ホーム > 特許ランキング > クリシア リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】ポリアミン類似体産生酵母
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20221219BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20221219BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20221219BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20221219BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20221219BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20221219BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20221219BHJP
C12P 7/40 20060101ALI20221219BHJP
C12P 7/64 20220101ALI20221219BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19
C12N15/52 Z ZNA
C12N15/53
C12N15/54
C12N9/00
C12N9/02
C12N9/10
C12P7/40
C12P7/64
C12P13/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022524993
(86)(22)【出願日】2020-10-27
(85)【翻訳文提出日】2022-06-24
(86)【国際出願番号】 EP2020080137
(87)【国際公開番号】W WO2021083869
(87)【国際公開日】2021-05-06
(31)【優先権主張番号】1951231-8
(32)【優先日】2019-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520011050
【氏名又は名称】クリシア リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キン、ジウフー
(72)【発明者】
【氏名】ニールセン、イェンス
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD09
4B050LL10
4B064AD01
4B064AD85
4B064AE01
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA28
4B065CA29
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つのポリアミンを産生することができる酵母細胞におけるポリアミン類似体の産生に関する。また、酵母細胞は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子、および少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を含むが、ポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を欠いているか、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む。酵母細胞は、一置換および／または多置換Ｎ－アシル化ポリアミンを産生することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのポリアミン類似体を産生することができる酵母細胞であって、少なくとも１つのポリアミンを産生することができ；
４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子を含み；
少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み；
少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を含み；かつ
ポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を欠いているか、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む、酵母細胞。
【請求項2】
前記４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの過剰発現のために改変されている、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項3】
前記４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ａｔ４ＣＬ１、Ａｔ４ＣＬ２、Ａｔ４ＣＬ３、Ａｔ４ＣＬ４、Ａｔ４ＣＬ５、および４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼＡｔ４ＣＬ１、Ａｔ４ＣＬ２、Ａｔ４ＣＬ３、Ａｔ４ＣＬ４、またはＡｔ４ＣＬ５のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ａｔ４ＣＬ１である、請求項１または２に記載の酵母細胞。
【請求項4】
前記少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼの過剰発現のために改変されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項5】
スペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子、スペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼコード遺伝子、およびプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項6】
前記スペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＳＨＴ、ニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＮａＤＨ２９、およびスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＡｔＳＨＴまたはスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＮａＤＨ２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項7】
前記スペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼコード遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＳＣＴ、およびスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼＡｔＳＣＴと少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項５または６に記載の酵母細胞。
【請求項8】
前記プトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子が、ニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＮａＡＴ１、およびプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＮａＡＴ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項５～７のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項9】
芳香族有機酸、脂肪酸、ハロゲン化芳香族有機酸、ハロゲン化脂肪酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの有機酸を産生することができる、請求項１～８のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項10】
前記少なくとも１つのポリアミン類似体が、ポリアミンアルカロイド、ポリアミン－脂肪酸コンジュゲート、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項11】
前記少なくとも１つのポリアミンが、スペルミン、サーモスペルミン、ｓｙｍ－ホモスペルミジン、１，３－ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、スペルミジン、ｓｙｍ－ノルスペルミジン、ノルスペルミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項12】
前記少なくとも１つのポリアミンシンターゼの過剰発現のために改変されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項13】
前記ポリアミンシンターゼコード遺伝子が、スペルミンシンターゼコード遺伝子、サーモスペルミンシンターゼコード遺伝子、およびホモスペルミジンシンターゼコード遺伝子からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項14】
前記スペルミンシンターゼコード遺伝子が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＰＥ４、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＳＰＭＳ、およびスペルミンシンターゼＳＰＥ４またはスペルミンシンターゼＡｔＳＰＭＳと少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１３に記載の酵母細胞。
【請求項15】
前記サーモスペルミンシンターゼコード遺伝子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＡＣＬ５、およびサーモスペルミンシンターゼＡｔＡＣＬ５と少なくとも８０％の配列同一性を有するサーモスペルミンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の酵母細胞。
【請求項16】
前記ホモスペルミジンシンターゼコード遺伝子が、ハナノボロギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｖｅｒｎａｌｉｓ）ＳｖＨＳＳ、ブラストクロリス・ビリディス（Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）ＢｖＨＳＳ、およびホモスペルミジンシンターゼＳｖＨＳＳまたはホモスペルミジンシンターゼＢｖＨＳＳと少なくとも８０％の配列同一性を有するホモスペルミジンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項17】
前記酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞であり、前記ポリアミンオキシダーゼがＦＭＳ１である、請求項１３～１６のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項18】
ポリアミン類似体を生成する方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の酵母細胞を、培地中で、前記酵母細胞による前記ポリアミン類似体の産生に適した培養条件で培養することと；
前記ポリアミン類似体を前記培地から、および／または前記酵母細胞から収集することと
を含む方法。
【請求項19】
前記酵母細胞を培養することが、請求項１～１７のいずれか一項に記載の酵母細胞を、芳香族有機酸、脂肪酸、ハロゲン化芳香族有機酸、ハロゲン化脂肪酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの有機酸を含む前記培地中で培養することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記少なくとも１つの有機酸を前記培地に添加することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記酵母細胞を培養することが、請求項１～１７のいずれか一項に記載の酵母細胞を前記培地中で、前記少なくとも１つの有機酸を産生し、かつ前記少なくとも１つの有機酸を前記培地中に放出することができる微生物と共培養することを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、遺伝子改変された酵母に、特に、ポリアミン類似体を産生することができる酵母に関する。
【背景技術】
【0002】
自然界に広く分布しているポリアミン類似体は、健康分野および農業分野における課題に取り組むために利用されている。例えば、アミド結合含有ポリアミン類似体、例えば、Ｎ１－クマロイル－スペルミン、Ｎ１－グアニル－１，７－ジアミン－ヘプタン、およびＮ１，Ｎ１１－ジエチル－ノルスペルミンは、ヒトの疾患、例えば癌、および新興のウイルスの脅威、例えばＣＯＶＩＤ－１９と戦うのに利用する潜在性がある、抗ウイルス薬、抗酸化剤、拮抗剤、および化学療法剤の重要なクラスを表す。同様に、ジアミンおよびポリアミンの広く分布するアミド結合含有ヒドロキシ桂皮酸アミド、例えばジ－ｐ－クマロイル－カフェオイル－スペルミジンは、うどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）感染を有意に減少させることができ、真菌病原体に対抗するのに利用する潜在性を実証している。
【0003】
しかしながら、構造の複雑さ、および自然界での存在量が少ないことに起因して、ポリアミン類似体を、従来の合成化学、または天然源からの抽出のいずれかから得ることは困難である。急速に生育する、遺伝的に扱い易い種における微生物ベースの生成が、天然物およびその誘導体のための伝統的なサプライチェーンに代わるものとして推し進められてきた。特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、多くの異なる燃料、化学物質、食品成分、および医薬品を生成するための、特に天然物の生成のための細胞工場として機能してきた。実際、微生物細胞工場（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）（２０１６）１５：１９８は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼおよびＡｔ４ＣＬ５の共発現、ならびに種々のヒドロキシシンナマートおよびベンゾアートコンジュゲートの産生のための、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）遺伝子Ａｔ４ＣＬ５を含有するベクター中への異なるＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼコード配列のクローニングを開示している。
【0004】
残念なことに、さらなる薬理学的研究および殺虫剤研究のためのポリアミン類似体の化学空間の解明が、いくつかの制限：（ｉ）多様なポリアミン、すなわち、従来の合成化学、または天然資源からの抽出のいずれかからのポリアミン類似体の合成または生合成のための前駆体にアクセスすることの困難、これによるポリアミン類似体の多様性の制限；（ｉｉ）生合成酵素、例えば、ポリアミンおよびポリアミン類似体の生合成についての知識の欠如；（ｉｉｉ）ポリアミンの生化学的機能についての知識の欠如、これによるポリアミンの臨床用途の制限によって妨げられている。
【0005】
結果的に、天然ポリアミンおよびその類似体の生成のための新規の方法の開発、ならびにこれらの構造の天然変異体および非天然変異体の双方を供給するための新たな技術およびバリューチェーンの開発が所望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一般的な目的は、ポリアミン類似体を産生することができる酵母細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
この目的および他の目的は、実施形態によって満たされる。
【0008】
本発明は、独立請求項に定義されている。本発明のさらなる実施形態が、従属請求項に定義されている。
【0009】
本発明は、少なくとも１つのポリアミン類似体を産生することができる酵母細胞に関する。酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンを産生することができる。また、酵母細胞は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子、および少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を含むが、ポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を欠いているか、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む。
【0010】
また、本発明は、ポリアミン類似体を生成する方法に関する。本方法は、本発明に従う酵母細胞を、培地中で、酵母細胞によるポリアミン類似体の産生に適した培養条件で培養することを含む。また、本方法は、ポリアミン類似体を培地から、および／または酵母細胞から収集することを含む。
【0011】
本発明は、一置換および／または多置換Ｎ－アシル化ポリアミンが挙げられる種々のポリアミン類似体を生成するための効率的な手段を提供する。したがって、本発明は、ポリアミン類似体を得るための従来の合成化学または天然源からの抽出を含む従来技術の方法に対する、費用効率の高い代替方法として使用することができる。
【0012】
実施形態は、そのさらなる目的および利点と共に、以下の説明を、添付の図面と共に参照することによって最もよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1a】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図1b】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図1c】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図1d】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図1e】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図1f】スペルミジンおよびより高次のポリアミンの過剰合成のための酵母代謝の改変を示す。
【図2a】酵母におけるクコサミン産生を示す。
【図2b】酵母におけるクコサミン産生を示す。
【図3a】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図3b】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図3c】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図3d】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図3e】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図3f】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成を示す。
【図4a】酵母における複雑なフェノールアミドのデノボ生合成を示す。
【図4b】酵母における複雑なフェノールアミドのデノボ生合成を示す。
【図4c】酵母における複雑なフェノールアミドのデノボ生合成を示す。
【図5a】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成のための改変した経路を示す。
【図5b】酵母における複雑なフェノールアミドの生合成のための改変した経路を示す。
