(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-22
(54)【発明の名称】操作された制御性Ｔ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20221215BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221215BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20221215BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221215BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221215BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221215BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20221215BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N5/10
C12N5/0783
C12N15/63 Z
A61K35/17 Z
A61P25/00
C07K14/725
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523914
(86)(22)【出願日】2020-10-22
(85)【翻訳文提出日】2022-06-21
(86)【国際出願番号】 GB2020052657
(87)【国際公開番号】W WO2021079120
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】1915359.2
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507299817
【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】シュタウス， ハンス
(72)【発明者】
【氏名】トーマス， シャリン
(72)【発明者】
【氏名】プレハム， オリビエ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZA02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドが主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されたときに前記ペプチドまたはそのバリアントもしくは断片に特異的に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関する。本発明は、さらに、操作されたＴｒｅｇを提供するための方法、ならびに前記操作されたＴｒｅｇおよびベクターの方法および使用ならびに前記Ｔｒｅｇをコードするベクターのキットに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む操作されたＴｒｅｇであって、前記ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、前記α鎖および前記β鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列は、以下のとおり：
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント、
である、操作されたＴｒｅｇ。
【請求項2】
前記ＴＣＲの前記α鎖が、以下のアミノ酸配列：ＣＤＲ１α－ＴＩＳＧＴＤＹ（配列番号３）
ＣＤＲ２α－ＧＬＴＳＮ（配列番号４）
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み、
前記ＴＣＲの前記β鎖が、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１β－ＤＦＱＡＴＴ（配列番号５）
ＣＤＲ２β－ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号６）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項3】
ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖の可変領域が、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列同一性は、請求項４に記載されるＣＤＲ配列を含まず、および（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖の可変領域が、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列同一性は、請求項４に記載されるＣＤＲ配列を含まない、
請求項２に記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項4】
（ａ）前記ＴＣＲの前記β鎖が、配列番号２７に示される位置２２に対応する位置にシステイン残基を含むヒト定常領域アミノ酸配列を含むか；または（ｂ）前記ＴＣＲの前記α鎖が、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み、および／もしくは前記ＴＣＲの前記β鎖が、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含む、
請求項１～３のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項5】
前記ＴＣＲの前記α鎖およびβ鎖の定常領域ドメインがそれぞれ、追加のシステイン残基を含み、前記α鎖と前記β鎖との間での付加的なジスルフィド結合の形成を可能にする、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項6】
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖が、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖が、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項7】
前記Ｔｒｅｇが、対象から単離されたＴ細胞に由来する、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項8】
先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇを含む医薬組成物。
【請求項9】
疾患の処置における使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物。
【請求項10】
医薬の製造における、請求項１～８のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物の使用。
【請求項11】
疾患を処置または予防することを必要とする対象において疾患を処置または予防するための方法であって、請求項１～８のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項12】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項９～１１のいずれかに記載の、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法。
【請求項13】
前記対象がＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１陽性対象である、請求項９～１２のいずれかに記載の、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列と、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列とを含む、ベクター。
【請求項15】
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードする核酸配列が、配列番号２８もしくは２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードする核酸配列が、配列番号３０もしくは３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｃ）前記核酸配列が、配向５’α鎖－β鎖３’で前記ＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含むか；または
（ｄ）前記核酸配列が、配向５’β鎖－α鎖３’で前記ＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含む、
請求項１４に記載のベクター。
【請求項16】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドまたはベクターと、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドまたはベクターとを含む、ポリヌクレオチドまたはベクターのキット。
【請求項17】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、ポリヌクレオチドまたはベクターのキット。
【請求項18】
請求項１～７のいずれかに記載のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入するステップを含む、請求項１～７のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇを産生するための方法。
【請求項19】
ＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをインビトロまたはエクスビボで前記細胞中に導入するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記Ｔ細胞が、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記Ｔ細胞が典型的なＴ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードする前記ポリヌクレオチドを導入するステップが、逐次に、別々に、または同時に行われる、請求項１９～請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードする前記ポリヌクレオチドが、請求項１６に記載のベクターを使用して前記細胞に導入される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関する。特に、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴｒｅｇに関する。本発明は、さらに、操作されたＴｒｅｇを提供するための方法、ならびに前記操作されたＴｒｅｇの方法および使用に関する。
本発明は、操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関する。特に、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴｒｅｇに関する。本発明は、さらに、操作されたＴｒｅｇを提供するための方法、ならびに前記操作されたＴｒｅｇの方法および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
多くの自己免疫性および炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、自己反応性Ｔ細胞を伴う。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の自己免疫性炎症性脱髄状態であり、若年成人において最も一般的な神経障害である。
多くの自己免疫性および炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、自己反応性Ｔ細胞を伴う。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の自己免疫性炎症性脱髄状態であり、若年成人において最も一般的な神経障害である。
【0003】
自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患に対する現在の処置は、一般に免疫系を抑制する。例えば、１つの処置には、細胞増殖抑制剤および免疫抑制薬の投与とともに骨髄を移植することが含まれる。自家造血幹細胞移植は、一部の患者にとって持続的な有益な効果を有し得るが、この手技は、実質的な毒性および危険性を伴う積極的な骨髄破壊的前処置を必要とする。
【0004】
いくつかの疾患修飾処置（ＤＭＴ）が臨床的再発の頻度を低下させるために承認されているが、ほとんどの患者は現在の治療スケジュール下で臨床的に悪化し続けている。ＤＭＴも幹細胞移植も、自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患の免疫病理のＣＮＳ特異的な抑制を媒介することはできない。
【0005】
現在、自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患に対する有効な処置は存在しない。処置は、通常は免疫系の全身的な抑制によって、単にその症状を軽減することに集中する。ＣＮＳ疾患の発症および進行に関連する局所的な免疫応答を特異的に標的とする治療が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の局面の概要
本発明は、少なくとも部分的には、抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するためにＴ細胞受容体遺伝子導入技術を使用することができるという本発明者らの決定に基づいている。ヒト抗原特異的Ｔｒｅｇは活性化されたＴ細胞を抑制できることが示されている。
本発明は、少なくとも部分的には、抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するためにＴ細胞受容体遺伝子導入技術を使用することができるという本発明者らの決定に基づいている。ヒト抗原特異的Ｔｒｅｇは活性化されたＴ細胞を抑制できることが示されている。
【0007】
特に、本発明者らは、例えば、精製されたＴｒｅｇ中へのＭＢＰ－ＴＣＲ遺伝子のレトロウイルス導入によって、ならびに／または典型的なＣＤ４＋Ｔ細胞中へのＭＢＰ－ＴＣＲおよびフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）遺伝子のレトロウイルス導入によって、ＭＢＰ特異的Ｔｒｅｇを作製した。理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＢＰに対して特異的なＴＣＲを有するこれらの操作されたＴｒｅｇは、疾患、例えば自己免疫疾患の抑制において使用され得、この場合、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＭＢＰ特異的Ｔｒｅｇの局所的活性化は、ＭＳおよびその他のＣＮＳ炎症状態において見られるようなＣＮＳ病理を抑制し得る。
【0008】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らが病原性Ｔ細胞の増殖を抑制するＴｒｅｇを開発することができたことは予想外であった。Ｔｒｅｇ中のＴＣＲは、典型的な（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）Ｔ細胞中のＴＣＲより自己抗原に対してより高い親和性を有することが当該分野で以前に示唆された（参照により本明細書に組み入れられるＰａｃｈｏｌｃｚｙｋ ａｎｄ Ｋｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８．１２５（４）４５０－４５８）。膵島抗原特異的ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇは、ウイルス抗原特異的ＴＣＲを発現するＴｒｅｇより効率が低かったことも報告されている。これはＴｒｅｇ特異的なＴＣＲ要件、例えばある種の親和性要件によるものであり得ることが示唆された。このように、Ｔｒｅｇレパートリーは非常に多様であり、典型的なＴ細胞のレパートリーと比較してＴ細胞受容体の異なるセットを有すると考えられていた。本発明者らは、典型的なＴ細胞から単離されたＭＢＰ特異的ＴＣＲがＴｒｅｇ細胞において首尾よく発現されることができ、機能的Ｔｒｅｇを産生することができることを予想外に実証した。
【0009】
さらに、多数のＴＣＲを、外因性ＴＣＲとして首尾よく発現させることができない。特にＴｒｅｇにおいては、いずれのＴＣＲが外因性ＴＣＲとして効果的に発現され得るかを予測することはできない。
【0010】
したがって、本発明は、Ｔ細胞受容体を含む操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であって、前記ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、
前記α鎖および前記β鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列は、以下のとおり：
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント、
である、操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
前記α鎖および前記β鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列は、以下のとおり：
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント、
である、操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
【0011】
ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）またはその断片と少なくとも９０％の同一性を含むペプチドが主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されると、ＴＣＲは、前記ペプチドに特異的に結合することが可能であり得る。
【0012】
ＭＢＰ１１１－１２９ペプチドは、ＤＲＢ１＊０４０１（ＨＬＡ－ＤＲ４）に弱く結合することが公知である。これは、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ１５に対して高い親和性で結合するＭＢＰ８１－９９とは対照的である。
【0013】
ＴＣＲのα鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１α－ＴＩＳＧＴＤＹ（配列番号３）
ＣＤＲ２α－ＧＬＴＳＮ（配列番号４）
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得、
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１β－ＤＦＱＡＴＴ（配列番号５）
ＣＤＲ２β－ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号６）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得る。
ＣＤＲ１α－ＴＩＳＧＴＤＹ（配列番号３）
ＣＤＲ２α－ＧＬＴＳＮ（配列番号４）
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得、
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１β－ＤＦＱＡＴＴ（配列番号５）
ＣＤＲ２β－ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号６）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得る。
【0014】
ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まず、および
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。
ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；および
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。
ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；および
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0015】
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは、それぞれ、追加のシステイン残基を含み得、α鎖とβ鎖との間での付加的なジスルフィド結合の形成を可能にする。適切には、追加のジスルフィド結合は、内因性ＴＣＲ鎖との誤対合を低減させる。
