(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-26
(54)【発明の名称】Ｍ－タンパク質アッセイおよびその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20221219BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20221219BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221219BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N27/62 V
G01N33/50 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525780
(86)(22)【出願日】2020-11-04
(85)【翻訳文提出日】2022-07-01
(86)【国際出願番号】 US2020058927
(87)【国際公開番号】W WO2021092044
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】62/931,063
(32)【優先日】2019-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391015708
【氏名又は名称】ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ－ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】サントキーテ，ラサ
(72)【発明者】
【氏名】ゼン，ジアニン
(72)【発明者】
【氏名】プイグ，オスカル
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA04
2G041DA05
2G041EA04
2G041FA12
2G041GA06
2G041HA01
2G041LA08
2G041MA05
2G045AA26
2G045BB03
2G045CA26
2G045DA36
2G045FB06
(57)【要約】
本開示は、精製された免疫グロブリンを液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することを含む、対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定するための方法を提供する。いくつかの局面において、免疫グロブリンは、免疫捕捉（ＩＣ）を使用して精製される。特定の局面において、対象は、形質細胞障害、例えば多発性骨髄腫を有する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
形質細胞障害を有する対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定する方法であって、以下：（ｉ）免疫捕捉により試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（ｉｉ）免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること
を含む、方法。
【請求項2】
形質細胞障害のための療法後の完全な応答者を決定する際の偽陽性を減少させる方法であって、以下：（ｉ）免疫捕捉により生体試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（ｉｉ）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること
を含む、方法。
【請求項3】
残存疾患を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を同定する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生体試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること
により測定され；対象が、形質細胞障害を有すると以前に同定された、方法。
【請求項4】
形質細胞障害を処置するための療法に適した対象を同定する方法であって、以下：（ｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、以下：
（１）免疫捕捉により生体試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること
により測定される、測定すること
を含む、方法。
【請求項5】
さらに以下：（ｉｉ）形質細胞障害を処置するための療法をＭ－タンパク質を有すると同定される対象に投与すること
を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
対象が形質細胞障害を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、以下：
（１）免疫捕捉により生体試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される、測定すること；および
（ｉｉ）形質細胞障害のための療法をＭ－タンパク質を有すると同定される対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項8】
形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）形質細胞障害のための療法を対象に投与すること；
（ｉｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、以下：
（１）免疫捕捉により生体試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および
（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること
により測定される、測定すること；および
（ｉｉｉ）形質細胞障害のための追加の療法を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項9】
生物学的試料が尿試料または血清試料である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
形質細胞障害のための療法を形質細胞障害を有する対象に投与することを含む、該対象を処置する方法であって、ここで対象が、血清および／または尿Ｍ－タンパク質を有すると同定されており、および血清および／または尿Ｍ－タンパク質が、免疫捕捉を使用して精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより、対象から得られる生物学的試料中で測定された、方法。
【請求項11】
対象が形質細胞障害を処置するために以前の療法を受けた、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
以前の療法が免疫療法を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
形質細胞障害のための療法が免疫療法を含む、請求項２、４から８、および１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
免疫療法が抗体療法を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
免疫療法がチェックポイント阻害剤の療法を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
抗体が、ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＮＫＧ２ａ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＩＬ－２、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、Ｆａｓリガンド、ＣＸＣＲ４、メソテリン、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ２２９、ＣＤ２００、ＣＤ２８、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３１７、ＣＤ７０、Ｂ２Ｍおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
形質細胞障害のための療法が、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を含む、請求項２、４から８、および１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
形質細胞障害のための療法が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、レナリドマイド、カルフィルゾミブ、ポマリドマイド、パノビノスタット、サリドマイド、幹細胞移植、ＣＡＲ－Ｔ療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２、４から８、および１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
Ｍ－タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ、ＩｇＤ、それらの断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
Ｍ－タンパク質が、カッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
Ｍ－タンパク質が、１つまたは複数の遊離軽鎖を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
ＭＳが、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
ＭＳが、レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＴＯＦを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＭＳが、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
免疫捕捉が、自動化された免疫捕捉である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
精製された免疫グロブリンが、軽鎖および重鎖に解離される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
精製された免疫グロブリンを軽鎖および重鎖に解離することをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
精製された免疫グロブリンが、化学的還元により解離される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
精製された免疫グロブリンが、該精製された免疫グロブリンを、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）；ＴＣＥＰ－ＨＣｌおよびその他のＴＣＥＰ塩； ＤＴＴ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）、ＤＴＥ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）；チオグリコレート；亜硫酸塩；亜硫酸水素塩；硫化物；二硫化物；２－メルカプトエタノール；２－メルカプトエタノール－ＨＣｌ；Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、中性ｐＨ；システイン－ＨＣｌ；グアニジン－ＨＣｌ；尿素；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される試薬と接触させることにより、解離される、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
ＬＣが、超高性能（ＵＣ）ＬＣである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
ＬＣが、ＭＳとオンラインである、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
形質細胞障害が、多発性骨髄腫を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
多発性骨髄腫が、軽鎖多発性骨髄腫を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
多発性骨髄腫が、形質細胞白血病を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項35】
形質細胞白血病が、一次形質細胞白血病または二次形質細胞白血病を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、ヒトＳＬＡＭＦ７への結合についてエロツズマブと交差競合する、請求項１７から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、エロツズマブと同じまたは重複するヒトＳＬＡＭＦ７上のエピトープに結合する、請求項１７から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１７から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、エロツズマブである、請求項１７から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、静脈内投与される、請求項１７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
対象に追加の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
レナリドマイドを対象に投与することをさらに含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
ポマリドミドを対象に投与することをさらに含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
デキサメタゾンを対象に投与することをさらに含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
ジフェンヒドラミンを対象に投与することをさらに含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
ラニチジンを対象に投与することをさらに含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
アセトアミノフェンを対象に投与することをさらに含む、請求項１および２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
残存疾患が、微小残存疾患（ＭＲＤ）を含む、請求項３、５、９および１１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
このＰＣＴ出願は、２０１９年１１月５日に出願された米国仮出願第６２／９３１，０６３号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
このＰＣＴ出願は、２０１９年１１月５日に出願された米国仮出願第６２／９３１，０６３号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定するための方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
開示の背景
モノクローナル免疫グロブリン血症は、Ｍ－タンパク質として一般に既知である１つまたは複数のモノクローナル免疫グロブリンの異常な産生を特徴とする血液学的障害である。Ｍ－タンパク質は骨髄中で急速に分裂するクローン形質細胞により発現され、血流に分泌されるため、血清中のＭ－タンパク質を測定することにより悪性形質細胞を検出することができる。Ｍ－タンパク質は、本質的に多様である：各患者の過剰産生抗体の可変領域は異なる；しかしながら、個人の悪性形質細胞は、元の前駆細胞と同一の分子量で定義された免疫グロブリンを発現する。
モノクローナル免疫グロブリン血症は、Ｍ－タンパク質として一般に既知である１つまたは複数のモノクローナル免疫グロブリンの異常な産生を特徴とする血液学的障害である。Ｍ－タンパク質は骨髄中で急速に分裂するクローン形質細胞により発現され、血流に分泌されるため、血清中のＭ－タンパク質を測定することにより悪性形質細胞を検出することができる。Ｍ－タンパク質は、本質的に多様である：各患者の過剰産生抗体の可変領域は異なる；しかしながら、個人の悪性形質細胞は、元の前駆細胞と同一の分子量で定義された免疫グロブリンを発現する。
【0004】
多発性骨髄腫患者の診断およびモニタリングについて、Ｍ－タンパク質の測定が必要である。現在のゲル電気泳動ベースのＭ－タンパク質アッセイは、感度および特異性が低く、Ｍ－タンパク質と共移動する免疫グロブリンまたは他の血清タンパク質の存在のため、非常に低いＭ－タンパク質濃度で定量的でない。したがって、生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定するための改良された方法が必要である。
【発明の概要】
【0005】
開示の概要
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定する方法であって、以下：（ｉ）免疫捕捉により試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（ｉｉ）免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することを含む方法に向けられる。
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定する方法であって、以下：（ｉ）免疫捕捉により試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（ｉｉ）免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することを含む方法に向けられる。
【0006】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害の療法後の完全な応答者を決定する際の偽陽性を減少させる方法であって、以下：（ｉ）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（ｉｉ）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することを含む方法に向けられる。
【0007】
本開示の特定の局面は、残存疾患を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を同定する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定され；対象が、形質細胞障害を有すると以前に同定された方法に向けられる。
【0008】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を処置するための療法に適した対象を同定する方法であって、以下：（ｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでタンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される、測定することを含む方法に向けられる。いくつかの局面において、該方法は、（ｉｉ）Ｍ－タンパク質を有すると同定される対象に形質細胞障害のための療法を投与することをさらに含む。
【0009】
いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害を有する。
【0010】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を処置する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること；およびＭ－タンパク質を有すると同定される対象に形質細胞障害のための療法を投与することにより測定される方法に向けられる。
【0011】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）形質細胞障害のための療法を対象に投与すること；（ｉｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される、測定すること；および（ｉｉｉ）形質細胞障害のための追加の療法を対象に投与することを含む方法に向けられる。
【0012】
いくつかの局面において、生物学的試料は、尿試料または血清試料である。
【0013】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害のための療法を形質細胞障害を有する対象に投与することを含む、対象を処置する方法であって、ここで対象が、血清および／または尿Ｍ－タンパク質を有すると同定されており、および血清および／または尿Ｍ－タンパク質が、免疫捕捉を使用して精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより、対象から得られる生物学的試料中で測定された方法に向けられる。
【0014】
いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害を処置するために以前の療法を受けた。いくつかの局面において、以前の療法は免疫療法を含む。いくつかの局面において、形質細胞障害のための療法は、免疫療法を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、抗体療法を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤の療法を含む。いくつかの局面において、抗体は、ＳＬＡＭＦ７、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＮＫＧ２ａ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＩＬ－２、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、Ｆａｓリガンド、ＣＸＣＲ４、メソテリン、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ２２９、ＣＤ２００、ＣＤ２８、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３１７、ＣＤ７０、Ｂ２Ｍおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗体結合部分を含む。いくつかの局面において、形質細胞障害のための療法は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を含む。
【0015】
いくつかの局面において、形質細胞障害のための療法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、レナリドマイド、カルフィルゾミブ、ポマリドマイド、パノビノスタット、サリドマイド、幹細胞移植、ＣＡＲ－Ｔ療法またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0016】
いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ、ＩｇＤ、それらの断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質は、カッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプを含む。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質は、１つまたは複数の遊離軽鎖を含む。
【0017】
いくつかの局面において、ＭＳは、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳを含む。いくつかの局面において、ＭＳは、レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＴＯＦを含む。いくつかの局面において、ＭＳは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを含む。
【0018】
