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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】プラスミンとの結合のための抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221219BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20221219BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221219BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221219BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221219BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20221219BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20221219BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20221219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221219BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20221219BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K16/40 ZNA
C12N15/13
C07K16/46
C12N15/63 Z
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61K45/00
A61P7/04
A61P31/04
A61P35/04
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P15/00
A61P17/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022524968
(86)(22)【出願日】2020-10-28
(85)【翻訳文提出日】2022-06-15
(86)【国際出願番号】 AU2020051164
(87)【国際公開番号】W WO2021081582
(87)【国際公開日】2021-05-06
(31)【優先権主張番号】2019904049
(32)【優先日】2019-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594202523
【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ウィストック，ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ロウ，ルビー
(72)【発明者】
【氏名】クエック，アダム
(72)【発明者】
【氏名】コンロイ，ポール
(72)【発明者】
【氏名】ウー，グオジエ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA531
4C084ZA811
4C084ZA891
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB351
4C084ZC411
4C085AA14
4C085AA16
4C085AA27
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、プラスミンに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、ここで、前記抗原結合タンパク質は、プラスミンの活性を低減する。本発明はまた、抗原結合タンパク質を含む組成物、並びにその使用及びそれを含む治療方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プラスミンのセリンプロテアーゼドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、プラスミンの活性を特異的に阻害する、抗原結合タンパク質。
【請求項2】
前記抗原結合ドメインが、プラスミンの前記セリンプロテアーゼドメインの触媒部位に結合する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項3】
前記抗原結合ドメインが、配列：配列番号３４、又はその断片を含むペプチドに結合する、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項4】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３３に記載されるＡｒｇ６３７、Ｌｅｕ６３８、Ｌｅｕ６４０、Ｐｒｏ６４２、Ａｒｇ６４４、Ｌｙｓ６４５、Ｇｌｎ７２１、Ｔｒｐ７８３、及びＡｓｎ７９１、又はそれに相当する位置のプラスミンのセリンプロテアーゼドメインの１つ若しくは複数の残基に結合するか、或いは表２に示す位置、又はそれに相当する位置のプラスミンのセリンプロテアーゼドメインの１つ若しくは複数の残基に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項5】
前記タンパク質が、ヒトプラスミンに結合する、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項6】
前記タンパク質が、プラスミンとストレプトキナーゼの結合を阻害する、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項7】
前記タンパク質が、以下：組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、トロンビン、トリプシン、第Ｘａ因子、血漿カリクレイン、ヒト活性化カリクレイン（ＨＰＫａ）、プロテインＣ、及び第ＸＩＩａ因子からなるリストから選択されるセリンプロテアーゼと有意に結合しないか、又はその活性を有意に低減若しくは阻害しない、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項8】
前記抗原結合タンパク質が、以下：フィブリン、フィブリノーゲン、第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸ因子、プロテアーゼ－活性化受容体Ｉ、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、フォン・ヴィレブランド因子、ビトロネクチン、プロ脳由来神経栄養因子、補因子Ｃ３及びＣ５、テネイシン、オステオカルシン、ＣＵＢドメイン含有タンパク質１及びコラゲナーゼから選択されるプラスミン基質の１つ若しくは複数のプラスミン媒介性切断を阻害又は低減する、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項9】
前記抗原結合タンパク質の残基とプラスミンの残基との相互作用が、Ｘ線結晶構造解析及び０～３．９Å（両端の値を含む）の接触距離解析によって明らかにされる、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項10】
前記抗原結合タンパク質が、プラスミン上で、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインとを含む抗体と同じエピトープに結合し、前記抗原結合タンパク質は、前記プラスミンの活性を低減又は阻害する、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項11】
前記エピトープが、Ｘ線結晶構造解析により明らかにされ、任意選択的に、前記エピトープは、０～３．９Å（両端の値を含む）の接触距離解析によって明らかにされる、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項12】
前記抗原結合タンパク質が、プラスミンに結合して、約１×１０４超、約５×１０４超、約１×１０５超、若しくは約８×１０５以上のｋａ（Ｍ－１ｓ－１）を呈示し、好ましくは、前記抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、約８×１０５のｋａ（Ｍ－１ｓ－１）を呈示する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項13】
前記抗原結合タンパク質が、プラスミンに結合して、約１×１０－３未満、又は約５×１０－４未満のｋｄ（ｓ－１）を呈示し、好ましくは、本発明の抗原結合は、プラスミンに結合して、約４．５×１０－４のｋｄ（ｓ－１）を呈示する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項14】
前記抗原結合タンパク質が、プラスミンに結合して、２ｍＭ未満、１００μＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５００ｐＭ以下のＫＤを呈示し、前記ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて決定される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項15】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３３から得られるペプチドに結合し、任意選択的に、前記抗原結合タンパク質は、配列番号３３の配列の４、５、７、８、９、１０個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基から構成されるペプチドに結合する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項16】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３４の配列の４、５、７、８、９、１０個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基から構成されるペプチドに結合する、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項17】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３３の６３７～７９１の残基を含むか、それらから本質的に構成されるか、又はそれらから構成されるペプチドに結合する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項18】
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３３に記載されるプラスミンの配列に従って、少なくとも、残基Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６及びＡｌａ／Ｓｅｒ７４１に結合する、請求項１７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項19】
前記抗原結合タンパク質が、以下：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４及び
ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域であり；
前記フレームワーク領域又は相補性決定領域のいずれかの配列は、本明細書に記載される通りであり、
任意選択的に、前記相補性決定領域のいずれかの配列は、表１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項20】
前記抗原結合タンパク質が、（ＮからＣ末端又はＣからＮ末端の順に）配列番号７及び８のアミノ酸配列を含むか、それから本質的に構成されるか、又はそれから構成される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項21】
前記抗原結合ドメインが、以下：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－リンカー－ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、
前記抗原結合ドメインが、以下：
（ｉ）配列番号４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号８に記載される配列と少なくとも約９５％若しくは９６％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含むＶＨ；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号７に記載される配列と少なくとも約９５％同一の配列を有するＶＬ；
（ｖ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｖｉ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ；
（ｖｉｉ）配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号７に記載される配列を有するＶＬ；
（ｉｘ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨと；配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｘ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ、及び配列番号７に記載される配列を有するＶＬ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項22】
前記タンパク質が、以下：（ｉ）配列番号２１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号２２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号１７に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｖ）配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；又は
（ｖ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨと；配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項23】
前記抗原結合タンパク質が、以下：（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ；或いは
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ
の形態である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項24】
前記抗原結合タンパク質が、以下：（ｉ）ジアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２：
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）二重特異性抗体；
（ｖｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ；或いは
（ｖｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ
の形態である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項25】
前記抗原結合タンパク質が、抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、前記結合タンパク質は、モノクローナル抗体又は可変ドメインである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項26】
前記リンカーが、化学物質、１つ若しくは複数のアミノ酸、又は２つのシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合である、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項27】
軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗プラスミン抗体であって、前記軽鎖可変領域は、以下：
配列番号１に記載されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ Ｌ２、及び配列番号３に記載されるＣＤＲ Ｌ３
を含み；
前記重鎖可変領域は、以下：
配列番号４に記載されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ Ｈ２、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ Ｈ３
を含む、抗プラスミン抗体。
【請求項28】
前記抗体が、配列番号７の配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項２７に記載の抗プラスミン抗体。
【請求項29】
前記抗体が、配列番号８の配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項２７又は２８に記載の抗プラスミン抗体。
【請求項30】
前記抗体が、配列番号１７に記載されるＦＲ Ｌ１、配列番号１８に記載されるＦＲ Ｌ２、配列番号１９に記載されるＦＲ Ｌ３、及び配列番号２０に記載されるＦＲ Ｌ４を有する軽鎖可変領域を含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の抗プラスミン抗体。
【請求項31】
前記抗体が、配列番号２１に記載されるＦＲ Ｈ１、配列番号２２に記載されるＦＲ Ｈ２、配列番号２３に記載されるＦＲ Ｈ３、及び配列番号２４に記載されるＦＲ Ｈ４を有する重鎖可変領域を含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の抗プラスミン抗体。
【請求項32】
前記タンパク質又は抗体が、裸抗体である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は抗プラスミン抗体。
【請求項33】
請求項１～３２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は抗体を含む、融合タンパク質。
【請求項34】
標識又は細胞毒性薬剤にコンジュゲートされた、請求項１～３２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又は抗体の形態のコンジュゲート。
【請求項35】
請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートをコードする核酸。
【請求項36】
請求項３５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項37】
それを必要とする対象のプラスミン活性を阻害する方法であって、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを前記対象に投与し、それにより、前記対象のプラスミン活性を阻害することを含む、方法。
【請求項38】
それを必要とする対象の線維素溶解を阻害する方法であって、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを対象に投与し、それにより、前記対象の線維素溶解を阻害することを含む、方法。
【請求項39】
前記方法が、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象のプラスミン活性の阻害、或いは外傷を被っているか、又は手術若しくは出産によって出血している対象における止血の回復を目的とする、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項40】
対象におけるレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症を治療又は予防する方法であって、前記方法が、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを前記対象に投与し、それにより、前記対象のレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症を治療又は予防することを含む、方法。
【請求項41】
前記方法が、感染症の重症度を低減すること、又は前記対象におけるレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染に関連するか、又はそれに起因する病態を治療することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
対象における癌の転移の阻害若しくは予防を含め、癌の伝播若しくは進行を治療、阻害、予防する、又は最小限にする方法であって、前記方法が、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートを、必要とする対象に投与し、それにより、前記対象における癌の転移の阻害若しくは予防を含め、癌の伝播若しくは進行を治療、阻害、予防する、又は最小限にすることを含む、方法。
【請求項43】
プラスミン活性を阻害するための薬剤の製造、又はそれを必要とする対象における、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートの使用。
【請求項44】
それを必要とする対象の線維素溶解の阻害を目的とする薬剤の製造における、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートの使用。
【請求項45】
前記薬剤が、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象のプラスミン活性の阻害、或いは外傷を被っているか、又は手術若しくは出産によって出血している対象における止血の回復を目的とする、請求項４３又は４４に記載の使用。
【請求項46】
レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の治療又は予防を目的とする薬剤の製造における、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートの使用。
【請求項47】
癌の転移の阻害若しくは予防を含め、癌の伝播若しくは進行の治療、阻害、予防、又は最小化を目的とする薬剤の製造における、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートの使用。
【請求項48】
請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項49】
それを必要とする対象におけるプラスミン活性の阻害に使用するための請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項50】
それを必要とする対象における線維素溶解の阻害に使用するための請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項51】
前記組成物が、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象のプラスミン活性の阻害における、或いは外傷を被っているか、又は手術若しくは出産によって出血している対象における止血の回復のための使用を目的とする、請求項４９又は４８に記載の医薬組成物。
【請求項52】
レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の治療又は予防に使用するための、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項53】
癌の転移の阻害若しくは予防を含め、癌の伝播若しくは進行の治療、阻害、予防又は最小化に使用するための、請求項４８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プラスミンとの結合のための抗原結合タンパク質及びその関連断片、前記抗原結合タンパク質及び断片の生産、並びに様々な病態の検出及び治療法のための前記抗体及び断片の使用に関する。
【0002】
関連出願
本出願は、オーストラリア仮特許出願ＡＵ ２０１９９０４０４９号明細書の優先権を主張するものであり、その内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、オーストラリア仮特許出願ＡＵ ２０１９９０４０４９号明細書の優先権を主張するものであり、その内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0003】
プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は、プラスミン、即ち、フィブリン、フィブリノーゲン、補体成分３及び５（Ｃ３及びＣ５）、ビトロネクチン、オステオカルシン、第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸ因子、並びにいくつかのコラゲナーゼを含む標的基質に対して広範囲の特異性を有するセリンプロテアーゼの不活性チモーゲン形態である。したがって、ＰＬＧ及びＰＬＭは一緒に、様々な重要な生理学的及び病理学的プロセスに関与し、こうしたプロセスとしては、線維素溶解及び止血、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、胚発生、組織再構築、炎症、創傷治癒、血管新生及び組織浸潤が挙げられる。
【0004】
ＰＬＧは、主として肝臓中で合成されるが、主要臓器及び組織中でも合成される。したがって、ＰＬＧは、血漿及び多くの血管外液中に相当量存在している。生理学的条件下で、ＰＬＧは、活性化ループ中の切断によって、活性形態であるプラスミン（ＰＬＭ）に変換される。活性化は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、又は様々な他のプロテアーゼにより媒介され得るが、これは、一本鎖ＰＬＧ（アミノ酸残基２０～８１０）を、ジスルフィド結合で連結された重鎖Ａ（残基２０～５８０）と軽鎖Ｂ（残基５８１～８１０）から構成されるＰＬＭに変換する。重鎖Ａは、５つのクリングルドメイン（リシン結合領域を介して基質への結合を媒介する）を含み、軽鎖Ｂは、セリンプロテアーゼドメインに対応する。最初の４つのクリングルドメインから構成される断片は、アンギオスタチンと名付けられ、新規の血管新生阻害剤である。
【0005】
プラスミノーゲン／プラスミン系は、線維素溶解、組織再構築、細胞遊走、炎症、並びに腫瘍浸潤及び転移などの多様な生理学的及び病理学的過程に関係するとされている。プラスミノーゲンの遺伝的欠陥は、血栓塞栓症の発病の危険因子である。
【0006】
様々な病態の治療及び／又は予防のプラスミン系を調節するための組成物及び方法が必要とされている。
【0007】
本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、この先行技術が、いかなる法的管轄においても、一般的な常識の一部を成すこと、又はこの先行技術が、当業者によって先行技術の他の部分により、合理的に理解されるものと予想され、関連すると考えられ、及び／又は組み合わされ得ることを承認又は示唆するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、プラスミンに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、抗原結合タンパク質が、プラスミンの活性を低減する、抗原結合タンパク質を提供する。
【0009】
好ましくは、プラスミンは、ヒトプラスミンである。
【0010】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインに結合する。