【0016】
適切には、ＴＣＲは、以下のように定常ドメインを含み得る：
（ａ）ＴＣＲのβ鎖が、配列番号２７に示される位置２２に対応する位置にシステイン残基を含むヒト定常領域アミノ酸配列を含み得るか；または
（ｂ）ＴＣＲのα鎖が、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み得、および／もしくはＴＣＲのβ鎖が、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み得る。
（ａ）ＴＣＲのβ鎖が、配列番号２７に示される位置２２に対応する位置にシステイン残基を含むヒト定常領域アミノ酸配列を含み得るか；または
（ｂ）ＴＣＲのα鎖が、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み得、および／もしくはＴＣＲのβ鎖が、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み得る。
【0017】
ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；および
ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0018】
一局面において、Ｔｒｅｇは、対象から単離されたＴ細胞に由来する。
【0019】
別の局面において、本発明は、本発明による操作されたＴｒｅｇを含む医薬組成物を提供する。
【0020】
一局面において、本発明は、疾患の処置における使用のための本発明による操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物に関する。
【0021】
別の局面において、本発明は、医薬の製造における、本発明による操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物の使用に関する。
【0022】
一局面において、疾患を処置または予防することを必要とする対象において疾患を処置または予防するための方法であって、本発明による操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0023】
別の局面において、疾患が多発性硬化症である、本発明による、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、または使用または方法が提供される。
【0024】
一局面において、対象がＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１陽性対象である、本発明による、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、または使用または方法が提供される。
【0025】
適切には、本発明は、本発明によるＴＣＲをコードするベクターであって、
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードする核酸配列が、配列番号２８もしくは２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードする核酸配列が、配列番号３０もしくは３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｃ）前記核酸配列が、配向５’α鎖－β鎖３’前記でＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含むか；または
（ｄ）前記核酸配列が、配向５’β鎖－α鎖３’で前記ＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含む、
ベクターを提供する。
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードする核酸配列が、配列番号２８もしくは２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードする核酸配列が、配列番号３０もしくは３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか；
（ｃ）前記核酸配列が、配向５’α鎖－β鎖３’前記でＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含むか；または
（ｄ）前記核酸配列が、配向５’β鎖－α鎖３’で前記ＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）前記ＴＣＲの前記β鎖をコードし、配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）前記ＴＣＲの前記α鎖をコードし、配列番号２９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含む、
ベクターを提供する。
【0026】
別の局面において、本明細書で定義されるＴＣＲをコードする核酸配列とＦＯＸＰ３をコードする核酸配列とを含むベクターが提供される。
【0027】
一局面において、本明細書において定義されるＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドまたはベクターと、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドまたはベクターとを含むポリヌクレオチドのキットまたはベクターのキットが提供される。適切には、第１および第２のポリヌクレオチドまたはベクターは別個である。
【0028】
一局面において、本明細書において定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入するステップを含む、本発明による操作されたＴｒｅｇを産生するための方法が提供される。
【0029】
適切には、Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【0030】
一局面において、前記方法は、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入するステップをさらに含む。
【0031】
適切には、細胞はＴ細胞である。
【0032】
適切には、Ｔ細胞は「典型的な（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）」Ｔ細胞である。
【0033】
適切には、細胞は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞である。適切には、細胞はヒトＴｒｅｇ細胞である。
【0034】
本発明の方法の一局面において、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドを導入するステップは、逐次に、別々に、または同時に行われる。
【0035】
本発明の方法の別の局面において、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドは、本発明のベクターを使用して細胞に導入される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】（Ａ）ＭＢＰ ＴＣＲαおよびβ鎖ならびに（Ｂ）ＦＯＸＰ３＋ＴＣＲαおよびβ鎖をコードするｐＭＰ７１レトロウイルスベクターの概略図を示す。
【0037】
【図2】ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲ ｐＭＰ７１。ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１によって提示されるＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）を認識する。ＴＣＲはコドン最適化されており、定常αおよびβドメインの両方がマウス化されており、付加的なジスルフィド結合がｃ－αとｃ－βとの間に追加されている。
【0038】
【図3】ＭＳ－２ ＴＣＲの上流のＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＲ１部位中に挿入された、３’Ｔ２Ａ部位でＳＴＯＰコドンが除去されたＦＯＸＰ３遺伝子を含むＦＯＸＰ３－２Ａ－ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲ ｐＭＰ７１。
【0039】
【図4】研究デザインを示す概略図。Ａ）操作されたＴｒｅｇにおけるＭＢＰ特異的抑制機能の実証。Ｂ）ＨＬＡトランスジェニックマウスモデルにおいてＭＳ様免疫病理を抑制するための操作されたＴｒｅｇの使用
【0040】
【図5】プロットは、マウスＴＣＲ定常領域およびＦＯＸＰ３の発現を通じて形質導入のレベルを評価するために７日目に行われた代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞を偽形質導入するか、またはＴＣＲ（ＭＳ－２）もしくはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３（ＭＳ－２ ＦＯＸＰ３）で形質導入する。
【0041】
【図6】非形質導入細胞上の（ｄ０）または形質導入細胞集団（ｄ７）に対してゲーティングしたＴｒｅｇ表面マーカーの相対発現を示すグラフ ｎ＝２～４。これらの結果は、制御性Ｔ細胞がインビトロ拡大中にＦＯＸＰ３発現を維持することを実証している。
【0042】
【図7】ペプチドによるエフェクターＴ細胞の再刺激を示すグラフ。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトＨＬＡ－ＤＲ４およびＣＤ８０またはＣＤ８６で形質導入した。その後の実験のために、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する細胞を等量で一緒に混合した。飽和量（１０μＭ／ｍｌ）のＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）（ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ）を含む培養培地中にＣＨＯ細胞を１０×１０６／ｍＬで再懸濁した。ＭＳ２またはＭＳ２－ＦＯＸＰ３構築物で形質導入されたＴ細胞を洗浄し、計数し、完全ＲＰＭＩ中に０．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞をＣＨＯ細胞と１：１で播種し、ペプチドありまたはなしで４時間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理した後、ＩＬ－２およびＩＦＮγに対する抗体で染色した。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
【0043】
【0044】
【図9】ペプチドをパルスされた（ｐｅｐｉｄｅ－ｐｕｌｓｅｄ）、照射されたＡＰＣありまたはなしで、形質導入されたＴ細胞を４日間培養した。上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２およびＩＦＮｇについてアッセイした（ｎ＝２～４）。これらのデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇおよびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖが同族ペプチドに対して低応答性であることを示している。
【0045】
【図10】ＭＳ２ ＴＣＲを発現する細胞からのＩＬ－２およびＩＦＮγ産生、ならびにＭＳ２ ＴＣＲおよびＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞からの産生を示す（ｎ＝３）。ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入された典型的なＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）が、ＴＣＲのみで形質導入された典型的な細胞よりも少ないＩＬ－２を産生する。
【0046】
【図11】ＴＣＲで形質導入されたＴｃｏｎｖをＣＦＳＥで染色し、ペプチドをパルスされ、照射されたＡＰＣありまたはなしで、１Ｔｃｏｎｖ：０．１ＡＰＣの比で４日間培養した。モックＴｒｅｇ（一番左端の棒）、ＭＢＰ ＴＣＲで形質導入されたＴｒｅｇ（左から２番目の棒）、ＭＢＰ ＴＣＲ－ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｒｅｇ（左から３番目の棒）およびＭＢＰ ＴＣＲ－ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｃｏｎｖ（各群で左から４番目の棒）を示された比で添加した。増殖は、ＣＦＳＥで染色されたＴｃｏｎｖの希釈物を分析することによって決定した（Ｂ）。これらのデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的にＴ細胞応答を抑制することを示している。
【0047】
【図12】ＴＣＲで形質導入されたＴｃｏｎｖをＣＦＳＥで染色し、ペプチドをパルスされ、照射されたＡＰＣありまたはなしで、１Ｔｃｏｎｖ：０．１ＡＰＣの比で４日間培養した。モックＴｒｅｇ（一番左端の棒）、ＭＢＰ ＴＣＲで形質導入されたＴｒｅｇ（左から２番目の棒）、ＭＢＰ ＴＣＲ－ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｒｅｇ（左から３番目の棒）およびＭＢＰ ＴＣＲ－ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｃｏｎｖ（各群で左から４番目の棒）を示された比で添加した。上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２についてアッセイした。これらのデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的にＴ細胞応答を抑制することを示している。
【0048】
【図13-1】ビーズ選別によって、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを単離した。ＴｒｅｇをＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３で形質導入した。形質導入された細胞および同等の数のＣＤ４５．１＋ＯＴＩトランスジェニックＴ細胞を、４Ｇｙの照射で前処置されたＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主に注入した。７日後、マウスの右または左側腹部の皮下に、フロイント不完全アジュバント中の３０ｕｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）または３０ｕｇのＯＶＡおよび３０ｕｇのヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を注射した。Ａ．対になったＦＡＣＳプロットは、同じマウスの右および左の鼠径リンパ節においてＣＤ４５．１によって同定されたＯＴＩ細胞を示す。左側のプロットは、注入されていない側腹部（ペプチドなし）からのデータを示し、右側は、ＯＶＡペプチドが注入された側腹部からのデータを示す。Ｂ．対になったＦＡＣＳプロットは、同じマウスの右および左の鼠径リンパ節中のＯＴＩ細胞を示す。左側のプロットは、ＯＶＡを注射された側腹部からのデータを示し、右側は、ＯＶＡ＋ＭＢＰペプチドを注射した側腹部からのデータを示す。Ｃ．ＯＶＡまたはＯＶＡ＋ＭＢＰを受けた側腹部の鼠径リンパ節中の％ＣＤ４５．１＋細胞（左パネル）およびＣＤ４５．１細胞の絶対数を示す３つの独立した実験からの累積データ（ｎ＝９）。
【図13-2】同上。
【図13-3】同上。
【0049】
【図14-1】ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲおよびＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲの発現および機能研究のためのレトロウイルスベクターの模式的表示。（ａ）上のパネル：α鎖－Ｐ２Ａ－β鎖－Ｔ２Ａ－切断型マウスＣＤ１９（ｔｍＣＤ１９）配置を使用して、以下のＴＣＲをレトロウイルスｐＭＰ７１ベクターにクローニングした：ＭＳ２－３Ｃ８野生型配列；ＭＳ２－３Ｃ８およびＭＳ２－３Ｃ８マウス定常。下のパネル：ＭＳ２－３Ｃ８ ｂａ ＴＣＲバリアントを、β鎖－Ｐ２Ａ－α鎖－Ｔ２Ａ－切断型マウスＣＤ１９配置を使用してレトロウイルスｐＭＰ７１ベクターにクローニングした。切断型マウスＣＤ１９を形質導入効率のマーカーとして使用した。ＭＳ２－３Ｃ８野生型配列を除くすべてのＴＣＲは、コドン最適化された可変ドメインおよび定常ドメインを含有した。（ｂ）表記のＴＣＲをコードするレトロウイルス構築物で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞（内因性ＴＣＲを発現しない）を示す３つの独立した実験の代表的な例。上のパネル：ＣＤ１９発現レベル。下のパネル：ゲーティングされたＣＤ１９ｈｉｇｈ細胞におけるＣＤ３発現レベルおよびＴＲＢＶ２０（ＩＭＧＴ命名法）発現レベル。ＣＤ３は、ＴＣＲ細胞表面発現の代用マーカーとして使用される。可変β鎖発現を決定するために、抗ＴＲＢＶ２０Ａｂで細胞を染色した。（ｃ）表記のＴＣＲをコードするレトロウイルス構築物で形質導入された、ＭＡＣＳ選別されたＣＤ４＋ヒトＴ細胞を示す４つの独立した実験の代表的な例。上のパネル：ＣＤ１９発現レベル。下のパネル：ゲーティングされたＣＤ１９ｈｉｇｈ細胞におけるＴＲＢＶ２０を発現するＣＤ４＋細胞のパーセンテージ。可変β鎖発現を決定するために、抗ＴＲＢＶ２０Ａｂで細胞を染色した。（ｄ）表記のＴＣＲで形質導入され、飽和濃度の関連ペプチドまたは対照ペプチドを負荷したＡＰＣで刺激されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を示す４つの独立した実験の代表的な例。ＢＦＡの存在下での刺激の１８時間後に細胞内サイトカイン染色によって決定された、ＩＬ２および／またはＩＦＮｇを産生したゲーティングされたＣＤ１９ｈｉｇｈＴ細胞の頻度が示されている。ＡＰＣは、ＣＤ８０およびＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲＢ１＊４０１を発現するＣＨＯ細胞であった。（ｅ）ＭＢＰ特異的炎症促進性サイトカインの産生を評価する抑制アッセイ。ＦＡＣＳ選別されたエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ１２７ｈｉｇｈ）をＭＳ２－３Ｃ８で形質導入し、ドナーを一致させたＦＡＣＳ選別されたＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ）をＭＳ２－３Ｃ８で形質導入するか、または偽形質導入した。９６ウェルプレート中で、関連するＭＢＰ－ペプチドを負荷した５，０００個のＡＰＣとともに、ウェルあたり最大５万個のＭＳ２－３Ｃ８発現Ｔｒｅｇおよび５万個のＴエフェクターを３日間共培養した。培養培地中のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図14-2】同上。
【図14-3】同上。
【図14-4】同上。
【図14-5】同上。
【図14-6】同上。
【図14-7】同上。
【0050】
【図15-1】ＴＣＲを形質導入された制御性Ｔ細胞は、照射された宿主中に生着することができるが、ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３－細胞の蓄積を防ぐために外因性ＦＯＸＰ３発現を必要とする。 ビーズ選別によって、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞からＴｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを単離した。Ｔｒｅｇを、ＴＣＲ、ＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３で形質導入し、またはウイルスを含まない上清（モック）とともに培養した。形質導入の１日後に、４Ｇｙの照射で前処置されたＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入された細胞を注入した。７週間後、形質導入されたＴｒｅｇの生着を決定するためにフローサイトメトリーを使用した。Ａ．形質導入後１日目でのヒト可変２．１およびマウスＦｏｘｐ３の発現を通じて、形質導入効率を決定した。Ｂ．移入された細胞（上のパネル）ならびにＦＯＸＰ３およびＴＣＲ（下のパネル）を同定するために、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｒｅｇを与えられたマウスからの脾細胞をＴｈｙ１．１で染色した。Ｃ．ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入されたＴｒｅｇの注射日と比較した形質導入効率の倍数変化（左のパネル）および形質導入された細胞の絶対数の倍数変化（右のパネル）を示す累積データ（ｎ＝３）。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。対応のないｔ検定による統計解析。Ｄ．移入の７週間後での形質導入された細胞内のＦＯＸＰ３の代表的な発現。グラフは、７週目での形質導入された集団内のパーセンテージＦＯＸＰ３＋細胞の累積（左）および注射日と比較したＦＯＸＰ３＋細胞の倍数変化を示す（ｎ＝３）。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。＊ｐ≧０．０５、＊＊ｐ≧０．０１ 対応のないｔ検定によって決定。
