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特表2022-552953サッカロマイセス・セレビシエを用いた簡単な前駆体原料からのカンナビノイドの持続可能な生成
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-21
(54)【発明の名称】サッカロマイセス・セレビシエを用いた簡単な前駆体原料からのカンナビノイドの持続可能な生成
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20221214BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221214BHJP
C12P 7/02 20060101ALI20221214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N1/19 ZNA
C12P7/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022521614
(86)(22)【出願日】2020-10-12
(85)【翻訳文提出日】2022-06-07
(86)【国際出願番号】 SG2020050584
(87)【国際公開番号】W WO2021071439
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】62/914,058
(32)【優先日】2019-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507421865
【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティ オブ シンガポール
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】リム，ケヴィン ジー ハン
(72)【発明者】
【氏名】ゴー，メイベル ダーリーン コー
(72)【発明者】
【氏名】ユー，ウェン シャン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC13
4B064AC16
4B064AC19
4B064AH19
4B064CA06
4B064CA19
4B064CB30
4B064CC24
4B064CD07
4B064DA01
4B065AA80X
4B065AA80Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BD29
4B065CA05
4B065CA44
(57)【要約】
生合成経路遺伝子をコードする核酸をゲノム内に含むサッカロマイセス・セレビシエの組換え細胞。カンナビノイドが、カンナビノイド前駆体基質の存在下で組換え細胞により生成され、カンナビノイド生合成経路遺伝子の少なくとも１つは、カンナビス・サティバ以外の生物体に由来し、該カンナビノイド生合成経路遺伝子の少なくとも１つは、プレニルトランスフェラーゼをコードする。実施形態において、プレニルトランスフェラーゼは、配列番号８～１１の任意の１つのアミノ酸配列を有sるうストレプトマイセスｓｐ由来のＮｐｈＢである。同じく開示されるのは、カンナビノイドを、組換え細胞およびカンナビノイド前駆体基質で生成するための方法である。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それぞれがカンナビノイド生合成経路遺伝子をコードする複数の核酸をそのゲノム内に含む、サッカロマイセス・セレビシエの組換え細胞であって、前記組換え細胞によりカンナビノイド前駆体基質の存在下でカンナビノイドが生成され、前記カンナビノイド生合成経路遺伝子の少なくとも１つが、カンナビス・サティバではない生物に由来する、組換え細胞。
【請求項2】
前記複数の核酸の１つが、プレニルトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項3】
前記プレニルトランスフェラーゼが、ストレプトマイセスｓｐ由来のＮｐｈＢである、請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項4】
前記プレニルトランスフェラーゼが、配列番号８～１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号８～１１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、を有する、請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項5】
前記複数の核酸の１つが、ニコチアナ・タバカムの４－クマリルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）リガーゼ、ロドシュードモナス・パルストリの安息香酸ＣｏＡリガーゼ、およびストレプトマイセス・コエリカラーのフェニル酢酸ＣｏＡリガーゼからなる群から選択されるＣｏＡリガーゼをコードする、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項6】
前記ＣｏＡリガーゼが、配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１～３と少なくとも７０％同一であり且つＣｏＡリガーゼ活性を有するアミノ酸配列、を有する、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項7】
前記複数の核酸の１つが、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）をコードする、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項8】
前記ＭＣＳが、配列番号５のアミノ酸配列を、またはＭＣＳ活性を有する配列番号５と７０％同一のアミノ酸配列、を有する、請求項７に記載の組換え細胞。
【請求項9】
前記カンナビノイド前駆体基質が、表１に列挙された前記カンナビノイド前駆体基質から選択される、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項10】
前記カンナビノイド前駆体基質が、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、またはオクタン酸である、請求項９に記載の組換え細胞。
【請求項11】
請求項１に記載の組換え細胞をカンナビノイド前駆体基質と接触させること、および前記組換え細胞を培養すること、を含む、カンナビノイドを生成するための方法。
【請求項12】
前記カンナビノイド前駆体基質が、表１に列挙された前記カンナビノイド前駆体基質から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記カンナビノイド前駆体基質が、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、またはオクタン酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記複数の核酸の１つが、プレニルトランスフェラーゼをコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記プレニルトランスフェラーゼが、ストレプトマイセスｓｐ由来のＮｐｈＢである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記プレニルトランスフェラーゼが、配列番号８～１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号８～１１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記複数の核酸の１つが、ニコチアナ・タバカムの４－クマリルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）リガーゼ、ロドシュードモナス・パルストリの安息香酸ＣｏＡリガーゼ、およびストレプトマイセス・コエリカラーのフェニル酢酸ＣｏＡリガーゼからなる群から選択されるＣｏＡリガーゼをコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
前記ＣｏＡリガーゼが、配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはＣｏＡリガーゼ活性を有する配列番号１～３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、を有する、、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記複数の核酸の１つが、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
