特表 2022-553069 ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精におけるＨＬＡクラスＩ分子とさらなる医学的意義

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-21

(54)【発明の名称】ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精におけるＨＬＡクラスＩ分子とさらなる医学的意義

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221214BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20221214BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20221214BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20221214BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20221214BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20221214BHJP

   C07K 14/74 20060101ALI20221214BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221214BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N5/071

C12N15/113 Z

C12N15/115 Z

C07K16/46

C07K16/00

C07K14/74

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523821

(86)(22)【出願日】2020-10-19

(85)【翻訳文提出日】2022-06-20

(86)【国際出願番号】 EP2020079347

(87)【国際公開番号】W WO2021078680

(87)【国際公開日】2021-04-29

(31)【優先権主張番号】19205450.0

(32)【優先日】2019-10-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520414376

【氏名又は名称】インテレクソン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ヴュルフェル ヴォルフガング

(72)【発明者】

【氏名】ヴィルツ ラルフ マルクス

(72)【発明者】

【氏名】ヴィンターハルター クリシュトフ

(72)【発明者】

【氏名】ヴュルフェル フランツィスカ

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、in vitro受精プログラムにおける胚着床の効率を高める方法に用いる核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関するものであり、 (I）少なくとも1つの核酸分子が、（a）HLA－H、HLA－G、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－Fポリペプチドまたは少なくとも８５％同一性があるポリペプチドをコードする核酸分子、または少なくとも１５０ヌクレオチドを含むその核酸分子の断片からなる核酸分子から選択され；胚移植効率を向上させる方法は、 (i）受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、または (ii）受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させること；または (iii)全身的に投与することを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精プログラムにおける胚移植の効率を高める方法に用いるための、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであって、
（Ｉ）少なくとも１つの核酸分子が、
（ａ） 配列番号１から１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｂ） 配列番号１８から３４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、
（ｃ） （ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｄ） （ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９６％同一、最も好ましくは少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子、
（ｅ） （ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子、
（ｆ） （ａ）から（ｅ）のいずれか１つに記載の核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含む、核酸分子および
（ｇ） ＴがＵで置換されている、（ａ）から（ｆ）のいずれか１つに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され；
（ＩＩ）ベクターが、（Ｉ）の核酸分子を含み；
（ＩＩＩ）宿主細胞が（ＩＩ）のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および
（ＩＶ）少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが、（Ｉ）の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択され；
胚移植効率を向上させる方法は、
（ｉ）受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させること；または
（ｉｉ）受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを子宮に接触させること；または
（ｉｉｉ）受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、または任意の組み合わせを全身的に投与すること、好ましくは注射、経皮および／または経膣投与によって投与することを含む、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項2】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精の前が、
（ｉ）未受精卵子の採取後、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する直前までの間の任意の時期であり、および
（ｉｉ）好ましくは、精子による卵子の受精後、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する直前までの間の任意の時期である、
請求項１に記載の使用のための核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項3】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精の後が、
（ｉ）受精卵子または着床前胚の子宮への移植の直後から受精卵子または着床前胚の子宮への移植の６日後までの任意の時期、
（ｉｉ）好ましくは、受精卵子または着床前胚の子宮への移植の直後から受精卵子または着床前胚の子宮への移植の４日後までの任意の時期、および
（ｉｉｉ）最も好ましくは、受精卵子または着床前胚の子宮への移植の直後から受精卵子または着床前胚の子宮への移植の２日後までの任意の時期である、
請求項１に記載の使用のための核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項4】

請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在下で、単離された卵子または着床前胚を培養することを含む、受精卵子または着床前胚が雌のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精中に着床する可能性を高めるためのｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項5】

単離された卵子が未受精卵子または受精卵子である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

妊娠中の中絶を防止するために使用するための、請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項7】

妊娠中の雌における妊娠高血圧腎症の治療または予防に使用するための、請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項8】

妊娠中の雌が雄の胚または胎児を宿す、請求項７に記載の使用のための核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項9】

ＨＥＬＬＰ症候群の治療または予防に使用するための、請求項１に記載の核酸分子またはタンパク質の阻害剤。

【請求項10】

請求項９に記載の使用するための阻害剤であって、
（ｉ）核酸分子の阻害剤が、低分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸分子、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの構築物、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼから選択されるか、および／または
（ｉｉ）タンパク質の結合分子、好ましくはタンパク質の阻害剤は、低分子、抗体または抗体ミメティック、アプタマーから選択される、阻害剤。

【請求項11】

抗体ミメティックが、好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、三重特異性結合分子およびプロボディから選択される、請求項１０に記載の使用のための阻害剤。

【請求項12】

自己免疫疾患、好ましくは妊娠中の雌における自己免疫疾患の治療または予防に使用するための、請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであって、自己免疫疾患は好ましくは皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群または強皮症である、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項13】

移植片対宿主病の治療または予防に使用するための、請求項１に記載の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせ。

【請求項14】

前記請求項のいずれかに記載の使用または方法のための阻害剤であって、
（Ｉ）少なくとも１つの核酸分子は、
（ａ） 配列番号１から６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｂ） 配列番号１８から２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、
（ｃ） （ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｄ） （ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９６％同一、最も好ましくは少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子、
（ｅ） （ｄ）の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子、
（ｆ） （ａ）から（ｅ）のいずれか１つに記載の核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも１５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６００ヌクレオチドを含み、核酸分子および
（ｇ）ＴがＵで置換されている、（ａ）から（ｆ）のいずれか１つに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され、
（ＩＩ）ベクターが、（Ｉ）の核酸分子を含み、
（ＩＩＩ）宿主細胞が（ＩＩ）のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および
（ＩＶ）少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが、（Ｉ）の核酸分子によってコードされているタンパク質またはペプチドから選択される、阻害剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、in vitro受精プログラムにおける胚着床の効率を高める方法に用いる核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関するものであり、 (I）少なくとも1つの核酸分子が、（a）配列番号1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、（b）配列番号18～23のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、(c) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85％同一、好ましくは少なくとも90％同一、最も好ましくは少なくとも95％同一のポリペプチドをコードする核酸分子、(d) （b）ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一、好ましくは少なくとも96％同一、最も好ましくは少なくとも98％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子、(e)(d)の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子、（f）（a）～（e）のいずれか1つの核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドからなる、核酸分子、および（g）（a）～（f）のいずれか1つの核酸分子に相当し、TはUで置換されている、核酸分子から選択され、および(II)ベクターが、(I)の核酸分子を含み; (III)宿主細胞が(II)のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および (IV）少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが、（I）の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択され；胚移植効率を向上させる方法は、(i）卵子、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させること；または (ii）受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを子宮に接触させること；または (iii) 受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、または任意の組み合わせを全身的に投与すること、好ましくは注射、経皮および／または経膣投与によって投与すること、を含む。

【0002】

本明細書では、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多くの文献が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、その全体は本明細書に参照により援用される。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照により援用されることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により援用される。

【背景技術】

【0003】

ヒト白血球抗原(HLA)系または複合体は、ヒトの主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。HLA遺伝子複合体は、染色体6p21内の3 Mbpの領域に存在する。 ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子は、生物医学科学および治療における重要な標的として長い研究歴を有する。100以上の疾患が、HLA遺伝子の異なる対立遺伝子と関連している。HLAとヒトの病気との関連が初めて報告されてから、ちょうど50年が経つ。HLA分子は、生理学、保護免疫、および劇的に疾患を引き起こす自己免疫反応性の中心であることが証明されている（Debdrou et al.(2018), Nature Reviews Immunology volume 18, pages 325－339）。

【0004】

自己免疫疾患におけるHLA遺伝子の役割については、例えばGough and Simmonds, Curr Genomics.2007 Nov; 8(7):453－465に総説がある。例えば、HLA－B27対立遺伝子は、強直性脊椎炎と呼ばれる炎症性関節疾患を発症するリスクを増大させる。

【0005】

免疫機能の異常を含む他の多くの疾患およびがんのある種の疾患もまた、特異的HLA対立遺伝子と関連している。例えば、EP 2 561 890には、癌の免疫学的治療のための手順が記載されている。この特許では、第一段階では、原発性腫瘍、転移・再発性腫瘍の組織における非典型HLAクラスIbグループのプロファイリングについて記載する。第二段階は、テーラーメイド抗体療法を含む。

【0006】

HLAクラスIb遺伝子、HLA－E、HLA－F、HLAGは、古典的なHLAクラスIa遺伝子よりもずっと後に発見された。その機能解明は、ささやかな始まりだった。しかし、その基本的な機能、病態生理や様々な疾患への関与が明らかになりつつある。様々な研究の結果、成人期におけるHLAクラスIb分子の機能的役割が支持されているが、特にHLA－GとHLA－Fは生殖と妊娠との関連で研究されている。胎盤の胎児－母体界面におけるHLAクラスIbタンパク質の発現は、半同種異系胎児(semi－allogeneic foetus)の母体受容に重要であるようである（Persson et al.(2017), Immunogenetics, DOI 10.1007/s00251－017－0988－4）。妊娠中、胎盤、より具体的には栄養胚葉(trophoblast、栄養膜)は、胚・胎児と母体の免疫系との間の「インターフェース」を形成している。栄養胚葉は、胚・胎児の「本来の」HLA識別（HLA－Aから－DQ）を発現せず、代わりに非古典的なHLA Ib群E、F、Gを示す。NK細胞の特異的受容体（例えば、キラー免疫グロブリン様受容体（KIR））およびリンパ球（リンパ球免疫グロブリン様受容体（LIL－R））との相互作用の間、非古典的HLA群は妊娠外でこれらの免疫担当細胞を抑制する（Wuerfel et al.(2019), Int.J. Mol.Sci.2019, 20, 1830; doi:10.3390/ijms20081830)。