【図15-2】同上。
【0051】
【図16-1】外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇはインビボで７週間後にＴｒｅｇ機能性を保持するが、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇはエフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する Ａ 無関係のペプチドまたは１０ｕＭ ＭＢＰをパルスしたＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞とともに脾細胞を４時間培養した。フローサイトメトリーによってＩＬ－２およびＩＦＮｇの産生を測定した。ＦＡＣＳプロットは、ＴＣＲのみを発現するＴｒｅｇを含有するＣＤ４５．１細胞（上のパネル）およびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇを含有するＴｈｙ１．１細胞を示す。Ｂ グラフは、ＴＣＲを発現する（濃い灰色）ＴｒｅｇおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を発現する（薄い灰色）Ｔｒｅｇによる累積的なＩＬ－２およびＩＦＮｇ産生を示す。エラーバーは、平均の標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図16-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0052】
詳細な説明
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド
ミエリン塩基性タンパク質は、神経の髄鞘形成の過程において重要であり、乏突起膠細胞およびシュワン細胞などの神経系中の細胞のミエリン鞘中に見出される。ＭＢＰ転写物は、骨髄および免疫系中にも見出される。ミエリン鞘の１つの機能は、軸索のインパルス伝導の速度を増加させることである。ＭＢＰは、ミエリンの正しい構造を維持するのに役立ち、ミエリン膜中の脂質と相互作用する。ＭＢＰは、ＣＮＳおよび様々な造血細胞に局在することが知られている。
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド
ミエリン塩基性タンパク質は、神経の髄鞘形成の過程において重要であり、乏突起膠細胞およびシュワン細胞などの神経系中の細胞のミエリン鞘中に見出される。ＭＢＰ転写物は、骨髄および免疫系中にも見出される。ミエリン鞘の１つの機能は、軸索のインパルス伝導の速度を増加させることである。ＭＢＰは、ミエリンの正しい構造を維持するのに役立ち、ミエリン膜中の脂質と相互作用する。ＭＢＰは、ＣＮＳおよび様々な造血細胞に局在することが知られている。
【0053】
ＭＢＰは、多発性硬化症（ＭＳ）などの脱髄性疾患の病因に関与している。研究により、ＭＳの病因におけるＭＢＰに対する抗体の役割が実証されている。
【0054】
一局面において、ＭＢＰの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１１として示されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッションＰ０２６８６－１を有する配列を含む：
【化1】
【0055】
ＭＢＰの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１１またはそのバリアントもしくは断片を含み得る。
【0056】
適切には、ＭＢＰの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッションＰ０２６８６－５などのＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッションＰ０２６８６－１のアイソフォームであり得る。アイソフォームＰ０２６８６－５は、上記の基準配列（配列番号１１）とは次のように異なる：アミノ酸残基１～１３３が欠損している。
【0057】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッションＰ０２６８６－５を配列番号１３として示す：
【化2】
【0058】
特に明記しない限り、本明細書で使用されるＭＢＰ ＸＸＸ－ＸＸＸは、参照により本明細書に組み込まれるＭｕｒａｒｏら、ＪＣＩ１９９７；１００，２，３３９－３４９において使用される、または配列番号１３（開始因子であるメチオニンを含まない）を参照することによる付番を指す。
【0059】
当技術分野において利用可能な方法を使用して、ペプチドがＭＨＣ分子によって提示され、Ｔ細胞によって認識されることが可能かどうかを決定し得る。例えば、アッセイは、試験されるべきＭＨＣ：ペプチド複合体を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、本明細書で定義されるＴＣＲを含むＴ細胞と共培養することを含み得る。次いで、ペプチドの提示の成功の指標として（例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイによって）、Ｔ細胞増殖を測定することができる。あるいは、エフェクターサイトカイン産生も測定され得る。
【0060】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」とは、ＴＣＲが当該ペプチドに結合するが、他のペプチドには結合しない、または他のペプチドに対してより低い親和性で結合することを意味する。
【0061】
２つの分子、例えば、ＴＣＲとペプチドまたはその断片間での結合親和性は、例えば、解離定数（ＫＤ）の決定によって定量され得る。ＫＤは、ＴＣＲとペプチド間での複合体形成および解離の速度論の測定によって、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））によって決定することができる。複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と称される。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを通じてｋａおよびｋｄに関係づけられる。
【0062】
異なる分子相互作用に関連する結合親和性、例えば、異なるＴＣＲおよびペプチドの結合親和性の比較は、個々のＴＣＲ／ペプチド複合体に対するＫＤ値の比較によって比較され得る。
【0063】
ペプチドは、任意のヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）によって提示されることが可能であり得る。
【0064】
一局面において、ペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ４によって提示されることが可能である。
【0065】
一局面において、ペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１分子によって提示されることが可能である。
【0066】
一局面において、ペプチドは、ＭＢＰ１１１－１２９：ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ（配列番号１２）と少なくとも９０％の同一性を有する。ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）と比較して変異され得る。例えば、改変されたＭＢＰペプチドが改変されていないペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である限り、ＭＢＰペプチドは、アミノ酸の挿入、欠失または置換によって変異され得る。ペプチドは、例えば、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）に対して３、２、１または０の変異を有し得る。適切には、ペプチドは、例えば、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）に対して３、２、１または０の保存的変異を有し得る。適切には、ペプチドは、例えば、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）に対して３、２、１または０の挿入を有し得る。適切には、ＭＢＰペプチド断片は、例えば、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）に対して３、２、１または０の欠失を有し得る。適切には、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）ペプチド断片は、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）ペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
【0067】
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＣＤＲ３は、処理された抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１は抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することも示されているのに対して、β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識すると考えられている。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に配置されている。これらの領域は、ＴＣＲ可変領域の構造を提供する。
【0068】
本発明のＴＣＲは、そのペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用することができるのに十分なその可変ドメインを含む。このような相互作用は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置を使用して測定することができる。適切には、ＴＣＲはＨＬＡ－ＤＲ４またはＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１と相互作用し得る。
【0069】
ＴＣＲ可変領域のレパートリーは、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および多様性（Ｄ）遺伝子の組み合わせ的連結によって、ならびにＮ領域の多様化（酵素デオキシヌクレオチジル－トランスフェラーゼによって挿入されたヌクレオチド）によって生成される。
【0070】
α鎖は、ＶセグメントとＪセグメント間での組換え事象から形成される。β鎖は、Ｖ、ＤおよびＪセグメントを伴う組換え事象から形成される。
【0071】
ＴＣＲδ遺伝子座も含むヒトＴＣＲα遺伝子座は、１４番染色体上（１４ｑ１１．２）に位置する。ＴＣＲβ遺伝子座は７番染色体（７ｑ３４）上に位置する。ＴＣＲα鎖の可変領域は、４６個の異なるＶα（可変）セグメントのうちの１つと５８個のＪα（連結）セグメントのうちの１つとの間での組換えによって形成される（参照により本明細書に組み入れられるＫｏｏｐら；１９９４；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；１９：４７８－４９３）。ＴＣＲβ鎖の可変領域は、５４個のＶβ、１４個のＪβおよび２個のＤβ（多様性）セグメント間での組換えから形成される（参照により本明細書に組み入れられるＲｏｗｅｎら、１９９６；Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７２：１７５５－１７６２）。
【0072】
各ＴＣＲ鎖遺伝子座に対するＶおよびＪ（および適宜Ｄ）遺伝子セグメントが同定されており、各遺伝子の生殖系列配列は公知であり、アノテーションが付されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｃａｖｉｎｅｒ＆Ｌｅｆｒａｎｃ；２０００；Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ；１７：８３－９６およびＦｏｌｃｈ＆Ｌｅｆｒａｎｃ；２０００；Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ；１７：４２－５４を参照）。
【0073】
天然のＴＣＲのα鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３は、Ｖα遺伝子によってコードされる。天然ＴＣＲのβ鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２およびＦＲ３は、Ｖβ遺伝子によってコードされる。
【0074】
各可変遺伝子の生殖系列配列は当技術分野において公知であるので（Ｓｃａｖｉｎｅｒ＆Ｌｅｆｒａｎｃを参照；上記のとおり、およびＦｏｌｃｈ＆Ｌｅｆｒａｎｃ；上記）、特定のＴＣＲのＶαおよび／またはＶβを配列決定することができ、ＴＣＲにおいて利用される生殖系列Ｖセグメントを同定することができる（例えば、Ｈｏｄｇｅｓら；２００３；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ；５６：１－１１，Ｚｈｏｕら；２００６；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；８６；３１４－３２１、参照により本明細書に組み入れられる）。
【0075】
本発明は、操作されたＴ細胞受容体を含む操作されたＴｒｅｇを提供する。
【0076】
本発明は、ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）と少なくとも９０％の同一性を含むペプチドが主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されると、前記ペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能であるＴＣＲを含む操作されたＴｒｅｇを提供する。
【0077】
一局面において、ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、
前記α鎖および前記β鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列は、以下のとおり：
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント、
である。
前記α鎖および前記β鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列は、以下のとおり：
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント、
である。
【0078】
一局面において、ＴＣＲのα鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１α－ＴＩＳＧＴＤＹ（配列番号３）
ＣＤＲ２α－ＧＬＴＳＮ（配列番号４）
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み、
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１β－ＤＦＱＡＴＴ（配列番号５）
ＣＤＲ２β－ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号６）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含む。
ＣＤＲ１α－ＴＩＳＧＴＤＹ（配列番号３）
ＣＤＲ２α－ＧＬＴＳＮ（配列番号４）
ＣＤＲ３α－ＴＶＹＧＧＡＴＮＫＬＩ（配列番号１）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み、
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１β－ＤＦＱＡＴＴ（配列番号５）
ＣＤＲ２β－ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号６）
ＣＤＲ３β－ＳＡＲＧＧＳＹＮＳＰＬＨ（配列番号２）
または最大３つのアミノ酸変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含む。
【0079】
適切には、ＣＤＲ中のアミノ酸変化は、保存的置換、挿入または欠失である。好ましくは、アミノ酸変化は保存的置換である。
【0080】
一局面において、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＣＤＲ配列は本明細書に開示されるとおりである。
【0081】
適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0082】
適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも９５％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも９７％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含み、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。
【0083】
換言すれば、ＴＣＲは、本明細書で定義されるα鎖およびβ鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号７および／または配列番号８の残りの配列にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列同一性を含み得る。
【0084】
別の局面において、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0085】
適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９７と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号７と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号８と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例示的なＴＣＲα鎖可変領域（配列番号７）
例示的なＴＣＲβ鎖可変領域（配列番号８）
例示的なＴＣＲα鎖可変領域（配列番号７）
【化3】
【化4】
【0086】
適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含み；および／またはＴＣＲのβ鎖は、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するヒト定常領域アミノ酸配列を含む。
【0087】
適切には、ＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。適切には、ＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号２６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0088】
適切には、ＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。適切には、ＴＣＲα鎖定常領域は、配列番号２７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0089】
適切には、ＴＣＲのβ鎖は、配列番号２７に示されている位置２２にシステイン残基を含むヒト定常領域アミノ酸配列を含む。
例示的なＴＣＲα鎖定常領域（配列番号２６）
例示的なＴＣＲβ鎖定常領域（配列番号２７）
例示的なＴＣＲα鎖定常領域（配列番号２６）
【化5】
【化6】
【0090】
一局面において、ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例示的なＴＣＲα鎖（配列番号９）
例示的なＴＣＲα鎖（配列番号９）
【0091】
【化7】
【0092】
【化8】
【0093】
適切には、ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０に示されるように、定常領域（下線が付されている）の位置２２にシステイン残基を含むヒト定常領域アミノ酸配列を含む。
【0094】
適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号９と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；およびＴＣＲのβ鎖は、配列番号１０と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0095】