前記ＭＣＳが、配列番号５のアミノ酸配列、またはＭＣＳ活性を有する配列番号５と７０％同一のアミノ酸配列、を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
配列番号８～１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有する、プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項22】
配列番号８～１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するプレニルトランスフェラーゼをコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
背景
本来は、植物カンナビス・サティバ（Cannabis. sativa）から単離される化合物であるフィトカンナビノイドの研究的および治療的使用は、大部分が法的および社会的問題により阻まれてきた。植物中の他のカンナビノイドとの混合物として生成されるΔ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）などの幾つかのカンナビノイドは、精神活性であることが見出されている。しかし、Ｃ．サティバから単離される少なくとも１１３種の公知のカンナビノイドが存在し（Ａｉｚｐｕｒｕａ－Ｏｌａｉｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ２０１６， ７９（２）：３２４－３３１）、そのほとんどが非精神活性であり、はっきりと異なる薬理学的特性を有する。
本来は、植物カンナビス・サティバ（Cannabis. sativa）から単離される化合物であるフィトカンナビノイドの研究的および治療的使用は、大部分が法的および社会的問題により阻まれてきた。植物中の他のカンナビノイドとの混合物として生成されるΔ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）などの幾つかのカンナビノイドは、精神活性であることが見出されている。しかし、Ｃ．サティバから単離される少なくとも１１３種の公知のカンナビノイドが存在し（Ａｉｚｐｕｒｕａ－Ｏｌａｉｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ２０１６， ７９（２）：３２４－３３１）、そのほとんどが非精神活性であり、はっきりと異なる薬理学的特性を有する。
【0002】
ヒトカンナビノイド受容体の広範囲の発現から、これらの化合物がヒトの身体に幅広い影響を有することが暗示される。主な２クラスの受容体が存在し、ＣＢ１受容体は、主に中枢神経系で発現され、一方でＣＢ２受容体は、主として末梢免疫系に見出される。加えて研究では、心臓、副腎、肺、脾臓および扁桃腺などの様々なヒト組織中のこれらの受容体の発現に及んでいない（Ｇａｌｉｅｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９５， ２３２（１）：５４－６１）。カンナビノイドとこれらの受容体との関連性が、ヒトの体内の生物系の広範囲に潜在的に影響を及ぼし得るシグナル伝達経路を作動させる。
【0003】
フィトカンナビノイドは、米国食品医薬品局により集中化学療法の癌処置を受ける患者への制吐薬として（ＴＨＣ ａｎｄ Ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ； Ｐｅｒｔｗｅｅ， Ｆｏｒｓｃｈ． Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｍｅｄ．， １９９９， Ｓｕｐｐｌ ３：１２－１５）、そして英国では他の薬物療法に非応答性の多発性硬化症の患者の痙性への高度に効果的な処置として（Ｆｌａｃｈｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２０１４， ７１（５－６）：２７１－２７９）、臨床での使用が認可されている。様々な試験で、抗腫瘍薬（Ｖｅｌａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ， ２０１２， １２（６）：４３６－４４４； Ｍａｒｉａ Ｐｙｓｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏ． Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０１６，．９：４３２３－４３３６）、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の複数の菌株に効果的になり得る抗菌剤（Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ２００８， ７１（８）：１４２７－１４３０）として、フィトカンナビノイドの治療能力も示されている。
【0004】
カンナビノイド研究におけるこれらの近年の発展に照らせば、法的カンナビスの市場は現在、国際的には７７億米ドルに値すると推定され、これは２０２１年までに３１４億米ドル前後に成長すると予期されている （Ｚｈａｎｇ， Ｆｏｒｂｅｓ， ２０１７）。
【0005】
現在、研究的または治療的使用のためのカンナビノイドのほとんどが、Ｃ．サティバ抽出物から生成されている。Ｃ．サティバの中の混合物として生成されるＴＨＣなどの精神活性成分は高濃度であるため、植物抽出物の違法使用に関連する法的および社会的意味合いは、伝統的栽培が直面した最大の難題を提起している。Ｃ．サティバの栽培で生成されるカンナビノイドの選択性の制御は限定されている。さらに、治療能力に関する研究のためにカンナビジバリン（ＣＢＤＶ）およびカンナビシクロール（ＣＢＬ）などの微量のカンナビノイドを生成するＣ．サティバ系統については市場に大きな格差がある。
【0006】
これらの植物の栽培は、環境因子を制御するために高度にエネルギー集約的な工程が必要であるため高費用になるだけでなく、それは環境的に持続可能でない。Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＥｎｅｒｇｙ ＆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓグループにより２０１２年に実行された研究では、米国のみでのカンナビノイド栽培の屋内実践からのエネルギー消費コストが、年間６０億米ドル前後であると推定された。さらに、最終生成物を１キログラム生成するためのこの実践からの温室効果ガス排出量は、車３００万台のそれに相当する（Ｍｉｌｌｓ， Ｅｎｅｒｇｙ Ｐｏｌｉｃｙ， ２０１２， ４６：５８－６７）。
【0007】
先に記載された複雑な問題を回避するカンナビノイド生成の代替手段が、求められている。
【発明の概要】
【0008】
概要
提示された要求を満たすために、カンナビノイドがカンナビノイド前駆体基質の存在下で組換え細胞により生成されるように、それぞれがカンナビノイド生合成経路遺伝子をコードする複数の核酸をそのゲノム内に含有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の組換え細胞が、提供される。カンナビノイド生合成経路遺伝子の少なくとも１つは、カンナビス・サティバ由来でない。
提示された要求を満たすために、カンナビノイドがカンナビノイド前駆体基質の存在下で組換え細胞により生成されるように、それぞれがカンナビノイド生合成経路遺伝子をコードする複数の核酸をそのゲノム内に含有するサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の組換え細胞が、提供される。カンナビノイド生合成経路遺伝子の少なくとも１つは、カンナビス・サティバ由来でない。
【0009】
同じく開示されるのは、組換え細胞をカンナビノイド前駆体基質と接触させること、および組換え細胞を培養すること、によりカンナビノイドを生成するための方法である。
【0010】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、この記載および以下の実施例に表される。他の特色、目的、および利点は、詳細な記載から、図面から、そして添付の特許請求の範囲からも明白となろう。
【0011】
以下の発明の記載は、添付の図面を参照している。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図3A】図３Ａは、経路（レベル２）の生物学的部分（レベル０）からの組み立てからのクローニング手順を示したＹｅａｓｔＦａｂ経路アッセイシステムの概略的表示である。Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０１５，． ４３（１３）：ｅ８８からの撮影画像。
