特表 2022-553932 薬物複合体形成の部位特異的な定量化の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-27

(54)【発明の名称】薬物複合体形成の部位特異的な定量化の方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221220BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221220BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221220BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221220BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221220BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20221220BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

A61K47/68 ZNA

A61K45/00

A61K47/65

A61P35/00

A61K39/395 E

A61K39/395 T

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022522821

(86)(22)【出願日】2020-10-19

(85)【翻訳文提出日】2022-05-16

(86)【国際出願番号】 US2020056368

(87)【国際公開番号】W WO2021077106

(87)【国際公開日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】62/916,876

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/043,756

(32)【優先日】2020-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．パイレックス

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ヤン シャンクン

【テーマコード（参考）】

2G045

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045BA13

2G045DA36

2G045DA37

2G045DA80

2G045FA40

2G045FB01

2G045FB06

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE59

4C084AA17

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB26

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

プロテアーゼによって支援される薬物脱複合体形成、リンカー標識、および質量分析を用いた、抗体薬物複合体の薬物複合体形成を部位特異的に定量化または特性評価する方法であって、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の特定の複合体形成部位に連結されたアタッチメントを、複合体形成が含む、方法。この方法は、アタッチメントの一部分を切断して、切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成し、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加させ、次いで、試料を質量分析に供して、切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含むペプチドまたはタンパク質を同定することを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程を含む、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法：
切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、前記少なくとも１つのアタッチメントの一部分を切断する工程であって、前記アタッチメントが、前記切断されたリンカーを含む、工程；
前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程；
前記切断されたリンカーおよび／または前記修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、前記試料を質量分析に供する工程。

【請求項2】

前記少なくとも１つのアタッチメントが、リンカーおよびペイロードを含み、前記アタッチメントの、切断された部分が、前記ペイロードを含み、前記リンカーが、前記切断されたリンカーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記切断されたリンカーおよび前記修飾されたリンカーの定量化に基づいて、前記アタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記質量分析が、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、
前記質量分析器を、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができ、
前記質量分析器が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記アタッチメントの一部分を切断するのに先立って、および／または前記複合体形成していない複合体形成部位に、前記修飾されたリンカーを付加するのに先立って、前記ペプチドまたはタンパク質を酵素で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記試料を前記質量分析に供するのに先立って、前記試料を酵素で処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

酵素、プロテアーゼ、化学物質、酸、塩基、または還元剤を用いて、前記アタッチメントの前記一部分を切断する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記複合体形成していない複合体形成部位に、前記修飾されたリンカーを付加する前記工程が、前記アタッチメントの前記一部分を切断する前記工程を実行するのに先立って実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記アタッチメントの前記一部分を切断する前記工程が、前記修飾されたリンカーを付加する前記工程および前記試料を前記質量分析に供する前記工程を実行するのに先立って実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記修飾されたリンカーの分子量が、前記切断されたリンカーの分子量と異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記酵素がトリプシンである、請求項５に記載の方法。

【請求項12】

パパイン、カテプシンＢ、またはプラスミンを用いて前記アタッチメントの前記一部分を切断する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記酵素がＧｌｕ－Ｃである、請求項６に記載の方法。

【請求項14】

前記特定の複合体形成部位または前記複合体形成していない複合体形成部位が、前記ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基の内部に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記アタッチメントが、マレイミド付着基を通じて、前記少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結されている、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ペプチドまたはタンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記リンカーが、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド含有リンカー、ピロリン酸ジエステルリンカー、またはヒドラゾンリンカーである、請求項２に記載の方法。

【請求項18】

前記リンカーがペプチドを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項19】

前記リンカーが、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項20】

前記リンカーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項21】

前記リンカーが、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項22】

前記修飾されたリンカーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記修飾されたリンカーが、マレイミド付着基を通じて、前記複合体形成していない複合体形成部位に付加される、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、請求項２に記載の方法。

【請求項25】

前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式Ｉ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒがリンカーであり、Ｘがペイロードである、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記リンカーが、ポリエチレングリコールを含み、前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式ＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ_１が、スペーサーであり、Ｒ_２が、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３が、－ＣＨ_３、または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２であり、Ｘが、ペイロードである、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記スペーサーが、ポリエチレングリコールを含み、前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式ＩＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ_１が、第１のスペーサーであり、Ｒ_２が、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３が、－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２であり、Ｒ_４が、第２のスペーサーであり、Ｘが、ペイロードである、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のスペーサーが、ポリエチレングリコールを含み、前記第２のスペースが、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）を含み；前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

以下の工程を含む、試料中の部分的に複合体形成したタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法：
切断されたリンカーを含有するタンパク質を生成するために、第１の酵素を用いて前記少なくとも１つのアタッチメントの一部分を切断する工程であって、前記アタッチメントが、前記切断されたリンカーを含む、工程と；
ペプチド混合物を得るために、前記試料を第２の酵素に供する工程と；
切断されたリンカーを含有するペプチドおよび／または切断されたリンカーを含有しないペプチドの定量化または特性評価に基づき、前記少なくとも１つの特定の複合体形成部位を定量化または特性評価するために、前記ペプチド混合物を質量分析に供する工程。

【請求項32】

前記少なくとも１つの特定の複合体形成部位が、前記タンパク質のリシン残基の内部に位置する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記少なくとも１つのアタッチメントが、リンカーおよびペイロードを含み、前記少なくとも１つのアタッチメントの切断された部分が、前記ペイロードを含み、前記リンカーが、前記切断されたリンカーを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記質量分析が、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、
前記質量分析器を、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができ、
前記質量分析器が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記ペプチド混合物を前記質量分析に供するのに先立って、前記ペプチド混合物を第３の酵素で処理する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記第１の酵素が、パパイン、カテプシンＢ、もしくはプラスミンである；および／または前記第２の酵素が、Ｇｌｕ－Ｃもしくはトリプシンである、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

前記第３の酵素が、Ａｓｐ－ＮまたはＧｌｕ－Ｃである、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記タンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記リンカーが、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

分野
本出願は概して、プロテアーゼによって支援される薬物脱複合体形成と質量分析とを用いて抗体薬物複合体の薬物複合体形成を部位特異的に定量化または特性評価する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、生物学的に活性な薬物、例えば薬物ペイロードを、リンカーを通じて付着させるアタッチメントを有する抗体を含む。ＡＤＣの開発は、薬効を向上させる戦略であるが、これは、抗体が標的細胞の特定の部位に結合することができることで、生物学的に活性な薬物を標的細胞に効率的に送達することが可能になるからである。ＡＤＣを用いて、標的癌細胞への化学療法薬物の送達の大幅な向上が達成されている。

【0003】

抗体の多価性、およびアミノ酸とリンカー分子との間の非特異的親電子反応に起因してＡＤＣの調製が困難である可能性がある。ＡＤＣの一般的な分布プロファイルは、ＡＤＣと、複合体形成していない抗体と、複合体形成していない薬物ペイロードとの混合物を含有する。複合体形成していない抗体の存在下では、標的細胞に送達可能な薬物の量が減少する可能性があるが、これは、複合体形成していない抗体が、標的抗原に対して、薬物複合体形成した抗体と競合するからである。通常、誘導されるＡＤＣは、変動する薬物抗体比（ＤＡＲ）と、複合体形成した複合体形成部位および複合体形成していない複合体形成部位を含む様々な複合体形成部位とを有する様々なＡＤＣ種を含有する、高度に不均質な種である。ＡＤＣの不均質性は、望ましくないＡＤＣ種の存在に起因して、薬物の安全性と有効性に顕著な影響を及ぼす可能性がある。所望のＡＤＣ製剤は、明確に定められたＤＡＲと、ある程度の均質性とを含んでいるのが望ましい。可変ＤＡＲを有するＡＤＣの部位特異的な薬物複合体形成の定量化および特性評価、例えば薬物複合体形成の部位特異的な定量化は、ＡＤＣ製剤の品質属性を制御するための重要な過程であり、この品質属性は、ＡＤＣの有効性に直接影響し得るものである。

【0004】

質量分光法（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー結合質量分光法（ＬＣ－ＭＳ）およびイメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）が、ＡＤＣ混合物の特性評価に使用されてきた（Ｗａｇｈ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，１０：２，２２２－２４３，２０１８，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（非特許文献１））。しかし、ＡＤＣの不均質性の複雑さに起因して、ＡＤＣの特性評価に向けた薬物複合体形成の部位特異的な定量化には、実質的な難題が存在する。

【0005】

明確に定められたＤＡＲと薬物の安全性および有効性に関連するある程度の均質性とを保証するためにＡＤＣを特性評価する方法、特にＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化および／または特性評価を求める要望が存在することは認識されよう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｗａｇｈ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，１０：２，２２２－２４３，２０１８，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ

【発明の概要】

【0007】

概要
本出願は、抗体薬物複合体の薬物複合体形成を部位特異的に定量化および／または特性評価する方法を提供するものであり、複合体形成は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の特定の複合体形成部位に連結されたアタッチメントを含む。ＤＡＲの幅広い変動と、抗体上の付着場所の不十分な制御とに起因して、薬物抗体複合体形成に使用される連結化学に関する課題が存在する場合がある。得られるＡＤＣは、様々なＡＤＣ種を含有する高度に不均質な混合物である可能性がある。異なる部位での部位特異的な薬物複合体形成を定量化する難題が残っており、所望のＡＤＣ製剤は、明確に定められたＤＡＲと、ある程度の均質性とを含むのが望ましい。

【0008】

本開示は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法であって：切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、アタッチメントの一部分を切断する工程であって、アタッチメントが、切断されたリンカーを含む、工程と；部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程と；切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、試料を質量分析に供する工程と、を含む方法を提供する。いくつかの態様では、アタッチメントの一部分は、パパイン、カテプシンＢ、またはプラスミンを用いて切断される。

【0009】

いくつかの態様では、本出願の方法において、少なくとも１つのアタッチメントは、リンカーとペイロードとを含み、アタッチメントの、切断された部分が、ペイロードを含み、リンカーが、切断されたリンカーを含む。いくつかの態様では、本出願の方法は、切断されたリンカーおよび修飾されたリンカーの定量化に基づいて、アタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価することをさらに含む。いくつかの態様では、本出願の方法において、質量分析は、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、質量分析器は、液体クロマトグラフィーシステムに結合させることができ、質量分析器は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である。

【0010】

いくつかの態様では、本出願の方法は、アタッチメントの一部分を切断するのに先立って、および／または複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加するのに先立って、ペプチドまたはタンパク質を酵素で処理することをさらに含む。いくつかの態様では、本出願の方法は、試料を質量分析に供するのに先立って、試料を酵素で処理することをさらに含む。いくつかの態様では、アタッチメントの一部分は、酵素、プロテアーゼ、化学物質、酸、塩基、または還元剤を用いて切断される。いくつかの態様では、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程は、アタッチメントの一部分を切断する工程を実行するのに先立って実行される。いくつかの態様では、アタッチメントの一部分を切断する工程は、修飾されたリンカーを付加する工程および試料を質量分析に供する工程を実行するのに先立って実行される。いくつかの態様では、修飾されたリンカーの分子量は、切断されたリンカーの分子量とは異なる。

【0011】

他の態様では、本出願の方法は、アタッチメントの一部分を切断するのに先立って、および／または複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加するのに先立って、ペプチドまたはタンパク質を酵素で処理することをさらに含み、酵素はトリプシンである。いくつかの態様では、本出願の方法は、試料を質量分析に供するのに先立って、試料を酵素で処理することをさらに含み、酵素はＧｌｕ－Ｃである。いくつかの態様では、特定の複合体形成部位または複合体形成していない複合体形成部位は、ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基の内部に位置する。いくつかの態様では、アタッチメントは、マレイミド付着基を通じて少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結される。いくつかの態様では、ペプチドまたはタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である。

【0012】

いくつかの態様では、リンカーは、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド含有リンカー、ピロリン酸ジエステルリンカー、またはヒドラゾンリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む、ペプチドを含む。いくつかの態様では、リンカーは、ポリエチレングリコール、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）をさらに含む。

【0013】

他の態様では、修飾されたリンカーは、ポリエチレングリコールを含む。いくつかの態様では、修飾されたリンカーは、マレイミド付着基を通じて複合体形成していない複合体形成部位に付加する。

【0014】

さらに他の態様では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0015】

いくつかの態様では、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質は、下記式Ｉ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒは、リンカーであり、Ｘは、ペイロードである。いくつかの態様では、リンカーは、ポリエチレングリコールを含み、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0016】

いくつかの態様では、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質は、下記式ＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ_１は、スペーサーであり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２であり、Ｘは、ペイロードである。いくつかの態様では、スペーサーは、ポリエチレングリコールを含み、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0017】

他の態様では、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質は、下記式ＩＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ_１は、第１のスペーサーであり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２であり、Ｒ_４は、第２のスペーサーであり、Ｘは、ペイロードである。いくつかの態様では、第１のスペーサーは、ポリエチレングリコールを含み、第２のスペースは、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）を含み、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0018】

本開示は、少なくとも部分的に、試料中の部分的に複合体形成したタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本出願の方法は、切断されたリンカーを含有するタンパク質を生成するために、第１の酵素を用いてアタッチメントの一部分を切断する工程であって、アタッチメントが、切断されたリンカーを少なくとも１つ含む、工程と；その後、ペプチド混合物を得るために、試料を第２の酵素に供する工程と；切断されたリンカーを含有するペプチドおよび／または切断されたリンカーを含有しないペプチドの定量化に基づいて、アタッチメントの少なくとも１つの特定の複合体形成部位を定量化または特性評価するために、ペプチド混合物を質量分析に供する工程と、を含む。一態様では、少なくとも１つの特定の複合体形成部位は、タンパク質のリシン残基の内部に位置する。

【0019】

一態様では、少なくとも１つのアタッチメントは、リンカーとペイロードとを含み、少なくとも１つのアタッチメントの切断された部分が、ペイロードを含み、リンカーが、切断されたリンカーを含む。一態様では、質量分析は、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、質量分析器は、液体クロマトグラフィーシステムに結合させることができ、質量分析器は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である。一態様では、本出願の方法は、ペプチド混合物を質量分析に供するのに先立って、ペプチド混合物を第３の酵素で処理することをさらに含む。一態様では、第１の酵素は、パパイン、カテプシンＢ、もしくはプラスミンである；および／または、第２の酵素は、Ｇｌｕ－Ｃもしくはトリプシンである。一態様では、第３の酵素は、Ａｓｐ－ＮまたはＧｌｕ－Ｃである。

【0020】

一態様では、タンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である。一態様では、リンカーは、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む。一態様では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0021】

本発明の、これらおよび他の態様は、以下の記載および添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され理解されよう。以下の記載は、様々な実施形態およびそれらの多くの具体的な細部を示しつつ、例示によって与えられるものであり、限定するものではない。本発明の範囲内で多くの置き換え、修正、追加、または並べ替えを行ってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、薬物がリンカーを通じて抗体と複合体形成した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を示す。ＡＤＣの抗体成分は、標的細胞の腫瘍抗原に結合し、次いでＡＤＣ抗原複合体は、受容体媒介性エンドサイトーシスを受ける。ＡＤＣの薬物成分は、ＡＤＣのリソソーム分解またはリンカーの切断により放出される可能性がある。

【図2】図２は、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））の化学構造を示す。

【図3】図３は、マレイミドアルキル化を通じてリンカーを抗体と複合体形成させることによるシステイン結合を示す。

【図4】図４は、チオール交換または逆反応を経ることによる、システイン複合体形成したＡＤＣについてのチオール－マレイミド複合体形成に関連した脱複合体形成を示す。

【図5A】図５Ａは、いくつかの態様によるＡＤＣの化学構造を示す。各ＡＤＣは、抗体と、リンカーによってつながったペイロードとを含み、リンカーは、いくつかの態様によれば、マレイミド付着基を使用してペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着させる。