【0007】

HLA遺伝子と疾患の関連性についてはすでに多くの知見が得られているが、HLA遺伝子に着目した研究、特にHLAシステムを利用した生物医学・治療のさらなるターゲットの特定が必要である。この必要性は、本発明によって対処される。

【0008】

よって、本発明は、第１の態様では、in vitro受精プログラムにおける胚着床の効率を高める方法に用いる核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関するものであり、 (I）少なくとも1つの核酸分子が、（a）配列番号1～17のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、（b）配列番号18～34のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、(c) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85％同一、好ましくは少なくとも90％同一、最も好ましくは少なくとも95％同一のポリペプチドをコードする核酸分子、(d) （b）ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一、好ましくは少なくとも96％同一、最も好ましくは少なくとも98％同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子、(e)(d)の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子、（f）（a）～（e）のいずれか1つの核酸分子の断片からなる核酸分子であって、前記断片は、少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドからなる、核酸分子、および（g）（a）～（f）のいずれか1つの核酸分子に相当し、TはUで置換されている、核酸分子から選択され、および(II)ベクターが、(I)の核酸分子を含み; (III)宿主細胞が(II)のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および (IV）少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが、（I）の核酸分子によってコードされるタンパク質またはペプチドから選択され；胚移植効率を向上させる方法は、以下を含む。 (i）卵子、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させること；または (ii）受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを子宮に接触させること；または (iii) 受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、または任意の組み合わせを全身的に投与すること、好ましくは注射、経皮および／または経膣投与によって投与すること。

【0009】

本発明はまた、in vitro受精プログラムにおける胚移植の効率を向上させる方法に関し、(i）受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させること；または (ii）受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを子宮に接触させること；または (iii) 受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、または任意の組み合わせを全身的に投与すること、好ましくは注射、経皮および／または経膣投与によって投与することを含み、ここで、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、本発明の第1の態様に関連して定義される通りである。

【0010】

in vitro受精（IVF）プログラムは、不妊に悩む女性（雌）を支援するための複雑な一連の手順で、例えば、遺伝的問題の予防や子供の受胎を支援するために使用される。IVF プログラムは、（i）ドナー雌の卵巣から成熟未受精卵子を採取する工程、（ii）単離した成熟未受精卵子を精子と受精させて受精卵子を得る工程、（iii）任意で受精卵子を着床前胚にin vitro着床前発生させる工程、および（iv）受精卵子または着床前胚を雌の子宮に移植する工程を含む。IVF 体外受精プログラムの1回のフルサイクルは、一般的に約3週間かかる。成熟した卵子は、精子と受精することができるという特徴がある。成熟した卵子は、一般に極体が隣接しているのが特徴である。 IVF で治療する雌自身の卵子とパートナーの精子を用いて行うことができる。体外受精では、既知または匿名のドナーからの卵子、精子、着床前胚を使用することがある。In vivoでは、正常な妊娠中に、受精した卵子は卵管膨大部で着床前胚に成長する。しかし、この発生はin vitroでも行うことができる。したがって、受精卵でも着床前胚でも、雌の子宮に移植することができる。IVFは、現在、生殖補助医療技術の中で最も効果的な方法である。

【0011】

本発明の第1の態様の方法は、上記（i）の未受精卵子の場合、受精卵子または着床前胚を子宮内に移植する前に、精子により未受精卵子を受精させ、任意に着床前胚にさらに発生させることを含む。

【0012】

着床とは、すでに受精した卵子が子宮の壁に付着する妊娠の段階のことである。出生前のこの段階の受胎卵は胚盤胞と呼ばれる。この接着により、胚は成長できるように母親から酸素と栄養分を受け取る。ヒトの正常妊娠の場合、着床前胚の着床は排卵後9日前後に起こる可能性が高いが、6日から12日の間に起こることもある。また、IVFプログラムでは、受精卵子や着床前胚は子宮に入れられた後、子宮の壁に付着する。

【0013】

第1の実施形態に係る治療対象となる雌は、好ましくはヒトである。より好ましくは、胚の着床不全のために以前の in vitro 受精プログラムが失敗したヒト女性である。このような場合、また一般的に、胚の着床を増加させる方法は、着床不全を治療または予防する方法であってもよい。

【0014】

配列番号18～34の核酸配列は、それぞれヒトHLA－H、HLA－J、HLA－L可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－F1、F2、F2およびHLA－G1、G2、G3、G4、G5、G6およびG7のコード化遺伝子である。HLA－F1～F3のうち、F1およびF5のHLAが好ましい。同様に、HLA－G1～G7のうち、G1、G5のHLAが好ましい。

【0015】

HLA－Lをコードする遺伝子は、膜貫通ドメインをコードする配列を含むこと、また可溶型HLA－Lを検出できることが出願EP 19 18 4681.5で報告されている。したがって、HLA－Lは全長の膜結合型と可溶型の両方が存在すると考えられている。また、全長のHLA－Lは翻訳後のタンパク質分解によって可溶型のHLA断片が放出されるかもしれない。

【0016】

HLA－Gの一次転写物（8つのエキソン, NCBI Gene Bank NM_002127.5, version of September 16, 2019）は、膜結合型（HLA－G1、－G2、－G3、－G4）および可溶型（HLA－G5、－G6、－G7）タンパク質アイソフォームをコードする7つの代替mRNAにスプライシングすることができる（Carosella et al, 2008, Trends Immunol.:29（3）:125－32）。HLA－G1は全長HLA－G分子であり、HLA－G2はエキソン4を欠き、HLA－G3はエキソン4と5を欠き、HLA－G4はエキソン5を欠いている。HLA－G1～G4は、エキソン6と7にコードされる膜貫通部と細胞質尾部の存在により、膜結合型分子である。HLA－G5はHLA－G1に似ているがイントロン5を残し、HLA－G6はエキソン4を欠くがイントロン4を残し、HLA－G7はエキソン4を欠くがイントロン2を残したものである。HLA－G5および－G6は、膜貫通型および細胞質尾部の翻訳を防ぐための早期停止コドンを含むイントロン4の存在により可溶型である。HLA－G7は、早期停止コドンを含むイントロン3が存在するため可溶型である。また、HLA－Fはオルタナティブスプライシングされている。F1、F2、F3の3つのアイソフォームは、いずれも膜結合型アイソフォームである。

【0017】

HLA－H、HLA－J、HLA－V、HLA－YおよびHLA－Eのオルタナティブスプライスフォームは知られていない。HLA－H、HLA－J、HLA－V、HLA－Yは可溶型で、HLA－Eは膜結合型である。

【0018】

本発明による用語「核酸分子」は、cDNAなどのDNA、または二本鎖もしくは一本鎖ゲノムDNAおよびRNAを含む。この点に関して、「DNA」(デオキシリボ核酸)は、ヌクレオチド塩基と呼ばれる、デオキシリボース糖骨格上で一緒に連結された、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)の化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。DNAは、ヌクレオチド塩基の一本鎖、または二重らせん構造を形成することができる2本の相補鎖を有することができる。「RNA」(リボ核酸)は、リボース糖骨格上で一緒に連結されたヌクレオチド塩基と呼ばれる、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびウラシル(U)を構成する化学構築ブロックの任意の鎖または配列を意味する。RNAは、典型的にはmRNAのようなヌクレオチド塩基の一本鎖を有する。また、一本鎖および二本鎖ハイブリッド分子、すなわち、DNA－DNA、DNA－RNAおよびRNA－RNAも含まれる。特定の核酸分子、例えば、shRNA、miRNA、または本明細書に後述するアンチセンス核酸分子も、当技術分野で既知の多くの手段によって修飾することができる。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、「キャップ」、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびヌクレオチド間修飾(例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど)および荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するものなど)が挙げられる。核酸分子には次のポリヌクレオチドとも呼ばれるものが、タンパク質(例えば、抗体、シグナルペプチド、等)、インターカレーター(例えば、アクリジン、プソラレン等)、キレーター(例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化的金属等)、及びアルキレーターのような、1つ以上の追加的な共有結合部分を含んでもよい。ポリヌクレオチドはメチルまたはエチルホスホトリエステルあるいはアルキルホスホルアミデート結合の形成によって誘導体化することができる。さらに、DNAまたはRNAの合成または半合成誘導体および混合ポリマーなどの、当技術分野で公知の核酸模倣分子が含まれる。このような核酸模倣分子または核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホラミデート核酸、2'－O－メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸(HNA)、ペプチド核酸(PNA)およびロックド核酸(LNA)が挙げられる(BraaschおよびCorey, Chem Biol 2001,8: 1を参照のこと)。LNAは、リボース環が2'－酸素と4'－炭素の間のメチレン結合によって拘束されているRNA誘導体である。また、含まれるのは、修飾塩基を含む核酸、例えばチオウラシル、チオグアニンおよびフルオロウラシルである。核酸分子は、典型的にはタンパク質および/またはポリペプチドを作製するために細胞機構によって使用される情報を含む遺伝情報を保有する。核酸分子はさらに、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'および3'非コード領域などを含み得る。

【0019】

本発明の核酸分子は、ゲノムDNAまたはmRNAであることが好ましい。mRNAの場合、核酸分子はさらに、ポリAテールを含み得る。

【0020】

配列番号１から１７のアミノ酸配列は、それぞれヒトHLAタンパク質HLA－H、HLA－J、HLA－L可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－F1、F2、F3およびHLA－G1、G2、G3、G4、G5、G6およびG7である。この場合も、HLA－F1～F3のうち、F1およびF2のHLAが好ましく、HLA－G1～G7のうち、G1およびG5のHLAが好ましい。

