特表 2022-553010 脳腫瘍の治療のためのシクロデキストリンベースのγリノレン酸製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-21

(54)【発明の名称】脳腫瘍の治療のためのシクロデキストリンベースのγリノレン酸製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/202 20060101AFI20221214BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221214BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221214BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20221214BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20221214BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20221214BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20221214BHJP

【ＦＩ】

A61K31/202

A61P35/00

A61P43/00 105

A61K9/107

A61K9/14

A61K9/19

A61K47/40

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523103

(86)(22)【出願日】2020-10-09

(85)【翻訳文提出日】2022-05-31

(86)【国際出願番号】 IB2020059524

(87)【国際公開番号】W WO2021074760

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/915,841

(32)【優先日】2019-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522154021

【氏名又は名称】セファコール インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ピアソン、ダニエル エイ．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA17

4C076AA31

4C076CC26

4C076CC27

4C076EE39

4C076GG06

4C206AA01

4C206AA02

4C206DA05

4C206MA02

4C206MA05

4C206MA42

4C206MA61

4C206MA64

4C206NA10

4C206ZB21

4C206ZB26

(57)【要約】

本発明は、脳腫瘍の治療のためのシクロデキストリンベースのγリノレン酸製剤に関する。より具体的には、本発明は、γ－リノレン酸のための担体としてのシクロデキストリン類似体の使用及びそれらの薬理学的使用に関する。本発明は、脳のがん、特に多形性神経膠芽腫及び他の神経膠腫、そして軟髄膜腫瘍を含む脳への転移がんの治療のために、シクロデキストリン包接複合体として製剤化されたＧＬＡを特色とする。本明細書において記載される包接複合体は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、β－シクロデキストリンスルホブチルエーテル（ｂＣＤＳＢＥ）、及び２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（ＤＭｂＣＤ）を、ＧＬＡと複合体化し、後続して可溶化する能力を利用する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

γ－リノレン酸（ＧＬＡ）のシクロデキストリン（ＣＤ）包接複合体であって、
前記ＧＬＡの濃度が１～２０ｍｇ／ｍｌの範囲であり；
前記ＣＤの濃度が１０～４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり；
前記シクロデキストリンが、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン；スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリンナトリウム塩；及び２，６－ジメチル－β－シクロデキストリンから選択され；
前記包接複合体が、ナノエマルジョンの形態である、前記包接複合体。

【請求項2】

前記ＣＤ：ＧＬＡのモル比が、約２：１～８：１の範囲である、請求項１に記載の包接複合体。

【請求項3】

前記ＣＤ：ＧＬＡのモル比が、約４：１である、請求項３に記載の包接複合体。

【請求項4】

前記ナノエマルジョン粒子サイズが、約５０ｎｍ～３００ｎｍの範囲である、請求項１に記載の包接複合体。

【請求項5】

前記複合体が、凍結乾燥物の形態である、請求項１に記載の包接複合体。

【請求項6】

がんの治療のための医薬品の製造のための、請求項１に記載の包接複合体の使用。

【請求項7】

前記がんが、多形性神経膠芽腫である、請求項６に記載の医薬品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脳腫瘍の治療のためのシクロデキストリンベースのγリノレン酸製剤に関する。より具体的には、本発明は、γ－リノレン酸のための担体としてのシクロデキストリン類似体の使用及びそれらの薬理学的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

毎年、１００，０００人のうち約５～６の症例が原発性悪性脳腫瘍と診断され、そのうちの約８０％は悪性神経膠腫（ＭＧ）である。多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、ＭＧ症例の半分以上を占める。これらのがんは、高い罹患率及び死亡率を伴う。現行の集学的治療（実現可能であるならば最大限の外科的切除、その後の放射線療法及び／または化学療法の併用を含む）の取り組みにもかかわらず、生存期間中央値は短い（わずか約１５か月）。新たに診断される神経膠腫患者のための治療の進歩にもかかわらず、本質的にすべての患者は疾患の再発を経験するだろう。再発性疾患の患者については、従来の化学療法は概して効果が無く、＜２０％の奏効率である。原発性神経膠腫からの拡散及び軟髄膜転移も高頻度で起こる。予無不良であり、ほとんど効果的な治療が無いので、脳腫瘍患者のために新しい治療法が、非常に必要とされる。