【図6a】フッ素置換芳香族アミノ酸（３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン；３－Ｆ－Ｌ－Ｐｈｅ）を供給した場合の、ｐ－クマリン酸過剰産生株（ＱＬ５８）を用いたフッ素置換水素化ヒドロキシ桂皮酸のインビボ産生を示す。（６ａ）フッ素置換桂皮酸（３Ｆ－ＣＡ）。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図6b】フッ素置換芳香族アミノ酸（３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン；３－Ｆ－Ｌ－Ｐｈｅ）を供給した場合の、ｐ－クマリン酸過剰産生株（ＱＬ５８）を用いたフッ素置換水素化ヒドロキシ桂皮酸のインビボ産生を示す。（６ｂ）フッ素置換ｐ－クマリン酸（３－Ｆ－ｐＨＣＡ）。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図6c】フッ素置換芳香族アミノ酸（３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン；３－Ｆ－Ｌ－Ｐｈｅ）を供給した場合の、ｐ－クマリン酸過剰産生株（ＱＬ５８）を用いたフッ素置換水素化ヒドロキシ桂皮酸のインビボ産生を示す。（６ｃ）フッ素置換水素化ｐ－クマリン酸（３－Ｆ－ＤＨｐＨＣＡ）。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図7a】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－プトレシンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（７ａ）Ｎ１－３－フルオロシンナモイルプトレシン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図7b】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－プトレシンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（７ｂ）Ｎ１－３－フルオロクマロイルプトレシン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図7c】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－プトレシンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（７ｃ）Ｎ１－３－フルオロヒドロクマロイルプトレシン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図7d】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－プトレシンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（７ｄ）Ｎ１，Ｎ６－ビス（３－フルオロクマロイル）プトレシン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図8a】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－スペルミジンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（８ａ）Ｎ１またはＮ１０－３－フルオロシンナモイルスペルミジン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図8b】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－スペルミジンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（８ｂ）Ｎ１またはＮ１０－３－フルオロクマロイルスペルミジン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図8c】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－スペルミジンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（８ｃ）Ｎ１またはＮ１０－３－フルオロヒドロクマロイルスペルミジン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図8d】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－スペルミジンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（８ｄ）Ｎ１，Ｎ１０－ビス（３－フルオロクマロイル）スペルミジン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【図8e】酵母ポリアミンプラットフォームによるフッ素置換ヒドロキシ桂皮酸－スペルミジンコンジュゲートのインビボ産生を示す。（８ｅ）Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（３－フルオロクマロイル）スペルミジン。細胞培養上清を、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムを、それぞれの注目する化合物の理論ｍ／ｚ値について選択した。
【発明を実施するための形態】
【0014】
ポリアミン類似体の多様性への効率的なアクセスを可能にするために、本発明者らは、酵母代謝を改変して、複雑なポリアミンのカテゴリー、例えば、スペルミジン、ホモ－スペルミジン、サーモスペルミン、およびスペルミンを過剰産生させた。この酵母プラットフォームの汎用性は、多様なポリアミン類似体の、テーラリング経路による生合成によって実証される。特に、本発明者らは、酵母の中心炭素および窒素代謝、メチオニンサルベージ経路、アデニンのサルベージ経路、ポリアミン輸送機構、およびポリアミン分解経路を体系的にリファクタリングすることによって、酵母が＞４００ｍｇ／ｌスペルミジンをディープウェルスケール発酵で産生できることを可能にした。さらに、テーラリング経路にプラグインし、かつ合成コンソーシアムを作出することによって、本発明者らは、酵母における三置換Ｎ－アシル化スペルミジンフェノールアミドを含むポリアミン類似体のデノボ生合成を実証した。
【0015】
次に、本発明の実施形態を示す、添付の図面および例を参照して、本発明を以下で説明する。この説明は、本発明を実施することができる全ての異なる方法、または本発明に追加することができる全ての特徴の詳細なカタログであることは意図されない。例えば、一方の実施形態に関して示される特徴は、他方の実施形態に組み込まれてもよく、そして特定の実施形態に関して示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。ゆえに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書中に記載の任意の特徴または特徴の組合せを除外または省略することができることを企図している。また、本明細書中で提案される種々の実施形態に対する、本発明から逸脱しない多数の変形および追加が、本開示に照らして、当業者に明らかであろう。それゆえに、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施形態を説明することが意図されており、その全ての再配列、組合せ、および変形を網羅的に特定することは意図されていない。
【0016】
本明細書中で別段の定義がない限り、本明細書中で用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0017】
一般に、本明細書中に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、当該技術において周知であり、かつ一般的に使用されるものである。
【0018】
本明細書中で言及される従来の方法および技術は、例えば、分子クローニング、ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）［第２版］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９において、例えば、その第１．２１節「プラスミドＤＮＡの抽出および精製（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）」、第１．５３節「プラスミドベクター中へのクローニングのための戦略（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、第１．８５節「組換えプラスミドを含有する細菌コロニーの識別（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｃｏｎｔａｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、第６節「ＤＮＡのゲル電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｏｆ ＤＮＡ）」、第１４節「ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡのインビトロ増幅（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、および第１７節「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内でのクローン化遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」において、より詳細に説明されている。
【0019】
本明細書の全体を通して参照される酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ：ＥＣ）番号（本明細書中で「クラス」とも呼ばれる）は、そのリソース「酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」（１９９２、別冊号６～１７を含む）（例えば、「酵素命名法１９９２：酵素の命名法および分類に関する国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会の勧告（Ｅｎｚｙｍｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ）」、Ｗｅｂｂ，Ｅ．Ｃ．（１９９２）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓによる国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）に公開されている）（ＩＳＢＮ ０－１２－２２７１６４－５）として入手可能）における国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）に従う。これは、各酵素クラスによって触媒される化学反応に基づく数値分類スキームである。
【0020】
文脈がそうでないことを示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴は、あらゆる組合せで使用できることが特に意図される。さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態において、本明細書中に記載の任意の特徴または特徴の組合せを除外または省略することができることも企図している。例示のために、組成物が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書が述べていれば、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独で、またはあらゆる組合せで省略かつ放棄できることが特に意図される。
【0021】
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。また、本明細書中で使用される「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる考えられる組合せを、そして択一的に（「または」）解釈される場合の組合せの欠如を指し、かつ包含する。
【0022】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、ならびに文言の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがこれに限定されない」を意味し、他の部分、添加物、成分、整数、または工程を排除するものではない。本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈がそうでないことを要求しない限り、複数および単数を企図するものとして理解されるべきである。
【0023】
本明細書中で使用される移行句、本質的にから「なる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙される特定の材料または工程、および特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に、物質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。ゆえに、用語、から本質的に「なる」は、本発明の特許請求の範囲において使用される場合、「含む」と等価であると解釈されることは意図されない。
【0024】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下で定義する。
【0025】
本明細書中で使用される用語「ポリアミン」は、２つ以上の第一級アミノ基を有する有機化合物を指す。ポリアミンの例として、プトレシン（Ｐｕｔ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）、サーモスペルミン（Ｔｓｐｍ）、ｓｙｍ－ホモスペルミジン（Ｈｓｐｄ）、１，２－ジアミノプロパン、カダベリン、アグマチン、ｓｙｍ－ノルスペルミジン、およびノルスペルミンが挙げられる。
【0026】
本明細書中で使用される用語「ポリアミン類似体」、「ポリアミン類似体」、または「ポリアミンコンジュゲート」は、ポリアミンを少なくとも１つの分子と反応させて、ポリアミンと少なくとも１つの分子との間にアミド結合を形成することによって形成される有機化合物を指す。特定の実施形態において、少なくとも１つの分子は、少なくとも１つのカルボキシル基含有分子であり、これによって、カルボン酸部分とポリアミンのアミン基とのカップリングを可能にする。そのようなカルボキシル基含有分子の非限定的であるが好ましい例として、芳香族有機酸、例えば、ヒドロキシ桂皮酸（α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、カフェイン酸、チコリ酸、桂皮酸、クロロゲン酸、ジフェルラ酸、ジヒドロカフェイン酸、クマリン酸、クマリン、フェルラ酸、およびシナピン酸が挙げられる）；ヒドロキシシンナモイル酒石酸（ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）（カフタル酸、コウタル酸、およびフェルタル酸が挙げられる）；フェノール酸（モノヒドロキシ安息香酸、例えば、３－ヒドロキシ安息香酸、４－ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、およびｐ－ヒドロキシ安息香酸グルコシドが挙げられる）；ジヒドロキシ安息香酸（２，３－ジヒドロキシ安息香酸、２，４－ジヒドロキシ安息香酸、２，６－ジヒドロキシ安息香酸、３，５－ジヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸エチル、ゲンチシン酸、ホモゲンチシン酸、オルセリン酸、およびプロトカテク酸が挙げられる）；トリヒドロキシ安息香酸（ベルゲニン、ケブル酸、没食子酸エチル、エウデスミック酸、没食子酸、タンニン酸、ノルベルゲニン、フロログルシノールカルボン酸、シリング酸、およびテオガリンが挙げられる）；バニリン；およびエラグ酸が挙げられる。ポリアミンを芳香族有機酸と反応させることによって形成されるポリアミン類似体は典型的に、ポリアミンアルカロイドと称される。カルボキシル基含有分子の他の例として、脂肪酸（以下に限定されないが、飽和脂肪酸、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、およびセロチン酸；ならびに不飽和脂肪酸、例えば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α－リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸が挙げられる）が挙げられる。ポリアミンを脂肪酸と反応させることによって形成されるポリアミン類似体は典型的に、ポリアミン－脂肪酸コンジュゲートと称される。
【0027】
ポリアミン命名法の技術において、一般に、アルカロイド内の原子の数、およびロカントのレタリングが重要である。主に２つのナンバリング系が文献において使用されている。本明細書中では、Ｂｅｎｔｚら、２０１５年によって開示されるナンバリング系が使用されている。系は、以下のルールで短く要約される：
Ｉ．ポリアミン骨格のナンバリングは、末端Ｎ原子を含むポリアミン構造全体を含む；
ＩＩ．ナンバリングは、最短炭素鎖の末端のＮ原子で始まる（例えば、アミノプロピルサブユニットの第一級アミノ基を有するスペルミジンについて）；
ＩＩＩ．対称骨格、例えばスペルミンの場合、ナンバリングは、置換基の最小のロカントを誘導するような分子の部位から始まる；そして
ＩＶ．Ｎ－誘導体化ポリアミンについて、Ｎ－置換基のロカントは、Ｎｎとして予め定められ、ｎは、置換されたＮ原子のロカント番号と一致する。
Ｉ．ポリアミン骨格のナンバリングは、末端Ｎ原子を含むポリアミン構造全体を含む；
ＩＩ．ナンバリングは、最短炭素鎖の末端のＮ原子で始まる（例えば、アミノプロピルサブユニットの第一級アミノ基を有するスペルミジンについて）；
ＩＩＩ．対称骨格、例えばスペルミンの場合、ナンバリングは、置換基の最小のロカントを誘導するような分子の部位から始まる；そして
ＩＶ．Ｎ－誘導体化ポリアミンについて、Ｎ－置換基のロカントは、Ｎｎとして予め定められ、ｎは、置換されたＮ原子のロカント番号と一致する。
【0028】
また、本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片もしくは部分、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡが挙げられる）を指し、それらはいずれも、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖もしくは分岐鎖、またはそれらのハイブリッドであり得る。本明細書中で提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、本明細書中では左側から右側に５’から３’方向に示され、そして米国配列規則（Ｕ．Ｓ．ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｕｌｅｓ）、米国特許施行規則（３７ ＣＦＲ）第１．８２１～１．８２５条、および世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に記載されているヌクレオチド文字を表すための標準コードを使用して表される。ｄｓＲＮＡが合成的に生成される場合、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、およびヒポキサンチン等のあまり一般的でない塩基も、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に使用することができる。例えば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピン類似体を含有するポリヌクレオチドは、ＲＮＡに高い親和性で結合し、かつ遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている。ホスホジエステル骨格、またはＲＮＡのリボース糖基中の２’－ヒドロキシへの修飾等の、他の修飾も行うことができる。本明細書中で使用される用語「組換え体」は、使用される場合、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、天然系において見出される内因性核酸と区別可能な構造コード配列または構造非コード配列を有する構築体を結果として生じさせるクローニング工程、制限工程、および／またはライゲーション工程の種々の組合せの産物であることを意味する。
【0029】
