特表 2022-553855 長さが２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を使用したヘテロ接合ＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のさまざまなノックアウト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-26

(54)【発明の名称】長さが２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を使用したヘテロ接合ＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のさまざまなノックアウト

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20221219BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20221219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221219BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221219BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20221219BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20221219BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20221219BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221219BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221219BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20221219BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20221219BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20221219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/57 ZNA

C12N5/10

C12N15/11 Z

C12N15/55

C12N9/16 Z

A61P7/00

A61P43/00 105

A61K48/00

A61K47/26

A61K38/47

A61K47/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526184

(86)(22)【出願日】2020-11-05

(85)【翻訳文提出日】2022-06-30

(86)【国際出願番号】 US2020059186

(87)【国際公開番号】W WO2021092227

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】62/931,659

(32)【優先日】2019-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521476126

【氏名又は名称】エメンドバイオ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100179062

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 正

(74)【代理人】

【識別番号】100199565

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 茂

(74)【代理人】

【識別番号】100212705

【弁理士】

【氏名又は名称】矢頭 尚之

(74)【代理人】

【識別番号】100219542

【弁理士】

【氏名又は名称】大宅 郁治

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100162570

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 早苗

(72)【発明者】

【氏名】バラム、デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】イザール、リオル

(72)【発明者】

【氏名】ヘルマン、アサエル

(72)【発明者】

【氏名】エマニュエル、ラフィ

(72)【発明者】

【氏名】ロッカー、リアット

(72)【発明者】

【氏名】マルバッハ・バール、ナダブ

(72)【発明者】

【氏名】ゴラン・マシアハ、ミハル

(72)【発明者】

【氏名】ジョージソン、ジョセフ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B050DD02

4B050LL01

4B050LL03

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC14

4C076CC26

4C076EE17

4C076EE57

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084DC22

4C084MA05

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZB211

(57)【要約】

重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関する変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、細胞は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子を含み、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する組成物を、前記細胞に導入することを含む、方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関する変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、前記細胞は、rs1683564、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を前記細胞に導入することを含み、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体は前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する、方法。

【請求項2】

前記第一のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号２５１７、２６０１、２４６４～２５１６、２５１８～２６００、２６０２～２６１３、１～２４６３、２６１４～３７５１又は１～２９５３のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞は、rs1683564、rs9749274、rs740021、rs199720952、rs28591229、rs71335276、rs3826946、rs10413889、rs3761005、rs10409474、rs3761007、rs17216649、rs10469327、rs8107095、rs10414837及びrs10424470からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記多型部位はrs1683564であり、前記第一のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号２５１７、２６０１、２４６４～２５１６、２５１８～２６００、２６０２～２６１３、１～２４６３、２６１４～３７５１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体が前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、前記変異体対立遺伝子は、前記１つ以上の多型部位に基づいて前記二本鎖切断の標的となる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子を導入することを更に含み、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第二の二本鎖切断は前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内で生じる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域はイントロン４である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第二のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号２９５４～３７５１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記細胞はrs10414837又はrs3761005においてヘテロ接合であり、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞はrs1683564においてヘテロ接合であり、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記第二のＲＮＡ分子は２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象から、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する細胞を採取することを含み、前記対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象を最初に選択し、前記対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記対象から前記細胞を採取することを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

動員及び／又はアフェレーシスにより、前記対象から前記細胞を採取することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

骨髄吸引により、前記対象から前記細胞を採取することを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記組成物を前記細胞に導入する前に、前記細胞を刺激する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記細胞を培養することを更に含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ-３及びＧＭ-ＣＳＦの１つ以上と共に培養する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記細胞を、少なくとも１つのサイトカインと共に培養する、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記少なくとも１つのサイトカインはヒトのサイトカインの組換え体である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞は複数の細胞の１つであり、前記第一のＲＮＡ分子を含む組成物又は前記第一のＲＮＡ分子及び前記第二のＲＮＡ分子を含む組成物を、少なくとも前記細胞及び前記複数の細胞の別の細胞に導入し、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を、少なくとも前記細胞中及び前記複数の細胞の別の細胞中で不活性化し、それによって複数の改変細胞を得る、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記第一のＲＮＡ分子を含む組成物を導入すること又は前記第二のＲＮＡ分子を導入することは、前記細胞のエレクトロポレーションを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

請求項２２又は２３に記載の方法によって得られた改変細胞。

【請求項25】

請求項２４に記載の細胞を培養して得られた改変細胞。

【請求項26】

前記細胞は生着が可能である、請求項２４又は２５に記載の改変細胞。

【請求項27】

子孫細胞を産生できる、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の改変細胞。

【請求項28】

生着後に子孫細胞を産生できる、請求項２７に記載の改変細胞。

【請求項29】

自己生着後に子孫細胞を産生できる、請求項２８に記載の改変細胞。

【請求項30】

生着後少なくとも１２月又は少なくとも２４月の間、子孫細胞を産生できる、請求項２８又は２９に記載の改変細胞。

【請求項31】

前記改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の改変細胞。

【請求項32】

前記改変細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞である、請求項３１に記載の改変細胞。

【請求項33】

前記改変細胞は、骨髄細胞又は末梢血単核細胞（ＰＭＣ）である、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の改変細胞。

【請求項34】

ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部分が欠損した改変細胞。

【請求項35】

前記改変細胞は、rs7250194、rs397773837、rs759823713、rs12976041、rs55921706、rs2007647、rs7255385、rs351108、rs6510983、rs375312008、rs1234492733、rs8111201、rs3761010、rs11881698、rs17223066、rs74176357、rs201984870、rs141213775、rs111361200、rs3761001、rs55793725、rs55791968、rs953484068、rs56234325、rs4807932、rs9304953、rs71335273、rs868711974及びrs570466264からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合の細胞から改変された、請求項３４に記載の改変細胞。

【請求項36】

請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物。

【請求項37】

請求項３６に記載の組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法であって、前記細胞と前記薬学的に許容される担体を混合することを含む方法。

【請求項38】

改変細胞を含む組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法であって、前記方法は：
(a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離し、前記対象から前記細胞を採取する工程；
(b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程(a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
(c) 工程(b)の改変細胞を培養する工程、
ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する、
を含む方法。

【請求項39】

(a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離する工程；
(b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程(a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
(c) 工程(b)の細胞を培養する工程、ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
(d) 工程(b)又は工程(c)の細胞を前記対象に投与する工程、
を含む方法によってin vitroで製造された組成物の使用であって、前記対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療するための使用。

【請求項40】

ＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を治療する方法であって、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の改変細胞、請求項３５に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法で製造した組成物の治療有効量の投与を含む方法。

【請求項41】

ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
(a) 前記対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離する工程；
(b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程(a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
(c) 工程(b)の細胞を培養する工程、ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
(d) 工程(b)又は工程(c)の細胞を前記対象に投与する工程、
を含み、それにより前記対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法。

【請求項42】

ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記対象は、rs7250194、rs397773837、rs759823713、rs12976041、rs55921706、rs2007647、rs7255385、rs351108、rs6510983、rs375312008、rs1234492733、rs8111201、rs3761010、rs11881698、rs17223066、rs74176357、rs201984870、rs141213775、rs111361200、rs3761001、rs55793725、rs55791968、rs953484068、rs56234325、rs4807932、rs9304953、rs71335273、rs868711974及びrs570466264からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
自己の改変細胞又は自己の改変細胞の子孫を前記対象に投与することを含み、ここで、前記自己修飾細胞は前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断が生じるように修飾されている、
ここで、前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第一のＲＮＡ分子を含む組成物の前記細胞への導入によって生じ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用して、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を前記細胞内で不活性化する、
それにより前記対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法。

【請求項43】

ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された一群の対象から治療を行う対象を選択する方法であって、
(a) 前記一群の対象のそれぞれから細胞を得る工程；
(b) 各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異についてスクリーニングし、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する対象のみを選択する工程；
(c) 工程(b)で選択した対象の細胞を、rs10414837、rs3761005、rs1683564からなる群から選択した１つ以上の多型部位におけるヘテロ接合性について配列決定によりスクリーニングする工程；
(d) 前記１つ以上の多型部位においてヘテロ接合の細胞を有する対象者のみを治療のために選択する工程；
(e) 前記対象の骨髄から、吸引又は末梢血の動員とアフェレーシスにいずれかによって、造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を得る工程；
(f) １つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子上に存在する前記１つ以上の多型部位のヘテロ接合対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする、配列番号１～２９５３のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４中の配列を標的とするガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子、ここで場合によっては、前記第二のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号２９５４～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有する、
を、工程(e)のＨＳＰＣに導入する工程；
ここで、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞において前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の第一の二本鎖切断に作用し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が第一の二本鎖切断に作用した前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞において前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の２つの対立遺伝子のイントロン４の第二の二本鎖切断に作用し、それによって改変細胞を得る、
(g) 工程(f)の改変細胞を前記対象に投与する工程；
を含み、
それによって前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法。

【請求項44】

配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子。

【請求項45】

請求項４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む第二のＲＮＡ分子を含む組成物であって、場合によっては前記第二のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号２９５４～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続したヌクレオチドを有する組成物。

【請求項46】

前記第二のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、請求項４５に記載の組成物。

【請求項47】

前記第二のＲＮＡ分子のガイド配列部分のヌクレオチド配列は、前記第一のＲＮＡ分子のガイド配列部分の配列と異なるヌクレオチド配列である、請求項４５又は４６に記載の組成物。

【請求項48】

前記第一のＲＮＡ分子及び／又は前記第二のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を更に含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

前記第一のＲＮＡ分子及び／又は前記第二のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含む、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記第二のＲＮＡ分子は、１つ以上のリンカーを更に含む、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記第一のＲＮＡ分子及び／又は前記第二のＲＮＡ分子の長さは最大で３００ヌクレオチドである、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を更に含む、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、請求項４４に記載のＲＮＡ分子又は請求項４３～５１のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に送達することを含む方法。

【請求項55】

ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、ＳＣＮ又はＣｙＮに罹患している対象に、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項４３～５１のいずれか一項に記載の組成物、請求項４４に記載のＲＮＡ分子で改変された細胞又は請求項４３～５１のいずれか一項に記載の組成物を送達することを含む方法。

【請求項56】

前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ及び前記ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、前記対象及び／又は前記細胞に、同時に又は異なる時に実質的に送達される、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

前記方法は、
(a) 変異体対立遺伝子から、疾患の原因となる変異を含むエクソンを削除すること、ここで、前記第一のＲＮＡ分子若しくは前記第一のＲＮＡ分子及び前記第二のＲＮＡ分子は、エクソンの一部分か前記エクソンに隣接する領域を標的とする；
(b) 複数のエクソン、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体若しくは遺伝子全体を削除すること;
(c) 前記第一のＲＮＡ分子若しくは前記第一のＲＮＡ分子及び前記第二のＲＮＡ分子が、変異体対立遺伝子のエクソンとイントロンの間の選択的スプライシングされるシグナル配列を標的とすること；
(d) 前記第二のＲＮＡ分子が、変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者に存在する配列を標的とすること；
(e) 前記第二のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること；又は
(f) 誤りが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のメカニズムによって前記変異体対立遺伝子を挿入若しくは削除し、前記変異体対立遺伝子の配列にフレームシフトを引き起こすこと、
(g) 場合によっては、前記フレームシフトにより、前記変異体対立遺伝子が不活性化若しくはノックアウトされること、
(h) 好ましくは、前記フレームシフトは前記変異体対立遺伝子中に早期終止コドンを形成するか、前記フレームシフトは前記変異体対立遺伝子の転写産物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解をもたらすこと、
を含む、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記不活性化又は治療により、前記変異体対立遺伝子によってコードされる短縮型タンパク質及び前記機能的対立遺伝子によってコードされる機能的タンパク質がもたらされる、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

(a) 前記細胞若しくは前記対象はrs10414837若しくはrs3761005においてヘテロ接合で、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する、又は
(b) 前記細胞若しくは前記対象はrs1683564においてヘテロ接合で、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物の使用であって、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するための使用。

【請求項61】

請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物を含む、細胞内での変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の不活性化に使用するため医薬であって、前記医薬は、前記細胞に、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物が送達される医薬。

【請求項62】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物又は請求項４４に記載のＲＮＡ分子の使用であって、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象の、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防するための使用。

【請求項63】

請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物、又は請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞を含む、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防に使用するための医薬であって、前記医薬は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物、又は請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞が送達される医薬。

【請求項64】

変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列は、前記変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を前記細胞内で不活性化するために前記細胞に向けられるキット。

【請求項65】

対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキット。

【請求項66】

変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物、又は請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞、及び前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を前記細胞内で不活性化するために前記細胞に前記組成物を送達するための指示書を含むキット。

【請求項67】

対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物、又は請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞、及び請求項３６、４５～５３のいずれか一項に記載の組成物を送達するための指示書を含み、請求項３７若しくは３８に記載の方法で製造した組成物又は請求項２４～３５のいずれか一項に記載の改変細胞は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキット

【請求項68】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合、切断活性を示す、請求項１～２３、３８、４１、４２及び４３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項６４若しくは６５に記載のキット。

【請求項69】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、連鎖球菌属sp.（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、トレポネーマ デンティコラ（Treponema denticola）、ノカルディオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム シビリクム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属sp.（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノテス属sp.（Cyanothece sp.）、ミクロシスティス エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属sp.（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシラプター ベッシー（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジタートス デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difjicile）、フィネゴルディア マグナ（Finegoldia magna）、ナトロアナエロビウス サーモフィラス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属sp.（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス ワトソニー（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属sp.（Nostoc sp.）、オーロスピラ マキシマ（Arthrospira maxima）、オーロスピラ プラテンシス（Arthrospira platensis）、オーロスピラ属sp.（Arthrospira sp.）、リングビア属sp.（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属sp.（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス マリナ（Acaryochloris marina）、フランシセラ cf.ノビシダFx1（Francisella cf. novicida Fx1）、アリサイクロバチルス アシドテッレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）、オレイフィラス属sp.（Oleiphilus sp.）、バクテリウムCG09_39_24（Bacterium CG09_39_24）及びデルタプロテオバクテリア バクテリウム（Deltaproteobacteria bacterium）のいずれかから誘導される、請求項６８に記載の方法又はキット。

【請求項70】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、以下の特徴：
(a) 切断活性が、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２４ヌクレオチド以上のガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２３ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい；
(b) 切断活性が、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２３ヌクレオチド以上のガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２２ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい；並びに
(c) 切断活性が、２２ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である
の１つ以上を有する、請求項１～２３、３８、４１及び４２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項６４若しくは６５に記載のキット。

【請求項71】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３７８９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３７９０又は配列番号３７９１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７０に記載の方法又はキット。

【請求項72】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物は、以下の特徴：
(a) 前記組成物は水溶液中に存在する；
(b) 前記組成物のｐＨは６～８である；
(c) 前記組成物はＲＮａｓｅを含まない
の１つ以上を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項６４～６７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項73】

前記第一のＲＮＡ分子は、２１～２２ヌクレオチドのガイド配列部分を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記ガイド配列部分は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～２２の連続するヌクレオチドを有する、請求項４４に記載のＲＮＡ分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この出願は、2019年11月6日に出願された米国仮出願第62/931,659号の利益を主張し、その内容はこの明細書に組み込まれる。

【0002】

この出願全体では、括弧内で参照されているものを含め、さまざまな出版物が参照されている。この出願で言及する全ての刊行物全体の開示は、この発明が関係する技術及びこの発明で使用できる技術の特徴を説明するために、この出願に組み込まれる。

【0003】

配列表の参照
この出願には、「201105_91193-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」という名称のファイル中のヌクレオチド配列が組み込まれるが、これはファイルのサイズが779KBで、2020年11月5日にMS-Windows（登録商標）とＯＳの互換性を有するIBM-PC形式のコンピューターで作成され、この出願の一部として2020年11月5日に提出されたテキストファイルに含まれている。

【背景技術】

【0004】

ヒトゲノムには、挿入及び欠失、反復配列のコピー数の差、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）など、いくつかのＤＮＡの変動がある。ＳＮＰは、ゲノム内の一塩基（アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ））が個人の間又は一対の染色体の間で異なる場合に生じるＤＮＡ配列の変動である。さまざまなＤＮＡの変動は、特性や病気の原因を特定する研究のマーカーとして、又は遺伝性疾患の原因として、何年にもわたって研究者が着目してきた。通常、ＳＮＰは良性で病気を引き起こさないと考えられている。

【0005】

遺伝性疾患は、ゲノム中の１つ以上の異常によって生じる。遺伝性疾患は、「顕性（dominant）」又は「潜性（recessive）」のいずれかと見なされる場合がある。潜性の遺伝性疾患とは、異常／欠陥遺伝子の２つのコピー（つまり、２つの対立遺伝子）の存在が必要な疾患である。これに対して、顕性の遺伝性疾患は、正常な（機能的な／健康な）の１つ以上の遺伝子に対して顕性を示す１つ以上の遺伝子を含む。したがって、顕性の遺伝性疾患では、その症状を引き起こし、又は、その症状に関与するのに必要な異常な遺伝子は、１コピー（すなわち対立遺伝子）のみである。そのような変異には、例えば、変化した遺伝子産物が新しい分子機能又は遺伝子発現の新しいパターンを示す機能獲得型変異が含まれる。機能獲得型変異は、一般的にドミナントネガティブ変異である。ドミナントネガティブ変異の例は、１つの対立遺伝子が変異してその機能を失い、残った単一の野生型対立遺伝子が特定の細胞機能を生じるには十分なタンパク質を産生しないハプロ不全である。他の例には、野生型対立遺伝子に対し拮抗的に作用する遺伝子産物を生じるドミナントネガティブ変異が含まれる。

【0006】

好中球減少症
好中球減少症は、血中の好中球の絶対数の減少として定義され、通常、末梢血中の好中球絶対数（ＡＮＣ）を測定することによって診断される。好中球減少症の重症度は、ＡＮＣが１０００～１５００／μＬで軽度、ＡＮＣが５００～１０００／μＬで中等度、ＡＮＣが５００／μＬ未満で重度である（Boxer 2012）。

【0007】

好中球減少症は、先天性（遺伝性）又は後天性のものに分類できる。一般に常染色体顕性遺伝で、先天性の２つの主な型は、周期性好中球減少症（ＣｙＮ）及び重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）である。周期性好中球減少症は、好中球数が正常からゼロまで変動することを特徴とし、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）は、出生時の非常に低いＡＮＣ（５００／μＬ）、前骨髄球／骨髄球段階の骨髄における骨髄造血の成熟停止、及び細菌感染症の早期の発症を特徴とする（Carlsson et al. 2012；Horwitz et al. 2013）。

【0008】

ＳＣＮは、血中の非常に低いＡＮＣを測定し、骨髄穿刺液を調べて骨髄成熟停止を特定することで診断できる（Dale 2017）。ＳＣＮは、通常、生後６月より前に診断されるが、ＣｙＮは一般に生後２年目以降に診断され、主な臨床症状は再発性の急性口腔疾患である。悪性の造血系疾患を除外し、細胞性であることを決定し、骨髄の成熟を評価し、正確な病因の兆候を検出するために、骨髄検査が必要であることが多く、ＳＣＮが疑われる場合は、細胞遺伝学的骨髄検査が重要となる。抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（Ｉｇ ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び糞便エラスターゼ）及び脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）の量も、ＳＣＮ及びＣｙＮの評価に関係する（Donadieu 2011を参照）。

【0009】

ＳＣＮは、常染色体潜性遺伝（ＨＡＸ１、Ｇ６ＰＣ３）、常染色体顕性遺伝（ＥＬＡＮＥ、ＧＦＩ１）又はＸ連鎖（ＷＡＳ）型の遺伝であるか、散発的に生じる可能性がる（Carlsson et al. 2012；Boxer 2012）。