【0003】

複数の研究により、神経膠腫におけるγ－リノレン酸（ＧＬＡ）の抗腫瘍活性が確立され［Ｎａｉｄｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ（１９９２）：Ｖｏｌ．４５（３），ｐａｇｅｓ １８１－１８４；Ｄａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）：Ｖｏｌ．９４（２），ｐａｇｅｓ １４７－１５５；Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）：Ｖｏｌ．５（１），ｐａｇｅｓ ３６－３９；Ｂａｋｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（２００３）：Ｖｏｌ．１９（４），ｐａｇｅｓ ３０５－３０９；Ｄａｓ，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ（２００４）：Ｖｏｌ．７０（６），ｐａｇｅｓ ５３９－５５２；及びＤａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ（２００７）：Ｖｏｌ．１３（７），ｐａｇｅｓ ＲＡ１１９－ＲＡ１３１］、この材料は、インビトロ及びインビボの両方の神経膠腫細胞に対する細胞傷害性作用について大規模に研究された［Ｆａｒａｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１１）：Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅ １７３；Ｍｉｙａｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２００９）：Ｖｏｌ．８，ｐａｇｅ ８；及びＢｅｎａｄｉｂａ，ｅｔ ａｌ．，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ（２００９）：Ｖｏｌ．６１（３），ｐａｇｅｓ ２４４－２５１］。これらの研究は、ＧＬＡが、動物腫瘍モデル及びヒトの両方において、正常な神経の細胞を傷つけること無く、且つ神経毒性が低いかまたは無い、神経膠腫細胞に対する選択的かつ特異的な殺腫瘍作用を有することを示している［Ｖａｒｔａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（１９９８）：Ｖｏｌ．７７（１０），ｐａｇｅｓ １６１２－１６２０；Ｌｅａｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ（２００２）：Ｖｏｌ．６７（５），ｐａｇｅｓ ２８３－２９２］。ＧＬＡは、がん細胞の侵入も阻害する［Ｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ（１９９９）：Ｖｏｌ．９１（６），ｐａｇｅｓ ９８９－９９６］。

【0004】

ＧＬＡは単独で抗がん作用を有するだけでなく、他の公知の抗がん薬及び放射線の殺腫瘍作用を増強することも可能である［Ｖａｒｔａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ（１９９７）：Ｖｏｌ．３２（３），ｐａｇｅｓ ２８３－２９２；Ａｎｔａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１４）：Ｖｏｌ．１３，ｐａｇｅ １４２、及びＡｎｔａｌ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ（２０１５）：Ｖｏｌ．１８５１（９），ｐａｇｅｓ １２７１－１２８２］。ＧＬＡは、抗がん薬、ドキソルビシン、シスプラチン、及びビンクリスチンのＨｅＬａ細胞への細胞傷害性をインビトロで促進した［Ｓａｎｇｅｅｔｈａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９３）：Ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ ４５７－４５９］。薬物取り込みの研究から、ＧＬＡががん細胞膜の中へ取り込まれて、がん細胞膜の流動性及び透過性を変更し、したがってＨｅＬａ細胞による抗がん薬取り込みを促進することが明らかにされた。これは、他の抗がん薬の細胞内濃度の増加を導き、それによって他の抗がん薬の抗がん作用を増加させる。一例において、ＧＬＡは、ＭＣＦ－７乳癌細胞に対するビノレルビンの細胞増殖阻害活性を、用量依存的様式で促進した［Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（２００２）：Ｖｏｌ．７２，ｐａｇｅｓ ２０３－２１９］。類似する様式で、ＧＬＡは、放射線誘導性の細胞殺傷へのラット星状細胞腫細胞の感度を増加させることも報告された［Ｖａｒｔａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ（１９９７）：Ｖｏｌ．３２（３），ｐａｇｅｓ ２８３－２９２］。これは、ＧＬＡへの事前暴露が、神経膠腫の患者において、腫瘍細胞を、放射線及び従来の抗がん薬の細胞傷害性作用により敏感にし得ることを示す。

