特表 2022-553208 神経学的障害の治療のための機能的ニューロンの再生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-22

(54)【発明の名称】神経学的障害の治療のための機能的ニューロンの再生

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20221215BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221215BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221215BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221215BHJP

   A61K 38/16 20060101ALN20221215BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20221215BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20221215BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76 ZNA

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61P25/28

A61K48/00

A61K38/16

C12N15/12

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022522922

(86)(22)【出願日】2020-10-16

(85)【翻訳文提出日】2022-06-14

(86)【国際出願番号】 US2020056059

(87)【国際公開番号】W WO2021076947

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/916,702

(32)【優先日】2019-10-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】398071440

【氏名又は名称】ザ・ペン・ステイト・リサーチ・ファウンデイション

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100218268

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ゴン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DC50

4C084MA17

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA161

4C084ZB211

4C084ZC411

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA08

4C087MA17

4C087MA56

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA16

4C087ZB21

4C087ZC41

(57)【要約】

本明細書は、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有する哺乳動物の治療に関与する方法および材料を提供する。例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む組成物を、脳における神経学的障害を有する哺乳動物に投与するための方法および材料が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脳における神経学的障害を有する哺乳動物を治療するための方法であって、前記方法が、神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、前記哺乳動物の前記脳に投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記神経学的障害が、アルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む発現ベクターを、前記脳に送達することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを、前記脳に送達することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを、前記脳に送達することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、前記ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記投与する工程が、定位頭蓋内注射を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記投与する工程が、２回以上の定位頭蓋内注射を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記投与する工程が、頭蓋外注射を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記投与する工程が、２回以上の頭蓋外注射を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記投与する工程が、後眼窩注射を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

アルツハイマー病を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記方法が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を含有する薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を、前記哺乳動物の脳に投与することを含む、方法。

【請求項15】

前記薬学的組成物が、１０^１０～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬの担体の濃度でアデノ随伴ウイルス粒子を含有する約１μＬ～約５００μＬの薬学的に許容される担体を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記薬学的組成物が、約０．１μＬ／分～約５μＬ／分の制御された流速で前記哺乳動物の前記脳に注射される、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

アルツハイマー病を有し、かつ（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化を低減させること、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集を低減させること、（３）神経炎症を低減させること、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）を低減させること、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンを生成すること、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存を増加させること、（７）新たな非反応性星状細胞を生成すること、（８）反応性星状細胞の数を低減させること、または（９）記憶を改善することを必要とする哺乳動物内で、前記（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）または（９）を行うための方法であって、前記方法が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、前記哺乳動物に投与することを含み、前記（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化が低減されるか、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集が低減されるか、（３）神経炎症が低減されるか、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）が低減されるか、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンが生成されるか、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存が増加されるか、（７）新たな非反応性星状細胞が生成されるか、（８）反応性星状細胞の数が低減されるか、または（９）前記記憶が改善される、方法。

【請求項18】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを送達することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを送達することを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを送達することを含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターが、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ発現ベクターである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、前記ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記投与する工程が、定位頭蓋内注射を含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記投与する工程が、２回以上の定位頭蓋内注射を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記投与する工程が、頭蓋外注射を含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記投与する工程が、２回以上の頭蓋外注射を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記投与する工程が、後眼窩注射を含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１７日に出願された米国特許出願第６２／９１６，７０２号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部と見なされる（かつ、参照によりそれに組み込まれる）。

【0002】

政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＡＧ０４５６５６の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

本明細書は、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有する哺乳動物の治療に関与する方法および材料に関する。例えば、本明細書は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を含有する組成物を、脳における神経学的障害を有する哺乳動物に投与するための方法および材料を提供する。

【背景技術】

【0004】

アルツハイマー病（ＡＤ）を含む神経学的障害は、認知機能障害および記憶障害によって特徴付けられる（Ｑｕｅｒｆｕｒｔｈ ａｎｄ Ｌａｆｅｒｌａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６２：３２９－３４４（２０１０））。死後組織の研究は、ＡＤ患者の脳が、健康な脳と比較して軽く、かつ物理的に小さいことを発見し、ＡＤ進行における重度のニューロンおよび組織の損失を示した（Ｇｏｍｅｚ－Ｉｓｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６：４４９１－４５００（１９９６））。星状細胞は、神経栄養因子および代謝サイトカインを輸送し、ニューロンと他の型の細胞との間の相互作用を維持し、ニューロン回路を支持する役割を果たす（Ｂｕｒｄａ ａｎｄ Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｎｅｕｒｏｎ，８１：２２９－２４８（２０１４））。これらの機能の途絶は、神経炎症を促進し、より重度のＡＤの病理学的進行をもたらす（Ｑｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８１４：２３５－２４９（２０１２））。細胞レベルおよび分子レベルでのこの漸進的で進行性の障害の下流影響は、学習および記憶系の障害ならびに行動異常である（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，Ｃｅｌｌ，１４８：１２０４－１２２２（２０１２）、およびＫｕｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５０：４３０－４３３（２０１５））。星状細胞は、脳および脊髄において分布する星の形状のグリア細胞である。正常な脳では、星状細胞は、正常な形態および最小限のＧＦＡＰ免疫反応性で静止状態を維持している。ミクログリアは、脳において偏在的に分布する脳常在マクロファージである。これらは、他の組織常在マクロファージ集団とは発達的に異なる（Ｇｉｎｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０：８４１－８４５（２０１０）、およびＳｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４３：３８２－３９３（２０１５））。ＡＤ病理学におけるミクログリアの役割の重要性を強調する新たな証拠がある。実際、新規の見識は、細胞外刺激を検出すると、ミクログリアは、Ｃ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＡＳＣ）斑点を含有するアポトーシス関連斑点様タンパク質を形成して、分泌する可能性があり、かかるＡＳＣ斑点は、ＡＤの脳におけるアミロイド沈着の播種および進行を促進することを示唆した（Ｖｅｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５２：３５５－３６１（２０１７））。現在、ＡＤを患っている人々のための有効な治療アプローチは存在しない。

【発明の概要】

【0005】

本明細書は、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有する哺乳動物の治療に関与する方法および材料に関する。例えば、本明細書は、ＮｅｕｒｏＤ１１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を含有する組成物を、脳における神経学的障害を有する哺乳動物に投与するための方法および材料を提供する。

【0006】

概して、本文書の一態様は、脳における神経学的障害を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。本方法は、神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、哺乳動物の脳に投与することを含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）。哺乳動物はヒトであり得る。神経学的障害は、アルツハイマー病であり得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む発現ベクターを脳に送達することを含み得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを脳に送達することを含み得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを脳に送達することを含み得る。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢであり得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み得、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。投与する工程は、定位頭蓋内注射を含み得る。投与する工程は、２回以上の定位頭蓋内注射を含み得る。投与する工程は、頭蓋外注射を含み得る。投与する工程は、２回以上の頭蓋外注射を含み得る。投与する工程は、後眼窩注射を含み得る。

【0007】

別の態様では、本明細書は、アルツハイマー病を有する哺乳動物を治療する方法を特徴とする。本方法は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を含有する薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を、哺乳動物の脳に投与することを含む（またはそれから本質的になるか、もしくはそれからなる）。薬学的組成物は、１０^１０～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬの担体の濃度でアデノ随伴ウイルス粒子を含有する約１μＬ～約５００μＬの薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的組成物は、約０．１μＬ／分～約５μＬ／分の制御された流速で哺乳動物の脳に注射され得る。

【0008】

別の態様では、本書は、アルツハイマー病を有し、かつ（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化を低減させること、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集を低減させること、（３）神経炎症を低減させること、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）を低減させること、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンを生成すること、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存を増加させること、（７）新たな非反応性星状細胞を生成すること、（８）反応性星状細胞の数を低減させること、または（９）記憶を改善することを必要とする哺乳動物内で、（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）または（９）を行うための方法を特徴とする。本方法は、哺乳動物に、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、哺乳動物に投与することを含み（またはそれから本質的になり）、（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化が低減されるか、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集が低減されるか、（３）神経炎症が低減されるか、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）が低減されるか、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンが生成されるか、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存が増加されるか、（７）新たな非反応性星状細胞が生成されるか、（８）反応性星状細胞の数が低減されるか、または（９）記憶が改善される。哺乳動物はヒトであり得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを送達することを含み得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを送達することを含み得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを送達することを含み得る。組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターは、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ発現ベクターであり得る。投与する工程は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み得、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。投与する工程は、定位頭蓋内注射を含み得る。投与する工程は、２回以上の定位頭蓋内注射を含み得る。投与する工程は、頭蓋外注射を含み得る。投与する工程は、２回以上の頭蓋外注射を含み得る。投与する工程は、後眼窩注射を含み得る。

【0009】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を使用して本発明を実施または試験することはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。

【0010】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現は、５×ＦＡＤの皮質における機能的ニューロンへの反応性星状細胞のインビボリプログラミングを可能にする。（図１Ａ）反応性星状細胞における１０ｃｒｅ－ｌｏｘＰ調節系の下で標的遺伝子を発現するＡＡＶ９ベクターの構築の概略図。（図１Ｂ）マウスの皮質の内側への定位注射は、インビボでの標的遺伝子の正確な送達を可能にした。（図１Ｃ）ＮｅｕｒｏＤ１過剰発現は、注射後３０日（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＤＰＩ）までに、高効率で皮質における星状細胞からニューロンへの変換を達成した。右側パネルは、左側パネルの点線で囲まれた領域の拡大画像を示した。反応性星状細胞においてＧＦＰ過剰発現のみを有する対照群においては、依然として典型的なグリア細胞形態が残っていること、ＮｅｕｒｏＤ１過剰発現細胞は、すでにニューロン様形態を有することに留意されたい。スケールバー＝３０μｍ（図１Ｄ）。注射の３０日後に、ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－ＣｒｅおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ感染細胞（カラーで見た場合、緑色に染色）は、反応性星状細胞マーカーのＧＦＡＰ（カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）に対して免疫陽性であった。ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－ＣｒｅおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ感染細胞（カラーで見た場合、緑色に染色）は、ＮｅｕｒｏＤ１（カラーで見た場合、赤色に染色）に対して免疫陽性であったが、反応性星状細胞マーカーのＧＦＡＰに対しては免疫陰性であった。スケールバー＝３０μｍ。（図１Ｅ）注射の３０日後に、ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－ＣｒｅおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰ感染細胞（カラーで見た場合、緑色に染色）は、成熟ニューロンマーカーのＮｅｕＮ（カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）に対して免疫陰性であった。ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－ＣｒｅおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ感染細胞（カラーで見た場合、緑色に染色）は、成熟ニューロンマーカーのＮｅｕＮに対して免疫陽性であり、これらの細胞は、高い発現レベルのＮｅｕｒｏＤ１（カラーで見た場合、赤色に染色）を有した。スケールバー＝３０μｍ。（図１Ｆ）５×ＦＡＤマウスの脳（２６ＤＰＩ）の皮質領域における変換されたニューロンの全細胞記録を示す典型的な位相差画像。スケールバー＝１０μｍ。（図１Ｇ）ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロン（２６ＤＰＩ）における反復活動電位を示す皮質スライス記録からの代表的な追跡。（図１Ｈ）皮質スライス記録におけるＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロン（２６ＤＰＩ）における自発的なシナプス事象を示す代表的な追跡。この図パネルの下部に、ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣの代表的な追跡を拡大した。

【図2】ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの皮質における過活性反応性星状細胞を改善する。（図２Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに免疫染色および分析のために解剖した。反応性星状細胞が、５×ＦＡＤマウスの皮質においてＮｅｕｒｏＤ１媒介の変換後に低減したことを示す代表的な画像。ＧＦＰ対照において、（白色に見えた）豊富な反応性星状細胞は、注射コアおよび周囲領域の両方に存在したことに留意されたい。しかしながら、（白色に見えた）反応性星状細胞は、ＮｅｕｒｏＤ１群の注射コアにおいては低減し、インサイチュで再生された（黄色に見えた）多数のニューロン形態を伴った。（図２Ｂ）ＧＦＰ対照群およびＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換群における反応性星状細胞（ＧＦＡＰ、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）間の差異（形態および数）を示す拡大された代表的な画像。スケールバーは３０μｍを表す。（図２Ｃ）５×ＦＡＤの皮質における反応性星状細胞マーカーのＧＦＡＰ（カラーで見た場合、赤色に染色）およびアミロイドプラーク（カラーで見た場合、青色、チオフラビン－Ｓ色素に染色）の共標識。スケールバーは３０μｍを表す。Ｎ＝８のＧＦＰ処置された５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝８のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図２Ｄ）反応性星状細胞数に対する定量分析。（図２Ｅ）反応性星状細胞のカバー領域のパーセンテージに対する定量分析。（図２Ｆ）反応性星状細胞マーカーのＧＦＡＰ強度に対する定量分析。

【図3】ＮｅｕｒｏＤ１誘導の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの皮質におけるニューロン損失を回復することができる。（図３Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに免疫染色および分析のために解剖した。ニューロン密度（ＮｅｕＮ、カラーで見た場合、赤色に染色）は、注射から６０日後にＮｅｕｒｏＤ１変換群で増加したことを示す代表的な画像。（図３Ｂ）ＮｅｕｒｏＤ１群における成熟ニューロン（ＮｅｕＮ、カラーで見た場合、赤色に染色）の数の増加を示す拡大画像。ＧＦＰ＋（カラーで見た場合、緑色に染色）およびＮｅｕＮ＋（カラーで見た場合、赤色に染色）細胞は、ＮｅｕｒｏＤ１によって新たに変換されたニューロン（黄色として統合）であった。スケールバーは３０μｍを表す。Ｎ＝６のＧＦＰ処置された５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝６のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図３Ｃ）定量的な結果は、ＮｅｕｒｏＤ１群における成熟ニューロン（ＮｅｕＮ＋細胞）の有意な増加を示した。（図３Ｄ）ニューロンおよび星状細胞の比の定量化。

【図4】ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、５×ＦＡＤマウスの皮質において、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換を介して再生され得る。（図４Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに分析のために解剖した。ＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウスの皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）およびすべての変換されたニューロン（ＧＦＰ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）の分布を示す代表的な画像。ＧＦＰ＋、ＮｅｕＮ＋、およびＧＡＢＡ＋トリプル免疫陽性細胞は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに変換される。（図４Ｂ）５×ＦＡＤの皮質における現存のＧＡＢＡ＋ニューロン（矢印、ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）および変換されたＧＡＢＡ＋ニューロン（矢印の頭、ＧＦＰ＋、ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）を示す拡大画像。スケールバーは３０μｍを表す。Ｎ＝８のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス（６０ＤＰＩ）。（図４Ｃ）５×ＦＡＤの皮質における現存のＧＡＤ６７＋ニューロン（矢印、ＧＡＤ６７＋およびＮｅｕＮ＋細胞）および変換されたＧＡＤ６７＋ニューロン（矢印の頭、ＧＦＰ＋、ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）を示す拡大画像。スケールバーは３０μｍを表す。Ｎ＝８のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス（６０ＤＰＩ）。

【図5】ＮｅｕｒｏＤ１群は、５×ＦＡＤマウスの皮質における異常なＧＦＰ凝集体が少ない。５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに分析のために解剖した。ＧＦＰ凝集体は、主にＧＦＰ対照群（上段）における処置された脳領域で観察され、この現象は、ＮｅｕｒｏＤ１処置された群（下段）において大幅に低減される。スケールバーは３０μｍを表す。

【図6】ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤ皮質ニューロンにおける細胞内Ａβレベルを緩和した。（図６Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに免疫染色および分析のために解剖した。５×ＦＡＤマウスの脳皮質領域におけるＡβレベル（Ａβ４２、カラーで見た場合、サファイア色に染色）を示す代表的な共焦点顕微鏡写真。脳試料の感染コア由来のすべてのニューロンの細胞内Ａβ４２レベル（ＮｅｕＮ＋領域におけるＡβ４２強度）を注意深く測定し、定量化した。矢印：既存のニューロン。矢印の頭：変換されたニューロン。スケールバーは３０μｍを表す。（図６Ｂ）ＧＦＰ対照群およびＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおけるニューロンの数の定量的な結果。Ｎ＝３のＧＦＰ処置された５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝３のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図６Ｃ）ＧＦＰ対照群の感染コアにおける既存のニューロンの数、ＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおける既存のニューロンの数、およびＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおける変換されたニューロンの数のそれぞれの定量的な結果。ＧＦＰ対照群における既存のニューロン数とＮｅｕｒｏＤ１群との間で差異は観察されなかったことに留意されたい。Ｎ＝３のＧＦＰ処置された５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝３のＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス。データは、複数の群と比較する場合、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡとして提示される。（図６Ｄ）ＧＦＰ群およびＮｅｕｒｏＤ１群における感染コアの内側のすべてのニューロンにおける細胞内Ａβ４２の強度の定量的な結果。ＧＦＰ対照で処置された３匹の５×ＦＡＤマウスの感染コア由来のニューロンの数＝６６２、ＮｅｕｒｏＤ１で処置された３匹の５×ＦＡＤマウスの感染コア由来のニューロンの数＝１３５７。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図６Ｅ）ＧＦＰ群およびＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおけるすべてのニューロンにおける細胞内Ａβ４２の強度を示す定量的なデータ。黒色のバー：ＧＦＰ対照群の３匹の５×ＦＡＤマウスの感染コア由来の既存のニューロンの数＝６６２、白色のバー：ＮｅｕｒｏＤ１群の３匹の５×ＦＡＤマウスの感染コア由来の既存のニューロンの数＝７１４、灰色の：ＮｅｕｒｏＤ１群の３匹の５×ＦＡＤマウスの感染コア由来の変換されたニューロンの数＝６４３。データは、複数の群と比較する場合、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙの事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡとして提示される。

【図7】ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、炎症促進性ミクログリアの緩和を可能にする。（図７Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに免疫染色および分析のために解剖した。一般的なミクログリア（Ｉｂａ１、カラーで見た場合、灰色に染色）および炎症促進性ミクログリア亜型（ｉＮＯＳ、カラーで見た場合、赤色に染色）の変化を示す代表的な共焦点画像。スケールバーは３０μｍを表す。（図７Ｂ）ＧＦＰ対照群とＮｅｕｒｏＤ１群との間のＩｂａ１強度に有意差がないことを示す定量化データ。Ｎ＝８のＧＦＰ群の５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝８のＮｅｕｒｏＤ１群の５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、スチューデントのｔ検定として提示される。（図７Ｃ）ＧＦＰとＮｅｕｒｏＤ１群との間のＩｂａ１＋ミクログリアのカバー区域のパーセンテージに有意差がないことを示す定量的な結果。Ｎ＝８のＧＦＰ群の５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝８のＮｅｕｒｏＤ１群の５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、スチューデントのｔ検定として提示される。（図７Ｄ）炎症促進性ミクログリア亜型（ｉＮＯＳ＋ミクログリア）の強度は、ＮｅｕｒｏＤ１群において大きく緩和される。Ｎ＝８のＧＦＰ群の５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝８のＮｅｕｒｏＤ１群の５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。

【図8】５×ＦＡＤの皮質におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換後に炎症促進性サイトカインＩＬ－１βが低減した。（図８Ａ）５×ＦＡＤマウスを、４ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに６０ＤＰＩに免疫染色および分析のために解剖した。ＮｅｕｒｏＤ１処置後の反応性星状細胞（カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）およびインターロイキン－１β（カラーで見た場合、赤色に染色）の低減を示す代表的な共焦点画像。スケールバーは３０μｍを表す。（図８Ｂ）ＮｅｕｒｏＤ１誘導細胞変換後のＩＬ－１βの強度の有意な減少を示す定量化分析。Ｎ＝８のＧＦＰ群の５×ＦＡＤマウス、およびＮ＝８のＮｅｕｒｏＤ１群の５×ＦＡＤマウス。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。

