▶ ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブールの特許一覧 ▶ センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィークの特許一覧 ▶ インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）の特許一覧
特表2022-553730粘弾性挙動を示すタンパク質ベースの生体材料、それを取得するためのプロセスおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】粘弾性挙動を示すタンパク質ベースの生体材料、それを取得するためのプロセスおよびその使用
(51)【国際特許分類】
A61L 27/50 20060101AFI20221219BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20221219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221219BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
A61L27/50
A61L27/22
A61K45/00
A61L27/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022524058
(86)(22)【出願日】2020-10-23
(85)【翻訳文提出日】2022-04-22
(86)【国際出願番号】 EP2020079901
(87)【国際公開番号】W WO2021078946
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】19306387.2
(32)【優先日】2019-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500262120
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＳＴＲＡＳＢＯＵＲＧ
(71)【出願人】
【識別番号】504007888
【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アロウイ，エヤ
(72)【発明者】
【氏名】デ ジョルジ，マルセラ
(72)【発明者】
【氏名】フリッシュ，ブノワ
(72)【発明者】
【氏名】ラヴァル，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】シャーフ，ピエール
【テーマコード（参考）】
4C081
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C081AB01
4C081AB11
4C081CD111
4C081CD112
4C081CD171
4C081CD172
4C081CE02
4C084AA17
4C084NA12
4C084NA20
(57)【要約】
本発明は、生体材料を調製するプロセスに関し、プロセスは、ａ）約１０ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つのタンパク質、及び約５００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つの塩を含む溶液を調製する工程と、ｂ）工程ａ）で得た溶液を、そのままで、工程ａ）で得た前記溶液を発泡させることによって得る泡として、又はそれらの混合物として、２つの非混和性相が形成されるまで、又は実質的に乾燥した固体が得られるまで、大気圧で４～５０℃からなる温度で、又は真空下にてより低い温度で、又は大気圧よりも低い圧力で蒸発させる工程と、を含み、それによって生体材料を得る。本発明はまた、プロセスによって得られる生体材料、及びインビトロ組織工学の支持体として、及び／又はインビトロ細胞培養およびインビトロ増殖のための、及び／又は移植可能な医療機器として、又は薬物としての生体材料の使用に関する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体材料を調製するプロセスであって、前記プロセスは、ａ）約１０ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つのタンパク質、および約５００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つの塩を含む溶液を調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で得た前記溶液を、そのままで、工程ａ）で得た前記溶液を発泡させることによって得る泡として、またはそれらの混合物として、２つの非混和性相が形成されるまで、または実質的に乾燥した固体が得られるまで、大気圧で４～５０℃からなる温度で、または真空下でより低い温度で、または大気圧よりも低い圧力で蒸発させる工程と、を含み、
それによって生体材料を得る、プロセス。
【請求項2】
前記少なくとも１つの塩が、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＣ２Ｈ３Ｏ２およびＮＨ４ＨＣＯ２の中から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
工程ｂ）で得られた前記乾燥した固体が、前記少なくとも１つの塩の少なくとも９０重量％が除去されるまで洗浄される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項4】
前記少なくとも１つのタンパク質が、アルブミンまたはグロブリンなどの血清タンパク質の中から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項5】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、オバルブミン、植物性アルブミン、または組換えアルブミンの中から選択される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項6】
工程ａ）および／または工程ｂ）の間に少なくとも１つの添加剤が添加される、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項7】
前記少なくとも１つの添加剤が、ポリマー、特に非帯電、正帯電、負帯電および双性イオン性ポリマー、非イオン性アミノ酸および粒子の中から選択される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項8】
前記少なくとも１つのタンパク質および前記少なくとも１つの塩が、１００～３０００で構成されるモル比（塩／タンパク質）にある、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に定義されているプロセスによって入手可能な生体材料。
【請求項10】
前記タンパク質の二次構造のパーセンテージが、ＩＲ分析または小角Ｘ線散乱によって測定された場合、対応する天然タンパク質と少なくとも同じであることを特徴とする、請求項９に記載の生体材料。
【請求項11】
少なくとも１つの有効成分と関連していることを特徴とする、請求項９または１０に記載の生体材料。
【請求項12】
前記少なくとも１つの活性成分が、抗癌物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、細胞増殖阻害剤、抗凝固剤、抗血栓剤、酵素を含む細胞－細胞外マトリックス相互作用のモジュレーター、阻害剤、鎮痛剤、抗増殖剤、抗真菌物質、細胞静止物質、成長因子、酵素、ホルモン、ステロイド、非ステロイド性物質、および抗ヒスタミン剤の中から選択される、請求項９～１１に記載の生体材料。
【請求項13】
インビトロ組織工学の支持体として、および／またはインビトロ細胞培養およびインビトロ増殖のために、および／または移植可能な医療機器としての、請求項９～１２のいずれか一項に記載の生体材料の使用。
【請求項14】
薬物として使用するための、請求項９～１２のいずれか一項に定義されている生体材料。
【請求項15】
欠陥組織の置換を必要とする対象における欠陥組織を置換するため、または薬物放出システムにおける、請求項９～１２に記載の生体材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体材料の調製プロセス、そのプロセスによって得られる生体材料、ならびに組織工学の支持体としての、細胞培養または増殖のための、移植可能な医療機器としての、および薬物としての生体材料の使用に言及する。
【0002】
したがって、本発明は、医療分野、特に組織工学、薬物送達、創傷被覆材および移植において有用性を有する。
【0003】
以下の説明では、括弧（［］）内の参照は、テキストの最後にある参照のリストを言及している。
【背景技術】
【0004】
生体材料は、組織工学、薬物送達、創傷被覆材、移植などのさまざまな治療用途で広く使用されている。
【0005】
合成、生体またはハイブリッド、それらは数十年ですべての治療分野：心臓血管、外科および整形外科、歯科、眼科、皮膚科、泌尿器科、腎臓科、神経学、内分泌学にて、特に組織の機能を再生または改善するために増えている。
【0006】
生体材料にはいくつかの種類があるが、生体材料の４つの主要なカテゴリーを想定することができる。
金属および金属合金、
広義の陶磁器、
ポリマーとソフトマター、
植物または動物の有機体から抽出されたサンゴまたは他の成分、例えばキチン、アルギン酸塩、ヘパリン、フコイダン、セルロース、コラーゲンまたはフィブリンなどの天然由来の材料。
金属および金属合金、
広義の陶磁器、
ポリマーとソフトマター、
植物または動物の有機体から抽出されたサンゴまたは他の成分、例えばキチン、アルギン酸塩、ヘパリン、フコイダン、セルロース、コラーゲンまたはフィブリンなどの天然由来の材料。
【0007】
天然由来の材料は一般に自然に生体適合性があり、生分解性であるため、この最後のカテゴリーの生体材料は特に興味深いものである。
【0008】
天然由来の材料に基づいて、熱凝集または架橋を含む複数の技術が生体材料を調製するために使用されてきた。しかし、高温と架橋剤の使用は、不可逆的な変性と材料の構造の変化を引き起こし、その生物学的特性を失い、炎症反応を引き起こす可能性のある新しい抗原部位を明らかにする可能性がある。
【0009】
したがって、これらの欠点を持たず、より天然の生体材料のニーズを満たす、天然由来の材料に基づく代替の生体材料の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0010】
広範な研究により、出願人は、水、酸性溶液、および細胞培養培地において、顕著な機械的特性と優れた安定性を示す新しい生体材料を開発した。
【0011】
驚くべきことに、得られた生体材料は固体のような挙動を示し、組織工学または細胞培養の支持体として適している。
【0012】
本開示は、おそらく完全に独特のタイプのタンパク質、または生体材料の調製プロセス中に変性されないいくつかの選択されたタンパク質で作られた最初の生体材料を報告する。これは、本発明の生体材料が対象において炎症反応を誘発する可能性が低いことを意味する。さらに、この生体材料は細胞毒性がなく、細胞接着およびコロニー形成に有利である。
【0013】
それはタンパク質でできているため、本発明の生体材料は完全に生分解性である。
【0014】
出願人によって開発された調製プロセスは、化学的または過酷な／変性剤の配合条件なしで生体材料を得ることを可能にする。また、生体材料の特性、特に機械的および固有の特性を調整し、新しい特性を備えた機能化された生体材料を取得することもできる。したがって、出願人は、目標とされる治療用途の要件に適応するように特性を調節することができる用途の広い生体材料を提供する。
【0015】
したがって、第１の態様では、本発明は、以下の工程を含む生体材料の調製プロセスを提供する。
ａ）約１０ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つのタンパク質、および約５００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つの塩を含む溶液を調製する工程。
ｂ）工程ａ）で得た溶液を、そのままで、工程ａ）で得た溶液を発泡させることによって得る泡として、またはそれらの混合物として、２つの非混和性相が形成されるまで、または実質的に乾燥した固体が得られるまで、大気圧で４～５０℃を含む温度で、または真空下でより低い温度で、または大気圧よりも低い圧力で蒸発させ、それによって生体材料を得る工程。
ａ）約１０ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つのタンパク質、および約５００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する少なくとも１つの塩を含む溶液を調製する工程。
ｂ）工程ａ）で得た溶液を、そのままで、工程ａ）で得た溶液を発泡させることによって得る泡として、またはそれらの混合物として、２つの非混和性相が形成されるまで、または実質的に乾燥した固体が得られるまで、大気圧で４～５０℃を含む温度で、または真空下でより低い温度で、または大気圧よりも低い圧力で蒸発させ、それによって生体材料を得る工程。
【0016】
本発明のプロセスは、共有結合架橋または熱凝集工程を使用しないという重要な利点を有し、それにより、非変性タンパク質を有する生体材料を得ることができる。
【0017】
工程ａ）で使用される少なくとも１つのタンパク質は、２０℃の温度で約１０ｍｇ／ｍＬと同等以上、例えば、２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、または５０ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する任意のタンパク質であり得る。例えば、このタンパク質は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１０００ｍｇ／ｍＬで構成される溶解度を有し得る。このタンパク質の水への溶解度は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、減衰全反射（ＡＴＲ）－ＦＴＩＲ分光法、ラマン分光法、または集束ビーム反射モード（ＦＢＲＭ）測定によって測定することができる。そのようなタンパク質は、例えば、アルブミンまたはグロブリン、特にγ－グロブリンなどの血清タンパク質の中から選択され得る。アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、オバルブミン、植物性アルブミン、および組換えアルブミン、例えば、天然のヒト血清アルブミンと構造的に同等であり、米で産生される組換えヒトアルブミンの中から特に選択され得る。アルブミンはまた、アルブミンナノ粒子であり得る。上に示したように、「少なくとも１つの」タンパク質を本発明のプロセスで使用することができ、これは、１つ、２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上の異なるタンパク質を工程ａ）の溶液で使用できることを意味する。好ましくは、１～３つの異なるタンパク質が使用され得る。工程ａ）の溶液中のタンパク質の濃度は、塩との混合を可能にする任意の濃度であり得る。例えば、１０ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬの範囲を含む。当業者は、塩の性質および塩濃度に応じて、溶液中のタンパク質の濃度を適応させることができる。ただし、以下で詳しく説明するように、目的の機能を備えた生体材料を得るには、タンパク質濃度よりも塩とタンパク質のモル比がより重要である。
【0018】
工程ａ）の少なくとも１つの塩は、２０℃の温度で約５００ｍｇ／ｍＬと同等以上、例
えば、７００ｍｇ／ｍＬ、または９００ｍｇ／ｍＬ、または１２００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する任意の塩であり得る。例えば、この塩は、約５００ｍｇ／ｍＬ～３０００ｍｇ／ｍＬの間で構成される溶解度を有し得る。この塩の水への溶解度は、約２０℃の温度、ｐＨ７、大気圧で測定することができる。塩の水への溶解度は、例えば、当業者によって知られている任意の方法、例えば、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、酸塩基滴定、電位差滴定、容積測定、秤量またはラマン分光法によって測定することができる。少なくとも１つの塩は、例えば、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＣ２Ｈ３Ｏ２およびＮＨ４ＨＣＯ２の中から選択され得る。上に示したように、「少なくとも１つの」塩を本発明のプロセスで使用することができ、これは、１つ、２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上の異なる塩を使用できることを意味する。好ましくは、それは１～３つの塩が使用され得る。例えば、少なくとも１つの塩は、例えば、１００／１００／１００、２００／２００／２００、または３００／３００／３００のモル比で、ＮａＢｒおよびＮａＩ、ＮａＢｒおよびＣａＣｌ２、ＫＩおよびＣａＣｌ２、またはＮａＢｒ／ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含み得る。工程ａ）の溶液中の塩の濃度は、タンパク質との混合を可能にする任意の濃度であり得る。それは、例えば、０．０１Ｍ～４０Ｍを含み得る。当業者は、タンパク質の性質およびタンパク質濃度に応じて、溶液中の塩の濃度を適応させることができる。ただし、以下で詳しく説明するように、目的の機能を備えた生体材料を得るには、塩とタンパク質のモル比が塩濃度よりも重要である。
えば、７００ｍｇ／ｍＬ、または９００ｍｇ／ｍＬ、または１２００ｍｇ／ｍＬと同等以上の水への溶解度を有する任意の塩であり得る。例えば、この塩は、約５００ｍｇ／ｍＬ～３０００ｍｇ／ｍＬの間で構成される溶解度を有し得る。この塩の水への溶解度は、約２０℃の温度、ｐＨ７、大気圧で測定することができる。塩の水への溶解度は、例えば、当業者によって知られている任意の方法、例えば、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、酸塩基滴定、電位差滴定、容積測定、秤量またはラマン分光法によって測定することができる。少なくとも１つの塩は、例えば、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＣ２Ｈ３Ｏ２およびＮＨ４ＨＣＯ２の中から選択され得る。上に示したように、「少なくとも１つの」塩を本発明のプロセスで使用することができ、これは、１つ、２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上の異なる塩を使用できることを意味する。好ましくは、それは１～３つの塩が使用され得る。例えば、少なくとも１つの塩は、例えば、１００／１００／１００、２００／２００／２００、または３００／３００／３００のモル比で、ＮａＢｒおよびＮａＩ、ＮａＢｒおよびＣａＣｌ２、ＫＩおよびＣａＣｌ２、またはＮａＢｒ／ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含み得る。工程ａ）の溶液中の塩の濃度は、タンパク質との混合を可能にする任意の濃度であり得る。それは、例えば、０．０１Ｍ～４０Ｍを含み得る。当業者は、タンパク質の性質およびタンパク質濃度に応じて、溶液中の塩の濃度を適応させることができる。ただし、以下で詳しく説明するように、目的の機能を備えた生体材料を得るには、塩とタンパク質のモル比が塩濃度よりも重要である。
【0019】
好ましくは、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも１つの塩は、工程ａ）において、タンパク質の性質および生体材料を得るための塩の性質に依存するモル比であり得る。生体材料の形成は、タンパク質と塩の両方の濃度の対の効果に依存することが出願人によって実証されているため、塩／タンパク質のモル比は、膜形成を評価するためのより適切で信頼できるパラメータである。これを知っていると、モル比は、当業者が、彼の一般的な知識および不溶性生体材料の所望の特性、特にその堅さを考慮して、過度の負担なしに決定することができる。例えば、モル比は、１００～４０００、例えば、１００～３０００、または３００～２５００、または４００～２０００、または６００～１５００、または６５０～１０００を含み得、塩と工程ａ）で使用されるタンパク質に依存する。例えば、ＮａＢｒとアルブミンの混合物のモル比は６６４であり得る。
【0020】
工程ａ）の溶液は、非変性条件において、適合された溶媒または溶媒の混合物中で少なくとも１つのタンパク質および少なくとも１つの塩を混合することによって実現され得る。この溶媒は、当業者が一般的な知識および塩およびタンパク質の性質を考慮して、過度の負担なしに選択することができる。例えば、この溶媒は、水、酢酸緩衝液などの緩衝液、水と緩衝液の混合物、およびエタノール、メタノール、アセトン、ＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの別の水混和性溶媒の中から選択することができる。工程ａ）中の溶液の温度は、５℃～４０℃であり得る。
【0021】
工程ａ）は、当業者によって知られているタンパク質の変性を回避する任意のｐＨで実施することができる。好ましくは、工程ａ）は、３．０～９．０を含むｐＨで実施され、３．０の値は、任意選択で除外される。ｐＨは、例えば、４．０～９．０、または４．０～８．０であり得る。
【0022】
混合物は、そのような混合物を受け入れるように適合された任意の容器または支持体上で実現され得るか、または移送され得る。それは、例えば、ガラスまたはシリコーンの型、顕微鏡またはマイクロアレイ基質、細胞および組織培養皿またはマイクロウェルプレート、または生体材料がその周りで形を成すことができるポリマー支持体であり得る。有利には、支持体は、得られるべき生体材料の所望の表面積、形状および厚さを考慮して選択され得る。この目的において、容器に注がれる混合物の量は、支持体の表面積および／ま
たは生体材料の所望の厚さに応じて選択され得る。生体材料は、任意の形状、例えば、膜、完全または中空の円柱、円錐、球、舗石を有し得る。参考までに、以下に例示するように、製剤に使用されるタンパク質の初期重量と容器の面積との間の比であるＭ／Ｓ比は、１０ｍｇ／ｃｍ２～４００ｍｇ／ｃｍ２、例えば、２０ｍｇ／ｃｍ２～４００ｍｇ／ｃｍ２を含み得る。
たは生体材料の所望の厚さに応じて選択され得る。生体材料は、任意の形状、例えば、膜、完全または中空の円柱、円錐、球、舗石を有し得る。参考までに、以下に例示するように、製剤に使用されるタンパク質の初期重量と容器の面積との間の比であるＭ／Ｓ比は、１０ｍｇ／ｃｍ２～４００ｍｇ／ｃｍ２、例えば、２０ｍｇ／ｃｍ２～４００ｍｇ／ｃｍ２を含み得る。
【0023】
蒸発の工程ｂ）は、工程ａ）で得られた溶液そのままで実行され得る。この場合、工程ｂ）は、工程ａ）の直後、または工程ａ）で得られた溶液の性質または物理的構造を変えない中間工程の後に実行される。
【0024】
あるいは、工程ｂ）は、工程ａ）で得られた溶液を発泡させることによって得られた泡に対して実施され得る。泡は、例えば、工程ａ）で得られた溶液に機械的作業を適用して、溶液の表面積を増加させることによって得ることができる。これは、当業者に知られている任意の方法、例えば、攪拌、工程ａ）で得られた溶液への大量のガスの分散、または工程ａ）で得られた溶液へのガスの注入によって実施することができる。
【0025】
別の実施形態では、工程ｂ）は、工程ａ）で得られた溶液と、工程ａ）で得られた溶液を発泡させることによって得られた泡との混合物に対して実施することができる。この場合、工程ａ）で得られた溶液の一部を取り、別の容器で発泡させることができる。得られた泡は、そのまま蒸発させるか、または溶液と一緒に戻し、それと混合し、次に工程ｂ）のように蒸発させることができる。好ましくは、泡を保存するために穏やかに混合が行われる。泡の蒸発により、多孔性の高い生体材料が生成される。
【0026】
工程ｂ）の蒸発は、２つの非混和性相の形成を可能にするために、または実質的に乾燥した固体を得るために行われる。有利には、それは、溶液、発泡体またはそれらの混合物中に存在するタンパク質の変性を回避することを可能にする条件下で実施される。この目的で、この目標を達成するために、温度と圧力を決定し、相互に調整することができる。当業者は、タンパク質または塩の種類に応じて、および当業者の一般的な知識に従って、これらのパラメータを決定することができる。例えば、温度は大気圧で４～５０℃、例えば４℃～２０℃、または１０℃～５０℃、または１５℃～５０℃、または２０℃～５０℃、または２５～４０℃、または２５～３５℃、または２０～３０°Ｃを含み得る。真空下の低温または大気圧よりも低い圧力で工程ｂ）を実施することも可能である。この場合、温度は、例えば、１℃～２０℃、または２℃～１５℃、または５℃～１０℃であり得、圧力は、１～１００ｋＰａであり得る。いずれの場合も、蒸発は、２つの非混和性相が形成されるまで、または実質的に乾燥した固体が得られるまで実行される。これは、例えば、生体材料の表面に薄層の塩が堆積するとき、または２０重量％未満の水、例えば１０％未満の水を含む固体が得られるときに実行される。２つの非混和性相または実質的に乾燥した固体の形成は視覚的に認識することができる。参考までに、重量分析による水分の測定により、任意に検証することができる。