【図5B】図５Ｂは、いくつかの態様によるＡＤＣの化学構造を示す。各ＡＤＣは、抗体と、リンカーによってつながったペイロードとを含み、リンカーは、いくつかの態様によれば、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを使用しリシンアミド結合を通じてペプチドまたはタンパク質のリシン残基に付着させる。

【図6A】図６Ａは、例示的な実施形態による、ＡＤＣをトリプシンにより消化し、トリプシンペプチド混合物をパパインで消化してペイロードを除去することと；修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）ことと；ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化することと；ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することと、を含む本出願の例示的方法を示す。

【図6B】図６Ｂは、例示的な実施形態による、ＡＤＣをトリプシンで消化し、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）ことと；ペプチド混合物をパパインで消化してペイロードを除去することと；ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化することと；ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することと、を含む本出願の例示的な方法を示す。

【図6C】図６Ｃは、例示的な実施形態による、ＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、ＡＤＣ試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチド混合物を得、トリプシンペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化し、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させ（例えば標識し）、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供すること、を含む本出願の例示的な方法を示す。

【図7】図７は、例示的な実施形態による、ＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、アルキル化し、その後、ＡＤＣ試料をＧｌｕ－Ｃにより消化してＧｌｕ－Ｃ消化されたペプチド混合物を得、ペプチド混合物をＡｓｐ－Ｎで消化し、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供すること、を含む本出願の例示的方法を示す。

【図8A】図８Ａは、例示的な実施形態による、マレイミド付着基を通じてタンパク質とペイロードをつなぐリンカー、例えば、ＬＫ１リンカーのアタッチメントを示す。マレイミド付着基は、ペプチドまたはタンパク質のスルフヒドリル基（－ＳＨ）に付着する。ＬＫ１リンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡ）のアタッチメントは、ＰＥＧ８（ポリエチレングリコール－８）と、バリン－アラニンジペプチド（ＶＡジペプチド）と、ＰＡＢＡとを含む。ＳＧ３１９９は、薬物ペイロードである。

【図8B】図８Ｂは、例示的な実施形態による、切断されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ）のアタッチメント、例えば、切断されたＬＫ１のアタッチメントを示しており、これは、ＰＡＢＡと薬物ペイロードとの除去によりペイロードを放出させるＬＫ１のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8C】図８Ｃは、例示的な実施形態による、ＬＫ１の修飾されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＣＯＯＨ）のアタッチメント、例えば、ＬＫ２のアタッチメントを示す。

【図8D】図８Ｄは、例示的な実施形態による、マレイミド付着基を通じてタンパク質とペイロードをつなぐリンカー、例えばＬＫ３リンカーのアタッチメントを示す。マレイミド付着基は、ペプチドまたはタンパク質のスルフヒドリル基（－ＳＨ）に付着する。ＬＫ３リンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ）のアタッチメントは、バリン－シトルリンジペプチド（ＶＣｉｔジペプチド）とＰＡＢＡとを含む。メイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）はは、薬物ペイロードである。

【図8E】図８Ｅは、例示的な実施形態による、切断されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）のアタッチメント、例えば切断されたＬＫ３のアタッチメントを示しており、これは、ＰＡＢＡと薬物ペイロードとの除去によりペイロードを放出させるＬＫ３のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8F】図８Ｆは、例示的な実施形態による、ＬＫ３の修飾されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）のアタッチメント、例えば、ＬＫ４のアタッチメントを示す。

【図8G】図８Ｇは、例示的な実施形態による、ＬＫ５リンカー、例えば、タンパク質とペイロードをつなぐ酵素切断部位としてバリン－シトルリンジペプチドを含むａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＮＭｅのアタッチメントを示す。細胞毒性化合物であるメイタンシノイド（Ｍａｙ）は、例示的な実施形態による、ＬＫ５に担持される薬物ペイロードである。

【図8H】図８Ｈは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ５、例えばａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔのアタッチメントを示しており、これは、ペイロードを放出させるＬＫ５のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8I】図８Ｉは、例示的な実施形態による、抗体の、複合体形成していないリシン残基の化学構造を示す。

【図9A】図９Ａは、抗体の鎖間ジスルフィド結合を示しており、これらは還元されてスルフヒドリル基（－ＳＨ）を誘導した。次いで、スルフヒドリル基は、例示的な実施形態により、ＡＤＣを調製するための複合体形成部位として使用された。

【図9B】図９Ｂは、ＬＫ１リンカーとペイロード薬物ＳＧ３１９９とを含有するＡＤＣを示す。ＡＤＣ、例えば、Ａｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡ－ＳＧ３１９９は、例示的な実施形態により、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。

【図9C】図９Ｃは、ＬＫ３リンカーとペイロード薬物メイタンシノイドとを含有するＡＤＣを示す。ＡＤＣ、例えば、Ａｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－メイタンシノイドは、例示的な実施形態により、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。

【図10】図１０は、例示的な実施形態による、インタクト質量を用いたＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物抗体比の決定を示す。（Ｘ軸：強度／［カウント］、Ｙ軸：１．４５ｅ５から１．５８ｅ５までの観察質量［ｍ／ｚ］）。

【図11】図１１は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣからパパインを用いて薬物ペイロードを除去した結果を示す。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物を得た。２つのトリプシンペプチド、例えば、ＳＣＤＫ（セリン－システイン－アスパラギン酸－リシン）およびＧＥＣ（グリシン－グルタミン酸－システイン）を、例示的な実施形態により、ＬＣ－ＭＳを使用して分析した。ＬＫ１は、質量分析時に＋１４９５．７（ペイロードを含む）と指定され、切断されたＬＫ１は＋７６２．２と指定される。

【図12】図１２Ａは、パパインが、かさ高い疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸に近い部位を優先的に切断するプロテアーゼであることを示す。図１２Ｂは、抗体のヒンジ領域に元々位置するトリプシンペプチドのアミノ酸配列を示す。このトリプシンヒンジ領域ペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１））は、複数のパパイン切断部位を含有する。パパイン切断部位は、矢印記号で表示されている。

【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、例示的な実施形態による、パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチドの分析結果を示す。図１３Ａは、例示的な実施形態による、トリプシンヒンジ領域ペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１））の分析結果を示す。図１３Ｂは、例示的な実施形態による、ＣＰＰＣＰＡＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２）のアミノ酸配列を有するペプチド（パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）の分析結果を示す。図１３Ｃは、例示的な実施形態による、ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３）のアミノ酸配列を有するペプチド（パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）の分析結果を示す。これらのペプチドは、ＬＫ１（ペイロードを含め、＋１４９５．７と指定される）または切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定される）を含有する場合がある。

【図14】図１４は、例示的な実施形態による、ヒンジ領域ペプチドについてのリンカー標識の効率を示す。ヒンジ領域ペプチドは、２つのシステイン残基を含有する。ヒンジ領域ペプチドの大部分は、二重標識を有する。

【図15】図１５は、例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＳに供するのに先立つ試料のＧｌｕ－Ｃ消化の分析結果を示す。ヒンジ領域ペプチドのプロファイルが顕著に減少し、これによって、ＬＣ－ＭＳを用いた定量化が顕著に簡略化された。

【図16】図１６は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化を示す。２つのペプチド、例えば、ＳＣＤＫまたはＧＥＣのアミノ酸配列を有するペプチドのピーク面積を示してある。これらのペプチドは、切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定される）および／またはＬＫ２（＋５９２．３と指定される）を含有する場合がある。

【図17】図１７は、例示的な実施形態による、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する、本出願の方法の日内精度を示す。

【図18】図１８Ａおよび１８Ｂは、例示的な実施形態による、２つの方法の比較結果を示す。図１８Ａは、例示的な実施形態による、図６Ａに示す方法としてパパイン消化の実行の後にＬＫ２付着させた結果を示す。図１８Ｂは、例示的な実施形態による、図６Ｂに示す方法としてＬＫ２付着の実行の後にパパイン消化を行った結果を示す。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析した。切断されたＬＫ１は＋７６２．４と指定される。ＬＫ２は＋５９２．３と指定される。（＋５９２．３，＋５９２．３）は、複合体形成がゼロであることを示す。（＋７６２．４，＋５９２．３）は、薬物複合体形成が１つであることを示す。（＋７６２．４，＋７６２．４）は、例示的な実施形態による薬物複合体形成が２つであることを示す。

【図19A】図１９Ａは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫについてのリンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析を示す。

【図19B】図１９Ｂは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫについてのリンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析を示す。

【図20A】図２０Ａは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示す。

【図20B】図２０Ｂは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示す。

【図21A】図２１Ａは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析する場合の、パパイン対基質比が異なるところでのサロゲートペプチドのピーク面積を示す。

【図21B】図２１Ｂは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料を分析する場合の、パパイン対基質比が異なるところでのサロゲートペプチドのピーク面積を示す。

【図22】図２２は、例示的な実施形態による、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えば、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、または１つもしくは２つのインタクトなＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示す。

【図23】図２３は、例示的な実施形態による、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えば、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、または１つもしくは２つの切断されたＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示す。例示的な実施形態により、切断されたリンカーを含有しないヒンジペプチドのピーク面積もモニタリングした。

【図24】図２４Ａは、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドのところでの複合体形成部位を分析することにより、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについてのＬＫ１複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。図２４Ｂは、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫおよびヒンジ領域ペプチドのところでの複合体形成部位を分析することにより、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣについてのＬＫ３複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。

【図25】図２５は、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する本出願の方法の日内精度および日間精度を示す。

【図26】図２６は、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチド上の複合体形成部位を分析することによって得られた、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２の薬物複合体形成分布のロット間ばらつきを示す。

【図27】図２７は、例示的な実施形態による、ｐＨ５．５、ｐＨ６、およびｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件でＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドを分析することにより、４０℃、２８日間熱ストレス下でＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについて得られた、ＬＫ１複合体形成の喪失百分率を示す。

【図28】図２８は、例示的な実施形態による、マレイミド環加水分解の化学的機構を示す。

【図29】図２９Ａは、例示的な実施形態による、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件下でＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジペプチドを分析することによって得られた、マレイミド環加水分解および複合体形成保持の百分率を示す。図２９Ｂは、例示的な実施形態による、複合体形成保持とマレイミド環加水分解との間の相関分析の結果を示す。

【図30A】図３０Ａ～３０Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン２０８残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図30B】同上。

【図30C】同上。

【図31A】図３１Ａ～３１Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の重鎖におけるリシン３９３およびリシン３８９残基（ＨＣ Ｌｙｓ３９３／ＨＣ＊ Ｌｙｓ３８９）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図31B】同上。

【図31C】同上。

【図32A】図３２Ａ～３２Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン６５残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図32B】同上。

【図32C】同上。

【図33A】図３３Ａ～３３Ｃは、例示的な実施形態による、５５個のアミノ酸を含有するペプチドを分析することにより、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン３９、４２、または４５残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図33B】同上。

【図33C】同上。

【図34】図３４Ａ～３４Ｂは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて、二重複合体形成について抗体の重鎖におけるリシン６４および７５残基（ＨＣ^＊Ｌｙｓ６４およびＬｙｓ７５）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図35A】図３５Ａ～３５Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の重鎖におけるリシン１５１および１４７残基（ＨＣ Ｌｙｓ１５１／ＨＣ＊ Ｌｙｓ１４７）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。

【図35B】同上。

【図35C】同上。

【図36】図３６は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ２－ＬＫ５について様々なリシン残基上の薬物複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

詳細な説明
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体の特異性を利用して、薬物、例えば高薬理活性の細胞障害性薬物または化学療法薬物を標的細胞に選択的に送達する治療薬である。ＡＤＣは、細胞毒性薬物を標的として、癌治療用に送達することができる。特定の腫瘍表面抗原を標的とする抗体を、リンカーを通じて薬物と複合体形成させて、癌治療用の有効な治療薬としてＡＤＣを生成することができる。図１に示されるとおり、ＡＤＣの抗体成分は腫瘍抗原に結合し、次いで、ＡＤＣ抗原複合体は受容体媒介性エンドサイトーシスを受ける。リソソームは、プロテアーゼ、例えばカテプシンＢおよびプラスミンを含有するので、ＡＤＣのリソソーム分解またはリンカーの切断に起因して、ＡＤＣの薬物成分を放出させることができる（Ｃｈａｎｇｓｈｏｕ Ｇａｏ．７ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＤＣ．２０１６，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｏｌ／ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ； Ｊａｇａｄｅｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ）：Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１７，５５，２０１６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１８６４－０１６－０４２８－ｙ）。好ましい標的抗原は、腫瘍と正常組織との間で発現の差を示すものであって癌細胞内で発現を増加させるのが望ましい。ＡＤＣは、癌細胞に選択的に薬物を送達することにより、有効性を高めるとともに毒性を低下させることができ、よって、従来の化学療法による癌治療と比較して最小有効量を下げる。また、抗体による標的指向性薬物送達に起因して、非標的組織、例えば正常組織に到達する薬物が減少するので、最大薬物耐用量が増加する。（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，ｍＡｂｓ，６：１，３４－４５，ＤＯＩ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２７０２２）。ＡＤＣを使用することで、従来の化学療法と比較して、有効性の向上、全身毒性の低減、好ましい薬物動態、好ましい薬力学、および好ましい生体内分布に起因して、治療ウィンドウを広げることができる（Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，２０１８，９（１），ｐａｇｅｓ ３３－４６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｎｋｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）。

【0024】

ＦＤＡ承認済みのＡＤＣには、ＣＤ３３陽性急性骨髄性白血病用に２０００年のゲムツズマブ・オゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）））、ＣＤ３０陽性再発または難治性ホジキンリンパ腫および全身性未分化大細胞リンパ腫用に２０１１年のブレンツキシマブ・ベドチン（アドセトリス（登録商標））（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）））、ＨＥＲ２陽性乳癌用に２０１３年のトラスツズマブ・エムタシン（カドサイラ（登録商標））（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）））、急性リンパ芽球性白血病用に２０１７年の、ＣＤ２２を標的としたイノツズマブ・オゾガマイシン（ベスポンサ（登録商標））（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ（Ｂｅｓｐｏｎｓａ（登録商標）））、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫用に２０１９年の、ＣＤ７９ｂを標的としたポラツズマブ・ベドチン（ポライビー（登録商標））（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ（Ｐｏｌｉｖｙ（登録商標）））、膀胱癌用に２０１９年のネクチン－４標的エンフォルツマブ・ベドチン（パドセブ（登録商標））（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ（Ｐａｄｃｅｖ（登録商標）））、乳癌用に２０１９年のＨＥＲ２標的トラスツズマブ・デルクステカン（エンハーツ（登録商標））（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ（Ｅｎｈｅｒｔｕ（登録商標）））などが挙げられる。しかし、マイロターグ（登録商標）は、臨床的有用性がなく、標準的な化学療法と比較して致死的毒性率も高いことから、２０１０年に市場から撤退した。マイロターグ（登録商標）、アドセトリス（登録商標）、カドサイラ（登録商標）の化学構造を図２に示す（Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ｅｔ ａｌ．）。活性ＡＤＣの臨床試験の大部分は、多様な標的抗原を対象とした第Ｉ相試験中である。ＡＤＣの標的抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ｃＭｅｔ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＧＣ－Ｃ、ＦＧＦＲ、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＥＮＰＰ３、ＡＸＬ受容体型チロシンキナーゼ、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ４、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、葉酸受容体１、ＰＳＭＡ、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ＳＬＣ４４Ａ４、ＴＡＡ、などが挙げられる。ＡＤＣの開発は困難であるが、これは、ＡＤＣの開発の約２５％が臨床試験中に中止されたと推定されたからである。