【0011】
好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンプロテアーゼドメインの触媒部位に結合する。触媒部位は、Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６及びＡｌａ／Ｓｅｒ７４１（番号付けは、配列番号３３に記載される通り、ヒトプラスミンに従う）を含む。好ましくは、抗原結合タンパク質は、配列番号３４に記載される配列、又はその断片を含むペプチドに結合する。
【0012】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、Ａｒｇ６３７、Ｌｅｕ６３８、Ｌｅｕ６４０、Ｐｒｏ６４２、Ａｒｇ６４４、Ｌｙｓ６４５、Ｇｌｎ７２１、Ｔｒｐ７８３、及びＡｓｎ７９１、又はそれに相当する位置のプラスミンのセリンプロテアーゼドメインの１つ若しくは複数の残基に結合する。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、表２に示す位置、又はそれに相当する位置のプラスミンのセリンプロテアーゼドメインの１つ若しくは複数の残基に結合する。より好ましくは、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインの１つ又は複数の残基に結合する抗原結合タンパク質の残基は、表２に定義されるアミノ酸残基の１つ又は複数である。
【0013】
本発明はまた、表２のＢ１０抗体について指定される残基に対する位置、若しくは同等の位置に同じアミノ酸を有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）も提供する。
【0014】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミノーゲンにも結合し得る。しかし、プラスミノーゲンは、チモーゲンの不活性形態であることから、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミノーゲンの活性化を阻害するのではなく、プラスミンに活性化されたプラスミノーゲンの活性を阻害することは理解されよう。
【0015】
本発明の特定の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミノーゲン活性化因子、即ち、ストレプトキナーゼのプラスミノーゲンとの結合、並びにストレプトキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化を阻害する。
【0016】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質の１残基とプラスミンの１残基との相互作用は、Ｘ線結晶構造解析及び０～３．９Å（両端の値を含む）の接触距離解析によって決定され得る。
【0017】
本発明はまた、プラスミン上で、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインとを含む抗体と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質も提供し、ここで、抗原結合タンパク質は、プラスミンの活性を低減又は阻害する。一実施形態では、上記エピトープは、Ｘ線結晶構造解析によって明らかにされる。好ましくは、上記エピトープは、Ｘ線結晶構造解析及び０～３．９Å（両端の値を含む）の接触距離解析によって明らかにされる。好ましくは、抗原結合タンパク質は、９２５Å２±５％の配列番号３３のプラスミンの表面面積を覆う。
【0018】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、約１×１０４超、約５×１０４超、約１×１０５超、若しくは約５×１０５以上又は本明細書に記載されるいずれかの値のｋａ（Ｍ－１ｓ－１）を呈示し得る。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、約８×１０５の値のｋａ（Ｍ－１ｓ－１）を呈示する。
【0019】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、約１×１０－３未満、又は約５×１０－４未満のｋｄ（ｓ－１）を呈示し得る。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、約４．５×１０－４±０．２又は本明細書に記載されるいずれかの値のｋｄ（ｓ－１）を呈示する。
【0020】
本発明の任意の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、２ｍＭ未満、１００μＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５００ｐＭ以下のＫＤを呈示し得る。好ましくは、ＫＤは、本明細書に記載される任意のアッセイ、例えば、マルチサイクルＳＰＲなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて決定される。
【0021】
本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号３３から得られるペプチドに結合し得る。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号３３の配列の４、５、７、８、９、１０個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基から構成されるペプチドに結合し得る。より好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号３４の配列の４、５、７、８、９、１０個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸残基から構成されるペプチドに結合し得る。一部の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号３３の配列の６３７～７９１の残基を含むか、それらから本質的に構成されるか、又はそれらから構成されるペプチドに結合する。より好ましくは、抗原結合タンパク質は、配列番号３３に記載されるプラスミンの配列に従って、少なくとも、残基Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６及びＡｌａ／Ｓｅｒ７４１に結合する。
【0022】
本発明の任意の態様において、抗原結合タンパク質は、ｔＰＡ、トロンビン、トリプシン、第Ｘａ因子（ＦＸａ）及び血漿カリクレインのいずれか１つ若しくは複数の活性を有意に低減、又は阻害しない。
【0023】
任意の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、セリンプロテアーゼトリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ、又はそれらの組合せと特異的に結合しない。
【0024】
本発明は、プラスミンとの結合のための抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、以下：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４及び
ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域であり；
上記フレームワーク領域又は相補性決定領域のいずれかの配列は、本明細書に記載される通りである。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４及び
ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域であり；
上記フレームワーク領域又は相補性決定領域のいずれかの配列は、本明細書に記載される通りである。
【0025】
本発明は、プラスミンとの結合のための抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、以下：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４及び
ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域であり；
上記相補性決定領域のいずれかの配列は、以下の表１に示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、上記フレームワーク領域は、やはり以下の表１に示されるアミノ酸配列を有し、これらは特定の残基にアミノ酸変異を含み、こうしたアミノ酸変異は、各抗体に由来する様々なフレームワーク領域をアラインメントすることによって決定することができる。本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、ＶＨからの配列であり、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａが、ＶＬからの配列であるか、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、ＶＬからの配列であり、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａが、ＶＨからの配列である場合も含む。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４及び
ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域であり；
上記相補性決定領域のいずれかの配列は、以下の表１に示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、上記フレームワーク領域は、やはり以下の表１に示されるアミノ酸配列を有し、これらは特定の残基にアミノ酸変異を含み、こうしたアミノ酸変異は、各抗体に由来する様々なフレームワーク領域をアラインメントすることによって決定することができる。本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、ＶＨからの配列であり、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａが、ＶＬからの配列であるか、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、ＶＬからの配列であり、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａが、ＶＨからの配列である場合も含む。
【0026】
本発明はまた、プラスミンに結合するか、又はそれと特異的に結合する抗原結合タンパク質も提供し、この場合、抗原結合タンパク質は、プラスミンに対するＢ１０抗体（即ち、配列番号８に記載される配列を有するＶＨと、配列番号７に記載される配列を有するＶＬを含む）の結合を競合的に阻害する。
【0027】
本発明は、プラスミンとの結合のための抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、以下：
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－リンカー－ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域である。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－リンカー－ＦＲ１ａ－ＣＤＲ１ａ－ＦＲ２ａ－ＣＤＲ２ａ－ＦＲ３ａ－ＣＤＲ３ａ－ＦＲ４ａ
を含み、ここで、
ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は各々、相補性決定領域であり；
ＦＲ１ａ、ＦＲ２ａ、ＦＲ３ａ及びＦＲ４ａは各々、フレームワーク領域であり；
ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａ及びＣＤＲ３ａは各々、相補性決定領域である。
【0028】
本明細書に定義されるように、リンカーは、化学物質、１つ若しくは複数のアミノ酸、又は２つのシステイン残基の間に形成されるジスルフィド結合であってもよい。
【0029】
本発明は、（ＮからＣ末端又はＣからＮ末端の順に）配列番号７及び８のアミノ酸配列を含むか、それから本質的に構成されるか、又はそれから構成される抗原結合タンパク質を提供する。
【0030】
本発明はまた、抗体の抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質も提供し、ここで、抗原結合ドメインは、プラスミンに結合するか、又はそれと特異的に結合し、抗原結合ドメインは、以下のうちの少なくとも１つを含む：
（ｉ）配列番号４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号８に記載される配列と少なくとも約９５％若しくは９６％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含むＶＨ；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号７に記載される配列と少なくとも約９５％同一の配列を有するＶＬ；
（ｖ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｖｉ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ；
（ｖｉｉ）配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号７に記載される配列を有するＶＬ；
（ｉｘ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨと；配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｘ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ、及び配列番号７に記載される配列を有するＶＬ。
（ｉ）配列番号４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号５に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号８に記載される配列と少なくとも約９５％若しくは９６％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含むＶＨ；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号７に記載される配列と少なくとも約９５％同一の配列を有するＶＬ；
（ｖ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨ；
（ｖｉ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ；
（ｖｉｉ）配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号７に記載される配列を有するＶＬ；
（ｉｘ）配列番号４に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨと；配列番号１に記載される配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に記載される配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に記載される配列を有するＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｘ）配列番号８に記載される配列を有するＶＨ、及び配列番号７に記載される配列を有するＶＬ。
【0031】
本発明の任意の態様において、抗原結合ドメインはさらに、以下のうちの少なくとも１つを含む：
（ｉ）配列番号２１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号２２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号１７に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｖ）配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；又は
（ｖ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨと；配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ。
（ｉ）配列番号２１に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）１、配列番号２２に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｉ）配列番号１７に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨ；
（ｉｖ）配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ；又は
（ｖ）配列番号２１に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号２２に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号２３に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２４に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＨと；配列番号１７に記載される配列を有するＦＲ１、配列番号１８に記載される配列を有するＦＲ２、配列番号１９に記載される配列を有するＦＲ３、及び配列番号２０に記載される配列を有するＦＲ４を含むＶＬ。
【0032】
本明細書に記載される通り、抗原結合タンパク質は、以下：
（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ；或いは
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ
の形態であってよい。
（ｉ）一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ－ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ；或いは
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）又は（ｉｉ）の１つ
の形態であってよい。
【0033】
さらに、本明細書に記載される通り、抗原結合タンパク質は、以下：
（ｉ）ジアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２：
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）二重特異性抗体又は他の形態の多重特異性抗体；
（ｖｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ；或いは
（ｖｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ
の形態であってもよい。
（ｉ）ジアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２：
（ｖｉ）Ｆｖ；
（ｖｉｉ）二重特異性抗体又は他の形態の多重特異性抗体；
（ｖｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ若しくは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／若しくはＣＨ３と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ；或いは
（ｖｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質と連結した（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ
の形態であってもよい。
【0034】
前述した抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合ドメインとも呼ばれ得る。
【0035】
好ましくは、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である。典型的に、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。組み換え又は修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化（ｄｅ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、半抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体若しくは多重特異性抗体）の形態であってもよい。抗体は、さらに、活性薬剤若しくは放射性標識、又は可溶性を改善するための薬剤との共役などの化学修飾、或いは本明細書に記載される他の化学修飾を含んでもよい。
【0036】
本明細書に記載されるように、抗原結合タンパク質は、可変ドメインであってもよい。
【0037】
本発明はまた、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗プラスミン抗体も提供し、
ここで、前記軽鎖可変領域は、以下：
配列番号１に記載されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ Ｌ２、及び配列番号３に記載されるＣＤＲ Ｌ３
を含み；また
前記重鎖可変領域は、以下：
配列番号４に記載されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ Ｈ２、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ Ｈ３
を含む。
ここで、前記軽鎖可変領域は、以下：
配列番号１に記載されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ Ｌ２、及び配列番号３に記載されるＣＤＲ Ｌ３
を含み；また
前記重鎖可変領域は、以下：
配列番号４に記載されるＣＤＲ Ｈ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ Ｈ２、及び配列番号６に記載されるＣＤＲ Ｈ３
を含む。
【0038】
本発明の任意の態様において、抗プラスミン抗体は、配列番号７の配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【0039】
本発明の任意の態様において、抗プラスミン抗体は、配列番号８の配列を有する重鎖可変領域を含む。
【0040】
本発明の任意の態様において、抗プラスミン抗体は、配列番号１７に記載されるＦＲ Ｌ１、配列番号１８に記載されるＦＲ Ｌ２、配列番号１９に記載されるＦＲ Ｌ３、及び配列番号２０に記載されるＦＲ Ｌ４を有する軽鎖可変領域を含む。
【0041】
本発明の任意の態様において、抗プラスミン抗体は、配列番号２１に記載されるＦＲ Ｈ１、配列番号２２に記載されるＦＲ Ｈ２、配列番号２３に記載されるＦＲ Ｈ３、及び配列番号２４に記載されるＦＲ Ｈ４を有する重鎖可変領域を含む。
【0042】
本発明のいずれかの態様において、抗体は、裸の抗体である。具体的には、抗体は、非コンジュゲート形態であり、コンジュゲートを形成するように構成されていない。
【0043】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の相補性決定領域配列（ＣＤＲ）は、ＩＭＧＴ番号付け方式に従って定義することができる。
【0044】
プラスミン「に結合する」タンパク質又は抗体への本明細書における言及は、プラスミン「に特異的に結合する」又は「特異的に～に結合する」タンパク質又は抗体に文字通りの裏付け（ｌｉｔｅｒａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）を与える。
【0045】
本発明はまた、上記の抗体の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片を提供する。
【0046】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ（単一ドメイン抗体）、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体を含む融合タンパク質を提供する。
【0047】
本発明はまた、標識又は細胞毒性剤にコンジュゲートされた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体又は融合タンパク質の形態のコンジュゲートを提供する。
【0048】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体）、融合タンパク質、又はコンジュゲートに結合するための抗体を提供する。
【0049】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートをコードする核酸を提供する。
【0050】
一例において、このような核酸は、核酸がプロモーターに作動可能に連結された発現構築物に含まれる。このような発現構築物は、ベクター、例えば、プラスミドであり得る。
【0051】
単一ポリペプチド鎖抗原結合タンパク質に関する本発明の例において、発現構築物は、ポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含み得る。
【0052】
抗原結合タンパク質を形成する複数のポリペプチド鎖に関する例において、発現構築物は、プロモーターに作動可能に連結された、例えば、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸、及びプロモーターに作動可能に連結された、例えば、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0053】
別の例において、発現構築物は、例えば、５’－３’の順序で作動可能に連結された以下の構成要素：
（ｉ）プロモーター
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
を含む２シストロン性発現構築物であり、
ここで、第１のポリペプチドが、ＶＨを含み、第２のポリペプチドが、ＶＬを含み、又はその逆である。
（ｉ）プロモーター
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
を含む２シストロン性発現構築物であり、
ここで、第１のポリペプチドが、ＶＨを含み、第２のポリペプチドが、ＶＬを含み、又はその逆である。
【0054】
本発明はまた、一方がＶＨを含む第１のポリペプチドをコードし、他方がＶＬを含む第２のポリペプチドをコードする、別個の発現構築物を想定している。例えば、本発明はまた、
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含む組成物を提供する。
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含む組成物を提供する。
【0055】
本発明は、本明細書に記載されるベクター又は核酸を含む細胞を提供する。好ましくは、細胞は、単離されるか、実質的に精製されるか又は組み換え型である。一例において、細胞は、本発明の発現構築物又は：
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含み、
ここで、第１及び第２のポリペプチドは会合して、本発明の抗原結合タンパク質を形成する。
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＨを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現構築物；及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現構築物