【図9】ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンは、５×ＦＡＤの脳において良好な形態で８ヶ月超生存することができる。（図９Ａ）５×ＦＡＤマウスを、６ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに注射の８ヶ月後に免疫染色および分析のために解剖した。ＧＦＰ対照群およびＮｅｕｒｏＤ１群における感染した細胞を示す代表的な画像。ＮｅｕｒｏＤ１群においては、変換されたニューロン（ＧＦＰ＋、カラーで見た場合、緑色に染色）は、５×ＦＡＤマウスの皮質領域全体に均等に分布したことに留意されたい。（図９Ｂ～図９Ｄ）皮質領域における感染コアにおける星状細胞、変換されたニューロン、およびＮｅｕｒｏＤ１発現レベルを示す典型的な顕微鏡写真。ＧＦＰ対照群においては、星状細胞（ＧＦＡＰ＋、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）は依然として過活性であり、豊富な異常なＧＦＰ凝集体（カラーで見た場合、緑色に染色）が観察された。ＮｅｕｒｏＤ１群においては、感染した星状細胞は、高い発現レベルのＮｅｕｒｏＤ１を有する成熟ニューロン（ＮｅｕＮ＋、カラーで見た場合、赤色に染色）、および強い神経突起を有する健康な形態（カラーで見た場合、緑色に染色）へ、成功裏に変換された。スケールバーは３０μｍを表す。

【図10】軸索、樹状突起、およびシナプスは、長期的な後の５×ＦＡＤの皮質におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換後に増加する。（図１０Ａ）５×ＦＡＤマウスを、６ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに注射の８ヶ月後に免疫染色および分析のために解剖した。代表的な画像は、感染した皮質におけるＮｅｕｒｏＤ１誘導変換後の軸索（ＮＦ２００、カラーで見た場合、サファイア色に染色）およびシナプス（シナプトフィシン、カラーで見た場合、赤色に染色）の増加を明らかにした。スケールバーは３０μｍを表す。Ｎ＝３。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図１０Ｂ）軸索マーカーのＮＦ２００の強度の定量分析。（図１０Ｃ）シナプスマーカーのシナプトフィシンの強度の定量分析。（図１０Ｄ）代表的な画像は、注射の８ヶ月後（ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｍｐｉ）でのＮｅｕｒｏＤ１処置後の樹状突起（ＭＡＰ２、カラーで見た場合、サファイア色に染色）および興奮性シナプス（ｖＧｌｕｔ１、カラーで見た場合、赤色に染色）の増加を明らかにした。スケールバーは３０μｍを表す。（図１０Ｅ）樹状突起マーカーのＭＡＰ２の強度の定量分析。（図１０Ｆ）興奮性シナプスマーカーのｖＧｌｕｔ１の強度の定量分析。

【図11】ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤの脳皮質における血管の完全性を保護する。（図１１Ａ）５×ＦＡＤの脳における血管上の血管セグメント（Ｌｙ６Ｃ、カラーで見た場合、赤色に染色）および星状細胞エンドフィート（ＡＱＰ４、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）を示す典型的な画像。５×ＦＡＤマウスを、６ヶ月齢でＡＡＶ９ウイルス送達系を介してＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１のいずれかによって処置し、さらに注射の８ヶ月後に免疫染色および分析のために解剖した。（図１１Ｂ）ＮｅｕｒｏＤ１またはＧＦＰの介入の８ヶ月後の５×ＦＡＤマウスの皮質における血管セグメント（Ｌｙ６Ｃ、カラーで見た場合、赤色に染色）および星状細胞エンドフィート（ＡＱＰ４、カラーで見た場合、サファイア色に染色）の代表的な画像。スケールバーは３０μｍを表す。（図１１Ｃ）ＡＱＰ４＋セグメントの長さの定量分析。Ｎ＝３の完全なままのＷＴマウス、Ｎ＝３のＧＦＰ対照群の５×ＦＡＤマウス、Ｎ＝３のＮｅｕｒｏＤ１群の５×ＦＡＤマウス、年齢および性別を一致させた。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定として提示される。（図１１Ｄ）Ｌｙ６Ｃ＋血管セグメントの長さの定量分析。

【図12】全体的な感染のための複数回の頭蓋内マイクロインジェクション。（図１２Ａおよび図１２Ｂ）ＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１発現を活性化するために使用されるＡＡＶ Ｃｒｅ－ＦＬＥＸ系のマップ。（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）マウスの脳における複数の頭蓋内注射部位を示す概略図。４つの注射窓をマウス頭蓋骨上の４つの点によって標識し（図１２Ｃ）、注射部位を矢印および十字によって示した（図１２Ｄ）。（図１２Ｅおよび図１２Ｆ）ＧＦＰウイルス注射の１５ＤＰＩのＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳の矢状図および冠状図。（図１２Ｇおよび図１２Ｈ）ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰウイルス注射の１５ＤＰＩのＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳の矢状図および冠状図。星状細胞は、Ｓ１００βによって標識され（カラーで見た場合、赤色に染色）、ニューロンは、ＮｅｕＮによって標識（カラーで見た場合、シアン色に染色）された。（図１２Ｆ）および（図１２Ｈ）の破線１および２は、下部パネルに示される相対的な冠状切片位置を示す。

【図13】ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の全体的な変換。（図１３Ａ）ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳におけるＧＦＰ対照ウイルス注射（１５ＤＰＩ）の概要、種々の区域の高倍率画像を、番号１～９のパネルに示した。ほぼすべてのＧＦＰ陽性細胞は、星状細胞マーカーのＳ１００β（カラーで見た場合、赤色に染色）で共標識されたことに留意されたい。（図１３Ｂ）ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳におけるＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰウイルス注射（１５ＤＰＩ）の概要、種々の区域の高倍率画像を、番号１～９のパネルに示した。皮質区域（１、３）、海馬（４～６）、鉤状回（７）、および中脳（９）におけるＧＦＰ陽性細胞の大部分は、ニューロンマーカーのＮｅｕＮ（カラーで見た場合、シアン色に染色）で共標識されたことに留意されたい。番号１～９のパネルの相対領域は、低倍率矢状画像に示されている。

【図14】対照マウスとＮｅｕｒｏＤ１処置されたマウスとの間の形態学的差異の直接比較。（図１４Ａ）種々の区域における対照マウスおよびＮｅｕｒｏＤ１処置されたマウスのＧＦＰ陽性細胞。１５ＤＰＩでは、対照群におけるＧＦＰ陽性細胞のほぼすべてが、依然として典型的な星状細胞の形態を示している。しかしながら、ＮｅｕｒｏＤ１処置されたマウスではＧＦＰ陽性細胞の大部分が典型的なニューロン形態を示した。（図１４Ｂ）強力なＮｅｕｒｏＤ１発現（カラーで見た場合、赤色に染色、矢印）は、ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ処置されたマウスの脳におけるＧＦＰ陽性細胞における免疫染色によって明らかにされ、ＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞もまたＮｅｕＮ（カラーで見た場合、シアン色に染色、矢印）で共局在化された。対照群において、ＧＦＰ陽性細胞はいずれもＮｅｕｒｏＤ１を含有しなかったか、またはＮｅｕＮと共局在化しなかった（上部）。

【図15】５×ＦＡＤマウスの脳における全体的な星状細胞からニューロンへの変換。（図１５Ａ）研究の作業フロー。（図１５Ｂ）広範な感染区域が、５×ＦＡＤマウスの脳において観察された。Ａβプラークは、チオフラビン－Ｓ染色（カラーで見た場合、青色に染色）によって明らかにされた。（図１５Ｃ）ＧＦＰ陽性細胞のほとんどすべては、種々の脳区域において、ニューロンマーカーのＮｅｕＮ（カラーで見た場合、赤色に染色）で共標識された。

【図16】５×ＦＡＤ大脳皮質においてＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンの特徴付け。（図１６Ａ）ＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウスの脳の矢状図。（図１６Ｂ）いくつかのＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンは、前頭皮質（ＦＣＸ）および頭頂皮質（ＰＣＸ）においてＴｂｒ１シグナル（カラーで見た場合、赤色に染色）を有することを示す高倍率画像。

【図17】ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ－ｐＧＦＡＰ：：ＧＦＰの後眼窩注射。（図１７Ａ）脳全体への効率的な感染を示す注射後１７日目の矢状画像。（図１７Ｂ）星状細胞におけるＧＦＰの特定の発現を示す、脳の種々の領域の高倍率画像。スケールバー：１００μｍ。

【図18】ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ－ｐＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ＋ＦＬＥＸ－ＧＦＰの後眼窩注射。（図１８Ａ）脳全体への効率的な感染を示す注射後１４日目の矢状画像。（図１８Ｂ）星状細胞およびニューロンの両方におけるＧＦＰの発現を示す、脳の種々の領域の高倍率画像。スケールバー：１００μｍ。

【図19】ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ－ｐＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ＋ＦＬＥＸ－ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰの後眼窩注射。（図１９Ａ）脳全体への効率的な感染を示す注射後１４日目の矢状画像。（図１９Ｂ）ニューロンマーカーのＮｅｕＮとの共局在化を示す脳の種々の領域でのＧＦＰおよびＮｅｕｒｏＤ１シグナルの高倍率画像。スケールバー：１００μｍ。

【図20】星状細胞の全体的な標的化のためのウイルス（例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰ）の後眼窩（ｒ．ｏ．）注射、およびバイジェニックマウス（５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウス）を作製するためのＣｒｅ７７．６マウスと５×ＦＡＤマウスとの間の交差の図。

【図21】バイジェニック（５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－）マウスにおける星状細胞の全体的な標的化の実証。（図２１Ａ）星状細胞の標的化に使用される方法の図。（図２１Ｂ）１１ＤＰＩでの２．０×１０^１０～３．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰの後眼窩（ｒ．ｏ．）注射後のマウスの脳の画像。

【図22】顕微鏡画像は、２．０×１０^１０～３．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスの後眼窩（ｒ．ｏ．）注射後、１１ＤＰＩでのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰによる脊髄細胞のウイルス感染を実証している。

【図23】顕微鏡画像は、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰ（２．０ｘ１０^１０～３．０ｘ１０^１０ゲノムコピー／マウス）の後眼窩注射後、１１ＤＰＩに他の臓器において明らかにＧＦＰシグナルが検出されないことを実証している。

【図24】顕微鏡画像は、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰ（２．０×１０^１０～３．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）の後眼窩（ｒ．ｏ．）注射後、１１ＤＰＩでのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰによる脳の種々の領域における星状細胞の全体的な標的化を実証している。ＯＢ＝嗅球、ＰｉＦ＝梨状皮質、ＭＯ＝運動皮質、Ｓｔｒ＝線条体、ＳＳ＝体性感覚皮質、ＶＩＳ＝視覚皮質、Ｓｕｂ＝鉤状回、Ｈｉｐ＝海馬、ＴＨ＝視床、ＭＢ＝中脳、ＣＢ＝小脳、およびＢＳ＝脳幹。

【図25】図２５Ａ。顕微鏡画像は、後眼窩注射（約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）を介したＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰの３０ＤＰＩでの大脳内における星状細胞のニューロンへの転換を実証している。図２５Ｂ。顕微鏡画像は、後眼窩注射（約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）を介したＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰの３０ＤＰＩに脊髄内に変換されたニューロンがないことを実証している。

【図26】顕微鏡画像は、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）の後眼窩（ｒ．ｏ．）注射後、３０ＤＰＩでのＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰによる脳の種々の領域における星状細胞からニューロンへの全体的な変換を実証している。ＯＢ＝嗅球、ＰｉＦ＝梨状皮質、ＭＯ＝運動皮質、Ｓｔｒ＝線条体、ＳＳ＝体性感覚皮質、ＶＩＳ＝視覚皮質、Ｓｕｂ＝鉤状回、Ｈｉｐ＝海馬、ＴＨ＝視床、ＭＢ＝中脳、ＣＢ＝小脳、およびＢＳ＝脳幹。

【図27】顕微鏡画像は、後眼窩（ｒ．ｏ．）注射後、３０ＤＰＩに、ＧＦＰ対照（上部）と指定された対照ウイルス（ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰ、約２．０ｘ１０^１０ゲノムコピー／マウス）を受けたか、またはＮｅｕｒｏＤ１（下部）と指定されたＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルス（ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、約２．０ｘ１０^１０ゲノムコピー／マウス）を受けたマウス（５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウス）についての種々の脳領域の直接比較を示す。対照ウイルスは明らかに星状細胞に感染するが、ＮｅｕｒｏＤ１発現を駆動するウイルスは星状細胞に感染し、それらを独特のニューロンに変換する。ＯＢ＝嗅球、ＰｉＦ＝梨状皮質、ＭＯ＝運動皮質、Ｓｔｒ＝線条体、ＳＳ＝体性感覚皮質、ＶＩＳ＝視覚皮質、Ｓｕｂ＝鉤状回、Ｈｉｐ＝海馬、ＴＨ＝視床、ＭＢ＝中脳、ＣＢ＝小脳、およびＢＳ＝脳幹。

【図28】ＡＤにおける記憶を改善するためにＮｅｕｒｏＤ１を発現するように設計されたウイルスの能力を確認するための実験設計の概略図である。

【図29】ＡＤのマウスモデルにおいて記憶を評価するためのＹ迷路の写真を提供する。図２９Ａは、対照群のためのＹ迷路である。図２９Ｂは、ＮｅｕｒｏＤ１群のためのＹ迷路である。

【図30】約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスの後眼窩注射を介して、対照ウイルス（ＧＦＰと指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰウイルス）またはＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルス（ＮｅｕｒｏＤ１と指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を受けた雄および雌の５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウスについてのマウスのアーム進入（上部）および変化率（下部）の棒グラフ。

【図31】線グラフは、臭気１、２、３、および４の正規化された臭気調査時間を提供する。約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスの後眼窩注射を介して、対照ウイルス（ＧＦＰと指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰウイルス）またはＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルス（ＮｅｕｒｏＤ１と指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を受けた５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウスを使用した、他で（Ｗｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３０（２）：５０５－５１４（２０１０））説明されるように実施された臭気習慣化アッセイから生成された結果。

【図32】棒グラフは、約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスの後眼窩注射を介して、対照ウイルス（ＧＦＰと指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰウイルス）またはＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルス（ＮｅｕｒｏＤ１と指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を受けた５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウスを使用した、他で（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ，９：７２（２０１６））説明されるように実施された恐怖条件付け記憶試験からの凍結パーセンテージを実証している。

【図33】空間学習および記憶を評価するためのモリス水迷路の図。

【図34】約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウスの後眼窩注射を介して、対照ウイルス（ＧＦＰと指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰウイルス）またはＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルス（ＮｅｕｒｏＤ１と指定されたＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を受けた５×ＦＡＤ^＋／－／ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ７７．６^＋／－マウスを使用して実施されたモリス水迷路評価の結果。移動経路の図（図３４Ａ）。ＮｅｕｒｏＤ１マウスと比較した、対照マウス（ＧＦＰ）の目標象限における時間の棒グラフ（図３４Ｂ）。ＮｅｕｒｏＤ１マウスと比較した、対照マウス（ＧＦＰ）の１、２、３、４、および５日間にわたる潜時の線グラフ（図３４Ｃ）。対照マウス（ＧＦＰ）とＮｅｕｒｏＤ１マウスとの間で実施された交差の数の棒グラフ（図３４Ｄ）。

【図35】ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンは、ＡＤマウスにおける記憶改善に寄与する。（図３５Ａ）変換されたニューロンが恐怖記憶の回復に直接的に関与しているかどうかを試験するための化学遺伝学的戦略の概略図である。（図３５Ｂ）ＤＲＥＡＤＤ受容体（ｈＭ４Ｄｉ）が変換されたニューロン（ＮｅｕｒｏＤ１列の矢印）において特異的に発現されることを示す免疫染色結果。スケールバー：２０μｍ。（図３５Ｃ）恐怖条件付け記憶試験のパラダイム。ＡＡＶ注射の２ヶ月後に記憶試験を実施する。下部図は、変換されたニューロンがクロザピンＮ－オキシド（ＣＮＯ）の注射によって急速に阻害されることを示す。（図３５Ｄ）ＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤマウス（ＮｅｕｒｏＤ１、生理食塩水群）における恐怖条件付け記憶増強が、ＣＮＯ投与（ＮｅｕｒｏＤ１、ＣＮＯ群）によって廃止されることを示す要約グラフ。データを平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｔｕｒｋｅｙ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本明細書は、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有する哺乳動物の治療に関与する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を含有する組成物を、脳における神経学的障害を有する哺乳動物に投与するための方法および材料を提供する。

【0013】

任意の適切な哺乳動物も、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有すると同定され得る。例えば、ヒトおよびサルなどの他の霊長類は、アルツハイマー病を有していると同定することができる。

【0014】

いくつかの場合では、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）によって影響を受けた対象へ投与することは、反応性星状細胞をグルタミン酸作動性ニューロンに変換することによる新たなグルタミン酸作動性ニューロンの生成、反応性星状細胞の数の低減、ＧＡＢＡ作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンを含む損傷したニューロンの生存、新たな非反応性星状細胞の生成、変換されていない反応性星状細胞の反応性の低減、ならびに損傷した領域内への血管の再結合を媒介する。いくつかの実施形態では、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）によって影響を受けた対象へ投与することは、以下を媒介する。（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化の低減、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集の低減、（３）神経炎症の低減、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）レベルの低減、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンの生成、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存の増加、（７）新たな非反応性星状細胞の生成、（８）反応性星状細胞の数の低減、および（９）記憶の改善。

【0015】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化を約１％～１００％低減させる。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で組成物が提供した後に、高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％低減させる。

【0016】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、細胞外アミロイドプラークの凝集を約１％～１００％低減させる。いくつかの場合では、本発明で提供する方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、細胞外アミロイドプラークの凝集を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％低減させる。

【0017】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、神経炎症を約１％～１００％低減させる。いくつかの場合では、本発明で提供する方法または組成物は、ここで提供される組成物の投与後に、神経炎症を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％低減させる。

【0018】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、脳におけるインターロイキン１β（ＩＬ－１β）を約１％～１００％低減させる。いくつかの場合では、本発明で提供する方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、脳におけるインターロイキン１β（ＩＬ－１β）を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％低減させる。

【0019】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、新たなグルタミン酸作動性ニューロンを生成し、本明細書で提供される組成物の投与後に、グルタミン酸作動性ニューロンの数をベースラインレベルから約１％～５００％増加させる。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、新たなグルタミン酸作動性ニューロンを生成し、本明細書で提供される組成物の投与後に、グルタミン酸作動性ニューロンの数をベースラインレベルから約１％～５０％、約１％～１００％、約１％～１５０％、約５０％～１００％、約５０％～１５０％、約５０％～２００％、約１００％～１５０％、約１００％～２００％、１００％～２５０％、約１５０％～２００％、約１５０％～２５０％、約１５０％～３００％、２００％～２５０％、２００％～３００％、２００％～３５０％、２５０％～３００％、２５０％～３５０％、約２５０％～４００％、約３００％～３５０％、約３００％～４００％、約３００％～４５０％、約３５０％～４００％、約３５０％～４５０％、約３５０％～５００％、約４００％～４５０％、約４００％～５００％、または約４５０％～５００％増加させる。

【0020】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、投与なしと比較して、本明細書で提供される組成物の投与後に、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存を約１％～１００％増加させる。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、投与なしと比較して、本明細書で提供される組成物の投与後に、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％増加させる。任意の適切な方法を使用して、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存率の増加を評価し得る。例えば、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ＧＡＢＡ合成酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、および／またはパルバルブミン（ＰＶ）に対する免疫染色を行って、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの数を測定し得る。ＧＡＢＡ作動性ニューロンの数の減少は、ＧＡＢＡ作動性ニューロン損失を示し得る。数が変わらない場合、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが生存することを示し得る。ＧＡＢＡ作動性ニューロンの数の増加は、ＧＡＢＡ作動性再生の発生を示し得る。

【0021】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、新たな非反応性星状細胞を生成し、本明細書で提供される組成物の投与後に、新たな非反応性星状細胞の数をベースラインレベルから約１％～１００％増加させる。いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、新たな非反応性星状細胞を生成し、本明細書で提供される組成物の投与後に、新たな非反応性星状細胞の数をベースラインレベルから約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％増加させる。

