的相互作用、天然ＩｇＭ抗体との非標的相互作用、および赤血球とのＩｇＭまたはＣＡＲ媒介非標的相互作用がないアデノウイルスを得ることができる。このようなアデノウイルスは、全身投与に特に有用である。
【0048】
第２の態様において、本発明は、ヒト疾患を治療または予防するために使用するための本発明のアデノウイルスに関する。上述したように、本発明のアデノウイルスは、全身投与に特に有用である。したがって、本発明のアデノウイルスは、ヒト疾患を治療または予防するのに使用するのに特に好適である。
【0049】
好ましい実施形態では、疾患は、遺伝子治療によって治療または予防される。本明細書で使用される用語「遺伝子治療」は、疾患を治療または予防するための患者の細胞への核酸の治療的送達を意味する。核酸は、形質導入された細胞によって発現される、例えば、治療用タンパク質などの治療用分子をコードする。
【0050】
好ましい実施形態では、疾患は、遺伝的ワクチン接種によって治療または予防される。本明細書で使用される用語「遺伝子ワクチン接種」は、疾患に対して対象を保護するため、または既存の疾患を治療するために、保護または治療免疫学的応答を生成するために、対象の細胞への核酸の送達を指す。核酸は、形質導入された細胞によって発現され、免疫学的応答を誘導する免疫原または抗原をコードする。
【0051】
好ましい実施形態では、疾患は癌である。上述のように、腫瘍溶解性アデノウイルスは、癌を治療するための有望なツールであり、本発明のアデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとして利用するために特に有用である。
【0052】
第３の態様において、本発明は、ヒトアデノウイルス種Ｃの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする核酸に関し、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、改変型ＨＶＲ１領域は配列ＩＤ番号：１の配列を有する。
【0053】
好ましい実施形態において、核酸は、配列ＩＤ番号：２の配列を有する。
【0054】
さらなる態様において、本発明は、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）または腫瘍細胞を形質導入するための、本発明によるアデノウイルスの使用に関するものである。
【0055】
間葉系幹細胞とも呼ばれる間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、腫瘍に移動する能力を自然に備えている。したがって、アデノウイルスを腫瘍組織に運ぶための興味深い担体細胞である。形質導入されたＭＳＣは、ウイルス粒子を隔離機構から隠し、細胞内ウイルス複製によりウイルス量を増加させ、新たに生成された粒子が遊離される腫瘍部位にそれらを輸送する。しかし、一般に使用されているＨＡｄＶ５型野生型ベクターでは、ＭＳＣはほとんど形質導入されない。驚くべきことに、本発明者らは、本発明によるアデノウイルスを使用した場合、ＨＡｄＶベクターによるＭＳＣの形質導入が大幅に促進されることを見いだした。さらに、本発明者らは、本発明によるアデノウイルスでＭＳＣを形質導入すると、野生型ＨＡｄＶで形質導入した場合と比較して、ＭＳＣにおけるアデノウイルスの複製が改善されることを見出した。本発明者らはさらに、ＭＳＣの移動挙動が、本発明によるアデノウイルスによるＭＳＣの形質導入によって、影響を受けないことを確認した。したがって、本発明に係るアデノウイルスは、ＭＳＣを形質導入するために特に有用である。
【0056】
好ましい実施形態において、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。
【0057】
以上のように、本発明のアデノウイルスは、それぞれのＨＡｄＶ野生型と比較して、腫瘍細胞の形質導入効率が向上しているか、または同程度であることが判明した。したがって、本発明のアデノウイルスは、腫瘍細胞の形質導入にも有用である。
【0058】
好ましい実施形態において、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。
【0059】
好ましい実施形態では、アデノウイルスは、ＭＳＣを形質導入するための形質導入エンハンサーと組み合わせて使用される。本発明者らは、本発明によるアデノウイルスを用いたＭＳＣの形質導入効率は、形質導入エンハンサーを用いることによりさらに向上することを見出した。
【0060】
好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサジメトリン、ポリ－Ｌ－リジンおよびラクトフェリンからなる群から選択される。
【0061】
好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミンまたは臭化ヘキサジメトリンである。
【0062】
さらに好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは凝固第Ｘ因子である。
【0063】
さらなる態様において、本発明は、ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関し、前記方法は、
複数のＭＳＣｓを本発明によるアデノウイルスと接触させる工程
を有する。
複数のＭＳＣｓを本発明によるアデノウイルスと接触させる工程
を有する。
【0064】
上述したように、本発明のアデノウイルスは、ＭＳＣを形質導入するのに特に有用である。これは、腫瘍組織へのアデノウイルスの担体としてＭＳＣを使用するための道を開くものである。
【0065】
好ましい実施形態において、複数のＭＳＣは、さらに、形質導入エンハンサーと接触され、前記形質導入エンハンサーは、好ましくは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサジメトリン、ポリ－Ｌ－リジンおよびラクトフェリンからなる群から選択される。
【0066】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる形質導入されたＭＳＣに関するものである。
【0067】
さらなる態様において、本発明は、疾患の治療に使用するための、本発明の形質導入されたＭＳＣに関する。
【0068】
好ましい実施形態において、疾患は、ヒト疾患である。
【0069】
好ましい実施形態では、疾患は、遺伝子治療によって治療される。
【0070】
好ましい実施形態では、疾患は細胞療法によって治療される。本明細書で使用される用語「細胞療法」は、疾患を治療するために細胞材料を患者に治療的に送達することを意味する。細胞材料は、一般に、本発明の方法によって得ることができる形質導入されたＭＳＣのような、無傷の生きた細胞である。
【0071】
さらに開示されるのは、腫瘍細胞を形質導入するためのｉｎ ｖｉｖｏの方法であり、前記方法は、
複数の腫瘍細胞と本発明によるアデノウイルスを接触させる工程
を有する。
複数の腫瘍細胞と本発明によるアデノウイルスを接触させる工程
を有する。
【0072】
さらに開示されるのは、腫瘍細胞を形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であり、前記方法は、
複数の腫瘍細胞と本発明によるアデノウイルスを接触させる工程
を有する。
複数の腫瘍細胞と本発明によるアデノウイルスを接触させる工程
を有する。
【0073】
上述したように、本発明のアデノウイルスは、腫瘍細胞の形質導入に特に有用である。
【0074】
好ましい実施形態において、複数の腫瘍細胞は、さらに、形質導入エンハンサーと接触され、前記形質導入エンハンサーは、好ましくは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサジメトリン、ポリ－Ｌ－リジンおよびラクトフェリンから成る群から選択される。形質導入エンハンサーを使用することにより、本発明のアデノウイルスによる腫瘍細胞の導入効率がさらに向上する。
【0075】
さらに、本開示による腫瘍細胞を形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法によって得ることができる形質導入腫瘍細胞も開示される。
【0076】
さらに開示されるのは、配列ＩＤ番号：３の改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルスである。
【0077】
配列ＩＤ番号：３の改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列は、野生型配列のＨＶＲ１領域における１３の連続したアミノ酸残基を４つの連続したリジン残基に置き換えることによって、ＨＡｄＶ５型ヘキソンタンパク質の野生型アミノ酸配列から誘導される。配列ＩＤ番号：３の改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は、配列ＩＤ番号：１の配列を有する改変型ＨＶＲ１領域を有する。したがって、配列ＩＤ番号：３の改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質の存在は、アデノウイルスヘキソンに改良された特性を与える。より具体的には、上述したように、そのようなアデノウイルスは、全身投与に特に有用である。
【0078】
好ましい実施形態において、アデノウイルスは、アデノウイルス種Ｃ、好ましくはアデノウイルス５型である。
【0079】
さらに開示されるのは、改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質を有するカプシドを有するヒトアデノウイルス種Ｃであり、前記改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質は改変型ＨＶＲ１領域を有し、前記改変型ＨＶＲ１領域は３～８個の連続したリジンまたはアルギニン残基を有する。
【0080】
配列ＩＤ番号：１の配列を有する改変型ＨＶＲ１領域は、４つの連続したリジン残基を有する。４つの連続したリジン残基がＨＶＲ１領域の配列ＩＤ番号：１における位置とは異なる位置に挿入される場合にも、それぞれ改変型ヘキソンタンパク質を有するアデノウイルスに見られる効果が得られると期待できる。さらに、改変型ＨＶＲ１領域が３～８個の連続したリジン残基を有する場合にも、同様に効果が得られると期待できる。アルギニン残基は、リジン残基と化学的に類似した性質、特に正電荷を有するので、改変型ＨＶＲ１領域が３～８個の連続したアルギニン残基を有する場合にも、同様に効果が得られるとさらに期待できる。
【0081】
好ましい実施形態において、３～８個の連続するリジンまたはアルギニン残基は、負に帯電していない１つまたはいくつかのアミノ酸残基に直接隣接している。直接隣接するアミノ酸残基は、３～８個の連続するリジンまたはアルギニン残基のＮ－末端および／またはＣ－末端に位置するアミノ酸残基である。
【0082】
好ましい実施形態では、改変型ＨＶＲ１領域は、４～８個の連続したリジンまたはアルギニン残基を有する。
【0083】
好ましい実施形態において、改変型ＨＶＲ１領域は、３～８個、好ましくは４～８個の連続したリジン残基を有する。
【0084】
さらなる好ましい実施形態において、改変型ＨＶＲ１領域は、４つの連続したリジン残基を有する。
【0085】
さらなる態様において、本開示は、ＭＳＣを形質導入するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関し、前記方法は、
複数のＭＳＣをアデノウイルスおよび形質導入エンハンサーと接触させる工程であって、前記形質導入エンハンサーが凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサジメトリン、ポリＬ－リジンおよびラクトフェリンからなる群から選択される、接触させる工程
を有する。
複数のＭＳＣをアデノウイルスおよび形質導入エンハンサーと接触させる工程であって、前記形質導入エンハンサーが凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、臭化ヘキサジメトリン、ポリＬ－リジンおよびラクトフェリンからなる群から選択される、接触させる工程
を有する。
【0086】
コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を発現していないＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏではアデノウイルスにほとんど感染しない。本発明者らは、形質導入エンハンサーを用いることで、ＭＳＣへのアデノウイルスの導入が著しく促進されることを見出した。これにより、腫瘍組織へのアデノウイルスの担体としてＭＳＣを使用することが容易になる。本発明者らは、さらに、形質導入エンハンサーの使用は、ＭＳＣにおけるアデノウイルスの複製を改善することにつながり、これは、アデノウイルスの担体としてのＭＳＣの医療上の使用にも利益をもたらすことを見出した。さらに、本発明者らは、ＭＳＣの移動挙動が、形質導入エンハンサーの使用によって影響を受けないことを確認した。
【0087】
好ましい実施形態において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス種Ｃであり、前記アデノウイルスは、好ましくは、アデノウイルス５型である。
【0088】
好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは、凝固第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミンまたは臭化ヘキサジメトリンである。
【0089】
さらに好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは、スペルミジンまたはスペルミンである。本発明者らは、スペルミジンまたはスペルミンが形質導入エンハンサーとして使用された場合に、アデノウイルスによるＭＳＣの増強された形質導入が最も顕著であることを見出した。
【0090】
別のさらに好ましい実施形態では、形質導入エンハンサーは、凝固第Ｘ因子である。本発明者らは、それぞれの組換えアデノウイルスを導入したＭＳＣによる治療用タンパク質の発現およびその後の分泌が、形質導入エンハンサーとして凝固第Ｘ因子の存在下で有意に増強されることを見出した。
【0091】
好ましい実施形態では、アデノウイルスは、導入遺伝子を有する。
【0092】
配列
ＨＡｄＶ５ヘキソンのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ３３９８６５．１、１８，８４２－２１，７００位にしたがって示されている。ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）は、Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１２にしたがって、それぞれ太字で示される。
ＨＡｄＶ５野生型ヘキソンのアミノ酸配列：
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶ
ＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹ
ＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＰＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤ
ＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦＧＱＡＰＹＳＧＩＮＩＴＫＥＧＩＱＩＧＶＥＧＱＴＰＫＹＡＤＫＴＦ
ＱＰＥＰＱＩＧＥＳＱＷＹＥＴＥＩＮＨＡＡＧＲＶＬＫＫＴＴＰＭＫＰＣＹＧＳＹＡＫＰＴＮＥＮＧＧＱＧＩＬ
ＶＫＱＱＮＧＫＬＥＳＱＶＥＭＱＦＦＳＴＴＥＡＡＡＧＮＧＤＮＬＴＰＫＶＶＬＹＳＥＤＶＤＩＥＴＰＤＴＨＩ
ＳＹＭＰＴＩＫＥＧＮＳＲＥＬＭＧＱＱＳＭＰＮＲＰＮＹＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＹＮＳＴＧＮＭＧＶＬＡＧ
ＱＡＳＱＬＮＡＶＶＤＬＱＤＲＮＴＥＬＳＹＱＬＬＬＤＳＩＧＤＲＴＲＹＦＳＭＷＮＱＡＶＤＳＹＤＰＤＶＲＩ
ＩＥＮＨＧＴＥＤＥＬＰＮＹＣＦＰＬＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＥＮＧＷＥＫＤＡＴＥＦＳＤＫＮ
ＥＩＲＶＧＮＮＦＡＭＥＩＮＬＮＡＮＬＷＲＮＦＬＹＳＮＩＡＬＹＬＰＤＫＬＫＹＳＰＳＮＶＫＩＳＤＮＰＮＴ
ＹＤＹＭＮＫＲＶＶＡＰＧＬＶＤＣＹＩＮＬＧＡＲＷＳＬＤＹＭＤＮＶＮＰＦＮＨＨＲＮＡＧＬＲＹＲＳＭＬＬ
ＧＮＧＲＹＶＰＦＨＩＱＶＰＱＫＦＦＡＩＫＮＬＬＬＬＰＧＳＹＴＹＥＷＮＦＲＫＤＶＮＭＶＬＱＳＳＬＧＮＤ
ＬＲＶＤＧＡＳＩＫＦＤＳＩＣＬＹＡＴＦＦＰＭＡＨＮＴＡＳＴＬＥＡＭＬＲＮＤＴＮＤＱＳＦＮＤＹＬＳＡＡ
ＮＭＬＹＰＩＰＡＮＡＴＮＶＰＩＳＩＰＳＲＮＷＡＡＦＲＧＷＡＦＴＲＬＫＴＫＥＴＰＳＬＧＳＧＹＤＰＹＹＴ
ＹＳＧＳＩＰＹＬＤＧＴＦＹＬＮＨＴＦＫＫＶＡＩＴＦＤＳＳＶＳＷＰＧＮＤＲＬＬＴＰＮＥＦＥＩＫＲＳＶＤ
ＧＥＧＹＮＶＡＱＣＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰ
ＭＳＲＱＶＶＤＤＴＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＬＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＦＰＹＰＬ
ＩＧＫＴＡＶＤＳＩＴＱＫＫＦＬＣＤＲＴＬＷＲＩＰＦＳＳＮＦＭＳＭＧＡＬＴＤＬＧＱＮＬＬＹＡＮＳＡＨＡ
ＬＤＭＴＦＥＶＤＰＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡ
ＴＴ
（配列ＩＤ番号：５）
ＨＡｄＶ５ヘキソンのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ３３９８６５．１、１８，８４２－２１，７００位にしたがって示されている。ヘキソンタンパク質の超可変領域１（ＨＶＲ１）は、Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１２にしたがって、それぞれ太字で示される。
ＨＡｄＶ５野生型ヘキソンのアミノ酸配列：
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶ
ＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹ
ＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＰＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤ
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ＱＰＥＰＱＩＧＥＳＱＷＹＥＴＥＩＮＨＡＡＧＲＶＬＫＫＴＴＰＭＫＰＣＹＧＳＹＡＫＰＴＮＥＮＧＧＱＧＩＬ
ＶＫＱＱＮＧＫＬＥＳＱＶＥＭＱＦＦＳＴＴＥＡＡＡＧＮＧＤＮＬＴＰＫＶＶＬＹＳＥＤＶＤＩＥＴＰＤＴＨＩ
ＳＹＭＰＴＩＫＥＧＮＳＲＥＬＭＧＱＱＳＭＰＮＲＰＮＹＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＹＮＳＴＧＮＭＧＶＬＡＧ
ＱＡＳＱＬＮＡＶＶＤＬＱＤＲＮＴＥＬＳＹＱＬＬＬＤＳＩＧＤＲＴＲＹＦＳＭＷＮＱＡＶＤＳＹＤＰＤＶＲＩ
ＩＥＮＨＧＴＥＤＥＬＰＮＹＣＦＰＬＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＥＮＧＷＥＫＤＡＴＥＦＳＤＫＮ
ＥＩＲＶＧＮＮＦＡＭＥＩＮＬＮＡＮＬＷＲＮＦＬＹＳＮＩＡＬＹＬＰＤＫＬＫＹＳＰＳＮＶＫＩＳＤＮＰＮＴ
ＹＤＹＭＮＫＲＶＶＡＰＧＬＶＤＣＹＩＮＬＧＡＲＷＳＬＤＹＭＤＮＶＮＰＦＮＨＨＲＮＡＧＬＲＹＲＳＭＬＬ
ＧＮＧＲＹＶＰＦＨＩＱＶＰＱＫＦＦＡＩＫＮＬＬＬＬＰＧＳＹＴＹＥＷＮＦＲＫＤＶＮＭＶＬＱＳＳＬＧＮＤ
ＬＲＶＤＧＡＳＩＫＦＤＳＩＣＬＹＡＴＦＦＰＭＡＨＮＴＡＳＴＬＥＡＭＬＲＮＤＴＮＤＱＳＦＮＤＹＬＳＡＡ
ＮＭＬＹＰＩＰＡＮＡＴＮＶＰＩＳＩＰＳＲＮＷＡＡＦＲＧＷＡＦＴＲＬＫＴＫＥＴＰＳＬＧＳＧＹＤＰＹＹＴ
ＹＳＧＳＩＰＹＬＤＧＴＦＹＬＮＨＴＦＫＫＶＡＩＴＦＤＳＳＶＳＷＰＧＮＤＲＬＬＴＰＮＥＦＥＩＫＲＳＶＤ
ＧＥＧＹＮＶＡＱＣＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰ
ＭＳＲＱＶＶＤＤＴＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＬＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＦＰＹＰＬ
ＩＧＫＴＡＶＤＳＩＴＱＫＫＦＬＣＤＲＴＬＷＲＩＰＦＳＳＮＦＭＳＭＧＡＬＴＤＬＧＱＮＬＬＹＡＮＳＡＨＡ
ＬＤＭＴＦＥＶＤＰＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡ
ＴＴ
（配列ＩＤ番号：５）
【0093】
ＨＡｄＶ５野生型ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４２）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４２）
【0094】
本発明のアデノウイルスの改変型ヘキソンタンパク質のアミノ酸配列、すなわちＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列：
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶ
ＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹ
ＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＰＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫ
ＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦＧＱＡＰＹＳＧＩＮＩＴＫＥＧＩＱＩＧＶＥＧＱＴＰＫＹＡＤＫＴＦＱＰＥＰＱＩＧＥＳ
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ＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰＭＳＲＱＶＶＤＤＴ
ＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＬＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＦＰＹＰＬＩＧＫＴＡＶＤＳＩ
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ＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡＴＴ
（配列ＩＤ番号：３）
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶ
ＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹ
ＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＰＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫ
ＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦＧＱＡＰＹＳＧＩＮＩＴＫＥＧＩＱＩＧＶＥＧＱＴＰＫＹＡＤＫＴＦＱＰＥＰＱＩＧＥＳ
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ＦＤＳＩＣＬＹＡＴＦＦＰＭＡＨＮＴＡＳＴＬＥＡＭＬＲＮＤＴＮＤＱＳＦＮＤＹＬＳＡＡＮＭＬＹＰＩＰＡＮ
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ＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰＭＳＲＱＶＶＤＤＴ
ＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＬＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＦＰＹＰＬＩＧＫＴＡＶＤＳＩ
ＴＱＫＫＦＬＣＤＲＴＬＷＲＩＰＦＳＳＮＦＭＳＭＧＡＬＴＤＬＧＱＮＬＬＹＡＮＳＡＨＡＬＤＭＴＦＥＶＤＰ
ＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡＴＴ
（配列ＩＤ番号：３）
【0095】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４３）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４３）
【0096】
ＨＡｄＶ５ヘキソンの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ３３９８６５．１、１８，８４２－２１，７００位にしたがって示されている。ヘキソンのＨＶＲ１は、Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１２にしたがって、それぞれ太字で示されている。挿入されたリジン残基をコードするヌクレオチドは、大文字で示されている。
【0097】
ＨＡｄＶ５野生型ヘキソンのヌクレオチド配列：
（配列ＩＤ番号：４）
【0098】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンのヌクレオチド配列：
（配列ＩＤ番号：２）
【0099】
ＨＡｄＶ５野生型ヘキソンのＨＶＲ１のヌクレオチド配列：
ｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａｇａａｇａａｇａｇｇａｃｇａｔｇａｃａａｃｇａａｇａｃｇａａｇｔａｇａｃｇａｇｃａａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａａａａａａｃｔｃａｃｇｔａｔｔｔ
（配列ＩＤ番号：４４）
ｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａｇａａｇａａｇａｇｇａｃｇａｔｇａｃａａｃｇａａｇａｃｇａａｇｔａｇａｃｇａｇｃａａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａａａａａａｃｔｃａｃｇｔａｔｔｔ
（配列ＩＤ番号：４４）
【0100】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンのＨＶＲ１のヌクレオチド配列：
ｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧｃａａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａａａａａａｃｔｃａｃｇｔａｔｔｔ
（配列ＩＤ番号：４５）
ｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧｃａａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａａａａａａｃｔｃａｃｇｔａｔｔｔ
（配列ＩＤ番号：４５）
【0101】
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４６）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４６）
【0102】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＫＫＫＮＥＫＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４７）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＥＥＥＫＫＫＮＥＫＥＶＤＥＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４７）
【0103】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４８）
ＤＥＡＡＴＡＬＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４８）
【0104】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４３）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４３）
【0105】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４８）
ＤＥＡＡＴＡＬＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：４８）
【0106】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５１）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５１）
【0107】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５２）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５２）
【0108】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９ヘキソンのＨＶＲ１のアミノ酸配列：
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＧＧＳＧＧＧＳＧＫＫＫＫＫＫＫＫＧＳＧＧＧＳＧＧＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５３）
ＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＧＧＳＧＧＧＳＧＫＫＫＫＫＫＫＫＧＳＧＧＧＳＧＧＱＡＥＱＱＫＴＨＶＦ
（配列ＩＤ番号：５３）
【0109】
ヒトアデノウイルス１型（ＨＡｄＶ１）、２型（ＨＡｄＶ２）、６型（ＨＡｄＶ６）、および５７型（ＨＡｄＶ５７）ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域で、配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列に置き換えられた部分は、以下の通りである（ａａ、アミノ酸）：
ＨＡｄＶ１：ＨＡｄＶ１ヘキソンのａａ １３６－１７３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＧ４８７７８．１）：
ＥＱＥＥＰＴＱＥＭＡＥＥＬＥＤＥＥＥＡＥＥＥＥＡＥＥＥＡＥＡＰＱＡＤＱＫＶＫ
（配列ＩＤ番号：７）
ＨＡｄＶ２：ＨＡｄＶ２ヘキソンのａａ １３６－１７１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ６７４７７．１）：
ＥＱＴＥＤＳＧＲＡＶＡＥＤＥＥＥＥＤＥＤＥＥＥＥＥＥＥＱＮＡＲＤＱＡＴＫ
（配列ＩＤ番号：８）
ＨＡｄＶ６：ＨＡｄＶ６ヘキソンのａａ １３６－１６７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＵ３６７８２．１）
ＥＱＮＥＴＡＱＶＤＡＱＥＬＤＥＥＥＮＥＡＮＥＡＱＡＲＥＱＥＱＡＫ
（配列ＩＤ番号：９）
ＨＡｄＶ５７：ＨＡｄＶ５７ヘキソンのａａ １３６－１６６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＦ８９１５８．１）：
ＤＥＤＤＴＱＶＱＶＡＡＥＤＤＱＤＤＤＥＥＥＥＱＬＰＱＱＲＮＧＫ
（配列ＩＤ番号：１０）
ＨＡｄＶ８９：ＨＡｄＶ８９ヘキソンのａａ １３６－１７２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＺＲ６７１８１）：
ＥＱＴＥＤＳＧＲＡＶＡＥＤＥＥＥＥＥＤＥＤＥＥＥＥＥＥＥＱＮＡＲＤＱＡＴＫ
（配列ＩＤ番号：４９）
ＨＡｄＶ１：ＨＡｄＶ１ヘキソンのａａ １３６－１７３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＧ４８７７８．１）：
ＥＱＥＥＰＴＱＥＭＡＥＥＬＥＤＥＥＥＡＥＥＥＥＡＥＥＥＡＥＡＰＱＡＤＱＫＶＫ
（配列ＩＤ番号：７）
ＨＡｄＶ２：ＨＡｄＶ２ヘキソンのａａ １３６－１７１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ６７４７７．１）：
ＥＱＴＥＤＳＧＲＡＶＡＥＤＥＥＥＥＤＥＤＥＥＥＥＥＥＥＱＮＡＲＤＱＡＴＫ
（配列ＩＤ番号：８）
ＨＡｄＶ６：ＨＡｄＶ６ヘキソンのａａ １３６－１６７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＵ３６７８２．１）
ＥＱＮＥＴＡＱＶＤＡＱＥＬＤＥＥＥＮＥＡＮＥＡＱＡＲＥＱＥＱＡＫ
（配列ＩＤ番号：９）
ＨＡｄＶ５７：ＨＡｄＶ５７ヘキソンのａａ １３６－１６６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＢＦ８９１５８．１）：
ＤＥＤＤＴＱＶＱＶＡＡＥＤＤＱＤＤＤＥＥＥＥＱＬＰＱＱＲＮＧＫ
（配列ＩＤ番号：１０）
ＨＡｄＶ８９：ＨＡｄＶ８９ヘキソンのａａ １３６－１７２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＺＲ６７１８１）：
ＥＱＴＥＤＳＧＲＡＶＡＥＤＥＥＥＥＥＤＥＤＥＥＥＥＥＥＥＱＮＡＲＤＱＡＴＫ
（配列ＩＤ番号：４９）
【0110】
得られた改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【0111】
本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アデノウイルスがアデノウイルス１型のアミノ酸配列（ＨＡｄＶ１－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列）：
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（配列ＩＤ番号：１１）
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（配列ＩＤ番号：１１）
【0112】
本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アデノウイルスがアデノウイルス２型のアミノ酸配列（ＨＡｄＶ２－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列）：
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（配列ＩＤ番号：１２）
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（配列ＩＤ番号：１２）
【0113】
本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アデノウイルスがアデノウイルス６型のアミノ酸配列（ＨＡｄＶ６－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列）：
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（配列ＩＤ番号：１３）
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（配列ＩＤ番号：１３）
【0114】
本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アデノウイルスがアデノウイルス５７型のアミノ酸配列（ＨＡｄＶ５７－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列）：
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（配列ＩＤ番号：１４）
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（配列ＩＤ番号：１４）
【0115】
本発明のアデノウイルスの改変型アデノウイルスヘキソンタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アデノウイルスがアデノウイルス８９型のアミノ酸配列（ＨＡｄＶ８９－Ｍｕｔ３ヘキソンのアミノ酸配列）：