【0010】

周期性好中球減少症及び先天性好中球減少症は、「好中球エラスターゼ遺伝子」（elastase, neutrophil expressed gene（ＥＬＡＮＥ遺伝子））の変異によって最も頻繁に引き起こされる。ＳＣＮ患者の４０～５５％でＥＬＡＮＥ遺伝子の変異が確認されており、男性と女性は等しく影響を受ける（Donadieu et al. 2011；Dale 2017）。ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、ＳＣＮの常染色体顕性及び散発性の症例に関連している（Carlsson et al. 2012）。現在まで、２００を超えるさまざまなＥＬＡＮＥ遺伝子の変異が同定されており、これらは全てのエクソン及びイントロン３とイントロン４にランダムに分布している（Skokowa et al. 2017）。現在、ＣｙＮ及びＳＣＮに関する１２０を超える異なるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異が知られており、例えば、Ｃ１５１Ｙ及びＧ２１４Ｒは、特に予後の不良に関連している（Makaryan et al. 2012を参照；ＣｙＮ及びＳＣＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異の包括的なリストは、Germeshausen et al 2013も参照）。

【0011】

ＥＬＡＮＥ遺伝子は、好中球の細胞外トラップ（病原体に結合する繊維のネットワーク）の機能に関与する好中球エラスターゼ（ＮＥ）をコードする。いくつかの研究は、変異型ＥＬＡＮＥ遺伝子の産物が、骨髄での好中球産生を妨害し、好中球減少症を引き起こすように作用することを示唆する。これらの研究は、ＮＥの変異が小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を開始し、骨髄での好中球形成の過程における細胞の喪失につながることを示す（Makaryan et al. 2017）。

【0012】

現在の治療法
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）は、ＳＣＮの第一選択治療と考えられている（Connelly, Choi, and Levine 2012）。Ｇ-ＣＳＦは、多くの好中球の産生を刺激し、それらのアポトーシスを遅らせる（Schaeffer and Klein 2007）。ＳＣＮ患者の１０％は依然として重度の細菌感染症又は敗血症で死亡するが、現在、全生存率は、悪性腫瘍を発症している患者を含め、８０％を超えると推定されている（Skokowa et al. 2017）。Ｇ-ＣＳＦ療法は敗血症による死亡を防ぐことに成功しているものの、長期治療は、ＳＣＮ患者で骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病を発症するリスクの増加と関係していることが確認された。ＳＣＮで最も一般的な白血病はＡＭＬであるが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び多形質性白血病も文献で報告されている（Connelly, Choi, and Levine 2012）。Ｇ-ＣＳＦに強く反応した患者（用量８μｇ未満／ｋｇ／日）は、１５年間のＧ-ＣＳＦ投与後にＭＤＳ／白血病を発症する累積発生率が１５％であるのに対し、高用量であるにもかかわらずＧ-ＣＳＦへの応答が良くない患者では発生率が３４％であったとの報告が以前に示された（Rosenberg et al. 2010）。

【0013】

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、Ｇ-ＣＳＦ療法に応答しない患者又はＡＭＬ／ＭＤＳを発症する患者のための代替治療である。しかし、ＨＣＴを受ける慢性好中球減少症の患者は、真菌などの感染性合併症や移植片対宿主病を発症するリスクが高くなる（Skokowa et al. 2017）。さらに、ＨＣＴは成功させるために一致したドナーが必要であるが、ほとんどの患者には一致したドナーがいない（Connelly, Choi, and Levine 2012）。

【発明の概要】

【0014】

顕性変異体対立遺伝子を破壊する、又は産生されたｍＲＮＡを分解することにより、顕性変異体対立遺伝子の発現をノックアウトする方法を開示する。

【0015】

この開示は、疾病の原因となる変異タンパク質をコードする変異を有する対立遺伝子（変異体対立遺伝子）と、機能的タンパク質をコードする対立遺伝子（機能的対立遺伝子）という２つの対立遺伝子を区別／識別するために、少なくとも１つの天然に存在するヘテロ接合のヌクレオチドの差異又は多型（例．一塩基多型（ＳＮＰ））を利用する方法を提供する。

【0016】

この発明の実施の態様は、細胞又は対象中の顕性変異体対立遺伝子を発現する遺伝子において、少なくとも１つのヘテロ接合ＳＮＰを利用する方法を提供する。この発明の実施の態様では、利用するＳＮＰは、疾患の表現型に関係していてもよく、又は関係していなくてもよい。この発明の実施の態様では、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異体対立遺伝子中のヘテロ接合ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能的な対立遺伝子とは異なるヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド塩基を標的とすることにより、遺伝子の変異体対立遺伝子を標的とする。

【0017】

いくつかの態様では、この方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能的タンパク質の発現を可能にする工程を更に含む。

【0018】

この発明は、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関する変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、その細胞は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である方法を提供し、
前記方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を細胞に導入することを含み、
ここで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。

【0019】

この発明は、この発明の方法によって得られる改変細胞を提供する。

【0020】

この発明は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部分が欠損した改変細胞を提供する。

【0021】

この発明は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0022】

この発明は、この発明の細胞と薬学的に許容される担体を混合することを含む組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法を提供する。

【0023】

この発明は、改変細胞を含む組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法を提供し、前記方法は：
a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離し、対象から細胞を採取する工程；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
c) 工程b)の改変細胞を培養する工程、
ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する、
を含む。

【0024】

この発明は、
a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276、and rs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離する工程；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して修飾細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
c) 工程b)の細胞を培養する工程、ここで前記改変細胞は生着が可能で生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
d) 工程b)又は工程c)の細胞を対象に投与する工程、
を含む方法
によってin vitroで製造された組成物の、対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療のための使用を提供する。

【0025】

この発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を治療する方法であって、改変細胞、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物の治療有効量の投与を含む方法を提供する。

【0026】

この発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である方法を提供し、
前記方法は、
a) 前記対象から得た細胞からＨＳＰＣを単離する工程；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して修飾細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
c) 工程b)の細胞を培養する工程、ここで前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
d) 工程b)又は工程c)の細胞を対象に投与する工程、
を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する。

【0027】

この発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276、and rs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である方法を提供し、前記方法は、
自己の改変細胞又は自己の改変細胞の子孫を対象に投与することを含み、ここで、自己修飾細胞はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子が二本鎖切断されるように修飾されている、
ここで、二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第一のＲＮＡ分子を含む組成物の細胞への導入によって生じ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体がＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用して、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化し、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する。

【0028】

この発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された一群の対象から治療を行う対象を選択する方法であって、
a) 前記一群の対象のそれぞれから細胞を得る工程；
b) 各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異についてスクリーニングし、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する対象のみを選択する工程；
c) 工程b)で選択した対象の細胞を、rs10414837、rs3761005、rs1683564からなる群から選択した１つ以上の多型部位におけるヘテロ接合性について配列決定によりスクリーニングする工程；
d) １つ以上の多型部位でヘテロ接合の細胞を有する対象者のみを治療のために選択する工程；
e) 前記対象の骨髄から、吸引又は末梢血の動員とはアフェレーシスによって、造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を得る工程；並びに
f) １つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子上に存在する前記１つ以上の多型部位のヘテロ接合対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４中の配列を標的とするガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子、ここで場合によっては、前記第二のＲＮＡ分子のガイド配列は２１～３０ヌクレオチドを含み、場合によっては、２１～３０の連続したヌクレオチドは、配列番号２９５４～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む、
を、工程e)のＨＳＰＣに導入する工程；
ここで、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の第一の二本鎖切断に作用し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が第一の二本鎖切断に作用した前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の２つの対立遺伝子のイントロン４の第二の二本鎖切断に作用し、それによって改変細胞を得る、
g) 工程f)の改変細胞を前記対象に投与する工程；
を含み、
それによって前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法を提供する。

【0029】

この発明は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含むＲＮＡ分子を提供する。

【0030】

この発明は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、この発明のＲＮＡ分子又は組成物を細胞に送達することを含む方法を提供する。

【0031】

この発明は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するための、ＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物の使用を提供する。

【0032】

この発明は、ＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物を含む、細胞内での変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の不活性化に使用するため医薬であって、前記医薬は、前記細胞に、ＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物が送達される医薬を提供する。

【0033】

この発明は、方法、改変細胞、組成物、前記方法で製造した組成物又はこの発明のＲＮＡ分子の使用であって、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象の、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防するための使用を提供する。

【0034】

この発明は、ＲＮＡ分子、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞を含む、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防に使用するための医薬であって、前記医薬は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に、ＲＮＡ分子、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞が送達される医薬を提供する。

【0035】

この発明は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、この発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するために細胞に向けられるキットを提供する。

【0036】

この発明は、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、この発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡは、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキットを提供する。

【0037】

この発明は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞、及びＥＬＡＮＥ遺伝子を細胞内で不活性化するように組成物を細胞に送達するための指示書を含むキットを提供する。

【0038】

この発明は、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞、及び前記組成物を送達するための指示書を含み、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】プロモーター領域を上流のＳＮＰ位置からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまで切除することを示す概略図。一例では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略１ａ－rs10414837、戦略１ｂ－rs3761005）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。

【図2】プロモーター領域を上流のＳＮＰ位置からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまで切除することを示す概略図。一例では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略１ａ－rs10414837、戦略１ｂ－rs3761005）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。別の例では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略１ａ－rs10414837、戦略１ｂ－rs3761005）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする。

【図3】イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までの切除を示す概略図。一例では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略２－rs1683564）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。別の例では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略２－rs1683564）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。さらに、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略２－rs1683564）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン３’ＵＴＲの配列を標的とする。

【図4】イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までの切除を示す概略図。この戦略は、健康な対立遺伝子を無傷で残しながら、疾患の原因となる対立遺伝子（変異体対立遺伝子）を特異的にノックアウトするように設計されている。対立遺伝子に特異的な編集は、集団内の比較的高いヘテロ接合性頻度で識別可能な（ヘテロ接合）ＳＮＰを標的とするガイド配列を使用することにより行われる。

【図5】ヘテロ接合体の頻度と選択したヘテロ接合ＳＮＰの間の重複／連鎖に基づく集団の予想されるカバレッジ。３種の治療戦略を立案することにより、集団の約８０％をカバーすることが可能であるかもしれない。表から集団の８０％が１つ以上のヘテロ接合ＳＮＰを有していると評価される。表から、集団の３３％がヘテロ接合ＳＮＰを１つ有し、３１％がヘテロ接合ＳＮＰを２つ有し、１６％がヘテロ接合ＳＮＰを３つ有し、２０％が表に示されたＳＮＰのいずれも有していない。

【図6】ＨｅＬａ細胞を９６穴プレート（３Ｋ／ウェル）に播種し、２４時間後、Turbofect試薬（Thermo Scientific）を使用して、６５ｎｇのＷＴ-Ｃａｓ９又はＤｅａｄ-Ｃａｓ９と、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミド（ｇ３６からｇ６６として特定、ＥＬＡＮＥ遺伝子のさまざまな領域及びＳＮＰを標的とする）を導入した。編集の割合（％）は、以下の式で計算した： １００％－（編集されていないバンドの強度／全バンドの強度）×１００３回の実験における、Ｄｅａｄ-Ｃａｓ９バックグラウンド活性を引いた後の各ｇＲＮＡの平均活性±ＳＤを示す。

【図7】ＳｐＣａｓ９-ＷＴのＲＮＡ成分と、ＥＭＸ１（sgEMX1）又はＥＬＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：rs3761005；ｇ６２：rs1683564）のいずれかを標的とするｇＲＮＡを、健康なドナーのＨＳＣにヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの７２時間後にｇＤＮＡを抽出し、ＩＤＡＡによって編集量を分析した。２回の実験における平均編集率（％）±ＳＤを示す。

【図8】ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子のイントロン４及びエクソン５を切除することによって行われる。これは、イントロン４でＤＳＢを行い、対立遺伝子に特異的なＤＳＢを行うためにＳＮＰであるrs1683564を利用することによって達成される。

【図9】ヒト細胞における固有忠実度。ＯＭＮＩ-５０又はＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと共に哺乳類細胞系でＤＮＡトランスフェクションにより発現させた。細胞溶解物を、部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅及びＮＧＳに使用した。インデルの割合は、ELANEg35_OMNI-50又はELANEg62_OMNI-50（表７参照）を使用したＨｅＬａ細胞株でのオンターゲット編集とオフターゲット編集について、明細書で説明するように測定し分析した。いずれの場合についても、図の下部に、下線を引いたＰＡＭ配列と共に、ゲノムのオンターゲット配列及びオフターゲット配列を示す。各実験は、３回の独立した実験による。

【図10A】図１０Ａ～Ｄは、ＯＭＮＩ-５０のＲＮＰとしての活性アッセイである。ＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化しＲＮＰを形成させた。図１０Ａのin vitroアッセイでは、ＲＮＰを、対応する標的及びＰＡＭ配列を有する直鎖状のＤＮＡテンプレートとインキュベートした。直鎖状のテンプレートを切断する能力で活性を確認した。図１０Ａは、さまざまなスペーサー長（１７～２３ヌクレオチド）のガイド３５を有するＯＭＮＩ-５０ ＲＮＰの活性アッセイ（表４）である。

【図10B】図１０Ｂのin vitroアッセイでは、ＲＮＰを、対応する標的及びＰＡＭ配列を有する直鎖状のＤＮＡテンプレートとインキュベートした。直鎖状のテンプレートを切断する能力で活性を確認した。スペーサー長が２０～２３ヌクレオチドのＲＮＰ（４、２、１．２、０．６及び０．２ｐｍｏｌ）の量を減らし、１００ｎｇのＤＮＡ標的テンプレートとインキュベートした。

【図10C】図１０Ｃのin vivoアッセイでは、Ｕ２ＯＳ細胞にＲＮＰをエレクトロポレーションし、ＮＧＳにより活性をインデル頻度として測定した。図１０Ｃは、Ｕ２ＯＳ細胞によるＯＭＮＩ-５０のＲＮＰとしての活性アッセイである。Ｕ２ＯＳ細胞株にスペーサー長が１７～２３ヌクレオチドのＲＮＰをエレクトロポレーションし、ＮＧＳにより編集量（インデル）を測定した。

【図10D】図１０Ｄのin vivoアッセイでは、Ｕ２ＯＳ細胞にＲＮＰをエレクトロポレーションし、ＮＧＳにより活性をインデル頻度として測定した。図１０Ｄは、Ｕ２ＯＳ細胞によるＯＭＮＩ-５０のＲＮＰとしての活性アッセイである。Ｕ２ＯＳ細胞株にELANE g35 sgRNAのＶ１～４を有するＲＮＰをエレクトロポレーションし、ＮＧＳにより編集量（インデル）を測定した。

【図11】ｉＰＳＣによるＯＭＮＩ-５０のＲＮＰとしての活性アッセイ。ｉＰＳＣ細胞株にスペーサー長が１７～２３ヌクレオチドのＲＮＰ（表４）をエレクトロポレーションし、ＮＧＳにより編集量（インデル）を測定した。

【図12】イントロン４の特徴的でない位置（２つの対立遺伝子の切断）及び３’ＵＴＲの下流のヘテロ接合ＳＮＰrs1683564の位置（対立遺伝子に特異的な切断）の２つ位置で切断し、対立遺伝子に特異的な欠失が生じるＥＬＡＮＥ遺伝子の切除戦略を示すスキーム。

【図13A】ＥＬＡＮＥ遺伝子変異Ｇ２２１終止（Ｇ２２１ｔｅｒ）を有する患者の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、切除によるレスキュー効果を示す。図１３Ａは、実験のフローを示すスキームである。Lonza P3 Cell Line 4D-Nucleofector（登録商標）XキットとDZ100プログラムを使用して、ＲＮＰをＨＳＣにエレクトロポレーションし、ＨＳＣリッチの培地中で３日間回復させ、増殖と骨髄前駆細胞への分化のために、ＩＬ-３、ＳＣＦ、ＧＭＣＳＦ及びＧＣＳＦと共に７日間培養し、続いて好中球への分化のためにＧＣＳＦ中で７日間培養した。１４日目に、ＦＡＣＳでＣＤ１４^＋の単球及びＣＤ６６ｂ^＋ＣＤ１４^＋の好中球について分析した。

【図13B】ＨＳＣを好中球に分化させ、分化の１４日目に健常者及びＧ２２１ｔｅｒ患者から得た未処置細胞及び編集した細胞のフローサイトメトリーによる分析。プロットは、健常者と比較して、未治療の患者では、ＣＤ６６ｂ^＋ＣＤ１４^＋の好中球が減少し、ＣＤ１４^＋の単球が増加することを示す。切除された患者のＨＳＣでは、好中球への分化は完全にレスキューされる点に留意されたい。

【図13C】１４日目の健常者及びＧ２２１ｔｅｒ患者における細胞組成中の好中球及び単球の割合を表すグラフ。

【図13D】ｄｄＰＣＲで測定した、５日目及び１４日目における、健常者及びrs1683564でホモ接合のＧ２２１ｔｅｒ患者の細胞の分化したＨＳＣからのsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-refによる切除効率を示すグラフで、切除は二対立遺伝子と予想される。切除は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン１及びエクソン５の領域を、それぞれ、ＦＡＭ及びＨＥＸでラベルしたプローブを使用して増幅することにより決定する。ＨＥＸ信号とＦＡＭ信号の比率を、切除効率に変換する。

【図14A】ＥＬＡＮＥ遺伝のＳ１２６Ｌ変異を有する患者の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、変異した対立遺伝子のさまざまな編集の後に、レスキュー効果を示す。図１４Ａは、ＨＳＣを好中球に分化させ、分化の１４日目に健常者及びＳ１２６Ｌ患者から得た未処置細胞及び編集した細胞のフローサイトメトリーによる分析である。プロットは、健常者と比較して、未治療の患者では、ＣＤ６６ｂ^＋ＣＤ１^＋の好中球が減少し、ＣＤ１４^＋の単球が増加することを示す。変異に関連するsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-refを切除した患者のＨＳＣは、好中球の分化を完全にレスキューするのに対し、sgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-altでは部分的なレスキュー効果であることに留意されたい。

【図14B】１４日目の健常者及びＳ１２６Ｌ患者における細胞組成中の好中球及び単球の割合を表すグラフ。

【図14C】ｄｄＰＣＲで測定した、４日目及び１４日目における、健常者及びrs1683564でホモ接合のＳ１２６Ｌ患者の細胞の分化したＨＳＣからのsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-ref及びsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-altによる切除効率を示すグラフで、切除は対立遺伝子に特異的であると予想される。切除は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン１及びエクソン５の領域を、それぞれ、ＦＡＭ及びＨＥＸでラベルしたプローブを使用して増幅することにより決定する。ＨＥＸ信号とＦＡＭ信号の比率を、切除効率に変換する。sgRNA-564DS-ref組成物による切除効率は、sgRNA-564DS-altよりも高くなることに留意されたい。

【図14D】rs1683564でヘテロ接合である、健常者及びＳ１２６Ｌ患者の細胞の分化したＨＳＣからｄｄＰＣＲによって測定したsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-ref及びsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-altによる４日目及び１４日目の対立遺伝子に特異的な編集を示すグラフ。編集の特異性は、オルタナティブ対立遺伝子に結合するＦＡＭプローブ及びリファレンス対立遺伝子に結合するＨＥＸプローブの２つの競合プローブを使用し、編集された対立遺伝子のシグナルが減少することを測定する。sgRNA-564DS-refで編集した場合のリファレンス対立遺伝子とオルタナティブ対立遺伝子の両者の減少は、sgRNA-564DS-altの場合と比較して特異性が低下していることに留意されたい。ヘテロ接合体の未処置細胞におけるリファレンス対立遺伝子の濃度とオルタナティブ対立遺伝子の濃度の比は１である。グラフは、各ｇＤＮＡ試料について、対照内因性遺伝子ＲＰＰ３０及びＳＴＡＴ１エクソン３に対して正規化した、リファレンス対立遺伝子（ＨＥＸ）、オルタナティブ対立遺伝子（ＦＡＭ）の平均濃度を表す。

【図14E】処置した全てのＥＬＡＮＥ遺伝子のｍＲＮＡの量は、細胞を好中球に分化させた後、ｑＲＴ－ＰＣＲで評価した。ｍＲＮＡの量を、編集していない細胞と比較して定量化する。

【図14F】未処置の細胞と比較した、sgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-ref及びsgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-altで切除した患者ＨＳＣから抽出されたＳ１２６Ｌ変異を有するエクソン４を標的とするｃＤＮＡについてＮＧＳで決定した対立遺伝子特異的転写のＩＧＶスナップショット。sgRNAコンスタント＋sgRNA-564DS-ref切除組成物に関する変異体対立遺伝子に特異的なＲＮＡの減少を、ＷＴ（Ｃを青でマーク）／Ｓ１２６Ｌ変異（Ｔを赤でマーク）転写の１：１の比率を示す未処置の細胞と比較して観察したことに留意されたい。全ての試料を３回評価した。