本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）等を生成するのに使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質または遺伝子産物を産生するのに使用することができても、できなくてもよい。遺伝子は、コード領域および非コード領域の双方、例えば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサー、終止配列、ならびに／または５’および３’非翻訳領域を含み得る。遺伝子は、「単離」されていてよく、これは、その天然状態にある核酸に関連して通常見出される成分が実質的に、または本質的にない核酸を意味する。そのような成分として、他の細胞材料、組換え生成由来の培地、および／または核酸の化学合成に使用される種々の化学物質が挙げられる。
【0030】
本明細書中で定義される「破壊された遺伝子」は、部分的に、または完全に非機能的な遺伝子および遺伝子産物を結果として生じさせる、遺伝子へのあらゆる変異または修飾を含む。そのような変異または修飾として、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、置換、挿入、および標的化配列の付加等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、遺伝子の破壊はまた、または代替的に、遺伝子の転写を制御する制御要素の変異または修飾、例えば、プロモーター、ターミネーター、および／またはエンハンスメント要素における変異または修飾によって達成することができる。そのような場合、そのような変異または修飾は、遺伝子の転写の部分的な、または完全な喪失、すなわち、天然かつ非修飾の制御要素と比較した転写の低下または引下げをもたらす。結果として、あるとしても少量の遺伝子産物しか、転写および翻訳後に利用可能でない。さらに、遺伝子の破壊はまた、遺伝子からの局在化シグナルの付加または除去を伴って、その天然の細胞内コンパートメント内での遺伝子産物の存在を減少させ得る。
【0031】
遺伝子破壊の目的は、遺伝子産物の利用可能な量を減少させること（遺伝子産物のいかなる産生も完全に防止することを含む）、または天然もしくは野生型遺伝子産物と比較して、酵素活性を欠く、もしくは酵素活性がより低い遺伝子産物を発現させることである。
【0032】
本明細書中で使用される用語「欠失」または「ノックアウト」は、作動不能である、またはノックアウトされている遺伝子を指す。
【0033】
用語「減弱活性」は、酵素に関連する場合、対照または野生型の状態と比較した、その天然のコンパートメント内での酵素の活性の低下を指す。酵素の減弱活性をもたらす改変として、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、置換、挿入、標的化配列の付加、または標的化配列の除去が挙げられるが、これらに限定されない。減弱酵素活性をもたらす修飾を含有する細胞は、そのような修飾を含有しない細胞と比較して、酵素の活性がより低い。酵素の減弱活性は、非機能性遺伝子産物、例えば、活性を本質的に有していない、例えば、野生型ポリペプチドの活性と比較して約１０％未満またはさらには５％未満の活性しかないポリペプチドをコードすることによって達成されてよい。
【0034】
遺伝子のコドン最適化バージョンとは、細胞中に導入され、かつ特定の細胞に関して遺伝子のコドンが最適化されている外来遺伝子を指す。一般に、全てのｔＲＮＡが、種の全体にわたって等しく、または同じレベルで発現するわけではない。これにより、遺伝子配列のコドン最適化は、最も一般的なｔＲＮＡに一致するように、すなわち、一般性が低いｔＲＮＡによって認識されるコドンを、所与の細胞において比較的一般的なｔＲＮＡによって認識される同義コドンと変えるようにコドンを変えることを含む。このようにして、コドン最適化遺伝子由来のｍＲＮＡは、より効率的に翻訳されることとなる。コドンおよび同義コドンは好ましくは、同じアミノ酸をコードする。
【0035】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すのに互換的に使用される。また、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、脂質結合、グリコシル化、Ｌ－グルタミン酸残基のグリコシル化、硫酸化、ヒドロキシル化、およびγ－カルボキシル化、ならびにＡＤＰ－リボシル化が挙げられるがこれらに限定されない修飾を含む。
【0036】
本明細書中で使用される用語「酵素」は、細胞内の化学反応または生化学反応を触媒するタンパク質として定義される。通常、本発明に従えば、酵素をコードするヌクレオチド配列は、スペルミジンを産生する能力を細胞に付与するのに十分な、細胞内での対応する遺伝子の発現を引き起こすヌクレオチド配列（プロモーター）に作動可能に連結されている。
【0037】
本明細書中で使用される用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの領域を指す。
【0038】
本明細書中で使用される用語「ゲノム」は、宿主細胞におけるプラスミドおよび染色体の双方を包含する。例えば、宿主細胞中に導入される本開示のコード核酸は、当該核酸が染色体に組み込まれているか、プラスミドに局在しているかに拘らず、ゲノムの一部であり得る。
【0039】
本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、１つ以上の遺伝子の転写を制御する機能を有する核酸配列を指し、これは、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する。この文脈における適切なプロモーターとして、天然の構成的プロモーターおよび誘導プロモーターの双方、ならびに改変されたプロモーターが挙げられ、これらは当業者に周知である。
【0040】
酵母細胞での使用に適したプロモーターとして、ＰＤＣ、ＧＰＤ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、およびＴＤＨのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターとして、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＣＵＰ１、ＨＩＳ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＴＰＩ、ＡＯＸ１、およびＥＮＯｌのプロモーターが挙げられる。
【0041】
本明細書中で使用される用語「ターミネーター」は、特に明記しない限り、「転写終止シグナル」を指す。ターミネーターは、ポリメラーゼの転写を妨害または停止する配列である。
【0042】
本明細書中で使用される、本開示に従う「組換え真核細胞」は、内因性核酸配列の追加のコピーを含有するか、または真核細胞内に天然には存在しないポリペプチドもしくはヌクレオチド配列で形質転換されているか、もしくは遺伝的に修飾されている細胞と定義される。野生型真核細胞は、本明細書中で使用される組換え真核細胞の親細胞と定義される。
【0043】
本明細書中で使用される用語「増大する」、「増大した」、「増大している」、「増強する」、「増強した」、「増強している」、および「増強」（およびそれらの文法的変形）は、対照と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の、またはそれらの中のあらゆる範囲の上昇を示す。
【0044】
本明細書中で使用される用語「引き下げる」、「引き下げられた」、「引下げ」、「減少させる」、「抑制する」、および「低下させる」、ならびに類似した用語は、対照と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上の、またはそれらの中のあらゆる範囲の低下を意味する。
【0045】
本明細書中で使用される遺伝子の発現の引下げは、遺伝子の転写を減少させ、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を減少させ、かつ／またはｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の翻訳後プロセシングを減少させる遺伝的修飾を含む。そのような遺伝的修飾として、遺伝子の制御配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーになされる挿入、欠失、置換、または変異が挙げられる。例えば、遺伝子のプロモーターは、あまり活性がないか、またはあまり誘導性でないプロモーターによって置き換えられることによって、遺伝子の転写を減少させ得る。また、プロモーターのノックアウトは、遺伝子の発現の引下げ、典型的には０をもたらす。
【0046】
本明細書中で使用される用語、本発明のヌクレオチド配列の「一部、部分」または「断片」は、参照核酸またはヌクレオチド配列と比較して長さが短く、かつ参照核酸またはヌクレオチド配列と同一またはほぼ同一、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、または９９％同一の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、かつ／またはそれからなるヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明に従うそのような核酸断片または部分は、適切な場合には、より大きなポリヌクレオチド内に構成要素となって含まれてもよい。
【0047】
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書中で「相同体」と称される。用語相同体は、同じ種および他の種由来の相同配列、ならびに同じ種および他の種由来のオーソログ配列を含む。「相同性」は、２つ以上の核酸配列間および／またはアミノ酸配列間の、位置同一性、すなわち配列類似性または同一性のパーセントに換算した類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸間またはタンパク質間での類似の機能的特性の概念を指す。ゆえに、本発明の組成物および方法はさらに、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対する相同体を含む。本明細書中で使用される「オーソログ」は、種分化中に共通の祖先遺伝子から生じた、異なる種において相同なヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列の相同体は、前記ヌクレオチド配列と実質的な、例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％の配列同一性を有する。
【0048】
本明細書中で使用される用語「過剰発現させる」または「過剰発現」は、例えば過剰発現することになる特定の異種ポリペプチドまたは組換えポリペプチドで形質転換されていない、その天然または対照の状態の細胞内で存在するよりも、遺伝子の高いレベルの活性、例えば遺伝子の転写；ｍＲＮＡの、タンパク質への高いレベルの翻訳；および／または遺伝子産物、例えばポリペプチドの高いレベルの産生を指す。過剰発現遺伝子の典型的な例が、遺伝子の天然プロモーターと比較して別のプロモーターの転写制御下にある遺伝子である。また、または代替的に、遺伝子の制御要素、例えばエンハンサーの他の変化を使用して、特定の遺伝子を過剰発現させることができる。さらに、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳に影響を及ぼす、すなわちこれを増大させる修飾を、代替的に、または追加的に使用して、本明細書中で使用される過剰発現遺伝子を達成することができる。また、当該用語は、細胞内の遺伝子のコピー数の増大、ならびに／またはｍＲＮＡおよび／もしくは遺伝子産物の量の増大を指し得る。さらに、同じ、または相同な遺伝子産物、例えば酵素をコードする、異なる種由来の遺伝子を含めることによって、過剰発現を達成することが可能である。過剰発現は、対照レベルと比較して、細胞内で、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％、１５００％、２０００％、もしくはそれよりも高いレベル、またはそれらの中のあらゆる範囲をもたらし得る。
【0049】
本明細書中で使用される用語「外来」または「異種」は、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、タンパク質、または遺伝子に関して使用される場合、それが導入される細胞、生物、ゲノム、またはＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列の一部として天然に存在しない核酸、タンパク質、または遺伝子（天然に存在するヌクレオチド配列の、天然に存在しない複数のコピーを含む）を指す。そのような外来遺伝子は、別の種もしくは株由来の遺伝子、宿主細胞内に天然に存在する遺伝子の修飾されたか、変異したか、もしくは進化したバージョン、または宿主細胞もしくは融合遺伝子内に天然に存在する遺伝子のキメラバージョンであり得る。これらの前者の場合、修飾、変異、または進化は、遺伝子のヌクレオチド配列の変化を引き起こすことによって、宿主細胞内に天然に存在する遺伝子と比較して別のヌクレオチド配列を有する、修飾されたか、変異したか、または進化した遺伝子が得られる。進化した遺伝子とは、進化した遺伝子をコードし、かつ野生型遺伝子または本来の遺伝子と比較して異なるヌクレオチド配列を有する新しい遺伝子を誘導するような遺伝的修飾、例えば変異、または進化的圧力への曝露によって得られる遺伝子を指す。キメラ遺伝子は、新しい遺伝子を生成するような、１つ以上のコード配列の部分の組合せによって形成される。これらの修飾は、遺伝子配列全体を単一のリーディングフレームに統合しており、かつ多くの場合、それらの元々の機能を保持する融合遺伝子とは異なる。
【0050】
「内因性」、「天然の」、または「野生型」核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列は、天然に存在するか、または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列を指す。ゆえに、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物内に天然に存在するか、または生物に内在するｍＲＮＡである。
【0051】
本明細書中で使用される用語「修飾された」は、生物に関して使用される場合、少なくとも１つのポリアミン類似体の産生を可能にするように修飾された宿主生物（そのように修飾されていない、普通であれば同一の宿主生物と比較）を指す。原則として、本開示に従うそのような「修飾」は、宿主生物におけるポリアミン類似体の産生を（修飾を受けていない、普通であれば同一の生物と比較して）適切に変更するあらゆる生理学的、遺伝的、化学的、または他の修飾を含み得る。しかしながら、ほとんどの実施形態において、修飾は、遺伝的修飾を含むこととなる。特定の実施形態において、本明細書中に記載される修飾は、遺伝子を宿主細胞中に導入することを含む。ポリペプチドの活性をブーストする遺伝的修飾は、以下に限定されないが：ポリペプチドをコードする遺伝子（同じ活性を有するポリペプチドをコードする、宿主細胞内に既に存在するあらゆる遺伝子から区別することができる）の１つ以上のコピーを導入することと；遺伝子の転写または翻訳を増大させるように、細胞内に存在する遺伝子を変更（例えば、調節配列、プロモーター配列、または他の配列について、変更、さらなる配列を付加、１つ以上のヌクレオチドを置換、配列を欠失、または交換）することと；活性をブーストするように、ポリペプチドをコードする遺伝子の配列（例えば、非コード配列またはコード配列）を（例えば、酵素活性を増大させること、フィードバック阻害を低下させること、特定の細胞内位置を標的化すること、ｍＲＮＡ安定性をブーストすること、タンパク質安定性をブーストすることによって）変更することとを含む。ポリペプチドの活性を引き下げる遺伝的修飾は、以下に限定されないが、ポリペプチドをコードする遺伝子の一部または全てを欠失させることと；ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊する核酸配列を挿入することと；細胞内に存在する遺伝子を変化させて、遺伝子の転写もしくは翻訳、または遺伝子によってコードされるｍＲＮＡもしくはポリペプチドの安定性を（例えば、１つ以上のヌクレオチドにさらなる配列を付加し、当該ヌクレオチドを変更し、当該ヌクレオチドから配列を欠失させ、当該ヌクレオチドを置換し、または当該ヌクレオチドを交換することによって、例えば、１つ以上のヌクレオチド、プロモーター配列、調節配列、もしくは他の配列を置換することによって）減少させることとを含む。用語「過剰産生」は、宿主細胞内の産物の産生に関して本明細書中で使用されており、宿主細胞の代謝経路に関与する様々なポリペプチドをコードする核酸配列の導入により、または他の修飾の結果として、宿主細胞が、非修飾宿主細胞または野生型細胞と比較して、より多くの産物を産生することを示す。
【0052】
本明細書中で使用される用語「ベクター」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつその発現を確実にするさらなるヌクレオチドに作動可能に連結されている直鎖ＤＮＡ分子または環状ＤＮＡ分子と定義される。
【0053】
酵母細胞の文脈における「導入すること」は、核酸分子が細胞の内部にアクセスするように、核酸分子を細胞と接触させることを意味する。したがって、ポリヌクレオチドおよび／または核酸分子を酵母細胞に、別個の形質転換事象における単回の形質転換事象で導入することができる。ゆえに、本明細書中で使用される用語「形質転換」は、細胞中への異種核酸の導入を指す。酵母細胞の形質転換は、安定性があってもよいし、一過性であってもよい。
【0054】
ポリヌクレオチドの文脈における「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが、細胞中に導入されて、細胞のゲノム中に組み込まれないことを意味する。
【0055】
細胞中に導入されるポリヌクレオチドの文脈にける「安定に導入すること」または「安定に導入された」とは、導入されたポリヌクレオチドが、細胞のゲノム中に安定に組み込まれることで、細胞がポリヌクレオチドにより安定に形質転換されることが意図される。本明細書中で使用される「安定性形質転換」または「安定に形質転換された」は、核酸分子が細胞中に導入されて、細胞のゲノム中に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その後代によって、より具体的には複数の連続した世代の後代によって継承されることができる。また、本明細書中で使用される安定性形質転換は、例えばミニ染色体として、染色体外に維持される核酸分子を指すこともできる。
【0056】
一過性形質転換は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットによって検出され得、これらは、生物中に導入された１つ以上の核酸分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することができる。細胞の安定性形質転換は、例えば、細胞のゲノムＤＮＡの、生物（例えば酵母）中に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列とのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定性形質転換は、例えば、細胞のＲＮＡの、酵母または他の生物中に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列とのノザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。また、細胞の安定性形質転換は、例えば、核酸分子の標的配列とハイブリダイズして、標的配列の増幅をもたらす（これを、標準的な方法に従って検出することができる）特異的プライマー配列を用いる、当該技術において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅反応によって検出することができる。また、形質転換は、当該技術において周知の直接配列決定および／またはハイブリダイゼーションプロトコールによって検出することもできる。
【0057】
また、本発明の実施形態は、本明細書中で定義されるポリペプチドの変異体を包含する。本明細書中で使用される「変異体」は、配列内の１つ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸で置換されているという点で、アミノ酸配列が、これが由来する塩基配列と異なるポリペプチドを意味する。例えば、配列番号１の変異体は、配列番号１と少なくとも約５０％同一の、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を有し得る。変異体および／または断片は、変異体配列が、本明細書中で指定される非変異体アミノ酸配列を有する酵素と類似するか、または同一の機能的酵素活性特性を有するという点で、機能的変異体／断片である（そしてこれは、本明細書の全体を通して使用される用語「機能的変異体」の意味である）。