【0005】

治療剤としてのＧＬＡの使用に関する１つの問題は、ＧＬＡが高度に親油性であること及び容易に製剤化されないことである。水中で可溶性でない活性剤の投与は、作用の所望される場所へ有効量の活性成分を導くために適切なビヒクルの使用を要求するという問題を提起する。水中油滴型エマルジョンは、水中で可溶性でない活性成分の送達のために一般的に使用される。しかしながら、活性成分を送達するのに従来使用されているエマルジョンは、複数の重大な制限及び短所に悩まされる。エマルジョンは速度論的に安定的な構造であり、複数のメカニズムを介して不安定化を受け、最終的にエマルジョンの完全な相分離をもたらす。経時的に物理的に変化するエマルジョンの傾向は、貯蔵及び取り扱いについての問題を提示する。さらに、この物理的な分解は、身体に投与された場合に調製物が、最適以下の状態である可能性を増加させる。製剤化されたＧＬＡが、経時的に安定的であり、治療を必要とする患者へ容易に投与されるようなＧＬＡの安定的な製剤が必要とされる。

【0006】

シクロデキストリン（ＣＤ）は世界中で多数の薬剤製品において使用される医薬賦形剤である。ＣＤは、複数のα（１／４）結合Ｄ－グルコピラノース単位からなるオリゴ糖のサブグループを形成する。ドーナツ型のＣＤ分子上でのヒドロキシル基の配置により、当該ＣＤ分子は親水性ドメイン及び疎水性ドメイン（極性の外部及び非極性の内部）を獲得する。それらの中心腔は、非極性の分子または分子部分のカプセル化を可能にし、これは、超分子分析化学、食品化学、及び医薬化学において活用されている特性である。最も一般的な天然のＣＤであり、医薬製品において使用されているものは、それぞれ６、７、及び８のＤ－グルコピラノース単位からなる、αＣＤ、βＣＤ、及びγＣＤだけである。水溶液中で、ＣＤは、親油性の低可溶性薬物の水溶性包接複合体を形成することが可能である。概して、様々なシクロデキストリンによる脂肪酸の複合体形成は公知であるが、本発明の包接複合体の形成に使用されるシクロデキストリン類似体とのγ－リノレン酸の複合体形成は、今までに記載されていない。

【発明の概要】

【0007】

したがって、本発明は、脳のがん、特に多形性神経膠芽腫及び他の神経膠腫、そして軟髄膜腫瘍を含む脳への転移がんの治療のために、シクロデキストリン包接複合体として製剤化されたＧＬＡを特色とする。本明細書において記載される包接複合体は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、β－シクロデキストリンスルホブチルエーテル（ｂＣＤＳＢＥ）、及び２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（ＤＭｂＣＤ）を、ＧＬＡと複合体化し、後続して可溶化する能力を利用する。

【0008】

一態様において、本発明は、γ－リノレン酸（ＧＬＡ）のシクロデキストリン（ＣＤ）包接複合体を特色とし、ＧＬＡの濃度は１～２０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、ＣＤの濃度は１０～４０％（ｗ／ｖ）の範囲である。

【0009】

一実施形態において、シクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）；スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン、ナトリウム塩（ｂＣＤＳＢＥ）；及び２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（ＤＭｂＣＤ）から選択される。

【0010】

別の実施形態において、ＣＤ／ＧＬＡのモル比は、約２：１～８：１の範囲である。

【0011】

さらなる実施形態において、ＣＤ／ＧＬＡのモル比は、約４：１である。

【0012】

一実施形態において、包接複合体は、ナノエマルジョンである。ナノエマルジョンは、粒子が１０～１，０００ナノメーターの直径の範囲のコロイド状微粒子系である。さらなる実施形態において、ナノエマルジョン粒子サイズは、約５０ｎｍ～３００ｎｍの範囲である。