【0025】

ＡＤＣは、特定の抗原を標的とする抗体、薬物ペイロード、および薬物ペイロードと抗体とをつなぐリンカーから構築される。ＡＤＣの開発用に一般に使用される抗体アイソタイプには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４などが挙げられる。複合体形成に利用可能なリンカーには、プロテアーゼ切断可能なリンカー、切断可能でないリンカー、ヒドラゾンリンカー、ジスルフィド結合型リンカーなど様々なタイプが挙げられる。抗体における利用できる複合体形成部位には、リシン残基およびシステイン残基などが挙げられる。加えて、非天然アミノ酸または人工システイン残基を、特定の部位のところで抗体に付加することができる。抗体の利用できる主要な複合体形成部位には、リシン残基のアミノ基などが挙げられる。一般的な抗体上には約８０個のリシン残基があり、約１０個のリシン残基が化学的に利用できる。抗体へのリンカーの化学的な複合体形成には、活性化されたカルボン酸エステルを用いたリシンアミド結合などが挙げられる。

【0026】

システインを用いた複合体形成もまた、ＡＤＣの構築に用いることができる。概して抗体には遊離チオールは存在せず、これは、全てのシステイン残基がジスルフィド結合を形成するためである。抗体、例えばＩｇＧ１には、４個の鎖間ジスルフィド結合、１２個の鎖内ジスルフィド結合がある。鎖間ジスルフィド結合は概して、ＩｇＧ１の構造安定性にとって重要ではない。抗体の鎖間ジスルフィド結合が選択的に還元されると、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基（－ＳＨ）を、主要な複合体形成部位として利用できる。よって、システイン複合体形成は、鎖間ジスルフィド結合の還元後、露出した８個のスルフヒドリル基に限定される場合がある。システイン複合体形成に使われる抗体あたりのリンカー薬物は１～８個の範囲にあり、１００種より多い異なるＡＤＣ種を生成することができる。ＡＤＣ混合物の不均質性における多様性は比較的高く、その理由は、薬物担持率および複合体形成部位の点でこれらのＡＤＣ種が異なるためである（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）。追加のシステイン残基を、遺伝子工学などの技術を通じて抗体に導入することができる。

【0027】

ＡＤＣは普通、様々なＤＡＲ、複合体形成部位、および占有度を含め、高度な構造的不均質性を有する。ペイロードの占有率は、溶媒接触性、局在電荷、および立体効果に依存して、異なる複合体形成部位で変化する可能性がある。特定の複合体形成部位の場所と占有率により、ＡＤＣの安定性および有効性を調節することができる。リシンまたはシステイン複合体形成したＡＤＣは、サイズバリアントおよびチャージバリアントを含む不均質性を示す。ＡＤＣ、例えばリシンまたはシステイン複合体形成したＡＤＣの品質属性について考慮すべき事柄には、ＤＡＲ、薬物担持率分布、複合体形成していない抗体の存在、残留薬物の存在などが挙げられる。複合体形成部位を選択することで、ＡＤＣの安定性および有効性を調節することができる。システインを用いた複合体形成法は、抗体のシステイン残基とチオール反応性官能基との間の特異的な反応に依拠する。マレイミドを使用して、マレイミドアルキル化を通じ、還元された抗体システインチオールとリンカーを複合体形成させることができる。図３は、マレイミド部分が抗体の還元型システイン残基と反応することを示している（Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ｅｔ ａｌ．）。

【0028】

薬物抗体複合体形成に使用される連結化学に関して課題がある。得られるＡＤＣが不安定な構造であるならば、想定よりも早い薬物放出につながる可能性がある。ＤＡＲの幅広い変動と、抗体上の付着場所の不十分な制御とに関連して他にも課題がある。ＡＤＣのばらつきおよび不安定性は、ばらついた薬物動態プロファイルの原因になる。得られるＡＤＣは、様々なＡＤＣ種を含有する高度に不均質な混合物となる可能性がある。システイン複合体形成したＡＤＣには、脱複合体形成が生じる、例えばチオール交換または逆反応を通る可能性があり、これは、システインを用いた複合体形成に関し、チオール－マレイミド複合体形成に関連する不安定性について図４に示されるとおりである。ＡＤＣの複合体形成が抗体のＣＨ２ドメインのリシン残基を用いる場合には、ＣＨ２ドメインは不安定化する可能性があり、これが、抗体の半減期に悪影響を及ぼす翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＰＴＭ））分解を誘発する。リシンを用いた複合体形成は、ＡＤＣの結合親和性を損なう可能性があり、例えば結合エピトープを直接変化させたり、間接的に構造変化を引き起こしたりする可能性がある。例えば、ＡＤＣ内のメチオニン２５８残基は、複合体形成していない抗体と比較して、酸化されやすい（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１６ Ｊａｎ ５；８８（１）：６９５－７０２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０３７０９．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｄｅｃ １４； Ｂｕｅｃｈｅｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９ （２０２０） １６１－１６８１６２）。ペイロードの脱複合体形成は、オンターゲット有効性の低下、抗標的の毒性増加、または制御できない薬物分布につながる可能性がある。ＡＤＣのＤＡＲは、血清中で経時的に変化する場合がある。薬物複合体形成の部位特異的な定量化、および異なる部位での薬物複合体形成の喪失の定量化には、難題が残されている。ＡＤＣの分析による特性評価には、分子の完全性、不均質性、分解、安定性、およびＤＡＲの変化などが挙げられる。所望のＡＤＣ製剤は、望ましくないＡＤＣ種を低減させることによって、明確に定められたＤＡＲと、ある程度の均質性とを含むことで、ＡＤＣ製剤の安全性および有効性を向上させるのが望ましい。

【0029】

ＤＡＲは、抗体と複合体形成した薬物の平均数を表し、ＡＤＣの有効性と安全性に直結し得る。ＤＡＲの特性評価は、ＡＤＣの重要な品質属性を制御するには重要である可能性があり、これは、明確に定められたＤＡＲから、全薬物担持率、薬物担持率分布、複合体形成していない抗体のレベル、複合体形成していない残留薬物のレベル、および複合体形成の部位に関する重要な情報が得られるからである。低ＤＡＲは薬物担持率が低いことを意味し、ＡＤＣの効能を低下させる原因である。高ＤＡＲは、ＡＤＣの薬物動態と毒性を変化させる可能性のある高薬物担持率を表す。ＡＤＣの主な品質属性には、ＤＡＲ、薬物担持率分布、複合体形成していない抗体のレベル、複合体形成していない残留薬物レベル、ＡＤＣのサイズバリアント、およびＡＤＣのチャージバリアントの特性評価などが挙げられる。

【0030】

質量分析の手法を用いるＡＤＣの特性評価および定量化は、実行ごとにばらつきがあって困難である可能性があり、これは、リンカーとペイロードの複合体形成がペプチドのイオン化に顕著に影響するからである。質量分析に基づくペプチドのマッピングは、治療用タンパク質の特性評価において強力であるものの、この一般的な手法では通常、ＡＤＣの部位特異的な複合体形成を定量化することができず、これは、野生型ペプチドと、複合体形成したペプチドとの分子量の顕著な違いからくるイオン化の不一致に起因している。加えて、ＡＤＣのトリプシン消化により、複合体形成部位、例えば重鎖と軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を含有する短いペプチドが得られ、これらの部位は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）上で保持することが難しい。さらに、薬物複合体形成したペプチドは、試料調製中、例えば高温および／または酸性の条件下で変質して、分析物の安定性および再現性を危うくする可能性がある。キャピラリー電気泳動－質量分析（ＣＥ－ＭＳ）をＡＤＣの特性評価に使用する場合には、短いペプチドを保持することが可能である。しかし、定量的な再現性に関して課題がある。

【0031】

リンカーの選択はＡＤＣの有効性にとって重要であり、これは、理想的なリンカーが、循環血液中で安定であることによって腫瘍細胞内での活性な遊離薬物の急速な放出を可能にすることが望ましいからである。適用可能なリンカーの形式は、切断可能でないリンカーまたは切断可能なリンカーとすることができる。切断可能なリンカーは、細胞外環境と細胞内環境との間の環境的な違い、例えばｐＨもしくは酸化還元電位に応答して、または特定のリソソーム酵素によって切断されるように、設計される。

【0032】

切断可能なリンカーの例には、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド含有リンカー、またはピロリン酸ジエステルリンカーなどが挙げられる。ヒドラゾンリンカーは、酸不安定性リンカーの一例である。酸不安定性リンカーは、血液中のｐＨレベルで安定であるように設計されるが、リソソーム中の低ｐＨ環境では、酸不安定性リンカーは不安定になり分解される場合がある。ジスルフィドリンカーは、細胞内の還元型グルタチオンのレベルが高い場合に、遊離薬物を細胞内で放出することができるジスルフィド結合を含有する。

【0033】

プロテアーゼ切断可能なリンカーは、血中で安定であるように設計されるが、リソソーム酵素による切断時に、活性な遊離薬物が細胞内のリソソーム内部で急速に放出されるものとすることができる。リソソーム内のプロテアーゼ活性は比較的高い。いくつか特定のペプチド配列は、リソソームプロテアーゼによって認識し切断することが可能であり、例えば、カテプシンＢによって加水分解させることのできるジペプチド連結がそうである。カテプシンＢは、特定のジペプチド配列、例えばバリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、およびバリン－シトルリンを認識することができ、そのような配列のＣ末端側のペプチド結合を切断する。スペーサー、例えばパラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）をこれらのジペプチドに結合させて、切断可能なジペプチドリンカーを構築することができる。かさ高いペイロード分子が使用される場合、ジペプチド部分とペイロードとの間にスペーサーが存在することで、ペイロードは、カテプシンＢにプロテアーゼ活性を発揮させることができる（Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ ｅｔ ａｌ．）。

【0034】

薬物ペイロードの選択は、ＡＤＣの治療効果にとって非常に重要である可能性がある。ＡＤＣにおけるペイロードは、癌細胞に対して強力であり、かつ正常細胞に対して低い抗標的細胞毒性を有する細胞毒性化学物質であることが好ましい。いくつかの態様では、ペイロードは、細胞毒性剤または抗有糸分裂剤である。いくつかの態様では、ペイロードは、微小管阻害剤、例えばメイタンシン類またはオーリスタチン類である。いくつかの例示的な例では、ペイロードは、ＤＮＡ損傷剤、例えばアントラサイクリン類、カリケアマイシン類、デュオカルマイシン類、ピロロベンゾジアゼピン類、またはピロロベンゾジアゼピン二量体類（ＰＢＤ）である。ＤＮＡ損傷剤は、ＤＮＡの副溝に結合して、ＤＮＡ鎖の切断、アルキル化、または架橋を引き起こすことによって機能する。いくつかの態様では、ペイロードは、トポイソメラーゼ阻害剤またはＲＮＡポリメラーゼ阻害剤である。いくつかの態様では、ペイロードは、アマニチン類またはチューブリシン類似体類である。いくつかの態様では、ペイロードは、葉酸およびプリン類似体類（メトトレキサート、６－メルカプトプリン）、微小管重合阻害剤／促進剤（ビンカアルカロイド類、タキサン類）、およびＤＮＡ損傷剤（アントラサイクリン類、ナイトロジェンマスタード）を含む化学療法薬物である。

【0035】

いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、ペイロードに担持されて抗体に付着し、切断部位を含む。いくつかの態様では、切断部位は、細胞外環境と細胞内環境との間の環境的な違い、例えばｐＨもしくは酸化還元電位に応答することによって、または特定のリソソーム酵素によって切断することができる。いくつかの態様では、切断部位は、酸不安定性切断部位、プロテアーゼ切断部位、ジスルフィド含有切断部位、またはピロリン酸ジエステル含有切断部位である。

【0036】

いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、ペイロードに担持されて抗体に付着し、スペーサーと切断部位とを含み、スペーサーは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはＰＥＧ８である。

【0037】

他の態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーはペイロードを担持して抗体に付着し、リンカーは、第１のスペーサーと、切断部位と、第２のスペーサーとを含み、第１のスペースは、ＰＥＧまたはＰＥＧ８であり、第２のスペーサーは、ＰＡＢＣまたはＰＡＢＡである。

【0038】

さらに他の態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ａの式Ｉに示されるとおり、マレイミド付着基を用いて抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着し、式中、Ｒは、リンカーであり、Ｘは、ペイロードである。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＥＧを含み、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。いくつかの態様では、リンカーは、切断部位をさらに含む。いくつかの態様では、切断部位は、プロテアーゼが認識できるジペプチドである。いくつかの態様では、ジペプチドは、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体である。

【0039】

いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ａの式ＩＩに示されるとおり、マレイミド付着基を用いて抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着し、式中、Ｒ_１は、スペーサー（ＰＥＧまたはＰＥＧ８など）であり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、アラニンまたはシトルリンの側鎖の一般構造、例えば－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２を表し、Ｘは、ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0040】

他の態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ａの式ＩＩＩに示されるとおり、マレイミド付着基を用いて抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着し、式中、Ｒ_１は、第１のスペーサー（ＰＥＧまたはＰＥＧ８など）であり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、アラニンまたはシトルリンの側鎖の一般構造、例えば－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２を表し、Ｒ_４は、第２のスペーサー（例えばＰＡＢＣまたはＰＡＢＡ）である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0041】

さらに他の態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ｂの式ＩＶに示されるとおり、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを用いてリシンアミド結合を通じて抗体のリシン残基に付着し、式中、Ｒは、リンカーであり、Ｘは、ペイロードである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＰＥＧを含み、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、抗微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。いくつかの態様では、リンカーは、切断部位をさらに含む。いくつかの態様では、切断部位は、プロテアーゼが認識できるジペプチドである。いくつかの態様では、ジペプチドは、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体である。

【0042】

いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ｂの式Ｖに示されるとおり、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを用いてリシンアミド結合を通じて抗体のリシン残基に付着し、式中、Ｒ_１は、スペーサー（例えばＰＥＧまたはＰＥＧ８）であり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、アラニンまたはシトルリンの側鎖の一般構造、例えば－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２を表し、Ｘは、ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0043】

いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗体と、ペイロードと、リンカーとを含み、リンカーは、図５Ｂの式ＶＩに示されるとおり、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを用いてリシンアミド結合を通じて抗体のリシン残基に付着し、式中、Ｒ_１は、第１のスペーサー（例えばＰＥＧまたはＰＥＧ８）であり、Ｒ_２は、－Ｈまたは－ＣＨ_３であり、Ｒ_３は、アラニンまたはシトルリンの側鎖の一般構造、例えば－ＣＨ_３または－（ＣＨ_２）_３ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２を表し、Ｒ_４は、第２のスペーサー（例えばＰＡＢＣまたはＰＡＢＡ）である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である。

【0044】

本出願は、ＡＤＣの薬物複合体形成を部位特異的に定量化および／または特性評価する例示的方法を提供し、ＡＤＣは、複合体形成した、および複合体形成していない複合体形成部位を含む。本出願の方法は、ＡＤＣをプロテアーゼで消化してペプチド混合物を生成する工程を含み、ペプチドは、複合体形成した、および／または複合体形成していない複合体形成部位を含有する場合がある。次いで、ペプチド混合物を修飾または標識して、複合体形成した複合体形成部位と複合体形成していない複合体形成部位との間の検出可能な差異を得ることができる。本出願は、ＡＤＣにおける複合体形成を部位特異的に定量化する新規の、プロテアーゼによって支援される薬物脱複合体形成およびリンカー標識（ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｎｋｅｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ（ＰＡＤＤＬＬ））法を提供する。いくつかの態様では、トリプシンを使用してＡＤＣを消化する。いくつかの態様では、ＬＣ－ＭＳを使用して、複合体形成した、および／または複合体形成していない複合体形成部位を含有するペプチド間の差異を検出する。