【0022】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、反応性星状細胞の数を約１％～１００％低減させる。いくつかの場合では、本発明で提供する方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、反応性星状細胞の数を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％低減させる。

【0023】

いくつかの場合では、本明細書で提供される方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、哺乳動物の記憶評価の特徴を約１％～１００％改善する。いくつかの場合では、本発明で提供する方法または組成物は、本明細書で提供される組成物の投与後に、哺乳動物の記憶評価の特徴を約１％～約１０％、１％～約２０％、１％～約３０％、１０％～約２０％、１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％改善する。

【0024】

いくつかの場合では、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）によって影響を受けた対象へ投与することは、恒常性を再導入し、プラークの除去に寄与し、かつ／または脳血管形成および血流を改善することができる。

【0025】

いくつかの場合では、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を、脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）によって影響を受けた対象へ投与することは、損傷部位での炎症の低減、損傷部位での神経阻害の低減、損傷部位での正常なミクログリア形態の再建、損傷部位での神経回路の再建、損傷部位での血管の増加、損傷部位での血液脳関門の再建、損傷部位での正常な組織構造の再建、および正常な血流の途絶による運動欠乏の改善を媒介する。

【0026】

いくつかの場合では、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を投与して、それを必要とする個々の対象における脳における神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の影響を改善することは、静止状態の星状細胞へ投与するよりも、反応性星状細胞へ投与した場合に、より大きな有益な効果を有する。

【0027】

ＮｅｕｒｏＤ１治療は、ＭＲＩによって診断される損傷の領域に施され得る。電気生理学は、神経細胞死または損傷によって引き起こされる神経発火の機能的変化を評価することができる。神経損傷をアッセイするための非侵襲的な方法には、脳波図（ＥＥＧ）が含まれる。損傷の点への血流の途絶は、近赤外線分光法および機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）を介して非侵襲的にアッセイされ得る。領域内の血流は、動脈瘤に見られるように増加するか、または虚血に見られるように減少するかのいずれかであり得る。血流の途絶によって引き起こされるＣＮＳへの損傷は、さらに、損傷の点の診断に使用され得る組織構造の短期および長期的な変化を引き起こす。短期的には、損傷は局所的な腫れを引き起こす。長期的には、細胞死は組織損失の点を引き起こす。組織死によって引き起こされる構造変化をアッセイするための非侵襲的な方法には、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ軸断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、または超音波検査が含まれる。これらの方法を単独で、または任意の組み合わせで使用して、損傷の病巣の位置を正確に示すことができる。

【0028】

上述のように、組織死によって引き起こされる構造変化をアッセイするための非侵襲的方法には、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、または超音波が含まれる。機能的アッセイは、ＥＥＧ記録を含み得る。

【0029】

本明細書に記載の神経学的障害を治療するための方法のいくつかの実施形態では、ＮｅｕｒｏＤ１は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターとして投与される。

【0030】

本明細書に記載の神経学的障害を治療するための方法のいくつかの実施形態では、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、定位性頭蓋内注射または後眼窩注射などの対象の脳内への注射によって送達される。いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするアデノ随伴ウイルスを含有する組成物は、脳における同じ位置で２回以上の頭蓋内注射を使用して脳に投与される。いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするアデノ随伴ウイルスを含有する組成物は、脳における２つ以上の異なる位置での２回以上の頭蓋内注射を使用して脳に投与される。

【0031】

「発現ベクター」という用語は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を、インビトロまたはインビボで宿主細胞に導入するための組換えビヒクルを指し、核酸は発現され、ＮｅｕｒｏＤ１を産生する。特定の実施形態では、配列番号１もしくは３、または実質的に同一の核酸配列を含む発現ベクターを発現して、発現ベクターを含有する細胞においてＮｅｕｒｏＤ１を産生する。「組換え」という用語は、２つ以上の核酸が連結されており、かつ自然界では連結して見出されない核酸構築物を示すために使用される。発現ベクターには、プラスミド、ウイルス、ＢＡＣおよびＹＡＣが含まれるが、これらに限定されない。特定のウイルス発現ベクターとしては、例示的に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスに由来するものが挙げられる。

【0032】

本明細書は、記載の方法による神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の治療を必要とする対象において神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を治療するための材料および方法を記載し、それは、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクターを提供すること、ならびにウイルスベクターを対象の脳に送達し、それによって、ウイルスベクターは中枢神経系のグリア細胞にそれぞれ感染し、感染したグリア細胞を産生し、それによって、外因性ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸）が、感染したグリア細胞において治療的に有効なレベルで発現されることを含み、感染した細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１の発現が、同じ神経学的状態を有する未治療の対象と比較して、対象において多い数のニューロンをもたらし、それによって神経学的障害が治療される。新たなニューロンの生成に加えて、反応性グリア細胞の数も低減し、放出される神経阻害因子の減少、神経炎症の減少、および均一に分布するより多くの血管がもたらされ、それによって局所環境がニューロン成長または軸索浸透に対してより寛容になり、したがって、神経学的状態を緩和する。

【0033】

いくつかの場合では、アデノ随伴ベクターは、本明細書に記載の方法において特に有用であり、注射部位で分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科ファミリーのｓｓＤＮＡ動物ウイルスの遍在的で、非細胞障害性で、複製能のないメンバーである。いくつかの態様によれば、血清型１～９などの様々な組換えアデノ随伴ウイルスのうちのいずれかを、本明細書に記載されるように使用することができる。いくつかの場合では、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅｂを使用して、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を投与する。

【0034】

「ＦＬＥＸ」スイッチアプローチは、本明細書に記載のいくつかの態様による感染した細胞においてＮｅｕｒｏＤ１を発現するために使用される。「ＦＬＥＸ」および「フリップ切除（Ｆｌｉｐ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ）」という用語は、２対の異型で反平行ｌｏｘＰ型の組換え部位が、逆向きＮｅｕｒｏＤ１コード配列のいずれかの側に配置され、それは最初にコード配列の反転を受け、続いて２つの部位の切除を受け、各直交組換え部位のうちの１つが反対方向に向けられ、さらなる組換えを行うことができず、安定した反転を達成する方法を示すために互換的に使用され、例えば、Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：５６２－５６５（２００３）、およびＡｔａｓｏｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８：７０２５－７０３０（２００８）を参照されたい。グリア細胞特異的プロモーターの制御下にある部位特異的組換え酵素は、反応性星状細胞を含むグリア細胞において強力に発現されるため、ＮｅｕｒｏＤ１は、反応性星状細胞を含むグリア細胞においても発現される。次いで、ＮｅｕｒｏＤ１の前の終止コドンが組換えから除去されるとき、構成的またはニューロン特異的プロモーターは、ＮｅｕｒｏＤ１の高発現を駆動し、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換できるようにする。

【0035】

特定の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１を、（１）ＧＦＡＰまたはＳ１００ｂまたはＡｌｄｈ１Ｌ１などの星状細胞特異的プロモーターの転写制御下にある部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクター、および（２）遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下であるＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクターを投与することによって、ＮｅｕｒｏＤ１を必要とする対象へ投与し、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向である。

【0036】

部位特異的組換え酵素およびそれらの認識部位は、例えば、認識部位ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２２７２部位、もしくはＦＬＰ－ＦＲＴ組換え、またはそれらの組み合わせとともに、Ｃｒｅ組換え酵素が挙げられる。

【0037】

ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸配列（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするＡＡＶ）を含む組成物を、哺乳動物に１回または複数回（例えば、２、３、４、５回、またはそれ以上）投与し得る。

【0038】

ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする外因性核酸配列（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするＡＡＶ）を含む組成物を、哺乳動物への投与のための薬学的組成物に製剤化し得る。例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を、含む治療有効量の組成物を、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とともに製剤化し得る。外因性ＮｅｕｒｏＤ１（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＡＡＶ）を含む薬学的組成物を、様々な投与経路、例えば、カプセル、液体などとしての経口投与のために製剤化し得る。いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を有するウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）は、非経口的に、好ましくは静脈内注射または静脈内注入によって投与される。投与は、例えば、静脈内注入によって、例えば、６０分間、３０分間、または１５分間であり得る。いくつかの場合では、投与は、１分～６０分であり得る。いくつかの場合では、投与は、１分～５分、１分～１０分、１分～１５分、５分～１０分、５分～１５分、５分～２０分、１０分～１５分、１０分～２０分、１０分～２５分、１５分～２０分、１５分～２５分、１５分～３０分、２０分～２５分、２０分～３０分、２０分～３５分、２５分～３０分、２５分～３５分、２５分～４０分、３０分～３５分、３０分～４０分、３０分～４５分、３５分～４０分、３５分～４５分、３５分～５０分、４０分～４５分、４０分～５０分、４０分～５５分、４５分～５０分、４５分～５５分、４５分～６０分、５０分～５５分、５０分～６０分、または５５分～６０分であり得る。いくつかの場合では、ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＡＡＶ）は、手術中に脳への注射によって局所的に投与される。注射および／または注入による投与に好適な組成物には、溶液および分散液、ならびに対応する溶液および分散液を調製することができる粉末が含まれる。かかる組成物は、ウイルスベクターおよび少なくとも１つの好適な薬学的に許容される担体を含む。静脈内投与のための好適な薬学的に許容される担体には、バクテリア静止水、リンガー溶液、生理学的生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）が含まれるが、これらに限定されない。注射および／または注入のための滅菌組成物は、必要な量のウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＡＡＶ）を適切な担体内に導入し、次いで濾過によって滅菌することによって調製され得る。注射または注入による投与のための組成物は、それらの調製後、長期間にわたって保管条件下で安定した状態を維持する必要がある。組成物は、この目的のための防腐剤を含有し得る。好適な保存剤には、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。

【0039】

薬学的組成物は、滅菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤を非限定的に含む、固体または液体形態での投与のために製剤化され得る。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提示することができ、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保管され得る。即時注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。

【0040】

本明細書に記載の薬学的組成物に使用され得る追加の薬学的に許容される担体、充填剤、およびビヒクルとしては、非限定的に、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸、水、塩、または電解質の部分グリセリド混合物、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス粒子」という用語は、その核酸ゲノムを細胞に伝達するＡＡＶウイルスのパッケージ化されたキャプシド形態を指す。

【0042】

ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を含有する組成物の有効量は、哺乳動物（例えば、ヒト）内の神経学的障害の症状を改善し、哺乳動物に対して重度の毒性を産生しない任意の量であり得る。例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするアデノ随伴ウイルスの有効量は、約１０^１０～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするアデノ随伴ウイルスの有効量は、１０^１０個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１１個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１０個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１２個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１０個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１３個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１１個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１２個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１１個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１３個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１１個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１２個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１３個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、１０^１２個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ、または１０^１３個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬ～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬであり得る。特定の哺乳動物が特定の量に応答しない場合、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードするＡＡＶの量を増加させ得る。投与されるウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を有するＡＡＶ）の量に関連する因子は、例えば、ウイルスベクターの投与経路、疾患の性質および重症度、治療される患者の疾患歴、ならびに治療される患者の年齢、体重、身長および健康である。いくつかの場合では、治療効果、患者の免疫応答、および遺伝子産物の安定性を達成するために必要とされる導入遺伝子の発現レベルは、投与される量に関連する。いくつかの場合では、ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を有するＡＡＶ）の投与は、脳の機能障害または疾患の完全または実質的に完全な治癒をもたらす量で生じる。

【0043】

いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を含有する組成物の有効量は、約０．１μＬ／分～約５μＬ／分の制御された流速で投与される任意の量であり得る。

【0044】

いくつかの場合では、制御された流速は、０．１μＬ／分～０．２μＬ／分、０．１μＬ／分～０．３μＬ／分、０．１μＬ／分～０．４μＬ／分、０．２μＬ／分～０．３μＬ／分、０．２μＬ／分～０．４μＬ／分、０．２μＬ／分～０．５μＬ／分、０．３μＬ／分～０．４μＬ／分、０．３μＬ／分～０．５μＬ／分、０．３μＬ／分～０．６μＬ／分、０．４μＬ／分～０．５μＬ／分、０．４μＬ／分～０．６μＬ／分、０．４μＬ／分～０．７μＬ／分、０．５μＬ／分～０．６μＬ／分、０．５μＬ／分～０．７μＬ／分、０．５μＬ／分～０．８μＬ／分、０．６μＬ／分～０．７μＬ／分、０．６μＬ／分～０．８μＬ／分、０．６μＬ／分～０．９μＬ／分、０．７μＬ／分～０．８μＬ／分、０．７μＬ／分～０．９μＬ／分、０．７μＬ／分～１．０μＬ／分、０．８μＬ／分～０．９μＬ／分、０．８μＬ／分～１．０μＬ／分、０．８μＬ／分～１．１μＬ／分、０．９μＬ／分～１．０μＬ／分、０．９μＬ／分～１．１μＬ／分、０．９μＬ／分～１．２μＬ／分、１．０μＬ／分～１．１μＬ／分、１．０μＬ／分～１．２μＬ／分、１．０μＬ／分～１．３μＬ／分、１．１μＬ／分～１．２μＬ／分、１．１μＬ／分～１．３μＬ／分、１．１μＬ／分～１．４μＬ／分、１．２μＬ／分～１．３μＬ／分、１．２μＬ／分～１．４μＬ／分、１．２μＬ／分～１．５μＬ／分、１．３μＬ／分～１．４μＬ／分、１．３μＬ／分～１．５μＬ／分、１．３μＬ／分～１．６μＬ／分、１．４μＬ／分～１．５μＬ／分、１．４μＬ／分～１．６μＬ／分、１．４μＬ／分～１．７μＬ／分、１．５μＬ／分～１．６μＬ／分、１．５μＬ／分～１．７μＬ／分、１．５μＬ／分～１．８μＬ／分、１．６μＬ／分～１．７μＬ／分、１．６μＬ／分～１．８μＬ／分、１．６μＬ／分～１．９μＬ／分、１．７μＬ／分～１．８μＬ／分、１．７μＬ／分～１．９μＬ／分、１．７μＬ／分～２．０μＬ／分、１．８μＬ／分～１．９μＬ／分、１．８μＬ／分～２．０μＬ／分、１．８μＬ／分～２．１μＬ／分、１．９μＬ／分～２．０μＬ／分、１．９μＬ／分～２．１μＬ／分、１．９μＬ／分～２．２μＬ／分、２．０μＬ／分～２．１μＬ／分、２．０μＬ／分～２．２μＬ／分、２．０μＬ／分～２．３μＬ／分、２．１μＬ／分～２．２μＬ／分、２．１μＬ／分～２．３μＬ／分、２．１μＬ／分～２．４μＬ／分、２．２μＬ／分～２．３μＬ／分、２．２μＬ／分～２．４μＬ／分、２．２μＬ／分～２．５μＬ／分、２．３μＬ／分～２．４μＬ／分、２．３μＬ／分～２．５μＬ／分、２．３μＬ／分～２．６μＬ／分、２．４μＬ／分～２．５μＬ／分、２．４μＬ／分～２．６μＬ／分、２．４μＬ／分～２．７μＬ／分、２．５μＬ／分～２．６μＬ／分、２．５μＬ／分～２．７μＬ／分、２．５μＬ／分～２．８μＬ／分、２．６μＬ／分～２．７μＬ／分、２．６μＬ／分～２．８μＬ／分、２．６μＬ／分～２．９μＬ／分、２．７μＬ／分～２．８μＬ／分、２．７μＬ／分～２．９μＬ／分、２．７μＬ／分～３．０μＬ／分、２．８μＬ／分～２．９μＬ／分、２．８μＬ／分～３．０μＬ／分、２．８μＬ／分～３．１μＬ／分、２．９μＬ／分～３．０μＬ／分、２．９μＬ／分～３．１μＬ／分、２．９μＬ／分～３．２μＬ／分、３．０μＬ／分～３．１μＬ／分、３．０μＬ／分～３．２μＬ／分、３．０μＬ／分～３．３μＬ／分、３．１μＬ／分～３．２μＬ／分、３．１μＬ／分～３．３μＬ／分、３．１μＬ／分～３．４μＬ／分、３．２μＬ／分～３．３μＬ／分、３．２μＬ／分～３．４μＬ／分、３．２μＬ／分～３．５μＬ／分、３．３μＬ／分～３．４μＬ／分、３．３μＬ／分～３．５μＬ／分、３．３μＬ／分～３．６μＬ／分、３．４μＬ／分～３．５μＬ／分、３．４μＬ／分～３．６μＬ／分、３．４μＬ／分～３．７μＬ／分、３．５μＬ／分～３．６μＬ／分、３．５μＬ／分～３．７μＬ／分、３．５μＬ／分～３．８μＬ／分、３．６μＬ／分～３．７μＬ／分、３．６μＬ／分～３．８μＬ／分、３．６μＬ／分～３．９μＬ／分、３．７μＬ／分～３．８μＬ／分、３．７μＬ／分～３．９μＬ／分、３．７μＬ／分～４．０μＬ／分、３．８μＬ／分～３．９μＬ／分、３．８μＬ／分～４．０μＬ／分、３．８μＬ／分～４．１μＬ／分、３．９μＬ／分～４．０μＬ／分、３．９μＬ／分～４．１μＬ／分、３．９μＬ／分～４．２μＬ／分、４．０μＬ／分～４．１μＬ／分、４．０μＬ／分～４．２μＬ／分、４．０μＬ／分～４．３μＬ／分、４．１μＬ／分～４．２μＬ／分、４．１μＬ／分～４．３μＬ／分、４．１μＬ／分～４．４μＬ／分、４．２μＬ／分～４．３μＬ／分、４．２μＬ／分～４．４μＬ／分、４．２μＬ／分～４．５μＬ／分、４．３μＬ／分～４．４μＬ／分、４．３μＬ／分～４．５μＬ／分、４．３μＬ／分～４．６μＬ／分、４．４μＬ／分～４．５μＬ／分、４．４μＬ／分～４．６μＬ／分、４．４μＬ／分～４．７μＬ／分、４．５μＬ／分～４．６μＬ／分、４．５μＬ／分～４．７μＬ／分、４．５μＬ／分～４．８μＬ／分、４．６μＬ／分～４．７μＬ／分、４．６μＬ／分～４．８μＬ／分、４．６μＬ／分～４．９μＬ／分、４．７μＬ／分～４．８μＬ／分、４．７μＬ／分～４．９μＬ／分、４．７μＬ／分～５．０μＬ／分、４．８μＬ／分および４．９μＬ／分、４．８μＬ／分～５．０μＬ／分、または４．９μＬ／分～５．０μＬ／分である。

【0045】

ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸を含有するＡＡＶ）は、約１．０×１０^１０～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ（ｋｇ体重当たりのウイルスゲノム）の範囲のウイルスの用量に対応する量で投与され得る。いくつかの場合では、ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸を有するＡＡＶ）は、約１．０×１０^１１～約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの範囲、約５．０×１０^１１～約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇの範囲、または約１．０×１０^１２～約５．０×１０^１１の範囲のウイルス用量に対応する量で投与され得る。いくつかの場合では、ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸を有するＡＡＶ）は、約２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量に対応する量で投与される。いくつかの場合では、ウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸を有するＡＡＶ）の有効量は、本明細書に記載のｖｇ／ｋｇ（ｋｇ体重当たりのウイルスゲノム）用量の体積に対応する約１μＬ～約５００μＬの体積であり得る。