【図4】図４は、Ｓ．セレビシエ中で生成されたカンナビノイドのＬＣ－ＭＳ分析の抽出されたイオンカウント（左側）および質量スペクトル（右側）を示す：（１段目）４ＣＬおよびＭＣＳを発現する陰性対照構築物４ＭＥ；（２段目）４ＣＬ、ＭＣＳ、ＯＬＳおよびＯＡＣを発現する構築物４ＭＯＯ；ならびに（最下段）ＯＬＡ標準。
【図5】図５は、インビトロ酵素アッセイのＬＣ－ＭＳ分析の抽出されたイオンカウントおよび質量スペクトルを示す：ＧＰＰおよびＯＬＡでの酵素不含の陰性対照（一段目）、ＧＰＰおよびＯＬＡでの酵素ＧＯＴ（２段目）、ＧＰＰおよびＯＬＡでの酵素ＮｐｈＢ（３段目）、ならびにＣＢＧＡ標準（最下段）。
【図6】図６は、Ｓ．セレビシエ中のゲラニオール生合成と共にモノテルペン前駆体ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰを過剰発現する単純化されたメバロン酸経路を示す（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１６， １００（１０）：４５６１－４５７１）。本発明のシステムにおいてＧＰＰを生成するように適合された遺伝子に下線を付している。
【図7】図７は、Ｓ．セレビシエ中で生成されたカンナビノイドのＬＣ－ＭＳ分析の抽出されたイオンカウントおよび質量スペクトルを示す：陰性対照は、カンナビノイド遺伝子のみを発現する構築物４ＭＯＯＮ ｐＭＫＵ＋Ｅｍｐｔｙ ｐＣＫＬ（１段目）であり、ｐＭＫＵベクター上のカンナビノイド遺伝子およびｐＣＫＬ上のメバロン酸遺伝子を発現する（２段目）、ならびにＣＢＧＡ標準を発現する（最下段）構築物４ＭＯＯＮ ｐＭＫＵ＋ＩＨＵＥ ｐＣＫＬ。
【図8】図８は、ＯＬＡとＤＶＡの炭素鎖長の差を示す（Ｇｒｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｂ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｓｃｉ． Ｃｒｙｓｔ． Ｅｎｇ． Ｍａｔｅｒ， ２０１６， ７２（Ｐｔ ２）：１７１－１７９）。
【図10-1】図１０は、抽出されたイオンカウントＬＣ－ＭＳ分析により同定されたＥ．コリ中で生成された新規なオリベトール酸類似体の構造を３列目に示す。Ｅ．コリは、１列目に示された生合成経路を発現し、２列目に示された基質とインキュベートされた。４ＭＯＯ＝４－クマリルＣｏＡリガーゼ、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）；ＢＭＯＯ＝安息香酸ＣｏＡリガーゼ、ＭＣＳ、ＯＬＳ、およびＯＡＣ；ＣＭＯＯ＝シンナミルＣｏＡリガーゼ、ＭＣＳ、ＯＬＳ、およびＯＡＣ；ならびにＰＭＯＯ＝フェニル酢酸ＣｏＡリガーゼ、ＭＣＳ、ＯＬＳ、およびＯＡＣ。
【図10-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0013】
詳細な説明
先に要約された通り、提供された組換え細胞は、それぞれがカンナビノイド生合成経路遺伝子をコードする複数の核酸をそのゲノム内に含有する。例示的組換え細胞において、カンナビノイド生合成経路遺伝子は、カンナビス・サティバ以外の生物体由来である。
先に要約された通り、提供された組換え細胞は、それぞれがカンナビノイド生合成経路遺伝子をコードする複数の核酸をそのゲノム内に含有する。例示的組換え細胞において、カンナビノイド生合成経路遺伝子は、カンナビス・サティバ以外の生物体由来である。
【0014】
本発明に包含される特定の組換え細胞は、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）リガーゼをコードする核酸を含有する。ＣｏＡリガーゼは、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）の４－クマリルＣｏＡリガーゼ（配列番号：１）、ロドシュードモナス・パルストリ（Rhodopseudomonas palstri）の安息香酸ＣｏＡリガーゼ（配列番号：２）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）のフェニル酢酸ＣｏＡリガーゼ（配列番号：３）であり得るが、これらに限定されない。ＣｏＡリガーゼは、酵素活性を保持しながら、上述の配列に対して７０％以上の（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％の、またはより大きな）同一性を有し得る。
【0015】
さらに組換え細胞は、マロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）、オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ）、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）のそれぞれをコードする核酸を含み得る。個々の組換え細胞において、ＭＣＳは、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）に置き換えられている。
【0016】
ＭＣＳは、配列番号：５のアミノ酸配列を有し得、ＯＬＳは、配列番号：６のアミノ酸配列を有し得、ＯＡＣは、配列番号：７のアミノ酸配列を有し得、ＡＡＥは、配列番号：４のアミノ酸配列を有し得る。
【0017】
あるいはＭＣＳ、ＯＬＳ、ＯＡＣ、およびＡＡＥは、対応する配列番号のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【0018】
先に表された組換え細胞は、カンナビノイド前駆体基質の存在下でカンナビノイドを生成することになる。カンナビノイド前駆体基質は、例えば酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、およびオクタン酸であり得る。追加的なカンナビノイド前駆体基質を、以下の表１に示す。
【0019】
【表1】
【0020】
概要の節に表された通り、先に記載された組換え細胞を使用するカンナビノイドを生成するための方法が、開示される。該方法は、組換え細胞をカンナビノイド前駆体基質と接触させること、および組換え細胞を培養すること、により実行される。
【0021】
例示的な方法において、組換え細胞は、ＣｏＡリガーゼ、マロニルＣｏＡシンセターゼ、オリベトールシンターゼ、およびオリベトール酸シクラーゼを発現し、カンナビノイド前駆体基質は、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、またはオクタン酸である。先の表１に示された追加的カンナビノイド前駆体基質もまた、この方法で用いられ得る。
【0022】
サッカロマイセス・セレビシエなどの微生物の中で合成的に再構成されたカンナビノイド生合成経路が、多量および微量のカンナビノイドのバイオプロダクションに用いられる。このバイオプロダクションの方法は、Ｃ．サティバの栽培により生成されるカンナビノイドの混合物に比較して、該当する特異的カンナビノイドの生成を容易にする。さらに、微量のカンナビノイドが、高収率で生成され得る。加えて、カンナビノイド生合成経路における酵素が、操作され、微生物中で発現されて、治療能力を有する新規かつ特有のカンナビノイドを生成することができる。
【0023】
当業者は、さらなる労作がなくとも、本明細書の開示に基づけば、本開示を最も完全な程度に利用し得ると考えられる。それゆえ以下の具体的実施例は、単に記載としてとらえられ、本開示の残り部分の限定ととらえるべきでない。本明細書で引用された全ての発行物は、全体として参照により組み入れられる。
【実施例】
【0024】
実施例１：カンナビノイド生合成経路の改変
微生物中のカンナビノイド生合成経路を再構築するためには、最初にこの経路の各ステップを触媒するＣ．サティバ中に存在する酵素を理解する必要がある。図１参照。
微生物中のカンナビノイド生合成経路を再構築するためには、最初にこの経路の各ステップを触媒するＣ．サティバ中に存在する酵素を理解する必要がある。図１参照。
【0025】
上流の生合成経路は、２つの機能的部分、つまりオリベトール酸（ＯＬＡ）を最終生成物として生成するポリケチド経路、およびゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成するイソプレノイド経路に分類され得る。
【0026】
ポリケチドＯＬＡ生成