【図15】ＯＭＮＩ５０ヌクレアーゼでELANE g35（sgRNA-コンスタント）部位を標的とするＵ２ＯＳ細胞のGUIDE-seqによって同定されたオフターゲット部位の配列。GUIDE-seqによるシーケンシング読み取り数とヒトｈｇ３８リファレンスの標的位置（染色体番号：位置）を右側に示す。オンターゲット部位を黒四角で示す。

【図16】ＳｐＣａｓ９又はＯＭＮＩ５０ヌクレアーゼで処置したＵ２ＯＳ細胞のコンスタントガイド配列パネルにおける編集率（％）を示すグラフ。

【図17】ＳｐＣａｓ９又はＯＭＮＩ５０ヌクレアーゼで処置したＵ２ＯＳ細胞のsgRNA-564DS-refパネルにおける編集の分析。

【図18】コンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-refを使用して処置した患者の試料を分析するためのコンスタントガイド配列オフターゲットパネルによる編集の分析。

【図19】コンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-refを使用して処置した患者の試料を分析するためのsgRNA-564DS-refオフターゲットパネルによる編集の分析。

【図20】コンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-Altを使用して処置した患者の試料を分析するためのsgRNA-564DS-Altオフターゲットパネルによる編集の分析。

【発明を実施するための形態】

【0040】

この発明の実施の態様は、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関する変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、その細胞は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を細胞に導入することを含み、
ここで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する、
方法を提供する。

【0041】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む。

【0042】

この発明の実施の態様では、細胞（又は対象）は、rs9749274、rs740021、rs199720952、rs28591229、rs71335276、rs3826946、rs10413889、rs3761005、rs10409474、rs3761007、rs1683564、rs17216649、rs10469327、rs8107095、rs10414837及びrs10424470からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む。

【0043】

いくつかの態様では、多型部位はrs1683564であり、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号２５１７、２６０１、２４６４～２５１６、２５１８～２６００、２６０２～２６１３、１～２４６３、２６１４～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む。

【0044】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子がＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、その変異体対立遺伝子は、１つ以上の多型部位に基づいて二本鎖切断の標的となる。

【0045】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子がＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、その変異体対立遺伝子は、１つ以上の多型部位における変異体対立遺伝子の配列に基づいて二本鎖切断の標的となる。

【0046】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する１つ以上の多形部位のヌクレオチド塩基に基づいて、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。

【0047】

この発明の実施の態様は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を導入することを更に含み、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する。ある態様では、第二のＲＮＡ分子は２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む。

【0048】

この発明の実施の態様では、組成物は、１、２、３又はそれ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでいてもよい。この発明の実施の態様では、細胞に組成物を導入することは、細胞に１、２、３又はそれ以上の組成物を導入することを含んでいてもよい。この発明の実施の態様では、各組成物は、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列又は同じＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでいてもよい。２つのＲＮＡ分子が関与するこの発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、第一のＲＮＡ分子と同じＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよく、又は、別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよい。

【0049】

この発明の実施の態様では、第二の二本鎖切断はＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内で生じる。この発明の実施の態様では、非コード領域はイントロン４にある。

【0050】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１の連続するヌクレオチドを含む。

【0051】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２２の連続するヌクレオチドを含む。

【0052】

この発明の実施の態様に応じて、第二のＲＮＡ分子のガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含む。

【0053】

この発明の実施の態様では、第二の二本鎖切断はＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内で生じる。

【0054】

この発明の実施の態様では、細胞はrs10414837又はrs3761005においてヘテロ接合で、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する。

【0055】

この発明の実施の態様では、細胞はrs1683564においてヘテロ接合であり、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する。

【0056】

いくつかの態様では、細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子中の多型部位rs10414837においてヘテロ接合であり、２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。そのような態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、表１に示されたrs10414837を標的とする配列番号のいずれか１つに示された連続するヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。

【0057】

いくつかの態様では、細胞はＥＬＡＮＥ遺伝子中の多型部位rs3761005においてヘテロ接合であり、２１～２２又は２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。そのような態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、表１に示されたrs3761005を標的とする配列番号のいずれか１つに示された連続するヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。

【0058】

いくつかの態様では、細胞はＥＬＡＮＥ遺伝子中の多型部位rs1683564においてヘテロ接合であり、２１～２２又は２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。そのような態様では、第一のＲＮＡ分子のガイド配列は、表１に示されたrs1683564を標的とする配列番号のいずれか１つに示された連続するヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。

【0059】

この発明の実施の態様は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する細胞を採取することを含む。

【0060】

この発明の実施の態様は、最初に、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象を選択し、対象から細胞を採取することを含む。

【0061】

この発明の実施の態様は、動員及び／又はアフェレーシスにより、対象から細胞を採取することを含む。

【0062】

この発明の実施の態様は、骨髄吸引により対象から細胞を採取することを含む。

【0063】

この発明の実施の態様では、細胞は、組成物が細胞に導入される前に刺激される。

【0064】

この発明の実施の態様は、細胞を培養することを含む。

【0065】

この発明の実施の態様では、細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ-３及びＧＭ-ＣＳＦの１つ以上と共に培養される。

【0066】

この発明の実施の態様では、細胞は、少なくとも１つのサイトカインと共に培養される。

【0067】

この発明の実施の態様では、少なくとも１つのサイトカインはヒトのサイトカインの組換え体である。

【0068】

この発明の実施の態様では、細胞は複数の細胞の中の１つの細胞であり、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子を含む組成物は、少なくとも前記細胞及び前記複数の細胞の中の別の細胞に導入され、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子は、少なくとも前記細胞中及び前記複数の細胞の別の細胞中で不活性化され、それによって複数の改変細胞が得られる。

【0069】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子を含む組成物を導入すること又は前記第二のＲＮＡ分子を導入すること、１つ以上の細胞のエレクトロポレーションを含む。

【0070】

この発明の実施の態様は、この発明の方法によって得られる改変細胞を提供する。

【0071】

この発明の実施の態様では、改変細胞は更に培養される。

【0072】

この発明の実施の態様では、細胞は生着が可能である。

【0073】

発明の実施の態様では、改変細胞は、患者に注入されると長期間生着でき、注入後少なくとも１２月の間、好ましくは少なくとも２４月の間、さらにより好ましくは注入後少なくとも３０月の間、分化した造血細胞を産生する。別の態様では、改変細胞は、自家移植されると長期間生着できる。別の態様では、改変細胞は、骨髄を破壊していない対象に注入されると長期間生着できる。この発明のある態様では、ヒトに移植した場合、長期間生着させるのに十分な数の改変細胞が対象に送達される。

【0074】

この発明の実施の態様では、改変細胞は子孫細胞を産生できる。

【0075】

この発明の実施の態様では、改変細胞は、生着後に子孫細胞を産生できる。

【0076】

この発明の実施の態様では、改変細胞は、自己生着後に子孫細胞を産生できる。

【0077】

この発明の実施の態様では、改変細胞は、生着後少なくとも１２月又は少なくとも２４月の間、子孫細胞を産生できる。

【0078】

ある態様では、細胞は幹細胞である。ある態様では、細胞はＥＳ細胞である。いくつかの態様では、幹細胞は造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。

【0079】

この発明の実施の態様では、改変細胞はＣＤ３４^＋造血幹細胞である。

【0080】

この発明の実施の態様では、改変細胞は、骨髄細胞又は末梢血単核細胞（ＰＭＣ）である。

【0081】

この発明の実施の態様は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部分が欠損した改変細胞を提供する。

【0082】

この発明の実施の態様では、改変細胞は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合の細胞から改変された。

【0083】

この発明の実施の態様は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0084】

この発明の実施の態様は、この発明の細胞と薬学的に許容される担体を混合することを含む組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法を提供する。

【0085】

この発明の実施の態様は、改変細胞を含む組成物をin vitro又はex vivoで製造する方法を提供し、前記方法は：
a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離し、対象から細胞を採取する工程；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子、
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によって、
c) 工程b)の改変細胞を培養する工程、
ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する、
を含む。

【0086】

この発明の実施の態様は、
a) ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している対象であって、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である対象から採取した細胞からＨＳＰＣを単離し；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によっては、
c) 工程b)の細胞を培養し、ここで、前記改変細胞は生着が可能で生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
工程b)又は工程c)の細胞を対象に投与する工程、
を含む方法
によってin vitroで製造された組成物の、対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療のための使用を提供する。

【0087】

この発明の実施の態様は、ＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を治療する方法であって、改変細胞、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物の治療有効量の投与を含む方法を提供する。

【0088】

この発明の実施の態様は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
a) 前記対象から得た細胞からＨＳＰＣを単離する工程；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列；及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を、工程a)の細胞に導入し、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を１つ以上の細胞内で不活性化して改変細胞を得る工程、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体が、１つ以上の細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し、
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を前記細胞に導入し、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞でＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；場合によっては、
c) 工程b)の細胞を培養する工程、ここで、前記改変細胞は生着が可能で、生着後に子孫細胞を産生する；並びに、
d) 工程b)又は工程c)の細胞を対象に投与する工程、
を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法を提供する。

【0089】

この発明の実施の態様は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、対象は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であり、前記方法は、
自己の改変細胞又は自己の改変細胞の子孫を対象に投与することを含み、ここで、自己修飾細胞はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子が二本鎖切断されるように修飾されている、
ここで、二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第一のＲＮＡ分子を含む組成物の細胞への導入によって生じ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体がＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用して、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化し、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法を提供する。

【0090】

この発明の実施の態様は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された一群の対象から治療を行う対象を選択する方法であって、
a) 前記一群の対象のそれぞれから細胞を得る工程；
b) 各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異についてスクリーニングし、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する対象のみを選択する工程；
c) 工程b)で選択した対象の細胞を、rs10414837、rs3761005、rs1683564からなる群から選択した１つ以上の多型部位におけるヘテロ接合性について配列決定によりスクリーニングする工程；
d) １つ以上の多型部位でヘテロ接合の細胞を有する対象者のみを治療のために選択する工程；
e) 前記対象の骨髄から、吸引又は末梢血の動員とはアフェレーシスによって、ＨＳＰＣ細胞を得る工程；並びに
f) １つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子上に存在する前記１つ以上の多型部位のヘテロ接合対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする、配列番号１～２９５３のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子、
を、工程e)のＨＳＰＣに導入する工程；
ここで、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の第一の二本鎖切断に作用し、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第一のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が第一の二本鎖切断に作用した前記１つ以上のＨＳＰＣ細胞で前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の２つの対立遺伝子のイントロン４の第二の二本鎖切断に作用し、それによって改変細胞を得る、
g) 工程f)の改変細胞を前記対象に投与する工程；
を含み、
それによって前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法を提供する。

【0091】

この発明の実施の態様は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～２２又は２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含むＲＮＡ分子を提供する。

【0092】

この発明の実施の態様は、ガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を更に含む。

【0093】

この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする。

【0094】

この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子のガイド配列のヌクレオチド配列は、第一のＲＮＡ分子のガイド配列の配列と異なる。

【0095】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を更に含む。この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を更に含む。

【0096】

この発明のある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３７８９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の配列同一性を有する。

【0097】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。

【0098】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含む。この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含む。

【0099】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子は、１つ以上のリンカーを更に含む。この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、１つ以上のリンカーを更に含む。

【0100】

この発明の実施の態様では、前記第一のＲＮＡ分子の長さは、最大で３００ヌクレオチドである。この発明の実施の態様では、前記第二のＲＮＡ分子の長さは、最大で３００ヌクレオチドである。

【0101】

この発明の実施の態様では、組成物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を更に含む。この発明の実施の態様では、組成物は、１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を更に含む。

【0102】

この発明の実施の態様は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、この発明のＲＮＡ分子又は組成物を細胞に送達することを含む方法を提供する。

【0103】

この発明の実施の態様では、１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及びＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、対象及び／又は細胞に、同時に又は異なる時に実質的に送達される。

【0104】

この発明の実施の態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列及びＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子は、対象及び／又は細胞に、同時に又は異なる時に実質的に送達される。

【0105】

この発明の実施の態様では、前記方法は、変異体対立遺伝子から、疾患の原因となる変異を含むエクソンを削除することを含み、ここで、前記第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、エクソンの一部分か前記エクソン全体に隣接する領域を標的とする。

【0106】

この発明の実施の態様では、前記方法は、複数のエクソン、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体を削除することを含む。

【0107】

この発明の実施の態様では、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子のエクソンとイントロンの間の選択的スプライシングされるシグナル配列を標的とする。

【0108】

この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者に存在する配列を標的とする。

【0109】

この発明の実施の態様では、第二のＲＮＡ分子はイントロンを標的とする。

【0110】

この発明の実施の態様では、前記方法により、誤りが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のメカニズムによって前記変異体対立遺伝子に挿入又は削除が生じ、前記変異体対立遺伝子の配列にフレームシフトを引き起こす。

【0111】

この発明の実施の態様では、フレームシフトにより、変異体対立遺伝子が不活性化又はノックアウトされる。

【0112】

この発明の実施の態様では、フレームシフトは変異体対立遺伝子中に早期終止コドンを形成するか、フレームシフトは変異体対立遺伝子の転写産物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解をもたらす。

【0113】

この発明の実施の態様では、不活性化又は治療により、変異体対立遺伝子がコードする短縮型タンパク質及び機能的対立遺伝子がコードする機能的タンパク質が得られる。

【0114】

この発明の実施の態様では、細胞又は対象は、rs10414837又はrs3761005においてヘテロ接合で、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する。

【0115】

この発明の実施の態様では、細胞又は対象はrs1683564においてヘテロ接合で、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４の二本鎖切断に作用する。

【0116】

この発明の実施の態様は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するための、ＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物の使用を提供する。

【0117】

この発明の実施の態様は、ＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物を含む、細胞内での変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の不活性化に使用するため医薬であって、前記医薬は、前記細胞にＲＮＡ分子、組成物又はこの発明の方法で製造した組成物が送達される医薬を提供する。

【0118】

この発明の実施の態様は、方法、改変細胞、組成物、前記方法で製造した組成物又はこの発明のＲＮＡ分子の使用であって、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象の、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防するための使用を提供する。

【0119】

この発明の実施の態様は、ＲＮＡ分子、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞を含む、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、軽減又は予防に使用するための医薬であって、前記医薬は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に、ＲＮＡ分子、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞が送達される医薬を提供する。

【0120】

この発明の実施の態様は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、この発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するために細胞に向けられるキットを提供する。

【0121】

この発明の実施の態様は、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、この発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列；並びに、前記ＲＮＡ分子を送達するための指示書を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキットを提供する。

【0122】

この発明の実施の態様は、変異型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を細胞内で不活性化するためのキットであって、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞、及びＥＬＡＮＥ遺伝子を細胞内で不活性化するように組成物を細胞に送達するための指示書を含むキットを提供する。

【0123】

この発明の実施の態様は、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットであって、組成物、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞、及び前記組成物を送達するための指示書を含み、この発明の方法で製造した組成物又はこの発明の改変細胞は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに罹患している又は罹患する危険性のある対象に向けられるキットを提供する。

【0124】

この発明の実施の態様は、方法又はキットを提供し、この方法又はキットのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２４ヌクレオチド以上のガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２３ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい。実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２３ヌクレオチド以上のガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２１ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２３ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２４ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である。

【0125】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２１～２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きく、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３７８９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３７９０又は配列番号３７９１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３７８９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％又は８２％の配列同一性を有するか、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３７９０又は配列番号３７９１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％又は８２％の配列同一性を有する。

【0126】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物は、以下の特徴：(a) 前記組成物は水溶液中に存在する；(b) 前記組成物のｐＨは６～８である；(c) 前記組成物はＲＮａｓｅを含まない、の１つ以上を有する。

【0127】

定義
特別に定義しない限り、この明細書で使用する全ての技術用語及び／又は学術用語は、この発明に関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。この明細書に記載した方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料をこの発明の態様の実施又は試験に使用することができ、代表的な方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義が記載された明細書が優先される。さらに、材料、方法及び実施例は例示であって、必ずしも限定を意図するものではない。

【0128】

この明細書で使用する用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙した構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。特に明記しない限り、単数形で記述した場合に複数形を含むことは当業者に明らかである。したがって、この出願では、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「少なくとも１つ」は同じ意味で使用される。

【0129】

特別に具体的に言及しない限り、数量、割合又は比率を表す全ての数値、並びに明細書及び特許請求の範囲で使用する数値は、全ての場合において、用語「約」で修飾されているものとして、この教示をよく理解するために、そして教示の範囲を制限するためではなく、理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、明細書及び特許請求の範囲に示した数値は近似値であって、取得しようとする所望の特性に応じて変化する可能性がある。ともかく、各数値は、少なくとも、その有効桁数に照らして、通常の端数処理の手法を当てはめて解釈する必要がある。

【0130】

特別に言及しない限り、この発明の態様の１つ以上の条件又は特性を変更する「実質的に」や「約」といった形容詞は、その条件又は特性が、それが意図される用途の許容範囲内に限定されることを意味すると理解される。特別に示さない限り、明細書及び特許請求の範囲における単語「又は」、「若しくは」は、排他的ではなく包括的であると見なされ、それが結びつける項目の少なくとも１つ又は任意の組合せを示す。

【0131】

この出願の明細書及び特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」、「含有する（include）」及び「有する（have）」並びにそれらの組合せは、動詞の１つ以上の目的語が、１つ又は複数のオブジェクトが、動詞の１つ以上の主語のコンポーネント、要素又は一部分の完全なリストではないことを示すために使用される。この明細書で用いられる他の用語は、当該技術分野において周知の意味で規定されることを意図している。

【0132】

この明細書では、用語「ヘテロ接合一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、ある集団の一対の染色体の間で異なっているゲノム内の一つの塩基の位置を指す。この明細書では、その位置で最も共通し又は最も一般的なヌクレオチド塩基を、リファレンス（ＲＥＦ）型、野生型（ＷＴ）、一般型又は主要な型と呼ぶ。その位置であまり一般的でないヌクレオチド塩基を、オルタナティブ（ＡＬＴ）型、少数型、まれな型又はバリアント型と呼ぶ。

【0133】

ＲＮＡ分子の「ガイド配列」は、特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドの配列を指し、例えば、ガイド配列は、その長さにわたり標的ＤＮＡの配列と完全に相補的であるヌクレオチドの配列である。いくつかの態様では、ガイド配列の長さは２１～２２ヌクレオチドである。以下により詳しく説明するように、ガイド配列の長さは、例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであってもよい。ガイド配列の全長は、その長さにわたり標的ＤＮＡの配列と完全に相補的である。ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部分であってもよく、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分として機能する。ガイド配列を有するＤＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、特定の標的ＤＮＡ配列に対し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的にできる。それぞれの可能性は、別の実施の態様である。ＲＮＡ分子は、任意の配列を標的とするようにオーダーメードが可能である。

【0134】

この明細書では、用語「標的」は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸へのＲＮＡ分子のガイド配列の優先的ハイブリダイゼーションを指す。用語「標的」は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の優先的標的化が存在するように、さまざまなハイブリダイゼーション効率を包含するが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加え意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じる可能性があることが理解される。ＲＮＡ分子が配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子の複合体がヌクレアーゼ活性のために配列を標的とすることが理解される。

【0135】

複数の細胞に存在するＤＮＡ配列を標的とする場合、標的化は、ＲＮＡ分子のガイド配列と１つ以上の細胞中の配列とのハイブリダイゼーションを含み、ＲＮＡ分子と複数の細胞中の全ての細胞よりも少ない数の標的配列とのハイブリダイゼーションを含むことが理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞中の配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞の標的配列とハイブリダイズし、全ての細胞よりも少ない数で標的配列とハイブリダイズする可能性があると理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞中の標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖切断を導入し、また、全ての細胞よりも少ない数での標的配列とのハイブリダイズにより二本鎖切断を導入する可能性があると理解される。この明細書では、用語「改変細胞」は、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわちオンターゲットハイブリダイゼーションの結果、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体によって二本鎖切断がもたらされる細胞を指す。

【0136】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡガイド分子は、変異体対立遺伝子の多型部位に存在するヌクレオチド塩基に基づいて変異体対立遺伝子を標的とする可能性がある。

【0137】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～２２の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含む。