を含み、
ここで、第１及び第２のポリペプチドは会合して、本発明の抗原結合タンパク質を形成する。
【0056】
本発明の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられる。
【0057】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列、又は本明細書に記載される免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ（単一ドメイン抗体）、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質、又はコンジュゲートと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0058】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列、又は本明細書に記載される抗原結合部位、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲート、希釈剤及び任意選択的に標識を含む診断用組成物を提供する。
【0059】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を含むか、又はＣＤＲ及び／又はＦＲ配列又は本明細書に記載される免疫グロブリン可変ドメイン、抗体、ｄａｂ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、又は多重特異性抗体、融合タンパク質又はコンジュゲートを含むキット又は製品を提供する。
【0060】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４定常領域又はそれらの混合物などのＩｇＧ定常領域を含み得る。ＶＨ及びＶＬを含む抗体又はタンパク質の場合、ＶＨは、重鎖定常領域に連結され得、ＶＬは、軽鎖定常領域に連結され得る。
【0061】
一例において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ４抗体の定常領域又はＩｇＧ４抗体の安定化定常領域を含む。一例において、タンパク質又は抗体は、２４１位（Ｋａｂａｔ番号付け方式に従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７ ａｎｄ／ｏｒ １９９１））にプロリンを有するＩｇＧ４定常領域を含む。
【0062】
一例において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、又は本明細書に記載される抗原結合タンパク質の組成物は、重鎖定常領域を含み、これは、Ｃ末端リシン残基を完全に若しくは部分的に含む又は含まない配列の混合物を含む安定化重鎖定常領域を含む。
【0063】
一例において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域又は安定化ＩｇＧ４定常領域（例えば、前述したような）と連結又は融合した、本明細書に開示されるＶＨを含み、ＶＬは、κ軽鎖定常領域と連結又は融合している。
【0064】
本発明の抗原結合タンパク質の機能特性は、本発明の抗体に対して準用されるものと理解される。
【0065】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、精製されるか、実質的に精製されるか、単離されるか、及び／又は組み換え型であり得る。
【0066】
本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の抗原結合タンパク質を発現するハイブリドーマを増殖させた培地から採取された上清の一部であり得る。
【0067】
本発明は、それを必要とする対象におけるプラスミン活性を阻害する方法を提供し、これは、本発明のプラスミン阻害抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象のプラスミン活性を阻害することを含む。必要とする対象は、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象を含み得る。
【0068】
好ましくは、プラスミン活性の阻害は、以下：フィブリン、フィブリノーゲン、第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸ因子、プロテアーゼ－活性化受容体Ｉ、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、ビトロネクチン、プロ脳由来神経栄養因子、補因子Ｃ３及びＣ５、テネイシン、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｉｎ）、ＣＵＢドメイン含有タンパク質１及びコラゲナーゼなどの他のプロテアーゼからなる群から選択されるプラスミンの１つ若しくは複数の基質のプラスミン切断の阻害を含む。
【0069】
本発明は、それを必要とする対象における線維素溶解を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象の線維素溶解を阻害することを含む。
【0070】
本発明はまた、外傷を被った、若しくは出血を被ったか、又は出血している（例えば、手術、外傷のために、若しくは出産後）対象の止血を回復するか、或いはプラスミン活性を阻害する方法も提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象における止血を回復するか、又はプラスミン活性を阻害することを含む。
【0071】
本発明はまた、対象におけるレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症を治療若しくは予防する方法も提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象のレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症を治療若しくは予防することを含む。これに関して、抗原結合タンパク質を用いて、感染症の再発を予防することもでき、これは、感染症の予防とみなされる。
【0072】
本発明は、それを必要とする対象における線維素溶解を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象の線維素溶解を阻害することを含む。
【0073】
本発明はまた、対象におけるレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症に関連するか、又はそれに起因する病態を治療する方法も提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を有効量で対象に投与し、それにより、対象のレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症に関連するか、又はそれに起因する病態を治療することを含む。レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症に関連するか、又はそれに起因する病態は、本明細書に記載される任意の病態であってよい。本発明の任意の態様では、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、慢性又は急性のいずれであってもよい。
【0074】
本発明はまた、対象におけるレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の重症度を低減する方法も提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象のレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の重症度を低減することを含む。
【0075】
さらには、本発明は、対象における癌を治療又は予防する方法も提供し、この方法は、本発明の抗原結合タンパク質を対象に投与し、それにより、対象の癌を治療又は予防することを含む。本明細書で使用される場合、癌を治療する方法は、癌の転移の阻害若しくは予防を含め、癌の伝播若しくは進行を阻害する、予防する、又は最小限にする方法を包含する。
【0076】
本発明は、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象におけるプラスミン活性の阻害を含め、それを必要とする対象におけるプラスミン活性の阻害を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用を提供する。
【0077】
本発明はまた、外傷を被ったか、又は手術若しくは出産後に止血の回復若しくはプラスミン活性の阻害を必要とする対象の止血の回復又は過剰なプラスミン活性の阻害を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【0078】
本発明はまた、外傷を被った対象における止血の回復又は過剰なプラスミン活性の阻害を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【0079】
本発明はまた、それを必要とする対象における線維素溶解の阻害を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【0080】
本発明はまた、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の治療又は予防を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【0081】
本発明はまた、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症に起因するか、又はそれと関連するいずれかの病態若しくは疾患の治療、予防又はその重症度の低減を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
【0082】
さらにまた、本発明は、対象における癌の治療又は予防を目的とする薬剤の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用も提供する。この薬剤はまた、癌の転移を含め、癌の伝播若しくは進行を阻害する、予防する、又は最小限にすることも目的とし得る。
【0083】
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【0084】
医薬組成物は、好ましくは、本明細書に記載される使用を目的とする。したがって、本発明は、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）症候群又は血栓溶解誘発性出血に罹患している対象におけるプラスミン活性の阻害を含め、それを必要とする対象におけるプラスミン活性の阻害に使用するための本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【0085】
本発明はまた、外傷を被ったか、或いは手術若しくは出産後に止血の回復又はプラスミン活性の阻害を必要とする対象における止血の回復又は過剰なプラスミン活性の阻害に使用するための医薬組成物も提供する。
【0086】
本発明はまた、外傷を被った対象における止血の回復又は過剰なプラスミン活性の阻害に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【0087】
本発明はまた、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症の治療又は予防に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物も提供する。
【0088】
本発明はまた、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症に起因するか、又はそれと関連するいずれかの病態若しくは疾患の治療、予防又はその重症度の低減に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物も提供する。
【0089】
さらに、本発明は、対象の癌の治療又は予防に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物はまた、癌の転移を含め、癌の伝播若しくは進行を阻害する、予防する、又は最小限にすることも目的とし得る。
【0090】
本発明の任意の態様において、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、レンサ球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する細菌に起因する。好ましくは、細菌は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する。より好ましくは、細菌は、Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）、好ましくは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。本発明の特定の態様では、感染症は、以下：化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、及び肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）からなる群から選択される細菌に起因する感染症であり得る。
【0091】
したがって、本発明の方法、使用又は医薬組成物は、本明細書に示される細菌に起因するか、若しくはそれと関連するいずれかの疾患の治療、予防又はその重症度の低減に有用である。例えば、本発明の方法、使用又は医薬組成物は、Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）に起因するか、若しくはそれと関連するいずれかの疾患／感染症の治療、予防又はその重症度の低減を目的し得るが、こうした疾患／感染症として、限定されないが、咽頭炎、扁桃炎、猩紅熱、蜂窩織炎、丹毒、リウマチ熱、皮膚及び軟組織感染症、心内膜炎、骨関節感染症、インプラント感染、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、壊死性筋膜炎、筋壊死、骨膜下膿瘍、壊死性肺炎、化膿性筋炎、縦隔炎、心筋、腎周囲、肝及び膵膿瘍、敗血症性血栓静脈炎、並びに眼内炎及びリンパ管炎などの重症眼感染症が挙げられる。
【0092】
本発明の方法及び使用は、癌の治療又は予防に適用することができる。癌の例としては、血液癌、上皮性癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、子宮体癌及び卵巣癌が挙げられる。
【0093】
本発明はさらに、本発明の抗原結合タンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
【0094】
本発明はまた、本明細書に記載されるベクター又は核酸分子を含む細胞を提供する。
【0095】
本発明はまた、本明細書に記載される細胞に由来する動物又は組織を提供する。
【0096】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明の抗原結合タンパク質又は医薬組成物を含むキット若しくは製造品を提供する。
【0097】
本発明の他の態様では、本明細書に記載した治療又は予防用途に使用するためのキットが提供され、このキットは、以下：
－本発明の抗原結合タンパク質又は医薬組成物を保持する容器と；
－使用説明を含むラベル若しくはパッケージ挿入物
を含む。
－本発明の抗原結合タンパク質又は医薬組成物を保持する容器と；
－使用説明を含むラベル若しくはパッケージ挿入物
を含む。
【0098】
本明細書において使用される際、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びこの用語の活用形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤、構成要素、整数又は工程を除外するものではない。
【0099】
本発明のさらなる態様及び前の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として及び添付の図面を参照して示される以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0100】
【図1】プラスミノーゲン及びプラスミンに対するＢ１０の結合。Ｂ１０をＮｉＨｃチップ上に固定化し；マルチサイクル表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、Ｂ１０（Ａ）プラスミノーゲン及び（Ｂ）プラスミンの結合キネティクスを測定した。点線は、実験データに当てはめた１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデルフィットを表す。（Ｃ）動力学定数（ｋａ及びｋｄ）及び親和定数（ＫＤ）を示す要約表。
【図2】Ｂ１０によるｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の用量依存的阻害。Ｂ１０は、（Ａ）溶液中のＥＡＣＡの存在下、又は（Ｂ）フィブリン血餅に対して、ｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化により産生されるプラスミンの活性を阻害する。
【図3】Ｂ１０によるＳＫ媒介性プラスミノーゲン活性化の阻害。Ｂ１０は、アッセイの全工程中のどの時点で反応物に添加しても（２０倍モル過剰で）、プラスミン活性を直ちに阻害する。この結果は、Ｂ１０が、プラスミン活性を阻害することを示している。
【図4】プラスミン及び他のセリンプロテアーゼの酵素活性に対するＢ１０の作用。（Ａ）Ｂ１０又は非阻害性プラスミノーゲン結合抗体（Ａ０１）の存在下でのプラスミン活性のプログレス曲線。プラスミン活性は、Ｂ１０の存在下で不検出であった。（Ｂ）Ｂ１０（０～１００ｎＭ）の存在下でプラスミン活性をアッセイしたところ、ＩＣ５０は、２４．３±１．４ｎＭであり；１：１０比のプラスミン及びＢ１０で完全阻害が記録された。（Ｃ）プラスミン（＊）を除いて、Ｂ１０は、セリンプロテアーゼ（ヒト活性化カリクレイン（ＨＰＫａ）、プロテインＣ、第ＩＩａ因子、トロンビン、第Ｘａ因子、ｕＰＡ及びｔＰＡを含む）の酵素活性を阻害しない。ナイーブ抗体ｇＡｂの存在下での酵素の活性も示す。
【図5】Ｂ１０によるプラスミノーゲンのストレプトキナーゼ結合の阻害。（Ａ）Ｂ１０又はナイーブニワトリＡＢ、即ちｇＡｂ（０～５００ｎＭ）の存在下で、ＣＭ４チップに固定化したストレプトキナーゼ上に１０ｎＭプラスミノーゲンを通過させた。Ｂ１０は、濃度６２．５～５００ｎＭで阻害を示した。対照であるナイーブニワトリ抗体ｇＡｂは、ＳＫに対するＰｌｇの結合の阻害を全く示さなかった。（Ｂ）抗体なし対照に対して正規化した、５００ｎＭ Ａｂの存在下でのＳＫに対するプラスミノーゲン結合のパーセンテージ。
【図6】単一組み換えセリンプロテアーゼドメインに対するＢ１０の結合。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＳＰ単独（破線）又はＢ１０単独（点線）と比較して、より高い分子量の複合体（ＳＰ＋Ｂ１０、実線）を示す。
【図7】プラスミンのセリンプロテアーゼドメイン（ＳＰ）と結合したＢ１０の結晶構造。ＳＰ／Ｂ１０二元複合体の結晶構造は、Ｂ１０がプラスミン触媒三残基に結合することを示す。ＳＰが示され、触媒三残基はスティック状に示され、標識されており、Ｂ１０軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）は標識されている。上は、二元複合体のイメージ図であり、下には、前述のように分子内相互作用に関与し、標識された重要な残基（標識及び番号付けされている）を示す。破線を用いて、極性相互作用を示す。
【図8】Ｂ１０は、Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）によるプラスミン産生を阻害する（酵素アッセイ）。（上）Ｂ１０に結合したプラスミノーゲンをＧＡＳと一緒にインキュベートした。産生されたプラスミンの活性を蛍光発生基質で測定した。この場合、ＧＡＳにより産生されたプラスミンは、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）により媒介されると推定される。（下）組み換えＳＫの存在又は非存在下でのプラスミン活性のプログレス曲線。
【図9】Ｂ１０は、合成血餅の繊維素溶解を阻害する。３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、１Ｕのウシトロンビン；及び１０ｎＭのｔＰＡを３７℃で２時間混合することにより調製した、事前形成の合成フィブリン血餅について繊維素溶解を測定した。０～９０Ｍ Ｂ１０；又はα２ＡＰ；又は０～６．２５ｍＭ ＴＸＡと混合した４５ｎＭのプラスミノーゲンを、血餅の表面に添加した。Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒを用いて、線維素溶解を３７℃で最大１０時間モニターした。５０％血餅溶解を達成するのに必要とされた時間をＩＣ５０計算のために使用した。Ｂ１０について得られたＩＣ５０値は、α２ＡＰ及びアプロチニンのそれと同等であった。
【図10】Ｂ１０は、赤血球及び血小板の存在下で全血血餅の溶解を阻害する。血餅溶解のパーセンテージ（陰性及び陽性対照と比較して）は、陽性対照で完全溶解を達成した時点（３０～４０分）での阻害剤濃度の関数として示し、非線形回帰を用いてプロットすることにより、ＩＣ５０を算出する。Ｂ１０は、全血血餅溶解を阻害するのに、α２ＡＰの約８倍有効であり、アプロチニンの約９倍有効である。
【発明を実施するための形態】
【0101】
本明細書において開示され、定義される本発明は、記載されるか又は本文若しくは図面から明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【0102】
本発明のさらなる態様及び前の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として及び添付の図面を参照して示される以下の説明から明らかになるであろう。
【0103】
これより、本発明の特定の実施形態が詳細に言及される。本発明は、実施形態とともに記載されるが、本発明は、本発明をそれらの実施形態に限定しないことが意図されることが理解されよう。むしろ、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替例、変更、及び均等物を包含することが意図される。
【0104】
出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、又は出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）は、手術、傷害若しくは凝固因子障害の重篤若しくは致命的な合併症である。プラスミン媒介性線維素溶解又は血餅溶解を阻害する抗線維素溶解剤は、重度の出血の際の血液喪失、緊急再手術、病的状態及び死亡を低減し得る。
【0105】
抑制されていないプラスミンは、血栓を溶解し（線維素溶解）、凝固因子（フィブリノーゲン、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子）を分解して、凝血を損ない、それにより、出血のリスクを増大する。加えて、抑制されていないプラスミンは、好中球及びマクロファージを活性化させて、走化性及び酸化ストレスを増大すると共に、炎症性サイトカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼの放出も促進する。
【0106】
５０年以上前のその最初の使用以来、小分子プラスミン阻害剤は、出血及び関連する合併症を低減することが証明されている。現在利用可能なプラスミン阻害剤は、典型的に、酵素活性部位を遮断するか、又はプラスミンと基質の相互作用を妨害する小分子の形態である。
【0107】
リシンアナログ、εアミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）及びトラネキサム酸（ＴＸ）は、リシン残基を模倣し、プラスミンクリングル上のリシン結合部位と相互作用して、フィブリンとその相互作用を遮断する。それらの分子サイズ及び作用機構のために、リシンアナログは、効力が低く、特異性もそれほど大きくはなく；それらは、腎臓疾患において蓄積し、血液脳関門及び胎盤を通過する。リシンアナログは、プラスミノーゲン及びｔＰＡがフィブリンと結合するのを阻止することにより、プラスミノーゲン活性化及び線維素溶解を阻害する。同じ機構によって、リシンアナログは、ａ２－アンチプラスミンとのクリングル相互作用を遮断すると共に、溶液中のｔＰＡ又はｕＰＡによるプラスミノーゲン活性化を増大することにより、プラスミン活性を実際に増大し得る。リシンアナログはまた、細胞受容体とプラスミノーゲン－プラスミンの相互作用も妨害して、組織因子とプラスミノーゲンの相互作用を遮断する。リシンアナログと他のクリングル含有タンパク質（ｔＰＡ、（プロ）トロンビン、肝細胞増殖因子、ｕＰＡ、リポタンパク質（ａ）のアポタンパク質）との相互作用の生物学的作用は、十分に理解されていない。リシンアナログは、胎盤及び血液脳関門を通過するため、心臓手術患者にてんかん発作を引き起こし、くも膜下出血患者の脳梗塞を増加させる。
【0108】
主要な臨床試験は、外傷の際の線維素溶解の阻害及び止血の回復における小分子プラスミノーゲン活性化阻害剤の有効性の理解を目標としてきた。これらの試験から、小分子プラスミン阻害剤が、非特異的作用機構、オフターゲット効果、低い効力、及び特定のタイプの出血に対する有効性の欠如によって、制限されることが判明した。特に、ＣＲＡＳＨ－２及びＭＡＴＴＥＲ試験は、リシンアナログのトラネキサム酸（ＴＸＡ）の有効性を検証し、傷害から３時間以内の重症患者にＴＸＡを投与すると、死亡率を有意に低下させることを明らかにした。重要なことには、これらの試験によってまた、ＴＸＡの生存利益が、投与が１５分遅れる毎に１０％ずつ減少し、３時間後には利益が得られなかったことが明らかになった。これは、インビボでの凝血及び線維素溶解プロテオームの変化によるものであり、これが、プラスミンへのｕＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の増大を招くと考えられる。このように、血漿中に産生されたプラスミンは、フィブリノーゲンの分解及びα２－アンチプラスミンの枯渇に起因する非特異的線維素溶解の可能性の増大を招く。したがって、プラスミノーゲン活性化の阻害がもはや有用ではない臨床状況下で使用するためのプラスミン活性部位阻害剤も必要である。
【0109】
特に、既存の治療法が無効であり、一部にはオフターゲット効果のために、それが有害となり得る脳出血などの重篤な、生命を脅かす出血を有する患者において、より高い特異性及び効力を備えた線維素溶解阻害剤が求められる。プラスミンの高度に特異的な触媒阻害剤の作製は、その酵素活性部位が、他のトリプシン様セリンプロテアーゼと有意な相同性を有するために、困難である。例えば、最も一般的に使用されているプラスミン活性部位阻害剤は、アプロチニンである。しかし、この分子は、トリプシン、トロンビン、活性化プロテインＣ、カリクレイン、好中球エラスターゼ及び他のプロテアーゼを含め、多くの他のセリンプロテアーゼの非特異的阻害剤である。アプロチニンは、死亡率増加に伴う安全性の懸念から、米国ではもはや利用可能ではない。したがって、他のセリンプロテアーゼに対して最小限の阻害剤活性を有するプラスミン特異的阻害剤が求められる。
【0110】
本発明者らは、プラスミンに結合し、その触媒活性を阻害又は低減する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を開発した。
【0111】
本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンのセリンプロテアーゼドメインに特異的に結合し、タンパク質の触媒部位との相互作用を介してプラスミン活性を阻害することが実証されている。
【0112】
有利なことに、本発明の抗原結合タンパク質は、ｔＰＡ、トロンビン、トリプシン、第Ｘａ因子及び血漿カリクレインなどの他のセリンプロテアーゼの活性を阻害しない。
