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特表2022-553648改良されたウリカーゼ及びそれを使用した高尿酸血症の治療方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】改良されたウリカーゼ及びそれを使用した高尿酸血症の治療方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/53 20060101AFI20221219BHJP
C12N 9/06 20060101ALI20221219BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221219BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20221219BHJP
A61K 38/44 20060101ALI20221219BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/53 ZNA
C12N9/06 A
C12N15/62 Z
A61P19/06
A61K38/44
A61K47/60
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022521317
(86)(22)【出願日】2020-10-10
(85)【翻訳文提出日】2022-06-06
(86)【国際出願番号】 CN2020120133
(87)【国際公開番号】W WO2021068925
(87)【国際公開日】2021-04-15
(31)【優先権主張番号】201910964325.4
(32)【優先日】2019-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】320000850
【氏名又は名称】上海君▲実▼生物医▲薬▼科技股▲分▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】519301559
【氏名又は名称】▲蘇▼州君盟生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】黄国▲鋒▼
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼朋
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼思
(72)【発明者】
【氏名】李▲鉄▼
(72)【発明者】
【氏名】李瑞▲勝▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼静
(72)【発明者】
【氏名】周岳▲華▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼洪川
(72)【発明者】
【氏名】姚盛
【テーマコード（参考）】
4B050
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD02
4B050GG03
4B050HH01
4B050LL01
4C076AA11
4C076BB13
4C076CC17
4C076EE59
4C076FF67
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA37
4C084DC23
4C084MA66
4C084NA06
4C084ZC311
4C084ZC312
(57)【要約】
改良されたウリカーゼ、その高尿酸血症の治療の方法及び対応する医薬組成物を提供する。
【課題】この改良されたウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないアミノ酸配列を含む。
【選択図】なし
【課題】この改良されたウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないアミノ酸配列を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないアミノ酸配列を含む、ウリカーゼ。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列に比べ、前記ウリカーゼのアミノ酸配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のアミノ酸残基の追加、欠失又は置換を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項3】
前記ウリカーゼは、Ｎ末端及び／又はＣ末端で切断されて酵素活性を保持したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片であり、好ましくは、前記切断は、Ｎ末端の１７個以内のアミノ酸残基の切断及び／又はＣ末端の５個以内のアミノ酸残基の切断であり、任意選択的に、Ｎ末端が切断された後、８個以内のアミノ酸残基を追加する、
ことを特徴とする請求項２に記載のウリカーゼ。
【請求項4】
前記切断は、Ｎ末端でＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱという１７個のアミノ酸を切断することであり、前記追加は、ＭＴＮＩＩＬＧＫ又はＭＡＮＩＩＬＧＫのアミノ酸配列を追加することであり、又は
前記切断は、Ｃ末端でＩＡＧＦＣという５個のアミノ酸を切断することである、
ことを特徴とする請求項３に記載のウリカーゼ。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に比べ、前記ウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の第１７５位、第１７８位及び第２５８位に対応する位置の少なくとも１つの位置に置換変異を有し、好ましくは、第１７５位の置換後のアミノ酸残基は、プロリン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はメチオニンであり、
好ましくは、第１７８位の置換後のアミノ酸残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
好ましくは、第２５８位の置換後のアミノ酸残基は、セリン、グルタミン酸、トレオニン、チロシン、アスパラギン又はグルタミンである、
ことを特徴とする請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項6】
前記ウリカーゼ配列に変異によって１～６個の表面露出したシステイン残基が導入され、且つ任意選択的に、第２０５位及び／又は第２０８位に置換変異が存在し、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３に対するものである、ことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載のウリカーゼ。
【請求項7】
前記ウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位及び第２８８位のうちの１～６個の位置にシステイン残基を含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３に対するものであり、好ましくは、前記ウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位及び第２８８位のうちの２つの位置にシステイン残基を含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３に対するものであり、
より好ましくは、前記ウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステイン残基を含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３に対するものである、
ことを特徴とする請求項６に記載のウリカーゼ。
【請求項8】
前記ウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７又は８に示され、又はそのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列の第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含むアミノ酸配列であり、且つ任意選択的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第２０５位及び／又は第２０８位に置換変異が存在し、好ましくは、前記置換変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の第２０５位のＳがＤ又はＥに置換され、第２０８位のＧがＲ、Ｋ又はＳに置換されることである、ことを特徴とする請求項１に記載のウリカーゼ。
【請求項9】
前記ウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列の第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含むアミノ酸配列であり、且つ任意選択的に、Ｓ２０５Ｄ及び／又はＧ２０８Ｒの置換変異を含む、ことを特徴とする請求項８に記載のウリカーゼ。
【請求項10】
前記ウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲであり、又は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである、
ことを特徴とする請求項９に記載のウリカーゼ。
【請求項11】
請求項１～１０の何れか１項に記載のウリカーゼと、当該ウリカーゼと共有結合又は融合発現して合成したポリマーとを含有する、コンジュゲート。
【請求項12】
前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスホリルコリンポリマー、反復ペプチド又は「Ｘ－ＴＥＮ」配列のポリマーと炭水化物に基づくポリマーから選ばれる、ことを特徴とする請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項13】
前記ポリマーは、前記ウリカーゼのＮ末端及び／又はＣ末端と融合発現するか、又は前記ウリカーゼに存在するシステイン残基によって共有結合する、ことを特徴とする請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
請求項１～１０の何れか１項に記載のウリカーゼ又は請求項１１～１３の何れか１項に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容されるベクターを含有する、医薬組成物。
【請求項15】
哺乳動物の体液と組織中の尿酸レベルを低下させるか又は高尿酸血症を治療する医薬品の製造における、請求項１～１０の何れか１項に記載のウリカーゼ、請求項１１～１３の何れか１項に記載のコンジュゲート又は請求項１４に記載の医薬組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改良されたウリカーゼ及び／又はＰＥＧ－ウリカーゼ、及びそれを使用した高尿酸血症の治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
痛風と高尿酸血症は、現在人々の健康に危害を及ぼすよく見られる疾患であり、統計によると、高尿酸血症の発症率は既に人口の１０％に達している。痛風は、血中尿酸レベルが高すぎることによって尿酸塩結晶が関節に沈殿する急性関節炎である。人々の食生活と生活習慣の変化に伴い、高タンパク質と高プリン食品の摂取が増加し、痛風患者の数は年々増加している一方、一部の悪性腫瘍、特に白血病やリンパ腫の患者において、放射線療法や化学療法後に短期間で大量の尿酸が腎臓に沈着し、急性腎不全を引き起こす。ここ数十年以来、多くの科学者は、他の種に由来するウリカーゼをヒトの高尿酸血症関連疾患の治療に使用することに力を入れてきた。但し、異種タンパク質を人体に適用する際の最大な問題の１つは、タンパク質の免疫原性によって引き起こされる抗タンパク質反応とアレルギー反応である。その後、科学者はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてタンパク質に共有結合修飾を行い、それによって、タンパク質の免疫原性を低下させ、タンパク質の溶解度を増加させ、タンパク質の半減期を延長できることを証明した。
【0003】
現在、臨床的に承認されたウリカーゼ類医薬品は２種類あり、その１つはＫｒｙｓｔｅｘｘａであり、もう１つはＥｌｉｔｅｋである。Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（ペグロティカーゼ（ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ））は、通常の治療法で治療しにくい成人患者の慢性痛風を治療するための承認されたペグ化ウリカーゼであり、それが高度ペグ化豚とヒヒウリカーゼ配列のキメラタンパク質であり、静脈内注射により２時間以内に投与することができる。Ｋｒｙｓｔｅｘｘａは、アナフィラキシー反応及び輸液反応に対するブラックボックス警告を含有する。一方、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）は、白血病、リンパ腫及び固形悪性腫瘍に罹患した小児及び成人患者の血漿尿酸レベルを初期管理するために使用されるように指示される、修飾された組換えアスペルギルス・フラブスウリカーゼであり、これらの患者は、腫瘍溶解及びその後の血漿尿酸の上昇が予想される抗癌治療を受ける。但し、Ｅｌｉｔｅｋは、体内で１６～２１時間の半減期を有し、静脈内注入により毎日投与する必要がある。同様に、Ｅｌｉｔｅｋもアナフィラキシー反応と溶血に対するブラックボックス警告を有する。
