(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】ヘテロＩｇＧ分子の対合のための電荷対変異の操作
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20221219BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221219BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20221219BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525717
(86)(22)【出願日】2020-11-06
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 US2020059378
(87)【国際公開番号】W WO2021092355
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】62/933,205
(32)【優先日】2019-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】エステス，ブラム
(72)【発明者】
【氏名】ガルセス，フェルナンド
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ジュウルン
(72)【発明者】
【氏名】ダリス，マーク
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗体ＣＨ３ドメイン及びヘテロ二量体の形成の促進に有用な変異を含む、ヘテロ二量体に関する。特定のｐＨでのヘテロ二量体の精製を最適化する方法もまた開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０位にアミノ酸の改変を含む、単離されたヘテロ多量体であって、（ｉ）前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ３７０位にアミノ酸の改変を含み、
（ｉｉ）前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含み、
ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる、
単離ヘテロ多量体。
【請求項2】
前記Ｋ３６０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ３６０Ｄからなる群から選択される、請求項１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項3】
前記Ｋ３７０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３７０Ｅ及びＫ３７０Ｄからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項4】
前記Ｅ３５７位におけるアミノ酸の改変は、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｈ及びＥ３５７Ｒからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項5】
前記Ｋ３６０位のアミノ酸の改変はＫ３６０Ｅであり、前記Ｋ３７０位のアミノ酸の改変はＫ３７０Ｄであり、前記Ｅ３５７位のアミノ酸の改変はＥ３５７Ｋである、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項6】
一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項7】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４０９位にアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｄ３９９位にアミノ酸の改変を含む、請求項６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項8】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｄ３９９位にアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４０９位にアミノ酸の改変を含む、請求項６に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項9】
前記Ｋ４０９位におけるアミノ酸の改変はＫ４０９Ｅ及びＫ４０９Ｄからなる群から選択され、前記Ｄ３９９位におけるアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｈ及びＤ３９９Ｒからなる群から選択される、請求項６～８のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項10】
前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変はＫ４０９Ｄであり、前記Ｄ３９９位のアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋである、請求項６～９のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項11】
前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変を含む前記ＣＨ３ドメインポリペプチドは、さらにＫ３９２位にアミノ酸の改変を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項12】
前記Ｋ３９２位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄからなる群から選択される、請求項１１に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項13】
一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項14】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４３９位にアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｅ３５６位にアミノ酸の改変を含む、請求項１３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項15】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｅ３５６位にアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４３９位にアミノ酸の改変を含む、請求項１３に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項16】
前記Ｋ４３９位におけるアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅ及びＫ４３９Ｄからなる群から選択され、前記Ｅ３５６位におけるアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｈ及びＥ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項17】
前記Ｋ４３９位のアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅであり、前記Ｅ３５６位のアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項18】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ変異を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７Ｋ及びＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項１１又は１２に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項19】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６Ｋ変異を含む、請求項１８に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項20】
前記ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ領域に基づくＦｃ領域に含まれる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項21】
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項２０に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項22】
前記ヘテロ多量体は、二重特異性又は多重特異性の抗体である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離ヘテロ多量体。
【請求項23】
単離されたヘテロ多量体を約ｐＨ５．０で安定化する方法であって、前記ヘテロ多量体は第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、（ｉ）前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３７０にアミノ酸の改変を含み、
（ｉｉ）前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含む方法において、
前記第１のＣＨ３ドメインのＫ３６０位にアミノ酸の改変を導入することを含み、前記改変はグルタミン酸又はアスパラギン酸でのＫ３６０の置換であり、
ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる、
方法。
【請求項24】
前記Ｋ３６０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ３６０Ｄからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記Ｋ３７０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３７０Ｅ及びＫ３７０Ｄからなる群から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
前記Ｅ３５７位におけるアミノ酸の改変は、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｈ及びＥ３５７Ｒからなる群から選択される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記Ｋ３６０位のアミノ酸の改変はＫ３６０Ｅであり、前記Ｋ３７０位のアミノ酸の改変はＫ３７０Ｄであり、前記Ｅ３５７位のアミノ酸の改変はＥ３５７Ｋである、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｄ３９９位のアミノ酸の改変を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｄ３９９位のアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｋ４０９位におけるアミノ酸の改変はＫ４０９Ｅ及びＫ４０９Ｄからなる群から選択され、前記Ｄ３９９におけるアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｈ及びＤ３９９Ｒからなる群から選択される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変はＫ４０９Ｄであり、前記Ｄ３９９位のアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋである、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記Ｋ４０９位のアミノ酸の改変を含む前記ＣＨ３ドメインポリペプチドは、さらにＫ３９２位にアミノ酸の改変を含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記Ｋ３９２位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４３９位のアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｅ３５６位のアミノ酸の改変を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｅ３５６位のアミノ酸の改変を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドが前記Ｋ４３９位のアミノ酸の改変を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記Ｋ４３９位におけるアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅ及びＫ４３９Ｄからなる群から選択され、前記Ｅ３５６位におけるアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｈ及びＥ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記Ｋ４３９位のアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅであり、前記Ｅ３５６位のアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋである、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ変異を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７Ｋ及びＤ３９９Ｋ変異を含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項41】
前記第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９Ｅ変異を含み、前記第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６Ｋ変異を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ領域に基づくＦｃ領域に含まれる、請求項２３～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記ヘテロ多量体は、二重特異性又は多重特異性の抗体である、請求項２３～４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質工学の分野に関する。具体的には、本発明は、ヘテロＩｇＧ分子の結晶性フラグメント（Ｆｃ）中の荷電残基を操作して、ホモＦｃ形成を阻止し、ヘテロＦｃ形成を駆動することに関する。
【0002】
本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１（ｃ）及び１．８２１（ｅ）によって要求されるコンピューター可読形式（ＣＲＦ）及び紙の複写の両方の役割を果たし、且つその全体が参照により本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」準拠の配列表を含む。２０２０年１１月６日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ－２３８９－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿１１０６２０２０＿ＳＴ２５であり、２３．６ｋｂのサイズである。
【背景技術】
【0003】
ＩｇＧ分子のＦｃ領域の天然の形成は、Ｆａｂアームの配列とは独立して、２つの一致するＦｃ鎖のアセンブリを含む。二重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗原に対して標的特異性を有する。これは、異なる配列からなる２つのＦａｂアームによるものである。その結果、天然のＦｃ領域を有する二重特異性分子は、重鎖分子を、１つの抗原に結合するモノクローナル抗体、第２の抗原に結合するモノクローナル抗体、及び両方の抗原に結合する二重特異性抗体からなる３つの主要な種に組み立てる傾向がある。
【0004】
これらの組換えタンパク質を発現させる際に、モノクローナル抗体の形成を防止するために、ＩｇＧ分子を主にＣＨ３領域において操作している。ＩｇＧ重鎖間の鎖対合の駆動に関する初期の研究は、鎖間の表面領域の輪郭がより大きな残基及びより小さな残基への変異で改変される、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ）戦略の使用から始まった。広く実施されているより最近のアプローチは電荷対変異の使用であり、２つの回転対称領域の一方における天然に荷電した残基を、正に荷電した残基を負に荷電した残基に変異させることによって、またその逆に負に荷電した残基を正に荷電した残基に変異させることによって逆転させる。このアプローチを１対の荷電残基に適用すると、一致するＦｃ領域間の２つの反発点と、異なるＦｃ領域間に塩橋を形成する２つの引き合う点とが生じる。我々の研究において、Ｆｃ領域における３対の荷電残基の残基をスクリーニングして最適化し、また、対合特異性への駆動の強化、及びより低いｐＨでの精製という利点を付加するために、隣接残基を試験した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０位にアミノ酸の改変を含む、単離されたヘテロ多量体であって、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ３７０位にアミノ酸の改変を含み、（ｉｉ）第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる、単離ヘテロ多量体を対象とする。
【0006】