【0045】

いくつかの態様では、本出願は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法であって、以下の工程：切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、アタッチメントの一部分を切断する工程であって、アタッチメントが、切断されたリンカーを含む、工程と；部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程と；切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、試料を質量分析に供する工程と；を含み、少なくとも１つのアタッチメントが、リンカーおよびペイロードを含み、アタッチメントの切断された部分が、ペイロードを含み、リンカーが、切断されたリンカーを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、この方法は、切断されたリンカーおよび修飾されたリンカーの定量化に基づいて、アタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価することをさらに含む。いくつかの態様では、質量分析は、質量分光法、または液体クロマトグラフィー－質量分光法である。部位特異的なペイロード（例えば、薬物）複合体形成は、切断されたリンカーおよび修飾されたリンカーの定量化、例えば、部位特異的なペイロード（例えば、薬物）複合体形成＝（切断されたリンカーの量）／（修飾されたリンカーの量＋切断されたリンカーの量）に基づいて、計算することができる。

【0046】

他の態様では、本出願の方法は、切断可能なリンカー、例えばプロテアーゼ切断可能なジペプチドリンカーを含有する様々なＡＤＣを定量するのに使用することができ、ＡＤＣは、異なる抗体アイソタイプ、リンカー構造、および薬物ペイロードを有することができ、ＡＤＣは、リシン複合体形成した、およびシステイン複合体形成したＡＤＣを含むものとすることができる。いくつかの態様では、本出願の方法は、非特異的な切断を最小限にすることによって薬物ペイロードを完全に脱複合体形成させるために最適化された条件で、インタクトＡＤＣを活性化されたパパインとインキュベートする工程と、その後、還元、変性、および酵素消化を含む、還元されたペプチドのマッピング手順を実行する工程とを含む。次いで、占有されていない複合体形成部位を、修飾されたリンカーで標識し、同等のイオン化効率を提供する。次いで、本出願の方法は、切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、ＡＤＣ試料を質量分析、例えばＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー結合質量分光法／質量分光法）に供することを含む。いくつかの態様では、ＡＤＣの修飾されたリンカーおよび切断可能なリンカーは、類似の構造を有する。いくつかの態様では、部位特異的なペイロード（例えば、薬物）複合体形成は、切断されたリンカーおよび修飾されたリンカーの定量化に基づき計算することができる。部位特異的な薬物複合体形成の百分率は、薬物脱複合体形成したペプチドおよびリンカー標識されたペプチドの前駆イオンの信号強度を用いて推定することができ、それは以下を含む：

。

【0047】

いくつかの好ましい態様では、修飾されたリンカーを、複合体形成していない複合体形成部位に付加する工程は、アタッチメントの一部分を切断する工程を実行するのに先立って実行される。いくつかの好ましい態様では、ペプチドまたはタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である。いくつかの好ましい態様では、修飾されたリンカーの分子量は、切断されたリンカーの分子量と異なり、これらの分子量は、質量分析で区別可能である。

【0048】

いくつかの態様では、本出願の方法は、図６Ａに示されるとおり、ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物をパパインで消化してペイロードを除去する工程と；修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）工程と；次いで、ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化する工程と；次いで、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供する工程と、を含む。いくつかの態様では、いくつかの工程の順序は、図６Ｂに示されるとおり逆である場合がある。修飾されたリンカーを、ペプチドの、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる工程は、ペプチド混合物をパパインで消化することによってペイロードを除去する工程を実行するのに先だって実行される場合がある。修飾されたリンカーを、ペプチドの、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる工程に関し、概して遊離スルフヒドリル基だけが、修飾されたリンカーと複合体形成することが可能である。いくつかの態様では、本出願の方法は、図６Ｂに示されるとおり、ペプチド混合物を得るためにＡＤＣをトリプシンで消化する工程と、修飾されたリンカーを、ペプチド混合物の、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）工程と；ペイロードを除去するために、ペプチド混合物をパパインで消化する工程と；ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化する工程と；ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供する工程と、を含む。

【0049】

他の態様では、本出願の方法の工程の順序は、図６Ｃに示されるとおり並べ替えられる場合がある。修飾されたリンカーを、ペプチドの、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる工程は、ペプチド混合物をパパインで消化することによってペイロードを除去する工程を実行した後、ならびにトリプシン消化およびＧｌｕ－Ｃ消化の工程を実行した後に実行される場合がある。いくつかの態様では、トリプシン消化に先だってパパイン消化を実行し、トリプシンペプチドに対するパパインの非特異的な消化を低減させる。いくつかの態様では、標識する工程は、マレイミドリンカーによるパパイン（システインプロテアーゼ）活性の阻害を低減させるために、パパイン消化の後に実行される。いくつかの好ましい態様では、本出願の方法は、図６Ｃに示されるとおり、ＡＤＣをパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、ＡＤＣをトリプシンで消化してトリプシンペプチド混合物を得、トリプシンペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化し、その後、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させ（例えば、標識し）、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することを含む。

【0050】

いくつかの好ましい態様では、パパインの非特異的な消化を最小限にするために、ＡＤＣは、他の工程を実行するのに先立ってペイロードを除去するよう、最初にパパインで消化される。いくつかの態様では、本出願の方法は、ＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、次いで、試料をトリプシンで消化し、次いで、トリプシンペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化し、次いで、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させ（例えば、標識し）、次いで、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することを含む。

【0051】

いくつかの態様では、本出願の方法は、トリプシンペプチドの混合物を得るために、ＡＤＣをトリプシンで消化する工程であって、ＡＤＣが、抗体と、少なくとも１つの薬物ペイロードと、バリン－アラニンジペプチドを含有する少なくとも１つの切断可能なリンカーとを含み、リンカーが、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着する、消化する工程と；ペイロードを除去して、パパイン性トリプシンペプチド混合物を得るために、トリプシンペプチド混合物をパパインで消化する工程と；修飾されたリンカーを、パパイン性トリプシンペプチドの、複合体形成していないスルフヒドリル基に複合体形成させる工程と；ペプチド混合物を質量分析、例えばＬＣ－ＭＳ分析に供する工程と；を含む。随意に、ペプチド混合物は、Ｇｌｕ－Ｃプロテアーゼ消化に供して、ヒンジ領域ペプチドの数を減少させて、質量分析を実行するのに先立って定量化を簡略化してもよい。

【0052】

いくつかの態様では、本出願の方法は、第１のペプチド混合物を得るために、ＡＤＣ混合物を第１の酵素で消化する工程であって、ＡＤＣが、ペプチドまたはタンパク質と、少なくとも１つのペイロードと、少なくとも１つのリンカーとを含む、消化する工程と；ペイロードを除去し、第２のペプチド混合物を得るために、第１のペプチド混合物を第２の酵素で消化する工程であって、第２の酵素が、第１のペプチド混合物中のペプチドも消化できる、消化する工程と；修飾されたリンカーを、第２のペプチド混合物のペプチド中の、複合体形成していない複合体形成部位と複合体形成させて、第３のペプチド混合物を得る工程と；ＬＣ－ＭＳを用いて第３のペプチド混合物を分析する工程と；を含む。随意に、第３のペプチド混合物は、ＬＣ－ＭＳ分析に先だって第３の酵素消化に供して、ペプチドの変数を減少させて、ＬＣ－ＭＳ定量化を簡略化してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素はトリプシンであり、第２の酵素はパパインであり、第３の酵素はＧｌｕ－Ｃである。

【0053】

他の態様では、本出願の方法は、図７に示されるとおり、リシン連結したＡＤＣをパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、アルキル化し、その後、ＡＤＣ試料をＧｌｕ－Ｃで消化してＧｌｕ－Ｃ消化ペプチド混合物を得、このペプチド混合物をＡｓｐ－Ｎで消化し、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することを含む。部位特異的なペイロード（例えば、薬物）複合体形成は、切断されたリンカーを含有するペプチドと、切断されたリンカーを含有しない元のペプチドとの定量化、例えば、部位特異的なペイロード（例えば、薬物）複合体形成＝（切断されたリンカーを含有するペプチド量）／（切断されたリンカーを含有するペプチド量＋元のペプチド量）に基づいて計算することができる。

【0054】

さらに他の態様では、本出願は、リシン連結したＡＤＣの薬物複合体形成を定量化または特性評価する方法を提供し、この方法は、切断されたリンカーを含有する抗体を生成するために、第１の酵素を用いて薬物ペイロードを切断する工程と；その後、ペプチド混合物を得るために、試料を第２の酵素に供する工程と；切断されたリンカーを含有するペプチドおよび／または切断されたリンカーを含有しないペプチドの定量化に基づいて、特定のリシン複合体形成部位を定量化または特性評価するために、ペプチド混合物を質量分析に供する工程と、を含む。

【0055】

望ましくないＡＤＣ種の存在に起因するＡＤＣの不均質性の懸念から、ＡＤＣの部位特異的な薬物複合体形成の定量化および特性評価、例えば薬物複合体形成の部位特異的な定量化が、薬物の安全性および有効性を向上させるためにますます要求されている。本明細書に開示される例示的な実施形態は、前述の要求を満足させる。本開示は、前述の要求を満足させるために、ＡＤＣの特定の複合体形成部位に連結されたアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法を提供する。それらは、薬物の安全性および有効性に関連して明確に定められたＤＡＲおよびある程度の均質性を保証するために、ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化または特性評価という長らくの切実な要望を満足させる。

【0056】

別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者に共通に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または均等な任意の方法および材料を実施または試験に使用することもできるが、特定の方法および材料を以下に記載する。特許、特許出願、公開特許出願、技術論文、および学術論文を含む様々な公開文献が、本明細書全体を通して引用されている。これらの引用文献および言及された公開文献の全ては、その全体が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0057】

用語「１つの（ａ）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるのが望ましく；用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって理解されるであろうとおりの標準的なばらつきを許容すると理解されるのが望ましく；そして範囲が提供される場合には、その端点が含まれる。本明細書で使用されるとおり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味するものと理解される。

【0058】

いくつかの態様では、本開示は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価する方法であって：切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、アタッチメントの一部分を切断する工程であって、切断されたリンカーをアタッチメントが含む、切断する工程と；修飾されたリンカーを、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に付加する工程と；切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、試料を質量分析に供する工程と；を含む。いくつかの態様では、本出願の方法において、ペプチドまたはタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である。

【0059】

本明細書で使用されるとおり、用語「複合体形成したペプチドまたはタンパク質」は、「抗体薬物複合体」、または「ＡＤＣ」を含む、不安定な結合を有するリンカーにより生物学的に活性な薬物に付着したペプチドまたはタンパク質を指すものとすることができる。複合体形成したペプチド、複合体形成したタンパク質、抗体薬物複合体、またはＡＤＣは、複合体形成部位、例えば複合体形成したペプチド、複合体形成したタンパク質、または抗体のアミノ酸残基の側鎖に共有結合することができる生物学的に活性な薬物（またはペイロード）のいくつかの分子を含むことができる（Ｓｉｌｅｒ Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，６ ｍＡｂｓ ３４－４５ （２０１３））。ＡＤＣに使用される抗体は、標的部位に選択的に蓄積し持続的に保持されるのに十分な親和性で結合できる可能性がある。ほとんどのＡＤＣは、ナノモル範囲のＫｄ値を有することができる。ペイロードは、ナノモル／ピコモルの範囲の効能を有し、標的組織へのＡＤＣの分布後に実現可能な細胞内濃度に達することができる可能性がある。ペイロードと抗体との間のつながりを形成するリンカーは、抗体部分の薬物動態特性（例えば、長い半減期）を利用するには、そしてペイロードが組織内に分布する際に抗体に付着した状態を保つには、循環中で十分安定に存在できるものであってよいが、しかし一旦ＡＤＣが標的細胞に取り込まれ得ると、生物学的に活性な薬物を効率的に放出可能であることが望ましい。リンカーは、細胞処理中に切断可能でないもの、そしてＡＤＣが標的部位に到達した後に切断可能なものとすることができる。細胞内部に放出された生物学的に活性な薬物は、切断可能でないリンカーとともに、ペイロードと、リソソーム内でＡＤＣが完全にタンパク質分解された後に抗体のアミノ酸残基、通常はリシンまたはシステイン残基に依然として付着しているリンカーの全構成要素とを含む。切断可能なリンカーは、ペイロードと抗体のアミノ酸付着部位との間に切断の部位を含む構造をとるものである。切断機構には、酸性の細胞内コンパートメントにおける酸不安定性結合の加水分解、細胞内プロテアーゼまたはエステラーゼによるアミドまたはエステル結合の酵素的切断、および細胞内の還元性環境によるジスルフィド結合の還元的切断などを挙げることができる。

【0060】

本明細書で使用されるとおり、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互につながった、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存性の高い、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた領域が散在する、超可変性の、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されるものとすることができ、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。用語「抗体」は、いずれかのアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンと非グリコシル化免疫グロブリンの両方を指すことを含む。用語「抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたもの、例えば抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含むが、これらには限定されない。ＩｇＧは、抗体のサブセットを含む。

【0061】

本明細書で使用されるとおり、用語「ペプチド」または「タンパク質」は、共有結合したアミド結合を有するあらゆるアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野において「ペプチド」または「ポリペプチド」として一般に公知の、１つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。タンパク質は、１つまたは複数のポリペプチドを含有して単一機能性の生体分子を形成する場合がある。いくつかの態様では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞タンパク質、またはそれらの組み合わせとすることができる。

【0062】

本明細書で使用されるとおり、用語「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、例えば抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域のみならず、抗体断片から形成されるトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、直鎖抗体、単鎖抗体分子、および多特異性抗体などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と重鎖可変領域とがペプチドリンカーによってつながった組換え単鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段で生成されてもよい。例えば、抗体断片は、インタクト抗体の断片化により酵素的もしくは化学的に生成されてもよい、かつ／または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に生成されてもよい。これに代わってまたはこれに加えて、抗体断片は、全体的または部分的に合成により生成されてもよい。抗体断片は、単鎖の抗体断片を随意に含んでもよい。これに代わってまたはこれに加えて、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって互いに連結された複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、複数分子の複合体を随意に含んでもよい。

【0063】

いくつかの態様では、本出願の方法において、試料を質量分析に供して、切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定する。いくつかの態様では、本出願の方法は、切断されたリンカーおよび修飾されたリンカーの定量化に基づいて、アタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価することをさらに含む。いくつかの態様では、本出願の方法における質量分析は、質量分光法または液体クロマトグラフィー－質量分光法である。いくつかの実施形態では、本出願の方法における質量分光法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行することができ、質量分析器は、液体クロマトグラフィーシステムに結合させることができ、質量分析器は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である。

【0064】

本明細書で使用されるとおり、「質量分析器」は、特定の分子種を同定し、その正確な質量を測定することが可能な装置を含む。この用語は、検出および／または特性評価のためにポリペプチドまたはペプチドの溶出先となり得るいずれかの分子検出器を含むことが企図される。質量分析器は、３つの主要部分：イオン源、質量分析部、および検出部を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物の原子、分子、またはクラスターは、気相に転換して、（エレクトロスプレーイオン化の場合のように）各々同時にイオン化することができる。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

【0065】

本明細書で使用されるとおり、用語、液体「クロマトグラフィー」は、液体または気体によって運ばれる化学混合物を、これが定常的な液相または固相の周囲またはその上を流れる際の化学実体の差分分布の結果として構成成分に分離できる過程を指す。クロマトグラフィーの非限定的な例には、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、混合モードのクロマトグラフィー、および順相クロマトグラフィー（ＮＰ）などが挙げられる。