【0113】
プラスミンに結合して、その活性を阻害又は低減する能力によって、また本明細書にさらに詳しく説明されるように、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミン及び線維素溶解系によって媒介される病態又は疾患を治療、予防するか、又はその進行を遅延させる上で有用である。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、外傷、又は手術若しくは出産後の出血の止血を促進する上で有用である。
【0114】
本発明の抗原結合タンパク質はまた、細菌が、プラスミン系を動員して、宿主組織の侵入を促進するために、ストレプトキナーゼ、又は関連酵素を利用する細菌感染症を治療又は予防する上でも有用性を有する。特に、本発明の抗原結合タンパク質は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に起因する感染症を治療又は予防するのに有用である。
【0115】
プラスミン系はまた、浸潤腫瘍にも使用されて、血管新生及び転移を促進し得る。したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、炎症性、腫瘍増殖及び転移活性の１つ若しくは複数の側面を阻害又は低減する能力も有する。
【0116】
総論
本明細書全体を通して、特に記載されない限り、又は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、組成物、工程群又は組成物群への言及は、それらの工程、組成物、工程群又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると理解されるものとする。したがって、本明細書において使用される際、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈上特に明記されない限り、複数の態様を含み、逆もまた同様である。例えば、「ａ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「ａｎ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「ｔｈｅ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含むなどである。
本明細書全体を通して、特に記載されない限り、又は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一の工程、組成物、工程群又は組成物群への言及は、それらの工程、組成物、工程群又は組成物群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含すると理解されるものとする。したがって、本明細書において使用される際、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈上特に明記されない限り、複数の態様を含み、逆もまた同様である。例えば、「ａ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「ａｎ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含み；「ｔｈｅ」への言及は、１つ並びに２つ以上を含むなどである。
【0117】
当業者は、本発明が、具体的に記載されるもの以外の変形及び変更を行うことが可能であることを理解するであろう。本発明が、全てのこのような変形及び変更を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及されるか又は示される工程、特徴、組成物及び化合物の全てを、個々に又は集合的に含み、また、前記工程又は特徴のあらゆる組合せ又はいずれか２つ以上を含む。
【0118】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載されるものと類似の又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されるものではない。
【0119】
本明細書において参照される特許及び刊行物は全て、全体が参照により援用される。
【0120】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施例によって範囲が限定されるものではなく、これらの実施例は、例示を意図したものに過ぎない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は、明らかに本発明の範囲内である。
【0121】
本明細書における本発明のいかなる実施例又は実施形態も、特に記載されない限り、本発明の他のいかなる実施例又は実施形態に対しても準用されると理解されるものとする。
【0122】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると理解されるものとする。
【0123】
特に示されない限り、本開示において用いられる組み換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含む）などの出典における文献全体を通して記載され、説明されている。
【0124】
本明細書における可変領域及びその部分、免疫グロブリン、抗体及びその断片の説明及び定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９－３２０，１９９４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３，１９８９及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３，９２７－９４８，１９９７における説明によってさらに明らかになり得る。
【0125】
「及び／又は」、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味に対して明確な裏付けを与えると理解されるものとする。
【0126】
本明細書において使用される際、「に由来する」という用語は、指定された整数が特定の起源から得られ得るが、必ずしもその起源から直接得られるとは限らないことを示すと理解されるものとする。
【0127】
例えば、残基の範囲への本明細書における言及は、その端点を含むものと理解される。例えば、「アミノ酸５６～６５を含む領域」への言及は、その端点を含む方式で理解され、すなわち、この領域は、指定された配列中で５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５と番号付けされたアミノ酸の配列を含む。
【0128】
選択される定義
プラスミンは、細胞遊走、組織再構築、及び細菌侵入に重要な役割を果たす。プラスミンは、トリプシンより高い選択性で、Ｌｙｓ－Ｘａａ及びＡｒｇ－－Ｘａａ結合を優先的に切断するセリンプロテアーゼである。プラスミンは、チモーゲンプラスミノーゲンの活性形態である。プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン上の様々な活性化因子のタンパク質溶解作用によってプラスミンに活性化される。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）又はウロキナーゼ（ｕＰａ）などのプラスミノーゲン活性化因子は、Ａｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２結合でのヒトプラスミノーゲン分子を切断して、活性プラスミンを産生する。その結果生じた２つのプラスミンの鎖は、２つの鎖間ジスルフィド架橋によって一緒に保持される。軽鎖（２５ｋＤａ）は、触媒中心（触媒三残基を含む）を担持し、トリプシン及び他のセリンプロテアーゼと配列類似性を共有する。重鎖（６０ｋＤａ）は、５つの高度に類似した三重ループ構造（クリングルと呼ばれる）から構成される。クリングルのいくつかは、リシン結合部位を含み、これは、フィブリンとのプラスミノーゲン／プラスミン相互作用を媒介する。プラスミンは、ペプチダーゼファミリーＳｉに属する。
プラスミンは、細胞遊走、組織再構築、及び細菌侵入に重要な役割を果たす。プラスミンは、トリプシンより高い選択性で、Ｌｙｓ－Ｘａａ及びＡｒｇ－－Ｘａａ結合を優先的に切断するセリンプロテアーゼである。プラスミンは、チモーゲンプラスミノーゲンの活性形態である。プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン上の様々な活性化因子のタンパク質溶解作用によってプラスミンに活性化される。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）又はウロキナーゼ（ｕＰａ）などのプラスミノーゲン活性化因子は、Ａｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２結合でのヒトプラスミノーゲン分子を切断して、活性プラスミンを産生する。その結果生じた２つのプラスミンの鎖は、２つの鎖間ジスルフィド架橋によって一緒に保持される。軽鎖（２５ｋＤａ）は、触媒中心（触媒三残基を含む）を担持し、トリプシン及び他のセリンプロテアーゼと配列類似性を共有する。重鎖（６０ｋＤａ）は、５つの高度に類似した三重ループ構造（クリングルと呼ばれる）から構成される。クリングルのいくつかは、リシン結合部位を含み、これは、フィブリンとのプラスミノーゲン／プラスミン相互作用を媒介する。プラスミンは、ペプチダーゼファミリーＳｉに属する。
【0129】
プラスミン（又はＰｌｍ）は、Ｐａｐ又はｐａｎ－ａｐｐｌｅドメイン、５つのクリングルドメイン（ＫＲ１～ＫＲ５）及びセリンプロテアーゼ（ＳＰ）ドメインを含む７ドメイン糖タンパク質である。不活性形態、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）は、血漿中を、閉鎖且つ活性化耐性立体構造で循環する。標的部位に局在化すると、プラスミノーゲンは、標的（フィブリン血餅及び細胞表面受容体を含む）上の表面リシン／アルギン残基に結合する。結合は、クリングルドメイン上のリシン－結合部位（ＬＢＳ）を介して起こり、これが、オープン構造へのプラスミノーゲンの再構成をトリガーする事象である。閉鎖構造からオープン構造への変換時に、ＫＲ－５とＳＰドメイン間の活性化ループが露出した状態になり、プラスミノーゲン活性化因子（組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子など）により切断されて、酵素として活性の形態、プラスミン（Ｐｌｍ）を形成する。プラスミノーゲン活性化系は、宿主セリンプロテアーゼ阻害剤：プラスミノーゲン活性化阻害剤１及び２（ＰＡＩ－１及びＰＡＩ－２）により厳密に調節される。標的から放出された活性プラスミンは、典型的に、特異的阻害剤α－２－アンチプラスミン又はハウスキーピング酵素α－２－マクログロブリンにより循環から除去される。
【0130】
本明細書に記載される「プラスミノーゲン」という用語は、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（Ｇｌｕ－Ｐｌｇ）、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン（Ｌｙｓ－Ｐｌｇ）、及びミニ－、ミディ－及びマイクロ－プラスミノーゲンをはじめとするプラスミノーゲンの変異体のいずれかを含む。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、プラスミンによるＧｌｕ－プラスミノーゲンの切断から形成されるＧｌｕ－ＰｌｇのＮ－切断型である。Ｌｙｓ－プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－Ｐｌｇと比較してフィブリンに対する高い親和性を呈示し、ｕＰＡ及びｔＰＡによって、より良好に活性化される。ミディ－プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンのクリングルドメイン４及び５と軽鎖（セリンプロテアーゼドメイン）を含む。これは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンからのクリングルドメイン１～３の切断によって形成される。ミニ－プラスミノーゲン（４４２Ｖａｌ－Ｐｌｇ又はネオプラスミノーゲンとしても知られる）は、Ｇｌｕ－プラスミノーゲンの残基４４２（クリングルドメイン４内に位置する）へのエラスターゼの作用によって生じる。したがって、ミニ－プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンのクリングルドメイン４、クリングルドメイン５及びセリンプロテアーゼドメインを含む。マイクロ－プラスミノーゲンは、ペプチドと、Ｎ末端に結合したクリングル５の数個の残基を連結する区間を有するプラスミノーゲンの酵素前駆体ドメインから構成される。これは、プラスミノーゲンに対するプラスミンの作用によって産生される。したがって、マイクロ－プラスミノーゲン（又はマイクロ－Ｐｌｇ）は、プラスミノーゲンの軽鎖（セリンプロテアーゼドメイン）を含み、クリングルドメインは含まない。（例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７０７１－５を参照）。プラスミノーゲンと同様、マイクロプラスミノーゲンは、ｔＰＡ及びウロキナーゼにより活性化されて、タンパク質分解活性分子を形成する。ヒトマイクロプラスミンは、約２９ｋＤａの分子量を有し、プラスミンと比較して、フィブリンに対し低い親和性を有する。
【0131】
あくまでも命名の目的で、限定はされないが、ヒトプラスミノーゲン（“ｇｌｕ－Ｐｌｇ）の例示的なアミノ酸配列は、配列番号３３に記載される。ｈＰｌｍセリンプロテアーゼドメインを含む配列は、配列番号３４に記載され、ここで、触媒三残基は下線が引かれ、太字で示される。
【0132】
本明細書において使用される場合、プラスミンと言うとき、プラスミンの少なくとも１つの生化学的又は生物物理学的活性を有する分子を指す。プラスミンの生化学的又は生物物理学的活性は、プラスミノーゲンのものから識別することができる。
【0133】
「プラスミン活性を阻害する」又は「プラスミン活性を低減する」という語句は、本発明の抗原結合タンパク質が、プラスミンの酵素活性を阻害又は低減することを意味する。さらに、活性は、好適なインビトロ、細胞又はインビボアッセイを用いて測定され、また、活性は、抗原結合タンパク質を用いないことを除いて同じ条件下の同じアッセイにおけるプラスミン活性と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％若しくはそれ以上、ブロック又は低減される。好ましくは、プラスミン活性は、いずれか１つ又は複数のプラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲンの活性化後に測定する。プラスミノーゲン活性化因子は、Ａｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２結合（番号付けは、ヒトプラスミノーゲンによる）を切断することができる任意の酵素である。例示的なプラスミノーゲン切断セリンプロテアーゼ、したがって、プラスミノーゲン活性化因子としては、凝固タンパク質第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及びプロトロンビン（第ＩＩ因子）、プロテインＣ、キモトリプシン及びトリプシン、様々な白血球エラスターゼ、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、並びにプラスミンが挙げられる。
【0134】
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、由来するその起源又は供給源のため、その天然状態でそれに伴う天然に会合している構成要素と会合しておらず；同じ供給源からの他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質又はポリペプチドである。タンパク質は、当該技術分野において公知のタンパク質精製技術を用いた単離によって、天然に会合している構成要素を実質的に含まない状態にされ、又はそのような単離によって実質的に精製され得る。「実質的に精製された」とは、タンパク質が、汚染物質を実質的に含まず、例えば、少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％、汚染物質が除去されていることを意味する。
【0135】
「組み換え」という用語は、人工的な遺伝子組み換えの産物を意味すると理解されるものとする。したがって、抗体抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質に関して、この用語は、Ｂ細胞成熟中に生じる天然の組み換えの産物である対象の身体内に天然に存在する抗体を包含しない。しかしながら、このような抗体が単離される場合、それは、抗体抗原結合ドメインを含む単離されたタンパク質であると考えられる。同様に、タンパク質をコードする核酸が、組み換え手段を用いて、単離され、発現される場合、得られるタンパク質は、抗体抗原結合ドメインを含む組み換えタンパク質である。組み換えタンパク質はまた、それが細胞、組織又は対象内にあり、例えば、そこでそれが発現される場合、人工的な組み換え手段によって発現されるタンパク質を包含する。
【0136】
「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸、又は互いに共有結合若しくは非共有結合された一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと理解されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を用いて共有結合され得る。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。タンパク質は、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含んでもよい。
【0137】
「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸を意味することが前の段落から理解されるであろう。
【0138】
本明細書において使用される際、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原、すなわち、ＶＨ若しくはＶＬ又はＶＨ及びＶＬの両方を含むＦｖに特異的に結合することが可能な抗体の領域を意味すると理解されるものとする。抗原結合ドメインは、完全抗体の文脈にある必要はなく、例えば、それは、単離されていても（例えば、ドメイン抗体）又は、例えば本明細書に記載されるようにｓｃＦｖなどの別の形態であってもよい。
【0139】
本開示の趣旨では、「抗体」という用語は、Ｆｖ中に含まれる抗原結合ドメインによって１つ又はいくつかの密接に関連する抗原（例えば、プラスミン）に特異的に結合することが可能なタンパク質を含む。この用語は、４鎖抗体（例えば、２つの軽鎖及び２つの重鎖）、組み換え又は修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化（ｄｅ－ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、半抗体、二重特異性抗体）を含む。抗体は、化学修飾、例えば、活性薬剤若しくは放射性標識、又は可溶性を改善するための薬剤とのコンジュゲート、例えば、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合タンパク質のペグ化をさらに含み得る。
【0140】
抗体は、一般に、定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）へと構成され得る定常ドメインを含む。抗体の例示的な形態は、それらの基本単位として４鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合された２つの重鎖（約５０～７０ｋＤ）及び２つの軽鎖（それぞれ約２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は、一般に、可変領域（存在する場合）及び定常ドメインを含み、哺乳動物においては、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は、一般に、可変領域、及びさらなる定常ドメインにヒンジ領域によって連結された１つ又は２つの定常ドメインを含む。哺乳動物の重鎖は、以下のタイプα、δ、ε、γ、又はμのうちの１つのものである。各軽鎖はまた、重鎖の１つに共有結合される。例えば、２つの重鎖並びに重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって結合される。鎖間ジスルフィド結合の数は、抗体のタイプの違いによって変化し得る。各鎖は、Ｎ末端可変領域（それぞれ約１１０アミノ酸長であるＶＨ又はＶＬ）、及びＣ末端に１つ以上の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（約１１０アミノ酸長であるＣＬ）は、重鎖の第１の定常ドメイン（３３０～４４０アミノ酸長であるＣＨ１）と整列され、ジスルフィド結合される。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列される。抗体重鎖は、２つ以上のさらなるＣＨドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３など）を含むことができ、ＣＨ１及びＣＨ２定常ドメインの間にヒンジ領域を含み得る。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。一例において、抗体は、ネズミ科（マウス又はラット）抗体又は霊長類（ヒトなど）抗体である。一例において、抗体重鎖は、Ｃ末端リジン残基が欠落している。一例において、抗体は、ヒト化、合成ヒト化、キメラ、ＣＤＲグラフト化又は脱免疫化抗体である。
【0141】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」又は「完全抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片と対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために、同義的に使用される。具体的には、完全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。
【0142】
本明細書において使用される際、「可変領域」は、抗原に特異的に結合することが可能な、本明細書において定義される抗体の軽鎖及び／又は重鎖の部分を指し、相補性決定領域（ＣＤＲ）；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと一緒に３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択的にＦＲ４）を含む。ＶＨは、重鎖の可変領域を指す。ＶＬは、軽鎖の可変領域を指す。
【0143】
本明細書において使用される際、「相補性決定領域」という用語（同義語はＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、その存在が特異的な抗原結合の主な原因になる、抗体可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲを有する。ＶＨのＣＤＲはそれぞれ、本明細書において、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３とも呼ばれ、ここで、ＣＤＲ Ｈ１が、ＶＨのＣＤＲ １に対応し、ＣＤＲ Ｈ２が、ＶＨのＣＤＲ ２に対応し、ＣＤＲ Ｈ３が、ＶＨのＣＤＲ ３に対応する。同様に、ＶＬのＣＤＲはそれぞれ、本明細書において、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３と呼ばれ、ここで、ＣＤＲ Ｌ１が、ＶＬのＣＤＲ １に対応し、ＣＤＲ Ｌ２が、ＶＬのＣＤＲ ２に対応し、ＣＤＲ Ｌ３が、ＶＬのＣＤＲ ３に対応する。一例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１（本明細書において「Ｋａｂａｔ番号付け方式」とも呼ばれる）に従って定義される。別の例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って定義される。本発明は、Ｋａｂａｔ番号付け方式によって定義されるＦＲ及びＣＤＲに限定されず、標準的な番号付け方式、又はＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３，１９８９；及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８，１９９７；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｋｔｈｕｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０，２００１の番号付け方式；又はＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２０６－２１１ １９９７において説明されるＩＭＧＴ方式を含む、全ての番号付け方式を含む。一例において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従って定義される。任意選択的に、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従う重鎖ＣＤＲ２は、本明細書に列挙される５つのＣ末端アミノ酸を含まないか、又はそれらのアミノ酸のいずれか１つ以上が、別の天然アミノ酸で置換される。これに関して、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：１３３－１３９，１９９５では、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸が一般に抗原結合に関与しないことが確立されている。
【0144】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。ＶＨのＦＲはそれぞれ、本明細書において、ＦＲ Ｈ１、ＦＲ Ｈ２、ＦＲ Ｈ３及びＦＲ Ｈ４とも呼ばれ、ここで、ＦＲ Ｈ１が、ＶＨのＦＲ １に対応し、ＦＲ Ｈ２が、ＶＨのＦＲ ２に対応し、ＦＲ Ｈ３が、ＶＨのＦＲ ３に対応し、ＦＲ Ｈ４が、ＶＨのＦＲ ４に対応する。同様に、ＶＬのＦＲはそれぞれ、本明細書において、ＦＲ Ｌ１、ＦＲ Ｌ２、ＦＲ Ｌ３及びＦＲ Ｌ４と呼ばれ、ここで、ＦＲ Ｌ１が、ＶＬのＦＲ １に対応し、ＦＲ Ｌ２が、ＶＬのＦＲ ２に対応し、ＦＲ Ｌ３が、ＶＬのＦＲ ３に対応し、ＦＲ Ｌ４が、ＶＬのＦＲ ４に対応する。
【0145】