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＳＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＹＡＱＡＰＬＳＧＥＴＩＴＫＳＧＬＱＩＧＳＤＮＡＥＴＱＡＫＰＶＹＡＤＰＳＹＱＰＥＰＱＩＧＥＳＱＷＮＥＡＤＡＮＡＡＧＧＲＶＬＫＫＴＴＰＭＫＰＣＹＧＳＹＡＲＰＴＮＰＦＧＧＱＳＶＬＶＰＤＥＫＧＶＰＬＰＫＶＤＬＱＦＦＳＮＴＴＳＬＮＤＲＱＧＮＡＴＫＰＫＶＶＬＹＳＥＤＶＮＬＥＴＰＤＴＨＬＳＹＫＰＧＫＧＤＥＮＳＫＡＭＬＧＱＱＳＭＰＮＲＰＮＹＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＹＮＳＴＧＮＭＧＶＬＡＧＱＡＳＱＬＮＡＶＶＤＬＱＤＲＮＴＥＬＳＹＱＬＬＬＤＳＩＧＤＲＴＲＹＦＳＭＷＮＱＡＶＤＳＹＤＰＤＶＲＩＩＥＮＨＧＴＥＤＥＬＰＮＹＣＦＰＬＧＧＩＧＶＴＤＴＹＱＡＩＫＡＮＧＮＧＡＧＤＮＧＮＴＴＷＴＫＤＥＴＦＡＴＲＮＥＩＧＶＧＮＮＦＡＭＥＩＮＬＮＡＮＬＷＲＮＦＬＹＳＮＩＡＬＹＬＰＤＫＬＫＹＮＰＴＮＶＥＩＳＤＮＰＮＴＹＤＹＭＮＫＲＶＶＡＰＧＬＶＤＣＹＩＮＬＧＡＲＷＳＬＤＹＭＤＮＶＮＰＦＮＨＨＲＮＡＧＬＲＹＲＳＭＬＬＧＮＧＲＹＶＰＦＨＩＱＶＰＱＫＦＦＡＩＫＮＬＬＬＬＰＧＳＹＴＹＥＷＮＦＲＫＤＶＮＭＶＬＱＳＳＬＧＮＤＬＲＶＤＧＡＳＩＫＦＤＳＩＣＬＹＡＴＦＦＰＭＡＨＮＴＡＳＴＬＥＡＭＬＲＮＤＴＮＤＱＳＦＮＤＹＬＳＡＡＮＭＬＹＰＩＰＡＮＡＴＮＶＰＩＳＩＰＳＲＮＷＡＡＦＲＧＷＡＦＴＲＬＫＴＫＥＴＰＳＬＧＳＧＹＤＰＹＹＴＹＳＧＳＩＰＹＬＤＧＴＦＹＬＮＨＴＦＫＫＶＡＩＴＦＤＳＳＶＳＷＰＧＮＤＲＬＬＴＰＮＥＦＥＩＫＲＳＶＤＧＥＧＹＮＶＡＱＣＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰＭＳＲＱＶＶＤＤＴＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＩＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＶＰＹＰＬＩＧＫＴＡＶＤＳＩＴＱＫＫＦＬＣＤＲＴＬＷＲＩＰＦＳＳＮＦＭＳＭＧＡＬＴＤＬＧＱＮＬＬＹＡＮＳＡＨＡＬＤＭＴＦＥＶＤＰＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡＴＴ
（配列ＩＤ番号：５０）
ＭＡＴＰＳＭＭＰＱＷＳＹＭＨＩＳＧＱＤＡＳＥＹＬＳＰＧＬＶＱＦＡＲＡＴＥＴＹＦＳＬＮＮＫＦＲＮＰＴＶＡＰＴＨＤＶＴＴＤＲＳＱＲＬＴＬＲＦＩＰＶＤＲＥＤＴＡＹＳＹＫＡＲＦＴＬＡＶＧＤＮＲＶＬＤＭＡＳＴＹＦＤＩＲＧＶＬＤＲＧＰＴＦＫＰＹＳＧＴＡＹＮＡＬＡＰＫＧＡＰＮＳＣＥＷＤＥＡＡＴＡＬＥＩＮＬＫＫＫＫＱＡＥＱＱＫＴＨＶＹＡＱＡＰＬＳＧＥＴＩＴＫＳＧＬＱＩＧＳＤＮＡＥＴＱＡＫＰＶＹＡＤＰＳＹＱＰＥＰＱＩＧＥＳＱＷＮＥＡＤＡＮＡＡＧＧＲＶＬＫＫＴＴＰＭＫＰＣＹＧＳＹＡＲＰＴＮＰＦＧＧＱＳＶＬＶＰＤＥＫＧＶＰＬＰＫＶＤＬＱＦＦＳＮＴＴＳＬＮＤＲＱＧＮＡＴＫＰＫＶＶＬＹＳＥＤＶＮＬＥＴＰＤＴＨＬＳＹＫＰＧＫＧＤＥＮＳＫＡＭＬＧＱＱＳＭＰＮＲＰＮＹＩＡＦＲＤＮＦＩＧＬＭＹＹＮＳＴＧＮＭＧＶＬＡＧＱＡＳＱＬＮＡＶＶＤＬＱＤＲＮＴＥＬＳＹＱＬＬＬＤＳＩＧＤＲＴＲＹＦＳＭＷＮＱＡＶＤＳＹＤＰＤＶＲＩＩＥＮＨＧＴＥＤＥＬＰＮＹＣＦＰＬＧＧＩＧＶＴＤＴＹＱＡＩＫＡＮＧＮＧＡＧＤＮＧＮＴＴＷＴＫＤＥＴＦＡＴＲＮＥＩＧＶＧＮＮＦＡＭＥＩＮＬＮＡＮＬＷＲＮＦＬＹＳＮＩＡＬＹＬＰＤＫＬＫＹＮＰＴＮＶＥＩＳＤＮＰＮＴＹＤＹＭＮＫＲＶＶＡＰＧＬＶＤＣＹＩＮＬＧＡＲＷＳＬＤＹＭＤＮＶＮＰＦＮＨＨＲＮＡＧＬＲＹＲＳＭＬＬＧＮＧＲＹＶＰＦＨＩＱＶＰＱＫＦＦＡＩＫＮＬＬＬＬＰＧＳＹＴＹＥＷＮＦＲＫＤＶＮＭＶＬＱＳＳＬＧＮＤＬＲＶＤＧＡＳＩＫＦＤＳＩＣＬＹＡＴＦＦＰＭＡＨＮＴＡＳＴＬＥＡＭＬＲＮＤＴＮＤＱＳＦＮＤＹＬＳＡＡＮＭＬＹＰＩＰＡＮＡＴＮＶＰＩＳＩＰＳＲＮＷＡＡＦＲＧＷＡＦＴＲＬＫＴＫＥＴＰＳＬＧＳＧＹＤＰＹＹＴＹＳＧＳＩＰＹＬＤＧＴＦＹＬＮＨＴＦＫＫＶＡＩＴＦＤＳＳＶＳＷＰＧＮＤＲＬＬＴＰＮＥＦＥＩＫＲＳＶＤＧＥＧＹＮＶＡＱＣＮＭＴＫＤＷＦＬＶＱＭＬＡＮＹＮＩＧＹＱＧＦＹＩＰＥＳＹＫＤＲＭＹＳＦＦＲＮＦＱＰＭＳＲＱＶＶＤＤＴＫＹＫＤＹＱＱＶＧＩＩＨＱＨＮＮＳＧＦＶＧＹＬＡＰＴＭＲＥＧＱＡＹＰＡＮＶＰＹＰＬＩＧＫＴＡＶＤＳＩＴＱＫＫＦＬＣＤＲＴＬＷＲＩＰＦＳＳＮＦＭＳＭＧＡＬＴＤＬＧＱＮＬＬＹＡＮＳＡＨＡＬＤＭＴＦＥＶＤＰＭＤＥＰＴＬＬＹＶＬＦＥＶＦＤＶＶＲＶＨＱＰＨＲＧＶＩＥＴＶＹＬＲＴＰＦＳＡＧＮＡＴＴ
（配列ＩＤ番号：５０）
【0116】
本発明のさらなる態様は、同封の実施例の説明、特に科学的結果によって当業者には明らかになるであろう。
【0117】
実施例
材料および方法
細胞
すべての細胞は、湿度９０％、ＣＯ２ ５％、３７℃で培養し、週２回、指示された分割率で継代した。細胞は、スクレイピングにより剥離されたＪ７７４Ａ．１細胞を除いて、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで剥離した。
材料および方法
細胞
すべての細胞は、湿度９０％、ＣＯ２ ５％、３７℃で培養し、週２回、指示された分割率で継代した。細胞は、スクレイピングにより剥離されたＪ７７４Ａ．１細胞を除いて、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで剥離した。
【0118】
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－１８５；分割率：１：８）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
【0119】
Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ－６７；分割率：１：１０）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
【0120】
ＳＫＯＶ－３細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－７７；分割率：１：３）を、５％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したロズウェルパーク記念研究所１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
【0121】
ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞（ヒト頭頸部扁平上皮癌由来の癌細胞、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｌｉｎｉｃの教授、Ｄｒ．Ｂｒｕｎｎｅｒの好意により提供された、分割率：１：１０）を、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
【0122】
ＭｉａＰａＣａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１４２０，分割率１：７～１：１５）は、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＢＳ、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１ｘペニシリン／ストレプトマイシンで増殖させた。
【0123】
Ｈｕｈ７細胞（ＪＣＲＢ０４０３、分割率１：１０）を、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。
【0124】
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢ－８０６５，分割率１：４～１：７）は、１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充したイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。
【0125】
ヒト間葉系間質細胞（ＭＳＣ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｕｌｍ，ドイツの好意により提供され、Ｆｅｋｅｔｅ，Ｒｏｊｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．に記載のように調製された）を、８％照射プールヒト血小板溶解液（ＰＬ）（Ｆｅｋｅｔｅ， Ｇａｄｅｌｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載のように調製され、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｕｌｍから提供された）および５００単位のヘパリン（Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）を補充したＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）アルファ イーグル最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させた。
【0126】
ウイルスとベクター
複製不能なヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄＶ５）ベクター粒子は、欠失したＥ１領域（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＹ３３９８６５．１、ｎｔ １－４４０とｎｔ ３５２３－３５９３５の配列）を有し、その欠失したＥ１領域に逆向きに挿入されたｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０８５－１）からサブクローン化されたＣＭＶプロモーター駆動の増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）の発現カセットを運搬した。
複製不能なヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄＶ５）ベクター粒子は、欠失したＥ１領域（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＹ３３９８６５．１、ｎｔ １－４４０とｎｔ ３５２３－３５９３５の配列）を有し、その欠失したＥ１領域に逆向きに挿入されたｐＥＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６０８５－１）からサブクローン化されたＣＭＶプロモーター駆動の増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）の発現カセットを運搬した。
【0127】
ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲベクター粒子はさらに、ファイバーノブに点変異（Ｙ→４７７Ａ）を運搬し、ＣＡＲ結合を著しく低下させる（Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0128】
ＨＡｄＶ５－ΔＦＸベクター粒子はさらに、ヘキソンタンパク質の超可変領域（ＨＶＲ）７に点変異（Ｅ→４５１Ｑ）を運搬し、血液凝固第Ｘ因子のベクターカプシドへの結合を消失はさせないが、著しく減少させる（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0129】
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１粒子は、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１の負電荷領域内で１３のアミノ酸欠失（ΔＥＥＥＤＤＤＮＥＤＶＤＥ（配列ＩＤ番号：６）；ｎｔ １９２８０－１９３１８）を運搬し、ＨＡｄＶ５粒子の負の表面電荷を減らした（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0130】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３粒子の場合、ＨＶＲ１内のこれら１３のアミノ酸は、４つのリジン残基で置換された（ＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥ（配列ＩＤ番号：６）→ＫＫＫＫ（配列ＩＤ番号：１５）；ｎｔ １９２８０－１９３１８）。
【0131】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２については、この１３のアミノ酸ストレッチのアスパラギン酸の一部は、リジン残基で置換された（ＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥ（配列ＩＤ番号：６）→ＥＥＥＫＫＫＮＥＫＥＶＤＥ（配列ＩＤ番号：１６）；ｎｔ １９２８９－１９３０６）。
【0132】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４については、ＨＶＲ１内のいくつかの負に帯電したアミノ酸は、リジン残基で置換された（ＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥ（配列ＩＤ番号：１７）→ＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫ（配列ＩＤ番号：１８））。
【0133】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５については、ＨＶＲ１内のいくつかのアミノ酸（ＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥ（配列ＩＤ番号：６）→ＫＫＫＫ（配列ＩＤ番号：１５））、ＨＶＲ５内のいくつかのアミノ酸（ＳＴＴＥＡＡＡＧＮＧＤＮＬＴＰＫ（配列ＩＤ番号：１９）→ＳＴＴＫＡＡＡＧＮＧＫＮＬＴＰＫ（配列ＩＤ番号：２０））、およびＨＶＲ７内のいくつかのアミノ酸（ＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＥＮＧＷＥＫＤＡＴＥＦＳＤＫＮＥＩＲＶＧＮＮＦ（配列ＩＤ番号：２１）→ＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＫＮＧＷＫＫＫＡＴＥＦＳＤＫＮＥＩＲＶＧＮＮＦ（配列ＩＤ番号：２２））はリジン残基で置換された。
【0134】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６については、ＨＶＲ１内のいくつかの負に帯電したアミノ酸（ＥＩＮＬＥＥＥＤＤＤＮＥＤＥＶＤＥＱＡＥ（配列ＩＤ番号：１７）→ＫＩＮＬＫＫＮＫＶＫＱＡＫ（配列ＩＤ番号：１８））、ＨＶＲ５内のいくつかの負に帯電したアミノ酸（ＳＴＴＥＡＡＡＧＮＧＤＮＬＴＰＫ（配列ＩＤ番号：１９）→ＳＴＴＫＡＡＡＧＮＧＫＮＬＴＰＫ（配列ＩＤ番号：２０））、およびＨＶＲ７内のいくつかの負に帯電したアミノ酸（ＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＥＮＧＷＥＫＤＡＴＥＦＳＤＫＮＥＩＲＶＧＮＮＦ（配列ＩＤ番号：２１）→ＧＧＶＩＮＴＥＴＬＴＫＶＫＰＫＴＧＱＫＮＧＷＫＫＫＡＴＥＦＳＤＫＮＥＩＲＶＧＮＮＦ（配列ＩＤ番号：２２））はリジン残基で置換された。
【0135】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７については、ＨＶＲ１内の配列ＩＤ番号：６の１３のアミノ酸は、６つのリジン残基で置換された。
【0136】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８については、ＨＶＲ１内の配列ＩＤ番号：６の１３のアミノ酸は、８つのリジン残基で置換された。
【0137】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９については、ＨＶＲ１内の配列ＩＤ番号：６の１３のアミノ酸は、２４のアミノ酸、すなわちグリシンおよびセリンから選ばれた８つのアミノ酸の柔軟なＧＳ－リンカーによって両側に挟まれた８つのリジン残基のストレッチによって置換された。
【0138】
ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３ベクター粒子については、ＨＶＲ１内の配列ＩＤ番号：６の１３のアミノ酸が４つのリジン残基で置換され、ベクター粒子はさらにファイバーノブに点変異（Ｙ→４７７Ａ）を運搬し、ＣＡＲ結合を著しく減少させる（Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0139】
ＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６ベクターは、ｅＧＦＰ発現カセットの代わりに、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）タンパク質（ヌクレオチドアクセッション ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ４１９９３６．１）をコードするｃＤＮＡをヒトＣＭＶプロモーター制御下でＥ１領域に運搬する。ＴＳＧ－６は、抗炎症活性を有するタンパク質であるため、抗炎症治療薬として使用することができる。
【0140】
複製コンピテント野生型アデノウイルス粒子（ＨＡｄＶ５ｗｔ）は欠失を有さないが、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ（１６４８／１６４９位）の間の非コード領域に順方向に挿入されたｅＧＦＰ発現カセットを運搬する。
【0141】
ベクターとウイルスレスキューおよび産生
複製不能なベクターはＥ１－トランス補体Ｎ５２．Ｅ６細胞で産生され、複製コンピテントウイルスはＡ５４９細胞で産生された。
複製不能なベクターはＥ１－トランス補体Ｎ５２．Ｅ６細胞で産生され、複製コンピテントウイルスはＡ５４９細胞で産生された。
【0142】