別の局面において、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは、それぞれ、追加のシステイン残基を含み、α鎖とβ鎖との間での付加的なジスルフィド結合の形成を可能にする。
【0096】
適切には、さらなるジスルフィド結合の形成のために、定常α鎖中の残基４８はトレオニンからシステインに変換され、定常β鎖の残基５７はセリンからシステインに変換される。
【0097】
適切には、ＴＣＲはコドン最適化される。
【0098】
適切には、ＴＣＲは、マウスにおける発現のためにコドン最適化される。
【0099】
一局面において、ＴＣＲ中で用いられる定常ドメインはマウス配列である。
【0100】
適切には、定常領域はマウス化されている。例えば、定常－αおよび定常－βドメインの両方がマウス化されている。
【0101】
別の局面において、ＴＣＲは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。適切には、ＴＣＲにおいて用いられる定常ドメインはヒト配列である。
【0102】
一局面において、ＴＣＲは、例えば、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含み得る。
【0103】
本ＴＣＲは、生殖系列ＶαまたはＶβ遺伝子によってコードされない本明細書で定義される１またはそれを超えるアミノ酸残基を含み得る。換言すれば、ＴＣＲは、変化していない生殖系列ＶαまたはＶβ遺伝子によってコードされる対応するα鎖および／またはβ鎖と比較して、本明細書に記載される位置の１またはそれより多くにおいて変化したアミノ酸残基を含むα鎖および／またはβ鎖の一部を含み得る。
【0104】
本明細書においてフレームワーク（ＦＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）として同定されるアミノ酸残基は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ’（ＩＭＧＴ）に従って同定される。この系は当技術分野において周知であり（Ｌｅｆｒａｎｃｅら；２００３；Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ；２７：５５－７７）、可変領域の構造の高度な保存に基づいている。付番は、ＦＲおよびＣＤＲの定義、Ｘ線回折研究からの構造データ、および超可変ループの特徴付けを考慮し、組み合わせている。
【0105】
ＦＲおよびＣＤＲ領域の境界画定は、ＩＭＧＴ付番システム内で定義されている。ＦＲ１領域は、位置２３に第１のＣＹＳを有する位置１～２６（Ｖ－ＧＥＮＥ群またはサブグループに応じて２５～２６のアミノ酸）を含む。ＦＲ２領域は、位置４１に保存されたＴＲＰを有する位置３９～５５（１６～１７のアミノ酸）を含む。ＦＲ３領域は、位置８９に保存された疎水性アミノ酸および位置１０４に第２のＣＹＳを有する位置６６～１０４（ＶＧＥＮＥ群またはサブグループに応じて３６～３９アミノ酸）を含む。ＩＧＭＴ付番システムの残基１は、ＦＲ１中の最初の残基である。ＩＧＭＴ付番システムの残基１０４は、ＦＲ３中の最後の残基である。
【0106】
本発明によるＴＣＲを生成するのに適した方法は、当技術分野において公知である。
【0107】
例えば、ＴＣＲをコードする核酸配列中の特定のヌクレオチドを変化させるために、変異誘発が実施され得る。このような変異誘発は、本明細書に記載のアミノ酸残基の１またはそれより多くを含むようにＴＣＲのアミノ酸配列を変化させる。
【0108】
変異誘発法の一例は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法（Ｐａｐｗｏｒｔｈら；１９９６；Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ；９（３）；３－４）である。この方法は、ｐｆｕポリメラーゼなどの高忠実度非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用する熱サイクリング反応における鋳型核酸配列を増幅するための相補的変異原性プライマーの対の使用を含む。
【0109】
本明細書で使用される「１またはそれを超える」または「少なくとも１つ」という用語は、本明細書に記載の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるアミノ酸残基を含み得る。
【0110】
本明細書で使用される「２またはそれを超える」という用語は、本明細書に記載の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるアミノ酸残基を含み得る。
保存的置換
保存的置換
【0111】
適切には、本発明において所与の位置に存在するアミノ酸残基は、所与の配列番号について列挙されたアミノ酸と生化学的に類似する残基として定義され得る。
【0112】
類似の生化学的特性を有するアミノ酸は、保存的置換を介して置換され得るアミノ酸として定義され得る。
【0113】
保存的アミノ酸置換は、ＴＣＲの高い発現が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
【0114】
保存的置換は、例えば以下の表３に従って行われ得る。第２の列内の同じブロック内の、好ましくは第３の列内の同じ行内のアミノ酸は、互いに対して代用できる：
表３
表３
【表3】
【0115】
本発明は、相同置換（本明細書において、置換および置き換えはいずれも、既存のアミノ酸残基の代替残基での交換を意味するために使用される）、すなわち、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性などのような同様のものから同様のものへの置換（like-for-like substitution）も包含する。
【0116】
特定の個々のアミノ酸を参照することによって本明細書で明示的に述べられていなければ、アミノ酸は、以下に列挙される保存的置換を使用して置換され得る。
【0117】
脂肪族非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン残基であり得る。
【0118】
脂肪族極性非荷電アミノは、システイン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギンまたはグルタミン残基であり得る。
【0119】
脂肪族極性荷電アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン残基であり得る。
【0120】
芳香族アミノ酸は、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン残基であり得る。
【0121】
適切には、表３の同じ行内のアミノ酸間で保存的置換が行われ得る。
配列
配列
【0122】
本発明は、さらに、本明細書に記載のＴＣＲα鎖および／またはβ鎖をコードするヌクレオチド配列を提供する。一局面において、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列が細胞中に導入され得る。
【0123】
適切には、ＴＣＲα鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４もしくは３２、または配列番号１４もしくは３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み得る。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有し得る。
配列番号１４
配列番号３２
配列番号１４
【化9】
【化10】
【0124】
適切には、ＴＣＲβ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５もしくは３３、または配列番号１５もしくは３３と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み得る。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有し得る。
配列番号１５
配列番号３３
配列番号１５
【化11】
【化12】
【化13】
【0125】
適切には、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６、または配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み得る。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有し得る。
配列番号１６
配列番号１６
【化14】
【0126】
適切には、ＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、または配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み得る。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有し得る。
配列番号１７
配列番号１７
【化15】
【0127】
適切には、ＴＣＲのα鎖をコードする核酸配列は、配列番号２８または３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖をコードする核酸配列は、配列番号２８または３０と少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0128】
適切には、ＴＣＲのβ鎖をコードする核酸配列は、配列番号２９または３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖をコードする核酸配列は、配列番号２９または３１と少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0129】
適切には、核酸配列は、配向５’α鎖－β鎖３’のＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）ＴＣＲのα鎖をコードし、配列番号２８と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）ＴＣＲのβ鎖をコードし、配列番号３０と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列とを含む。
【0130】
適切には、核酸配列は、配向５’β鎖－α鎖３’のＴＣＲ鎖を提供し、（ｉ）ＴＣＲのβ鎖をコードし、配列番号３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列と、（ｉｉ）ＴＣＲのα鎖をコードし、配列番号２９と少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列とを含む。
配列番号２８－例示的なＴＣＲα鎖
配列番号２９－例示的なＴＣＲα鎖
配列番号３０－例示的なＴＣＲβ鎖
配列番号３１－例示的なＴＣＲβ鎖
配列番号２８－例示的なＴＣＲα鎖
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【0131】
本明細書で使用される場合、「導入された」という用語は、外来ＤＮＡを細胞中に挿入するための方法を指す。本明細書で使用される場合、導入されるという用語は、形質導入方法と形質移入方法の両方を含む。形質移入は、非ウイルス法によって核酸を細胞中に導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して外来ＤＮＡを細胞中に導入するプロセスである。
【0132】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互いに同義であることを意図している。核酸配列は、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列または部分ゲノムＤＮＡ配列などの任意の適切なタイプのヌクレオチド配列であり得る。
【0133】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常の意味で使用され、典型的にはα－アミノ基と隣接するアミノ酸のカルボキシル基との間でのペプチド結合によって一方が他方に連結された一連の残基、典型的にはＬ－アミノ酸を意味する。本用語は、「タンパク質」と同義である。
【0134】
遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが当業者によって理解される。さらに、ポリペプチドがその中で発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、当業者は、日常的な技術を使用して、本明細書に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることを理解されたい。
【0135】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明による核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明による核酸は、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が、当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホナートおよびホスホロチオアート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載されている使用のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。このような修飾は、関心対象のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【0136】
ポリヌクレオチドは、単離された形態または組換え形態であり得る。ポリヌクレオチドはベクター中に組み込まれ得、ベクターは宿主細胞中に組み込まれ得る。このようなベクターおよび適切な宿主は、本発明のさらに別の局面を形成する。
【0137】
ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【0138】
ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対存在量のバイアスに対応する。コドンが対応するｔＲＮＡの相対存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変更することによって、発現を増加させることが可能である。適切には、ポリヌクレオチドは、疾患のマウスモデルにおける発現に対してコドン最適化され得る。適切には、ポリヌクレオチドは、ヒト対象における発現に対してコドン最適化され得る。
【0139】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀なコドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変更することによって、哺乳動物の産生細胞中でのパッケージング成分の発現の増加を達成することができる。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞および様々な他の生物について当技術分野で公知である。
【0140】
コドン最適化は、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび潜在的スプライス部位の除去も含み得る。
【0141】
ポリヌクレオチドは、α鎖をコードする核酸配列とβ鎖をコードする核酸配列の両方が同じｍＲＮＡ転写物から発現されることを可能にする核酸配列を含み得る。
【0142】
例えば、ポリヌクレオチドは、α鎖をコードする核酸配列とβ鎖をコードする核酸配列との間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列の中央での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。
【0143】
ポリヌクレオチドは、α鎖をコードする核酸配列と、内部自己切断配列によって連結された、β鎖をコードする核酸配列とを含み得る。
【0144】
内部自己切断配列は、α鎖を含むポリペプチドとβ鎖を含むポリペプチドとが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【0145】
切断部位は、ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部切断活性も必要とせずにポリペプチドが個々のペプチドに直ちに切断されるような、自己切断性であり得る。
【0146】
便宜上、本明細書においては「切断」という用語が使用されるが、切断部位は、古典的な切断以外の機構によってペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチドの場合、宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果など、「切断」活性を説明するための様々なモデルが提案されてきた（参照により本明細書に組み入れられるＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。タンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに、切断部位がタンパク質を別個の実体として発現させる限り、このような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要ではない。
【0147】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。
【0148】
類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関してバリアントを考えることが可能であり、好ましくは、バリアントは配列同一性に関して表される。
【0149】
配列比較は、目測で、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの公的におよび商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２またはそれを超える配列間の配列同一性を計算することができる。
【0150】
配列同一性は、連続した配列にわたって計算され得る、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基（例えば、５０個未満の連続するアミノ酸）にわたってのみ行われる。
【0151】
これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば、他の点では同一の配列の対において、１つの挿入または欠失が、その後のアミノ酸残基をアラインメントから除外し、したがって、全体的なアラインメントを実施した場合に、潜在的に％相同性の大きな低下をもたらすことを考慮に入れることができない。そのため、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度に不利にすることなく、可能性のある挿入および欠失を考慮に入れる最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所相同性を最大化することを試みるために配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【0152】
しかしながら、同じ数の同一のアミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する（２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列よりも高いスコアを達成するように、これらのより複雑な方法は、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対して相対的に高いコストを課し、ギャップ内の各後続する残基に対してより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が、通例、使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生じる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対して－１２、各伸長に対して－４である。
【0153】