ポリケチド経路（図１の赤色を参照）は、基質のヘキサン酸およびマロニルＣｏＡで開始する。ＣｓＡＡＥ１（配列番号：４）と命名されたアシル活性化酵素が、Ｃ．サティバのトリコーム中のヘキサン酸へのコエンザイムＡ部分の付加を担う（Ｓｔｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２０１２， ７１（３）：３５３－３６５）。オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ：配列番号：６）と命名されたＩＩＩ型ポリケチドシンターゼはその後、１単位のヘキサノイルＣｏＡおよび３単位のマロニルＣｏＡを利用することにより、テトラケチドチオエステル（３，５，７－トリオキソドデカノイルＣｏＡ）の形成を触媒する（Ｔａｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，， ２００９， ５８３（１２）：２０６１－２０６６）。最後に、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ；配列番号：７)は、Ｃ２～Ｃ７アルドール縮合環化ステップを触媒して、ＯＬＡを生成する（Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２０１２， １０９（３１）：１２８１１－１２８１６）。
ポリケチド経路（図１の赤色を参照）は、基質のヘキサン酸およびマロニルＣｏＡで開始する。ＣｓＡＡＥ１（配列番号：４）と命名されたアシル活性化酵素が、Ｃ．サティバのトリコーム中のヘキサン酸へのコエンザイムＡ部分の付加を担う（Ｓｔｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２０１２， ７１（３）：３５３－３６５）。オリベトールシンターゼ（ＯＬＳ：配列番号：６）と命名されたＩＩＩ型ポリケチドシンターゼはその後、１単位のヘキサノイルＣｏＡおよび３単位のマロニルＣｏＡを利用することにより、テトラケチドチオエステル（３，５，７－トリオキソドデカノイルＣｏＡ）の形成を触媒する（Ｔａｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，， ２００９， ５８３（１２）：２０６１－２０６６）。最後に、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ；配列番号：７)は、Ｃ２～Ｃ７アルドール縮合環化ステップを触媒して、ＯＬＡを生成する（Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２０１２， １０９（３１）：１２８１１－１２８１６）。
【0027】
イソプレノイドＧＰＰ生成
Ｃ．サティバ中では、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）などのイソプレノイドが、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール４－リン酸（ＭＥＰ）経路を通して生成される（図１の青色を参照）（Ｖａｎ Ｂａｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．， ２０１１， １２（１０）：Ｒ１０２）。推定的ゲラニルピロリン酸シンターゼはその後、１単位のＤＭＡＰＰと１単位のＩＰＰを組み合わせて、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成する。イソプレノイドはまた、酵母および幾つかの細菌などの微生物中により共通して存在するメバロン酸経路を通して自然に生成され得る（Ｂｕｈａｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００７， ４０（９－１０）：５７５－５８４）。
Ｃ．サティバ中では、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）などのイソプレノイドが、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール４－リン酸（ＭＥＰ）経路を通して生成される（図１の青色を参照）（Ｖａｎ Ｂａｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．， ２０１１， １２（１０）：Ｒ１０２）。推定的ゲラニルピロリン酸シンターゼはその後、１単位のＤＭＡＰＰと１単位のＩＰＰを組み合わせて、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生成する。イソプレノイドはまた、酵母および幾つかの細菌などの微生物中により共通して存在するメバロン酸経路を通して自然に生成され得る（Ｂｕｈａｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００７， ４０（９－１０）：５７５－５８４）。
【0028】
エンドポイントのカンナビノイド
ＯＬＡおよびＧＰＰが生成されると、芳香族プレニルトランスフェラーゼ酵素であるゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）はその後、ＧＰＰ中のＣ１０プレニル基をオリベトール酸のＣ３に転移することにより、最初のカンナビノイドであるカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ） の生成を触媒する（Ｆｅｌｌｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９８， ４２７（２）：２８３－２８５；図１参照）。テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）およびカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）などの異なるカンナビノイドの生合成はその後、それぞれのシンターゼ（即ち、ＴＨＣＡシンターゼおよびＣＢＤＡシンターゼ）により、ＧＰＰから前もって転移されたＣＢＧＡ上のＣ１０炭素鎖を異なった方法で環化すること（図１の黒色を参照）により実行され得る。
ＯＬＡおよびＧＰＰが生成されると、芳香族プレニルトランスフェラーゼ酵素であるゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）はその後、ＧＰＰ中のＣ１０プレニル基をオリベトール酸のＣ３に転移することにより、最初のカンナビノイドであるカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ） の生成を触媒する（Ｆｅｌｌｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９８， ４２７（２）：２８３－２８５；図１参照）。テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）およびカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）などの異なるカンナビノイドの生合成はその後、それぞれのシンターゼ（即ち、ＴＨＣＡシンターゼおよびＣＢＤＡシンターゼ）により、ＧＰＰから前もって転移されたＣＢＧＡ上のＣ１０炭素鎖を異なった方法で環化すること（図１の黒色を参照）により実行され得る。
【0029】
カンナビノイド生合成経路の修飾
カンナビノイド生合成になされる修飾を、図１に緑色で示す。分子ツールキットは、４つの異なるアシルＣｏＡリガーゼを利用して様々な官能基を有するアシルＣｏＡチオエステルを生成するように過去に確立された（Ｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１２， ５１（２２）：４５６８－４５７９）。植物ニコチアナ・タバカムから単離された４－クマリルＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）（配列番号：１）、グラム陰性菌ロドシュードモナス・パルストリ由来の安息香酸ＣｏＡリガーゼ（ＢＺＬ）（配列番号：２）およびグラム陽性菌ストレプトマイセス・コエリカラー由来のフェニル酢酸ＣｏＡリガーゼ（ＰＣＬ）（配列番号：３）は、それぞれＯＬＳのネイティブ基質ヘキサン酸をはじめとするカルボン７０種（先の表１参照）の多様な範囲に対して基質無差別性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であることが決定された。さらに土壌菌リゾビウム・トリフォリー由来のマロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）は、ＣｏＡ部分を有する複数のマロン酸をプライミングして、ＯＬＳなどのＩＩＩ型ポリケチドシンターゼのためのエクステンダー単位として作用する。これらの特徴がはっきりした基質無差別性のＣｏＡリガーゼをＣ．サティバ由来のＣｓＡＡＥ１の代わりにこの経路で用いると、多様なカンナビノイドの下流生成が容易になる。