【0021】

用語「タンパク質」は、本明細書中で用語「ポリペプチド」と互換的に使用される場合、少なくとも50個のアミノ酸を含む、一本鎖タンパク質またはそれらの断片を含む、アミノ酸の線状分子鎖を表す。本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、最大49個のアミノ酸からなる一群の分子を記載する。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、および少なくとも40アミノ酸のより好ましい分子群を表す。ペプチドおよびポリペプチドの群は、「(ポリ)ペプチド」という用語を用いて一緒に言及される。(ポリ)ペプチドはさらに、少なくとも2つの同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。そのような多量体の対応する高次構造は、対応して、ホモ－またはヘテロ二量体、ホモ－またはヘテロ三量体などと呼ばれる。例えば、HLAタンパク質はシステインを含んでいるため、二量化する可能性のある部位がある。用語「(ポリ)ペプチド」および「タンパク質」はまた、天然に修飾された(ポリ)ペプチドおよびタンパク質をいい、ここで、修飾は例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化および当該分野で周知の類似の修飾によって達成される。

【0022】

本発明によれば、「配列同一性パーセント(%)」という用語は、鋳型核酸またはアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数と比較した、2つ以上の整列した核酸またはアミノ酸配列の同一ヌクレオチド/アミノ酸の一致(「ヒット」)の数を表す。他の用語では、アラインメントを使用して、2つ以上の配列またはサブ配列について、同じ(例えば、80%、85%、90%または95%同一)であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージが比較の窓にわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような指定された領域にわたって、または手動でアラインメントされ、視覚的に検査される場合に、(サブ)配列が比較され、そして最大対応についてアラインメントされる場合に決定され得る。この定義はまた、整列される任意の配列の相補体にも適用される。

【0023】

本発明に関連するヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析およびアラインメントは、好ましくはNCBI BLASTアルゴリズム(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, および David J. Lipman(1997)、 Nucleic Acids Res.25:3389－3402)を用いて行われる。BLASTは、ヌクレオチド配列(ヌクレオチドBLAST)およびアミノ酸配列(タンパク質BLAST)に使用することができる。当業者は、核酸配列を整列させるためのさらなる適切なプログラムを知っている。

【0024】

本明細書で定義するように、少なくとも85％の同一、好ましくは少なくとも90％の同一、最も好ましくは少なくとも95％同一の配列が、本発明によって想定される。しかし、本発明はまた、少なくとも97.5%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、および100%同一の好ましい配列同一性の増加を想定する。これら全ての配列に関連して、免疫抑制が可能なタンパク質またはペプチドをコードする対応する配列番号の能力を保持していることが好ましい。また、これらの配列に関連して、移植効果を高めることが可能であることを保持していることが好ましい。

【0025】

本発明の第1の態様の好ましい実施形態によれば、核酸分子は異種ヌクレオチド配列に融合され、好ましくは異種プロモーターに作動可能に連結される。

【0026】

異種ヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子に直接的または間接的に融合され得る。間接融合の場合、好ましくは、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列がGS－リンカー(例えば、Gly－Gly－Gly－Gly－Ser)n(配列番号35)(式中、nは1～3)が使用される。

【0027】

本明細書で使用する場合、異種ヌクレオチド配列は、本発明の第1の態様に関連して定義したようなヌクレオチド配列と融合した天然に見出すことができない配列である。これらのヌクレオチド配列がヒト由来であることに注目すると、異種ヌクレオチド配列もヒト由来であることが好ましい。

【0028】

したがって、異種プロモーターとは、本発明の第1の態様に関連して定義されるようなヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然に見出すことができないプロモーターのことである。異種プロモーターは、好ましくはヒト由来である。

【0029】

プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸配列であり、前記遺伝子は、本発明の第1の態様に関連して定義される本発明に従うものである。これに関連して、「作動可能に連結された」とは、異種プロモーターが本発明の核酸分子に融合され、その結果、プロモーターを介して、本発明の核酸分子の転写が開始され得ることを意味する。異種プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、組織特異的または発生段階特異的なプロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであり得る。構成的プロモーター事実上すべての組織で発現を指令し、完全ではないにしても、大部分は環境因子と発生因子とは無関係である。それらの発現は通常内因性因子によって条件づけられないので、構成的プロモーターは通常種を越えて、さらには界を越えて活性化されている。組織特異的または発生段階特異的プロモーター、特定の組織または発生のある段階における遺伝子の発現を指示する。誘導性プロモーターの活性は生物的または非生物的因子の有無により誘導される。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が必要に応じてオンになったりオフになったりできるので、遺伝子工学において非常に強力な道具である。合成プロモーターは、多様な起源由来のプロモーター領域の一次元素を一緒にすることによって構築される。

【0030】

遺伝子を異種に発現させるために当技術分野で使用される異種プロモーターの非限定的な例はSV40、CMV、HSV、UBC、EF1A、PGK、Vlambda1、RSVおよびCAGG(哺乳動物系について); COPIAおよびACT5C(ショウジョウバエ系について);ならびにGAL1、GAL10、GAL7、GAL2(酵母系について)であり、そしてまた本発明と関連して使用され得る。

【0031】

ヒトにおける高い安定した導入遺伝子発現のためのプロモーターは、例えば、Hoffmann et al., Gene Ther.2017 May;24(5):298－307. doi:10.1038/gt.2017.20.Epub 2017 Apr 20に記載されている。 適切なプロモーターの非限定的な例は、ユビキタスプロモーターであるCMV、CAG、CBA、およびEF1a、ならびに組織特異的プロモーターであるシナプシン、CamKIIa、GFAP、RPE、ALB、TBG、MBP、MCK、TNT、およびaMHCである。

【0032】

あるいはまたは加えて、異種核酸配列は本発明の核酸配列が融合タンパク質を生じるようなコード配列であってもよい。

【0033】

本明細書で使用する「縮重」という用語は、遺伝暗号の縮重を意味する。コドンの縮重とは、アミノ酸を指定する3塩基対コドンの組み合わせの多さとして示される遺伝暗号の重複性のことである。同義突然変異の存在を説明するのは、遺伝暗号の縮重である。

【0034】

少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドを含む断片は、免疫抑制能を有するタンパク質またはペプチドをコードする対応する全長配列の能力を保持する断片であることが望ましい。第1の態様に関連して、断片はまた、好ましくは、移植効力を高めることができる。5'－ATP開始コドンおよび/または3'－TAG停止コドンを欠く断片のみであることが最も好ましい。

【0035】

本発明による「ベクター」という用語は好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または、例えば、本発明の核酸分子を有する遺伝子工学において慣用的に使用される別のベクターを意味する。本発明の核酸分子は例えば、いくつかの市販のベクターに挿入され得る。ベクターを介したヒトへの導入遺伝子の発現には、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（AAV）が好ましく、AAVがより好ましい。AAVは、DNAを標的細胞に送達するように設計できる非エンベロープ型ウイルスで、この分野では特に臨床段階の実験的治療戦略で大きな注目を集めている。ウイルス遺伝子を一切持たず、様々な治療用途に適したDNA配列を含む組み換えAAV粒子を生成する能力は、これまでのところ、遺伝子治療の最も安全な戦略の一つであることが証明されている（レビューについては、Naso et al.(2017), BioDrugs; 31(4):317－334.を参照）。

【0036】

ベクターに挿入された核酸分子は例えば、標準的な方法によって合成され得るか、または天然資源から単離され得る。コード配列の転写調節エレメントおよび/または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションはまた、確立された方法を使用して実施され得る。原核細胞または真核細胞における発現を確実にする転写調節エレメント(発現カセットの一部)は、当業者に周知である。これらの元素は転写の開始を確実にする調節配列(例えば、翻訳開始コドン、天然関連または異種プロモーターおよび/またはインシュレーターなどのプロモーター;上記を参照のこと)、内部リボソーム侵入部位(IRES)(Owens, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)、 1471－1476)、および任意に転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写ならびに翻訳エンハンサーが含まれ得る。好ましくは、本発明のポリペプチド/タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが原核生物または真核生物細胞における発現を可能にするこのような発現制御配列に作動可能に連結される。ベクターは、さらなる調節エレメントとして分泌シグナルをコードする核酸配列をさらに含み得る。このような配列は、当業者に周知である。さらに、使用される発現系に依存して、発現されたポリペプチドを細胞内区画に指向し得るリーダー配列が、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加され得る。そのようなリーダー配列は当技術分野でよく知られる。

【0037】

さらに、ベクターは選択マーカーを含むことが好ましい。選択可能なマーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、およびカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。具体的に設計されたベクターは細菌－真菌細胞または細菌－動物細胞(例えば、Invitrogenで入手可能なGatewayシステム)のような異なる宿主間でのDNAのシャトリングを可能にする。本発明による発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよびコードされたペプチドまたは融合タンパク質の複製および発現を指示することができる。ファージベクターまたはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)のようなベクターを介する導入とは別に、上記の核酸分子は直接導入のために、またはリポソームを介する細胞への導入のために設計され得る。さらに、バキュロウイルス系またはワクシニアウイルスまたはセムリキフォレストウイルスに基づく系を、本発明の核酸分子のための真核生物発現系として使用することができる。

【0038】

「宿主細胞」という語は細胞によるタンパク質またはペプチドまたは融合タンパク質の産生のために、任意の方法で選択され、改変され、形質転換され、増殖され、または使用され、または操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。

【0039】

本発明の宿主細胞は典型的には本発明の核酸分子またはベクター(単数または複数)を宿主細胞に導入することによって産生され、その宿主細胞/その存在により、本発明のタンパク質またはペプチドまたは融合タンパク質をコードする本発明の核酸分子の発現が媒介される。宿主細胞が由来または単離される宿主は任意の原核細胞または真核細胞または生物であってよく、好ましくはヒト胚の破壊によって直接誘導されたヒト胚性幹細胞を除く。