したがって、最大％配列同一性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮に入れて、最適なアラインメントの生成を必要とする。このようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；参照によって本明細書に組み入れられるＤｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書－Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（参照により本明細書に組み込まれるＡｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３－４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはいずれも、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（参照により本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌら、１９９９同書，ｐａｇｅｓ７－５８～７－６０を参照）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【0154】
一態様において、配列同一性は、配列の全体にわたって決定される。一態様において、配列同一性は、本明細書に列挙される配列と比較されている候補配列の全体にわたって決定される。
【0155】
最終的な配列同一性は同一性に関して測定することができるが、アラインメント過程自体は、典型的には、全か無かの対比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性または進化的距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケール化された類似性スコア行列が一般に使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルト行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、供給される場合、公のデフォルト値または特注の記号比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージについては公のデフォルト値、または他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
【0156】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、通例、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【0157】
本発明による「バリアント」という用語は、得られたアミノ酸配列が非修飾配列と実質的に同じ活性を保持するという場合には、配列からのまたは配列への１（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変動、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。例えば、保存的アミノ酸置換が行われ得る。本明細書で使用される場合、バリアントポリペプチドは、本明細書に示される配列と少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むと見なされる。
【0158】
一局面において、バリアントは親配列の機能を維持する。
ＦＯＸＰ３
ＦＯＸＰ３
【0159】
一局面において、本発明による細胞は、同じくこの細胞に導入されたＦＯＸＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0160】
一局面において、本発明の細胞、操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物は、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする操作された核酸配列を含み得る、言い換えれば、操作された核酸配列は、細胞の内因性ゲノムの一部ではない。
【0161】
ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発達および機能における制御経路の主要な制御因子として機能する。
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、ヒト由来であり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション：Ｑ９ＢＺＳ１：
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、ヒト由来であり、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション：Ｑ９ＢＺＳ１：
【化20】
【0162】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ポリペプチドは、配列番号１８と８５、９０、９５、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、断片はＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として作用することができる。
【0163】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８の天然のバリアントであり得る。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８のアイソフォームである。例えば、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８と比較して、アミノ酸位置７２～１０６の欠失を含み得る。あるいは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１８と比較して、アミノ酸位置２４６～２７２の欠失を含み得る。
【0164】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む：
【化21】
【0165】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ポリペプチドは、配列番号１９と８５、９０、９５、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、断片はＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として作用することができる。
【0166】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９の天然のバリアントであり得る。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９のアイソフォームである。例えば、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号９と比較して、アミノ酸位置７２～１０６の欠失を含み得る。あるいは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１９と比較して、アミノ酸位置２４６～２７２の欠失を含み得る。
【0167】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２０に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる：
【化22】
【化23】
【0168】
本発明のいくつかの態様において、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０と少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一であるポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含む。本発明のいくつかの態様において、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０またはその機能的断片を含む。
【0169】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２１に示される核酸配列によってコードされる：
【化24】
【0170】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２１に示される核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも８０％同一である核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２１と８５、９０、９５、９８または９９％同一である核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、断片はＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、断片によってコードされるポリペプチドは、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として作用することができる。
【0171】
ＴＣＲおよび／またはＦＯＸＰ３をコードする核酸は、開始コドンの上流にリーダー配列を含み得る。この配列は、転写物の翻訳を調節し得る。例として、本発明において使用するための適切リーダー配列は、ＭＥＫＭＬＥＣＡＦＩＶＬＷＬＱＬＧＷＬＳＧ（配列番号２２）およびＭＬＣＳＬＬＡＬＬＬＧＴＦＦＧＶＲ（配列番号２３）である。
【0172】
さらなる局面において、本発明は、本明細書で定義されるＴＣＲをコードする第１の核酸配列と、ＦＯＸＰ３をコードする第２の核酸とを含む核酸配列のキットを提供する。
ベクター
ベクター
【0173】
本発明は、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。適切には、ベクターは、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。一局面において、本明細書で定義されるＴＣＲをコードする核酸およびＦＯＸＰ３をコードする核酸などの本発明の１またはそれを超える核酸配列を含むベクターのキットが提供される。
【0174】
「ベクター」という用語は、発現ベクター、すなわちＴＣＲの発現を可能にする構築物、すなわち本発明によるα鎖および／またはβ鎖を含む。適切には、発現ベクターはさらに、ＦＯＸＰ３ポリペプチドの発現を可能にする。いくつかの態様において、ベクターはクローニングベクターである。
【0175】
ベクターが、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドに加えて、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む場合；ベクターは、５’ＦＯＸＰ３－ＴＣＲ３’の配向を有し得る。したがって、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに対して５’であり得る。
【0176】
適切には、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドは、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列とＴＣＲをコードする核酸配列の両方が同じｍＲＮＡ転写物から発現されることを可能にする核酸配列によって、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドから分離され得る。
【0177】
例えば、ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列と（ｉｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列との間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列の中央での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。
【0178】
ポリヌクレオチドは、内部自己切断配列によって連結された（ｉ）ＦＯＸＰ３および（ｉｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列を含み得る。ＴＣＲαおよびβ鎖をコードするポリヌクレオチドは、内部自己切断配列によっても分離され得る。
【0179】
適切には、ベクターは、構造：５’強力なプロモーター（例えば、ＬＴＲ）－ＦｏｘＰ３－２Ａ－ＴＣＲ－３’ＬＴＲを有し得る。ここで、ＦＯＸＰ３発現は、最適な発現のために強力なＬＴＲプロモーターによって直接駆動される。ＴＣＲの前には２Ａ配列が存在し、したがって、ＴＣＲの発現は、ＬＴＲプロモーター活性および２Ａ切断活性の両方に依存する。重要なことに、５’から３’方向にＦＯＸＰ３がＴＣＲに先行する配置は、ＦＯＸＰ３が発現された場合にのみＴＣＲ発現が起こり得ること、および、ＦＯＸＰ３なしでのＴＣＲの発現が起こらないことを確実にする。操作されたＴｒｅｇがエフェクター表現型を獲得するリスクを低下させ、および／またはＴＣＲを出発集団中に存在するＴエフェクター細胞中に導入することに関連するリスクを低下させるので、これは、操作されたＴｒｅｇの本文脈における具体的な利点である。
【0180】
切断配列は、（ｉ）ＦＯＸＰ３および（ｉｉ）ＴＣＲを含むポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【0181】
切断部位は、ポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部切断活性も必要とせずにポリペプチドが個々のペプチドに直ちに切断されるような、自己切断性であり得る。
【0182】
便宜上、本明細書においては「切断」という用語が使用されるが、切断部位は、古典的な切断以外の機構によってペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチドの場合、宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果など、「切断」活性を説明するための様々なモデルが提案されてきた（参照により本明細書に組み入れられるＤｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。タンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに、切断部位がタンパク質を別個の実体として発現させる限り、このような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要ではない。
【0183】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。
【0184】
類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関してバリアントを考えることが可能であり、好ましくは、バリアントは配列同一性に関して表される。
【0185】
配列比較は、目測で、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの公的におよび商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２またはそれを超える配列間の配列同一性を計算することができる。
【0186】
適切には、本発明のベクターから発現されるＦＯＸＰ３ポリペプチドは、自己切断ペプチド、例えば２Ａ自己切断ペプチドのＮ末端に配置され得る。このようなＦＯＸＰ３－２Ａポリペプチドは、配列番号２４もしくは２５として示される配列またはこれらと少なくとも８０％同一である配列番号２４もしくは２５のバリアントを含み得る。適切には、バリアントは、配列番号２４または２５と少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一であり得る。
配列番号２４
配列番号２５
配列番号２４
【化25】
【化26】
【0187】
適切なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、ポリペプチドと複合体化されたまたは固相粒子上に固定化された核酸が挙げられ得る。
【0188】
ウイルス送達系としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが挙げられる。
【0189】
レトロウイルスは、溶菌ウイルスとは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。これに関して、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染実体である。レトロウイルスが細胞に感染すると、逆転写酵素によってそのゲノムがＤＮＡ形態に変換される。ＤＮＡコピーは、新しいＲＮＡゲノムおよび感染ウイルス粒子の構築に必要な、ウイルスによってコードされるタンパク質の産生のための鋳型として機能する。
【0190】
多くのレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス－２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ならびにレンチウイルスを含むすべての他のレトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄｉａｅ）が存在する。
【0191】
レトロウイルスの詳細なリストは、参照により本明細書に組み入れられるＣｏｆｆｉｎら（“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ７５８－７６３）に見出すことができる。
【0192】
レンチウイルスもレトロウイルス科に属するが、レンチウイルスは、参照により本明細書に組み込まれる分裂細胞および非分裂細胞（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．３０５３－３０５８）の両方に感染することができる。
【0193】
ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを細胞、例えば本明細書で定義される宿主細胞に導入することが可能であり得る。ベクターは、理想的には、α鎖および／またはβ鎖が宿主細胞中で適切に発現されるように、宿主細胞中で持続的な高レベルの発現をすることができるべきである。
【0194】
ベクターはレトロウイルスベクターであり得る。ベクターは、ＭＰ７１ベクター骨格を基礎とし得る、またはＭＰ７１ベクター骨格から誘導可能であり得る。ベクターは、ウッドチャック肝炎応答エレメント（ＷＰＲＥ）の完全長バージョンまたは短縮バージョンを欠如し得る。
【0195】
ヒト細胞の効率的な感染のために、ウイルス粒子は両種指向性エンベロープまたはテナガザル白血病ウイルスエンベロープでパッケージングされ得る。
細胞
細胞
【0196】
本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞、例えば宿主細胞を提供する。
【0197】
宿主細胞は、ＴＣＲを発現および産生するために使用することができる任意の細胞であり得る。
【0198】
適切には、細胞は、典型的なＴ細胞などのＴ細胞である。
【0199】
適切には、細胞はＴｒｅｇ細胞である。
【0200】
一局面において、Ｔ細胞またはＴｒｅｇなどの細胞は、対象から得られた血液から単離され得る。適切には、Ｔ細胞またはＴｒｅｇなどの細胞は、対象から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離される。
【0201】
適切には、細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【0202】
一局面において、細胞は幹細胞である。
【0203】
別の局面において、細胞は前駆細胞である。
【0204】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、同じ種類のより多くの幹細胞を無限に生じさせることができ、分化によってそこから他の特殊化された細胞が生じ得る未分化細胞を意味する。幹細胞は複能性である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。
【0205】
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、分化して１またはそれを超える種類の細胞を形成することができるが、インビトロで制限された自己再生を有する細胞を意味する。
【0206】
適切には、細胞は、ＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化することができる。
【0207】
適切には、細胞は、ＴｒｅｇなどのＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞に分化する能力を有する。
【0208】
適切には、細胞はヒト細胞である。適切な細胞はヒトＴｒｅｇである。
【0209】
適切には、細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。適切には、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。適切には、細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。適切には、細胞は臍帯血から取得され得る。適切には、細胞は成体末梢血から取得され得る。