【0058】
したがって、提示されるアミノ酸配列のいずれかの「機能的変異体」または「機能的断片」は、非変異体配列と同じ酵素カテゴリー（すなわち、同じＥＣ番号を有する）内に残るあらゆるアミノ酸配列である。酵素が特定のカテゴリーに入るかを判定する方法が、当業者に周知であり、当業者であれば、本発明の技術を使用せずとも酵素カテゴリーを決定することができる。適切な方法は、例えば、国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）から得ることができる。
【0059】
アミノ酸置換は、アミノ酸が、特性が大まかには類似する異なるアミノ酸で置換されている場合、「保存的」であるとみなされ得る。非保存的置換は、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換されている場合である。
【0060】
「保存的置換」とは、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味し、クラスは、以下のように定義される：クラスアミノ酸の例
非極性：Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非荷電極性：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性：Ｄ、Ｅ
塩基性：Ｋ、Ｒ、Ｈ。
非極性：Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非荷電極性：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性：Ｄ、Ｅ
塩基性：Ｋ、Ｒ、Ｈ。
【0061】
当業者に周知であるように、保存的置換によってポリペプチドの一次構造を変更しても、当該ポリペプチドの活性が大きく変更されない場合がある。なぜなら、配列中に挿入されるアミノ酸の側鎖は、置換されたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成することができる場合があるからである。これは、置換が、ポリペプチドの高次構造を決定するのに重要な領域内にある場合でも、そうである。
【0062】
本発明の実施形態において、本明細書中の他の箇所で定義されるように、ポリペプチドの酵素活性を妨げない限り、非保存的置換が可能である。酵素の置換バージョンは、上記のＮＣ－ＩＵＢＭＢ命名法を使用して決定される、非置換酵素と同じ酵素クラスのままであるような特徴を保持しなければならない。
【0063】
大まかに言えば、ポリペプチドの生物学的活性を変更することのない、保存的置換よりも少ない非保存的置換が可能であろう。任意の置換の（実際には、任意のアミノ酸の欠失または挿入の）効果の決定は、完全に、本発明の態様に従って、変異体ポリペプチドが酵素活性を保持しているかを容易に判定することができる当業者のルーチン能力の範囲内である。例えば、ポリペプチドの変異体が、本発明の範囲に入る（すなわち、先で定義される「機能的変異体または断片」である）かを判定する場合、当業者は、変異体または断片が、本明細書中の他の箇所で言及されているＮＣ－ＩＵＢＭＢ命名法を参照して定義される基質変換酵素活性を保持しているかを判定することとなる。そのような変異体は全て、本発明の範囲内である。
【0064】
標準的な遺伝コードを使用して、ポリペプチドをコードするさらなる核酸配列が、本明細書中で開示されるものに加えて、当業者によって容易に考えられ、かつ製造され得る。核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ分子である場合、例えば、ｃＤＮＡを含んでもゲノムＤＮＡを含んでもよい。核酸は、本明細書中の他の箇所に記載されるように、発現ベクター内に含有されてよい。
【0065】
したがって、本発明の実施形態は、本発明の実施形態によって企図されるポリペプチドをコードする変異体核酸配列を包含する。核酸配列に関する用語「変異体」は、ポリヌクレオチドによってコードされる、結果として生じるポリペプチド配列が、塩基配列によってコードされるポリペプチドと少なくとも同じか、または類似の酵素特性を示すことを条件とした、ポリヌクレオチド配列からの、またはポリヌクレオチド配列への１つ以上のヌクレオチドの任意の置換、変異、修飾、置換、欠失、または付加を意味する。当該用語は、対立遺伝子変異体を含み、そしてまた、本発明の実施形態のポリヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（「プローブ配列」）も含む。そのようなハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件にて、高ストリンジェンシー条件にて、またはそれらの間で起こり得る。一般的に、用語低ストリンジェンシー条件は、洗浄工程が０．３３０～０．８２５Ｍ ＮａＣｌバッファ溶液中で、プローブ配列の計算されたか、または実際の融解温度）（Ｔｍ）よりも約４０～４８℃低い温度（例えば、約ラボ周囲温度～約５５℃にて起こるハイブリダイゼーションと定義することができる。一方、高ストリンジェンシー条件は、プローブ配列の計算されたか、または実際のＴｍよりも約５～１０℃低い温度（例えば、約６５℃）での、０．０１６５～０．０３３０Ｍ Ｎバッファ溶液中での洗浄を含む。バッファ溶液は、例えば、生理食塩水－クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム）であってよく、低ストリンジェンシー洗浄は３×ＳＳＣバッファ中で行い、高ストリンジェンシー洗浄は０．１×ＳＳＣバッファ中で行う。核酸配列のハイブリダイゼーションに関係する工程は、例えば分子クローニング、ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）［第２版］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９において、例えばその第１１節「合成オリゴヌクレオチドプローブ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ）」において記載されている。
【0066】
好ましくは、核酸配列変異体は、本発明の実施形態の核酸配列と共通のヌクレオチドの約８０％以上、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。
【0067】
本発明の変異体核酸は、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されていてよい。
【0068】
本明細書中で使用される「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列間、または２つのペプチドもしくはタンパク質配列間の配列類似性を指す。類似性は、配列間の構造的関係および／または機能的関係を判定するための配列アラインメントによって判定される。
【0069】
アミノ酸配列間の配列同一性は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，米国から入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アラインメントツール（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）を使用して、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを介して、デフォルトパラメータ設定（タンパク質アラインメントについて、ギャップコスト存在（Ｇａｐ ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）：１１伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）：１）を使用して、配列のアラインメントを比較することによって求めることができる。本明細書中で言及される配列比較および同一性パーセンテージは、このソフトウェアを使用して求めた。配列同一性のレベルを、例えば配列番号１と比較する場合、比較は、好ましくは、高い同一性重複の短い領域が、同一性の高い全体評価を生じさせることを回避するために、配列番号１の全長に対してなされるべきである（すなわち、グローバルアライメント法を用いる）。例えば、例えば５つのアミノ酸を有する短いポリペプチド断片は、配列番号１の全体の中で５つのアミノ酸領域に対して１００％同一の配列を有する場合があるが、これは、当該断片が、配列番号１内の位置に相当する他の位置でも同一のアミノ酸を有するより長い配列の部分を形成する場合を除き、１００％のアミノ酸同一性を与えない。比較される配列中の等しい位置が、同じアミノ酸によって占められている場合、分子は、当該位置にて同一である。同一性のパーセンテージとしてのアラインメントのスコアリングは、比較される配列によって共有される位置にて同一のアミノ酸の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアライメントは、配列内の可能性のある挿入および欠失を考慮するように、配列の１つ以上にギャップが導入されることを求めてもよい。配列比較方法は、比較される配列内の同じ数の同一分子について、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメントが、ギャップが多いものよりも高いスコアを達成することとなるように、ギャップペナルティを使用してもよい。最大同一性パーセントの計算は、ギャップペナルティを考慮した、最適なアライメントの生成を含む。上述のように、配列同一性パーセンテージは、デフォルトのパラメータ設定を使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバル配列アラインメント（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）ツールを使用して求めてもよい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）第４８巻：４４３－４５３において発表された。
【0070】
本発明の一態様は、少なくとも１つのポリアミン類似体を産生することができる酵母細胞に関する。酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンを産生することができる。酵母細胞は、少なくとも１つの補酵素Ａ（ＣｏＡ）リガーゼコード遺伝子、好ましくは４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子、および少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を含むが、ポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を欠いているか、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む。
【0071】
本発明の酵母細胞は、カルボキシル基含有分子をＣｏＡエステルに変換することができる４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）をコードする遺伝子を含む。次いで、対応するＣｏＡエステルは、酵母細胞によって産生された少なくとも１つのポリアミンと共に、ポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼの基質となり、これによって少なくとも１つのポリアミン類似体が得られる（少なくとも１つのポリアミン類似体をアセチル化し、かつ少なくとも１つのポリアミンとＣｏＡエステル間にアミド結合を形成することによる）。
【0072】
一実施形態において、酵母細胞は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの過剰発現のために改変されている。
【0073】
一実施形態において、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの過剰発現は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子を、酵母細胞内で高度に活性なプロモーターの転写制御下に置くことによって達成される。酵母細胞での使用に適したプロモーターとして、ＰＤＣ、ＧＰＤ、ＧＰＤ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＴＤＨ、およびＴＤＨ３のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターとして、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＣＵＰ１、ＨＩＳ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＴＰＩ、ＡＯＸ１、およびＥＮＯｌのプロモーターが挙げられる。
【0074】
酵母細胞は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子の１つまたは複数、すなわち少なくとも２つのコピーを含み、これによって、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ用のｍＲＮＡのコピー数を増大させ、かつこれによって、酵母細胞によって産生される４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの量を増大させることができる。そのような場合、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子の複数のコピーは、１つのプロモーターの転写制御下にあってもよいし、各４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子が、それぞれのプロモーターの転写制御下にあってもよい。後者の場合、同じタイプのプロモーターを使用して、それぞれの４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子の転写を制御してもよいし、異なるタイプのプロモーターを使用してもよい。
【0075】
一実施形態において、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）コード遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ１（Ａｔ４ＣＬ１）、Ａｔ４ＣＬ２、Ａｔ４ＣＬ３、Ａｔ４ＣＬ４、またはＡｔ４ＣＬ５、および４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼＡｔ４ＣＬ１、Ａｔ４ＣＬ２、Ａｔ４ＣＬ３、Ａｔ４ＣＬ４、またはＡｔ４ＣＬ５のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）４ＣＬ１（配列番号１）、４ＣＬ２、４ＣＬ３、４ＣＬ４、または４ＣＬ５のいずれかと少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこの４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼは、カルボキシル基含有分子の、ＣｏＡエステルへの変換を触媒することができ、好ましくは４－クマラートの、４－クマロイル－ＣｏＡへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有する４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの酵素効率は、関連する４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼの対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0076】
特定の実施形態において、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子はＡｔ４ＣＬ１である。Ａｔ４ＣＬ１のアミノ酸配列を配列番号１に示し、Ａｔ４ＣＬ１のヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【0077】
一実施形態において、酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼの過剰発現のために改変されている。
【0078】
一実施形態において、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼの過剰発現は、少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子を、酵母細胞内で高度に活性なプロモーターの転写制御下に置くことによって達成される。酵母細胞での使用に適したプロモーターとして、ＰＤＣ、ＧＰＤ、ＧＰＤ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＴＤＨ、およびＴＤＨ３のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターとして、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＣＵＰ１、ＨＩＳ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＴＰＩ、ＡＯＸ１、およびＥＮＯｌのプロモーターが挙げられる。
【0079】
酵母細胞は、ポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子の１つまたは複数のコピーを含み、これによって、ポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ用のｍＲＮＡのコピー数を増大させ、かつこれによって、酵母細胞によって産生されるポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼの量を増大させることができる。そのような場合、ポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子の複数のコピーは、１つのプロモーターの転写制御下にあってもよいし、各ポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子が、それぞれのプロモーターの転写制御下にあってもよい。後者の場合、同じタイプのプロモーターを使用して、それぞれのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子の転写を制御してもよいし、異なるタイプのプロモーターを使用してもよい。
【0080】
一実施形態において、酵母細胞は、スペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１Ｍ３４）コード遺伝子、スペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２４９）コード遺伝子、およびプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１３８）コード遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む。
【0081】
特定の実施形態において、スペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＳＨＴ）コード遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）スペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＡｔＳＨＴ）、ニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＤＨ２９（ＮａＤＨ２９）、およびスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＡｔＳＨＴ（配列番号３）またはスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＮａＤＨ２９（配列番号５）と少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＨＴまたはニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＤＨ２９のいずれかと少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、スペルミジンおよびＣｏＡエステルの、ポリアミン類似体への変換を触媒することができ、好ましくは、スペルミジンおよびクマロイル－ＣｏＡ、フェルロイル－ＣｏＡ、カフェオイル－ＣｏＡ、シンナモイル－ＣｏＡ、またはシナポイル－ＣｏＡの、Ｎ１－（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）スペルミジン、Ｎ１０－（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）スペルミジン、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）スペルミジン、および／またはＮ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）スペルミジンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの酵素効率は、関連するスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0082】