別の態様では、本発明は、約ｐＨ５．０で単離されたヘテロ多量体を安定化する方法であって、ヘテロ多量体は第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３７０にアミノ酸の改変を含み、（ｉｉ）第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含む方法において、第１のＣＨ３ドメインのＫ３６０位にアミノ酸の改変を導入することを含み、この改変はグルタミン酸又はアスパラギン酸でのＫ３６０の置換であり、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる、方法を対象とする。
【0007】
一実施形態では、Ｋ３６０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ３６０Ｄからなる群から選択される。
【0008】
一実施形態では、Ｋ３７０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３７０Ｅ及びＫ３７０Ｄからなる群から選択される。
【0009】
一実施形態では、Ｅ３５７位におけるアミノ酸の改変は、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｈ及びＥ３５７Ｒからなる群から選択される。
【0010】
一実施形態では、Ｋ３６０位のアミノ酸の改変はＫ３６０Ｅであり、Ｋ３７０位のアミノ酸の改変はＫ３７０Ｄであり、Ｅ３５７位のアミノ酸の改変はＥ３５７Ｋである。
【0011】
一実施形態では、一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む。
【0012】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む。
【0013】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９位にアミノ酸の改変を含む。
【0014】
一実施形態では、Ｋ４０９位におけるアミノ酸の改変はＫ４０９Ｅ及びＫ４０９Ｄからなる群から選択され、Ｄ３９９位におけるアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｈ及びＤ３９９Ｒからなる群から選択される。
【0015】
一実施形態では、Ｋ４０９位のアミノ酸の改変はＫ４０９Ｄであり、Ｄ３９９位のアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋである。
【0016】
一実施形態では、Ｋ４０９位にアミノ酸の改変を含むＣＨ３ドメインポリペプチドは、さらにＫ３９２位にアミノ酸の改変を含む。
【0017】
一実施形態では、Ｋ３９２位のアミノ酸の改変は、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄからなる群から選択される。
【0018】
一実施形態では、一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む。
【0019】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む。
【0020】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５６位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４３９位にアミノ酸の改変を含む。
【0021】
一実施形態では、Ｋ４３９位におけるアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅ及びＫ４３９Ｄからなる群から選択され、Ｅ３５６位におけるアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｈ及びＥ３５６Ｒからなる群から選択される。
【0022】
一実施形態では、Ｋ４３９位のアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅであり、Ｅ３５６位のアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋである。
【0023】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７Ｋ及びＤ３９９Ｋ変異を含む。
【0024】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６Ｋ変異を含む。
【0025】
一実施形態では、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ領域に基づくＦｃ領域に含まれる。
【0026】
一実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
【0027】
一実施形態では、ヘテロ多量体は、二重特異性又は多重特異性の抗体である。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】Ｆｃ鎖に融合した単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）及び弾頭を欠くＦｃ鎖を示す。２つのｓｃＦｖ弾頭を有するホモ二量体（Ａ）又は２つの弾頭を欠くホモ二量体（Ｃ）に組み立てられた分子は、それぞれ約１００ｋＤａ又は５０ｋＤａの分子量になる。意図したヘテロ－Ｆｃ型（Ｂ）に組み立てた場合、分子量は約７５キロダルトン（ｋＤａ）である。
【図2】スクリーニングからのリードｓｃＦｖ－Ｆｃ分子を示す。
【図3】改変モノクローナル抗体を示す。改変には、ＣＨ３領域における電荷対変異の付加、及びＦａｂ領域の一方と及びＦｃ領域の間のヒンジにおけるＤＥＶＤ切断部位の付加が含まれる。
【図4】ｐＨ６．０、５．６、及び５．０におけるヘテロ二量体の陽イオン交換を示す。
【図5】Ｋ３６０変異体と比較した、ｐＨ６．０、５．６、及び５．０におけるヘテロ二量体の陽イオン交換を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本明細書で使用される「多量体タンパク質」は、インビトロ又はインビボで単一のタンパク質を形成するために互いに会合した２つ以上の別個のポリペプチド又はタンパク質鎖を含有するタンパク質を指す。多量体タンパク質は、「ホモ多量体」を形成する同種の２つ以上のポリペプチドからなり得る。或いは、多量体タンパク質はまた、「ヘテロ多量体」を形成する異なる配列の２つ以上のポリペプチドから構成され得る。したがって、「ヘテロ多量体」は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基だけアミノ酸配列が異なる分子である。ヘテロ多量体は、第１及び第２のポリペプチドによって形成される「ヘテロ二量体」を含むか、又は３以上のポリペプチドが存在する、より高次の三次構造を形成することができる。
【0030】
本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」という用語は、１つ又は複数の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質には、抗体及びその機能的断片が含まれ得る。「機能的抗体断片」は、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる、抗体の一部である。機能的抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物などの任意の哺乳動物源に由来するものとすることができる。機能的抗体断片は、標的抗原の結合について、インタクトな抗体と比肩することができ、断片は、インタクトな抗体の改変（例えば、酵素的又は化学的切断）によって産生されるか、又は組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成を使用して新規に合成され得る。
【0031】
「重鎖」及び「軽鎖」は、ＩｇＧを構成する２つのポリペプチドを指す。重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインに分解され得る：ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで以下のドメインに分解され得る：ＶＬ及びＣＬ。ＣＨ１及びＣＬドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインが機能的な構造を形成するように相互作用する。
【0032】
抗原結合タンパク質にはまた、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ又は複数の機能的抗体断片を含むタンパク質が含まれ得る。例えば、抗原結合タンパク質には、ダイアボディ（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４－６４４８，１９９３を参照）；イントラボディ；ドメイン抗体（単一のＶＬ若しくはＶＨドメイン又はペプチドリンカーによって結合した２つ以上のＶＨドメイン、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４－５４６，１９８９を参照）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５－１０６，２００４及びＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３－１３５，２００１を参照）；トリアボディ；テトラボディ；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ、Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５－２３，２００４を参照）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に付着した１つ又は複数のペプチド、国際公開第００／２４７８２号パンフレットを参照）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７－１０６２，１９９５を参照）；小モジュラー免疫薬（米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号明細書を参照）；及び免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が含まれ得る。
【0033】
特定の態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、それらが２つの異なる抗原に特異的に結合し得ることを意味する「二重特異性」である。別の態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、それらが３つの異なる抗原に特異的に結合し得ることを意味する「三重特異性」である。別の態様では、本発明の抗原結合タンパク質は、それらが４つの異なる抗原に特異的に結合し得ることを意味する「四重特異性」である。本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下で、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して、標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を識別することができる場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。抗原結合タンパク質は、ＫＤが１×１０－８Ｍ以下である場合、「高親和性」で抗原に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、５×１０－７Ｍ以下のＫＤで標的抗原に結合する。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、１×１０－７Ｍ以下のＫＤで標的抗原に結合する。
【0034】
親和性は、様々な手法を使用して決定され、その一例は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。様々な実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）に基づくアッセイ）によって決定される。この方法論を用いて、会合速度定数（ｋａ、単位：Ｍ－１ｓ－１）及び解離速度定数（ｋｄ、単位：ｓ－１）を測定することができる。次いで、平衡解離定数（ＫＤ、単位：Ｍ）を、運動速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から算出することができる。一部の実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、平衡解離定数（ＫＤ、単位：Ｍ）及び会合速度定数（ｋａ、単位：Ｍ－１ｓ－１）を測定することができる。解離速度定数（ｋｄ、単位：ｓ－１）は、これらの値（ＫＤ×ｋａ）から算出することができる。他の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法によって決定される。特定の実施形態では、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される。本発明の特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ）によって発現される標的抗原に対し、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載の方法によって実施された、結合平衡除外法による決定で、２０ｎＭ（２．０×１０－８Ｍ）以下のＫＤ、１０ｎＭ（１．０×１０－８Ｍ）以下のＫＤ、１ｎＭ（１．０×１０－９Ｍ）以下のＫＤ、５００ｐＭ（５．０×１０－１０Ｍ）以下のＫＤ、２００ｐＭ（２．０×１０－１０Ｍ）以下のＫＤ、１５０ｐＭ（１．５０×１０－１０Ｍ）以下のＫＤ、１２５ｐＭ（１．２５×１０－１０Ｍ）以下のＫＤ、１０５ｐＭ（１．０５×１０－１０Ｍ）以下のＫＤ、５０ｐＭ（５．０×１０－１１Ｍ）以下のＫＤ、又は２０ｐＭ（２．０×１０－１１Ｍ）以下のＫＤをもって特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、ｋｄ（解離速度定数）によって測定される標的抗原に対する結合アビディティが、約１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０ｓ－１若しくはそれ以下（値が低いほど結合アビディティが高いことを示す）、及び／又はＫＤ（平衡解離定数）によって測定される標的抗原に対する結合親和性が、約１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２、１０－１３、１０－１４、１０－１５、１０－１６Ｍ若しくはそれ以下（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）などの望ましい特性を示す。
【0035】
本発明の特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は多価である。結合タンパク質の結合価は、結合タンパク質内の個々の抗原結合ドメインの数を示す。例えば、本発明の抗原結合タンパク質に関する「一価」、「二価」、「三価」及び「四価」という用語は、それぞれ、１つ、２つ、３つ及び４つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を指す。したがって、四価抗原結合タンパク質は４つ以上の抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は多価である。例えば、特定の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、以下の４つの抗原結合ドメインを含む四価である：第１の標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメイン及び第２の標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメイン。四重特異性抗原結合タンパク質は四価であり、以下の４つの抗原結合ドメインを含む：第１の標的抗原に結合する１つの抗原結合ドメイン、第２の標的抗原に結合する１つの抗原結合ドメイン、第３の標的抗原に結合する１つの抗原結合ドメイン、及び第４の標的抗原に結合する１つの抗原結合ドメイン。
【0036】
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」と互換的に使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し、その抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の領域を指す。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、標的抗原の天然リガンド由来であってよい。本明細書で使用する場合、「標的抗原」という用語は、二重特異性分子の第１の標的抗原及び／又は第２の標的抗原を指し、また、四重特異性分子の第１の標的抗原、第２の標的抗原、第３の標的抗原及び／又は第４の標的抗原を指す。
【0037】
本発明の抗原結合タンパク質の特定の実施形態では、結合ドメインは、抗体又はその機能的断片に由来であってよい。例えば、本発明の抗原結合タンパク質の結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲ領域」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列させられ、標的タンパク質の特異的エピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は両方とも、通常、以下のこれらの要素の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と一致する。
【0038】
したがって、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるＥＵインデックス及びＡＨｏ番号付けスキーム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７－７０）の両方が、本発明において使用され得る。所与の抗体のアミノ酸位置並びに相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、いずれの系を使用しても特定され得る。例えば、３９、４４、１８３、３５６、３５７、３６０、３７０、３９２、３９９、及び４０９のＥＵ重鎖位置はそれぞれ、ＡＨｏ重鎖位置４６、５１、２３０、４８４、４８５、４９１、５０１、５２８、５３５、及び５５１と同一である。