カンナビノイド生合成になされる修飾を、図１に緑色で示す。分子ツールキットは、４つの異なるアシルＣｏＡリガーゼを利用して様々な官能基を有するアシルＣｏＡチオエステルを生成するように過去に確立された（Ｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１２， ５１（２２）：４５６８－４５７９）。植物ニコチアナ・タバカムから単離された４－クマリルＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）（配列番号：１）、グラム陰性菌ロドシュードモナス・パルストリ由来の安息香酸ＣｏＡリガーゼ（ＢＺＬ）（配列番号：２）およびグラム陽性菌ストレプトマイセス・コエリカラー由来のフェニル酢酸ＣｏＡリガーゼ（ＰＣＬ）（配列番号：３）は、それぞれＯＬＳのネイティブ基質ヘキサン酸をはじめとするカルボン７０種（先の表１参照）の多様な範囲に対して基質無差別性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であることが決定された。さらに土壌菌リゾビウム・トリフォリー由来のマロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）は、ＣｏＡ部分を有する複数のマロン酸をプライミングして、ＯＬＳなどのＩＩＩ型ポリケチドシンターゼのためのエクステンダー単位として作用する。これらの特徴がはっきりした基質無差別性のＣｏＡリガーゼをＣ．サティバ由来のＣｓＡＡＥ１の代わりにこの経路で用いると、多様なカンナビノイドの下流生成が容易になる。
【0030】
各ＣｏＡリガーゼは、ＣｏＡ部分をマロン酸上に付加することを担うマロニルＣｏＡシンセターゼ（ＭＣＳ）と対合される。
【0031】
異種系の中でＣ．サティバ由来のプレニルトランスフェラーゼ、即ちＧＯＴを発現するのは、難題である。事実、この酵素は、バイオインフォマティクスの予測ツールＴＭＥＭＭにより示された通り、固有の膜内外領域を有する膜結合タンパク質であると予測される（Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．， ２０１７， １７（４））。図２参照。
【0032】
ストレプトマイセスｓｐ（Streptomyces sp.）由来の可溶性プレニルトランスフェラーゼ、即ちＮｐｈＢは、Ｅ．コリ（E. coli）などの細菌系の中でＯＬＡをプレニルアクセプターとして受容し得ることが過去に示された（Ｋｕｚｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２００５， ４３５（７０４４）：９８３－９８７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１２， ５１（１２）：２６０６－２６１８）。この酵素は、カンナビノイド生合成経路の中でプレニルトランスフェラーゼの異種発現のためのＧＯＴの代替物として用いられた。
【0033】
実施例２：サッカロマイセス・セレビシエ中での構築物の組み立て
Ｓ．セレビシエ中での構築物作製のための分子クローニング方策が、ＹｅａｓｔＦａｂシステムとして知られるプラスミドのＧｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙを基にした一式である。この組み立てシステムは、プロモータおよびターミネータなどの転写単位からオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をモジュール式に組み立てて、続いて最大６つの異なる転写単位の発現カセットを組み立てることができる。
Ｓ．セレビシエ中での構築物作製のための分子クローニング方策が、ＹｅａｓｔＦａｂシステムとして知られるプラスミドのＧｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙを基にした一式である。この組み立てシステムは、プロモータおよびターミネータなどの転写単位からオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をモジュール式に組み立てて、続いて最大６つの異なる転写単位の発現カセットを組み立てることができる。
【0034】
ＹｅａｓｔＦａｂプラスミドの一式は、最大８つの転写単位のまとめて組み立てることができるように拡張された。アセンブリのモジュール性は、有利にはプロモータおよびターミネータなどの転写調節単位を取り換えて生合成経路で異なった方法で各遺伝子の発現を調節するのが比較的容易であるため、下流の最適化を容易にする。経路組み立てのこの方法では、ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＢｓａＩおよびＢｓｍＢＩ）は、酵素認識部位の付近を切断して、制限酵素およびＤＮＡリガーゼの両方をワンポット消化－ライゲーション反応で作用させる。図３Ａを参照されたい。
【0035】
プロモータ、オープンリーディングフレームおよびターミネータなどの標準的な生物学的部分は、個々のプラスミド（レベル０）に個別にクローニングされる。ワンポット消化－ライゲーション反応の第一ラウンドの後、それらは、ＰＯＴと呼ばれる個々の転写単位（レベル１）に組み立てられる。各ＰＯＴはその後、次の反応で別のＰＯＴと合わさって、図３Ｂに表された通り一緒にアライメントされるプレフィックスおよびサフィックスを通して、最大８つの転写単位をまとめて経路（レベル２）を組み立てるように設計される。
【0036】
酵母の構成型プロモータのライブラリが、過去に相対的強度に従って特徴づけられた。生合成経路において各酵素を発現し、相対的反応速度および発現宿主への毒性を反映するように、様々な強度のプロモータおよびターミネータの組を選択した。各ＯＲＦが（以下の表２参照）、酵母内の互いに接近した相同配列の間で頻繁に起こる相同組換えを予防するように、異なるプロモータおよびターミネータを割り付けた（Ｏｒｒ－Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８１， ７８（１０）：６３５４－６３５８）。
【0037】
【表2】
【0038】
割り付けられたプロモータおよびターミネータでの転写単位の組み立ての後、それらを、単一プラスミド中の多数の遺伝子で経路に組み立てた。酵母では、追加的ＩＰＰをＧＰＰに付加することによりＧＰＰのＣ１５バージョンとなるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を、酵素Ｅｒｆ２０ｐにより内因的に生成する。過去の試験では、酵素の二重変異体、即ちＥｒｇ２０ｐＷＷ（Ｆ９６Ｗ－Ｎ１２７Ｗ）の発現が内因性ＧＰＰレベルを上昇させることが示された（Ｉｇｎｅａ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ．， ２０１４， ３（５）：２９８－３０６）。この二重突然変異体を、アビエス・グランディス由来のゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ－ＧＰＰａｓｅ）（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２００２， ４０５（１）：１３０－１３６）およびキメラＧＰＰシンターゼ（Ｃｈｉ－ＧＰＰａｓｅ）と共に用いて、構築物中でＧＰＰを生成して、反応を前進させた。
【0039】
実施例３：カンナビノイドのバイオプロダクション
発現遺伝子を意図したプラスミドに組み立てた後、それらを、意図した生成物のバイオプロダクションのために単一生物体（Ｓ．セレビシエ）の中に形質転換した。アミノ酸メチオニン、ロイシン、ヒスチジンおよびウラシルに対して栄養素要求性である酵母株ＢＹ４７４１（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ， １９９８， １４（２）：１１５－１３２）を、カンナビノイドのバイオプロダクションに用いた。各プラスミドで形質転換された酵母が次に確実に機能的酵素を発現するように、予防的手段として段階的アプローチをとることができる。各ステップの生成物（例えば、ＯＬＡ、ＣＢＧＡ、およびＣＢＤＡ）をその後、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を用いて検出した後、生合成経路の次のステップに移行した。
発現遺伝子を意図したプラスミドに組み立てた後、それらを、意図した生成物のバイオプロダクションのために単一生物体（Ｓ．セレビシエ）の中に形質転換した。アミノ酸メチオニン、ロイシン、ヒスチジンおよびウラシルに対して栄養素要求性である酵母株ＢＹ４７４１（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ， １９９８， １４（２）：１１５－１３２）を、カンナビノイドのバイオプロダクションに用いた。各プラスミドで形質転換された酵母が次に確実に機能的酵素を発現するように、予防的手段として段階的アプローチをとることができる。各ステップの生成物（例えば、ＯＬＡ、ＣＢＧＡ、およびＣＢＤＡ）をその後、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を用いて検出した後、生合成経路の次のステップに移行した。