【0004】
上記状況に鑑み、当分野では、高尿酸血症を治療するために、より安全で、より便利で、且つより低い免疫原性を有する医薬品を開発することが切望されている。
【発明の概要】
【0005】
従来技術におけるウリカーゼ類医薬品の既知の副作用を克服し、より安全で、より便利で、より低い免疫原性を有するウリカーゼ類医薬品を得るために、本発明に記載の技術的解決手段が検討される。
【0006】
本発明の第１態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないアミノ酸配列を含む、改良されたウリカーゼの配列を提供する。
【0007】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と約１個～約２２個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２個のアミノ酸）の差異を有する。
【0008】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２２個のアミノ酸の差異を有する。
【0009】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２１個のアミノ酸の差異を有する。
【0010】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２０個のアミノ酸の差異を有する。
【0011】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１９個のアミノ酸の差異を有する。
【0012】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１８個のアミノ酸の差異を有する。
【0013】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１７個のアミノ酸の差異を有する。
【0014】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１６個のアミノ酸の差異を有する。
【0015】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１５個のアミノ酸の差異を有する。
【0016】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１４個のアミノ酸の差異を有する。
【0017】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１３個のアミノ酸の差異を有する。
【0018】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１２個のアミノ酸の差異を有する。
【0019】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１１個のアミノ酸の差異を有する。
【0020】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１０個のアミノ酸の差異を有する。
【0021】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と９個のアミノ酸の差異を有する。
【0022】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と８個のアミノ酸の差異を有する。
【0023】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と７個のアミノ酸の差異を有する。
【0024】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と６個のアミノ酸の差異を有する。
【0025】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と５個のアミノ酸の差異を有する。
【0026】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と４個のアミノ酸の差異を有する。
【0027】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と３個のアミノ酸の差異を有する。
【0028】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２個のアミノ酸の差異を有する。
【0029】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と１個のアミノ酸の差異を有する。
【0030】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、アミノ酸配列に１個又は複数個のアミノ酸残基の追加、欠失又は置換を含むことにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なることができる。
【0031】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、Ｎ末端及び／又はＣ末端で切断されて酵素活性を保持したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片である。
【0032】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の断片は、Ｎ末端で１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断された断片である。
【0033】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸が切断された配列である。
【0034】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、且つ約１～８個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８）に置換された配列である。
【0035】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸が切断され、且つ約１～８個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８）に置換された配列である。
【0036】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸が切断され、且つ８個のアミノ酸に置換された配列である。
【0037】
幾つかの具体的な実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸（ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱ）が切断され、且つＭＴＮＩＩＬＧＫ又はＭＡＮＩＩＬＧＫアミノ酸に置換された配列である。
【0038】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端で約１～５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。
【0039】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端で５個のアミノ酸が切断された配列である。
【0040】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、且つＣ末端で約１～５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。
【0041】
幾つかの具体的な実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸が切断され、且つＣ末端で５個のアミノ酸が切断された配列である。
【0042】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、約１～８個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８）に置換され、且つＣ末端で約１～５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。
【0043】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸が切断され、８個のアミノ酸に置換され、且つＣ末端で５個のアミノ酸が切断された配列である。
【0044】
幾つかの具体的な実施形態において、本発明に記載のウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で１７個のアミノ酸（ＭＴＡＴＡＥＴＳＴＧＴＫＶＶＬＧＱ）が切断され、Ｍ（Ｔ／Ａ）ＮＩＩＬＧＫアミノ酸に置換され、且つＣ末端で５個のアミノ酸が切断された配列である。
【0045】
別の実施形態において、前記切断されたウリカーゼは、約１～約１３個の更なるアミノ酸変化（例えば、追加、欠失又は置換）を含有する。
【0046】
幾つかの実施形態において、タンパク質の半減期を延長し、及び／又は免疫原性を軽減するために、ウリカーゼの配列は、合成又は生物合成のポリマーと融合発現又は共有結合する。本発明に用いられる例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスホリルコリンポリマー、反復ペプチド又は「Ｘ－ＴＥＮ」配列のポリマー、又は炭水化物に基づくヒドロキシエチルデンプンのようなポリマーである。
【0047】
幾つかの実施形態において、タンパク質の半減期を延長し、及び／又は免疫原性を軽減するために、合成又は生物合成のポリマーは、ウリカーゼのＮ末端及び／又はＣ末端と融合発現する。
【0048】
幾つかの実施形態において、共有結合に用いられる１～６（例えば、１、２、３、４、５又は６）個の表面露出部位を産生するために、ウリカーゼ配列を修飾する。例えば、幾つかの実施形態において、ウリカーゼ配列は、１、２、３、４、５又は６個の表面接触可能なシステイン残基を含有するように修飾され、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）はこれらのシステイン残基と共有結合することができる。
【0049】
幾つかの実施形態において、薬物動態学的挙動を変えることができるポリマー又はポリペプチドの部位特異的共有結合を形成するために、追加、欠失及び／又は置換によって天然に存在するウリカーゼ配列の所望の位置に新しいシステインを導入する。
【0050】
幾つかの実施形態において、どのアミノ酸残基が表面したかを確定するために、ウリカーゼの結晶構造を分析することによってＣｙｓ置換に用いられる適切なアミノ酸の選択を指導する。その後、１個又は複数個の表面露出したアミノ酸を選択して、それをシステインに修飾する。
【0051】
幾つかの実施形態において、最終的に修飾されたウリカーゼ配列におけるこれらのシステインは、表面露出した位置にあり、このように、これらのシステインをペグ化させることができる。
【0052】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、約１～約７個のシステイン残基、特に約１、２、３、４、５、６又は７個のシステイン残基を含む。幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、約２個のシステイン残基を含む。
【0053】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、１個又は複数個のシステイン残基に付加するＰＥＧ部分を含む。システイン残基の数と位置に対する制御は、ＰＥＧ付加部位の数及び抱合体の最適性質（生物と物理的属性及び酵素活性を含む）を制御することによって達成可能である。
【0054】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第３５位、第１９４位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。
【0055】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第３５位、第１９４位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。
【0056】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位と第２８８位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。
【0057】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位と第２８８位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。
【0058】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含み、且つ第２０５位及び／又は第２０８位に置換変異が存在し、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。