ＳＨＴコード遺伝子は、ポリアミンアルカロイド、特に一置換、二置換（ビス置換とも称される）、および／または三置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンに関して、酵母細胞内でのポリアミン類似体の産生を触媒している。特定の実施形態において、そのようなＳＨＴコード遺伝子を４ＣＬコード遺伝子と共に発現させることにより、酵母細胞は、ＡｔＳＨＴの場合には対称性の三置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンを、ＮａＤＨ２９の場合には対称性の単一置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンを産生することができる。
【0083】
ＡｔＳＨＴのアミノ酸配列を配列番号３に示し、ＡｔＳＨＴのヌクレオチド配列を配列番号４に示す。ＮａＤＨ２９の対応するアミノ酸配列を配列番号５に示し、ＮａＤＨ２９のヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【0084】
一実施形態において、スペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＳＣＴ）コード遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）スペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＡｔＳＣＴ）、およびスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼＡｔＳＣＴと少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＣＴ（配列番号７）と少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼは、スペルミジンおよびＣｏＡエステルの、ポリアミン類似体への変換を触媒することができ、好ましくは、スペルミジンおよびクマロイル－ＣｏＡ、フェルロイル－ＣｏＡ、カフェオイル－ＣｏＡ、シンナモイル－ＣｏＡ、またはシナポイル－ＣｏＡの、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）スペルミジンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミジンクマロイル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼの酵素効率は、ＡｔＳＣＴの対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0085】
ＳＣＴコード遺伝子は、ポリアミンアルカロイド、特に二置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンに関して、酵母細胞内でのポリアミン類似体の産生を触媒している。特定の実施形態において、そのようなＳＣＴコード遺伝子を４ＣＬコード遺伝子と共に発現させることにより、酵母細胞は、ＡｔＳＣＴの場合には対称性の二置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンを産生することができる。
【0086】
ＡｔＳＣＴのアミノ酸配列を配列番号７に示し、ＡｔＳＣＴのヌクレオチド配列を配列番号８に示す。
【0087】
一実施形態において、プトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子は、ニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＡＴ１（ＮａＡＴ１）、およびプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼＮａＡＴ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）ＡＴ１（配列番号９）と少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、プトレシンおよびＣｏＡエステルの、ポリアミン類似体への変換を触媒することができ、好ましくは、プトレシンおよびクマロイル－ＣｏＡ、フェルロイル－ＣｏＡ、カフェオイル－ＣｏＡ、シンナモイル－ＣｏＡ、またはシナポイル－ＣｏＡの、Ｎ１－（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）プトレシン、Ｎ６－ビス（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）プトレシン、および／またはＮ１，Ｎ６－ビス（クマロイル、フェルロイル、カフェオイル、シンナモイル、またはシナポイル）プトレシンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの酵素効率は、ＮａＡＴ１の対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0088】
プトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子は、ポリアミンアルカロイド、特に二置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはプトレシンに関して、酵母細胞内でのポリアミン類似体の産生を触媒している。特定の実施形態において、そのようなプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子を４ＣＬコード遺伝子と共に発現させることにより、酵母細胞は、ＮａＡＴ１の場合には対称性の二置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはプトレシンを産生することができる。
【0089】
ＮａＡＴ１のアミノ酸配列を配列番号９に示し、ＮａＡＴ１のヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。
【0090】
一実施形態において、酵母細胞は、複数のタイプのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む。それゆえに、実施形態は、Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、ＡｔＳＨＴおよび／またはＮａＤＨ２９等のＳＨＴコード遺伝子、ならびにＡｔＳＣＴ等のＳＣＴコード遺伝子を含む酵母細胞；Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、ＡｔＳＨＴおよび／またはＮａＤＨ２９等のＳＨＴコード遺伝子、ならびにＮａＡＴ１等のプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む酵母細胞；Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、ＡｔＳＣＴ等のＳＣＴコード遺伝子、およびＮａＡＴ１等のプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む酵母細胞；ならびにＡｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、ＡｔＳＨＴおよび／またはＮａＤＨ２９等のＳＨＴコード遺伝子、ＡｔＳＣＴ等のＳＣＴコード遺伝子、ならびにＮａＡＴ１等のプトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む酵母細胞を包含する。例えば、Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、ＡｔＳＣＴ等のＳＣＴコード遺伝子、およびＡｔＳＨＴ等のＳＨＴコード遺伝子を含む酵母細胞は、非対称三置換Ｎ－アシル化ポリアミン、好ましくはスペルミジンを産生することができる。
【0091】
一実施形態において、芳香族有機酸、脂肪酸、ハロゲン化芳香族有機酸、ハロゲン化脂肪酸、またはそれらの組合せ等のカルボキシル基含有分子は、酵母細胞が培養される培地に添加される。それゆえに、この実施形態において、酵母細胞に、酵母細胞によって発現される４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼによってＣｏＡエステルに変換されるカルボキシル基含有分子が供給される。次いで、酵母細胞に、単一のカルボキシル基含有分子、または異なるカルボキシル基含有分子の混合物が供給されてもよい。例えば、Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、およびＡｔＳＨＴ等のＳＨＴコード遺伝子を含む酵母細胞は、芳香族有機酸の混合物を供給する場合、スペルミジン等の非対称三置換Ｎ－アシル化ポリアミンを産生することができる。これに対応して、Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、およびＡｔＳＣＴ等のＳＣＴコード遺伝子を含む酵母細胞は、芳香族有機酸の混合物を供給する場合、スペルミジン等の非対称二置換Ｎ－アシル化ポリアミンを産生することができる。Ａｔ４ＣＬ１等の４ＣＬコード遺伝子、およびＮａＤＨ２９等のＳＨＴコード遺伝子を含む酵母細胞は、芳香族有機酸の混合物を供給する場合、スペルミジン等の対称性の一置換Ｎ－アシル化ポリアミンを産生することができる。
【0092】
芳香族有機酸および／または脂肪酸および／またはそれらのハロゲン化バージョン等のカルボキシル基含有分子を酵母細胞に供給する代わりに、または供給の補足として、酵母細胞は、カルボキシル基含有分子を産生または過剰産生するように改変することができる。それゆえに、特定の実施形態において、酵母細胞は、芳香族有機酸、ハロゲン化芳香族有機酸、脂肪酸、ハロゲン化脂肪酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの有機酸を産生することができる。そのような芳香族有機酸および／または脂肪酸の産生について改変された酵母細胞は、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５に開示されている。これらの、酵母細胞が、芳香族有機酸、ハロゲン化芳香族有機酸、脂肪酸、ハロゲン化脂肪酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの有機酸を産生することができることに関する教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0093】
しかしながら、本発明の酵母細胞においてそのようなカルボキシル基含有分子を過剰産生すると、例えば芳香族アミノ酸（ＡＡＡ）代謝に関して、ポリアミン代謝とカルボキシル基含有分子の代謝との間にフラックスアンバランスを引き起こす場合がある。カルボキシル基含有分子の別の供給源は、培地にカルボキシル基含有分子を添加することによって酵母細胞に供給する代わりに、または供給の補足として、本発明の酵母細胞を、カルボキシル基含有分子を産生かつ分泌することができる微生物細胞、好ましくは酵母細胞と共培養することである。非限定的であるが例示的な、本発明の酵母細胞と共培養することができるそのような微生物細胞の例が、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９；およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５に開示されている。
【0094】
本明細書中で使用されるハロゲン化芳香族有機酸として、ハロゲン置換芳香族有機酸が挙げられ、ハロゲン化脂肪酸として、ハロゲン置換脂肪酸が挙げられる。そのようなハロゲン置換芳香族有機酸およびハロゲン置換脂肪酸の実例として、フッ素置換、塩素置換、臭素置換、およびヨウ素置換された芳香族有機酸および脂肪酸、好ましくはフッ素置換された芳香族有機酸および脂肪酸が挙げられる。
【0095】
一実施形態において、少なくとも１つのポリアミンは、スペルミン、サーモスペルミン、ｓｙｍ－ホモスペルミジン、１，３－ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、スペルミジン、ｓｙｍ－ノルスペルミジン、ノルスペルミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【0096】
本発明の酵母細胞は、ポリアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．５．３．１７）コード遺伝子を欠いており、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む。また、酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を含む。
【0097】
酵母細胞によって発現される少なくとも１つのポリアミンシンターゼは、酵母細胞内での少なくとも１つのポリアミンの産生を触媒する。ポリアミンオキシダーゼは、スペルミンの、スペルミジンに戻る変換を触媒する酵素である。それゆえに、酵母細胞は、あらゆるポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を欠いており、または破壊されたポリアミンオキシダーゼコード遺伝子を含む。これは、酵母細胞が好ましくは、あらゆるポリアミンオキシダーゼを欠くか、またはそのようなポリアミンオキシダーゼが酵母細胞内で発現されるならば、ポリアミンオキシダーゼは好ましくは、酵素的に不活性であるか、または少なくとも、天然のポリアミンオキシダーゼと比較して酵素効率がかなり低いことを意味する。
【0098】
一実施形態において、酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンシンターゼの過剰発現のために改変されている。
【0099】
一実施形態において、少なくとも１つのポリアミンシンターゼの過剰発現は、少なくとも１つのポリアミンシンターゼコード遺伝子を、酵母細胞内で高度に活性なプロモーターの転写制御下に置くことによって達成される。酵母細胞での使用に適したプロモーターとして、ＰＤＣ、ＧＰＤ、ＧＰＤ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＴＤＨ、およびＴＤＨ３のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なプロモーターとして、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＣＵＰ１、ＨＩＳ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＴＰＩ、ＡＯＸ１、およびＥＮＯｌのプロモーターが挙げられる。
【0100】
酵母細胞は、ポリアミンシンターゼコード遺伝子の１つまたは複数のコピーを含み、これによって、ポリアミンシンターゼ用のｍＲＮＡのコピー数を増大させ、かつこれによって、酵母細胞によって産生されるポリアミンシンターゼの量を増大させることができる。そのような場合、ポリアミンシンターゼコード遺伝子の複数のコピーは、１つのプロモーターの転写制御下にあってもよいし、各ポリアミンシンターゼコード遺伝子が、それぞれのプロモーターの転写制御下にあってもよい。後者の場合、同じタイプのプロモーターを使用して、それぞれのポリアミンシンターゼコード遺伝子の転写を制御してもよいし、異なるタイプのプロモーターを使用してもよい。
【0101】
一実施形態において、ポリアミンシンターゼコード遺伝子は、スペルミンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．２２）コード遺伝子、サーモスペルミンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．７９）コード遺伝子、およびホモスペルミジンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．４４またはＥＣ２．５．１．４５）コード遺伝子からなる群から選択される。
【0102】
一実施形態において、スペルミンシンターゼコード遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）スペルミンシンターゼ、好ましくはＳｃＳＰＥ４、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）スペルミンシンターゼ（ＡｔＳＰＭＳ）、およびスペルミンシンターゼＳｃＳＰＥ４またはスペルミンシンターゼＡｔＳＰＭＳと少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＳｃＳＰＥ４またはＡｔＳＰＭＳと少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するスペルミンシンターゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのスペルミンシンターゼは、スペルミジンの、スペルミンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するスペルミンシンターゼの酵素効率は、ＳｃＳＰＥ４またはＡｔＳＰＥＳの対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0103】
ＳｃＳＰＥ４のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、ＳｃＳＰＥ４のヌクレオチド配列を配列番号１２に示す。ＡｔＳＰＭＳの対応するアミノ酸配列を配列番号１３に示し、ＡｔＳＰＭＳのヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。
【0104】
一実施形態において、サーモスペルミンシンターゼコード遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）サーモスペルミンシンターゼ、好ましくはＡｔＡＣＬ５、およびサーモスペルミンシンターゼＡｔＡＣＬ５と少なくとも８０％の配列同一性を有するサーモスペルミンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＡｔＡＣＬ５と少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するサーモスペルミンシンターゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのサーモスペルミンシンターゼは、スペルミジンの、サーモスペルミンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するサーモスペルミンシンターゼの酵素効率は、ＡｔＡＣＬ５の対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0105】
ＡｔＡＣＬ５のアミノ酸配列を配列番号１５に示し、ＡｔＡＣＬ５のヌクレオチド配列を配列番号１６に示す。
【0106】
一実施形態において、ホモスペルミジンシンターゼ（ＨＳＳ）コード遺伝子は、ハナノボロギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｖｅｒｎａｌｉｓ）ホモスペルミジンシンターゼ（ＳｖＨＳＳ）、ブラストクロリス・ビリディス（Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）ホモスペルミジンシンターゼ（ＢｖＨＳＳ）、およびホモスペルミジンシンターゼＳｖＨＳＳまたはホモスペルミジンシンターゼＢｖＨＳＳと少なくとも８０％の配列同一性を有するホモスペルミジンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＳｖＨＳＳまたはＢｖＨＳＳと少なくとも８５％、またはさらには９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するホモスペルミジンシンターゼをコードする。一実施形態において、少なくとも８０％の配列同一性を有するこのホモスペルミジンシンターゼは、プトレシンの、ｓｙｍ－ホモスペルミジンへの変換、またはプトレシンもしくはスペルミジンの、ｓｙｍ－ホモスペルミジンへの変換を触媒することができる。少なくとも８０％の配列同一性を有するホモスペルミジンシンターゼの酵素効率は、ＳｖＨＳＳまたはＢｖＨＳＳの対応する酵素効率よりも低くても、これと実質的に等しくても、これよりも高くてもよく、好ましくは少なくとも実質的に等しいか、またはより高い酵素効率である。