【0046】

いくつかの場合では、ウイルスベクターの有効投与体積は、１μＬ～２５μＬ、１μＬ～５０μＬ、１μＬ～７５μＬ、２５μＬ～５０μＬ、２５μＬ～７５μＬ、２５μＬ～１００μＬ、５０μＬ～７５μＬ、５０μＬ～１００μＬ、５０μＬ～１２５μＬ、７５μＬ～１００μＬ、７５μＬ～１２５μＬ、７５μＬ～１５０μＬ、１００μＬ～１２５μＬ、１００μＬ～１５０μＬ、１００μＬ～１７５μＬ、１２５μＬ～１５０μＬ、１２５μＬ～１７５μＬ、１２５μＬ～２００μＬ、１５０μＬ～１７５μＬ、１５０μＬ～２００μＬ、１５０μＬ～２２５μＬ、１７５μＬ～２００μＬ、１７５μＬ～２２５μＬ、１７５μＬ～２５０μＬ、２００μＬ～２２５μＬ、２００μＬ～２５０μＬ、２００μＬ～２７５μＬ、２２５μＬ～２５０μＬ、２２５μＬ～２７５μＬ、２２５μＬ～３００μＬ、２５０μＬ～２７５μＬ、２５０μＬ～３００μＬ、２５０μＬ～３２５μＬ、２７５μＬ～３００μＬ、２７５μＬ～３２５μＬ、２７５μＬ～３５０μＬ、３００μＬ～３２５μＬ、３００μＬ～３５０μＬ、３００μＬ～３７５μＬ、３２５μＬ～３５０μＬ、３２５μＬ～３７５μＬ、３２５μＬ～４００μＬ、３５０μＬ～３７５μＬ、３５０μＬ～４００μＬ、３５０μＬ～４２５μＬ、３７５μＬ～４００μＬ、３７５μＬ～４２５μＬ、３７５μＬ～４５０μＬ、４００μＬ～４２５μＬ、４００μＬ～４５０μＬ、４００μＬ～４７５μＬ、４２５μＬ～４５０μＬ、４２５μＬ～４７５μＬ、４２５μＬ～５００μＬ、４５０μＬ～４７５μＬ、４５０μＬ～５００μＬ、または４７５μＬ～５００μＬである。

【0047】

いくつかの場合では、投与されるウイルスベクター（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸を有するＡＡＶ）の量は、１つ以上の導入遺伝子（例えば、ＮｅｕｒｏＤ１）の発現の強度に従って調整される。

【0048】

いくつかの場合では、遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下にあるＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は、逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向であり、さらに部位特異的組換え酵素による組換え酵素活性のための部位を含む、アデノ随伴ウイルスベクターは、部位特異的組換え酵素をコードするアデノ随伴ウイルスとともに、対象の脳内へ定位注射によって送達される。

【0049】

いくつかの場合では、遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下にあるＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は、逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向であり、さらに部位特異的組換え酵素による組換え酵素活性のための部位を含む、アデノ随伴ウイルスベクターは、いくつかの態様による、ＣＮＳの正常な血流の途絶の領域またはその部位において、部位特異的組換え酵素をコードするアデノ随伴ウイルスとともに、対象の脳内へ定位注射によって送達される。任意選択で、定位注射の部位は、ＣＮＳにおける正常な血流の途絶によって引き起こされるグリア瘢痕内またはその近くである。

【0050】

いくつかの場合では、部位特異的組換え酵素は、Ｃｒｅ組換え酵素であり、組換え酵素活性のための部位は、認識部位ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２２７２部位である。

【0051】

いくつかの場合では、対象のＮｅｕｒｏＤ１治療が、治療中または治療後に監視され、治療の進行および／または最終転帰を監視する。ニューロン細胞の統合および組織微小環境の回復の成功についての治療後のアッセイは、正常な電気生理学、血流、組織構造、および機能の回復またはほぼ回復によって診断され得る。神経機能をアッセイするための非侵襲的な方法には、ＥＥＧが含まれる。血流は、近赤外線分光法およびｆＭＲＩを介して非侵襲的にアッセイされ得る。組織構造をアッセイするための非侵襲的方法には、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン、または超音波が含まれる。行動アッセイは、脳機能の回復のための非侵襲的アッセイに使用され得る。行動アッセイは、元の脳損傷によって引き起こされる機能の喪失と一致する必要がある。例えば、損傷が麻痺を引き起こした場合、患者の可動性および四肢の器用さをテストする必要がある。損傷が発話の喪失または遅延を引き起こした場合、話し言葉を介した患者のコミュニケーション能力をアッセイする必要がある。ＮｅｕｒｏＤ１治療後の正常な行動の回復は、効果的なニューロン回路の作製および統合に成功したことを示す。神経機能および組織の健康についてアッセイするために、これらの方法を単独で、または任意の組み合わせで使用し得る。治療を評価するためのアッセイは、ＮｅｕｒｏＤ１治療の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、１年後、またはそれ以降などの任意の時点で実施され得る。かかるアッセイは、必要に応じてベースライン比較を確立するために、ＮｅｕｒｏＤ１治療の前に実施され得る。

【0052】

本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。かかる用語は、例示的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、Ｆ．Ｍ．Ａｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ，２００２、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４、Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ｄ．Ｒ．，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｎｕｔｓ ａｎｄ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ，Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ，２００３、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，ｐ．（Ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４、Ａ．Ｎａｇｙ，Ｍ．Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｒ．Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ Ｅｄ．；Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５，２００２，ＩＳＢＮ－１０：０８７９６９５９１９、Ｋｕｒｓａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ（Ｅｄ．），Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２、１８５，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０８を含む様々な標準的な参考文献の文脈で定義され使用されていることが見出される。

【0053】

本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、明確に別途示されない限り、または文脈が明確に別途示さない限り、限定することを意図せず、複数の指示対象を含む。

【0054】

本明細書で使用される場合、「ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質」という用語は、胎児の脳発達および成人の神経新生に関与するｂＨＬＨ前神経転写因子を指し、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，３０：３５－４７（２００４）、Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：１０９７－１１０５（２００９）、およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：１０９０－１０９２（２００９）を参照されたい。ＮｅｕｒｏＤ１は、主に神経系において発生の後期に発現し、ニューロンの分化、成熟、および生存に関与する。

【0055】

「ＮｅｕｒｏＤ１核酸」または「外因性ＮｅｕｒｏＤ１核酸」という用語は、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸、配列番号２として本明細書で同定されるヒトＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸、および配列番号４として本明細書で同定されるマウスＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸を包含する。配列番号２および配列番号４のＮｅｕｒｏＤ１タンパク質に加えて、「ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質」という用語は、本明細書に記載の方法に含まれ得る配列番号２および配列番号４のバリアントなどのＮｅｕｒｏＤ１タンパク質のバリアントを包含する。本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、天然に生じる遺伝的バリエーションおよび組換え調製されたバリエーションを指し、その各々は、配列番号２または配列番号４などの参照ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質と比較して、そのアミノ酸配列の１つ以上の変化を含む。かかる変化には、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換、付加、または欠失によって修飾されているものが含まれる。「バリアント」という用語は、例えば、これらに限定されないが非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、トリ、家禽、ならびにマウスおよびラットを含むがこれらに限定されないげっ歯類由来のＮｅｕｒｏＤ１オーソログなど、哺乳動物およびトリＮｅｕｒｏＤ１を含むヒトＮｅｕｒｏＤ１オーソログを包含する。非限定的な実施例では、配列番号４のアミノ酸として本明細書に例示されるマウスＮｅｕｒｏＤ１は、ヒトＮｅｕｒｏＤ１のオーソログである。

【0056】

いくつかの場合では、好ましいバリアントは、配列番号２または配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。

【0057】

変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準の分子生物学の技法を使用して導入され得る。当業者は、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の機能的特性を変化させることなく、１つ以上のアミノ酸変異が導入され得ることを認識するであろう。例えば、配列番号２または４のＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の機能的特性を変化させることなく、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を行うことができる。

【0058】

ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質バリアントを産生するために保存的アミノ酸置換がＮｅｕｒｏＤ１タンパク質において行われ得る。保存的アミノ酸置換は、類似の特徴を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の技術分野で認められた置換である。例えば、各アミノ酸は、以下の特徴、正電荷、負電荷、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、および親水性のうちの１つ以上を有すると説明され得る。保存的置換は、同じ特徴を有する別のアミノ酸に対する特定の構造的または機能的特徴を有する１つのアミノ酸の置換である。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが含まれ、脂肪族アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン、およびバリンが含まれ、芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、グリシン、チロシン、およびトリプトファンが含まれ、極性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、およびチロシンが含まれ、疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、およびトリプトファンが含まれ、保存的置換には、各群内のアミノ酸間の置換が含まれる。アミノ酸はまた、相対サイズの観点から記載されてもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸塩、グリシン、アスパラギン、プロリン、スレオニン、セリン、およびバリンは各々、通常は小さいと考えられる。

【0059】

ＮｅｕｒｏＤ１バリアントは、合成アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、および／または非標準アミノ酸を含み得、例示的に、α－アミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシ－フェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、３－ホスホセリン、ホモセリン、５－ヒドロキシトリプトファン、１－メチルヒスチジン、３－メチルヒスチジン、およびオルニチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するために、配列が最適な比較の目的のためにアライメントされる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップが導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性の％＝同一の重複した位置の数／位置の総数Ｘ１００％）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。

【0061】

２つの配列間の同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用しても達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＰＮＡＳ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）のように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＰＮＡＳ，８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本明細書に記載の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２にセットされたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が実施される。

【0062】

本明細書に記載のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３にセットされたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が実施される。比較の目的ためのギャップ付きのアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載のギャップ付きＢＬＡＳＴを利用する。あるいは、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施する。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）の既定値パラメータが使用される（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。

【0063】

配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８８）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用される。

【0064】

２つの配列間の同一性のパーセントは、ギャップを許容してまたはギャップを許容することなく、上述の技法と同様の技法を使用して決定される。同一性のパーセントを計算する際、典型的には、正確な一致のみが計数される。

【0065】

「ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物で作動可能な、配列番号２および４の断片などのＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の断片、ならびにそれらのバリアントを包含する。

【0066】

ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質および核酸は、ＮｅｕｒｏＤ１を発現する生物の脳または細胞株の細胞などの天然供給源から単離され得る。あるいは、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質または核酸は、発現構築物を使用した発現などによって、インビトロまたはインビボで組み換えて生成され得る。ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質および核酸はまた、周知の方法によって合成され得る。

【0067】

方法および組成物に含まれるＮｅｕｒｏＤ１は、組換え核酸技術を使用して産生され得る。組換えＮｅｕｒｏＤ１の産生は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列を包含する組換え発現ベクターを宿主細胞内に導入することを含む。

【0068】

いくつかの実施形態によるＮｅｕｒｏＤ１を産生するために宿主細胞内に導入されるＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号４、またはそれらのバリアントをコードする。

【0069】

いくつかの場合では、配列番号１として本明細書で同定される核酸配列は、配列番号２をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してＮｅｕｒｏＤ１を産生する。いくつかの態様によると、配列番号３として本明細書で同定される核酸配列は、配列番号４をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してＮｅｕｒｏＤ１を産生する。

【0070】

遺伝子コードの縮重性質により、配列番号１および３と実質的に同一の核酸配列は、ＮｅｕｒｏＤ１およびＮｅｕｒｏＤ１のバリアントをコードし、かかる代替の核酸は、発現ベクターに含まれ得、発現してＮｅｕｒｏＤ１およびＮｅｕｒｏＤ１のバリアントを産生し得ることが理解される。当業者は、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸の断片を使用して、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の断片を産生し得ることを理解するであろう。

【0071】

発現ベクターは、目的のポリペプチドをコードするセグメントの転写を提供する１つ以上の調節要素に作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む核酸を含有し得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第２の核酸との機能的関係にある核酸を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写される核酸および調節要素などの２つ以上の核酸分子の機能的連結を包含する。本明細書で使用される場合、「調節要素」という用語は、作動可能に連結された核酸の発現のいくつかの態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例示的な調節要素としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａドメインなどであるがこれらに限定されないエンハンサー、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、プロモーター、転写終結配列、および上流調節ドメインが挙げられ、これらは、作動可能に連結された核酸配列の複製、転写、転写後プロセシングに寄与する。当業者であれば、日常的な実験のみで発現ベクターにおいて、これらおよび他の調節要素を選択および使用することができる。

【0072】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列などの転写される核酸配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、概して、転写される核酸配列の上流に位置付けられ、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。具体的な実施形態では、プロモーターは、概して、所望の分子を産生するために転写される核酸配列の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

【0073】

当業者によって認識されるように、遺伝子の５’非コード領域を単離し、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するために、その全体をプロモーターとして使用することができる。あるいは、５’非コード領域の一部分を単離し、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するために使用することができる。概して、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するために、遺伝子の５’非コード領域の約５００～６０００ｂｐを使用する。任意選択で、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するのに必要な最小量の５’非コード領域を含有する遺伝子の５’非コード領域の一部分を使用する。遺伝子の５’非コード領域の指定された部分の作動可能に連結された核酸の発現を駆動する能力を決定するためのアッセイは、当技術分野で周知である。

【0074】

本明細書に記載の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、発現ベクターが移入される生物の多くの、ほとんどの、またはすべての細胞型における発現を駆動する「遍在的」または「構成的」プロモーターである。ＮｅｕｒｏＤ１の発現に使用され得る遍在的プロモーターの非限定的な例としては、サイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ベータアクチンプロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース調節タンパク質７８プロモーター、グルコース調節タンパク質９４プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、ベータキネシンプロモーター、ＲＯＳＡプロモーター、ユビキチンＢプロモーター、真核生物開始因子４Ａ１プロモーター、および伸長因子Ｉプロモーターであり、これらはすべて当技術分野で周知であり、日常的な方法論を使用して一次供給源から単離することができるか、または商業的供給源から得られる。プロモーターは、単一の遺伝子に完全に由来し得るか、または１つより多い遺伝子に由来する部分を有するキメラであり得る。

【0075】

調節配列の組み合わせは、発現ベクターに含まれ得、ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用され得る。ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するための発現ベクターに含まれる非限定的な例は、サイトメガロウイルスＣＭＶ初期エンハンサー要素およびニワトリベータアクチンプロモーターを組み合わせたＣＡＧプロモーターである。

【0076】

本明細書に記載の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、グリア細胞、特に星状細胞および／またはＮＧ２細胞において優先的に発現を駆動するものである。かかるプロモーターは、「星状細胞特異的」および／または「ＮＧ２細胞特異的」プロモーターと称される。

【0077】

星状細胞特異的プロモーターの非限定的な例は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）プロモーターである。ヒトＧＦＡＰプロモーターは、配列番号６として本明細書に示されている。マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーターは、配列番号７として本明細書に示されている。

【0078】

ＮＧ２細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、ニューロングリア抗原２（ＮＧ２）としても知られているコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４遺伝子のプロモーターである。ヒトＮＧ２プロモーターは、配列番号８として本明細書に示されている。

【0079】

本明細書に記載の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、反応性グリア細胞、特に反応性星状細胞および／または反応性ＮＧ２細胞において優先的に発現を駆動するものである。かかるプロモーターは、「反応性星状細胞特異的」および／または「反応性ＮＧ２細胞特異的」プロモーターと称される。

【0080】

「反応性星状細胞特異的」プロモーターの非限定的な例は、リポカリン２（ｌｃｎ２）遺伝子のプロモーターである。マウスｌｃｎ２プロモーターは、配列番号５として本明細書に示されている。

【0081】

遍在的および細胞型特異的プロモーターの相同体およびバリアントを、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に使用し得る。

【0082】

いくつかの場合では、プロモーター相同体およびプロモーターバリアントは、ＮｅｕｒｏＤ１を発現するための発現ベクターに含まれ得る。「プロモーター相同体」および「プロモーターバリアント」という用語は、本明細書に開示されるものと比較して、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸上でＮｅｕｒｏＤ１の細胞型特異的発現、またはＮｅｕｒｏＤ１の遍在的発現など、所望の型の発現を付与するために実質的に類似した機能的特性を有するプロモーターを指す。例えば、プロモーター相同体またはバリアントは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、Ａｌｄｈ１Ｌ１、ＮＧ２、ｌｃｎ２およびＣＡＧプロモーターと比較して、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸に対して細胞型特異的発現を付与するための実質的に類似した機能的特性を有する。

【0083】

当業者は、所与のプロモーターの機能的特性を変更することなく、１つ以上の核酸変異を導入することができることを認識するであろう。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準の分子生物学の技法を使用して導入され、プロモーターバリアントを産生し得る。本明細書で使用される場合、「プロモーターバリアント」という用語は、単離された天然に生じるか、またはＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、Ａｌｄｈ１Ｌ１、ＮＧ２、ｌｃｎ２、およびｐＣＡＧプロモーターなどであるがこれらに限定されない、参照プロモーターの組換え調製されたバリアントのいずれかを指す。

【0084】

他の種由来のプロモーターが機能的であることが当技術分野で既知であり、例えば、マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーターは、ヒト細胞において機能的である。他の種由来の相同体および相同プロモーターは、当技術分野で既知のバイオインフォマティクスツールを使用して同定することができ、例えば、Ｘｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，６：Ｒ７２（２００５）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３３：Ｄ１０３－１０７（２００５）、およびＨａｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３１：３５５４－３５５９（２００３）を参照されたい。

【0085】

構造的に、ＮｅｕｒｏＤ１の細胞型特異的プロモーターまたはおよび／または遍在的プロモーターの相同体およびバリアントは、参照の発達的に調節された、および／または遍在的プロモーターと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有し、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、および任意選択で、転写因子のための１つ以上の結合部位を含む。

【0086】

配列番号１または配列番号３と実質的に同一である核酸配列は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１または配列番号３にハイブリダイゼーション可能な相補的な核酸配列を有するとして特徴付けられる。

【0087】

ＮｅｕｒｏＤ１をコードする１つ以上の核酸に加えて、追加のタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列が、発現ベクターに含まれ得る。例えば、かかる追加のタンパク質には、ベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、および抗生物質耐性レポーターを含むが、これらに限定されない、レポーターなどの非ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質が含まれる。

【0088】

特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号２のＮｅｕｒｏＤ１、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、または配列番号１と実質的に同一の核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。

【0089】

特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号４のＮｅｕｒｏＤ１、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、または配列番号２と実質的に同一の核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。

【0090】

配列番号９は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸に作動可能に連結されたＣＡＧプロモーターを含む核酸の例であり、ＥＧＦＰをコードする核酸配列およびエンハンサーＷＰＲＥをさらに含む。ＩＲＥＳは、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸およびＥＧＦＰをコードする核酸を分離する。配列番号９は、ＮｅｕｒｏＤ１およびレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現のための発現ベクター内に挿入される。任意選択で、ＩＲＥＳおよびＥＧＦＰをコードする核酸を除去し、残りのＣＡＧプロモーターおよびＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸を、ＮｅｕｒｏＤ１の発現のための発現ベクター内に挿入する。ＷＰＲＥまたは別のエンハンサーは、任意選択で含まれる。

【0091】

任意選択で、レポーター遺伝子は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする組換え発現ベクターに含まれる。レポーター遺伝子は、組換え発現ベクターからのＮｅｕｒｏＤ１の発現のための代理マーカーとして機能するペプチドまたはタンパク質を産生するために含まれ得る。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」という用語は、発現した場合、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、および／またはリガンド結合アッセイによって容易に検出可能な遺伝子を指す。例示的なレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＭｍＧＦＰ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４：１１３３－１１３７（１９９７））、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ、およびベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0092】

宿主細胞における遺伝物質によってコードされる所望のタンパク質の一過性または安定的な発現などの遺伝物質をレシピエント宿主細胞内に導入するプロセスは、「トランスフェクション」と称される。トランスフェクション技法は、当技術分野で周知であり、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」技術としても知られる粒子加速形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール媒介トランスフェクション、熱ショック媒介トランスフェクション、およびウイルス媒介トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、ウイルス媒介トランスフェクションは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスに由来するものなどのウイルスベクターを使用して達成され得る。

【0093】

任意選択で、宿主細胞は、エクスビボでトランスフェクションされ、次いで宿主生物内に再導入される。例えば、細胞または組織を対象から取り出し、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする発現ベクターでトランスフェクションし、次いで対象に戻すことができる。

【0094】

宿主グリア細胞において外因性ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドを発現してグリア細胞をニューロンに変換するための、ＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターのインビトロまたはインビボでの宿主グリア細胞内への導入は、様々なトランスフェクション方法論のうちのいずれかによって達成される。

【0095】

グリア細胞をニューロンに変換するための宿主グリア細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸の発現は、任意選択で、インビトロまたはインビボで宿主グリア細胞にＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードするｍＲＮＡを導入することによって達成される。