【0066】

本明細書で使用されるとおり、用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」は、溶液を含有するエレクトロスプレーニードルの先端と対抗電極との間に電位差を加える結果生じる高度に帯電した液滴の流れが大気圧で形成され脱溶媒和することを通じて、溶液中の陽イオンまたは陰イオンのいずれかを気相に移動させるスプレーイオン化の過程を指す。溶液中の電解質イオンから気相イオンを生成するには、概して３つの主要な工程がある。これらは：（ａ）ＥＳ注入先端での帯電した液滴の生成；（ｂ）気相イオンを生成できる高度に帯電した小液滴をもたらす、溶媒蒸発と液滴の崩壊の繰り返しとによる帯電した液滴の収縮；および（ｃ）非常に小さく高度に帯電した液滴から気相イオンを生成する機構、である。段階（ａ）～（ｃ）は概して、装置の大気圧領域で行われる。いくつかの態様では、エレクトロスプレーイオン化質量分析器は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器とすることができる。

【0067】

本明細書で使用されるとおり、用語「トリプル四重極質量分析器」は、直列にした２つの四重極質量分析器からなるタンデム質量分析器であって、それらの間に（質量分解しない）高周波（ＲＦ）の単なる四重極を置いて、衝突誘発解離用のセルとして作用させるものを指す。トリプル四重極質量分析器では、ペプチド試料はＭＳ装置に結合したＬＣに注入される。第１の四重極は質量フィルタとして使用することができ、目的のｍ／ｚを持つペプチドを分離する。第２の四重極は、ペプチドを破壊して断片にするための衝突セルとして使用される。第３の四重極は、最初の親ペプチドから、指定されたｍ／ｚの断片を得るための、第２の質量フィルタとして働く。本明細書で使用されるとおり、用語「タンデム質量分析」は、質量選択と質量分離の複数の段階を用いることにより試料分子の構造情報を得ることができる技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に転換し、そのままイオン化できること、および第１の質量選択工程の後、何らかの予測可能かつ制御可能なやり方で試料分子の崩壊を誘発できることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳ^ｎは、意味のある情報が得られる限り、または断片イオンの信号が検出可能である限り、まず前駆体イオンを選択、分離し（ＭＳ^２）、それを断片化し、一次断片イオンを分離し（ＭＳ^３）、それを断片化し、二次断片を分離する（ＭＳ^４）等により実行することができる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで実行することに成功している。特定の用途向けにどのような分析器を組み合わせるかは、多くの様々な要因、例えば感度、選択性、およびスピードのみならず、サイズ、コスト、入手可能性によっても決定することができる。タンデムＭＳ方法の２つの大きな分類区分が、空間的タンデムと時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析計を空間的に結合させた、または空間的タンデム分析計と結合させたハイブリッドのものもある。空間的タンデム質量分析器は、イオン源、前駆体イオン活性化装置、および少なくとも２つの非トラップ型質量分析器を含む。機器の１つの区画においてイオンを選択し、中間領域で解離させ、次いで生成物イオンを別の分析器に送ってｍ／ｚ分離とデータ収集を行うように、特定のｍ／ｚ分離機能を設計することができる。時間的タンデム質量分析器では、イオン源において生成されたイオンを、同一の物理的装置においてトラップ、分離、断片化、およびｍ／ｚ分離することができる。

【0068】

例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法を提供する。

【0069】

いくつかの態様では、本開示は、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも１つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法であって、以下の工程：切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、アタッチメントの一部分を切断する工程であって、切断されたリンカーをアタッチメントが含む、切断する工程と；部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程と；切断されたリンカーおよび／または修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、試料を質量分析に供する工程と；を含む方法を提供する。

【0070】

いくつかの態様では、アタッチメントの一部分は、酵素、例えばパパイン、カテプシンＢ、またはプラスミンを用いて切断され、酵素対基質の比は、約１：０．１から約１：１００、約１：１０から約１：３００、約１：１０から約１：２５０、好ましくは約１：２０、好ましくは約１：２００、約１：０．２、約１：０．５、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：１０、約１：１５、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：５５、約１：６０、約１：６５、約１：７０、約１：７５、約１：８０、約１：８５、約１：９０、または約１：９５である。酵素消化は、約２５から４５℃で約１分から一晩；約３７℃で約０．５時間、好ましくは約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、または４時間未満の間、実行される。

【0071】

他の態様では、修飾されたリンカーが、部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に付加する。修飾されたリンカーは、室温で約２時間、または約１８から３７℃で約１分から一晩、ペプチドとともにインキュベートされ、ペプチド対リンカーのモル比は、好ましくは約１：５００、約１：１０から約１：２０００、約１：２０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：１０００、約１：１２００、約１：１５００、または約１：１８００である。

【0072】

本方法が、前述のペプチド、タンパク質、抗体、抗薬物抗体、抗原抗体複合体、タンパク質医薬品、クロマトグラフィーカラム、または質量分析器のいずれにも限定されないことは理解される。

【0073】

本明細書で提供される方法工程を、数字および／または文字により通しで標識しても、その方法またはその方法のいずれの実施形態をも特定の表示された順序に限定することを意味するわけではない。

【0074】

本開示をさらに詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照すれば、本開示はさらに完全に理解されることになろう。これらは、例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0075】

材料と方法
１． 切断可能なリンカーおよび修飾されたリンカー
ＬＫ１は、図８Ａに示されるとおり、タンパク質とペイロードとをつなぐ切断可能なリンカーである。ＬＫ１は、酵素切断部位として特定のアミノ酸配列、例えば、プロテアーゼ、例えばカテプシンＢまたはパパインによって認識可能な、バリン－アラニンジペプチド（ＶＡジペプチド）を含有する。ＬＫ１リンカーは、マレイミド付着基（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ）を通じてペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と複合体形成することができる。図８Ａに示されるとおり、ＬＫ１リンカーのアタッチメント、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡは、第１のスペーサーとしてＰＥＧ８（ポリエチレングリコール－８）、酵素切断部位としてバリン－アラニンジペプチド、および第２のスペーサーとしてＰＡＢＡを含む。細胞毒性化合物であるＳＧ３１９９は、ＬＫ１に担持される薬物ペイロードである。図８Ｂは、切断されたＬＫ１のアタッチメント、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡを示しており、これは、ペイロードを放出させるＬＫ１のプロテアーゼ消化の後に生成され、ＰＡＢＡおよびペイロードは複合体から除去される。質量分析時に、ペイロードを含むＬＫ１は＋１４９５．７、切断されたＬＫ１は＋７６２．２と指定される。ＬＫ２、例えば、ＬＫ１の修飾されたリンカー（修飾されたＬＫ１）は、ＰＥＧ８を含有するリンカーである。図８Ｃは、ＬＫ２リンカーのアタッチメントを示す。ＬＫ２リンカーは、マレイミド付着基（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ）を通じて、ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と複合体形成することができる。切断されたＬＫ１（図８Ｂ）とＬＫ２（図８Ｃ）の間には質量差があるが、これは、ＬＫ２がバリン－アラニンジペプチドを含有しないからである。ＬＫ２は、マレイミド付着基、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＣＯＯＨを通じてペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と複合体形成することができる。ＬＫ２は、質量分析時に＋５９２．３と指定される。質量分析時に、ペイロードを含むＬＫ１は＋１４９５．７、切断されたＬＫ１は＋７６２．２と指定される。ＰＡＢＡ（パラアミノベンジルアルコール）の分子量は、約１３７．１Ｄａである。ＳＧ３１９９（薬物ペイロード）の分子量は、約５８４．７Ｄａである。

【0076】

ＬＫ３は、図８Ｄに示されるとおり、タンパク質とペイロードをつなぐ切断可能なリンカーである。ＬＫ３は、酵素切断部位として特定のアミノ酸配列、例えば、プロテアーゼ、例えばカテプシンＢまたはパパインによって認識可能な、バリン－シトルリンジペプチド（Ｖａｌ－Ｃｉｔジペプチド）を含有する。ＬＫ３リンカーは、マレイミド付着基（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ）を通じてペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と複合体形成することができる。図８Ｄに示されるとおり、ＬＫ３リンカーのアタッチメント、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡは、酵素切断部位としてバリン－シトルリンジペプチドを、そしてスペーサーとしてＰＡＢＡを含む。細胞毒性化合物であるメイタンシノイド（Ｍａｙ）は、ＬＫ３に担持される薬物ペイロードである。図８Ｅは、ペイロードを放出させるＬＫ３のプロテアーゼ消化後に生成される、切断されたＬＫ３、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔのアタッチメントを示し、ＰＡＢＡおよびペイロードは複合体から除去される。質量分析時に、ペイロードを含むＬＫ３は＋１３３２．６、切断されたＬＫ３は＋４６７．２と指定される。ＬＫ４、例えば、ＬＫ３の修飾されたリンカー（修飾されたＬＫ３）は、バリン－シトルリンジペプチドを含有するリンカーである。図８Ｆは、ＬＫ４リンカーのアタッチメントを示す。ＬＫ４リンカーは、マレイミド付着基（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ）、例えば、ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔを通じてペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基と複合体形成することができる。ＬＫ４は、質量分析時に＋４５３．２と指定される。質量分析時に、ペイロードのメイタンシノイドを含むＬＫ３は＋１３３２．６と指定され、切断されたＬＫ３は＋４６７．２と指定される。

【0077】

ＬＫ５は、図８Ｇに示されるとおり、タンパク質とペイロードをつなぐ切断可能なリンカーである。ＬＫ５は、酵素切断部位として特定のアミノ酸配列、例えば、プロテアーゼ、例えばカテプシンＢまたはパパインによって認識可能な、バリン－シトルリンジペプチド（Ｖａｌ－Ｃｉｔジペプチド）を含有する。ＬＫ５リンカーは、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを用いたリシンアミド結合により、ペプチドまたはタンパク質のリシン残基と複合体形成することができる。図８Ｇに示されるとおり、ＬＫ５リンカーのアタッチメント、例えば、ａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＮＭｅは、バリン－シトルリンジペプチドを酵素切断部位として含む。細胞毒性化合物であるメイタンシノイド（Ｍａｙ）は、ＬＫ５に担持される薬物ペイロードである。図８Ｈは、ペイロードを放出させるＬＫ５のプロテアーゼ消化の後に生成される、切断されたＬＫ５のアタッチメント、例えば、ａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔを示している。質量分析時に、ペイロードを含むＬＫ５は＋１２４９．６と指定され、切断されたＬＫ５は＋３８４．２と指定される。図８Ｉは、抗体の、複合体形成していないリシン残基の化学構造を示している。

【0078】

２． 抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製
ＭＡＢ１、例えば残基２９７に変異（Ｎ２９７Ｑ）を有するモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を用いて、ＡＤＣを調製した。残基２９７の変異のため、ＭＡＢ１はグリコシル化部位が欠損している。図９Ａに示されるとおり、抗体の鎖間ジスルフィド結合を還元して、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基（－ＳＨ）を誘導した。次いで、このスルフヒドリル基を、ＡＤＣを調製するための複合体形成部位として使用した。ＡＤＣ試料緩衝液は、５％グリセロールとともにＰＢＳを含有するものであった。図９Ｂに示されるとおり、ペイロード薬物ＳＧ３１９９を担持したＬＫ１リンカーを、マレイミド付着基を通じてＭＡＢ１のシステイン残基と複合体形成させ、ＡＤＣを誘導した。誘導されたＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ、例えばＡｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡ－ＳＧ３１９９は、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。ＭＡＢ１－ＬＫ１－ＳＧ３１９９ ＡＤＣのＤＡＲは約３．６である。ペイロードＳＧ３１９９を含むＬＫ１の分子量は約１４９５．７Ｄａである。ＰＥＧスペーサーの腕部、例えばＰＥＧ８の長さは約３０．８オングストロームである。ＭＡＢ１－ＬＫ１－ＳＧ３１９９ ＡＤＣのプロテアーゼ切断可能な部位は、バリン－アラニンジペプチド（Ｖａｌ－Ａｌａ、またはＶＡ）である。

【0079】

図９Ｃに示されるとおり、ペイロード薬物メイタンシノイド（Ｍａｙ）を担持したＬＫ３リンカーを、マレイミド付着基を通じてＭＡＢ１のシステイン残基と複合体形成させ、ＡＤＣを誘導した。誘導されたＭＡＢ１－ＬＫ３－Ｍａｙ ＡＤＣ、例えばＡｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－メイタンシノイド（Ａｂ－ＭＣ－ＶＣｉｔ－ＰＡＢＡ－ＮＭＥ－Ｍａｙ）は、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。ＭＡＢ１－ＬＫ３－Ｍａｙ ＡＤＣのＤＡＲは約２．２である。ペイロードのメイタンシノイドを含むＬＫ３の分子量は約１３３２．６Ｄａである。ＭＡＢ１－ＬＫ３－Ｍａｙ ＡＤＣのプロテアーゼ切断可能な部位は、バリン－シトルリンジペプチド（Ｖａｌ－ＣｉｔまたはＶＣｉｔ）である。Ｌ－シトルリン（Ｃｉｔ）は、Ｌ－アルギニンおよび一酸化窒素に変換することのできる、天然に存在するアミノ酸である。

【0080】

ＭＡＢ２およびＬＫ５を用いてリシン結合した抗体複合体を調製した。ＬＫ５リンカーは、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを用いたリシンアミド結合を通じてＭＡＢ２のリシン残基と複合体形成させた。各重鎖には約２５個のリシン残基があり、各軽鎖には約１０個のリシン残基がある。ＭＡＢ２は、２つの異なるエピトープを標的とする二重特異性抗体である。２種類の異なるロットのＭＡＢ２－ＬＫ５ ＡＤＣを調製し、それぞれのＤＡＲ値は約２．９および２．７であった。

【0081】

３． Ｇｌｕ－Ｃ消化
Ｇｌｕ－Ｃは、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））から単離されたセリンプロテアーゼである。Ｇｌｕ－Ｃ、例えばＶ－８プロテアーゼは、エンドプロテイナーゼであり、炭酸水素アンモニウムおよび酢酸アンモニウムの緩衝液中で反応を行うと、グルタミン残基のカルボキシル側を特異的に切断し、限られた数のペプチド断片を生成する。Ｇｌｕ－Ｃ切断はまた、リン酸塩緩衝液中でグルタミン残基とアスパラギン残基の両方で生じ得る。Ｇｌｕ－Ｃは、質量分析によるタンパク質同定用途において、配列のカバレッジを向上させる非常に特異的なエンドプロテイナーゼである。Ｇｌｕ－Ｃは単独で、またはトリプシンもしくは他のプロテアーゼと併せて使用して、ペプチドのマッピングおよびタンパク質配列決定のための相補的なタンパク質消化物を生成させることができる。Ｇｌｕ－Ｃはヒンジ領域ペプチドＣ末端の不均質性（ＴＨ↑Ｔ↑ＣＰＰＣＰＡＰＥ↑Ｌ）を低減させることができる。

【0082】

４． Ａｓｐ－Ｎ消化
Ａｓｐ－Ｎは、亜鉛メタロプロテイナーゼであり、単独で、またはトリプシンもしくは他のプロテアーゼと併せて使用して、ペプチドのマッピングおよびタンパク質配列決定のためのタンパク質消化物を生成させることができるものである。Ａｓｐ－Ｎは、エンドプロテイナーゼであり、主に、アスパラギン酸残基、およびシステイン酸残基の酸化によって生じるシステイン酸残基の、アミノ側で切断され、限られた数のペプチド断片を生成するものである。Ａｓｐ－Ｎの切断はまた、グルタミン残基のところでも生じ得る。ＡｓｐＮは３７℃で２～２０時間程度かけて効率よくタンパク質を消化することができる。