【0107】
ＳｖＨＳＳのアミノ酸配列を配列番号１７に示し、ＳｖＨＳＳのヌクレオチド配列を配列番号１８に示す。ＢｖＨＳＳの対応するアミノ酸配列を配列番号１９に示し、ＢｖＨＳＳのヌクレオチド配列を配列番号２０に示す。
【0108】
一実施形態において、酵母細胞は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ナドソニア（Ｎａｄｓｏｎｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ロードスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、およびアシビア（Ａｓｈｂｙａ）属からなる群から選択される。特定の実施形態において、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、チゴサッカロマイセス・バイリィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、カンジダ・スファエリカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｈａｅｒｉｃａ）、またはシゾサッカロマイセス・マリデヴォランス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｌｉｄｅｖｏｒａｎｓ）からなる群から選択される。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい酵母種である。
【0109】
一実施形態において、酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞であり、ポリアミンオキシダーゼはＦＭＳ１である。それゆえに、一実施形態において、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞はＦＭＳ１を欠いており、または破壊されたＦＭＳ１を含む。
【0110】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのポリアミン類似体を産生することができる酵母細胞に関する。酵母細胞は、少なくとも１つのポリアミンを産生することができる。酵母細胞は、４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼコード遺伝子および少なくとも１つのポリアミンＮ－アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【0111】
また、前掲の酵母細胞の種々の実施形態は、本発明のこの態様に利用することができる。
【0112】
本発明のさらなる態様は、ポリアミン類似体を生成する方法に関する。本方法は、本発明に従う酵母細胞を、培地中で、酵母細胞によるポリアミン類似体の産生に適した培養条件で培養することを含む。また、本方法は、ポリアミン類似体を培地から、および／または酵母細胞から収集することを含む。
【0113】
一実施形態において、酵母細胞を培養することは、芳香族有機酸、脂肪酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの有機酸を含む培地中で酵母細胞を培養することを含む。それゆえに、この実施形態において、少なくとも１つの有機酸の形態のカルボキシル基含有分子が培地中に含まれる。それゆえに、酵母細胞には、少なくとも１つの有機酸が供給される。
【0114】
特定の実施形態において、方法は、少なくとも１つの有機酸を培地に添加することを含む。ゆえに、少なくとも１つの有機酸は、少なくとも１つの有機酸を培地に添加することによって、培地中で酵母細胞に利用可能となる。この特定の実施形態において、単一の有機酸が培地に添加されるか、または複数の異なる有機酸が培地に添加される。
【0115】
別の特定の実施形態において、酵母細胞を培養することは、培地中の酵母細胞を、少なくとも１つの有機酸を産生し、かつ少なくとも１つの有機酸を培地中に放出することができる微生物、好ましくは酵母細胞と共培養することを含む。
【0116】
記載される２つの特定の実施形態は、組み合わせることができる。すなわち、少なくとも１つの有機酸を培地に添加し、この中で、本発明の酵母細胞は、少なくとも１つの有機酸を産生することができる少なくとも１つの微生物、好ましくは酵母細胞と共培養される。培地に添加される少なくとも１つの有機酸は、少なくとも１つの微生物によって産生される少なくとも１つの有機酸と同じであっても異なってもよい。
【0117】
本発明のこの態様における培地は、酵母細胞が培養されてポリアミン類似体を産生することができるあらゆる培地であり得る。培養は、例えば、バッチ、流加培養、もしくは灌流培養、または発酵、バイオリアクター発酵等の形態であり得る。
【0118】
例
例１：酵母における天然代謝の系統的再配線によるスペルミジン産生の向上
例１において、本発明者らは、中心炭素窒素代謝、メチオニンサルベージ経路、アデニンのサルベージ経路、ポリアミン輸送機構、およびポリアミン消費／分解経路が挙げられる、酵母株における代謝を体系的にリファクタリングした。加えて、本発明者らは、追加の潜在的陽性遺伝子標的も導入した。この酵母株は、新しいモジュール式遺伝的設計により構築した。具体的には、デノボＳｐｄ生合成経路は、より大きな炭素フラックスを糖炭素源からＳｐｄに迂回させるための多数の生合成酵素についてのコード配列を含有する複数の遺伝的モジュールに分割される。
例１：酵母における天然代謝の系統的再配線によるスペルミジン産生の向上
例１において、本発明者らは、中心炭素窒素代謝、メチオニンサルベージ経路、アデニンのサルベージ経路、ポリアミン輸送機構、およびポリアミン消費／分解経路が挙げられる、酵母株における代謝を体系的にリファクタリングした。加えて、本発明者らは、追加の潜在的陽性遺伝子標的も導入した。この酵母株は、新しいモジュール式遺伝的設計により構築した。具体的には、デノボＳｐｄ生合成経路は、より大きな炭素フラックスを糖炭素源からＳｐｄに迂回させるための多数の生合成酵素についてのコード配列を含有する複数の遺伝的モジュールに分割される。
【0119】
Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）の蓄積を増大させるように設計した前駆体過剰産生モジュール（Ｉ）は、８つのタンパク質：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＮＡＤＰ（＋）依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１）［配列番号２１］、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のミトコンドリアアスパラギン酸グルタミン酸担体タンパク質（ＡＧＣ１）［配列番号２２］、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のミトコンドリアＬ－オルニチン担体タンパク質（ＯＲＴ１）［配列番号２３］、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のグルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥｃａｒｇＡ）［配列番号２４］、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のアセチルグルタミン酸キナーゼ（ＥｃａｒｇＢ）［配列番号２５］、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＮ－アセチル－ガンマ－グルタミル－リン酸レダクターゼ（ＣｇａｒｇＣ）［配列番号２６］、コリネ菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＣｇａｒｇＤ）［配列番号２７］、およびコリネ菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｇａｒｇＪ）［配列番号２８］の過剰発現を含んだ。さらに、２つのタンパク質の減弱または除去：天然プロモーターＰＡＲＧ３を、より弱いプロモーターＰＫＥＸ２と交換することによる、酵母天然オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡＲＧ３）［配列番号２９］の減弱、およびＬ－オルニチントランスアミナーゼ（ＣＡＲ２）［配列番号３０］の活性の、ＣＡＲ２のノックアウトによる除去もまた、このモジュール（Ｉ）に含めた。
【0120】
Ｌ－オルニチンからＰｕｔを過剰産生するように設計したプトレシン（Ｐｕｔ）モジュール（ＩＩ）は、２つの遺伝的修飾；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＳＰＥ１）［配列番号３１］の過剰発現および天然のオルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素（ＯＡＺ１）［配列番号３２］の欠失を含んだ。
【0121】
スペルミジン生合成モジュール（ＩＩＩ）を、プトレシンからのスペルミジン（Ｓｐｄ）の過剰産生のために設計した（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の２つのタンパク質：アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＡｄｏＭｅｔＤＣ；ＳＰＥ２）［配列番号３３］およびスペルミジンシンターゼ（ＳｐｄＳｙｎ；ＳＰＥ３）［配列番号３４］の過剰発現を特徴とした）。また、このモジュールには、スペルミジンの消費または分解を回避するための２つの天然タンパク質の欠失：スペルミンシンターゼをコードするＳＰＥ４［配列番号１２］および非特異的ポリアミンオキシダーゼをコードするＦＭＳ１［配列番号３５］の欠失を含めた。
【0122】
Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）モジュール（ＩＶ）を、補因子ＡｄｏＭｅｔのアクセシビリティを高めるように設計した。この修飾には、多数のタンパク質：サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の５’－メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＥＵ１）［配列番号３６］、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＴ２）［配列番号３７］、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＴ１）［配列番号３８］、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のリボース－リン酸ピロホスホキナーゼ（ＰＲＳ５）［配列番号３９］、およびリーシュマニア・インファントゥム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）由来のＳ－アデノシルメチオニンシンターゼ（ＬｉＭＡＴ）［配列番号４０］の過剰発現を含めた。また、このモジュールには、アデニンデアミナーゼ活性（ＡＡＨ１）［配列番号４１］の欠失も含めた。
【0123】
ポリアミン流出モジュール（Ｖ）を、細胞に対する細胞傷害性またはポリアミン生合成に対する阻害を軽減するように設計した。このモジュールには、ＴＰＯ５によってコードされる酵母天然ポリアミントランスポーター［配列番号４２］の過剰発現を含めた。
【0124】
最後に、さらに重要なことに、追加のスペルミジン生合成モジュール（ＶＩ）を、プトレシンおよびＡｄｏＭｅｔからのスペルミジンの過剰産生のために設計した。このモジュールには、ＳＰＥ２－ＳＰＥ３によってコードされるＡｄｏＭｅｔＤＣ－ＳｐｄＳｙｎ融合タンパク質［配列番号４３］の過剰発現を含めた。
【0125】
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系または伝統的な遺伝的マーカーベースの方法を介して、組込み遺伝子座として増殖欠陥および活性発現がないと本発明者らが予想した領域への染色体組込みによって、例１における遺伝子の過剰発現を得た。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ベースのゲノム編集の実施は、Ｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１５によって開発されたプロトコルに従った。特に、Ｃａｓ９の構成的発現を可能にする、ＨＩＳ３マーカーを有するプラスミドｐＬ－ＣＡＳ９－ＨＩＳを有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｔｒａｉｎ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１Ｃが、全ての遺伝子改変についての開始株であった。選択した遺伝子座における効率的なゲノム編集を可能にするために、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）プラスミドを構築した。遺伝的部分、すなわち、プロモーター、ターミネーター、ＯＲＦ、および相同アームの種々の組合せを含む遺伝的モジュールを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ）手順に従って、組込みカセットとして構築した。以下の遺伝子およびプロモーターの組合せを、例１に使用した：ＴＰＩ１ｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ；ｔＨＸＴ７ｐ－ＡＧＣ１－ＣＹＣ１ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ；ＰＧＫ１ｐ－ＳＰＥ３－ｐＹＸ２１２ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ；ＴＤＨ３ｐ－ＳＰＥ２－ＤＩＴ１ｔ；ＴＤＨ３ｐ－ＣｇａｒｇＪ－ＴＤＨ２ｔ；ＰＧＫ１ｐ－－ＥｃａｒｇＢ－ＡＤＨ１ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＣｇａｒｇＣ－ＦＢＡ１ｔ；ｔＨＸＴ７ｐ－ＣｇａｒｇＤ－ＴＰＩ１ｔ；ＴＰＩ１ｐ－ＥｃａｒｇＡ－ＣＹＣ１ｔ；ＴＰＩ１ｐ－ＭＥＵ１ｐ－ＦＢＡ１ｔ；ＰＧＫ１ｐ－ＢＡＴ２－ＣＹＣ１ｔ；ＴＤＨ３ｐ－ＡＰＴ１－ＤＩＴ１ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＰＲＳ５－ＰＲＭ９ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＬｉＭＡＴ－ＰＲＭ９；ＴＤＨ３ｐ－ＴＰＯ５－ＣＹＣ１ｔ；ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ２－ＳＰＥ３－ＰＲＭ９ｔ。
【0126】
全ての天然の遺伝的部分、すなわち、天然のプロモーター、ターミネーター、ＯＲＦ、および相同アームを、テンプレートとしてＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅した。最適化した異種遺伝子について、合成断片またはプラスミド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから入手）を、ＰＣＲ増幅に使用した。ハイフィデリティＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを、分子クローニング手順の全体を通して利用した。カセットまたはプラスミドを、標準的なＬｉＡｃ／ＳＳ ＤＮＡ／ＰＥＧ形質転換法によって酵母中に導入した。ＵＲＡ３ベースのプラスミドまたはカセットを含有する株を、アミノ酸のない６．７ｇ／ｌ酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）、ウラシルのない０．７７ｇ／ｌ完全サプリメントミクスチュア（ＣＳＭ－ＵＲＡ）、２０ｇ／ｌグルコース、および２０ｇ／ｌアガーからなる、ウラシルのない合成完全培地（ＳＣ－ＵＲＡ）上で選択した。ＵＲＡ３マーカーを除去して、５－フルオロオロチン酸（５’－ＦＯＡ）プレートに対して選択した。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ベースの系も使用して、ＡＡＨ１、ＳＰＥ４、およびＦＭＳ１の欠失を実施した。他の遺伝子ノックアウト実験を、従来の方法によって行った。本明細書中で使用される全てのプライマーを表１に列挙しており、全てのプラスミドを表２に列挙しており、全ての株を表３に列挙している。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【表2】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0127】
ディープウェルスケール発酵を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と組み合わせたアッセイを使用して、結果として生じた株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡを評価した。特に、ポリアミンを生成するための、結果として生じたＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株の２４ディープウェルバッチ発酵を、Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ １９９２によって開発された最小培地中で行った。２４時間の前培養物由来の培養物を、０．２の初期ＯＤ６００で２４ディープウェルプレート中の２ｍｌ最小培地に接種して、３００ｒｐｍ、３０℃にて１２０時間培養した。７．５ｇ／ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．４ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／ｌグルコース、２ｍｌ／ｌ微量金属、および１ｍｌ／ｌビタミン溶液（必要に応じて、４０ｍｇ／ｌウラシル、４０ｍｇ／ｌヒスチジンを補充）を含有する最小培地のｐＨを４．５に調整した。０．１ｍｌの液体培養物をとることによってサンプルを調製して、熱水（ＨＷ）抽出に供した。当該方法において、本発明者らは、抽出物の状況として、ディープウェルプレートの発酵に最小培地を使用した。０．９ｍｌの発酵培地を含有するチューブを、１００℃の水浴中で１０分間予熱した。次いで、熱い発酵培地を、０．１ｍｌの液体培養物上に素早く注いだ；混合液を直ちにボルテックスして、サンプルを水浴に入れた。３０分後、各チューブを氷上に５分間置いた。遠心分離後、上清を直接、誘導体化に使用した。誘導体化のために、０．１２５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液および０．２５ｍｌの塩化ダンシル溶液（アセトン中５ｍｇ／ｍｌ）を、０．２５ｍｌのサンプルに添加した。次いで、反応混合液を、暗所において４０℃にて１時間、時々振盪させながらインキュベートした。０．２７５ｍｌのメタノールを添加することによって、反応を停止させた。サンプルを、ＨＰＬＣ検出に使用した２５ｍｍシリンジフィルター（０．４５μｍナイロン）で濾過した。以下のクロマトグラフィー条件を使用した：Ｃ１８（１００ｍｍ×内径４．６ｍｍ、２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ）、励起波長３４０ｎｍ、発光波長５１５ｎｍ、サンプル注入１．５μｌ、カラム温度４０℃、検出器感度７、４．０分での取得開始。移動相は、１ｍｌ／分の速度による水およびメタノールであった。溶出プログラムは、以下の通りであった：０～５分５０％～６５％メタノール、５～７．５分６５％～７５％メタノール、７．５～９．５分７５％～８７．５％メタノール、９．５～１０．５分８７．５％～１００％メタノール、１０．５～１１．５分１００％メタノール、１１．５～１３．５分１００％～５０％メタノール、１３．５～１６分５０％メタノール。
【0128】