【0039】
抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同じ抗原結合性断片（その各々が単一の抗原結合部位を有する）及び残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン定常領域を含有する）が産生される。Ｆａｂ断片は、可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）の全てを含有する。したがって、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆｃ断片は炭水化物を示し、抗体の１つのクラスを別のクラスから識別する多くの抗体エフェクター機能（結合補体及び細胞受容体など）に関与する。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖に由来するＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖成分を表す。
【0040】
「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。
【0041】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域で、重鎖間のジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。
【0042】
「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全抗原認識及び結合部位を含有する最小の断片である。この断片は、緊密な非共有会合での、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲは相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、抗原を認識し、結合する能力を有するが、ＶＨ及びＶＬの両方を含む結合部位全体よりも親和性は低い。
【0043】
本明細書において「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と互換的に使用される「可変領域」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広範に保存され、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域は、ベータ－シート構造を採用し、ＣＤＲは、ベータ－シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造中に保持され、他方の鎖のＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。
【0044】
「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンのアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含み、少なくとも２つのシステイン残基を含む約１００アミノ酸残基を含むペプチドを表す。免疫グロブリンドメインとしては、例えば、免疫グロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、免疫グロブリン軽鎖のＶＬ、ＣＬが挙げられる。また、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン以外のタンパク質にも存在する。免疫グロブリン以外のタンパク質における免疫グロブリンドメインの例としては、免疫グロブリンスーパーファミリー、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）などに属するタンパク質に含まれる免疫グロブリンドメインが挙げられる。免疫グロブリンドメインのいずれも、本発明の多価抗体の免疫グロブリンドメインとして使用することができる。
【0045】
ヒト抗体では、ＣＨ１は、ＥＵインデックスの１１８～２１５位にアミノ酸配列を有する領域を意味する。「ヒンジ領域」と呼ばれる柔軟性の高いアミノ酸領域は、ＣＨ１とＣＨ２との間に存在する。ＣＨ２は、ＥＵインデックスの２３１～３４０位にアミノ酸配列を有する領域を表し、ＣＨ３は、ＥＵインデックスの３４１～４４６位にアミノ酸配列を有する領域を表す。
【0046】
「ＣＬ」は、軽鎖の定常領域を表す。ヒト抗体のκ鎖の場合、ＣＬは、ＥＵインデックスの１０８～２１４位にアミノ酸配列を有する領域を表す。λ鎖では、ＣＬは１０８～２１５位にアミノ酸配列を有する領域を表す。
【0047】
標的抗原に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）これらの抗原に対する既知の抗体、又はｂ）抗原タンパク質若しくはその断片を使用する新規な免疫化法により、ファージディスプレイにより、又は他の常法により得られる新しい抗体若しくは抗体断片に由来するものとすることができる。抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体とすることができる。特定の実施形態では、結合ドメインの起源である抗体は、モノクローナル抗体である。これらの及び他の実施形態では、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものとすることができる。
【0048】
本明細書で使用する場合、「安定性」及び「安定化」という用語は、ある期間にわたる抗原結合ポリペプチド又はタンパク質の化学的若しくは物理的完全性及び／又は生物活性の維持と定義される。抗原結合ポリペプチド又はタンパク質の安定化には、抗原結合ポリペプチド又はタンパク質の、その生物学的及び／又は治療的に活性な形態から不活性な形態への分解又は劣化の防止又は遅延が含まれる。不安定性は、凝集、変性、断片化、又は化学的改変、例えば酸化、架橋、脱アミド化、及び抗原結合ポリペプチド又はタンパク質を含む組成物に存在する他の成分との反応などの事象から生じ得る。
【0049】
組成物中の抗原結合タンパク質又はポリペプチドの安定性は、当該技術分野で知られた方法、例えば、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ技術による抗原結合活性などの生物学的活性の測定、或いはサイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリーゲル電気泳動、円偏光二色性又は質量分析などの抗原結合タンパク質又はポリペプチドに対する純度又は物理的／化学的変化を決定する他の技術を使用して特徴付けることができる。安定性は、組成物（すなわち、場合によっては、懸濁液又は分散液）の製剤化又は調製時などの初期時点でのこれらのタイプの特徴付け方法によって得られた測定値と、後の時点、すなわち、所与の環境又は条件での貯蔵後に得られた測定値との比較によって決定される。
【0050】
「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在する可能性のある天然の変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、通常、様々なエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個別の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって生成することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化することができる。ハイブリドーマを生成する融合手順に使用される骨髄腫細胞は、非抗体産生細胞であり、高い融合効率を有し、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する、特定の選択培地での増殖を不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合における使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２及びＵＣ７２９－６である。
【0051】
いくつかの例では、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を標的抗原で免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それにより、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株が作製される。
【0052】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の技術、例えば、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどを使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂをさらにスクリーニングして、例えば、標的抗原を発現している細胞に結合する能力、標的抗原が、そのそれぞれの受容体若しくはリガンドへの結合をブロック若しくは妨害する能力、又は標的抗原のいずれも機能的にブロックする能力など、特定の性質を有するｍＡｂを同定することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質の結合ドメインは、標的抗原に対するヒト化抗体に由来するものであってよい。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）が、対応するヒト免疫グロブリン由来の領域を含むように改変された抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物で作られたモノクローナル抗体から生成することができる。一般に抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体のある特定のアミノ酸残基が、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同となるように改変される。ヒト化は、例えば、種々の方法を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照）。別の種において生成された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作り出すために、複数のヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列に由来するＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。
【0054】
本発明の抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源とすることができる標的抗原に対して生成される新規な抗体は、完全ヒト抗体とすることができる。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の産生を実施するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を、内因性のＩｇ遺伝子が不活性化されたマウスに導入することは、任意の所望の抗原で免疫化することができる動物であるマウスで、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させる一手段である。完全ヒト抗体を使用すると、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって生じることがある免疫原性及びアレルギー性の応答を最小化することができる。
【0055】
完全ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって産生することができる。この目的のための抗原は、通常、６つ以上の連続アミノ酸を有し、任意選択により、担体にコンジュゲートされる（ハプテンなど）。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性のマウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、ヒト重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノムに挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体より少ない補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原が投与されると、これらのトランスジェニック動物は、その免疫原に免疫特異性があるが、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細は、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。
【0056】
本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれる上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー及びカッパ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）及びカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ又はカッパの発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９－５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１に詳細に記載されており、これらの文献はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、及び同第５，７７０，４２９号明細書、並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット、及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい。その全ての開示内容はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。こうしたトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の産生を利用する技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６においても開示されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【0057】
ヒト由来抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して生成することができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、２つの戦略のうちの１つによって導入することができる。すなわち、断片を操作して、所望する場合、哺乳動物細胞で発現する完全な抗体にするか、又はエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を有する抗体断片にすることができる。通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、その後、特定の抗原に結合するために選択することができる。抗体断片はファージ表面に発現し、Ｆｖ又はＦａｂ（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の抗原結合による選択は、パンニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって実現される。抗原に特異的な抗体断片は濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３（１９９４）を参照）。これについては、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示することが可能であり、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、次いで、抗原を用いて選択することができる。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。
【0058】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は抗体を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）とすることができる。「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」という用語は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択により免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に、それぞれさらに分けられる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来するものとすることができる。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち、軽鎖と重鎖との間）、及び抗体重鎖のヒンジ領域間の、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。
【0059】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体抗体（本明細書では「ヘテロ免疫グロブリン」又は「ヘテロＩｇ」と互換的に使用される）であり、これは２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む抗体を指す。
【0060】
ヘテロ二量体抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含むことができる。「定常領域」という用語は、本明細書で使用する場合、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接には関与しないが、種々のエフェクター機能を発揮する。上記のように、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てに見出される、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域、例えば、ヒトのカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域とすることができる。ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列の例を以下の表１に示す。