【0138】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～２５又は２１～３０の連続するヌクレオチドを有するガイド配列を含む。

【0139】

この発明の実施の態様のいずれかでは、ＲＮＡ分子のガイド配列は、２１～２２の連続するヌクレオチドを含んでいてもよく、配列番号１～３７５１で示される配列のいずれか一つ又は上記配列群からの一つの配列を含むと理解される。

【0140】

この明細書では、配列番号で示される「連続するヌクレオチド」は、介在するヌクレオチドを伴わない、ある配列番号で示されるヌクレオチド配列中の一連のヌクレオチドを指す。

【0141】

この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは２１又は２２ヌクレオチドであってもよく、配列番号１～３７５１のいずれか１つに示される配列の２１又は２２ヌクレオチドからなる。この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは２１ヌクレオチド未満であってもよい。例えば、この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドであってもよい。そのような態様では、ガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか１つに示される配列において、それぞれ、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドからなってもよい。

【0142】

この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは２１ヌクレオチドであってもよく、配列番号１～３７５１のいずれか１つに示される配列内の連続するヌクレオチドを含む。この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは２２ヌクレオチドであってもよく、配列番号１～３７５１のいずれか１つに示される配列内の連続するヌクレオチドを含む。この発明の実施の態様では、ガイド配列の塩基長は２１～３０であってもよく、配列番号１～３７５１のいずれか１つに示される配列内の連続するヌクレオチドを含む。

【0143】

この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは２２ヌクレオチドを超えてもよい。例えば、この発明の実施の態様では、ガイド配列の長さは、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであってもよい。そのような態様では、ガイド配列は、配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～２２の連続するヌクレオチド、及び標的配列の３’末端、標的配列の５’末端又は両者に隣接するヌクレオチドかその配列に完全に相補的なヌクレオチドを有する。

【0144】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイド配列を含むＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列を切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃｐｆ１）は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含まず、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。

【0145】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を更に含んでいてもよい。そのような実施の態様は、ＲＮＡ分子のガイドとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合物として設計されてもよい（Jinek (2012) Scienceを参照）。この発明の実施の態様は、また、別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む別個のＲＮＡ分子を利用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。そのような態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子とハイブリダイズでき、明細書に記載された発明の特定の用途で有利な場合がある。

【0146】

用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、塩基対形成を介してｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子に十分に相補的な配列を指す（米国特許第8906616号を参照）。この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含む。

【0147】

この発明の実施の態様に応じて、ＲＮＡ分子の長さは、最大で３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０又は１００ヌクレオチドであってもよい。それぞれの可能性は、別の実施の態様である。この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子の長さは、１７～３００、１００～３００、１５０～３００、２００～３００、１００～２００又は１５０～２５０ヌクレオチドであってもよい。それぞれの可能性は、別の実施の態様である。

【0148】

この開示において、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡの領域及び遺伝子産物の産生を調節するＤＮＡの全ての領域を含み、当該調節配列がコード配列及び／又は転写された配列に隣接しているか否かは問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位並びに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0149】

「真核生物」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0150】

この明細書では、用語HSPCは、造血幹細胞及び造血幹前駆細胞の両者を指す。幹細胞の非限定的な例には、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、多能性前駆細胞、系統制限前駆細胞（a lineage restricted progenitor cell）が含まれる。

【0151】

この明細書では、「前駆細胞」とは、幹細胞に由来する系統細胞を指し、有糸分裂能及び多能性を保持する（例えば、細胞の成熟した系統の全ての型ではないが、複数の型に分化又は発生する可能性がある）。この明細書では、「造血（hematopoiesis, hemopoiesis）」は、さまざまな種類の血球（例．赤血球、巨核球、骨髄細胞（例．単球、マクロファージ及び好中球）及びリンパ球）及び体内（例．骨髄中）の他の要素の形成及び発生を指す。

【0152】

この明細書では、用語「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断できる酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然から単離又は誘導されてもよい。天然のソースはどのような生物であってもよい。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を有する修飾タンパク質又は合成タンパク質であってもよい。遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して行うことができる。

【0153】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するヘテロ接合の多型部位を標的とするように設計されており、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するヘテロ接合の多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0154】

この開示は、疾病の原因となる変異タンパク質をコードするような変異を有する対立遺伝子（変異体対立遺伝子）と、機能性タンパク質をコードする対立遺伝子（機能性対立遺伝子）という２つの対立遺伝子を区別／識別するために、少なくとも１つの天然に存在するヌクレオチドの差異又は多型（例．一塩基多型（ＳＮＰ））を利用する方法を提供する。この方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能的タンパク質の発現を可能にする工程を更に含む。いくつかの態様では、この方法は、ドミナントネガティブな遺伝性疾患を治療、軽減又は予防するためのものである。

【0155】

この発明の実施の態様は、特定の細胞又は対象で顕性変異の対立遺伝子を発現する遺伝子において少なくとも１つのヘテロ接合ＳＮＰを利用する方法を提供する。この発明の実施の態様では、利用するＳＮＰは、疾患の表現型に関連していてもよく、又は関連していなくてもよい。この発明の実施の態様では、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異体対立遺伝子中のヘテロ接合ＳＮＰに存在するヌクレオチド塩基を標的とし、したがって、遺伝子の機能的対立遺伝子中に異なるヌクレオチド塩基を有することにより、遺伝子の変異体対立遺伝子を標的とする。

【0156】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン又はプロモーターに存在する第一のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第一のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同じ若しくは別のエクソン又はイントロンに存在する第二のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第二のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、第二のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子又は機能的対立遺伝子の両者に存在する非コード領域の配列を標的とする。

【0157】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的にし、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0158】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子のプロモーター及び／若しくは開始コドンの少なくとも一部分、並びに／又はＵＴＲの一部分を標的とする。

【0159】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子は、プロモーターの一部分、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーターに存在する第一のヘテロ接合ＳＮＰ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーターの上流に存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、第二のＲＮＡ分子は、第一のヘテロ接合性ＳＮＰの下流のＥＬＡＮＥ遺伝子中で、かつ、プロモーター、ＵＴＲ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン若しくはエクソンに存在する第二のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第一のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、前記第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第二のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0160】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子は、プロモーター内部、プロモーターの上流又はＥＬＡＮＥ遺伝子のＵＴＲに存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者のイントロンに存在する配列を標的とするように設計されている。

【0161】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両者に存在するプロモーターの上流の配列を標的とし、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の部位に存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0162】

この発明の実施の態様に応じて、変異体対立遺伝子から、疾患の原因となる変異を含むエクソンを削除することを含む方法が提供され、ここで、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、エクソンの一部分かエクソン全体に隣接する領域を標的とする。

【0163】

この発明の実施の態様に応じて、複数のエクソン、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体を削除することを含む方法が提供される。

【0164】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン又はプロモーターに存在する第一のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、かつ、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同じ若しくは異なるエクソン又はイントロンに存在する第二のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第二のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両者に存在するイントロンの配列を標的とする。

【0165】

この発明の実施の態様に応じて、第一のＲＮＡ分子又は第一及び第二のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子のエクソンとイントロンの間の選択的スプライシングされるシグナル配列を標的とする。

【0166】

この発明の実施の態様に応じて、第二のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者に存在する配列を標的とする。

【0167】

この発明の実施の態様に応じて、第二のＲＮＡ分子はイントロンを標的とする。

【0168】

この発明の実施の態様に応じて、誤りが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のメカニズムによって前記変異体対立遺伝子に挿入又は削除が生じ、前記変異体対立遺伝子の配列にフレームシフトを引き起こすことを含む方法が提供される。

【0169】

この発明の実施の態様に応じて、フレームシフトにより、変異体対立遺伝子が不活性化又はノックアウトされる。

【0170】

この発明の実施の態様に応じて、フレームシフトは変異体対立遺伝子中に早期終止コドンを形成する。

【0171】

この発明の実施の態様に応じて、フレームシフトは変異体対立遺伝子の転写産物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解をもたらす。

【0172】

この発明の実施の態様に応じて、不活性化又は治療により、変異体対立遺伝子によってコードされる短縮型タンパク質及び機能的対立遺伝子によってコードされる機能的タンパク質が生じる。

【0173】

この開示の組成物及び方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮの治療、予防、軽減又は進行を遅らせるために利用してもよい。

【0174】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的にするＲＮＡ分子を細胞に送達することによって非活性化され、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0175】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子は、プロモーターの少なくとも一部分の削除、並びに／又は開始コドン及び／若しくはＵＴＲの一部分の削除によって不活性化される。
いくつかの態様では、変異体対立遺伝子を非活性化する方法は、プロモーターの少なくとも一部分の削除を含む。そのような態様では、あるＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター内又はプロモーターの上流に存在する第一のヘテロ接合ＳＮＰを標的とするように設計されてもよく、別のＲＮＡ分子は、第一のＳＮＰの下流で、かつ、プロモーター、ＵＴＲ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン若しくはエクソンに存在する第二のヘテロ接合ＳＮＰを標的とするように設計されている。あるいは、あるＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター内、プロモーターの上流、又はＵＴＲに存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的とするように設計されてもよく、別のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者のイントロンに存在する配列を標的とするように設計されている。あるいは、あるＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子及び機能的対立遺伝子の両者に存在するプロモーターの上流の配列を標的とするように設計されてもよく、別のガイド配列は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の部位、例えば、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン、イントロン、ＵＴＲ又はプロモーターの下流に存在するヘテロ接合ＳＮＰを標的とするように設計されており、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0176】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子を非活性化する方法は、変異体対立遺伝子から疾患の原因となる変異を含むエクソンを削除することを含むエクソンスキッピング工程を含む。変異体対立遺伝子中の疾患の原因となる変異を含むエクソンを削除するには、エクソンの一部分かエクソン全体に隣接する領域を標的とする２つのＲＮＡ分子が必要である。疾患の原因となる変異を含むエクソンの削除は、野生型の活性の一部又は全てを保持する残りのタンパク質の発現を可能にしながら、タンパク質の疾患の原因となる作用を排除するように設計されてもよい。単一のエクソンスキッピングの代わりに、複数のエクソン、オープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体は、切除したい領域に隣接する２つのＲＮＡ分子を使用して切除できる。

【0177】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子を非活性化する方法は、２つのＲＮＡ分子を細胞に送達することを含み、一方のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエクソン又はプロモーターに存在する第一のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第一のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、他方のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同じ若しくは別のエクソン又はイントロンに存在する第二のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、前記ＲＮＡ分子はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在する第二のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は前記ＲＮＡ分子は変異体対立遺伝子又は機能的対立遺伝子の両者に存在するイントロンの配列を標的とする。

【0178】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異体対立遺伝子のエクソンとイントロンの間の選択的スプライシングされるシグナル配列を標的とするために使用され、それにより、変異体対立遺伝子内の選択的スプライシングされるシグナル配列を破壊する。

【0179】

変異体対立遺伝子を不活性化する上述した戦略のいずれか又は組合せを、この発明で使用してもよい。

【0180】

変異体対立遺伝子を非活性化するために、追加の戦略を使用してもよい。例えば、この発明の実施の態様では、変異体対立遺伝子におけるエラーが発生しやすい非相同末端結合メカニズムによるヌクレオチドの挿入又は削除、及びフレームシフト変異の形成につながる二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるために、ＲＮＡ分子を使用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異体対立遺伝子のエクソン又はスプライス部位に誘導する。フレームシフト変異は、(1) 変異体対立遺伝子における早期終止コドンの形成による当該遺伝子の不活性化若しくはノックアウトと、その結果の短縮型タンパク質の生成、又は (2) 変異体対立遺伝子の転写産物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解、がもたらされる可能性がある。別の態様では、１つのＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異体対立遺伝子のプロモーターに向けるために使用される。

【0181】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子を不活性化する方法は、機能性タンパク質を活性化し、活性を高めることができる、タンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチドをコードする核酸、又は化合物などの小分子を提供することなどにより、機能性タンパク質の活性を増強することを更に含む。

【0182】

いくつかの態様に応じ、この開示は目的の遺伝子の変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子（例．ヘテロ接合ＳＮＰ）との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含む配列（すなわち、機能的対立遺伝子に存在しない変異体対立遺伝子の配列）へのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼに結合し、会合し、及び／又は指向するＲＮＡ分子を提供する。

【0183】

いくつかの態様では、この方法は、目的の遺伝子の変異体対立遺伝子を対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９タンパク質）と接触させる工程を含み、前記対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及び前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）は、目的の遺伝子の機能的対立遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも１つのヌクレオチドが異なる、目的の遺伝子の変異体対立遺伝子のヌクレオチド配列と結合し、変異体対立遺伝子を改変又はノックアウトする。

【0184】

いくつかの態様では、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは目的の遺伝子をコードする細胞に導入される。いくつかの態様では、目的の遺伝子をコードする細胞は哺乳類の対象中にある。いくつかの態様では、目的の遺伝子をコードする細胞は植物中にある。

【0185】

いくつかの態様では、切断された変異体対立遺伝子は、エラーが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによって更に挿入又は削除（インデル）が生じ、変異体対立遺伝子の配列にフレームシフトが生じる。いくつかの態様では、生じたフレームシフトは、変異体対立遺伝子を不活性化又はノックアウトする。いくつかの態様では、生じたフレームシフトは、変異体対立遺伝子に早期終止コドンを形成し、短縮型タンパク質を生成する。そのような態様では、この方法により、変異体対立遺伝子がコードする短縮型タンパク質と、機能的対立遺伝子がコードする機能的タンパク質が産生される。いくつかの態様では、この発明の方法により変異体対立遺伝子中に生じたフレームシフトは、変異体対立遺伝子の転写物のナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解をもたらす。

【0186】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子は、「好中球エラスターゼ遺伝子」（elastase, neutrophil expressed gene（ＥＬＡＮＥ遺伝子））の対立遺伝子である。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ＳＣＮ又はＣｙＮ遺伝性疾患に関連する変異配列と共存する／遺伝的にリンクするＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合ＳＮＰを標的とする。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子はＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合ＳＮＰを標的とし、このＳＮＰのヘテロ接合性は集団において非常に一般的である。この発明の実施の態様では、ＲＥＦヌクレオチドは変異体対立遺伝子では一般的であるが、治療を受ける対象の機能的対立遺伝子では一般的でない。この発明の実施の態様では、ＡＬＴヌクレオチドは変異体対立遺伝子では一般的であるが、治療を受ける対象の機能的対立遺伝子では一般的でない。いくつかの態様では、変異体ＥＬＡＮＥ対立遺伝子内の疾患の原因となる変異を標的にする。

【0187】

この発明の実施の態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ遺伝子関連疾患の表現型に関係していてもよく、又は関係していなくてもよい。この発明の実施の態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ遺伝子関連疾患の表現型に関係している。この発明の実施の態様では、ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ遺伝子関連疾患の表現型に関係していない。

【0188】

いくつかの態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは目的の遺伝子のエクソンにある。そのような態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列は、目的の遺伝子のエクソンを標的とするように設計されている。

【0189】

いくつかの態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは、目的の遺伝子のイントロン又はエクソンにある。いくつかの態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは、イントロンとエクソンの間のスプライス部位にある。いくつかの態様では、ヘテロ接合ＳＮＰは、目的の遺伝子のＰＡＭサイトにある。

【0190】

当業者は、この発明の各実施態様において、この発明のそれぞれのＲＮＡ分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の目的の標的ゲノムＤＮＡ配列と結合するなどヌクレアーゼ（例．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）と複合体を形成できることを理解する。次いで、ヌクレアーゼは標的ＤＮＡを切断し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせる。そのため、この発明の実施の態様では、この発明のガイド配列及びＲＮＡ分子は、ＰＡＭサイトから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の位置を標的としてもよい。

【0191】

したがって、この発明の実施の態様では、ヌクレアーゼ（例．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）と複合体を形成したこの発明のＲＮＡ分子は、標的部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８上流又は下流の遺伝子の対立遺伝子の二本鎖切断に作用してもよい。当業者は、ヘテロ接合の多型部位が存在し、それが標的を明確に定めるために使用される場合、ＲＮＡ分子は、ヘテロ接合の多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基のみを二本鎖切断の標的とし作用するように設計されてもよいことを理解する。

【0192】

ヘテロ接合の多型部位がＰＡＭサイト内に存在する場合、ＲＮＡ分子は、ＰＡＭサイトから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の配列を標的とするように設計されてもよく、ＲＮＡ分子とヌクレアーゼの複合体は、ＰＡＭサイトのヘテロ接合の多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つのみを標的とし、ＰＡＭサイトの切断をもたらすように設計され、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ヘテロ接合の多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つを標的とするように設計されることが理解される。

【0193】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合の多型部位を標的とするように設計されており、ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子に存在するヘテロ接合の多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

【0194】

この発明の実施の態様では、ＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は医薬は、ヘテロ接合ＥＬＡＮＥ遺伝子に起因する疾患の表現型を示す対象の治療に利用される。この発明の実施の態様では、疾患はＳＣＮ又はＣｙＮである。そのような態様では、この方法は、疾患の表現型の改善、軽減又は予防をもたらす。

【0195】

この発明の実施の態様では、この発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は医薬は、ＳＣＮ又はＣｙＮの第２の治療薬と組み合わせて、対象を治療する。この発明の実施の態様では、この発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、キット又は医薬は、第２の治療薬の投与前、第２の治療薬の投与中、及び／又は第２の治療薬の投与後に投与される。

【0196】

この発明の実施の態様では、この発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は医薬は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）と組み合わせて投与される。

【0197】

上述した実施の態様は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡが、同時に、対象又は細胞で有効であることに関連している。ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡは、実質的に同時に送達することも、異なる時に送達することもできるが、同時に効果がある。例えば、これは、ＲＮＡ分子及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡが対象又は細胞に実質的に存在する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを対象又は細胞に送達することを含む。

【0198】

この発明の実施の態様に応じて、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法が提供され、前記方法は、
a) ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有し、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ以上の多型部位でヘテロ接合である細胞を選択する；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を前記細胞に導入する、
工程を含み、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する；
それによって、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を不活性化する。

【0199】

この発明の実施の態様に応じて、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法が提供され、前記方法は、
a) ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有し、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ以上の多型部位でヘテロ接合である細胞を選択する；
b) ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を前記細胞に導入する、
工程を含み、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し；かつ、
前記方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を導入することを更に含み、前記第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；
それによって、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を不活性化する。

【0200】

この発明の実施の態様に応じて、ＳＣＮ又はＣｙＮに関する変異を有するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法であって、その細胞はＥＬＡＮＥ遺伝子中のrs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合である方法が提供され、前記方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を細胞に導入することを含み、
ここで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体はＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する；
それによって、細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を不活性化する。

【0201】

この発明の実施の態様に応じて、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有し、ＥＬＡＮＥ遺伝子中のrs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択される１つ以上の多型部位においてヘテロ接合であるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を細胞内で不活性化する方法が提供され、前記方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び、
２１～３０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む第一のＲＮＡ分子
を含む組成物を前記細胞に導入することを含み、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第一のＲＮＡ分子の複合体は前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用し；かつ、
前記方法は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列を含む第二のＲＮＡ分子を導入することを更に含み、第二のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の第二の二本鎖切断に作用する；
それによって、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を不活性化する。

【0202】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第一のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能的対立遺伝子ではなく、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の二本鎖切断に作用する。

【0203】

この発明の実施の態様では、細胞は、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子中の少なくとも１つの追加の多型部位がヘテロ接合である。

【0204】

この発明の実施の態様では、ＳＣＮ又はＣｙＮに関するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する、及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象からのものであってもよい。したがって、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異を有する細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象を選択することを含んでいてもよい。この発明の別の態様では、細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象から細胞を選択することを含んでいてもよい。この発明の実施の態様では、この発明の組成物を細胞に導入することは、この発明の組成物を、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異に苦しむ対象の細胞に導入することを含んでいてもよい。

【0205】

よって、この発明の実施の態様では、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を対象の細胞内で不活性化する方法が提供され、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮをもたらすＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、rs10424470、rs4807932、rs10414837、rs376107533、rs3761010、rs351108、rs3826946、rs10413889、rs3761007、rs10409474、rs3761005、rs351107、rs3761001、rs740021、rs781452480、rs371057361、rs570466264、rs1041904080、rs7250194、rs17216649、rs199720952、rs6510983、rs17223066、rs7255385、rs9749274、rs111361200、rs112639467、rs141213775、rs28591229、rs10469327、rs3834645、rs1683564、rs71335276及びrs8107095からなる群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ以上の多型部位でヘテロ接合である対象を選択する工程を含む。