【0027】
蒸発段階の持続時間は、当業者の一般的な知識に従って、過度の負担なしに当業者が決定することができる。これは、タンパク質や塩の種類、プロセスを実行するために選択された温度と圧力、蒸発する溶液の量、または容器の形状の関数であり得る。例えば、蒸発は、１０時間～３０日、例えば、１日～２０日、または２日～３０日で実施することができる。より長い期間で実行することも可能であるが、それは生体材料の技術的特徴に改善がないことが多い。
【0028】
工程ｂ）は、当業者によって知られているタンパク質の変性を回避する任意のｐＨで実施することができる。例えば、工程ｂ）は、３．０～９．０を含むｐＨで実行することができ、３．０の値は、任意選択で除外される。タンパク質の種類に応じて、ｐＨは例えば
４．０～９．０、または４．０～８．０であり得る。
４．０～９．０、または４．０～８．０であり得る。
【0029】
蒸発は、上記の基準を満たす任意の手段、例えばオーブンまたは真空オーブンによって実施することができる。
【0030】
本発明のプロセスは、本発明の生体材料を得ることを可能にするため、上記のような工程ａ）およびｂ）からなり得る。この場合、プロセスには他の工程はなく、生体材料は、実質的に乾燥した固体、または工程ｂ）で得られた２つの非混和性相の固相である可能性があるため、工程ｂ）の最後に直接得ることができる。
【0031】
あるいは、本発明のプロセスは、本発明の生体材料を得ることを可能にする追加の工程を含み得る。追加の工程は、工程ａ）の前、および／または工程ａ）とｂ）の間、および／または工程ｂ）の後に実行することができる。この場合、生体材料は、これらの追加の工程の実施後に取得することができる。
【0032】
例えば、工程ｂ）で得られた固相または乾燥固体を洗浄して、塩の少なくとも一部を除去し、それによって生体材料を得ることができる。好ましくは、工程ｂ）で得られた固相または乾燥固体は、少なくとも１つの塩の少なくとも９０重量％が除去されるまで洗浄され得、それにより生体材料が得られる。洗浄は、例えば、前記少なくとも１つの塩の少なくとも９５％、または少なくとも９９重量％が除去されるまで実施され得る。洗浄は、当業者が知っている任意の手段、例えば蒸留水または水性緩衝液を用いて実施することができる。得られる塩濃度の制御は、以下に示すように、例えば、ＢＣＡまたは微量分析による任意の既知の方法で実施することができる。
【0033】
工程ｂ）で得られた固相または乾燥固体の浸漬の工程は、例えば、洗浄後に実施することができる。浸漬すると、生体材料に水分を補給させることができる。浸漬は、当業者が知っている任意の手段によって、例えば、蒸留水または緩衝液を用いて、室温で４８時間実施することができる。
【0034】
工程ａ）および／または工程ｂ）の間、または上記の任意の追加の工程の間に、少なくとも１つの添加剤を加えることも可能である。添加剤は、生体材料の特性を所望に応じて調節することを可能にする任意の物質であり得る。添加物はまた、場合によっては、生体材料から塩またはその一部を除去することを可能にし得る。添加剤は、当業者が一般的な知識および生体材料の所望の特性に従って選択することができる。それらは、例えば、ポリマー、特に非荷電、正荷電、負荷電および双性イオン性ポリマー、非イオン性アミノ酸および粒子の中から選択され得る。ポリマーは、多糖類、タンパク質、ペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびに／または合成および半合成ポリマーから選択される任意の天然ポリマーであり得る。例えば、ポリマーには、ポリペプチド、ホモポリペプチド、キトサン、ヒアルロン酸、ヘパリン、アルギン酸塩、コンドロイチン硫酸塩、ポリアルギニン、ポリリジン、ε－ポリリジン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリシクロデキストリン、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリエチレンイミン、キサンタンガム、ポリアクリル酸、ポリペプチドグリコール、デンプン、セルロースとその誘導体、コラーゲン、インスリン、フィブリノーゲン、カゼイン、ゼラチン、グリアジン、グルテン、エラスチン、グロブリン、およびヘモグロビンが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸は、すべての適切なアミノ酸の中から、好ましくはアルギニン、オルニチン、リジンおよびシステインの中から選択することができる。粒子は、任意の適切な粒子であり得、例えば、ナノ粒子、例えば、カーボンナノチューブまたはグラフェン、微粒子、細菌およびウイルスベクターの中から選択され得る。添加剤は、当業者に知られている任意の手段によって組み込むことができる。例えば、それは、工程ａ）で得られた溶液に前記添加剤を直接溶解および／または懸濁することによって、または前記添加剤を水混和性溶媒に溶解および／または懸濁するこ
とによって、その後工程ａ）で得られた溶液に混合物を加えることによって、工程ａ）で得られた溶液に組み込むことができる。さらに、または代わりに、添加剤は、工程ｂ）で得られた生体材料に、溶媒に溶解および／または懸濁された前記添加剤を吸着させることによって、工程ｂ）で得られた生体材料に組み込まれ得る。添加剤の量は、タンパク質および生体材料の所望の特性に適合させることができ、したがって、当業者は、当業者の一般的な知識に従って決定することができる。例えば、添加剤のパーセンテージは、生体材料中のタンパク質からの総量に対して、０～２０重量％、例えば、１～１８重量％、または２～１５重量％、または３～１２重量％であり得る。
とによって、その後工程ａ）で得られた溶液に混合物を加えることによって、工程ａ）で得られた溶液に組み込むことができる。さらに、または代わりに、添加剤は、工程ｂ）で得られた生体材料に、溶媒に溶解および／または懸濁された前記添加剤を吸着させることによって、工程ｂ）で得られた生体材料に組み込まれ得る。添加剤の量は、タンパク質および生体材料の所望の特性に適合させることができ、したがって、当業者は、当業者の一般的な知識に従って決定することができる。例えば、添加剤のパーセンテージは、生体材料中のタンパク質からの総量に対して、０～２０重量％、例えば、１～１８重量％、または２～１５重量％、または３～１２重量％であり得る。
【0035】
さらに、または代わりに、少なくとも１つの有効成分を、工程ａ）で得られた溶液および／または工程ｂ）で得られた生体材料に組み込むことができる。これにより、生体材料の機能化が可能になり得る。有効成分は、当業者に知られている任意の手段によって組み込むことができる。例えば、それは、工程ａ）で得られた溶液に前記活性成分を直接溶解および／または懸濁することによって、または水混和性溶媒に前記活性成分を溶解および／または懸濁し、次に、工程ａ）で得られた溶液に混合物を加えることによって、工程ａ）で得られた溶液に組み込むことができる。追加的または代替的に、有効成分は、工程ｂ）で得られた生体材料への溶媒に溶解および／または懸濁された前記有効成分の吸着によって、工程ｂ）で得られた生体材料に組み込まれ得る。この場合、溶媒は、水、有機溶媒、または水と水混和性溶媒との混合物の中から選択することができる。有利なことに、膜形成を阻害したり、調製された材料の特性を大幅に変更したりすることなく、タンパク質／塩溶液に最大３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を添加できるため、水不溶性の有効成分を組み込むことができる。例えば、タンパク質と溶媒の性質に応じて、合計１％、または２％、または３％、または４％、または５％、または６％、または７％、または８％、または９％、または１０％、または１１％、または１２％、または１３％、または１４％、または１５％、または１６％、または１７％、または１８％、または１９％または２０％または２１％または２２％、または２３％、または２４％、または２５％、または２６％、または２７％、または２８％、または２９％、または３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒になり得る。例えば、最大１５％のエタノール、１０％のＤＭＳＯ、または３０％のアセトニトリルまたはジクロロメタンであり得る。当業者は、日常的な実験を行うことにより、タンパク質、塩、および溶媒の機能にこの量を適応させることができる。有利なことに、膜形成を阻害したり、調製された材料の特性を大幅に変更したりすることなく、最大３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒をＢＳＡ／塩溶液に添加することが可能であり、したがって、水不溶性活性物質を組み込むことができる。
【0036】
有効成分は、生体材料に興味深い特性を与えることを可能にする任意の物質であり得る。有効成分は、当業者の一般的な知識および生体材料の所望の特性に従って、当業者が選択することができる。それは、ゴセレリン、ロイプロリド、カルムスチン、パクリタキセル、ヒストレリンまたはゲムシタビン、ジクロフェナクなどの抗炎症剤、アザチオプリンまたはメトトレキサートなどの免疫抑制剤、シクロスポリンなどの免疫調節剤、細胞外細胞の調節剤、イマチニブまたはアキシチニブなどの細胞増殖阻害剤、リバロキサバンまたはエドキサバンなどの抗凝固剤、クロピドグレルなどの抗血栓剤、酵素阻害剤、モルフィンまたはヒドロコドンなどの鎮痛剤、抗増殖剤、抗真菌物質、細胞静止物質、エリスロポイエチンなどの増殖因子を含むマトリックス相互作用トロンボポイエチン、酵素、ホルモン、ヒドロコルチゾンやプレドニゾロンなどのステロイド、非ステロイド性物質、およびジフェンヒドラミンやフェキソフェナジンなどの抗ヒスタミンなどの抗癌物質から選択され得るが、これらに限定されない。有効成分の量は、タンパク質および生体材料の所望の特性に適合させることができ、したがって、当業者は、当業者の一般的な知識に従って決定することができる。例えば、有効成分のパーセンテージは、生体材料中のタンパク質の総量に対して、０～３０重量％であり得、例えば、０～２５％重量、または１～２５％重量、または１～２０重量％、または１～１８重量％、または２～１５重量％、または３～
１２重量％であり得る。
１２重量％であり得る。
【0037】
いずれの場合でも、本発明のプロセスによって得られる生体材料は、生体材料の総重量に対して、少なくとも５０重量％、例えば、少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらには１００％のタンパク質を含み得る。
【0038】
調製プロセスの実施によって得られる生体材料は、本発明の第２の目的である。
【0039】
上で説明したように、その視覚的外観を含む生体材料の特性は、調製プロセスのパラメータの１つ以上、特に塩の種類および塩／タンパク質の比率を変更することによって調整することができ、それによって生体材料の特性を必要に応じて調整する可能性を提供する。
【0040】
生体材料の硬さに関しては、それは、発泡体からヒドロゲルを含むコンパクトな材料に至るまで、固体の不溶性生体材料であり得る。
【0041】
生体材料の形状に関して、それは、想定される用途および生体材料を調製するために使用される容器に応じて、任意の所望の形状であり得る。それは、膜、チューブ、シリンダー、パッド、リングであり得るが、このリストは限定的なものではない。生体材料はまた、所望の形状またはサイズを得るために、プロセスの実施後に切断され得る。
【0042】
生体材料は、生体材料を粉砕することにより、微粒子を含む任意の所望のサイズにすることができる。
【0043】
生体材料の視覚的側面は、半透明から不透明であり得る。
【0044】
上記のように、本発明の生体材料の主な利点の１つは、生体材料を調製するために使用されるタンパク質が、本発明の調製プロセス中に変性されないことである。調製は非変性条件で行われ、タンパク質の形状および／または二次構造は、工程ａ）で得られた溶液および工程ｂ）で得られた生体材料で分析することができる。「変性されない」とは、本発明によれば、工程ａ）で得られた溶液中の前記タンパク質の二次構造のパーセンテージが、同様の濃度で調製された対応する天然タンパク質の対照溶液または対照の乾燥天然タンパク質粉末のものと少なくとも同等であり、かつ工程ｂ）で得られた生体材料中の前記タンパク質の二次構造のパーセンテージが、対応する天然タンパク質と比較して、少なくとも実質的なβ－ターンおよび分子間β－シートの増加、ならびに、不規則構造の大幅な減少を示すことを意味する。生体材料中のタンパク質の二次構造の形状およびパーセンテージは、以下に示されるように、当業者によって知られている任意の方法、例えば、ＩＲ分析またはＳＡＸＳ（小角Ｘ線散乱）によって、制御され得る。
【0045】
本発明の生体材料は、経時的に特に安定している。有利には、それは、水溶液中で、酸性、中性および塩基性のｐＨにおいて、および／またはエタノールなどの有機溶媒中で、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも７日間安定である。これは、水素結合とジスルフィド架橋の破壊による構造の変化、および２０％未満の質量損失が観察されたとしても、この期間中に生体材料の溶解が実質的にないことを意味する。例えば、質量損失は、塩基性溶液で最大２０％、水、エタノール、酸性溶液で最大１０％になり得る。生体材料の質量損失は、以下の実施例で示すように計算することができる。
【0046】
上で説明したように、生体材料はタンパク質、特に非変性タンパク質のみでできている可能性があり、これは優れた生体適合性を意味する。有利には、生体材料は、その生物学
的特性を改善するために、前に例示されたように、少なくとも１つの有効成分と関連付けられ得る。
的特性を改善するために、前に例示されたように、少なくとも１つの有効成分と関連付けられ得る。
【0047】
したがって、本発明の別の目的は、インビトロでの組織工学および／またはインビトロでの細胞培養および増殖および／または移植可能な医療機器のための支持体としての本発明の生体材料の使用に関する。実際、本発明の生体材料は、細胞増殖に必要な構造的および生化学的支持を提供し、それらは三次元である可能性があるため、それらは細胞培養および薬物／細胞送達に特に適している。
【0048】
本発明の別の目的は、薬物として使用するための生体材料の使用に関する。本発明の生体材料は生物学的システムと相互作用することができるため、例えば、診断目的の装置、組織または器官の代用物、または機能的代用の装置の構成に使用することができる。したがって、本発明の生体材料は、特に欠陥組織を置き換えることを必要とする対象の欠陥組織を置き換えるために、または薬物放出システムのために、移植可能な医療機器としてインビボで使用され得る。言い換えれば、本発明はまた、本発明の生体材料を含む移植可能な医療装置を記載する。有利には、本発明の生体材料を含むデバイスまたは薬物は、生体材料の性質に応じて、一定期間後に生体内に吸収され得る。例えば、期間は、生体に挿入されてから２０日後、または３０日後、または６０日を超える場合がある。
【0049】
本発明は、添付の図面に関して、以下の実施例によってさらに説明されるが、限定として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】塩の存在下での蒸発によるアルブミンベースの生体材料の調製を表している。選択した製剤のＮａＢｒ／ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のモル比は６６４である。蒸発は、生体材料が完全に乾燥するまで、大気圧下のオーブン（３７℃）で７日間続けられる。過剰な塩は、生体材料の表面に薄い層を形成する。蒸発後、洗浄と浸漬の工程を適用して塩を除去し、水に不溶性のアルブミンベースの生体材料を残す。
【図2】ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の形成（３７℃での蒸発、ｐＨ＝６、Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）の経時的な追跡を表している。一度洗浄すると、膜は透明になる。型の底は焦げ付き防止のシリコンディスクで覆われている。右上隅にある不規則性は、気泡によるものである。
【図3】ＮａＢｒの濃度を上げた場合（ｐＨ＝６）のアルブミンの表面電荷滴定を表している。
【図4】振動プロトコル（周波数ランプ：１００Ｈｚ～０．０１Ｈｚ、せん断応力制御：１Ｐａ）によるアルブミンベースの膜のレオロジー特性を表している。弾性成分のせん断弾性率（Ｐａ）は実線で表され、粘性成分のせん断弾性率（Ｐａ）は破線で表される。
【図5】さまざまな溶解培地（左から右へ：水、生理食塩水、ＮａＣｌ溶液１Ｍ、ＮａＢｒ溶液１Ｍ、酸性溶液ｐＨ３、塩基性溶液ｐＨ１０、エタノールおよびトリプシン０．１２５ｍｇ／ｍＬ）における、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（３７℃およびｐＨ＝６での蒸発）の安定性を表している。各溶解培地について、膜を２５ｍＬの培地に入れた。実験は３７℃で７日間攪拌しながら実施した。
【図6】蒸留水
【化1】
、２－メルカプトエタノール
【化2】
および尿素の溶液
【化3】
でインキュベートしたＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（３７℃およびｐＨ＝６での蒸発）のレオロジー特性を表している。溶液の場合、２つの膜のバッチを３０ｍＬの培地に入れた。実験は室温で２４時間行った。膜のレオロジー特性は、振動プロトコル（周波数ランプ：１００Ｈｚ～０．０１Ｈｚ、せん断応力制御：１Ｐａ）によって評価した。
【図7A】ＢＳＡ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、Ｄ２Ｏ中）に存在するアルブミンのミッドＩバンドのフィッティングと、各二次構造のサブバンドの識別（フィッティング曲線と元のミッドＩバンドスペクトルは重複している、残留ＲＭＳエラー＜０．００５）を表している。
【図7B】ＢＳＡ対照溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、Ｄ２Ｏ、実線）とＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４溶液（ＢＳＡ：１００ｍｇ／ｍＬ、ＮａＢｒ：１Ｍ、Ｄ２Ｏ、破線）におけるＢＳＡの中間Ｉバンドの比較を表している。
【図7C】ＢＳＡ対照粉末（実線）とＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（破線）におけるＢＳＡの中間Ｉバンドの比較を表している。
【図7D】ＢＳＡ対照液（１００ｍｇ／ｍＬ、Ｄ２Ｏ、実線）とＢＳＡ対照粉末（破線）におけるＢＳＡの中間Ｉバンドの比較を表している。
【図7E】ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４溶液（ＢＳＡ：１００ｍｇ／ｍＬ、ＮａＢｒ：１Ｍ、Ｄ２Ｏ、実線）とＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（破線）におけるＢＳＡの中間Ｉバンドの比較を表している。
【図8A】ＢＳＡ溶液（溶液２、４０重量％Ｈ２Ｏ）の散乱曲線、および、３ｖ０３ＰＢＤ原子座標（５０高調波、排除体積８．７１０４、デフォルト値他のパラメータ）からの単量体ＢＳＡタンパク質を使用してＣＲＹＳＯＬを用いて測定された理論強度を表す。スケール係数を適用して理論曲線にデータを合わせた。
【図8B】（ａ）ＢＳＡの乾燥粉末、（ｂ、ｃ）ＢＳＡの溶液（（ｂ）２４．２１重量％Ｈ２Ｏを含む溶液１、（ｃ）３９．０９重量％Ｈ２Ｏを含む溶液２）、（ｄ）ＮａＢｒの乾燥粉末（＊は１１１、２００、および２２０のブラッグ反射を示す）、（ｅ）ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜のＸ線散乱曲線。わかりやすくするために、データは垂直方向にシフトされている。
【図9A】選択した条件下（３７℃での蒸発およびｐＨ＝６）で、６６４のＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比で配合されたあるアルブミンベース膜のＳＥＭ分析を表している。観察前に試料を金属化した。膜の表面。
【図9B】選択した条件下（３７℃での蒸発およびｐＨ＝６）で、６６４のＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比で配合されたあるアルブミンベース膜のＳＥＭ分析を表している。観察前に試料を金属化した。膜の断面。
【図10】膜抽出物（１２．５％、２５％、５０％、１００％のＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００、）で処理されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率を表している。間接的な細胞毒性は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００抽出物と接触して２４時間培養されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３細胞の正規化された代謝活性を、陽性対照（Ｃｔｌ＋）の正規化された代謝活性と比較することによって推定された。（＊）治療群と陽性対照（Ｃｔｌ＋）の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。生物学的複製＝１、技術的複製の合計＝４。
【図11】アルブミン膜と直接接触して培養されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３線維芽細胞の細胞生存率を表している。直接的な細胞毒性は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００
【化4】
、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４
【化5】
およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜
【化6】
（Ｍ／Ｓ＝２５ｍｇ／ｃｍ２）と接触して２４時間培養されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３細胞の正規化された代謝活性を、陽性対照（Ｃｔｌ＋）の正規化された代謝活性と比較することによって推定された。Ｃｔｌ＋
【化7】
グループと処理されたグループの間に有意差は観察されなかった。生物学的複製＝４、技術的複製の合計＝２０。
【図12A】ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜と接触して２４時間培養されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞の顕微鏡検査を表している。線維芽細胞が、生体材料の周囲に見られた。
【図12B】ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜と接触して２４時間培養されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞の顕微鏡検査を表している。線維芽細胞が、生体材料の上部に見られた。
【図13】培地を除去した後、空の未使用ウェルに新たに移した、アルブミン膜（ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＮａＣｌ２７００、それぞれ、
【化8】
上で測定されたＢａｌｂｃ ３Ｔ３線維芽細胞の正規化された代謝活性を表している。細胞接着は、処理グループと未処理グループの間でＢａｌｂｃ ３Ｔ３細胞の正規化された代謝活性を比較することによって推定される。（＊）治療群と陽性対照（Ｃｔｌ＋、
【化9】
）の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。（＊＊）治療群間で有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。生物学的複製＝３、技術的複製の合計＝１２。
【図14A】ＢＳＡ膜と接触して３７℃で４８時間培養されたＲＡＷマクロファージを表している（Ｍ／Ｓ＝２５ｍｇ／ｃｍ２、左から右へ：ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００ＬＰＳ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４ＬＰＳ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００ＬＰＳ）。マクロファージの活性化と炎症反応を評価するために、亜硝酸塩の濃度を測定した。未処理群（ＮＴ）は、膜なしおよびＬＰＳなしで培養された。ＬＰＳは、ＬＰＳ処理対照群（ＴＬＰＳ）およびＬＰＳ活性化群（ＬＰＳ）の培地（５０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間後に添加された。（＊）治療群とＮＴ群の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。（＊＊）治療群とＴ（ＬＰＳ）群の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。生物学的複製＝３、技術的複製の合計＝１２。