ベクターおよびウイルスＤＮＡはそれぞれ、ＳｗａＩ制限酵素消化によって環状バクミドＤＮＡから切り出され、その後、標準的な手順で精製された。産生細胞（Ｎ５２．Ｅ６またはＡ５４９細胞）を、遺伝子導入剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、上記のように調製した線状ＤＮＡを遺伝子導入した。ベクター粒子とウイルス粒子はそれぞれ、細胞数の増加に伴う連続的な採取および感染サイクルを行うことで増幅させた。２ｘ１０８～４ｘ１０８の細胞に感染させた後、感染後４８時間で細胞を回収し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に再懸濁し、３回の連続凍結／解凍サイクルで溶解した。粒子を１回のＣｓＣｌステップ勾配（密度下部：１．４１ｇ／ｍｌ、密度上部：１．２７ｇ／ｍｌ；１７６，０００ｘｇ、４℃で２時間）および１回の連続したＣｓＣｌ勾配（密度：１．３４ｇ／ｍｌ；１７６，０００ｘｇ、４℃で２０時間）により精製した。その後、ＰＤ－１０サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて粒子を脱塩し、１０％グリセロールを含むバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で－８０℃にて保存した。物理的力価は、単離されたウイルス／ベクターＤＮＡのＯＤ２６０ｎｍにおける光学密度測定によって決定された。
【0143】
相同組換え
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６ベクターのＨＶＲ１、ＨＶＲ５およびＨＶＲ７領域の改変は、適宜、バクミドキット「Ｃｏｕｎｔｅｒ－Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｒｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」にしたがって相同組み換えで行われた。したがって、ＨＡｄＶ５配列を運搬するバクミドは、ストレプトマイシン耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）にエレクトロポレーションにより形質導入された。細菌を、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を添加した溶原培地（ＬＢ）寒天プレートにストリークし、３７℃で一晩培養した。ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）耐性を確認した後、キットに付属のｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを用いてエレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉを形質導入した。テトラサイクリン（３μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地プレート上に細菌をストリークした。プレートは３０℃で２０時間インキュベートされた。翌日、単一コロニーを選び、３０℃で一晩培養し、Ｌ－アラビノースと３７℃への温度シフトによって、Ｒｅｄ／ＥＴプラスミドからの組換えタンパク質ＲｅｄαおよびＲｅｄβの発現を誘導した。その後、目的の遺伝子領域について相同アームを持つｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットを運搬するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物で細菌は形質導入された。細菌懸濁液をテトラサイクリン（３μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にストリークし、３０℃で２４時間以上培養した。次に、ストレプトマイシン感受性と制限酵素分析によって確認されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の完全性でクローンを選別した。ｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットの導入が確認された後、Ｌ－アラビノースと３７℃への温度シフトによりＲｅｄ／ＥＴ遺伝子の発現が再度誘導された。細菌は、それぞれＨＶＲ１、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７のいずれかの変異を運搬する第２のＰＣＲ産物で形質転換された。これらの第２のＰＣＲ産物も目的の遺伝子領域に対して相同なアームを運搬し、うまく組み換えられたクローンはクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で、３７℃で一晩選択された。予想される変異について、ＤＮＡ制限分析で単一コロニーを解析した。大規模なバクミド調製後、陽性クローンは配列決定によってさらに検証された。
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６ベクターのＨＶＲ１、ＨＶＲ５およびＨＶＲ７領域の改変は、適宜、バクミドキット「Ｃｏｕｎｔｅｒ－Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｒｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」にしたがって相同組み換えで行われた。したがって、ＨＡｄＶ５配列を運搬するバクミドは、ストレプトマイシン耐性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）にエレクトロポレーションにより形質導入された。細菌を、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を添加した溶原培地（ＬＢ）寒天プレートにストリークし、３７℃で一晩培養した。ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）耐性を確認した後、キットに付属のｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを用いてエレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉを形質導入した。テトラサイクリン（３μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地プレート上に細菌をストリークした。プレートは３０℃で２０時間インキュベートされた。翌日、単一コロニーを選び、３０℃で一晩培養し、Ｌ－アラビノースと３７℃への温度シフトによって、Ｒｅｄ／ＥＴプラスミドからの組換えタンパク質ＲｅｄαおよびＲｅｄβの発現を誘導した。その後、目的の遺伝子領域について相同アームを持つｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットを運搬するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物で細菌は形質導入された。細菌懸濁液をテトラサイクリン（３μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にストリークし、３０℃で２４時間以上培養した。次に、ストレプトマイシン感受性と制限酵素分析によって確認されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の完全性でクローンを選別した。ｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットの導入が確認された後、Ｌ－アラビノースと３７℃への温度シフトによりＲｅｄ／ＥＴ遺伝子の発現が再度誘導された。細菌は、それぞれＨＶＲ１、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７のいずれかの変異を運搬する第２のＰＣＲ産物で形質転換された。これらの第２のＰＣＲ産物も目的の遺伝子領域に対して相同なアームを運搬し、うまく組み換えられたクローンはクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で、３７℃で一晩選択された。予想される変異について、ＤＮＡ制限分析で単一コロニーを解析した。大規模なバクミド調製後、陽性クローンは配列決定によってさらに検証された。
【0144】
相同組換え用ＰＣＲ産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６の生成には、それぞれのｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットをコードするＰＣＲ産物は、目的の遺伝子領域と相補的に隣接した相同性アームを付加したものである。使用したプライマーは７４塩基対（ｂｐ）（目的の遺伝子領域に相補的な５’－５０ｂｐとｒｐｓＬ－ｎｅｏ－３’に相補的な２４ｂｐ）により構成された。ＰＣＲ反応において、５μｌ Ｐｆｘ増幅バッファー（１０ｘ）、１μｌ ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、２μｌ ｄＮＴＰ’ｓ（１０ｍＭ）、１μｌの各プライマー１０μＭ
（ＨＶＲ１について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｃａａａｔｃｃｔｔｇｃｇａａｔｇｇｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａｇｇｃｃｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｃｇｇｇａｔｃｇ
（配列ＩＤ番号：２３），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｃｃａｇａａｔａａｇｇｃｇｃｃｔｇｃｃｃａａａｔａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｇｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇ
（配列ＩＤ番号：２４），
ＨＶＲ５について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｇｇａｇｇｇｃａａｇｇｃａｔｔｃｔｔｇｔａａａｇｃａａｃａａａａｔｇｇａａａｇｃｔａ－
ｇａａａｇｔｃａａｇＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＧ
（配列ＩＤ番号：２５），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｇｔｃｔｇｇｇｇｔｔｔｃｔａｔａｔｃｔａｃａｔｃｔｔｃａｃｔｇｔａｃａａｔａｃｃａｃｔｔｔａｇｇａｇｔｃＴＣＡＧＡＡ－
ＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ
（配列ＩＤ番号：２６）；
ＨＶＲ７について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｃａｔｇｇａａｃｔｇａａｇａｔｇａａｃｔｔｃｃａａａｔｔａｃｔｇｃｔｔｔｃｃａｃｔｇｇ－
ｇａｇｇｔｇｔｇＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＧ
（配列ＩＤ番号：２７），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｃｔｃｃａｃａｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｔａｇａｔｔｇａｔｔｔｃｃａｔｇｇｃａａａａｔｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｃＴＣＡＧＡＡ－
ＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ
（配列ＩＤ番号：２８）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
０．５μｌ ｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットテンプレート、および、０．５μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）は、最終容量５０μｌで混合された。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：１サイクル：９５℃で５分（初期変性）；２７サイクル：９５℃で４５秒（変性）、６０℃で４５秒（アニーリング）、６８℃で２分（伸長）；１サイクル：６８℃で１０分（最終伸長）。
ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６の生成には、それぞれのｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットをコードするＰＣＲ産物は、目的の遺伝子領域と相補的に隣接した相同性アームを付加したものである。使用したプライマーは７４塩基対（ｂｐ）（目的の遺伝子領域に相補的な５’－５０ｂｐとｒｐｓＬ－ｎｅｏ－３’に相補的な２４ｂｐ）により構成された。ＰＣＲ反応において、５μｌ Ｐｆｘ増幅バッファー（１０ｘ）、１μｌ ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、２μｌ ｄＮＴＰ’ｓ（１０ｍＭ）、１μｌの各プライマー１０μＭ
（ＨＶＲ１について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｃａａａｔｃｃｔｔｇｃｇａａｔｇｇｇａｔｇａａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔｃｔｔｇａａａｔａａａｃｃｔａｇｇｃｃｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｃｇｇｇａｔｃｇ
（配列ＩＤ番号：２３），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｃｃａｇａａｔａａｇｇｃｇｃｃｔｇｃｃｃａａａｔａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｇｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇ
（配列ＩＤ番号：２４），
ＨＶＲ５について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｇｇａｇｇｇｃａａｇｇｃａｔｔｃｔｔｇｔａａａｇｃａａｃａａａａｔｇｇａａａｇｃｔａ－
ｇａａａｇｔｃａａｇＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＧ
（配列ＩＤ番号：２５），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｇｔｃｔｇｇｇｇｔｔｔｃｔａｔａｔｃｔａｃａｔｃｔｔｃａｃｔｇｔａｃａａｔａｃｃａｃｔｔｔａｇｇａｇｔｃＴＣＡＧＡＡ－
ＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ
（配列ＩＤ番号：２６）；
ＨＶＲ７について：
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｆｗ：
ｃａｔｇｇａａｃｔｇａａｇａｔｇａａｃｔｔｃｃａａａｔｔａｃｔｇｃｔｔｔｃｃａｃｔｇｇ－
ｇａｇｇｔｇｔｇＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＴＣＧ
（配列ＩＤ番号：２７），
ｒｐｓＬ－ｎｅｏ ｒｅｖ：
ｃｔｃｃａｃａｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｔａｇａｔｔｇａｔｔｔｃｃａｔｇｇｃａａａａｔｔａｔｔｔｃｃａａｃｔｃＴＣＡＧＡＡ－
ＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧ
（配列ＩＤ番号：２８）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
０．５μｌ ｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットテンプレート、および、０．５μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）は、最終容量５０μｌで混合された。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：１サイクル：９５℃で５分（初期変性）；２７サイクル：９５℃で４５秒（変性）、６０℃で４５秒（アニーリング）、６８℃で２分（伸長）；１サイクル：６８℃で１０分（最終伸長）。
【0145】
以前に挿入されたｒｐｓＬ－ｎｅｏカセットを置換する２番目のＰＣＲ産物は、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、または、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６に所望の変異を運搬した、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔから購入した合成テンプレートを使用して生成された。ＰＣＲ反応において、５μｌ Ｐｆｘ増幅バッファー（１０ｘ）、１μｌ ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、２μｌ ｄＮＴＰ’ｓ（１０ｍＭ）、１μｌの各プライマー１０μＭ
（ＨＶＲ１ ｆｗ：ｔｔｔｔａａｇｃｃｃｔａｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｇｃ（配列ＩＤ番号：２９），
ＨＶＲ１ ｒｅｖ：ＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＣ（配列ＩＤ番号：３０）；
ＨＶＲ５ ｆｗ：ｃａｃａａａｔｇａａａａｔｇｇａｇｇｇｃａａｇｇ，（配列ＩＤ番号：３１），
ＨＶＲ５ ｒｅｖ：ｇｔｇｇｇｃａｔｇｔａａｇａａａｔａｔｇａｇｔｇ（配列ＩＤ番号：３２）；
ＨＶＲ７ ｆｗ：ｇａｃａｇｃｔａｔｇａｔｃｃａｇａｔｇｔｔａｇａａ（配列ＩＤ番号：３３），
ＨＶＲ７ ｒｅｖ：ｃｔｃｃａｃａｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｔａｇａｔｔｇ（配列ＩＤ番号：３４）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