株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡは、＞４００ｍｇ／ｌの濃度でのＳｐｄ力価をもたらし、本明細書中で使用する修飾を部分的にのみ有する株と比較して、Ｓｐｄ力価が有意に増大した（国際公開第２０１６／１４４２４７号パンフレットおよび国際公開第２０１９／０１３６９６号パンフレットにおける例を参照）。
【0129】
例２：酵母におけるより高次のポリアミン産生
生命（Ｌｉｆｅ）が、ポリアミンの構造変異体を合成するための多様な経路を進化させてきた。実際に、ＰｕｔおよびＳｐｄは典型的に、一般的なポリアミンとしてほとんどの細胞に見出される一方、ｓｙｍ－ホモスペルミジン（Ｈｓｐｄ）、サーモスペルミン（Ｔｓｐｍ）、スペルミン（Ｓｐｍ）、分岐鎖ポリアミン、および長鎖ポリアミン（ＬＣＰＡ）等の珍しいポリアミンもまた自然界で同定されている。例２は、遺伝的モジュール（ＶＩＩ）を設計して、例１のＳｐｄプラットフォーム株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ中に導入することによって、ｓｙｍ－ホモスペルミジン（Ｈｓｐｄ）、サーモスペルミン（Ｔｓｐｍ）、およびスペルミン（Ｓｐｍ）の生合成を調査した。
生命（Ｌｉｆｅ）が、ポリアミンの構造変異体を合成するための多様な経路を進化させてきた。実際に、ＰｕｔおよびＳｐｄは典型的に、一般的なポリアミンとしてほとんどの細胞に見出される一方、ｓｙｍ－ホモスペルミジン（Ｈｓｐｄ）、サーモスペルミン（Ｔｓｐｍ）、スペルミン（Ｓｐｍ）、分岐鎖ポリアミン、および長鎖ポリアミン（ＬＣＰＡ）等の珍しいポリアミンもまた自然界で同定されている。例２は、遺伝的モジュール（ＶＩＩ）を設計して、例１のＳｐｄプラットフォーム株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ中に導入することによって、ｓｙｍ－ホモスペルミジン（Ｈｓｐｄ）、サーモスペルミン（Ｔｓｐｍ）、およびスペルミン（Ｓｐｍ）の生合成を調査した。
【0130】
本発明者らは最初に、植物および細菌の双方に存在するトリアミンＨｓｐｄを異種合成することに着手した。植物において、Ｈｓｐｄは、ホモスペルミジンシンターゼ（植物ＨＳＳ；ＥＣ２．５．１．４５）によって形成されるピロリジジンアルカロイド生合成における第１の経路特異的中間体である。この酵素は、細菌ホモスペルミジンシンターゼ（細菌ＨＳＳ；ＥＣ２．５．１．４４）よりも特異的である。これは、後者が、アミノブチル基のドナーとしてＰｕｔを使用することができないからである。Ｈｓｐｄ微生物産生のための植物および細菌の双方のＨＳＳの可能性を調査するために、酵母におけるＨｓｐｄの生合成のために設計した遺伝的サブモジュール（ＶＩＩ－ａ）および（ＶＩＩ－ｂ）が、それぞれハナノボロギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｖｅｒｎａｌｉｓ）ＳｖＨＳＳおよびブラストクロリス・ビリディス（Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）ＢｖＨＳＳ１３の発現をコードした。サブモジュールを、ＧｅｎＳｃｉｐｔからオーダーした高コピープラスミドＳｖＨＳＳ＿ｐ４２６ＧＰＤおよびＢｖＨＳＳ＿ｐ４２６ＧＰＤとして導入して、酵母コドン最適化ＳｖＨＳＳ遺伝子［配列番号１８］およびＢｖＨＳＳ遺伝子［配列番号２０］をそれぞれ、Ｓｐｄプラットフォーム株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ中に保持した。形質転換実験は、例１と同じ手順に従った。結果として生じた株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ＳｖＨＳＳ＿ｐ４２６ＧＰＤ）およびＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ＢｖＨＳＳ＿ｐ４２６ＧＰＤ）を、例１に記載したのと同じ手順で、Ｈｓｐｄ産生についてアッセイした。
【0131】
本発明者らは、双方のＨＳＳの過剰発現が、Ｈｓｐｄの生合成を可能にすることを見出した。特に、ＳｖＨＳＳは、４０．９ｍｇ／でのＨｓｐｄ力価を可能にした一方、ＢｖＨＳＳは、３１．１ｍｇ／でのＨｓｐｄ力価を可能にした（図１ａおよび図１ｄ参照）。
【0132】
その後、本発明者らはまた、サブモジュール（ＶＩＩ－ｃ）、サブモジュール（ＶＩＩ－ｄ）、およびサブモジュール（ＶＩＩ－ｅ）を導入することによって、Ｓｐｄプラットフォーム（例１）をテトラアミンＳｐｍおよびＴｓｐｍの生成に利用した。Ｓｐｍは、後生動物、顕花植物、および酵母の全体を通じて見出される最も一般的なテトラアミンである。特定のアミノプロピルトランスフェラーゼ、すなわちスペルミンシンターゼ（ＳｐｍＳｙｎ；ＥＣ２．５．１．２２）が、Ｓｐｍ生合成を担っている。本発明者らは最初に、Ｓｐｍ過剰産生のための酵母天然ＳｐｍＳｙｎ Ｓｐｅ４ｐを調査した。
【0133】
ＪＱＳＰＤ＿ＡＡにおいて高コピープラスミドＳＰＥ４＿ｐ４２６ＧＰＤ（サブモジュール（ＶＩＩ－ｃ）としてコドン最適化酵母ＳＰＥ４［配列番号１２］を過剰発現した場合、５３．１ｍｇ／ｌのＳｐｍが得られた（図１ｃおよび図１ｆ参照）。本発明者らはまた、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株において高コピープラスミドＡｔＳＰＭＳ＿ｐ４２６ＧＰＤ（サブモジュール（ＶＩＩ－ｄ））として過剰発現されたＡｔＳＰＭＳ［配列番号１４］によって、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＳｐｍＳｙｎを試験した。これにより、Ｓｐｍ（４１．８ｍｇ／ｌ；図１ｃおよび図１ｆ参照）が産生した。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来の植物ＡＣＬ５アミノプロピルトランスフェラーゼ（ＴｓｐｍＳｙｎ；ＥＣ２．５．１．７９）は、Ｓｐｍ異性体Ｔｓｐｍを合成することが示された。これにより、本発明者らはまた、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株において高コピープラスミドＡｔＡＣＬ５＿ｐ４２６ＧＰＤ（サブモジュール（ＶＩＩ－ｅ））としてＡｔＡＣＬ５［配列番号１６］を過剰発現させた。この戦略は、４３．８ｍｇ／ｌのＴｓｐｍ産生を可能にした（図１ｂおよび図１ｅ参照）。酵母コドン最適化遺伝子を有するプラスミドは全て、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。例２において、例１で使用したのと同じ形質転換および生成物アッセイを使用した。全てのプラスミドを表２に列挙しており、全ての株を表３に列挙している。
【0134】
図５ａは、酵母におけるスペルミジンおよびより高次のポリアミンの生合成のための改変した経路を示す。
【0135】
例３：酵母におけるクコアミンの生合成
次に、本発明者らは、クコアミン（ポリメチレンポリアミン骨格で構成される一連の植物ポリアミン類似体、例えばＰｕｔ、Ｓｐｄ、およびＳｐｍ）、および少なくとも１つのジヒドロカフェイン酸断片を合成することに着手した。多用途の生物活性、例えば、抗高血圧症、抗トリパノソーマ、抗脂質過酸化、ならびにリポキシゲナーゼ、消毒、および神経保護に起因して、クコアミンは近年、機能性食品および薬物候補として注目されている。クコアミンは、最初に地骨皮（Ｃｏｒｔｅｘ Ｌｙｃｉｉ）において発見され、その後、ナス（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科の他の植物、例えば、トマト、ジャガイモ、およびタバコにおいて発見された。ジヒドロカフェオイル部分およびアミン部分のカップリングは、コミットした工程であり、クコアミン生合成への実際のエントリーポイントと考えることができる。しかしながら、これらの植物においてこの反応を媒介する酵素は、これまでほとんど記載されていない。それでも、ＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼスーパーファミリーに属するＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼのパネルは、補酵素Ａ活性化ヒドロキシケイ皮酸でアミン（－ＮＨ２）基をアシル化することによって、ポリアミンのＮ－アシル化を触媒することが実証された。アシルアクセプターおよびアシルドナーに対するその特異性／無差別性は、植物源に応じて異なる。
次に、本発明者らは、クコアミン（ポリメチレンポリアミン骨格で構成される一連の植物ポリアミン類似体、例えばＰｕｔ、Ｓｐｄ、およびＳｐｍ）、および少なくとも１つのジヒドロカフェイン酸断片を合成することに着手した。多用途の生物活性、例えば、抗高血圧症、抗トリパノソーマ、抗脂質過酸化、ならびにリポキシゲナーゼ、消毒、および神経保護に起因して、クコアミンは近年、機能性食品および薬物候補として注目されている。クコアミンは、最初に地骨皮（Ｃｏｒｔｅｘ Ｌｙｃｉｉ）において発見され、その後、ナス（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科の他の植物、例えば、トマト、ジャガイモ、およびタバコにおいて発見された。ジヒドロカフェオイル部分およびアミン部分のカップリングは、コミットした工程であり、クコアミン生合成への実際のエントリーポイントと考えることができる。しかしながら、これらの植物においてこの反応を媒介する酵素は、これまでほとんど記載されていない。それでも、ＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼスーパーファミリーに属するＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼのパネルは、補酵素Ａ活性化ヒドロキシケイ皮酸でアミン（－ＮＨ２）基をアシル化することによって、ポリアミンのＮ－アシル化を触媒することが実証された。アシルアクセプターおよびアシルドナーに対するその特異性／無差別性は、植物源に応じて異なる。
【0136】
例３は、複数のＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼを発現する３つの遺伝的サブモジュールを設計して、例１のＳｐｄプラットフォーム株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ中に導入することによって、クコアミンの生合成を調査した。Ｎ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼは、補酵素Ａ活性化ヒドロキシ桂皮酸のみを受け入れるので、本発明者らはまた、当該モジュールにおいてプロミスキャス４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．１２）を共発現させた。サブモジュール（ＶＩＩＩ－ｂ）は、２つのタンパク質；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロミスキャス４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ１（Ａｔ４ＣＬ１）［配列番号２］（これは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）４ＣＬファミリーの他のメンバーと比較して、カフェイン酸をそのＣｏＡエステルに最も効率的に変換することが示されている）；およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のスペルミジンジクマロイルトランスフェラーゼ（ＡｔＳＣＴ；ＥＣ２．３．１．２４９）［配列番号８］の共発現をコードした。高コピープラスミドｐＬＡｔ４ＣＬ－ＡｔＡＣＴとして構築したこのモジュールは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからオーダーし、酵母コドン最適化Ａｔ４ＣＬ１およびＡｔＳＣＴのための発現カセットを有した。全てのプラスミドを表２に列挙しており、全ての株を表３に列挙している。
【0137】
サブモジュール（ＶＩＩＩ－ｃ）は、２つのタンパク質；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロミスキャス４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ１（Ａｔ４ＣＬ１）、およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＡｔＳＨＴ；ＥＣ２．３．１Ｍ３４）［配列番号４］の共発現をコードした。高コピープラスミドｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＡｔＳＨＴとして構築したこのモジュールは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからオーダーし、酵母コドン最適化Ａｔ４ＣＬ１およびＡｔＳＨＴのための発現カセットを有した。
【0138】
サブモジュール（ＶＩＩＩ－ｄ）は、２つのタンパク質；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）プロミスキャス４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ１（Ａｔ４ＣＬ１）、およびニコチアナ・アッテヌアータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）由来のスペルミジンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＮａＤＨ２９；ＥＣ２．３．１Ｍ３４）［配列番号６］の共発現をコードした。高コピープラスミドｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＤＨ２９として構築したこのモジュールは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからオーダーし、酵母コドン最適化Ａｔ４ＣＬ１およびＮａＤＨ２９のための発現カセットを有した。
【0139】
最後に、サブモジュール（ＶＩＩＩ－ｅ）は、２つのタンパク質－シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属プロミスキャス４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ１（Ａｔ４ＣＬ１）およびＮ．アッテヌアータ（Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ）プトレシンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（ＮａＡＴ１；ＥＣ２．３．１．１３８）［配列番号１０］の共発現をコードした。高コピープラスミドｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＡＴ１として構築したこのモジュールは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからオーダーし、酵母コドン最適化Ａｔ４ＣＬ１およびＮａＡＴ１のための発現カセットを有した。
【0140】
これらのプラスミドを、例２に記載したのと同じ手順により、Ｓｐｄプラットフォーム株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ中に形質転換して、それぞれ株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ－ＡｔＳＣＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＡｔＡＨＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＤＨ２９）、およびＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＡＴ１）を得た。これらの株を、２ｍＭジヒドロカフェイン酸（３，４－ジヒドロキシヒドロケイ皮酸）を１２０時間供給することによってアッセイして、増殖培地を、以下の手順に従って、ポリアミン類似体産生について分析した。ポリアミン類似体の検出を、オービトラップ融合質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に連結したＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）での液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）測定によって行った。系は、３５℃に保ったＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ２．１×１００ｍｍ、１．８μｍカラムを使用した。流量は、アセトニトリル中０．１％ギ酸（Ａ）および０．１％ギ酸（Ｂ）（移動相として）を用いて、０．３５０ｍＬ／分であった。勾配は、５％Ｂとして１分間開始してから、５分まで９５％Ｂへの直線勾配を続けた。この溶媒組成液を１．５分間保持した。その後、これを５％Ｂに変えて、８分まで保持した。サンプル（５μｌ）を、加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＭＳに、陽イオンモードまたは陰イオンモードで通した。シースガスを５０（ａ．ｕ．）に、補助ガスを１０（ａ．ｕ．）に、そしてスイープガスを１（ａ．ｕ．）にセットした。コーン温度およびプローブ温度は、それぞれ３２５℃および３８０℃であり、スプレー電圧は３５００Ｖであった。スキャン範囲は８０から５００Ｄａであり、スキャン間の時間は５０ｍｓであった。
【0141】
本発明者らは、これらの努力がクコアミン生合成に至ったことがわかって喜びを感じた。特に、ＮａＤＨ２９株では、３１０．２１２８［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが検出された（図２ａ参照）。このことは、ＮａＤＨ２９が、Ｎ１－またはＮ１０－ジヒドロカフェオイルスペルミジンの生合成を可能にし、そしてＡｔ４ＣＬ１もまた、ジヒドロカフェイン酸を基質として受け入れることができることを示している。また、本発明者らは、ＡｔＳＣＴ過剰発現株では、３１０．２１２８［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する単一のＬＣ－ＭＳピークを見ることができた。さらに、株ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＡＴ１）にジヒドロカフェイン酸を供給した場合、４１７．２０１０［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが検出された（図２ｂ参照）。このことは、ＮａＡＴ１が、Ｎ１，Ｎ６－ビス（ジヒドロカフェオイル）プトレシンの生合成を可能にしたことを示している。
【0142】
例４：酵母における複雑なフェノールアミドの生合成