【0206】

したがって、この発明の実施の態様は、対象又は細胞をＥＬＡＮＥ遺伝子についてスクリーニングすること含む。当業者は、例えば、合成による配列決定、サンガー配列決定、核型分析、蛍光in situハイブリダイゼーション、及び／又はマイクロアレイによる試験のような限定されない例により、当該技術分野においてＥＬＡＮＥ遺伝子の変異をスクリーニングする方法を容易に理解する。この発明の実施の態様では、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、エクソンのシーケンシングによってスクリーニングされる。

【0207】

この発明の実施の態様では、対象は、末梢血中の好中球絶対数（ＡＮＣ）の測定により、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断されるか、診断された。この発明の実施の態様では、ＳＣＮは、対象が生後６月に達する前に診断されるか、診断された。この発明の実施の態様では、ＣｙＮは、生後１２～２４月、又は２４月の後に診断されるか、診断された。この発明の実施の態様では、ＳＣＮ又はＣｙＮは、１つ以上の再発性の急性口腔疾患により診断される。この発明の実施の態様では、ＳＣＮ又はＣｙＮは骨髄検査により診断され、好ましくは、骨髄検査は細胞遺伝学的骨髄検査である。この発明の実施の態様では、ＳＣＮ又はＣｙＮは、抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（Ｉｇ ＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び便中エラスターゼ）、脂溶性ビタミン量（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）の１つ以上により診断される。任意の診断方法は他の任意の診断方法と併用できることが理解される。

【0208】

この発明の実施の態様では、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象は、エクソンのシーケンシングによりスクリーニングされ、ＥＬＡＮＥ遺伝子の病原性変異が特定される。別の態様では、対象はサンガーシーケンシングによってスクリーニングされ、表１に示された少なくとも１つのＳＮＰのヘテロ接合性を確認する。この発明の実施の態様では、ＳＮＰは、rs1683564、rs10414837及びrs3761005の一つである。この発明の実施の態様では、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子上のヘテロ接合ＳＮＰのヌクレオチドは、BAC bioを使用して決定される。この発明の実施の態様では、表１に従って、適切なガイド配列が選択される。この発明の実施の態様では、選択されたガイド配列は、対象から得た細胞（例．ＰＢＭＣ）に導入され、細胞内の病原性のＥＬＡＮＥ遺伝子変異の減少は、例えば、次世代シーケンシングにより測定される。

【0209】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムは、疾患の原因となる変異に対処するために、配列特異的な方法でヌクレアーゼを標的部位に標的化することを可能にすることが理解される。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、自己複製能及び分化能を有しているので、治療の可能性がある（Yu, Natanson and Dunbar 2016）。したがって、この発明の実施の態様は、ＨＳＰＣにゲノム編集を行う。

【0210】

この発明の実施の態様では、自家療法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されたＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者の自家ＣＤ３４^＋造血幹細胞を利用する。この発明の実施の態様では、患者のアフェレーシス後、ＣＤ３４^＋細胞を、骨髄又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離する。

【0211】

ＳＣＮやＣｙＮといったドミナントネガティブな（又は複合ヘテロ接合の）適応症では、戦略は、ヘテロ接合ＳＮＰ配列を標的とすることにより変異体対立遺伝子を編集し、非変異体対立遺伝子又は他のオフターゲットでの切断を回避することである。

【0212】

この発明の実施の態様は、以下の工程：
以下の表１に示したＳＮＰの少なくとも１つでヘテロ接合性である特定され、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者の選択。この発明の実施の態様では、対象は、rs10414837、rs3761005又はrs1683564でヘテロ接合である；
候補患者の特定されたヘテロ接合ＳＮＰ位置に基づく治療戦略の選択；
吸引、又は末梢血の動員とアフェレーシスのいずれかによる、対象の骨髄からのＨＳＰＣ細胞の取得、ここで、ＨＳＰＣ細胞は場合によって処理（濃縮、刺激、及びその両者）される；
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はこれをコードする配列（例．ｍＲＮＡ）、
変異体対立遺伝子の同定されたヘテロ接合ＳＮＰ位置の特定の配列（ＲＥＦ／ＡＬＴ配列）を標的とする特徴的なＲＮＡ分子、及び
イントロン４の配列を標的とし、変異体対立遺伝子と他の対立遺伝子に共通する特徴的ではないＲＮＡ分子
を含む組成物の、ＨＳＰＣ細胞への（例えば、ex vivoエレクトロポレーションによる）導入、
これにより、ＨＳＰＣ細胞を編集して変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の発現をノックアウトする；並びに、
編集したＨＳＰＣの候補患者への導入；
を含んでいてもよい。

【0213】

この発明の実施の態様では、患者のアフェレーシス後、ＣＤ３４^＋細胞を、骨髄又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分離してもよい。ＨＳＰＣ動員後のアフェレーシスによって、患者から骨髄又はＰＢＭＣを採取してもよい。発明の実施の態様では、アフェレーシスの産物を洗浄して血小板を除去し、例えばCliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）による精製で、ＣＤ３４^＋細胞集団を濃縮してもよい。この発明の実施の態様では、選択された細胞は、ex vivoでヒトサイトカインの組換え体の混合物によって事前に刺激されてもよい。この発明の実施の態様では、細胞はエレクトロポレーションされてもよい。この発明の実施の態様では、エレクトロポレーションの前に、刺激された細胞（例．ＣＤ３４^＋細胞）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、定められた条件でプレインキュベートしてもよい。この発明の実施の態様では、細胞は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ混合物又は事前に構築されたＲＮＰ（ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質のリボヌクレアーゼタンパク質）を用いてex vivoでエレクトロポレーションし、次いで、細胞を洗浄する。この発明の実施の態様では、細胞を懸濁して最終製剤にする。この発明の実施の態様では、細胞は再懸濁してもよい。この発明の実施の態様では、再懸濁した細胞は、注入用バッグに充填してもよい。この発明の実施の態様では、バッグは、温度が制御された冷凍庫で凍結工程により凍結し、及び／又は液体窒素の気体中で保存してもよい。この発明の実施の態様では、製品を、患者の静脈内に（ＩＶ）投与してもよい。

【0214】

顕性遺伝性障害
当業者は、ヘテロ接合による任意の遺伝的障害（例．顕性遺伝的障害）を有する全ての対象に、この明細書に記載された方法を適用してもよいことを理解する。ある態様では、この発明を使用して、例えば、ＳＣＮ又はＣｙＮなどの顕性遺伝性障害に関与する、関連する、又は当該障害の原因となる遺伝子を標的にすることができる。いくつかの態様では、顕性遺伝性障害は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。いくつかの態様では、標的遺伝子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子である（Entrez Gene, gene ID No: 335）。

【0215】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＰＡＭ認識
いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその機能的バリアントから選択される。いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。そのような態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（例．Ｃｐｆ１）を誘導するＲＮＡ配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼに結合し、及び／又は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを、変異体対立遺伝子とその対応する機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチド（例．ＳＮＰ）を含む配列に誘導する。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ複合体はｔｒａｃｒＲＮＡを更に含まない。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲタンパク質である例では、顕性変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、ＲＮＡ分子がハイブリダイズするように設計されている領域内のＰＡＭサイトの内部及び／又はＰＡＭサイトの近傍に存在してもよい。当業者は、当該技術分野で一般的に知られている方法によって、ＲＮＡ分子がゲノム内の選択された標的に結合するように操作できることを理解する。

【0216】

この発明の実施の態様では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を利用して、標的認識の追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のｃｒＲＮＡとプロトスペーサー間のワトソンクリック塩基対を介してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）を標的ＤＮＡに誘導する。次いで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは標的ＤＮＡを切断し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせる。当業者は、この発明の操作された各ＲＮＡ分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の目的の標的ゲノムＤＮＡ配列、例えば、限定されない例として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）ではＮＧＧ又はＮＡＧ（ここで「Ｎ」は任意の核酸塩基である）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）ではＮＮＧＲＲＴ、Ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９ ＷＴではＮＮＮＶＲＹＭ、ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントではＮＧＡＮ又はＮＧＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲバリアントではＮＧＣＧ、ＳｐＣａｓ９－ＥＱＲバリアントではＮＧＡＧ、髄膜炎菌（ＮｍＣａｓ９）ではＮＮＮＮＧＡＴＴ、又はＣｐｆｌではＴＴＴＶといった、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの型に関連する配列に一致するＰＡＭと結合するように更に設計されていることを理解する。この発明のＲＮＡ分子は、それぞれ、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形成するように設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対応する１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して目的のポリヌクレオチド配列を標的とするように設計されている。

【0217】

いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（例．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）を使用して、細胞のゲノム内の所望の位置でＤＮＡ切断を引き起こしてもよい。最も一般的に使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲシステムに由来するが、他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼもこの明細書に記載されたゲノム編集組成物及び方法での使用が企図されている。例えば、この明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0211023号を参照。

【0218】

この発明の実施において使用してもよいＣＲＩＳＰＲシステムは、大きく異なる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、又はＶ型のシステムであってもよい。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の限定されない例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓｌ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘｌ０、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６が含まれる（例えばKoonin 2017を参照）。

【0219】

いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（例．Ｃａｓ９）に由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、連鎖球菌属sp.（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、トレポネーマ デンティコラ（Treponema denticola）、ノカルディオプシス ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリサイクロバチルス アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム シビリクム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属sp.（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノテス属sp.（Cyanothece sp.）、ミクロシスティス エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属sp.（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシラプター ベッシー（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジタートス デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difjicile）、フィネゴルディア マグナ（Finegoldia magna）、ナトロアナエロビウス サーモフィラス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム サーモプロピオニカム（Pelotomaculumthermopropionicum）、アシディチオバチルス カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属sp.（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス ワトソニー（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属sp.（Nostoc sp.）、オーロスピラ マキシマ（Arthrospira maxima）、オーロスピラ プラテンシス（Arthrospira platensis）、オーロスピラ属sp.（Arthrospira sp.）、リングビア属sp.（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属sp.（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス マリナ（Acaryochloris marina）、フランシセラ cf.ノビシダFx1（Francisella cf. novicida Fx1）、アリサイクロバチルス アシドテッレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）、オレイフィラス属sp.（Oleiphilus sp.）、バクテリウムCG09_39_24（Bacterium CG09_39_24）、デルタプロテオバクテリア バクテリウム（Deltaproteobacteria bacterium）又は既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする種に由来するものであってもよい。培養されていない細菌がコードするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼも、この発明で使用してもよい（Burstein et al. Nature, 2017を参照）。既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＰＳＲタンパク質のバリアント、例えば、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１３３５Ｅバリアント、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント、ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント、又はＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアントも、この発明で使用してもよい。

【0220】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２１～３０又は２１～２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合、切断活性を示し、上述した種に由来するかもしれない。２１ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、Mojica, F. J., et al. (1993)に記載されている。２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、Kim, E. et al. (2017)に記載されている。Mojica, F. J., et al. (1993)及びKim, E. et al. (2017)の全体及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについての具体的な説明は、この明細書に組み込まれる。そのような態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは操作されていてもよく、及び／又は天然に存在しなくてもよい。

【0221】

したがって、Ｃａｓ９タンパク質、修飾Ｃａｓ９若しくはＣａｓ９のホモログ若しくはオルソログといったＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１並びにそのホモログ及びオルソログといった他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼは、この発明の組成物で使用してもよい。

【0222】

特定の態様では、ＣＲＩＰＳＲヌクレアーゼは、天然のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有することが条件で、天然配列の断片、並びに天然配列ポリペプチドの誘導体及びその断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。この明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾物及びそれらの融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチド又はその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質又はその断片の変異体、融合物、共有結合修飾物が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｃａｓタンパク質又はその断片、及びＣａｓタンパク質の誘導体又はその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から入手してもよく、化学的に合成してもよく、又はこれら２つの方法の組合せであってもよい。細胞は、自然にＣａｓタンパク質を産生する細胞であってもよく、又は、多くの内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、若しくは、内因性のＣａｓと同じであるか異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよい。場合によっては、細胞は自然にＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。

【0223】

いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１である。Ｃｐｆ１は、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、付着末端を有するＤＮＡ二本鎖切断することによりＤＮＡを切断する。アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）及びラクノスピラ科（Lachnospiraceae）の２つのＣｐｆ１酵素は、ヒトの細胞で効率的なゲノム編集活性を有することが示されている（Zetsche et al. (2015) Cellを参照）。

【0224】

したがって、Ｃａｓ９タンパク質、修飾Ｃａｓ９若しくはＣａｓ９のホモログ、オルソログ若しくはバリアントといったＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１並びにそのホモログ、オルソログ若しくはバリアントといった他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼは、この発明で使用してもよい。

【0225】

いくつかの態様では、ガイド分子は、新規の又は改善された特性を与える１つ以上の化学修飾（例．分解に対する安定性の改善、ハイブリダイゼーションエネルギーの改善、又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼとの結合特性の改善）を含む。適切な化学修飾には、修飾塩基、修飾された糖、又は修飾されたヌクレオシド間結合の１つ以上が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な化学修飾の例には、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルシュードウリジン、「β-D-ガラクトシルケウオシン（galactosylqueuosine）」、2'- O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルシュードウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、「2,2-ジメチルグアノシン」、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、「β、D-マンノシルケウオシン（mannosylqueuosine）」、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)-N-メチルカルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、ケウオシン（queuosine）、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-ベータ-D-リボフラノシルプリン-6-イル)-カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン（wybutosine）、「3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、(ａｃｐ３)ｕ」、2'-O-メチル（Ｍ）、3'-ホスホロチオエート（ＭＳ）、3'-チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、シュードウリジン又は1-メチルシュードウリジンが含まれる。それぞれの可能性は、この発明の別の実施の態様である。

【0226】

適切な化学修飾のさらなる限定されない例には、ｍ^１Ａ（1-メチルアデノシン）；ｍ^２Ａ（2-メチルアデノシン）；Ａｍ（2′-O-メチルアデノシン）；ｍｓ^２ｍ^６Ａ（2-メチルチオ-N⁶-メチルアデノシン）；ｉ^６Ａ（N⁶-イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ^２ｉ６Ａ（2-メチルチオ-N⁶イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ^６Ａ（N⁶-(cis-ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ^２ｉｏ^６Ａ（2-メチルチオ-N⁶-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン）；ｇ^６Ａ（N⁶-グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ^６Ａ（N⁶-スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｔ^６Ａ（2-メチルチオ-N⁶-スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ^６ｔ^６Ａ（N⁶-メチル-N⁶-スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ^６Ａ（N⁶-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｈｎ^６Ａ（2-メチルチオ-N⁶-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ(ｐ)（2′-O-リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（イノシン）；ｍ^１Ｉ（1-メチルイノシン）；ｍ^１Ｉｍ（1,2′-O-ジメチルイノシン）；ｍ^３Ｃ（3-メチルシチジン）；Ｃｍ（2′-O-メチルシチジン）；ｓ^２Ｃ（2-チオシチジン）；ａｃ^４Ｃ（N⁴-アセチルシチジン）；ｆ^５Ｃ（5-ホルミルシチジン）；ｍ^５Ｃｍ（5,2′-O-メチルシチジン）；ａｃ^４Ｃｍ（N⁴-アセチル-2′-O-メチルシチジン）；ｋ^２Ｃ（リシジン）；ｍ^１Ｇ（1-メチルグアノシン）；ｍ^２Ｇ（N²-メチルグアノシン）；ｍ^７Ｇ（7-メチルグアノシン）；Ｇｍ（2′-O-メチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇ（N²,N²-ジメチルグアノシン）；ｍ^２Ｇｍ（N^2,2′-O-ジメチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇｍ（N²,N²,2′-O-トリメチルグアノシン）；Ｇｒ(ｐ)（2′-O-リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ_２ｙＷ（パーオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ^＊（中間体ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）；Ｑ（ケウオシン）；ｏＱ（エポキシケウオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル-ケウオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル-ケウオシン）；ｐｒｅＱ_０（7-シアノ-7-デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ_１（7-アミノメチル-7-デアザグアノシン）；Ｇ^＋（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ^５Ｕｍ（5,2′-O-ジメチルウリジン）；ｓ^４Ｕ（4-チオウリジン）；ｍ^５ｓ^２Ｕ（5-メチル-2-チオウリジン）；ｓ^２Ｕｍ（2-チオ-2′-O-メチルウリジン）；ａｃｐ^３Ｕ（3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ^５Ｕ（5-ヒドロキシウリジン）；ｍｏ^５Ｕ（5-メトキシウリジン）；ｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン 5-オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン 5-オキシ酢酸 メチルエステル）；ｃｈｍ^５Ｕ（5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン）；ｍｃｈｍ^５Ｕ（5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン メチルエステル）；ｍｃｍ^５Ｕ（5-メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ^５Ｕｍ（5-メトキシカルボニルメチル-2′-O-メチルウリジン）；ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ（5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン）；ｎｍ^５Ｓ^２Ｕ（5-アミノメチル-2-チオウリジン）；ｍｎｍ^５Ｕ（5-メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ（5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン）；ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ（5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン）；ｎｃｍ^５Ｕ（5-カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ^５Ｕｍ（5-カルバモイルメチル-2′-O-メチルウリジン）；ｃｍｎｍ^５Ｕ（5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ^５Ｕｍ（5-カルボキシメチルアミノメチル-2′-O-メチルウリジン）；ｃｍｍｍ^５ｓ^２Ｕ（5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン）；ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（2′-O-メチルイノシン）；ｍ^４Ｃ（N⁴-メチルシチジン）；ｍ^４Ｃｍ（N⁴,2′-O-ジメチルシチジン）；ｈｍ^５Ｃ（5-ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ^３Ｕ（3-メチルウリジン）；ｃｍ^５Ｕ（5-カルボキシメチルウリジン）；ｍ^６Ａｍ（N⁶,2′-O-ジメチルアデノシン）；ｍ^６ _２Ａｍ（N⁶,N⁶,O-2′-トリメチルアデノシン）；ｍ^２′^７Ｇ（N²,7-ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（N²,N²,7-トリメチルグアノシン）；ｍ^３Ｕｍ（3,2′-O-ジメチルウリジン）；ｍ^５Ｄ（5-メチルジヒドロウリジン）；ｆ^５Ｃｍ（5-ホルミル-2′-O-メチルシチジン）；ｍ^１Ｇｍ（1,2′-O-ジメチルグアノシン）；ｍ^１Ａｍ（1,2′-O-diメチルアデノシン）；τｍ^５Ｕ（5-タウリノメチルウリジン）；τｍ^５ｓ^２Ｕ（5-タウリノメチル-2-チオウリジン）；ｉｍＧ-１４（4-デメチルワイオシン）；ｉｍＧ２（イソワイオシン）；又はａｃ^６Ａ（N⁶-アセチルアデノシン）が含まれる。それぞれの可能性は、この発明の別の実施の態様である（例えば、米国特許第9,750,824号を参照）。

【0227】

この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２４ヌクレオチド以上のガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２３ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい。この発明の実施の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２０ヌクレオチド以下、及び／又は２３ヌクレオチド以上のガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合と比較して、２１～２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に大きい。ある態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの切断活性は、２２ヌクレオチドのガイド配列を含むＲＮＡ分子と共に使用した場合に最大である。

【0228】

ある態様では、そのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号３７８９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号３７９０又は配列番号３７９１に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0229】

変異体対立遺伝子を特異的に標的とするガイド配列
遺伝子は、数千のＳＮＰを含む場合がある。２４塩基対のターゲットウィンドウを利用して遺伝子内のそれぞれのＳＮＰを標的とするためには、数十万のガイド配列が必要となる。ＳＮＰを標的とする場合のガイド配列は、ガイド配列が分解し、活性が制限され、活性がもたらされず、又はオフターゲット効果を生じる可能性がある。したがって、遺伝子を標的とするためには、適切なガイド配列が必要である。この発明により、変異タンパク質の発現をノックアウトし、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を不活性化し、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する新規な一組のガイド配列が特定された。