【0096】

グリア細胞をニューロンに変換するための宿主グリア細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸の発現は、任意選択で、インビトロまたはインビボで宿主グリア細胞にＮｅｕｒｏＤ１タンパク質を導入することによって達成される。これらおよび他の技法の詳細は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２、およびＥｎｇｅｌｋｅ，Ｄ．Ｒ．，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｎｕｔｓ ａｎｄ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ，Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ，２００３に記載されているように、当技術分野で既知である。

【0097】

ＮｅｕｒｏＤ１もしくはその機能的断片をコードする核酸、ＮｅｕｒｏＤ１もしくはその機能的断片をコードするｍＲＮＡ、および／またはＮｅｕｒｏＤ１タンパク質、その全長、もしくはその機能的断片を含む発現ベクターは、任意選択で、インビトロまたはインビボで宿主細胞内に導入するための担体と会合する。

【0098】

特定の態様では、担体は、リポソーム、ミセル、単層、または多層小胞を含む脂質粒子、ヒドロゲル粒子、ポリグリコール酸粒子、またはポリ乳酸粒子などのポリマー粒子、例えば、米国特許第５，６４８，０９７号に記載されるようなリン酸カルシウム粒子などの無機粒子、および例えば、米国特許第６，６３０，４８６号に記載されるような無機／有機粒子状担体などの粒子状担体である。

【0099】

粒子状担体は、脂質粒子、ポリマー粒子、無機粒子、および無機／有機粒子の中から選択され得る。粒子の種類の混合物はまた、粒子状の薬学的に許容される担体として含まれ得る。

【0100】

粒子状担体は、典型的には、粒子が約１ｎｍ～１０ミクロンの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。特定の態様では、粒子状担体は、粒子が約１ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。

【0101】

リポソームのさらなる説明ならびにそれらの調製および使用に関連する方法は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２６４），Ｖ．Ｐ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ａｎｄ Ｖ．Ｗｅｉｓｓｉｇ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ ｅｄ．，２００３に見出され得る。ナノ粒子のさらなる態様は、Ｍｏｇｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９：３１１－３０（２００５）に記載されている。

【0102】

組換え発現ベクターを使用したＮｅｕｒｏＤ１の発現は、当技術分野で認識される昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または任意の他の単一もしくは多細胞生物などの真核または原核宿主細胞発現系に発現ベクターを導入することによって達成される。宿主細胞は、任意選択で、初代細胞または不死化誘導体細胞である。不死化細胞は、少なくとも５回の複製継代の間、インビトロで維持することができるものである。

【0103】

組換え発現ベクターを含有する宿主細胞は、ＮｅｕｒｏＤ１が産生される条件下で維持される。宿主細胞は、Ｃｅｌｉｓ，Ｊｕｌｉｏ，ｅｄ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．に記載されているような既知の細胞培養技法を使用して培養および維持され得る。特定の栄養素、酸素、張力、二酸化炭素、および低減した血清レベルに関する培地製剤を含む、これらの細胞の様々な培養条件を、当業者によって選択および最適化することができる。

【0104】

いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、対象のグリア細胞内に導入する。グリア細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸の発現は、グリア細胞をニューロンに「変換する」。

【0105】

いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１またはそれらの機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、対象の星状細胞内に導入する。グリア細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸の発現は、星状細胞をニューロンに「変換する」。

【0106】

いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１またはそれらの機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、対象の反応性星状細胞内に導入する。反応性星状細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（もしくはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸、またはそれらの機能的断片の発現は、反応性星状細胞をニューロンに「変換」する。

【0107】

いくつかの場合では、ＮｅｕｒｏＤ１またはそれらの機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、対象のＮＧ２細胞内に導入する。ＮＧ２細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（もしくはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸、またはそれらの機能的断片の発現は、ＮＧ２細胞をニューロンに「変換する」。

【0108】

外因性ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターの導入後の外因性ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）の発現の検出は、ＮｅｕｒｏＤ１を検出するためのイムノアッセイ、ＮｅｕｒｏＤ１核酸を検出するための核酸アッセイ、およびＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）をコードする外因性核酸と共発現するレポーター遺伝子の検出を含むが、これらに限定されない、様々な標準的な方法論のうちのいずれかを使用して達成される。

【0109】

「変換する」および「変換された」という用語は、本明細書では、グリア細胞、星状細胞または反応性星状細胞の表現型のニューロン表現型への変化をもたらす、ＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片の発現の効果を説明するために使用される。同様に、「ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロン」、および「変換されたニューロン」という語句は、本明細書では、結果として生じるニューロン表現型を有する外因性ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質またはその機能的断片を含む細胞を指定するために使用される。

【0110】

「表現型」という用語は、本明細書で言及される細胞の周知の検出可能な特徴を指す。ニューロン表現型は、ニューロンの形態、１つ以上のニューロンマーカーの発現、ニューロンの電気生理学的特徴、シナプス形成、および神経伝達物質の放出のうちの１つ以上であり得るが、これらに限定されない。例えば、ニューロン表現型は、樹状突起、軸索および樹状突起棘の存在などのニューロンの特徴的な形態学的態様、シナプス点におけるシナプスタンパク質の存在、および樹状突起におけるＭＡＰ２の存在などの特徴的なニューロンタンパク質の発現および分布、ならびに自発的および誘発されるシナプス事象などの特徴的な電気生理学的徴候を包含するが、これらに限定されない。

【0111】

さらなる例では、星状細胞表現型および反応性星状細胞表現型などのグリア表現型は、概して「星の形状」の形態などの星状細胞および反応性星状細胞の特徴的な形態学的態様、ならびにグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の存在などの特徴的な星状細胞および反応性星状細胞のタンパク質発現を包含するが、これらに限定されない。

【0112】

「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む任意の形態で２つ以上のヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸の一本鎖形態におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を指す。

【0113】

「ＮｅｕｒｏＤ１核酸」という用語は、単離されたＮｅｕｒｏＤ１核酸分子を指し、配列番号１もしくは配列番号３に記載のＤＮＡ配列、もしくはその相補体、もしくはその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する単離されたＮｅｕｒｏＤ１核酸、または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号３に記載の核酸、もしくはその相補体、もしくはその断片とハイブリダイゼーションする配列を有する単離されたＤＮＡ分子を包含する。

【0114】

配列番号３の核酸は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１に記載の核酸にハイブリダイゼーションする配列を有する単離されたＤＮＡ分子の例である。ＮｅｕｒｏＤ１核酸の断片は、ＮｅｕｒｏＤ１核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の態様において作動可能なＮｅｕｒｏＤ１核酸の任意の断片である。

【0115】

標的ＮｅｕｒｏＤ１ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリダイゼーションすることができる核酸プローブまたはプライマーは、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの検出および／または定量化に使用され得る。核酸プローブは、少なくとも１０、１５、３０、５０、または１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、ＮｅｕｒｏＤ１ ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその相補配列に特異的にハイブリダイゼーションするのに十分であり得る。核酸プローブは、少なくとも、１０、１５、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはその相補配列に特異的にハイブリダイゼーションするのに十分であり得る。

【0116】

「相補体」および「相補的」という用語は、ヌクレオチド間のワトソン－クリック塩基対合を指し、具体的には、２つの水素結合によるアデニン残基に連結されたチミンまたはウラシル残基、ならびに３つの水素結合によって連結されたシトシンおよびグアニン残基での互いに水素結合されたヌクレオチドを指す。概して、核酸は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して、ある「パーセントの相補性」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して８０％、９０％、または１００％の相補性を有し得、これは、配列の１０個のヌクレオチドのうち８個、１０個のヌクレオチドのうち９個、または１０個のヌクレオチドのうち１０個が、特定の第２のヌクレオチド配列に対して相補的であることを示す。例えば、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－５’は、ヌクレオチド配列５’－ＡＧＣＴ－３’に１００％相補的である。さらに、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－は、ヌクレオチド配列５’－ＴＴＡＧＣＴＧＧ－３’の領域に１００％相補的である。

【0117】

「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイゼーションする」という用語は、相補的核酸の対合および結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当技術分野で周知であるように、核酸の相補性の程度、核酸の融解温度、Ｔｍ、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェントさなどの要因に応じて、２つの核酸間で様々な程度に生じる。「ハイブリダイゼーション条件のストリンジェントさ」という用語は、ホルムアミドおよびデンハルト溶液などの特定の一般的な添加剤に関する、ハイブリダイゼーション媒体の温度、イオン強度、および組成の条件を指す。

【0118】

特定の核酸に関する特定のハイブリダイゼーション条件の決定は、日常的であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２に記載されているように、当技術分野で周知である。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションのみを可能にする条件である。典型的には、約８５～１００％の相補性を有する核酸は、高度に相補的であると考えられ、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。中間ストリンジェントな条件は、中間の相補性である、約５０～８４％の相補性、および高い相補性を有する核酸がハイブリダイゼーションする条件によって例示される。対照的に、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、相補性の程度が低い核酸がハイブリダイゼーションする条件である。

【0119】

「特異的ハイブリダイゼーション」および「特異的にハイブリダイゼーションする」という用語は、試料中の標的核酸以外の核酸への実質的なハイブリダイゼーションを伴わない、特定の核酸の標的核酸へのハイブリダイゼーションを指す。

【0120】

ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェントさは、当業者に周知のように、プローブおよび標的のＴｍならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のイオン強度を含むいくつかの要因に依存する。所望のハイブリダイゼーションのストリンジェントさを達成するためのハイブリダイゼーションおよび条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，２００２に記載されている。

【0121】

高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、３７℃で終夜にわたる、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、３０％ホルムアミド、および１００マイクログラム／ｍＬの変性サーモン精子を含有する溶液中での約１００ヌクレオチド長にわたる核酸のハイブリダイゼーション、それに続く６０℃で１５分間、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中の洗浄である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである。デンハルト溶液は、０．０２％のウシ血清アルブミン／０．０２％のフィコール／０．０２％のポリビニルピロリドンである。高ストリンジェントな条件下で、配列番号１および配列番号３は、実質的に同一の標的の相補体にハイブリダイゼーションし、無関係な配列にはハイブリダイゼーションしない。

【0122】

神経学的状態の治療を必要とする対象において神経学的状態を治療する方法が提供され、それは、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１を対象の中枢神経系または末梢神経系のグリア細胞に送達することを含み得、グリア細胞における治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１は、同じ神経学的状態を有する未治療の対象と比較して対象において多い数のニューロンをもたらし、それによって神経学的状態が治療される。

【0123】

また、反応性グリア細胞のニューロンへの変換は、反応性グリア細胞に関連する神経炎症および神経阻害因子を低減し、それによって、神経学的状態が緩和されるように、グリア瘢痕組織をニューロン成長に対してより寛容にする。

【0124】

本明細書で使用される場合、「神経学的状態」または「神経学的障害」という用語は、追加のニューロンによって緩和、改善、または予防される対象の中枢神経系の任意の状態を指す。ニューロンの喪失もしくは阻害、および／またはニューロン機能の喪失もしくは阻害をもたらす損傷または疾患は、本明細書に記載の方法による治療のための神経学的状態である。

【0125】

グルタミン酸作動性ニューロンの損失もしくは阻害、および／またはグルタミン酸作動性ニューロン機能の損失もしくは阻害をもたらす損傷または疾患は、本明細書に記載されるように治療され得る神経学的状態である。ＧＡＢＡ作動性、コリン作動性、ドーパミン作動性、ノルエピネフリン作動性、またはセロトニン作動性ニューロンなどの他の型のニューロンの喪失または阻害は、同様の方法で治療され得る。

【0126】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療される神経学的状態の症状または徴候を緩和、改善、または予防するのに有効な本発明の組成物の量を意味することを意図している。特定の実施形態では、治療有効量は、神経学的状態の徴候および／または症状を有する対象において有益な効果を有する量である。

【0127】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、および「ＮｅｕｒｏＤ１治療」という用語、または文法的同等物は、神経学的状態、神経学的状態の症状または徴候を緩和、阻害または改善すること、および神経学的状態の症状または徴候を予防することを指し、治療的処置および／または予防的処置を含むが、これらに限定されない。

【0128】

神経学的状態の徴候および症状は、かかる徴候および症状の検出および評価方法とともに当技術分野で周知である。

【0129】

いくつかの場合では、対象の神経学的状態のための療法の組み合わせを施すことができる。

【0130】

特定の態様によれば、それを必要とする個々の対象におけるＣＮＳにおける正常な血流の途絶の影響を治療するために、対象に投与される追加の薬剤または治療的処置には、血栓の除去、血流の促進、１つ以上の抗炎症剤の投与、１つ以上の抗酸化剤の投与、および興奮毒性を低減するのに有効な１つ以上の薬剤の投与などの治療が含まれるが、これらに限定されない。

【0131】

「対象」という用語は、ヒトを指し、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタならびにマウスおよびラットを含むがこれらに限定されないげっ歯類などであるがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物、ならびに鳥類、家禽、爬虫類、および両生類などであるがこれらに限定されない非哺乳類動物も指す。

【0132】

本発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例において例示される。これらの実施例は、例示目的で提供されており、本発明の組成物および方法の範囲に対する限定とは見なされない。

【実施例】

【0133】

材料および方法
実験動物
５×ＦＡＤマウスは、ヒトＡＰＰに３つの変異［スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、ロンドン（Ｖ７１７Ｉ）およびフロリダ（Ｉ７１６Ｖ）］を有し、ヒトＰＳ１タンパク質に２つの変異（Ｍ１４６ＬおよびＬ２８６Ｖ）を有する。これらの５×ＦＡＤトランスジェニックマウスは、アミロイド病理学、神経変性、ならびに学習および記憶障害を含むＡＤの主要な特徴を再現し、したがって、古典的なＡＤ動物モデルとして機能する（Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２６：１０１２９－１０１４０（２００６））。

【0134】

ウイルスベクター構築物および産生
ＧＦＡＰ発現細胞を特異的に標的とするために、Ｃｒｅ－組換え酵素依存性ＡＡＶベクターを構築した。変換因子は、これらのフリップ切除（ＦＬＥＸ）ベクターにおいてアンチセンス方向に挿入され、２対の反平行な異型ｌｏｘＰ部位に隣接する（Ａｔａｓｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８：７０２５－７０３０（２００８））。Ｃｒｅ遺伝子をグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のプロモーターの下に配置し、変換因子またはＧＦＰ対照遺伝子を各個々のベクターのＣＡＧプロモーターの下に配置した。まず、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂ）のＭｌｕｌ部位とＳａｃｌｌ部位との間のＣＭＶプロモーターを置き換えるために、ｐＤＲＩＶＥ－ｈＧＦＡＰプラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｉｎｃ）からのｈＧＦＡＰプロモーターを挿入した。ＰＣＲを適用して、ｈＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃４０５９１、Ｄｒ．Ａｌｂｅｅ Ｍｅｓｓｉｎｇからの贈与）からのＣｒｅ遺伝子をクローニングし、次いでｐＡＡＶ－ｈＧＦＡＰ：：Ｃｒｅベクターを生成するために、ＣｒｅをｐＡＡＶ ＭＣＳのＥｃｏＲＩとＳａｌ１部位との間に挿入した。ＮｅｕｒｏＤ１，ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを、前の研究（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４：１８８－２０２（２０１４））に記載のレトロウイルス構築物からＰＣＲによってクローニングし、ｐＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＧＦＰおよびｐＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰベクターを構築した。ＮｅｕｒｏＤ１遺伝子をＰ２Ａ－ＧＦＰと融合させ、さらにサブクローニングし、ｐＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２８３０４、Ｄｒ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂｏｙｄｅｎからの贈与）のＫｐｎ１部位とＸｈｏ１部位との間に挿入した。すべてのプラスミド構築物を、検証のために配列決定した。組換えＡＡＶ９の産生のために、２９３ＡＡＶ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を培養した。すなわち、２９３ＡＡＶ９を、三重プラスミド、ｐＡＡＶ発現ベクター、ｐＡＡＶ９－ＲＣ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂ）、およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂ）でトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を培養培地から採取し、遠心分離し、続いて、それをドライアイス／エタノールまたは３７℃の水浴中に交互に保つことによって、４回の凍結融解を行った。次に、生のＡＡＶ溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ５５Ｔｉロータを用いて、不連続なイオジキサノール勾配で１時間、５４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって精製した。遠心分離後、ウイルスを含有する上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓによって濾過し、純粋なウイルスを得た。ｈＧＦＡＰ：：Ｃｒｅについてのウイルス力価は、ＣＡＧ：：ＦＬＥＸ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰについては１．２ｘ１０^１２ＧＣ／ｍＬ、１．４ｘ１０^１２ＧＣ／ｍＬ、およびＣＡＧ：：ＦＬＥＸ－ＧＦＰについては１．４ｘ１０^１２ＧＣ／ｍＬであり、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒＴＭ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって測定された。

【0135】

定位頭蓋内ウイルス注射
ウイルスの頭蓋内注射のためにマウスに対して手術を行った。マウスを、２．５％のアベチン（１０ｍＬ／ｋｇ）を用いた腹腔内注射によって麻酔し、次いで定位的設定に配置した。次いで、人工眼軟膏を、眼のカバーおよび保護のために塗布した。マウスを、前頭皮質領域の上の頭蓋骨上の４９個の中間線の頭皮切開およびドリル穴を手術した。各注射部位に、ウイルスの直接頭蓋内注射（５μＬシリンジおよび３４Ｇ針を介して）を適用した（ＡＰ：＋１．３ｍｍ、ＭＬ：１．４ｍｍ、ＤＶ：－１．０ｍｍ）。各部位について、総注射体積は２μＬであり、流速は、０．２μＬ／分で制御した。注射後、針を所定の位置にさらに１０分間保持し、次いで、部位からゆっくりと引き抜いた。

【0136】

免疫組織化学および定量化
マウスを１０ｍＬ／ｋｇの２．５％のアベルチンを用いて腹膜に注入することによって麻酔し、次いで氷冷した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で灌流して脳内の血液を洗い流し、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中の４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定した。脳組織を解剖し、次いで４％のＰＦＡを用いて４℃で一晩固定した。試料をさらに、Ｌｅｉｃａビブラトームにより４５μｍで矢状方向にスライスし、４℃で０．１ＭのＰＢ中に保存した。免疫染色について、脳スライス試料を、ＰＢＳで３回、各１０分間すすぎ、次いで、ブロッキング溶液（０．１ＭのＰＢＳ中、０．３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ、５％の正常ロバ血清、５％正常ヤギ血清の混合物）で、室温で２時間インキュベーションした。脳スライスを、以下の一次抗体とともに、４℃で、一晩［０．１ＭのＰＢＳ中、５％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）および正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で］さらにインキュベーションした。モノクローナル抗ＧＡＤ６７（マウス、１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５４０６）、ポリクローナル抗ＧＡＢＡ（ウサギ、１：１０００、Ｓｉｇｍａ、Ａ２０５２）、モノクローナル抗パルブアルブミン（マウス、１：２０００、Ｓｉｇｍａ、Ｐ３０８８）、ウサギモノクローナル抗βアミロイド１－４２（ウサギ、１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７００２５４）、ポリクローナル抗グリア線維性酸性タンパク質（ニワトリ、１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５５４１）、ポリクローナル抗Ｉｂａ１（ウサギ、１：５００、Ｗａｋｏ、０１９－１９７４１）、モノクローナル抗ｉＮＯＳ（マウス、１：５００、ＢＤ、６１０３２８）、ポリクローナル抗ＧＦＰ（ニワトリ、１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１３９７０）、モノクローナル抗ＮｅｕｒｏＤ１（マウス、１：５００、Ａｂｃａｍ、ａｂ６０７０４）、ポリクローナル抗ＩＬ１β（ウサギ、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ａｂ９７２２）、ポリクローナル抗ＭＡＰ２（ニワトリ、１：５００、Ａｂｃａｍ、ａｂ５３９２）、モノクローナル抗シナプトフィシン（マウス、１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３６８）、ポリクローナル抗小胞性グルタミン酸トランスポーター１（モルモット、１：３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ａｂ５９０５）、モノクローナル抗ニューロフィラメント２００（マウス、１：５００、Ｓｉｇｍａ、Ｎ０１４２）、モノクローナル抗Ｌｙ６ｃ（ラット、１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１５６２７）、ポリクローナル抗ＡＱＰ４（ウサギ、１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２０８１２）、ポリクローナル抗ダブルコルチン（ヤギ、１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－８０６６）、抗ネスチン（マウス、１：５００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ＭＯ１５０５６）、およびポリクローナル抗Ｋｉ６７（ウサギ、１：１０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１５５８０）。試料をＰＢＳで３回洗浄した後、次いで脳切片を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートした適切な二次抗体で、室温で２時間インキュベーションした。スライスをＰＢＳで３回洗浄した後、脳切片を、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ３６９３１によるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する退色防止封入剤を用いてスライド上に封入した。チオフラビン－ｓ染色については、上記の免疫組織化学プロトコルに従って、脳試料に対して共通の手順を実施した。組織切片を二次抗体中でインキュベーションした後、まず、試料をＰＢＳ（２μｇ／ｍＬ）中に希釈したチオフラビンｓによって、シェーカー上で１０分間洗浄した。次に、ＰＢＳを使用して脳試料を２回、各１０分間洗浄する。次いで、試料を、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐ３６９３４）でスライド上に封入した。蛍光画像を、Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ９０００ビューアおよびアナライザ）、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００）、またはＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ ＺＥＮ顕微鏡ソフトウェアによって取得および処理された画像）で取得した。共焦点取得パラメータ設定は、各個々の標的タンパク質免疫染色について同じままであった。第２章では、各試料について、（多くの変換されたニューロンが観察された）注射コアの１０００μｍ内の類似した皮質層での３つのランダムな位置で画像を撮影した。次いで、定量的なデータを平均化して、試料を表した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって同じ設定（ＩｍａｇｅＪ １．４６ｒ、Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）で画像をさらに分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってグラフ化した。