【0040】
Ｓ．セレビシエ培養物を、静止期まで生育して、酵素を発現させた。基質、即ちヘキサン酸およびマロン酸を培養物に添加し、その後２５℃で一晩インキュベートした。培養物をスピンダウンして、ペレットを上清培地から分離した。細胞ペレットおよび上清培地の両方を、ＬＣ－ＭＳにより意図する生成物の存在についてチェックした。
【0041】
ＬＣ－ＭＳ分析のための試料を調製するために、上清培地をｐＨ＜２．０に酸性化した後、それを酢酸エチルで３回抽出した。抽出された酢酸エチルをロータリー真空濃縮機を用いて乾燥させ、メタノールに再懸濁させ、ＬＣ－ＭＳにより分析した。最初にガラスビーズでの物理的剪断により、または化学的溶解により細胞を溶解することにより、細胞ペレットを意図した生成物の存在についてもチェックした。結果的に溶解物は、酸性化、有機抽出およびＬＣ－ＭＳ分析の類似のステップを受けた。
【0042】
実施例４：新規カンナビノイドの生合成
カンナビノイドライブラリの多様化を実行して、コンピュータ解析に情報提供される３種の異なるアプローチにより、新規で人為的なカンナビノイドを生成することができる。
カンナビノイドライブラリの多様化を実行して、コンピュータ解析に情報提供される３種の異なるアプローチにより、新規で人為的なカンナビノイドを生成することができる。
【0043】
最初に、構築物に供給された異なる基質の利用を含む前駆体駆動型コンビナトリアル生合成の伝統的アプローチは、系の中の酵素の基質無差別性プロファイルの探求を容易にするであろう。各ステップで形成された独特で新規な生成物はその後、その経路の次のステップの新しい基質として役立ち、こうして生成された生成物の多様性が上昇する。各酵素は、結合ポケットでの立体的制約および相互作用により許容できる基質に対して生来の特異性を有する。インシリコドッキングなどのコンピュータ計算によるアプローチは、好適な結合親和性を有する基質を同定し、その後、実験的にテストする高処理能力の手法で、低分子化合物の大規模ライブラリのスクリーニングを可能にする。
【0044】
第二に、酵素構造への基質のインシリコドッキングは、活性部位の微小環境での空間的制約および基質の相互作用をはっきりと解明することになる。その後、この情報を利用して、タンパク質エンジニアリングを駆動する。各酵素が許容し得る基質の多様性を上昇させ得る特異的突然変異を合理的に設計するために、酵素の結合ポケットへの基質の重要な相互作用を理解することが不可欠である。
【0045】
最後に、こうして導入された突然変異は、タンパク質構造全体のアーキテクチャを非意図的に変更してタンパク質の不安定性および不活性をもたらし得るため、各酵素に適用され得るタンパク質エンジニアリングの度合いには限定がある。各生合成ステップを実行する酵素の異なる生物体からのオーソログを同定して、経路に組み込むことができる。Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｔｏｏｌ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＥＦＩ－ＥＳＴ）は、タンパク質クエリー配列のオーソログの同定を支援するバイオインフォマティクスウェブサーバである（Ｇｅｒｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２０１５， １８５４（８）：１０１９－１０３７）。このウェブツールは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースを利用して、触媒された機能および反応に関するクエリー配列に関係する現存するアミノ酸配列を同定する。それは、非常に異なる基質特異性プロファイルを有し得る多様なファミリーからタンパク質を同定する配列類似性ネットワークを作成することにより、それらの関連性の視覚化を容易にする。こうして同定された、作用し得る基質の全体的に異なる組みを有するオーソログは、カンナビノイド生合成経路の個々のステップの適切な交換体として役立つことができ、結果的に独特で新規なカンナビノイド製品を生成させることができる。
【0046】
実施例５：Ｓ．セレビシエにおけるカンナビノイドのバイオプロダクション
転写単位を、先の実施例２に記載された通りＰＯＴに組み立てた。それぞれ酵母の低または高コピーの複製起点ＣＥＮおよび２ミクロンに加え、ＵＲＡ３選択マーカを含有するレベル２アッセンブリプラスミドｐＣＫＵおよびｐＭＫＵに、プラスミドを挿入した。組み立てられたプラスミドを、過去に記載された酢酸リチウム法を利用してＳ．セレビシエＢＹ４７４１の個々の菌株に形質転換した（Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ２００７， ２（１）：３５－３７）。これらの菌株を一晩生育させた後、基質ヘキサン酸およびマロン酸を培養物に添加した。基質との２５℃で一晩のインキュベーションの後、培養物を回収し、各培養物からの生育培地を酢酸エチルで抽出した。結果を図４に示す。
転写単位を、先の実施例２に記載された通りＰＯＴに組み立てた。それぞれ酵母の低または高コピーの複製起点ＣＥＮおよび２ミクロンに加え、ＵＲＡ３選択マーカを含有するレベル２アッセンブリプラスミドｐＣＫＵおよびｐＭＫＵに、プラスミドを挿入した。組み立てられたプラスミドを、過去に記載された酢酸リチウム法を利用してＳ．セレビシエＢＹ４７４１の個々の菌株に形質転換した（Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ２００７， ２（１）：３５－３７）。これらの菌株を一晩生育させた後、基質ヘキサン酸およびマロン酸を培養物に添加した。基質との２５℃で一晩のインキュベーションの後、培養物を回収し、各培養物からの生育培地を酢酸エチルで抽出した。結果を図４に示す。
【0047】
カンナビノイド経路において４種の酵素、即ちＣｏＡリガーゼ、ＭＣＳ、ＯＬＳ、およびＯＡＣを発現する酵母の培養上清から、ＯＬＡのものに対応する２２３．１００のｍ／ｚ値（誤差１１．７ｐｐｍ）を有する約４分で溶出したピークが実証された。図４の最上段および最下段を参照されたい。このピークは、ポリケチドシンターゼおよびポリケチドシクラーゼ、ＯＬＳおよびＯＡＣが欠如した酵母からの陰性対照上清では認められなかった。図４の最上段を参照されたい。
【0048】
この経路の次のステップでは、ＣＢＧＡが生成される。それを実行するために、ＯＬＡを生成する上述の最初の４つの遺伝子を、ＧＰＰシンターゼ酵素（Ｅｒｇ２０ｐＷＷ、ＡｇＧＰＰａｓｅ、またはＣｈｉＧＰＰａｓｅ）およびプレニルトランスフェラーゼ、即ちＧＯＴまたはＮｐｈＢと一緒にレベル２アッセンブリプラスミドｐＣＫＵおよびｐＭＫＵを組み立てた。転写単位の組み立ておよび宿主酵母株への形質転換の後、培養上清を先に記載された通りＬＣ－ＭＳにより分析した。ＣＢＧＡ生成物は、組み立てられた構築物の全てにおいて、細胞内または細胞外で観察されなかった。理論に結び付けるわけではないが、幾つかの培養物中のＣＢＧＡの欠如が、プレニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴまたはＮｐｈＢ）の極わずかの酵素発現、または反応に入手可能な基質（ＯＬＡまたはＧＰＰ）の欠如から生じた可能性がある。
【0049】
プレニルトランスフェラーゼ酵素の活性をテストするために、ＧＯＴおよびＮｐｈＢプレニルトランスフェラーゼの転写単位を発現するレベル１ＰＯＴプラスミドを、別々にＢＹ４７４１細胞に形質転換した。先に記載された通り、培養物を静止期で生育および溶解した。その後、溶解物の分取物を、基質ＯＬＡおよびＧＰＰで設定されたインビトロ酵素アッセイに別々に添加した。陰性対照もまた、溶解物を水に置き換えることにより設定した。３０℃でのインキュベーションの後、ＬＣ－ＭＳ検出の前に酸性化および有機抽出を実施した。結果を図５に示す。
【0050】
ＣＢＧＡに対応する小さなピークが、陰性対照（酵素が添加されていない）およびＧＯＴを含有する溶解物中で観察された。図５の１段目および２段目を参照されたい。このデータから、ＯＬＡ上へのゲラニル部分のプレニル化が酵素触媒を用いない自然な工程として起こることが示唆され、ＯＬＡおよびＧＰＰが混合物中に存在すれば、少量が観察されるであろう。Ｓ．セレビシエＢＹ４７４１中で発現されたＧＯＴは、ＣＢＧＡに対応するピーク面積が陰性対照のものと類似していたため、不活性であると決定された。
【0051】