【0230】

この開示は、機能的対立遺伝子を改変せずに残しながら、不活性化のために変異体対立遺伝子を特異的に標的とすることができるガイド配列を提供する。この発明のガイド配列は、変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子とを特異的に区別するように設計されており、区別する可能性が最も高い。不活性化されることが望まれる変異体対立遺伝子を標的とする全ての可能なガイド配列のうち、この明細書に開示される特定のガイド配列は、開示された態様で機能するのに特に有効である。

【0231】

簡単に説明すると、ガイド配列は以下の特性を有していてもよい：(1) 一般の集団、特定の民族の集団又は患者の集団で高保有率であり、１％を超えるヘテロ接合のＳＮＰ／挿入／削除／インデルであって、同じ集団でヘテロ接合率が１％を超えるＳＮＰ／挿入／欠失／インデルを標的とする；(2) 遺伝子の一部に近接する、例えば、遺伝子の任意の部分（例．プロモーター、ＵＴＲ、エクソン又はイントロン）から５０００塩基以内の、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置を標的とする；及び (3) 疾患／遺伝子の創始者変異又は一般的な病原性変異を標的とするＲＮＡ分子を使用する変異体対立遺伝子を標的とする。いくつかの態様では、一般の集団、特定の民族の集団又は患者の集団におけるＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの保有率は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超えており、同じ集団におけるＳＮＰ／挿入／欠失／インデルのヘテロ接合率は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超えている。それぞれの可能性は、別の実施の態様であり、自由に組み合わせることができる。

【0232】

各遺伝子について、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルにしたがい、以下の戦略のいずれかを使用して、変異体対立遺伝子を非活性化してもよい：(1) １つのＲＮＡ分子によるノックアウト戦略－１つのＲＮＡ分子を利用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異体対立遺伝子に誘導し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、変異体対立遺伝子のエクソン又はスプライス部位領域にフレームシフト変異を形成する；(2) ２つのＲＮＡ分子によるノックアウト戦略－最初のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子のプロモーター又は上流の領域を標的とし、別のＲＮＡ分子は、変異体対立遺伝子のプロモーター、エクソン又はイントロンにおける最初のＲＮＡ分子の下流を標的とする；(3) エクソンスキップ戦略－スプライス部位を破壊するために、１つのＲＮＡ分子を使用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、イントロンの５’末端（ドナー配列）又はイントロンの３’末端（アクセプター配列）のいずれかのスプライス部位領域に標的化してもよい。あるいは、第１のＲＮＡ分子がエクソンの上流領域を標的とし、第２のＲＮＡ分子が第１のＲＮＡ分子の下流の領域を標的とし、それによってエクソンを切除するように、２つのＲＮＡ分子を利用してもよい。各変異体対立遺伝子について特定されたＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置に基づいて、変異体対立遺伝子を非活性化する上述した方法のいずれか１つ又は組合せを利用してもよい。

【0233】

２つのＲＮＡ分子を使用する場合、ガイド配列は、第一のＳＮＰがエクソン１の上流、例えば５’非翻訳領域内、プロモーター内、又は転写開始部位の５’側の最初の２０００塩基内にあり、第二のＳＮＰが第一のＳＮＰの下流、例えば、転写開始部位の５’側の最初の２０００塩基内、イントロン１、イントロン２若しくはイントロン３内、又はエクソン１、エクソン２若しくはエクソン３内にある、２つのＳＮＰを標的としてもよい。

【0234】

この発明のガイド配列は、標的遺伝子の上流、好ましくは標的遺伝子の最後のエクソンの上流のＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、例えば５’非翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始部位の５’側の最初の４０００～５０００塩基内など、エクソン１の上流のＳＮＰを標的としてもよい。

【0235】

この発明のガイド配列は、既知のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に非常に近接（例．５０塩基対、より好ましくは２０塩基対内）したＳＮＰを標的としてもよい。

【0236】

この発明のガイド配列は、(1) 標的遺伝子のヘテロ接合ＳＮＰ；(2) 当該遺伝子の上流及び下流のヘテロ接合ＳＮＰ；(3) 一般の集団、特定の民族の集団又は患者の集団におけるＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの保有率が１％を超えるＳＮＰ；(4) グアニン－シトシン含量が３０％を超え８５％未満である；(5) チミン／ウラシルの繰り返しが４以上でない、又はグアニン、シトシン若しくはアデニンの繰り返しが８以上でない；(6) オフターゲット分析によるオフターゲットが存在しない；及び (7) 好ましくは、イントロンの上流又はＳＮＰの下流ではなく上流にある標的エクソン、を標的としてもよい。

【0237】

この発明の実施の態様では、ＳＮＰは遺伝子の上流又は下流にあってもよい。この発明の実施の態様では、ＳＮＰは遺伝子の上流又は下流３０００塩基対以内にある。

【0238】

変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、目的遺伝子の上流、下流又は疾患の原因となる変異の配列内にあってもよい。変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、目的遺伝子のエクソン内又はイントロン内にあってもよい。いくつかの態様では、変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、目的遺伝子のエクソン内にある。いくつかの態様では、変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、目的遺伝子のイントロン又はエクソン内にあり、イントロンとエクソンとの間のスプライス部位に近接（例．スプライス部位の上流又は下流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）している。

【0239】

いくつかの態様では、少なくとも１つのヌクレオチドは一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの態様では、変異体対立遺伝子の各ＳＮＰのヌクレオチドバリアントを発現させてもよい。いくつかの態様では、ＳＮＰは創始者変異又は一般的な病原性変異であってもよい。

【0240】

ガイド配列は、(1) 一般の集団で保有率が高く（例．１％超）；かつ、(2) ヘテロ接合性率が高い（例．１％超）ＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、グローバルに分散しているＳＮＰを標的としてもよい。ＳＮＰは創始者変異又は一般的な病原性変異であってもよい。いくつかの態様では、一般の集団における保有率は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。それぞれの可能性は、別の実施の態様である。いくつかの態様では、集団におけるヘテロ接合率は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。それぞれの可能性は、別の実施の態様である。

【0241】

いくつかの態様では、変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、疾患の原因となる、集団での保有率の高い変異に関連している／共存している。そのような態様では、「保有率が高い」とは、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を指す。それぞれの可能性は、この発明の別の実施の態様である。ある態様では、変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、疾患に関連する変異である。いくつかの態様では、ＳＮＰは集団内で非常に一般的である。そのような態様では、「非常に一般的」とは、集団の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％を指す。それぞれの可能性は、この発明の別の実施の態様である。

【0242】

この発明のガイド配列は、上記基準のいずれか１つを満たしていてもよく、変異体対立遺伝子と対応する機能的対立遺伝子を区別する可能性が最も高い。

【0243】

図５は、ヒトにおけるＥＬＡＮＥ遺伝子ＳＮＰ選択の異型遺伝子性を示す。

【0244】

この発明の実施の態様は、プロモーター領域を上流のＳＮＰ位置からイントロン４まで切除することを含んでいてもよい。ある態様では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略１ａ－rs10414837、戦略１ｂ－rs3761005）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする（図１）。

【0245】

この発明の実施の態様は、イントロン４から３’ＵＴＲの下流の領域まで切除することを含んでいてもよい。ある態様では、第一のガイド配列は、変異体対立遺伝子の上流の領域におけるヘテロ接合ＳＮＰ（戦略２－rs1683564）の配列を標的とし、第二のガイド配列は、遺伝子の２つの対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。

【0246】

この発明の実施の態様は、イントロン４から３’ＵＴＲの下流の領域まで切除することを含んでいてもよい（図４）。この戦略は、健康な対立遺伝子を無傷で残しながら、疾患の原因となる対立遺伝子（変異体対立遺伝子）を特異的にノックアウトするように設計されている。対立遺伝子に特異的な編集は、集団内の比較的高いヘテロ接合性頻度で識別可能な（ヘテロ接合）ＳＮＰを標的とするガイド配列を使用することにより行われる。

【0247】

細胞への送達
具現化された方法では、明細書に記載したＲＮＡ分子及び組成物は、適切な手段により標的の細胞又は対象に送達されてもよいことが理解される。以下の態様は、この発明のＲＮＡ分子及び組成物の送達方法の限定されない例である。

【0248】

いくつかの態様では、この発明のＲＮＡ分子の組成物は、哺乳動物細胞又は植物細胞を含む、ドミナントネガティブ対立遺伝子を含む及び／又は発現する細胞を標的としてもよい。例えば、ある態様では、ＲＮＡ分子は、変異体ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を特異的に標的とし、標的細胞は肝細胞である。

【0249】

この発明の核酸組成物、例えば、ＲＮＡ分子組成物は、適切なウイルスベクター系を用いて送達してもよい。従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、核酸及び標的組織を導入することができる。特定の態様では、in vivo又はex vivoでの遺伝子治療で使用するために核酸を投与する。非ウイルスベクター送達系には、裸の核酸、及びリポソーム又はポロキサマーといった送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。遺伝子治療方法の総説については、Anderson (1992) Science 256:808-813；Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217；Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166；Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175；Miller (1992) Nature 357:455-460；Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154；Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36；Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44；Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.)及びYu et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26を参照。

【0250】

核酸及び／若しくはタンパク質の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、粒子銃加速、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、人工ウイルス粒子、及び薬剤で増強された核酸の取込み、が含まれ、又は、バクテリア若しくはウイルス（例．アグロバクテリウム属、根粒菌sp. NGR234、シノリゾビウム メリロティ（Sinorhizoboiummeliloti）、メソリゾビウム ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ静脈モザイクウイルス）により、植物細胞に届けられる（例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4を参照）。例えば、Sonitron 2000 system（Rich-Mar）を用いるソノポレーションも、核酸の送達に使用できる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性脂質媒介送達も、in vivo又はin vitro送達方法として考えられている（Zuris et al. (2015) Nat. Biotechnol. 33(1):73-80を参照；Coelho et al. (2013) N. Engl. J. Med. 369, 819-829；Judge et al. (2006) Mol. Ther. 13, 494-505及びBasha et al. (2011) Mol. Ther. 19, 2186-2200も参照）。

【0251】

他の代表的な核酸送達系には、Amaxa Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）及びCopernicus Therapeutics Inc.が提供するものが含まれる（例えば、米国特許第6,008,336号を参照）。リポフェクチンは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号及び第4,897,355号に説明されており、リポフェクチンの試薬は市販（例．トランスフェクタム（登録商標）、リポフェクチン（登録商標）及びリポフェクタミン（登録商標）RNAiMAX）されている。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質には、Felgnerのもの、国際公開第91/17424号、国際公開第91/16024号が含まれる。送達は、細胞（ex vivo投与）又は標的組織（in vivo投与）に行うことができる。

【0252】

免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の製造は、当業者に周知である（例えば、Crystal (1995) Science 270:404-410；Blaese et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297；Behr et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389；Remy et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654；Gao et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722；Ahmad et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820；米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号及び第4,946,787号を参照）。

【0253】

追加の送達方法には、送達される核酸をEnGeneIC送達ビヒクル（ＥＤＶ）内にパッケージングすることが含まれる。これらのＥＤＶは、標的組織に特異性を有するアームとＥＤＶに特異性を有するアームを有する二重特異性抗体により、標的組織に特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いで、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞に入った後、内容物が放出される（MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照）。

【0254】

核酸を送達するＲＮＡ又はＤＮＡウイルスの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化した方法を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与する（in vivo）ことも、in vitroで細胞を処理するために使用して改変細胞を患者に投与する（ex vivo）こともできる。核酸を送達するウイルスによる従来の系には、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス及び単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0255】

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染でき、通常、ウイルス力価が高いレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性の長い末端反復配列で構成されている。最小のシス作用性のＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分で、治療用遺伝子を標的細胞に統合し、導入遺伝子を恒久的に発現するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが含まれる（例えば、Buchschacher et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739；Johann et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640；Sommerfelt et al. (1990) Virol. 176:58-59；Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378；Miller et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224；国際出願番号PCT/US94/05700を参照）。

【0256】

少なくとも６種のウイルスベクターが現在、臨床試験における遺伝子導入で利用でき、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥のあるベクターの補完を含むアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。

【0257】

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ-Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al. (1995) Blood 85:3048-305；Kohn et al.(1995) Nat. Med. 1:1017-102；Malech et al. (1997) PNAS 94:22 12133-12138）。PA317/pLASNは、遺伝子治療の臨床試験で使用された最初の治療用ベクターであった（Blaese et al. (1995)）。ＭＦＧ-Ｓパッケージベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察された（Ellem et al. (1997) Immunol Immunother. 44(1):10-20；Dranoff et al. (1997) Hum. Gene Ther. 1:111-2）。

【0258】

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染できるウイルス粒子を形成するのに使用される。このような細胞には、アデノウイルス、ＡＡＶ及びＰｓｉ-２細胞をパッケージ化する２９３細胞、又はレトロウイルスをパッケージ化するＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージ化するプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、通常、パッケージングと（該当する場合）その後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる他のウイルス配列を含む。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、通常、パッケージング及びホストゲノムへの統合に必要なＡＡＶゲノムの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージされており、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含むが、ＩＴＲ配列を欠く。細胞株は、アデノウイルスにもヘルパーとして感染している。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列を欠くため、ヘルパープラスミドは大量にパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理により低減できる。さらに、ＡＡＶはバキュロウイルス系を使用して臨床利用の規模で生産できる（米国特許第7,479,554号を参照）。

【0259】

多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターは特定の組織に対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面にリガンドをウイルス被覆タンパク質との融合タンパク質として発現させることにより、ウイルスベクターを改変して特定の細胞に特異性を持たせることができる。目的の細胞に存在することが知られている受容体と親和性のあるリガンドが選択される。例えば、Han et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変でき、組換えウイルスがヒト上皮成長因子受容体を発現するヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞のペアに拡張できる。例えば、繊維状ファージは、事実上選択した細胞受容体に対して特異的な結合親和性を有する抗体断片（例．ＦＡＢ又はＦｖ）を提示するように操作できる。これらの説明は主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利な特定の取込み配列を含むように操作できる。

【0260】

遺伝子治療ベクターは、以下に説明するように、通常、全身投与（例．硝子体内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用によって、個々の患者に投与することによりin vivoで送達できる。あるいは、ベクターは、個々の患者の外植された細胞（例．リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）又はユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にex vivoで送達でき、次いで、通常、ベクターが組み込まれた細胞を選択した後、患者に再移植される。

【0261】

診断、研究又は遺伝子治療のための（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入による）ex vivo細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい態様では、細胞は、対象生物から単離され、核酸組成物がトランスフェクトされ、そして対象生物（例．患者）に再注入される。ex vivoトランスフェクションに適したさまざまな細胞は、当業者に周知である（例えば、Freshney et al. (1994) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 3rd ed 及び、患者から細胞を単離し、培養する方法の考察でそこに引用されている文献を参照）。

【0262】

そのような細胞又はそのような細胞から生成された細胞株の限定されない例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例．ＣＨＯ-Ｓ、ＣＨＯ-Ｋ１、ＣＨＯ-ＤＧ４４、ＣＨＯ-ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ-ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８-Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０-Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例．ＨＥＫ２９３-Ｆ、ＨＥＫ２９３-Ｈ、ＨＥＫ２９３-Ｔ）、ｐｅｒＣ６細胞、植物細胞（分化又は未分化）、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera Frugiperda、Ｓｆ）などの昆虫細胞、又はサッカロミセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）及びシゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）などの真菌細胞が含まれる。特定の態様では、細胞株はＣＨＯ-Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、初代細胞を単離し、誘導ヌクレアーゼ系（例．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）による処置後に治療される対象に再導入するためにex vivoで使用してもよい。適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び、限定されるものではないが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞といった他の血液細胞が含まれる。適切な細胞には、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４^＋）、神経幹細胞及び間葉系幹細胞などの幹細胞も含まれる。

【0263】

ある態様では、幹細胞は、細胞のトランスフェクション及び遺伝子治療のためにex vivoで使用される。幹細胞を使用する利点は、in vitroで他の細胞型に分化できること、又は骨髄に生着する（細胞のドナーなどの）哺乳動物に導入できることである。ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮγ及びＴＮＦαなどのサイトカインを使用して、in vitroでＣＤ３４^＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞に分化させる方法が知られている（例として、Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)を参照）。

【0264】

幹細胞は、形質導入及び分化のために既知の方法で単離される。例えば、幹細胞は、不要な細胞（例．ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５^＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ-１（顆粒球）、Ｉａｄ（分化した抗原提示細胞））に結合する抗体で骨髄細胞をパンニングすることにより、骨髄細胞から分離される（例として、Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照）。いくつかの態様では、改変された幹細胞も使用してもよい。

【0265】

通常、細胞は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与される。「薬学的に許容される」というフレーズは、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症がなく、合理的なリスク／ベネフィットバランスに見合った、健全な医学的判断の範囲内でヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物及び／又は製剤を指す。「薬学的に許容される担体」というフレーズは、この明細書では、液体又は固体の賦形剤、希釈剤、添加剤又は溶媒封入材料などの、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを意味する。

【0266】

明細書に記載したＲＮＡ分子及び組成物は、有糸分裂後の細胞や活発に分裂していない細胞（例．停止細胞）のゲノム編集に適している。この発明のＲＮＡ分子及び組成物を使用して編集できる有糸分裂後の細胞の例には、肝細胞が含まれるが、これには限定されない。

【0267】

治療用の核酸組成物を含むベクター（例．レトロウイルス、リポソーム、他）は、in vivoで細胞に形質導入するために生物に直接投与することもできる。投与は、注射、注入、局所適用（例．点眼及びクリーム）及びエレクトロポレーションを含むがこれらには限定されない、分子を最終的に血液又は組織細胞と接触させるために通常使用される経路によって行われる。そのような核酸を投与する適切な方法は、利用可能で当業者に周知であり、そして、複数の経路によって特定の組成物を投与できるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも迅速で効果的な反応を提供できる。いくつかの態様に応じ、組成物は静脈注射により送達される。

【0268】

免疫細胞（例．Ｔ細胞）への遺伝子の導入に適したベクターには、非組込みレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、米国特許出願公開第2009/0117617号を参照。

【0269】

薬学的に許容される担体は、一部は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用する方法によって決まる。したがって、以下で説明するように、利用できる医薬組成物のさまざまな適切な製剤がある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照）。

【0270】

いくつかの態様に従い、目的の遺伝子の変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子で異なる少なくとも１つのヌクレオチド（例．ＳＮＰ）を含む配列（すなわち、機能的対立遺伝子には存在しない変異体対立遺伝子の配列）に、結合／会合する、及び／又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを前記配列に向けるＲＮＡ分子が提供される。配列は疾患に関連する変異の内部に存在してもよい。配列は疾患に関連する変異の上流又は下流に存在してもよい。変異体対立遺伝子と機能的対立遺伝子との間の配列の相違は、この発明のＲＮＡの標的となり、変異体対立遺伝子を不活性化するか、機能的対立遺伝子の活性を維持しながら、その優勢な疾患の原因となる効果を無効にしてもよい。

【0271】

開示された組成物及び方法は、患者の顕性遺伝性障害を治療する医薬の製造に使用してもよい。

【0272】

明細書に開示された態様の作用機序
ＳＣＮ又はＣｙＮにつながることが実証されたＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、短縮型Ｎ末端タンパク質を生成する代替のインフレームＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を翻訳し、ＥＲ及びタンパク質の誤った折り畳みストレスを引き起こす。

【0273】

理論やメカニズムに拘束されるものではないが、この発明は、変異した病的対立遺伝子の発現の防止、変異した病的対立遺伝子からの短縮型の非病的ペプチドの生成、又は、ＳＣＮ若しくはＣｙＮの予防、軽減若しくは治療のための変異した病的ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の修復／修正など、機能的ＥＬＡＮＥ対立遺伝子ではなく変異した病的ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の処理にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適用するために利用してもよい。

【0274】

ＯＲＦの上流及び下流に位置するＳＮＰを利用する別の編集戦略を適用してもよい。戦略には、遺伝子全体の排除、遺伝子のＣ末端を除外する遺伝子の短縮化、及び遺伝子の発現の減弱が含まれる。

【0275】

いくつかの態様では、２つのガイド配列（例．表１に示したガイド配列）を利用して、遺伝子全体（すなわち、エクソン１、２、３、４及び５）を除去して、変異タンパク質をノックアウトしてもよい。いくつかの態様では、第一のガイドＲＮＡは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子のＯＲＦの上流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列を標的として、対立遺伝子特異的ＤＳＢを引き起こすために利用され、かつ、第二のガイドＲＮＡは、エクソン５若しくはＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列で、イントロン４、３’ＵＴＲ若しくはＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子の下流に位置する配列で、又は、イントロン４、３’ＵＴＲ若しくはＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子の下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列で、ＤＳＢを引き起こすために、利用されてもよい。