【0040】

本発明の宿主として有用な好適な原核生物（細菌）は、例えば、大腸菌のようなクローニング及び／又は発現に一般的に用いられるもの（例えば、,E coli株BL21、HB101、DH5a、XL1 Blue、Y1090およびJM101）、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Burkholderia glumae、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas stutzeri、Streptomyces lividans、Lactococcus lactis、Mycobacterium smegmatis、Streptomyces coelicolorまたはBacillus subtilisがあげられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で周知である。

【0041】

適当な真核宿主細胞は、脊椎動物細胞、昆虫細胞、真菌/酵母細胞、線虫細胞または植物細胞であり得る。真菌/酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ細胞、ピキア・パストリス細胞またはアスペルギルス細胞であり得る。本発明の核酸分子またはベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞の好ましい例は酵母、大腸菌および/またはバチルス属の種(例えば、枯草菌)の細胞である。1つの好ましい実施形態において、宿主細胞は酵母細胞(例えば、S. cerevisiae)である。

【0042】

異なる好ましい実施形態では、宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞、ヒト胚腎細胞(HEK－293)、ヒト胚網膜細胞(Crucell's Per.C6)、またはヒト羊水細胞(GlycotopeおよびCEVEC)などの哺乳動物宿主細胞である。細胞は、組換えタンパク質を産生するために当技術分野で頻繁に使用される。CHO細胞は、ヒトのための組換えタンパク質治療薬の工業用産生のために最も一般的に使用される哺乳動物宿主細胞である。

【0043】

受精卵子や着床前胚が着床する割合は、胚の品質と子宮の受容性の2つの要因に大きく左右される。子宮の受容性に関しては、着床の際に胚が（栄養胚葉を経由して）子宮の壁に直接接触することが注目される。IVF プログラムの卵子が受精卵子や着床前胚を受け取る雌のものである場合、胚は父親の遺伝情報により半同種移植（semi－allotransplant）となり、IVF プログラムの卵子が雌ドナーのものである場合、胚はさらに同種移植（allotransplant） となる。それにもかかわらず、子宮が胚を拒絶することなく、胚を子宮に付着させることができるのは、非常に注目に値する。HLAクラスIb遺伝子HLA－E、HLA－F（F1～F3）、HLA－G（G1～G7）、HLA遺伝子HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Yは胚に発現し、主に免疫抑制機能を発揮して、胚が母体に拒絶されず移植されると考えられている。妊娠および癌におけるHLA－E、HLA－FおよびHLA－Gの発現は先行技術から知られているが、本発明者らの知る限り、先行技術には、着床前胚の子宮への着床、ましてやin vitro受精プログラムにおけるHLA－E、HLA－FおよびHLA－Gの特定の役割について記載がない。

【0044】

HLA－H、HLA－JおよびHLA－Lに関しては、HLA－L、HLA－HおよびHLA－Jが当技術分野で誤って偽遺伝子としてアノーテートされていることが、出願人によって以前に意外にも発見された。実際、これらの遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、HLA－L、HLA－H、HLA－Jの発現がさまざまながんで検出された（PCT/EP2019/060606、EP 19 18 4729.2、EP 19 18 4681.5、EP 19 18 4717.7）。さらに、HLA－VとHLA－Yにはプロモーター領域とオープンリーディングフレームも見いだされた。HLA－L、HLA－H、HLA－J、HLA－VおよびHLA－Yはいずれも当技術分野で誤って命名されたものなので、HLA－L、HLA－H、HLA－J、HLA－VおよびHLA－Yをまとめて新しいHLAグループと記載することができ、本明細書ではクラスIwと呼ぶ。また、膀胱がん患者におけるHLA－L、HLA－H、HLA－Jの高発現レベルは、これらの患者の生存に悪影響を及ぼすことが明らかになった。これらのHLA遺伝子の発現レベルが高いほど、患者が2年間のうちにがんで死亡する可能性が高くなる (EP 19 18 4681.5 and EP 19 18 4717.7)。この一連の証拠は、HLAフォームL、HおよびJの発現が、腫瘍患者の免疫システムを回避するメカニズムとして腫瘍に利用されていることを示している。HLA－V、HLA－Yについても同様に考えることができる。着床時にHLA－L、HLA－H、HLA－J、HLA－VおよびHLA－Yが胚に発現して母親の免疫システムを回避し、胚を子宮に着床させるというのは、少なくともこの癌に関するデータからもっともらしいと言える。

【0045】

つまり、HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－F、HLA－Gは子宮の胚に対する受容性を高め、IVFプログラムにおける胚の着床の効率性を向上させる。胚盤胞細胞培養液にHLAクラスIbおよびIw遺伝子を補充することにより、 IVF プログラム中の胚着床の効率を高めることを、実施例1により説明する。さらに、実施例2は、胚盤胞細胞培養液におけるHLAクラスIbおよびIw遺伝子の発現を示したものである。したがって、本発明による核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、本明細書に定義される方法で使用される場合、子宮の受容性を高め、その結果、IVFプログラム中の胚の着床の効率を高めることになる。

【0046】

これに関連して、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚に接触させてもよい。実際には、例えば、未受精卵子、受精卵子、および／または着床前胚を、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む培養液中で培養することにより行うことができる。これにより、受精卵子や着床前胚が子宮に移植され、その後子宮壁に到達した時点で、HLA－H, HLA－J, HLA－L, HLA－V, HLA－E, HLA－F および/または HLA－G の量が増加する。

【0047】

また、受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前に、同時に、および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを子宮に接触させてもよい。実際には、例えば、受精卵子または着床前胚を子宮に移植する前、同時に、および／または後に、子宮をリンスするための核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む溶液を準備することによって行うことができる。この方法は、同様に、着床時の受精卵子または着床前胚と子宮の界面におけるHLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－E、HLA－Fおよび/またはHLA－Gの量を増加させることにつながる。

【0048】

さらに別の選択肢として、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、または任意の組み合わせは、受精卵子または着床前胚の子宮への移植の前、それと同時および／または後に全身投与されてよく、好ましくは注射、経皮および／または経膣投与によって投与されてもよい。また、全身投与により、着床時の受精卵子または着床前胚と子宮との界面におけるHLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－E、HLA－Fおよび／またはHLA－Gの量を増加させることになる。

【0049】

本発明の第1の態様の好ましい実施形態によれば、in vitro受精の前は、（i）未受精卵子の採取後から受精卵または着床前胚の子宮への移植の直前までの間の任意の時間であり、（ii）好ましくは精子による卵子の受精後から受精卵または着床前胚の子宮への移植の直前までの間の任意の時間である。

【0050】

本明細書で上述したように、IVFプログラムは、（i）ドナー雌の卵巣から成熟未受精卵子を採取すること、（ii）成熟未受精卵子を精子と受精させて受精卵子を得ること、（iii）任意で受精卵子を着床前胚にin vitro着床前発生させること、および（iv）受精卵子または着床前胚を雌の子宮に移植することを含む。

【0051】

上記の好ましい実施形態によれば、in vitro受精の前は、段階（ii）または（iii）であることができ、好ましくは段階（iii）である。

【0052】

in vitro受精後の本発明の第1の態様のさらに好ましい実施形態によれば、（i）受精卵子または着床前胚の子宮への移植直後から、受精卵子または着床前胚の子宮への移植の6日後までの間の任意の時期であり、(ii）好ましくは、受精卵子または着床前胚の子宮への移植直後から受精卵子または着床前胚の子宮への移植の4日後までの間の任意の時期であり、（iii）最も好ましくは、受精卵子または着床前胚の子宮への移植直後から受精卵子または着床前胚の子宮への移植の2日後までの間の任意の時期である。

【0053】

この好ましい実施形態に関して、受精卵または着床前胚の移植は、ヒトにおいて、卵子の受精後直接、および卵子の受精後6日後までいつでも行うことができることに留意されたい。これは、受精後、6日目に胚盤胞がハッチし、着床できる状態になるからである。胚盤胞が子宮の外でハッチしてしまうと、もう子宮に着床することができない。

【0054】

本発明は、第２の態様において、本発明の第１の態様の核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在下で、単離された卵子または着床前胚を培養することを含む、受精卵子または着床前胚が雌の in vitro 受精中に着床する可能性を高めるためのex vivoまたは in vitroの方法に関する。

【0055】

本発明の第1の態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第2の態様にも準用される。

【0056】

(i)～(iv)のIVFプログラムの工程については、本明細書で上述したとおりである。 第2の態様のex vivoまたはin vitroの方法は、in vivo工程（i）および（iv）を含まないが、核酸分子、ベクター、宿主細胞、タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの非存在下で培養された単離卵子または着床前胚と比較して、（その後工程（iv）で使用された場合に）in vitro受精中に着床する可能性が増加した受精卵子または着床前胚のex vivoまたはin vitro生産に関連するものである。

【0057】

本発明の第2の態様の好ましい実施形態によれば、単離された卵子は、未受精卵子または受精卵子である。

【0058】

したがって、単離された卵子は、精子と受精する前および／または後に、核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在下で培養することができる。

【0059】

本発明は、第3の態様において、妊娠中の中絶を予防するために用いる、本発明の第1の態様において定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関するものである。

【0060】

本発明の上記態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第3の態様にも準用される。

【0061】

同様に、本発明は、本発明の第1の態様で定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを妊娠中の雌に投与することを含む、妊娠中の中絶を予防するための方法に関する。

【0062】

中絶とは、胚や胎児が子宮の外で生存できるようになる前に排出し、妊娠を終了させることである。第3の態様に係る中絶は、介入なしに発生することであり、流産または自然流産と指定されることもある。 妊婦の年齢や健康状態にもよるが、既知の妊娠のうち15％から30％が臨床的に明らかな流産に終わる。このような自然流産の80%は妊娠初期に起こる。

【0063】

また、胚が子宮に着床した後も、胚は母体に拒絶されることがある。このような拒絶反応は、HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－E、HLA－Fおよび／またはHLA－Gの免疫抑制効果によって防止することができる。したがって、本発明による核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、中絶を防止するためにも使用することができる。