【0059】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含み、且つ第２０５位にＳ２０５Ｄ又はＳ２０５Ｅの置換変異が存在し、及び／又は第２０８位にＧ２０８Ｒ、Ｇ２０８Ｋ又はＧ２０８Ｓの置換変異が存在し、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。
【0060】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含み、且つＳ２０５Ｄ及び／又はＧ２０８Ｒの置換変異が存在し、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。
【0061】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、６、７又は８に示される。
【0062】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0063】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0064】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0065】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0066】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0067】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0068】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0069】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0070】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0071】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0072】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0073】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0074】
本発明の第２様態は、本発明に記載のウリカーゼを含む医薬組成物、及び本発明に記載の組成物を利用して哺乳動物の体液中の尿酸レベルを低下させる方法を提供する。好ましい実施形態として、前記医薬組成物は、上記に言及された任意のＰＥＧ－ウリカーゼ、及び薬学的に許容されるベクターを含む。
【0075】
本発明の第３様態は、哺乳動物の体液と組織中の尿酸レベルを低下させる方法を提供する。好ましい実施形態として、前記方法は、哺乳動物に、尿酸レベルを効果的に低下させることができる量である有効量のＰＥＧ－ウリカーゼを投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1】各種のウリカーゼの酵素比活性の比較である。
【図2】各種のウリカーゼの熱安定性実験である。
【図3】各種のウリカーゼの熱安定性研究である。３ａ：タンパク質分子の４℃でのＰＲ－ＨＰＬＣ分析、３ｂ：タンパク質分子の４℃でのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析。
【図4】ＰＥＧ化修飾されたウリカーゼの酵素活性動態学的研究評価である。
【図5】ＰＥＧ化修飾されたウリカーゼの熱安定性評価である。
【図6】ＰＥＧ化修飾されたウリカーゼの体内薬力評価である。
【発明を実施するための形態】
【0077】
本発明は、改良されたウリカーゼ配列に関し、ここで複数の異なるウリカーゼ配列を含む。前記ウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないアミノ酸配列を含むことができる。本発明は、更に、上記改良されたウリカーゼのＰＥＧ化物及び上記ＰＥＧ－ウリカーゼの医薬組成物を提供する。これらの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼは、
（１）タンパク質の熱安定性、溶解性及び酵素活性を向上させ、
（２）分子間の高重合を避け、
（３）ＰＥＧが、存在可能な抗原エピトープをカバーし、存在している免疫原性を低下させ、血液における半減期を延ばし、
（４）野生型ウリカーゼに比べ、類似する又はより高い酵素活性を有する。
（１）タンパク質の熱安定性、溶解性及び酵素活性を向上させ、
（２）分子間の高重合を避け、
（３）ＰＥＧが、存在可能な抗原エピトープをカバーし、存在している免疫原性を低下させ、血液における半減期を延ばし、
（４）野生型ウリカーゼに比べ、類似する又はより高い酵素活性を有する。
【0078】
用語
本発明を理解しやすくために、以下、一部の技術用語を具体的に定義する。本明細書の他の部分で明確に説明しない限り、本明細書で使用される技術用語は、何れも当業者に通常理解される意味を有する。
本発明を理解しやすくために、以下、一部の技術用語を具体的に定義する。本明細書の他の部分で明確に説明しない限り、本明細書で使用される技術用語は、何れも当業者に通常理解される意味を有する。
【0079】
尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）
尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）は尿酸の酸化を触媒する酵素であり、酸化生成物はより溶解しやすいアラントインである。アラントインはより排泄しやすいプリン代謝物に属する。これは、４つの同じ３４ＫＤａサブユニットで構成されるホモ四量体酵素であり、この酵素は一連の反応を開始させる開始剤として、尿酸をより溶解しやすく排泄しやすい生成物（アラントイン）に転換し、即ち、ウリカーゼは、尿酸（ＵＡ）とＯ2とＨ2Ｏの反応を触媒して５－ヒドロキシイソ尿酸（ＨＩＵ）を形成し、Ｈ2Ｏ2を放出する。ＨＩＵは、非酵素加水分解によって２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－ウレイドイミダゾリン（ＯＨＣＵ）を生成し、その後、自発的に脱炭酸してラセミ体のアラントインを形成する不安定な生成物である。機能性ウリカーゼを含有する種に２種類の更なる酵素（ＨＩＵ加水分解酵素とＯＨＣＵ脱炭酸酵素）を発現させ、この２種類の更なる酵素はこれらの反応をより速く触媒して（Ｓ）－アラントインを生成することができる。機能性ウリカーゼは、例えば、古細菌、細菌及び真核生物などの様々な生体において発見された。但し、ヒト及び一部の霊長類動物ではウリカーゼは発現しない。これは、コドン３３の位置、コドン１８７の位置でのナンセンス変異、及びイントロン２におけるスプライス受容部位での変異に起因するものである。要するに、ヒトにおけるウリカーゼ発現の欠如により高い全身ＵＡレベルをもたらし、痛風や腫瘍溶解症候群などの高尿酸血症の発生をもたらす場合もある。保守的な推定によると、中国の既存の高尿酸血症患者は１．２億に達し、高尿酸血症は既に高血圧、高血糖、高血脂に次ぐ４番目に多くなっている。痛風は、血清ＵＡレベルが体液中のＵＡ溶解度を超える炎症性関節炎であると定義され、６．８ｍｇ／ｄＬを超える血清ＵＡレベルは、組織中のＵＡ結晶の形成をもたらし、これによって急性炎症反応を引き起こす。痛風は、慢性的な痛み、仕事や家庭生活の機能障害及び健康に関連する生活品質の低下などを引き起こす。腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）とは、腫瘍細胞が短期間に大量に溶解して細胞内の代謝産物を放出することによって引き起こされる、高尿酸血症、高カリウム血症、高リン血症、低カルシウム血症と急性腎不全を主な症状とする臨床症候群を指す。
尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）は尿酸の酸化を触媒する酵素であり、酸化生成物はより溶解しやすいアラントインである。アラントインはより排泄しやすいプリン代謝物に属する。これは、４つの同じ３４ＫＤａサブユニットで構成されるホモ四量体酵素であり、この酵素は一連の反応を開始させる開始剤として、尿酸をより溶解しやすく排泄しやすい生成物（アラントイン）に転換し、即ち、ウリカーゼは、尿酸（ＵＡ）とＯ2とＨ2Ｏの反応を触媒して５－ヒドロキシイソ尿酸（ＨＩＵ）を形成し、Ｈ2Ｏ2を放出する。ＨＩＵは、非酵素加水分解によって２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－ウレイドイミダゾリン（ＯＨＣＵ）を生成し、その後、自発的に脱炭酸してラセミ体のアラントインを形成する不安定な生成物である。機能性ウリカーゼを含有する種に２種類の更なる酵素（ＨＩＵ加水分解酵素とＯＨＣＵ脱炭酸酵素）を発現させ、この２種類の更なる酵素はこれらの反応をより速く触媒して（Ｓ）－アラントインを生成することができる。機能性ウリカーゼは、例えば、古細菌、細菌及び真核生物などの様々な生体において発見された。但し、ヒト及び一部の霊長類動物ではウリカーゼは発現しない。これは、コドン３３の位置、コドン１８７の位置でのナンセンス変異、及びイントロン２におけるスプライス受容部位での変異に起因するものである。要するに、ヒトにおけるウリカーゼ発現の欠如により高い全身ＵＡレベルをもたらし、痛風や腫瘍溶解症候群などの高尿酸血症の発生をもたらす場合もある。保守的な推定によると、中国の既存の高尿酸血症患者は１．２億に達し、高尿酸血症は既に高血圧、高血糖、高血脂に次ぐ４番目に多くなっている。痛風は、血清ＵＡレベルが体液中のＵＡ溶解度を超える炎症性関節炎であると定義され、６．８ｍｇ／ｄＬを超える血清ＵＡレベルは、組織中のＵＡ結晶の形成をもたらし、これによって急性炎症反応を引き起こす。痛風は、慢性的な痛み、仕事や家庭生活の機能障害及び健康に関連する生活品質の低下などを引き起こす。腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）とは、腫瘍細胞が短期間に大量に溶解して細胞内の代謝産物を放出することによって引き起こされる、高尿酸血症、高カリウム血症、高リン血症、低カルシウム血症と急性腎不全を主な症状とする臨床症候群を指す。
【0080】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
それは、構造Ｈ－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2）n－ＯＨを有するポリエーテル化合物である。タンパク質の共有結合に最も一般的に使用されるＰＥＧ試薬は、構造ＣＨ3－Ｏ－（ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ）n－Ｘを有するモノメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体であり、ここで、Ｘは線形リンカー及び反応性官能基（線形ＰＥＧ）を含有し、ｎは１１０～１８２００の整数である。場合によって、Ｘは分岐要素を含有することができ、これによってＰＥＧ試薬が１つの反応性官能基と複数のＰＥＧポリマー鎖（分岐ＰＥＧ）又は複数の反応性官能基とＰＥＧポリマー鎖（フォーク状ＰＥＧ）を含有するようになる。ＰＥＧ試薬は、約５、１０、２０、４０、６０と８０ＫＤａの総ＰＥＧポリマーを含むことができる。
それは、構造Ｈ－（Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2）n－ＯＨを有するポリエーテル化合物である。タンパク質の共有結合に最も一般的に使用されるＰＥＧ試薬は、構造ＣＨ3－Ｏ－（ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ）n－Ｘを有するモノメトキシポリ（エチレングリコール）誘導体であり、ここで、Ｘは線形リンカー及び反応性官能基（線形ＰＥＧ）を含有し、ｎは１１０～１８２００の整数である。場合によって、Ｘは分岐要素を含有することができ、これによってＰＥＧ試薬が１つの反応性官能基と複数のＰＥＧポリマー鎖（分岐ＰＥＧ）又は複数の反応性官能基とＰＥＧポリマー鎖（フォーク状ＰＥＧ）を含有するようになる。ＰＥＧ試薬は、約５、１０、２０、４０、６０と８０ＫＤａの総ＰＥＧポリマーを含むことができる。
【0081】
幾つかの実施例において、チオール反応性ＰＥＧは、少なくとも１つのシステインのチオール基と反応するために用いることができる。例えば、ＰＥＧ－マレイミド、ＰＥＧ－オルトピリジルジスルフィド、ＰＥＧ－ビニルスルホン及びＰＥＧ－ヨードアセトアミドを使用することができる。他の実施形態において、チオール反応性ＰＥＧは、単一のチオール反応性部分を有する直鎖又は分岐鎖構造であってもよく、又は、各ＰＥＧ分子が２個以上の反応性基を有するフォーク構造であってもよい。
【0082】
当分野において、ウリカーゼにおける１つ又は複数のシステインをＰＥＧ化可能な方法は多く知られている。全て本発明に用いることができる。
【0083】