本明細書において使用される際、「Ｆｖ」という用語は、複数のポリペプチドから構成されるか又は単一のポリペプチドから構成されるかにかかわらず、任意のタンパク質を意味すると理解されるものとし、ここで、ＶＬ及びＶＨが会合し、抗原結合ドメインを有する、すなわち、抗原に特異的に結合することが可能な複合体を形成する。抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖中にあり得る。さらに、本発明のＦｖ（並びに本発明の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合し得るか又は結合し得ない複数の抗原結合ドメインを有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片並びに組み換え手段を用いて産生されるこのような断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。いくつかの例において、ＶＨは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に連結されず、及び／又はＶＬは、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結されない。例示的なＦｖを含むポリペプチド又はタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはより高次の複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン、例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインに連結された上記のもののいずれか、例えば、ミニボディが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片からなり、酵素パパインにより完全抗体を消化して、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部からなる断片を生じることによって産生され得、又は組み換え手段を用いて産生され得る。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、完全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖及びＶＨを含む重鎖の一部及び単一の定常ドメインからなる分子を生じることによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片は、このように処理される抗体ごとに得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組み換え手段によって産生され得る。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、その後の還元を伴わずに、完全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂ断片を含む組み換え断片である。「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が好適な可撓性のポリペプチドリンカーによって共有結合された、抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組み換え分子である。
【0146】
本明細書において使用される際、抗原結合部位又はその抗原結合ドメインと、抗原との相互作用に関する「結合する」という用語は、この相互作用が抗原における特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、エピトープ「Ａ」（又は遊離した、非標識の「Ａ」）を含む分子の存在は、標識「Ａ」及びタンパク質を含む反応において、抗体に結合される標識「Ａ」の量を減少させる。
【0147】
本明細書において使用される際、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、本発明の抗原結合タンパク質が、特定の抗原又はそれを発現する細胞と、別の抗原又は細胞より、高い頻度で、より急速に、より長い期間及び／又はより高い親和性で反応又は会合することを意味すると理解されるものとする。例えば、抗原結合タンパク質は、それが他のセリンプロテアーゼなどの他の関連分子に結合するよりも、実質的に高い親和性（例えば、１．５倍又は２倍又は５倍又は１０倍又は２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍～１００倍又は１５０倍又は２００倍）で、プラスミン（例えば、ヒトプラスミン）に結合する。本発明の一例において、抗原結合タンパク質は、関連するセリンプロテアーゼより、少なくとも１．５倍又は２倍以上高い親和性（例えば、５倍又は１０倍又は２０倍又は５０倍又は１００倍又は２００倍）でプラスミン（好ましくはヒト）に「特異的に結合する」。一般に、必ずしもではないが、結合への言及は、特異的結合を意味し、各用語は、他の用語に対する明確な裏付けを与えると理解されるものとする。
【0148】
本明細書において使用される際、「検出可能に結合しない」という用語は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体が、バックグラウンドより１０％、又は８％又は６％又は５％未満高いレベルで候補抗原に結合することを意味すると理解されるものとする。バックグラウンドは、タンパク質の非存在下、及び／又は陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／又は陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合のレベルは、抗原結合タンパク質が固定され、抗原と接触されるバイオセンサー分析（例えばＢｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。
【0149】
本明細書において使用される際、「有意に結合しない」という用語は、ポリペプチドへの本発明の抗原結合タンパク質の結合のレベルが、バックグラウンド、例えば、抗原結合タンパク質の非存在下、及び／又は陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／又は陰性対照ポリペプチドの存在下で検出される結合のレベルより統計的に有意に高くないことを意味すると理解されるものとする。結合のレベルは、抗原結合タンパク質が固定され、抗原と接触されるバイオセンサー分析（例えばＢｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。
【0150】
本明細書において使用される際、「エピトープ」という用語（同義語は「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質が結合する、プラスミンの領域を意味すると理解されるものとする。特に定義されない限り、この用語は、抗原結合タンパク質が接触する特定の残基又は構造に必ずしも限定されるわけではない。例えば、この用語は、抗原結合タンパク質によって接触されるアミノ酸にわたる領域、及びこの領域の外側の５～１０（若しくはそれ以上）又は２～５又は１～３アミノ酸を含む。いくつかの例において、エピトープは、抗原結合タンパク質が折り畳まれるときに互いに近くに配置される一連の不連続なアミノ酸、すなわち、「立体配座エピトープ」を含む。当業者はまた、「エピトープ」という用語が、ペプチド又はポリペプチドに限定されないことを認識するであろう。例えば、「エピトープ」という用語は、糖側鎖、ホスホリル側鎖、又はスルホニル側鎖などの化学的に活性な表面基を含み、及び、特定の例において、特異的な三次元構造的特徴、及び／又は特異的な電荷特性を有し得る。
【0151】
本明細書において使用される際、「疾患」という用語は、正常な機能に対する破壊又は干渉を指し、何らかの特定の疾患に限定されず、疾病又は障害を含む。
【0152】
本明細書において使用される際、「予防すること」、「予防する」又は「予防」という用語は、本発明の抗原結合タンパク質を投与し、それによって、疾患の少なくとも１つの症状の発生を停止するか又は妨げることを含む。この用語は、再発を予防するか又は妨げるための、寛解している対象の処置も包含する。
【0153】
本明細書において使用される際、「治療すること」、「治療する」又は「治療」という用語は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を投与し、それによって、特定の疾病又は疾患の少なくとも１つの症状を低減又は除去することを含む。
【0154】
本明細書において使用される際、「対象」という用語は、ヒト、例えば哺乳動物を含む任意の動物を意味すると理解されるものとする。例示的な対象としては、限定はされないが、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられる。例えば、対象はヒトである。
【0155】
抗体
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質又はプラスミン結合タンパク質は、抗体である。
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質又はプラスミン結合タンパク質は、抗体である。
【0156】
抗体を産生するための方法は、当該技術分野において公知であり、及び／又はＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。一般に、このような方法において、プラスミン（例えば、ヒトプラスミン）若しくはその領域（例えば、細胞外領域）又は免疫原性断片若しくはそのエピトープ又はそれ（すなわち、免疫原）を発現及び提示する細胞は、任意選択的に、任意の好適な又は所望の担体、アジュバント、又は薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化され、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ又はブタに投与される。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹膜内、又は他の公知の経路によって投与され得る。
【0157】
ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。所望の抗体力価を得る必要がある場合、１つ以上のさらなる免疫化が行われ得る。追加免疫及び力価測定のプロセスは、好適な力価が得られるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたとき、免疫された動物から採血し、血清を単離及び貯蔵し、及び／又は動物を用いて、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する。
【0158】
モノクローナル抗体は、本発明によって想定される抗体の１つの例示的な形態である。「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、同じ抗原、例えば、抗原内の同じエピトープに結合することが可能な均一な抗体集団を指す。この用語は、抗体の起源又はそれが作製される方法に関して限定されるものではない。
【0159】
ｍＡｂの産生のために、例えば、上記の米国特許第４１９６２６５号明細書又はＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）において例示される手順などのいくつかの公知の技術のいずれか１つが使用され得る。
【0160】
例えば、好適な動物が、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で免疫原により免疫化される。ウサギ、マウス及びラットなどのげっ歯類が、例示的な動物である。例えば、ネズミ科の抗体を発現しない、ヒト抗体を発現するように遺伝子組み換えされたマウスを用いて、本発明の抗体を産生することもできる（例えば、国際公開第２００２／０６６６３０号パンフレットに記載されるように）。
【0161】
免疫化の後、抗体を産生する能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ産生プロトコルに使用するために選択される。これらの細胞は、脾臓、へんとう腺若しくはリンパ節の生検から、又は末梢血試料から得られる。次に、免疫された動物からのＢ細胞は、一般に免疫原により免疫された動物と同じ種に由来する不死化骨髄腫細胞と融合される。
【0162】
組織培養培地中でヌクレオチドのデノボ合成を阻止する薬剤を含む選択的培地中での培養によって、ハイブリッドが増幅される。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンである。
【0163】
増幅されたハイブリドーマは、例えば、フローサイトメトリー及び／又は免疫組織化学及び／又はイムノアッセイ（例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイなど）によって、抗体特異性及び／又は力価についての機能的選択に供される。
【0164】
或いは、ＭＡｂを分泌する細胞株を産生するため、ＡＢＬ－ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１３，ＵＳＡ）が使用される（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９７：８５－９５，１９９６に記載されるように）。
【0165】
抗体はまた、例えば、米国特許第６３０００６４号明細書及び／又は米国特許第５８８５７９３号明細書に記載されるように、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって産生又は単離され得る。例えば、本発明者らは、ファージディスプレイライブラリーから完全ヒト抗体を単離した。
【0166】
本発明の抗体は、合成抗体であり得る。例えば、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成ヒト化抗体、霊長類化抗体又は脱免疫化抗体である。
【0167】
抗体結合ドメインを含むタンパク質
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」という用語と同義的に使用される）であるか又はそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全て又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号明細書を参照）。
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」という用語と同義的に使用される）であるか又はそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全て又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号明細書を参照）。
【0168】
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、国際公開第９８／０４４００１号パンフレット及び／又は国際公開第９４／００７９２１号パンフレットに記載されるものなどのダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はより高次のタンパク質複合体であるか又はそれを含む。
いくつかの例において、本発明のタンパク質は、国際公開第９８／０４４００１号パンフレット及び／又は国際公開第９４／００７９２１号パンフレットに記載されるものなどのダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はより高次のタンパク質複合体であるか又はそれを含む。
【0169】
例えば、ダイアボディは、２つの会合するポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖が構造ＶＬ－Ｘ－ＶＨ又はＶＨ－Ｘ－ＶＬを含み、ここで、ＶＬが、抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨが、抗体重鎖可変領域であり、Ｘが、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬを会合させる（又はＦｖを形成させる）のに不十分な残基を含むリンカーであるか、又は存在せず、１つのポリペプチド鎖のＶＨが他のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合ドメインを形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することが可能なＦｖ分子を形成する。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖中で同じであり得、又はＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖中で異なり得、それによって、二重特異性ダイアボディ（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）を形成し得る。
【0170】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖におけるＶＨ及びＶＬ領域、並びにｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合して、Ｆｖを形成する）のを可能にするＶＨ及びＶＬの間のポリペプチドリンカーを含むことを認識するであろう。例えば、リンカーは、１２を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖におけるＶＨ及びＶＬ領域、並びにｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合して、Ｆｖを形成する）のを可能にするＶＨ及びＶＬの間のポリペプチドリンカーを含むことを認識するであろう。例えば、リンカーは、１２を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。
【0171】
本発明はまた、ジスルフィド安定化Ｆｖ（又はｄｉＦｖ若しくはｄｓＦｖ）を想定しており、ここで、単一のシステイン残基が、ＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、このシステイン残基はジスルフィド結合によって連結されて、安定なＦｖが生じる。
【0172】
或いは、又はそれに加えて、本発明は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、Ｆｏｓ又はＪｕｎに由来する）によって、非共有結合又は共有結合によって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。或いは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２６３３６７号明細書に記載されるように、２つのｓｃＦｖは、両方のｓｃＦｖが抗原を形成し、抗原に結合することを可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
【0173】
重鎖抗体
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まない限り、多くの他の形態の抗体と構造的に異なる。したがって、これらの抗体は、「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖抗体は、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）中に見られる。
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが軽鎖を含まない限り、多くの他の形態の抗体と構造的に異なる。したがって、これらの抗体は、「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖抗体は、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）中に見られる。
【0174】
従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために、天然重鎖抗体中に存在する可変領域は、一般に、ラクダ科動物抗体において「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲにおいてＶ－ＮＡＲと呼ばれる。
【0175】
ラクダ科動物由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な説明は、特に、以下の参照文献、国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９７／４９８０５号パンフレット及び国際公開第９７／４９８０５号パンフレットに見出される。
【0176】
軟骨魚類由来の重鎖抗体及びその可変領域、並びにそれらの産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な説明は、特に、国際公開第２００５／１１８６２９号パンフレットに見出される。
【0177】
他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質
本発明はまた、
（ｉ）米国特許第５７３１１６８号明細書に記載される「キー・アンド・ホール（ｋｅｙ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載される）；
（ｉｉｉ）化学架橋剤を用いて産生されるヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載される）；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４号に記載される）
などの、他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質を想定している。
本発明はまた、
（ｉ）米国特許第５７３１１６８号明細書に記載される「キー・アンド・ホール（ｋｅｙ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載される）；
（ｉｉｉ）化学架橋剤を用いて産生されるヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載される）；及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４号に記載される）
などの、他の抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質を想定している。
【0178】
タンパク質に対する突然変異
本発明はまた、本明細書に開示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、抗原結合タンパク質又はこれをコードする核酸も提供する。一例において、本発明の抗原結合タンパク質又は核酸は、本明細書に開示される配列と少なくとも約８５％若しくは９０％若しくは９５％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含む。
本発明はまた、本明細書に開示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、抗原結合タンパク質又はこれをコードする核酸も提供する。一例において、本発明の抗原結合タンパク質又は核酸は、本明細書に開示される配列と少なくとも約８５％若しくは９０％若しくは９５％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含む。
【0179】
或いは、又は加えて、抗原結合タンパク質は、いずれかの実施例に従って本明細書に記載されるＶＨ又はＶＬのＣＤＲと少なくとも約８０％若しくは８５％若しくは９０％若しくは９５％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含む。
【0180】
別の例では、本発明の核酸は、いずれかの実施例に従って本明細書に記載される機能を有する抗原結合タンパク質をコードする配列と少なくとも約８０％若しくは８５％若しくは９０％若しくは９５％若しくは９７％若しくは９８％若しくは９９％同一の配列を含む。本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸も包含し、これは、遺伝暗号の縮重のために、本明細書に例示される配列とは異なる。
【0181】
核酸又はポリペプチドの同一性％は、ギャップ作成ペナルティ＝５、及びギャップ伸張ペナルティ＝０．３を有するＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３，１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリー配列は、少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、クエリー配列は、少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、２つの配列は、それらの全長にわたってアラインされる。
【0182】
本発明はまた、本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコードする核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を想定している。「中程度のストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が、２×ＳＳＣ緩衝液中、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中、４５℃～６５℃の範囲の温度で、又は同等の条件で行われるものと本明細書において定義される。「高いストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が、０．１×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中、又はより低い塩濃度で、及び少なくとも６５℃の温度で、又は同等の条件で行われるものと本明細書において定義される。特定のレベルのストリンジェンシーへの本明細書における言及は、当業者に公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を使用する同等の条件を包含する。例えば、二本鎖核酸の鎖が解離する温度（溶融温度、又はＴｍとしても知られている）を計算するための方法は、当該技術分野において公知である。核酸のＴｍと同様（例えば、５℃以内又は１０℃以内）又は等しい温度は、高いストリンジェンシーと考えられる。中程度のストリンジェンシーは、核酸の算出Ｔｍの１０℃～２０℃又は１０℃～１５℃以内であると考えられるべきである。
【0183】
本発明はまた、本明細書に記載される配列と比較して１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む本発明の抗原結合タンパク質の突然変異形態を想定している。いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、１０以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１つの保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖及び／又はハイドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）及び／又は親水性を有するアミノ酸残基で置換されたものである。
【0184】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ハイドロパシーインデックスは、例えば、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５－１３２，１９８２に記載され、親水性インデックスは、例えば、米国特許第４５５４１０１号明細書に記載されている。
【0185】
本発明はまた、非保存的アミノ酸変異を想定している。例えば、荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸による置換、及び中性又は正荷電アミノ酸による置換が特に興味深い。いくつかの例において、抗原結合タンパク質は、１０以下、例えば、９又は８又は７又は６又は５又は４又は３又は２又は１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
【0186】
一例において、突然変異は、本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインのＦＲ内で生じる。別の例において、突然変異は、本発明の抗原結合タンパク質のＣＤＲ内で生じる。
【0187】
抗原結合タンパク質の突然変異形態を産生するための例示的な方法としては、以下のものが挙げられる：
・ＤＮＡの突然変異誘発（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３０９－３２２，２００９）又はＲＮＡ（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：１６３－１６８，２００６；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１８，２００７；及び国際公開第１９９９／０５８６６１号パンフレット）；