１００ｎｇのテンプレートプラスミドＤＮＡ、および、０．５μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）は、最終容量５０μｌで混合された。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：１サイクル：９５℃で５分（初期変性）；２７サイクル：９５℃で４５秒（変性）、５５℃で４５秒（アニーリング）、６８℃で２分（伸長）；１サイクル：６８℃で１０分（最終伸長）。
（ＨＶＲ１ ｆｗ：ｔｔｔｔａａｇｃｃｃｔａｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｇｃ（配列ＩＤ番号：２９），
ＨＶＲ１ ｒｅｖ：ＣＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＣ（配列ＩＤ番号：３０）；
ＨＶＲ５ ｆｗ：ｃａｃａａａｔｇａａａａｔｇｇａｇｇｇｃａａｇｇ，（配列ＩＤ番号：３１），
ＨＶＲ５ ｒｅｖ：ｇｔｇｇｇｃａｔｇｔａａｇａａａｔａｔｇａｇｔｇ（配列ＩＤ番号：３２）；
ＨＶＲ７ ｆｗ：ｇａｃａｇｃｔａｔｇａｔｃｃａｇａｔｇｔｔａｇａａ（配列ＩＤ番号：３３），
ＨＶＲ７ ｒｅｖ：ｃｔｃｃａｃａｇｇｔｔｇｇｃａｔｔｔａｇａｔｔｇ（配列ＩＤ番号：３４）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
１００ｎｇのテンプレートプラスミドＤＮＡ、および、０．５μｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）は、最終容量５０μｌで混合された。ＰＣＲサイクルは以下のように行った：１サイクル：９５℃で５分（初期変性）；２７サイクル：９５℃で４５秒（変性）、５５℃で４５秒（アニーリング）、６８℃で２分（伸長）；１サイクル：６８℃で１０分（最終伸長）。
【0146】
ＰＣＲ産物はトリス酢酸－エチレンジアミン四酢酸（ＴＡＥ）ゲルでのアガロースゲル電気泳動で分離された。所望のバンドを切り出し、フェノール－クロロホルム抽出後、エタノール沈殿で精製した。
【0147】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８、および、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９の作製も同様の手順で行った。
【0148】
銀染色
５ｘ１０９ベクター粒子を、β－メルカプトエタノールを含む１ｘＳＤＳ－ローディングバッファー２０μｌ ＰＢＳに溶解し、７０℃で５分間変性させた。その後、ウイルスタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した（５％スタッキングゲル、８％分離／ランニングゲル）。ウイルスタンパク質を可視化するために、銀染色を行った。タンパク質は固定用バッファー（５０％メタノール、１２％酢酸、０．０５％のホルムアルデヒド３７％）で３０分間固定し、洗浄バッファー（５０％エタノール）で１５分間洗浄した後、平衡化バッファー（０．８ｍＭチオ硫酸ナトリウム）で１分間前処理を行った。次に、ゲルをｄＨ２Ｏで３回洗浄し、含浸バッファー（１１．７８ｍＭ 硝酸銀、０．０５％のホルムアルデヒド３７％）で２０分間インキュベーションした。タンパク質の染色は、ゲルを展開バッファー（０．５７Ｍ 炭酸ナトリウム、０．０５％のホルムアルデヒド３７％、１５．８μＭ チオ硫酸ナトリウム）中で適当な時間インキュベートすることによって行われた。タンパク質のバンドは非常に明瞭であるが、マーカーのバンドがほとんど見えなくなった時点で、停止バッファー（５０％メタノール、１２％酢酸）で現像を停止した。
５ｘ１０９ベクター粒子を、β－メルカプトエタノールを含む１ｘＳＤＳ－ローディングバッファー２０μｌ ＰＢＳに溶解し、７０℃で５分間変性させた。その後、ウイルスタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した（５％スタッキングゲル、８％分離／ランニングゲル）。ウイルスタンパク質を可視化するために、銀染色を行った。タンパク質は固定用バッファー（５０％メタノール、１２％酢酸、０．０５％のホルムアルデヒド３７％）で３０分間固定し、洗浄バッファー（５０％エタノール）で１５分間洗浄した後、平衡化バッファー（０．８ｍＭチオ硫酸ナトリウム）で１分間前処理を行った。次に、ゲルをｄＨ２Ｏで３回洗浄し、含浸バッファー（１１．７８ｍＭ 硝酸銀、０．０５％のホルムアルデヒド３７％）で２０分間インキュベーションした。タンパク質の染色は、ゲルを展開バッファー（０．５７Ｍ 炭酸ナトリウム、０．０５％のホルムアルデヒド３７％、１５．８μＭ チオ硫酸ナトリウム）中で適当な時間インキュベートすることによって行われた。タンパク質のバンドは非常に明瞭であるが、マーカーのバンドがほとんど見えなくなった時点で、停止バッファー（５０％メタノール、１２％酢酸）で現像を停止した。
【0149】
ゼータ電位測定
ゼータ電位の測定は、ゼータサイザーナノ－ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて行った。２ｘ１０１１ベクター粒子をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（３．５Ｋ ＭＷＣＯ ０．５ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と共に４℃で容易に撹拌しながら３回（２時間後に一晩、および６時間）透析を行った。続いて、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを、フィルターなしでメーカーに従って実施し、グリセロールを除去した。透明な使い捨てゼータセルキュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）の必要容量は１ｍｌであったため、精製ベクター粒子を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４ 滅菌ろ過）で１ｍｌまで充填した（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＤＴＳＮａｎｏ ５．１０ ソフトウェアでの測定と解析には、以下の設定を適用した：測定タイプ ゼータ電位；サンプル材料 タンパク質 ＲＩ １．４５０、Ａｂｓｏｒ ０．００；サンプル分散媒 水温２５℃、粘度０．８８７２ＣＰ、ＲＩ １．３３０、誘電率７８．５；サンプル一般オプション Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ；サンプル温度２５℃、測定開始時 ２分平衡時間；サンプルセル ＤＴＳ １０６０Ｃ 透明ディスポーザブルゼータセル；測定自動最小１０、最大１５；測定回数 １。
ゼータ電位の測定は、ゼータサイザーナノ－ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて行った。２ｘ１０１１ベクター粒子をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（３．５Ｋ ＭＷＣＯ ０．５ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と共に４℃で容易に撹拌しながら３回（２時間後に一晩、および６時間）透析を行った。続いて、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを、フィルターなしでメーカーに従って実施し、グリセロールを除去した。透明な使い捨てゼータセルキュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）の必要容量は１ｍｌであったため、精製ベクター粒子を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４ 滅菌ろ過）で１ｍｌまで充填した（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＤＴＳＮａｎｏ ５．１０ ソフトウェアでの測定と解析には、以下の設定を適用した：測定タイプ ゼータ電位；サンプル材料 タンパク質 ＲＩ １．４５０、Ａｂｓｏｒ ０．００；サンプル分散媒 水温２５℃、粘度０．８８７２ＣＰ、ＲＩ １．３３０、誘電率７８．５；サンプル一般オプション Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ；サンプル温度２５℃、測定開始時 ２分平衡時間；サンプルセル ＤＴＳ １０６０Ｃ 透明ディスポーザブルゼータセル；測定自動最小１０、最大１５；測定回数 １。
【0150】
ＦＸを介したＳＫＯＶ－３細胞の形質導入
ＳＫＯＶ－３細胞を２００μｌの血清含有ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地に２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞を洗浄し、８μｇ／ｍｌのＦＸを含むまたは含まない（対照として）１００μｌの無血清ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地培地を提供した。細胞にｐＭＯＩ １０００を形質導入した（２ｘ１０７ＶＰ）。３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、２００μｌの血清含有ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地を添加した。形質導入後７２時間で、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現を分析した。
ＳＫＯＶ－３細胞を２００μｌの血清含有ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地に２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、細胞を洗浄し、８μｇ／ｍｌのＦＸを含むまたは含まない（対照として）１００μｌの無血清ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地培地を提供した。細胞にｐＭＯＩ １０００を形質導入した（２ｘ１０７ＶＰ）。３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、２００μｌの血清含有ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地を添加した。形質導入後７２時間で、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰ発現を分析した。
【0151】
スカベンジャー受容体を介した取り込み
Ｊ７７４Ａ．１細胞は、２４ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で１ｍｌの血清含有ダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃で一晩培養を行った。翌日、細胞を洗浄し、５００μｌの無血清ダルベッコ改変イーグル培地を提供した。指示された場合、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解したポリイノシン酸（Ｐｏｌｙ－（Ｉ））（３０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。最後に、２０００のｐＭＯＩ（１ｘ１０８ＶＰ）で細胞を形質導入した。３７℃での３時間のインキュベートした後、細胞を２回洗浄し、続いて１ｍｌの血清含有ダルベッコ改変イーグル培地中でインキュベートした。形質導入の２４時間後に、ウェルあたり２００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水、２０μｌのプロテイナーゼＫ、および２０μｌのＲＮａｓｅを加えて細胞を回収した。室温で２分間インキュベートした後、さらに２００μｌのＡＬバッファー（"ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ"）を加え、５６℃で１０分間インキュベートした。その後、"ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ"（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）のプロトコルに従い、溶解した細胞のＤＮＡを単離した。
Ｊ７７４Ａ．１細胞は、２４ウェルプレートに１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で１ｍｌの血清含有ダルベッコ改変イーグル培地に播種し、３７℃で一晩培養を行った。翌日、細胞を洗浄し、５００μｌの無血清ダルベッコ改変イーグル培地を提供した。指示された場合、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解したポリイノシン酸（Ｐｏｌｙ－（Ｉ））（３０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。最後に、２０００のｐＭＯＩ（１ｘ１０８ＶＰ）で細胞を形質導入した。３７℃での３時間のインキュベートした後、細胞を２回洗浄し、続いて１ｍｌの血清含有ダルベッコ改変イーグル培地中でインキュベートした。形質導入の２４時間後に、ウェルあたり２００μｌのダルベッコリン酸緩衝食塩水、２０μｌのプロテイナーゼＫ、および２０μｌのＲＮａｓｅを加えて細胞を回収した。室温で２分間インキュベートした後、さらに２００μｌのＡＬバッファー（"ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ"）を加え、５６℃で１０分間インキュベートした。その後、"ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ"（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）のプロトコルに従い、溶解した細胞のＤＮＡを単離した。
【0152】
単離した全ＤＮＡサンプルのアデノウイルス含有量を定量化するために、アデノウイルスＥ４遺伝子の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。マウスβ－アクチンのコピー数は、異種細胞採取効率を除外するための正規化に使用された。単離した全ＤＮＡサンプルのアデノウイルス含有量を定量化するために、アデノウイルスＥ４遺伝子の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。マウスβ－アクチンのコピー数は、異種細胞採取効率を除外するための正規化に使用された。ｑＰＣＲ反応は、１０μｌのＫａｐａ ＳＹＢＲＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲマスターミックス、０．４μｌの各プライマー（１０μＭ）
（マウスβ－アクチンについて：
ｆｗ：ｃａａｇｇａｇｔｇｃａａｇａａｃａｃａｇ（配列ＩＤ番号：３５）；
ｒｅｖ：ｇｃｃｔｔｇｇａｇｔｇｔｇｔａｔｔｇａｇ（配列ＩＤ番号：３６）；
Ａｄ５ Ｅ４について：
ｆｗ：ｔａｇａｃｇａｔｃｃｃｔａｃｔｇｔａｃｇ（配列ＩＤ番号：３７）；
ｒｅｖ：ｃｃｇｇａｃｇｔａｇｔｃａｔａｔｔｔｃｃ（配列ＩＤ番号：３８）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
および２μｌの単離全ＤＮＡを最終容量２０μｌで含んだ。
（マウスβ－アクチンについて：
ｆｗ：ｃａａｇｇａｇｔｇｃａａｇａａｃａｃａｇ（配列ＩＤ番号：３５）；
ｒｅｖ：ｇｃｃｔｔｇｇａｇｔｇｔｇｔａｔｔｇａｇ（配列ＩＤ番号：３６）；
Ａｄ５ Ｅ４について：
ｆｗ：ｔａｇａｃｇａｔｃｃｃｔａｃｔｇｔａｃｇ（配列ＩＤ番号：３７）；
ｒｅｖ：ｃｃｇｇａｃｇｔａｇｔｃａｔａｔｔｔｃｃ（配列ＩＤ番号：３８）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）、
および２μｌの単離全ＤＮＡを最終容量２０μｌで含んだ。
【0153】
ＰＣＲサイクルは以下のように行った：１サイクル：９５℃で１０分（初期変性）；４０サイクル：９５℃で３０秒（変性）、６０℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で２０秒（伸長）；１サイクル：９５℃で１分（変性）、５５℃で３０秒（アニーリング）；１サイクル：９５℃で３０秒（最終伸長）。
【0154】
ＩｇＭを介した中和
Ａ５４９細胞は、９６ウェルプレートの２００μｌの血清含有最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）に播種した。翌日、示されたウイルスベクター粒子を、２Ｅ６ ＶＰ／μｌの割合でＰＢＳまたは血漿サンプルとともに３７℃で１０分間インキュベートした。ナイーブなヒトおよびマウスの血漿サンプルは、８００ｘｇで１０分間遠心分離することにより全血から調製した。補体活性を維持するために、血液サンプルは１００μｇ／ｍｌのヒルジン（Ｃｅｌｇｅｎｅ）で抗凝固処理した。細胞を洗浄し、１００μｌの無血清培地中でｐＭＯＩが１０００のプレインキュベーションウイルスベクターで形質導入し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、２００μｌの血清含有培地を補充した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を剥離し、フローサイトメトリーでｅＧＦＰの発現を解析した。
Ａ５４９細胞は、９６ウェルプレートの２００μｌの血清含有最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）に播種した。翌日、示されたウイルスベクター粒子を、２Ｅ６ ＶＰ／μｌの割合でＰＢＳまたは血漿サンプルとともに３７℃で１０分間インキュベートした。ナイーブなヒトおよびマウスの血漿サンプルは、８００ｘｇで１０分間遠心分離することにより全血から調製した。補体活性を維持するために、血液サンプルは１００μｇ／ｍｌのヒルジン（Ｃｅｌｇｅｎｅ）で抗凝固処理した。細胞を洗浄し、１００μｌの無血清培地中でｐＭＯＩが１０００のプレインキュベーションウイルスベクターで形質導入し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、２００μｌの血清含有培地を補充した。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を剥離し、フローサイトメトリーでｅＧＦＰの発現を解析した。