【0210】
いくつかの局面において、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は臍帯血から取得され得る。臍帯血は、当技術分野において公知の技術に従って採取することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，１４７，６２６号および同第７，１３１，９５８号）。
【0211】
一局面において、ＨＳＰＣは、多能性幹細胞源、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）から取得され得る。
【0212】
本明細書で使用される場合、「造血幹細胞・前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」という用語は、抗原マーカーＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋）細胞およびこのような細胞の集団を指す。特定の態様において、「ＨＳＰＣ」という用語は、抗原マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）および系統（ｌｉｎ）マーカーの非存在によって同定される細胞を指す。ＣＤ３４＋および／またはＬｉｎ（－）細胞を含む細胞の集団は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
【0213】
ＨＳＰＣは、大腿骨、股関節、肋骨、胸骨および他の骨を含む成体の骨髄から取得または単離することができる。ＨＳＰＣを含有する骨髄吸引液は、針および注射器を使用して股関節から直接取得または単離することができる。ＨＳＰＣの他の供給源としては、臍帯血、胎盤血、動員末梢血、ワルトン膠様質、胎盤、胎児血液、胎児肝臓または胎児脾臓が挙げられる。特定の態様において、治療用途において使用するために十分な量のＨＳＰＣを採取することは、対象中の幹細胞および前駆細胞を動員することを必要とし得る。
【0214】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、多能性状態に再プログラムされた非多能性細胞を指す。対象の細胞が多能性状態に再プログラムされたら、次いで、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞（それぞれ、ＨＳＣおよびＨＰＣ）などの所望の細胞型にプログラムされ得る。
【0215】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」という用語は、細胞の分化能（potency）をより分化していない状態へと増加させる方法を指す。
【0216】
本明細書で使用される場合、「プログラミング」という用語は、細胞の分化能を減少させ、または細胞をより分化した状態に分化させる方法を指す。
【0217】
適切には、細胞は対象に合致しているか、または対象にとって自家である。細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の状況で、または関係のないドナー（unconnected donor）（第三者）からの末梢血のいずれかからエクスビボで生成され得る。
【0218】
適切には、細胞は対象にとって自家である。適切には、対象はヒトである。
【0219】
いくつかの局面において、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の免疫細胞へのエクスビボ分化に由来し得る。これらの例では、細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによる形質移入を含む多くの手段のうちの１つによって本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【0220】
適切には、細胞は、本発明のＴＣＲに加えて、ウイルスベクターによる形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡによる形質移入を含む多くの手段のうちの１つによってＦＯＸＰ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【0221】
本明細書で使用される場合、「典型的なＴ細胞」またはＴｃｏｎｖという用語は、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えて、表面抗原分類４）ＣＤ４または表面抗原分類８（ＣＤ８）であり得る補助受容体を発現するＴリンパ球細胞を意味する。典型的なＴ細胞は、末梢血、リンパ節および組織中に存在する。ＦＯＸＰ３は、胸腺由来のＴｒｅｇによって発現され、最近活性化された典型的なＴ細胞によって発現され得る。
【0222】
本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」またはＴｒｅｇという用語は、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５およびＦＯＸＰ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）を発現するＴ細胞を意味する。Ｔｒｅｇはまた、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下でまたは表面タンパク質ＣＤ１２７の低レベル発現と組み合わせて、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を使用して同定され得る（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－）。Ｔｒｅｇはまた、細胞表面上に高レベルのＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子－４）またはＧＩＴＲ（糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体）を発現し得る。典型的なＴ細胞とは異なり、制御性Ｔ細胞はＩＬ－２を産生せず、したがってベースラインにおいてアネルギーである。Ｔｒｅｇ細胞には、胸腺由来の天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞および末梢で生成された誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞が含まれる。
【0223】
一局面において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞である。
【0224】
一局面において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞である。
【0225】
一局面において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞である。
【0226】
本明細書で使用される場合、「天然のＴｒｅｇ」という用語は、胸腺由来のＴｒｅｇを意味する。天然のＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ヘリオス＋ニューロピリン１＋である。ｉＴｒｅｇと比較して、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ－１（プログラム細胞死－１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、ヘリオス（Ｉｋｚｆ２）およびＣＤ７３のより高い発現を有する。ｎＴｒｅｇは、個別に、ヘリオスタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の発現に基づいてｉＴｒｅｇと区別され得る。
【0227】
本明細書で使用される場合、「誘導性制御性Ｔ細胞」（ｉＴｒｅｇ）という用語は、胸腺の外部で成熟したＣＤ４＋の典型的なＴ細胞から発生するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ヘリオス－ニューロピリン１－Ｔ細胞を意味する。例えば、ｉＴｒｅｇは、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βの存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦＯＸＰ３－細胞からインビトロで誘導することができる。
【0228】
本発明の方法は、本明細書に記載されているように、本ＴＣＲをコードする第１のヌクレオチド配列とＦＯＸＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列とを天然のＴｒｅｇ（内因性ＦＯＸＰ３を既に発現している）中に導入することを含み得る。適切には、本発明の方法は、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドに加えて、本ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを本明細書において定義される天然のＴｒｅｇ中に導入することを含み、ベクターは、本明細書に記載されているとおり、５’ＦＯＸＰ３－ＴＣＲ３’の配向を有する。したがって、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに対して５’であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（内因性ＦＯＸＰ３を既に発現している）中での外因性ＦＯＸＰ３発現が制御性Ｔ細胞の制御機能を増強することを示した。特に、本発明者らは、（例えば、外因性ＦＯＸＰ３を導入することによって）内因性ＦＯＸＰ３を既に発現しているＴｒｅｇ中でのＦＯＸＰ３発現を増加させることが、内因性ＦＯＸＰ３を発現しない典型的なＴ細胞中で外因性ＦＯＸＰ３を発現することによって提供される制御機能より大きな程度で、Ｔｒｅｇの制御機能を増強することを決定した。さらに、内因性ＦＯＸＰ３を既に発現しているＴｒｅｇ中でＦＯＸＰ３発現を増加させることは、対象への投与後にインビボでのＴｒｅｇ機能プロファイルの改善された保持を可能にする。例えば、外因性ＦＯＸＰ３を発現しない天然のＴｒｅｇは、対象への投与後にそれらのＴｒｅｇプロファイルを失い得ることが決定されており、例えば、外因性ＦＯＸＰを発現しない天然のＴｒｅｇは、対象への投与に続く期間後に低下したレベルのＦＯＸＰ３発現を有し、炎症促進性エフェクターサイトカインを産生することが可能であり得る。本発明によって提供されるＴｒｅｇは、ＦＯＸＰ３発現を保持し、対象への投与に続く期間後に炎症促進性エフェクターサイトカインを産生する能力が低下し得る。
組成物
組成物
【0229】
本発明は、本発明による操作されたＴｒｅｇ、ベクターまたは細胞を含む組成物も提供する。適切には、本発明は、本発明による操作されたＴｒｅｇを含む組成物を提供する。適切には、本発明は、本発明によるベクターを含む組成物を提供する。適切には、本発明は、本発明による細胞を含む組成物を提供する。
【0230】
いくつかの態様において、組成物は医薬組成物である。このような医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤または佐剤を含み得る。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬実務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（またはこれらに加えて）、任意の適切な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）および他の担体剤を含み得る。
【0231】
医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定であるべきである。非経口投与のための製剤としては、懸濁剤、液剤、油性または水性ビヒクル中の乳剤、ペースト剤、および本明細書において論述されているような埋め込み可能な徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒を用いて調製され得る。本発明に従って使用するための医薬組成物は、使用される投与量および濃度で対象に対して非毒性である、薬学的に許容され得る分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、等張剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、担体、賦形剤、塩または安定剤を含み得る。好ましくは、このような組成物は、所与の投与方法および／または投与部位、例えば非経口（例えば、皮下、皮内、または静脈内注射）または髄腔内投与に適合する、疾患の処置における使用のための薬学的に許容され得る担体または賦形剤をさらに含むことができる。
【0232】
医薬組成物が本発明による細胞を含む場合、組成物は、現在の優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）を使用して製造され得る。
【0233】
適切には、細胞を含む医薬組成物は、以下のものの混合物または組み合わせを含む、酢酸メチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、およびジメチルアセトアミドなどの、但しこれらに限定されない有機溶媒を含み得る。
【0234】
適切には、細胞を含む医薬組成物はエンドトキシンを含まない。
処置の方法
処置の方法
【0235】
本発明は、本発明の操作されたＴｒｅｇを対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【0236】
本発明は、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【0237】
本発明は、疾患の処置および／または予防における使用のための本発明の操作されたＴｒｅｇも提供する。
【0238】
本発明は、疾患の処置および／または予防における使用のための本発明の医薬組成物も提供する。
【0239】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明による操作されたＴｒｅｇ、ベクターまたは細胞の使用にも関する。
【0240】
好ましくは、本処置の方法は、対象への本発明の医薬組成物の投与に関する。
【0241】
「処置する／処置／処置している」という用語は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは改善するために、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは阻止するために、既存の疾患または状態を有する対象に本明細書に記載の操作されたＴｒｅｇ、細胞、ベクター、または医薬組成物を投与することを指す。
【0242】
本明細書で使用される「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」／「予防する」（または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））への言及は、疾患の症状の発症を遅延または予防することを指す。予防は、（疾患が起こらないように）絶対的であり得、または一部の個体においてもしくは限られた時間にわたってのみ有効であり得る。
【0243】
本発明の好ましい態様において、本明細書に記載される方法のいずれかの対象は、哺乳動物、好ましくはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットである。好ましくは、対象はヒトである。
【0244】
本発明の医薬組成物の投与は、活性成分を生物学的に利用可能にする様々な経路のいずれをも使用して達成することができる。例えば、Ｔｒｅｇ、細胞、ベクターまたは医薬組成物は、静脈内、髄腔内、経口および非経口経路、鼻腔内、腹腔内、皮下、経皮または筋肉内に投与することができる。
【0245】
一局面において、本発明による操作されたＴｒｅｇまたは本発明による医薬組成物は静脈内投与される。
【0246】
別の局面において、本発明による操作されたＴｒｅｇまたは本発明による医薬組成物は髄腔内投与される。
【0247】
典型的には、医師は、個々の対象に最も適した実際の投与量を決定し、実際の投与量は特定の患者の年齢、体重および応答によって変化する。投与量は、疾患症状を軽減および／または予防するのに十分であるようなものである。
【0248】
当業者は、例えば、送達の経路（例えば、経口対静脈内対皮下など）が投与量に影響を及ぼし得ること、および／または必要とされる投与量が送達の経路に影響を及ぼし得ることを理解する。例えば、特定の部位または位置内での特に高濃度の作用物質（agent）が関心対象である場合には、集中的な送達が所望され得るおよび／または有用であり得る。所与の治療レジメンに対して経路および／または投与スケジュールを最適化するときに考慮されるべき他の要因としては、例えば、処置されている疾患（例えば、タイプまたはステージなど）、対象の臨床状態（例えば、年齢、全体的な健康状態など）、併用療法の存在または非存在、および医療従事者に公知の他の要因が挙げられ得る。
【0249】
投与量は、疾患の症状を安定化または改善するのに十分であるようなものである。
【0250】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明による細胞、例えばＴ細胞を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供する。
【0251】
適切には、本発明は、本発明による操作されたＴｒｅｇを対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法も提供する。
【0252】
本方法は、以下のステップ：
（ｉ）対象からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列、および必要に応じて、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸を細胞に導入すること；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与すること
を含み得る。
（ｉ）対象からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列、および必要に応じて、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸を細胞に導入すること；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与すること
を含み得る。
【0253】
適切には、（ｉｉ）からの細胞は、対象への投与前にインビトロで拡大させ得る。
【0254】
本方法は、以下のステップ：
（ｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列、および必要に応じて、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸を細胞含有試料に導入すること；および
（ｉｉ）（ｉ）からの細胞を対象に投与すること
を含み得る。
疾患
（ｉ）ＴＣＲをコードする核酸配列、および必要に応じて、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸を細胞含有試料に導入すること；および
（ｉｉ）（ｉ）からの細胞を対象に投与すること
を含み得る。
疾患
【0255】
本発明の方法および使用によって処置および／または予防されるべき疾患は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する任意の疾患であり得る。
【0256】
疾患は、例えば、がん、感染性疾患または自己免疫疾患であり得る。
【0257】
適切には、本発明の方法および使用によって処置および／または予防されるべき疾患は、自己免疫疾患であり得る。
【0258】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の方法および使用によって処置および／または予防されるべき疾患は、ＭＢＰが抗原である、例えばＭＢＰが自己抗原である任意の疾患であり得る。
【0259】
適切には、疾患は、自己免疫性および炎症性中枢神経系疾患（例えば、慢性神経変性状態）であり得る。
【0260】
適切には、疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、向神経性ウイルス感染症、脳卒中、腫瘍随伴性障害および外傷性脳損傷などの慢性神経変性状態であり得る。
【0261】
一局面において、疾患は多発性硬化症である。
【0262】
適切には、疾患は慢性進行性多発性硬化症である。
【0263】
適切には、疾患は再発／寛解型多発性硬化症である。
【0264】
一局面において、疾患は、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、強皮症およびシェーグレン症候群などの全身性の自己免疫および炎症性疾患の中枢神経系（ＣＮＳ）病変を有し得る。
【0265】
適切には、疾患は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性対象中に存在する。