・ポリペプチドをコードする核酸の、突然変異誘発細胞への導入、例えば、ＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
・ＤＮＡシャッフリング（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－９１，１９９４に開示される）；並びに
・部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ）ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載される）。
・ＤＮＡの突然変異誘発（Ｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２５：３０９－３２２，２００９）又はＲＮＡ（Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：１６３－１６８，２００６；Ｋｏｐｓｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：１８，２００７；及び国際公開第１９９９／０５８６６１号パンフレット）；
・ポリペプチドをコードする核酸の、突然変異誘発細胞への導入、例えば、ＸＬ－１Ｒｅｄ、ＸＬ－ｍｕｔＳ及びＸＬ－ｍｕｔＳ－Ｋａｎｒ細菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
・ＤＮＡシャッフリング（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－９１，１９９４に開示される）；並びに
・部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（ｅｄ）ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（ｅｄ）（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載される）。
【0188】
本発明の突然変異体抗原結合タンパク質の生物学的活性を決定するための例示的な方法は、当業者に明らかであり、及び／又は、例えば、抗原結合について本明細書に記載される。例えば、抗原結合、結合の競合阻害、親和性、会合、解離及び治療効果を決定するための方法は、本明細書に記載される。
【0189】
定常領域
本発明は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載される抗原結合タンパク質及び／又は抗体を包含する。これは、Ｆｃに融合された抗体の抗原結合断片を含む。
本発明は、抗体の定常領域を含む、本明細書に記載される抗原結合タンパク質及び／又は抗体を包含する。これは、Ｆｃに融合された抗体の抗原結合断片を含む。
【0190】
本発明のタンパク質を産生するのに有用な定常領域の配列は、いくつかの異なる供給源から入手され得る。いくつかの例において、タンパク質の定常領域又はその部分は、ヒト抗体に由来する。定常領域又はその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプを含む任意の抗体クラスに由来し得る。一例において、定常領域は、ヒトアイソタイプＩｇＧ４又は安定化ＩｇＧ４定常領域である。
【0191】
一例において、定常領域のＦｃ領域は、例えば、天然又は野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３ Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能を誘導する低減された能力を有する。一例において、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。タンパク質を含むＦｃ領域のエフェクター機能のレベルを評価するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
【0192】
一例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域（即ち、ＩｇＧ４定常領域）、例えば、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域である。好適なＩｇＧ４ Ｆｃ領域の配列は、当業者に明らかであり、及び／又は一般公開されているデータベースにおいて入手可能である（例えば、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手可能である）。
【0193】
一例において、定常領域は、安定化ＩｇＧ４定常領域である。「安定化ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換又はＦａｂアーム交換若しくは半抗体の形成を被る傾向又は半抗体を形成する傾向を低減するように修飾されたＩｇＧ４定常領域を意味すると理解されよう。「Ｆａｂアーム交換」は、ヒトＩｇＧ４のタンパク質修飾の１タイプを指し、この場合、ＩｇＧ４重鎖及び結合した軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子からの重鎖－軽鎖ペアと交換される。したがって、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを取得し得る（その結果、二重特異性分子が生じる）。Ｆａｂアーム交換は、インビボで天然に起こり、精製血液細胞又は還元型グルタチオンなどの還元剤によりインビトロで誘導することができる。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が解離して、各々が単一重鎖と単一軽鎖を含む２つの分子を形成するとき形成する。
【0194】
一例において、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７ ａｎｄ／ｏｒ １９９１）に従って、ヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む。この位置は、ＥＵ番号付け方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１及びＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５，１９６９）に従って、ヒンジ領域の２２８位に対応する。ヒトＩｇＧ４の場合、この残基は、一般にセリンである。プロリンをセリンで置換した後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含む。これに関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、Ｆｃ及びＦａｂ領域を連結する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であり、それが、抗体の２つのＦａｂアームに可動性を付与することは認識されよう。ヒンジ領域は、システイン残基を含み、これらの残基は、重鎖間ジスルフィド結合に関与する。これは、一般に、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従い、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６～Ｐｒｏ２４３の区間として定義されている。同じ位置に重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域をＩｇＧ１配列とアラインメントすることができる（例えば、国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレットを参照）。
【0195】
安定化されたＩｇＧ４抗体の別の例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の４０９位（ＥＵ番号付け方式に従って）のアルギニンが、リシン、トレオニン、メチオニン、又はロイシンで置換された抗体である（例えば、国際公開第２００６／０３３３８６号パンフレットに記載される通り）。加えて、又は代替的に、定常領域のＦｃ領域は、４０５（ＥＵ番号付け方式に従って）に対応する位置に、以下：アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選択される残基を含む。任意選択的に、ヒンジ領域は、２４１位にプロリン（即ち、ＣＰＰＣ配列）を含む（前述した通り）。
【0196】
別の例において、Ｆｃ領域は、低下したエフェクター機能を有するように修飾された領域、すなわち、「非免疫刺激性Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０及び３３１からなる群から選択される１つ以上の位置に置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。別の例において、Ｆｃ領域は、以下の変異Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａの１つ以上、及びＧ２３６の欠失、及び／又は以下の変異Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓの１つ以上を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域である（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３－２６２４，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４，２００１）。非免疫刺激性Ｆｃ領域のさらなる例が、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７ ：１１２９－１１３８ ２００６；及び／又はＨｅｚａｒｅｈ Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７５：１２１６１－１２１６８，２００１）に記載されている。
【0197】
別の例において、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４抗体由来の少なくとも１つのＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１抗体由来の少なくとも１つのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、ここで、Ｆｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９及び４２７（ＥＵ番号付け）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置に置換を含む（例えば、国際公開第２０１０／０８５６８２号パンフレットに記載される）。例示的な置換としては、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、及び４２７Ｆが挙げられる。
【0198】
さらなる修飾
本発明はまた、Ｆｃ領域又は定常領域を含む抗体又は抗原結合タンパク質へのさらなる修飾を想定している。
本発明はまた、Ｆｃ領域又は定常領域を含む抗体又は抗原結合タンパク質へのさらなる修飾を想定している。
【0199】
例えば、抗体は、タンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、抗体は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、より低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、それにより、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する。一例において、Ｆｃ領域は、約ｐＨ７．４におけるその親和性と比較して、約ｐＨ６においてＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、それにより、細胞のリサイクリング後の血液中へのＦｃの再放出を促進する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを減少させることによって、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
【0200】
例示的なアミノ酸置換としては、ＥＵ番号付け方式に従って、Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ又はＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６Ｆ又はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ又はＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含む。さらなる又は代替的なアミノ酸置換は、例えば、米国特許出願公開第２００７０１３５６２０号明細書又は米国特許第７０８３７８４号明細書に記載されている。
【0201】
タンパク質の産生
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、例えば、本明細書に記載され、及び／又は当該技術分野において公知であるように、タンパク質を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養することによって産生される。
一例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、例えば、本明細書に記載され、及び／又は当該技術分野において公知であるように、タンパク質を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養することによって産生される。
【0202】
組み換え発現
別の例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、組み換え型である。
別の例において、いずれかの実施例に従う本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、組み換え型である。
【0203】
組み換えタンパク質の場合、それをコードする核酸が、発現構築物又はベクターへとクローニングされ得、次に、それが、タンパク質を本来産生しない宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えばシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は骨髄腫細胞へとトランスフェクトされる。タンパク質を発現するために使用される例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成する分子クローニング技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂を含む）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が、組み換え核酸の構築に好適である。組み換え抗体を産生する方法も、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４８１６５６７号明細書又は米国特許第５５３０１０１号明細書を参照されたい。
【0204】
単離の後、核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は無細胞系若しくは細胞内における発現のために、発現構築物におけるプロモーター又は発現ベクターに作動可能に連結されて挿入される。
【0205】
本明細書において使用される際、「プロモーター」という用語は、その最も広義に解釈されるべきであり、ＴＡＴＡボックス又は開始要素を含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、それは、例えば、発生及び／又は外部刺激に応答して、又は組織特異的に、核酸の発現を変化させるさらなる調節要素（例えば、上流側活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を伴うか又は伴わずに、正確な転写開始のために必要とされる。本明細書の文脈において、「プロモーター」という用語はまた、それが作動可能に連結された核酸の発現を付与し、活性化し、若しくは強化する、組み換え、合成若しくは融合核酸、又はその誘導体を表すために使用される。例示的なプロモーターは、さらに発現を強化し、及び／又は前記核酸の空間的発現及び／又は時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的な調節要素のさらなるコピーを含有し得る。
【0206】
本明細書において使用される際、「作動可能に連結された」という用語は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように、核酸に対してプロモーターを配置することを意味する。
【0207】
細胞における発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は、一般に、限定はされないが、以下のものの１つ以上を含む：シグナル配列、タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書において提供される情報から得られる）、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配列を認識するであろう。例示的なシグナル配列としては、原核生物の分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母の分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、又は酸ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【0208】
哺乳動物細胞において活性な例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α－ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β－アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター又はその活性断片を含むハイブリッド調節要素が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【0209】
例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む群から選択される酵母細胞などの酵母細胞における発現に好適な典型的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、又はＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。
【0210】
単離された核酸又はそれを含む発現構築物を、発現のために細胞に導入するための手段は、当業者に公知である。所与の細胞に使用される技術は、公知の確立された技術に依存する。組み換えＤＮＡを細胞に導入するための手段としては、特に、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び／又はセルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）などを用いてリポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧに媒介されるＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション及びＤＮＡ被覆タングステン又は金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）などを用いた微小粒子衝撃が挙げられる。
【0211】
タンパク質を産生するのに使用される宿主細胞は、使用される細胞のタイプに応じて、様々な培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、哺乳動物細胞を培養するのに好適である。本明細書に記載される他の細胞タイプを培養するための培地は、当該技術分野において公知である。
【0212】
タンパク質の単離
タンパク質を単離するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
タンパク質を単離するための方法が、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。
【0213】
抗原結合タンパク質が、培養培地に分泌される場合、このような発現系からの上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記の工程のいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、付随的な汚染物質の増殖を防止するために含まれてもよい。或いは、又はそれに加えて、上清は、例えば、連続遠心分離を用いて、タンパク質を発現する細胞からろ過され、及び／又は分離され得る。
【0214】
細胞から調製される抗原結合タンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー又はプロテインＧクロマトグラフィー）、又は上記の任意の組合せを用いて精製され得る。これらの方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開第９９／５７１３４号パンフレット又はＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。
【0215】
当業者はまた、タンパク質が、精製又は検出を容易にするためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、又はシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、又はＦＬＡＧタグ、又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように修飾され得ることを認識するであろう。次に、得られたタンパク質は、アフィニティ精製などの、当該技術分野において公知の方法を用いて精製される。例えば、ヘキサｈｉｓタグを含むタンパク質は、タンパク質を含む試料を、固体又は半固体の担体に固定された、ヘキサｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）と接触させ、試料を洗浄して、非結合タンパク質を除去し、その後、結合したタンパク質を溶離することによって精製される。或いは、又はそれに加えて、タグに結合するリガンド又は抗体が、アフィニティ精製方法において使用される。
【0216】
抗原結合タンパク質の活性のアッセイ
プラスミン及びその突然変異体への結合
本発明の抗原結合タンパク質がプラスミンに結合することは、本明細書における開示から当業者に明らかであろう。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている。このような方法は、一般に、抗原結合部位を固定し、それを標識抗原（プラスミン）と接触させることを必要とする。洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、標識の量及び、結果として、結合した抗原が検出される。当然ながら、抗原結合タンパク質を標識し、抗原を固定化してもよい。パニングタイプのアッセイも使用され得る。或いは、又はそれに加えて、表面プラズモン共鳴アッセイが使用され得る。
プラスミン及びその突然変異体への結合
本発明の抗原結合タンパク質がプラスミンに結合することは、本明細書における開示から当業者に明らかであろう。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている。このような方法は、一般に、抗原結合部位を固定し、それを標識抗原（プラスミン）と接触させることを必要とする。洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、標識の量及び、結果として、結合した抗原が検出される。当然ながら、抗原結合タンパク質を標識し、抗原を固定化してもよい。パニングタイプのアッセイも使用され得る。或いは、又はそれに加えて、表面プラズモン共鳴アッセイが使用され得る。
【0217】
任意選択的に、プラスミン又はそのエピトープに対する、固定された抗原結合タンパク質の解離定数（Ｋｄ）、会合定数（Ｋａ）及び／又は親和定数（ＫＤ）が決定される。プラスミン結合タンパク質の「Ｋｄ」又は「Ｋａ」又は「ＫＤ」は、一例において、放射性標識又は蛍光標識されたプラスミンリガンド結合アッセイによって測定される。「Ｋｄ」の場合、このアッセイは、非標識プラスミンの滴定系列の存在下で、最小濃度の標識プラスミン又はそのエピトープにより抗原結合タンパク質を平衡させる。洗浄して、非結合プラスミン又はそのエピトープを除去した後、タンパク質のＫｄの指標である標識の量が決定される。
【0218】
別の例によれば、Ｋｄ、Ｋａ又はＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、例えば、固定化プラスミン又はその領域又は固定化抗原結合タンパク質を有するＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定される。
【0219】
阻害活性の測定
本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、プラスミン活性を阻害することができる。有利なことに、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミン活性の生理学的阻害剤又はプラスミン活性の病理学的阻害剤と同等レベルか、又はそれより有意に高いレベルで、プラスミン媒介性血餅溶解を阻害する。
本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、プラスミン活性を阻害することができる。有利なことに、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミン活性の生理学的阻害剤又はプラスミン活性の病理学的阻害剤と同等レベルか、又はそれより有意に高いレベルで、プラスミン媒介性血餅溶解を阻害する。
【0220】
プラスミン活性を阻害又は低減するタンパク質の能力を評価するための様々なアッセイが、当該技術分野において公知である。
【0221】
一例において、抗原結合タンパク質は、プラスミンによるいずれかの基質のタンパク質溶解を阻害する。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに結合して、セリンプロテアーゼドメインによるプラスミン基質の結合及び／又は切断を阻止する。好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンの触媒三残基に結合するか、又はそれを立体遮蔽することによって、触媒三残基が、プラスミン基質を切断することができないようにするが、この場合、触媒三残基は、配列番号３３の残基Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６及びＡｌａ／Ｓｅｒ７４１（キモトリプシン番号付けを用いて、Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ１０２及びＳｅｒ１９５に相当する）を含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、抗触媒抗原結合タンパク質である。
【0222】