【0064】

本発明は、第4の態様において、妊娠中の雌における妊娠高血圧腎症の治療または予防に用いるための、本発明の第1の態様において定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関する。

【0065】

本発明の上記態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第4の態様にも準用される。

【0066】

同様に、本発明は、本発明の第1の態様で定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを妊娠中の雌に投与することを含む、妊娠中の雌における妊娠高血圧腎症の治療または予防のための方法に関する。

【0067】

妊娠高血圧腎症とは、一部の妊婦がかかる病気で、通常、妊娠後期（20週頃～）または出産後すぐに発症する。 軽症の妊娠高血圧腎症は妊娠の6％程度、重症は妊娠の1～2％程度といわれている。妊娠高血圧腎症は、高血圧と、別の臓器系（多くは肝臓と腎臓）の損傷の兆候を特徴とする。 妊娠高血圧腎症は、治療せずに放置すると、母親と胎児／幼児の両方に深刻な合併症を引き起こし、致命的な状態になる可能性もある。

【0068】

現在、最も有効な治療法は出産であるが、出産しても症状が消えるまで時間がかかることがある。

【0069】

妊娠高血圧腎症は、妊娠中、胎児に栄養を与える器官である胎盤から始まる。妊娠初期には、新生血管が発達し、胎盤に効率よく血液を送るために進化する。 栄養胚葉は胚盤胞の外層を形成する細胞で、胚に栄養を与え、胎盤の大部分に成長する。胎児－母体界面には様々な免疫細胞や免疫エフェクター分子が存在し、半同種異系胎児(semi－allogeneic foetus)に対する免疫寛容の維持に重要な役割を果たすとされている。胎児の栄養胚葉細胞はHLA－H, HLA－J, HLA－L, HLA－V, HLA－E, HLA－F および/または HLA－Gを発現し、その免疫抑制効果により母体のT細胞介在性異種反応から保護されており、母体のT細胞介在性異種反応性が妊娠高血圧腎症と関係していると推測される。

【0070】

従って、本発明による核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、妊娠高血圧腎症の治療または予防に用いることも可能であると考えられる。

【0071】

本発明の第4の態様の好ましい実施形態によれば、妊娠中の雌は、雄の胚または胎児を身籠る。

【0072】

妊娠高血圧腎症の有病率は、雄の胚または胎児を身ごもった雌では、雌の胚または胎児を身ごもった雌よりも高い。これは、同種のY染色体が存在するため、雄胎児の方がより同種反応性が高いためと推測される。

【0073】

本発明は、第5の態様において、HELLP症候群の治療または予防に使用するための、本発明の第1の態様に定義される核酸分子またはタンパク質もしくはペプチドの阻害剤に関連する。

【0074】

本発明の上記態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第5の態様にも準用される。

【0075】

同様に、本発明は、妊娠中の雌またはそれを必要として出産した雌に、本発明の第1の態様に定義される核酸分子またはタンパク質もしくはペプチドの阻害剤を投与することを含む、HELLP症候群を治療または予防する方法に関する。

【0076】

HELLP症候群（溶血、肝酵素上昇、低血小板））は、溶血、肝酵素上昇、低血小板数を特徴とする妊娠の合併症である。通常、妊娠後期3カ月か産後まもなく始まる。 HELLP症候群は、妊娠の約0.7%に発生する。HELLP症候群では、胎児の細胞が母体の生体に流入し、母体に移植片対宿主反応を引き起こす。HELLP症候群は、母体の免疫システムが胚に対してまだ耐性がないため、最初の妊娠でより頻繁に発生する。

【0077】

母親の免疫系が母親の体内に浮遊する胎児細胞を認識できるようにするために、核酸分子またはタンパク質の阻害剤、あるいは本発明の第1の態様で定義されるような阻害剤が使用されてもよい。このような阻害剤は、HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－E、HLA－Fおよび／またはHLA－Gの免疫抑制効果を抑制するため、胎児細胞に対する母親の免疫系の免疫寛容を抑制する。

【0078】

ミメティック本発明の第5の態様の好ましい実施形態に従って、（i）核酸分子の阻害剤は、低分子、アプタマー、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アンチセンス核酸分子、CRISPR－Cas9ベースの構築物、CRISPR－Cpf1ベースの構築物、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写活性化因子様（TAL）エフェクター（TALE）ヌクレアーゼから選択され、および／または（ii）タンパク質の結合分子、好ましくはタンパク質の阻害剤は、小分子、抗体または抗体ミメティック、アプタマーから選択される。

【0079】

本発明の第５の態様のさらにより好ましい実施形態において、抗体ミメティックは、好ましくはアフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPin、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Fynomers(登録商標)、三重特異性結合分子およびプロボディから選択される。

【0080】

本明細書で使用される「低分子」は、好ましくは有機分子である。有機分子は炭素基礎を有する化合物のクラスに関連するか、または属し、炭素原子は、炭素－炭素結合によって一緒に連結される。化学化合物の供給源に関連する用語「有機」の本来の定義であり、有機化合物は植物または動物または微生物の供給源から得られる炭素含有化合物であり、一方、無機化合物は、鉱物源から得られたものである。有機化合物は、天然であっても合成であってもよい。有機分子は好ましくは芳香族分子であり、より好ましくはヘテロ芳香族分子である。有機化学では、芳香族性という用語が同じ原子セットを有する他の幾何学的または結合配列よりも安定性が高い共鳴結合の環を有する環状(環形状)、平面(平坦)分子を表すために使用される。芳香族分子は非常に安定であり、他の物質と反応するために容易に分解しない。複素芳香族分子において、芳香環中の原子の少なくとも1つは、炭素以外の原子、例えば、N、S、またはOであり、上記の全ての有機分子について、分子量は好ましくは200Da～1500Daの範囲であり、より好ましくは300Da～1000Daの範囲である。

【0081】

あるいは、本発明に係る「低分子」が無機化合物であってもよい。無機化合物は鉱物源に由来し、炭素原子を持たないすべての化合物(二酸化炭素、一酸化炭素および炭酸塩を除く)を含む。好ましくは、低分子が約2000Da未満、または約500Da未満などの約1000Da未満、さらにより好ましくは約Da amu未満の分子量を有する。小分子の大きさは、当技術分野でよく知られている方法、例えば質量分析によって決定することができる。低分子は、例えば、標的分子のクリスタル構造に基づいて設計することができ、ここでは、生物学的活性の原因と考えられる部位を同定し、in vivoハイスループットスクリーニング(HTS)アッセイのようなin vivoアッセイで検証することができる。

【0082】

本発明で使用される用語「抗体」は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。さらに、標的（例えばHLA－J）に対する結合特異性を保持する誘導体やその断片も「抗体」の用語に含まれる。抗体断片または誘導体は、特に、FabまたはFab'断片、Fd、F（ab'）2、FvまたはscFv断片、VhHまたはV－NAR－ドメインのような単一ドメインVHまたはV様ドメイン、ならびにミニボディ、ダイアボディ、トリボディまたはトリプルボディ、テトラボディまたは化学結合Fab'－マルチマーなどのマルチマー形式を含む（例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198; Harlow and Lane “Using Antibodies:A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Altshuler EP, Serebryanaya DV, Katrukha AG.2010, Biochemistry (Mosc)., vol. 75(13), 1584; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol., vol. 23(9), 1126を参照。）多量体フォーマットは特に、2つの異なったタイプの抗原に同時に結合することができる二重特異性抗体を含む。第一の抗原は、本発明に係るタンパク質上に見出すことができる。第二の抗原は、例えば、栄養胚葉細胞や子宮のある種の細胞に特異的に発現する胎盤マーカーであってもよい。二重特異性抗体フォーマットの非限定的な例は、Biclonics(二重特異的、全長ヒトIgG抗体)、DART(Dual－affinity Re－targeting Antibody)およびBiTE(種々の抗体の2つの一本鎖可変断片(scFvs)からなる)分子である(Kontermann and Brinkmann (2015)、 Drug Discovery Today, 20(7):838－847)。このような二重特異性抗体を用いることで、二重特異性抗体の作用を、例えば、子宮や胎盤に集中させることができる。胎盤バイオマーカーは、例えば、Manokhina et al.(2017), Hum Mol Genet.; 26(R2):R237－R245 に記載されている。

【0083】

用語「抗体」はまた、キメラ(ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン)、一本鎖およびヒト化(非ヒトCDRを除くヒト抗体)抗体などの実施形態を含む。

【0084】

抗体の産生のための様々な技術は当該分野で周知であり、そして例えば、Harlow and Lane(1988)および(1999)ならびにAltshuler et al. 2010(上掲)に記載される。従って、ポリクローナル抗体は添加剤およびアジュバントとの混合物中の抗原での免疫化の後に動物の血液から得られ得、そしてモノクローナル抗体は連続的な細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の技術によって産生され得る。このような技術に関する例は、例えば、Harlow E and Lane D, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow E and Lane D, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載されており、Koehler and Milstein, 1975によってもともと記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor D, 1983, Immunology Today, vol.4,7; Li J, et al.2006, PNAS, vol.103(10), 3557）、EBV－ハイブリドーマ法によるヒトモノクローナル抗体の作製（Cole et al., 1985, Alan R. Liss, Inc, 77－96）などがある。さらに、組換え抗体はモノクローナル抗体から得ることができ、またはファージ、リボソーム、mRNA、もしくは細胞ディスプレイなどの様々なディスプレイ方法を用いてde novoで調製することができる。組換え(ヒト化)抗体の発現に適したシステムは例えば、細菌、イースト、昆虫、哺乳動物細胞株、またはトランスジェニック動物もしくは植物から選択することができる(例えば、米国特許第6,080,560号; Holliger P, Hudson PJ.2005, Nat Biotechnol.、 vol.23(9)、 11265を参照されたい)。さらに、一本鎖抗体の産生のために記載された技術(特に、米国特許第4,946,778号参照)は、例えばHLA－Jのエピトープに特異的な一本鎖抗体を産生するように適合され得る。BIAcoreシステムで使用されるような表面プラズモン共鳴は、ファージ抗体の効率を増加させるために使用され得る。