【0137】

ヒトＡβＥｌｉｓａ
ＡＤ＋ＧＧ－およびＡＤ＋ＧＧ＋同腹仔の脳由来の前頭皮質領域を単離し、１ｍＭのＰＭＳＦプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３６９７８）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ２７１４）を有するＮＰ４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＦＮＮ００２１）で溶解し、続いて４℃で、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＥＬＩＳＡ試験によるＡβ負荷の定量分析のために上清を収集した。ヒトＡβ４２ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＫＨＢ３４４１）およびヒトＡβ４０ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＫＨＢ３４８１）を、Ａβレベルの測定に適用した。ＥＬＩＳＡキットのプロトコルは厳密に従った。まず、抗原結合の目的で、Ａβ抗体（ＥＬＩＳＡキットに含まれる）でコーティングされたプレート中の対応するウェルに標準物質および試料を充填した。第２に、ヒトＡβ４２検出器抗体（または、対応してヒトＡβ４０抗体）をウェルに添加し、プレートをタップして溶液を完全に混合し、続いて室温でシェーカー上で３時間インキュベーションした。次いで、溶液を廃棄し、ウェルを１ｘ洗浄緩衝液で４回洗浄する。ＨＲＰコンジュゲート抗体を、室温で試料とともに３０分間インキュベーションし、続いて、ウェルを１ｘ洗浄緩衝液で４回洗浄した。次いで、安定化させた色原体を各ウェルに適用し、暗い場所で３０分間さらにインキュベーションした。各ウェル中の試料を停止溶液で処理した後、３０分以内にプレートを読み取って４５０ｎｍの吸光度を得、標準曲線を生成する（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。未知の試料のＡβ４２およびＡβ４０レベルを分析し、４５０ｎｍでの光学密度の値および標準物質ラダーの既知の濃度を用いて定量化した。各試料を２回繰り返し、平均値を分析した。

【0138】

脳スライス電気生理学
注射の約１ヶ月後、脳皮質領域を解剖し、脳スライス記録のためにＬｅｉｃａビブラトームで３００μｍにスライスした。低温切断溶液は、（ｍＭで）７５スクロース、８７ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、０．５ＣａＣｌ_２、７ＭｇＣｌ_２、２５ＮａＨＣＯ_３、１．２５ＮａＨ_２ＰＯ_４、および２０グルコースを含有した。（ｍＭで）１１９ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ_２ＰＯ_４、２６ＮＡＨＣＯ_３、１．３ＭｇＣｌ_２、２．５ＣａＣｌ_２、１０グルコースを含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中に脳スライスを維持し、９５％のＯ_２および５％のＣＯ_２でバブリングした。脳スライスをＡＣＳＦ中でインキュベーションし、次いで、（ｍＭで）１３５Ｋ－グルコネート、１０ＫＣｌ、５Ｎａ－ホスホクレアチン、１０ＨＥＰＥＳ、ＥＧＴＡ、ＭｇＡＴＰ、および０．５Ｎａ_２ＧＴＰを含有するピペット溶液（ｐＨ７．３、ＫＯＨで２９０ｍＯｓｍ／Ｌに調節）で、これらの試料上で全細胞記録を実施した。ピペット抵抗を３～５ＭΩ、直列抵抗を２０～４０ＭΩに設定し、電圧クランプの電位を－７０ｍＶに保持した。ｐＣｌａｍｐ９ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をデータ収集に利用し、Ｃｌａｍｐｆｉｔ、およびＳｙｎａｐｔｏｓｏｆｔソフトウェアを分析に使用した。成人脳スライスを、先のプロトコル（Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８３：２２１－２４２（２０１４））に従って調製した。要するに、１２～１４ヶ月齢の成人トランスジェニックマウスに、（ｍＭで）９３ＮＭＤＧ、９３ＨＣｌ、３０ＮａＨＣＯ_３、２０ＨＥＰＥＳ、１５グルコース、１２Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、７ＭｇＳＯ_４、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ_２ＰＯ_４、５アスコルビン酸ナトリウム、３ピルビン酸ナトリウム、２チオウレア、０．５ＣａＣｌ_２、ｐＨ範囲７．３～７．４、３００ｍＯｓｍｏであり、９５％のＯ_２／５％のＣＯ_２でバブリングした、切断溶液を経心臓灌流した。マウスの脳をさらに解剖し、切断溶液中で３００μｍに切断し、室温でインキュベーションした。脳スライスを切断溶液中で収集し、１２～１５分間、３２～３４℃でインキュベーションした。連続して９５％のＯ_２／５％ＣＯ_２バブリングしながら、（ｍＭで）９２ＮａＣｌ、３０ＮａＨＣＯ_３、２０ＨＥＰＥＳ、１５グルコース、１２Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ_２ＰＯ_４、５アスコルビン酸ナトリウム、２チオウレア、３ピルビン酸ナトリウム、２ＭｇＳＯ_４、および２ＣａＣｌ_２の保持溶液中でスライスを保持した。保持溶液中で試料を０．５時間回復した後、パッチクランプ記録を、（ｍＭで）１２４ＮａＣｌ、２６ＮａＨＣＯ_３、１０グルコース、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．３ＭｇＳＯ_４、および２．５ＣａＣｌ_２の標準ａＣＳＦ中で行った。

【0139】

ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡ合成にはＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｑＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘを使用した。ｃＤＮＡを合成するために、各試料について２０μＬの総反応体積で１μｇのＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡを合成するためのプログラム設定は、２５℃で５分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間、４℃で保持であった。ｃＤＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まないＨ_２Ｏを使用してさらに５回希釈した。定量的リアルタイムＰＣＲに使用されるプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって設計された。Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰｅｒｆｅＣＴａＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、ＲＯＸＴＭを含む試薬をこの実験に使用した。１μｇの全ＲＮＡに対応する５μＬのｃＤＮＡを、２５μＬの総反応体積で使用した。プログラムパラメータは、９５℃で１５秒間、増幅のための６５℃で４５秒間の４０回のＰＣＲサイクルであった。ＰＣＲサイクル後、溶融曲線をチェックし、各標的遺伝子の比較Ｃｔ値を測定した。内部対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用し、ＤＭＳＯ処理された対照群における遺伝子発現に関して相対遺伝子発現を分析した。定量的リアルタイムＰＣＲデータは、各試料について２回のＰＣＲ反応の複製を有した。

【0140】

データ分析
データを平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。２群比較における統計分析に、スチューデントのｔ検定を用いた。一元配置ＡＮＯＶＡまたは二元配置ＡＮＯＶＡ分析を、複数の群間の比較に適用した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で設定した。嗅覚行動試験では、交差馴化指数のＦ値およびＰ値の計算のために、ＳＰＳＳソフトウェアを介して、ＬＳＤ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。統計学的有意性は、＊とラベル付けしたｐ＜０．０５、＊＊とラベル付けしたｐ＜０．０１、＊＊＊とラベル付けした．ｐ＜０．００１で設定した。すべての行動試験および分析は、盲検的に実施された。

【0141】

実施例１－アルツハイマー病マウスモデルにおけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の有益な効果
反応性グリアにおけるＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現は、５×ＦＡＤマウスの脳における星状細胞からニューロンへの変換を高効率で可能にする
ＡＤの脳において、典型的な特徴には、神経膠症、ニューロン損失、アミロイドプラーク、および細胞内神経原線維変化が含まれる。神経膠症は、ヒトＡＤ皮質（Ｃａｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：１７７６２（２０１７））および５×ＦＡＤマウスおよびＴｇ２５７６ ＡＤマウスなどのＡＤトランスジェニックマウスモデル（Ｇａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：５２３－５２７（１９９５）、Ｎｕｓｓｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５：６５１－６５５（２０１２）、およびＯａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２６：１０１２９－１０１４０（２００６））において高度に増強されることが報告されている。特に、５×ＦＡＤマウスの脳におけるアミロイド沈着および神経膠症は、２ヶ月齢で始まり、大部分は、より深い皮質層および鉤状回領域に蓄積される。さらに、ニューロンの数は、病理学的進行中に５×ＦＡＤの脳において年齢とともに減少する（Ｏａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２６：１０１２９－１０１４０（２００６））。異常に増加した星状細胞の数および低減したニューロンの数は、脳の内側のニューロンと星状細胞との間の不均衡な比率をもたらし、これはさらに脳回路の機能障害を説明する。したがって、反応性星状細胞のニューロンへの直接インビボ変換によって、過剰な反応性星状細胞が低減し、５×ＦＡＤの脳におけるニューロンの損失の補充に利用されると仮定した。

【0142】

この目標を達成するために、ＣＡＧプロモーター下でＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰまたはＧＦＰ偽対照を発現するＡＡＶ９ベクター（それぞれＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ－ｌｏｘＰまたはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ＧＦＰ－ｌｏｘＰ）とともに反応性星状細胞ＧＦＡＰプロモーター（ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ）の制御下でＣｒｅを発現するアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを設計し、構築した。したがって、ＧＦＰ対照群では、ＧＦＰのみが反応性星状細胞において過剰発現される（ＧＦＡＰ＋細胞）が、ＮｅｕｒｏＤ１およびＧＦＰは、ＮｅｕｒｏＤ１群における反応性星状細胞において共発現される（図１Ａ）。定位注射は、マウスの脳皮質領域で行われた（座標：Ｌ／Ｒ：±１．４、Ａ／Ｐ：＋１．３、ＤＶ：－１．０ｍｍ）（図１Ｂ）。５×ＦＡＤの皮質のこのサブ領域では、アミロイドプラークの重い負荷がすでに蓄積しており、星状細胞は、かかる病理学的状態における星状細胞の過活性状態を示す、細長く、より厚い突起を有する拡大した細胞体の非定型的な形態を示した。次に、注射の３０日後に、脳組織試料を解剖し、免疫染色を行い、５×ＦＡＤマウスの脳における注射領域におけるＮｅｕｒｏＤ１発現レベルを検査した。以前のデータ（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４：１８８－２０２（２０１４））で裏付けられたように、反応性星状細胞は、３０ｄｐｉでＮｅｕｒｏＤ１過剰発現によって効率的にニューロン形態様細胞に変換されている。特に、ＧＦＰ過剰発現を有する星状細胞は、ＧＦＰ対照群においてグリア形態のままである（図１Ｃ）。感染した細胞および変換された細胞をさらに同定するために、それぞれ、ＧＦＰを有する反応性星状細胞マーカーのＧＦＡＰ、ＧＦＰを有する成熟ニューロンマーカーのＮｅｕＮ（ニューロン核）の共免疫染色を行った。代表的な画像は、感染した細胞の大部分がＧＦＡＰ＋（反応性星状細胞マーカー、マゼンタ色）であるという観察に基づいて、ＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ系が星状細胞において高い特異性を有することを示している（図１Ｄ）。興味深いことに、ＮｅｕｒｏＤ１過剰発現（カラーで見た場合、赤色に染色）を有する感染した反応性星状細胞は、３０ｄｐｉまでに５×ＦＡＤの皮質において、成熟ニューロン（ＮｅｕＮ＋、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）へ成功裏に変換されている（図１Ｅ）。変換されたニューロン（明視野位相画像、２５ｄｐｉ）（図１Ｆ）上の電気生理学的研究において、活動電位の代表的な追跡（図１Ｇ）、ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣ（図１Ｈ）を記録した。まとめると、上記のデータは、ＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現が、１ヶ月以内に５×ＦＡＤの皮質において、高効率で、反応性星状細胞から成熟および完全な機能的ニューロンへの直接インビボ変換を可能にすることを確認している。

【0143】

ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの脳における星状細胞の過活性状態を改善した
脳において、健康な星状細胞は、正常なニューロン伝達、シナプス生理学、およびエネルギー代謝を維持および制御する上で重要な役割を果たす（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０：７７４－７７８（２０１０））。しかしながら、ＡＤの脳の病理学的背景において、異常な過活性星状細胞およびアストログリオーシスが広く報告されている（Ｂｕｒｄａ ａｎｄ Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｎｅｕｒｏｎ，８１：２２９－２４８（２０１４））。星状細胞に対するこれらの異常な変化は、グルタミン酸塩およびＧＡＢＡのリサイクル、カリウム緩衝、ならびにさらにコリン作動性調節およびカルシウム調節を変化させることを含む、正常な脳機能およびシグナル伝達経路にも干渉する（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１２１－１４１（２０１６））。反応性星状細胞の機能的ニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの脳において反応性星状細胞の数および星状細胞の過活性状態を低減させることによって、脳に利益をもたらすことができると仮定した。ここでｓは、発明者らの研究が、反応性星状細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現が、５×ＦＡＤの脳における反応性星状細胞を機能的成熟ニューロンに効率的に変換することができることを示している。この大発見で先端の技術が、ＡＤの潜在的な治療方法として適用され得るかどうかを調査するために、ＮｅｕｒｏＤ１によって誘導されるインビボ直接細胞変換後の有益な効果をさらに検査する。際だったことに、注射コア領域付近の反応性星状細胞に対するいくつかの有益な効果が、注射の６０日後に観察された（ここでは、早い時点（約６０ＤＰＩ）で観察することができる有益な効果を、短期的な有益な効果として定義した）（図２Ａおよび図２Ｂ）。まず、ＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現によって過剰な反応性星状細胞が成熟ニューロンに変換されたため、反応性星状細胞の数は、ＮｅｕｒｏＤ１群において減少した（図２Ｃおよび２Ｄ：ＧＦＰ対照群におけるＧＦＡＰ＋細胞数：４５．５±１．０、ＮｅｕｒｏＤ１群におけるＧＦＡＰ＋細胞数：３０．３±１．１、Ｎ＝８、ｐ＜０．００１）。次に、ＮｅｕｒｏＤ１群における残りの反応性星状細胞は、細胞体の拡大が少なく、より薄い突起の形態を示し、ＧＦＰ対照群と比較した場合、反応性星状細胞の過活性状態が改善されたことを示した（図２Ｃ～図２Ｆ：ＧＦＰ対照群におけるＧＦＡＰ＋のカバー区域のパーセンテージ：２１．０±１．９、ＮｅｕｒｏＤ１群におけるＧＦＡＰ＋がカバー区域のパーセンテージ：６．４±１．１、Ｎ＝８、ｐ＜０．００１。ＧＦＰ対照群におけるＧＦＡＰ＋強度：５７．２±４．８、ＮｅｕｒｏＤ１群におけるＧＦＡＰ＋強度：１８．３±３．２、Ｎ＝８、ｐ＜０．００１）。

【0144】

ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの脳におけるニューロンプールを補充することができる
過剰な反応性星状細胞が劇的に低減したという知見とともに、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換群におけるニューロンの有意な増加も観察した。ここでは、ＮｅｕｒｏＤ１介入後のいくつかの異なる時点（３０ｄｐｉ、６０ｄｐｉ、９０ｄｐｉ、データは示さず）を慎重に検査し、６０ｄｐｉまで、広いニューロン誘導が観察され得ることを見出した。５×ＦＡＤマウスは、早ければ１．５ヶ月に細胞内β－アミロイド産生を開始し、２ヶ月齢で細胞外アミロイドプラークを形成し始めた。６ヶ月齢までに、アミロイドプラークの重い負荷が５×ＦＡＤマウスの脳の皮質全体に沈着し、徐々にニューロン損失をもたらした。ＮｅｕｒｏＤ１群は、ＧＦＰ対照群と比較した場合に、処置された脳領域におけるニューロンの数の有意な増加を示す（図３Ｂおよび図３Ｃ）。したがって、病理学的状態における異常なニューロンおよび星状細胞比は、ＮｅｕｒｏＤ１介入後に逆転した（図３Ｄ）。発明者らの戦略は、過剰な反応性星状細胞を変換することによってニューロンプールを補充し、これは、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の別の有益な特徴である。

【0145】

ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、５×ＦＡＤの皮質においてのＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換によって生成され得る
複数の証拠は、ＡＤの発症の間のＧＡＢＡ作動性ニューロンの損失（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，９２：１１４－１２５（２０１６）、およびＶｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４９：７０８－７２１（２０１２））、ならびにＧＡＢＡの合成（Ｌｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０９：１００７１－１００７６（２０１２））および輸送（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，５：４１５９（２０１４））の変化を含む、ＡＤの脳においてＧＡＢＡ作動性系が激しく変化することを示唆している。したがって、発明者らの戦略がＡＤマウスの脳において適正なＧＡＢＡ作動性ニューロンも再生することができるかどうかを疑問視した。この懸念に対処するために、成熟ニューロンマーカーのＮｅｕＮおよびＧＡＢＡ作動性マーカーのＧＡＢＡの共免疫染色を実施した（図４Ａ）。興味深いことに、現存のＧＡＢＡ作動性ニューロン（図４Ｂ、矢印、ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）に加えて、変換されたニューロンの群（図４Ｂ、矢印ヘッド、ＧＦＰ＋、ＧＡＢＡ＋およびＮｅｕＮ＋細胞）も、残りのＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞体におけるＧＡＢＡレベルと比較して、細胞体における同様のレベルのＧＡＢＡを発現する（ＧＡＢＡ免疫蛍光によって示される）。変換されたニューロンのうちのいくつかがＧＡＢＡ作動性であることをさらに検証するために、ＧＡＢＡ作動性マーカーのＧＡＤ６７を適用し、いくつかの変換されたニューロンがＧＡＤ６７免疫陽性であることを見出した。この観察は、ＮｅｕｒｏＤ１が、５×ＦＡＤマウスの皮質における星状細胞をＧＡＢＡ作動性ニューロンに変換することができることを示している。変換されたニューロンのうち、１８．５％±２．１％がＧＡＢＡ＋ニューロンであり、これは、非病理学的マウスの脳における総皮質ニューロンにおけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの割合と同様である。したがって、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤの皮質領域における適正な数のＧＡＢＡ作動性ニューロンを再生して、ＧＡＢＡ作動性ニューロンプールを補充することができる。