好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンのいずれか公知の基質の切断を阻害又は阻止するが、そうした基質として、限定されないが、以下：フィブリン、フィブリノーゲン、第Ｖ、ＶＩＩＩ及びＸ因子、プロテアーゼ－活性化受容体Ｉ、フィブロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、ビトロネクチン、プロ脳由来神経栄養因子、補因子Ｃ３及びＣ５、テネイシン、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｉｎ）、ＣＵＢドメイン含有タンパク質１及びコラゲナーゼなどの他のプロテアーゼが挙げられる。
【0223】
本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミンに対するストレプトキナーゼの結合を阻害するか、又はストレプトキナーゼと類似の機構でプラスミンに結合する病原体由来タンパク質の結合を阻害し得る。より具体的には、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）により分泌されるストレプトキナーゼは、プラスミノーゲン／プラスミンのセリンプロテアーゼドメインを包み込み、一旦結合すると、プラスミノーゲンを活性化して、プラスミンを形成することは公知である。本発明の抗原結合タンパク質は、有利なことに、ストレプトキナーゼがプラスミンのセリンプロテアーゼドメインと結合するのを阻害し、それによって、ストレプトキナーゼによるプラスミノーゲン活性化に媒介されるプラスミン活性を阻害する。
【0224】
プラスミン活性の阻害を測定するための例示的な方法は、例えば、実施例２、５及び６に記載される。
【0225】
本発明の抗原結合タンパク質はまた、生体サンプル中のプラスミン及び／又はプラスミノーゲンの検出が必要な用途においても有用である。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、組織学及びＥＬＩＳＡに上記タンパク質が用いられる場合を含む診断用途、並びに抗原結合タンパク質と標的タンパク質との結合が、有用な診断情報を提供し得る類似の用途について有用となり得る。
【0226】
治療される病態
本発明の抗原結合タンパク質は、手術、傷害後の出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、若しくは出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）の最小化若しくは低減、又は凝固因子障害を有する個体に有用である。このような状況での抗原結合タンパク質の使用によって、プラスミン媒介性線維素溶解又は血餅溶解を阻害し、それにより、血液喪失を低減するとともに、輸血の必要性を低減若しくは最小限にする。輸血は、不適合、アレルギー反応、多臓器機能不全及び感染の高いリスクを伴い、罹患率及び死亡率の増加を招く。
本発明の抗原結合タンパク質は、手術、傷害後の出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、若しくは出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）の最小化若しくは低減、又は凝固因子障害を有する個体に有用である。このような状況での抗原結合タンパク質の使用によって、プラスミン媒介性線維素溶解又は血餅溶解を阻害し、それにより、血液喪失を低減するとともに、輸血の必要性を低減若しくは最小限にする。輸血は、不適合、アレルギー反応、多臓器機能不全及び感染の高いリスクを伴い、罹患率及び死亡率の増加を招く。
【0227】
本発明の抗原結合タンパク質はまた、血友病、月経過多、フォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）症候群及び血栓溶解誘発性出血などの他の病態における出血を予防するために使用することもできる。
【0228】
本発明の抗原結合タンパク質は、心臓手術、整形手術、脳神経外科手術、肝臓移植、血管手術、胸部手術、婦人科手術を受けた患者、又は末期腎疾患、分娩前後の出血、胃腸の出血、外傷、外傷性脳損傷、脳内出血及びくも膜下出血を有する患者の出血の低減を含め、いくつかの臨床的症状における線維素溶解の阻害に有用である。言い換えれば、本発明の抗原結合タンパク質は、線溶亢進状態にある個体におけるプラスミンの阻害に有用である。
【0229】
したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、プラスミン活性の阻害が必要とされる非常に多様なシナリオにおける線維素溶解の阻害に有用である。
【0230】
本発明の抗原結合部位はまた、ストレプトキナーゼ及び関連酵素によりそれらの発病を媒介する細菌の存在若しくはその増加したレベルに関連する、若しくはそれに起因するいずれかの病態の治療又は予防にも有用である。
【0231】
化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、又はＡ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）は、通性、グラム陽性球菌であり、これらは、鎖状に成長し、ヒトにおいて様々な感染症を引き起こすが、そうした感染症として、咽頭炎、扁桃炎、猩紅熱、蜂窩織炎、丹毒、リウマチ熱、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、壊死性筋膜炎、筋壊死及びリンパ管炎が挙げられる。
【0232】
このように、本発明の抗原結合タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）又は肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に起因する皮膚の色素沈着過度若しくは炎症、膿痂疹、咽頭炎、扁桃炎、猩紅熱、蜂窩織炎、丹毒、リウマチ熱、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、壊死性筋膜炎、筋壊死及びリンパ管炎を阻害又は予防するのに有用である。
【0233】
本発明の抗原結合タンパク質はまた、腫瘍の転移（これも、プラスミン系を動員することがわかっている）を阻害する上でも有用である。本発明の抗原結合タンパク質で治療が可能な癌の例として、嚢胞性及び固形腫瘍、骨及び軟組織腫瘍があり、そうしたものとして、肛門組織、胆管、膀胱、血液細胞、腸、脳、乳房、カルチノイド、子宮頸部、眼、食道、頭部及び頸部、腎臓、喉頭、白血病、肝臓、肺、リンパ節、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、骨髄腫、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚（例えば、扁平上皮癌）、肉腫、胃、精巣、甲状腺、膣、外陰部における腫瘍が挙げられる。軟組織腫瘍として、良性シュワン腫モノソミー、デスモイド腫瘍、脂肪芽腫、脂肪腫、子宮平滑筋腫、明細胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫、粘液型脂肪肉腫、胞巣状横紋筋肉腫及び滑膜肉腫が挙げられる。具体的な骨腫瘍としては、非化骨性線維腫、単房骨嚢胞、内軟骨腫、動脈瘤様骨嚢腫、骨芽細胞腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、骨形成性線維腫及びアダマンチノーマ、骨巨細胞腫、線維性骨異形成症、ユーイング肉腫、好酸球肉芽腫、骨肉腫、軟骨腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫並びに転移性癌腫が挙げられる。白血病には、急性リンパ芽球性、急性骨髄芽球性、慢性リンパ芽球性及び慢性骨髄腫白血病が含まれる。
【0234】
他の例として、乳腺腫瘍、大腸腫瘍、腺癌、中皮腫、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、生殖細胞腫瘍、肝細胞癌／胆管、癌腫、神経内分泌腫瘍、下垂体部腫瘍、小２０円形細胞腫瘍、扁平上皮癌、黒色腫、異型線維黄色腫、セミノーマ、非セミノーマ、間質性ライディッヒ細胞腫、セルトリ細胞腫、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、口腔腫瘍、膀胱腫瘍、骨腫瘍、子宮頸部腫瘍、食道腫瘍、喉頭部腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、膣腫瘍及びウィルムス腫瘍が挙げられる。
【0235】
組成物
いくつかの例において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、経口的に、非経口的に、吸入スプレー、吸着、吸収によって、局所（スプレー又はローションを含む）、直腸内、鼻腔内、口腔、膣内、脳室内で、埋め込まれたリザーバを介して、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を含む投与製剤として、又は任意の他の好都合な剤形によって投与され得る。本明細書において使用される際の「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。
いくつかの例において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、経口的に、非経口的に、吸入スプレー、吸着、吸収によって、局所（スプレー又はローションを含む）、直腸内、鼻腔内、口腔、膣内、脳室内で、埋め込まれたリザーバを介して、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を含む投与製剤として、又は任意の他の好都合な剤形によって投与され得る。本明細書において使用される際の「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。
【0236】
対象への投与のための好適な形態（例えば医薬組成物）に、抗原結合タンパク質を調製するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）及びＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８４）に記載される方法が挙げられる。
【0237】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与又は器官若しくは関節の内腔若しくは管腔への投与に特に有用である。投与のための組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、例えば水性担体に溶解された抗原結合タンパク質の溶液を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などが使用され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの、生理学的条件を模倣するのに必要とされる薬学的に許容される助剤を含有し得る。これらの製剤における本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、幅広く変化し得、選択される具体的な投与方法及び患者のニーズに応じて、主に、液量、粘度、体重などに基づいて選択される。例示的な担体としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルも使用され得る。リポソームも担体として使用され得る。ビヒクルは、等張性及び化学安定性を強化する少量の添加剤、例えば、緩衝液及び保存剤を含有し得る。
【0238】
本発明の抗原結合タンパク質は、局部又は局所投与、例えば、治療を必要とする皮膚若しくは組織への局所適用のために製剤化することができる。局所適用のための製剤は、典型的に、別の任意の成分とともに、又はそれなしで、有効薬剤と組み合わせた局所ビヒクルを含む。本発明の医薬組成物は、局所投与用のスプレー、クリーム、ゲル、ローションなどの形態であってよい。
【0239】
好適な局所ビヒクル及び追加の成分は、当技術分野で公知であり、ビヒクルの選択が、具体的な物理的形態及び送達方法に左右され得ることは明らかであろう。局所用ビヒクルとしては、有機溶媒、例えば、アルコール（例えば、エタノール、イソ－プロピルアルコール若しくはグリセリン）、ブチレン、イソプレン若しくはプロピレングリコールなどのグリコール、ラノリンなどの脂肪族アルコール、水と有機溶媒の混合物、並びにアルコールなどの有機溶媒とグリセリンの混合物、脂肪酸、アシルグリセロール（鉱油などの油、及び天然若しくは合成の脂肪を含む）、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド及びワックスといった脂質ベースの材料、コラーゲン及びゼラチンなどのタンパク質ベースの材料、シリコーンベースの材料（不揮発性及び揮発性の両方）、並びにマイクロスポンジ及びポリマーマトリックスなどの炭化水素ベースの材料が挙げられる。
【0240】
組成物は、さらに、適用される製剤の安定性又は有効性を改善するように構成される１つ若しくは複数の成分、例えば、安定剤、懸濁剤、乳化剤、粘度調整剤、ゲル化剤、保存料、抗酸化剤、皮膚透過増強剤、保湿剤及び持続放出材料を含有してもよい。こうした成分の例は、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ－Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ １９９３）及びＭａｒｔｉｎ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。製剤は、マイクロカプセル、例えば、ヒドロキシルメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子又はナノカプセルを含む。
【0241】
局所製剤は、例えば、固体、ペースト、クリーム、フォーム、ローション、ゲル、粉末、水性液体、エマルジョン、スプレー及び皮膚パッチを含む多種多様な物理的形態で調製してよい。こうした形態の物理的な外観及び粘度は、製剤中に存在する乳化剤及び粘度調整剤の存在及び量に決定することができる。固体は、概して硬質、且つ注入不可能で、一般的に、バー若しくはスティック、又は特定の形状に製剤化される。固体は、不透明又は透明であってよく、任意選択的に、溶媒、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、芳香剤、染料／着色料、保存料、及び最終製品の有効性を増大若しくは増強する他の有効成分を含有してもよい。クリーム及びローションは、往々にして互いに類似しており、主にその粘度が異なる。ローション及びクリームはいずれも不透明、半透明若しくは透明であってよく、多くの場合、乳化剤、溶媒、及び粘度調整剤、並びに保湿剤、皮膚軟化剤、芳香剤、染料／着色料、保存料、及び最終製品の有効性を増大若しくは増強する他の有効成分を含有する。ゲルは、強若しくは高粘度から弱若しくは低粘度まで、様々な粘度で調製することができる。これらの製剤は、ローション及びクリームの製剤と同様に、溶媒、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、芳香剤、染料／着色料、保存料、及び最終製品有効性を増大若しくは増強する他の有効成分を含有してもよい。液体は、クリーム、ローション、又はゲルよりも薄く、多くの場合、乳化剤を含有しない。液体局所製剤は、多くの場合、溶媒、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、芳香剤、染料／着色料、保存料、及び最終製品の有効性を増大若しくは増強する他の有効成分を含有する。
【0242】
局所製剤に使用される乳化剤として、限定されないが、イオン性乳化剤、セテアリルアルコール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルのようなノニオン性乳化剤、ステアリン酸ＰＥＧ－４０、セテアレス－１２、セテアレス－２０、セテアレス－３０、セテアレスアルコール、ステアリン酸ＰＥＧ－１００及びステアリン酸グリセリルが挙げられる。好適な粘度調整剤として、限定されないが、保護コロイド又はノニオン性ガム、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、キサンタンガム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、シリカ、マイクロクリスタリンワックス、蜜蝋、パラフィン、及びパルミチン酸セチルが挙げられる。ゲル組成物は、キトサン、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリクオタニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍｓ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー又はグリチルリチン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎａｔｅ）などのゲル化剤の添加により形成することができる。好適な界面活性剤として、限定されないが、ノニオン性、両性、イオン性及びカチオン性界面活性剤が挙げられる。例えば、ジメチコンコポリオール（ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎｅ ｃｏｐｏｌｙｏｌ）、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウラミドＤＥＡ，コカミドＤＥＡ、及びコカミドＭＥＡ、オレイルベタイン、コカミドプロピルホスファチジルＰＧ－ジモニウムクロライド（ＰＧ－ｄｉｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、及びラウレス硫酸アンモニウムの１つ又は複数を局所製剤中に用いることができる。
【0243】
保存料として、限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、安息香酸、及びホルムアルデヒドなどの抗菌薬、さらには物理的安定剤並びにビタミンＥ、アスコルビン酸ナトリウム／アスコルビン酸及び没食子酸プロピルなどの抗酸化剤が挙げられる。好適な保湿剤として、限定されないが、乳酸及び他のヒドロキシ酸並びにそれらの塩、グリセリン、プロピレングリコール、及びブチレングリコールが挙げられる。好適な皮膚軟化剤としては、ラノリンアルコール、ラノリン、ラノリン誘導体、コレステロール、ワセリン、ネオペンタン酸イソステアリル及び鉱油が挙げられる。好適な芳香剤及び着色料として、限定されないが、ＦＤ＆ＣレッドＮｏ．４０及びＦＤ＆ＣイエローＮｏ．５が挙げられる。局所製剤に含有させることができる他の好適な追加成分として、限定されないが、研磨剤、吸湿剤、固化防止剤、消泡剤、帯電防止剤、収斂剤（例えば、ウィッチヘーゼル（ｗｉｔｃｈ ｈａｚｅｌ））、アルコール及びカモミールエキスなどのハーブエキス、結合剤／賦形剤、緩衝剤、キレート化剤、フィルム形成剤、品質改良剤、高圧ガス、不透明化剤、ｐＨ調節剤及び保護剤が挙げられる。
【0244】
局所用組成物の典型的な送達方法は、指を用いる塗布、布、ティッシュ、綿棒、スティック又はブラシのような物理的な塗布具を用いる塗布、霧、エアロゾル又は泡のスプレーを含むスプレー、点滴投与、散布、浸漬、及びすすぎが挙げられる。さらに、制御放出ビヒクルを使用することもでき、また、経皮投与（例えば、経皮パッチとして）用に組成物を製剤化してもよい。
【0245】
製剤化の後、本発明の抗原結合タンパク質は、投与製剤と適合する方法で、及び治療的／予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上述される注射剤のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、他の薬学的に許容される形態、例えば、錠剤、丸薬、カプセル若しくは経口投与用の他の固体、坐薬、ペッサリー、点鼻液若しくはスプレー、エアゾール、吸入剤、リポソーム形態、ゲル、クリーム、スプレーなども考えられる。医薬用の「持続放出」カプセル又は組成物も使用され得る。持続放出製剤は、一般に、長期間にわたって一定の薬物レベルを与えるように設計され、本発明の抗原結合タンパク質を送達するのに使用され得る。
【0246】
国際公開第２００２／０８０９６７号パンフレットには、例えば、喘息の治療のための抗体を含むエアロゾル化された組成物を投与するための組成物及び方法が記載されており、それは、本発明の抗原結合タンパク質の投与にも好適である。
【0247】
投与量及び投与時期
本発明の抗原結合タンパク質の好適な投与量は、具体的な抗原結合タンパク質、治療される疾患及び／又は治療される対象に応じて変化する。好適な投与量を決定することは熟練した医師の能力の範囲内であり、例えば、最適量以下の投与量から開始し、最適又は有用な投与量を決定するために投与量を徐々に変更することによってなされる。或いは、治療／予防のための適切な投与量を決定するために、細胞培養アッセイ又は動物試験からのデータが使用され、ここで、好適な用量は、ほとんど又は全く毒性を有さない活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。治療的／予防的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定される際にＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する化合物の濃度又は量）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本発明の抗原結合タンパク質の好適な投与量は、具体的な抗原結合タンパク質、治療される疾患及び／又は治療される対象に応じて変化する。好適な投与量を決定することは熟練した医師の能力の範囲内であり、例えば、最適量以下の投与量から開始し、最適又は有用な投与量を決定するために投与量を徐々に変更することによってなされる。或いは、治療／予防のための適切な投与量を決定するために、細胞培養アッセイ又は動物試験からのデータが使用され、ここで、好適な用量は、ほとんど又は全く毒性を有さない活性化合物のＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。治療的／予防的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養において決定される際にＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する化合物の濃度又は量）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて配合され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0248】
いくつかの例において、本発明の方法は、本明細書に記載されるタンパク質の予防又は治療有効量を投与することを含む。
【0249】
投与時期は、本発明の抗原結合タンパク質を受ける対象の臨床状態に基づいて決定することができる。例えば、対象が外傷を被っている状況では、本発明の抗原結合タンパク質は、対象の線溶亢進を弱めるために、外傷後可能な限り早期に投与することが有意であることは理解されよう。
【0250】
「治療有効量」という用語は、治療を必要とする対象に投与されたとき、対象の予後及び／又は状態を改善し、及び／又は本明細書に記載される臨床状態の１つ以上の症状を、その状態の臨床的診断特性又は臨床的特徴として観察され、認められるレベル未満のレベルまで、低減若しくは阻害する量である。対象に投与される量は、治療される疾患の具体的な特徴、治療される疾患のタイプ及び段階、投与方法、並びに全体的な健康、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、及び体重などの対象の特徴に依存する。当業者は、これらの及び他の要因に応じて、適切な投与量を決定することができる。したがって、この用語は、本発明を、特定の量、例えば、タンパク質の重量又は量に限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は、対象において所定の結果を得るのに十分な抗原結合タンパク質の任意の量を包含する。
【0251】
本明細書において使用される際、「予防的に有効な量」という用語は、臨床状態の１つ以上の検出可能な症状の発症を予防する又は阻害する又は遅らせるのに十分な量のタンパク質を意味すると理解されるものとする。当業者は、このような量が、例えば、投与される特定の抗原結合タンパク質及び／又は特定の対象及び／又は疾患のタイプ若しくは重症度若しくはレベル及び／又は疾患の素因（遺伝的素因若しくはそれ以外）に応じて変化することを認識するであろう。したがって、この用語は、本発明を、特定の量、例えば、抗原結合タンパク質の重量又は量に限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は、対象において所定の結果を得るのに十分な抗原結合タンパク質の任意の量を包含する。
【0252】
キット
本発明は、以下の１つ以上を含むキットをさらに含む：
（ｉ）本発明の抗原結合タンパク質又はそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ）本発明の細胞；
（ｉｉｉ）本発明の複合体；又は
（ｉｉｉ）本発明の医薬組成物。
本発明は、以下の１つ以上を含むキットをさらに含む：
（ｉ）本発明の抗原結合タンパク質又はそれをコードする発現構築物；
（ｉｉ）本発明の細胞；
（ｉｉｉ）本発明の複合体；又は
（ｉｉｉ）本発明の医薬組成物。
【0253】
プラスミンを検出するためのキットの場合、キットは、例えば、本発明の抗原結合タンパク質に連結された検出手段をさらに含み得る。
【0254】
治療的／予防的使用のためのキットの場合、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【0255】
任意選択的に、本発明のキットは、いずれかの実施例に従い本明細書に記載される方法の使用説明書とともに包装される。
【0256】
本明細書に開示され、定義される本発明が、本文又は図面に記載されるか、若しくはそれらから明らかな個別の特徴の２つ以上の別の組合せ全てにまで及ぶことは理解されよう。これらの異なる組合せの全てが、本発明の様々な別の態様を構成する。
【0257】
【表1】
【0258】
【表2】
【0259】
【表3】
【0260】
【表4】
【0261】
【表5】
【0262】
【表6】
【実施例】
【0263】
実施例１：Ｂ１０抗体の生成
ニワトリにおいて完全長プラスミノーゲンに対する抗体応答を高めることにより、プラスミンとの結合のための抗体を取得した。ＰＣＲによりニワトリのｃＤＮＡから抗体可変重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬ）を増幅し、フレキシブルリンカーを介して一緒に連結することにより、ｓｃＦｖライブラリーを作製した。
ニワトリにおいて完全長プラスミノーゲンに対する抗体応答を高めることにより、プラスミンとの結合のための抗体を取得した。ＰＣＲによりニワトリのｃＤＮＡから抗体可変重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬ）を増幅し、フレキシブルリンカーを介して一緒に連結することにより、ｓｃＦｖライブラリーを作製した。
【0264】
選択は、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅを用いたプラスミノーゲン結合抗体のスクリーニングにより実施した。プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化又はプラスミン活性の阻害を予防又は阻害した抗体を同定するために、ＳＫ媒介性プラスミノーゲン活性化及び線維素溶解アッセイを実施した。
【0265】
実施例２：プラスミン活性部位との結合に関する抗体Ｂ１０の特性決定
ＳＰＲアッセイ
アミンカップリングにより、ニワトリ抗体をシリーズＳ ＣＭ４（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップ上に固定化した。プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０から構成されるバッファー中のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、０．３９ｎＭから最大５０ｎＭまでの濃度で、本発明の抗体に対するプラスミノーゲン又はプラスミンの結合を分析した。１８０秒の会合、次いで６００秒の解離のために、プラスミノーゲン／プラスミンを３０μｌ／分で注入した。各サイクルの終了時に、１０ｍＭグリシンｐＨ１．８を用いて、センサーチップを再生した後、次の注入、最小６サイクルを実施した。動態パラメータを取得するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）１：１結合モデルでセンサーグラムをフィッティングした。