【0085】

本明細書中で使用される用語「抗体ミメティック」は、抗体と同様に、抗原、例えばHLA－Jタンパク質に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しない化合物を指す。抗体ミメティックは通常、約3～20kDaのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。例えば、抗体模倣体は、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、DARPins、アビマー、ナノフィチン、アフィリン、クニッツドメインペプチド、Fynomers(登録商標)、三重特異性結合分子およびプロドディー(prododies)からなる群より選択され得る。これらのポリペプチドは当該分野で周知であり、そして以下にさらに詳細に記載される。

【0086】

本明細書中で使用される「アフィボディ」という用語は、ブドウ球菌タンパク質AのZ－ドメインに由来する抗体ミメティックのファミリーを指し、構造的には、アフィボディ分子は、融合タンパク質にも取り込むことができる3－ヘリックスバンドルドメインに基づく。アフィボディはそれ自身、約6kDaの分子量を有し、高温および酸性またはアルカリ性条件下で安定である。標的特異性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する2つのαヘリックスに位置する13のアミノ酸をランダム化することにより得られる(Feldwisch J, Tolmachev V.; (2012) Methods:Mol Biol.899:103－26)。

【0087】

用語「アドネクチン」(「モノボディ」とも呼ばれる)は、本明細書中で使用される場合、ヒトフィブロネクチンIII (10Fn3)の10番目の細胞外ドメインに基づく分子に関し、2～3の露出したループを有する94残基のIg様βサンドイッチフォールドを採用するが、中央のジスルフィド架橋を欠く(Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245－255)。所望の標的特異性、例えばHLA－Jに対するアドネクチンは、タンパク質の特異的ループに修飾を導入することによって遺伝子操作することができる。

【0088】

本明細書中で使用される用語「アンチカリン」は、リポカリンに由来する改変タンパク質を指す(Beste G, Schmidt FS, Stibora T, Skerra A. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):1898－903; Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245－255)。アンチカリンは8本鎖βバレルを有し、リポカリンの中で高度に保存されたコアユニットを形成し、開いた末端に4つの構造的に可変なループを介してリガンドに対する結合部位を天然に形成する。アンチカリンは、IgGスーパーファミリーとは相同ではないが、これまで抗体の結合部位に典型的と考えられてきた特徴を示す: (i)配列変異の結果としての高い構造可塑性、(ii)立体配座柔軟性の上昇で、形状の異なる標的への誘導適合を可能にする。

【0089】

本明細書中で使用される用語「DARPin」は、設計されたアンキリンリピートドメイン(166残基)を指し、これは、典型的には3回の反復β－ターンから生じる硬い界面を提供する。DARPinは通常、人工的なコンセンサス配列に対応する3つの反復配列をもっており、反復ごとに6つの位置がランダム化されている。そのため、DARPinは構造的柔軟性を欠いている(Gebauer and Skerra, 2009)。

【0090】

本明細書中で使用される用語「アビマー」は、種々の膜受容体のA－ドメインに由来し、リンカーペプチドによって連結される、各々30～35アミノ酸の2つ以上のペプチド配列からなる抗体ミメティックのクラスを指す。標的分子の結合はAドメインを介して起こり、所望の結合特異性、例えばHLA－Jに対するドメインは、例えばファージディスプレイ技術によって選択することができる。アビマーに含まれる異なるAドメインの結合特異性は同一であってもよいが、同一である必要はない(Weidle UH, et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4): 155－68)。

【0091】

「ナノフィチン」(別名アフィチン)は、スルホロブス・アシドカルダリウスのDNA結合タンパク質Sac7dに由来する抗体模倣タンパク質である。ナノフィチンは通常、約7kDaの分子量を有し、そして結合表面上のアミノ酸をランダム化することによって、標的分子(例えば、HLA－J)に特異的に結合するように設計される(Mouratou B, Behar G, Paillard－Laurance L, Colinet S, Pecorari F.、 (2012) Methods: Mol Biol.; 805:315－31)。

【0092】

本明細書で使用される「アフィリン」という語は、ガンマ－Bクリスタリン性またはユビキチンのいずれかを足場として使用し、ランダム突然変異誘発によってこれらのタンパク質の表面上のアミノ酸を修飾することによって開発される抗体ミメティックを指す。所望の標的特異性、例えばHLA－Jに対するアフィリンの選択は例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイ技術によって行われる。足場にもよるが、アフィリンの分子量はおよそ10または20kDaである。本明細書で使用される場合、用語アフィリンはまた、アフィリンの二量体型または多量体型を指す(Weidle UH, et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155－68)。

【0093】

「クニッツドメインペプチド」は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)、アミロイド前駆体タンパク質(APP)または組織因子経路阻害剤(TFPI)のようなクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来する。クニッツドメインは約6kDAの分子量を有し、必要な標的特異性、例えばHLA－Jに対するドメインはファージディスプレイなどのディスプレイ技術によって選択することができる(Weidle et al.、 (2013)、 Cancer Genomics Proteomics; 10(4):155－68)。

【0094】

本明細書中で使用される「Fynomer(登録商標)」という用語は、ヒトFyn SH3ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチドを指す。Fyn SH3由来ポリペプチドは当技術分野でよく知られており、例えば、Grabulovski et al.(2007) JBC, 282, p. 3196－3204, WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57－68, Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245－255, or Schlatter et al.(2012), MAbs 4:4, 1－12)に記載されている。

【0095】

本明細書で用いられる用語「三重特異性結合分子」は、ポリペプチド分子が三つの結合ドメインを有し、よって三つの異なったエピトープに対して結合、好ましくは特異的に結合することができることを意味する。これら3つのエピトープのうちの少なくとも1つは、本発明の第4の態様のタンパク質のエピトープである。2つの他のエピトープはまた、本態様の第4のタンパク質のエピトープであり得るか、または1つもしくは2つの異なった抗原のエピトープであり得る。三重特異性結合分子は、好ましくはTriTacである。TriTacは、3つの結合ドメインから構成され、血清半減期が延長され、モノクローナル抗体の約3分の1の大きさである固形腫瘍のためのT細胞誘導(T－cell engager)である。

【0096】

アプタマーは、特定の標的分子に結合する核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダムな配列プールからこれらを選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも、リボスイッチに存在する。アプタマーは、基本研究および臨床目的の両方において、高分子薬物として用いることができる。アプタマーはリボザイムと組み合わせることができ、それらの標的分子の存在下で自己切断する。これらの化合物分子は、さらなる研究、工業的および臨床用途を有する (Osborne et. al. (1997)、 Current Opinion in Chemical Biology, 1:5－9; Stull & Szoka (1995)、 Pharmaceutical Research, 12, 4:465－483)。

【0097】

核酸アプタマーは、通常オリゴヌクレオチドの(通常は短い)鎖からなる核酸種である。典型的には、小分子、タンパク質、核酸、さらには細胞、組織および生物などの種々の分子標的に結合するために、in vitro選択の反復ラウンドまたは同等にSELEX (指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化)を介して改変されている。

【0098】

ペプチドアプタマーは、通常、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドまたはタンパク質である。それらは、両端でタンパク質足場に結合した可変ペプチドループからなる。この二重構造束縛は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベルまで大きく増加させる(ナノモル範囲)。可変ペプチドループは典型的には10～20個のアミノ酸を含み、足場は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。現在、細菌タンパク質であるチオレドキシンAが最も一般的に使用されている足場タンパク質であり、可変ペプチドループがレドックス活性部位内に挿入されており、－Cys－Gly－Pro－Cys－ループ（配列番号36）、2つのシステインの側鎖がジスルフィド結合を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は異なるシステムを用いて行うことができるが、現在最も広く用いられているのは酵母ツーハイブリッドシステムである。

【0099】

アプタマーは、一般的に使用される生体分子、特に抗体のそれらに匹敵する分子認識特性を提供するので、バイオテクノロジーおよび治療用途のための有用性を提供する。アプタマーは、その識別認識に加えて、試験管内で完全に改変することができ、化学合成により容易に生産され、望ましい貯蔵特性を有し、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体よりも有利である。非修飾アプタマーは血流から速やかに除去され、半減期は数分から数時間である。これは主に、アプタマーが本来低分子量である結果、ヌクレアーゼの分解と腎臓による身体からのクリアランスのためである。非修飾アプタマーの応用は、現在、血液凝固のような一過性の状態の治療、または局所送達が可能な眼のような器官の治療に焦点を当てている。この迅速なクリアランスは、in vivo画像診断などの応用において利点となりうる。2'－フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール(PEG)結合、アルブミンへの融合または他の半減期延長タンパク質などのいくつかの修飾が科学者に利用可能であり、アプタマーの半減期を数日間または数週間にわたって増加させることができる。

【0100】

本明細書で使用される場合、用語「プロボディ」は、プロテアーゼ活性化可能なプロドラッグ、例えば、プロテアーゼ活性化可能な抗体プロドラッグを意味する。プロボディは、真正のIgG重鎖および修飾された軽鎖からなる。マスキングペプチドは、腫瘍特異的プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーを介して軽鎖に融合される。マスキングペプチドは健康な組織へのプローブ様結合を防止し、それによって毒性の副作用を最小限にする。さらに、プロボディにより、低分子、抗体または抗体ミメティックおよびアプタマーの結合および/または阻害活性を、特定の組織または細胞型、特に罹患組織または細胞型に限定することができる。プロボディでは低分子、抗体または抗体ミメティックまたはアプタマーは本発明のタンパク質への結合を制限または防止するマスキングペプチドに結合され、このマスキングペプチドはプロテアーゼによって切断され得る。プロテアーゼは、基質として知られる特異的アミノ酸配列を切断することによってタンパク質をより小さな断片に消化する酵素である。正常の健康な組織では、プロテアーゼ活性は厳密に制御される。がん細胞では、プロテアーゼ活性はアップレギュレートされる。プロテアーゼ活性が調節され、最小限である健康な組織または細胞において、プロボディの標的結合部位はマスクされたままであり、したがって結合することができない。一方、プロテアーゼ活性がアップレギュレートされる疾患組織または細胞では、プロボディの標的結合部位はマスクされず、したがって結合および/または阻害することができる。