ポリアミンプラットフォームにおけるクコアミンの生合成の首尾良い実証は、フェノール部分の、ポリアミンとのコンジュゲーションから生じる窒素含有二次代謝産物の定量的に主要な群を構成する、より多様かつ複雑なフェノールアミドの生合成のために、このプラットフォームをさらに利用する確信を本発明者らに与えた。これにより、例４において、特定のポリアミンＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼを過剰発現させることによって、複雑なフェノールアミドの生成が可能となった。例３において実証した同じ戦略に従って、本発明者らはまた、これらの株、すなわち、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ－ＡｔＡＣＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＡｔＡＨＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＤＨ２９）、およびＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＡＴ１）を、２ｍＭ ｐ－クマリン酸、２ｍＭコーヒー酸、または２ｍＭフェルラ酸を１２０時間供給することによってアッセイして、培地を、ポリアミン類似体の産生について分析した。発酵、サンプル調製、またはＬＣ－ＭＳ確認手順は、例３のものと同じであった。実際、Ａｔ４ＣＬ１を、ＡｔＳＣＴ、ＡｔＳＨＴ、またはＮａＤＨ２９と共発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株に、ヒドロキシ桂皮酸、すなわちｐ－クマリン酸、コーヒー酸、またはフェルラ酸を供給すると、フェノールアミド生合成がもたらされた。特に、ｐ－クマリン酸を供給した場合、５８４．２７４８［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＨＴ株において検出された（図３ａ参照）。このことは、ＡｔＳＨＴが、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（クマロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。同様に、カフェイン酸を供給した場合、６３２．２５９９［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＨＴ株において検出された（図３ｂ参照）。このことは、ＡｔＳＨＴが、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（カフェオイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。さらに、ｐ－クマリン酸を供給した場合、４３８．２３８３［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｃ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。同様に、カフェイン酸を供給した場合、４７０．２２８２［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｄ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（カフェオイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。加えて、フェルラ酸を供給した場合、４９８．２５９９［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｅ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（フェルロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。これに対応して、ＮａＤＨ２９株にｐ－クマリン酸、カフェイン酸、またはフェルラ酸を供給すると、それぞれＮ１－もしくはＮ１０－クマロイルスペルミジン、Ｎ１－もしくはＮ１０－カフェオイルスペルミジン、またはＮ１－もしくはＮ１０－フェルロイルスペルミジンの生合成が首尾良く可能となった。それゆえに、種々の位置選択性を有する様々なＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼを選択することによって、本発明者らは、一置換、二置換、および三置換スペルミジンフェノールアミドの位置選択的生合成を達成した。同様に、ＮａＡＴ１株にｐ－クマリン酸、カフェイン酸、またはフェルラ酸を供給すると、それぞれＮ１－クマロイルプトレシン、Ｎ１，Ｎ６－ビス（カフェオイル）プトレシン、Ｎ１－カフェオイルプトレシン、およびＮ１－フェルロイルプトレシンの生合成が首尾良く可能となった（図３ｆ参照）。全てのプラスミドを表２に列挙しており、全ての株を表３に列挙している。
ポリアミンプラットフォームにおけるクコアミンの生合成の首尾良い実証は、フェノール部分の、ポリアミンとのコンジュゲーションから生じる窒素含有二次代謝産物の定量的に主要な群を構成する、より多様かつ複雑なフェノールアミドの生合成のために、このプラットフォームをさらに利用する確信を本発明者らに与えた。これにより、例４において、特定のポリアミンＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼを過剰発現させることによって、複雑なフェノールアミドの生成が可能となった。例３において実証した同じ戦略に従って、本発明者らはまた、これらの株、すなわち、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ－ＡｔＡＣＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＡｔＡＨＴ）、ＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＤＨ２９）、およびＪＱＳＰＤ＿ＡＡ（ｐＬＡｔ４ＣＬ１－ＮａＡＴ１）を、２ｍＭ ｐ－クマリン酸、２ｍＭコーヒー酸、または２ｍＭフェルラ酸を１２０時間供給することによってアッセイして、培地を、ポリアミン類似体の産生について分析した。発酵、サンプル調製、またはＬＣ－ＭＳ確認手順は、例３のものと同じであった。実際、Ａｔ４ＣＬ１を、ＡｔＳＣＴ、ＡｔＳＨＴ、またはＮａＤＨ２９と共発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株に、ヒドロキシ桂皮酸、すなわちｐ－クマリン酸、コーヒー酸、またはフェルラ酸を供給すると、フェノールアミド生合成がもたらされた。特に、ｐ－クマリン酸を供給した場合、５８４．２７４８［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＨＴ株において検出された（図３ａ参照）。このことは、ＡｔＳＨＴが、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（クマロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。同様に、カフェイン酸を供給した場合、６３２．２５９９［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＨＴ株において検出された（図３ｂ参照）。このことは、ＡｔＳＨＴが、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（カフェオイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。さらに、ｐ－クマリン酸を供給した場合、４３８．２３８３［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｃ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。同様に、カフェイン酸を供給した場合、４７０．２２８２［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｄ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（カフェオイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。加えて、フェルラ酸を供給した場合、４９８．２５９９［Ｍ＋Ｈ］＋に相当するｍ／ｚ値を有する大きな単一のＬＣ－ＭＳピークが、ＡｔＳＣＴ株において検出された（図３ｅ参照）。このことは、ＡｔＳＣＴが、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（フェルロイル）スペルミジンの生合成を可能にしたことを示している。これに対応して、ＮａＤＨ２９株にｐ－クマリン酸、カフェイン酸、またはフェルラ酸を供給すると、それぞれＮ１－もしくはＮ１０－クマロイルスペルミジン、Ｎ１－もしくはＮ１０－カフェオイルスペルミジン、またはＮ１－もしくはＮ１０－フェルロイルスペルミジンの生合成が首尾良く可能となった。それゆえに、種々の位置選択性を有する様々なＮ－ヒドロシンナモイルトランスフェラーゼを選択することによって、本発明者らは、一置換、二置換、および三置換スペルミジンフェノールアミドの位置選択的生合成を達成した。同様に、ＮａＡＴ１株にｐ－クマリン酸、カフェイン酸、またはフェルラ酸を供給すると、それぞれＮ１－クマロイルプトレシン、Ｎ１，Ｎ６－ビス（カフェオイル）プトレシン、Ｎ１－カフェオイルプトレシン、およびＮ１－フェルロイルプトレシンの生合成が首尾良く可能となった（図３ｆ参照）。全てのプラスミドを表２に列挙しており、全ての株を表３に列挙している。
【0143】
例５：酵母共培養物における複雑なフェノールアミドの生合成
例４において、本発明者らは、本発明者らのポリアミンプラットフォーム株に複数の芳香族有機酸、例えば、ｐ－クマリン酸、コーヒー酸、またはフェルラ酸を供給することで、種々のポリアミン由来フェノールアミドの生合成が可能となることを実証した。しかしながら、滴定実験に使用されるこれらの芳香族有機酸は、入手するのが概して高価であり、ある程度、フェノールアミドの生成のためのこの滴定ベースのプロセスの経済的実現可能性が犠牲となる。対照的に、本発明者らは、いかなる芳香族有機酸も供給しないこれらのフェノールアミドのデノボ生成が、経済的に実現可能なバイオプロセスとなり得ると考えている。実際、酵母が挙げられる微生物の代謝工学および合成生物学における最近の進歩は、これらの芳香族有機酸、例えばｐ－クマリン酸の生成用の多くのプラットフォーム株を既にもたらしている。本発明者らのポリアミンプラットフォームによるポリアミン由来フェノールアミドのデノボ生成の概念を実証するために、本発明者らは、追加の遺伝的モジュールサブモジュール（ＶＩＩＩ－ｆ）、ｐ－クマリン酸過剰産生酵母株を、本発明者らの系に導入した。本発明者らはこれを、ポリアミン産生株およびｐ－クマリン酸過剰産生株を含む合成コンソーシアムを設計することによって実証した。特に、本発明者らは、Ａｔ４ＣＬ１、ならびにＡｔＳＨＴ、ＡｔＳＣＴ、ＮａＤＨ２９、およびＮａＡＴ１の１つを共過剰発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株を、ｐ－クマリン酸過剰産生株ＱＬ５８（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）と共培養すると、一連のポリアミン－ｐ－クマリン酸コンジュゲート、すなわち、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（クマロイル）スペルミジン、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル）スペルミジン、Ｎ１－またはＮ１０－クマロイルスペルミジン、およびＮ１－クマロイルプトレシンのデノボ生合成が生じた（図４ａ～図４ｃ参照）。ｐ－クマリン酸過剰産生株における全てのポジティブ遺伝的標的を、本発明者らのポリアミンプラットフォーム株、例えばＪＱＳＰＤ＿ＡＡおよびその誘導体中に導入することによって、本明細書中で使用されるサブモジュール（ＶＩＩＩ－ｆ）も、またはこれを代替的に導入することができることを強調しておかなければならない。
例４において、本発明者らは、本発明者らのポリアミンプラットフォーム株に複数の芳香族有機酸、例えば、ｐ－クマリン酸、コーヒー酸、またはフェルラ酸を供給することで、種々のポリアミン由来フェノールアミドの生合成が可能となることを実証した。しかしながら、滴定実験に使用されるこれらの芳香族有機酸は、入手するのが概して高価であり、ある程度、フェノールアミドの生成のためのこの滴定ベースのプロセスの経済的実現可能性が犠牲となる。対照的に、本発明者らは、いかなる芳香族有機酸も供給しないこれらのフェノールアミドのデノボ生成が、経済的に実現可能なバイオプロセスとなり得ると考えている。実際、酵母が挙げられる微生物の代謝工学および合成生物学における最近の進歩は、これらの芳香族有機酸、例えばｐ－クマリン酸の生成用の多くのプラットフォーム株を既にもたらしている。本発明者らのポリアミンプラットフォームによるポリアミン由来フェノールアミドのデノボ生成の概念を実証するために、本発明者らは、追加の遺伝的モジュールサブモジュール（ＶＩＩＩ－ｆ）、ｐ－クマリン酸過剰産生酵母株を、本発明者らの系に導入した。本発明者らはこれを、ポリアミン産生株およびｐ－クマリン酸過剰産生株を含む合成コンソーシアムを設計することによって実証した。特に、本発明者らは、Ａｔ４ＣＬ１、ならびにＡｔＳＨＴ、ＡｔＳＣＴ、ＮａＤＨ２９、およびＮａＡＴ１の１つを共過剰発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株を、ｐ－クマリン酸過剰産生株ＱＬ５８（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）と共培養すると、一連のポリアミン－ｐ－クマリン酸コンジュゲート、すなわち、Ｎ１，Ｎ５，Ｎ１０－トリ（クマロイル）スペルミジン、Ｎ１，Ｎ１０－ビス（クマロイル）スペルミジン、Ｎ１－またはＮ１０－クマロイルスペルミジン、およびＮ１－クマロイルプトレシンのデノボ生合成が生じた（図４ａ～図４ｃ参照）。ｐ－クマリン酸過剰産生株における全てのポジティブ遺伝的標的を、本発明者らのポリアミンプラットフォーム株、例えばＪＱＳＰＤ＿ＡＡおよびその誘導体中に導入することによって、本明細書中で使用されるサブモジュール（ＶＩＩＩ－ｆ）も、またはこれを代替的に導入することができることを強調しておかなければならない。
【0144】
図５ｂは、酵母における複雑なフェノールアミドの生合成のための改変した経路を示す。
【0145】
例６：酵母共培養物におけるハロゲン化フェノールアミドの生合成
例５において、本発明者らは、ポリアミン産生株およびｐ－クマリン酸過剰産生株を含む合成コンソーシアムを設計することによって、天然に存在するポリアミン由来フェノールアミドのデノボ産生、すなわち、唯一の炭素源として単純な糖を用いた産生が達成され得ることを実証した。しかしながら、本発明者らはまた、その天然対応物に加えて、非天然ポリアミン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲートが、その潜在的に向上した医薬特性について盛んに研究されていることにも気付いた（Ｍｏｕｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この探索において注目する主要なファルマコフォアの１つが、ハロゲン化誘導体、例えばフッ素置換基である。なぜなら、有機フッ素は、鉛化合物の吸収、分布、代謝、排泄、および毒性（ＡＤＭＥＴ）特性に影響を及ぼすことが知られているからである（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明者らは、ヒドロキシ桂皮酸に対する４ＣＬｓ－ＮＡＴ系、すなわち４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ＋Ｎ－アシルトランスフェラーゼの観察されるプロミスキュアティが、フッ素置換前駆体に変換されると仮定して、このクラスのフッ素置換ポリアミン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲートの産生のための生合成アプローチを確立することに着手した。フッ素置換ヒドロキシ桂皮酸にアクセスするために、本発明者らは、芳香族化学物質を過剰産生する株（ＱＬ５８）を使用して（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、この株にフッ素置換芳香族アミノ酸（３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン）を供給した。これから、３－フルオロ－桂皮酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１６５．０３５８）、３－フルオロ－ｐ－クマリン酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１８１．０３０５）、およびフッ素置換水素化ｐ－クマリン酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１８３．０４６３）の予測ｍ／ｚ値に相当するピークが検出された（図６ａ～図６ｃ参照）。これは、芳香族アミノ酸から芳香族化合物を生合成するためにここで動員された異種経路がプロミスキャスであることを示唆している。その後、ポリアミン過剰産生株（Ａｔ４ＣＬ１、ならびにＡｔＳＨＴ、ＡｔＳＣＴ、ＮａＤＨ２９、およびＮａＡＴ１の１つを共過剰発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株）および芳香族過剰産生株ＱＬ５８の双方を含む例５の共培養系に、３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニンを補充すると、一連のモノ－およびジ－非天然フッ素置換プトレシン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲート（図７ａ～図７ｄ参照）、ならびに一覧の一置換、二置換、および三置換非天然フッ素置換スペルミジン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲート（図８ａ～図８ｅ参照）が得られた。
例５において、本発明者らは、ポリアミン産生株およびｐ－クマリン酸過剰産生株を含む合成コンソーシアムを設計することによって、天然に存在するポリアミン由来フェノールアミドのデノボ産生、すなわち、唯一の炭素源として単純な糖を用いた産生が達成され得ることを実証した。しかしながら、本発明者らはまた、その天然対応物に加えて、非天然ポリアミン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲートが、その潜在的に向上した医薬特性について盛んに研究されていることにも気付いた（Ｍｏｕｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ａｎｔｏｎｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この探索において注目する主要なファルマコフォアの１つが、ハロゲン化誘導体、例えばフッ素置換基である。なぜなら、有機フッ素は、鉛化合物の吸収、分布、代謝、排泄、および毒性（ＡＤＭＥＴ）特性に影響を及ぼすことが知られているからである（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明者らは、ヒドロキシ桂皮酸に対する４ＣＬｓ－ＮＡＴ系、すなわち４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ＋Ｎ－アシルトランスフェラーゼの観察されるプロミスキュアティが、フッ素置換前駆体に変換されると仮定して、このクラスのフッ素置換ポリアミン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲートの産生のための生合成アプローチを確立することに着手した。フッ素置換ヒドロキシ桂皮酸にアクセスするために、本発明者らは、芳香族化学物質を過剰産生する株（ＱＬ５８）を使用して（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、この株にフッ素置換芳香族アミノ酸（３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン）を供給した。これから、３－フルオロ－桂皮酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１６５．０３５８）、３－フルオロ－ｐ－クマリン酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１８１．０３０５）、およびフッ素置換水素化ｐ－クマリン酸（［Ｍ－Ｈ］－＝１８３．０４６３）の予測ｍ／ｚ値に相当するピークが検出された（図６ａ～図６ｃ参照）。これは、芳香族アミノ酸から芳香族化合物を生合成するためにここで動員された異種経路がプロミスキャスであることを示唆している。その後、ポリアミン過剰産生株（Ａｔ４ＣＬ１、ならびにＡｔＳＨＴ、ＡｔＳＣＴ、ＮａＤＨ２９、およびＮａＡＴ１の１つを共過剰発現するＪＱＳＰＤ＿ＡＡ株）および芳香族過剰産生株ＱＬ５８の双方を含む例５の共培養系に、３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニンを補充すると、一連のモノ－およびジ－非天然フッ素置換プトレシン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲート（図７ａ～図７ｄ参照）、ならびに一覧の一置換、二置換、および三置換非天然フッ素置換スペルミジン－ヒドロキシ桂皮酸コンジュゲート（図８ａ～図８ｅ参照）が得られた。
【0146】
上記の実施形態は、本発明の一部の実例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に対して種々の修正、組合せ、および変更を行うことができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な場合、他の構成で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【0147】
参考文献
【配列表フリーテキスト】
【0148】
配列表４４～２６６ ＜２２３＞プライマー
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【配列表】
【国際調査報告】