ＳＰＲアッセイ
アミンカップリングにより、ニワトリ抗体をシリーズＳ ＣＭ４（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップ上に固定化した。プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０から構成されるバッファー中のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、０．３９ｎＭから最大５０ｎＭまでの濃度で、本発明の抗体に対するプラスミノーゲン又はプラスミンの結合を分析した。１８０秒の会合、次いで６００秒の解離のために、プラスミノーゲン／プラスミンを３０μｌ／分で注入した。各サイクルの終了時に、１０ｍＭグリシンｐＨ１．８を用いて、センサーチップを再生した後、次の注入、最小６サイクルを実施した。動態パラメータを取得するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）１：１結合モデルでセンサーグラムをフィッティングした。
【0266】
結合実験の結果（図１）の結果は、本発明の抗原結合タンパク質が、プラスミノーゲン及びプラスミンの両方と結合するが、プラスミンと比較してプラスミノーゲンに対する親和性はわずかに高いことを示している。
【0267】
Ｂ１０は、ｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化により形成されるプラスミンの活性を阻害する
【0268】
溶液中：
２０ｎＭのプラスミノーゲンを２０ｍＭ ＥＡＣＡの存在下で、様々なＢ１０濃度（０～２００ｎＭ）と室温で３０分間混合した。インキュベーション後、３５５ｎｍ及び４６０ｎｍのそれぞれ励起及び発光波長にて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で蛍光発生基質を用い、４ｎＭのｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化を測定した。進度曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて非線形指数方程式：
Ｙ ＝ Ｙ０＊ｅｘｐ（活性化の速度＊Ｘ）
（式中、Ｘ＝０のとき、Ｙ０はＹ値である）
にフィッティングした。活性化の速度を、対応するＢ１０濃度に対してプロットして、阻害曲線を取得するが、これは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６の阻害剤対応答モデル：
Ｙ＝最小 ＋ （最大－最小）／（１＋（（ＸＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）／（ＩＣ５０ ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）））
（式中、最大（Ｔｏｐ）及び最小（Ｂｏｔｔｏｍ）は、蛍光読取りのプラトーであり、ヒルスロープ（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）は、曲線の勾配の尺度である）でフィッティングすることができる。ＩＣ５０値、即ち、溶液中のｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の５０％を阻害するＢ１０の濃度は、２１．５１±２．２８ｎＭである。
２０ｎＭのプラスミノーゲンを２０ｍＭ ＥＡＣＡの存在下で、様々なＢ１０濃度（０～２００ｎＭ）と室温で３０分間混合した。インキュベーション後、３５５ｎｍ及び４６０ｎｍのそれぞれ励起及び発光波長にて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で蛍光発生基質を用い、４ｎＭのｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化を測定した。進度曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて非線形指数方程式：
Ｙ ＝ Ｙ０＊ｅｘｐ（活性化の速度＊Ｘ）
（式中、Ｘ＝０のとき、Ｙ０はＹ値である）
にフィッティングした。活性化の速度を、対応するＢ１０濃度に対してプロットして、阻害曲線を取得するが、これは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６の阻害剤対応答モデル：
Ｙ＝最小 ＋ （最大－最小）／（１＋（（ＸＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）／（ＩＣ５０ ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）））
（式中、最大（Ｔｏｐ）及び最小（Ｂｏｔｔｏｍ）は、蛍光読取りのプラトーであり、ヒルスロープ（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）は、曲線の勾配の尺度である）でフィッティングすることができる。ＩＣ５０値、即ち、溶液中のｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の５０％を阻害するＢ１０の濃度は、２１．５１±２．２８ｎＭである。
【0269】
フィブリン上：
３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Ｂａｎｋｓｉａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１Ｕのウシトロンビン（Ｊｏｍａｒ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；及び１０ｎＭのｔＰＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を３７℃で２時間混合することにより調製した、事前形成フィブリン血餅の表面上で、プラスミノーゲン活性化を測定した。濃度（０～２μＭ）のＢ１０と混合した１００ｎＭのプラスミノーゲンを血餅の表面に添加した。前述のように、２００μＭの蛍光発生基質（Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍ）を用いて、プラスミン活性をモニターした。プラスミノーゲン活性化の速度及びＩＣ５０を前述のように算出した。フィブリン上のｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の阻害について得られたＩＣ５０値は、８６±１１．６ｎＭである。結果を図２に示す。
３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Ｂａｎｋｓｉａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１Ｕのウシトロンビン（Ｊｏｍａｒ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；及び１０ｎＭのｔＰＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を３７℃で２時間混合することにより調製した、事前形成フィブリン血餅の表面上で、プラスミノーゲン活性化を測定した。濃度（０～２μＭ）のＢ１０と混合した１００ｎＭのプラスミノーゲンを血餅の表面に添加した。前述のように、２００μＭの蛍光発生基質（Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍ）を用いて、プラスミン活性をモニターした。プラスミノーゲン活性化の速度及びＩＣ５０を前述のように算出した。フィブリン上のｔＰＡ媒介性プラスミノーゲン活性化の阻害について得られたＩＣ５０値は、８６±１１．６ｎＭである。結果を図２に示す。
【0270】
Ｂ１０は、プラスミノーゲンのＳＫ媒介性活性化により形成されるプラスミンの活性を阻害する
【0271】
本発明の抗体の能力を評価するために、ストレプトキナーゼによるプラスミノーゲン活性化を使用した。３７℃にて、５ｎＭの組み換えストレプトキナーゼで５０ｎＭのプラスミノーゲンを活性化した。それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長により、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で２００μＭのプラスミン蛍光発生基質Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ）を用い、プラスミノーゲン活性化の進行をモニターした。個別に、プロセス中の特定の時点（ｔ＝０、ｔ＝６０分、及びｔ＝１６０分）で、０．５μＭの抗体を添加した。陰性対照として、抗体の代わりにＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を添加した。
【0272】
図３の結果は、Ｂ１０抗体が、アッセイの全工程中のどの時点で反応物に添加されても、直ちにプラスミン活性を阻害することを示している。
【0273】
プラスミン及び他の血漿プロテアーゼの活性に対するＢ１０の作用
それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長により、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、２００μＭの蛍光発生基質（Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で、プラスミン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）活性を測定した。１０：１の抗体：プラスミン比でのＢ１０及びＡ０１（非阻害性プラスミノーゲン抗体）のプログレス曲線。Ｂ１０は、Ａ０１と比較して、Ｐｌｍ活性の完全な阻害を示した。それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長により、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、抗体Ｂ１０（０～２００ｎＭ）の存在下のプラスミン（２０ｎＭ）の活性を３７℃で測定した。ＩＣ５０は、２４．３±１．４ｎＭであった。
それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長により、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、２００μＭの蛍光発生基質（Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で、プラスミン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）活性を測定した。１０：１の抗体：プラスミン比でのＢ１０及びＡ０１（非阻害性プラスミノーゲン抗体）のプログレス曲線。Ｂ１０は、Ａ０１と比較して、Ｐｌｍ活性の完全な阻害を示した。それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長により、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、抗体Ｂ１０（０～２００ｎＭ）の存在下のプラスミン（２０ｎＭ）の活性を３７℃で測定した。ＩＣ５０は、２４．３±１．４ｎＭであった。
【0274】
他の血漿セリンプロテアーゼとの交差反応性を調べるために、２５０ｎＭのＢ１０を１０ｎＭのヒト血漿プロテアーゼ、即ち、血漿カリクレイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、第Ｘａ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、第ＸＩＩａ因子（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、プロテインＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、トロンビン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、ｕＰＡ（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ）、ｔＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ）及びプラスミンと混合した。４０５ｎｍにて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用い、３７℃で、トロンビン、第Ｘａ因子、ｔＰＡ及びプラスミン活性は、色素生成基質Ｔ２９４３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて測定し、血漿カリクレイン、第ＸＩＩａ因子及びプロテインＣ活性は、色素生成基質Ｓ２０３２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いて測定した。ｕＰＡ活性は、蛍光発生基質（Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ）を用いて、それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長によりＦｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用い、３７℃で測定した。また、ナイーブ抗体ｇＡｂの存在下での酵素の活性も示す。ここでは、抗体がバッファーで置換されたＨＥＰＥＳ緩衝食塩水対照に対して酵素活性を正規化した。図４Ｃに示すように、Ｂ１０は、Ｐｌｍ以外の試験血漿プロテアーゼに対する活性に作用を及ぼさない。
【0275】
Ｂ１０によるプラスミノーゲンとのＳＫ結合の阻害
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、プラスミノーゲンとストレプトキナーゼの結合に対するＢ１０の影響を調べた。０、６２．５、１２５、２５０及び５００ｎＭのＢ１０又はナイーブニワトリ抗体（ｇＡｂ）の存在下、ＣＭ４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップに固定化したストレプトキナーゼ全体に１０ｎＭプラスミノーゲンを通過させた。Ｂ１０は、試験した６２．５～５００ｎＭの全ての濃度で阻害を示した。ナイーブニワトリ抗体ｇＡｂ（対照）は、阻害を全く示さなかった。図５Ｂに、５００ｎＭ Ｇ０５及びｇＡｂの存在下でのプラスミノーゲンに対するＳＫ結合（抗体なし対照に対して正規化）のパーセンテージを示す。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、プラスミノーゲンとストレプトキナーゼの結合に対するＢ１０の影響を調べた。０、６２．５、１２５、２５０及び５００ｎＭのＢ１０又はナイーブニワトリ抗体（ｇＡｂ）の存在下、ＣＭ４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップに固定化したストレプトキナーゼ全体に１０ｎＭプラスミノーゲンを通過させた。Ｂ１０は、試験した６２．５～５００ｎＭの全ての濃度で阻害を示した。ナイーブニワトリ抗体ｇＡｂ（対照）は、阻害を全く示さなかった。図５Ｂに、５００ｎＭ Ｇ０５及びｇＡｂの存在下でのプラスミノーゲンに対するＳＫ結合（抗体なし対照に対して正規化）のパーセンテージを示す。
【0276】
図５に示す結果は、Ｂ１０が、ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンの結合を、対照抗体と比較して約３３％阻害することを示す。
【0277】
実施例３：セリンプロテアーゼドメインとＢ１０の結合
Ｂ１０は、クリングル５－セリンプロテアーゼドメイン（ＫＲ５－ＳＰ）に結合し、それと一緒に安定した二元複合体を形成するが、それは、サイズ排除クロマトグラフィーにより共精製することができる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、バッファーは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水であった。図６に示すように、共複合体は、単一ピークとして５８．５ｍｌで溶離された。参照として、ＫＲ５－ＳＰ及びＢ１０抗体は、やはり単一ピークとして、それぞれ６７．２ｍｌ及び７３．３ｍｌで溶離された。
Ｂ１０は、クリングル５－セリンプロテアーゼドメイン（ＫＲ５－ＳＰ）に結合し、それと一緒に安定した二元複合体を形成するが、それは、サイズ排除クロマトグラフィーにより共精製することができる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、バッファーは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水であった。図６に示すように、共複合体は、単一ピークとして５８．５ｍｌで溶離された。参照として、ＫＲ５－ＳＰ及びＢ１０抗体は、やはり単一ピークとして、それぞれ６７．２ｍｌ及び７３．３ｍｌで溶離された。
【0278】
実施例４：単一組み換えクリングル５－セリンプロテアーゼドメインに結合するＢ１０の結晶構造
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファー中１０ｍｇ／ｍｌの精製済複合体を、２０℃にて、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５及び０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８Ｋの存在下で結晶化した。結晶を２０％（ｖ／ｖ）グリセロールの存在下、液体Ｎ２中でフラッシュ冷却した。ＥＩＧＥＲ Ｘ １６Ｍピクセル検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ Ｌｔｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ＡＣＲＦ検出器としても知られる）を用いたＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ ＭＸ２ビームラインで、２．７Åデータセットを収集した。検索モデルとして、プラスミノーゲン（ＰＤＢ ＩＤ ４ＤＵＲ）及びニワトリ一本鎖フラグメント可変（ＰＤＢ ＩＤ ４Ｐ４８）の構造からのＳＰドメインを用い、分子置換によるプログラムＰＨＡＳＥＲ（ＣＣＰ４）を使用して結晶構造を解析した。ＣＯＯＴを用いたモデル化及びＰＨＥＮＩＸを用いた精密化の複数ラウンドを実施した。ＰｙＭＯＬ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）を用いて作製した最終モデルを図７に示す。
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファー中１０ｍｇ／ｍｌの精製済複合体を、２０℃にて、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５及び０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８Ｋの存在下で結晶化した。結晶を２０％（ｖ／ｖ）グリセロールの存在下、液体Ｎ２中でフラッシュ冷却した。ＥＩＧＥＲ Ｘ １６Ｍピクセル検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ Ｌｔｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ＡＣＲＦ検出器としても知られる）を用いたＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ ＭＸ２ビームラインで、２．７Åデータセットを収集した。検索モデルとして、プラスミノーゲン（ＰＤＢ ＩＤ ４ＤＵＲ）及びニワトリ一本鎖フラグメント可変（ＰＤＢ ＩＤ ４Ｐ４８）の構造からのＳＰドメインを用い、分子置換によるプログラムＰＨＡＳＥＲ（ＣＣＰ４）を使用して結晶構造を解析した。ＣＯＯＴを用いたモデル化及びＰＨＥＮＩＸを用いた精密化の複数ラウンドを実施した。ＰｙＭＯＬ（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）を用いて作製した最終モデルを図７に示す。
【0279】
Ｂ１０－ＳＰ複合体構造から、触媒ドメインとＢ１０の結合が、機能性触媒部位の形成を妨害し、それによってプラスミンと基質の結合／基質の切断を阻止することが明らかにされる。
【0280】
実施例５：ＧＡＳの存在下でのプラスミン活性に対するＢ１０の作用
１．０のＯＤ６００を除いて前述と同様に、ＧＡＳ培養物を増殖させた。１ｍｌの培養物を各サンプルに使用した。細胞を２回洗浄し、２％プラスミノーゲン欠失ＦＣＳを補充した２５０μｌのＰＢＳ中に各サンプルを再懸濁させた。８０ｎＭのプラスミノーゲンと８μＭのＢ１０／ｇＡｂ又は１３．５ｍＭ ＴＸＡを室温で１５分混合した後、洗浄済ＧＡＳ細胞と一緒に室温で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、最後に、２％プラスミノーゲン欠失ＦＣＳを補充した５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。１０μｌの再懸濁細胞を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４及び２００μＭ 蛍光発生基質Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ）で緩衝した１００μｌの反応混合物に添加した。それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長で、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用い、プラスミン活性を３７℃で測定した。
１．０のＯＤ６００を除いて前述と同様に、ＧＡＳ培養物を増殖させた。１ｍｌの培養物を各サンプルに使用した。細胞を２回洗浄し、２％プラスミノーゲン欠失ＦＣＳを補充した２５０μｌのＰＢＳ中に各サンプルを再懸濁させた。８０ｎＭのプラスミノーゲンと８μＭのＢ１０／ｇＡｂ又は１３．５ｍＭ ＴＸＡを室温で１５分混合した後、洗浄済ＧＡＳ細胞と一緒に室温で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、最後に、２％プラスミノーゲン欠失ＦＣＳを補充した５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。１０μｌの再懸濁細胞を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４及び２００μＭ 蛍光発生基質Ｈ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ）で緩衝した１００μｌの反応混合物に添加した。それぞれ３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起及び発光波長で、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用い、プラスミン活性を３７℃で測定した。
【0281】
図８に示す結果は、Ｂ１０が、対照抗体及びＨＥＰＥＳ緩衝食塩水対照と比較して、ＧＡＳにより生成されるプラスミン活性を約６０％低減することを証明する。下のパネルは、ＧＡＳ細胞の非存在下で、組み換えＳＫ（２ｎＭ）が溶液中のＰｌｇを活性化することを示す。
【0282】
実施例６：Ｂ１０は、合成血餅及び全血血餅の溶解を阻害する
３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Ｂａｎｋｓｉａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１Ｕのウシトロンビン（Ｊｏｍａｒ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；及び１０ｎＭのｔＰＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を３７℃で２時間混合することにより、合成フィブリン血餅を形成した。０～９０ｎＭ Ｂ１０；又は０～９０ｎＭ α２ＡＰ；又は０～６．２５ｍＭ ＴＸＡと混合した４５ｎＭのプラスミノーゲンを血餅の表面に添加することにより、線維素溶解を開始した。
３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（Ｂａｎｋｓｉａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１Ｕのウシトロンビン（Ｊｏｍａｒ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；及び１０ｎＭのｔＰＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を３７℃で２時間混合することにより、合成フィブリン血餅を形成した。０～９０ｎＭ Ｂ１０；又は０～９０ｎＭ α２ＡＰ；又は０～６．２５ｍＭ ＴＸＡと混合した４５ｎＭのプラスミノーゲンを血餅の表面に添加することにより、線維素溶解を開始した。
【0283】
Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ（ＢＭＧ）を用いて、線維素溶解を３７℃で最大１０時間モニターした。５０％血餅溶解を達成するのに必要とされた時間をＩＣ５０計算のために使用した。Ｂ１０について得られたＩＣ５０値は、α２ＡＰ及びアプロチニンのそれと同等であり（図９）、ＴＸＡより有意に低かった（約５０倍）。
【0284】
全血血餅は、健康なドナーから採取したヒト血液から形成した。ＨＢＳ中に合成リン脂質、Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｇｅｒｍａｎｙを補充した組み換え組織因子及び６７ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する混合物の１５％を全血と１：４の比で混合することにより、ハロ形状の（Ｈａｌｏ－ｓｈａｐｅｄ）血餅を作製した。プレートを密封してから、使用まで３７℃で６０分インキュベートした。
【0285】
７ｎＭまでのｔＰＡ、並びに下記濃度：０～３１２．５ｎＭ Ｂ１０；０～１０００ｎＭ α２ＡＰ；０～１０００ｎＭアプロチニンの抗体若しくはＰｌｍ阻害剤の添加により、血餅溶解を誘導した。血餅溶解によって濁度の増大が起こり、血餅溶解を、プレートリーダを用いて、ＯＤ６１０ｎＭでモニターした。
【0286】
高濃度（例えば、最大１，０００ｎＭ）で、α２ＡＰ及びアプロチニンだけが部分的に血餅溶解を阻害し；濃度最大１００μＭのＴＸＡは、血餅溶解を遅延させ、血餅溶解の完全な阻害が３００μＭ以上で観察された（データは示していない）。抗体Ｂ１０は、２５０ｎＭ以上の濃度で血餅溶解を完全に阻害する。
【0287】
５０％血餅溶解を達成するのにかかった時間をＩＣ５０計算のために使用した。Ｂ１０について得られたＩＣ５０値は、α２ＡＰの約８倍であり、アプロチニンの約９．５倍高かった（図１０）が、これは、Ｂ１０が、全血血餅溶解の阻害について有意に有効であることを示している。Ｂ１０は、ＴＸＡより１８０倍超有効であった（示していない）。
【0288】
したがって、生体システムと酷似する血餅溶解アッセイにおいて、抗体Ｂ１０は、プラスミン誘導性溶解の阻害について、プラスミンの生理学的阻害剤であるα２ＡＰより有意に有効である。さらに、抗体Ｂ１０は、プラスミン誘導性溶解の阻害について、既存の薬理学的薬剤であるＴＸＡ及びアプロチニンより有意に有効である。
【0289】
本明細書において開示され、定義される本発明は、記載されるか又は本文若しくは図面から明らかである個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解されよう。これらの異なる組合せは全て、本発明の様々な代替的な態様を構成する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】