その一方でＮｐｈＢ含有溶解物では、陰性対照のピークより大きなＣＢＧＡのピーク面積が示され、ＮｐｈＢが活性であることが示された。図５の３段目を参照されたい。０．１分後に溶出された二次ピークもまた、ＮｐｈＢにより触媒された試料中で、ＣＢＧＡと同じｍ／ｚ値で観察された。このピークは、ＣＢＧＡと異なる部位でプレニル化されたＯＬＡの非特異的生成物、即ち２－Ｏ－ゲラニルオリベトール酸であることが過去に報告された（Ｚｉｒｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１７， ２５９：２０４－２１２）。ＮｐｈＢは、酵母株ＢＹ４７４１中で発現されると機能することが示されているため、ＣＢＧＡの極わずかの生成は、構築物中でのＯＬＡおよびＧＰＰの供給にどうしても左右される。理論に結び付けるのではないが、ＯＬＡに対応するピークは、全ての構築物中で検出されたため、ＧＰＰの不充分な収量が、ＣＢＧＡの低収量の原因である可能性が最も高い。
【0052】
Ｓ．セレビシエにおいてＧＰＰ由来のモノテルペンを過剰発現するための方法は、当該技術分野で周知である。高い商業的価値により酵母内で改善されたモノテルペン生成を実現する際の作業を記載した発表論文は豊富に存在する。ＧＰＰ収量を改善するための１つのアプローチは、酵母宿主によって生じた代謝負荷を低減することである。メバロン酸経路に関与する４種の遺伝子、およびそれぞれのモノテルペンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼを過剰発現することにより、過去に操作された酵母株に比較してゲラニオール収量の７倍増加が実現される（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．）。
【0053】
図６を参照すると、イソプレノイド二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ１）は、ＤＭＡＰＰとＩＰＰの間の異性化を触媒する。これは、ＧＰＰ生成に好適な前駆体の比率の改善を援助する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１３， １６８（４）：４４６－４５１）。ＨＭＧ－ＣｏＡは、メバロン酸経路の重要な律速段階として同定され、この遺伝子のトランケート型ｔＨＭＧ１を過剰発現すると、この経路のメバロン酸供給が増加する （Ａｓａｄｏｌｌａｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ２０１０， １０６（１）：８６－９６； Ｓｃａｌｃｉｎａｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ， ２０１２． １４（２）： ｐ． ９１－１０３）。ＵＰＣ２は、ステロール生合成の調節に関与する転写因子であり、突然変異体ＵＰＣ２－１を過剰発現すると、ステロール取り込むを好気的に増進し、その結果、メバロン酸生成を増進する（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ２００５， ２５（１６）：７３７５－７３８５）。
【0054】
ＩＤＩ１、ｔＨＭＧ１、およびＵＰＣ２－１遺伝子を先に記載された通りＹｅａｓｔＦａｂシステムを利用して過去に記載されたＧＰＰシンターゼ、Ｅｒｇ２０ｐＷＷと共にレベル１ＰＯＴに組み立てて、次に栄養素要求性マーカＬＥＵ２を発現するレベル２アッセンブリプラスミド（ｐＣＫＬ／ｐＭＫＬ）に組み立てた。これにより、組み立てられて酵母株に形質転換された各プラスミドの長さを低減するために、カンナビノイドおよびイソプレノイドのための遺伝子発現を別のプラスミドに維持することができる。
【0055】
一連の中等度～強いプロモータおよびターミネータを、ロイシン栄養素要求性マーカ（ＬＥＵ２）を用いてｐＣＫＬ／ｐＭＫＬプラスミドに維持されたＧＰＰ生成用の４種の遺伝子を過剰発現するように個別に割り付け、一方でプロモータおよびターミネータの異なる組を、別のプラスミドｐＣＫＵ／ｐＭＫＵに維持されたカンナビノイド遺伝子内の酵素に割り付けた。以下の表３を参照されたい。
【0056】
【表3】
【0057】
カンナビノイド（ｐＣＫＵ／ｐＭＫＵ）およびメバロン酸遺伝子の両方の組み立てが実現された後、両方のプラスミドをその後、酵母株ＢＹ４７４１に形質転換し、ウラシルおよびロイシンの両方が欠如した培地で生育して、形質転換について選択した。同じバイオプロダクション手順を、両方のプラスミドを発現する構築物で実行した。溶解された細胞ペレットの有機抽出を実行した後に、微量のＣＢＧＡを細胞内で検出した。結果を図７に示す。約６．７分の溶出時間および３５９．２２２３のｍ／ｚ値（誤差－１．３４ｐｐｍ）を有するピークは、ＣＢＧＡ標準のピークに対応する。
【0058】
酵母内で発現された経路により生成されたＣＢＧＡの収量をさらに増加させるために、コンピュータ計算によるタンパク質エンジニアリングを野生型ＮｐｈＢで実行して、副生物２－Ｏ－ゲラニルオリベトール酸の代わりにＣＢＧＡを生成することにおける選択性を改善した。正しい部位のＧＰＰからのゲラニル部分を使用してオリベトール酸をプレニル化してＣＢＧＡを生成することに高い特異性がある４種の突然変異体、即ちＶ４９Ｗ／Ｙ２８８Ａ（配列番号：８）、Ｖ４９Ｗ／Ｙ２８８Ｐ（配列番号：９）、Ｖ４９Ｗ／Ｙ２８８Ａ／Ｑ２９５Ｆ（配列番号：１０）、およびＶ４９Ｗ／Ｙ２８８Ｐ／Ｑ２９５Ｆ（配列番号：１１）を作製した。ＣＢＧＡ収量の有意な増加を示しながら副生物を全く生成しないこれらの突然変異体を、次に経路に取り込み、ＣＢＧＡ力価が、インビボで有意に改善した。
【0059】
実施例６：カンナビノイドの多様化
カンナビノイド合成経路における分岐点を活用して、新規なカンナビノイド化合物を生成することができる。先の構築物中で用いられたアシルＣｏＡリガーゼおよびポリケチドシンターゼ、即ちＯＬＳの無差別性により、ヘキサン酸（Ｃ６）の代わりに基質として異なる短鎖～中鎖脂肪酸（Ｃ３～Ｃ１０）を利用して、オリベトール酸の類似体を生成することができる。Ｃ．サティバにおける例は、カンナビノイドのテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）およびカンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）の生成であり、両者とも経路において同じ酵素により生成される。微量で生成されたこれらのカンナビノイドは、ＯＬＡの代わりにポリケチド前駆体ジバリン酸（ＤＶＡ）を利用する。ＯＬＡ中のＣ５鎖の代わりに芳香族環のＣ２上にＣ３鎖長を有するＤＶＡ（図８参照）はまた、ヘキサン酸（Ｃ６）の代わりにスターター単位として酪酸（Ｃ４）を用いて、Ｃ．サティバの中のＣｓＡＡＥ１酵素により生成される。
カンナビノイド合成経路における分岐点を活用して、新規なカンナビノイド化合物を生成することができる。先の構築物中で用いられたアシルＣｏＡリガーゼおよびポリケチドシンターゼ、即ちＯＬＳの無差別性により、ヘキサン酸（Ｃ６）の代わりに基質として異なる短鎖～中鎖脂肪酸（Ｃ３～Ｃ１０）を利用して、オリベトール酸の類似体を生成することができる。Ｃ．サティバにおける例は、カンナビノイドのテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）およびカンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）の生成であり、両者とも経路において同じ酵素により生成される。微量で生成されたこれらのカンナビノイドは、ＯＬＡの代わりにポリケチド前駆体ジバリン酸（ＤＶＡ）を利用する。ＯＬＡ中のＣ５鎖の代わりに芳香族環のＣ２上にＣ３鎖長を有するＤＶＡ（図８参照）はまた、ヘキサン酸（Ｃ６）の代わりにスターター単位として酪酸（Ｃ４）を用いて、Ｃ．サティバの中のＣｓＡＡＥ１酵素により生成される。
【0060】
ヘキサン酸（Ｃ６）の代わりに異なるスターター単位（Ｃ３～Ｃ１０）を利用することにより、ＯＬＳおよびＯＡＣを基質無差別性についてテストした。結果を図９に示す。
【0061】
特定のＯＬＡ類似体、即ち（Ｃ３、Ｃ９、Ｃ１０）は、Ｓ．セレビシエ内で生成しなかったが、Ｅ．コリの中で同じ生合成経路構築物を利用して生成した。図１０を参照されたい。これは、Ｅ．コリ中に存在して、プロピオン酸、ノナン酸およびデカン酸などの基質で作用し得るＳ．セレビシエの中に存在しない内在性アシルＣｏＡリガーゼの存在による可能性がある。そのような内在性リガーゼは、作用するポリケチドシンターゼＯＬＳの基質としてプライミングされたアシルＣｏＡチオエステルを提供することができる。
【0062】
実施例７：カンナビノイド生成の更なる多様化
前駆体駆動型コンビナトリアル生合成の伝統的方法は、新しい生成物が形成されたかどうかを実験的に検出するために、基質の大規模ライブラリの骨の折れるスクリーニングを含む。好適な基質を同定するためにとられた時間および資金を縮小するために、ドッキングなどのコンピュータ法を予測モデルとして用いて、酵素の結合ポケットにフィットすることが可能で活性部位への好適な結合親和性を有する基質を同定する。これは、高処理能力の手法で何千もの基質ライブラリのスクリーニングを促進して、実験的テストのための最も好適な基質のランクづけリストを生成する。