【0083】

５．実験用試薬の調製
４．１． 質量分析用の移動相Ａ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中、０．０５％のＴＦＡ）：２Ｌのパイレックスガラス製ボトルに入れた２ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ 水に、１ｍＬのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加える。ボトルを３～４回逆さにして混合する。室温で最高３ヶ月間、保存する。
４．２． 質量分析用の移動相Ｂ（アセトニトリル中、０．０４５％のＴＦＡ）：１Ｌのパイレックスガラス製ボトルに入れた１Ｌのアセトニトリルに、０．４５ｍＬのＴＦＡを加える。ボトルを３～４回逆さにして混合する。室温で最高３ヶ月間、保存する。
４．３． ５ｍＭ酢酸溶液：１４．３μＬの氷酢酸をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で５０ｍＬに希釈し、よく混合する。４℃で最高３ヶ月間、保存する。
４．４． ０．１ＭのＴＣＥＰ原液：２８．７ｍｇのＴＣＥＰ－ＨＣｌ（トリス（２－カルボキエチル）ホスフィンヒドロクロリド）をＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶かし、最終体積を１ｍＬに調節する。５０μＬのアリコートを作製し、－２０℃で最高３ヶ月間、保存する。
４．５． １００ｍＭのトリスＨＣｌ中、８Ｍの尿素：０．４８ｇの尿素を、６４０μＬの１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５に溶かし、最終体積を１ｍＬとする。完全に溶解するまでボルテックスし、マイクロセントリフュージ（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１４，０００ｇで３分間、遠心分離する。その都度、新しいものとする。０．４８２９ｇの尿素を実験用に秤量した。
４．６． ５％のＴＦＡ溶液：１０ｕＬのＴＦＡを１９０ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、よく混合する。
４．７． ０．１ｍｇ／ｕＬの新規標識原液：１０ｍｇの各標識を１００ｕＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶かし、０．１ｍｇ／ｕＬの原液とする。２ｕＬ／ＥＡのアリコートを調製する。
４．８． パパイン活性化緩衝液（１．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭのメルカプトメタノール、５．５ｍＭのシステイン）：０．５ＭのＥＤＴＡ、４．４ｕＬと、５５ｍＭのメルカプトエタノール、２．４ｕＬと、１．７３ｍｇのシステインとを２ｍＬの水に加え、よく混合する。

【0084】

６．新規標識の試験方法
ＡＤＣ試料の濃度に応じて、２５μｇの各ＡＤＣ試料を新しいマイクロセントリフュージ・チューブに移し、水を加えて全体積を１０μＬとする。２０ｕＬのパパイン懸濁液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１８０ｕＬのパパイン消化緩衝液で希釈し、３７℃で３０分間、インキュベートする。３０ｕＬのパパイン（１ｍｇ／ｍＬの公称濃度）を１２０ｕＬの活性化緩衝液で希釈し、０．２ｍｇ／ｍＬの公称濃度とする。パパイン活性化緩衝液をブランク緩衝液として使用して、２８０ｎｍと３２０ｎｍのＵＶ（紫外）測定によりパパイン濃度を測定する。活性化されたパパインを、パパイン活性化緩衝液で希釈して０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にする。０．１ｍｇ／ｍＬのパパイン溶液、１．２５ｕＬ（酵素：基質の比は１：２００）をインタクトＡＤＣに加え、３７℃で１時間、インキュベートする。各試料に０．１ＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌ、０．５μＬを加える。試料を３秒間、ボルテックスし、次いでミニセントリフュージ（Ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で３秒間、スピンダウンする。サーモミキサー中、試料を８００ｒｐｍで振とうしつつ、９５℃で２０分間、インキュベートする。インキュベーション後、試料を室温まで５分間、冷却する。ミニセントリフュージを用いて凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を３秒間スピンダウンする。１Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、８Ｍの尿素６μＬを、各試料に加える。配列決定グレードの修飾されたトリプシン（２０μｇ／バイアル）を、５２０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で戻して０．０３８μｇ／μＬの最終濃度にする。複数のバイアルのトリプシンが必要であれば、異なるバイアルからトリプシン溶液を組み合わせる。各試料に０．０３８μｇ／μＬのトリプシン溶液、３２．５μＬを加える。試料を、サーモミキサー中、８００ｒｐｍで振とうしつつ、３７℃、暗所で３時間、インキュベートする。０．１ＭのＴＣＥＰを水で希釈し、０．０５ＭのＴＣＥＰにする。０．０５ＭのＴＣＥＰ、０．８ｕＬを各試料に移す。配列決定グレードのＧｌｕ－Ｃ（１０ｕｇ／バイアル）を４０ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水で戻し、０．２５ｕｇ／ｕＬの最終濃度にする。０．２５ｕｇ／ｕＬのＧｌｕ－Ｃ溶液、５ｕＬを各試料に加える。試料を３７℃、暗所でサーモミキサー中、８００ｒｐｍで振とうしつつ、１．５時間、インキュベートする。標識リンカーをＤＭＳＯまたは水で希釈し、標識リンカーを（異なるＡＤＣのリンカー構造に基づいて）各試料に移して、ＡＤＣの遊離スルフヒドリル基と比較してリンカーが過剰となるようにする。室温で２時間、インキュベートする。消化混合物を０．６ｕＬの５％ＴＦＡで酸性化する。１０μＬの各試料を、サーモサイエンティフィックＱエグザクティブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）またはＱエグザクティブ・プラス・ハイブリッド・カドルポ－ル－オービトラップ・マススペクトロメータ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に結合させたウォーターズ・アクイティ・Ｉ－クラス・ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）に注入する。残りの消化された試料を、－８０℃の冷凍庫で保存する。残りの溶液を、酵素標識最適化実験用に冷凍する。

【0085】

実施例１． ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物抗体比の同定
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物抗体比（ＤＡＲ）を、インタクト質量を用いて測定した。図１０に示されるとおり、平均ＤＡＲを計算して２．３４と推定した（Ｘ軸：強度／［カウント］、Ｙ軸：１．４５ｅ５から１．５８ｅ５までの観察質量［ｍ／ｚ］）。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣは不均質であり、様々なバリアント、例えばサイズバリアントおよびチャージバリアントを有する。

【0086】

実施例２． ＡＤＣからのペイロードの除去
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣのペイロードを除去するのにパパインを使用した。パパイン（１ｍｇ／ｍＬ）をパパイン活性化緩衝液（１．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭのメルカプトエタノール、５．５ｍＭのシステイン）中、３７℃で３０分間、活性化した。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物を得た。次いで、トリプシンペプチド混合物を、活性化されたパパインを用いて３７℃で約４時間以下の間、消化して、ペイロード、例えばＳＧ３１９９を除去した。酵素対基質の比は１：２０である。重鎖と軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を還元した。２つのトリプシンペプチド、例えばＳＣＤＫ（セリン－システイン－アスパラギン酸－リシン）、およびＧＥＣ（グリシン－グルタミン酸－システイン）を、ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。図１１に示されるとおり、ペイロードは１時間以内で完全に除去された。パパインは、ＬＫ１リンカーのバリン－アラニンジペプチドを認識することができる。パパインの切断部位は、図９Ｂに示されるとおり、バリン－アラニンジペプチドとＰＡＢＡとの間にある。ＰＡＢＡとＳＧ３１９９が、パパイン消化後にＬＫ１リンカーのアタッチメントから除去された結果、質量喪失が生じた。ＬＫ１を含有するトリプシンペプチドは、図１１で＋１４９５．７（ペイロードを含む）と標識される。切断されたＬＫ１を含有するトリプシンペプチドは、図１１で＋７６２．４と標識される。

【0087】

パパイン消化による除去ペイロードの完全な切断は、１：２０の酵素対基質比で、３７℃、１時間で達成された。可逆的パパイン阻害剤（ＧＧＹＲなど）または非可逆的パパイン阻害剤（キオムスタチンなど）を、９５℃、２０分間の加熱工程と併用することによってパパイン活性をクエンチして、消化反応を終了させた。

【0088】

実施例３． パパインを用いたトリプシンヒンジ領域ペプチドの消化
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンにより消化し、次いでパパインにより消化して、ＬＣ－ＭＳ分析用のペプチドを得た。ＬＫ１中のバリン－アラニンジペプチドを認識させることを通じてペイロードを除去するために、パパインを使用した。図９Ｂに示されるとおり、ＬＫ１リンカー中のバリン－アラニンジペプチドとＰＡＢＡの間にパパイン切断部位が位置する。パパインは、図１２Ａに示されるとおり、かさ高い疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸に近い部位を優先的に切断するプロテアーゼである。したがってパパインは、トリプシンペプチドをさらに小さい断片に消化することもできる。抗体をトリプシンで消化してトリプシンペプチドを生成する場合、抗体のヒンジ領域に元々位置する、

のアミノ酸配列を有するトリプシンペプチドが生成される。このトリプシンヒンジ領域ペプチドは、マレイミド付着基を通じてリンカー－ペイロードを付加させる複合体形成部位である２つのシステイン残基（Ｃ）を含有する。このトリプシンヒンジ領域ペプチドはまた、図１２Ｂに示されるとおり、複数のパパイン切断部位を含有する。パパイン切断部位は、図１２Ｂに矢印記号で示してある。

【0089】

ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物を得た。続いて、トリプシンペプチド混合物を、活性化されたパパインを用いて消化した。パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチドを、図１３Ａ～１３Ｃに示されるとおり、ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。ＬＫ１を含有するペプチドは、図１３Ａに質量＋１４９５．７（ペイロードを含む）として指定されている。切断されたＬＫ１を含有するペプチドは、図１３Ａ～１３Ｃに質量＋７６２．４として指定される。図１３Ａ～１３Ｃに、トリプシンヒンジ領域ペプチド（図１３Ａ、アミノ酸配列

）、ＣＰＰＣＰＡＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２）のアミノ酸配列を有するペプチド（図１３Ｂ、パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）、およびＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３）のアミノ酸配列を有するペプチド（図１３Ｃ、パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）の分析結果を示す。これらのペプチドは、ＬＫ１（ペイロードを含み、＋１４９５．７と指定される）、または切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定される）を含有する場合がある。

【0090】

実施例４． 複合体形成していないシステイン残基への修飾されたリンカーの付着
高または低ＤＡＲのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化して、トリプシンペプチド混合物を生成した。パパインを使用して、ＬＫ１のバリン－アラニンジペプチドを認識させてペイロードを除去した。パパインは、トリプシンペプチドをさらに小さい断片に消化することもできる。このトリプシンペプチド混合物をパパインで消化し、次いで、修飾されたリンカーを使用してパパイン性トリプシンペプチドを標識した。ＰＥＧ８－ＣＯＯＨを含有する修飾されたリンカー（図８Ｃに示す）を、２ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）中、室温で約２時間、１：５００のペプチド対リンカーのモル比で、ペプチドとともにインキュベートした。この修飾されたリンカーを、複合体形成していないシステイン残基と、マレイミド付着基を通じて複合体形成させて、ペプチドの質量を増加させた。したがって、複合体形成していないシステインを含有するペプチドの質量は、切断されたＬＫ１を含有する複合体形成したペプチドと比較して、質量差を補償されている。図１４は、ヒンジ領域ペプチドについてリンカー標識の効率を示す。ヒンジ領域ペプチドは、２つのシステイン残基を含有する。図１４に示されるとおり、ヒンジ領域ペプチドの大部分は二重標識を有しており、これは、修飾されたリンカーであるＬＫ２の、複合体形成していないシステイン残基への付着が完了したことを示している。リンカー付着の完了に起因して、切断されたＬＫ１およびＬＫ２の標識の定量化に基づく部位特異的な薬物複合体形成の計算、例えば、部位特異的な薬物複合体形成＝（標識された切断されたＬＫ１）／（標識されたＬＫ２＋標識された切断されたＬＫ１）が可能になる。

【0091】

実施例５． ＬＣ－ＭＳ分析に先立つＧｌｕ－Ｃ消化
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化して、トリプシンペプチド混合物を生成した。パパインを使用して、ＬＫ１中のバリン－アラニンジペプチドを認識させてペイロードを除去した。パパインは、トリプシンペプチドをさらに小さい断片に消化することもできる。トリプシンペプチド混合物をパパインで消化し（約３０分）、次いで、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、パパイン性トリプシンペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。ＬＫ２標識の後、ＬＣ－ＭＳ分析の実行に先立って、ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化した。パパイン消化後、９個を超えるヒンジ領域ペプチドが得られた。Ｇｌｕ－Ｃの使用に起因して、ヒンジ領域ペプチドのプロファイルは、３つのペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４）、ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５）、およびＣＰＰＣＰＡＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６）のアミノ酸配列）に減少しており、これにより、図１５に示されるとおり、ＬＣ－ＭＳを用いた定量化が著しく単純化された。Ｇｌｕ－Ｃ消化の場合、酵素対基質比は、３７℃、約３時間で１：２０である。

【0092】

実施例６． ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化
２つのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えば一つは低ＤＡＲのもの、およびもう一つは高ＤＡＲのものを、図６Ａに示されるとおり本出願の方法によって分析し、ここで、パパインを用いてペイロードを除去する工程は、修飾されたリンカーを、複合体形成していない複合体形成部位に付加する工程を実行するのに先立って実行した。２つのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチド混合物を生成し、次いでパパインで消化して、ＬＫ１中のバリン－アラニンジペプチドを認識させて、ペイロードを除去した。次に、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、パパイン性トリプシンペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。ＬＫ２標識後、ペプチドをＧｌｕ－Ｃで消化し、その後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。低ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えばＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ１９は、１．９という推定ＤＡＲを有する（インタクト、ＥＳＩ）。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えば、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８は、３．６という推定ＤＡＲを有する（インタクト、ＥＳＩ）。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を、それぞれ三組調製した（ｎ＝３）。図１６に、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化を示す。２つのペプチド、例えば、ＳＣＤＫまたはＧＥＣのアミノ酸配列を有するペプチドのピーク面積を示した。これらのペプチドは、切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定）および／またはＬＫ２（＋５９２．３と指定）を含有する場合がある。ＬＫ２（＋５９２．３）を含有するペプチドのピーク面積は、元々複合体形成していなかった複合体形成部位を定量化していることを示している。切断されたＬＫ１（＋７６２．４）を含有するペプチドのピーク面積は、１つの薬物ペイロードと元々複合体形成していた複合体形成部位の定量化を示している。加えて、本出願の方法、例えば図６Ａの方法は、図１７に示されるとおり良好な日内精度を示したが、これは、本出願の方法による計算されたＤＡＲ値が、インタクト質量法と同等であったからである。図１７に、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド、およびヒンジ領域ペプチドの分析結果を示す。

【0093】

実施例７． ペイロードを除去するのに先立つ、修飾されたリンカーによる標識
２つの方法、例えば図６Ａおよび６Ｂに示す方法を並べて比較した。図６Ａに示す１つの方法を使用して、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析し、ここでは、パパインを用いてペイロードを除去する工程は、修飾されたリンカー（ＬＫ２）で標識する工程に先だって実行した。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料をトリプシンで消化して、トリプシンペプチドを生成した。次いで、トリプシンペプチドをパパインで消化し、ＬＫ１のバリン－アラニンジペプチドを認識させてペイロードを除去した。次いで、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、ペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。次いで、ペプチドをＧｌｕ－Ｃで消化し、その後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。分析結果を図１８Ａに示す。