【0061】
【表1】
【0062】
ヘテロ二量体抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型の重鎖定常領域とすることができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体の抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２重鎖定常領域配列の例を下記の表２に示す。
【0063】
【表2】
【0064】
可変領域を上記軽鎖及び重鎖定常領域に付着させて、完全な抗体軽鎖及び重鎖をそれぞれ形成することができる。さらに、このようにして生成された重鎖及び軽鎖ポリペプチドの各々を組み合わせて、完全な二重特異性抗体構造、例えば、ヘテロ二量体抗体を形成することができる。本明細書において提供される重鎖及び軽鎖可変領域が、上に列挙された例示的な配列と異なる配列を有する他の定常ドメインにも結合され得ることを理解されたい。
【0065】
本発明の特定の実施形態では、２つの異なる重鎖が本発明のヘテロ二量体分子を形成するために使用される。ヘテロ二量体抗体への軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするために、各抗体からの軽鎖及び／又は重鎖は、誤対合分子の形成を減少させるように操作することができる。例えば、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を促進する１つのアプローチはいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」法であり、これは、接触界面で２つの異なる抗体重鎖のＣＨ３ドメインに変異を導入することを含む。具体的には、一方の重鎖中の１つ以上の嵩高いアミノ酸を短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン又はトレオニン）で置換して「ホール」を生成する一方、他方の重鎖に大きな側鎖を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、チロシン又はトリプトファン）を導入して「ノブ」を生成する。改変された重鎖が同時発現された場合、ホモ二量体（ホール－ホール又はノブ－ノブ）と比較して、ヘテロ二量体（ノブ－ホール）がより大きい割合で形成される。「ノブ・イントゥ・ホール」方法は、国際公開第９６／０２７０１１号パンフレット、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９：６１７－６２１，１９９６、及びＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：６７７－６８１，１９９８に詳細に記載されている（これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0066】
ヘテロ二量体の形成を促進しホモ二量体の形成を排除する別のアプローチは、静電ステアリング機構を利用することを伴う（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７－１９６４６，２０１０を参照（この文献は参照によりその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。このアプローチは、２つの異なる重鎖が静電引力を引き起こす反対の電荷によって会合するように、各重鎖中のＣＨ３ドメインに荷電残基を導入するか又はそれを利用することを含む。同一の重鎖は同じ電荷を有し、したがって反発するので、同一の重鎖のホモ二量体化は嫌われる。この同じ静電ステアリング技術を用いて、正しい軽鎖－重鎖対に反対の電荷を有する残基を結合界面に導入することによって、軽鎖と非同族重鎖との誤対合を防止することができる。ヘテロ二量体及び正しい軽鎖／重鎖対合を促進するための静電ステアリング技術及び好適な電荷対変異は、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット及び国際公開第２０１４／０８１９５５に記載されており、これらの両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0067】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質が第１の標的抗原に特異的に結合する第１の抗体由来の第１の軽鎖（ＬＣ１）及び第１の重鎖（ＨＣ１）、並びに標的２に特異的に結合する第２の抗体由来の第２の軽鎖（ＬＣ２）及び第２の重鎖（ＨＣ２）を含むヘテロ二量体抗体である実施形態においては、ＨＣ１又はＨＣ２は、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、一実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメイン又はＨＣ２のＣＨ３ドメインが、野生型ヒトＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジン及びアルギニン）がＣＨ３ドメイン中の対応する位置で１つ以上の負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）で置換されるように、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。これらの及び他の実施形態では、３７０、３９２及び４０９（ＥＵ番号付けシステム）から選択される１つ以上の位置のアミノ酸（例えば、リシン）が、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）で置換される。アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、本明細書においては、通常、特定の位置におけるアミノ酸残基が一文字略語で示され、次いで、目的の元の配列に対するアミノ酸位置の数字が続き、次いで、置換アミノ酸残基の１文字の略語が続く。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、目的の元の配列に対して、アミノ酸位置３０でのアスパラギン酸残基によるトレオニン残基の置換を表す。別の例の「Ｓ２１８Ｇ」は、目的の元のアミノ酸配列に対して、アミノ酸位置２１８でのグリシン残基によるセリン残基の置換を表す。
【0068】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体抗体のＨＣ１又はＨＣ２は、負に荷電したアミノ酸を正に荷電したアミノ酸で置換する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。例えば、一実施形態では、ＨＣ１のＣＨ３ドメイン又はＨＣ２のＣＨ３ドメインが、野生型ヒトＩｇＧアミノ酸配列中の１つ以上の負に荷電したアミノ酸がＣＨ３ドメイン中の対応する位置で１つ以上の正に荷電したアミノ酸で置換されるように、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。これらの及び他の実施形態では、ＣＨ３ドメインの３５６、３５７、及び３９９（ＥＵ番号付けシステム）から選択される１つ以上の位置のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）が、正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジン、及びアルギニン）で置換される。
【0069】
特定の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、３６０位、３７０位、３９２位及び４０９位に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３６０Ｅ／Ｄ、Ｋ３７０Ｅ／Ｄ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ及びＫ４０９Ｅ／Ｄの置換）を含む第１の重鎖、及び３５６位及び３９９位に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋの置換）を含む第２の重鎖を含む。他の特定の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、３９２位、４０９位及び３７０位に負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｄの置換）を含む第１の重鎖、及び３５６位、３９９位及び３５７位に正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋの置換）を含む第２の重鎖を含む。関連する実施形態では、第１の重鎖は、抗第１の抗原抗体に由来し、第２の重鎖は、抗第２の抗原抗体に由来する。
【0070】
本発明は、第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０位にアミノ酸の改変を含む単離されたヘテロ多量体であって、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ３７０位にアミノ酸の改変を含み、（ｉｉ）第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる、単離ヘテロ多量体を対象とする。
【0071】
別の態様では、本発明は、単離されたヘテロ多量体を約ｐＨ５．０で安定化する方法であって、ヘテロ多量体は第１のＣＨ３ドメインポリペプチド及び第２のＣＨ３ドメインポリペプチドを含むヘテロ二量体ＣＨ３ドメインを含み、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３７０位にアミノ酸の改変を含み、（ｉｉ）第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７位にアミノ酸の改変を含む方法において、第１のＣＨ３ドメインのＫ３６０位にアミノ酸の改変を導入することを含み、この改変はグルタミン酸又はアスパラギン酸でのＫ３６０の置換である（ここで、アミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスによる）方法を対象とする。
【0072】
一実施形態では、Ｋ３６０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ３６０Ｄからなる群から選択される。
【0073】
一実施形態では、Ｋ３７０位におけるアミノ酸の改変は、Ｋ３７０Ｅ及びＫ３７０Ｄからなる群から選択される。
【0074】
一実施形態では、Ｅ３５７位におけるアミノ酸の改変は、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｈ及びＥ３５７Ｒからなる群から選択される。
【0075】
一実施形態では、Ｋ３６０位のアミノ酸の改変はＫ３６０Ｅであり、Ｋ３７０位のアミノ酸の改変はＫ３７０Ｄであり、Ｅ３５７位のアミノ酸の改変はＥ３５７Ｋである。
【0076】
一実施形態では、一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む。
【0077】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９位にアミノ酸の改変を含む。
【0078】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＤ３９９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４０９位にアミノ酸の改変を含む。
【0079】
一実施形態では、Ｋ４０９位におけるアミノ酸の改変はＫ４０９Ｅ及びＫ４０９Ｄからなる群から選択され、Ｄ３９９位におけるアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｈ及びＤ３９９Ｒからなる群から選択される。
【0080】
一実施形態では、Ｋ４０９位のアミノ酸の改変はＫ４０９Ｄであり、Ｄ３９９位のアミノ酸の改変はＤ３９９Ｋである。
【0081】
一実施形態では、Ｋ４０９位にアミノ酸の改変を含むＣＨ３ドメインポリペプチドは、さらにＫ３９２位にアミノ酸の改変を含む。
【0082】
一実施形態では、Ｋ３９２位のアミノ酸の改変は、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄからなる群から選択される。
【0083】
一実施形態では、一方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、他方のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む。
【0084】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４３９位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５６位にアミノ酸の改変を含む。
【0085】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５６位にアミノ酸の改変を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ４３９位にアミノ酸の改変を含む。
【0086】
一実施形態では、Ｋ４３９位におけるアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅ及びＫ４３９Ｄからなる群から選択され、Ｅ３５６位におけるアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｈ及びＥ３５６Ｒからなる群から選択される。
【0087】
一実施形態では、Ｋ４３９位のアミノ酸の改変はＫ４３９Ｅであり、Ｅ３５６位のアミノ酸の改変はＥ３５６Ｋである。
【0088】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはＫ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはＥ３５７Ｋ及びＤ３９９Ｋ変異を含む。
【0089】
一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＫ４３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ３ドメインポリペプチドはさらにＥ３５６Ｋ変異を含む。
【0090】
一実施形態では、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ領域に基づくＦｃ領域に含まれる。
【0091】
一実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
【0092】
一実施形態では、ヘテロ多量体は、二重特異性又は多重特異性の抗体である。
【0093】
特定の重鎖とその同族の軽鎖との会合を促進するために、重鎖及び軽鎖の両方は、相補的アミノ酸置換を含有し得る。本明細書で使用する場合、「相補的アミノ酸置換」とは、一方の鎖における正に荷電したアミノ酸への置換と他方の鎖における負の荷電したアミノ酸置換とが対合することを指す。例えば、いくつかの実施形態では、重鎖は、荷電アミノ酸を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、対応する軽鎖は、荷電アミノ酸を導入する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、重鎖に導入される荷電アミノ酸は、軽鎖に導入されるアミノ酸の反対の電荷を有する。特定の実施形態では、第１の軽鎖（ＬＣ１）／対になる重鎖（ＨＣ１）の結合界面で、１つ又は複数の正に荷電した残基（例えば、リシン、ヒスチジン又はアルギニン）をＬＣ１に、１つ又は複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）をＨＣ１に導入することができ、一方、第２の軽鎖（ＬＣ２）／対になる重鎖（ＨＣ２）の結合界面で、１つ又は複数の負に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）をＬＣ２に、１つ又は複数の正に荷電した残基（例えば、リシン、ヒスチジン又はアルギニン）をＨＣ２に導入することができる。静電相互作用は、界面で反対に荷電した残基（極性）が引き合うため、ＬＣ１をＨＣ１に誘導して対合させ、ＬＣ２をＨＣ２と誘導して対合させる。界面で同じ荷電残基（極性）を有する重鎖／軽鎖の対（例えば、ＬＣ１／ＨＣ２及びＬＣ２／ＨＣ１）は反発し、結果として望ましくないＨＣ／ＬＣの対合が抑制される。
【0094】
これらの及び他の実施形態では、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸が１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸で置換されるような、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。或いは、重鎖のＣＨ１ドメイン又は軽鎖のＣＬドメインは、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸が１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸で置換されるような、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｌ１２８、Ａ１４１、Ｌ１４５、Ｋ１４７、Ｄ１４８、Ｈ１６８、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１７３、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｓ１８３、Ｖ１８５及びＫ２１３から選択されるＥＵ位置でのヘテロ二量体抗体中の第１の及び／又は第２の重鎖のＣＨ１ドメインにおける１つ又は複数のアミノ酸が、荷電したアミノ酸で置換される。特定の実施形態では、負又は正に荷電したアミノ酸により置換される重鎖残基は、Ｓ１８３（ＥＵ番号付けシステム）である。いくつかの実施形態では、Ｓ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換される。代替的な実施形態では、Ｓ１８３は負に荷電したアミノ酸で置換される。例えば、一実施形態では、Ｓ１８３は、第１の重鎖において負に荷電したアミノ酸で置換され（例えば、Ｓ１８３Ｅ）、第２の重鎖において、Ｓ１８３は、正に荷電したアミノ酸で置換される（例えば、Ｓ１８３Ｋ）。