【図14B】ＢＳＡ膜と接触して３７℃で４８時間培養されたＲＡＷマクロファージを表している（Ｍ／Ｓ＝２５ｍｇ／ｃｍ２、左から右へ：ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００ＬＰＳ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４ＬＰＳ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００ＬＰＳ）。マクロファージの活性化と炎症反応を評価するために、ＴＮＦ－αの濃度を測定した。未処理群（ＮＴ）は、膜なしおよびＬＰＳなしで培養された。ＬＰＳは、ＬＰＳ処理対照群（ＴＬＰＳ）およびＬＰＳ活性化群（ＬＰＳ）の培地（５０ｎｇ／ｍＬ）に２４時間後に添加された。（＊）治療群とＮＴ群の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。（＊＊）治療群とＴ（ＬＰＳ）群の間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。生物学的複製＝３、技術的複製の合計＝１２。
【図15A】水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜に対して０．５Ｈｚの固定周波数、０．０１～１００％の範囲のひずみ、および室温で実行された振幅スイープ試験を表している。貯蔵（Ｇ´、Ｐａ）および損失（Ｇ”、Ｐａ）弾性率は、振幅（ひずみ、％）の関数として表される。３つの連続した振幅掃引試験を実行した。
【図15B】水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜に対して０．５Ｈｚの固定周波数、０．０１～１００％の範囲のひずみ、および室温で実行された振幅スイープ試験を表している。損失弾性率（Ｇ”、Ｐａ）は、振幅（ひずみ、％）の関数として表される。Ｇ”弾性率が最大に達する（ペイン効果）。３つの連続した振幅掃引試験を実行した。
【図15C】水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜に対して０．５Ｈｚの固定周波数、０．０１～１００％の範囲のひずみ、および室温で実行された振幅スイープ試験を表している。貯蔵弾性率（Ｇ´、Ｐａ）は時間（秒）で表される。３つの連続した振幅掃引試験を実行した。
【図16】ＳＥＭを使用したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の断面の評価を表している。
【図17】熱処理（８０℃、７２時間）ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料（実線）と対照ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料（点線）のアミドＩバンドの中央のＦＴ－ＩＲスペクトルを表している。
【図18A】制御された真空（２００、６００、および８００ｍｂａｒ）下でのＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の生成を表している。対照は大気圧で調製された。調製したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の視覚的側面。
【図18B】制御された真空（２００、６００、および８００ｍｂａｒ）下でのＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の生成を表している。対照は大気圧で調製された。調製したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の相対収率（％、白）、吸水率（％、斑点）および初期膨張（％、ハッチング）。
【図19】ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の相対収率（％、白色）、吸水率（％、斑点）、および初期膨張（％、斑点）に関する、３７℃で蒸発する前のＢＳＡ／ＮａＢｒ溶液に対する、有機溶媒（エタノール（％、ｖ／ｖ）、ＤＭＳＯ（％、ｖ／ｖ）、アセトニトリル（％、ｖ／ｖ）、およびジクロロメタン（％、ｖ／ｖ））の影響の調査を表している。対照バッチは、０％溶媒（体積比溶媒／溶液）で調製した。
【図20】ＣａＣｌ２とＮａＢｒの塩のさまざまな組み合わせで調製されたアルブミン膜の相対収率（％、白）、吸水率（％、斑点）、および初期膨張（％、斑点）を表している。モル比ＣａＣｌ２／ＢＳＡを４００に設定し、モル比ＮａＢｒ／ＢＳＡを１００～１０００で変化させた。対照は、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２のみで調製した。
【図21】アルブパッド材料（すなわち、本発明による生体材料）におけるドキソルビシン（ＤＯＸ）のプレロードを表す。
【図22】０．２５～１ｍｇ／膜（膜の質量が約４００ｍｇ、厚さが約５００μｍ）の範囲のさまざまな量のドキソルビシン（ＤＯＸ）が事前に充填されたＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜のＣＬＳＭ画像を表している。無充填の膜（０）を対照として使用した。矢印は試料の下部を指している。
【図23A】ＢＳＡ／ＮａＢｒ（黒）およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２（白）膜からリンスプロセス中に除去されたドキソルビシン（ＤＯＸ）の定量化を、０、２５０、５００、７５０および１０００の初期ＤＯＸ質量／膜（μｇ）の関数として表している。すすぎ液で除去されたＤＯＸの質量（μｇ）。
【図23B】ＢＳＡ／ＮａＢｒ（黒）およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２（白）膜からリンスプロセス中に除去されたドキソルビシン（ＤＯＸ）の定量化を、０、２５０、５００、７５０および１０００の初期ＤＯＸ質量／膜（μｇ）の関数として表している。すすぎプロセス中に除去されたＤＯＸのパーセンテージ。
【図24A】３７℃の水中で３５日後のＢＳＡ／ＮａＢｒ（μｇ）膜からのドキソルビシン（ＤＯＸ）放出を表している。最初に０．２５ｍｇ（十字）、０．５ｍｇ（三角形）、０．７５ｍｇ（円）、および１ｍｇ（実線）のＤＯＸを充填した膜（４００ｍｇ）を試験した。
【図24B】３７℃の水中で３５日後のＢＳＡ／ＮａＢｒ（％）膜からのドキソルビシン（ＤＯＸ）放出を表している。最初に０．２５ｍｇ（十字）、０．５ｍｇ（三角形）、０．７５ｍｇ（円）、および１ｍｇ（実線）のＤＯＸを充填した膜（４００ｍｇ）を試験した。
【図24C】３７℃の水中で３５日後のＢＳＡ／ＣａＣｌ２（μｇ）膜からのドキソルビシン（ＤＯＸ）放出を表している。最初に０．２５ｍｇ（十字）、０．５ｍｇ（三角形）、０．７５ｍｇ（円）、および１ｍｇ（実線）のＤＯＸを充填した膜（４００ｍｇ）を試験した。
【図24D】３７℃の水中で３５日後のＢＳＡ／ＣａＣｌ２（％）膜からのドキソルビシン（ＤＯＸ）放出を表している。最初に０．２５ｍｇ（十字）、０．５ｍｇ（三角形）、０．７５ｍｇ（円）、および１ｍｇ（実線）のＤＯＸを充填した膜（４００ｍｇ）を試験した。
【図25】０．２５ｍｇのＦＩＴＣインスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）を事前に充填したＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜（膜の質量≒４００ｍｇ、厚さ≒５００μｍ）のＣＬＳＭ画像を表している。無充填の膜（０）を対照として使用した。矢印は試料の下部を指している。
【図26A】すすぎプロセス中（μｇ）の、３７℃の水中で３５日間後のＦＩＴＣ－インスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）の定量化を表している。膜（４００ｍｇ）には、最初に０．２５ｍｇのＩＮＳ－ＦＩＴＣを充填した。ＩＮＳ－ＦＩＴＣ放出。無充填の膜（０）を対照として使用した。
【図26B】すすぎプロセス中（％）の、３７℃の水中で３５日間後のＦＩＴＣ－インスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）の定量化を表している。膜（４００ｍｇ）には、最初に０．２５ｍｇのＩＮＳ－ＦＩＴＣを充填した。ＩＮＳ－ＦＩＴＣ放出。無充填の膜（０）を対照として使用した。
【図26C】ＢＳＡ／ＮａＢｒ（黒）およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２（白）膜からの放出中（％）の、３７℃の水中で３５日間後のＦＩＴＣ－インスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）の定量化を表している。膜（４００ｍｇ）には、最初に０．２５ｍｇのＩＮＳ－ＦＩＴＣを充填した。ＩＮＳ－ＦＩＴＣ放出。無充填の膜（０）を対照として使用した。
【図27A】生体内評価用に準備された移植片ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＮａＣｌ、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２、およびＨＳＡ／ＧＬＵの視覚的側面を表している。
【図27B】生体内評価用に準備された移植片ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＮａＣｌ、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２、およびＨＳＡ／ＧＬＵの水分摂取量を表している。
【図28A】犠牲後にヌードマウスに移植された材料（ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＮａＢｒ、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２、およびＨＳＡ／ＧＬＵ）の組織学的評価を表している。Ｇｏｍｏｒｉ染色で染色された周囲組織を伴う移植片（矢印でマーク）の組織学的カットの代表的な倍率。
【図28B】犠牲後にヌードマウスに移植された材料（ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＮａＢｒ、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２、およびＨＳＡ／ＧＬＵ）の組織学的評価を表している。ＧｏｍｏｒｉおよびＰｉｃｒｏＳｉｎｉｕｓ染色で染色された周囲組織を伴う移植片（矢印でマーク）の組織学的カットの代表的な倍率。
【実施例】
【0051】
実施例１：蒸発および塩支援圧縮によって生成されたアルブミンベースの生体材料の調製
【0052】
材料
【0053】
化学試薬
ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、≧９６％）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ヒト血清アルブミン（≧９６％）、オボアルブミン（≧９８％）、およびウシ血液由来のガンマグロブリン（≧９９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、≧９６％）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ヒト血清アルブミン（≧９６％）、オボアルブミン（≧９８％）、およびウシ血液由来のガンマグロブリン（≧９９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0054】
臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム（ＫＣ２Ｈ３Ｏ２）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）はＶＷＲ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。臭化カリウム（ＫＢｒ）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）とリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）はＰｒｏｌａｂｏから入手した。ヨウ化カリウム（ＫＩ）はＣａｒｂｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓから購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、無水）およびギ酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ２）はＦｌｕｋａから購入した。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ）はＭｅｒｃｋから購入した。炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）はＡｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。臭化カリウム（ＫＢｒ）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）とリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）はＰｒｏｌａｂｏから入手した。ヨウ化カリウム（ＫＩ）はＣａｒｂｏ Ｅｒｂａ Ｒｅａｇｅｎｔｓから購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、無水）およびギ酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ２）はＦｌｕｋａから購入した。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ）はＭｅｒｃｋから購入した。炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）はＡｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。
【0055】
ＢＣＡアッセイ試薬（ビシンコニン酸溶液および硫酸銅（ＩＩ）五水和物）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。重水（Ｄ２Ｏ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0056】
生物学的試薬
３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を、安定化グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を含有し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、および１％（ｖ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン溶液１００Ｘ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）（最終濃度：それぞれ０．０６ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬ）を
補った、ダルベッコ改変イーグル中高グルコース（ＤＭＥＭ）で培養した。トリプシン（０．５ｇ／Ｌ）－ＥＤＴＡ（０．２ｇ／Ｌ）（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を使用して３７℃で５分間細胞を採取した。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ生存率アッセイはＰｒｏｍｅｇａから購入した。
３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を、安定化グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を含有し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、および１％（ｖ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン溶液１００Ｘ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）（最終濃度：それぞれ０．０６ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬ）を
補った、ダルベッコ改変イーグル中高グルコース（ＤＭＥＭ）で培養した。トリプシン（０．５ｇ／Ｌ）－ＥＤＴＡ（０．２ｇ／Ｌ）（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を使用して３７℃で５分間細胞を採取した。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ生存率アッセイはＰｒｏｍｅｇａから購入した。
【0057】
３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度で、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－７１）を、安定化グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有し、５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補った、ダルベッコ改変イーグル中高グルコース（ＤＭＥＭ）で培養した。トリプシン（０．５ｇ／Ｌ）－ＥＤＴＡ（０．２ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、３７℃で５分間細胞を採取した。大腸菌（Ｋ１２）のリポ多糖（ＬＰＳ）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。ＥＬＩＳＡ試験用の精製抗マウスＴＮＦ－α抗体クローン１Ｆ３Ｆ３Ｄ４およびビオチン化抗マウスＴＮＦ－α抗体クローンＸＴ３／ＸＴ２２は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼアビジン（アビジンＨＲＰ）はジャクソンから購入した。ｓｉｇｍａから購入したＰ－アミノベンゼンスルホンアミドと酢酸。Ｎ－（１－ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。
【0058】
方法
【0059】
調製（一般的な手順）
ｐＨ６の酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）中にＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＮａＢｒ１Ｍ（モル比ＮａＢｒ／ＢＳＡ＝６６４）の溶液を調製した。この溶液を型に入れ（底を非粘着性のシリコンディスクで覆った）、３７℃で７日間蒸発させた。得られた乾燥生体材料を洗浄して塩を除去し、蒸留水に室温で４８時間浸した。次に、水不溶性膜（ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４）を回収し、特性を評価した。
ｐＨ６の酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）中にＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＮａＢｒ１Ｍ（モル比ＮａＢｒ／ＢＳＡ＝６６４）の溶液を調製した。この溶液を型に入れ（底を非粘着性のシリコンディスクで覆った）、３７℃で７日間蒸発させた。得られた乾燥生体材料を洗浄して塩を除去し、蒸留水に室温で４８時間浸した。次に、水不溶性膜（ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４）を回収し、特性を評価した。
【0060】
初期特性評価
塩／アルブミンのモル比（式１）およびＭ／Ｓ比（式２）を使用して、製剤にラベルを付けた。相対収率（式３）、吸水率（式４）、および初期膨張（式５）を使用して、調製された膜を比較した。材料の密度（式６）は、材料を室温の蒸留水に浸すことによって評価した。ＷＢＳＡは、製剤に使用されるアルブミンの初期重量を表す。Ａｉは、蒸発プロセス中に使用されるコンテナの面積を表す。Ｗｄは、蒸留水で４８時間洗浄し、３７℃のオーブンで一晩乾燥させた後の最終乾燥膜の重量を表す。Ｖｄは、室温で蒸留水に材料を浸して測定した乾燥膜の体積である。Ｗｈは、蒸留水に２４時間浸漬し、濾紙を使用して過剰な表面水を除去した後の平衡状態にある水和膜の重量を表す。Ａｈは、電子デジタルノギス（ＴＡＣＫＬＩＦＥ－ＤＣ０１、精度±０．２ｍｍ）を使用して直径を測定した後に計算された、水和膜の表面の面積である。
塩／アルブミンのモル比（式１）およびＭ／Ｓ比（式２）を使用して、製剤にラベルを付けた。相対収率（式３）、吸水率（式４）、および初期膨張（式５）を使用して、調製された膜を比較した。材料の密度（式６）は、材料を室温の蒸留水に浸すことによって評価した。ＷＢＳＡは、製剤に使用されるアルブミンの初期重量を表す。Ａｉは、蒸発プロセス中に使用されるコンテナの面積を表す。Ｗｄは、蒸留水で４８時間洗浄し、３７℃のオーブンで一晩乾燥させた後の最終乾燥膜の重量を表す。Ｖｄは、室温で蒸留水に材料を浸して測定した乾燥膜の体積である。Ｗｈは、蒸留水に２４時間浸漬し、濾紙を使用して過剰な表面水を除去した後の平衡状態にある水和膜の重量を表す。Ａｈは、電子デジタルノギス（ＴＡＣＫＬＩＦＥ－ＤＣ０１、精度±０．２ｍｍ）を使用して直径を測定した後に計算された、水和膜の表面の面積である。
【0061】
【数1】
【0062】
標準化された誘導電位（ＳＩＰ）測定
滴定溶液を、ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＱ水に溶解して調製した。滴定溶液を、ＮａＢｒを６０ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＱ水に溶解することによって調製した。次に、ＮａＢｒ溶液を使用して、ストリーミング電流検出を使用して誘導電位を測定することにより、タンパク質の表面電荷を滴定した。Ｍｕｅｔｅｋ ＰＣＤ ０２検出器を使用した。１０ｍＬのＢＳＡ溶液を検出器タンクに移した。次に、５分間の平衡化時間の後、３０μｌ／分の頻度で生理食塩水ＮａＢｒ溶液の連続添加を行った。測定された電位がプラトーに達したときにアッセイを停止した。
滴定溶液を、ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＱ水に溶解して調製した。滴定溶液を、ＮａＢｒを６０ｍｇ／ｍＬの濃度でｍＱ水に溶解することによって調製した。次に、ＮａＢｒ溶液を使用して、ストリーミング電流検出を使用して誘導電位を測定することにより、タンパク質の表面電荷を滴定した。Ｍｕｅｔｅｋ ＰＣＤ ０２検出器を使用した。１０ｍＬのＢＳＡ溶液を検出器タンクに移した。次に、５分間の平衡化時間の後、３０μｌ／分の頻度で生理食塩水ＮａＢｒ溶液の連続添加を行った。測定された電位がプラトーに達したときにアッセイを停止した。
【0063】
ＢＣＡアッセイ
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（初期ＢＳＡ濃度＝２００ｍｇ／ｍＬ、Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２、ｎ＝３）を、それぞれ４．５ｍＬの超純水（２×１．５ｍＬ（２×３０分）、次に１ｘ１５ｍＬ（２時間））で洗浄した。次に、各すすぎ液について、メスフラスコを使用して容量を５ｍＬに調整した。次に、標準範囲（２０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ）を使用したＢＣＡ試験により、製剤に使用した初期溶液、およびリンス溶液のアルブミン濃度を測定した。アッセイを９６ウェルプレートで実施した。試薬（ビシンコニン酸／ＣｕＳＯ４）を溶液に加えた（２００μＬの試薬から２５μＬのタンパク質溶液）。次に、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ ＸＭ分光蛍光光度計（ＳＡＦＡＳ Ｍｏｎａｃｏ）を使用して、５６０ｎｍでの吸光度の読み取りを室温で行った。膜中のアルブミンの量を計算した後、ＮａＢｒの量を推定した。
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（初期ＢＳＡ濃度＝２００ｍｇ／ｍＬ、Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２、ｎ＝３）を、それぞれ４．５ｍＬの超純水（２×１．５ｍＬ（２×３０分）、次に１ｘ１５ｍＬ（２時間））で洗浄した。次に、各すすぎ液について、メスフラスコを使用して容量を５ｍＬに調整した。次に、標準範囲（２０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ）を使用したＢＣＡ試験により、製剤に使用した初期溶液、およびリンス溶液のアルブミン濃度を測定した。アッセイを９６ウェルプレートで実施した。試薬（ビシンコニン酸／ＣｕＳＯ４）を溶液に加えた（２００μＬの試薬から２５μＬのタンパク質溶液）。次に、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ ＸＭ分光蛍光光度計（ＳＡＦＡＳ Ｍｏｎａｃｏ）を使用して、５６０ｎｍでの吸光度の読み取りを室温で行った。膜中のアルブミンの量を計算した後、ＮａＢｒの量を推定した。