【0101】

本発明によれば、短鎖干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られる「低分子干渉RNA (siRNA)」という用語は、生物学において様々な役割を果たす18～30、好ましくは19～25、最も好ましい21～23またはさらに好ましい21ヌクレオチド長二本鎖RNA分子を指す。最も顕著なことは、siRNAが特定の遺伝子の発現を妨害するRNA干渉(RNAi)経路に関与することである。siRNAは、RNAi経路における役割に加えて、RNAi関連経路においても、例えば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造を形成する際に、作用する。

【0102】

天然に存在するsiRNAは、明確な構造をもっている。すなわち、両端に2ntの3'突出部をもつ短い二本鎖のRNA (dsRNA)である。各鎖は5'ホスフェート基と3'ヒドロキシル(－OH)基をもつ。この構造は、長いdsRNAか小さなヘアピンRNAのどちらかをsiRNAに変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。 siRNAを細胞内に外因的に(人工的に)導入して、目的の遺伝子の特異的なノックダウンをもたらすこともできる。このようにして、配列が既知である本質的に任意の遺伝子を、適切に調整されたsiRNAとの配列相補性に基づいて標的化することができる。二本鎖RNA分子またはその代謝プロセシング産物は、標的特異的核酸修飾、特にRNA干渉および/またはDNAメチル化を媒介することができる。外因的に導入されたsiRNAは、その3'末端および5'末端に突出部を欠くことがあるが、しかしながら、少なくとも1つのRNA鎖が5'および/または3'－突出部を有することが好ましい。好適には、二本鎖の一方の末端は、1～5ヌクレオチド、より好適には1～3ヌクレオチド、最も好適には2ヌクレオチドの3'－突出部を有する。もう一方の末端は平滑末端であってもよいし、最大6ヌクレオチドの3'－突出部を有していてもよい。一般に、siRNAとして作用するのに適した任意のRNA分子が、本発明において想定される。これまで最も効率的なサイレンシングは、2－nt 3'突出部を有するように対になった21－ntセンスおよび21－ntアンチセンス鎖から構成されるsiRNA二重鎖で得られた。2－ntの3'突出部の配列は、第1の塩基対に隣接する対になっていないヌクレオチドに限定された標的認識の特異性に少し寄与する(Elbashir et al. 2001)。3'突出部の2'－デオキシヌクレオチドはリボヌクレオチドと同程度に効率的であるが、合成がより安価で、おそらくヌクレアーゼ抵抗性がより高い。siRNAの送達は、例えば、siRNAを生理食塩水と組み合わせ、その組み合わせを静脈内または経鼻的に投与することにより、またはsiRNAをグルコース（例えば5％グルコースなど）中に配合することにより、当技術分野で知られている方法のいずれかを用いて達成することができ、カチオン性脂質およびポリマーは、静脈内または腹腔内（IP）のいずれかの全身経路を通じたin vivoでのsiRNA送達に使用できる (Fougerolles et al.(2008), Current Opinion in Pharmacology, 8:280－285; Lu et al.(2008), Methods in Molecular Biology, vol. 437:Drug Delivery Systems － Chapter 3:Delivering Small Interfering RNA for Novel Therapeutics)。

【0103】

短ヘアピンRNA (shRNA)は、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる、緊密なヘアピンターンを作るRNAの配列である。 shRNAは、細胞に導入されたベクターを使用し、U6プロモーターを利用して、常にshRNAが発現されるようにする。このベクターは通常娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングを受け継ぐことができる。shRNAヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAに切断され、次にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に結合する。この複合体は結合しているsiRNAに一致するmRNAに結合して切断する。 本発明で使用されるsi/shRNAは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のDNA/RNA合成装置を用いて化学的に合成されることが望ましい。RNA合成試薬の供給業者は、Proligo (Hamburg、ドイツ)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部、Rockford, IL, USA)、Glen Research (Sterling, VA, USA)、ChemGenes (Ashland, MA, USA)およびCruachem (Glasgow, UK)である。最も好都合なことに、siRNAまたはshRNAは、異なる品質およびコストのRNA合成生成物を販売する、市販のRNAオリゴ合成供給業者から得られる。一般に、本発明で適用可能なRNAは、従来技術で合成され、RNAiに適した品質で容易に提供される。

【0104】

RNAiに影響を及ぼすさらなる分子には、例えば、マイクロRNA(miRNA)が含まれる。前記RNA種は一本鎖RNA分子である。内因的に存在するmiRNA分子は、相補的なmRNA転写産物に結合し、RNA干渉と同様のプロセスを通して、前記mRNA転写産物の分解の引き金を引くことによって、遺伝子発現を調節する。したがって、外因的miRNAはそれぞれの細胞に導入した後に、HLA－Jの阻害剤として使用され得る。

【0105】

リボザイム(リボ核酸酵素由来、RNA酵素または触媒RNAとも呼ばれる)は、化学反応を触媒するRNA分子である。多くの天然リボザイムは、自身の切断または他のRNAの切断のいずれかを触媒するが、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもわかっている。よく特徴づけられた小さな自己切断RNAの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、およびin vitroで選択された鉛依存性リボザイムであるが、グループIイントロンはより大きなリボザイムの例である。触媒による自己切断の原理は近年よく確立されるようになった。ハンマーヘッド型リボザイムは、リボザイム活性をもつRNA分子の中で最もよく特徴づけられている。ハンマーヘッド型構造が異種RNA配列に組み込まれ、リボザイム活性がそれによってこれらの分子に移入され得ることが示されたので、標的配列が潜在的に一致する切断部位を含むならば、ほぼあらゆる標的配列に対する触媒的アンチセンス配列を作製することができるようである。ハンマーヘッド型リボザイムを構築する基本原理は以下の通りである:GUC (またはCUC)トリプレットを含むRNAの関心領域が選択される。通常6～8ヌクレオチドの2本のオリゴヌクレオチド鎖が取られ、触媒ハンマーヘッド配列がそれらの間に挿入される。最良の結果は通常、短いリボザイムと標的配列で得られる。

【0106】

また、最近の発展は、ハンマーヘッド型リボザイムを有する小さな化合物を認識するアプタマーの組み合わせである。標的分子と結合したときにアプタマーに誘導される立体配座変化はリボザイムの触媒機能を調節することができる。

【0107】

用語「アンチセンス核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、標的核酸に相補的である核酸を指す。本発明によるアンチセンス分子は、標的核酸と相互作用することができ、より具体的には、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ハイブリッドの形成により、標的遺伝子の転写および/または標的mRNAの翻訳が減少または遮断される。アンチセンス技術に関する標準的な方法が記載されている(例えば、Melaniら、Cancer Res.(1991)51:2897－2901を参照)。

【0108】

CRISPR/Cas9はCRISPR‐Cpf1と同様に、ほぼ全ての細胞/モデル生物に適用可能であり、ノックアウト突然変異、染色体欠失、DNA配列の編集および遺伝子発現の調節に用いることができる。遺伝子発現の調節は、転写抑制因子と結合した触媒的に死んだCas9酵素(dCas9)を用いて、特定遺伝子、ここでは例えばHLA－J遺伝子の転写を抑制することによって操作することができる。同様に、触媒的に不活性な「死んだ」Cpf1ヌクレアーゼ(PrevotellaおよびFrancisella－1由来のCRISPR)を、合成転写リプレッサーまたはアクチベーターに融合させて、内因性プロモーター(例えば、HLA－J発現を制御するプロモーター)をダウンレギュレートし得る。あるいは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)のDNA結合ドメインが標的（例えばHLA－J）遺伝子またはそのプロモーター領域またはその5’－UTRを特異的に認識し、それによって標的の発現を阻害するように設計することができる。

【0109】

興味の遺伝子またはその発現に関与する調節分子を標的とする核酸分子を阻害するものとして提供される阻害剤も、本明細書において想定される。標的遺伝子または調節分子の発現を減少または消失させるこのような分子には限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび転写アクチベーター様(TAL)ヌクレアーゼが含まれる。このような方法は、Silva et al., Curr Gene Ther.2011;11(1):11－27; Miller et al., Nature biotechnology.2011;29(2):143－148, and Klug, Annual review of biochemistry.2010; 79:213－231に記載されている。

【0110】

本発明は、第6の態様において、自己免疫疾患、好ましくは妊娠中の雌における自己免疫疾患の治療または予防に用いるための、第1の態様において定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関し、ここで、自己免疫疾患は好ましくは皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群または強皮症である。

【0111】

本発明の上記態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第６の態様にも準用される。

【0112】

同様に、本発明は、第1の態様で定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを、治療されるべき対象、好ましくは妊娠中の雌に投与することを含む自己免疫疾患の治療方法に関する。

【0113】

自己免疫疾患とは、対象の自己免疫系が対象の身体を攻撃する疾患である。HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－FおよびHLA－Gの免疫抑制効果は、対象の身体に対する不要な免疫反応の防止または治療が期待されるものである。したがって、本発明による核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、自己免疫疾患を治療するための手段である。

【0114】

自己免疫疾患は、好ましくは皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、シェーグレン症候群および強皮症から選択され、これらの自己免疫疾患は、非妊娠女性と比較して妊娠女性に高い有病率があることに留意されたい。