【0013】

別の実施形態において、ＣＤ／ＧＬＡ複合体は、凍結乾燥物である。

【0014】

別の態様において、本発明は、がんの治療のための医薬品の製造に有用なＧＬＡ／ＣＤ包接複合体を特色とする。

【0015】

一実施形態において、がんは、多形性神経膠芽腫である。

【0016】

別の実施形態において、医薬品のシクロデキストリンは、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン；スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン、ナトリウム塩；及び２，６－ジメチル－β－シクロデキストリンから選択される。

【0017】

さらに別の実施形態において、医薬品は、モル比が約２：１～８：１のＣＤ／ＧＬＡの範囲である、ＣＤ／ＧＬＡ包接複合体を含む。さらなる実施形態において、ＣＤ／ＧＬＡのモル比は、約４：１である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】２０％のＨＰｂＣＤ中の１０ｍｇ／ｍＬのＧＬＡの溶液の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す。

【図2】ＧＬＡ／ＨＰｂＣＤ包接複合体によるＵ８７細胞生存率の阻害を示す。

【図3】ＧＬＡ／ｂＣＤＳＢＥ包接複合体によるＵ８７細胞生存率の阻害を示す。

【図4】ＧＬＡ／ＤＭｂＣＤ包接複合体によるＵ８７細胞生存率の阻害を示す。

【図5】本発明のＧＬＡ／ＣＤ製剤を使用する同所性腫瘍モデルにおける、腫瘍ｖｓ対照の写真を示す。

【図6】本発明のＧＬＡ／ＣＤ製剤を使用する同所性腫瘍モデルにおける、腫瘍ｖｓ対照の顕微鏡写真を示す。

【図7】本発明のＧＬＡ／ＣＤ製剤を使用する同所性腫瘍モデルにおける、腫瘍ｖｓ対照の顕微鏡写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

γ－リノレン酸を、２２％のＧＬＡを含有するボラージ油へと加工されたＢｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの種子から得た。この商業的に入手可能な材料を、ガスクロマトグラフィー－炎イオン化検出（ＧＣ－ＦＩＤ）によって分析して、もたらされたＧＬＡ純度が９８％以上であるように、当業者に公知の方法によって精製した。本発明の方法において使用される製剤は、このレベルの純度のＧＬＡを使用する。

【0020】

ＧＬＡを、蒸留水または緩衝溶液のいずれか中でシクロデキストリン複合体として製剤化した。様々なシクロデキストリンは、本明細書において提供される実施例におけるＧＬＡ製剤について示されるように有用である。かかるシクロデキストリンとしては、２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（ＤＭＢＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、またはβ－シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩（ｂＣＤＳＢＥ）が挙げられる。一実施例において、２０マイクロリットルの２０％のＨＰｂＣＤ溶液中の１０ｍｇ／ｍＬのＧＬＡを、炭素コーティング銅グリッドへ添加した。グリッドを室温で風乾し、次いで透過電子顕微鏡（Ｔｅｃｈｎａｉ Ｇ２、Ｐｈｉｌｉｐｓ、オランダ）下で観察した。もたらされた写真は、２００±８５ｎｍの平均サイズの良好に分散した小滴を示す。図１を参照されたい。

【0021】

一旦一緒に混合して透明溶液を形成したならば、水溶性付加物は凍結乾燥され得る。凍結乾燥物の再構成は、凍結乾燥前の製剤と同じ特性を備えた透明溶液を与える。

【0022】

以下の非限定的実施例を、本発明をさらに例示するために提供する。

【0023】

実施例１。ＧＬＡ／ＣＤ包接複合体の製剤化
（ｉ）４０％のシクロデキストリン溶液の調製
（ａ）２，６－ジメチル－β－シクロデキストリン（ＤＭＢＣＤ）、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、またはβ－シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩（ｂＣＤＳＢＥ）から選択される、４．００ｇのシクロデキストリンを、コニカル遠心チューブの中へ秤量した。０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４で５ｍＬ）を添加した。混合物を、溶液が透明になるまで、ボルテックスで撹拌した及び／または超音波で処理した。
（ｂ）追加のＰＢＳを添加して、各々のチューブ中の体積を１０．０ｍＬまでにし、溶液をよく混合した。
（ｃ）溶液を滅菌条件下で０．２２μｍのフィルターを介して濾過し、＜４℃で保存した。