【0276】

エクソン３で翻訳が終止する終止コドンが生じるフレームシフト変異を有する健康な個人がいる。したがって、見込みのある戦略は、多くてもエクソン１から３を含むように、変異した対立遺伝子を短縮することであってもよい。いくつかの態様では、２つのガイド配列（例．表１に示したガイド配列）を利用して、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子のＣ末端を切除してもよい。いくつかの態様では、第一のガイドＲＮＡは、エクソン５若しくは変異体対立遺伝子の下流のＳＮＰ／ＷＴ配列を標的として、対立遺伝子特異的ＤＳＢを引き起こすために利用されてもよく、かつ、第二のガイドＲＮＡは、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン１、２若しくは３に位置する配列、又はＳＮＰ／ＷＴ配列でＤＳＢを引き起こすために利用されてもよい。短縮された変異体対立遺伝子によってコードされるペプチド／タンパク質は、病的な効果を示さない可能性がある。あるいは、ナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解が誘発され、変異体対立遺伝子の発現がノックアウトされてもよい。結果は、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調べることで確認できる。

【0277】

いくつかの態様では、ＯＲＦの上流に位置するＳＮＰを利用して、近位のプロモーター及びエンハンサー領域から要素を切除することにより、変異体対立遺伝子の発現を弱めてもよい。例えば、ＳＮＰを標的としてエンハンサー領域の大部分を切除することによって、大幅な減少を達成してもよい。

【0278】

ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子を特異的に標的とするＲＮＡガイド配列の例
多数のガイド配列が変異体対立遺伝子を標的とするように設計が可能であるが、この明細書に記載した方法を効果的に実施し、対立遺伝子を効果的に区別するために、配列番号１～３７５１で特定された以下の表１に示すヌクレオチド配列を具体的に選択した。

【0279】

表１は、上述した態様で記載したように使用するために、変異体ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の配列内のさまざまなＳＮＰと結合するように設計されたガイド配列を示す。各操作されたガイド分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧ又はＮＡＧ（Ｎは任意の核酸塩基）に一致するＰＡＭの隣にある標的ゲノムＤＮＡ配列と結合するように更に設計されている。ＳｐＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．１（ＰＡＭ配列：ＮＧＡＮ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭ配列：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（ＰＡＭ配列：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭ配列：ＮＧＣＧ）、ＳａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆ１（ＰＡＭ配列：ＴＴＴＶ）又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＮＶＲＹＭ）を含むがこれらには限定されない１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて作動するように設計されている。この発明のＲＮＡ分子は、それぞれ１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形成するように設計され、利用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼそれぞれに対応する１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して、ポリヌクレオチド配列を標的とするように設計される。

【0280】

【表1-1】

【0281】

【表1-2】

【0282】

【表1-3】

【0283】

【表1-4】

【0284】

上述した態様について、この明細書で開示した各態様は、他の開示した各態様に適用可能であると考えられる。例えば、この発明のＲＮＡ分子又は組成物は、この発明のいずれかの方法で利用可能であることが理解される。

【0285】

この明細書では、全ての見出しは単に整理のためのものであって、開示を限定することを意図するものではない。個々のセクションの内容は、全てのセクションに等しく適用される場合がある。

【0286】

この発明の完全な理解を容易にするために、以下に実施例を示す。以下の実施例は、この発明を実施する代表的なモードを示す。しかし、この発明の範囲は、これらの実施例に開示された特定の態様に限定されず、例示のみを目的としている。

【0287】

さらに、以下の実施例は、ＳｐＣａｓ９と前記ＳｐＣａｓ９の標的を開示されたＳＮＰ位置とするのに適したガイド配列を利用する方法を開示する。実施例は、開示された戦略のフィージビリティを示す。当業者は、同じガイド配列を別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共に使用して、開示されたＳＮＰを標的にして、各戦略を適用できることを理解する。さらに、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的を同じＳＮＰとする別のガイド配列を他のヌクレアーゼと一緒に使用して、各戦略を適用できる。

【実施例】

【0288】

実施例１ ＳｐＣａｓ９と組み合わせて作動し、ＳＮＰを標的とするのに適したガイド配列及び開示した戦略に準拠する配列のスクリーニング
ＨｅＬａ細胞を９６穴プレート（３Ｋ／ウェル）に播種した。２４時間後、Turbofect試薬（Thermo Scientific）を使用して、６５ｎｇのＷＴ-Ｃａｓ９又はＤｅａｄ-Ｃａｓ９と、２０ｎｇのｇ３６からｇ６６として特定したｇＲＮＡプラスミドを細胞に導入し、ＥＬＡＮＥ遺伝子のさまざまな領域及びＳＮＰを標的とした。１２時間後、新鮮な培地を添加し、導入の７２時間後にゲノムＤＮＡを抽出し、Ｃａｓ９が標的とすると予想される領域を増幅した。産物のサイズは、ＤＮＡラダー標準を用い、キャピラリー電気泳動によって分析した。バンドの強度は、Peak Scannerソフトウェアv1.0を使用して分析した。編集の割合（％）は、以下の式で計算した：
１００％－（編集されていないバンドの強度／全バンドの強度）×１００
図６は、３回の実験における、Ｄｅａｄ-Ｃａｓ９バックグラウンド活性を引いた後の各ｇＲＮＡの平均活性±ＳＤを表す。

【0289】

【表2】

【0290】

実施例２ 切除戦略のフィージビリティの実証
ＳｐＣａｓ９-ＷＴ及びＲＮＡのペア（ｓｇ３５（ＩＮＴ４）と、戦略１ａではｇ３９（rs10414837）、戦略１ｂではｇ５８（rs3761005）、戦略２ではｇ６２（rs1683564））をＨｅＬａ細胞に移入した。トランスフェクションの７２時間後にｇＤＮＡを抽出し、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）キット（10042958及び10031228、Bio-Rad Laboratories）を使用して、エクソン１（戦略１）又はエクソン５（戦略２）のコピー数の減少を測定することにより、切除効率を評価した。さらに、エクソン１を戦略２の切除率の正規化に使用し、エクソン５を戦略１の切除率の正規化に使用した。表３に示した結果は、２回の実験の平均切除％±ＳＤ（標準偏差）を表す。

【0291】

【表3】

【0292】

実施例３ さまざまなｓｇＲＮＡで編集した対立遺伝子識別の評価
リボヌクレオプロテイン複合体（ＲＮＰ）は、製造元の指示に従って、リファレンス配列を標的とするｇＲＮＡと、Integrated DNA Technology（IDT）で購入したＷＴ-Ｃａｓ９（＃1081058）又はＨｉＦｉ Ｃａｓ９（＃1081060）から構築した。次いで、4D-Nucleofecor（登録商標）系（Lonza）を使用して、ＲＮＰをＳＮＰを含むｉＰＳＣにヌクレオフェクトした。７２時間後、ｇＤＮＡを抽出し、ＳＮＰ領域を増幅し、ＮＧＳ分析を行った。リファレンス対立遺伝子及びオルタナティブ対立遺伝子で検出された編集率（％）に従い、対立遺伝子の識別を評価した。Cas-Analyzerソフトウェアを使用して、各部位のインデル頻度を計算した。結果を表４にまとめる。

【0293】

【表4】

【0294】

実施例４ ＨＳＣにおける編集効率
ＳｐＣａｓ９-ＷＴのＲＮＡ成分と、ＥＭＸ１（sgEMX1）又はＥＬＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：rs3761005；ｇ６２：rs1683564）のいずれかを標的とするｇＲＮＡを、健康なドナーのＨＳＣにヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの７２時間後にｇＤＮＡを抽出し、アンプリコン分析によるインデル検出（ＩＤＡＡ）で編集量を分析した。図７は、２回の実験における平均編集率（％）±ＳＤを表す。

【0295】

実施例５ 機能成熟アッセイ
編集された細胞における表現型のレスキューを証明するために、患者の人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）から始める成熟アッセイが、再プログラムされた体細胞から準備される。細胞は、患者の細胞の再生可能な供給源であり、疾患の表現型を正確に複製する。簡単に説明すると、リプログラミング遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｌ-Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４及びＳＶ４０ＬＴを発現するエピソームを患者のＰＢＭＣに移入する。市販のキット（STEMdiff（登録商標）Hematopoietic Kit, STEMCELL Technologies）を使用して、患者のｉＰＳＣ及び同じＳＮＰ遺伝子型を有する正常なｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させる。分化の１２日後、細胞における前駆細胞マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５の発現をフローサイトメトリーで分析することによって効率を推定する。正常な前駆細胞及び分化したＳＣＮ前駆細胞を遺伝子編集し、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ-３及び好中球への分化を促進するＧＭ-ＣＳＦを含む馴化培地で５日間増殖させる。編集されたＳＣＮ細胞は好中球に分化するが、編集されていないＳＣＮ由来の細胞は初期の分化段階で停止する。フローサイトメトリーで好中球表面マーカー（例．ＣＤ１６、ＣＤ６６ｂ及び汎骨髄性マーカーＣＤ３３のアップレギュレーション）を検出することによって、好中球への分化の効率を測定する。

【0296】

実施例６ 免疫不全マウスによるin vivoでの予備的な用量の探索及び生体内分布の実験
投与スケジュール、用量及び投与経路を調べ、Ｇ-ＣＳＦ投与後の免疫不全ＮＳＧマウスにおける自己複製及び多系統能力を有するＨＳＣの存在と数を決定する。再増殖アッセイを行い、機能的な免疫系を再生し、長期の生着を確立できるＨＳＣの存在と数を決定する。このような検証には、ヒトの生着と造血の再増殖を大いにサポートするＮＳＧ系統を使用する。ＮＳＧマウスはＮＯＤ ＳＣＩＤマウスで、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠き、いくつかのサイトカインのシグナル伝達経路が不十分で、自然免疫に多くの欠陥がある。一次移植の１６週間後に移植を評価する（移植後１２週後の分析）。

【0297】

ＮＳＧマウスによる１６週間の予備的な生体内分布の実験では、用量と最大期間を調査し、いくつかの細胞用量で行われる。この実験は３つの用量で行い、編集されていないＳＣＮ細胞が投与されたマウスも含む。予備的実験の期間は１６週間であるが、２つの高用量群のうちの１つは最大で６月継続する。予備的実験ではマウスは６月間生存し、重要な生体内分布実験の期間は６箇月である。実験中、ｑＰＣＲ及び免疫組織化学による発現の持続も調べる。

【0298】

実施例７ 免疫不全マウスによる重要な生体内分布実験
重要な生体内分布の実験はＮＳＧマウスを利用し、実施例６の予備的な用量の探索に従う。この実験は、Good Laboratory Practice（ＧＬＰ）に準拠して行われ、重要な非臨床薬物動態、薬力学及び毒物学の実験である。毒性の評価は、ＨＳＣ注入後の、死亡率、臨床観察、体重、臓器重量、臨床病理及び病理解剖に基づく。

【0299】

遺伝子編集されたＣＤ３４^＋細胞のＮＳＧマウスへの移植は、内因性の骨髄を枯渇し、ドナー細胞の生着を可能にするための移植前処置が必要である。したがって、臨床状況を模倣するために、ブスルファンによる前処置が採用される。一群当たり１０匹のオスとメスのマウスからなる３つの群（遺伝子編集された細胞、編集されていない細胞及びブスルファンのみの対照）を用いる。

【0300】

ＮＳＧモデルマウスはヒトの好中球が枯渇した状況と完全には類似していないものの、ex vivoで遺伝子編集された細胞のin vivo注入の前に、マウスはブスルファンで処置されて骨髄の機能が消耗されているので、遺伝子編集したＣＤ３４^＋細胞の生体内分布の実験で使用するモデルの有効性には影響しない。好中球枯渇マウス系統、Ｌｙｚ２^{Ｃｒｅ／Ｃｒｅ}Ｍｃｌ－１^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}（Ｍｃｌ－１^{ΔＭｙｅｌｏ}）における骨髄細胞白血病１（Ｍｃｌ-１）抗アポトーシスタンパク質は、Ｍｃｌ-１の骨髄特異的欠失が非常に重度の好中球減少症を引き起こすことを示す（Csepregi et al. 2018）。Ｍｃｌ-１^{ΔＭｙｅｌｏ}マウスは繁殖が可能で、特定の病原体が除かれた条件と従来の飼育条件の両者の生存率は正常に近い。しかし、ＮＳＧマウスとは対照的に、Ｍｃｌ-１^{ΔＭｙｅｌｏ}モデルマウスの経験は限られている。

【0301】

実施例８ 編集の分析
高いオンターゲット活性を有する配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含むガイド配列をスクリーニングする。ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によってオンターゲット活性を決定する。

【0302】

配列番号１～３７５１のいずれか一つに示されるヌクレオチド配列を含む２１～３０の連続するヌクレオチドを含むガイド配列が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の修正に適していることが、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によって判明している。

【0303】

実施例９ ＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子特異的ノックアウトの有効性
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子のイントロン４及びエクソン５の切除により行われる。これは、図８で説明するように、イントロン４でＤＳＢを行い、対立遺伝子に特異的なＤＳＢを行うためにＳＮＰrs1683564を利用することによって達成される。この戦略により、ＨＳＣが成熟した機能的な好中球に効果的に分化できることを実証するために、健康なドナーに、イントロン４のそれぞれのＳＮＰ（表１を参照）を標的とするｇ３５及びｇ６２を含むＲＮＰを有するＨＳＣ（Lonza）でヌクレオフェクトする。陽性対照として編集していない細胞を使用する。ヌクレオフェクションの４８時間後、公開されている手順（Zhenwang Jie, et al. Plos One 2017）に従って、ＨＳＣを好中球に分化させる。編集した細胞と編集していない細胞の分化効率は、好中球特異的マーカーＣＤ６６ｂ及びＣＤ１７７で染色後、ＦＡＣＳで測定する。
ＨＳＣ由来の好中球の機能を評価するために、以下の分析を行う：
１．食作用は、EZCell（登録商標）Phagocytosis Assay Kit（BioVision）で分析する。このキットは、フローサイトメトリーによるin vitroでの食作用の迅速かつ正確な検出及び定量化のために、事前に標識されたザイモサン粒子を利用する。
２．殺傷アッセイは、ＨＳＣ由来の好中球を大腸菌とインキュベートし、細菌を寒天プレートに播種してコロニーを形成させることによって行う。対照として、未処理の細菌又は分化していないＨＳＣとインキュベートした細菌を使用する。殺傷効率を以下の式：
（好中球のコロニー数／対照のコロニー数）×１００
で計算する。
３．走化性は、EZCell（登録商標）Cell Migration/Chemotaxis Assay Kit（Biovision）で分析する。

【0304】

実施例１０ 治療対象の選択
工程１：エクソンのシーケンシングにより、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された４人の患者Ａ～Ｄをスクリーニングし、ＥＬＡＮＥ遺伝子中のＥＬＡＮＥ病原性変異を特定する。
工程２：変異が特定された対象をサンガーシーケンシングによってスクリーニングし、rs1683564、rs10414837及びrs3761005の少なくとも１つのヘテロ接合性を確認する。
工程３：rs1683564、rs10414837及びrs3761005の少なくとも１つがヘテロ接合であると判断された各対象について、BAC bioにより、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異体対立遺伝子上のヘテロ接合ＳＮＰのヌクレオチドを決定する。
工程４：表５に示した適切なガイド配列を選択する。選択されたガイド配列の長さを、ヘテロ接合ＳＮＰを標的とするために使用するヌクレアーゼに基づいて決定する。例えば、ＳｐＣａｓ９は、ガイド配列が２０ヌクレオチドのＲＮＡ分子と組み合わせて使用される。別の例では、ＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼは、ガイド配列が２２ヌクレオチドのＲＮＡ分子と組み合わせて使用される。

【0305】

【表5】

【0306】

工程５：選択したガイド配列をそれぞれの対象から得たＨＳＣに導入し、次世代シーケンシングによってＨＳＣにおける病原性ＥＬＡＮＥ遺伝子変異の減少を確かめる。患者Ａ～Ｄの方法論を以下に示す：
１．工程１の方法で患者Ａをスクリーニングし、患者の表現型及び臨床状態と一致する、ＥＬＡＮＥ遺伝子に既知の病原性変異があることが判明する。工程２の方法で患者ＡのＳＮＰの近傍をスクリーニングし、３つのＳＮＰ（rs10414837、rs1683564及びrs3761005）の全てについてホモ接合であることが判明する。患者Ａは治療の条件を満たさないと判断される。
２．既知の病原性ＥＬＡＮＥ変異について患者Ｂを確かめる。工程２の方法で患者Ｂをスクリーニングし、ＳＮＰrs1683564及びrs10414837についてホモ接合であることがわる。患者Ｂは、プロモーター領域のrs3761005についてヘテロ接合であることがわかる。患者Ｂは治療に適格であると判断される。工程３の方法で、病原性ＥＬＡＮＥ変異と同じ対立遺伝子（連鎖決定）に存在するＳＮＰのヌクレオチドが決定される。患者Ｂは、ＥＬＡＮＥ病原性変異と同じ対立遺伝子上のＳＮＰrs3761005がリファレンス塩基であることがわかる。g58refは、このＳＮＰに完全に相補的で、イントロン４の非コード領域に向けられたg35と組み合わせて選択される。工程４によれば、選択されたガイド組成物は、一組のガイドg58ref及びg35を含む。患者ＨＳＣのＮＧＳによる工程５の方法で、選択したガイドの組合せを使用した変異体対立遺伝子の切除の成功を確かめる。
３．患者Ｃは、幼児期から重度の好中球減少症である。工程Ａのスクリーニングでは、ＥＬＡＮＥ遺伝子に病原性の変異は見られない。患者Ｃは治療の条件を満たさないと判断される。
４．患者Ｄは、ＥＬＡＮＥ遺伝子に既知の病原性変異を有することが確かめられ、工程２によるＳＮＰの遺伝子型判定で、３つのＳＮＰのうち２つでヘテロ接合－－rs10414837とrs1683564の両者がヘテロ接合で、rs3761005はホモ接合－－であることがわかる。遺伝子操作に使用することが可能な２つのＳＮＰから選択される。選択するために、工程３を行い、ＳＮＰと病原性変異の関係を決定、つまり、ＳＮＰのどのヌクレオチド（リファレンス又はオルタナティブ）がＥＬＡＮＥ病原性変異と同じ対立遺伝子に存在するかを決定する（ＳＮＰプレゼンテーション）。患者Ｄのrs10414837はリファレンスと判断され、sg39refは使用に適していると判断される。ＳＮＰrs1683564を参照することで、オルタナティブがＥＬＡＮＥ病原性変異に関連することがわかり、sg62altが使用に適したガイド配列であると判断される。これらの各ガイド配列を、g35と組み合わせて使用する。工程４により、二組のガイド配列：sg39ref＋g35及びg62alt＋g35を特定する。どちらのガイド配列の組合せが好ましいかを判断するために、編集特性のデータベース並びに各ガイド配列及び一組のガイド配列の編集プロパティと特性を、オフターゲット及び編集効率を決定するために評価する。データベース評価に基づいて一組のガイド配列を選択し、ＨＳＣのＮＧＳによる工程５を行う。

【0307】

実施例１１ ２１及び２２ヌクレオチドのガイド配列で活性が改善されたヌクレアーゼ
ＣＲＩＳＰＲリピート（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ヌクレアーゼ及びＰＡＭ配列を、環境試料の配列のさまざまなメタゲノムデータベースから予測した。ＣＲＩＳＰＲリピート、ｔｒａｃＲＮＡ配列及びヌクレアーゼ配列が予測された細菌の種／株のリストを表６に示す。

【0308】

【表6】

【0309】

ＯＭＮＩヌクレアーゼの構築
同定された潜在的なＯＭＮＩ候補のオープンリーディングフレームを、大腸菌及びヒト細胞株での発現のためにコドン最適化した。大腸菌に最適化したＯＲＦを、細菌プラスミドｐｂ-ＮＮＣにクローニングし、ヒトに最適化したものはｐｍＯＭＮＩプラスミドにクローニングした（表７）。