【0094】

図６Ｂに示すもう一方の方法を実行して、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析した、ここでは、修飾されたリンカー（ＬＫ２）による標識付けの工程は、パパインを用いてペイロードを除去する工程に先だって実行した。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料をトリプシンで消化し、トリプシンペプチドを生成した。次いで、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、トリプシンペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。次いで、ペプチドをパパインで消化し、ＬＫ１のバリン－アラニンジペプチドを認識させてペイロードを除去した。次いで、ペプチドをＧｌｕ－Ｃで消化し、その後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。分析結果を図１８Ｂに示す。

【0095】

比較結果を図１８Ａおよび１８Ｂに示す。図１８Ａは、図６Ａに示す方法により、パパイン消化を実行した後、ＬＫ２付着を行った結果を示している。図１８Ｂは、図６Ｂに示す方法により、ＬＫ２付着の後にパパイン消化を実行した結果を示している。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析した。（＋５９２．３、＋５９２．３）は、複合体形成がゼロであることを示す。（＋７６２．４、＋５９２．３）は、１つの薬物複合体形成を示す。（＋７６２．４、＋７６２．４）は、２つの薬物複合体形成を示す。複合体形成した薬物ペイロードが存在することで、ヒンジ領域ペプチド内部のパパイン切断部位が優先的に選択される場合がある。この優先的なパパイン切断は、立体障害効果、例えばバイスタンダー効果を生じる場合がある。修飾されたリンカー（ＬＫ２）で標識する工程を、パパインを用いてペイロードを除去する工程に先だって実行した場合には、優先的なパパイン切断は低減した。

【0096】

実施例８． 初期工程としてのパパイン消化
ＡＤＣのパパインによる非特異的な消化を考慮すべきことから、非特異的な消化を最小にするために、様々な順序で複数の工程を試験した。いくつかのＡＤＣを、他の工程を行うのに先立って、例えば、トリプシンで試料を消化するのに先立って、Ｇｌｕ－Ｃで試料を消化するのに先立って、または修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば標識する）のに先だって、まずパパインで消化して、ペイロードを除去した。

【0097】

複数の工程の好ましい順序は、図６Ｃに示されるとおり、まずＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、次いで、試料をトリプシンで消化し、次いで、トリプシンペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化し、次いで、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させ（例えば標識し）、次いで、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供するということであることを見いだした。

【0098】

ＡＤＣの分析から得られたトリプシンペプチドを、断片化に関してさらに調査した。リンカージペプチド構造上の徹底的な断片化に起因して、いくつかのペプチドの同定（ＩＤ）が改変された。切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）または切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫを分析し、小さな構成成分を生じる徹底的な断片化を観察した。図１９Ａは、切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫについて行った、リンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析結果を示している。図１９Ｂは、切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫについて行った、リンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析結果を示している。

【0099】

複合体形成部位を含有するいくつかのペプチドをサロゲートペプチドとして選択した。表１に示されるとおり、切断されたＬＫ１またはＬＫ３を含有するいくつかのペプチドを、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド、およびヒンジ領域ペプチドを含むサロゲートペプチドとして選択した。これらのサロゲートペプチドは、９５％超の関連ペプチドを包含していた。図２０Ａは、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける、特定のサロゲートペプチドの百分率を示している。図２０Ｂは、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示している。

【0100】

（表１）サロゲートペプチド

【0101】

パパイン消化条件は、サロゲートペプチドのピーク面積をモニタリングすることにより最適化した。ＭＡＢ１－ＬＫ１およびＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料を分析するために、異なるパパイン対基質比、例えば１：２０、１：５０、１：１００および１：２００を試験した。サロゲートペプチドの全ピーク面積は、パパイン濃度が高くなると減少した。図２１Ａは、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析した場合の、異なるパパイン対基質比でのサロゲートペプチドのピーク面積を示している。図２１Ｂは、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料を分析した場合の、異なるパパイン対基質比でのサロゲートペプチドのピーク面積を示している。結果は、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣおよびＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣの両方の場合に、１：２００のパパイン対基質比が好ましいことを示した。

【0102】

好ましい消化時間を選択するためにパパイン消化条件をさらに最適化した。インタクトなＬＫ１またはＬＫ３を含有するペプチドのピーク面積をモニタリングすることにより、パパイン消化中の異なるインキュベーション時間で、インタクトなリンカーペイロードの存在を検出した。図２２は、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えばＧＥＣ、ＳＣＤＫ、または１つもしくは２つのインタクトなＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示している。ＭＡＢ１－ＬＫ１のパパイン消化に関しては、ＬＫ１（Ｖａｌ－Ａｌａジペプチドを含有する）のインタクトなリンカーペイロードは、１時間のパパイン消化後に検出不可能となった。ＭＡＢ１－ＬＫ３のパパイン消化に関しては、ＬＫ３（Ｖａｌ－Ｃｉｔジペプチドを含有する）のインタクトなリンカーペイロードは、５分間のパパイン消化後に検出不可能となった。結果は、好ましいパパイン消化時間が１時間であることを示した。ＬＫ３、例えばＶａｌ－Ｃｉｔジペプチドを含有する基質のペイロードを除去するためのパパイン消化が完了するまでの時間は、ＬＫ１、例えばＶａｌ－Ａｌａジペプチドを含む基質と比較して短かった。

【0103】

好ましい消化時間を選択するために、切断されたリンカーペイロードをモニタリングすることによってパパイン消化条件をさらに最適化した。切断されたＬＫ１またはＬＫ３を含有するペプチドのピーク面積をモニタリングすることによって、パパイン消化中の異なるインキュベーション時間で、切断されたリンカーペイロードの存在を検出した。図２３は、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えばＧＥＣ、ＳＣＤＫ、または１つもしくは２つの切断されたＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示している。また、切断されたリンカーを含有しないヒンジペプチドのピーク面積もモニタリングした。ＬＫ１およびＬＫ３両方について、薬物ペイロードを除去するためのパパイン消化は、１時間のインキュベーション内で完了した。結果は、パパイン対基質比１：２００の条件下で、好ましいパパイン消化時間が１時間であることを示した。

【0104】

ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについてのＬＫ１複合体形成の部位特異的な定量化を、図２４Ａに示されるとおり、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドにおける複合体形成部位を分析することによって推定した。ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣについてのＬＫ３複合体形成の部位特異的な定量化を、図２４Ｂに示されるとおり、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドにおける複合体形成部位を分析することによって推定した。複合体形成の百分率は、特定のペプチド上に位置する複合体形成した薬物の百分率に基づいて推定した。例えば、ヒンジ領域の複合体形成の百分率は、以下の式：
複合体形成の百分率（ヒンジ領域）＝０×（０薬物の百分率）＋１×（１薬物の百分率）＋２×（２薬物の百分率）
に基づいて推定することができる。

【0105】

加えて、本出願の方法、例えば図６Ｃの方法は、良好な日内精度および日間精度を示したが、これは、本出願の方法による計算されたＤＡＲ値が、インタクト質量法と同等であったためである。図２５は、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する、本出願の方法の日内精度および日間精度を示している。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣおよびＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣを分析するためのリンカー－薬物複合体形成の部位特異的な定量化において、良好な日内および日間の精度が実証されたが、これは、計算された全ＤＡＲ値がインタクト質量法と同等であったためである。ＤＡＲ値は、以下の式：
ＤＡＲ＝［複合体形成比（ヒンジ領域）＋複合体形成比（ＧＥＣ）＋複合体形成比（ＳＣＤＫ）］×２
に基づいて計算した。

【0106】

ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣを、表２に示されるとおり、ロット間ばらつき、および異なる複合体形成部位上での複合体形成安定性に関して試験した。２つの異なるロットのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ、例えばＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２を試験して、薬物複合体形成の分布を観察した。ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８のＤＡＲ値は３．６であった。ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２のＤＡＲ値は３．６５であった。図２６は、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチド上の複合体形成部位を分析することによる、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２の薬物複合体形成分布のロット間ばらつきを示している。

【0107】

（表２）ロット間ばらつきと複合体形成安定性

【0108】

実施例９． ＳＣＤＫペプチドにおける複合体形成
サンダーソンら（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）によって、抗ＣＤ３０システイン結合ＡＤＣが抗体の重鎖上で複合体形成安定性に乏しいことが示された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｒｕｇ－ｌｉｎｋｅｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３０ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ １５；１１：８４３－８５２）ことから、システイン結合したＡＤＣの複合体形成安定性を分析した。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの分析を、ＬＫ１複合体形成の喪失を分析することにより、熱ストレス下で行った。図２７は、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジ領域ペプチドを、異なるｐＨ条件、例えばｐＨ５．５、ｐＨ６、およびｐＨ６．５で分析することによって得られた、４０℃、２８日間の熱ストレス下でのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣに対するＬＫ１複合体形成の喪失百分率を示している。結果は、ＳＣＤＫペプチドからＬＫ１複合体形成が２０％より大きく喪失したことが観察されたことを示した。この喪失百分率は、低いｐＨ条件下ほど増加した。

【0109】

マレイミド環加水分解と複合体形成保持の相関を調べた。マレイミド環加水分解の化学的機構を図２８に示す。図２９Ａは、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件下でＧＥＣ、ＳＣＤＫ、およびヒンジペプチドを分析することによって得られた、マレイミド環加水分解の百分率と複合体形成保持を示している。図２９Ｂは、複合体形成保持とマレイミド環加水分解との相関分析を示している。結果は、重鎖のＳＣＤＫ（２２５残基におけるＣ）でのマレイミド環加水分解の低い傾向が、複合体形成安定性が劣ることに起因する可能性があることを示した。

【0110】

実施例１０． リシン連結したＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化
ＭＡＢ２－ＬＫ５ ＡＤＣ、例えば、リシン連結したＡＤＣを、部位特異的な薬物複合体形成を定量化するために分析した。ＭＡＢ２－ＬＫ５ ＡＤＣを、図７に示されるとおり、パパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、アルキル化し、その後、ＡＤＣ試料をＧｌｕ－Ｃで消化してＧｌｕ－Ｃ消化ペプチド混合物を得て、ペプチド混合物をＡｓｐ－Ｎで消化し、そしてその後、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。部位特異的な薬物複合体形成を、切断されたリンカーを含有するペプチドと、切断されたリンカーを含有しない元のペプチドの定量化、例えば、部位特異的な薬物複合体形成＝（切断されたリンカーを含有するペプチドの量）／（切断されていないリンカーを含有するペプチド＋元のペプチドの量）に基づいて推定した。

【0111】

抗体の軽鎖のリシン２０８残基上の薬物複合体形成を、図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３０Ｃに示されるとおり、パパイン消化を用いて分析した。結果は、薬物脱複合体形成の完了時点で非特異的な切断がわずかであったことを示した。抗体の重鎖中のリシン３９３残基およびリシン３８９残基（ＨＣ Ｌｙｓ３９３／ＨＣ＊ Ｌｙｓ３８９）上の薬物複合体形成を、図３１Ａ、図３１Ｂ、および図３１Ｃに示されるとおり、パパイン消化を使用して分析した。結果は、薬物脱複合体形成の完了時点で非特異的な切断がわずかであったことを示した。抗体の軽鎖中のリシン６５残基上の薬物複合体形成を、図３２Ａ、図３２Ｂ、および図３２Ｃに示されるとおり、パパイン消化を使用して分析した。結果は、薬物脱結合体形成の完了時に非特異的な切断がわずかであったことを示した。抗体の軽鎖のリシン３９、４２、または４５残基上の薬物複合体形成を、図３３Ａ、図３３Ｂ、および図３３Ｃに示されるとおり、５５個のアミノ酸を含有するペプチドを分析することによって、パパイン消化を使用して分析した。結果は、わずかな非特異的な切断で薬物脱複合体形成が完了することを示した。二重複合体形成のための抗体の重鎖のリシン６４残基および７５残基（ＨＣ＊ Ｌｙｓ ６４およびＬｙｓ７５）上の薬物複合体形成を、図３４Ａおよび図３４Ｂに示されるとおり、パパイン消化を用いて分析した。結果は、薬物脱複合体形成により、低存在量のペプチド種の感度を高めることができることを示した。また、低存在量のペプチド種のピーク面積は２０倍よりも大きく増加した。抗体の重鎖のリシン１５１残基および１４７残基（ＨＣ Ｌｙｓ１５１／ＨＣ＊ Ｌｙｓ１４７）上の薬物複合体形成を、図３５Ａ、図３５Ｂ、および図３５Ｃに示されるとおり、パパイン消化を使用して分析した。結果は、１つのペプチドについては、薬物脱複合体形成が完了に達しないことを示した。

【0112】

薬物複合体形成を、４つの鎖について７３／７９のリシン残基上で定量化した。７３／７９のリシン残基の定量化結果は約９２．４％であった。図３６に示されるとおり、ＭＡＢ２－ＬＫ５について、様々なリシン残基上の薬物複合体形成の部位特異的な定量化を実行した。本出願の、プロテアーゼによって支援される薬物脱複合体形成（ＰＡＤＤ）法により、リシン連結したＡＤＣの様々なリシン残基上の薬物複合体形成の効率的かつ信頼性の高い部位特異的な定量化が可能になった。平均ＤＡＲ＝［ＨＣ中のユニークペプチド（ｕｎｉｑｕｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）による複合体形成％］の総和＋［ＨＣ＊中のユニークペプチドによる複合体形成％］の総和＋２×［ＬＣ中の複合体形成％＋ＨＣおよびＨＣ＊中の一定ペプチドにおける複合体形成％］の総和。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図36】

【手続補正書】

【提出日】2022-06-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0021】

[本発明1001]
以下の工程を含む、試料中の部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の少なくとも1つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも1つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法：
切断されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を生成するために、前記少なくとも1つのアタッチメントの一部分を切断する工程であって、前記アタッチメントが、前記切断されたリンカーを含む、工程；
前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質の、複合体形成していない複合体形成部位に、修飾されたリンカーを付加する工程；
前記切断されたリンカーおよび／または前記修飾されたリンカーを含有するペプチドまたはタンパク質を同定するために、前記試料を質量分析に供する工程。
[本発明1002]
前記少なくとも1つのアタッチメントが、リンカーおよびペイロードを含み、前記アタッチメントの、切断された部分が、前記ペイロードを含み、前記リンカーが、前記切断されたリンカーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記切断されたリンカーおよび前記修飾されたリンカーの定量化に基づいて、前記アタッチメントの部位特異的な複合体形成を定量化または特性評価する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記質量分析が、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、
前記質量分析器を、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができ、
前記質量分析器が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記アタッチメントの一部分を切断するのに先立って、および／または前記複合体形成していない複合体形成部位に、前記修飾されたリンカーを付加するのに先立って、前記ペプチドまたはタンパク質を酵素で処理する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記試料を前記質量分析に供するのに先立って、前記試料を酵素で処理する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
酵素、プロテアーゼ、化学物質、酸、塩基、または還元剤を用いて、前記アタッチメントの前記一部分を切断する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記複合体形成していない複合体形成部位に、前記修飾されたリンカーを付加する前記工程が、前記アタッチメントの前記一部分を切断する前記工程を実行するのに先立って実行される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記アタッチメントの前記一部分を切断する前記工程が、前記修飾されたリンカーを付加する前記工程および前記試料を前記質量分析に供する前記工程を実行するのに先立って実行される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記修飾されたリンカーの分子量が、前記切断されたリンカーの分子量と異なる、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記酵素がトリプシンである、本発明1005の方法。
[本発明1012]
パパイン、カテプシンＢ、またはプラスミンを用いて前記アタッチメントの前記一部分を切断する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記酵素がＧｌｕ－Ｃである、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記特定の複合体形成部位または前記複合体形成していない複合体形成部位が、前記ペプチドまたはタンパク質のシステイン残基の内部に位置する、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記アタッチメントが、マレイミド付着基を通じて、前記少なくとも1つの特定の複合体形成部位に連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記ペプチドまたはタンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記リンカーが、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド含有リンカー、ピロリン酸ジエステルリンカー、またはヒドラゾンリンカーである、本発明1002の方法。
[本発明1018]
前記リンカーがペプチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1019]
前記リンカーが、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む、本発明1002の方法。
[本発明1020]
前記リンカーが、ポリエチレングリコールを含む、本発明1002の方法。
[本発明1021]
前記リンカーが、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）を含む、本発明1002の方法。
[本発明1022]
前記修飾されたリンカーが、ポリエチレングリコールを含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記修飾されたリンカーが、マレイミド付着基を通じて、前記複合体形成していない複合体形成部位に付加される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、本発明1002の方法。
[本発明1025]
前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式Ｉ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒがリンカーであり、Ｘがペイロードである、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記リンカーが、ポリエチレングリコールを含み、前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式ＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ ₁ が、スペーサーであり、Ｒ ₂ が、－Ｈまたは－ＣＨ ₃ であり、Ｒ ₃ が、－ＣＨ ₃ 、または－（ＣＨ ₂ ） ₃ ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ ₂ であり、Ｘが、ペイロードである、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記スペーサーが、ポリエチレングリコールを含み、前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記部分的に複合体形成したペプチドまたはタンパク質が、式ＩＩＩ：