【0266】
適切には、疾患は多発性硬化症であり、対象はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
【0267】
適切には、疾患は慢性進行性多発性硬化症であり、対象はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
【0268】
適切には、疾患は再発／寛解型多発性硬化症であり、対象はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
多発性硬化症
多発性硬化症
【0269】
多発性硬化症（ＭＳ）は、欧州および米国の若年成人において最も一般的な神経障害である。ＭＳは脱髄疾患として特徴付けられ、脳および／または脊髄全体の所々にミエリンの破壊が徐々に生じて、神経接続を妨害し、筋力低下、協調性の喪失ならびに発話および視覚障害を引き起こす中枢神経系の慢性変性疾患である。
【0270】
臨床的に孤立した症候群（ＣＩＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）および続発性進行性ＭＳ（ＳＰＭＳ）を含むＭＳの進行のいくつかのタイプまたはパターンが、特定されている。一部の患者では、障害の増加または進行は非常に緩やかであり、他の患者ではより迅速に起こり得る。しかしながら、一般に、発作からの回復はますます不完全になり、症状は増加し、障害が増大する傾向がある。
【0271】
いくつかの疾患修飾処置（ＤＭＴ）が臨床的再発の頻度を低下させるために承認されているが、ほとんどの患者は現在の治療スケジュール下で臨床的に悪化し続けている。自家造血幹細胞移植は、患者にとって持続的な有益な効果を有し得るが、この手技は、実質的な毒性を伴う積極的な骨髄破壊的前処置を必要とする。ＤＭＴも幹細胞移植も、ＭＳの免疫病理の抗原特異的抑制を媒介することができない。理論に束縛されることを望むものではないが、将来的には、本発明の操作されたＴｒｅｇの１用量の投与が、全身性副作用の非存在下でＭＳ免疫病理の持続的抑制を提供し得る。これは、ＭＳを有する人々における疾患の進行に対して大きな影響を及ぼす。
【0272】
適切には、本発明のＴｒｅｇ、ベクターまたは医薬組成物は、視力の低下または喪失、つまずき（ｓｔｕｍｂｌｉｎｇ）および不規則な歩行（ｕｎｅｖｅｎ ｇａｉｔ）、不明瞭な発話、頻尿および失禁、気分変化およびうつ、筋攣縮および麻痺を含むＭＳの症状の１またはそれより多くを軽減または改善し得る。
方法
方法
【0273】
本発明は、本明細書で定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入することを含む、操作されたＴｒｅｇを産生するための方法も提供する。適切には、本方法は、本発明のＴＣＲ分子の発現を可能にする条件下で細胞をインキュベートすることをさらに含む。必要に応じて、本方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【0274】
適切には、細胞はＴ細胞である。
【0275】
適切には、細胞はＴｒｅｇ細胞である。
【0276】
適切には、細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【0277】
一局面において、細胞は幹細胞である。適切には、本発明による方法では、本明細書で定義されるＴＣＲをコードする核酸が幹細胞中に導入され、次いで、幹細胞は、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化される。
【0278】
適切には、幹細胞は、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化する能力を有する。適切には、細胞は胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。適切には、細胞は臍帯血から取得され得る。適切には、細胞は成体末梢血から取得され得る。適切には、細胞は造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。適切には、細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【0279】
別の局面において、細胞は前駆細胞である。適切には、前駆細胞は、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化する能力を有する。
【0280】
別の局面において、本発明は、操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、本明細書で定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドとをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入することを含む、方法を提供する。適切には、細胞は、本明細書で定義される天然のＴｒｅｇであり得る。適切には、本明細書で定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドとして提供される。適切には、別個のポリペプチドは、別々に、逐次にまたは同時に細胞中に導入される。ポリペプチドが別々にまたは逐次に導入される場合、適切には、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドが最初に導入される。ポリペプチドが別々にまたは逐次に導入される場合、適切には、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドが最初に導入される。適切には、本明細書で定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド上で提供される。
【0281】
いくつかの態様において、本発明による方法は、
（ａ）細胞集団から天然のＴｒｅｇを単離すること；および
（ｂ）天然のＴｒｅｇ中でのＦＯＸＰ３発現を増加させること
を含む。
（ａ）細胞集団から天然のＴｒｅｇを単離すること；および
（ｂ）天然のＴｒｅｇ中でのＦＯＸＰ３発現を増加させること
を含む。
【0282】
「細胞集団からＴｒｅｇを単離すること」という表現は、複数の異なる種類の細胞の異種混合物からＴｒｅｇを分離することを意味する。適切な細胞集団は、ヒト対象からの試料に由来する。
【0283】
適切には、ＴｒｅｇはＴｒｅｇの集団として単離される。
【0284】
適切には、Ｔｒｅｇの集団は、少なくとも７０％のＴｒｅｇ、例えば７５％、８５％、９０％または９５％のＴｒｅｇを含む。
【0285】
適切には、本方法は、ＦＯＸＰ３および本発明のＴＣＲ分子の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートすることをさらに含む。必要に応じて、本方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【0286】
一局面において、本発明は、操作されたＴｒｅｇを作製するための方法であって、本明細書で定義されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドとＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドとをインビトロまたはエクスビボで細胞中に導入すること、および細胞を、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇなどのＴ細胞に分化させることを含む、方法を提供する。適切には、本方法は、ＦＯＸＰ３および本発明のＴＣＲ分子の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートすることをさらに含む。必要に応じて、本方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【0287】
適切には、一局面において、細胞は、ＦＯＸＰ３が細胞中に導入される前にＴ細胞に分化する。
【0288】
操作されたＴｒｅｇの精製は、当技術分野において公知の任意の方法によって達成され得る。適切には、操作されたＴｒｅｇは、細胞集団の陽性および／または陰性選択を使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫磁気単離（すなわち、磁性ナノ粒子またはビーズに結合させた抗体を使用すること）を使用して精製され得る。
【0289】
適切には、操作されたＴ細胞の精製は、本明細書で定義されるＴＣＲの発現を使用して実施され得る。
【0290】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、範囲を定義する数を包含する。別段の指示がなければ、それぞれ、任意の核酸配列は、５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれている。
【0291】
値の範囲が提供されている場合、文脈上明確に別段の指示がなければ、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限の間に介在する各値も具体的に開示されていることを理解されたい。記載された範囲内の任意の記載された値または介在する値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在する値との間のより小さい各範囲が、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、その範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、より小さな範囲に限界の一方が含まれる、限界の両方が含まれない、または限界の両方が含まれる各範囲も本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【0292】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を指示しなければ、複数表記を含むことに留意しなければならない。
【0293】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であって、包括的または非限定的であり、追加の列挙されていないメンバー、要素、または方法ステップを排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
【0294】
本明細書に記載されている本発明の実施形態は組み合わされ得ることに留意されたい。
【0295】
本明細書中で論述される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、このような刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈されるべきではない。
【0296】
ここで、実施例によって本発明をさらに説明するが、実施例は本発明を実施する上で当業者を補助する役割を果たすことが意図されており、決して本発明の範囲を限定することが意図されているわけではない。
【実施例】
【0297】
実施例
［実施例１］ ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３をコードするレトロウイルスベクターの産生
ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲ
参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｕｒａｒｏら、ＪＣＩ１９９７；１００，２，３３９－３４９によって記載されるように、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１によって提示されるＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）を認識する。コドン最適化されたＭＳ２－ＴＣＲ ｖα、マウス化定常αドメイン、コドン最適化されたＭＳ２－ＴＣＲ ｖβおよびマウス化定常βドメインをレトロウイルス発現カセットｐＭＰ７１にクローニングすることによって、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲをコードするコドン最適化されたＭＳ－２ ＴＣＲ発現カセットを構築した（図１および図２）。参照により本明細書に組み入れられるＢｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ １５；１０９（６）：２３３１－２３３８．およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ａｐｒ １５；６７（８）：３８９８－３９０３に記載されているように、定常αドメインと定常βドメインとの間に付加的なジスルフィド結合を追加した。定常－αおよびＭＳ２－ＴＣＲ ｖβドメインは、Ｐ２Ａ配列によって分離された。
ＭＳ２－３Ｃ８ ＦＯＸＰ３
［実施例１］ ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３をコードするレトロウイルスベクターの産生
ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲ
参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｕｒａｒｏら、ＪＣＩ１９９７；１００，２，３３９－３４９によって記載されるように、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１によって提示されるＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）を認識する。コドン最適化されたＭＳ２－ＴＣＲ ｖα、マウス化定常αドメイン、コドン最適化されたＭＳ２－ＴＣＲ ｖβおよびマウス化定常βドメインをレトロウイルス発現カセットｐＭＰ７１にクローニングすることによって、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲをコードするコドン最適化されたＭＳ－２ ＴＣＲ発現カセットを構築した（図１および図２）。参照により本明細書に組み入れられるＢｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ １５；１０９（６）：２３３１－２３３８．およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ａｐｒ １５；６７（８）：３８９８－３９０３に記載されているように、定常αドメインと定常βドメインとの間に付加的なジスルフィド結合を追加した。定常－αおよびＭＳ２－ＴＣＲ ｖβドメインは、Ｐ２Ａ配列によって分離された。
ＭＳ２－３Ｃ８ ＦＯＸＰ３
【0298】
上記のＭＳ－２ ＴＣＲを改変することによって、ＦＯＸＰ３およびＭＳ－２ ＴＣＲをコードする発現カセットを構築した（図１および図３）。ＭＳ－２ ＴＣＲの上流のＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＲ１部位を使用して、ＳＴＯＰコドンが除去されたＦＯＸＰ３遺伝子およびＴ２Ａ配列をｐＭＰ７１ベクター中に挿入した。
［実施例２］ ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３によるＴ細胞の形質導入
［実施例２］ ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３によるＴ細胞の形質導入
【0299】
標準的な組織培養条件で２４時間、８ｍＬのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中に、２×１０６個でＰｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏ細胞を播種した。１日目に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）形質移入試薬と、エコトロピックレトロウイルス補助受容体をコードする２．５μｇの関連プラスミドＤＮＡおよび１．５μｇのｐＣＬ－Ａｍｐと混合された最適培地とを使用して、室温で２０分間、細胞を形質移入した。接着性Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ（Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＡＭＰＨＯ）細胞に形質移入混合物を添加し、さらに２４時間インキュベートした。２日目に、培地を５ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）組織培養培地に交換し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。
【0300】
ＣＤ４＋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ選択キットを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。その後、フローサイトメトリー抗体ＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ１２７で細胞を染色した後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）サイトメーターを使用して細胞を選別した。
【0301】
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７－ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋Ｔｃｏｎｖをポリプロピレンチューブ中に収集した。細胞選別の純度は、ＦＯＸＰ３ ＰＥ抗体の添加によって決定した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＦＯＸＰ３＋細胞の純度は、常に＞７０％であった。
【0302】
０日目に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズと１：１で培養することによって、ＦＡＣＳ選別された細胞を４８時間活性化した。２日目に、細胞を計数し、Ｔｃｏｎｖについては完全Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ－１６４０）（Ｇｉｂｃｏ）またはＴｒｅｇについてはＴｅｘＭＡＣＳ（登録商標）培地中に１×１０６／ｍＬで再懸濁した。レトロネクチンでコーティングすることによって、組織培養処理されていない２４ウェルプレートを事前に調製し、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞懸濁液を１：１で混合した。ＩＬ－２の最終濃度は、Ｔｃｏｎｖでは３００ｕ／ｍｌ、Ｔｒｅｇでは１０００ｕ／ｍｌであった。細胞を３７度で一晩インキュベートした後、上清を除去し、新鮮な完全培地およびＩＬ－２を補充した。培地を１日おきに交換した。
【0303】
１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；１００単位／ｍＬペニシリン；１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン；２ｍＭ Ｌ－グルタミンが補充されたＲＰＭＩ－１６４０中でＴｃｏｎｖ細胞を成長させた。１００単位／ｍＬペニシリン；１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＴｅｘＭＡＣＸ（登録商標）培地中で制御性Ｔ細胞を培養した。
【0304】
図５のＦＡＣＳドットプロットは、マウスＴＣＲ定常領域およびＦＯＸＰ３の発現の測定を通じて形質導入のレベルを評価するために７日目に行われた代表的なフローサイトメトリー分析を示す。
［実施例３］ インビトロ拡大中のＦＯＸＰ３発現
［実施例３］ インビトロ拡大中のＦＯＸＰ３発現
【0305】
実施例２で上記したようにＴ細胞を単離した。０日目に、ＦＯＸＰ３およびＴｒｅｇ細胞表面マーカーであるＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２としても知られる）およびＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーによって測定した。
【0306】
実施例２で上記したように、Ｔ細胞を形質導入し、培養した。７日目に、フローサイトメトリーによって細胞を分析し、形質導入された細胞集団に対してドットプロットをゲーティングした。ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２５の相対的発現を測定した。図６は、インビトロ拡大の７日目におけるＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２５の発現を示す棒グラフを示す。ＦＯＸＰ３の発現は、インビトロ拡大中に維持される。
ＭＳ－２ ＴＣＲ形質導入されたＴ細胞の抗原特異的活性化
［実施例４］ エフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇのペプチド再刺激
ＭＳ－２ ＴＣＲ形質導入されたＴ細胞の抗原特異的活性化