【0095】
軽鎖がカッパ軽鎖である実施形態では、Ｆ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２３、Ｑ１２４、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｎ１３７、Ｎ１３８、Ｑ１６０、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７４及びＳ１７６から選択される位置（カッパ軽鎖におけるＥＵ番号付け）でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸が、荷電したアミノ酸で置き換えられる。軽鎖がラムダ軽鎖である実施形態では、Ｔ１１６、Ｆ１１８、Ｓ１２１、Ｅ１２３、Ｅ１２４、Ｋ１２９、Ｔ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１３７、Ｅ１６０、Ｔ１６２、Ｓ１６５、Ｑ１６７、Ａ１７４、Ｓ１７６及びＹ１７８から選択される位置（ラムダ鎖におけるＥＵ番号付け）でヘテロ二量体抗体中の第１及び／又は第２の軽鎖のＣＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸が、荷電したアミノ酸で置き換えられる。いくつかの実施形態では、負又は正に荷電したアミノ酸により置換される残基は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のＣＬドメインのＳ１７６（ＥＵ番号付けシステム）である。特定の実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。代替的な実施形態では、ＣＬドメインのＳ１７６は、負に荷電したアミノ酸で置換される。一実施形態では、Ｓ１７６は、第１の軽鎖において正に荷電したアミノ酸で置換され（例えば、Ｓ１７６Ｋ）、第２の軽鎖において、Ｓ１７６は、負に荷電したアミノ酸で置換される（例えば、Ｓ１７６Ｅ）。
【0096】
ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける相補的アミノ酸置換に加えて、又はその代替として、ヘテロ二量体抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域に、荷電アミノ酸を導入する１つ又は複数の相補的アミノ酸置換が含まれてもよい。例えば、一部の実施形態では、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域が、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸が１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸で置換されるような、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。或いは、重鎖のＶＨ領域又は軽鎖のＶＬ領域が、野生型ＩｇＧアミノ酸配列中の１つ又は複数の負に荷電したアミノ酸が１つ又は複数の正に荷電したアミノ酸で置換されるような、野生型ＩｇＧアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。
【0097】
ＶＨ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ及びＶＬ領域のアセンブリを媒介するアミノ酸残基）としては、ＥＵ位置１、３、３５、３７、３９、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５９、８９、９１、及び９３が挙げられる。ＶＨ領域中のこれらの界面残基の１つ以上は、荷電した（正又は負に荷電した）アミノ酸で置換され得る。特定の実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ３９Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置３９のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ３９Ｋ）。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／又は第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。特定の実施形態では、第１の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ４４Ｅ）、第２の重鎖のＶＨ領域中のＥＵ位置４４のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ４４Ｋ）。
【0098】
ＶＬ領域内のＶ領域界面残基（すなわち、ＶＨ及びＶＬ領域のアセンブリを媒介するアミノ酸残基）としては、ＥＵ位置３２、３４、３５、３６、３８、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、８５、８７、８９、９０、９１、及び１００が挙げられる。ＶＬ領域中の１つ以上の界面残基は、荷電アミノ酸、好ましくは、同族重鎖のＶＨ領域に導入されるものと反対の電荷を有するアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸、例えば、リシンに置換される。代替の実施形態では、第１及び／又は第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えば、グルタミン酸に置換される。特定の実施形態では、第１の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に置換され（例えば、Ｇ１００Ｋ）、第２の軽鎖のＶＬ領域中のＥＵ位置１００のアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に置換される（例えば、Ｇ１００Ｅ）。
【0099】
定常ドメインのいずれも、ヘテロ二量体抗体の正確なアセンブリを容易にするために、上記の電荷対変異の１つ以上を含むように改変され得る。
【0100】
本発明のヘテロ二量体抗体はまた、重鎖及び／又は軽鎖を含む抗体であって、１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が、例えば、抗体が発現される宿主細胞の型に起因する翻訳後の改変のために、重鎖及び軽鎖のいずれか１つに関して、Ｎ末端、Ｃ末端、又はその両方から欠失している抗体を包含する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はしばしば、抗体重鎖からＣ末端リシンを切断する。
【0101】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、（ｉ）第１の標的抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン、（ｉｉ）第２の標的抗原に特異的に結合する第２の結合ドメイン、及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含み、一方の結合ドメインはＦｃ領域のアミノ末端に位置し、他方の結合ドメインはＦｃ領域のカルボキシル末端に位置する。いくつかのこのような実施形態においては、第１及び第２の結合ドメインの各々は、免疫グロブリン可変領域を含む。例えば、特定の実施形態では、第１の結合ドメインは抗第１の標的抗原抗体由来の第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含み、第２の結合ドメインは抗第２の標的抗原抗体由来の第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む。
【0102】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成することができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択的に、ＣＨ４ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び貪食などのエフェクター機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、エフェクター機能を低減又は排除するように改変される場合がある。
【0103】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の特定の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）は、本明細書に記載されるペプチドリンカーを介して、又は免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合されたＦａｂフラグメントである。「免疫グロブリンヒンジ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結するアミノ酸配列を指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、一般に、約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までのアミノ酸配列と定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列させることができ、当業者に決定可能である。いくつかの実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。他の実施形態では、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。一実施形態では、アミノ末端結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ断片）は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介してＦｃ領域に融合される。
【0104】
本明細書で使用する場合、用語「改変重鎖」は、免疫グロブリン重鎖、特にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２重鎖、及び機能的抗体断片（例えば、Ｆａｂ）又はその一部（例えば、免疫グロブリン軽鎖又はＦｄ断片）を含む融合タンパク質であって、機能的抗体断片又はその一部は、そのＮ末端で、任意選択的にペプチドリンカーを介して、重鎖のＣ末端に融合されるタンパク質を指す。
【0105】
本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシル末端に位置する結合ドメイン（すなわち、カルボキシル末端結合ドメイン）はＦａｂ断片である。このような実施形態では、Ｆａｂは、Ｆａｂ断片のＶＨ領域のアミノ末端を介し、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のカルボキシル末端（例えば、ＣＨ３ドメインのカルボキシル末端）に融合されるか、又は連結される。したがって、一実施形態では、得られる融合タンパク質がＮ末端からＣ末端まで、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ペプチドリンカー、ＶＨ領域、及びＣＨ１領域を含むように、ＦａｂのＶＨ領域のアミノ末端を介してＦｃ領域にＦａｂが融合される。
【0106】
Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂに連結するペプチドリンカーは、本明細書中に記載されるペプチドリンカーのいずれかとすることができる。特定の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に連結するペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長である。他の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に連結するペプチドリンカーは、少なくとも８アミノ酸長である。Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂフラグメントに連結するために特に好適なペプチドリンカーは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎ（ここで、ｘ＝３又は４、及びｎ＝２、３、４、５又は６）などのグリシン－セリンリンカーである。一実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂ断片に連結するペプチドリンカーは、Ｌ１０（Ｇ４Ｓ）２リンカー（配列番号１０）である。別の実施形態では、Ｆｃ領域をカルボキシル末端Ｆａｂフラグメントに連結するペプチドリンカーは、Ｌ９又はＧ３ＳＧ４Ｓリンカー（配列番号１１）である。
【0107】
カルボキシル末端結合ドメインがＦａｂ断片である本発明の抗原結合タンパク質のいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ末端に位置する結合ドメイン（すなわち、アミノ末端結合ドメイン）もまた、Ｆａｂ断片である。アミノ末端Ｆａｂ断片は、本明細書に記載されるペプチドリンカー又は免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃ領域のアミノ末端に融合され得る。いくつかの実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。他の実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に連結される。一実施形態では、アミノ末端Ｆａｂ断片は、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介してＦｃ領域に融合される。
【0108】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的に特異的に結合する第１の抗体を含み、第２の標的に特異的に結合する第２の抗体由来のＦａｂ断片の１つのポリペプチド鎖（例えば、重鎖（ＶＨ２－ＣＨ１））は、第１の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合される。このような実施形態における二重特異性抗原結合タンパク質はまた、第２の抗体由来のＦａｂ断片の他の半分（例えば、軽鎖（ＶＬ２－ＣＬ））を含むポリペプチド鎖を含む。この型を本明細書では「ＩｇＧ－Ｆａｂ」型と称し、このタイプの分子の一実施形態を図１に概略的に示す。したがって、特定の実施形態では、本発明は、以下を含む二重特異性の多価抗原結合タンパク質を含む：（ｉ）第１の抗体由来の軽鎖、（ｉｉ）第１の抗体由来の重鎖（ここで、重鎖は、そのカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して、第２の抗体のＶＨ－ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチドに融合されて、改変重鎖を形成している）、及び（ｉｉｉ）第２の抗体のＶＬ－ＣＬドメインを含む第２のポリペプチド。二量体化される場合、二重特異性抗原結合タンパク質は、２つの改変重鎖、第１の抗体由来の２つの軽鎖、及び第２の抗体由来のＦａｂ断片の他の半分（Ｆｄ断片）を含む２つのポリペプチド鎖を含むホモ六量体である。別の実施形態では、重鎖のカルボキシル末端に融合される第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びのＣＬドメインを含み、且つ第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。
【0109】
本明細書に記載されるような電荷対変異又は相補的アミノ酸置換は、第１の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ１）又は第２の抗体のＦａｂ領域（Ｆａｂ２）に導入されて、正確な重鎖－軽鎖対合を促進し得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆａｂ１のＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）で置換され、Ｆａｂ１のＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン）で置換される。他の実施形態では、Ｆａｂ１のＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン）で置換され、Ｆａｂ１のＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）で置換される。特定の実施形態では、Ｆａｂ２のＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）で置換され、Ｆａｂ２のＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン）で置換される。他の実施形態では、Ｆａｂ２のＶＬドメインのＥＵ位置３８のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン）で置換され、Ｆａｂ２のＶＨドメインのＥＵ位置３９のアミノ酸は負に荷電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸）で置換される。
【0110】