いくつかの局面において、免疫捕捉は、自動化された免疫捕捉である。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、軽鎖および重鎖に解離される。いくつかの局面において、該方法は、精製された免疫グロブリンを軽鎖および重鎖に解離することをさらに含む。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、化学的還元により解離される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、該精製された免疫グロブリンを、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＴＣＥＰ－ＨＣｌおよびその他のＴＣＥＰ塩；ＤＴＴ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）、ＤＴＥ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）；チオグリコレート；亜硫酸塩；亜硫酸水素塩；硫化物；二硫化物；２－メルカプトエタノール；２－メルカプトエタノール－ＨＣｌ；Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、中性ｐＨ；システイン－ＨＣｌ；グアニジン－ＨＣｌ；尿素；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される試薬と接触させることにより解離される。
【0019】
いくつかの局面において、ＬＣは、超高性能（ＵＣ）ＬＣである。いくつかの局面において、ＬＣはＭＳとオンラインである。
【0020】
いくつかの局面において、形質細胞障害は、多発性骨髄腫を含む。いくつかの局面において、多発性骨髄腫は、軽鎖多発性骨髄腫を含む。いくつかの局面において、多発性骨髄腫は、形質細胞白血病を含む。いくつかの局面において、形質細胞白血病は、一次形質細胞白血病または二次形質細胞白血病を含む。
【0021】
いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ヒトＳＬＡＭＦ７への結合についてエロツズマブと交差競合する。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、エロツズマブと同じまたは重複するヒトＳＬＡＭＦ７上のエピトープに結合する。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体はエロツズマブである。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は静脈内投与される。
【0022】
いくつかの局面において、方法は、追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、対象にレナリドマイドを投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、対象にポマリドマイドを投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、対象にデキサメタゾンを投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、対象にジフェンヒドラミンを投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、対象にラニチジンを投与することをさらに含む。いくつかの局面において、方法は、アセトアミノフェンを対象に投与することをさらに含む。
【0023】
いくつかの局面において、残存疾患は、微小残存疾患（ＭＲＤ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図１は、ヒトから得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定するための免疫捕捉（ＩＣ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）方法論を示すフローチャートである。
【0025】
図２Ａ－２Ｉは、以下：正常なヒト血清からの免疫捕捉免疫グロブリン（図２Ａ－２Ｃ）；第１の多発性骨髄腫患者の血清から得られる血清試料から免疫捕捉される免疫グロブリン（図２Ｄ－２Ｆ）；および第２の多発性骨髄腫患者から得られる血清試料から免疫捕捉される免疫グロブリン（図２Ｇ－２Ｉ）についての液体クロマトグラフィー（図２Ａ、２Ｄ、および２Ｇ）、代表的な質量スペクトル（図２Ｂ、２Ｅ、および２Ｈ）、および再構成されたスペクトル（図２Ｃ、図２Ｆ、および２Ｉ）による、免疫グロブリンの単純化された分離の結果を示すグラフ表示である。
【0026】
図３は、ＰＨＹＴＩＰ（登録商標）抗ラムダ／カッパ捕捉アプローチを使用する、Ｍ－タンパク質およびモノクローナル治療用抗体（ｔ－ｍＡｂ）の一貫した高収率の回収率のグラフ表示である。
【0027】
図４は、示されているように、５つの同一でない治療用ｍＡｂ（ｔ－ｍＡｂ）についてのデコンボリューションされた軽鎖標準曲線のグラフを示す。
【0028】
図５Ａ－５Ｉは、ポリクローナルバックグラウンドより上の単一モノクローナル抗体軽鎖の低レベルの定量化を示す。３つの個別のモノクローナル抗を、正常なヒト血清にスパイクし、免疫捕捉ＩＣ－ＬＣ－ＭＳ方法論を使用してテストした。ｍＡｂ１についての結果を図５Ａ－５Ｃに、ｍＡｂ２について図５Ｄ－５Ｆに、およびｍＡｂ３について図５Ｇ－５Ｉに示す。各抗体を、１０００μｇ／ｍＬ（図５Ａ、５Ｄ、および５Ｇ）、１００μｇ／ｍＬ（図５Ｂ、５Ｅ、および５Ｈ）、および１０μｇ／ｍＬ（図５Ｃ、５Ｆ、および５Ｉ）の濃度でテストした。免疫捕捉ＩＣ－ＬＣ－ＨＲＭＳ方法論についての推定ＬＯＤは、感度が１０００μｇ／ｍＬの臨床ＳＰＥＰアッセイのＬＯＤの１００分の１である。図５Ｊ－５Ｍは、異なるＭ－タンパク質（ＩｇＧＫ、図５Ｊ；ＩｇＧＬ、図５Ｋ；ＩｇＡＫ、図５Ｌ；およびＩｇＡＬ、図５Ｍ）を健康な血清にスパイクすることにより構成される人工試料中でのＩＣ－ＬＣ－ＭＳの検出限界を示す。検出限界は、ポリクローナルバックグラウンドに対するＭ－タンパク質ピークの比により異なる。
【0029】
図６は、ＳＩＦＥにより測定可能な最低の段階希釈濃度でＩＣ－ＬＣ－ＭＳ法により測定されるＭ－タンパク質ＭＳ応答の分布を表すプロットである。推定されるＩＣ－ＬＣ－ＭＳ方法のＬＯＤは、ＳＩＦＥＬＯＤの１０－１００分の１である。
【0030】
図７Ａ－７Ｎは、ＩＣ－ＬＣ－ＭＳ法アッセイが、Ｍ－タンパク質を検出するときに治療用モノクローナル抗体からの干渉を排除することを示す代表的な質量スペクトルである。
【0031】
図８Ａ－８Ｈは、ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイ（図８Ｃおよび８Ｇ）と比較した標準的な臨床試験（ＳＰＥＰ、図８Ａおよび８Ｅ；ＳＩＦＥ、図８Ｂおよび８Ｆ；およびｓＦＬＣ、図８Ｄおよび８Ｈ）の感度を示すグラフ表示である。異なる処置サイクル（１サイクルは２８日）で２人の多発性骨髄腫患者（患者１、図８Ａ－８Ｄ；患者２、図８Ｅ－８Ｈ）から収集される血清試料が、この分析のために使用された。
【0032】
図９Ａ－９Ｆは、Ｃ１Ｄ１（図９Ａ）、Ｃ１８Ｄ１（図９Ｂ）、Ｃ８Ｄ１（図９Ｃ）、Ｃ２６Ｄ１（図９Ｄ）、Ｃ１５Ｄ１（図９Ｅ）およびＣ３１Ｄ１（図９Ｆ）についてのＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイによる免疫グロブリンプロファイルのグラフ表示である。多発性骨髄腫患者からの血清試料において、全ての処置時点で２２４７０±１．５Ｄａで検出可能なモノクローナル軽鎖ピークを示す。
【0033】
開示の詳細な説明
本開示は、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定するための方法を提供する。本開示はまた、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、形質細胞障害のための療法に適した対象を同定するための方法を提供する。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質は、試料中の免疫グロブリンおよび／または遊離軽鎖を精製し、精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される。いくつかの局面において、免疫グロブリンおよび／または遊離軽鎖は、免疫捕捉を使用して精製される。いくつかの局面において、該方法は、形質細胞障害のための療法を投与することをさらに含む。いくつかの局面において、該方法は、形質細胞障害を処置するのに有用な抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体（抗ＳＬＡＭＦ７抗体）を対象に投与することをさらに含む。
本開示は、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定するための方法を提供する。本開示はまた、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、形質細胞障害のための療法に適した対象を同定するための方法を提供する。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質は、試料中の免疫グロブリンおよび／または遊離軽鎖を精製し、精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される。いくつかの局面において、免疫グロブリンおよび／または遊離軽鎖は、免疫捕捉を使用して精製される。いくつかの局面において、該方法は、形質細胞障害のための療法を投与することをさらに含む。いくつかの局面において、該方法は、形質細胞障害を処置するのに有用な抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体（抗ＳＬＡＭＦ７抗体）を対象に投与することをさらに含む。
【0034】
Ｉ．語
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書で明示的に規定されている場合を除き、以下の各語は、以下に記載されている意味を有するものとする。追加の定義は、出願全体で説明される。
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書で明示的に規定されている場合を除き、以下の各語は、以下に記載されている意味を有するものとする。追加の定義は、出願全体で説明される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「Ｍ－タンパク質」なる語は、対象におけるモノクローナル免疫グロブリン血症、例えば多発性骨髄腫による１つまたは複数のモノクローナル免疫グロブリンの異常な産生の結果である、免疫グロブリンの多様な群を指す。Ｍ－タンパク質は、骨髄において急速に分裂するクローン形質細胞により発現され、血流に分泌される。Ｍ－タンパク質は本質的に多様である：各患者の過剰産生抗体の可変領域は異なる；しかしながら、個人の悪性形質細胞は、元の前駆細胞と同一の分子量で定義された免疫グロブリンを発現する。重鎖の定常領域に基づいて、Ｍ－タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＤクラスに属することができる。多発性骨髄腫において、ＩｇＧが最も一般的な免疫グロブリンであり、ＩｇＡが２番目に一般的であり、ＩｇＭは０．５％未満の症例しか含まず、ＩｇＤは非常にまれである。軽鎖の定常領域に基づいて、各免疫グロブリンは、カッパおよびラムダのアイソタイプに分けることができる。各Ｍ－タンパク質は、インタクトな免疫グロブリン分子および／またはベンスジョーンズタンパク質としても既知である「遊離軽鎖」（ＦＬＣ）などの免疫グロブリン断片から実質的になるか、またはそれらからなることができる。「遊離軽鎖」は、重鎖に関連しない免疫グロブリンの軽鎖を指す。尿または血清中の遊離軽鎖の存在は、多発性骨髄腫のいくつかのマーカーの１つである。遊離軽鎖は、尿中で低分子量のモノマー、ダイマー、または高分子量のポリマーとして、血清中でテトラマーとして存在することができる。
【0036】
Ｍ－タンパク質は典型的に血流中に分泌されるため、悪性形質細胞は、血清中のＭ－タンパク質を測定することにより検出することができる。「測定すること」または「測定される」または「測定」なる語は、対象から得られる生物学的試料中の測定可能な量のＭ－タンパク質を決定することを意味する。本明細書で使用される場合、測定することは、質量分析工程を含む方法を使用して達成される。質量分析は、試料中に存在する１つまたは複数の分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定するのに役立つ分析ツールである。これらの測定値は、試料成分の正確な分子量を計算するためによく使用されることができる。通常、質量分析計は、分子量の決定により未知の化合物を同定し、既知の化合物を定量化し、および分子の構造および化学的性質を決定するために使用できる。本明細書に開示される方法において、精製および還元された免疫グロブリンは、質量分析計に適用され、生物学的試料中のＭ－タンパク質を同定する能力を高める。
【0037】
本明細書で使用される「生物学的試料」なる語は、対象から単離される生物学的材料を指す。生物学的試料は、Ｍ－タンパク質を含んでもよい任意の生物学的物質を含有することができる。生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、骨髄生検、および／または尿などの任意の適切な生物学的組織または体液であることができる。一局面において、試料は血清試料である。一局面において、試料は尿試料である。一局面において、試料は骨髄生検である。
【0038】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル免疫グロブリン血症」は、１つまたは複数のＭ－タンパク質の産生を特徴とする一種の血液学的障害を指す。モノクローナル免疫グロブリン血症は、重要性が不明なモノクローナル免疫グロブリン血症などの良性から、多発性骨髄腫などの癌性までさまざまである。
【0039】
本明細書で使用される場合、「形質細胞障害」は、（時にはリンパ形質細胞様細胞またはＢリンパ球に関連する）前悪性または悪性形質細胞のクローンまたは複数のクローンがＭ－タンパク質を産生して血流中に分泌する。形質細胞障害の非排他的な例は、重要性が不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）および、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞関連新生物を含む血液悪性腫瘍を含む。
【0040】
本明細書で使用される場合、「多発性骨髄腫」または「形質細胞骨髄腫」は、形質細胞の癌を指す。形質細胞は、抗体を産生する白血球の一種である。多発性骨髄腫はさらに、骨髄における癌細胞の蓄積と関連している。癌細胞は、異常なモノクローナル抗体（Ｍ－タンパク質）を産生する。
【0041】
「投与すること」は、当技術分野で既知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用する、対象への治療薬を含む組成物の物理的導入を指す。投与経路の非限定的な例は、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口投与経路を含む。本明細書で使用される場合、「非経口投与」なる句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、これに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病変内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入、ならびにインビボ電気穿孔を含む。他の非非経口(non-parenteral)経路は、例えば鼻腔内、膣内、直腸、舌下または局所的な、経口、局所、表皮または粘膜の投与経路を含む。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つまたは複数の長期間にわたって実施できる。
【0042】
本明細書で使用される場合、「有害事象」（ＡＥ）は、医学的処置の使用に関連する、好ましくない、一般に意図しない、または望ましくない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または疾患である。例えば、有害事象は、処置に応答した免疫系の活性化または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）の拡大に関連することができる。医学的処置は、１つまたは複数の関連するＡＥを有することができ、各ＡＥは同じまたは異なるレベルの重症度を有することができる。「有害事象を変える」ことができる方法への言及は、異なる処置レジームの使用に関連する１つまたは複数のＡＥの発生率および／または重症度を低下させる処置レジームを意味する。
【0043】
「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」は、これに限定されないが、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を含む。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つの定常ドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0044】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがこれに限定されない、一般的に既知のアイソタイプのいずれかに由来することができる。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがこれに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。ヒトにおいて、免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリンカッパ遺伝子座および免疫グロブリンラムダ遺伝子座の２つの遺伝子座によりコードされている。このように、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかに分類される。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＬＣ－ラムダおよびＬＣ－カッパナノボディ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）、ならびにカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかに特異的に結合できる種々の市販の抗体が利用可能であり、これは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＫａｐｐａ－ＦＩＴＣ（Ｃ１５６２３）、Ｌａｍｂｄａ－ＰＥ（Ｃ１５１８９）、Ｌａｍｂｄａ－ＰＣ７（Ｂ９０４１６）、およびＫａｐｐａ－ＡＰＣ（Ｂ９０４２０）；Ａｂｃａｍによる抗カッパ軽鎖抗体（例えば、ａｂ１３４０８３、ａｂ７９５５８、およびａｂ１９３６）および抗ラムダ軽鎖抗体（例えば、ａｂ１２４７１９、ａｂ１８７３７０、ａｂ１８５１３１、およびａｂ２００９６６）；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃe（登録商標）によるカッパ軽鎖モノクローナル抗体（ＴＢ２８－２）、ＦＩＴＣ、およびラムダ軽鎖モノクローナル抗体（１－１５５－２）、ＡＰＣを含むが、これに限定されない。これらの例は、限定することを意図するものではなく、任意の既知の抗カッパおよび／または抗ラムダ捕捉試薬を、本明細書に開示される方法において使用できる。
【0045】
「捕捉試薬」なる語は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトまたは非ヒト抗体；完全合成抗体；単鎖抗体、ナノボディ、アファマー、その他の分析対象物結合タンパク質およびアプタマー、およびそれらの任意の組み合わせを含む。明示的に述べられていない場合、および文脈が別段の指示をしない限り、「捕捉試薬」なる語はまた、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合断片または抗原結合部分を含み、一価および二価の断片または部分、および一本鎖抗体を含む。
【0046】
本明細書で使用される場合、抗体、例えば治療用抗体の抗原結合「部分」または「断片」は、抗原に結合する能力を保持する、全体よりも少ない抗体の一部を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により実施できることが十分に実証されている。抗体の「抗原結合部分」なる語に含まれる結合断片の例は、以下を含む：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、または（ｖ）それらの任意の組み合わせ。
【0047】
本明細書で使用される場合、「治療用抗体」は、抗原に結合し、インビボまたはインビトロで効果を誘発することができる抗体またはその抗原結合部分を指す。
【0048】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する単離された抗体は、ＳＬＡＭＦ７以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）が、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する単離された抗体は、異なる種のＳＬＡＭＦ７分子などの他の抗原と交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないことができる。
【0049】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、単一分子組成の抗体分子、すなわち、一次配列が本質的に同一であり、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体分子の天然に存在しない調製物を指す。モノクローナル抗体は、単離された抗体の一例である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニック、または当技術分野で既知の他の技術により産生することができる。
【0050】
「ヒト抗体」（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」なる語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」なる語は、同義語として使用される。
【0051】
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体のＣＤＲの外側のアミノ酸の一部、ほとんど、または全てが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置き換えられている抗体を指す。ヒト化形態の抗体の一局面において、ＣＤＲ外のアミノ酸の一部、ほとんど、または全てがヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置き換えられている一方、１つまたは複数のＣＤＲ内の一部、ほとんど、または全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸のわずかな追加、欠失、挿入、置換または改変は、特定の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限り、許容される。「ヒト化抗体」は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。
【0052】
「キメラ抗体」は、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体、例えば可変領域がマウス抗体に由来する抗体および定常領域を指す。領域は、ヒト抗体に由来する。
【0053】
「抗抗原抗体」は、抗原に特異的に結合する抗体を指す。例えば、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する。
【0054】
「癌」は、体内の異常な細胞の制御されない成長を特徴とする種々の疾患の幅広い群を指す。調節されていない細胞分裂および成長は分裂して成長し、悪性腫瘍の形成をもたらし、また、隣接する組織に侵入し、リンパ系または血流を介して体の離れた部分に転移することができる。
【0055】
「免疫療法」なる語は、免疫応答を誘導、増強、抑制、または他の方法により改変することを含む方法による、疾患に罹患している、または罹患または再発のリスクのある対象の処置を指す。対象の「処置」または「療法」は、症状、合併症または状態、または疾患に関連する生化学的兆候の発症、進行、発達、重症度または再発を逆転、緩和、改良、阻害、減速または予防することを目的として、対象に対して実施される任意のタイプの介入またはプロセス、あるいは活性剤の投与を指す。いくつかの局面において、免疫療法は、対象に治療用抗体を投与することを含む。
【0056】
「シグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７」、「ＳＬＡＭＦ７」、「ＣＤ３１９」、または「ＣＳ－１」は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、活性化Ｔ細胞、ほとんどのＢ細胞、および多発性骨髄腫細胞により発現される免疫調節受容体を指す。ＳＨ２Ｄ１Ｂを共発現する細胞において、ＳＬＡＭＦ７はリン酸化ＳＨ２Ｄ１Ｂに依存するメカニズムによりＮＫ細胞の機能を積極的に調節する。ＳＨ２Ｄ１Ｂがない場合、ＳＬＡＭＦ７はＮＫ細胞の機能を阻害する。本明細書で使用される場合、「ＳＬＡＭＦ７」なる語は、ヒトＳＬＡＭＦ７（ｈＳＬＡＭＦ７）、ｈＳＬＡＭＦ７の変異体、アイソフォーム、および種相同体、ならびにｈＳＬＡＭＦ７と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全なｈＳＬＡＭＦ７配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ９ＮＱ２５下で見出すことができる。
【0057】
「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」なる語は、非ヒト霊長類などの脊椎動物、ヒツジ、イヌ、およびマウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物を含むがこれに限定されない。好ましい局面において、対象はヒトである。「対象」および「患者」なる語は、本明細書では交換可能に使用される。
【0058】
薬物または治療薬の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患の発症から対象を保護する任意の量の薬物である。疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による不調または障害の予防により証明される疾患の退行を促進する。疾患の退行を促進する治療薬の能力は、臨床試験中のヒト対象、ヒトにおける有効性を予測する動物モデルシステムにおけるような熟練した医師に既知の様々な方法を用いて、またはインビトロアッセイにおける薬剤の活性を評価することにより、評価できる。
【0059】
例として、「抗癌剤」は、対象における癌の退行を促進する。好ましい局面において、治療有効量の薬物は、癌を排除する点まで癌の退行を促進する。「癌の退縮を促進する」は、有効量の薬物を単独で、または抗腫瘍剤と組み合わせて投与すると、腫瘍の成長またはサイズの減少、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の減少、無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による不調または障害の予防をもたらすことを意味する。さらに、処置に関する「有効」および「有効性」なる語は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者の癌の退行を促進する薬物の能力を指す。生理学的安全性は、薬物の投与に起因する毒性のレベル、または細胞、臓器、および／または生物レベルでの他の有害な生理学的影響（副作用）を指す。
【0060】
「免疫応答」は、当技術分野で理解されている通りであり、一般に、外来物質または異常な、例えば、癌性細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、応答は、これらの因子およびそれらにより引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性または他の異常な細胞、または自己免疫または病的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織の選択的な標的化、それへの結合、それへの損傷、それの破壊、および／またはそれの脊椎動物の体からの排除をもたらす、免疫系の１つまたは複数の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）、およびこれらの細胞のいずれか、または肝臓により生成される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用により媒介される。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞、例えばエフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞の活性化または阻害、または免疫系の他の任意の細胞、例えばＮＫ細胞の活性化または阻害を含む。
【0061】
「免疫関連応答パターン」は、癌特異的免疫応答を誘導することにより、または天然の免疫プロセスを改変することにより抗腫瘍効果を生み出す免疫療法剤で処置される癌患者においてしばしば観察される臨床応答パターンを指す。この反応パターンは、腫瘍量の初期増加または新しい病変の出現に続く有益な治療効果を特徴とし、従来の化学療法剤の評価において、疾患の進行として分類され、薬物の失敗と同義である。したがって、免疫療法剤の適切な評価は、標的疾患に対するこれらの薬剤の効果の長期モニタリングを必要とすることができる。
【0062】
「免疫調節剤」または「免疫制御剤」は、薬剤、例えば、免疫応答の調節、調節、または改変に関与することができるシグナル伝達経路の成分を標的とする薬剤を指す。免疫応答を「調節する」、「制御する」、または「改変する」ことは、免疫系の細胞またはかかる細胞（例えば、Ｔｈ１細胞などのエフェクターＴ細胞）の活性における任意の変化を指す。かかる調節は、種々の細胞タイプの数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少、または免疫系内で起こることができる他の変化により現れることができる免疫系の刺激または抑制を含む。抑制性および刺激性の両方の免疫調節剤が同定されており、そのうちのいくつかは腫瘍微小環境において機能を強化することができる。いくつかの局面において、免疫調節剤は、Ｔ細胞の表面上の分子を標的とする。「免疫調節標的」または「免疫制御標的」は、物質、薬剤、部分、化合物または分子による結合の標的であり、その活性がその結合により変化する分子、例えば細胞表面分子である。免疫調節標的は、例えば、細胞表面上の受容体（「免疫調節受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節リガンド」）を含む。
【0063】
「免疫療法」は、免疫系または免疫応答を誘導、増強、抑制、または他の方法で改変することを含む方法による、疾患に罹患している、または罹患または再発のリスクのある対象の処置を指す。特定の局面において、免疫療法は、対象に抗体を投与することを含む。他の局面において、免疫療法は、対象に小分子を投与することを含む。他の局面において、免疫療法は、サイトカインまたはその類似体、変異体、または断片を投与することを含む。
【0064】
治療有効量の薬物は、「予防有効量」を含み、これは、癌を発症するリスクのある対象（例えば、前癌状態を有する対象）または癌の再発を患うリスクのある対象に、単独でまたは抗腫瘍剤と組み合わせて投与された場合に、癌の発症または再発を阻害する薬物の任意の量である。好ましい局面において、予防的に有効な量は、癌の発生または再発を完全に防ぐ。癌の発生または再発を「阻害する」とは、癌の発生または再発の可能性を減らすか、または癌の発生または再発を完全に防ぐことを意味する。
【0065】
代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、記載または列挙された構成要素の「１つまたは複数」を指すと理解されるべきである。
【0066】
「約」または「本質的に～を含む」なる語は、当業者により決定される特定の値または組成物の許容誤差範囲内にある値または組成物を指し、これは、部分的に、価値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの限界に依存する。例えば、「約」または「本質的に含む」は、当技術分野における慣行ごとに１以内または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」または「本質的に～を含む」は、最大１０％の範囲を意味することができる。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、これらの用語は、最大で１桁、または最大で５倍の値を意味することができる。特定の値または組成物が出願および特許請求の範囲で提供される場合、特に明記しない限り、「約」または「本質的に～を含む」の意味は、その特定の値または組成物の許容誤差範囲内にあると想定されるべきである。
【0067】
本明細書に記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲または整数範囲は、記載された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、特に明記されていない限り、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
【0068】
本開示の様々な局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。
【0069】
ＩＩ．開示の方法
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を処置する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること；および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること；およびＭ－タンパク質を有すると同定される対象に治療有効量の免疫療法を投与することにより測定される方法に向けられる。いくつかの局面において、免疫療法は、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分（「抗ＳＬＡＭＦ７抗体」）を含む。
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を処置する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること；および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用すること；およびＭ－タンパク質を有すると同定される対象に治療有効量の免疫療法を投与することにより測定される方法に向けられる。いくつかの局面において、免疫療法は、ＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分（「抗ＳＬＡＭＦ７抗体」）を含む。
【0070】
本開示のいくつかの局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）対象に治療有効量の免疫療法を投与すること；（ｉｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）へ適用することにより測定される、測定すること；および（ｉｉｉ）追加の治療有効量の免疫療法を対象に投与することを含む方法に向けられる。いくつかの局面において、免疫療法は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を含む。
【0071】
本開示のいくつかの局面は、免疫療法に適した対象を同定する方法であって、以下：（ｉ）対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することであって、ここでＭ－タンパク質が、（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される、測定することを含む方法に向けられる。いくつかの局面において、該方法は、Ｍ－タンパク質を有すると同定される対象に治療有効量の免疫療法を投与することをさらに含む。いくつかの局面において、免疫療法は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を含む。いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害を有する。
【0072】
本開示のいくつかの局面は、残存疾患を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を同定する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定され；対象が、形質細胞障害を有すると以前に同定された方法に向けられる。
【0073】
本開示のいくつかの局面は、対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定する方法であって、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することを含む方法に向けられる。いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害を有する。
【0074】
いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、偽陽性の発生を低減する。多発性骨髄腫を含む形質細胞障害を処置するための処置オプションの中には、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を含む治療用抗体の使用がある。しかしながら、Ｍ－タンパク質を測定するための既存の方法は、形質細胞障害を示すＭ－タンパク質（多発性骨髄腫など）と、最近処置された衣装の血清中に残る治療用抗体を区別できない。その結果、測定可能なＭ－タンパク質が残っていない場合でも、対象は誤ってＭ－タンパク質レベルが陽性であると分類される。これらの偽陽性は、結果を確認するための骨髄生検などのより侵襲的な検査または必要でなくてもよい追加の処置につながることができる。本明細書に開示される方法は、疾患および治療用抗体を示すＭ－タンパク質の分化を可能にし、偽陽性の発生率を低減する。
【0075】
いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、Ｍ－タンパク質を測定する標準的な方法と比較して、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質の早期の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、ＳＰＥＰアッセイと比較して、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質の早期の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、ＳＩＦＥアッセイと比較して、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質の早期の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、標準的な方法を使用してｓＦＬＣ比を測定することと比較して、対象から得られる試料中のＭ－タンパク質の早期の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、標準的な方法と比較して、少なくとも約１０％早い、少なくとも約２０％早い、少なくとも約２５％早い、少なくとも約３０％早い、少なくとも約４０％早い少なくとも約５０％早い、少なくとも約６０％早い、少なくとも約７０％早い、少なくとも約８０％早い、少なくとも約９０％早い、少なくとも約９５％早い、Ｍ－タンパク質の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、少なくとも標準的な方法より、少なくとも約１サイクル早い、少なくとも約２サイクル早い、少なくとも約３サイクル早い、少なくとも約４サイクル早い、少なくとも約５サイクル早い、少なくとも約６サイクル早い、少なくとも約７サイクル早い、少なくとも約８サイクル早い、少なくとも約９サイクル早い、少なくとも約１０サイクル早い、少なくとも約１５サイクル早い、少なくとも約２０サイクル早い、約２５サイクル早い、少なくとも約３０サイクル早い、Ｍ－タンパク質の検出を可能にする。いくつかの局面において、本明細書に開示される方法は、標準的な方法より少なくとも約１０サイクル早いＭ－タンパク質の検出を可能にする。
【0076】
Ａ．形質細胞障害
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を診断、モニター、および／または処置する方法に向けられる。形質細胞障害は、（リンパ形質細胞様細胞またはＢリンパ球と関連する場合もある）前悪性または悪性形質細胞のクローンまたは複数のクローンが過剰産生して血流Ｍ－タンパク質に分泌される、進行性のより重篤なモノクローナル免疫グロブリン血症のスペクトルを含む。形質細胞障害の非排他的な例は、重要性が不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）および多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞関連新生物などの血液悪性腫瘍を含む。
本開示の特定の局面は、形質細胞障害を診断、モニター、および／または処置する方法に向けられる。形質細胞障害は、（リンパ形質細胞様細胞またはＢリンパ球と関連する場合もある）前悪性または悪性形質細胞のクローンまたは複数のクローンが過剰産生して血流Ｍ－タンパク質に分泌される、進行性のより重篤なモノクローナル免疫グロブリン血症のスペクトルを含む。形質細胞障害の非排他的な例は、重要性が不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）および多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞関連新生物などの血液悪性腫瘍を含む。
【0077】
本開示の特定の局面において、形質細胞疾患はＭＧＵＳである。ＭＧＵＳは、クローン形質細胞増殖の無症候性の前癌段階である。ＭＧＵＳは、５０歳以上の人口の約３－５％において存在する。ＭＧＵＳを有する対象の約１％は、毎年多発性骨髄腫に進行する。
【0078】
本開示の特定の局面において、形質細胞障害は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、全ての血液癌の１０－１５％を占めるクローン形質細胞の悪性腫瘍である。ＭＭは、骨髄におけるモノクローナル形質細胞の制御されていない増殖を特徴とし、機能しないインタクトな免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖（例えば、Ｍ－タンパク質）の産生および末端器官の損傷をもたらす。
【0079】
ＭＭは通常、ＭＧＵＳから１年に約１％の割合で発達する。「くすぶり型多発性骨髄腫」（ＳＭＭ）と呼ばれる中等度の無症候性のより進行した前癌病変も、ＭＭに進行する前に一部の患者において生じる。
【0080】
ＭＭの標準的な診断は、徹底的な病歴聴取、身体検査、および２４時間の尿試料の分析、骨髄生検、および骨格Ｘ線撮影を含む種々の臨床検査を含む。ＭＭは、骨髄形質細胞症および骨髄腫関連の末端器官損傷に加えて、患者の血清および尿中にモノクローナルタンパク質（Ｍ－タンパク質）が存在することを特徴とする。ＭＭ患者において、Ｍ－タンパク質の血清レベルは少なくとも３０ｇ／Ｌである。ＭＧＵＳおよびＳＭＭはまた、血清中にＭ－タンパク質が存在することを特徴とする。ＭＭのようなＳＭＭ患者において、Ｍ－タンパク質は少なくとも３０ｇ／Ｌの濃度で血清中に見出される。しかしながら、ＳＭＭ患者は、尿中にＭ－タンパク質を有さず、末端器官の損傷を示さない。ＭＧＵＳは、３０ｇ／Ｌ未満のＭ－タンパク質血清濃度を特徴とする。
【0081】
ＭＭのための処置は、個々の患者の年齢、併存症、およびリスクプロファイルに基づく。ＭＭ処置の最近の進展により、５年生存率は約５０％に上昇した。しかしながら、ほとんどの患者は最終的に致命的な再発を患う。７０歳未満のほとんどの患者の標準処置は、自家幹細胞移植である。患者は通常、移植を受ける前に、完全またはほぼ完全な応答を達成することを目的として、２－６サイクルの誘導処置を受ける。移植後、患者は通常、プレドニゾンまたはデキサメタゾン有りまたは無しで、サリドマイドまたはレナリドマイドの維持療法を１２か月間受ける。患者が移植について不適格である場合、処置は通常、ステロイド、細胞毒性薬（シクロホスファミドなど）、およびサリドマイド、レナリドマイド、またはボルテゾミブの組み合わせで構成される。
【0082】
最近の開発は５年生存率を増加させたが、これらの進歩は、高リスクのＭＭまたは再発性のＭＭ患者の生存率を増加させなかった。高リスクＭＭ患者の生存期間中央値は、わずか２－３年である。高リスクおよび再発ＭＭ患者の処置における進歩はほとんどない一方、１つの進歩は、腫瘍細胞表面抗原を標的とする免疫療法の使用である。
【0083】
シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー受容体は、免疫療法的ＭＭ処置の１つの標的である。ＳＬＡＭ受容体は、癌、特にＭＭなどの異なる疾患の病因に関与している。エロツズマブは、免疫療法のＭＭ処置として使用されるＳＬＡＭＦ７に対するＩｇＧ１ヒト化抗体である。エロツズマブ、レナリドマイド、およびデキサメタゾンの組み合わせは、有意な抗ＭＭ活性を示す。レナリドミドおよびデキサメタゾンと組み合わせたエロツズマブの使用は、再発および難治性ＭＭの処置において承認されている。エロツズマブ、レナリドミド、およびデキサメタゾンの組み合わせも、併存疾患または高齢のために高用量療法および自家幹細胞移植の候補者ではない新たに診断されたＭＭ患者における使用について研究されている。
【0084】
本明細書に記載の方法は、任意の既知のタイプの形質細胞疾患を有する対象から得られる試料中のＭ－タンパク質を測定するために使用することができる。特定の局面において、形質細胞疾患はＭＭである。いくつかの局面において、ＭＭは軽鎖ＭＭを含む。いくつかの局面において、ＭＭは形質細胞白血病を含む。いくつかの局面において、形質細胞白血病は、一次形質細胞白血病または二次形質細胞白血病を含む。いくつかの局面において、形質細胞疾患はＭＧＵＳである。いくつかの局面において、形質細胞疾患はＳＭＭである。
【0085】
いくつかの局面において、生物学的試料は、形質細胞疾患、例えばＭＭを有する対象から収集される。いくつかの局面において、対象は、形質細胞疾患、例えばＭＭと以前に診断されていた。いくつかの局面において、対象は寛解している。いくつかの局面において、対象は再発または難治性である。いくつかの局面において、対象は、形質細胞疾患、例えばＭＭの処置のための標準的な療法の後に再発または難治性である。いくつかの局面において、対象は、対象が以前に形質細胞疾患、例えばＭＭと診断された残存疾患を有する。
【0086】
いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害、例えばＭＭを処置するために以前の療法を受けた。いくつかの局面において、以前の療法は、形質細胞障害、例えば、ＭＭの処置のためのケア療法の標準であった。いくつかの局面において、以前の療法は、自家幹細胞移植を含む。いくつかの局面において、以前の療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法を含む。いくつかの局面において、以前の療法は、ステロイド、細胞毒性剤（例えば、化学療法、例えばシクロホスファミド）、免疫調節剤（例えば、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド）、ボルテゾミブ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの局面において、以前の療法は免疫療法を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、本明細書に開示される任意の免疫療法である。いくつかの局面において、免疫療法は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法はエロツズマブを含む。
【0087】
いくつかの局面において、生物学的試料は、対象から得られる組織または流体試料である。いくつかの局面において、生物学的試料は、血液、血漿、血清、または尿試料から選択される。特定の局面において、生物学的試料は血清試料である。特定の局面において、生物学的試料は尿試料である。いくつかの局面において、生物学的試料は骨髄生検である。生物学的試料は、当技術分野で既知の任意の方法により収集することができる。
【0088】
Ｂ．病気を診断する方法
本開示の特定の局面は、対象における形質細胞障害を診断する方法に向けられる。多発性骨髄腫などの形質細胞障害の診断のために、Ｍ－タンパク質の測定が必要である。しかしながら、ゲル電気泳動ベースのＭ－タンパク質アッセイを含む現在の方法は、感度および特異性が低く、免疫グロブリンまたはＭ－タンパク質と共移動する他の血清タンパク質が存在するため、１０ｍｇ／ｍＬ未満のＭ－タンパク質濃度では定量的でない。さらに、これらの電気泳動ベースのアッセイは、遊離軽鎖（ＦＬＣ）を分泌する多発性骨髄腫患者にとっては非常に限られた有用性しか有さない。血清ＦＬＣは急速に尿中に排泄される。したがって、ＦＬＣは、尿タンパク質電気泳動（ＵＰＥＰ）および尿免疫固定電気泳動（ＵＩＦＥ）テストを使用して尿中で測定されている。さらに、ＳＰＥＰおよびＳＩＦＥアッセイにおいて、関与しない免疫グロブリンと呼ばれる通常のポリクローナル免疫グロブリンと、疾患に関連するモノクローナル免疫グロブリンとを十分に区別できない。その結果、多発性骨髄腫患者を診断およびモニターするために、複雑なテストアルゴリズムが必要とされる。