【0024】

（ｉｉ）Ｈ_２Ｏ中でのγ－リノレン酸（ＧＬＡ）懸濁物の調製
（ａ）１００ｍｇのＧＬＡを、１５ｍＬの遠心チューブの中へ配置した。
（ｂ）４．９ｍＬの滅菌水をＧＬＡへ添加し、チューブを３時間高速でボルテックスで撹拌して、均一の懸濁物を生じさせた。
（ｃ）一旦懸濁物の撹拌が完了したならば、ＧＬＡ懸濁物を、２．０ｍＬのエッペンドルフチューブの中へ直ちに分配し、ステップ（ｉｉｉ）において示されるような様々なシクロデキストリン類似体と混合した。

【0025】

（ｉｉｉ）ＧＬＡ試験サンプルの希釈及び撹拌
ＧＬＡ／シクロデキストリン希釈物を、表１中で示されるように、適切な量の４０％のＣＤ溶液、２０ｍｇ／ｍＬのＧＬＡ懸濁物、ＰＢＳ、及び／または水を、滅菌条件下で２ｍＬエッペンドルフチューブへ添加することによって調製した。透明な外観が観察されるまで（通常約１５秒）、混合物を使用前にボルテックスで撹拌した。
表１。ＧＬＡ／シクロデキストリンの希釈

【表1】

【0026】

実施例２．Ｕ８７細胞生存率アッセイ
（ｉ）２０％のシクロデキストリン希釈物中での１０ｍｇのＧＬＡ／ｍＬの調製
表１からのシクロデキストリン溶液の各々を、表２中で示されるように、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＥａｇｌｅの最小必須培地（ＥＭＥＭ）により、９６ウェルプレート中で希釈した。
表２。Ｕ８７細胞アッセイのためのＧＬＡ／ＣＤ溶液の希釈

【表2】

【0027】

（ｉｉ）Ｕ８７細胞アッセイにおける試験
１００μＬの培地中のＵ８７細胞を、９６ウェルプレートのウェル中で個別に２４時間インキュベーションして、接着を確実にした。次いで試験品またはシクロデキストリン対照希釈物の各々からの１００μＬのアリコートを、適切な試験ウェルへ添加し、プレートを５％のＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で７２時間インキュベーションした。

【0028】

Ｕ８７細胞をＧＬＡ／ＣＤ溶液または対照ＣＤ溶液の存在下においてインキュベーションした後に、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して、細胞生存率を査定した。簡潔には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイは、存在するＡＴＰ（培養培地中に存在する代謝的に活性のある細胞の数に比例する）の定量化に基づいて、培養における生存細胞の数を決定する均一法である。アッセイは、耐熱性ルシフェラーゼ（安定的な発光シグナルを生成する）の特性に依存する。アッセイを以下の通り遂行した。
（１）プレートをインキュベーターから取り出し、室温で約３０分間平衡化した；
（２）細胞培地を、細胞を乱さないように注意深く除去し、１００μＬのウシ胎仔血清不含有培地により置き換えた；
（３）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（１００μＬ）を各々のウェルへ添加した；
（４）ウェルの内容物を旋回振盪機上で２分間混合して、細胞溶解を誘導した；
（５）プレートを室温で１０分間インキュベーションした；
（６）発光を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｒｅａｄｅｒを使用して記録した。

【0029】

（ｉｉｉ）細胞生存率のＧＬＡ／ＣＤ溶液の効果
図２中で示されるように、ＴＦが試験品（ＧＬＡ／２０％のＨＰｂＣＤ）であり、ＶＣがビヒクル対照（２０％のＨＰｂＣＤ単独）である場合に、ＧＬＡ／ＨＰｂＣＤのＩＣ_５０＝１１７μｇ／ｍＬ（４２０μＭ）であった。図３中で示されるように、ＴＦが試験品（ＧＬＡ／２０％のｂＣＤＳＢＥ）であり、ＶＣがビヒクル対照（２０％のｂＣＤＳＢＥ単独）である場合に、ＧＬＡ／ｂＣＤＳＢＥのＩＣ_５０＝１１７μｇ／ｍＬ（４２０μＭ）であった。そして図４中で示されるように、ＴＦが試験品（ＧＬＡ／２０％のＤＭｂＣＤ）であり、ＶＣがビヒクル対照（２０％のＤＭｂＣＤ単独）である場合に、ＧＬＡ／ＤＭｂＣＤのＩＣ_５０＝６０μｇ／ｍＬ（２１６μＭ）であった。