【0064】
微量分析
電子励起Ｘ線微量分析は、１０ｋＶの加速電子電圧（出現角度＝３５°、取得時間＝１００秒、処理時間＝７．６８μｓ）で動作するＱｕａｎｔａ ２５０ ＥＳＥＭ（ＦＥＩ
Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、試料のランダムに選択された領域で実行した。４つのＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を分析した：ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＮａＢｒ７００、およびＢＳＡ／ＮａＢｒ１４００（Ｍ／Ｓ＝１１３ｍｇ／ｃｍ２）。ＮａＢｒの量は、試料中の臭化ナトリウムの原子百分率を使用して推定した。
電子励起Ｘ線微量分析は、１０ｋＶの加速電子電圧（出現角度＝３５°、取得時間＝１００秒、処理時間＝７．６８μｓ）で動作するＱｕａｎｔａ ２５０ ＥＳＥＭ（ＦＥＩ
Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、試料のランダムに選択された領域で実行した。４つのＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を分析した：ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＮａＢｒ７００、およびＢＳＡ／ＮａＢｒ１４００（Ｍ／Ｓ＝１１３ｍｇ／ｃｍ２）。ＮａＢｒの量は、試料中の臭化ナトリウムの原子百分率を使用して推定した。
【0065】
レオロジー的挙動と圧縮アッセイ
レオロジー特性評価と圧縮アッセイを、直径２ｃｍの平面可動装置を備えたＭａｌｖｅｒｎ Ｋｉｎｅｘｕｓウルトラ＋レオメーターを使用して実行した。水和ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２、厚さ＝１．７ｍｍ）を使用した。振動プロトコルでは、試料に１Ｐａの制御されたせん断応力をかけ、２５℃で１００Ｈｚから０．０１Ｈｚの範囲の振動周波数ランプに従って測定を実行した。圧縮アッセイでは、２５℃で０．５Ｎから４０Ｎ（０．０４ｍｍ／ｓ）のフォースランプを試料に適用した。各試料の弾性率（Ｅ）は、ひずみ（ε）－応力（σ）曲線の弾性領域内で計算した（式７）。
σ＝Ｅ×ε （７）
レオロジー特性評価と圧縮アッセイを、直径２ｃｍの平面可動装置を備えたＭａｌｖｅｒｎ Ｋｉｎｅｘｕｓウルトラ＋レオメーターを使用して実行した。水和ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２、厚さ＝１．７ｍｍ）を使用した。振動プロトコルでは、試料に１Ｐａの制御されたせん断応力をかけ、２５℃で１００Ｈｚから０．０１Ｈｚの範囲の振動周波数ランプに従って測定を実行した。圧縮アッセイでは、２５℃で０．５Ｎから４０Ｎ（０．０４ｍｍ／ｓ）のフォースランプを試料に適用した。各試料の弾性率（Ｅ）は、ひずみ（ε）－応力（σ）曲線の弾性領域内で計算した（式７）。
σ＝Ｅ×ε （７）
【0066】
トラクションアッセイ
トラクションアッセイを、１００Ｎの力センサーを搭載したＩｎｓｔｒｏｎ ＥｌｅｃｔｒｏＰｕｌｓ Ｅ３０００を使用して実行した。６つの水和ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ比１１０．９ｍｇ／ｃｍ２）のバッチを使用した。試料をパンチで切断して、標準化された寸法（初期有効長Ｌ０＝４０ｍｍ、有効初期幅ｌ０＝１０ｍｍ、初期厚さｅ０＝１．７４±０．０７９ｍｍ）の６つの試験片を形成した。次に、引張試験を、室温で、０．１ｍｍ／秒の引張速度で実施した。弾性率（Ｅ）は、ひずみ（ε）－応力（σ）曲線の弾性領域内で計算した（式７）。
トラクションアッセイを、１００Ｎの力センサーを搭載したＩｎｓｔｒｏｎ ＥｌｅｃｔｒｏＰｕｌｓ Ｅ３０００を使用して実行した。６つの水和ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ比１１０．９ｍｇ／ｃｍ２）のバッチを使用した。試料をパンチで切断して、標準化された寸法（初期有効長Ｌ０＝４０ｍｍ、有効初期幅ｌ０＝１０ｍｍ、初期厚さｅ０＝１．７４±０．０７９ｍｍ）の６つの試験片を形成した。次に、引張試験を、室温で、０．１ｍｍ／秒の引張速度で実施した。弾性率（Ｅ）は、ひずみ（ε）－応力（σ）曲線の弾性領域内で計算した（式７）。
【0067】
水溶液中での安定性
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）を、３つのバッチで次の溶解培地２５ｍＬに入れた：蒸留水、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）、酸性培地（ｐＨ３、カラーインジケーター：ブロモチモールブルー）、塩基性培地（ｐＨ１０、カラーインジケーター：ブロモチモールブルー）、１Ｍ ＮａＣｌの食塩水、１Ｍ ＮａＢｒの食塩水、エタノールおよびトリプシン溶液（ＰＢＳバッファーで希釈した０．１２５ｍｇ／ｍＬ）。次に、膜を含む培地を３７℃で振とう（１８０ｒｐｍ）しながら７日間インキュベートした。その後、膜を水で洗浄してから、質量損失の特性を調べた（式８）。
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）を、３つのバッチで次の溶解培地２５ｍＬに入れた：蒸留水、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）、酸性培地（ｐＨ３、カラーインジケーター：ブロモチモールブルー）、塩基性培地（ｐＨ１０、カラーインジケーター：ブロモチモールブルー）、１Ｍ ＮａＣｌの食塩水、１Ｍ ＮａＢｒの食塩水、エタノールおよびトリプシン溶液（ＰＢＳバッファーで希釈した０．１２５ｍｇ／ｍＬ）。次に、膜を含む培地を３７℃で振とう（１８０ｒｐｍ）しながら７日間インキュベートした。その後、膜を水で洗浄してから、質量損失の特性を調べた（式８）。
【0068】
【数2】
【0069】
ＩＲ分析
重水素化硫酸トリグリシン検出器（ＲＴＤＬａＴＧＳ）およびＫＢｒビームスプリッターを備えたＶＥＲＴＥＸ ７０ ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を赤外線測定に使用した。Ｄ２Ｏ溶液を使用して、約１６５０ｃｍ－１の水のアミドＩバンドと強い吸収バンドの間のスペクトルの重複を回避した。すべての試料は、２つのＣａＦ２ウィンドウの間に配置した。試料のＦＴＩＲスペクトルは、室温にて、４０００～８００ｃｍ－１、公称分解能２ｃｍ－１で記録され、スペクトルあたり１２８スキャンを累積し、スキャンレートは１０ｋＨｚで、Ｄ２Ｏスペクトルをバックグラウンドとして使用した。液体試料（ＢＳＡ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の溶液）は、１００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ濃度で、Ｄ２Ｏで調製した。固体試料（ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の膜）をＤ２Ｏで水和した。
重水素化硫酸トリグリシン検出器（ＲＴＤＬａＴＧＳ）およびＫＢｒビームスプリッターを備えたＶＥＲＴＥＸ ７０ ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を赤外線測定に使用した。Ｄ２Ｏ溶液を使用して、約１６５０ｃｍ－１の水のアミドＩバンドと強い吸収バンドの間のスペクトルの重複を回避した。すべての試料は、２つのＣａＦ２ウィンドウの間に配置した。試料のＦＴＩＲスペクトルは、室温にて、４０００～８００ｃｍ－１、公称分解能２ｃｍ－１で記録され、スペクトルあたり１２８スキャンを累積し、スキャンレートは１０ｋＨｚで、Ｄ２Ｏスペクトルをバックグラウンドとして使用した。液体試料（ＢＳＡ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の溶液）は、１００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ濃度で、Ｄ２Ｏで調製した。固体試料（ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の膜）をＤ２Ｏで水和した。
【0070】
スペクトル分析は、分光計ソフトウェアＯＰＵＳ７．５（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実行した。二次構造解析では、デコンボリューションされたスペクトルのアミドＩ領域（１７００～１６００ｃｍ－１）に対してカーブフィッティング法を実行した。カーブフィッティングの前に、低波数（１６００ｃｍ－１）側と高波数（１７００ｃｍ－１）側の最小値を使用して、アミドＩバンドのスペクトルをベースライン補正した。デコンボリューションは、ガウス線形状を使用した最小二乗反復曲線あてはめプログラム（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）に従って実行した。サブバンドの数とその位置は、デコンボリューションされたスペクトルと、スペクトルの２次および４次導関数から決定した。最終的な適合では、残留ＲＭＳエラーを可能な限り減らすために（０．００５未満）、これらのパラメータの少なくとも１つを毎回変更させずに、すべてのバンドの高さ、幅、および位置を調整した。最後に、元の曲線と近似曲線の２次導関数を比較して、曲線近似の精度を確認した。取り付けられたコンポーネントの分数領域を使用して、さまざまな二次構造要素（αヘリックス、βシート、βターン、およびランダムコイル）のパーセンテージを計算した。
【0071】
ＳＡＸＳ ＩＣＳ
小角および広角Ｘ線散乱分析（ＳＡＸＳおよびＷＡＸＳ）は、乾燥ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜と、凍結乾燥ＢＳＡの乾燥粉末およびＢＳＡの２つの溶液（溶液１：１１３．６９ｍｇＢＳＡ＋３６．３１ｍｇＨ２Ｏ、溶液２：１１９．３９ｍｇＢＳＡ＋７９．６１ｍｇＨ２Ｏ）の３つの対照で実行した。測定は、４０ｋＶ、３０ｍＡで動作するマイクロフォーカス回転アノードジェネレーター（Ｍｉｃｒｏｍａｘ－００７ＨＦ）に取り付けられたＲｉｇａｋｕ回折計で実行した。ビームは単色化され（波長λ＝１．５４Å）、共焦点Ｍａｘ－ＦｌｕｘＯｐｔｉｃｓ（Ｏｓｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．）と３つのピンホールコリメーションシステムで集束された。散乱強度は、散乱ベクトルｑ（式９）の大きさの関数として測定し、式中、θは散乱角である。大きな散乱ベクトル範囲をカバーするために、２つの異なる構成を使用した。
小角および広角Ｘ線散乱分析（ＳＡＸＳおよびＷＡＸＳ）は、乾燥ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜と、凍結乾燥ＢＳＡの乾燥粉末およびＢＳＡの２つの溶液（溶液１：１１３．６９ｍｇＢＳＡ＋３６．３１ｍｇＨ２Ｏ、溶液２：１１９．３９ｍｇＢＳＡ＋７９．６１ｍｇＨ２Ｏ）の３つの対照で実行した。測定は、４０ｋＶ、３０ｍＡで動作するマイクロフォーカス回転アノードジェネレーター（Ｍｉｃｒｏｍａｘ－００７ＨＦ）に取り付けられたＲｉｇａｋｕ回折計で実行した。ビームは単色化され（波長λ＝１．５４Å）、共焦点Ｍａｘ－ＦｌｕｘＯｐｔｉｃｓ（Ｏｓｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．）と３つのピンホールコリメーションシステムで集束された。散乱強度は、散乱ベクトルｑ（式９）の大きさの関数として測定し、式中、θは散乱角である。大きな散乱ベクトル範囲をカバーするために、２つの異なる構成を使用した。
【0072】
低いｑ範囲は、試料位置からｄ＝０．８１ｍに配置された２Ｄマルチワイヤ検出器で調査された（０．０１Å－１＜ｑ＜０．３３Å－１）。より高いｑ値は、試料の近くに挿入されたＦｕｊｉイメージングプレートを使用して測定した（ｄ＝０．１ｍ、０．１Å－１＜ｑ＜３Å－１）。散乱パターンは、等方性散乱の通常の手順に従って処理した。強度は放射状に統合され、電子バックグラウンド、検出器効率、試料透過率、および試料厚さに対して補正された。ＢＳＡ溶液の場合、純粋な溶媒と容器からの散乱も測定し、差し引いた。強度は、キャリブレーションされたルポレン標準を使用して絶対スケールに変換した。散乱ベクトルは、ベヘン酸銀粉末の回折ピークを使用して較正した。
【0073】
【数3】
【0074】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
走査型電子顕微鏡の評価を、１０ｋＶの加速電子電圧で動作するＱｕａｎｔａ ２５０
ＥＳＥＭ（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実行した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ比＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）を３７℃で４８時間乾燥させた。次に、Ｈｕｍｍｅｒ Ｊｒスパッタリング装置（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、試料を金－パラジウム合金でコーティングした。表面と断面を調べた。
走査型電子顕微鏡の評価を、１０ｋＶの加速電子電圧で動作するＱｕａｎｔａ ２５０
ＥＳＥＭ（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実行した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（Ｍ／Ｓ比＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）を３７℃で４８時間乾燥させた。次に、Ｈｕｍｍｅｒ Ｊｒスパッタリング装置（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、試料を金－パラジウム合金でコーティングした。表面と断面を調べた。
【0075】
抽出物の細胞毒性試験
間接的な細胞毒性評価については、ＩＳＯ規格（ＩＳＯ１０９９３－５（２００９））に従った。この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。膜をエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用するまで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。各膜を１２ウェルプレートに移し、１．５ｍＬの培地（ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））で、３７℃で７２時間撹拌しながら抽出した。次に、１２．５％、２５％、５０％、および１００％（ｖ／ｖ）の抽出物を含む希釈液を調製した。Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を９６ウェルプレートでウェルあたり８０００細胞（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））で３７℃で２４時間培養した。翌日、各ウェルの培地を１００μＬの希釈抽出物と交換した。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと２０％のＤＭＳＯを含む培地で調製した。次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベートした後、各ウェルの培地を、新鮮な培地（１ｍｇ／ｍＬ）で希釈したＭＴＴの溶液１００μＬと交換し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次に、ホルマザン結晶を８０μＬのＤＭＳＯに可溶化し、室温で１５分間平衡化した後、ＳＡＦＡＳ装置を使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定した。陽性対照の代謝活性を使用して、各グループの生細胞のパーセンテージを決定した。
間接的な細胞毒性評価については、ＩＳＯ規格（ＩＳＯ１０９９３－５（２００９））に従った。この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。膜をエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用するまで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。各膜を１２ウェルプレートに移し、１．５ｍＬの培地（ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））で、３７℃で７２時間撹拌しながら抽出した。次に、１２．５％、２５％、５０％、および１００％（ｖ／ｖ）の抽出物を含む希釈液を調製した。Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を９６ウェルプレートでウェルあたり８０００細胞（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））で３７℃で２４時間培養した。翌日、各ウェルの培地を１００μＬの希釈抽出物と交換した。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと２０％のＤＭＳＯを含む培地で調製した。次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベートした後、各ウェルの培地を、新鮮な培地（１ｍｇ／ｍＬ）で希釈したＭＴＴの溶液１００μＬと交換し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次に、ホルマザン結晶を８０μＬのＤＭＳＯに可溶化し、室温で１５分間平衡化した後、ＳＡＦＡＳ装置を使用して５６０ｎｍでの吸光度を測定した。陽性対照の代謝活性を使用して、各グループの生細胞のパーセンテージを決定した。
【0076】
直接細胞毒性試験
この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、非粘着性シリコーン型で２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。水和した膜を円形パンチを使用して切断し、小さなディスク（直径＝５ｍｍ、厚さ＝０．７ｍｍ）を得た。ディスクをエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用するまで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。直接的な細胞毒性評価のために、滅菌されたディスクを黒い壁の９６ウェルプレートに移した。次に、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を、生体材料のディスク上にウェルあたり８０００細胞（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））でプレートに直接添加した。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと２０％のＤＭＳＯを含む培地に添加した。次に、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを室温で３０分間平衡化した。培地を排除した。各ウェルに、５０μＬの新しい培地を加え、続いて５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加えた。次に、ＳＡＦＡＳ装置および以下のプロトコルを使用して生物発光を測定した。生物発光を測定する前に、プレートを２分間撹拌し、次に１０分間平衡化させた。陽性対照の代謝活性を使用して、各グループの生細胞のパーセンテージを決定した。
この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、非粘着性シリコーン型で２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。水和した膜を円形パンチを使用して切断し、小さなディスク（直径＝５ｍｍ、厚さ＝０．７ｍｍ）を得た。ディスクをエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用するまで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。直接的な細胞毒性評価のために、滅菌されたディスクを黒い壁の９６ウェルプレートに移した。次に、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞（クローンＡ３１ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１６３）を、生体材料のディスク上にウェルあたり８０００細胞（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（１０％）＋ＰＳ（１％））でプレートに直接添加した。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと２０％のＤＭＳＯを含む培地に添加した。次に、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを室温で３０分間平衡化した。培地を排除した。各ウェルに、５０μＬの新しい培地を加え、続いて５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加えた。次に、ＳＡＦＡＳ装置および以下のプロトコルを使用して生物発光を測定した。生物発光を測定する前に、プレートを２分間撹拌し、次に１０分間平衡化させた。陽性対照の代謝活性を使用して、各グループの生細胞のパーセンテージを決定した。
【0077】
マクロファージ活性化アッセイ
この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、非粘着性シリコーン型で２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。水和した膜を円形パンチを使用して切断し、小さなディスク（直径＝５ｍｍ、厚さ＝０．７ｍｍ）を得た。ディスクをエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用する
まで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。マクロファージ活性化アッセイでは、滅菌したディスクを９６ウェルプレートに移した。次に、ＲＡＷ２６４．７マクロファージをウェルあたり１０００００細胞でプレートに直接添加した（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（５％）＋ＰＳ（１％））。３７℃で２４時間培養した後、ＬＰＳをＬＰＳ処理グループに添加して、各ウェルの最終濃度を５０ｎｇ／ｍＬにした。次に、プレートを３７℃でさらに２４時間インキュベートした。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと、５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む培地で調製した。次に、細胞の形状を顕微鏡で評価し、ＮＯおよびＴＮＦ－αの産生を次のように評価した。
この試験中に使用された膜は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００であった。膜を、非粘着性シリコーン型で２５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓ比で調製した。水和した膜を円形パンチを使用して切断し、小さなディスク（直径＝５ｍｍ、厚さ＝０．７ｍｍ）を得た。ディスクをエタノール７０％で洗浄し、次に滅菌ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＵＶ光下で１５分間滅菌した。次に、それらをさらに使用する
まで滅菌ＰＢＳ１Ｘに保存した。マクロファージ活性化アッセイでは、滅菌したディスクを９６ウェルプレートに移した。次に、ＲＡＷ２６４．７マクロファージをウェルあたり１０００００細胞でプレートに直接添加した（培地：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（５％）＋ＰＳ（１％））。３７℃で２４時間培養した後、ＬＰＳをＬＰＳ処理グループに添加して、各ウェルの最終濃度を５０ｎｇ／ｍＬにした。次に、プレートを３７℃でさらに２４時間インキュベートした。陽性対照および陰性対照を、それぞれ培地のみと、５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを含む培地で調製した。次に、細胞の形状を顕微鏡で評価し、ＮＯおよびＴＮＦ－αの産生を次のように評価した。