【0155】
ＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６と凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を導入エンハンサーとしたＭＳＣの形質導入
２～３ｘ１０５ＭＳＣをアルファ－イーグル最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）を含む６ｍｌ ＰＬの６ｃｍディッシュに播種し、３７℃にて一晩培養した。翌日、ＦＸ（２μｇ／ｍｌ）を、アルファ－最小必須培地中で、対応する量のＴＳＧ－６発現ベクター粒子ＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６とともに、最終容量２９０μｌで、３７℃で２０～３０分プレインキュベートした。ベクター粒子とＦＸのプレインキュベーションの間、細胞を洗浄し、６ｃｍディッシュあたり２．７ｍｌの補充を含まないアルファ－最小必須培地を提供した。最後に、プレインキュベートしたベクター粒子溶液を細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、アルファ－最小必須培地で３回洗浄を行った。この細胞をアルファ－最小必須培地を含むＰＬ中でさらに７２時間３７℃で培養した。細胞培養上清を回収し、細胞培養上清中のＴＳＧ－６の濃度をサンドイッチＴＳＧ－６ ＥＬＩＳＡで分析した。
２～３ｘ１０５ＭＳＣをアルファ－イーグル最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）を含む６ｍｌ ＰＬの６ｃｍディッシュに播種し、３７℃にて一晩培養した。翌日、ＦＸ（２μｇ／ｍｌ）を、アルファ－最小必須培地中で、対応する量のＴＳＧ－６発現ベクター粒子ＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６とともに、最終容量２９０μｌで、３７℃で２０～３０分プレインキュベートした。ベクター粒子とＦＸのプレインキュベーションの間、細胞を洗浄し、６ｃｍディッシュあたり２．７ｍｌの補充を含まないアルファ－最小必須培地を提供した。最後に、プレインキュベートしたベクター粒子溶液を細胞に加え、３７℃で３時間インキュベートした後、アルファ－最小必須培地で３回洗浄を行った。この細胞をアルファ－最小必須培地を含むＰＬ中でさらに７２時間３７℃で培養した。細胞培養上清を回収し、細胞培養上清中のＴＳＧ－６の濃度をサンドイッチＴＳＧ－６ ＥＬＩＳＡで分析した。
【0156】
この目的のために、９６ウェル ＭａｘｉＳｏｒｂ Ｎｕｎｃプレートは、１００μｌ／ウェルのコーティング液（０．１Ｍ 炭酸／重炭酸ナトリウムバッファー ｐＨ９．６中の１μｇ／ｍｌ ＴＳＧ－６モノクローナルマウスＩｇＧ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ－６５８８６）とともに、４℃で一晩インキュベートされた。翌日、プレートをＥＬＩＳＡプレート洗浄機"Ｗｅｌｌ Ｗａｓｈ Ｖｅｒｓａ"で３００μｌ／ウェルの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで３回洗浄後、３００μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で室温において、シェーカーで１時間インキュベーションした。別の洗浄後、対応する希釈液またはＴＳＧ－６ タンパク質標準品（Ｒ&Ｄ ２１０４－ＴＳ－０５０）のサンプルを１００μｌ／ウェルずつウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。再度、プレートを洗浄し、検出液（０．２５μｇ／ｍｌ 抗－ＴＳＧ－６ゴートポリクローナルＩｇＧ Ｒ&Ｄ ＢＡＦ２１０４，ＰＢＳ）１００μｌ／ウェルは、室温において、シェーカーで１時間インキュベートされた。１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｄａｋｏ Ｐ０３９７ ｃ＝０．０２０μｇ／ｍｌ）を添加し、続いて室温において１時間シェーカーでインキュベートする前に、プレートを再度洗浄した。最後に、別の洗浄工程の後、検出基質（１－ＳｔｅｐＵｌｔｒａ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ３４０２８）を１００μｌ／ウェルずつウェルごとに添加し、暗所で酵素反応を開始させた。１５分後、１００μｌ／ウェルの硫酸（２Ｍ）を加えて反応を停止し、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで測定した。
【0157】
ＨＡｄＶ５とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、および、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３とＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲによる腫瘍細胞株の形質導入
異なる腫瘍細胞株（ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ、ＭｉａＰａＣａ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９）を９６ウェルプレートのそれぞれの培地２００μｌに播種した。翌日、細胞を洗浄し、１００μＬの無血清培地中でＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３のいずれかにより３００または１０００のｐＭＯＩで形質導入した。３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、２００μＬの真菌培地を加えた。導入後２４時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰの発現を分析した。
異なる腫瘍細胞株（ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ、ＭｉａＰａＣａ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９）を９６ウェルプレートのそれぞれの培地２００μｌに播種した。翌日、細胞を洗浄し、１００μＬの無血清培地中でＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３のいずれかにより３００または１０００のｐＭＯＩで形質導入した。３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、２００μＬの真菌培地を加えた。導入後２４時間後に細胞を採取し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰの発現を分析した。
【0158】
ｐＭＯＩが１０００のＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３およびＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲによる異なる腫瘍細胞株の形質導入にも同じ手順が適用された。
【0159】
増強分子あり、または、増強分子なしのＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３によるＭＳＣの形質導入
ＭＳＣは、２４ウェルプレートで１ｍＬのＰＬ含有ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）アルファ最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）に播種された。翌日、ＰＬフリー培地中、３００μＬの総容量で、３７℃で３０分間、示されたウイルスベクター粒子を増強分子とともに、または増強分子なしでプレインキュベーションした。増強分子として、第Ｘ因子（２５０～２０００ｎｇ／ｍＬ）、スペルミジン（１～６２５ｎｇ／μＬ）、スペルミン（１～１０００ｎｇ／μＬ）、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（０．０８～８１μｇ／μＬ）、ポリ－Ｌ－リジン（１～２５％ ｖ／ｖ）およびラクトフェリン（１～１０００μｇ／ｍＬ）が使用された。その後、ＭＳＣを洗浄し、５００μＬのＰＬフリー培地を提供した。細胞を、３００μＬのプレインキュベートされたウイルス粒子を添加することによって形質導入し（示されたｐＭＯＩをもたらす）、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１ｍＬのＰＬ含有培地を添加した。導入から７２時間後にＭＳＣを剥離し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰの発現を分析した。
ＭＳＣは、２４ウェルプレートで１ｍＬのＰＬ含有ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）アルファ最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）に播種された。翌日、ＰＬフリー培地中、３００μＬの総容量で、３７℃で３０分間、示されたウイルスベクター粒子を増強分子とともに、または増強分子なしでプレインキュベーションした。増強分子として、第Ｘ因子（２５０～２０００ｎｇ／ｍＬ）、スペルミジン（１～６２５ｎｇ／μＬ）、スペルミン（１～１０００ｎｇ／μＬ）、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（０．０８～８１μｇ／μＬ）、ポリ－Ｌ－リジン（１～２５％ ｖ／ｖ）およびラクトフェリン（１～１０００μｇ／ｍＬ）が使用された。その後、ＭＳＣを洗浄し、５００μＬのＰＬフリー培地を提供した。細胞を、３００μＬのプレインキュベートされたウイルス粒子を添加することによって形質導入し（示されたｐＭＯＩをもたらす）、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１ｍＬのＰＬ含有培地を添加した。導入から７２時間後にＭＳＣを剥離し、フローサイトメトリーによりｅＧＦＰの発現を分析した。
【表1】
【0160】
ＭＳＣは、２４ウェルプレートで１ｍＬのＰＬ含有ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）アルファ最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）に播種された。翌日、ＰＬフリー培地中、３００μＬの総容量で、３７℃で３０分間、示されたウイルスベクター粒子を増強分子とともに、または増強分子なしでプレインキュベーションした。増強分子としては、第Ｘ因子（４ｆｇ／ウイルス粒子）、スペルミジン（５００ｆｇ／ウイルス粒子）、ポリブレン（１８ｆｇ／ウイルス粒子）をＨＡｄＶ５ｗｔと組み合わせて使用した。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔはエンハンサーなしで使用された。その後、ＭＳＣを洗浄し、５００μＬのＰＬフリー培地を提供した。３００μＬのプレインキュベートしたウイルス粒子を添加することにより細胞を感染させ（ｐＭＯＩが３００または１０００となる）、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＰＬ含有培地１ｍＬを加えた。感染後２４、４８、７２、９６時間後に細胞および上清を回収し、溶解した。２４時間前に２４ウェルプレートに事前に播種したＡ５４９への再感染には、ＭＳＣライセートを使用した。再感染から４時間後に、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＡ５４９ ＤＮＡを単離した。得られたＡ５４９ ＤＮＡサンプルを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、ＭＳＣが産生する感染性アデノウイルスを定量化した。ｑＰＣＲ解析には、アデノウイルスＥ４転写単位の一部が増幅された
（フォワードプライマー：ＴＡＧＡＣＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧ（配列ＩＤ番号：３７）；
リバースプライマー：ＧＧＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ（配列ＩＤ番号：３９）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）。
標準化のため、β－アクチンも分析された
（フォワードプライマー：ＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧ（配列ＩＤ番号：４０）；
リバースプライマー：ＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡ（配列ＩＤ番号：４１）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）。
（フォワードプライマー：ＴＡＧＡＣＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧ（配列ＩＤ番号：３７）；
リバースプライマー：ＧＧＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ（配列ＩＤ番号：３９）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）。
標準化のため、β－アクチンも分析された
（フォワードプライマー：ＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧ（配列ＩＤ番号：４０）；
リバースプライマー：ＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡ（配列ＩＤ番号：４１）；
すべてのプライマー配列は５’→３’方向で表示）。
【0161】
Ｋａｐａ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）を製造元のプロトコルに沿って使用した。
【0162】
形質導入されていないＭＳＣおよび形質導入されたＭＳＣ移動アッセイ
ＭＳＣ移動（ＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３により形質導入していない、または形質導入した）を評価するために、ボイデンチャンバーアッセイを実施した。そのために、ＭＳＣを６ウェルプレートの３ｍＬ ＰＬ含有ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）α最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）に播種した。翌日、ＰＬフリー培地中、３００μＬの総容量で、３７℃で３０分間、標記ウイルスベクター粒子を増強分子とともに、または増強分子なしでプレインキュベーションした。増強分子として、第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、ポリブレン、ポリ－Ｌ－リジンおよびラクトフェリンを使用した。その後、ＭＳＣを洗浄し、３０００μＬのＰＬフリー培地を提供した。細胞を、３００μＬのプレインキュベーションされたウイルス粒子を添加することによって形質導入し（示されたｐＭＯＩになる）、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１ｍＬのＰＬ含有培地を添加した。形質導入４時間後にＭＳＣを剥離し、トランスウェルインサートに播種した（孔径８μＭ、トランスウェルあたり１ｘ１０４細胞）。トランスウェルは、前日に１ｘ１０５ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞が播種された２４ウェルプレート上に設置された。対照として、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ培養培地（３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に対するＭＳＣ移動を分析した。ＭＳＣをトランスウェルに播種してから１８時間後に、トランスウェルをＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールを用いて細胞を固定した。その後、１０μｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）およびＰＢＳで希釈した１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを用いて、ＭＳＣを染色した。移動した細胞は、ＤＡＰＩで染色された核を数えることによって定量化された。