【0030】

実施例３．人工脳脊髄液中でのＧＬＡ／ＨＰｂＣＤ包接複合体の調製
人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）及びａＣＳＦ中のＨＰｂＣＤエマルジョンを、以下の通りに調製する。

【0031】

（ｉ）ａＣＳＦ中及び２０％のＨＰｂＣＤ／ａＣＳＦ中での２０ｍｇ／ｍＬのＧＬＡの調製
ａ）２×溶液Ａのために、以下の量を、２５０ｍＬの滅菌Ｈ_２Ｏ中で溶解した。ＮａＣｌ（８．６６ｇ）；ＫＣｌ（０．２２４ｇ）；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（０．２０６ｇ）；及びＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（０．１６３ｇ）。
ｂ）２×溶液Ｂのために、以下の量を、２５０ｍＬの滅菌Ｈ_２Ｏ中で溶解した。Ｎａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．２１４ｇ）；及びＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ（０．０２７ｇ）。
ｃ）２×ａＣＳＦのために、溶液Ａ及びＢを等体積で組み合わせた。

【0032】

（ｉｉ）２×ａＣＳＦ中での４０％のＨＰｂＣＤの調製
ａ）２．００ｇのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）を、滅菌済みの目盛のある１５ｍＬのコニカル遠心チューブ中で秤量し、２．０ｍＬの２×ａＣＳＦを添加し、ＨＰｂＣＤが完全に湿るまで、懸濁物をボルテックスで撹拌した。
ｂ）追加の２×ａＣＳＦ（約１．８５ｍＬ）を、５．０ｍＬの目盛線までＨＰｂＣＤ溶液へ小分けで添加し、ＨＰｂＣＤのすべてが溶液になるまで、各々の添加後にボルテックスで撹拌した／超音波で処理した。
ｃ）溶液を、ラミナーフローフード中で０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。

【0033】

実施例４．同所性腫瘍モデルにおけるＧＬＡ／ＨＰｂＣＤ製剤の有効性
Ｃ６神経膠腫細胞を、１０％のウシ胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ細胞培養液中で増殖させた。対数増殖期の細胞を使用し、５％のＣＯ_２／９５％の空気の加湿雰囲気において７５ｃｍ^２フラスコ中で３７℃で増殖させた。

【0034】

皮下注射を後肢の上方の背中の側面で行い、この場合、１００μＬの３×１０^６のＣ６神経膠腫細胞を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を、Ｗｉｓｔａｒのラットで脇腹腫瘍を発生させるために注射した。動物を１４日間収容し、その間に、腫瘍サイズ、動物の体重を周期的に測定した。腫瘍発生後に、動物を、１群（ｎ＝３）あたり３匹の動物で２つの群へと無作為に割り当てた。１００μＬの１０ｍｇ／ｍｌのＧＬＡ／ＨＰｂＣＤ／ａＣＳＦ製剤の腫瘍内投与を、１つの群へ隔日で１４日間投与し、他の群へのビヒクル対照と共に行った。動物の体重、食料／水分摂取量、及び腫瘍体積を、周期的に書き留めた。実験の終了時に、ラットを安楽死させ、腫瘍を組織病理学的分析のために切除した。ＧＬＡ／ＨＰｂＣＤ／ａＣＳＦ製剤の有効性を、腫瘍体積の低減及び腫瘍退縮の組織学的証拠によって査定した。

【0035】

図５中で示されるように、有意な腫瘍退縮（７５±３．２％）が指摘された。ＴＦ０２１試験製剤の腫瘍の詳細な組織学的検査から、腫瘍退縮の領域に泡状のマクロファージ及びリンパ球が浸潤したことが示され、そのようなものは、ビヒクル対照ＶＣ０２１において観察されなかった（図６）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】