【0078】
ＮＯ産生の評価
細胞上清中の亜硝酸塩の濃度を、Ｇｒｉｅｓｓ試験によって評価した（ｎ＝３）。６０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬（３０％酢酸中の５８．１ｍＭｐ－アミノベンゼンスルホンアミドと６０％酢酸中の３．９ｍＭＮ－（１－ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩のｖ／ｖ混合物）を４０μＬの上清に添加し、５４３ｎｍでの吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウムの検量線と比較した。
細胞上清中の亜硝酸塩の濃度を、Ｇｒｉｅｓｓ試験によって評価した（ｎ＝３）。６０μＬのＧｒｉｅｓｓ試薬（３０％酢酸中の５８．１ｍＭｐ－アミノベンゼンスルホンアミドと６０％酢酸中の３．９ｍＭＮ－（１－ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩のｖ／ｖ混合物）を４０μＬの上清に添加し、５４３ｎｍでの吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウムの検量線と比較した。
【0079】
ＴＮＦ－α産生の評価
細胞上清中のＴＮＦ－α濃度を、市販の試薬を使用し、製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によって評価した。捕捉抗体を０．０５Ｍ ｐＨ９．６炭酸塩／重炭酸塩バッファーで１μｇ／ｍＬに希釈し、４℃で１晩コーティングした後、ＰＢＳ ０．０５％
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １％ ＢＳＡ（１時間、３７℃）でブロッキングした。次に、試料を培地で希釈し、捕捉抗体（２時間、３７℃）でインキュベートした後、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １％ ＢＳＡで０．５μｇ／ｍＬに希釈した検出抗体を添加した（１時間、３７℃）。次に、アビジンＨＲＰを導入し（４５分、３７℃）、１．２５ｍＭテトラメチルベンジジンおよび１３．０５ｍＭ Ｈ２Ｏ２の溶液を０．１Ｍ ｐＨ５クエン酸バッファーに添加して顕色した。最後に、１Ｍ ＨＣｌを添加して顕色を停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
細胞上清中のＴＮＦ－α濃度を、市販の試薬を使用し、製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ｎ＝３）によって評価した。捕捉抗体を０．０５Ｍ ｐＨ９．６炭酸塩／重炭酸塩バッファーで１μｇ／ｍＬに希釈し、４℃で１晩コーティングした後、ＰＢＳ ０．０５％
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １％ ＢＳＡ（１時間、３７℃）でブロッキングした。次に、試料を培地で希釈し、捕捉抗体（２時間、３７℃）でインキュベートした後、ＰＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ １％ ＢＳＡで０．５μｇ／ｍＬに希釈した検出抗体を添加した（１時間、３７℃）。次に、アビジンＨＲＰを導入し（４５分、３７℃）、１．２５ｍＭテトラメチルベンジジンおよび１３．０５ｍＭ Ｈ２Ｏ２の溶液を０．１Ｍ ｐＨ５クエン酸バッファーに添加して顕色した。最後に、１Ｍ ＨＣｌを添加して顕色を停止し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0080】
統計分析
データを、Ｒ（バージョン３．６．１、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析した。分布の正規性は、シャピロ－ウィルク検定で決定した。分散の同等性は、Ｆ検定で決定した。データが正規分布しており、試料の分散が等しい場合、ｔ検定（両側検定）を使用して２つの平均を比較した。これらの２つの条件が当てはまらない場合は、代わりにマンホイットニー検定を実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
データを、Ｒ（バージョン３．６．１、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析した。分布の正規性は、シャピロ－ウィルク検定で決定した。分散の同等性は、Ｆ検定で決定した。データが正規分布しており、試料の分散が等しい場合、ｔ検定（両側検定）を使用して２つの平均を比較した。これらの２つの条件が当てはまらない場合は、代わりにマンホイットニー検定を実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
【0081】
結果と考察
【0082】
処方パラメータスクリーニング
水溶液へのアルブミンの溶解度とその熱およびｐＨ安定領域を徹底的に研究した。以前の研究では、アルブミンは３～９のｐＨ範囲で安定していることが示されていた。また、変性温度はｐＨに依存し、低いｐＨ値（ｐＨ７．４では６２℃、ｐＨ３．５では４６．８℃）で低下することが示された。この作業では、アルブミンの本来の構造を可能な限り維持するために、蒸発温度を３７℃、ｐＨを６に設定した。次に、操作条件の徹底的なスクリーニングを実施して、興味深い生体材料の形成を可能にする条件を特定した。制御されたｐＨ（ｐＨ＝６）で処方されたアルブミン溶液（タンパク質のみまたは塩を含む）を、残留物が完全に乾燥するまで３７℃のオーブンで蒸発させた（図１を参照）。その後、残留物を洗浄して過剰の塩とタンパク質を除去し、次に蒸留水に４８時間浸して、それらの水溶性を評価した。水不溶性材料を生成する配合物のみが選択された。生体材料分野での
潜在的な用途では、優れた取り扱い性を示す水不溶性膜が最も有望である。
水溶液へのアルブミンの溶解度とその熱およびｐＨ安定領域を徹底的に研究した。以前の研究では、アルブミンは３～９のｐＨ範囲で安定していることが示されていた。また、変性温度はｐＨに依存し、低いｐＨ値（ｐＨ７．４では６２℃、ｐＨ３．５では４６．８℃）で低下することが示された。この作業では、アルブミンの本来の構造を可能な限り維持するために、蒸発温度を３７℃、ｐＨを６に設定した。次に、操作条件の徹底的なスクリーニングを実施して、興味深い生体材料の形成を可能にする条件を特定した。制御されたｐＨ（ｐＨ＝６）で処方されたアルブミン溶液（タンパク質のみまたは塩を含む）を、残留物が完全に乾燥するまで３７℃のオーブンで蒸発させた（図１を参照）。その後、残留物を洗浄して過剰の塩とタンパク質を除去し、次に蒸留水に４８時間浸して、それらの水溶性を評価した。水不溶性材料を生成する配合物のみが選択された。生体材料分野での
潜在的な用途では、優れた取り扱い性を示す水不溶性膜が最も有望である。
【0083】
１０５ｍｇ／ｃｍ２のＭ／Ｓが配合された材料の場合、６８～６９時間後に固体材料が得られた（図２を参照）。６９時間後、残留水が蒸発するにつれて、過剰な塩の薄い白い層が材料の表面に形成される。洗浄後、塩の層は急速に除去され、半透明の膜が得られる（図２を参照）。材料の形成と圧縮を可能にするために、Ｍ／Ｓが１０５ｍｇ／ｃｍ２の膜には７日間の蒸発期間が最適であることがわかった。
【0084】
第１のパラメータ：塩
最初に、塩なしで調製されたアルブミン残留物の溶解度を検証し、アルブミン膜の処方における塩の重要性を確認した。次に、３つの異なる濃度（０．５Ｍ、１Ｍ、および２Ｍ）で多くの塩の徹底的なスクリーニングを実行した。前述のように、蒸留水中で４８時間後の乾燥残留物の水溶性を使用して、膜形成を可能にする塩を特定した。
最初に、塩なしで調製されたアルブミン残留物の溶解度を検証し、アルブミン膜の処方における塩の重要性を確認した。次に、３つの異なる濃度（０．５Ｍ、１Ｍ、および２Ｍ）で多くの塩の徹底的なスクリーニングを実行した。前述のように、蒸留水中で４８時間後の乾燥残留物の水溶性を使用して、膜形成を可能にする塩を特定した。
【0085】
ホフマイスターシリーズによると、イオンが異なれば、タンパク質の安定性と溶解性に異なる影響を及ぼす。リオトロピック効果は、イオンのサイズ、電荷密度、分極率に関連している。高濃度の塩とタンパク質を含む溶液を扱う場合は、溶媒分子、塩のイオン、およびタンパク質間の相互作用の影響を考慮する必要がある。この実験では、さまざまな陰イオンと陽イオンのカップルを持つ１２の塩が試験された：ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＩ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＣ２Ｈ３Ｏ２、ＮＨ４ＨＣＯ２、Ｋ２ＣＯ３、Ｋ２ＨＰＯ４。この実験の結果は、アルブミン膜の形成が塩の種類とその濃度の両方に依存していることを示唆している。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、またはＫＢｒの存在下では、アルブミン分子は膜に組織化されず、乾燥残留物は結晶化した塩と乾燥タンパク質の混合物であり、完全に水溶性である。さらに、二価の陰イオン（Ｋ２ＣＯ３およびＫ２ＨＰＯ４）を含む塩で調製された初期溶液中のアルブミンの早期凝集は、膜形成を防ぐ。水不溶性膜は、１２の塩のうち７つで得られた：ＮａＢｒ、ＫＩ、ＮａＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＣ２Ｈ３Ｏ２およびＮＨ４ＨＣＯ２。ＮａＢｒを使用すると、試験した３つの濃度すべてで膜が得られた。ただし、他の６つの塩では、特定の濃度でのみアルブミン膜が得られた。これらの膜の物理的側面と特性（吸水、初期膨張、取り扱い性）は、使用する塩の種類とその濃度によって大幅に異なる。
【0086】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（初期塩濃度＝１Ｍ）は、優れた機械的強度と取り扱い性を示した。これらの膜（Ｍ／Ｓ＝１０５ｍｇ／ｃｍ２）は、８７．６％±４．１％の相対収率で製造され、吸水率と初期膨張はそれぞれ１２３．１％±６．８％と１２１．６％±４．７％と推定され（ｎ＝８）、そしてそれらの密度は１．２９±０．０２ｇ／ｃｍ３であった。この製剤は、アルブミンベースの膜形成のパラメータの特定およびこれらの材料の特性評価のための参照として選択された。
【0087】
第２のパラメータ：塩／アルブミンのモル比
塩濃度が膜形成に影響を与えることが以前に示された。ただし、塩の濃度を独立したパラメータと見なす必要があるのか、特定の溶液中のアルブミンの濃度と組み合わせる必要があるのかは不明である。膜の形成に対するＢＳＡとＮａＢｒの初期濃度の影響を、２つのアッセイで得られた膜を比較することによって評価した。第１のアッセイでは、一定濃度のＮａＢｒと可変濃度のＢＳＡ、したがって可変モル比の塩／アルブミンが使用された。一方、第２のアッセイでは、モル比の塩／アルブミンを変更せずに、両方の濃度を同時に変更する必要があった。第１のアッセイでは、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、および４００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液を１Ｍ ＮａＢｒで調製した。ＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比はそれぞれ６６４、３３２、２２１、１６６であった。モル比を下げると、製剤の収率が著しく低下し（それぞれ８６．４％、７７．２％、６２．７％、０％）、得られた膜は視覚的側面と吸水率の点で大幅に異なった。さらに、４００ｍ
ｇ／ｍＬのアルブミン濃度（モル比の塩／アルブミン＝１６６）で溶液を蒸発させた後に得られた残留物は完全に水溶性であった。第２のアッセイでは、調製した溶液にそれぞれ次の濃度のＢＳＡとＮａＢｒが含まれていた：１Ｍで１００ｍｇ／ｍＬ、２Ｍで２００ｍｇ／ｍＬ、３Ｍで３００ｍｇ／ｍＬ、４Ｍで４００ｍｇ／ｍＬ。ＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比はすべての溶液で６６４であった。第１のアッセイとは異なり、第２のアッセイのすべての溶液が膜形成をもたらした。得られた膜は同じ視覚的側面を共有し、同様の特性を示した。したがって、膜形成に対する塩濃度の影響は、初期溶液中のアルブミン濃度と組み合わせずに評価することはできない。膜の形成は、塩とアルブミンの両方の濃度の対の効果に依存するため、塩／アルブミンのモル比は、アルブミン膜の形成を評価するためのより適切で信頼できるパラメータであることを証明する。
塩濃度が膜形成に影響を与えることが以前に示された。ただし、塩の濃度を独立したパラメータと見なす必要があるのか、特定の溶液中のアルブミンの濃度と組み合わせる必要があるのかは不明である。膜の形成に対するＢＳＡとＮａＢｒの初期濃度の影響を、２つのアッセイで得られた膜を比較することによって評価した。第１のアッセイでは、一定濃度のＮａＢｒと可変濃度のＢＳＡ、したがって可変モル比の塩／アルブミンが使用された。一方、第２のアッセイでは、モル比の塩／アルブミンを変更せずに、両方の濃度を同時に変更する必要があった。第１のアッセイでは、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、および４００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液を１Ｍ ＮａＢｒで調製した。ＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比はそれぞれ６６４、３３２、２２１、１６６であった。モル比を下げると、製剤の収率が著しく低下し（それぞれ８６．４％、７７．２％、６２．７％、０％）、得られた膜は視覚的側面と吸水率の点で大幅に異なった。さらに、４００ｍ
ｇ／ｍＬのアルブミン濃度（モル比の塩／アルブミン＝１６６）で溶液を蒸発させた後に得られた残留物は完全に水溶性であった。第２のアッセイでは、調製した溶液にそれぞれ次の濃度のＢＳＡとＮａＢｒが含まれていた：１Ｍで１００ｍｇ／ｍＬ、２Ｍで２００ｍｇ／ｍＬ、３Ｍで３００ｍｇ／ｍＬ、４Ｍで４００ｍｇ／ｍＬ。ＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比はすべての溶液で６６４であった。第１のアッセイとは異なり、第２のアッセイのすべての溶液が膜形成をもたらした。得られた膜は同じ視覚的側面を共有し、同様の特性を示した。したがって、膜形成に対する塩濃度の影響は、初期溶液中のアルブミン濃度と組み合わせずに評価することはできない。膜の形成は、塩とアルブミンの両方の濃度の対の効果に依存するため、塩／アルブミンのモル比は、アルブミン膜の形成を評価するためのより適切で信頼できるパラメータであることを証明する。
【0088】
次の工程は、膜を形成できるＮａＢｒ／ＢＳＡのモル比の範囲を特定することである。ＢＳＡ溶液を、設定された濃度のアルブミン（１００ｍｇ／ｍ）と５０～２０００のモル比ＮａＢｒ／ＢＳＡで調製した。これらの溶液を蒸発させ、得られた材料を前述のように４８時間水に浸した。完全に形成された膜は、モル比１００～３０００の範囲内で、特に２００～２０００以内で得られた。この範囲の最低および最高のモル比の場合、得られた膜は堅牢性が低く、取り扱い中に破損および劣化しやすいが、許容できる。
【0089】
アルブミン表面電荷の影響
アルブミン膜の形成における初期溶液のイオン含有量の十分に確立された含意のために、膜形成につながるイオン現象のより良い理解を提供するために、アルブミンの表面電荷を評価する必要がある。アルブミンの表面電荷は、初期溶液のｐＨとそのイオン強度に依存する。
アルブミン膜の形成における初期溶液のイオン含有量の十分に確立された含意のために、膜形成につながるイオン現象のより良い理解を提供するために、アルブミンの表面電荷を評価する必要がある。アルブミンの表面電荷は、初期溶液のｐＨとそのイオン強度に依存する。
【0090】
膜の形成に対するｐＨの影響を評価するために、６６４のモル比ＮａＢｒ／ＢＳＡのアルブミンとＮａＢｒの溶液を、４、５、６、７、および８のｐＨ値で調製した。等電点が４．７、等電点が５．２の場合、ＢＳＡはｐＨ６、７、８で正味の負電荷を持ち、ｐＨ４で正味の正電荷を持ち、ｐＨ５付近で双性イオンになる。試験したすべてのｐＨ値でアルブミン膜が得られた。これらの膜は、同様の視覚的側面と配合収量を共有したが、それらの吸水率と初期膨張は大幅に異なっていた。最高のｐＨ値で調合された膜は、より高い吸水率と初期膨張を示す。したがって、ｐＨは膜の形成に中程度の影響を与えるようである。さらに、ｐＨ６でのアルブミン表面電荷の研究により、塩を添加することにより、タンパク質と塩の陽イオンとの間の相互作用により、タンパク質の全体的な表面電荷が増加することが明らかになった。実際、測定された誘導電位は、プラトーに達する前に塩濃度を上げることによって大幅に増加する（図３を参照）。アルブミンの表面電荷の増加は、分子間の静電反発力の減少をもたらし、それらの凝集を促進してアルブミン膜を形成することができる。
【0091】
残留塩分
生物学的評価を見越して、配合された材料の最終的な組成と残留塩分を十分に特徴づける必要がある。したがって、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の最終的な組成を決定し、残留ＮａＢｒを定量化するために、２つの補完的な方法が使用された。まず、ＢＣＡアッセイを使用して、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の洗浄に使用したすすぎ水でアルブミンを定量した。すすぎ溶液を蒸発させた後、乾燥残留物を秤量し、洗浄プロセスによって除去されたＮａＢｒの量を計算し、膜を形成するために最初に使用したＮａＢｒの量と比較した。洗浄されたＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の残留ＮａＢｒ含有量は、１％（重量％）未満と推定された。これらの結果を検証し、特に臭素含有量をターゲットにするために、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の最終組成を微量分析によって直接分析した。微量分析は乾燥した膜で直接行われ、試験された膜の臭素含有量は分析された領域で検出できなかったことが明らかになった（分析された領域＝１１８０μｍ２、試料の厚さ＝１ｍｍ）。さらに、ＢＳＡ／Ｎ
ａＢｒ膜の分析Ｘ線回折（図８を参照）では、膜に結晶性ＮａＢｒの痕跡は検出されなかった。結論として、アルブミンベースの生体材料の処方のために溶液に最初に添加されたＮａＢｒは、洗浄プロセス中に排除される。
生物学的評価を見越して、配合された材料の最終的な組成と残留塩分を十分に特徴づける必要がある。したがって、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の最終的な組成を決定し、残留ＮａＢｒを定量化するために、２つの補完的な方法が使用された。まず、ＢＣＡアッセイを使用して、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の洗浄に使用したすすぎ水でアルブミンを定量した。すすぎ溶液を蒸発させた後、乾燥残留物を秤量し、洗浄プロセスによって除去されたＮａＢｒの量を計算し、膜を形成するために最初に使用したＮａＢｒの量と比較した。洗浄されたＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の残留ＮａＢｒ含有量は、１％（重量％）未満と推定された。これらの結果を検証し、特に臭素含有量をターゲットにするために、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の最終組成を微量分析によって直接分析した。微量分析は乾燥した膜で直接行われ、試験された膜の臭素含有量は分析された領域で検出できなかったことが明らかになった（分析された領域＝１１８０μｍ２、試料の厚さ＝１ｍｍ）。さらに、ＢＳＡ／Ｎ
ａＢｒ膜の分析Ｘ線回折（図８を参照）では、膜に結晶性ＮａＢｒの痕跡は検出されなかった。結論として、アルブミンベースの生体材料の処方のために溶液に最初に添加されたＮａＢｒは、洗浄プロセス中に排除される。
【0092】
機械的性質
選択されたアルブミンベースの生体材料の粘弾性挙動を、水で飽和した後に研究した。保存係数（Ｇ´）は、損失係数（Ｇ´´）よりも高いことがわかった（図４を参照）。さらに、ゾル－ゲル転移は観察されなかった。したがって、試験された周波数の範囲内で、膜は固体のような挙動を示す。
選択されたアルブミンベースの生体材料の粘弾性挙動を、水で飽和した後に研究した。保存係数（Ｇ´）は、損失係数（Ｇ´´）よりも高いことがわかった（図４を参照）。さらに、ゾル－ゲル転移は観察されなかった。したがって、試験された周波数の範囲内で、膜は固体のような挙動を示す。
【0093】
圧縮アッセイ中に、モル比６６４のＢＳＡとＮａＢｒで配合された膜の弾性率は０．７ＭＰａであることがわかった。さらに、引張試験を、同じ方法で配合されたアルブミン膜のバッチ（ｎ＝６）で実行した。トラクションアッセイ後に計算された膜の弾性率は０．８７±０．１２ＭＰａである。したがって、どちらのアッセイでも同様の結果が得られる。生体材料の破壊を引き起こした最大応力は、０．１９±０．０３ＭＰａと推定された。
【0094】
以下の表１は、トラクションと圧縮の結果の比較を示している。使用した膜は、選択した条件下（３７℃での蒸発およびｐＨ＝６）で、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＮａＢｒを６６４のモル比ＮａＢｒ／ＢＳＡで配合した。試験は、水和生体材料で実施した。
【0095】
【表1】
【0096】
水溶液中での安定性
生体液と接触して使用される生体材料は、水性培地中で良好な安定性を有することが重要である。組織再生のための移植または足場の処方などの用途では、生体材料は水に不溶性であるか、分解プロセスが非常に遅い必要がある。したがって、膜ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の水溶液中での安定性が試験された。膜の生分解性もトリプシン溶液で試験した（図５を参照）。
生体液と接触して使用される生体材料は、水性培地中で良好な安定性を有することが重要である。組織再生のための移植または足場の処方などの用途では、生体材料は水に不溶性であるか、分解プロセスが非常に遅い必要がある。したがって、膜ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の水溶液中での安定性が試験された。膜の生分解性もトリプシン溶液で試験した（図５を参照）。
【0097】
トリプシン溶液と接触してインキュベートされた膜は完全に分解され、緩衝液に溶解した。プロテアーゼなしで、３７℃で７日間インキュベートした膜については、１７％損失した塩基性溶液でインキュベートした膜を除いて、膜の各バッチは各溶解培地でそれらの初期質量の１０％未満しか失われなかった。さらに、製剤化されたアルブミンベースの膜は水性培地に不溶性であり、３７℃でそれらの培地で７日以上のインキュベーションの間無傷のままである。実際、これらの膜は少しも変質を見せることなく蒸留水中で最大１か月間保存することができる。さらに、これらの生体材料は酸性および塩基性のｐＨに対して耐性を示す。水とエタノールで観察された質量損失は、主に、攪拌中のチューブの側面
に対する摩擦によって引き起こされた膜の侵食によって説明できる。したがって、これらのアルブミンベースの膜は水溶液中で非常に安定しており、完全に生分解性である。
に対する摩擦によって引き起こされた膜の侵食によって説明できる。したがって、これらのアルブミンベースの膜は水溶液中で非常に安定しており、完全に生分解性である。
【0098】
尿素（２Ｍ、４Ｍ、および８Ｍ）および２－メルカプトエタノール（０．１Ｍ）の溶液中のＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の安定性も試験した。尿素と２－メルカプトエタノールは、それぞれ水素結合とジスルフィド架橋を切断することによってタンパク質のアンフォールディングを誘発することができる、よく知られている変性剤である。試験したアルブミンベースの膜は壊れたり溶解したりすることはなかったが、水和膜の直径（Ａｈ）は大幅に増加し、初期膨張（Ｅ％）が増加したことを示し、複素弾性率（Ｇ＊）が減少すると、それらの弾性率（Ｅ）の減少を示す（図６を参照）。さらに、水素結合とジスルフィド架橋の破壊は、膜の構造を変化させたが、それらの分解はさせなかった。
【0099】
アルブミンのコンフォメーションの評価
【0100】