「有効量」は、医学的な障害の症状又は徴候を改善又は予防するために十分な量を意味する。有効量は、診断を可能又は容易にするために十分な量をも意味する。特定の患者又は獣医対象に対する有効量は、例えば治療される病勢、患者の全体的な健康状況、投与の方法や経路、用量や副作用の重症度などの要因に応じて変化可能である。有効量は、明らかな副作用又は毒性作用を回避できる最大用量又は投与計画であり得る。結果として、診断測定又はパラメータは、少なくとも５％、通常少なくとも１０％、より一般的には少なくとも２０％、最も一般的には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも８０％、最も望ましくは少なくとも９０％改良でき、ここで、１００％は、正常な受検者で見られる診断パラメータとして定義される（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照）。
【0084】
「同一性」とは、２個のポリヌクレオチド配列の間又は２個のポリペプチド配列の間の配列の類似性を指す。２個の配列間の同一性百分率は、２個の配列に共通される、配列が一致するか又は同じである位置の数を、比較される位置の数で割って１００をかけた関数である。例えば、配列に対して最適比較を行う場合、２個の配列の１０個の位置のうち６個が一致するか又は同じである場合、２個の配列の同一性は６０％である。一般的には、２個の配列を比較する場合、最大百分率の同一性を得るために比較を行う。
【0085】
本明細書で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、標的領域の末端又はそれ以外の配列情報が必ず入手可能である必要があり、これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの反対鎖の配列と同じであるか又は類似してよい。２個のプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅材料の末端と一致してよい。ＰＣＲにより、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列及び細胞からの全ＲＮＡ、ファージ又はプラスミド配列で転写されたｃＤＮＡなどを増幅することができる。一般的には、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１： ２６３； Ｅｒｌｉｃｈ編（１９８９）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ）を参照する。本明細書で使用されるＰＣＲは、（一意ではない）核酸試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例として見なされ、当該方法は、プライマーである既知の核酸と核酸ポリメラーゼを用いて特定の核酸断片を増幅又は産生することを含む。
【0086】
改良されたウリカーゼ
本発明は、全体的に、改良されたウリカーゼ、ＰＥＧ－ウリカーゼ、及びその哺乳動物の高尿酸血症の治療における用途に関する。より具体的には、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないウリカーゼアミノ酸配列、ＰＥＧ－ウリカーゼ及びその用途を提供する。
本発明は、全体的に、改良されたウリカーゼ、ＰＥＧ－ウリカーゼ、及びその哺乳動物の高尿酸血症の治療における用途に関する。より具体的には、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するとともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ではないウリカーゼアミノ酸配列、ＰＥＧ－ウリカーゼ及びその用途を提供する。
【0087】
本発明により提供されるウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と約１個～約２０個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸）の差異を有し、即ち、約１～約２０個のアミノ酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なる。
【0088】
１つ又は複数の実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼは、アミノ酸配列に１個又は複数個のアミノ酸残基（例えば１～２０個）の追加、欠失又は置換を含むことにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と異なることができる。アミノ酸配列にアミノ酸の追加、欠失及び置換を導入するために用いられる方法は、当分野で周知のものである。例えば、幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端及び／又はＣ末端で切断されて酵素活性を保持した配列である。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断された配列である。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、且つ約１～８個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８）に置換された配列である。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端で約１～５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、且つＣ末端で約５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮ末端で約１～１７個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７）が切断され、約１～８個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８）に置換し、且つＣ末端で約５個のアミノ酸（例えば、約１、２、３、４又は５）が切断された配列である。幾つかの実施形態において、Ｎ末端で切断後にアミノ酸配列ＭＴＮＩＩＬＧＫ又はその断片により置換される。幾つかの実施形態において、当該ＭＴＮＩＩＬＧＫ配列における２番目のアミノ酸残基Ｔは、任意選択的に、その他のアミノ酸残基、例えば、アラニン、又は、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンとメチオニンのような、アラニンと同じように非極性アミノ酸に属するその他のアミノ酸により置換可能である。
【0089】
幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の第１７５位、第１７８位及び第２５８位の少なくとも１つの位置に置換変異を有する配列である。好ましくは、第１７５位の置換後のアミノ酸残基は、プロリン、又は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンとメチオニンのような、プロリンと同じように非極性アミノ酸に属するその他のアミノ酸である。好ましくは、第１７８位の置換後のアミノ酸残基は、グルタミン酸、又は、アスパラギン酸のような、グルタミン酸と同じように極性電荷アミノ酸に属するその他のアミノ酸である。好ましくは、第２５８位の置換後のアミノ酸残基は、セリン、又は、グルタミン酸、トレオニン、チロシン、アスパラギンとグルタミンなどの、セリンと同じように極性無電荷アミノ酸に属するその他のアミノ酸である。好ましくは、前記アミノ酸置換は、少なくとも第１７５位と第１７８位のアミノ酸置換を含み、任意選択的に第２５８位のアミノ酸置換を更に含む。より好ましくは、本発明にかかるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列のうちの第１７５位がＰであり、且つ第１７８位がＥであり、任意選択的に第２５８位がＳである配列であり、更に好ましくは、又は任意選択的に、当該ウリカーゼのＮ末端及び／又はＣ末端は、更に上記任意の形態に記載の切断及び／又は置換を有する。好ましくは、本発明は、ここの前記置換変異を有するウリカーゼ配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列も含み、且つこのような配列の少なくとも第１７５位、第１７８位及び第２５８位のアミノ酸残基は、本発明に記載の変異後の残基であり、例えば、それぞれＰ、Ｅ及びＳである。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼの配列は、更に又は独立してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の第２０５位及び／又は第２０８位に置換変異が存在する。幾つかの実施形態において、本発明にかかるウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の第２０５位と第２０８位の少なくとも１つの位置に置換変異を有する配列である。好ましくは、第２０５位の置換後のアミノ酸残基は、アスパラギン酸又はアスパラギン酸と同じように極性負電荷アミノ酸に属するグルタミン酸であり、第２０８位の置換後のアミノ酸残基は、アルギニン又はアルギニンと同じように極性正電荷アミノ酸に属するリジン又はヒスチジンである。
【0090】
幾つかの実施形態において、タンパク質の半減期を延長し、及び／又は免疫原性を軽減するために、本発明は、本明細の任意の実施形態に記載のウリカーゼ配列を、合成又は生物合成のポリマーと共有結合又は組換え発現させ、本発明に用いられる例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスホリルコリンポリマー、反復ペプチド又は「Ｘ－ＴＥＮ」配列のポリマー、又は炭水化物に基づくヒドロキシエチルデンプンのようなポリマーである。幾つかの実施形態において、共有結合に用いられる１～６（例えば、１、２、３、４、５又は６）個の表面露出部位を産生するために、本発明により提供されるウリカーゼ配列を修飾する。例えば、幾つかの実施形態において、ウリカーゼ配列は、１、２、３、４、５又は６個の表面露出したシステイン残基を含有するように修飾され、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）はこれらのシステイン残基と共有結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位と第２８８位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。幾つかの実施形態において、本発明により提供されるウリカーゼは、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位と第２８８位のうちの２つの位置にシステインを含み、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対するものである。好ましくは、本発明により提供されるウリカーゼは、第１４２位と第２１６位、第３５位と第２８８位、第３５位と第１４２位、第２１６位と第２８８位、第３５位と第１９４位、又は第８２位と第２８７位の２つの位置にシステインを含み、特に好ましくは、第３５位、第１４２位、第１９４位、第２１６位と第２８８位から選ばれる任意の２つの位置にシステインを含む。幾つかの実施形態において、前記システイン変異を有するウリカーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を基に、第３５位、第８２位、第１４２位、第１９４位、第２１６位、第２８７位と第２８８位のうちの少なくとも１つの位置にシステインを含むウリカーゼであり、位置番号はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。好ましい実施形態において、このようなウリカーゼの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端で５個以内のアミノ酸残基が切断された配列を基に、上記１つ又は複数の位置にシステイン変異を有するウリカーゼである。幾つかの実施形態において、このようなウリカーゼ配列は、上記システイン変異を導入するほか、更に第２０５位及び／又は第２０８位に上記任意の実施形態に記載の置換変異が存在し、好ましい置換変異は、Ｓ２０５Ｄ及び／又はＧ２０８Ｒである。幾つかの実施形態において、このようなウリカーゼ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端で５個以内のアミノ酸残基が切断された配列であり、上記任意の実施形態に記載のシステインの変異（特に第３５位、第１４２位、第１９４位、第２１６位と第２８８位から選ばれる任意の２つの位置にシステインを含む）を導入し、且つ第２０５位及び／又は第２０８位に上記任意の実施形態に記載の置換変異（好ましくは、Ｓ２０５Ｄ及び／又はＧ２０８Ｒである）が存在する配列である。
【0091】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0092】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0093】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0094】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0095】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0096】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣである。