【0115】

本発明は、第7の態様において、移植片対宿主病の治療または予防に用いるための、第1の態様に定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせに関する。

【0116】

本発明の上記態様の定義および好ましい実施形態は、本発明の第７の態様にも準用される。

【0117】

また、本発明は、第1の態様に定義される核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを対象に投与することを含む、移植片対宿主病を治療または予防する方法にも関する。

【0118】

移植片対宿主病（GVHD）とは、移植後に、ドナーの組織（移植片）に存在する免疫細胞がホスト自身の組織を攻撃することによって、患者に起こる免疫疾患である。GVHDは、血縁ドナーおよび非血縁ドナーからの骨髄移植（幹細胞移植）後の合併症の一つである。このような移植は同種移植（allogeneic transplant）と呼ばれる。急性GVHDや慢性GVHDでは、症状は軽度なものから生命を脅かす重度のものまであり、他の臓器障害とともに皮膚炎、黄疸、胃腸（GI）の不快感などを伴うことが多い。急性GVHDは通常、移植後100日以内に発症し、急性型では皮疹、肝機能障害、吐き気や下痢などの腸管症状が臨床症状として現れる。慢性GVHDはその後に発症し、慢性型は様々な臓器や身体系に影響を及ぼす可能性がある。GVHDは、移植ドナーとレシピエント患者の免疫細胞間の多くの相互作用が関与する複雑な病態生理を有する。

【0119】

HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－F、HLA－Gの免疫抑制効果により、GVHDの予防・治療が期待される。したがって、本発明による核酸分子、ベクター、宿主細胞、またはタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせは、GVHDを治療するための手段である。

【0120】

最後に、本発明のすべての以前の態様の好ましい実施形態に従って、（I）少なくとも1つの核酸分子は、(a)配列番号1から6のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子、 (b) 配列番号18から23のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子、(c) （ａ）のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは少なくとも95%同一であるポリペプチドをコードする核酸分子;(d) (b)のヌクレオチド配列と少なくとも９５%同一、好ましくは少なくとも９６%同一、最も好ましくは少なくとも９８%同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子;(e)(d)の核酸分子に対して縮重したヌクレオチド配列からなる核酸分子;(f) (a)から(e)のいずれか1つに記載の核酸分子の断片であって、前記断片は、少なくとも150ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも450ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも600ヌクレオチドを含むか、または (g) TがUで置換されている、(a)から(f)のいずれかに記載の核酸分子に対応する核酸分子から選択され;(II)ベクターが、(I)の核酸分子を含み; (iii)宿主細胞が(II)のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされ、および (IV)少なくとも1つのタンパク質またはペプチドが、（I）の核酸分子によってコードされているタンパク質またはペプチドから選択される。

【0121】

HELLP症候群の治療のための、本発明の第1の態様で定義された核酸分子またはタンパク質もしくはペプチドの阻害剤を読み取る本発明の第5の態様に関しては、この阻害剤は、好ましくは、上記好ましい実施形態の（I）で定義された核酸分子核酸分子または（IV）で定義されたタンパク質もしくはペプチドの阻害剤であると理解されるであろう。

【0122】

配列番号1～6は、HLA－H、HLA－J、HLA－L可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－V、およびHLA－Yのアミノ酸配列であり、配列番号 18～23はHLA－H、HLA－J、HLA－L、可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－V、およびHLA－Yをコードするヌクレオチド配列である。本明細書で上述したように、HLA－H、HLA－J、HLA－L、可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－Yが従来偽遺伝子と誤って分類されていたが、実際にはタンパク質コード遺伝子であることは本願および本願の上記引用先出願の貢献するところである。本明細書で上記した理由から、HLA－H、HLA－J、HLA－L、可溶型、HLA－L膜結合型、HLA－V、HLA－Yまたはそれらの阻害剤は、本発明の第2の態様の方法と同様に、本明細書に開示される種々の医療行為に有用である。HLA－Lに関しては、膜結合型よりも可溶型が好ましい。

【0123】

上記の好ましい実施形態に関連して、医療用途がこれらのHLAの免疫寛容効果を促進または阻害することを必要とするかどうかに応じて、HLA－G、HLA－Eおよび／またはHLA－Fまたはその阻害剤をさらに使用することが好ましい。

【0124】

本明細書で特徴付けられる実施形態に関して、特に請求項では、従属請求項で言及される各実施形態が、各請求項の各実施形態(独立または従属)と組み合わせられることが意図されている。例えば、3つの選択肢A、B、Cを記載する独立請求項1、3つの選択肢D、E、Fを記載する従属請求項2、請求項1および2に依存し3つの選択肢G、H、Iを記載する請求項3の場合、明細書は、 特に明記しない限り、組み合わせA, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, 対応する実施形態を明確に開示すると理解されよう。

【0125】

同様に、また、独立請求項及び/又は従属請求項が選択肢を記載していない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に遡って参照している場合、それによってカバーされる対象事項の組み合わせは、明示的に開示されているとみなされることが理解される。例えば、独立請求項1、請求項1をさかのぼって参照する従属請求項2、および請求項2および1の両方をさかのぼって参照する従属請求項3の場合、請求項3及び1の対象事項の組み合わせは、請求項3、2及び1の対象事項の組み合わせと同様に明確かつ明白に開示されることになる。請求項1～3のいずれか1項を参照するさらなる従属請求項4が存在する場合、請求項4及び1、請求項4、2及び1、請求項4、3及び1並びに請求項4、3、2及び1の対象事項の組み合わせは、明確かつ明白に開示されることになる。
実施例により本発明を説明する。

【実施例】

【0126】

実施例1胚盤胞細胞培養液へのHLAクラスIbおよびIw遺伝子の補充
本実施例は、胚盤胞細胞培養に、合成したHLAクラスIbおよびIw分子を補充し、あるいは全身に適用してin vitro受精胚の着床を支援する手順に関するものである。

【0127】

HLA－G、HLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、および/またはHLA－Fを胚細胞培養に添加した。細胞培養に加えるHLAタンパク質の用量は、 Sjoeblom et al.(Sjoeblom C1, Wikland M, Robertson SA., Hum Reprod.1999 Dec;14(12):3069－76) および Bhatnagar et al.(Bhatnagar P1, Papaioannou VE, Biggers JD, Development.1995 May;121(5):1333－9)に従って評価した。組換えHLA－GまたはHLA－H、HLA－J、HLA－L、HLA－V、HLA－Y、HLA－E、HLA－Fタンパク質は、最先端のものとして、Favier et al (Favier et al., PLoS One.2011; 6(7): e21011)に従って作成した。

【0128】

静脈内投与用に、cGMP条件下でリコンビナントHLA－G, HLA－H, HLA－J, HLA－L, HLA－V, HLA－Y, HLA－E, および/または HLA－Fタンパク質を作製した。品質、無菌性、エンドトキシン試験および化学的純度は、欧州薬局方V.8.0（欧州薬局方（Ph.Eur.)Vol 8 (2013－2016) European Directorate of Quality of Medicines）のモノグラフに従って試験されている。

【0129】

着床率と妊娠率に対するHLAの補給の効果を比較するために、HLAタンパク質の補給を受けない対照群もモニターされた。

【0130】

米国生殖医学会のガイドライン（Fertil Steril, 2017;107:882－96）に従い、5日目に胚移植を実施した。着床の成功は、血清中の遊離β－ヒトコリオゴナドトロピン（β－hCG）レベルの測定と膣超音波観察によって確認された。
HLAを補充した胚は、対照群に比べ、着床率、妊娠成功率が有意に高いことが観察された。

【0131】

実施例2－胚盤胞細胞培養液中のHLAクラスIbおよびIw遺伝子の抽出と測定
HLAクラス IbとIwの発現を評価するために、まず胚盤胞細胞培養液からRNAを抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT－PCR）により評価した。胚盤胞は細胞外小胞（EV）にRNAを排出するため（Giacominiら、Sci Rep. 2017; 7:5210）、Koenigらのプロトコルに従ってExoQuick^TM（SBI Systems Bioscience Inc.Mountain View CA, USA）でまずEVを収集しRNAを単離した（Koenigら, Hum Immunol.2016 Sep;77(9):791－9）。ExoQuick^TM 試薬を除去した後、Stratifyer Blood extraction kit のプロトコルにしたがって RNA を抽出した。簡単に説明すると、プロテイナーゼK消化後、ライセートは核酸の結合を促進する特殊なバッファーの存在下でゲルマニウムコートされた磁性粒子と混和された。精製は、混合、磁化、遠心分離、夾雑物の除去を連続的に行うことにより行われた。RNAは25μlの溶出バッファーで溶出し、RNA溶出液は使用するまで－80℃で保存した。 すべての抽出物について、安定したリファレンス／ハウスキーパー遺伝子として知られる構成的発現遺伝子カルモジュリン2遺伝子（CALM2）のqRT－PCRによる定量を行い、十分な高品質RNA量を有するかどうかを検証した。qRT－PCR法による遺伝子発現の詳細な解析のために、目的の部位に隣接するプライマーおよび中間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、プライマー/プローブ配列をエキソン/エキソン境界を横切って位置させることによってRNA具体的な測定可能にした。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合、プライマーを選択して、全ての関連するまたは選択されたスプライスバリアントを適切に増幅した。全てのプライマー対を、従来のPCR反応によって特異性についてチェックした。HLA－H, HLA－J, HLA－L, HLA－V、HLA－V、 HLA－Y, HLA－E, HLA－F, およびHLA－Gに対する特異的プライマーが作製された。
HLA－H, HLA－J, HLA－L, HLA－V, HLA－V、HLA－Y, HLA－E, HLA－F, およびHLA－Gは胚盤胞細胞培養で発現が確認された。

【配列表】

2022553069000001.app

【国際調査報告】