本開示の特定の局面は、対象における形質細胞障害を診断する方法に向けられる。多発性骨髄腫などの形質細胞障害の診断のために、Ｍ－タンパク質の測定が必要である。しかしながら、ゲル電気泳動ベースのＭ－タンパク質アッセイを含む現在の方法は、感度および特異性が低く、免疫グロブリンまたはＭ－タンパク質と共移動する他の血清タンパク質が存在するため、１０ｍｇ／ｍＬ未満のＭ－タンパク質濃度では定量的でない。さらに、これらの電気泳動ベースのアッセイは、遊離軽鎖（ＦＬＣ）を分泌する多発性骨髄腫患者にとっては非常に限られた有用性しか有さない。血清ＦＬＣは急速に尿中に排泄される。したがって、ＦＬＣは、尿タンパク質電気泳動（ＵＰＥＰ）および尿免疫固定電気泳動（ＵＩＦＥ）テストを使用して尿中で測定されている。さらに、ＳＰＥＰおよびＳＩＦＥアッセイにおいて、関与しない免疫グロブリンと呼ばれる通常のポリクローナル免疫グロブリンと、疾患に関連するモノクローナル免疫グロブリンとを十分に区別できない。その結果、多発性骨髄腫患者を診断およびモニターするために、複雑なテストアルゴリズムが必要とされる。
【0089】
本開示のいくつかの局面は、対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、対象における形質細胞障害を診断する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される方法に向けられる。いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害を示す１つまたは複数のマーカーを有する。いくつかの局面において、対象は、骨痛（例えば、脊椎または胸部）、悪心、便秘、食欲不振、精神的霧または混乱、倦怠感、頻繁な感染症、体重減少、足における脱力感またはしびれ、過度の喉の渇きから選択される、形質細胞障害、例えば多発性骨髄腫の１つまたは複数の症状を以前に示した。いくつかの局面において、測定Ｍ－タンパク質レベルが閾値レベルよりも大きい場合、対象は形質細胞障害を有すると同定される。
【0090】
本開示の特定の局面は、残存疾患、例えば最小残存疾患を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を同定する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定され；対象が、形質細胞障害を有すると以前に同定された方法に向けられる。
【0091】
微小残存病変（ＭＲＤ）は、処置中、または患者が寛解している（疾患の症状または徴候がない）処置後に人の中に残る少数の癌細胞に与えられる名称である。それは癌の再発の主な原因である。癌処置において、ＭＲＤ検査はいくつかの重要な役割を有する：処置により癌が根絶されたか、痕跡が残っているかを判断すること、異なる処置の有効性を比較すること、患者の寛解状態をモニターすること、ならびに癌の再発を検出すること、およびそれらのニーズに最適な処置を選択すること。いくつかの局面において、ＭＲＤは形質細胞ＭＲＤである。
【0092】
いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害の処置のために少なくとも１つの以前の療法を受けた。いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害の処置のために、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つの以前の療法を受けた。いくつかの局面において、対象は、形質細胞障害の処置のために８つの以前の療法を受けた。いくつかの局面において、対象は、残存病変を示す他のマーカーを提示しない。いくつかの局面において、測定Ｍ－タンパク質レベルが閾値レベルよりも大きい場合、対象は残存疾患を有すると同定される。
【0093】
いくつかの局面において、以前の療法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、レナリドマイド、カルフィルゾミブ、ポマリドマイド、パノビノスタット、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、幹細胞移植、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0094】
いくつかの局面において、以前の療法は、シクロホスファミドを含む。シクロホスファミド（ＣＰ）は、他の名前の中でサイトホスファンとしても既知であり、化学療法として、また免疫系を抑制するために使用される薬である。それは、化学療法として、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、および肉腫を処置するために使用される。それは、口または静脈への注射により取られる。
【0095】
いくつかの局面において、以前の療法は、ドキソルビシンを含む。とりわけＡｄｒｉａｍｙｃｉｎの商品名で販売されているドキソルビシンは、癌を処置するために使用される化学療法薬である。これは、乳癌、膀胱癌、カポジ肉腫、リンパ腫、および急性リンパ性白血病を含む。それはしばしば、他の化学療法剤と併用される。ドキソルビシンは、静脈への注射により与えられる。
【0096】
いくつかの局面において、以前の療法は、エトポシドを含む。とりわけＥｔｏｐｏｐｈｏｓなるブランド名で販売されているエトポシドは、多くのタイプの癌を処置するために使用される化学療法薬である。これは、精巣癌、肺癌、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、および卵巣癌を含む。それは、口または静脈への注射により使用される。
【0097】
いくつかの局面において、以前の療法は、メルファランを含む。メルファランは、とりわけＡｌｋｅｒａｎの商品名で販売されており、多発性骨髄腫、卵巣癌、ＡＬアミロイドーシス、場合によっては悪性黒色腫を処置するために使用される化学療法薬である。該薬剤は、メラノーマにおいて使用できる可能性のある薬剤として最初に調査されたが、有効であることが見出されなかった。それは、２０１６年に米国において、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における造血前駆（幹）細胞移植前の高用量コンディショニング処置としての使用のために承認された（経口療法のためのＭＭ患者の緩和処置は適切でない）。
【0098】
いくつかの局面において、以前の療法は、ビンクリスチンを含む。ビンクリスチンは、ロイロクリスチンとしても既知であり、とりわけＯｎｃｏｖｉｎなるブランド名で販売されており、多くのタイプの癌を処置するために使用される化学療法薬である。これは、とりわけ急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ホジキン病、神経芽細胞腫、および小細胞肺癌を含む。ビンクリスチンは、種々のタイプの化学療法レジメンにおいて使用するために静脈内注入により送達される。その主な用途は、化学療法レジメンＣＨＯＰの一部としての非ホジキンリンパ腫、ＭＯＰＰ、ＣＯＰＰ、ＢＥＡＣＯＰＰの一部としてのホジキンリンパ腫、または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）におけるあまり有名でないスタンフォードＶ化学療法レジメン、および腎芽細胞腫についての処置にある。それはまた、デキサメタゾンおよびＬ－アスパラギナーゼでＡＬＬの寛解を誘導し、プレドニゾンと併用して小児白血病を処置するために使用される。ビンクリスチンは、例えば、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）または慢性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の処置において、免疫抑制剤として使用されることがある。
【0099】
いくつかの局面において、以前の療法は、ボルテゾミブを含む。とりわけＶｅｌｃａｄｅなるブランド名で販売されているボルテゾミブは、多発性骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫の処置において使用される抗癌薬である。これは、以前に処置を受けたことがある人および受けていない人における多発性骨髄腫を含む。それは、一般的に他の薬と一緒に使用される。それは注射により与えられる。２つの非盲検試験により、再発／難治性の多発性骨髄腫を有する高度に前処置された人々において、２１日サイクルの１、４、８、および１１日目に最大８サイクルのボルテゾミブ（デキサメタゾン有りまたは無しで）の有効性が確立された。フェーズＩＩＩは、高用量デキサメタゾンレジメンに対するボルテゾミブの優位性を示した（例えば、ＴＴＰ中央値６．２月対３．５か月、および１年生存率８０％対６６％）。
【0100】
いくつかの局面において、以前の療法は、レナリドマイドを含む。レナリドマイドは、とりわけＲｅｖｌｉｍｉｄなる商品名で販売されており、多発性骨髄腫（ＭＭ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置するために使用される薬である。ＭＭについて、それは、少なくとも１回の他の処置の後に、一般的にデキサメタゾンと一緒に使用される。それは、サリドマイドのより強力な分子類似体であり、アポトーシスの誘導を通じて腫瘍血管新生、腫瘍分泌サイトカイン、および腫瘍増殖を阻害する。
【0101】
レナリドマイドは、完全または「非常に良好な部分的」応答を誘導するだけでなく、無増悪生存期間を改良するのに効果的である。骨髄腫に対してレナリドマイドを投与されている人々においてより共通する有害事象は、好中球減少症（白血球数の減少）、深部静脈血栓症、感染症、およびその他の血液悪性腫瘍のリスクの増加であった。二次原発性血液悪性腫瘍のリスクは、再発または難治性の多発性骨髄腫においてレナリドミドを使用することの利点を上回らない。
【0102】
いくつかの局面において、以前の療法は、カルフィルゾミブを含む。カルフィルゾミブ（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発され、Ｋｙｐｒｏｌｉｓなる商品名で販売）は、選択的プロテアソーム阻害剤として作用する抗癌剤である。化学的には、それは、テトラペプチドエポキシケトンであり、エポキソマイシンの類似体である。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１２年７月２０日に、ボルテゾミブおよび免疫調節療法（レナリドマイドなど）による処置を含む、少なくとも２つの前処置を受け、最後の処置の完了時または完了後６０日以内に疾患の進行を示した多発性骨髄腫の患者における使用のためにそれを承認した。最初の承認は、応答率に基づいていた。全生存期間（ＯＳ）の利点を示すデータは、後にＥＮＤＥＡＶＯＲ試験において実証され、ＦＤＡにより承認された。
【0103】
いくつかの局面において、以前の療法は、ポマリドマイドを含む。ポマリドマイド（ＩＮＮ；米国においてＰｏｍａｌｙｓｔとして、ＥＵおよびロシアにおいてＩｍｎｏｖｉｄとして販売される）は、Ｃｅｌｇｅｎｅにより販売されるサリドマイドの誘導体である。それは、抗血管新生であり、免疫調節剤としても機能する。ポマリドマイドは、再発性および難治性の多発性骨髄腫の治療薬として、２０１３年２月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。それは、レナリドマイドおよびボルテゾミブを含む少なくとも２つの以前の療法を受けており、最後の処置の完了時または完了後６０日以内に疾患の進行を示した人々における使用が承認されている。それは、２０１３年８月に欧州委員会から同様の承認を受けた。
【0104】
いくつかの局面において、以前の療法は、パノビノスタットを含む。パノビノスタット（商品名Ｆａｒｙｄａｋ）は、種々の癌の処置のためのＮｏｖａｒｔｉｓによる薬である。それは、ヒドロキサム酸であり、非選択的ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ｐａｎ－ＨＤＡＣ阻害剤）として機能する。それは、２０１５年２月２３日に多発性骨髄腫の患者において使用するためのＦＤＡ迅速承認を受け、２０１５年８月２８日に同じ使用について欧州医薬品庁により承認された。
【0105】
いくつかの局面において、以前の療法は、サリドマイドを含む。とりわけＴｈａｌｏｍｉｄなるブランド名で販売されているサリドマイドは、免疫調節薬であり、サリドマイドクラスの薬の原型である。それは、主に特定の癌（多発性骨髄腫）およびハンセン病の合併症の処置として使用される。それは、世界保健機関の必須医薬品リスト上にあり、医療システムにおいて必要とされる最も安全で最も効果的な医薬品である。
【0106】
いくつかの局面において、以前の療法は、造血幹細胞移植を含む。通常、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）（幹細胞移植）は、骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する多能性造血幹細胞の移植である。それは、自家（患者自身の幹細胞が使用される）、同種異系（幹細胞はドナーに由来する）または同系（同一の双子からの）であってもよい。特定の局面において、以前の療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法を含む。
【0107】
それは、多発性骨髄腫または白血病などの血液または骨髄の特定の癌を有する患者に対して最も頻繁に実施される。これらの場合、レシピエントの免疫系は通常、移植前に放射線療法または化学療法で破壊される。感染症および移植片対宿主病は、同種造血幹細胞移植の主要な合併症である。
【0108】
いくつかの局面において、生物学的試料中で測定されるＭ－タンパク質のレベルは、対象が罹患している形質細胞障害のタイプを示している。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象は、形質細胞疾患、例えば多発性骨髄腫を有すると同定される。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約５ｇ／Ｌから少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象は、形質細胞疾患、例えば多発性骨髄腫のリスクのある候補者として同定される。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が検出限界未満のＭ－タンパク質レベルを有する場合、対象は、形質細胞疾患、例えば多発性骨髄腫を有していないと同定される。
【0109】
Ｃ．形質細胞疾患処置に対する反応性を測定する方法
Ｍ－タンパク質の測定は、患者の診断のためだけでなく、処置を受けている多発性骨髄腫患者のモニタリングのためにも必要である。しかしながら、抗ＳＬＡＭＦ７抗体などの治療用モノクローナル抗体で処置される多発性骨髄腫患者は、既存の血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥＰ）および血清免疫固定電気泳動（ＳＩＦＥ）アッセイを使用して処置応答をモニターする場合、薬物干渉の可能性を有する。現在のＭ－タンパク質テストは、完全寛解（ＣＲ）における患者をモニターすることはできず、これは残りのＭ－タンパク質が完全な応答未満を示すためである。
Ｍ－タンパク質の測定は、患者の診断のためだけでなく、処置を受けている多発性骨髄腫患者のモニタリングのためにも必要である。しかしながら、抗ＳＬＡＭＦ７抗体などの治療用モノクローナル抗体で処置される多発性骨髄腫患者は、既存の血清タンパク質電気泳動（ＳＰＥＰ）および血清免疫固定電気泳動（ＳＩＦＥ）アッセイを使用して処置応答をモニターする場合、薬物干渉の可能性を有する。現在のＭ－タンパク質テストは、完全寛解（ＣＲ）における患者をモニターすることはできず、これは残りのＭ－タンパク質が完全な応答未満を示すためである。
【0110】
本開示の特定の局面は、形質細胞障害の処置のための療法に対して完全な応答を有する対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、該対象を同定する方法であって、ここでＭ－タンパク質が、以下：（１）免疫捕捉により生物学的試料中の免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を精製すること、および（２）精製された免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）に適用することにより測定される方法に向けられる。特定の局面において、本明細書に開示される方法は、Ｍ－タンパク質と治療用抗体とを区別することができる。
【0111】
いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ビンクリスチン、ボルテゾミブ、レナリドマイド、カルフィルゾミブ、ポマリドマイド、パノビノスタット、サリドマイド、幹細胞移植、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0112】
いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、シクロホスファミドを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、ドキソルビシンを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、リポソームドキソルビシンを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、エトポシドを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、メルファランを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、ビンクリスチンを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、ボルテゾミブを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、レナリドマイドを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、カルフィルゾミブを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、ポマリドマイドを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、パノビノスタットを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、サリドマイドを含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、造血幹細胞移植を含む。いくつかの局面において、形質細胞障害の処置のための療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法を含む。
【0113】
いくつかの局面において、療法は、免疫療法を投与することを含む。いくつかの局面において、療法は、治療用抗体を投与することを含む。形質細胞障害の処置に有用な任意の免疫療法は、本明細書に開示される方法において使用されることができる。いくつかの局面において、療法は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することを含む。いくつかの局面において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤を含む。当技術分野で既知の任意のチェックポイント阻害剤を、本明細書に開示される方法において使用することができる。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、１つまたは複数のチェックポイントタンパク質の活性を遮断、阻害、または低下させる任意の試薬である。いくつかの局面において、チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＮＫＧ２ａ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＩＬ－２、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、Ｆａｓリガンド、ＣＸＣＲ４、メソテリン、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0114】
いくつかの局面において、免疫療法は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。当技術分野で既知の抗ＰＤ－１抗体は、現在記載される組成物および方法において使用することができる。ＰＤ－１に高い親和性で特異的に結合する種々のヒトモノクローナル抗体が、米国特許第８，００８，４４９号に開示されている。米国特許第８，００８，４４９号に開示されている抗ＰＤ－１ヒト抗体は、以下の特徴の１つまたは複数を示すことが実証されている：（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを使用した表面プラズモン共鳴により決定されるように、１ｘ１０－７Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する；（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない；（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を増加させる；（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン－γ産生を増加させる；（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ－２分泌を増加させる；（ｆ）ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１に結合する；（ｇ）ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を阻害する；（ｈ）抗原特異的記憶反応を刺激する；（ｉ）抗体反応を刺激する；および（ｊ）インビボで腫瘍細胞の増殖を阻害する。本開示で使用可能な抗ＰＤ－１抗体は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合し、前述の特徴の少なくとも１つ、いくつかの局面において少なくとも５つを示すモノクローナル抗体を含む。
【0115】
他の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、例えば、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第６，８０８，７１０号、第７，４８８，８０２号、第８，１６８，７５７号および第８，３５４，５０９号、米国公開番号２０１６／０２７２７０８、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＷＯ２０１５／１１２９００、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１４／２０６１０７、ＷＯ２０１５／３５６０６、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１７／０２０２９１、ＷＯ２０１７／０２０８５８、ＷＯ２０１６／１９７３６７、ＷＯ２０１７／０２４５１５、ＷＯ２０１７／０２５０５１、ＷＯ２０１７／１２３５５７、ＷＯ２０１６／１０６１５９、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１７／０４０７９０、ＷＯ２０１７／１３３５４０、ＷＯ２０１７／１３２８２７、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１０６０６１、ＷＯ２０１７／１９８４６、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５、およびＷＯ２０１７／１３３５４０に記載されている。
【0116】