【0097】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第１４２位と第２１６位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0098】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0099】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１４２位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0100】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第２１６位と第２８８位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0101】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第３５位と第１９４位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0102】
幾つかの実施形態において、本発明に記載のウリカーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変異体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に比べ、前記変異体の第８２位と第２８７位のアミノ酸残基は何れもＣであり、第２０５位のアミノ酸残基はＤであり、第２０８位のアミノ酸残基はＲである。
【0103】
ここで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は野生型ミクロコッカス属ウリカーゼの配列であり、それはＮＣＢＩ登録番号がＤ０ＶＷＱ１．１であるウリカーゼである。
【0104】
ウリカーゼの酵素活性を測定するための方法は当分野で周知のものであり、且つ当分野で周知の任意の好適な方法は何れも本発明に記載のウリカーゼの酵素活性を測定するために用いられる。
【0105】
疾患及びその治療又は予防
本発明は、更に、本発明の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを使用して哺乳動物の体液又は組織中の高尿酸血症を治療又は予防する方法を提供する。当該方法は、通常、治療又は予防有効量の本発明の何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ、又は前記改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含有する医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む。実際の状況に応じて、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、吸入、エアロゾル送達を含むが、これらに限定されない適切な投与方式を選択することができる。
本発明は、更に、本発明の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを使用して哺乳動物の体液又は組織中の高尿酸血症を治療又は予防する方法を提供する。当該方法は、通常、治療又は予防有効量の本発明の何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ、又は前記改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含有する医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む。実際の状況に応じて、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、吸入、エアロゾル送達を含むが、これらに限定されない適切な投与方式を選択することができる。
【0106】
受検者は、通常、尿酸の上昇に関連する疾患、即ち尿酸の低下により改善できる疾患に罹患している。通常、尿酸の上昇に関連する疾患は、例えば痛風と腫瘍溶解症候群のような高尿酸血症を含む。
【0107】
キット
本発明は、更に、本発明の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含む、キット形態を呈するキットを提供する。本発明のキットは、１種又は複数種の成分を含み、本明細書に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ及び１種又は複数種のその他の成分を含むが、これらに限定されず、本明細書に記載の薬学的に許容されるベクターを含むが、これらに限定されない。前記改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを組成物とし、又は医薬組成物において薬学的に許容されるベクターと組み合わせることができる。
本発明は、更に、本発明の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含む、キット形態を呈するキットを提供する。本発明のキットは、１種又は複数種の成分を含み、本明細書に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ及び１種又は複数種のその他の成分を含むが、これらに限定されず、本明細書に記載の薬学的に許容されるベクターを含むが、これらに限定されない。前記改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを組成物とし、又は医薬組成物において薬学的に許容されるベクターと組み合わせることができる。
【0108】
一実施形態において、キットは、容器（例えば、滅菌ガラス又はプラスチックバイアル）にある本発明の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ又はその医薬組成物を含む。
【0109】
キットは、キットに収納された医薬組成物と剤形の情報を含む薬品の取扱書を含んでもよい。このような情報は、一般的に患者や医者が付属の医薬組成物及び剤形を効果的且つ安全に使用することに役立つ。例えば、薬品の取扱書において、薬物動態学、薬力学、臨床研究、効果パラメータ、適応症と使用方法、禁忌症、警告事項、予防措置、副作用、過剰使用、適切な用量と投与、供給仕様、適切な保管条件、参照、メーカー／卸売業者情報、特許情報といった本発明の併用薬に関する情報を提供することができる。
【0110】
医薬組成物及び用量
本発明は、本明細書に記載の何れか１つの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含有する医薬組成物も含む。本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、ある特定の目的を達成するために一緒に組み合わせられる少なくとも１つの医薬品と、任意選択的に薬学的に使用可能なベクター又は補助材料との組み合わせを意味する。幾つかの実施形態において、本発明の目的を達成するために協働し得る限り、前記医薬組成物は、時間的及び／又は空間的に分離された組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分（例えば、本発明による何れか１つの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ）は、全体として対象に投与し、又は別々に対象に投与することができる。前記医薬組成物に含まれる成分が別々に対象に投与される場合、前記成分は同時又は順次に対象に投与することができる。好ましくは、前記薬学的に使用可能なベクターは、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張食塩溶液、例えばグルコース、マンニトール、デキストロース、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール又はポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどのポリアルキレングリコールである。使用される薬学的に使用可能なベクターのタイプは、特に、本発明による組成物が経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与又は静脈投与のために調製されたか否かによって決まる。本発明による組成物は、湿潤剤、乳化剤又は緩衝液物質を添加剤として含むことができる。
本発明は、本明細書に記載の何れか１つの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを含有する医薬組成物も含む。本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、ある特定の目的を達成するために一緒に組み合わせられる少なくとも１つの医薬品と、任意選択的に薬学的に使用可能なベクター又は補助材料との組み合わせを意味する。幾つかの実施形態において、本発明の目的を達成するために協働し得る限り、前記医薬組成物は、時間的及び／又は空間的に分離された組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分（例えば、本発明による何れか１つの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼ）は、全体として対象に投与し、又は別々に対象に投与することができる。前記医薬組成物に含まれる成分が別々に対象に投与される場合、前記成分は同時又は順次に対象に投与することができる。好ましくは、前記薬学的に使用可能なベクターは、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張食塩溶液、例えばグルコース、マンニトール、デキストロース、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール又はポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどのポリアルキレングリコールである。使用される薬学的に使用可能なベクターのタイプは、特に、本発明による組成物が経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与又は静脈投与のために調製されたか否かによって決まる。本発明による組成物は、湿潤剤、乳化剤又は緩衝液物質を添加剤として含むことができる。
【0111】
本発明の何れか１つの改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼの医薬組成物又は無菌組成物を製造するために、当該ウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼと薬学的に許容されるベクター又は賦形剤とを混合することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照する。
【0112】
本発明の医薬組成物を当分野で周知の各種の適切な投与剤形に製造することができ、この剤形には、凍結乾燥粉末、膏剤、水溶液剤又は懸濁剤などが含まれるが、これらに限定されない。許容されるベクター、賦形剤又は安定剤と混合することにより、例えば凍結乾燥粉末、膏剤、水溶液剤又は懸濁剤の形態の治療剤と診断剤の剤形を製造することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ及びＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照する）。
【0113】
使用
本発明は、尿酸の上昇に関連する疾患の治療又は予防における、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼの使用を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、尿酸の上昇に関連する疾患の治療又は予防に用いられる何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを提供する。
本発明は、尿酸の上昇に関連する疾患の治療又は予防における、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼの使用を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、尿酸の上昇に関連する疾患の治療又は予防に用いられる何れか１つの実施形態に記載の改良されたウリカーゼ又はＰＥＧ－ウリカーゼを提供する。
【0114】
略語
本発明の明細書及び実施例において、以下の略語を使用する。
ＩＰＴＧ イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド
Ｔｍ値 融解温度
ＤＴＴ ジチオスレイトール
本発明の明細書及び実施例において、以下の略語を使用する。
ＩＰＴＧ イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド
Ｔｍ値 融解温度
ＤＴＴ ジチオスレイトール
【0115】
以下の実施例によって本発明について更に説明するが、前記実施例は本発明を制限するものとして解釈すべきではない。本願全体に引用される全ての参照文献の内容は引用により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【0116】