第２の抗体由来のＶＨ－ＣＨ１領域（すなわち、Ｆｄ断片）が第１の抗体の重鎖に融合される実施形態において、第１の抗体由来の重鎖はＳ１８３Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第１の抗体由来の軽鎖はＳ１７６Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体由来の軽鎖はＳ１７６Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体由来のＦｄ領域（これは第１の抗体由来の重鎖のＣ末端に融合される）は、Ｓ１８３Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含む。他の実施形態では、第１の抗体由来の重鎖がＧ４４Ｅ突然変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第１の抗体由来の軽鎖がＧ１００Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体由来の軽鎖がＧ１００Ｅ変異（ＥＵ）及びＳ１７６Ｅ変異（ＥＵ番号付け）を含み、第２の抗体由来のＦｄ領域（これは第１の抗体由来の重鎖のＣ末端に融合される）がＧ４４Ｋ変異（ＥＵ）及びＳ１８３Ｋ変異（ＥＵ番号付け）を含む。前述の例における電荷は、対応する軽鎖又は重鎖上の電荷もまた、正しい重鎖／軽鎖対が反対の電荷を有するように反転される限り、反転され得る。
【0111】
ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインに関連する「～に対応する」は、リンカーが存在しなければ、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基が第１の重鎖のＣ末端から数えられることを意味する。ペプチドリンカーが存在する場合は、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基は、ペプチドリンカーのＣ末端から数えられる。いずれの場合も、アミノ酸残基は、第１の重鎖のＮ末端から数えられることはない。むしろ、ＶＨ２及び第２のＣＨ１ドメインの場合、計数はＶＨ２ドメインの最初のアミノ酸残基から開始される。アミノ酸残基の計数は、ＥＵ又はＡＨｏの慣例により行われる。
【0112】
特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１はＱ３９Ｅ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｋ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｂ）ＶＨ２はＱ３９Ｋ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｅ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｃ）ＶＬ１はＱ３８Ｋ変異を含み、第１のＣＬドメインはＳ１７６Ｅ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；且つｄ）ＶＬ２はＱ３８Ｅ変異を含み、第２のＣＬドメインはＳ１７６Ｋ変異を含む（ＥＵ番号付けを使用）。
【0113】
特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインはＧ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｂ）第２のＣＨ１ドメインはＧ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅを含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｃ）第１のＣＬドメインはＧ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；且つｄ）第２のＣＬドメインはＧ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含む（ＥＵ番号付けを使用）。
【0114】
特定の実施形態では、ａ）ＶＨ１はＱ３９Ｋ変異を含み、第１のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｅ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｂ）ＶＨ２はＱ３９Ｅ変異を含み、第２のＣＨ１ドメインはＳ１８３Ｋ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｃ）ＶＬ１はＱ３８Ｅ変異を含み、第１のＣＬドメインはＳ１７６Ｋ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；且つｄ）ＶＬ２はＱ３８Ｋ変異を含み、第２のＣＬドメインはＳ１７６Ｅ変異を含む（ＥＵ番号付けを使用）。
【0115】
特定の実施形態では、ａ）第１のＣＨ１ドメインはＧ４４Ｋ及びＳ１８３Ｅ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｂ）第２のＣＨ１ドメインはＧ４４Ｅ及びＳ１８３Ｋを含み（ＥＵ番号付けを使用）；ｃ）第１のＣＬドメインはＧ１００Ｅ及びＳ１７６Ｋ変異を含み（ＥＵ番号付けを使用）；且つｄ）第２のＣＬドメインはＧ１００Ｋ及びＳ１７６Ｅ変異を含む（ＥＵ番号付けを使用）。
【0116】
特定の実施形態では、第１の重鎖は、ペプチドリンカーを介してＶＨ２に融合される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）６及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６からなる群から選択される配列を含む。これらの配列はまた、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２０）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１）と記載することができる。
【0117】
さらに、又は代わりに、正しい重鎖－軽鎖対合は、カルボキシル末端Ｆａｂ結合ドメイン中のＣＨ１及びＣＬドメインを交換することによって促進され得る。一例として、重鎖のカルボキシル末端に融合される第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含んでもよく、且つ第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含んでもよい。別の実施形態では、重鎖のカルボキシル末端に融合される第１のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含んでもよく、且つ第２のポリペプチドは、第２の抗体由来のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含んでもよい。
【0118】
本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクター機能に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑと、Ｆｃとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性を含むエフェクター機能、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強する１つ又は複数のアミノ酸置換を定常領域に含む。エフェクター機能を増強することができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）としては、以下に限定されないが、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又はこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【0119】
他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、エフェクター機能を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換を定常領域に含む。エフェクター機能を低減することができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付け）としては、以下に限定されないが、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又はこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【0120】
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクター機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又はタイプに影響を及ぼす１つ又は複数のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース及びキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸への結合、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンも使用され得る。
【0121】
特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列のうちの１つ又は複数を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に実現することができる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。改変はまた、１つ若しくは複数のセリン残基若しくはトレオニン残基の開始配列への付加、又はそれらによる開始配列の置換によってもなすことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基の位置で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、改変することができる。
【0122】
本発明はまた、炭水化物構造が改変された結果、エフェクター活性が改変されている二重特異性抗原結合タンパク質分子、例えば、フコシル化がないか又は減少してＡＤＣＣ活性の向上を示す抗原結合タンパク質の産生を包含する。フコシル化を減少させる又は排除する様々な方法が当該技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクター機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４を参照）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を減少させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするための細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤を用いる培養によって、実現することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９を参照）。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３を参照）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された炭水化物レベルの増加も、ＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９を参照）。
【0123】
他の実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質のグリコシル化は、１つ又は複数のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除くことによって減少又は排除される。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を低減又は排除することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７位（ＥＵ番号付け）に、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７Ｇなどの変異を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ２３４位及びＬ２３５位（ＥＵ番号付け）にＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａなどの変異を含む。特定の一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、分子のＦｃ領域をさらに操作してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域中の１つ又は複数のアミノ酸が、二量体状態でジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ番号付け）に対応する残基は、システインで置換され得る。一実施形態では、残基の特定の対が、互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換され、それによってジスルフィド結合の混乱が制限又は防止される。特定の実施形態では、対として、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域はまたＮ２９７Ｇ変異を含む場合がある。
【0124】
例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み又は付加による（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いて、例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合させることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照）、或いはＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマーなどの分子の付加による、血清半減期を延長するための本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の改変もまた望ましい場合がある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ又は複数のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質中の類似の位置に移入される領域を構成する。一実施形態では、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が移入される。一実施形態では、エピトープがＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインからとられ、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３若しくはＶＨ領域、又は２つ以上のそのような領域に移される。或いは、エピトープがＦｃ領域のＣＨ２ドメインからとられ、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移される。Ｆｃバリアント及びそのサルベージ受容体との相互作用の説明については、国際出願である、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。
【0125】
本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質及びその成分をコードする、１つ又は複数の単離された核酸を含む。本発明の核酸分子には、単鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子並びにそれらの断片の組み合わせが含まれる。一実施形態では、本発明の核酸はヒト供給源に由来するが、本発明には非ヒト種に由来するものも含まれる。
【0126】
免疫グロブリン若しくはその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）又は目的のポリペプチド由来の関連するアミノ酸配列は、直接タンパク質配列解析法によって決定することができ、好適なコードヌクレオチド配列は普遍コドン表に従ってデザインすることができる。或いは、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の結合ドメインの起源となり得る、モノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、そのような抗体を産生する細胞から単離し、配列決定することができる。
【0127】
本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドなどの、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸の場合、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸コンストラクトの構成要素としての核酸分子を指す。一実施形態では、核酸は、夾雑内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているもの）によって、その構成要素のヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに由来した。このような配列は、通常真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供且つ／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在することができ、この場合、これは、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書に記載されるいかなる単鎖ポリヌクレオチド配列も左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【0128】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質のバリアントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発により、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該技術分野においてよく知られた他の技術を使用して、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることによって調製することができる。しかし、約１００～１５０個までの残基を有するバリアントＣＤＲを含む抗原結合タンパク質は、確立された技術を使用してインビトロ合成によって調製することができる。バリアントは、通常、天然の類似体と同様の定性的生物学的活性、例えば抗原への結合を示す。このようなバリアントは、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに至るのであるが、但し、最終コンストラクトは所望の特性を保持するものとする。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを改変する場合もある。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質バリアントは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を改変する目的で調製される。他の実施形態では、本明細書に記載の目的のため、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の改変が望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のいずれかにおける変異誘発が企図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な改変をデザインするために、当業者は共分散分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共分散分析によって決定されるこのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態学的、薬力学的及び／又は製造可能性の特性を改善することができる。