いくつかの局面において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、およびＯＮＯ－４５３８としても既知である）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ；ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ－３４７５として既知である；ＷＯ２００８／１５６７１２を参照）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；ＷＯ２０１５／１１２９００を参照）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；ＡＭＰ－５１４としても既知である；ＷＯ２０１２／１４５４９３を参照）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；ＲＥＧＮ－２８１０としても既知である；ＷＯ２０１５／１１２８００を参照）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ；トリパリマブとしても既知である；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＢＧＢ－Ａ３１７（Ｂｅｉｇｅｎｅ；Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂとしても既知である；ＷＯ２０１５／３５６０６およびＵＳ２０１５／００７９１０９を参照）、ＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＳＨＲ－１２１０としても既知である；ＷＯ２０１５／０８５８４７；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ；別名ＡＮＢ０１１；ＷＯ２０１４／１７９６６４を参照）、ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／Ｈａｒｂｉｎ ＧｌｏｒｉａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；別名ＷＢＰ３０５５；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＡＭ－０００１（Ａｒｍｏ）、ＳＴＩ－１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＷＯ２０１４／１９４３０２を参照）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ；ＷＯ２０１７／０４０７９０を参照）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ、ＷＯ２０１７／１９８４６を参照）、ＢＣＤ－１００（Ｂｉｏｃａｄ；Kaplon et al., mAbs 10(2):183-203 (2018)、およびＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ；ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５、およびＷＯ２０１７／１３３５４０を参照）からなる群から選択される。
【0117】
いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＮＫＧ２ａに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＩＣＯＳに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＫＩＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－１０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＩＬ－２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ９６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、Ｆａｓリガンドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、メソセリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＣＤ２７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの局面において、チェックポイント阻害剤は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。
【0118】
いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ２２９、ＣＤ２００、ＣＤ２８、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３１７、ＣＤ７０、およびＢ２Ｍから選択されるタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ５６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ２２９に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ２００に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ２８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ３１７に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、ＣＤ７０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの局面において、免疫療法は、Ｂ２Ｍに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む。
【0119】
いくつかの局面において、対象は、単剤療法、例えば抗ＰＤ－１単剤療法を投与され、ここで対象は１つまたは複数の追加の抗癌剤を投与されない。いくつかの局面において、対象は、例えば、対象が第１のチェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体、および１つまたは複数の追加の抗癌剤を投与される、併用療法を投与される。特定の局面において、対象は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む併用療法を投与される。
【0120】
本開示の他の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が抗ＰＤ－１抗体の代わりに使用される。特定の局面において、方法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与することを含む。いくつかの局面において、対象は、抗ＰＤ－Ｌ１単剤療法を投与される。いくつかの局面において、対象は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体および第２の抗癌剤、例えば抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む併用療法を投与される。
【0121】
いくつかの局面において、抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体またはその一部である。
【0122】
いくつかの局面において、療法は、測定の前に投与される。いくつかの局面において、療法は、測定の時点で進行中である。いくつかの局面において、療法は、測定の少なくとも１日前に実施される。いくつかの局面において、療法は、測定の、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月前に投与される。いくつかの局面において、療法は、測定の１週間未満前に投与される。いくつかの局面において、療法は、測定の、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または２日未満前に投与される。
【0123】
Ｄ．免疫グロブリンの精製
本開示の特定の局面において、免疫グロブリンは、ＬＣ－ＭＳ分析の前に生物学的試料から精製される。免疫グロブリンを精製するための当技術分野で既知の任意の方法を、本明細書に開示される方法において使用することができる。特定の局面において、免疫グロブリンは、リガンド結合技術を使用して生物学的試料から精製される。免疫グロブリンのリガンド結合精製は、標的免疫グロブリンと相互作用して標的免疫グロブリンを濃縮または精製する捕捉試薬の使用を含む。本明細書に開示される方法において、標的免疫グロブリンは、Ｍ－タンパク質であり、これは、免疫グロブリンの非常に多様な集団であることができ、Ｍ－タンパク質からなり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤクラス免疫グロブリンに属することができる。さらに、Ｍ－タンパク質は、インタクトな免疫グロブリン分子および／またはベンスジョーンズタンパク質としても既知の遊離軽鎖（ＦＬＣ）などの免疫グロブリン断片を含むことができる。
本開示の特定の局面において、免疫グロブリンは、ＬＣ－ＭＳ分析の前に生物学的試料から精製される。免疫グロブリンを精製するための当技術分野で既知の任意の方法を、本明細書に開示される方法において使用することができる。特定の局面において、免疫グロブリンは、リガンド結合技術を使用して生物学的試料から精製される。免疫グロブリンのリガンド結合精製は、標的免疫グロブリンと相互作用して標的免疫グロブリンを濃縮または精製する捕捉試薬の使用を含む。本明細書に開示される方法において、標的免疫グロブリンは、Ｍ－タンパク質であり、これは、免疫グロブリンの非常に多様な集団であることができ、Ｍ－タンパク質からなり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤクラス免疫グロブリンに属することができる。さらに、Ｍ－タンパク質は、インタクトな免疫グロブリン分子および／またはベンスジョーンズタンパク質としても既知の遊離軽鎖（ＦＬＣ）などの免疫グロブリン断片を含むことができる。
【0124】
いくつかの局面において、捕捉試薬は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、１つまたは複数のモノクローナル抗体を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、１つまたは複数のポリクローナル抗体を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、１つまたは複数のモノクローナル抗体および１つまたは複数のポリクローナル抗体を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、１つまたは複数のナノボディを含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、抗原、例えば標的免疫グロブリンにより結合されることができるポリペプチドを含む。
【0125】
いくつかの局面において、単一の捕捉試薬は、標的免疫グロブリン（例えば、Ｍ－タンパク質）を捕捉および精製するために使用される。いくつかの局面において、複数の捕捉試薬が、標的免疫グロブリン（例えば、Ｍ－タンパク質）を精製するために使用される。いくつかの局面において、いくつかの捕捉試薬は、標的免疫グロブリン（例えば、Ｍ－タンパク質）を精製するために使用される。いくつかの局面において、捕捉試薬は、免疫グロブリンの標的クラスに特異的である。いくつかの局面において、捕捉試薬は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンに特異的である。いくつかの局面において、捕捉試薬は、ＩｇＡクラスの免疫グロブリンに特異的である。いくつかの局面において、捕捉試薬は、ＩｇＭクラスの免疫グロブリンに特異的である。いくつかの局面において、捕捉試薬は、ＩｇＤクラスの免疫グロブリンに特異的である。
【0126】
いくつかの局面において、捕捉試薬は、一般的な捕捉試薬である。本明細書で使用される場合、「一般的な捕捉試薬」は、複数のヒト免疫グロブリンに結合することができるリガンドまたは他の結合剤である。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、少なくとも２つのクラスのヒト免疫グロブリンに結合することができる。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、少なくとも３つのクラスのヒト免疫グロブリンに結合することができる。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、少なくとも４つのクラスのヒト免疫グロブリンに結合することができる。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、全ての既知のクラスのヒト免疫グロブリンに結合することができる。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＤクラスの免疫グロブリンに結合することができる。いくつかの局面において、一般的な捕捉試薬は、インタクトな免疫グロブリン分子および免疫グロブリン断片（例えば、遊離軽鎖）の両方に結合することができる。
【0127】
特定の局面において、捕捉試薬は、免疫グロブリン軽鎖に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、免疫グロブリン軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの局面において、捕捉試薬は、免疫グロブリンラムダ軽鎖に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（「抗ラムダ抗体」）を含む。当技術分野で既知のヒトラムダ軽鎖に特異的に結合することができる任意の抗ラムダ抗体を、本明細書に開示される方法において使用することができ、これは本明細書に開示される抗ラムダ抗体を含むがこれに限定されない。いくつかの局面において、捕捉試薬は、免疫グロブリンカッパ軽鎖に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（「抗カッパ抗体」）を含む。当技術分野で既知のヒトカッパ軽鎖に特異的に結合することができる任意の抗カッパ抗体を、本明細書に開示される方法において使用することができ、これは本明細書に開示される抗カッパ抗体を含むがこれに限定されない。いくつかの局面において、捕捉試薬は、抗ラムダ抗体および抗カッパ抗体を含む。
【0128】
いくつかの局面において、抗ラムダ抗体と抗カッパ抗体との比は、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１約、約４．５：１、約５：１約、約６：１、約７：１約、約８：１、約９：１約、または約１０：１である。いくつかの局面において、抗カッパ抗体と抗ラムダ抗体との比は、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１約、約６：１、約７：１約、約８：１、約９：１約、または約１０：１である。いくつかの局面において、抗ラムダ抗体と抗カッパ抗体との比は約１：１である。特定の局面において、捕捉試薬は、親和性マトリックスに組み込まれる。いくつかの局面において、親和性マトリックスは、ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（登録商標）ナノボディ樹脂（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）を含む。特定の局面において、親和性マトリックスは、抗ラムダ抗体対抗カッパ抗体の１：１の比を含む、ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（登録商標）ナノボディ樹脂（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）を含む。
【0129】
本開示のいくつかの局面において、親和性試薬、例えば親和性マトリックスは、カラムにパッケージ化される。いくつかの局面において、カラムは自動化に適している。本明細書に開示される免疫捕捉法によるＭ－タンパク質の精製の自動化は、アッセイスループットおよび改良されたアッセイ再現性を含むがこれに限定されないいくつかの利点を有する。特定の局面において、カラムは、チップカラムである。特定の局面において、カラムは、ＰＨＹＴＩＰカラム（ＰＨＹＮＥＸＵＳ）である。特定の局面において、カラムは、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約５５μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約６５μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約７５μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約８５μｇ、少なくとも約９０μｇ、少なくとも約９５μｇ、少なくとも約１００μｇ、または少なくとも約１５０μｇの免疫グロブリンをロードする能力を有する。特定の局面において、カラムは、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約５５μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約６５μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約７５μｇ、または少なくとも約８０μｇ、少なくとも約８５μｇ、少なくとも約９０μｇ、少なくとも約９５μｇ、少なくとも約１００μｇ、または少なくとも約１５０μｇのラムダ免疫グロブリンをロードする能力を有する。特定の局面において、カラムは、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約５５μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約６５μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約７５μｇ、または少なくとも約８０少なくとも約８５μｇ、少なくとも約９０μｇ、少なくとも約９５μｇ、少なくとも約１００μｇ、または少なくとも約１５０μｇのカッパ免疫グロブリンをロードする能力を有する。特定の局面において、カラムは、少なくとも約４０μｇのラムダおよび少なくとも約４０μｇのカッパ免疫グロブリンをロードする能力を有する。
【0130】
特定の局面において、カラムは、マルチチャネルデバイスにロードされる。いくつかの局面において、マルチチャネルデバイスは、マルチチャネルピペットである。いくつかの局面において、マルチチャネルデバイスは、ロボットデバイスである。いくつかの局面において、マルチチャネルデバイスは、自動化が可能なロボットデバイスである。いくつかの局面において、マルチチャネルデバイスは、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）プラットフォームである。いくつかの局面において、Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）プラットフォームは９６チャネルを備えている。
【0131】
いくつかの局面において、カラムは、単一チャネル装置、例えば単一チャネルピペットにロードされる。
【0132】
いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、軽鎖および重鎖にさらに解離される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、化学的還元により解離される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、変性剤と接触される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、該精製された免疫グロブリンを、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＴＣＥＰ－ＨＣｌおよびその他のＴＣＥＰ塩；ＤＴＴ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）、ＤＴＥ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４－ジチオール）；チオグリコレート；亜硫酸塩；亜硫酸水素塩；硫化物；二硫化物；２－メルカプトエタノール；２－メルカプトエタノール－ＨＣｌ；Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液、中性ｐＨ；システイン－ＨＣｌ；グアニジン－ＨＣｌ；尿素；またはそれらの任意の組み合わせから選択される還元剤と接触させることにより解離される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、該精製された免疫グロブリンをＴＣＥＰと接触させることにより解離される。
【0133】
特定の局面において、精製された免疫グロブリンは、還元剤、例えばＴＣＥＰの少なくとも約１ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの最終濃度での、還元剤、例えばＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、還元剤、例えばＴＣＥＰの、少なくとも約１０ｍＭから少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭから少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭから少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭから少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭから少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約２ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約６ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約８ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約９ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭから少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭから少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭから少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭから少なくとも約２５ｍＭ、または少なくとも約１５ｍＭから少なくとも約２０ｍＭの最終濃度での、還元剤、例えばＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。特定の局面において、精製された免疫グロブリンは、還元剤、例えばＴＣＥＰの、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約ｍＭ、少なくとも約１１ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１３ｍＭ、少なくとも約１４ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約１６ｍＭ、少なくとも約１７ｍＭ、少なくとも約１８ｍＭ、少なくとも約１９ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２１ｍＭ、少なくとも約２２ｍＭ、少なくとも約２３ｍＭ、少なくとも約２４ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約２６ｍＭ、少なくとも約２７ｍＭ、少なくとも約２８ｍＭ、少なくとも約２９ｍＭ、または少なくとも約３０ｍＭの最終濃度での、還元剤、例えばＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。特定の局面において、精製された免疫グロブリンは、還元剤、例えばＴＣＥＰの少なくとも約２０ｍＭの最終濃度での、還元剤、例えばＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。
【0134】
いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、少なくとも約２０℃から少なくとも約３０℃、少なくとも約２１℃から少なくとも約２９℃、少なくとも約２２℃から少なくとも約２８℃、少なくとも約２３℃から少なくとも約２７℃、または少なくとも約２４℃から少なくとも約２６℃でのＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより減少する。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、少なくとも約２０℃、少なくとも約２１℃、少なくとも約２２℃、少なくとも約２３℃、少なくとも約２４℃、少なくとも約２４℃、約２５℃、少なくとも約２６℃、少なくとも約２７℃、少なくとも約２８℃、少なくとも約２９℃、または少なくとも約３０℃でのＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、約２０℃でのＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。
【0135】
いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、少なくとも約２０から少なくとも約３０分、少なくとも約２１から少なくとも約３０分、少なくとも約２２から少なくとも約３０分、少なくとも約２３から少なくとも約３０分、少なくとも約２４から少なくとも約３０分、少なくとも約２５から少なくとも約３０分、少なくとも約２６から少なくとも約３０分、少なくとも約２７から少なくとも約３０分、少なくとも約２８から少なくとも約３０分、少なくとも約２９から少なくとも約３０分、少なくとも約２０から少なくとも約２９分、少なくとも約２０から少なくとも約２８分、少なくとも約２０から少なくとも約２７分、少なくとも約２０から少なくとも約２６分、少なくとも約２０から少なくとも約２５分、少なくとも約２０から少なくとも約２４分、少なくとも約２０から少なくとも約２３分、少なくとも約２０から少なくとも約２２分、少なくとも約２０から少なくとも約２１分、少なくとも約２１から少なくとも約２９分、少なくとも約２２から少なくとも約２８分、少なくとも約２３から少なくとも約２７分、または少なくとも約２４から少なくとも約２６分の、ＴＣＥＰ中でのインキュベーションにより還元される。溶出した試料は、１００ｍＭの緩衝ＴＣＥＰ溶液を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した後、２５℃での３０分間のインキュベーションにより、直ちに還元した。
【0136】
いくつかの局面において、精製された免疫グロブリンは、精製の直後に還元される。いくつかの局面において、精製されたタンパク質は、還元される前に一定期間保存される。
【0137】
Ｅ．液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
質量分析（ＭＳ）は、小分子、高分子、および混合モードの生体高分子試料の定性的および定量的分析の両方を実施する手段である。ＭＳは、創薬、合成反応のモニタリング、およびナノ粒子の特性評価を含むさまざまな異なる適用において使用されている。ＭＳは、試料の完全なサービスを提供し、方法開発、バリデーション、およびテスト試料分析の実行を可能にする。
質量分析（ＭＳ）は、小分子、高分子、および混合モードの生体高分子試料の定性的および定量的分析の両方を実施する手段である。ＭＳは、創薬、合成反応のモニタリング、およびナノ粒子の特性評価を含むさまざまな異なる適用において使用されている。ＭＳは、試料の完全なサービスを提供し、方法開発、バリデーション、およびテスト試料分析の実行を可能にする。
【0138】
本開示において有用なＭＳシステムは、一般に、以下の非限定的能力のうちの１つ以上を提供する：正確な質量分析／分子式の検証；ＬＣ－ＵＶ－ＭＳを使用する試料の純度分析；フローインジェクションまたはＵＰＬＣ分離による複雑な混合物の正確な質量分析；生物学的または環境試料中の有機化合物の定量；オリゴヌクレオチド分子量の決定；質量分析によるイメージング；臨床薬理学および迅速な薬物動態（ＰＫ）分析；またはそれらの任意の組み合わせ。
【0139】
定性的および定量的分析に使用される多くの異なるタイプの高分解能ＭＳ機器があり、それらのいずれもが本明細書に開示される方法において使用することができる。ＭＳ機器の非限定的な例は、Ｂｒｕｋｅｒ ＭａｘｉｓまたはＩｍｐａｃｔシステム、ＡＢＳｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００／６６００、ＡＢＳｃｉｅｘ Ｘ５００Ｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ＸＴ、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ（登録商標）Ｇ２ＴＯＦ、または任意の他のモデルを含む。
【0140】
本開示の特定の局面は、試料を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に続いてＭＳに適用することにより、生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定する方法に向けられる。ＭＳおよびＬＣを組み合わせた技術は、一般にＬＣ－ＭＳとして既知である。ＬＣおよびＭＳの組み合わせにより、実験誤差が減少し、精度が向上する。いくつかの局面において、ＬＣ－ＭＳのＬＣは、高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの局面において、免疫グロブリンは、最初に免疫捕捉により精製され、次いで、精製された免疫グロブリンは化学的還元により解離され、および次いで、精製され、解離された免疫グロブリンはＬＣ－ＭＳに適用される。いくつかの局面において、精製され、解離された免疫グロブリンは、ＬＣ－ＭＳに適用される。
【0141】
ＬＣ－ＭＳは、それらの物理的および化学的特性に従って混合物を分離し、次いで各ピーク内の成分を同定し、それらの質量スペクトルに基づいて検出する手段を提供する。いくつかの局面において、ＬＣ－ＭＳにおいて使用される流量は、ＨＰＬＣにおいて通常使用されるものよりも少ない。流量をＨＰＬＣより低く保つと、完全なイオン化の可能性が高まり、ＭＳの検出感度が維持される。ＭＳの検出感度は２００μＬ／分を超えて低下し始める。いくつかの局面において、ＬＣ－ＭＳにおいて使用されるカラムは、より小さな溶媒流量および試料体積に対応するために、ＨＰＬＣにおいて通常使用されるカラムよりも小さい。いくつかの局面において、シリンジポンプは、ＬＣ－ＭＳにおいて使用される。シリンジポンプは、低流量でも非常に正確な供給を可能にする。
【0142】
特定の局面において、ＬＣ－ＭＳは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍを含む。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍは、ＵＰＬＣテクノロジーに通常期待される高分解能、高感度の分離を提供する。さらに、このシステムは、サイズ排除（ＳＥＣ）または逆相（ＲＰ）を含むがこれに限定されない、必要な全てのクロマトグラフィーモードを実行するための柔軟性および堅牢性を可能にする。このシステムは、既存の全てのＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、およびＵＰＬＣ方法をさらに支持する。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍは、非ステンレス鋼材料で作られたバイオイナート流路を含む。これにより、大きな分子をインタクトで移動させておくことができ、試料の回収率がより良くなり、キャリーオーバーがなくなる。
【0143】
いくつかの局面において、ＬＣ－ＭＳは、ＬＣカラムを含む。いくつかの局面において、ＬＣカラムはＣ３カラムである。いくつかの局面において、ＬＣカラムはＣ４カラムである。本開示において有用なＣ４カラムの例は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４３００Å、１．７μｍ、２．１ｍｍｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ）、ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＢＤ Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－Ｐｈａｓｅ ５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ ３．６ｕ Ｃ４（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）；ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ－Ｃ３、８０Å、５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）；およびＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ３（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含むが、これに限定されない。特定の局面において、ＬＣ－ＭＳは、Ｃ４カラムを備えたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍを含む。いくつかの局面において、試料は、カラム、例えばＣ４カラム上に注入され、カラム温度は、約７０℃から約９０℃、約７０℃から約８５℃、約７０℃から約８０°Ｃ、約７０°Ｃから約７５°Ｃ、約７５°Ｃから約９０°Ｃ、約７５°Ｃから約８５°Ｃ、約７５°Ｃから約８０°Ｃ、約８０°Ｃから約９０°Ｃ、または約８５°Ｃから約９０°Ｃに設定される。いくつかの局面において、カラム温度は、約７５℃から約８５℃に設定される。いくつかの局面において、カラム温度は、約７５℃から約８０℃に設定される。いくつかの局面において、カラム温度は、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８°Ｃ、約７９°Ｃ、約８０°Ｃ、約８１°Ｃ、約８２°Ｃ、約８３°Ｃ、約８４°Ｃ、約８５°Ｃ、約８６°Ｃ、約８７°Ｃ、約８８°Ｃ、約８９°Ｃ、または約９０°Ｃに設定される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約７５℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラム上に注入される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約７６℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラム上に注入される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約７７℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラム上に注入される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約７８℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラム上に注入される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約７９℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラムに注入される。いくつかの局面において、試料は、カラム温度が約８０℃に設定された状態で、カラム、例えばＣ４カラム上に注入される。
【0144】
いくつかの局面において、移動相は、移動相Ａおよび移動相Ｂを含む。いくつかの局面において、移動相Ａは、約０．０１％から約１．０％、約０．０２％から約０．９％、約０．０３％から約０．０３％を含む。約０．８％、約０．０４％から約０．７％、約０．０５％から約０．６％、約０．０６％から約０．５％、約０．０７％から約０．４％、約０．０８％から約０．３％、約０．０９％から約０．２％、約０．１％から約０．２％、約０．０１％から約０．２％、約０．０２％から約０．２％、約０．０３％から約０．２％、約０．０４％から約０．２％、約０．０５％から約０．２％、約０．０６％から約０．２％、約０．０７％から約０．２％、約０．０８％から約０．２％、約０．０９％から約０．２％、約０．０１％から約０．１９％、約０．０２％から約０．１８％、約０．０３ ％から約０．１７％、約０．０４％から約０．１６％、約０．０５％から約０．１５％、約０．０６％から約０．１４％、約０．０７％から約０．１８％、約０．０８％から約０．１２％、約０．０９％から約０．１１％、約０．０５％から約０．１％、または約０．１％から約０．１５％の水中のギ酸（ＦＡ）を含む。いくつかの局面において、移動相Ａは、約０．０５％から約０．１５％の水中のＦＡを含む。いくつかの局面において、移動相Ａは、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１０％、約０．１１％、約０．１２％、約０．１３％、約０．１４％、または約０．１５％の水中のＦＡを含む。いくつかの局面において、移動相Ａは、約０．１％の水中のＦＡを含む。
【0145】
いくつかの局面において、移動相Ｂは、約０．０１％から約１．０％、約０．０２％から約０．９％、約０．０３％から約０．８％、約０．０４％から約０．７％、約０．０５％から約０．６％、約０．０６％から約０．５％、約０．０７％から約０．４％、約０．０８％から約０．３％、約０．０９％から約０．２％、約０．１％から約０．２％、約０．０１％から約０．２％、約０．０２％から約０．２％、約０．０３％から約０．２％、約０．０４％から約０．２％、約０．０５％から約０．２％、約０．０６％から約０．２％、約０．０７％から約０．２％、約０．０８％から約０．２％、約０．０９％から約０．２％、約０．０１％から約０．１９％、約０．０２％から約０．１８％、約０．０３から約０．１７％、約０．０４％から約０．１６％、約０．０５％から約０．１５％、約０．０６％から約０．１４％、約０．０７％から約０．１８％、約０．０８％から約０．１２％、約０．０９％から約０．１１％、約０．０５％から約０．１％、または約０．１％から約０．１５％のアセトニトリル中のギ酸（ＦＡ）を含む。いくつかの局面において、移動相Ｂは、約０．０５％から約０．１５％のアセトニトリル中のＦＡを含む。いくつかの局面において、移動相Ｂは、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１０％、約０．１１％、約０．１２％、約０．１３％、約０．１４％、または約０．１５％のアセトニトリル中のＦＡを含む。いくつかの局面において、移動相Ｂは、約０．１％のアセトニトリル中のＦＡを含む。
【0146】
いくつかの局面において、勾配分離プログラムは、以下のように使用される：０－１．０分 １０％移動相Ｂ；１．１－３．０分 １０－３３％移動相Ｂ；３．０－１０．０分 ３３－４０％移動相Ｂ；１０．１－１０．５分 ４０－９０％移動相Ｂ；９０％移動相Ｂで１０．５－３．０分保持；１３．０－１５．０分 ９０－１０％移動相Ｂ；および１５．０分での実行停止。勾配分離プログラムは、ユーザーが１つまたは複数の移動相の時間および供給量を設定し、必要な設定で実行し、分析を適切に終了することを可能にする。
【0147】
いくつかの局面において、流量（すなわち、１分あたりの機器により送達される移動相の量（体積））は、約０．０２５ｍＬ／分から約１．０ｍＬ／分、約０．０５ｍＬ／分から約１．０ｍＬ／分、約０．０７５ｍＬ／分から約１．０ｍＬ／分、約０．０２５ｍＬ／分から約０．９ｍＬ／分、約０．０２５ｍＬ／分から約０．８ｍＬ／分、約０．０２５ｍＬ／分から約０．７ｍＬ／分、約０．０２５ｍＬ／分から約０．６ｍＬ／分、約０．０２５ｍＬ／分から約０．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分から約０．９ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．８ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．７ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．６ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．５ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．４ｍＬ／分、０．１ｍＬ／分から約０．３ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．９ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．８ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．７ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．６ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．５ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．４ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分から約０．３ｍＬ／分、０．３ｍＬ／分から約０．９ｍＬ／分、０．３ｍＬ／分から約０．８ｍＬ／分、０．３ｍＬ／分から約０．７ｍＬ／分、０．３ｍＬ／分から約０．６ｍＬ／分、０．３ｍＬ／分から約０．５ｍＬ／分、または０．３ｍＬ／分から約０．４ｍＬ／分に設定される。いくつかの局面において、流量は、約０．１ｍＬ／分から０．５ｍＬ／分に設定される。いくつかの局面において、流量は、約０．０２５ｍＬ／分、約０．０５ｍＬ／分、約０．０７５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分、約０．２５ｍＬ／分、約０．２６ｍＬ／分、約０．２７ｍＬ／分、約０．２８ｍＬ／分、約０．２９ｍＬ／分、約０．３０ｍＬ／分、約０．３１ｍＬ／分、約０．３２ｍＬ／分、約０．３３ｍＬ／分、約０．３４ｍＬ／分、または約０．３５ｍＬ／分に設定される。いくつかの局面において、流量は、約０．３ｍＬ／分に設定される。
【0148】
いくつかの局面において、注入体積（すなわち、各実行のために機器に注入される試料の量（体積））は、約１．０μＬから約３．０μＬ、約１．０μＬから約２．５μＬ、約１．０μＬから約２．０μＬ、約１．０μＬから約１．５μＬ、約１．５μＬから約３．０μＬ、約２．０μＬから約３．０μＬ、約２．５μＬから約３．０μＬ、または約１．５μＬから約２．５μＬである。いくつかの局面において、注入体積は、約１．５μＬから約２．５μＬである。いくつかの局面において、注入体積は、約１．０μＬ、約１．５μＬ、約２．０μＬ、約２．５μＬ、または約３．０μＬである。いくつかの局面において、注入体積は、約２．０μＬである。
【0149】
いくつかの局面において、ＬＣはＭＳとオンラインである。いくつかの局面において、免疫グロブリンは、高速液体クロマトグラフィーカラム（ＨＰＬＣ）上での分離後、ＭＳにより直接分析される。いくつかの局面において、ＭＳは、飛行時間型ＭＳ高分解能機器を含む。いくつかの局面において、ＭＳは、飛行時間型ＭＳを含む。いくつかの局面において、ＭＳは、レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳを含む。特定の局面において、ＭＳは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを含む。特定の局面において、ＭＳは、Ｍａｘｉｓ ４Ｇ Ｑ－ＴＯＦ（別名ＵＨＲ）機器を含む。いくつかの局面において、ＭＳは、ＭＡＬＤＩ ＭＳを含まない。いくつかの局面において、ＭＳはマイクロフローＭＳを含まない。いくつかの局面において、Ｍａｘｉｓ ４Ｇ Ｑ－ＴＯＦは、標準的なＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ（ＥＳＩ）Ａｐｏｌｌｏ－ソース（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。いくつかの局面において、例えば、ＥＳＩ－Ｌ低濃度チューニングミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を注入することにより、各分析の前に機器が較正される。いくつかの局面において、各１５分の実行は、廃棄セグメント、ソースセグメント、および追加の廃棄セグメントとしてセグメント化される。いくつかの局面において、各１５分の実行は、次のようにセグメント化される：廃棄まで約３分、次いでソースまで約７分、および廃棄まで最後約５分。
【0150】
いくつかの局面において、毛細管電圧（すなわち、エレクトロスプレーに適用される電圧）は、約４０００Ｖから約６０００Ｖ、約４０００Ｖから約５９００Ｖ、約４０００Ｖから約５８００Ｖ、約４０００Ｖから約５７００Ｖ、４０００Ｖから約５６００Ｖ、４０００Ｖから約５５００Ｖ、４０００Ｖから約５４００Ｖ、４０００Ｖから約５３００Ｖ、４０００Ｖから約５２００Ｖ、４０００Ｖから約５１００Ｖ、４０００Ｖから約５０００Ｖ、４０００Ｖから約４９００Ｖ、４０００Ｖから約４８００Ｖ、４０００Ｖから約４７００Ｖ、約４０００Ｖから約４６００Ｖ、約４０００Ｖから約４５００Ｖ、約４０００Ｖから約４４００Ｖ、約４０００Ｖから約４３００Ｖ、約４０００Ｖから約４２００Ｖ、約４０００Ｖから約４１００Ｖ、約４１００Ｖから約５０００Ｖ、約４２００Ｖから約５０００Ｖ、約４３００Ｖから約５０００Ｖ、約４４００Ｖから約５０００Ｖ、約４５００Ｖから約５０００Ｖ、約４６００Ｖから約５０００Ｖ、約４７００Ｖから約５０００Ｖ、約４８００Ｖから約５０００Ｖ、約４９００Ｖから約５０００Ｖ、約４１００Ｖから約４９００Ｖ、約４２００Ｖから約４８００Ｖ、約４３００Ｖから約４７００Ｖ、または約４４００Ｖから約４６００Ｖに設定される。いくつかの局面において、毛細管電圧は、約４０００Ｖ、約４１００Ｖ、約４２００Ｖ、約４３００Ｖ、約４４００Ｖ、約４５００Ｖ、４６００Ｖ、約４６００Ｖ、約４７００Ｖ、約４８００Ｖ、約４９００Ｖ、または約５０００Ｖに設定される。いくつかの局面において、毛細管電圧は、約４５００Ｖに設定される。
【0151】
いくつかの局面において、ネブライザー（すなわち、液体を微細な霧に変換する装置）は、約１．０バールから約２．２バール、約１．０バールから約２．１バール、約１．０バールから約２．０バール、約１．０バールから約１．９バール、約１．０バールから約１．８バール、約１．０バールから約１．７バール、約１．０バールから約１．６バール、約１．０バールから約１．５バール、約１．０バールから約１．４バール、約１．０バールから約１．３バール、約１．０バールから約１．２バール、約１．０バールから約１．１バール、約１．０バールから約２．２バール、約１．１バールから約２．２バール、約１．２バールから約２．２バール、約１．３バールから約２．２バール、約１．４バールから約２．２バール、約１．５バールから約２．２バール、約１．６バールから約２．２バール、約１．７バールから約２．２バール、約１．８バールから約２．２バール、約１．９バールから約２．２バールバール、約２．０バールから約２．２バール、約２．１バールから約２．２バール、約１．１バールから約２．１バール、約１．２バールから約２．０バール、約１．３バールから約１．９バール、約１．４バールから約１．８バール、約１．５バールから約１．７バール、または約１．５バールから約２．０バールに設定される。いくつかの局面において、ネブライザーは、約１．０バール、約１．１バール、約１．２バール、約１．３バール、約１．４バール、約１．５バール、約１．６バール、約１．７バール、約１．８バール、約１．９バール、２．０バール、約２．１バール、または約２．２バールに設定される。いくつかの局面において、ネブライザーは、約１．６バールに設定される。
【0152】