［実施例４］ エフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇのペプチド再刺激
【0307】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をヒトＨＬＡ－ＤＲ４およびＣＤ８０またはＣＤ８６で形質導入した。その後の実験のために、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する細胞を等量で一緒に混合した。
【0308】
飽和量（１０μＭ／ｍｌ）のＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）（ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ）を含む培養培地中にＣＨＯ細胞を１０×１０６／ｍＬで再懸濁した。標準的な組織培養条件で懸濁液を２時間インキュベートした後、照射し、洗浄し、再懸濁した。
【0309】
ＭＳ２またはＭＳ２－ＦＯＸＰ３構築物で形質導入されたＴ細胞を洗浄し、計数し、完全ＲＰＭＩ中に０．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞をＣＨＯ細胞と１：１で蒔き、ペプチドありまたはなしで４時間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理した後、ＩＬ－２およびＩＦＮγに対する抗体で染色した。
【0310】
図７は、エフェクターＴ細胞のペプチド再刺激を示すＦＡＣＳドットプロットを示す。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
【0311】
上記のように、Ｔｒｅｇ細胞をＣＨＯ細胞とともに培養した。図８は、Ｔｒｅｇ細胞のペプチド再刺激を示すＦＡＣＳドットプロットを示す。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
［実施例５］ 同族ペプチドに対する、ＴＣＲを形質導入されたＴ細胞およびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３を形質導入されたＴ細胞の応答
［実施例５］ 同族ペプチドに対する、ＴＣＲを形質導入されたＴ細胞およびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３を形質導入されたＴ細胞の応答
【0312】
ＴＣＲを形質導入されたＴｃｏｎｖ、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇ、ＴＣＲ－ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖおよびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖ（上記の方法）を、ペプチドをパルスされ（ｐｅｐｉｄｅ－ｐｕｌｓｅｄ）、照射されたＡＰＣありまたはなしで４日間培養した。上清を培養物から収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２およびＩＦＮγについてアッセイした（ｎ＝２～４）。図９は、同族ペプチドに対する、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇおよびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖの応答を示す。
［実施例６］ ＴＣＲ形質導入およびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３形質導入
［実施例６］ ＴＣＲ形質導入およびＴＣＲ－ＦＯＸＰ３形質導入
【0313】
ＣＨＯ細胞を上記のように調製した。ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３でＴｃｏｎｖ細胞を形質導入した。形質導入されたＴ細胞を磁気ビーズ選別によって単離した。ＡＰＣにコンジュゲートさせた抗マウス定常β抗体で、形質導入された細胞を染色した。細胞を十分に洗浄し、第２の抗ＡＰＣ抗体で染色した。細胞を洗浄し、磁気カラムに通し、形質導入された細胞を捕捉し、溶出した。常に、精製された細胞の９５％超がＡＰＣ＋であった。
【0314】
ＣＨＯ細胞なしで培養された非刺激細胞は、陰性対照として作用した。ＰＭＡ（ホルボール１２ミリスタート１３アセタート）刺激された細胞は、陽性対照として作用した。白のバーは、ＭＳ２ ＴＣＲを発現する細胞からのサイトカイン産生を示し、黒のバーは、ＭＳ２ ＴＣＲおよびＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞からのサイトカイン産生を示す（ｎ＝３）。図１０は、ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入された典型的なＴ細胞が、ＴＣＲのみで形質導入された典型的な細胞よりも少ないＩＬ－２を産生することを示す。
ＭＳ－２ ＴＣＲで形質導入されたＴｒｅｇの抗原特異的抑制
［実施例７］ ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の増殖
ＭＳ－２ ＴＣＲで形質導入されたＴｒｅｇの抗原特異的抑制
［実施例７］ ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の増殖
【0315】
ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞にペプチドを負荷し、上述したように照射した後、０．１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。等体積の温かいＦＢＳを添加し、さらに３分間インキュベートする前に、３７度の加温されたＰＢＳ中においてＣＦＳＥ細胞トレース色素で、形質導入されたレスポンダーＴ細胞を３分間染色した。
【0316】
５倍体積の完全培地で細胞を洗浄した後、計数し、１×１０６形質導入細胞／ｍｌで再懸濁した。ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇの形質導入効率をフローサイトメトリーによって決定した。制御性Ｔ細胞を培養物から取り出し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ中に１×１０６形質導入細胞／ｍｌで再懸濁する。１Ｔｒｅｇ：０．１ＣＨＯ細胞：および様々な比率のＴｃｏｎｖで細胞を播種した。増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色されたＴｃｏｎｖの希釈物を分析することによって決定した。
【0317】
図１１のデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的様式で増殖を抑制することを示す。上清を培養培地から収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２についてアッセイした。図１２に示されるデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的様式でＩＬ－２産生を抑制することを示す。
［実施例８］ 実験的自己免疫性脳脊髄炎の養子移入モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
［実施例８］ 実験的自己免疫性脳脊髄炎の養子移入モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
【0318】
養子移入によって、ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１についてトランスジェニックである免疫不全ＮＯＤｓｃｉｄガンママウス（ＮＳＧ）にＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲで形質導入されたヒトの典型的なＴ細胞を投与する。
【0319】
ヒトＴ細胞の養子移入は、マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）型疾患を誘発し得る。次いで、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲまたは対照Ｔｒｅｇで形質導入されたヒトＴｒｅｇ細胞でマウスを処置する。
【0320】
ＨＬＡ－ＤＲＢ１＋０４０１拘束性ＭＢＰ１１１－１２９（配列番号１２）特異的ヒト化ＴＣＲトランスジェニックマウスは、脊髄および脊髄神経根に加えて脳幹および脳神経根中に位置するＭＳ２－３Ｃ８トランスジェニックＴ細胞および炎症性病変の浸潤を有する（参照により本明細書に組み入れられるＱｕａｎｄｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖ．２００（２）；２００４）。
【0321】
ＴＣＲ誘導性Ｔｒｅｇによる病原性Ｔ細胞の増殖の抑制を、マウスモデルにおいて、例えばＣＦＳＥ、ＩＬ－２および／またはＩＦＮγレベルによって測定する。
［実施例９］ 実験的自己免疫性脳脊髄炎の古典的モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
［実施例９］ 実験的自己免疫性脳脊髄炎の古典的モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
【0322】
広く受け入れられているＭＳの動物モデルであるＥＡＥを誘発するために、マウスをＭｏｇ（ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質）で免疫する。
【0323】
次いで、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲまたは対照Ｔｒｅｇで形質導入されたヒトＴｒｅｇ細胞でマウスを処置する。ＴＣＲ誘導性Ｔｒｅｇによる病原性Ｔ細胞の増殖の抑制を、マウスモデルにおいて、例えばＣＦＳＥ、ＩＬ－２および／またはＩＦＮγレベルによって測定する。
［実施例１０］ ＴＣＲを形質導入された制御性Ｔ細胞は、照射された宿主中に生着することができる
［実施例１０］ ＴＣＲを形質導入された制御性Ｔ細胞は、照射された宿主中に生着することができる
【0324】
ビーズ選別によって、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを単離した。ＴｒｅｇをＴＣＲで形質導入した。形質導入の１日後に、４Ｇｙの照射で前処置されたＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入された細胞を注入した（０日目）。７週間後、フローサイトメトリーを使用して、ＴＣＲに対する染色によって、形質導入されたＴｒｅｇの生着を決定した（＋７週間）。
【0325】
図１３の結果は、投与７週間後のＴｒｅｇの持続性および抗原特異的抑制効果を示す。
［実施例１４］ コドン最適化されたＭＳ２－３Ｃ８を用いた発現および機能研究
［実施例１４］ コドン最適化されたＭＳ２－３Ｃ８を用いた発現および機能研究
【0326】
α鎖－Ｐ２Ａ－β鎖－Ｔ２Ａ－切断型マウスＣＤ１９（ｔｍＣＤ１９）またはβ鎖－Ｐ２Ａ－α鎖－Ｔ２Ａ－切断型マウスＣＤ１９（ｔｍＣＤ１９）配置を使用して、レトロウイルスｐＭＰ７１ベクターにＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲについてのコドン最適化された配列をクローニングした（図１４Ａ）。
【0327】
ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲは、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１４Ｂ）およびＣＤ４＋ヒトＴ細胞（図１４Ｃ）中で豊富に発現された。結果を、ＭＳ２－３Ｃ＊野生型配列およびマウス定常ドメインを有するＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲと比較した。
【0328】
コドン最適化されたＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲ、野生型ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲまたはマウス定常ドメインを有するＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲで形質導入され、飽和濃度の関連ペプチドを負荷したＡＰＣで刺激されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原特異的サイトカイン応答が可能であった（図１４Ｄ）。
【0329】
ＭＢＰ特異的炎症促進性サイトカインの産生を評価する抑制アッセイも行い、ＭＳ２－３Ｃ８ ＴＣＲについて抗原特異的抑制データを示した（図１４Ｅ）。
［実施例１５］ 参照ＭＢＰ ＴＣＲ形質導入Ｔｒｅｇの／による抗原特異的抑制
［実施例１５］ 参照ＭＢＰ ＴＣＲ形質導入Ｔｒｅｇの／による抗原特異的抑制
【0330】
ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞にペプチドを負荷し、照射した後、０．１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。等体積の温かいＦＢＳを添加し、さらに３分間インキュベートする前に、３７度の加温されたＰＢＳ中においてＣＦＳＥ細胞トレース色素で、形質導入されたレスポンダーＴ細胞を３分間染色した。
【0331】
５倍体積の完全培地中で細胞を洗浄した後、計数し、１×１０６形質導入細胞／ｍｌで再懸濁した。ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇの形質導入効率をフローサイトメトリーによって決定した。制御性Ｔ細胞を培養物から取り出し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ中に１×１０６形質導入細胞／ｍｌで再懸濁する。１Ｔｒｅｇ：０．１ＣＨＯ細胞：および様々な比率のＴｃｏｎｖで細胞を蒔いた。増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色されたＴｃｏｎｖの希釈物を分析することによって決定した。
【0332】
図１５のデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的様式で増殖を抑制することを示す。上清を培養培地から収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２についてアッセイした。図１５に示されるデータは、ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇが抗原特異的様式でＩＬ－２産生を抑制することを示す。
【0333】
この参照実験において使用された発現カセットは、ＦＯＸＰ３および参照ＭＢＰ ＴＣＲを５’－３’方向にコードした。
［実施例１６Ａ］
外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、生着し、持続し、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＴＣＲの発現を保持する
［実施例１６Ａ］
外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、生着し、持続し、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＴＣＲの発現を保持する
【0334】
ビーズ選別によって、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞からＴｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを単離した。ＣＤ４５．１＋ＴｒｅｇにＴＣＲを形質導入し、Ｔｈｙ１．１＋ＴｒｅｇにＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３を形質導入した。形質導入の１日後、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入された細胞を、４Ｇｙの照射で前処置されたＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に１：１の比で注入した。ＦＡＣＳプロットは、注入された細胞のＣＤ４５．１：Ｔｈｙ１．１の比およびそれらのそれぞれのＦＯＸＰ３発現を示す。
【0335】
７週間後、ＴＣＲについて染色することによって生着した細胞を同定するために、フローサイトメトリーを使用した。ＴＣＲ＋集団内のＣＤ４５．１：Ｔｈｙ１．１の比を決定し、ＦＯＸＰ３およびＣＤ２５について染色することによって、生着したＣＤ４５．１（ＴＣＲを形質導入されたＴｒｅｇ）またはＴｈｙ１．１（ＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入されたＴｒｅｇ）細胞の表現型を調べた。
【0336】
ビーズ選別によって、ＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞からＴｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを単離した。ＴｒｅｇをＴＣＲ、ＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３で形質導入するか、またはウイルスを含まない上清（モック）とともに培養した。形質導入の１日後に、４Ｇｙの照射で前処置されたＨＬＡ－ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入された細胞を注入した。７週間後、フローサイトメトリーを使用して、形質導入されたＴｒｅｇの生着を決定した。図１５Ａは、形質導入後１日目のヒト可変２．１およびマウスＦｏｘｐ３の発現を通じて決定された形質導入効率を示す。図１５Ｂは、移入された細胞（上のパネル）ならびにＦＯＸＰ３およびＴＣＲ（下のパネル）を同定するためにＴｈｙ１．１で染色された、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入されたＴｒｅｇを与えられたマウスからの脾細胞を示す。図１５Ｃは、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３を形質導入されたＴｒｅｇについての注射日と比較した形質導入効率の倍数変化（左パネル）および形質導入された細胞の絶対数の倍数変化（右パネル）を示す累積データを示す。図１５Ｄは、移入の７週間後での、形質導入された細胞内のＦＯＸＰ３の代表的な発現を示す。グラフは、７週目での形質導入された集団内のパーセンテージＦＯＸＰ３＋細胞の累積（左）および注射日と比較したＦＯＸＰ３＋細胞の倍数変化を示す。
［実施例１６Ｂ］
外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇはインビボで７週間後にＴｒｅｇ機能性を保持するが、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇはエフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する
［実施例１６Ｂ］
外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇはインビボで７週間後にＴｒｅｇ機能性を保持するが、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇはエフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する
【0337】
無関係のペプチドまたは１０ｕＭ ＭＢＰをパルスしたＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞とともに脾細胞を４時間培養した。エフェクターサイトカイン産生の欠如によって実証されるように、外因性ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇは、インビボで７週間後にＴｒｅｇ機能性を保持するのに対して、外因性ＦＯＸＰ３を発現しないＴｒｅｇは、エフェクターサイトカインを産生する能力を獲得する（図１６）。
【0338】
上記の明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法および系の様々な改変および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求されている本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学、細胞免疫学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に属することが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図14-4】
【図14-5】
【図14-6】
【図14-7】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【配列表】
【国際調査報告】