ＩＲ分析。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、タンパク質の二次構造を評価するために使用される確立された方法である。タンパク質の赤外スペクトルは、それぞれアミド領域およびＣＨ領域として知られる吸収スペクトルの一連の吸収領域によって特徴付けられる。二次構造に関する情報は、主にアミドＩ領域（１７００～１６００ｃｍ－１）およびアミドＩＩ領域（１６００～１５００ｃｍ－１）のスペクトルから取得できる。アミドＩ領域は、主にペプチドグループのＣ＝Ｏ伸縮振動を反映しており、タンパク質の二次構造に関する情報を提供する。さらに、この技術により、高濃度の溶液や固体材料に含まれるタンパク質の二次構造を調べることができ、水和物または乾燥物のいずれかを使用することができる。ＦＴＩＲを使用して、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜のアルブミンの構造を評価した。この実験では、Ｈ２Ｏバンドが同じ吸収範囲にあるアミドＩバンドに干渉するのを防ぐために、Ｄ２Ｏを使用して、すぐに利用できるＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜を水和し、２つの対照溶液を調製した：ＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の調製に使用したものに匹敵するＢＳＡとＮａＢｒとの溶液（ＢＳＡ濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ比＝１：６６４）。
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、タンパク質の二次構造を評価するために使用される確立された方法である。タンパク質の赤外スペクトルは、それぞれアミド領域およびＣＨ領域として知られる吸収スペクトルの一連の吸収領域によって特徴付けられる。二次構造に関する情報は、主にアミドＩ領域（１７００～１６００ｃｍ－１）およびアミドＩＩ領域（１６００～１５００ｃｍ－１）のスペクトルから取得できる。アミドＩ領域は、主にペプチドグループのＣ＝Ｏ伸縮振動を反映しており、タンパク質の二次構造に関する情報を提供する。さらに、この技術により、高濃度の溶液や固体材料に含まれるタンパク質の二次構造を調べることができ、水和物または乾燥物のいずれかを使用することができる。ＦＴＩＲを使用して、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜のアルブミンの構造を評価した。この実験では、Ｈ２Ｏバンドが同じ吸収範囲にあるアミドＩバンドに干渉するのを防ぐために、Ｄ２Ｏを使用して、すぐに利用できるＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜を水和し、２つの対照溶液を調製した：ＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の調製に使用したものに匹敵するＢＳＡとＮａＢｒとの溶液（ＢＳＡ濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ、ＢＳＡ／ＮａＢｒ比＝１：６６４）。
【0101】
アミドＩバンドの逆重畳積分したスペクトルの分析により、科学文献ですでに利用可能なデータを使用して識別された複数のサブバンドの存在が明らかになった。試験された試料のアミドＩバンドには、６つのサブバンドが見つかった：α－ヘリックス（１６５５ｃｍ－１）、β－シート（１６１２、１６２９、１６７８ｃｍ－１）、β－ターン（１６６９ｃｍ－１）、ランダムコイル（１６４３ｃｍ－１）サブバンド（図７を参照）。次に、これらの二次構造のパーセンテージを計算した（残留ＲＭＳエラー＜０．００５）。ＢＳＡおよびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４の溶液中に存在するアルブミンについて、非常に類似したパーセンテージのβシート、βターン、αヘリックス、およびランダムコイルが得られた。したがって、確立された実験条件では、ＮａＢｒはアルブミンの二次構造を変更しない。しかし、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜では、βシートおよびβターンで増加し、α－ヘリックスおよびランダムコイルで減少しているようである（表２）。タンパク質の展開は、組織化されていない二次構造であるランダムコイルの増加を特徴としている。膜の処方において、アルブミンは、これらのいくつかの組織化されていない構造では、β組織化された構造に有利のように思われる。
【0102】
以下の表２は、ＢＳＡ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、Ｄ２Ｏ中）、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４溶液（ＢＳＡ濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ、Ｄ２Ｏ）およびＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜（残留ＲＭＳエラー＜０．００５）に存在するアルブミンのアミドＩバンドで識別された各二次構造のパーセンテージの分析を示している。ＢＳＡ溶液（ＢＳＡ１００ｍｇ／ｍＬ ８０℃ Ｄ２Ｏ）を８０℃で一晩インキュベートし、変性タンパク質の基準として使用した。
【0103】
【表2】
【0104】
結晶学ＳＡＸＳ ＩＣＳ
小角および広角Ｘ線散乱測定（ＳＡＸＳ、ＷＡＸＳ）は、試料内の原子間距離を調査する。溶液中のタンパク質の場合、高分子の階層構造レベルが明らかになる。したがって、別個の散乱ベクトルドメインは、４次および３次構造（分子の形状とサイズ、ｑ＜≒０．２Å－１）、ドメイン間相関（≒０．２＜ｑ＜≒０．５Å－１）、ドメイン内組織（≒０．５＜ｑ＜≒０．８Å－１）および二次構造（≒１．１＜ｑ＜≒１．９Å－１））などの分子の特徴的な構成にリンクされる。ＷＡＸＳは構造の乱れや変動に非常に敏感であり、高分子組織の小さな変化を証明することができる。ただし、データの解釈は非常に複雑であり、結晶学的結果に基づく理論計算との比較が必要になることがよくある。分子間相関がない希薄な領域では、散乱測定は分子内の特性（フォームファクター）のみを反映する。濃度が増加するか、バルク膜の特性では、これはもはや当てはまらず、分子間相関が散乱強度に深く寄与する。
小角および広角Ｘ線散乱測定（ＳＡＸＳ、ＷＡＸＳ）は、試料内の原子間距離を調査する。溶液中のタンパク質の場合、高分子の階層構造レベルが明らかになる。したがって、別個の散乱ベクトルドメインは、４次および３次構造（分子の形状とサイズ、ｑ＜≒０．２Å－１）、ドメイン間相関（≒０．２＜ｑ＜≒０．５Å－１）、ドメイン内組織（≒０．５＜ｑ＜≒０．８Å－１）および二次構造（≒１．１＜ｑ＜≒１．９Å－１））などの分子の特徴的な構成にリンクされる。ＷＡＸＳは構造の乱れや変動に非常に敏感であり、高分子組織の小さな変化を証明することができる。ただし、データの解釈は非常に複雑であり、結晶学的結果に基づく理論計算との比較が必要になることがよくある。分子間相関がない希薄な領域では、散乱測定は分子内の特性（フォームファクター）のみを反映する。濃度が増加するか、バルク膜の特性では、これはもはや当てはまらず、分子間相関が散乱強度に深く寄与する。
【0105】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の構造組織を、ＳＡＸＳとＷＡＸＳによって調査した。洗浄および乾燥した膜を測定し（ｅ、図２．Ｓ８Ｂ）、天然ＢＳＡと比較した（ａ、図２．Ｓ８Ｂ）。異なる濃度で調製された２つのＢＳＡ溶液（ｂおよびｃ、図２．Ｓ８Ｂ）（溶液１２４．２重量％Ｈ２Ｏ、溶液２４０重量％Ｈ２Ｏ）も、散乱パターンの解釈の基準となると見なされた。実験強度を図２．Ｓ８Ａ（溶液２）に示し、ＣＲＹＳＯＬで計算され、モノマーＢＳＡ（ＰＤＢ原子座標３ｖ０３）の結晶学的記述に基づいて計算された理論曲線と比較した。０．１～１Å－１の間では、実験曲線と理論曲線の両方がよく対応している。小さな偏差は確かに溶液中のタンパク質内の動的変動と無秩序を反映している。０．１Å－１未満では、０．０８４Å－１付近にピークが観察された。これは、計算では考慮されていない静電反発力から生じるＢＳＡ間の空間相関に関連している。タンパク質濃度を上げると（溶液１）、分子の重心間の距離が短くなるため、このピークはより高いｑ値（０．０９Å－１）にシフトする。高いｑ値（＞１Å－１）では、１．５Å－１付近に大きな最大値が観察された。この領域では、モデルの精度は低くなるが、これはプログラムの許容可能なｑ範囲外である（約０．５Å－１）。したがって、ＣＲＹＳＯＬは、ソリューション内のＢＳＡのデータの主な特性を説明することができる。タンパク質は主に結晶秩序状態のα－ヘリックスを含んでいるため（計算で使用）、約０．２Å－１（ｄ＝２π／ｑ 約３０Å）で観察される予測されたショルダーはおそらくαドメイン間の相関に関連しているが、０．４～０．７Å－１の間の３つの寄与（９→１５Å）は、ドメインの内部構造、より具体的にはα－ヘリックスパッキングに関連している。理論的に正しく記述されていない１．５Å－１前後の広い最大値（約４Å）はすべてのタンパク質に見られ、内部組織の主な特徴（α－ヘリックスまたはβ－シート）に対する感度が低くなっている
。
。
【0106】
凍結乾燥粉末ＢＳＡの散乱パターンを図２．Ｓ８Ｂ（ａ）に示す。このアモルファス試料は、未溶媒のネイティブＢＳＡの基準として使用される。強度は、単純なＢＳＡ溶液と比較して大幅に変更されている。分子内および分子間相関が散乱強度に寄与するため、データの解釈はより複雑になる。障害、分子間相関、または特定の再配列は、溶液と固体状態の間の散乱曲線の潜在的な変化を説明し得る。タンパク質の形状とサイズを決定することはもはや不可能であり、内部構造または分子間相関に関連するより短い長さのスケールのみが測定可能である。最初に、非常に低いｑで大きな上昇が観察された。この動作は特定の組織とは関係がなく、単に試料の粉末の性質（ポロド散乱）の結果である。そのような寄与がない場合、強度は一定の低い値になる傾向がある（ｑ→０）。０．１→０．３Å－１の範囲で、０．１９Å－１（３３Å）付近に小さな最大値が観察された。このピークは、溶液中の「球状」ＢＳＡ分子で観察された相関ピークの高濃度限界に関連している可能性がある。しかし、接触しているタンパク質間の平均距離（３３Å）は回転半径に非常に近いため（Ｒｇ＝２８．７±１．５Å）、これはありそうにない。この最大値は、タンパク質ドメイン間の相関（分子内および分子間寄与を含む）に関連している可能性が高く、ＢＳＡ溶液で以前に観察された約０．２Å－１の肩に相当する（純粋な分子内寄与）。したがって、α－ドメインはまだ固体状態で存在している。他の変化は０．３～１Å－１の間で観察される。ＢＳＡ溶液の構造化された山塊は、０．６６Å－１に近い単一の寄与に減少した。この最大値は、９．５Åの特徴的なパッキング距離（この種の組織の古典的な値）を持つＢＳＡドメインのα－ヘリックスに関連付けられた単一の平均距離を示している。最後に、１．４２Å－１付近で依然として大きな寄与が観察された。ＢＳＡ溶液と比較して、最大値の幅が狭くなり、その位置が小さいｑ値にシフトした。この観察結果は、４．７Åのストランド間距離を特徴とする固体ＢＳＡのβシート含有量の増加に関連している可能性がある。したがって、粉末ＢＳＡの散乱パターンは、無秩序な固体状態での内部構造のわずかな変化を示している。
【0107】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の散乱曲線を図２．Ｓ８Ｂ（ｅ）に示す。０．０４Å－１未満で観察された上昇は、膜の多孔性（ポロド散乱）に関連している。ブラッグピークは現れておらず、膜に結晶性ＮａＢｒが存在しないことを示している（純粋なＮａＢｒ塩回折図を比較のために図２．Ｓ８Ｂ（ｄ）に示す）。純粋なアモルファスＢＳＡ粉末と比較して、小さいが重要な変更のみが観察された。ドメイン間相関に関連する第１のピークは、より低いｑ値（０．１９Å－１～０．１７Å－１）にシフトし、タンパク質ドメイン間の距離が大きい（３３．１Å～３７．９Å）ことを示している（内部および相互寄与）。この挙動は解釈が困難であるが、α－ドメインの縮小などの三次構造のわずかな変化に起因している。α－ヘリックスパッキングに関連する０．６５Å－１付近のピークはまだ存在しているが、純粋なＢＳＡよりも強度が低くなっている。これは、膜のらせん組織の変更と一致している。ＢＳＡ粉末と比較して、１．４Å－１付近の大きな最大値の形状も変化している。これは、１．３７Å－１（４．５８Å）でさらに鋭い寄与を示し、強い非対称プロファイルにつながっている。これは、分子内または分子間起源のβシート含有量の増加と互換性がある。結論として、ＢＳＡの二次構造は、α／β構造比をわずかに変更して調製された材料に保存される。これらの発見は、アミドＩバンド分析の中でＦＴＩＲによって得られた結果を裏付けている。
【0108】
ＳＥＭ表面分析
ＮａＢｒ（モル比ＮａＢｒ／ＢＳＡ＝６６４）で製造された膜の表面トポグラフィーを研究し、それらの多孔性を評価するために、膜を、ＳＥＭを使用して分析した。膜の表面は、多くの細孔および細孔様の下部構造を有し非常に粗く見える（Ａ、図９）。この同じ膜のスライス（断面）を観察すると、生体材料の内部に小さな細孔が存在することがわかる。しかし、表面の観察から想像するほど多くはないようにみられる（Ｂ、図９）。表面
の凹凸は、主に配合に使用される蒸発によるものである。
ＮａＢｒ（モル比ＮａＢｒ／ＢＳＡ＝６６４）で製造された膜の表面トポグラフィーを研究し、それらの多孔性を評価するために、膜を、ＳＥＭを使用して分析した。膜の表面は、多くの細孔および細孔様の下部構造を有し非常に粗く見える（Ａ、図９）。この同じ膜のスライス（断面）を観察すると、生体材料の内部に小さな細孔が存在することがわかる。しかし、表面の観察から想像するほど多くはないようにみられる（Ｂ、図９）。表面
の凹凸は、主に配合に使用される蒸発によるものである。
【0109】
その他のアルブミンタンパク質
開発された製剤手順では、再現性の高いＢＳＡを使用してアルブミンベースの膜が製造する。これらの膜の実現可能性を研究するために、他のアルブミンタンパク質を用いた製剤化が行われた。ウシ血清アルブミンと非常によく似た構造を持つヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）と、他の２つのタンパク質とは構造と分子量が異なるオボアルブミン（ＯＶＡ）の２つのアルブミンが選択された。ｈＳＡとＯＶＡの両方で興味深い膜が得られた。これらはＢＳＡ膜とは異なる形態を有している。さらに、それらは水和しやすく、より高い水分含有量と初期の腫れをもたらす。結論として、確立された製剤プロセスは、タンパク質の由来に関係なく、アルブミンベースの膜の調製することができる。ただし、このタンパク質のコストが低く、ヒトのものと非常に類似しているため、この研究ではＢＳＡベースの膜のみがさらに特徴づけられた。
開発された製剤手順では、再現性の高いＢＳＡを使用してアルブミンベースの膜が製造する。これらの膜の実現可能性を研究するために、他のアルブミンタンパク質を用いた製剤化が行われた。ウシ血清アルブミンと非常によく似た構造を持つヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）と、他の２つのタンパク質とは構造と分子量が異なるオボアルブミン（ＯＶＡ）の２つのアルブミンが選択された。ｈＳＡとＯＶＡの両方で興味深い膜が得られた。これらはＢＳＡ膜とは異なる形態を有している。さらに、それらは水和しやすく、より高い水分含有量と初期の腫れをもたらす。結論として、確立された製剤プロセスは、タンパク質の由来に関係なく、アルブミンベースの膜の調製することができる。ただし、このタンパク質のコストが低く、ヒトのものと非常に類似しているため、この研究ではＢＳＡベースの膜のみがさらに特徴づけられた。
【0110】
他の膜製剤は、γ－グロブリンなどの異なるタンパク質で試験した。主な制約は、タンパク質の水への溶解度である。実際、アルブミンは水への比類のない溶解度を持っており、非常に高濃度の溶液の調製を可能にする。タンパク質の溶解度のしきい値のためにタンパク質濃度を下げる必要がある場合は、膜の取り扱いに適合する最小の厚さに達するために必要な量を増やして、蒸発処理を大幅に延長する必要がある。γ－グロブリンの膜（２０℃≒２０ｍｇ／ｍＬでの水への溶解度）は、ウシγ－グロブリンとＮａＢｒの溶液を蒸発させることによってうまく処方された（モル比塩／タンパク質＝６６４、Ｍ／Ｓ＝３５ｍｇ／ｃｍ２）。したがって、この作業で開発された製剤手順は、タンパク質ベースの膜の製剤に有望であることを証明する。
【0111】
生物学的アッセイ
【0112】
細胞毒性と細胞接着
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の生物学的特性を研究した。比較基準を持つために、他の２つの興味深い膜、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００をこれらの実験に含めた。まず、膜浸出性成分の細胞毒性を、膜抽出物中でＢａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞をインキュベートすることによって評価した。この細胞株の場合、代謝活性を測定することで細胞生存率を推定できる。次に、各抽出物で培養された細胞の正規化された代謝活性を、未処理の細胞（陽性対照）の代謝活性と比較した。この実験では、抽出物を希釈して、用量依存的な効果を明らかにした。得られたデータの統計分析は、未処理のグループとＢＳＡ／ＮａＢｒ膜抽出物のさまざまな希釈で処理されたグループの代謝活性の間に有意差はないと結論付けた（図１０を参照）。さらに、前に示したように、アルブミンの非細胞毒性および最終膜におけるＮａＢｒの欠如は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の浸出性成分の観察された非細胞毒性と一致する。次に、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３細胞をこれらの膜と直接インキュベートすることにより、直接的な細胞毒性を評価した。この実験では、比較的薄い膜（平均厚さ約０．７ｍｍ）を使用して、顕微鏡による細胞と材料間の相互作用の追跡を可能にした（図１１を参照）。データの統計分析では、未処理の細胞と試験した膜で培養した細胞の代謝活性に有意差は見られなかった（図１０を参照）。さらに、顕微鏡検査により、線維芽細胞が膜の周囲および膜の上に広がっていることが明らかになった（図１２を参照）。膜への細胞の付着を定量化するために、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３細胞を膜とともに２４時間インキュベートした。次に、培地を除去し、膜を空のウェルに移し、各膜上の細胞の代謝活性を測定した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００グループの間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。播種された線維芽細胞の約４５％（４４．５５％±１０．６７％）がＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜に付着した。推定パーセンテージは、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００膜（２７．３６％±１１．２２％）で低く、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００膜（７７．６２％±２０．２６％）で高
かった（図１３を参照）。したがって、最初の製剤溶液は、洗浄プロセス中に塩が完全に除去されるにもかかわらず、細胞と膜との相互作用に大きな影響を与えるようである。結論として、製剤化されたアルブミンベースの生体材料は細胞毒性がなく、細胞接着とコロニー形成に有利である。
ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜の生物学的特性を研究した。比較基準を持つために、他の２つの興味深い膜、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００をこれらの実験に含めた。まず、膜浸出性成分の細胞毒性を、膜抽出物中でＢａｌｂｃ ３Ｔ３マウス線維芽細胞をインキュベートすることによって評価した。この細胞株の場合、代謝活性を測定することで細胞生存率を推定できる。次に、各抽出物で培養された細胞の正規化された代謝活性を、未処理の細胞（陽性対照）の代謝活性と比較した。この実験では、抽出物を希釈して、用量依存的な効果を明らかにした。得られたデータの統計分析は、未処理のグループとＢＳＡ／ＮａＢｒ膜抽出物のさまざまな希釈で処理されたグループの代謝活性の間に有意差はないと結論付けた（図１０を参照）。さらに、前に示したように、アルブミンの非細胞毒性および最終膜におけるＮａＢｒの欠如は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の浸出性成分の観察された非細胞毒性と一致する。次に、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３細胞をこれらの膜と直接インキュベートすることにより、直接的な細胞毒性を評価した。この実験では、比較的薄い膜（平均厚さ約０．７ｍｍ）を使用して、顕微鏡による細胞と材料間の相互作用の追跡を可能にした（図１１を参照）。データの統計分析では、未処理の細胞と試験した膜で培養した細胞の代謝活性に有意差は見られなかった（図１０を参照）。さらに、顕微鏡検査により、線維芽細胞が膜の周囲および膜の上に広がっていることが明らかになった（図１２を参照）。膜への細胞の付着を定量化するために、Ｂａｌｂｃ ３Ｔ３細胞を膜とともに２４時間インキュベートした。次に、培地を除去し、膜を空のウェルに移し、各膜上の細胞の代謝活性を測定した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００、およびＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００グループの間に有意差が観察された（ｐ＜０．０５）。播種された線維芽細胞の約４５％（４４．５５％±１０．６７％）がＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜に付着した。推定パーセンテージは、ＢＳＡ／ＮａＢｒ４００膜（２７．３６％±１１．２２％）で低く、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００膜（７７．６２％±２０．２６％）で高
かった（図１３を参照）。したがって、最初の製剤溶液は、洗浄プロセス中に塩が完全に除去されるにもかかわらず、細胞と膜との相互作用に大きな影響を与えるようである。結論として、製剤化されたアルブミンベースの生体材料は細胞毒性がなく、細胞接着とコロニー形成に有利である。
【0113】
マクロファージの活性化
マクロファージの活性化に対するアルブミン膜の効果を、亜硝酸塩とＴＮＦ－αの濃度を測定することによって評価した。ＮＯおよびＴＮＦ－αは、炎症反応を開始および維持するために活性化されたマクロファージによって産生される。生マクロファージを、試験した膜で２４時間培養した。その後、ＬＰＳをＬＰＳ活性化グループのウェルに直接導入してマクロファージを活性化し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。未処理グループ（ＮＴ）と比較して、亜硝酸塩の生成は、試験された膜の存在下でわずかに増加する（ｐ＜０．０５）。ＬＰＳの活性化は、培地中の亜硝酸塩濃度の大幅な増加を引き起こす。ただし、ＬＰＳ処理対照（ＴＬＰＳ）と比較して、マクロファージをアルブミン膜で培養した場合、亜硝酸塩の生成は大幅に低下するようである（ｐ＜０．０５）。ＴＮＦ－αの産生は、不活化グループと同様の傾向をたどった。ただし、ＢＳＡ／ＮａＢｒグループとＴ ＬＰＳグループのＴＮＦ－α産生に有意差はなく、ＴＮＦ－α産生の有意な低下を示したＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００グループとは異なる（ｐ＜０．０５）。したがって、試験したアルブミンベースの膜は、マクロファージを活性化することによって炎症反応を効率的に誘発することはない。
マクロファージの活性化に対するアルブミン膜の効果を、亜硝酸塩とＴＮＦ－αの濃度を測定することによって評価した。ＮＯおよびＴＮＦ－αは、炎症反応を開始および維持するために活性化されたマクロファージによって産生される。生マクロファージを、試験した膜で２４時間培養した。その後、ＬＰＳをＬＰＳ活性化グループのウェルに直接導入してマクロファージを活性化し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。未処理グループ（ＮＴ）と比較して、亜硝酸塩の生成は、試験された膜の存在下でわずかに増加する（ｐ＜０．０５）。ＬＰＳの活性化は、培地中の亜硝酸塩濃度の大幅な増加を引き起こす。ただし、ＬＰＳ処理対照（ＴＬＰＳ）と比較して、マクロファージをアルブミン膜で培養した場合、亜硝酸塩の生成は大幅に低下するようである（ｐ＜０．０５）。ＴＮＦ－αの産生は、不活化グループと同様の傾向をたどった。ただし、ＢＳＡ／ＮａＢｒグループとＴ ＬＰＳグループのＴＮＦ－α産生に有意差はなく、ＴＮＦ－α産生の有意な低下を示したＢＳＡ／ＣａＣｌ２７００グループとは異なる（ｐ＜０．０５）。したがって、試験したアルブミンベースの膜は、マクロファージを活性化することによって炎症反応を効率的に誘発することはない。
【0114】
結論