ＭＳＣ移動（ＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３により形質導入していない、または形質導入した）を評価するために、ボイデンチャンバーアッセイを実施した。そのために、ＭＳＣを６ウェルプレートの３ｍＬ ＰＬ含有ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）α最小必須培地（Ｌｏｎｚａ）に播種した。翌日、ＰＬフリー培地中、３００μＬの総容量で、３７℃で３０分間、標記ウイルスベクター粒子を増強分子とともに、または増強分子なしでプレインキュベーションした。増強分子として、第Ｘ因子、スペルミジン、スペルミン、ポリブレン、ポリ－Ｌ－リジンおよびラクトフェリンを使用した。その後、ＭＳＣを洗浄し、３０００μＬのＰＬフリー培地を提供した。細胞を、３００μＬのプレインキュベーションされたウイルス粒子を添加することによって形質導入し（示されたｐＭＯＩになる）、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１ｍＬのＰＬ含有培地を添加した。形質導入４時間後にＭＳＣを剥離し、トランスウェルインサートに播種した（孔径８μＭ、トランスウェルあたり１ｘ１０４細胞）。トランスウェルは、前日に１ｘ１０５ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞が播種された２４ウェルプレート上に設置された。対照として、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ培養培地（３％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に対するＭＳＣ移動を分析した。ＭＳＣをトランスウェルに播種してから１８時間後に、トランスウェルをＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノールを用いて細胞を固定した。その後、１０μｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジン－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）およびＰＢＳで希釈した１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを用いて、ＭＳＣを染色した。移動した細胞は、ＤＡＰＩで染色された核を数えることによって定量化された。
【0163】
ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２によるＭＳＣの形質導入
ｐＭＯＩが１０００のＭＳＣの形質導入は、ＭＳＣを剥離し、導入２４時間後にｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析した以外は、「増強分子あり、または、増強分子なしのＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３によるＭＳＣの形質導入」の項で述べたように実施された。増強分子は使用しなかった。
ｐＭＯＩが１０００のＭＳＣの形質導入は、ＭＳＣを剥離し、導入２４時間後にｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析した以外は、「増強分子あり、または、増強分子なしのＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３によるＭＳＣの形質導入」の項で述べたように実施された。増強分子は使用しなかった。
【0164】
統計解析
結果は、平均値±標準偏差で示した。統計解析は、対応のない２標本（ウェルチ）スチューデントのｔ－検定またはＷｉｌｃｏｘ検定で行った。計算はＲＳｔｕｄｉｏ－ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１５．０またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０７で行った。Ｐ値≦０．０５を統計的に有意とした。
結果は、平均値±標準偏差で示した。統計解析は、対応のない２標本（ウェルチ）スチューデントのｔ－検定またはＷｉｌｃｏｘ検定で行った。計算はＲＳｔｕｄｉｏ－ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１５．０またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０７で行った。Ｐ値≦０．０５を統計的に有意とした。
【0165】
結果
変異体ベクターの作製と特性評価
図１は、ＨＡｄＶ５野生型とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１（図１Ａ）と、ＨＡｄＶ５野生型、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６のＨＶＲ１、ＨＶＲ５およびＨＶＲ７（図１Ｂ）のアミノ酸配列のアライメントを示したものである。負に帯電したアミノ酸は太字で描かれている。挿入されたリジン残基はイタリック体で示されている。
変異体ベクターの作製と特性評価
図１は、ＨＡｄＶ５野生型とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１（図１Ａ）と、ＨＡｄＶ５野生型、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６のＨＶＲ１、ＨＶＲ５およびＨＶＲ７（図１Ｂ）のアミノ酸配列のアライメントを示したものである。負に帯電したアミノ酸は太字で描かれている。挿入されたリジン残基はイタリック体で示されている。
【0166】
注目すべきことに、変異ベクターＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ４、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ５、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ６の産生は、Ｎ５２．Ｅ６細胞に切断したバクミドＤＮＡを遺伝子導入してもウイルスレスキューがなかったため、実行不可能であり、このベクターは生存不可能であることを示している。
【0167】
図１４は、ＨＡｄＶ５野生型とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１のアミノ酸配列のアラインメントを示したものである。挿入されたリジン残基は太字で描かれている。さらに挿入されたアミノ酸はイタリック体で示されている。
【0168】
変異ベクターＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ７、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ８、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ９の産生は、Ｎ５２．Ｅ６細胞に切断したバクミドＤＮＡを遺伝子導入してもウイルスレスキューがなかったため、実行不可能であり、それぞれこのベクターは生存できず、機能的ウイルス粒子は形成できないことを示している。
【0169】
図２は、ＨＡｄＶ５野生型およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ヘキソンタンパク質の超可変領域１をコードするヌクレオチド配列のアラインメントを示している。挿入されたリジン残基をコードするヌクレオチドは、大文字で示されている。
【0170】
ウイルスタンパク質の完全性は銀染色により確認された（図３）。対照として、未修飾のベクター粒子（ＨＡｄＶ５）を用い、ヘキソンタンパク質の分子量１０８ｋＤａを明らかにした。銀染色により、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１ではＨＶＲ１のネガティブループの欠失が、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ではＨＶＲ１領域の変異が確認された。これらの改変はいずれも、ヘキソンタンパク質の分子量をそれぞれ目に見える形で減少させる結果となった。一方、アスパラギン酸の代わりにリジンが挿入されたヘキソンタンパク質（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２）は、予想通り、未修飾のヘキソンタンパク質と同じ分子量を示した。
【0171】
ベクター粒子の表面電荷を決定するためのゼータ電位測定では、対照ベクターＨＡｄＶ５で－２２．８ｍＶの負の表面電荷が明らかになり、これは文献と一致した（図４）。興味深いことに、負に帯電したＨＶＲ１ループを欠失させた場合（ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１）、粒子の負の表面電荷は統計的に有意ではなく、わずかに減少しただけだった（－１９．４ｍＶ）。ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２の場合、アスパラギン酸をリジンに置換すると、表面電荷はさらに減少した（－１７．３３ｍＶ）。しかし、興味深いことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３は、ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２と比較して、統計的に有意な表面電荷の減少を示した（－８．１ｍＶ；ＨＡｄＶ５と比較：ｐ<４．３０３ｘ１０－５；ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１と比較：ｐ<２．７３８ｘ１０－４；ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２と比較：ｐ<１．１３９ｘ１０－７）。
【0172】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３は、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１よりも、ＦＸを介したＣＡＲ陰性ＳＫＯＶ－３細胞の形質導入が有意に少ないことを示す
ヒト血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）がＨＡｄＶ５に結合すると、肝細胞の形質導入を仲介し、その結果、粒子の封じ込めを誘発する。ＦＸに関連する結合残基は、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ５及びＨＶＲ７内に位置している（Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＡＲを介した細胞導入を除外するために、本発明者らは、ＣＡＲ陰性ＳＫＯＶ－３細胞を用い（図５）、ＦＸが変異ベクターの細胞形質導入を促進するかどうかを分析した。ＨＡｄＶ５－ΔＦＸベクター粒子は、ＨＶＲ７内の点変異により著しく減少したＦＸ結合を示すことが知られており（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、対照として使用された。ＨＡｄＶ５－ΔＦＸによるＦＸを介した細胞形質導入は、ＦＸ存在下のＨＡｄＶ５と比較して有意に減少した（ｐ<３．６８６ｘ１０－５）。驚くべきことに、同様の効果はＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３でも観察され、ＦＸ存在下ではＨＡｄＶ５と比較して統計的に有意な細胞形質導入の減少を示した（ｐ<１．１３５ｘ１０－５）。興味深いことに、ＦＸを介したＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１の形質導入効率は、ＨＡｄＶ５と比較して有意に低下していなかった。また、ＨＶＲ１にアスパラギン酸残基の代わりにリジン残基を導入したもの（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２）は、ＦＸを介した取り込みを減少させないことが示された。以上の結果から、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２はＦＸ結合能の低下は見られないが、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３はＨＡｄＶ５－ΔＦＸと同程度の有意なＦＸ結合能の低下が見られることが判明した。
ヒト血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）がＨＡｄＶ５に結合すると、肝細胞の形質導入を仲介し、その結果、粒子の封じ込めを誘発する。ＦＸに関連する結合残基は、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ５及びＨＶＲ７内に位置している（Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＡＲを介した細胞導入を除外するために、本発明者らは、ＣＡＲ陰性ＳＫＯＶ－３細胞を用い（図５）、ＦＸが変異ベクターの細胞形質導入を促進するかどうかを分析した。ＨＡｄＶ５－ΔＦＸベクター粒子は、ＨＶＲ７内の点変異により著しく減少したＦＸ結合を示すことが知られており（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、対照として使用された。ＨＡｄＶ５－ΔＦＸによるＦＸを介した細胞形質導入は、ＦＸ存在下のＨＡｄＶ５と比較して有意に減少した（ｐ<３．６８６ｘ１０－５）。驚くべきことに、同様の効果はＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３でも観察され、ＦＸ存在下ではＨＡｄＶ５と比較して統計的に有意な細胞形質導入の減少を示した（ｐ<１．１３５ｘ１０－５）。興味深いことに、ＦＸを介したＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１の形質導入効率は、ＨＡｄＶ５と比較して有意に低下していなかった。また、ＨＶＲ１にアスパラギン酸残基の代わりにリジン残基を導入したもの（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２）は、ＦＸを介した取り込みを減少させないことが示された。以上の結果から、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２はＦＸ結合能の低下は見られないが、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３はＨＡｄＶ５－ΔＦＸと同程度の有意なＦＸ結合能の低下が見られることが判明した。
【0173】
スカベンジャー受容体によるＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の取り込みは、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）と比較して有意に減少する
全身投与されたＨＡｄＶ５の主な受け手は、クッパー細胞（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）と呼ばれる肝臓に常在するマクロファージである。これらの細胞は、細胞表面に負に帯電した分子と結合し捕捉するスカベンジャー受容体を持っていることが知られている。ＨＡｄＶ５は、全体として負の表面電荷を示すが、これは主にＨＶＲ１内の負に帯電したアミノ酸のストレッチに起因する（Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。粒子の負の表面電荷を減らすために、本発明者らは、負に帯電したＨＶＲ１ループを削除するか（ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１）、ストレッチ内にアスパラギン酸の代わりにリジンを挿入するか（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２）、ストレッチ全体を４つのリジン残基で置換した（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３）（図４）。その結果、マウスマクロファージによる３つの変異ベクターＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３全ての取り込みが対照ベクターＨＡｄＶ５と比較して有意に減少することが明らかになった（ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１ ｐ<０．００１４６２；ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２ ｐ<０．００１２１９；ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ ｐ<０．００１２４１）（図６）。この効果はＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ではさらに顕著であった。マクロファージによるＨＡｄＶ５粒子の取り込みは、ポリイノシン酸（Ｐｏｌｙ－（Ｉ））の存在下で有意に抑制された。Ｐｏｌｙ－（Ｉ）はスカベンジャー受容体に結合し、飽和させるため、スカベンジャー受容体を介したウイルス取り込み機構が確認された。細胞とＰｏｌｙ－（Ｉ）のプレインキュベーションは、マクロファージによるＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２の取り込みに影響を与えなかった。興味深いことに、Ｐｏｌｙ－（Ｉ）と細胞のプレインキュベーションは、マクロファージによるＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３粒子の取り込みを増加させた。
全身投与されたＨＡｄＶ５の主な受け手は、クッパー細胞（Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）と呼ばれる肝臓に常在するマクロファージである。これらの細胞は、細胞表面に負に帯電した分子と結合し捕捉するスカベンジャー受容体を持っていることが知られている。ＨＡｄＶ５は、全体として負の表面電荷を示すが、これは主にＨＶＲ１内の負に帯電したアミノ酸のストレッチに起因する（Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。粒子の負の表面電荷を減らすために、本発明者らは、負に帯電したＨＶＲ１ループを削除するか（ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１）、ストレッチ内にアスパラギン酸の代わりにリジンを挿入するか（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２）、ストレッチ全体を４つのリジン残基で置換した（ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３）（図４）。その結果、マウスマクロファージによる３つの変異ベクターＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２、およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３全ての取り込みが対照ベクターＨＡｄＶ５と比較して有意に減少することが明らかになった（ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１ ｐ<０．００１４６２；ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２ ｐ<０．００１２１９；ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ ｐ<０．００１２４１）（図６）。この効果はＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ではさらに顕著であった。マクロファージによるＨＡｄＶ５粒子の取り込みは、ポリイノシン酸（Ｐｏｌｙ－（Ｉ））の存在下で有意に抑制された。Ｐｏｌｙ－（Ｉ）はスカベンジャー受容体に結合し、飽和させるため、スカベンジャー受容体を介したウイルス取り込み機構が確認された。細胞とＰｏｌｙ－（Ｉ）のプレインキュベーションは、マクロファージによるＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２の取り込みに影響を与えなかった。興味深いことに、Ｐｏｌｙ－（Ｉ）と細胞のプレインキュベーションは、マクロファージによるＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３粒子の取り込みを増加させた。