【0146】

ＮｅｕｒｏＤ１処置された５×ＦＡＤは、脳における異常な凝集が少ない
ＧＦＰ対照群とＮｅｕｒｏＤ１媒介の変換群との間の星状細胞およびニューロンの変化の比較中に、５×ＦＡＤマウスの皮質における定位注射の６０日後に、ＧＦＰ対照群の内側に大量の異常なＧＦＰ標識大凝集体（カラーで見た場合、緑色に染色）を予期せず発見した（図５）。しかしながら、この現象は、ＮｅｕｒｏＤ１群において大幅に低減された。この新規の知見は、ＮｅｕｒｏＤ１処置されたＡＤの脳におけるより健康な局所環境を示唆する。異常なＧＦＰ凝集体の供給源は、ＡＤの病理学的状態においてＧＦＰ感染細胞の破片、またはＡＤの病理学の進行中にＧＦＰ破片を取り込む他の細胞である可能性があり、さらなる同定が必要である。

【0147】

新たに変換されたニューロンは、５×ＦＡＤの皮質における細胞内Ａβ負荷が少ない
上記の興味深い観察によれば、ＮｅｕｒｏＤ１によって媒介される細胞変換は、異常な反応性星状細胞を低減させ、ニューロンを補充し、したがって、星状細胞とニューロン細胞との間の正常な通信を再構築することによって、より健康な環境を脳に提供し得るとさらに仮定する。以前の研究では、反応性星状細胞（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１０：４２７（２０１７））および活性化ミクログリア（Ｖｅｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５２：３５５－３６１（２０１７））は、ＡＤ、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症を含む多くの神経変性疾患におけるアミロイド毒性の進行において重要な役割を果たしていることも報告されている（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４１：４８１－４８７（２０１７））。一方で、アミロイドβの存在は、細胞内シグナル伝達経路および星状細胞の正常な機能を妨げる。一方、反応性星状細胞は、アミロイド前駆体タンパク質、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ１）、およびγセクレターゼを含む、Ａβ産生に必要な３つの成分のレベルが増加している（Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｌｉ，Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．，７（２０１７））。次に、反応性星状細胞をニューロンにリプログラミングする発明者らの戦略が、５×ＦＡＤマウスの脳におけるアミロイド産生および進行に影響を及ぼし得るかどうかを調査した。Ａβが細胞外に沈着していることはよく認識されており、このペプチドがニューロン内にも蓄積する可能性があり（ＬａＦｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：４９９－５０９（２００７））、かつシナプス機能障害およびニューロン損失を含む疾患進行を促進する可能性がある（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｗｉｒｔｈｓ，Ｆｒｏｎｔ．Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２：８（２０１０））ことを示す証拠が増えてきている。この質問に答えるために、さらに、ニューロンマーカーのＮｅｕＮおよびβ－アミロイド（Ａβ４２）の共免疫染色によって細胞内Ａβ負荷を検査した。各脳試料の感染コアにおけるすべてのニューロンの細胞内Ａβレベルを注意深く測定し、分析した。驚くべきことに、ＮｅｕｒｏＤ１変換された新規ニューロンにおいては、最小レベルの細胞内Ａβ４２のみが検出され、一方、ＧＦＰ対照群における既存のニューロンは、大量の細胞内Ａβ４２を含有する（図６Ａおよび図６Ｄ、ＧＦＰ対照群における３匹の５×ＦＡＤマウス由来のニューロンの数＝６６２、ＮｅｕｒｏＤ１群における３匹の５×ＦＡＤマウス由来のニューロンの数＝１３５７、６０ＤＰＩ）。さらに、ＮｅｕｒｏＤ１処置された群において、既存のニューロンにおける細胞内Ａβ４２レベルも低減された（図６Ａおよび図６Ｅ、ＧＦＰ群の感染コアにおけるすべての既存のニューロンにおける細胞内Ａβ４２強度：４３．１±０．７、ＧＦＰ対照群における３匹の５×ＦＡＤマウス由来の分析された既存のニューロンの数＝６６２）。ＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおけるすべての既存のニューロンにおける細胞内Ａβ４２強度：２４．２±０．１、ＮｅｕｒｏＤ１群における３匹の５×ＦＡＤマウス由来の分析された既存のニューロンの数＝７１４。ＮｅｕｒｏＤ１群の感染コアにおいてすべての変換されたニューロンの細胞内Ａβ４２強度：２７．０±０．２、ＮｅｕｒｏＤ１群における３匹の５×ＦＡＤマウス由来の分析された変換されたニューロンの数＝６４３）、反応性星状細胞を減少させることは、β－アミロイドの病理学的進行を逆転させるか、または少なくとも遅延させることができることを示唆している。

【0148】

ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの皮質における炎症促進性ミクログリアを低減する
豊富なアミロイド沈着物および過剰な反応性星状細胞に加えて、アルツハイマー病の脳はまた、炎症応答によって特徴付けられる。この免疫応答は、ＡＤの病理学的進行に密接に関与する脳の固有の骨髄細胞（ミクログリア）によって主に駆動される。アミロイドβは、二次刺激に対してより感受性にすることによってミクログリアをプライミングし、それらの活性化を促進することができる。ミクログリアに対するそのようなプライミング効果は、これらの細胞を介して炎症促進性ケモカインおよびサイトカインの一定の産生をもたらし、これはさらに、病因の加速および疾患の進行の悪化をもたらす。さらに、これらの増加したサイトカインは、ＡＤの病理学的進行中のプライミングされたミクログリアの反応状態の維持に寄与する（Ｈｅｐｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：３５８－３７２（２０１５））。したがって、まず、一般的なミクログリアマーカーのＩｂａ１（図７Ａ、カラーで見た場合、灰色に染色）および炎症促進性ミクログリア亜型マーカーのｉＮＯＳ（図７Ａ、カラーで見た場合、赤色に染色）を共免疫染色することによって、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の直接細胞変換が、５×ＦＡＤの皮質における免疫応答に対して任意の有益な効果を有するかどうかを試験した。ミクログリア（図７Ａ、Ｉｂａ１＋細胞、カラーで見た場合、灰色に染色）は、両群において同様の強度のままであり、一方で、ＮｅｕｒｏＤ１群においては、ミクログリアの活性状態（活性化されたミクログリアは、典型的には、細胞体の異常な拡大およびより厚い突起を示す）は、有意な統計学的差異ではないと結論付けられ得るが、僅かに低減された。しかしながら、炎症促進性ミクログリア亜型マーカーであるｉＮＯＳの免疫蛍光は、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換後にほぼ低減され、ＡＤマウスの脳におけるＮｅｕｒｏＤ１処置下で炎症促進性応答が緩和されることを示唆している。

【0149】

炎症促進性サイトカインＩＬ－１βは、５×ＦＡＤの皮質におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換後に下方調節された
近年、インビトロ（ｖａｎ Ｇｉｊｓｅｌ－Ｂｏｎｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，１２：ｅ０１７５３６９（２０１７））およびインビボ（Ｍｅｄｅｉｒｏｓ ａｎｄ ＬａＦｅｒｌａ，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２３９：１３３－１３８（２０１３）、Ｓｔａｍｏｕｌｉ ａｎｄ Ｐｏｌｉｔｉｓ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｅ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｉ，２７：２６４－２７５（２０１６））の証拠の蓄積は、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む炎症促進性サイトカインのレベルの増加が、ＡＤの病理学的進行において役割を果たしているという概念を支持した。かかる炎症促進性サイトカインのレベルの増加は、アミロイドベータの食作用を一時停止させることによってＡＤの脳を妨げる（Ｓｔａｍｏｕｌｉ ａｎｄ Ｐｏｌｉｔｉｓ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｅ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｉ，２７：２６４－２７５（２０１６））。複数の炎症促進性サイトカインの中でも、インターロイキンがＡＤにおける星状細胞、ニューロンおよびミクログリア間の複雑な細胞間相互作用に密接に関与しているため、特にＩＬ－１βに興味があった。増強されたインターロイキンレベルは、ミクログリアによるアミロイドプラークの除去の有効性に影響を与え、アストログリオーシスおよび神経死を増加させる。さらに、インターロイキンは、ＡＤの病理学の炎症性カスケードの特徴の促進に必要な細胞内シグナル伝達事象を調節する（Ｓｔａｍｏｕｌｉ ａｎｄ Ｐｏｌｉｔｉｓ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｅ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｋｉ，２７：２６４－２７５（２０１６））。５×ＦＡＤマウスの脳におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の変換後の炎症促進性応答に関する有益な効果を研究するために、注射の６０日後に反応性星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）およびインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）の共免疫染色を行うことによって、炎症促進性変化を検査する。驚くべきことに、反応性星状細胞（ＧＦＡＰ＋細胞、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）がほとんど低減したという以前の知見と並行して（図８Ａおよび図８Ｂ）、インターロイキン－１βレベルの顕著な減少（カラーで見た場合、赤色に染色、ＧＦＰ対照群におけるＩＬ－１β強度：６２．７±５．０、ＮｅｕｒｏＤ１群におけるＩＬ－１β強度：２４．３±２．８）はまた、５×ＦＡＤマウスの皮質の処置領域において、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換後の反応性星状細胞の内側でも観察された。まとめると、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換は、５×ＦＡＤマウスの脳におけるＡβ負荷の低減の基礎にある潜在的なメカニズムであり得る炎症促進性サイトカインＩＬ－１βを低減することによって、ＡＤの脳に利益をもたらす。

【0150】

ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンは、５×ＦＡＤマウスの脳において８ヶ月超生存した
本明細書に記載されるように、反応性星状細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１過剰発現は、機能的ニューロンへの効率的な変換を達成し、細胞内Ａβ負荷を減少させ、注射の２ヶ月後までに５×ＦＡＤの脳における炎症促進性応答を改善し得る。さらに、変換されたニューロンが長期間後に５×ＦＡＤマウスの脳で生存できるかどうか、および長期間にどのような対応する有益な効果が観察され得るかを疑問視した。質問に答えるために、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＧＦＰと混合したＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－Ｃｒｅまたは２４ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰと混合したＡＡＶ９－ＧＦＡＰ－Ｃｒｅのいずれかの皮質領域（座標：Ｌ／Ｒ：±１．４、Ａ／Ｐ：１．３、ＤＶ：－１．０）へのインサイチュ送達を、定位注射を介して適用した。脳試料は、さらなる調査のために約８ヶ月後に収集された。免疫蛍光分析により、ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンは、注射の８ヶ月後で依然として生存し得ることが示された。変換されたニューロンは、複数の神経突起を有する健康なニューロン形態を有し（図９Ｃおよび図９Ｄ、カラーで見た場合、緑色に染色）、ＮｅｕｒｏＤ１の高い発現レベルを維持した（図９Ｃ、カラーで見た場合、赤色に染色）（図９Ｄ、カラーで見た場合、マゼンタ色に染色）。対照的に、注射の８ヶ月後にＧＦＰ凝集体の大きな負荷が、ＧＦＰ対照群において観察された。この長期的な処置群において、異常なＧＦＰ凝集体が２つの潜在的な供給源：（１）細胞の内側でのＣｒｅ毒性の一定の蓄積に起因する、死んだ感染した星状細胞の破片、および／または（２）ＧＦＰ対照群における漏出したニューロンの萎縮神経突起からくるものか疑った。Ｃｒｅは、ＧＦＡＰプロモーターの下（反応性星状細胞の内側）でのみ過剰発現されると考えられている。しかしながら、注射後の長期間に、Ｃｒｅは、死んだ星状細胞から周囲領域に放出され、結果として周囲のニューロンに取り込まれる可能性がある。したがって、ＧＦＰ対照群における既存のニューロンのうちのいくつかは、ＧＦＰ発現も有する可能性がある。しかしながら、それらは、免疫染色データによって支持されるＮｅｕｒｏＤ１の過剰発現を得られない（図９Ｃおよび図９Ｄ）。ＡＤの病理学的状態におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の長期的な有益な効果に興味があるため、このＣｒｅ－ｌｏｘＰ系における微妙に漏出した標識化問題の代わりに、ニューロンおよび病理学的マーカーの変化の検査および比較に焦点を当てた。

【0151】

５×ＦＡＤの皮質における軸索、樹状突起およびシナプスに対するＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換の長期的な効果
ＡＤの脳において、シナプスは尊いものであり、ＡＤの病理学的進行中に徐々に低減した。ニューロン神経突起およびシナプスの喪失は、ＡＤおよび認知症における学習および記憶の障害をもたらす（Ｍｉｔｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，３４：２３４１－２３５１（２０１３）、およびＰａｌｏｐ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３：８１２－８１８（２０１０））。ＡＤにおけるこの症状は、３つの主な原因で説明され得る。（１）正常な星状細胞は、ニューロンの生存および増殖を促進し、シナプスの形成および機能を促進し、シナプスおよびミエリン破片の除去を助ける（Ｌｉｄｄｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４１：４８１－４８７（２０１７））。しかしながら、ＡＤの背景にある機能障害の反応性星状細胞は、この細胞間調節を中断し、シナプスの形成および維持を妨げる可能性がある。（２）ミクログリアは、ほとんどの組織マクロファージのように、シナプスを保護および再構築することによって、ＣＮＳの恒常性および可塑性を支持することができる。さらに、正常な機能的ミクログリアによって合成される脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、学習関連のシナプス形成を促進するためにも重要である（Ｐｒｉｎｚ ａｎｄ Ｐｒｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：３００－３１２（２０１４））。以前の研究では、ＢＤＮＦなどの神経栄養因子の欠乏は、シナプス喪失をもたらし、シナプス機能を途絶するニューロンの完全性を著しく損なう可能性があることを報告している（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５５：１５９６－１６０９（２０１３））。（３）他のカスケード分子またはタンパク質、例えば、シナプスに局在するＣ１ｑおよびＣ３は、シナプス排除を調節し得る（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：７１２－７１６（２０１６））。しかしながら、この機能はＡＤの状態において中断される。ＮｅｕｒｏＤ１媒介の変換が、５×ＦＡＤの脳における適正なニューロンの神経突起およびシナプスを維持するために長期的に有益な効果を有するかどうかを研究するために、ここで、インビボ介入の８ヶ月後に免疫染色によって軸索、樹状突起、およびシナプス密度の変化を検査した。特に、シナプス変化の検査のために、全体的なシナプスマーカーとしてシナプトフィシン、および興奮性シナプスマーカーとしてｖＧｌｕＴ１を試験した。軸索は、ニューロフィラメント２００（ＮＦ２００、図１０Ａ、カラーで見た場合、サファイア色に染色）によって標識されるが、樹状突起は、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、図１０Ｂ、カラーで見た場合、サファイア色に染色）免疫陽性である。Ａβ凝集体を、チオフラビン－ｓ染色によって明らかにした（図１０Ａおよび図１０Ｂ、カラーで見た場合、青色に染色）。全体的なシナプスマーカーのシナプトフィシンの強度の有意な増加が観察された（図１０Ａ、カラーで見た場合、赤色に染色）。シナプトフィシンの増加した強度に従って、興奮性シナプスマーカーのｖＧｌｕＴ１（図１０Ｂ、カラーで見た場合、赤色に染色）はまた、ＮｅｕｒｏＤ１処置後にかなり増強された強度を示した。また、５×ＦＡＤマウスが６ヶ月齢のとき（注射の２ヶ月後）、軸索、樹状突起、およびシナプスの変化を調査した。しかしながら、ＧＦＰ対照群とＮｅｕｒｏＤ１群との間に有意差は観察されなかった。考えられる理由の１つは、神経変性およびシナプス損失が、５×ＦＡＤマウスがまだＡＤの病理学的進行の初期段階または中間段階である場合はそれほど重度ではないことである。これらの有益な効果は、５×ＦＡＤマウスを大幅により長い時間処置した場合に拡大され、それらがより多くのニューロンおよびシナプスの損失を含む重度な症状を発症するＡＤの病理学的進行の後期段階で検査された。まとめると、これらのデータは、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換が、（１）より健康な脳環境に起因する既存のニューロンのシナプスを維持および保存すること、ならびに（２）変換によってより多くの新たなニューロンが生成されるときに新たなシナプスを増加させることによって、シナプス密度を増加させることを示している。ＮＦ２００およびＭＡＰ２の強度もまた、ＮｅｕｒｏＤ１群において増強され、これは、軸索および樹状突起の両方が、ＮｅｕｒｏＤ１処置後に増加したことを示唆している。したがって、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の発明者らの治療戦略は、脳におけるニューロンの完全性をより良好に維持するための適正な軸索、樹状突起、およびシナプスの維持、保護、および生成において有益で支持的な役割を果たし、ＡＤ患者の潜在的な療法として役立ち得る。

【0152】

本明細書で実証されるように、本明細書に記載の方法および材料を使用して作製された新たなニューロンは、神経学的状態の破壊的ＣＮＳ環境（例えば、ＡＤの脳の破壊的環境）に耐える特性を有するニューロンであり得る。さらに、本明細書に記載の方法および材料を使用して、神経学的状態（例えば、ＡＤ）を有する哺乳動物の脳内のニューロンおよび／または星状細胞の恒常性を再建し得る。

【0153】

ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換は、５×ＦＡＤマウスの皮質における血管形態を保護する
初期の研究は、ＡＤの病因が、Ａβの蓄積および沈着、神経変性、ミクログリアおよび星状細胞の活性化、ならびに重要なことに、血管の退縮および変性で特徴付けられることを明らかにした。血管壁におけるＡβ沈着は、脳アミロイド血管障害としても知られている（Ｊａｕｎｍｕｋｔａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２５：２４７－２５０（２０１５））。血管の周りを囲む蓄積されたアミロイド－βの毒性は、神経血管ユニットに対して有害な影響を示し、内皮細胞および周皮細胞の変性を介して血管の完全性および機能障害をもたらした（Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３０：１４３６－１４４３（２０１２））。さらに、別の研究は、正常な星状細胞は、血管平滑筋細胞および周皮細胞とともに、血管の直径、血流、および神経血管の可塑性の調節に重要な役割を果たすものであることを報告した（Ｋｉｍｂｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１３８：３７１６－３７３３（２０１５））。したがって、ＡＤの脳においては、肥大した反応性星状細胞およびアミロイドプラークの蓄積が血管周囲を囲み、酸化誘導性炎症が血管の形態的途絶および血管応答不良をもたらす（Ｍａｒｃｈｅｓｉ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２５：５－１３（２０１１））。ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換による反応性星状細胞の低減が、血管の完全性に対する障害を緩和し得るかどうかを調査するために、ＮｅｕｒｏＤ１またはＧＦＰ対照介入の８ヶ月後で、５×ＦＡＤの脳試料上での血管マーカーのリンパ球抗原６複合体（Ｌｙ６Ｃ）および反応性星状細胞末端足マーカーのアクアポリン４（ＡＱＰ４）の共免疫染色によって血管の完全性を検査した（図１１）。驚くべきことに、ＧＦＰ対照群におけるより短いＬｙ６ｃ＋およびＡＱＰ４＋セグメントとは対照的に、ＮｅｕｒｏＤ１群は、大幅により長いＬｙ６ｃ＋およびＡＱＰ４＋セグメントを示し、血管の完全性がＮｅｕｒｏＤ１群においてより良好に保存されることを示唆した（図１１）。まとめると、本明細書で提供される結果は、血管完全性におけるＮｅｕｒｏＤ１媒介の細胞変換の保護的役割を実証している。野生型の完全なままのマウスの脳も対照として検査した。

【0154】

実施例２－ＮｅｕｒｏＤ１ ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢの複数回の頭蓋内注射によるＡＤマウスの脳の全体的な感染
マウスの脳におけるニューロン変換のために星状細胞を全体的に標的化するために、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ ＦＬＥＸ系（図１２Ａおよび図１２Ｂ）および複数回の頭蓋内注射（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）をこの研究において適用した。マウスの脳においてＮｅｕｒｏＤ１およびＧＦＰ（対照）を異所的に発現させるためにＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢを選択した。ＦＬＥＸ ＧＦＰおよびＮｅｕｒｏＤ１ ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢをＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳内に注射した。注射の１５日後（ｄｐｉ）、マウスの脳を組織学的分析のためにスライスした。注射された領域の周囲の矢状切片および冠状切片の免疫組織化学的分析は、ＧＦＰ陽性細胞が、ＧＦＰおよびＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ注射されたマウスの脳の両方において広い区域で検出可能であることを示した。これらの結果は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢの複数回の頭蓋内注射が、マウスの脳を介して広範な感染を達成することを示す。