これらの試験では、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、酢酸カリウム、ギ酸アンモニウムの塩を使用して、いくつかの興味深い生体材料モデルが開発された。これらの膜の特性は、配合パラメータを変更することによって調整することができる。重要な２つのパラメータを特定した：塩の存在と塩／アルブミンのモル比。また、三成分系の塩１／塩２／アルブミンまたは塩／アルブミン／ポリマーを有する膜を得ることが可能であり、これらを調製することができた。これらのシステムは、膜の特性（機械的および固有の特性）を調整し、新しい特性を備えた機能化された生体材料を取得することを可能にする。塩の存在下での蒸発によって調製されたアルブミンベースの生体材料は、目標とする治療用途の要件に適応するようにその特性を調節することができる、用途の広いモデルを形成する。
これらの試験では、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、酢酸カリウム、ギ酸アンモニウムの塩を使用して、いくつかの興味深い生体材料モデルが開発された。これらの膜の特性は、配合パラメータを変更することによって調整することができる。重要な２つのパラメータを特定した：塩の存在と塩／アルブミンのモル比。また、三成分系の塩１／塩２／アルブミンまたは塩／アルブミン／ポリマーを有する膜を得ることが可能であり、これらを調製することができた。これらのシステムは、膜の特性（機械的および固有の特性）を調整し、新しい特性を備えた機能化された生体材料を取得することを可能にする。塩の存在下での蒸発によって調製されたアルブミンベースの生体材料は、目標とする治療用途の要件に適応するようにその特性を調節することができる、用途の広いモデルを形成する。
【0115】
実施例２：技術の多様性の物理化学的調査と評価、活性物質の充填、および生体適合性と生体内での生分解性の予備評価
【0116】
２．１技術の多様性の物理化学的調査と評価
以下の実験では、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中で調製したＢＳＡ（初期濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ）およびＮａＢｒ（初期濃度＝６２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、乾燥した材料が形成されるまで３７°Ｃで蒸発させることによって、ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料を調製した。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２材料については、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中で調製したＢＳＡ（初期濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ）およびＣａＣｌ２（初期濃度＝１５５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、乾燥した材料が形成されるまで３７℃で蒸発させることによって調製した。
以下の実験では、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中で調製したＢＳＡ（初期濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ）およびＮａＢｒ（初期濃度＝６２ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、乾燥した材料が形成されるまで３７°Ｃで蒸発させることによって、ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料を調製した。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２材料については、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中で調製したＢＳＡ（初期濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ）およびＣａＣｌ２（初期濃度＝１５５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、乾燥した材料が形成されるまで３７℃で蒸発させることによって調製した。
【0117】
有機溶媒中での安定性。活性物質の大部分が親油性分子である有機溶媒は、生体材料への可溶化と充填に非常に役立つ。さらに、容易に形成される材料への薬物の充填（後充填）には、薬物を可溶化するために使用される溶媒中での材料の安定性が必要である。有機溶媒中のＡｌｂｕｐａｄ材料（すなわち、本発明による生体材料）の安定性を、エタノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、およびジクロロメタンの溶媒で評価した。ＢＳＡ／Ｎａ
ＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜を、室温で７２時間各溶媒に入れた。それらの安定性は、それらの質量損失を比較することによって評価した。７２時間のインキュベート後、試験したすべての溶媒中で膜は質量損失を示さなかった。さらに、それらの物理的側面は、目に見える劣化の兆候を示さず、それらの水和特性も維持された。したがって、Ａｌｂｕｐａｄ材料は、エタノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、およびジクロロメタン中で安定している。
ＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜を、室温で７２時間各溶媒に入れた。それらの安定性は、それらの質量損失を比較することによって評価した。７２時間のインキュベート後、試験したすべての溶媒中で膜は質量損失を示さなかった。さらに、それらの物理的側面は、目に見える劣化の兆候を示さず、それらの水和特性も維持された。したがって、Ａｌｂｕｐａｄ材料は、エタノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、およびジクロロメタン中で安定している。
【0118】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜のレオロジー評価。この研究では、粘弾性挙動を研究するために、水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜（ｎ＝４）で振幅掃引試験を実施した。Ｇ´は弾性または回復可能な成分を表し、Ｇ´´は粘性成分である。各試験中、周波数は０．５Ｈｚに設定し、ひずみを０．０１から１００％に増加させた。試験した試料のいずれにも目立った損傷はなく、１０％のひずみを超えると強い滑り効果が観察され、データが使用できなくなった（省略）。１％ひずみ下の線形粘弾性領域（ＬＶＥ）では、Ｇ´（５９．６±５．１ｋＰａ）はＧ´´（７．７±０．８ｋＰａ）よりも高くなる（図１５Ａ）。したがって、この範囲では、材料は固体弾性材料として挙動する。１％のひずみの後、Ｇ´´が増加し、１．７９±０．０７％のひずみで最大に達するとペイン効果が識別される（図１５Ｂ）。この効果は、２つの相で構成される材料の特徴であり、より硬い粒子が浮遊しているマトリックスで、特定の変形でより大きなエネルギー散逸を引き起こす。この効果は、主にカーボンブラック粒子が充填されたゴムエラストマーで説明されており、材料の微細構造の変形によって引き起こされる変化に起因する。したがって、ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料は、より硬い粒子を含むマトリックスで構成される。しかしながら、洗浄プロセス中に塩が除去されたと判断された。したがって、粒子は、より柔らかいアルブミンマトリックスに囲まれたアルブミン凝集体／粒子である可能性がある。この結果は、ＢＳＡ／ＮａＢｒ材料のセクションのＭＥＢ分析によって確認され、これらの材料を形成する粒子構造が明らかになった（図１６）。材料が複数の連続した振幅スイープ試験にかけられると（図１５Ｃ）、Ｇ´は初期値を回復し、実験中に材料の凝集力が変化しなかったことを証明する。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜などの他のいくつかの配合物でも同様の観察が行われ、これらのレオロジー所見がＡｌｂｕｐａｄ材料に特有の特性であることを示している。
【0119】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の接触角。接触角の測定を、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の乾燥試料の表面にｍｉｌｌｉＱ水（５μＬ）のマイクロドロップを堆積させることによって実行した（堆積速度＝２μｌ／秒）。画像を１００秒間記録した（１．４ ＦＰＳ）。これらの試験中に、９０°～１００°で変化する接触角が測定された。膜の水和および材料への液滴の沈下の速度論は遅く（＞３０分）、したがってこれらの測定中に観察することができなかった。したがって、乾燥したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の表面は、水和速度が遅く、表面粗さが高いため、適度に親水性である（以前の試験のＳＥＭ分析によって観察された）。
【0120】
ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の加速劣化。乾燥したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を８０℃のオーブンに３日間入れた。次に、熱処理された膜のアミドＩスペクトルを、ＦＴ－ＩＲを使用して分析し、対照膜と比較した。熱処理された膜のアミドＩバンドは、未処理のコントロールのものと同様であった（図１７）。したがって、膜内のアルブミンの二次構造は、試験条件での加熱によって変化しなかった。
【0121】
制御された真空下での製造。真空下での蒸発によるＡｌｂｕｐａｄ材料の製造は、蒸発に必要な時間を短縮するための有用なツールを提供することができる。したがって、制御された圧力下での配合の実現可能性を、真空オーブンを使用して実行した。ＢＳＡ／ＮａＢｒの溶液（ＢＳＡの初期濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ、ＮａＢｒの初期濃度＝１Ｍ）を真空オーブン内で３７℃で２４時間蒸発させ、次の圧力値を試験した：８００、６００、および２００ｍｂａｒ。次に、それらの安定性を評価するために、乾燥した材料を洗浄し、水に４８時間浸した。さらに、物理的外観、相対収量、吸水率、および初期膨張値を使用し
て、制御された真空下で形成された材料を特徴付け、大気圧下で調製された制御バッチと比較した。試験したすべての圧力値で制御された真空下でＢＳＡ／ＮａＢｒ溶液を蒸発させた後、取り扱い可能で水に不溶性の材料が得られた。形成された膜は、対照バッチと同様の物理的側面および取り扱い性を有していた。ただし、膜形成中の溶液からの可溶性ガスの除去により、膜構造に気泡が閉じ込められ、２００および６００ｍｂａｒで大きな細孔が形成される（図１８Ａ）。したがって、例えば蒸発の前に溶液を脱気する工程を追加することによって、これらの細孔の形成を制御または防止するために、配合の最適化が必要である。さらに、真空下での製剤の相対収率（６０％～７０％）は、対照バッチ（＞９０％）よりも比較的低くなっている（図１８Ｂ）。次に、６００ｍｂａｒで調製された膜の機械的およびレオロジー特性を評価した。圧縮アッセイを、平行平板測定システムのレオメーターを使用して、水和したＢＳＡ／ＮａＢｒ６００ｍｂａｒの水和（水中）膜で実行した。膜の弾性率は０．７６ＭＰａであり、対照バッチの弾性率および以前にＢＳＡ／ＮａＢｒ材料で測定された弾性率と同様であった。水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜（ｎ＝４）で振幅掃引試験を実施し、それらのレオロジー特性を研究した。各試験中、周波数は０．５Ｈｚに設定し、ひずみを０．０１から１００％に増加させた。これらの実験により、６００ｍｂａｒの制御された真空下で配合されたＢＳＡ／ＮａＢｒ膜は、大気圧下で配合されたＢＳＡ／ＮａＢｒ膜と同様のレオロジー特性を持っていることが明らかになった。したがって、制御された真空下で調製することは、特性を変えることなくアルブパッド材料の形成することを可能にする。
て、制御された真空下で形成された材料を特徴付け、大気圧下で調製された制御バッチと比較した。試験したすべての圧力値で制御された真空下でＢＳＡ／ＮａＢｒ溶液を蒸発させた後、取り扱い可能で水に不溶性の材料が得られた。形成された膜は、対照バッチと同様の物理的側面および取り扱い性を有していた。ただし、膜形成中の溶液からの可溶性ガスの除去により、膜構造に気泡が閉じ込められ、２００および６００ｍｂａｒで大きな細孔が形成される（図１８Ａ）。したがって、例えば蒸発の前に溶液を脱気する工程を追加することによって、これらの細孔の形成を制御または防止するために、配合の最適化が必要である。さらに、真空下での製剤の相対収率（６０％～７０％）は、対照バッチ（＞９０％）よりも比較的低くなっている（図１８Ｂ）。次に、６００ｍｂａｒで調製された膜の機械的およびレオロジー特性を評価した。圧縮アッセイを、平行平板測定システムのレオメーターを使用して、水和したＢＳＡ／ＮａＢｒ６００ｍｂａｒの水和（水中）膜で実行した。膜の弾性率は０．７６ＭＰａであり、対照バッチの弾性率および以前にＢＳＡ／ＮａＢｒ材料で測定された弾性率と同様であった。水和（水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜（ｎ＝４）で振幅掃引試験を実施し、それらのレオロジー特性を研究した。各試験中、周波数は０．５Ｈｚに設定し、ひずみを０．０１から１００％に増加させた。これらの実験により、６００ｍｂａｒの制御された真空下で配合されたＢＳＡ／ＮａＢｒ膜は、大気圧下で配合されたＢＳＡ／ＮａＢｒ膜と同様のレオロジー特性を持っていることが明らかになった。したがって、制御された真空下で調製することは、特性を変えることなくアルブパッド材料の形成することを可能にする。
【0122】
溶剤調査。エタノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリルなどの有機溶媒を使用すると、水溶性の低い活性物質をアルブミンと塩の溶液に組み込むための興味深いツールが提供され、よってこれらの分子をＡｌｂｕｐａｄ材料に事前充填する方法を提供する。有機溶媒は、蒸発工程（エタノールなどの揮発性溶媒の場合）または洗浄工程（ＤＭＳＯなどの水混和性溶媒の場合）で容易に除去される。したがって、混合有機溶媒／アルブミン溶液におけるＡｌｂｕｐａｄ材料の配合の実現可能性の研究が試験された。この調査では、エタノール、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ジクロロメタンの４つの溶媒を選択した。溶媒は、２．５、５、１０、１５、２０、２５、および３０％ｖ／ｖの溶媒／溶液の体積比に従って、ＢＳＡ／ＮａＢｒ溶液に直接添加した。次に、溶媒／溶液混合物を３７℃で７日間蒸発させた。続いて、乾燥材料を蒸留水で４８時間洗浄した。配合された材料の相対収率、吸水率、および初期膨張を、有機溶媒なしで配合された対照バッチと比較した（体積比＝０％）。試験したすべての比率で、４つの溶媒の存在下で安定した水不溶性の膜が形成された。これらの材料は取り扱い可能であり、対照バッチと同様の物理的側面を共有していた。エタノールの存在下で配合された材料の場合、２．５％～１５％の範囲の体積比で調製された膜は、対照バッチの値と比較して、同様の相対収率（８５～８８％）、吸水率（２３８～２５０％）、および初期膨張（１３７～１４５％）を有した（図１９）。２０％～３０％の範囲の体積比で調製された膜は、対照バッチと比較した場合、相対収率（８０～８２％）の低下、ならびに吸水率（３０４～３４６％）および初期膨張（１４７～１５４％）の増加を示した（図１９）。ＤＭＳＯの存在は、製剤の相対的収率または材料の初期膨張値に影響を与えなかった。２．５％～１０％の範囲の体積比で調製された膜の吸水値は、対照バッチと同等であったが、１５％～３０％の範囲の体積比で調製された膜の吸水値はより高かった（１９４～３４５％）（図１９）。試験された非水混和性溶媒（アセトニトリル、ジクロロメタン）に関しては、調製されたすべての膜は、同様の相対収率、吸水率、および初期膨張値を共有していた（図１９）。結論として、最大３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の存在は、膜の形成を妨げず、取り扱い可能な材料の調製を可能にする。最大１５％のエタノール、１０％のＤＭＳＯ、および３０％のアセトニトリルまたはジクロロメタンの対照バッチと比較して、これらの材料の特性の変化は観察されなかった。同様の結果が、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜、ならびにＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２スポンジの場合にも得られた。
【0123】
塩の組み合わせ。塩は、Ａｌｂｕｐａｄテクノロジーを使用してアルブミン材料を配合するための重要なパラメータであり、塩の種類とその濃度は、材料の特性を調整するための適切なツールである。さらに、塩の組み合わせは、材料特性のより良い調整のための追加のツールを提供し、Ａｌｂｕｐａｄ材料プラットフォームが潜在的なアプリケーションの要件に応じてより柔軟に適応できるようにする。したがって、Ａｌｂｕｐａｄ技術の適用性を、塩の組み合わせを使用したアルブミン材料の配合のために調査した。これらの実験では、２つの異なる塩のさまざまな組み合わせを試験した：一次塩（Ｓ１）および二次塩（Ｓ２）。Ｓ１の塩／アルブミンのモル比を設定し、Ｓ２の塩／アルブミンのモル比を１００～１０００まで変化させた。次の塩の組み合わせを試験した：ＮａＢｒ４００／ＣａＣｌ２、ＣａＣｌ２４００／ＮａＢｒ、ＮａＢｒ４００／ＭｇＣｌ２、ＮａＢｒ５０／ＮａＣｌ、ＮａＢｒ４００／ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２４００／ＭｇＣｌ２およびＮａＣｌ４００／ＫＣｌ。取り扱い可能な膜を、ＮａＢｒ４００／ＣａＣｌ２、ＣａＣｌ２４００／ＮａＢｒ、ＮａＢｒ４００／ＭｇＣｌ２、ＮａＢｒ４００／ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２４００／ＭｇＣｌ２の組み合わせで取得し、すべてをＳ２モル比で試験した。試験された塩の中で、塩ＮａＢｒ、ＣａＣｌ２、およびＭｇＣｌ２ｇが、取り扱い可能で安定したアルブミン材料の形成を可能にする。実際のところ、塩の組み合わせが、膜形成を可能にする少なくとも１つの塩を含み、この塩の塩／アルブミンのモル比が十分である（＞１００）場合、アルブミン膜が得られた。材料の特性に対する二次塩の影響を評価するために、相対収率、吸水率、および初期膨張を使用して、形成された材料を特徴付けした。図２０は、ＣａＣｌ２４００／ＮａＢｒの組み合わせで配合された膜を表している。１００～１０００の範囲のＮａＢｒモル比を試験し、塩／アルブミンのモル比が４００のＣａＣｌ２およびＢＳＡのみで調製し対照を調製した。配合物へのＮａＢｒの添加は、配合物の相対的収率を変化させなかった。しかし、それは吸水率の顕著な増加を生み出した。膜特性の変化は、他の組み合わせでも認められた。さらに、３つの塩の組み合わせによる製剤の実現可能性も試験した。これらの実験は、安定で扱いやすい膜がＮａＢｒ／ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２の組み合わせで製造できることを示した（試験されたモル比：１００／１００／１００、２００／２００／２００、３００／３００／３００）。結論として、複数の塩を使用しても膜の形成が妨げられることはなく、Ａｌｂｕｐａｄの材料特性を微調整するための適切なツールを提供する。
【0124】
タンパク質調査。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の４つのバッチを試験した：ＨＳＡＦＡＦ（脂肪酸フリー）、ＨＳＡＬＦＰ（低葉酸粉末）、ＨＳＡＲＧＰ（試薬グレード粉末）およびｒＨＳＡ（米からの組換えＨＳＡ）。さらに、２つの球状タンパク質、γ－グロブリン（ヒト由来）とヘモグロビン（ヒト由来）を試験した。タンパク質の溶解度はＡｌｂｕｐａｄテクノロジーの適用性の主要な基準であり、これらの球状タンパク質は、水溶性が適切であるため選択された。各タンパク質を、ＮａＢｒ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２の塩で試験した（塩／タンパク質のモル比：０～２０００）。タンパク質と塩の溶液を３７℃のオーブンで７日間蒸発させた。次に、乾燥した材料を洗浄し、水に４８時間浸して塩を除去し、水不溶性材料を選択した。水不溶性膜は、ＮａＢｒおよびＣａＣｌ２を含むすべてのヒトアルブミンタンパク質で得られた。これらの膜は安定していて扱いやすいものであった。γ－グロブリンベースの膜は、ＮａＢｒで適切に形成された。したがって、Ａｌｂｕｐａｄテクノロジーを使用して、ヒト血清アルブミン、組換えヒトアルブミン、およびヒトγ－グロブリンを使用して、安定した取り扱い可能な材料を製造することができる。
【0125】
２．２活性物質の装填
様々な物質を充填するアルブミンの生来の能力のために、アルブミンベースの材料は、薬物送達および徐放のために有望である。さらに、Ａｌｂｕｐａｄテクノロジーにより、初期溶液での材料の形成前（プレロード）に活性物質を装填すること、および形成後（ポストロード）に活性物質を材料に装填することができる。予備調査により、Ａｌｂｕｐａ
ｄ材料には、ピロキシカムやフルチカゾンなどの親油性物質、および水溶性分子であるクロルヘキシジンを事前に装填できることが明らかになった。この調査では、安定した取り扱い可能な材料が形成され、この装填戦略のＡｌｂｕｐａｄテクノロジーへの適用性を検証するに至った。さらに、概念実証を確立し、この物質の経時的な放出を研究するために、抗腫瘍薬であるドキソルビシン（ＤＯＸ）、および糖尿病の治療に使用されるペプチドであるインスリン（ＩＮＳ）もＡｌｂｕｐａｄ材料に装填した。これらの物質の装填を、蛍光イメージングによって評価した。水中での薬物放出の定量化を、経時的な蛍光滴定によって実行した。
様々な物質を充填するアルブミンの生来の能力のために、アルブミンベースの材料は、薬物送達および徐放のために有望である。さらに、Ａｌｂｕｐａｄテクノロジーにより、初期溶液での材料の形成前（プレロード）に活性物質を装填すること、および形成後（ポストロード）に活性物質を材料に装填することができる。予備調査により、Ａｌｂｕｐａ
ｄ材料には、ピロキシカムやフルチカゾンなどの親油性物質、および水溶性分子であるクロルヘキシジンを事前に装填できることが明らかになった。この調査では、安定した取り扱い可能な材料が形成され、この装填戦略のＡｌｂｕｐａｄテクノロジーへの適用性を検証するに至った。さらに、概念実証を確立し、この物質の経時的な放出を研究するために、抗腫瘍薬であるドキソルビシン（ＤＯＸ）、および糖尿病の治療に使用されるペプチドであるインスリン（ＩＮＳ）もＡｌｂｕｐａｄ材料に装填した。これらの物質の装填を、蛍光イメージングによって評価した。水中での薬物放出の定量化を、経時的な蛍光滴定によって実行した。
【0126】
Ａｌｂｕｐａｄ膜に事前装填されたＤＯＸの装填とリリース。ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜には、図２１に示すように、蒸発前にＤＯＸを溶液に直接組み込むことにより、ＤＯＸを事前に装填した。異なる量のＤＯＸが次のように溶液に組み込まれた：膜あたり０．２５、０．５、０．７５および１ｍｇのＤＯＸ（膜の質量≒約４００ｍｇ）。溶液を蒸発させた後、取り扱い可能な膜を得た。調製された膜は、ＤＯＸの存在により着色されたように見えた。さらに、膜の着色の強度は、充填されたＤＯＸの充填量に比例した。膜内のＤＯＸの存在を視覚化するために、ＣＬＳＭイメージングを実行した（図２２）。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜では、ＤＯＸの蛍光が膜のマトリックス内に均一に分布しており（厚さ＝５００μｍの厚さ）、活性物質が材料に正常に充填されたことを示している（図２２）。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜に関しては、材料の不透明性により、材料マトリックス内に充填されたＤＯＸの観察が妨げられた。しかし、ＤＯＸ蛍光がそれらの表面で観察され、これらの膜へのＤＯＸのローディングも成功したことが明らかになった（図２２）。
【0127】
次に、塩を除去するために膜を水で洗浄した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を水（３×２０ｍＬ）で２時間洗浄した。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜を水（４×２０ｍＬ）で２時間洗浄した。すすぎ溶液を収集し、除去されたＤＯＸの量を４８５ｎｍでの蛍光分光法によって測定した（図２３）。除去されたＤＯＸは、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜では２０％～３０％、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜では３５％～５０％であった。したがって、最初に充填されたＤＯＸの５０％～７０％は、洗浄後も膜に存在した。