本発明の幾つかの好ましい実施形態及び態様を証明し、更に解釈するために以下の実施例を提供するが、本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【0117】
実施例１：ウリカーゼの調製
ウリカーゼ発現ベクターの構築
ウリカーゼヌクレオチドの配列（蘇州金唯智生物科技有限公司）を合成してＰＥＴ２８ａ発現ベクターに構築する。この構築された標的遺伝子の５’酵素切断部位はＮｃｏＩであり、３’酵素切断部位はＸｈｏＩである。
ウリカーゼ発現ベクターの構築
ウリカーゼヌクレオチドの配列（蘇州金唯智生物科技有限公司）を合成してＰＥＴ２８ａ発現ベクターに構築する。この構築された標的遺伝子の５’酵素切断部位はＮｃｏＩであり、３’酵素切断部位はＸｈｏＩである。
【0118】
ＡＧ－２Ｃ１３分子の構築を例として、コドン最適化後のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【0119】
atgaccgcgaccgccgaaaccagcacgggtaccaaagttgttctgggccagaaccagtacggcaaagccgaagttcgtctggttaaggttacccgcaacacgtgccgccatgagattcaagatctgaatgtgaccagccagctccgcggcgatttcgaagccgcgcataccgccggtgataatgcccatgttgttgcgacggacacgcagaaaaacacggtttacgccttcgcccgcgatggtttcgcgaccaccgaagaatttctgctccgtctgggcaaacacttcaccgaaggttttgactgggttaccggtggtcgttgggccgcccagcagtttttctgggaccgcatcaacgaccacgaccacgcctttagccgcaataaaagcgaggtgcgtacggccgttctggaaatcagcggtagcgaacaagccatcgtggccggcattgaaggtctgaccgttctgaagagcaccggcagcgaatttcatggcttcccgcgcgacaagtacacgacgctgccagaaaccgaggatcgcattctggccaccgatgtgagtgcccgttggcgctataacacggtggaggtggatttcgatgccgtttacgcgagcgttcgcggtctgctgctgaaagcgtttgccgaaacccatagtctggcgctgcagcagaccatgtacgaaatgggtcgcgcggttatcgagacgcacccggaaatcgacgagatcaagatgagtctgccgaacaagcaccactttctggttgatctgagcccgttcggccaagataatccgaacgaggttttttacgcggccgatcgcccgtacggtctgatcgaggccaccatccagcgcgaaggctgctaa（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
【0120】
ウリカーゼの発現：
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ）転換実験により、ＬＢ／Ｋａｎａプレートに転換後のモノクローナルコロニーを選び出す。ウリカーゼ発現ベクターを含有する大腸菌を５ｍｌのＬＢ液体培地（５０ｕｍ／ｍｌのカナマイシンを含有する）にて３７℃で一晩培養し、上記種子液を２００ｍｌのＬＢ液体培地を含有する振とうフラスコに接種し、接種比率が３％であり、３７℃で培養する。菌体はＯＤ ６００が０．６～０．８になるまで成長した後、培養温度を２５℃に下げる。ＩＰＴＧを加えてその最終濃度が０．３ｍＭになるようにし、標的ウリカーゼタンパク質の発現を誘導する。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ）転換実験により、ＬＢ／Ｋａｎａプレートに転換後のモノクローナルコロニーを選び出す。ウリカーゼ発現ベクターを含有する大腸菌を５ｍｌのＬＢ液体培地（５０ｕｍ／ｍｌのカナマイシンを含有する）にて３７℃で一晩培養し、上記種子液を２００ｍｌのＬＢ液体培地を含有する振とうフラスコに接種し、接種比率が３％であり、３７℃で培養する。菌体はＯＤ ６００が０．６～０．８になるまで成長した後、培養温度を２５℃に下げる。ＩＰＴＧを加えてその最終濃度が０．３ｍＭになるようにし、標的ウリカーゼタンパク質の発現を誘導する。
【0121】
ウリカーゼの精製：
菌体を高圧均質化法又は超音波法で粉砕し、遠心分離処理後、アニオン交換の方法で更に精製し、純度＞９５％のタンパク質を得て、後続の特性分析を行う。ＤＮＡ配列決定により、プロテアーゼのアミノ酸配列を得る。
菌体を高圧均質化法又は超音波法で粉砕し、遠心分離処理後、アニオン交換の方法で更に精製し、純度＞９５％のタンパク質を得て、後続の特性分析を行う。ＤＮＡ配列決定により、プロテアーゼのアミノ酸配列を得る。
【0122】
ＡＧ－００を例として、それが最適化後のＤＮＡ配列と一致することが検証され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、以下の通りである。
【0123】
MTATAETSTG TKVVLGQNQY GKAEVRLVKV TRNTARHEIQ DLNVTSQLRG DFEAAHTAGD
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLQPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLQPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
【0124】
対照ウリカーゼの合成
上記と類似する方法で対照ウリカーゼＭＥＤＩ４９４５を合成し、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。ＭＥＤＩ４９４５は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２４１５に開示されたウリカーゼであり、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
上記と類似する方法で対照ウリカーゼＭＥＤＩ４９４５を合成し、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。ＭＥＤＩ４９４５は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２４１５に開示されたウリカーゼであり、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【0125】
MATAETSTGCKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRCTARHEIQDLNVTSQLSGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRAD
【0126】
実施例２：ミクロコッカス属ウリカーゼの配列の進化
Ａ．Ｃ末端の最適化
Ｃ末端Ｃｙｓを除去するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対してＣ末端の５個のアミノ酸を切断することにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を生成する。即ち、実施例１と類似する方法によって、ＤＮＡ特異的プライマーを設計し、ＡＧ－００配列をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によってそのＣ末端の第２９８～３０２位のアミノ酸を削除し、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、得られた分子をＡＧ－００－１と命名し、配列は以下の通りである。
Ａ．Ｃ末端の最適化
Ｃ末端Ｃｙｓを除去するために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対してＣ末端の５個のアミノ酸を切断することにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を生成する。即ち、実施例１と類似する方法によって、ＤＮＡ特異的プライマーを設計し、ＡＧ－００配列をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によってそのＣ末端の第２９８～３０２位のアミノ酸を削除し、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、得られた分子をＡＧ－００－１と命名し、配列は以下の通りである。
【0127】
MTATAETSTG TKVVLGQNQY GKAEVRLVKV TRNTARHEIQ DLNVTSQLRG DFEAAHTAGD
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLQPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSN
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLQPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSN
【0128】
Ｂ．Ｎ末端アミノ酸の置換
１５種を超える比較されるウリカーゼデータベースを使用し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１～１７位は、同じ属のウリカーゼと比べて高度に保存されていないことが発見されたため、実施例１と類似する方法によって、特異的プライマーを設計し、ＡＧ－００をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によってアミノ酸配列（ＭＴＮＩＩＬＧＫ）でＡＧ－００ウリカーゼ分子の第１～１７位のアミノ酸を置換し、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を生成し、分子をＡＧ－００－２と命名し、配列は以下の通りである。
１５種を超える比較されるウリカーゼデータベースを使用し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における第１～１７位は、同じ属のウリカーゼと比べて高度に保存されていないことが発見されたため、実施例１と類似する方法によって、特異的プライマーを設計し、ＡＧ－００をテンプレートとして、ＰＣＲ増幅によってアミノ酸配列（ＭＴＮＩＩＬＧＫ）でＡＧ－００ウリカーゼ分子の第１～１７位のアミノ酸を置換し、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を生成し、分子をＡＧ－００－２と命名し、配列は以下の通りである。
【0129】
MTNIILGKNQ YGKAEVRLVK VTRNTARHEI QDLNVTSQLR GDFEAAHTAG DNAHVVATDT
QKNTVYAFAR DGFATTEEFL LRLGKHFTEG FDWVTGGRWA AQQFFWDRIN DHDHAFSRNK
SEVRTAVLEI SGSEQAIVAG IEGLTVLKST GSEFHGFPRD KYTTLQETTD RILATDVSAR
WRYNTVEVDF DAVYASVRGL LLKAFAETHS LALQQTMYEM GRAVIETHPE IDEIKMSLPN
KHHFLVDLQP FGQDNPNEVF YAADRPYGLI EATIQREGSR ADHPIWSN
QKNTVYAFAR DGFATTEEFL LRLGKHFTEG FDWVTGGRWA AQQFFWDRIN DHDHAFSRNK
SEVRTAVLEI SGSEQAIVAG IEGLTVLKST GSEFHGFPRD KYTTLQETTD RILATDVSAR
WRYNTVEVDF DAVYASVRGL LLKAFAETHS LALQQTMYEM GRAVIETHPE IDEIKMSLPN
KHHFLVDLQP FGQDNPNEVF YAADRPYGLI EATIQREGSR ADHPIWSN
【0130】
Ｃ．部位特異的変異
実施例１と同じ方法によって、ＡＧ－００配列を基に、ＤＮＡ特異的プライマーを設計し、ブリッジＰＣＲ技術によって第２５８位のグルタミン（Ｑ）をセリン（Ｓ）に変異させ、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を生成し、ＡＧ－０１と命名し、配列は以下の通りである。
実施例１と同じ方法によって、ＡＧ－００配列を基に、ＤＮＡ特異的プライマーを設計し、ブリッジＰＣＲ技術によって第２５８位のグルタミン（Ｑ）をセリン（Ｓ）に変異させ、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を生成し、ＡＧ－０１と命名し、配列は以下の通りである。
【0131】
MTATAETSTG TKVVLGQNQY GKAEVRLVKV TRNTARHEIQ DLNVTSQLRG DFEAAHTAGD
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLQETTDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
【0132】