いくつかの局面において、乾燥ガス（すなわち、高グレード、低水分ガス）は、約７．５Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．６Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．７Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．８Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．９Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．０Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．１Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．２Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．３Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．４Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．５Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．６Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．８Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．９Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．０Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．１Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．２Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．３Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．４Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．５Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．６Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．７Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．８Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約８．９Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約９．０Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約９．１Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約９．２Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約９．３Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約９．４Ｌ／分から約９．５Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約９．４Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約９．３Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約９．２Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約９．１Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約９．０Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．９Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．８Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．７Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．６Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．５Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．４Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．３Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．２Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．１Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約８．０、約７．５Ｌ／分から約７．９Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約７．８Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約７．７Ｌ／分、約７．５Ｌ／分から約７．６Ｌ／分、約７．６Ｌ／分から約９．４Ｌ／分、約７．７Ｌ／分から約９．３Ｌ／分、約７．８Ｌ／分から約９．２Ｌ／分、約７．９Ｌ／分から約９．１Ｌ／分、約８．０Ｌ／分から約９．０Ｌ／分、約８．１Ｌ／分から約８．９Ｌ／分、約８．２Ｌ／分から約８．８Ｌ／分、約８．３Ｌ／分から約８．７Ｌ／分、または約８．４Ｌ／分から約８．６Ｌ／分に設定される。いくつかの局面において、乾燥ガスは、約８．０Ｌ／分、約８．１Ｌ／分、約８．２Ｌ／分、約８．３Ｌ／分、約８．４Ｌ／分、約８．５Ｌ／分、約８．６Ｌ／分、約８．７Ｌ／分、約８．８Ｌ／分、約８．９Ｌ／分、または約９．０Ｌ／分に設定される。いくつかの局面において、乾燥ガスは、約８．５Ｌ／分に設定される。
【0153】
いくつかの局面において、乾燥温度（すなわち、放射線および湿気から遮蔽された気温）は、約１７５℃から約２２５℃、約１８０℃から約２２５℃、約１８５℃から約１８５℃、約２２５°Ｃ、約１９０°Ｃから約２２５°Ｃ、約１９５°Ｃから約２２５°Ｃ、約２００°Ｃから約２２５°Ｃ、約２０５°Ｃから約２２５°Ｃ、約２１０°Ｃから約２２５°Ｃ、約２１５°Ｃから約２２５°Ｃ、約２２０°Ｃから約２２５°Ｃ、約１７５°Ｃから約２２０°Ｃ、約１７５°Ｃから約２１５°Ｃ、約１７５°Ｃから約２１０°Ｃ、約１７５°Ｃから約２０５°Ｃ、約１７５°Ｃから約２００°Ｃ、約１７５°Ｃから約１９５°Ｃ、約１７５°Ｃから約１９０°Ｃ、約１７５°Ｃから約１８５°Ｃ、約１７５°Ｃから約１８０°Ｃ、約１８０°Ｃから約２２０°Ｃ、約１８５°Ｃから約２１５°Ｃ、約１９０°Ｃから約２１０°Ｃ、または約１９５°Ｃから約２０５°Ｃに設定される。いくつかの局面において、乾燥温度は、約１７５℃、約１８０℃、約１８５℃、約１９０℃、約１９５℃、約２００℃、約２０５℃、約２１０℃、約２１５°Ｃ、約２２０°Ｃ、または約２２５°Ｃに設定される。いくつかの局面において、乾燥温度は、約２００℃に設定される。
【0154】
いくつかの局面において、転送ファンネル無線周波数（ＲＦ）および／または多重極ＲＦパラメータは、約３５０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約３６０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約３７０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約３８０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約３９０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約４００Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約４１０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約４２０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約４３０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約４４０Ｖｐｐから約４５０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４４０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４３５Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４３０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４２０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４１０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約４００Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約３９０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約３８０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約３７０Ｖｐｐ、約３５０Ｖｐｐから約３６０Ｖｐｐ、約３６０Ｖｐｐから約４４０Ｖｐｐ、約３７０Ｖｐｐから約４３０Ｖｐｐ、約３８０Ｖｐｐから約４２０Ｖｐｐ、または約３９０Ｖｐｐから約４１０Ｖｐｐに設定される。いくつかの局面において、転送ファンネルＲＦおよび／または多重極ＲＦパラメータは、約３５０Ｖｐｐ、約３６０Ｖｐｐ、約３７０Ｖｐｐ、約３８０Ｖｐｐ、約３９０Ｖｐｐ、約４００Ｖｐｐ、約４１Ｖｐｐ、約４２０Ｖｐｐ、約４３０Ｖｐｐ、約４４０Ｖｐｐ、または約４５０Ｖｐｐに設定される。いくつかの局面において、転送ファンネルＲＦおよび／または多重極ＲＦパラメータは、約４００Ｖｐｐに設定される。
【0155】
いくつかの局面において、ソース内衝突誘起解離（ｉｓＣＩＤ）エネルギーが、適用される。いくつかの局面において、ｉｓＣＩＤエネルギーは適用されない。ｉｓＣＩＤは、気相で選択されたイオンのフラグメンテーションを誘導する質量分析技術である。選択されたイオン（通常は分子イオンまたはプロトン化分子）は通常、電位を適用してイオンの運動エネルギーを増加させることで加速され、中性分子（例えば、ヘリウム、窒素、またはアルゴン）と衝突する。衝突において、運動エネルギーの一部は、内部エネルギーに変換され、これは結合の切断および分子イオンのより小さな断片への断片化をもたらす。
【0156】
いくつかの局面において、イオンクーラー転送時間は、約５０μｓから約１５０μｓ、約６０μｓから約１５０μｓ、約７０μｓから約１５０μｓ、約８０μｓから約１５０μｓ、約９０μｓから約１５０μｓ、約１００μｓから約１５０μｓ、約１１０μｓから約１５０μｓ、約１２０μｓから約１５０μｓ、約１３０μｓから約１５０μｓ、約１４０μｓから約１５０μｓ、約５０μｓから約１４０μｓ、約５０μｓから約１３０μｓ、約５０μｓから約１２０μｓ、約５０μｓから約１１０μｓ、約５０μｓから約１００μｓ、約５０μｓから約９０μｓ、約５０μｓから約８０μｓ、約５０μｓから約７０μｓ、約５０μｓから約６０μｓ、約６０μｓから約１４０μｓ、約７０μｓから約１３０μｓ、約８０μｓから約１２０μｓ、または約９０μｓから約１１０μｓである。いくつかの局面において、イオンクーラー転送時間は、約５０μｓ、約６０μｓ、約７０μｓ、約８０μｓ、約９０μｓ、約１００μｓ、約１１０μｓ、約１２０μｓ、約１３０μｓ、約１４０μｓ、または約１５０μｓである。いくつかの局面において、イオンクーラー転送時間は、約１００μｓである。イオンクーラー転送は、分析中に高エネルギーイオンを減速させる手段である。
【0157】
いくつかの局面において、イオンクーラー転送は、約２０μｓから約３０μｓ、約２１μｓから約３０μｓ、約２２μｓから約３０μｓ、約２３μｓから約３０μｓ、約２４μｓから約３０μｓ、約２５μｓから約３０μｓ、約２６μｓから約３０μｓ、約２７μｓから約３０μｓ、約２８μｓから約３０μｓ、約２９μｓから約３０μｓ、約２０μｓから約２９μｓ、約２０μｓから約２８μｓ、約２０μｓから約２７μｓ、約２０μｓから約２６μｓ、約２０μｓから約２５μｓ、約２０μｓから約２４μｓ、約２０μｓから約２３μｓ、約２０μｓから約２２μｓ、約２０μｓから約２１μｓ、約２１μｓから約２９μｓ、約２２μｓから約２８μｓ、約２３μｓから約２７μｓ、または約２４μｓから約２６μｓのプレパルス貯蔵を有する。いくつかの局面において、イオンクーラー転送は、約２０μｓ、約２１μｓ、約２２μｓ、約２３μｓ、約２４μｓ、約２５μｓ、約２６μｓ、約２７μｓ、約２８μｓ、約２９μｓ、または約３０μｓのプレパルス貯蔵を有する。いくつかの局面において、イオンクーラー転送は、約２５μｓのプレパルス貯蔵を有する。
【0158】
いくつかの局面において、ＴＯＦ ＭＳスキャンは、約１．０Ｈｚの取得速度でｍ／ｚ７００－２７００から取得される。
【0159】
本明細書に開示される方法について、任意のＥＳＩ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計を使用することができる。これは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｍａｘｉｓ、ＡＢＳｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００／６６００、ＡＢＳｃｉｅｘ Ｘ５００Ｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ＸＴ、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ（登録商標）Ｇ２ ＴＯＦ分光計または任意の他のモデルを含むがこれに限定されない。
【0160】
Ｆ．処置の方法
本開示のいくつかの局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法に向けられる。本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定すること、およびＭ－タンパク質を有すると同定される対象にＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合部分（「抗ＳＬＡＭＦ７抗体」）を投与することを含む方法に向けられる。本開示の他の局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を対象に投与すること；（ｉｉ）本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定すること；および（ｉｉｉ）追加の治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を対象に投与することを含む方法に向けられる。本開示のさらに他の局面は、本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、抗ＳＬＡＭＦ７抗体療法に適した対象を同定する方法に向けられる。いくつかの局面において、該方法は、Ｍ－タンパク質を有すると同定される対象に治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することをさらに含む。
本開示のいくつかの局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法に向けられる。本開示の特定の局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定すること、およびＭ－タンパク質を有すると同定される対象にＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合部分（「抗ＳＬＡＭＦ７抗体」）を投与することを含む方法に向けられる。本開示の他の局面は、形質細胞障害を有する対象を処置する方法であって、以下：（ｉ）治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を対象に投与すること；（ｉｉ）本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定すること；および（ｉｉｉ）追加の治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を対象に投与することを含む方法に向けられる。本開示のさらに他の局面は、本明細書に開示される任意の方法を使用して対象から得られる生物学的試料中のＭ－タンパク質を測定することを含む、抗ＳＬＡＭＦ７抗体療法に適した対象を同定する方法に向けられる。いくつかの局面において、該方法は、Ｍ－タンパク質を有すると同定される対象に治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することをさらに含む。
【0161】
ヒトＳＬＡＭＦ７に特異的に結合する任意の抗体またはその抗原結合部分を、本明細書に開示される方法において使用することができる。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ヒトＳＬＡＭＦ７への結合についてエロツズマブと交差競合する。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、エロツズマブと同じヒトＳＬＡＭＦ７上のエピトープに結合する。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、エロツズマブとしてヒトＳＬＡＭＦ７上の重複するエピトープに結合する。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ヒト抗体である。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、キメラ抗体である。特定の局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、エロツズマブである。
【0162】
エロツズマブ（ＢＭＳ－９０１６０８およびＨｕＬｕｃ６３とも呼ばれる）は、多発性骨髄腫において高度かつ均一に発現される細胞表面糖タンパク質であるＳＬＡＭＦ７（ＣＳ－１としても既知である）に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である（米国公開番号ＵＳ２００６／０２４２９６、ＵＳ２０１０／１６８３９７、ＵＳ２００９／２４６８５２、ＵＳ２００９／２３８８３５、ＵＳ２０１２／０６４０６７、ＵＳ２０１２／０７０４４０、ＵＳ２０１２／０６４０６８、ＵＳ２０１２／０６４０８３、ＵＳ２０１２／０６４０６９、ＵＳ２０１４／０６５０６３、ＵＳ２０１６／００２３３５、ＵＳ２００５／０２５７６３、ＵＳ２００９／２３８８２７、ＵＳ２００８／１２４３３２、ＵＳ２０１１／１６５１５４、ＵＳ２０１６／２０６７３４、ＵＳ２００８／１５２６４６、ＵＳ２０１４／３２２２０１、ＵＳ２０１６／１３７７３５、ＵＳ２０１７／３４２１５０、ＵＳ２００８／０９５７６８、ＵＳ２０１１／２０６７０１、ＵＳ２０１３／０５２１５８、およびＵＳ２０１３／０５８９２１；およびＰＣＴ発行番号ＷＯ２００４／１００８９８、ＷＯ２００５／１０２３８７、ＷＯ２００８／０１９３７６、ＷＯ２００８／０１９３７８、ＷＯ２００８／０１９３７９、ＷＯ２０１０／０５１３９１、ＷＯ２０１１／０５３３２１、およびＷＯ２０１１／０５３３２２を参照；これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。エロツズマブは、末梢血リンパ球の存在下で、初代多発性骨髄腫細胞に対して有意な抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する(Tai et al., Blood, 112:1329-1337 (2008))。エロツズマブは、ＮＫ細胞を介してＡＤＣＣを媒介することが既知である(van Rhee, F. et al., Mol. Cancer Ther., 8(9):2616-2624 (2009))。再発または難治性の多発性骨髄腫を有する患者の処置についての、単独で (Zonder et al., Blood, 120(3):552-559 (2012))、ボルテゾミブ(Jakubowiak et al., J. Clin. Oncol., 30(16):1960-1965 (Jun. 1, 2012))、またはレナリドマイドおよび低用量デキサメタゾン(Lonial et al., J. Clin. Oncol., 30:1953-1959 (2012))と組み合わされて投与されるこの薬物の安全性および有効性を評価した３つの研究の結果;および再発性または難治性の多発性骨髄腫を有する患者の処置についてのRichardson et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 116:986 (2010)が、報告されている。３つの組み合わせは全て、管理可能な安全性プロファイルおよび有望な活活性を示した。例えば、再発または難治性の多発性骨髄腫の処置におけるレナリドミドおよび低用量デキサメタゾンの併用によるエロツズマブの安全性および有効性を評価する第Ｉ／ＩＩ相試験は、１０ｍｇ／ｋｇ用量を受ける患者において３３か月のＰＦＳおよび９２％の応答率を実証した(Lonial et al., J. Clin. Oncol., 31 (2013) (Suppl., Abstr. 8542))。以前に未処置の多発性骨髄腫患者におけるエロツズマブ有りまたは無しでのレナリドミド／デキサメタゾンの第ＩＩＩ相臨床試験が進行中であり、一方でファーストライン設定におけるこの同じ組み合わせを評価するように設計される別の第ＩＩＩ相試験もまた進行中である。
【0163】
特定の局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体、例えばエロツズマブは、治療有効量の追加の治療薬との併用療法として投与される。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、例えばエロツズマブは、追加の治療薬と同時に投与される。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、例えばエロツズマブは、追加の治療薬の前に投与される。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、例えばエロツズマブは、追加の治療薬の後に投与される。いくつかの局面において、治療薬は抗癌剤である。いくつかの局面において、追加の治療薬は、ボルテゾミブ、レナリドマイド、ポマリドマイド、デキサメタゾン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの局面において、追加の治療薬は、ボルテゾミブ、レナリドマイド、ポマリドマイド、デキサメタゾン、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のボルテゾミブと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のレナリドマイドと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のデキサメタゾンと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のボルテゾミブおよび治療有効量のレナリドマイドと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のボルテゾミブおよび治療有効量のデキサメタゾンと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のレナリドマイドおよび治療有効量のデキサメタゾンと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のボルテゾミブ、治療有効量のレナリドマイド、および治療有効量のデキサメタゾンと組み合わせて投与される。
【0164】
いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のジフェンヒドラミンと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のラニチジンと組み合わせて投与される。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のアセトアミノフェンと組み合わせて投与される。
【0165】
いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のアゴニストＣＤ１３７抗体と組み合わせて投与される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ ２０１６／０２６４６７０ Ａ１を参照）。いくつかの局面において、治療有効量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、治療有効量のウレルマブと組み合わせて投与される。
【0166】
抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、任意の経路により投与することができる。いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、静脈内、皮下、皮内、腹腔内、筋肉内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。特定の局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、静脈内投与される。
【0167】
いくつかの局面において、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、本明細書に開示される任意の方法を使用して決定されるように、Ｍ－タンパク質を有する対象に投与される。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質がＭ－タンパク質の閾値レベルを超える場合、対象は抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与される。いくつかの局面において、Ｍ－タンパク質の閾値レベルは、対象から得られる血清試料中の、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約３ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／ＬのＭ－タンパク質である。特定の局面において、Ｍ－タンパク質の閾値レベルは、対象から得られる血清試料中の約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質である。
【0168】
いくつかの局面において、閾値レベルは、対象が特定のタイプの形質細胞障害を有することを示した。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象はＭＭを有すると同定される。いくつかの局面において、該方法は、ＭＭを有すると同定される対象に抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することをさらに含む。いくつかの局面において、該方法は、ＭＭを有すると同定される対象から骨髄生検を取得することをさらに含む。
【0169】
いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約１ｇ／Ｌから少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象ＭＭを有するリスクのある候補者として同定される。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約５ｇ／Ｌから少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象は、ＭＭを有するリスクのある候補者として同定される。いくつかの局面において、対象から得られる血清試料が（本明細書に開示される任意の方法を使用して測定されるように）少なくとも約１０ｇ／Ｌから少なくとも約３０ｇ／ＬのＭ－タンパク質を有すると決定される場合、対象は、ＭＭを有するリスクのある候補者として同定される。いくつかの局面において、該方法は、ＭＭを有するリスクのある候補として同定される対象から骨髄生検を取得することをさらに含む。特定の局面において、骨髄生検は、ＭＭのマーカーについてさらに分析される。
【0170】
上で引用された全ての参考文献、ならびに本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0171】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。
【0172】
実施例
本実施例は、完全に自動化された免疫捕捉工程、分析フロークロマトグラフィー、および簡略化されたデータ抽出手順を使用してＭ－タンパク質を検出する免疫捕捉（ＩＣ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）アッセイを記載する。ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、Ｍ－タンパク質を検出する際の治療用モノクローナル抗体からの干渉を排除する。
本実施例は、完全に自動化された免疫捕捉工程、分析フロークロマトグラフィー、および簡略化されたデータ抽出手順を使用してＭ－タンパク質を検出する免疫捕捉（ＩＣ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）アッセイを記載する。ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、Ｍ－タンパク質を検出する際の治療用モノクローナル抗体からの干渉を排除する。
【0173】
材料および方法
１．材料
１．材料
【0174】
ヒト骨髄腫血漿からの精製免疫グロブリンサブタイプ、緩衝トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）溶液、両性剤３－１２、塩酸、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルおよび２－プロパノールを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。モノクローナル治療用抗体を、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔから入手した。ギ酸（ＳｕｐｒａＰｕｒグレード）を、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。ＥＳＩ－Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水を、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＬＣ－ｌａｍｂｄａ（Ｈｕ）およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｋａｐｐａ ＸＬ樹脂の１：１混合物を含有するＰｈｙＴｉｐカラムを、ＰｈｙＮｅｘｕｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）によりカスタムメイドした。ヒト血清を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（ＮＹ，ＵＳＡ）により購入した。
【0175】
２.血清試料
【0176】
正常なポリクローナルバックグラウンドを有するヒト血清プールを、４つの正常なヒト血清プールを組み合わせることにより調製した。多発性骨髄腫試料の段階希釈液を、以前に定量化されたＭ－タンパク質濃度（≧５０００．０μｇ／ｍＬおよび≦３５．０μｇ／ｍＬ）の血清から調製した。合計５０の多発性骨髄腫血清試料を選択した。３０の試料はＩｇＧ（カッパ）を含有し；１３の試料はＩｇＧ（ラムダ）を含有し；および７つの試料はＩｇＡを含有し、４つはカッパ軽鎖を有し、３つはラムダ軽鎖を有した。選択した各Ｍ－タンパク質について、血清を通常の血清プールと混合して１０００．０μｇ／ｍＬのＭ－タンパク質に希釈した後、１０００．０μｇ／ｍＬ試料を分析対象物濃度５００．０、２５０．０、１００．０、５０．０、２５．０、および１０．０μｇ／ｍＬに段階希釈した。
【0177】
３．標準および品質制御試料
【0178】
エロツズマブは、多発性骨髄腫の処置のためのヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。純粋で安定しており、大量に入手できるため、それは、内因性モノクローナル抗体を模倣するのに適した代理分析対象物である。エロツズマブのストック溶液は、プールされたヒト血清を、最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬになるように凍結乾燥したｍＡｂを含有する薬物バイアルに加えることにより調製した。プールされたヒト血清の多くをスクリーニングし、Ｍスパイクを含有しないものを品質制御（ＱＣ）調製のためにプールした。エロツズマブおよびＱＣ試料を、プールされたブランクのヒト血清での段階希釈により、ストック溶液から調製した。
【0179】
４．試料調製
【0180】
血清試料、標準、およびＱＣをＰＢＳで４０倍に希釈し、１１０μＬの希釈試料を免疫捕捉のために使用した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＬＣ－ｌａｍｂｄａ（Ｈｕ）およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｋａｐｐａ ＸＬ樹脂の１：１混合物を含有するカスタムメイドのＰｈｙＴｉｐカラムを、免疫グロブリンの免疫捕捉のために使用した。これらのＰｈｙＴｉｐカラムを、９６チャネルを備えたＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）自動化プラットフォーム（ＴＥＣＡＮ，ＵＳＡ）上で使用した。自動化された免疫捕捉プロセスは、次の工程を含んだ：１）ＰＢＳでチップを４サイクル洗浄すること；２）希釈された血清から免疫グロブリンを３２サイクル捕捉すること；３）洗浄バッファーＩ（１０ｍＭリン酸、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％両性剤、ｐＨ７．４）、ＰＢＳ、および水でチップを合計８サイクル洗浄すること；４）１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１２ｍＭ ＨＣｌでの１０サイクルの溶出。溶出した試料を、１００ｍＭの緩衝ＴＣＥＰ溶液を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した後、２５℃で３０分間インキュベートすることにより、直ちに還元した。
【0181】
５．ＬＣ－ＭＳ
【0182】
クロマトグラフィーを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ｃｌａｓｓ Ｂｉｏシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）上で実施した。試料をＣ４カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ３００Å，１．７μｍ，２．１ｍｍｘ１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）に注入し、カラム温度を８０°Ｃに設定した。移動相Ａは水中の０．１％のギ酸（ＦＡ）を含有し、移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％のＦＡを含有した。勾配分離プログラムを次のように使用した：０－１．０分 １０％Ｂ；１．１－３．０分 １０－３３％Ｂ；３．０－１０．０分 ３３－４０％Ｂ；１０．１－１０．５分 ４０－９０％Ｂ；９０％Ｂで１０．５－１３．０分保持；１３．０－１５．０分 ９０－１００％Ｂ；および１５．０分での実行停止。流量を０．３μＬ／分に設定し、注入体積は２．０μＬであった。
【0183】
ＵＰＬＣを、標準的なエレクトロスプレー（ＥＳＩ）アポロソース（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＭａｘｉｓ ４Ｇ Ｑ－ＴＯＦ機器を用いてオンラインで行った。質量精度を確保するために、ＥＳＩ－Ｌ低濃度チューニングミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を注入することにより、各分析の前に機器をキャリブレーションした。各１５分の実行を、次のようにセグメント化した：廃棄まで３分；次いでソースまで７分；および廃棄まで最後５分。キャピラリー電圧を、４５００Ｖに設定した。ネブライザーを、１．６バールに設定した。乾燥ガスを、８．５Ｌ／分に設定した。乾燥温度を、２００℃に設定した。転送ファンネルＲＦおよびマルチポールＲＦパラメータを、４００Ｖｐｐに設定し；ｉｓＣＩＤエネルギーを適用しなかった。イオンクーラー転送時間は１００μｓで、プレパルスストレージは２５μｓであった。イオン極性は正であり、移動平均がアクティブ化され、２に設定された。ＴＯＦＭＳスキャンを、１．０Ｈｚの取得速度でｍ／ｚ７００－２７００から取得した。
【0184】
６．ＭＳデータ分析
【0185】
ＭＳデータファイルを、Ｃｏｍｐａｓｓ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ４．３ソフトウェアを使用して処理した。方法の詳細は次のとおりである：テストされた全ての免疫グロブリンがこの保持ウィンドウにおいて共溶出していたため、分析対象物の保持時間（ＲＴ）を５．６－６．８分に設定した。ＭＳピークスペクトル抽出ウィンドウは８００－２４００ｍ／ｚ以内であり；質量スペクトルの平滑化およびベースライン減算は無効になり、最大エントロピーデコンボリューション範囲は２０，０００－２８，０００Ｄａであった。デコンボリューションされたスペクトルの積分は、クロマトグラフィーピークの積分に類似していた。Jian et al., 8 Bioanalysis 1679-1691 (2016)。ピーク検出パラメータを上記のように調整し、分析対象物のピーク高さを計算した。軽鎖の分子量およびスペクトルのピーク高さを、ｍｇｆファイルに書き出した。その後のモノクローナル軽鎖（ＬＣ）の検出を、前処置モノクローナルＬＣの±１．０Ｄａ以内の分子量を有するポリクローナルバックグラウンドより上のピークの存在を検索することにより実行した。軽鎖のピーク高さを、カウントとして記録した。目的の分析対象物に隣接するポリクローナルバックグラウンドのＬＣのピーク高さも、記録した。バックグラウンドを差し引き、ポリクローナルバックグラウンドにおける差異を説明するために、隣接する軽鎖のピーク高さを分析対象物のピーク高さから差し引いた。軽鎖の非定量的測定について、正確な個々の軽鎖保持時間を使用して質量スペクトルを抽出した。
【0186】
７．血清タンパク質電気泳動
【0187】
ＳＰＥＰおよびＳＩＦＥ分析を、製造業者の指示に従って、Ｈｅｌｅｎａラボゲル電気泳動システム（Ｈｅｌｅｎａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＴＸ）上で実施した。負のＳＩＦＥを、電気泳動ゲル上の明確なバンドの不在として定義した。
【0188】
結果および考察
１．ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイワークフロー
１．ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイワークフロー
【0189】
記載されたＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、完全に自動化された免疫捕捉工程および単純化されたデータ抽出手順を使用する。ＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ（登録商標）ロボットプラットフォーム上で抗カッパ／抗ラムダ樹脂混合物を充填したＰｈｙｎｅｘｕｓチップを使用して、免疫グロブリンおよび遊離軽鎖を血清から精製する。精製工程の後、インタクトな抗体を還元し、軽鎖をＬＣ－ＭＳにより分析する。Ｍ－タンパク質のデコンボリューションされたピーク高さの強度を、分析対象物を定量するために便宜上使用する。アッセイワークフローの要約を、図１に提供する。
【0190】
２．ＬＣ－ＭＳおよびデータ分析
【0191】
液体クロマトグラフィー工程を使用して、軽鎖を脱塩し、共精製タンパク質から分離し；しかしながら、個々の軽鎖分析対象物のそれぞれを分離しなかった。定義されたクロマトグラムプロファイルは、７２秒幅であった。テストされた全てのヒト免疫グロブリン軽鎖は、この保持ウィンドウにおいて溶出していた。分析対象物の相対量の測定のために、各Ｍ－タンパク質のデコンボリューションされたスペクトルピーク高さの強度を使用した。図２Ａ－２Ｉは、正常なヒト血清（図２Ａ－２Ｃ）、多発性骨髄腫患者０１（図２Ｄ－２Ｆ）、および多発性骨髄腫患者０２（図２Ｇ－２Ｉ）血清から精製された免疫グロブリンの簡略化されたクロマトグラム、質量スペクトル、およびデコンボリューション／再構成スペクトルを示す。合計イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）は、還元された免疫グロブリンの幅広い１．２分の溶出ピークを表す（図２Ａ、２Ｄ、および２Ｇ。通常の血清から抽出された質量スペクトル（図２Ａ）は、広範囲の未分解ピークを示す。多発性骨髄腫血清免疫グロブリンから抽出された質量スペクトル（図２Ｅおよび２Ｈ）は、明確に定義された複数の荷電イオンを表す。正常なヒト免疫グロブリンのデコンボリューションされた質量スペクトル（図２Ｃ）は、ポリクローナルバックグラウンドより上のピークを有さない複数の低強度ピークを有する。一方で、多発性骨髄腫免疫グロブリンの質量スペクトルのデコンボリューションは、各患者の疾患関連軽鎖を表す単一の高強度ピークを生成する（図２Ｆおよび２Ｉ）。各個人により疾患関連軽鎖の質量は異なり、悪性血漿細胞により過剰産生される異なる免疫グロブリンを表す。質量スペクトル免疫グロブリン精製のために使用される浸出ラムダ／カッパナノボディの割合は、アスタリスクで示される。
【0192】
現在の生物分析の慣行において、多価イオンを、インタクトなタンパク質を定量化するために合計する。これらのイオンを、定量用の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を生成するために処理する。しかしながら、各患者のＭ－タンパク質について個々のｍ／ｚイオンを選択するアプローチは、実用的でない。さらに、シグナル強度は広範囲に帯電したイオン間で大幅に希釈され、潜在的な干渉からの分析対象物イオンの分離は非常に困難になる。上記の理由により、デコンボリューションされた軽鎖のピーク高さを定量に使用した。「デコンボリューションされたピーク高さ」アプローチは、定量のためのＸＩＣを生成するための複数の荷電イオンの使用より堅牢で感度が高いことが示された。
【0193】
３．免疫グロブリン精製
【0194】
方法の分析感度を改良するために、免疫グロブリンを血清試料から精製する必要がある。分析対象物の多様性のために、全てのヒト免疫グロブリンに良好な親和性で結合する一般的な捕捉試薬が必要とされた。抗体精製に利用できるいくつかの日常的な方法があり；しかしながら、それらのほとんどは特定のクラスの免疫グロブリンにのみ結合する。多発性骨髄腫のＭ－タンパク質を、重鎖または軽鎖の免疫グロブリンクラスのいずれかに関連付けることができる。したがって、全ての抗体クラスおよび遊離軽鎖に結合する捕捉試薬が、単純で堅牢なアッセイを開発するために求められた。注意深い技術的考察および最初の実験の後、１：１の比で混合された抗ラムダ／抗カッパ捕捉樹脂を選択した。この出願について最高のパフォーマンスを発揮するアフィニティマトリックスは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手可能なＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ナノボディ樹脂であった。この樹脂を、自動化に完全に対応できるＰｈｙＴｉｐｓ（登録商標）に充填した。選択したＰｈｙＴｉｐｓ（登録商標）は、４０μｇのラムダおよび４０μｇのカッパ免疫グロブリンをロードする能力を有した。チップの過飽和を防ぎ、全ての内因性免疫グロブリンを捕捉するために、血清試料を４０倍に希釈した。免疫捕捉手順を、内因性ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、および治療用モノクローナル抗体を使用してテストした。Ｓｉｇｍａから購入した９つの内因性Ｍ－タンパク質、および８つの治療用モノクローナル抗体を使用して免疫捕捉回収率を評価した。免疫捕捉回収率を、ヒト血清から精製された分析対象物のＭＳ応答（ピーク高さ）を、スパイクなしで正常なヒト血清から精製されたポリクローナルバックグラウンドにポストスパイクされた対応する分析対象物のピーク高さと比較することにより評価した。図３に示すように、テストされた全ての抗体の定量的回収率は、一貫して８０．０％より高かった。
【0195】
ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイ評価
１．シグナル強度に対する分析対象物不均一性の影響
１．シグナル強度に対する分析対象物不均一性の影響
【0196】
不均一な分析対象物に関する主要な懸念の１つは、ＭＳ応答が大きく変化し、分析対象物の濃度だけでなく、その性質に依存することである。異なる軽鎖間のイオン化の違いが重要であるかどうかを調べるために、１０．０；２５．０；５０．０；１００．０；２５０．０；５００．０および１０００．０μｇ／ｍＬの濃度で正常血清にスパイクされる５つの同一でないＩｇＧカッパ治療用抗体をテストして、標準のデコンボリューション曲線を作成した。テストした全ての抗体のアッセイＬＬＯＱは２５．０μｇ／ｍＬで、ＬＯＤは１０．０μｇ／ｍＬであった。ＭＳ応答は、異なる分析対象物間で２０－３０％の範囲で変化した。分析対象物およびキャリブレーターが同一になることはめったにないため、バイオマーカー濃度が通常は相対的であることを考慮すると、これは許容できる変動である。５つの同一でない治療用ｍＡｂについてのデコンボリューションされた軽鎖標準曲線を図４に示す。
【0197】
２．ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイ感度
【0198】
ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイの感度をテストするために、３つの個々のモノクローナル抗体（Ａ、Ｂ、およびＣ）を正常なヒト血清にスパイクし、免疫捕捉ＩＣ－ＬＣ－ＨＲＭＳ方法論によりテストした（図５Ａ－５Ｉ）。各抗体を、１０００μｇ／ｍＬ（図５Ａ、５Ｄ、および５Ｇ）、１００μｇ／ｍＬ（図５Ｂ、５Ｅ、および５Ｈ）、および１０μｇ／ｍＬ（図５Ｃ、５Ｄ、および５Ｉ）の濃度でテストした。１０μｇ／ｍＬの分析対象物を検出するために、目的の分析対象物について固有の０．２分のクロマトグラフィーウィンドウから質量スペクトルを抽出した。テストされた抗体の分子量は、テストされた全ての濃度で１．０Ｄａ以内の元のピーク質量と一致した。３つのピークは全てシグナル対ノイズ比が低かったが、正確な質量のために高い信頼性で検出できた。このデータに基づくと、免疫捕捉ＩＣ－ＬＣ－ＭＳ方法論の検出ＬＯＤの推定限界は、感度が１０００μｇ／ｍＬの臨床ＳＰＥＰアッセイの１００分の１である。最大の感度を達成するために、質量スペクトルを、上記のように正確な個々の軽鎖保持時間を使用して抽出した。
【0199】
ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイの検出限界をテストするために、健康血清に異なるＭ－タンパク質をスパイクした（図５Ｊ－５Ｍ；表１）。ＩｇＧＫ（１０ｍｇ／Ｌ；図５Ｊ）、ＩｇＧＬ（５ｍｇ／Ｌ；図５Ｋ）、ＩｇＡＫ（１０ｍｇ／Ｌ；図５Ｌ）、およびＩｇＡＬ（１０ｍｇ／Ｌ；図５Ｍ）に対応するピークは、図５Ｊ－５Ｍにおいて矢印で示される。
【表1】
【0200】
３．ＳＩＦＥおよびＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイ感度の直接比較
【0201】
ＬＣ－ＭＳおよびＳＩＦＥアッセイ感度を比較するために、５０個の多発性骨髄腫血清を、１０００．０から５０．０μｇ／ｍＬの理論的Ｍ－タンパク質濃度に連続的に希釈した。全ての希釈試料を２つに分割し、ＳＩＦＥおよびＩＣ－ＬＣ－ＭＳの両方により分析した。ＳＩＦＥ ＬＯＤを、元の試料の濃度および希釈係数に基づいて計算した。そして、ＳＩＦＥゲル上に明確なバンドを与える最後の元の試料希釈として決定した。予想どおり、ＳＩＦＥ感度は分析対象物により大きく異なり、２５０．０－１０００．０μｇ／ｍＬであることがわかった。文献で報告されるＳＩＦＥ感度よりわずかに低い感度は、全ての多発性骨髄腫血清が、多発性骨髄腫血清よりも高いポリクローナル免疫グロブリン濃度を有する正常なヒト血清プールにおいて希釈されたという事実により説明できる。高いポリクローナルバックグラウンドは、濃く染色されたゲル上に明確なバンドを見る分析者の能力を自然に妨げる。ＳＩＦＥにより測定可能な最低段階希釈濃度でＩＣ－ＬＣ法により測定されたＭＳ応答の分布を表すプロットを、図６に示す。推定されるＩＣ－ＬＣ－ＭＳ方法のＬＯＤは、ＳＩＦＥ ＬＯＤの１０－１００分の１である。
【0202】
４．治療用抗体干渉への対処
【0203】
ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイが内因性抗体と治療用抗体とを容易に区別することを示すために内因性モノクローナル抗体濃度を有する５０の多発性骨髄腫血清に、この生物学的薬物の薬物動態ＥＣ５０に相当する濃度である２００．０μｇ／ｍＬのエロツズマブを添加した。４９の場合において、内因性抗体はエロツズマブと区別することができる。エロツズマブおよびＭ－タンパク質の代表的な質量ピークを、図７Ａ－７Ｎに示す。図７Ｅは、エロツズマブを含有しないＭ－タンパク質対照を示す。Ｍ－タンパク質軽鎖の分子量を、１つの例を除いて全て正確に同定した。内因性モノクローナル抗体の分子量がエロツズマブの質量ピークを除いて２．０Ｄａ未満であったため、血清の１つがエロツズマブ干渉を有すると判断した。エロツズマブピークの存在下での１．０Ｄａを超えるＭ－タンパク質質量ピークシフトは、これが実際の干渉ケースであることを示した（データは示さず）。
【0204】
５．ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、骨髄腫疾患を高感度にモニターし、標準的な方法より早くＭ－タンパク質の増加を検出することができる。
【0205】
ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイが、標準的なＳＰＥＰ／ＳＩＦＥ／ｓＦＬＣテストと比較した場合に、多発性骨髄腫疾患のモニタリングに関してより正確な情報を提供できるかどうかを調査した。各対象についてのＭ－タンパク質開始の持続的な増加を決定するために、ｌｏｇ１０スケールでのＩＣ－ＬＣ－ＭＳ測定および視覚的に同定された明確な変曲点を検査した。非常に良好な部分応答（ＶＧＰＲ）および完全応答（ＣＲ）を有する骨髄腫患者の場合、ＩＣ－ＬＣ－ＭＳはより感度が高かった。Ｍ－タンパク質は、本明細書に開示される新規アッセイにより測定された全ての時点で検出可能であった。しかしながら、ＳＰＥＰ／ＳＩＦＥは、患者１についてのサイクル５－２９（図８Ａ－８Ｂ）および患者２についてのサイクル８－２８（図８Ｅ－８Ｆ）において陰性であった。ＩＣ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、ＳＰＥＰ／ＳＩＦＥの両方よりもはるかに早くＭ－タンパク質の持続的な増加を検出できた。患者１について、持続的な増加をサイクル２０において、またはＳＰＥＰよりも１０サイクル早く検出した（図８Ｃと図８Ａを比較のこと）。患者２について、持続的な増加をサイクル１６において、またはＳＰＥＰよりも１３サイクル早く検出した（図８Ｇと図８Ｅを比較のこと）。
【0206】
図９Ａ－９Ｆは、対象における選択された時点のＩＣ－ＬＣ－ＭＳプロファイルを示し、ここでＭ－タンパク質は、アッセイの優れた特異性のために、全ての時点でＩＣ－ＬＣ－ＭＳピーク分析アルゴリズムにより検出された。Ｍ－タンパク質軽鎖の質量の特徴は、ベースライン試料中で、次いでその後連続試料中で容易に同定できる。このアプローチは、ポリクローナルバックグラウンドより上のＭ－タンパク質の非常に特異的な追跡を可能にする。
【0207】
本明細書に開示される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図7-6】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【国際調査報告】