前駆体駆動型コンビナトリアル生合成の伝統的方法は、新しい生成物が形成されたかどうかを実験的に検出するために、基質の大規模ライブラリの骨の折れるスクリーニングを含む。好適な基質を同定するためにとられた時間および資金を縮小するために、ドッキングなどのコンピュータ法を予測モデルとして用いて、酵素の結合ポケットにフィットすることが可能で活性部位への好適な結合親和性を有する基質を同定する。これは、高処理能力の手法で何千もの基質ライブラリのスクリーニングを促進して、実験的テストのための最も好適な基質のランクづけリストを生成する。
【0063】
ＯＬＳの２．２Å分解構造で開始して、この酵素のネイティブ基質であるヘキサノイルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを最初にドッキングして、陽性対照として役立たせた。ＯＬＳは、図１１および１２に示された通り、ＯＬＳのＣｙｓ１５７に付着されたヘキサノイル中間体上にアセチル－ケトン基を付着させることにより、ＣｏＡ部分により活性部位にシャトリングされた異なるＲ基を有する２種の基質、つまりヘキサノイルＣｏＡスターター単位と、そのスターター単位を反復的に伸長する３つのマロニルＣｏＡエクステンダー単位と、を使用する。
【0064】
マロニルＣｏＡなどのエクステンダー単位を利用して同じ３つの延長ステップを実施し得る異なるスターター単位を同定するために、ＯＬＳに依然として共有結合で付着されている最後の中間体状態、即ち、トリケチド中間体の３，５－ジオキソデカノイルＣｏＡ（２単位のマロニルＣｏＡでの伸長の後）、ＧＯＬＤを用いてドッキングした（Ｇｒｏｏｍ ｅｔ ａｌ．；図１２の左パネル参照）。これにより、多数の延長ステップを実施する反応メカニズムを収容する空間的制約の描写が可能になる。結合ポケットが、対応するスターター単位の最後の供給結合で付着された中間体状態にフィットすることが可能ならば、最初の２、３ラウンドの延長を実施することが可能なはずである。
【0065】
最後のマロニルＣｏＡ単位をその後、マメ科メディカゴ・サティバ（Medicago sativa）由来の相同性タンパク質カルコンシンターゼ（ＣＨＳ２）（ＰＤＢコード：１ＣＭＬ）と複合体化された結晶化マロニルＣｏＡリガンドを利用して重ね合わせた（Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １９９９， ６（８）：７７５－７８４）。重ね合わせられたマロニルＣｏＡリガンド（図１２の右パネルの黄色リガンド）を、タンパク質局在化最適化プログラム（ＰＬＯＰ）を利用してＯＬＳ構造の中にドッキングされた３，５－ジオキソデカノイルＣｏＡ中間体（図１２の青色リガンド）を用いてエネルギー最小化した（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００２， １０６（４４）：１１６７３－１１６８０； Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ２００４， ５５（２）：３５１－３６７； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ２０１１， ７９（１０）：２９２０－２９３５； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ２００６， ６５（２）：４３８－４５２； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ．， ２００７， ３（６）：２１０８－２１１９．）。この最後の重ね合わせステップは、より嵩張るＲ基を有していてＯＬＳ結合ポケット内で最後のマロニルＣｏＡリガンドと立体衝突を生じ、それにより最後の伸長ステップを妨害し得るスターター単位を同定する。これらの候補物質は次に、排除される。図１２の左および右パネルの陽性対照から観察された通り、ヘキサノイルＣｏＡスターター単位からのドッキングされた３，５－ジオキソデカノイルＣｏＡ中間体と、エネルギー最小化されたマロニルＣｏＡの両方の位置が、最後の伸長ステップのために２つの基質を一緒にプライミングする。
【0066】
上述の通り、７０のアシルＣｏＡスターター単位（Ｇｏ ｅｔ ａｌ．）および１２の異なるアシルＣｏＡエクステンダー単位（Ｇｏ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ， ２０１５， ５（７）：４０３３－４０４２）のライブラリが、利用可能である。まとめるとこれは、ＯＬＳなどのＩＩＩ型ポリケチドシンターゼの基質として役立ち得るスターター単位とエクステンダー単位の合計８４０の組み合わせとなる。これらを、ＯＬＳ構造にドッキングされる基質ライブラリとして使用する。ドッキングの結果のアウトプットを適切にランクづけして、実験結果と比較し、予測モデルの正確さをチェックする。ＯＬＳの基質無差別性のこの実験的テストは、様々な鎖長またはＲ基を有するオリベトール酸を生成し、その後、それを用いて、オリベトール酸－カンナビノイド足場のＣ２上の様々なＲ基を有するカンナビノイドを生成することができる（図８参照）。
【0067】
実施例８：タンパク質エンジニアリング
タンパク質エンジニアリングは、酵素を特異的な所望の特徴にエンジニアリングする旧来の分野である。それにもかかわらず、良好な選択法を用いなければ、莫大な量の配列空間が、生成物の多様性を呈する突然変異を選択する際に予測モデルを必要とする。
タンパク質エンジニアリングは、酵素を特異的な所望の特徴にエンジニアリングする旧来の分野である。それにもかかわらず、良好な選択法を用いなければ、莫大な量の配列空間が、生成物の多様性を呈する突然変異を選択する際に予測モデルを必要とする。
【0068】
上述の通り、ＮｐｈＢ突然変異体を、任意の副生成物を有さずにＣＢＧＡを生成するための高い選択性を持って設計した。このプレニルトランスフェラーゼが異なる基質を許容し、これにより異なる所望のカンナビノイド生成物を生成するように、異なるＮｐｈＢ突然変異体を設計した。
【0069】
カンナビノイド生合成経路における最後の環化ステップは、予めＧＰＰから移行されたＣ１０鎖を環化する（図１参照）。ＣＢＧＡ類似体は、より長いプレニル鎖長を持って提供され、より長い鎖長を利用可能であるためより多様な構造の前駆体として役立つ。ＧＰＰのＣ１５鎖長類似体であるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびＣ２０鎖長類似体であるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が、ＧＰＰの適切な交換物として用いられて、Ｃ１５またはＣ２０プレニル鎖のＣＢＧＡを生成する。同じコンピュータ計算でのタンパク質エンジニアリングアプローチを利用して、より長いＦＰＰおよびＧＰＰへのより良好な親和性を与えるＮｐｈＢ酵素上の特異的突然変異を同定することができる。これらの突然変異をテストして、次にＣＢＧＡ類似体を生成することができる。
【0070】
カンナビノイドシンターゼのオーソログライブラリをＣＢＧＡ類似体を生成する株に対してスクリーニングして、様々なカンナビノイド化学構造の生成についてテストし、次に生物活性についてテストする。
【0071】
他の実施形態
本明細書に開示された特色の全ては、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示された各特色は、同一、均等、または類似の目的を果たす代替的特色により置き換えられてもよい。したがって他に明確に述べられない限り、開示された各特色は、均等な、または類似の特色の包括的な集まりの例に過ぎない。
本明細書に開示された特色の全ては、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示された各特色は、同一、均等、または類似の目的を果たす代替的特色により置き換えられてもよい。したがって他に明確に述べられない限り、開示された各特色は、均等な、または類似の特色の包括的な集まりの例に過ぎない。
【0072】
先の記載から、当業者は、本発明の本質的特色を容易に確認することができ、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および改良を行って、様々な用途および条件にそれを適合させることができる。したがって他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2022-06-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】