【0128】
膜からのＤＯＸ放出を、３７℃の水中で３５日間撹拌しながら調べた。３５日間にわたる上澄みのＤＯＸ滴定により、Ａｌｂｕｐａｄ材料からのこの活性物質の放出プロファイルが遅く、バースト効果が制限されて制御されていることが明らかになった（図２４）。さらに、存在するＤＯＸの１０～５０％は、製剤に応じて３５日後に未放出のままであり、薬物送達のための材料の可能性を示している。
【0129】
Ａｌｂｕｐａｄ膜に事前装填されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの充填と放出。
ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜には、蒸発前にＩＮＳ－ＦＩＴＣを溶液に直接組み込むことにより、ＩＮＳ－ＦＩＴＣを事前に充填した。溶液に組み込まれたＩＮＳ－ＦＩＴＣの量は、膜あたり０．２５ｍｇであった（膜の質量は約４００ｍｇ）。溶液を蒸発させた後、取り扱い可能な膜を得た。膜内のＩＮＳ－ＦＩＴＣの存在を視覚化するために、ＣＬＳＭイメージングを実行した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜では、ＩＮＳ－ＦＩＴＣの蛍光が膜のマトリックス内に均一に分布しており（厚さ＝５００μｍの厚さ）、有効成分が材料に正常に充填されたことを示している（図２５）。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜に関しては、材料の不透明性により、材料マトリックス内に充填されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの観察が妨げられた。しかし、蛍光がそれらの表面で観察され、これらの膜へのＤＯＸの充填も成功したことが明らかになった（図２５）。
ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜には、蒸発前にＩＮＳ－ＦＩＴＣを溶液に直接組み込むことにより、ＩＮＳ－ＦＩＴＣを事前に充填した。溶液に組み込まれたＩＮＳ－ＦＩＴＣの量は、膜あたり０．２５ｍｇであった（膜の質量は約４００ｍｇ）。溶液を蒸発させた後、取り扱い可能な膜を得た。膜内のＩＮＳ－ＦＩＴＣの存在を視覚化するために、ＣＬＳＭイメージングを実行した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜では、ＩＮＳ－ＦＩＴＣの蛍光が膜のマトリックス内に均一に分布しており（厚さ＝５００μｍの厚さ）、有効成分が材料に正常に充填されたことを示している（図２５）。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜に関しては、材料の不透明性により、材料マトリックス内に充填されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの観察が妨げられた。しかし、蛍光がそれらの表面で観察され、これらの膜へのＤＯＸの充填も成功したことが明らかになった（図２５）。
【0130】
次に、塩を除去するために膜を水で洗浄した。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を水（３ｘ２０ｍＬ）で２時間洗浄した。ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜を水（４ｘ２０ｍＬ）で２時間洗浄した。す
すぎ溶液を収集し、除去されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの量を４９５ｎｍでの蛍光分光法によって測定した（図２．７ＡおよびＢ）。ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜の場合、それぞれ充填されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの８％および１％が洗浄プロセス中に除去された。したがって、洗浄プロセス後、ＩＮＳ－ＦＩＴＣの９０％超が膜に存在した。続いて、膜からのＩＮＳ－ＦＩＴＣの放出を、３７℃の水中で３０日間撹拌しながら調べた。ＤＯＸで得られた結果によると、３０日間にわたる上清のＩＮＳ－ＦＩＴＣ滴定により、Ａｌｂｕｐａｄ材料からのこの活性物質の放出プロファイルが遅く、バースト効果が制限されて制御されていることが明らかになった（図２６Ｃ）。さらに、利用可能なＩＮＳ－ＦＩＴＣの６０～８０％は、製剤に応じて３０日後に未放出のままであり、この活性物質の徐放のための可能性を示している。
すぎ溶液を収集し、除去されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの量を４９５ｎｍでの蛍光分光法によって測定した（図２．７ＡおよびＢ）。ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜の場合、それぞれ充填されたＩＮＳ－ＦＩＴＣの８％および１％が洗浄プロセス中に除去された。したがって、洗浄プロセス後、ＩＮＳ－ＦＩＴＣの９０％超が膜に存在した。続いて、膜からのＩＮＳ－ＦＩＴＣの放出を、３７℃の水中で３０日間撹拌しながら調べた。ＤＯＸで得られた結果によると、３０日間にわたる上清のＩＮＳ－ＦＩＴＣ滴定により、Ａｌｂｕｐａｄ材料からのこの活性物質の放出プロファイルが遅く、バースト効果が制限されて制御されていることが明らかになった（図２６Ｃ）。さらに、利用可能なＩＮＳ－ＦＩＴＣの６０～８０％は、製剤に応じて３０日後に未放出のままであり、この活性物質の徐放のための可能性を示している。
【0131】
結論として、実行されたすべての実験を考慮すると、プレロード法を使用して材料を充填することの実現可能性が証明された。さらに、ゲンタマイシンなどの他の活性物質も、３０％（ｗｔ／ｗｔ）の高い充填率でＡｌｂｕｐａｄ膜に正常に充填された。さらに、最大充填率は、活性物質の溶解度およびそのアルブミンとの相互作用に依存する。したがって、さらなる調査により、標的となる活性物質の充填の研究と最適化が可能になるはずである。さらに、放出培地中のプロテアーゼの存在は、膜からの物質放出の増加を可能にするはずである。
【0132】
２．３生体適合性とインビボでの生分解性の予備評価
【0133】
電子ビーム照射を使用したＡｌｂｕｐａｄ材料の滅菌の最適化。アルブパッド材料のインビボ移植の前に、材料との適合性を検証するために電子ビーム照射を使用する滅菌を試験しており、したがって、その特性またはそれを構成するアルブミンの構造の劣化または有意な変化を引き起こさない。そのため、ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＢＳＡ／ＣａＣｌ２の２種類の膜を用意した。以下の条件における照射下での安定性を試験するために、これらの試料の照射をグループに分けた：放射線防護剤（ビタミンＣ）の存在下または非存在下、および乾燥または水和（水中）膜の形態。５、１０、２５、２５ｋＧｙの４つの照射線量を試験した。照射された膜の物理的側面、質量損失および水分摂取を、照射されていない対照バッチと比較した。さらに、アルブミンの二次構造の変化を検出するために、照射された膜のＩＲスペクトルを対照のＩＲスペクトルと比較した。これらの実験は、材料の照射がすべての試験された照射線量でそれらの分解を引き起こさなかったこと、および放射線防護剤としてのビタミンＣの使用が必要でないことを明らかにした。照射された試料と対照バッチとの比較は、それらの照射後の材料の特性の有意な変化を示さなかった。さらに、ＦＴ－ＩＲ分析では、材料の照射がアミドＩバンドの中で変化せず、したがって、乾燥試料および水和試料でアルブミンの二次構造に損傷を与えないことが示された。結論として、電子ビーム照射による滅菌はＡｌｂｕｐａｄ材料と互換性があり、インビボ評価の前にこれらの材料を滅菌するために２５ｋＧｙで効率的に使用することができる。
【0134】
マウスへの移植製剤、滅菌および皮下移植。インビボでのアルブパッド材料の生体分解性および生体適合性の予備調査を実施するために、以下のバッチの円筒形移植片を調製した：ＢＳＡ／ＮａＢｒ（ＢＳＡの初期濃度＝３００ｍｇ／ｍＬ、ＮａＢｒの初期濃度＝１．８Ｍ、ｎ＝５）、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２（ＢＳＡの初期濃度＝２００ｍｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ２の初期濃度＝２．１Ｍ、ｎ＝１０）、ＨＳＡ／ＮａＢｒ（ＨＳＡの初期濃度＝３００ｍｇ／ｍＬ、ＮａＢｒの初期濃度＝１．８Ｍ、ｎ＝５）およびＨＳＡ／ＣａＣｌ２（ＨＳＡの初期濃度＝２００ｍｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ２の初期濃度＝２．１Ｍ、ｎ＝１０）。移植片の対照バッチを、グルタルアルデヒドの存在下でＨＳＡを架橋することによって調製した（ＨＳＡ／ＧＬＵ、ｎ＝５）。次に、移植片を完全に洗浄し、推奨サイズ（長さ≒１ｃｍ、直径≦５ｍｍ）に合うようにカットした（図２７Ａ）。これらの材料の吸水率を使用して、ＢＳＡおよびＨＳＡで調製されたバッチを比較した。ＢＳＡ／ＮａＢｒおよびＨＳ
Ａ／ＮａＢｒが同様の視覚的側面と吸水率の値（それぞれ、１２４±３％および１２７±２１％）を有し、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２およびＨＳＡ／ＣａＣｌ２が同様（それぞれ２２４±５２％および２２０±１０％）であった（図２７Ｂ）。次に、移植片を２４ウェルプレートで、３７℃で２４時間乾燥させた。次に移植片の乾燥バッチを、選択した方法（電子ビーム、２５ｋＧｙ）を使用して滅菌した。
Ａ／ＮａＢｒが同様の視覚的側面と吸水率の値（それぞれ、１２４±３％および１２７±２１％）を有し、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２およびＨＳＡ／ＣａＣｌ２が同様（それぞれ２２４±５２％および２２０±１０％）であった（図２７Ｂ）。次に、移植片を２４ウェルプレートで、３７℃で２４時間乾燥させた。次に移植片の乾燥バッチを、選択した方法（電子ビーム、２５ｋＧｙ）を使用して滅菌した。
【0135】
次に、滅菌された移植片をマウスの皮下移植に使用した。移植片をＰＢＳで４℃で６時間再水和し、移植前にＰＢＳですすいだ。スイスマウスには、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２、およびＨＳＡ／ＧＬＵ移植片を移植した（移植片の種類ごとに３匹のマウス）。ヌードマウスには、ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＮａＢｒおよびＨＳＡ／ＣａＣｌ２移植片を移植した。ＢＳＡ／ＧＬＵ材料を移植した対照グループで急性毒性が観察され、このグループのマウスを犠牲にした。Ａｌｂｕｐａｄ材料を移植されたマウスは、実験中（２８日間）、有意な体重変動（±５～１０％の体重変動）なしに生存していた。移植片の体積は、ノギスを使用して皮膚を通して測定された。スイスマウスグループでは、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２移植片は１７日間の移植後に完全に分解され、一方で、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２移植片は、２８日後の実験終了までに完全に分解はされず、平均して体積の５０％が失われた。ヌードマウスでは、ＢＳＡ／ＮａＢｒ、ＨＳＡ／ＮａＢｒ、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２、ＨＳＡ／ＣａＣｌ２の分解は、２８日間の埋め込み後に、それぞれ体積の２３％、３５％、５３％、４３％を失った。２８日目にマウスを犠牲にした後、ゴモリおよびピクロシニウス染色後の顕微鏡検査により、移植片およびその周辺組織の切断物に対する組織学的評価を実行した。調製されたカットの観察は、移植片が断片化されていないことを明らかにし、それらの生分解が進行性であり、大きな断片の形成をもたらさないことを示している（図２８Ａ）。移植片を取り巻く組織の表現型は正常であり、コラーゲン線維の形成と配向は天然組織で観察されたものと同様であることが観察された（図２８Ｂ）。材料との接触では線維増殖は観察されなかった。したがって、試験された移植片は周囲の組織またはマウスに対して無毒であり、移植片のタイプに応じた速度にて生体内において生分解性であることが証明された。
実験セクション
実験セクション
【0136】
化学試薬。ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、≧９６％）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入した。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、ヘモグロビン（ヒト）、ウシ血液からのγ－グロブリン（９９％以上）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ、米で発現）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、ＦＩＴＣに結合したインスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）および酸化重水素（Ｄ２Ｏ）を購入した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）はＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２、無水）はＦｌｕｋａから購入した。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ）はＭｅｒｃｋから購入した。ＳｅｒａＣａｒｅから、次のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を購入した：ＨＳＡ試薬グレード粉末（ＲＧＰ）、ＨＳＡ低葉酸粉末（ＬＦＰ）、およびＨＳＡ脂肪酸フリー（ＦＡＦ）。
【0137】
配合（一般的な手順）。ｐＨ６の酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ）中にＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＮａＢｒ１Ｍの溶液を調製した。この溶液をシリコーン型に入れ、乾燥するまで３７℃で蒸発させた。得られた乾燥生体材料を洗浄して塩を除去し、蒸留水に室温で４８時間浸した。次に、水不溶性膜（ＢＳＡ／ＮａＢｒ）を収集し、特性を評価した。
【0138】
初期の特徴づけ。相対収率（式Ｓ１）、吸水量（式Ｓ２）、および初期膨張（式Ｓ３）を使用して、配合された膜を比較した。ＷＢＳＡは、製剤に使用されるアルブミンの初期質量を表す。Ａｉは、蒸発プロセス中に使用される円形容器の面積を表す。Ｗｄは、蒸留水で４８時間洗浄し、３７°Ｃのオーブンで一晩乾燥させた後の最終乾燥膜の質量を表す
。Ｖｄは、室温で蒸留水に材料を浸して測定した乾燥膜の体積である。Ｗｈは、蒸留水に２４時間浸漬し、濾紙を使用して過剰な表面水を除去した後の平衡状態にある水和膜の質量を表す。Ａｈは、電子デジタルノギス（ＴＡＣＫＬＩＦＥ－ＤＣ０１、精度±０．２ｍｍ）を使用して直径を測定した後に計算された、蒸留水に２４時間浸漬した後の平衡状態にある水和膜の表面の面積である。
。Ｖｄは、室温で蒸留水に材料を浸して測定した乾燥膜の体積である。Ｗｈは、蒸留水に２４時間浸漬し、濾紙を使用して過剰な表面水を除去した後の平衡状態にある水和膜の質量を表す。Ａｈは、電子デジタルノギス（ＴＡＣＫＬＩＦＥ－ＤＣ０１、精度±０．２ｍｍ）を使用して直径を測定した後に計算された、蒸留水に２４時間浸漬した後の平衡状態にある水和膜の表面の面積である。
【0139】
【数4】
【0140】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）。走査型電子顕微鏡および微量分析の評価は、１０ｋＶの加速電子電圧で動作するＱｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ ＳＥＭ（ＦＥＩＣｏｍｐａｎｙ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実行した。ＳＥＭ実験では、ＢＳＡ／ＮａＢｒ６６４膜を乾燥させた後、ＨｕｍｍｅｒＪｒスパッタリングデバイス（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ、ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して金－パラジウム合金でコーティングした。
【0141】
有機溶媒中での安定性。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜を５ｍＬの次の有機溶媒に入れた：ＤＭＳＯ、アセトニトリル、およびジクロロメタン。次に、膜を含む培地を、撹拌しながら室温で７２時間インキュベートした。その後、膜を水で洗浄してから、質量損失の特性を調べた（式Ｓ４）。
【0142】
【数5】
【0143】
膜の機械的性質。圧縮試験は、レオメーターＫｉｎｅｘｕｓ ｕｌｔｒａ＋（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を平行板構成（直径２０ｍｍ）で使用して実施した。３つの水和物のバッチ（蒸留水中）ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜（厚さ＝０．７ｍｍ）を使用した。弾性率（Ｅ）を、ひずみ（ε）－応力（σ）曲線の弾性領域内で計算した（式Ｓ５）。
σ＝Ｅ×ε （Ｓ５）
σ＝Ｅ×ε （Ｓ５）
【0144】
レオロジー測定。ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜（厚さ＝０．７ｍｍ）の粘弾性挙動は、平行板構成（直径２０ｍｍ）のレオメーターＫｉｎｅｘｕｓｕｌｔｒａ＋（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して評価した。膜を事前に蒸留水で２４時間水和した。ＢＳＡ／ＮａＢｒディスクをプレート間にロードし、試料が両方のプレートと良好に接触するまでギャップを閉じた（法線力＜１Ｎ）。実験の開始時および実験の合間に、試料を５分間平衡化した。この間、垂直抗力はすべての試料で０．１Ｎ未満の値に減少した。振幅掃引試験を、２５℃で０．５Ｈｚの固定周波数で、０．０１～１００％のせん断ひず
みで実施した。せん断弾性率Ｇ＊（ω）＝σ（ω）／γ（ω）は、応力（σ）とひずみ振幅（γ）の比率から得られる。Ｇ＊（ω）＝Ｇ´＋ｉＧ”は、弾性貯蔵弾性率（Ｇ´）と粘性損失弾性率（Ｇ”）の複素数である。せん断弾性率の絶対値｜Ｇ＊｜を、｜Ｇ＊｜＝（Ｇ´２＋Ｇ”２）０．５を使用して計算した。
みで実施した。せん断弾性率Ｇ＊（ω）＝σ（ω）／γ（ω）は、応力（σ）とひずみ振幅（γ）の比率から得られる。Ｇ＊（ω）＝Ｇ´＋ｉＧ”は、弾性貯蔵弾性率（Ｇ´）と粘性損失弾性率（Ｇ”）の複素数である。せん断弾性率の絶対値｜Ｇ＊｜を、｜Ｇ＊｜＝（Ｇ´２＋Ｇ”２）０．５を使用して計算した。
【0145】
接触角の測定。Ａｔｔｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｔａ張力計よびＢｉｏｌｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｗｅｄｅｎ）のＯｎｅＡｔｔｅｎｓｉｏｎソフトウェアを使用した。実験は、乾燥したＢＳＡ／ＮａＢｒ膜上の水の静的接触角を測定するための「液滴」モードで実施した。ハミルトンマイクロシリンジ（針の直径＝０．７ｍｍ）を使用して、水滴を分配した。各測定は、５μＬのｍｉｌｌｉＱ水（液滴速度＝２μｌ／ｓ）の液滴を使用して行われ、各試料に対して３回繰り返した。内蔵カメラは、材料との交差点での液滴による接線角度を測定しながら、固着液滴（フレームレート＝１４ＦＰＳ）の一連の画像をキャプチャした。平均接触角（左右の接触角の平均）を、液滴が安定するのに十分な時間である１０秒後に記録した。
【0146】
ＩＲ分析。ＦＴＩＲ実験を、ＤＴＧＳ検出器を使用してＶｅｒｔｅｘ７０分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。スペクトルを、Ｂｌａｃｋｍａｎ－Ｈａｒｒｉｓの３項アポダイゼーションとＢｒｕｋｅｒ ＯＰＵＳ／ＩＲソフトウェア（バージョン７．５）を使用して、２ｃｍ－１解像度で１２８干渉画像を８００～４０００ｃｍ－１に平均化することによって、単一反射ｄｉａｍｏｎｄＡＴＲを使用してＡｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＲ）モードで記録した。準備が整ったＢＳＡ／ＮａＣｌ膜（乾燥）を細かく粉砕し、スペクトルを記録した。アミドＩバンド領域（１７００～１６００ｃｍ－１）を分解するために、ＯＰＵＳ７．５ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｋ ＧｍｂＨ）を使用してデータ処理を実行した。カーブフィッティングの前に、スペクトルはアミドＩバンド領域でベースライン補正し、正規化の「最小－最大」法を使用して正規化した。サブバンドの数とその位置を、スペクトルの４次導関数から決定した。デコンボリューションは、ガウス線形状を使用した最小二乗反復曲線あてはめプログラム（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）に従って実行した。最終的な適合では、残留ＲＭＳエラーを可能な限り減らすために（０．００５未満）、これらのパラメータの少なくとも１つを毎回変更させずに、すべてのバンドの高さ、幅、および位置を調整した。最後に、元の曲線と近似曲線の２次導関数を比較して、曲線近似の精度を確認した。適合したコンポーネントの分数領域を使用して、文献に従って識別した後、さまざまな二次構造要素（α－ヘリックス、β－シート、β－ターン、およびランダムコイル）のパーセンテージを計算した。
【0147】
プレロード配合。ＢＳＡ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を、ｐＨ６の酢酸緩衝液（０．２Ｍ）で調製し、ＮａＢｒ（ＮａＢｒ／ＢＳＡモル比＝４００）またはＣａＣｌ２（ＣａＣｌ２／ＢＳＡモル比＝７００）塩と混合した。ドキソルビシン（ＤＯＸ）のプレロードでは、蒸発前に次の量のＤＯＸを初期溶液に添加した：膜あたり０．２５、０．５、０．７５、および１ｍｇ（膜質量＝４００ｍｇ）。インスリン（ＩＮＳ－ＦＩＴＣ）のプレロードでは、蒸発前に、膜あたり０．２５ｍｇのＩＮＳ－ＦＩＴＣ（膜の質量＝４００ｍｇ）を初期溶液に添加した。溶液を粘着性のないシリコーン型に入れ、３７℃で４８時間蒸発させた。得られた乾燥生体材料を、塩を除去するために、ＢＳＡ／ＮａＢｒ膜の場合は３×２０ｍＬの水で、ＢＳＡ／ＣａＣｌ２膜の場合は４×２０ｍＬの水で完全に洗浄した。
【0148】
共焦点レーザー走査型顕微鏡の特性評価（ＣＬＳＭ）。事前装填された膜内のＤＯＸまたはＩＮＳ－ＦＩＴＣの存在を視覚化するために、ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用してＣＬＳＭイメージングを実行した。膜イメージングの励起／発光波長は、事前装填されたＤＯＸとＩＮＳ－ＦＩＴＣの材料の両方で４５０／５１５ｎｍに固定した。
【0149】
放出実験。ＤＯＸまたはＩＮＳ－ＦＩＴＣのプレロードされた膜の放出を、Ｇｅｎｉｕｓ ＸＣ分光蛍光光度計（ＳＡＦＡＳ、Ｍｏｎａｃｏ）で監視した。放出実験は、Ｈ２Ｏ（膜あたり１０ｍＬ）中、３７℃で実施した。各上清を回収した後、新鮮な１０ｍＬの水を添加した。上澄みを分光蛍光光度計で分析した。ＤＯＸおよびＩＮＳ－ＦＩＴＣの励起および発光の波長は、それぞれλｅｘ／λｅｍ＝４８５ｎｍ／５９５ｎｍおよびλｅｘ／λｅｍ＝４９５ｎｍ／５２０ｎｍであった。
【0150】
統計分析。データを、Ｒ（バージョン３．６．１、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析した。分布の正規性は、シャピロ－ウィルク検定で決定した。分散の同等性は、Ｆ検定で決定した。データが正規分布しており、試料の分散が等しい場合、ｔ検定（両側検定）を使用して２つの平均を比較した。これらの２つの条件が当てはまらない場合は、代わりにマンホイットニー検定を実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分析した。分布の正規性は、シャピロ－ウィルク検定で決定した。分散の同等性は、Ｆ検定で決定した。データが正規分布しており、試料の分散が等しい場合、ｔ検定（両側検定）を使用して２つの平均を比較した。これらの２つの条件が当てはまらない場合は、代わりにマンホイットニー検定を実行した。値は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であると見なされた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図27A】
【図27B】
【図28A】
【図28B】
【国際調査報告】