【0129】
本発明の核酸配列。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重のために、極めて多数の核酸が作製され得、それらの全ては、本発明のＣＤＲ（並びに、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖及び軽鎖、又は他の成分）をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したなら、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の異なる核酸を作製し得るであろう。
【0130】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、改変重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ又は複数の核酸を含むベクターを含む。「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例としては、以下に限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが挙げられる。「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の宿主細胞において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含有する組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、以下に限定されないが、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含むことができる。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び場合によりその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択により発現ベクターによってコードされ、目的のコード配列に作動可能に連結されることが可能であり、これにより、所望する場合、細胞から目的のポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、本発明のいずれかのアミノ末端に付加／融合され得る。特定の実施形態では、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号２２）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。他の実施形態では、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号２３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。さらに他の実施形態では、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。本明細書に記載されるポリペプチド配列のアミノ末端に融合され得る他の好適なシグナルペプチド配列としては、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２５）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号２６）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２７）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号２９）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号３０）が挙げられる。他のシグナルペプチドは当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、本発明のポリペプチド鎖のいずれかに融合され得る。
【0131】
通常、本発明の二重特異性抗原タンパク質を産生するために宿主細胞で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びに二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含有する。集合的に「隣接配列」と呼ばれるこのような配列は、特定の実施形態では、通常、以下のヌクレオチド配列の１つ又は複数を含む：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。これらの配列の各々を、以下で考察する。
【0132】
任意選択により、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ポリペプチドコード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有することができ、このオリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は市販の抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、通常、ポリペプチドが発現すると、ポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって実現することができる。任意選択により、タグは、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製されたポリペプチドから除去することができる。
【0133】
隣接配列は、同種性（すなわち、宿主細胞と同一の種及び／又は株に由来する）、異種性（すなわち、宿主細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源に由来する隣接配列の組み合わせ）、合成、又は天然とすることができる。したがって、隣接配列の供給源は、あらゆる原核生物若しくは真核生物、あらゆる脊椎生物若しくは無脊椎生物、又はあらゆる植物であってよいが、但し、隣接配列は、宿主細胞機構において機能的であり、且つ当該機構によって活性化され得ることを条件とする。
【0134】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該技術においてよく知られたいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。通常、本明細書において有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されていよう。したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織源から単離することができる。場合によっては、隣接配列の全ヌクレオチド配列が知られている可能性がある。この場合、隣接配列は、核酸合成又はクローン化の常法を使用して合成することができる。
【0135】
隣接配列の全てが既知であるか、又はその一部のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して、並びに／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくは隣接配列断片などの好適なプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得ることができる。隣接配列が不明である場合、隣接配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列又は別の遺伝子を含有し得るより大きなＤＮＡ片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を産生し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）又は当業者に知られた他の方法を使用して単離することにより実現することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に分かるであろう。
【0136】
複製起点は、通常、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞内でのベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有していなければ、知られている配列に基づいて化学的に合成して、ベクター中にライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、様々なウイルス性の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えば、ＨＰＶ若しくはＢＰＶなど）が哺乳動物細胞におけるベクターのクローン化に有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含有するという理由でのみ、使用されることが多い）。
【0137】
転写終結配列は通常、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置しており、転写を終結させるように機能する。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、又はベクターの一部として市販品が購入されるが、既知の核酸合成方法を使用して容易に合成することもできる。
【0138】
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシンに対する耐性を付与するか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するか、又は（ｃ）複合培地若しくは規定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞の双方の選択に用いることができる。
【0139】
他の選択遺伝子を用いて、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存にとって重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それにより、選択遺伝子と、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の１つ又は複数の成分などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの双方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。
【0140】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側、及び発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。特定の実施形態では、１つ以上のコード領域が、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されていてよく、単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。
【0141】
真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるなどの場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができ、これもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ又は複数の追加のアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位にある１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。或いは、いくつかの酵素切断部位を使用すると、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドがわずかに切断された形態を生じ得る。
【0142】
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が産生されるように、２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列にライゲートされる。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組み合わせを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。
【0143】
プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。従来、プロモーターは、次の２つのクラスにグループ化される：誘導性プロモーター及び構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じ、その制御下で、ＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、供給源ＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の、例えば、重鎖、軽鎖、改変重鎖、又は他の成分をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【0144】
酵母宿主とともに使用するのに好適なプロモーターも当該技術分野においてよく知られている。有利には、酵母エンハンサーが、酵母プロモーターと共に用いられる。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモーターはよく知られており、以下に限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【0145】
対象となり得るさらなるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）、メタロチオニン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）、及びβ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）、又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域も対象とする：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）、膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）、リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）、精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）、肝臓において活性であるアルファ－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）、肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）、骨髄細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）、及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。
【0146】
エンハンサー配列をベクターに挿入し、高等真核生物によって、二重特異性抗原結合タンパク質の成分（例えば、軽鎖、重鎖、改変重鎖、Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位の５’側及び３’側の双方の位置にて見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な複数のエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェトプロテイン、及びインスリン）。しかしながら、一般的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいて、コード配列の５’側及び３’側のいずれに位置してもよいが、一般的には、プロモーターの５’側の部位に位置決めされる。適切な天然の又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、細胞外への抗体の分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の型に依存し、異種性のシグナル配列が天然のシグナル配列に取って代わることができる。シグナルペプチドの例は、上に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとしては、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
【0147】