【0155】

ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスの脳における全体的な星状細胞からニューロンへの変換
ＮｅｕｒｏＤ１が全体的に星状細胞をニューロンに変換できるかどうかを試験するために、免疫染色によってマウスの脳の種々の区域を検査した。ＧＦＰ陽性細胞のほぼすべてが、ＧＦＰ処置されたマウスにおいて星状細胞マーカーのＳ１００βを用いて共標識されたことを見出した（図１３Ａ）。興味深いことに、皮質区域、海馬、鉤状回、および中脳を含む、ＮｅｕｒｏＤ１処置されたマウスの脳において、ニューロンマーカーのＮｅｕＮを用いて共標識された多数のＧＦＰ陽性細胞を観察した（図１３Ｂ）。

【0156】

対照の脳とＮｅｕｒｏＤ１処置マウスの脳との間のＧＦＰ陽性細胞の異なる形態を直接示すために、高倍率画像を１枚ずつ示した。ＮｅｕｒｏＤ１群におけるＧＦＰ陽性細胞の大部分は典型的なニューロン形態を示したが、対照群におけるＧＦＰ陽性細胞は典型的な星状細胞形態を示した（図１４Ａ）。さらに、変換されたニューロンにおいてＮｅｕｒｏＤ１が過剰発現されていることも検出した（図１４Ｂ）。これらの結果は、ＧＦＡＰ：：Ｃｒｅ ＦＬＥＸ系が星状細胞を特異的に標的化し、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ ＮｅｕｒｏＤ１の複数回の頭蓋内注射は、マウスの脳にわたる広範な星状細胞からニューロンへの変換を達成することを示す。

【0157】

５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの脳における全体的な星状細胞からニューロンへの変換
ＡＤマウスの脳における全体的な変換を達成するために、全体的な変換系を５×ＦＡＤマウスの脳に適用した。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ ＧＦＡＰ：：ＣｒｅウイルスをＦＬＥＸ ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰとともに１３ヶ月齢の５×ＦＡＤマウスの脳に共注入し、変換分析のために１ヶ月後にマウスを屠殺した（図１５Ａ）。広範なＡβプラークを、チオフラビン－Ｓ染色（カラーで見た場合、青色に染色、図１５Ｂ）によって検出した。興味深いことに、脳のほぼ全区域がＧＦＰによってカバーされ（図１５Ｂ）、これは、５×ＦＡＤマウスの脳において、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢの感染効率がかなり高かったことを示す。５×ＦＡＤマウスの脳における星状細胞からニューロンへの変換を検査するために、ＧＦＰおよびＮｅｕＮ免疫染色を用いた。多くのＧＦＰ陽性細胞を、種々の脳区域を介してＮｅｕＮと共局在化した（図１５Ｃ）。これらのデータは、全体的な星状細胞からニューロンへの変換が、５×ＦＡＤマウスモデルの脳においても機能することを実証している。加えて、本明細書で提示される結果は、新たなニューロンおよび新たな星状細胞が恒常性に達していることを実証している。

【0158】

脳は非常に複雑でありながら組織化された臓器であり、ニューロンの異なる亜型は、脳におけるその特定の位置を有している。例えば、層およびニューロン亜型特異性は、大脳皮質内で同定されている。全体的な変換が大脳皮質における正しい場所において正しいニューロンを生成できるかどうかを検査するために、全体的な変換後に典型的な皮質マーカーのＴｂｒ１発現パターンを調査した。Ｔｂｒ１は、皮質層ＩＩ／ＩＩＩおよびＶＩニューロンで高度に発現される。興味深いことに、Ｔｂｒ１が、大脳皮質の深い層に位置するＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンで発現していたことも見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。これらの結果は、全体的な変換が、正しい位置において皮質ニューロンの特異的亜型を生成することができることを示唆している。

【0159】

実施例３－ＮｅｕｒｏＤ１ ＡＡＶの後眼窩注射による星状細胞のニューロンへの全体的な変換
最近発見されたＡＡＶの血清型であるＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０（８）：１１７２－１１７９（２０１７））を使用することによって、静脈内注射によって、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断してマウスの脳を効率的に形質導入することができる。まず、ＧＦＡＰプロモーター駆動型ＧＦＰプラスミドでＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢをパッケージ化した。後眼窩注射の１７日後に、マウスの脳をＧＦＰ蛍光によって広く標識化した（図１７Ａ）。星状細胞マーカーであるＳ１００βでの共免疫染色は、皮質、線条体、および海馬領域において、ＧＦＰの非常に特異的な発現を示した。

【0160】

次に、Ｃｒｅ－ＦＬＥＸ系でＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢウイルスをパッケージ化し、目的の遺伝子のより高い発現を達成しようとした。まず、ＧＦＡＰ：：ＣｒｅおよびＦＬＥＸ－ＧＦＰウイルスを用いてＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢを作製した。この組み合わせの後眼窩注射もまた、脳における広範囲の感染および強力な発現を示した（図１８Ａ）。種々の脳領域における多くのＧＦＰ陽性細胞は、星状細胞形態およびＧＦＡＰシグナルを示したが、それらのうちのいくつかはまた、ニューロン形態およびＮｅｕＮとの共局在化を示した（図１８Ｂ）。

【0161】

また、Ｃｒｅ－ＦＬＥＸ－ＮｅｕｒｏＤ１系をＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢウイルスに組み込んだ。ＧＦＡＰ：：ＣｒｅおよびＦＬＥＸ－ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰウイルスとともにＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢを後眼窩注射した後、ＧＦＰおよびＮｅｕｒｏＤ１シグナルの両方が、脳の種々の領域において検出された（図１９）。興味深いことに、ＧＦＰおよびＮｅｕｒｏＤ１シグナルの多くは、ニューロンマーカーのＮｅｕＮと共局在化され、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢウイルスの静脈内注射を介して全身的な感染および星状細胞からニューロンへの変換を達成することができることを示唆している。これらの結果は、ＮｅｕｒｏＤ１を星状細胞に送達する非侵襲的療法を使用して、ＡＤおよび大規模脳卒中などの多くの神経変性疾患においてニューロンを全球的に再生することができることを実証している。

【0162】

図２０は、脳内（図２１Ａ～２１Ｂ）、脳の種々の領域（図２４）、および脊髄（図２２）のＧＦＰ染色によって確認されるように、星状細胞の全体的な標的化のためのウイルス（例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＧＦＰ）の後眼窩（ｒ．ｏ．）注射を実証している。他の臓器においては、明らかなＧＦＰシグナルは検出されなかった（図２３）。

【0163】

ＮｅｕｒｏＤ１を発現するように設計されたウイルス（ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）を後眼窩注射を介して注射した場合、星状細胞は大脳内でニューロンに変換されたが、脊髄においては、変換が生じるのにより長い時間がかかるようである（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。この星状細胞のニューロンへの全体的な変換は、脳の種々の領域において種々の効率でも観察された（図２６および２７）。

【0164】

ＡＤの動物モデルにおいて、ＮｅｕｒｏＤ１を発現するように設計されたウイルス（ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、約２．０×１０^１０ゲノムコピー／マウス）の後眼窩注射は、成功裏に記憶を改善した（図２８）。特に、ＮｅｕｒｏＤ１を発現するように設計されたウイルスの後眼窩注射は、Ｙ迷路記憶評価アッセイを使用して評価されるように（図２９Ａ、図２９Ｂおよび図３０）、臭気習慣化アッセイを使用して評価されるように（図３１）、恐怖条件付け記憶試験を使用して評価されるように（図３２）、ならびに空間学習および記憶を評価するためにモリス水迷路を使用して評価されるように（図３３および図３４Ａ～図３４Ｄ）、記憶の改善をもたらした。

【0165】

これらの結果は、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅｂ後眼窩注射が、ニューロンへの変換のために全体的に星状細胞を標的とするための良い方法であることを実証している。これらの結果はまた、ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の効率が、種々の脳領域において異なること、ならびに皮質および海馬の星状細胞が、ＮｅｕｒｏＤ１によって高効率でニューロンに変換され得ることを実証している。さらに、これらの結果は、星状細胞のニューロンへの全体的な変換が、ＡＤのマウスモデル（すなわち、５×ＦＡＤマウス）における学習および記憶性能を改善することができることを実証している。

【0166】

神経幹細胞の移植によってアルツハイマーの脳全体において数十億の新たなニューロンを産生するのは非常に困難であり、それはアルツハイマーの脳の内側で数十億のニューロンを全体的に再生する代替的な方法を発明することを促した。本明細書に記載されるように、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅｂウイルスの後眼窩注射によって５×ＦＡＤマウスの脳におけるインサイチュニューロン変換のために星状細胞を全体的に標的化することができる遺伝子治療戦略を開発した。ＮｅｕｒｏＤ１がこれらの星状細胞で過剰発現された場合、種々の脳領域において、特に皮質および海馬において多数の変換されたニューロンを発見した。これまで、５×ＦＡＤマウスの脳における全体的な星状細胞からニューロンへの変換を通じて、いくつかの興味深い知見を結論付けた。５×ＦＡＤ^＋／－／Ｃｒｅ７７．６^＋／－バイジェニックマウスにＡＡＶ ＰＨＰ．ｅｂウイルスを後眼窩注射した後、レポーター遺伝子のＧＦＰが種々の脳および脊髄領域全体にわたる星状細胞において広く発現されていることを見出した。ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅｂ－ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ注射の３０日後、５×ＦＡＤマウスの脳において多くのＧＦＰ陽性の変換されたニューロンを観察した。ＮｅｕｒｏＤ１媒介の星状細胞からニューロンへの変換の効率は、５×ＦＡＤマウスの脳における大脳皮質、梨状皮質、および海馬において約７０～９０パーセントである。

【0167】

５×ＦＡＤ^＋／－／Ｃｒｅ７７．６^＋／－バイジェニックマウスを、６ヶ月齢でＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰで処置した。次いで、８ヶ月齢（ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅｂ注射の２ヶ月後）に一連の行動試験を実施し、Ｙ迷路アッセイ、恐怖条件付け記憶、臭気習慣化、およびＭｏｒｒｉｓ水迷路によって評価されるように、全体的な星状細胞からニューロンへの変換が５×ＦＡＤマウスにおける学習および記憶性能を有意に改善することを見出した。

【0168】

ＮｅｕｒｏＤ１処置がＡＤマウスにおける認知機能の改善を示した後、さらに、ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンを阻害する実験を設計し、記憶の増強がそれに応じて低減するかどうかを検査した。この目的のために、変換されたニューロンがｈＭ４Ｄｉを発現するように、ＮｅｕｒｏＤ１とともに阻害性受容体のｈＭ４Ｄｉを発現することによる化学遺伝学的方法を用いた。ＮｅｕｒｏＤ１処置がＡＤマウスにおける恐怖条件付け記憶を増強したことを確認した後、ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンが発火活動電位から阻害されるように、ＣＮＯを適用して、ｈＭ４Ｄｉ受容体を活性化させた。興味深いことに、ＣＮＯがＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンを沈黙させた後、記憶増強が廃止されたことを見出した（図３５Ａ～図３５Ｄ）。これらの結果は、さらにＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロンがＡＤマウスにおける記憶増強に寄与したことがさらに実証している。

【0169】

実施例４－追加の実施形態
実施形態１．脳における神経学的障害を有する哺乳動物を治療するための方法であって、上述の方法が、神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、上述の哺乳動物の脳に投与することを含む、方法。

【0170】

実施形態２．上述の哺乳動物が、ヒトである、実施形態１に記載の方法。

【0171】

実施形態３．上述の神経学的障害が、アルツハイマー病である、実施形態１に記載の方法。

【0172】

実施形態４．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む発現ベクターを、脳に送達することを含む、実施形態１に記載の方法。

【0173】

実施形態５．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを、脳に送達することを含む、実施形態１に記載の方法。

【0174】

実施形態６．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを、脳に送達することを含む、実施形態１に記載の方法。

【0175】

実施形態７．アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢである、実施形態６に記載の方法。

【0176】

実施形態８．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0177】

実施形態９．上述の投与する工程が、定位頭蓋内注射を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0178】

実施形態１０．上述の投与する工程が、２回以上の定位頭蓋内注射を含む、実施形態９に記載の方法。

【0179】

実施形態１１．上述の投与する工程が、頭蓋外注射を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0180】

実施形態１２．上述の投与する工程が、２回以上の頭蓋外注射を含む、実施形態１１に記載の方法。

【0181】

実施形態１３．上述の投与する工程が、後眼窩注射を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0182】

実施形態１４．アルツハイマー病を有する哺乳動物を治療する方法であって、上述の方法が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を含有する薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を、上述の哺乳動物の脳に投与することを含む、方法。

【0183】

実施形態１５．薬学的組成物が、１０^１０～１０^１４個のアデノ随伴ウイルス粒子／ｍＬの担体の濃度でアデノ随伴ウイルス粒子を含有する約１μＬ～約５００μＬの薬学的に許容される担体を含む、実施形態１４に記載の方法。

【0184】

実施形態１６．薬学的組成物が、約０．１μＬ／分～約５μＬ／分の制御された流速で上述の哺乳動物の脳に注射される、実施形態１４または１５に記載の方法。

【0185】

実施形態１７．アルツハイマー病を有し、かつ（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化を低減させること、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集を低減させること、（３）神経炎症を低減させること、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）を低減させること、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンを生成すること、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存を増加させること、（７）新たな非反応性星状細胞を生成すること、（８）反応性星状細胞の数を低減させること、または（９）記憶を改善することを必要とする哺乳動物内で、上述の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）または（９）を行うための方法であって、上述の方法が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする外因性核酸を含む組成物を、上述の哺乳動物に投与することを含み、上述の（１）高リン酸化タウタンパク質の神経原線維変化が低減されるか、（２）細胞外アミロイドプラークの凝集が低減されるか、（３）神経炎症が低減されるか、（４）インターロイキン１β（ＩＬ－１β）が低減されるか、（５）新たなグルタミン酸作動性ニューロンが生成されるか、（６）ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存が増加されるか、（７）新たな非反応性星状細胞が生成されるか、（８）反応性星状細胞の数が低減されるか、または（９）上述の記憶が改善される、方法。

【0186】

実施形態１８．上述の哺乳動物が、ヒトである、実施形態１７に記載の方法。

【0187】

実施形態１９．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを送達することを含む、実施形態１７または１８に記載の方法。

【0188】

実施形態２０．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターを送達することを含む、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。

【0189】

実施形態２１．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを送達することを含む、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の方法。

【0190】

実施形態２２．上述の組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターが、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ発現ベクターである、実施形態２１に記載の方法。

【0191】

実施形態２３．上述の投与する工程が、ＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、上述のＮｅｕｒｏＤ１ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号２またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号４またはその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号１またはその機能的断片、配列番号３またはその機能的断片、および配列番号２もしくは配列番号４またはそれらの機能的断片と７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0192】

実施形態２４．上述の投与する工程が、定位頭蓋内注射を含む、実施形態１７～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0193】

実施形態２５．上述の投与する工程が、２回以上の定位頭蓋内注射を含む、実施形態２４に記載の方法。

【0194】

実施形態２６．上述の投与する工程が、頭蓋外注射を含む、実施形態１７～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0195】

実施形態２７．上述の投与する工程が、２回以上の頭蓋外注射を含む、実施形態２６に記載の方法。

【0196】

実施形態２８．上述の投与する工程が、後眼窩注射を含む、実施形態１７～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0197】

配列
配列番号１－ヒトＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするヒトＮｅｕｒｏＤ１核酸配列－１０７１ヌクレオチド、終止コドンを含む
ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＧＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＧＧＡＣＴＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＴＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＡＣＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＴＴＡＡＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧ
配列番号２－配列番号１によってコードされるヒトＮｅｕｒｏＤ１アミノ酸配列－３５６アミノ酸
ＭＴＫＳＹＳＥＳＧＬＭＧＥＰＱＰＱＧＰＰＳＷＴＤＥＣＬＳＳＱＤＥＥＨＥＡＤＫＫＥＤＤＬＥＡＭＮＡＥＥＤＳＬＲＮＧＧＥＥＥＤＥＤＥＤＬＥＥＥＥＥＥＥＥＥＤＤＤＱＫＰＫＲＲＧＰＫＫＫＫＭＴＫＡＲＬＥＲＦＫＬＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭＨＧＬＮＡＡＬＤＮＬＲＫＶＶＰＣＹＳＫＴＱＫＬＳＫＩＥＴＬＲＬＡＫＮＹＩＷＡＬＳＥＩＬＲＳＧＫＳＰＤＬＶＳＦＶＱＴＬＣＫＧＬＳＱＰＴＴＮＬＶＡＧＣＬＱＬＮＰＲＴＦＬＰＥＱＮＱＤＭＰＰＨＬＰＴＡＳＡＳＦＰＶＨＰＹＳＹＱＳＰＧＬＰＳＰＰＹＧＴＭＤＳＳＨＶＦＨＶＫＰＰＰＨＡＹＳＡＡＬＥＰＦＦＥＳＰＬＴＤＣＴＳＰＳＦＤＧＰＬＳＰＰＬＳＩＮＧＮＦＳＦＫＨＥＰＳＡＥＦＥＫＮＹＡＦＴＭＨＹＰＡＡＴＬＡＧＡＱＳＨＧＳＩＦＳＧＴＡＡＰＲＣＥＩＰＩＤＮＩＭＳＦＤＳＨＳＨＨＥＲＶＭＳＡＱＬＮＡＩＦＨＤ
配列番号３－マウスＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするマウスＮｅｕｒｏＤ１核酸配列－１０７４ヌクレオチド、終止コドンを含む
ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＡＣＡＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧ
配列番号４：配列番号３によってコードされるマウスＮｅｕｒｏＤ１アミノ酸配列－３５７アミノ酸
ＭＴＫＳＹＳＥＳＧＬＭＧＥＰＱＰＱＧＰＰＳＷＴＤＥＣＬＳＳＱＤＥＥＨＥＡＤＫＫＥＤＥＬＥＡＭＮＡＥＥＤＳＬＲＮＧＧＥＥＥＥＥＤＥＤＬＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＤＱＫＰＫＲＲＧＰＫＫＫＫＭＴＫＡＲＬＥＲＦＫＬＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭＨＧＬＮＡＡＬＤＮＬＲＫＶＶＰＣＹＳＫＴＱＫＬＳＫＩＥＴＬＲＬＡＫＮＹＩＷＡＬＳＥＩＬＲＳＧＫＳＰＤＬＶＳＦＶＱＴＬＣＫＧＬＳＱＰＴＴＮＬＶＡＧＣＬＱＬＮＰＲＴＦＬＰＥＱＮＰＤＭＰＰＨＬＰＴＡＳＡＳＦＰＶＨＰＹＳＹＱＳＰＧＬＰＳＰＰＹＧＴＭＤＳＳＨＶＦＨＶＫＰＰＰＨＡＹＳＡＡＬＥＰＦＦＥＳＰＬＴＤＣＴＳＰＳＦＤＧＰＬＳＰＰＬＳＩＮＧＮＦＳＦＫＨＥＰＳＡＥＦＥＫＮＹＡＦＴＭＨＹＰＡＡＴＬＡＧＰＱＳＨＧＳＩＦＳＳＧＡＡＡＰＲＣＥＩＰＩＤＮＩＭＳＦＤＳＨＳＨＨＥＲＶＭＳＡＱＬＮＡＩＦＨＤ
マウスＬＣＮ２プロモーター－配列番号５
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ヒトＧＦＡＰプロモーター－配列番号６
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マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーター－配列番号７
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ヒトＮＧ２プロモーター－配列番号８
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ＣＡＧ：：ＮｅｕｒｏＤ１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－配列番号９
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【0198】

その他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、それを限定することは意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

2022553208000001.app

【国際調査報告】