類似する方法を採用し、第１７５位のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）に変異させ、第１７８位のトレオニン（Ｔ）をグルタミン酸（Ｅ）に変異させ、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を生成し、ＡＧ－０２と命名し、配列は以下の通りである。
【0133】
MTATAETSTG TKVVLGQNQY GKAEVRLVKV TRNTARHEIQ DLNVTSQLRG DFEAAHTAGD
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLPETEDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLPETEDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
【0134】
類似する方法を採用し、第１７５位のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）に変異させ、第１７８位のトレオニン（Ｔ）をグルタミン酸（Ｅ）に変異させ、第２５８位のグルタミン（Ｑ）をセリン（Ｓ）に変異させ、且つ構築された生成物に対してＤＮＡ配列決定を行って検証し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を生成し、ＡＧ－０５と命名し、配列は以下の通りである。
【0135】
MTATAETSTG TKVVLGQNQY GKAEVRLVKV TRNTARHEIQ DLNVTSQLRG DFEAAHTAGD
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLPETEDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
NAHVVATDTQ KNTVYAFARD GFATTEEFLL RLGKHFTEGF DWVTGGRWAA QQFFWDRIND
HDHAFSRNKS EVRTAVLEIS GSEQAIVAGI EGLTVLKSTG SEFHGFPRDK YTTLPETEDR
ILATDVSARW RYNTVEVDFD AVYASVRGLL LKAFAETHSL ALQQTMYEMG RAVIETHPEI
DEIKMSLPNK HHFLVDLSPF GQDNPNEVFY AADRPYGLIE ATIQREGSRA DHPIWSNIAG
FC
【0136】
Ｄ．Ｎ末端の最適化
周知のように、タンパク質が大腸菌において発現する時、Ｎ末端のメチオニンはＭｅｔアミノペプチダーゼによって除去されることができ、これはメチオニンの次の第２位のアミノ酸残基のサイズにより決められ、第２位がより小さい残基であれば典型的な分解が発生し、第２位が体積のより大きい残基であれば分解が発生せず、又は第２位の残基が体積の大きいものでもなく特に小さいものでもない場合、Ｍｅｔアミノペプチダーゼは部分的に分解でき、これによって不均一性が発生する。そのため、原核生物の発現による第１位のアミノ酸の完全でない剪断を無くすために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列における第２位のトレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に変異させ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を生成し、ＡＧー００－２Ａと命名する。
周知のように、タンパク質が大腸菌において発現する時、Ｎ末端のメチオニンはＭｅｔアミノペプチダーゼによって除去されることができ、これはメチオニンの次の第２位のアミノ酸残基のサイズにより決められ、第２位がより小さい残基であれば典型的な分解が発生し、第２位が体積のより大きい残基であれば分解が発生せず、又は第２位の残基が体積の大きいものでもなく特に小さいものでもない場合、Ｍｅｔアミノペプチダーゼは部分的に分解でき、これによって不均一性が発生する。そのため、原核生物の発現による第１位のアミノ酸の完全でない剪断を無くすために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列における第２位のトレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に変異させ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を生成し、ＡＧー００－２Ａと命名する。
【0137】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
MANIILGKNQ YGKAEVRLVK VTRNTARHEI QDLNVTSQLR GDFEAAHTAG DNAHVVATDT
QKNTVYAFAR DGFATTEEFL LRLGKHFTEG FDWVTGGRWA AQQFFWDRIN DHDHAFSRNK
SEVRTAVLEI SGSEQAIVAG IEGLTVLKST GSEFHGFPRD KYTTLQETTD RILATDVSAR
WRYNTVEVDF DAVYASVRGL LLKAFAETHS LALQQTMYEM GRAVIETHPE IDEIKMSLPN
KHHFLVDLQP FGQDNPNEVF YAADRPYGLI EATIQREGSR ADHPIWSN
MANIILGKNQ YGKAEVRLVK VTRNTARHEI QDLNVTSQLR GDFEAAHTAG DNAHVVATDT
QKNTVYAFAR DGFATTEEFL LRLGKHFTEG FDWVTGGRWA AQQFFWDRIN DHDHAFSRNK
SEVRTAVLEI SGSEQAIVAG IEGLTVLKST GSEFHGFPRD KYTTLQETTD RILATDVSAR
WRYNTVEVDF DAVYASVRGL LLKAFAETHS LALQQTMYEM GRAVIETHPE IDEIKMSLPN
KHHFLVDLQP FGQDNPNEVF YAADRPYGLI EATIQREGSR ADHPIWSN
【0138】
Ｅ．修飾されたミクロコッカス属ウリカーゼの酵素活性の評価
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝系（ｐＨ８．５）を使用し、まず試験管に０．２５ｍＬの尿酸溶液と０．３７５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を加え、３７℃の水浴において１０ｍｉｎ保温し、０．１２５ｍｌの適切に希釈された上記ウリカーゼ溶液（０．００４ｍｇ／ｍＬ）を試験管に加え、正確に１０ｍｉｎ反応させた後、０．０５ｍＬの２０％ＫＯＨを加えて反応を終了する。残りの尿酸の２９２ｎｍにおける吸光度を測定し、修飾されたミクロコッカス属ウリカーゼの酵素活性を評価し、結果を図１に示し、点変異の導入によってウリカーゼの酵素活性に影響を与えなかったことが分かる。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝系（ｐＨ８．５）を使用し、まず試験管に０．２５ｍＬの尿酸溶液と０．３７５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を加え、３７℃の水浴において１０ｍｉｎ保温し、０．１２５ｍｌの適切に希釈された上記ウリカーゼ溶液（０．００４ｍｇ／ｍＬ）を試験管に加え、正確に１０ｍｉｎ反応させた後、０．０５ｍＬの２０％ＫＯＨを加えて反応を終了する。残りの尿酸の２９２ｎｍにおける吸光度を測定し、修飾されたミクロコッカス属ウリカーゼの酵素活性を評価し、結果を図１に示し、点変異の導入によってウリカーゼの酵素活性に影響を与えなかったことが分かる。
【0139】
尿酸オキシダーゼの活性は次のように定義される。３７℃、ｐＨ８．５で１分間あたりに１ｕｍｏｌの尿酸の分解を触媒するために必要な酵素の量が１つの酵素活性単位として定義される。
【0140】
Ｆ．修飾されたミクロコッカス属ウリカーゼの熱安定性の評価
修飾された上記ウリカーゼ分子を５０℃、６０℃、７０℃の条件で水浴において３０分間放置する。３７℃の条件で、２０分間平衡化し、その後、２０ｕｌの０．００４ｍｇ／ｍｌウリカーゼ溶液を加えた後、マイクロプレートリーダーを使用して直ちに数値を読取り、１０分間反応させる。ウリカーゼの残りの酵素活性を測定し、結果は吸光度の差で反映される。４℃で放置されたウリカーゼの酵素活性に正規化処理を行い、結果を図２に示す。活性測定体系：５０ｕｌの濃度８００ｕＭの尿酸、３０ｕｌの緩衝液である。
修飾された上記ウリカーゼ分子を５０℃、６０℃、７０℃の条件で水浴において３０分間放置する。３７℃の条件で、２０分間平衡化し、その後、２０ｕｌの０．００４ｍｇ／ｍｌウリカーゼ溶液を加えた後、マイクロプレートリーダーを使用して直ちに数値を読取り、１０分間反応させる。ウリカーゼの残りの酵素活性を測定し、結果は吸光度の差で反映される。４℃で放置されたウリカーゼの酵素活性に正規化処理を行い、結果を図２に示す。活性測定体系：５０ｕｌの濃度８００ｕＭの尿酸、３０ｕｌの緩衝液である。
【0141】
ＡＧ－００は６０℃で３０分間熱処理された後、酵素活性が４７％に保持されたが、ＡＧ－０１、ＡＧ－０２とＡＧ－０５は同じ条件で処理され、酵素活性保持率がそれぞれ６０％、７５％と７８％であった。７０℃の条件で処理され、ＡＧ－００の酵素活性は６％に保持され、ウリカーゼＡＧ－０１、ＡＧ－０２とＡＧ－０５の酵素活性保持率がそれぞれ１７％、２０％と１５％であった。点変異の導入によって酵素活性の熱安定性を向上させたことが分かる。
【0142】
Ｇ．修飾されたミクロコッカス属ウリカーゼのＴｍ値の評価
タンパク質Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ検出試薬キットを使用してタンパク質分子のＴｍ値を評価する。緩衝液（Ｎａ2ＨＰＯ4２．３４ｇ／Ｌ；ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ０．４８ｇ／Ｌ；ショ糖７５．３１ｇ／Ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０ ０．２ｇ／Ｌ；ｐＨ７．６±２）を使用して、上記ウリカーゼを０．５７１５ｍｇ／ｍＬに希釈し、試薬キットにおける１０００×蛍光色素を超純水で８×蛍光色素に希釈し、７０μＬの０．５７１５ｍｇ／ｍＬウリカーゼを１０μＬの８×蛍光色素と１．５ｍＬのＥＰチューブで均一に混合してから、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。また、空白対照試料として、７０μＬの製剤緩衝液と１０μＬの８×蛍光色素とを混合してなるものを使用し、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。また、システム空白対照として、７０μＬの超純水と１０μＬの８×蛍光色素とを混合してなるものを使用し、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。
タンパク質Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈｉｆｔ検出試薬キットを使用してタンパク質分子のＴｍ値を評価する。緩衝液（Ｎａ2ＨＰＯ4２．３４ｇ／Ｌ；ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ０．４８ｇ／Ｌ；ショ糖７５．３１ｇ／Ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０ ０．２ｇ／Ｌ；ｐＨ７．６±２）を使用して、上記ウリカーゼを０．５７１５ｍｇ／ｍＬに希釈し、試薬キットにおける１０００×蛍光色素を超純水で８×蛍光色素に希釈し、７０μＬの０．５７１５ｍｇ／ｍＬウリカーゼを１０μＬの８×蛍光色素と１．５ｍＬのＥＰチューブで均一に混合してから、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。また、空白対照試料として、７０μＬの製剤緩衝液と１０μＬの８×蛍光色素とを混合してなるものを使用し、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。また、システム空白対照として、７０μＬの超純水と１０μＬの８×蛍光色素とを混合してなるものを使用し、８ストリップのＰＣＲチューブ又は９６ウェルのＰＣＲプレートに分注し、分注体積は３０μＬであり、合計で２つのウェルに分注する。
【0143】
測定モード 融解曲線
蛍光団の検出 ＲＯＸ
チューブ／ウェルあたりの試料の体積 ３０μＬ
２５℃での平衡化段階の時間 ２分間
昇温段階の速度 １％
９９℃での平衡化段階の時間 ２分間
結果を以下の表１に示す。
蛍光団の検出 ＲＯＸ
チューブ／ウェルあたりの試料の体積 ３０μＬ
２５℃での平衡化段階の時間 ２分間
昇温段階の速度 １％
９９℃での平衡化段階の時間 ２分間
結果を以下の表１に示す。
【0144】
ＡＧ－０１、ＡＧ－０２、ＡＧ－０５及びＡＧ－００－２のＴｍ Ｄ値（最初のタンパク質変性の温度）は何れも野生型ウリカーゼ分子ＡＧ－００及び対照ＭＥＤＩ４９４５より高いことが分かる。点変異の導入によってウリカーゼの熱安定性を向上させたことが分かる。
【0145】
【表1】
【0146】
実施例３：特異性ＰＥＧ化