【0174】
ＦＸ結合を切断したＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ベクター粒子は天然ＩｇＭによる中和から逃れる
他の者及び本発明者らは、ＦＸがアデノウイルス５型ベクター粒子を天然のＩｇＭ抗体による中和から遮蔽することを示した（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らは、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３が有意に減少したＦＸ結合を示すことを確認したので（図５）、これらの粒子がヒト及びマウスのＩｇＭによる中和を受けやすくなるかどうかを分析した。したがって、本発明者らは、異なるドナー及びマウス系統の検証可能なＡｄ－ナイーブヒトおよびマウス血漿サンプルとベクター粒子をインキュベートし、続いてＡ５４９細胞形質導入を分析した（図７）。ＦＸと正常に結合する対照ＨＡｄＶ５ベクター粒子（図５）は、ヒトまたはマウス血漿の存在下で、ＰＢＳでインキュベートしたときと同じ効率でＡ５４９細胞を形質導入した。一方、ＦＸとの結合が低下しているＨＡｄＶ５－ΔＦＸ粒子（図５）をプレインキュベーションすると、ヒトおよびマウスの両方の血漿とのインキュベーションで天然ＩｇＭによりほぼ完全に中和された。しかしながら、興味深いことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３がＨＡｄＶ５－ΔＦＸと同等のＦＸ結合の減少を示すにもかかわらず（ＨＡｄＶ５－ΔＦＸのそれぞれのプレインキュベーションと比較してｐ<５ｘ１０－１１）、本発明者らはこの効果を観察しなかった（図５）。このように、本発明者らは、導入したＭｕｔ３変異により、ＦＸ遮蔽を欠いたベクター粒子が天然のＩｇＭから逃れることができることを示す。
他の者及び本発明者らは、ＦＸがアデノウイルス５型ベクター粒子を天然のＩｇＭ抗体による中和から遮蔽することを示した（Ｋｒｕｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らは、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３が有意に減少したＦＸ結合を示すことを確認したので（図５）、これらの粒子がヒト及びマウスのＩｇＭによる中和を受けやすくなるかどうかを分析した。したがって、本発明者らは、異なるドナー及びマウス系統の検証可能なＡｄ－ナイーブヒトおよびマウス血漿サンプルとベクター粒子をインキュベートし、続いてＡ５４９細胞形質導入を分析した（図７）。ＦＸと正常に結合する対照ＨＡｄＶ５ベクター粒子（図５）は、ヒトまたはマウス血漿の存在下で、ＰＢＳでインキュベートしたときと同じ効率でＡ５４９細胞を形質導入した。一方、ＦＸとの結合が低下しているＨＡｄＶ５－ΔＦＸ粒子（図５）をプレインキュベーションすると、ヒトおよびマウスの両方の血漿とのインキュベーションで天然ＩｇＭによりほぼ完全に中和された。しかしながら、興味深いことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３がＨＡｄＶ５－ΔＦＸと同等のＦＸ結合の減少を示すにもかかわらず（ＨＡｄＶ５－ΔＦＸのそれぞれのプレインキュベーションと比較してｐ<５ｘ１０－１１）、本発明者らはこの効果を観察しなかった（図５）。このように、本発明者らは、導入したＭｕｔ３変異により、ＦＸ遮蔽を欠いたベクター粒子が天然のＩｇＭから逃れることができることを示す。
【0175】
形質導入エンハンサーとしての第Ｘ因子の存在下でＨＡｄＶ５－ＴＳＧ６を形質導入したＭＳＣによるＨＡｄＶ５にコードされた治療用タンパク質ＴＳＧ－６の分泌の有意な増強
第Ｘ因子（ＦＸ）の存在下で、ＭＳＣによる代表的な治療用タンパク質としてのＴＳＧ－６の発現およびその後の分泌は、有意に促進されることがわかった（図８）。ＦＸ存在下においてｐＭＯＩ９００で形質導入された細胞の上清中のＴＳＧ－６濃度は、ＦＸ非存在下においてｐＭＯＩ２００００で形質導入された細胞の上清中のＴＳＧ－６濃度と比較して約３倍であった。
第Ｘ因子（ＦＸ）の存在下で、ＭＳＣによる代表的な治療用タンパク質としてのＴＳＧ－６の発現およびその後の分泌は、有意に促進されることがわかった（図８）。ＦＸ存在下においてｐＭＯＩ９００で形質導入された細胞の上清中のＴＳＧ－６濃度は、ＦＸ非存在下においてｐＭＯＩ２００００で形質導入された細胞の上清中のＴＳＧ－６濃度と比較して約３倍であった。
【0176】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を使用すると、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）と比較して、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入が改善または維持される
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３をＨＡｄＶ５と比較すると、いくつかの腫瘍細胞株への導入効率が向上もしくは維持されていることがわかり、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を腫瘍溶解性ウイルスとして利用するメリットがあることが示唆された（図９）。例えば、ｅＧＦＰ陽性のＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞の割合は、ＨＡｄＶ５（ｐＭＯＩ ３００）と比較してＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を用いた場合、約２０％から約７５％増加することができる。
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３をＨＡｄＶ５と比較すると、いくつかの腫瘍細胞株への導入効率が向上もしくは維持されていることがわかり、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を腫瘍溶解性ウイルスとして利用するメリットがあることが示唆された（図９）。例えば、ｅＧＦＰ陽性のＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞の割合は、ＨＡｄＶ５（ｐＭＯＩ ３００）と比較してＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３を用いた場合、約２０％から約７５％増加することができる。
【0177】
ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ５）とエンハンサーとのプレインキュベーション、またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３の利用により、ＭＳＣの形質導入が有意に促進された
ＭＳＣがＨＡｄＶ５のみで形質導入されるとｅＧＦＰ発現はほとんど検出されないが、すべての増強分子（エンハンサー）および変異型ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ウイルスベクターは平均蛍光強度（ＭＦＩ）を８００倍以上まで統計的に有意に改善することがわかった（図１０）。驚くべきことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３による導入では、増強分子を使用せずに高いｅＧＦＰ発現（ＨＡｄＶ５導入に比べてＭＦＩが６００倍以上増加）が得られた。
ＭＳＣがＨＡｄＶ５のみで形質導入されるとｅＧＦＰ発現はほとんど検出されないが、すべての増強分子（エンハンサー）および変異型ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ウイルスベクターは平均蛍光強度（ＭＦＩ）を８００倍以上まで統計的に有意に改善することがわかった（図１０）。驚くべきことに、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３による導入では、増強分子を使用せずに高いｅＧＦＰ発現（ＨＡｄＶ５導入に比べてＭＦＩが６００倍以上増加）が得られた。
【0178】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３と増強分子であるスペルミジン（５００ｆｇ／ウイルス粒子）、スペルミン（１２５０ｆｇ／ウイルス粒子）、第Ｘ因子（４ｆｇ／ウイルス粒子）の組み合わせも検討した（図１２）。その結果、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３による細胞の形質導入は、増強分子によってわずかに（３倍）増強されることがわかった。
【0179】
エンハンサーでプレインキュベートしたＨＡｄＶ５ｗｔを使用するか、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔを使用することによる、ＭＳＣでのアデノウイルス複製が改善
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔだけでなく、増強分子もＨＡｄＶ５ｗｔ単独での感染と比較して、アデノウイルスの複製を改善することがわかった。特に、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔは、使用するｐＭＯＩに依存せず、４８時間後に最大約５ｘ１０３の感染性粒子／ＭＳＣを示すことが明らかになった。スペルミジンとＨＡｄＶ５ｗｔのｐＭＯＩが１０００の組み合わせのみが、同様に高いウイルス収量（～４．７ｘ１０３ウイルス粒子／ＭＳＣ）となる。ＨＡｄＶ５ｗｔとエンハンサーの他の全ての組み合わせでは、感染性アデノウイルス粒子が時間の経過とともに蓄積し（おそらく、最初は感染していなかったＭＳＣの一定の再感染が原因）、検出可能なピークを示さなかった。
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔだけでなく、増強分子もＨＡｄＶ５ｗｔ単独での感染と比較して、アデノウイルスの複製を改善することがわかった。特に、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３ｗｔは、使用するｐＭＯＩに依存せず、４８時間後に最大約５ｘ１０３の感染性粒子／ＭＳＣを示すことが明らかになった。スペルミジンとＨＡｄＶ５ｗｔのｐＭＯＩが１０００の組み合わせのみが、同様に高いウイルス収量（～４．７ｘ１０３ウイルス粒子／ＭＳＣ）となる。ＨＡｄＶ５ｗｔとエンハンサーの他の全ての組み合わせでは、感染性アデノウイルス粒子が時間の経過とともに蓄積し（おそらく、最初は感染していなかったＭＳＣの一定の再感染が原因）、検出可能なピークを示さなかった。
【0180】
ＭＳＣの導入は、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動を抑制しない
ＭＳＣはＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動が、単独培養培地に比べて有意に増加していることがわかった（図１３）。驚くべきことに、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動は、ＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３で細胞を形質導入しても阻害されないことがわかった。試験した増強分子はいずれも否定的な効果を示さなかった。
ＭＳＣはＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動が、単独培養培地に比べて有意に増加していることがわかった（図１３）。驚くべきことに、ＵＭ－ＳＣＣ－１１Ｂ細胞への移動は、ＨＡｄＶ５またはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３で細胞を形質導入しても阻害されないことがわかった。試験した増強分子はいずれも否定的な効果を示さなかった。
【0181】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－Ｍ３）を使用すると、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ－５）と比較して、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入が改善または維持され、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－ΔＣＡＲ－Ｍ３）を使用すると、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ（ＨＡｄＶ－５－ΔＣＡＲ）と比較して、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入が改善された
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３をＨＡｄＶ５と比較すると、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入効率が改善または維持されていることがわかった（図１５、図９も参照）。
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３をＨＡｄＶ５と比較すると、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入効率が改善または維持されていることがわかった（図１５、図９も参照）。
【0182】
また、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３を用いた場合、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲと比較して、いくつかの腫瘍細胞株の形質導入効率が著しく改善されることがわかった（図１５）。これは、ＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３により、腫瘍細胞のＣＡＲ非依存的な形質導入が可能になることを示している。
【0183】
ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－Ｍ３）とＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３（ＨＡｄＶ－５－ΔＣＡＲ－Ｍ３）を利用すると、ＭＳＣの形質導入が有意に向上し、ＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１（ＨＡｄＶ－５－ΔＨＶＲ１）とＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２（ＨＡｄＶ－５－Ｍ２）を利用してもＭＳＣの形質導入が行われない。
ＭＳＣはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３およびＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３ベクターによって効率的に形質導入される一方、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ－５）によって形質導入されるとｅＧＦＰ発現がほとんど検出されないことがわかった（図１６、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３およびＨＡｄＶ５については図１０も参照のこと）。
ＭＳＣはＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３およびＨＡｄＶ５－ΔＣＡＲ－Ｍｕｔ３ベクターによって効率的に形質導入される一方、ＨＡｄＶ５野生型（ＨＡｄＶ－５）によって形質導入されるとｅＧＦＰ発現がほとんど検出されないことがわかった（図１６、ＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ３およびＨＡｄＶ５については図１０も参照のこと）。
【0184】
さらに、ＭＳＣはＨＡｄＶ５－ΔＨＶＲ１およびＨＡｄＶ５－Ｍｕｔ２によって形質導入されないことが判明した（図１６）。
【0185】
参考文献
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Ｆｅｋｅｔｅ Ｎ．， Ｇａｄｅｌｏｒｇｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｏｏｌｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ： ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ， ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１２；１４：５４０－５５４．
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】