【0310】

【表7】

【0311】

最適化されたＤＮＡ配列によってコードされるＯＭＮＩヌクレアーゼの哺乳類細胞における発現
最初に、ＯＭＮＩ-５０タンパク質をコードする最適化されたＤＮＡ配列の哺乳類細胞における発現を検証した。そのために、Jet-optimus（登録商標）トランスフェクション試薬（ポリプラストランスフェクション）を使用して、Ｐ２ＡペプチドによってｍＣｈｅｒｒｙに結合させたＨＡタグ付きＯＭＮＩヌクレアーゼ又は化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードする発現ベクター（ｐｍＯＭＮＩ、表７）をＨｅＬａ細胞に導入した。Ｐ２Ａペプチドは、細胞内で組換えタンパク質の切断を誘導できる自己切断ペプチドであり、ＯＭＮＩヌクレアーゼとｍＣｈｅｒｒｙは発現時に分かれ、ｍＣｈｅｒｒｙは発現ベクターからのＯＭＮＩの転写効率の指標として機能する。フローサイトメトリーにより、活性アッセイにおけるＯＭＮＩ-５０の転写量を決定した。

【0312】

内因性のゲノム標的対するヒト細胞の活性
ＯＭＮＩ-５０の、ヒト細胞の特定のゲノム位置での編集を促進する能力についても分析した。そのため、ＯＭＮＩ-５０を、ヒトゲノムの特定の位置を標的とするように設計されたｓｇＲＮＡと共にＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした（ｐｍＧｕｉｄｅ、表７）。７２時間後、細胞を回収し、その半分を、マーカーとしてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を用いたＦＡＣＳによるトランスフェクション効率の定量化に使用した。残りの細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡの対応する推定ゲノム標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＮＧＳにかけ、得られた配列を使用して、各標的部位における編集の割合を計算した。切断部位の周囲の短い挿入又は欠失（インデル）は、ヌクレアーゼによって誘発されたＤＮＡ切断後のＤＮＡ末端の修復の代表的な結果である。したがって、編集の割合を、各アンプリコン内の配列を含むインデルの割合から推定した。全ての編集の値を、各実験で得たトランスフェクション及び翻訳効率に対して正規化し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の割合から推定した。正規化された値は、ヌクレアーゼを発現した細胞集団内の効果的な編集量を表す。それぞれが異なるゲノム位置を標的とするように設計された１１のユニークなｓｇＲＮＡのパネルを用いて、ＯＭＮＩ-５０のゲノム活性を評価した。これらの実験の結果を表８にまとめる。表から理解できるように、ＯＭＮＩ-５０は、試験を行った全ての標的部位で、陰性対照と比較して、著しく高い編集量を示す。

【0313】

【表8-1】

【0314】

【表8-2】

【0315】

ヒト細胞における固有忠実度
ヌクレアーゼの固有忠実度は、その切断特異性の尺度である。高忠実度ヌクレアーゼは、意図していない標的（オフターゲット）の切断を最小限とするか、行わずに、意図された標的（オンターゲット）の切断を促進するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼでは、ガイドＲＮＡのスペーサーに対する配列の相補性に基づいて標的を取得する。オフターゲティングは、意図しない標的とスペーサーの配列の類似性に起因する。ヒト細胞のゲノムレベルでのＯＭＮＩの固有忠実度を、オンターゲット領域及び事前に検証済みのオフターゲット領域の両者について、ＰＣＲ増幅、ＮＧＳ及びインデル分析に続いて、説明した活性アッセイを行うことにより測定した。ＯＭＮＩ-５０の固有忠実度の実測値を図９に示す。ここでは、個別に２つのガイドＲＮＡを使用してＯＭＮＩ-５０の忠実度を測定し、いずれの場合も、参照としてＳｐＣａｓ９の実測値も示す。第一の部位を、ｃｈｒ１９のＥＬＡＮＥ遺伝子の上流をオンターゲットとし、ｃｈｒ１５をオフターゲットとしたELANE g35 gRNA（表８）を使用して標的とした。図９が示すように、ＯＭＮＩ-５０によるオン／オフターゲット編集効率の比は４１：０で、ＳｐＣａｓ９のオン／オフ比は６．８：１である（それぞれ、４０．９％／０％；１８．６％／２．７％）。第二の部位を、ELANE g62 gRNA（表８）で標的とした。このｇＲＮＡスペーサー配列は、ｃｈｒ１９のＥＬＡＮＥ遺伝子をオンターゲットとし、ｃｈｒ１をオフターゲットとする。この場合、ＯＭＮＩ-５０によるオン／オフ比は７２：１で、ＳｐＣａｓ９では１．７：１の比であった（それぞれ、３８．９％／０．６％；４３．１％／２５．８％）。これらの結果は、ＯＭＮＩ-５０がヒトの細胞環境でＳｐＣａｓ９と比較して有意に高い固有忠実度を有することを示す。

【0316】

タンパク質の精製
ＯＭＮＩ-５０のオープンリーディングフレームを細菌発現プラスミド（T7-NLS-OMNI-NLS-HA-His-tag、pET9a、表７）にクローニングし、Ｃ４３細胞（Lucigen）で発現させた。細胞をＴＢ（Terrific Broth）中で対数期中期まで増殖し、温度を１８℃に下げた。０．６ＯＤに１ｍＭのＩＰＴＧを使用して１６～２０時間発現を誘導し、細胞を採取して－８０℃で凍結した。ペースト状の細胞をＥＤＴＡフリーの完全プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII（Calbiochem）を加えた溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール ｐＨ８．０、１ｍＭのＴＣＥＰ）に再懸濁した。超音波処理により細胞を溶解し、透明な溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂と共にインキュベートした。樹脂を自然落下式カラムに充填し、洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール ｐＨ８．０、１ｍＭのＴＣＥＰ）で洗浄し、ＯＭＮＩタンパク質を１００～５００ｍＭのイミダゾールを添加した洗浄バッファーで溶出した。ＯＭＮＩタンパク質を含む画分を集めて濃縮し、セントリコン（Amicon Ultra 15ml 100K、Merck）にロードし、緩衝液をＧＦ緩衝液（５０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン、０．４Ｍのアルギニン）に交換した。濃縮したＯＭＮＩタンパク質を、ＳＥＣ（HiLoad 16/600 Superdex 200 pgを備えたAKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）で、５０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン、０．４Ｍのアルギニンを使用）によって更に精製した。ＯＭＮＩタンパク質を含む画分を集め、濃縮し、最終保存緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン及び１ｍＭのＴＣＥＰ）と共にセントリコン（Amicon Ultra 15ml 100K、Merck）にロードした。精製したＯＭＮＩタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素で急速凍結し、－８０℃で保存した。

【0317】

ＲＮＰ活性アッセイによるガイド配列の最適化
ＯＭＮＩ-５０の合成ｓｇＲＮＡを、３’及び５’末端に３つの2'-O-メチル3'-ホスホロチオエート（Agilent）を使用して合成した。さまざまなスペーサー長（１７～２３ヌクレオチド）のガイド３５を有するＯＭＮＩ-５０ ＲＮＰの活性アッセイ（表９、図１０Ａ）。簡単に説明すると、４ｐｍｏｌのＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼと６ｐｍｏｌの合成ガイド配列を混合した。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体と１００ｎｇのオンターゲットのテンプレートを反応させた。スペーサー長が２２塩基より大きいもののみが、オンターゲットテンプレートのほぼ完全な切断を示す。さらに、スペーサー長が２０～２３ヌクレオチドの量を減らしたＲＮＰ（４、２、１．２、０．６及び０．２ｐｍｏｌ）を１００ｎｇのＤＮＡ標的テンプレートと反応させた（図１０Ｂ）。スペーサー長が２２ヌクレオチドのものは、ＲＮＰが低濃度であっても優れた切断活性を示す。

【0318】

【表9-1】

【0319】

【表9-2】

【0320】

【表9-3】

【0321】

スペーサー長の最適化を、細胞株でも行った。１００μＭのヌクレアーゼと１２０μＭのさまざまなスペーサー長（１７～２３ｎｔ、表４）の合成ガイド配列及び１００μＭのＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（IDT）と混合することにより、ＲＮＰを構築した。室温で１０分間インキュベートした後、ＲＮＰ複合体を２００,０００個の事前に洗浄したＵ２ＯＳ細胞と混合し、Lonza SE Cell Line 4D-Nucleofector（登録商標）XキットとDN100プログラムを使用し、取扱説明書に従ってエレクトロポレーションした。７２時間後に細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡの対応する推定ゲノム標的をＰＣＲで増幅した。アンプリコンをＮＧＳにかけ、得られた配列を使用して編集の割合を計算した。図１０Ｃが示すように、スペーサー長が１７～１９塩基では編集率は低く、スペーサー長が２０塩基では編集率は中程度で、スペーサー長が２１～２３塩基は編集率が最高である。

【0322】

同じ細胞株を使用して、トレーサーＲＮＡ修飾のさまざまなバージョンも試験した（表９）。ｓｇＲＮＡのさまざまなバージョンは、スペーサー長が２０塩基で試験を行った。図１０Ｄが示すように、ｓｇＲＮＡのＶ１、Ｖ２又はＶ３を使用したＲＮＰ構築物の編集率は同程度である。一方、ｓｇＲＮＡのＶ４を使用したＲＮＰ構築物の編集率は大幅に高い。

【0323】

編集効率におけるＯＭＮＩ-５０のガイド配列長の影響もｉＰＳ細胞で試験した。さまざまなスペーサー長（１７～２３ｎｔ、表４）のガイド配列を有するＯＭＮＩ-５０ ＲＮＰ複合体を細胞にヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクションの７２時間後に細胞を回収し、ｇＤＮＡを、標的遺伝子内の内因性ゲノム領域を増幅するｓｇ３５オンターゲットプライマーを使用する、部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅とキャピラリーゲル電気泳動分析に使用した。キャピラリーゲル電気泳動のデータは、全編集率の決定に使用した。図１１が示すように、スペーサー長が１９ヌクレオチドでは編集率はバックグラウンド（ＮＴ）と同様であり、スペーサー長が２０ヌクレオチドでは編集率は中程度で、スペーサー長が２１～２３ヌクレオチドは編集率が最も著しく、上述したin vitroのＵ２ＯＳを用いた実験と一致する。

【0324】

実施例１２ ＥＬＡＮＥ編集組成物の検証
上述したように、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、主として常染色体顕性障害である重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）の原因である。以下に、ＥＬＡＮＥ変異体対立遺伝子を差次的にノックアウトすることによる治療の例を示す。これは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲの下流に位置するヘテロ接合のＳＮＰrs1683564を標的とし、エクソン５と３’ＵＴＲの切除につながるイントロン４の２つの対立遺伝子の切断し、ＥＬＡＮＥ変異体対立遺伝子の転写産物を不安定にすることによって達成される（図１５）。

【0325】

患者由来のＣＤ３４^＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の治療としてのＥＬＡＮＥ編集組成物を検証するために、分化の手順を確立した。この手順は、健康なボランティアのＨＳＣと好中球にＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する患者のＨＳＣをin vitroで分化させることによって、好中球減少症の患者で観察される内因性の欠陥を再現する（図１６Ａ）。好中球分化能の障害は、Ｇ２２１終止（Ｇ２２１ｔｅｒ）又はＳ１２６ＬのＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を行っていない患者のＨＳＣで明らかになり、ＳＣＮ患者の造血障害と一致して、健康なドナーと比較して、ＣＤ１４^＋単球が４倍増加し、ＣＤ６６ｂ^＋好中球が半分に減少した（図１６Ｂ；図１７Ａ左のパネル）。

【0326】

治療用組成物が好中球の分化と成熟の欠陥をレスキューするかどうかを理解するために、Ｇ２２１ｔｅｒ変異を有し、rs1683564でホモ接合の患者のＨＳＣを編集して、ＥＬＡＮＥ遺伝子の下流領域を切除した。ＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼ及びsgRNA-564DS-ref（sg62-REF）＋sgRNAコンスタント（sg35）で構築されたＲＮＰを用いて行い、２つの対立遺伝子がノックアウトした。次いで、編集した細胞を好中球に分化させた。切除されたＨＳＣは分化の欠陥がレスキューされ、ＣＤ１４^＋ＣＤ６６ｂ^＋細胞が１００％増加し、単球が健康なドナーの正常レベルにまで減少した。分化の５日目及び１４日目における切除効率は、健康なドナーが両者の時点において４０％で一定であったのとは対照的に、患者では、３０％から４５％に変化し、５０％増加した。これは、修正された細胞にとって好ましい治療上の利点を示唆する（図１６Ｂ～Ｄ）。

【0327】

次に、治療用組成物について、ＯＭＮＩ-５０、rs1683564リファレンスを標的とするsgRNA-564DS-ref又はオルタナティブ配列を標的とするsgRNA-564DS-altで構築されたＲＮＰを、イントロン４を標的とするsgRNAコンスタントと共に用いて、Ｓ１２６Ｌ変異を有する患者のＨＳＣ及び正常なＨＳＣであって、両者ともrs1683564でヘテロ接合であるＨＳＣで試験した。Ｓ１２６Ｌ変異に関連するrs1683564リファレンスを標的とするＥＬＡＮＥの単一対立遺伝子をノックアウトする組成物は、ＥＬＡＮＥ変異体対立遺伝子の欠失をもたらし、観察された分化異常を大幅にレスキューし、ＣＤ１４^＋ＣＤ６６ｂ^＋細胞の１００％の増加と単球を正常に減少させることにつながる。特に、rs1683564オルタナティブを標的とするＥＬＡＮＥの単一対立遺伝子をノックアウトする組成物は、野生型のＥＬＡＮＥ対立遺伝子の欠失をもたらし、ＣＤ１４^＋ＣＤ６６ｂ^＋細胞の５０％の増加と、単球の５０％の減少という中間のレスキュー表現型を示した（図１７Ａ及び１７Ｂ）。分化の４日目と１４日目における切除の割合は、オルタナティブ対立遺伝子よりもリファレンス対立遺伝子で高く、切除効率は、それぞれ、約２５％、約４０％であった（図１７Ｃ）。

【0328】

オルタナティブガイド配列とリファレンスガイド配列の切除効率の不一致を更に理解するために、各ガイド配列の対立遺伝子特異性を試験した。sgRNA-564DS-altは高度な特異性を示したのに対して、sgRNA-564DS-refは、主にリファレンス対立遺伝子の編集とある程度のオルタナティブ対立遺伝子の編集によって表される異なる編集を示した。これは、rs1683564を標的とする２つのガイド配列間の高度な切除効率を説明する（図１７Ｄ）。

【0329】

ＥＬＡＮＥ遺伝子のｍＲＮＡの量に対する切除の影響を評価するために、分化した細胞から全ＲＮＡを抽出し、切除されなかった領域に対応するプライマーを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによりＥＬＡＮＥ遺伝子のｍＲＮＡの量を測定した。正常細胞及び患者細胞におけるリファレンス切除組成物及びオルタナティブ切除組成物によるＲＮＡの不安定化のため、ＥＬＡＮＥ遺伝子のｍＲＮＡが、未処置の細胞と比較して、５０％以上の減少した（図１７Ｅ）。加えて、編集された対立遺伝子の減少をＮＧＳで決定した。sgRNA-564DS-refを使用して切除を行った場合、変異体ＥＬＡＮＥ対立遺伝子のｃＤＮＡの読み取りが減少し、sgRNA-564DS-altを使用した場合、野生型ＥＬＡＮＥ対立遺伝子のｃＤＮＡの読み取りが減少した。この結果は、両者の切除が異なる方法でＥＬＡＮＥ遺伝子の発現を減少することを強調する（図１７Ｆ）。

【0330】

【表10】

【0331】

これらの結果は、切除によるレスキューは、患者由来のＨＳＣ中の好中球の分化に影響することを示し、これらの組成物は強力なＳＣＮ治療薬として機能することを実証する。

【0332】

実施例１３ ＥＬＡＮＥ遺伝子に関連するＳＣＮの治療に関するｓｇＲＮＡを用いたＯＭＮＩ-５０のオフターゲットの分析
ＯＭＮＩ-５０のオフターゲット活性を明らかにするために、GUIDE-Seq法を用いた。これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び生細胞内の他のＲＮＡがガイドするヌクレアーゼ（ＲＧＮ）によって引き起こされるＤＮＡのオフターゲットゲノム編集のin vitroでの偏りのない検出を可能にする分子生物学技術である。ヒトの生細胞のゲノムのＲＮＡがガイドするヌクレアーゼ（ＲＧＮ）である平滑末端ＣＲＩＳＰＲが誘導するＤＳＢは、ＮＨＥＪと一致する末端結合工程により、これらの切断部位で、平滑末端二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の組込みによってタグ付けされる。ゲノムＤＮＡのｄｓＯＤＮ組込み部位は、偏りのない増幅と大規模なＮＧＳにより、ヌクレオチドレベルで正確にマッピングされる。

【0333】

この実験では、Ｕ２ＯＳ細胞株を使用し、以下のｄｓＯＤＮ配列：
ＡＴＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡＡＣ（配列番号３８３１）（１００ｐｍｏｌ）を組み込んだ。ＥＬＡＮＥ遺伝子コンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-refガイド配列について試験した。

【0334】

実験は２回行い、大規模な次世代シーケンシングによって配列決定した。GUIDE-Seqライブラリーの調製は、Tsai et al., Nat Biotechnology, 2015を一部改変して行った。シーケンシングの結果は、Tsai et al., Nat Biotechnology (2015)に記載の「GUIDE-Seq analysis」で分析した。GUIDE-Seq読み取り数でソートした、識別されたオフターゲットは、最終的に出力する表で注釈を付ける。図１８に示すように、色分けしたシーケンスグリッドで検出したオフターゲット部位のアラインメントを視覚化する。

【0335】

リピートの結果を一つの表に統合し、rhAmpseqテクノロジー（IDT）で検証するオフターゲットを選択した。rhAmpseqシステムは、イルミナプラットフォームでのシーケンシング用に多重化されたパネルを使用した標的のアンプリコンのシーケンシングを可能にする。

【0336】

rhAmpseqパネルの生成では、GUIDE-seq analysisで得られた最終的なオフターゲット表に以下のフィルターを適用した。

【0337】

【表11】

【0338】

最終的なパネルには、以下のオフターゲットが存在した。

【0339】

【表12】

【0340】

ＥＬＡＮＥ遺伝子コンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-refガイド配列用に生成されたパネルを使用し、IDT rhAmpseqプロトコルによって、オフターゲットを検証した。ＳｐＣａｓ９又はＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼを上記ＲＮＡガイド配列と共に使用して、Ｕ２ＯＳ細胞を編集した（図１９及び図２０）。NextSeq PE150シーケンサーでrhAmpseqライブラリーをシーケンシングし、IDTパイプラインで分析した。

【0341】

図１９及び２０に示した結果は、ＳｐＣａｓ９と比較して、ＯＭＮＩ-５０はオンターゲット活性及び特異性が高いことを示す。sgコンスタントについて分析した１１０のオフターゲットについて、ＯＭＮＩ-５０は、１つのサイト（ＯＴ-２）でのみ編集活性が０．５％を超えたのに対し、ＳｐＣａｓ９では、６０以上のサイトで超えた。sgRNA-564DS-Refの場合、ＯＭＮＩ-５０はＳｐＣａｓ９よりもオンターゲット活性が高く、また、編集率が０．５％を超えたのは、２５のオフターゲット部位のうち２つだけであったのに対し、ＳｐＣａｓ９では１４の部位で編集率が０．５％を超えた。

【0342】

さらに、コンスタントガイド配列若しくはsgRNA-564DS-refで、又はコンスタントガイド配列及びsgRNA-564DS-Altガイド配列で処置した患者由来のＨＳＣのオフターゲットパネルを検証した（図１７で説明する例を参照）。図１５に示すように、これにより、エクソン５及び３’ＵＴＲが切除される。検討した１１０のターゲットにおいて、コンスタントガイド配列ではオフターゲットは確認されなかったことが示された（図２１）。sgRNA-564DS-refガイド配列及びsgRNA-564DS-Altガイド配列では、各パネルで１つのオフターゲットが確認された（図２２及び図２３）。これらの結果は、ＯＭＮＩ-５０ヌクレアーゼの高い忠実度を強調する。

【0343】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2022553855000001.app

【国際調査報告】