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により修飾された治療性タンパク質は、選択されたタンパク質残基（例えばリジン側鎖）にランダムに付加可能であり、又は特定の部位に対して特異性を有する。特定の部位に対する特異的ＰＥＧ化によって、確定した生理活性を有する高度に均一であるペグ化生成物をよりよく制御して生成することができる。部位特異的付加に用いられる方法では、ペアリングされていないシステイン残基と結合することは最も広く使用され、これはタンパク質配列に１つ又は複数の遊離したシステイン残基を導入する必要がある。Ｃ末端で切断されたＡＧ－００－１分子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）にシステインが含有されないため、アミノ酸変異によってシステインを導入することができる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により修飾された治療性タンパク質は、選択されたタンパク質残基（例えばリジン側鎖）にランダムに付加可能であり、又は特定の部位に対して特異性を有する。特定の部位に対する特異的ＰＥＧ化によって、確定した生理活性を有する高度に均一であるペグ化生成物をよりよく制御して生成することができる。部位特異的付加に用いられる方法では、ペアリングされていないシステイン残基と結合することは最も広く使用され、これはタンパク質配列に１つ又は複数の遊離したシステイン残基を導入する必要がある。Ｃ末端で切断されたＡＧ－００－１分子配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）にシステインが含有されないため、アミノ酸変異によってシステインを導入することができる。
【0147】
Ｃｙｓ変異の導入
ＡＧ－００－１配列におけるＣｙｓ残基を導入する潜在的な部位を選択するために、以下の幾つかの要因を考慮する。
ＡＧ－００－１配列におけるＣｙｓ残基を導入する潜在的な部位を選択するために、以下の幾つかの要因を考慮する。
【0148】
（１）活性に影響を与えるリスクを避けるために、部位は酵素活性部位から離れる必要がある。
（２）立体障害により隣接するＣｙｓがＰＥＧ化されにくいことを避けるために、部位は互いに接近してはいけない。
（３）チオール反応性ＰＥＧ試薬との有効な反応を確実に発生させるために、部位はタンパク質の表面に位置しなければならない。
（４）部位はドメイン又は保存領域に位置してはいけない。
（２）立体障害により隣接するＣｙｓがＰＥＧ化されにくいことを避けるために、部位は互いに接近してはいけない。
（３）チオール反応性ＰＥＧ試薬との有効な反応を確実に発生させるために、部位はタンパク質の表面に位置しなければならない。
（４）部位はドメイン又は保存領域に位置してはいけない。
【0149】
分析を経て、上記要求を満たす部位は、Ａ３５、Ｆ８２、Ｓ１４２、Ｔ１９４、Ｅ２１６、Ｇ２８７及びＳ２８８を含むことが分かる。従って、上記幾つかの部位をＣｙｓ変異の部位として選択する。
【0150】
実施例１と類似する方法を採用してＣｙｓ変異を導入し、ＡＧ－２Ｃ１２、ＡＧ－２Ｃ１３、ＡＧ－２Ｃ１６、ＡＧ－２Ｃ１７、ＡＧ－１Ｃ１３－１、ＡＧ－２Ｃ０１、ＡＧ－２Ｃ０５－１、ＡＧ－２Ｃ０１－１及びＡＧ－２Ｃ１２－１といった分子を調製する。
【0151】
タンパク質安定性の研究
各種の改良されたウリカーゼをリン酸塩緩衝液において、ｐＨ７．０、１ｍＭのＤＴＴ、４℃の条件で放置し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣを使用して各タンパク質の放置安定性を比較し、結果を図３ａと３ｂに示す。
各種の改良されたウリカーゼをリン酸塩緩衝液において、ｐＨ７．０、１ｍＭのＤＴＴ、４℃の条件で放置し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣを使用して各タンパク質の放置安定性を比較し、結果を図３ａと３ｂに示す。
【0152】
ＲＰ－ＨＰＬＣ（図３ａ）の結果により、ＡＧ－２Ｃ１３、ＡＧ－２Ｃ１３－１、ＡＧ－２Ｃ１２、ＡＧ－２Ｃ０１－２の純度が高いことが示される。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図３ｂ）の結果により、ＡＧ－２Ｃ１３、ＡＧ－２Ｃ１７、ＡＧ－２Ｃ１２、ＡＧ－２Ｃ０１－２の純度が高いことが示される。ＳＥＣ－ＨＰＬＣとＲＰ－ＨＰＬＣの結果をまとめて、ＡＧ－２Ｃ１３、ＡＧ－２Ｃ１２、ＡＧ－２Ｃ０１－２分子を好ましいものとする。
【0153】
ウリカーゼＰＥＧの修飾方法：
２ｍｇのウリカーゼ（１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に順次にＴＣＥＰ．ＨＣｌ（０．５ｍｇ、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、Ｍ－ＭＡＬ－ＰＥＧ－１０Ｋ（２７．５ｍｇ、マレイミドポリエチレングリコール、分子量１００００Ｄａ）を加え、室温で２時間反応させる。反応液をイオン交換クロマトグラフィーで精製すれば、ペグ化ウリカーゼが得られる。
２ｍｇのウリカーゼ（１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に順次にＴＣＥＰ．ＨＣｌ（０．５ｍｇ、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、Ｍ－ＭＡＬ－ＰＥＧ－１０Ｋ（２７．５ｍｇ、マレイミドポリエチレングリコール、分子量１００００Ｄａ）を加え、室温で２時間反応させる。反応液をイオン交換クロマトグラフィーで精製すれば、ペグ化ウリカーゼが得られる。
【0154】
ウリカーゼの活性測定方法：リン酸塩緩衝系（ｐＨ７．３）を使用する。活性測定系は、上記方法（実施例２）を参照し、残りの尿酸の２９２ｎｍにおける吸光度を測定する。
【0155】
上記選択したＣｙｓ変異部位に対して、２つずつ組み合わせてＰＥＧ化修飾とウリカーゼ活性の評価を行う。結果を表２に示す。
【0156】
【表2】
【0157】
表２に示される分子に導入された２個のシステインは、何れもＰＥＧにより好適に修飾され、この導入部位が分子表面に露出していることが証明された。また、ウリカーゼの単一のサブユニットがｍＰＥＧにより二重修飾された後、酵素活性保持率は４４％から１１３％まで変化する。更に、第２０５位と第２０８位に変異を導入することで酵素活性を更に向上させることができる。
【0158】
実施例４：ＰＥＧ化修飾されたウリカーゼ活性の評価
Ａ．ＰＥＧ化ウロキナーゼの酵素活性動態学的研究
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝系（ｐＨ８．５）を使用し、ウリカーゼ作業液の母液は２ｍＭ尿酸であり、４℃で保存する。酵素活性の測定過程：
温度を３７度に設定する。
基質（尿酸）濃度勾配は、６００μｍｏｌ、５００μｍｏｌ、４００μｍｏｌ、２００μｍｏｌ、１００μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、２５μｍｏｌ、１２．５μｍｏｌとされる。
Ａ．ＰＥＧ化ウロキナーゼの酵素活性動態学的研究
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝系（ｐＨ８．５）を使用し、ウリカーゼ作業液の母液は２ｍＭ尿酸であり、４℃で保存する。酵素活性の測定過程：
温度を３７度に設定する。
基質（尿酸）濃度勾配は、６００μｍｏｌ、５００μｍｏｌ、４００μｍｏｌ、２００μｍｏｌ、１００μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、２５μｍｏｌ、１２．５μｍｏｌとされる。
【0159】
まず、５０ｕｌの上記尿酸溶液と３０ｕｌの上記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を９６ウェルのプレートに加え、３７℃で２０ｍｉｎ保温し、その後、２０ｕｌの適切に希釈されたウリカーゼ溶液（０．００４ｍｇ／ｍＬ）を９６ウェルのプレートに迅速に加える。プロセスの設定：１０ｍｉｎ反応させ、２０ｓおきに一回データを読取り、反応をスタートする。結果を図４と表３に示す。
【0160】
結果により、ウリカーゼ分子の最大反応速度は、順次にＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ及びＭＥＤＩ４９４５であることが示される。
【0161】
【表3】
【0162】
Ｂ．ＰＥＧ修飾されたウロキナーゼの加速安定性の評価（３７℃）
ＰＥＧ修飾されたウリカーゼを３７℃の恒温箱に入れ、緩衝系はリン酸緩衝液系であり、ｐＨは７．０である。ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図５に示す。３７℃の条件で、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧの安定性はＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧとＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧより優れることが分かる。
ＰＥＧ修飾されたウリカーゼを３７℃の恒温箱に入れ、緩衝系はリン酸緩衝液系であり、ｐＨは７．０である。ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図５に示す。３７℃の条件で、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧの安定性はＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧとＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧより優れることが分かる。
【0163】
実験例６：体内薬力学的研究
単回静脈注射（ｉ．ｖ．）の投与方式により、外因性尿酸を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）することで誘導された高尿酸血症マウスモデルで受検物の血清尿酸レベルに対する影響を評価する。１２０匹の正常のマウス（ＩＣＲ－ｍａｌｅ）をランダムに６群に分け、１群に２０匹である。第１群、第２群はそれぞれ空白対照と溶媒対照として溶媒を投与し、第３群は陽性対照としてＭＥＤＩ４９４５を０．１ｍｇ／ｋｇ投与し、第４、５、６群は治療群として、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ及びＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧを投与する。投与後の翌日に、空白対照群を除き、他の各群の実験マウスに全て尿酸を腹腔内注射してモデリングし（２５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）、各群の１～１０番の動物に対して、モデリング後の３０ｍｉｎと３ｈに採血し、１１～２０番の動物に対して１．５ｈと６ｈに採血する。
単回静脈注射（ｉ．ｖ．）の投与方式により、外因性尿酸を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）することで誘導された高尿酸血症マウスモデルで受検物の血清尿酸レベルに対する影響を評価する。１２０匹の正常のマウス（ＩＣＲ－ｍａｌｅ）をランダムに６群に分け、１群に２０匹である。第１群、第２群はそれぞれ空白対照と溶媒対照として溶媒を投与し、第３群は陽性対照としてＭＥＤＩ４９４５を０．１ｍｇ／ｋｇ投与し、第４、５、６群は治療群として、それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ及びＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧを投与する。投与後の翌日に、空白対照群を除き、他の各群の実験マウスに全て尿酸を腹腔内注射してモデリングし（２５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ）、各群の１～１０番の動物に対して、モデリング後の３０ｍｉｎと３ｈに採血し、１１～２０番の動物に対して１．５ｈと６ｈに採血する。
【0164】
結果を図６に示す。０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ及びＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧ治療群の動物の血清尿酸レベルは、モデリング後の０．５ｈ～６ｈの各時点に何れも溶媒対照群（ｐ＜０．０１）より明らかに低く、モデリング後の０．５ｈ～１．５ｈに、３つの治療群の動物の血清尿酸レベルは何れも検出下限より低い（ＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ群は除外され、１．５ｈに８．３５μｍｏｌ／ｌであった）。測定用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で、ＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ及びＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧを単回注射投与した後、外因性尿酸を腹腔内注射することで誘導されたＩＣＲマウスの高尿酸血症モデルで血清尿酸レベルに対して明らかな低下作用を有する。この用量で、ウロキナーゼＡＧ－２Ｃ１３－ＰＥＧ、ＡＧ－２Ｃ０１－２－ＰＥＧ及びＡＧ－２Ｃ１２－ＰＥＧは、モデリング後の各時点に効果上の明らかな差異がなく、３ｈ後の薬力が何れもＭＥＤＩ４９４５より優れる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】