提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含有していても含有していなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つ以上がベクター内に最初から存在していない場合、それらを個々に得てベクターにライゲートしてもよい。隣接配列の各々を得るために用いられる方法は、当業者によく知られている。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質などのタンパク質を産生することができる。
【0148】
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質の異なる成分をコードする核酸を、同じ発現ベクターに挿入してもよい。例えば、抗第１の標的抗原軽鎖をコードする核酸を、抗第１の標的抗原重鎖をコードする核酸と同じベクターにクローニングすることができる。このような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、単一のプロモーターの制御下で、２つの核酸が分離されてもよい。或いは、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下にあってもよい。いくつかの実施形態では、抗第１の標的抗原軽鎖及び重鎖をコードする核酸を１つの発現ベクターにクローニングし、抗第２の標的抗原軽鎖及び重鎖をコードする核酸を第２の発現ベクターにクローニングする。
【0149】
同様に、ＩｇＧ－Ｆａｂ二重特異性抗原結合タンパク質については、３つの成分の各々をコードする核酸を、同じ発現ベクターにクローニングしてもよい。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ－Ｆａｂ分子の軽鎖をコードする核酸、及び第２のポリペプチド（Ｃ末端のＦａｂドメインのもう半分を含む）をコードする核酸を、１つの発現ベクターにクローニングし、一方、改変重鎖（重鎖及びＦａｂドメインの半分を含む融合タンパク質）をコードする核酸を、第２の発現ベクターにクローニングする。特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分が、同じ宿主細胞集団から発現される。例えば、１つ又は複数の成分が別個の発現ベクターにクローン化される場合でも、１つの細胞が二重特異性抗原結合タンパク質の全ての成分を産生するように、宿主細胞に両方の発現ベクターを同時トランスフェクトする。
【0150】
ベクターが構築され、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ又は複数の核酸分子が、１つ又は複数のベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターを、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入することができる。したがって、本発明は、二重特異性抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ又は複数の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞を包含する。「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸で形質転換されているか、又は形質転換されることが可能であり、それにより、目的の遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的の遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫の形態又は遺伝的構造が元の親細胞と同一であるか否かに関係なく、親細胞の子孫が含まれる。一実施形態において少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【0151】
抗原結合タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含むよく知られた方法で実現することができる。選択される方法は、ある程度、使用される宿主細胞の型に応じることになる。こうした方法及び他の適切な方法は、当業者によく知られており、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。
【0152】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると抗原結合タンパク質を合成し、抗原結合タンパク質はその後、（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合は）培養培地から、又は（それが分泌されない場合は）それを産生する宿主細胞から直接的に、採取することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）に望ましいか又は必要であるポリペプチドの改変、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの様々な要因に依存する。
【0153】
例示的な宿主細胞としては、原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの多くの他の属、種及び株が、ここで一般に利用可能であり、有用である。
【0154】
グリコシル化された抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来とすることができる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルスの株及びバリアント、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の、対応する昆虫の許容宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１バリアント、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公に入手可能である。
【0155】
脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、このような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は常法となっている。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、以下に限定されないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローン化された２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態では、どの細胞株が発現レベルが高く本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を恒常的に産生するかを決定することによって、細胞株を選択してよい。別の実施形態では、それ自体の抗体は作製しないが、異種性抗体を作製及び分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞が、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質を発現させるための宿主細胞である。
【0156】
宿主細胞は、二重特異性抗原結合タンパク質の産生のために上記の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地で培養される。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規なベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法であって、本明細書に記載される１つ又は複数の発現ベクターを含む宿主細胞を、この１つ又は複数の発現ベクターによってコードされる二重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下にて培養培地で培養する工程と、培養培地から二重特異性抗原結合タンパク質を回収する工程とを含む方法を提供する。
【0157】
本発明の抗原結合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０、米国特許第４，７６７，７０４号明細書、同第４，６５７，８６６号明細書、同第４，９２７，７６２号明細書、同第４，５６０，６５５号明細書、若しくは同第５，１２２，４６９号明細書、国際公開第９０／１０３４３０号パンフレット、国際公開第８７／００１９５号パンフレット、又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。他に必要な任意の栄養補助物質もまた、当業者に知られる適切な濃度で含めてもよい。温度及びｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【0158】
宿主細胞を培養すると、二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞内で産生されるか、細胞膜周辺腔内で産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、粒状の破片である宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又は親和性リガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７－１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔質ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて実現することができるよりも、流速を速く、処理時間を短くすることが可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されるべき特定の二重特異性抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた可能である。
【0159】
本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、生体試料中の標的抗原の検出、及び標的抗原を発現する細胞又は組織の同定に有用である。本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質は、標的抗原に関連する疾患及び／又は病態を検出、診断、又はモニターする診断目的に使用され得る。また、当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ １５（Ｅｄｓ Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ ａｎｄ Ｐ．Ｈ．ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７－１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６－９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７－３０９６）を使用して、試料中の標的抗原の存在を検出する方法が提供される。標的の検出は、インビボ又はインビトロで実施することができる。
【0160】
本明細書で提供される診断用途には、標的抗原の発現を検出するための抗原結合タンパク質の使用が含まれる。受容体の存在の検出において有用な方法の例には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定法（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが含まれる。
【0161】
診断用途では、通常、抗原結合タンパク質が検出可能な標識基で標識される。好適な標識基としては、以下の、放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基又は二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。タンパク質の標識方法は、当該技術分野において様々なものが知られており、そうしたものを使用してよい。
【0162】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を使用して、標的抗原を発現する１つ又は複数の細胞を同定することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は標識基で標識され、標識された抗原結合タンパク質の標的抗原への結合が検出される。さらなる特定の実施形態では、標的抗原への抗原結合タンパク質の結合は、インビボで検出される。さらなる特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られた技術を使用して単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照されたい。
【実施例】
【0163】
改変された塩架橋の有無にかかわらず、モノクローナル抗体の結晶構造に基づいて、Ｋ３６０が２つのＦｃ鎖間の界面残基として同定されている。ヘテロ－Ｆｃ分子の対合及び構造の改善をスクリーニングするために行われた初期の実験は、Ｆｃに融合された単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）と弾頭を欠くＦｃ鎖との組み合わせを用いて行われた。意図したヘテロ－Ｆｃ型に組み立てた場合、図１に示すように、分子量は約７５キロダルトン（ｋＤａ）であった。対照的に、２つのｓｃＦｖ弾頭を有するか、又は弾頭を全て欠くホモ二量体に分子が組み立てられた場合、分子量は、それぞれ約１００ｋＤａ又は５０ｋＤａであった。これらの分子の生成において、改変フラグメントを合成し、ゴールデンゲートクローニング戦略を用いてプラスミドにクローニングした。得られた組換え分子のパネルを、ＮＲＣＣによって確立され公表された方法に従って、懸濁液中のＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ１細胞の一過性発現を用いて作製した。生成から６日後に、培養培地（ＣＭ）を細胞培養物から回収し、一般に確立されている手順でプロテインＡ精製に進め、続いて分析した。この分析において、非共有結合凝集と所望の種の比率を、工業的に確立された方法に従ってサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定した。ホモ二量体とヘテロ二量体の形成比を、主に分子サイズによる移動に基づいて、Ｃａｌｉｐｅｒ ＳＤＳマイクロキャピラリーゲル電気泳動（ｍＣＥ）装置を用いて測定した。４４のバリアントの最初のスクリーニングから、好ましい対合特異性及び発現力価を有する分子のセットを、さらなる最適化及び分析のために選択した。スクリーニングにおけるリードバリアントの測定値を図２に示す。選択されたバリアントの各々は、ＷＴ（４７．６１％のヘテロ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）と比較して、８９．４％～９４．６％の範囲のレベルを有しており、対合特異性が改善していることは明らかである。産生されるヘテロ－ｓｃＦｖ－Ｆｃの量を、産生力価、及びｍＣＥによって計算され、図２において７５ｋＤａ ＭＰ（ｍｇ／Ｌ）下で示される主ピークパーセントから計算した。これらの測定により、多くのバリアントはＷＴよりも多くの所望の種を有し、いくつかは確立されたバリアントＣＰＭｖ１よりも多くの所望の種を有した。
【0164】
第２の実験では、リードバリアントを改変されたモノクローナル抗体で試験した。図３に示すように、改変には、ＣＨ３領域における電荷対変異の付加、及びＦａｂ領域の一方と及びＦｃ領域の間のヒンジにおけるＤＥＶＤ切断部位の付加が含まれる。この型をヘテロＩｇＧの代わりに使用して、軽鎖と重鎖との間の非特異的対合によって導入される可変性を排除した。この実験では、内部ベクターと結合したＣＨＯ－Ｋ１安定発現系を用いて産生を行った。これらの産生からの力価は１８６ｍｇ／Ｌ～２７５ｍｇ／Ｌの範囲であり、かなり低い分散を示す。精製は、プロテインＡキャプチャーで開始した。これに続いて、確立された方法に従ってＳＥＣによってＨＭＷ種を除去した。次いで、このプロセスを、工業標準的技法に従って、陽イオン交換（ＣＥＸ）によるモノクローナル抗体からの単離で完了した。ＳＥＣ及びＭＳによって測定した所望の生成物の純度に従って、プールするために画分を選択した。精製のＣＥＸ段階の間に、いくつかのバリアントが複数のピークに分裂することが観察された。これらのピークをＭＳで測定したところ、主に分子量が一致する種であった。さらに、１つのピークからサンプルを収集し、ＣＥＸに再ロードしたところ、それらは、以前に観察された同じパターンに複数のピークに分離した（データは示さず）。これは、これらのバリアントがＣＥＸカラムの特定の条件に暴露された場合に立体構造の変化をもたらす程度の不安定性を有していたことを示す。この現象は、図４に示すように、ＣＥＸに使用された緩衝液がｐＨ５．０である場合に特に顕著であり、一方、分子の計算されたｐＩは７．９３の範囲であった。ピーク分布は、緩衝液がｐＨ５．６及び６．０である場合により均一であった。また、Ｋ３７０Ｄ／Ｅを有するＥ３５７ＫのＣＰＭをＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ／Ｅを有するＤ３９９ＫのＣＰＭと組み合わせて使用した場合に、複数のピークの形成が起こることが観察された。図５に示すように、Ｋ３７０Ｄ／Ｅを有するＥ３５７Ｋでの電荷対をＫ３６０Ｅ変異体と組み合わせて使用した場合、不均一なピークの度合いは実質的に減少し、ｐＨ５．６及び６．０で観察された時間に近く溶出する主ピークをもたらした。これらの結果から、Ｋ３６０Ｅを加えたＣＰＭｖ５３１及びＣＰＭｖ５２６は、標準精製条件で最も頑強なバリアントであると同定された。
【0165】
本明細書において論じ、引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書により組み込まれる。開示した発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【0166】
当業者は、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか、又は確認することができよう。このような同等物は、続く特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】