の複合体形成したペプチドまたはタンパク質からなる群から選択され、
式中、Ｒ ₁ が、第1のスペーサーであり、Ｒ ₂ が、－Ｈまたは－ＣＨ ₃ であり、Ｒ ₃ が、－ＣＨ ₃ または－（ＣＨ ₂ ） ₃ ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ ₂ であり、Ｒ ₄ が、第2のスペーサーであり、Ｘが、ペイロードである、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記第1のスペーサーが、ポリエチレングリコールを含み、前記第2のスペースが、パラアミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、またはパラアミノベンジルアルコール（ＰＡＢＡ）を含み；前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
以下の工程を含む、試料中の部分的に複合体形成したタンパク質の少なくとも1つの特定の複合体形成部位に連結された少なくとも1つのアタッチメントの複合体形成を定量化または特性評価する方法：
切断されたリンカーを含有するタンパク質を生成するために、第1の酵素を用いて前記少なくとも1つのアタッチメントの一部分を切断する工程であって、前記アタッチメントが、前記切断されたリンカーを含む、工程と；
ペプチド混合物を得るために、前記試料を第2の酵素に供する工程と；
切断されたリンカーを含有するペプチドおよび／または切断されたリンカーを含有しないペプチドの定量化または特性評価に基づき、前記少なくとも1つの特定の複合体形成部位を定量化または特性評価するために、前記ペプチド混合物を質量分析に供する工程。
[本発明1032]
前記少なくとも1つの特定の複合体形成部位が、前記タンパク質のリシン残基の内部に位置する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記少なくとも1つのアタッチメントが、リンカーおよびペイロードを含み、前記少なくとも1つのアタッチメントの切断された部分が、前記ペイロードを含み、前記リンカーが、前記切断されたリンカーを含む、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記質量分析が、質量分析器、エレクトロスプレーイオン化質量分析器、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析器、またはトリプル四重極質量分析器を用いて実行され、
前記質量分析器を、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができ、
前記質量分析器が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することが可能である、本発明1031の方法。
[本発明1035]
前記ペプチド混合物を前記質量分析に供するのに先立って、前記ペプチド混合物を第3の酵素で処理する工程をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1036]
前記第1の酵素が、パパイン、カテプシンＢ、もしくはプラスミンである；および／または前記第2の酵素が、Ｇｌｕ－Ｃもしくはトリプシンである、本発明1031の方法。
[本発明1037]
前記第3の酵素が、Ａｓｐ－ＮまたはＧｌｕ－Ｃである、本発明1035の方法。
[本発明1038]
前記タンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体のＦｃ領域、または融合タンパク質である、本発明1031の方法。
[本発明1039]
前記リンカーが、バリン－アラニン、フェニルアラニン－リシン、バリン－シトルリン、またはそれらの誘導体を含む、本発明1033の方法。
[本発明1040]
前記ペイロードが、薬物、化合物、毒素、細胞毒性剤、抗有糸分裂剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、アマニチン類似体、チューブリシン類似体、化学療法薬物、微小管重合阻害剤、または微小管重合促進剤である、本発明1033の方法。
本発明の、これらおよび他の態様は、以下の記載および添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され理解されよう。以下の記載は、様々な実施形態およびそれらの多くの具体的な細部を示しつつ、例示によって与えられるものであり、限定するものではない。本発明の範囲内で多くの置き換え、修正、追加、または並べ替えを行ってもよい。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0022】

【図1】図１は、薬物がリンカーを通じて抗体と複合体形成した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を示す。ＡＤＣの抗体成分は、標的細胞の腫瘍抗原に結合し、次いでＡＤＣ抗原複合体は、受容体媒介性エンドサイトーシスを受ける。ＡＤＣの薬物成分は、ＡＤＣのリソソーム分解またはリンカーの切断により放出される可能性がある。

【図2】図２は、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））の化学構造を示す。

【図3】図３は、マレイミドアルキル化を通じてリンカーを抗体と複合体形成させることによるシステイン結合を示す。

【図4】図４は、チオール交換または逆反応を経ることによる、システイン複合体形成したＡＤＣについてのチオール－マレイミド複合体形成に関連した脱複合体形成を示す。

【図5A】図５Ａは、いくつかの態様によるＡＤＣの化学構造を示す。各ＡＤＣは、抗体と、リンカーによってつながったペイロードとを含み、リンカーは、いくつかの態様によれば、マレイミド付着基を使用してペプチドまたはタンパク質のシステイン残基のスルフヒドリル基に付着させる。

【図5B】図５Ｂは、いくつかの態様によるＡＤＣの化学構造を示す。各ＡＤＣは、抗体と、リンカーによってつながったペイロードとを含み、リンカーは、いくつかの態様によれば、活性化されたカルボン酸エステルまたはＮＨＳエステルを使用しリシンアミド結合を通じてペプチドまたはタンパク質のリシン残基に付着させる。

【図6A】図６Ａは、例示的な実施形態による、ＡＤＣをトリプシンにより消化し、トリプシンペプチド混合物をパパインで消化してペイロードを除去することと；修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）ことと；ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化することと；ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することと、を含む本出願の例示的方法を示す。

【図6B】図６Ｂは、例示的な実施形態による、ＡＤＣをトリプシンで消化し、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させる（例えば、標識する）ことと；ペプチド混合物をパパインで消化してペイロードを除去することと；ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化することと；ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供することと、を含む本出願の例示的な方法を示す。

【図6C】図６Ｃは、例示的な実施形態による、ＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、ＡＤＣ試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチド混合物を得、トリプシンペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化し、修飾されたリンカーを、複合体形成していないスルフヒドリル基と複合体形成させ（例えば標識し）、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供すること、を含む本出願の例示的な方法を示す。

【図7】図７は、例示的な実施形態による、ＡＤＣ試料をパパインで消化してペイロードを除去し、その後、還元および変性させ、その後、アルキル化し、その後、ＡＤＣ試料をＧｌｕ－Ｃにより消化してＧｌｕ－Ｃ消化されたペプチド混合物を得、ペプチド混合物をＡｓｐ－Ｎで消化し、そしてその後、ペプチド混合物をＬＣ－ＭＳ分析に供すること、を含む本出願の例示的方法を示す。

【図8A】図８Ａは、例示的な実施形態による、マレイミド付着基を通じてタンパク質とペイロードをつなぐリンカー、例えば、ＬＫ１リンカーのアタッチメントを示す。マレイミド付着基は、ペプチドまたはタンパク質のスルフヒドリル基（－ＳＨ）に付着する。ＬＫ１リンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡ）のアタッチメントは、ＰＥＧ８（ポリエチレングリコール－８）と、バリン－アラニンジペプチド（ＶＡジペプチド）と、ＰＡＢＡとを含む。ＳＧ３１９９は、薬物ペイロードである。

【図8B】図８Ｂは、例示的な実施形態による、切断されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ）のアタッチメント、例えば、切断されたＬＫ１のアタッチメントを示しており、これは、ＰＡＢＡと薬物ペイロードとの除去によりペイロードを放出させるＬＫ１のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8C】図８Ｃは、例示的な実施形態による、ＬＫ１の修飾されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＣＯＯＨ）のアタッチメント、例えば、ＬＫ２のアタッチメントを示す。

【図8D】図８Ｄは、例示的な実施形態による、マレイミド付着基を通じてタンパク質とペイロードをつなぐリンカー、例えばＬＫ３リンカーのアタッチメントを示す。マレイミド付着基は、ペプチドまたはタンパク質のスルフヒドリル基（－ＳＨ）に付着する。ＬＫ３リンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ）のアタッチメントは、バリン－シトルリンジペプチド（ＶＣｉｔジペプチド）とＰＡＢＡとを含む。メイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）はは、薬物ペイロードである。

【図8E】図８Ｅは、例示的な実施形態による、切断されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）のアタッチメント、例えば切断されたＬＫ３のアタッチメントを示しており、これは、ＰＡＢＡと薬物ペイロードとの除去によりペイロードを放出させるＬＫ３のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8F】図８Ｆは、例示的な実施形態による、ＬＫ３の修飾されたリンカー（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）のアタッチメント、例えば、ＬＫ４のアタッチメントを示す。

【図8G】図８Ｇは、例示的な実施形態による、ＬＫ５リンカー、例えば、タンパク質とペイロードをつなぐ酵素切断部位としてバリン－シトルリンジペプチドを含むａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＮＭｅのアタッチメントを示す。細胞毒性化合物であるメイタンシノイド（Ｍａｙ）は、例示的な実施形態による、ＬＫ５に担持される薬物ペイロードである。

【図8H】図８Ｈは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ５、例えばａｄｉｐ－Ｖａｌ－Ｃｉｔのアタッチメントを示しており、これは、ペイロードを放出させるＬＫ５のプロテアーゼ消化の後に生成されるものである。

【図8I】図８Ｉは、例示的な実施形態による、抗体の、複合体形成していないリシン残基の化学構造を示す。

【図9A】図９Ａは、抗体の鎖間ジスルフィド結合を示しており、これらは還元されてスルフヒドリル基（－ＳＨ）を誘導した。次いで、スルフヒドリル基は、例示的な実施形態により、ＡＤＣを調製するための複合体形成部位として使用された。図９Ａは、出現順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１３、および１３をそれぞれ開示している。

【図9B】図９Ｂは、ＬＫ１リンカーとペイロード薬物ＳＧ３１９９とを含有するＡＤＣを示す。ＡＤＣ、例えば、Ａｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－ＶＡ－ＰＡＢＡ－ＳＧ３１９９は、例示的な実施形態により、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。図９Ｂは、出現順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４～１５をそれぞれ開示している。

【図9C】図９Ｃは、ＬＫ３リンカーとペイロード薬物メイタンシノイドとを含有するＡＤＣを示す。ＡＤＣ、例えば、Ａｂ－ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－メイタンシノイドは、例示的な実施形態により、薬物ペイロードを放出する切断部位を有する。

【図10】図１０は、例示的な実施形態による、インタクト質量を用いたＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物抗体比の決定を示す。（Ｘ軸：強度／［カウント］、Ｙ軸：１．４５ｅ５から１．５８ｅ５までの観察質量［ｍ／ｚ］）。

【図11】図１１は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣからパパインを用いて薬物ペイロードを除去した結果を示す。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物を得た。２つのトリプシンペプチド、例えば、ＳＣＤＫ（セリン－システイン－アスパラギン酸－リシン）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＧＥＣ（グリシン－グルタミン酸－システイン）を、例示的な実施形態により、ＬＣ－ＭＳを使用して分析した。ＬＫ１は、質量分析時に＋１４９５．７（ペイロードを含む）と指定され、切断されたＬＫ１は＋７６２．２と指定される。

【図12】図１２Ａは、パパインが、かさ高い疎水性アミノ酸または芳香族アミノ酸に近い部位を優先的に切断するプロテアーゼであることを示す。図１２Ｂは、抗体のヒンジ領域に元々位置するトリプシンペプチドのアミノ酸配列を示す。このトリプシンヒンジ領域ペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１））は、複数のパパイン切断部位を含有する。パパイン切断部位は、矢印記号で表示されている。

【図13】図１３Ａ～１３Ｃは、例示的な実施形態による、パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチドの分析結果を示す。図１３Ａは、例示的な実施形態による、トリプシンヒンジ領域ペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１））の分析結果を示す。図１３Ｂは、例示的な実施形態による、ＣＰＰＣＰＡＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２）のアミノ酸配列を有するペプチド（パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）の分析結果を示す。図１３Ｃは、例示的な実施形態による、ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３）のアミノ酸配列を有するペプチド（パパインで消化されたトリプシンヒンジ領域ペプチド）の分析結果を示す。これらのペプチドは、ＬＫ１（ペイロードを含め、＋１４９５．７と指定される）または切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定される）を含有する場合がある。

【図14】図１４は、例示的な実施形態による、ヒンジ領域ペプチドについてのリンカー標識の効率を示す。ヒンジ領域ペプチドは、２つのシステイン残基を含有する。ヒンジ領域ペプチドの大部分は、二重標識を有する。

【図15】図１５は、例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＳに供するのに先立つ試料のＧｌｕ－Ｃ消化の分析結果を示す。ヒンジ領域ペプチドのプロファイルが顕著に減少し、これによって、ＬＣ－ＭＳを用いた定量化が顕著に簡略化された。図１５は、出現順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６および１６をそれぞれ開示している。

【図16】図１６は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化を示す。２つのペプチド、例えば、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）またはＧＥＣのアミノ酸配列を有するペプチドのピーク面積を示してある。これらのペプチドは、切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定される）および／またはＬＫ２（＋５９２．３と指定される）を含有する場合がある。

【図17】図１７は、例示的な実施形態による、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する、本出願の方法の日内精度を示す。

【図18】図１８Ａおよび１８Ｂは、例示的な実施形態による、２つの方法の比較結果を示す。図１８Ａは、例示的な実施形態による、図６Ａに示す方法としてパパイン消化の実行の後にＬＫ２付着させた結果を示す。図１８Ｂは、例示的な実施形態による、図６Ｂに示す方法としてＬＫ２付着の実行の後にパパイン消化を行った結果を示す。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析した。切断されたＬＫ１は＋７６２．４と指定される。ＬＫ２は＋５９２．３と指定される。（＋５９２．３，＋５９２．３）は、複合体形成がゼロであることを示す。（＋７６２．４，＋５９２．３）は、薬物複合体形成が１つであることを示す。（＋７６２．４，＋７６２．４）は、例示的な実施形態による薬物複合体形成が２つであることを示す。

【図19A】図１９Ａは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）についてのリンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析を示す。

【図19B】図１９Ｂは、例示的な実施形態による、切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）についてのリンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析を示す。

【図20A】図２０Ａは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示す。図２０Ａは、出現順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、８、および７をそれぞれ開示している。

【図20B】図２０Ｂは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示す。図２０Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を開示している。

【図21A】図２１Ａは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を分析する場合の、パパイン対基質比が異なるところでのサロゲートペプチドのピーク面積を示す。図２１Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を開示している。

【図21B】図２１Ｂは、例示的な実施形態による、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料を分析する場合の、パパイン対基質比が異なるところでのサロゲートペプチドのピーク面積を示す。図２１Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を開示している。

【図22】図２２は、例示的な実施形態による、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えば、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、または１つもしくは２つのインタクトなＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示す。

【図23】図２３は、例示的な実施形態による、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えば、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、または１つもしくは２つの切断されたＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示す。例示的な実施形態により、切断されたリンカーを含有しないヒンジペプチドのピーク面積もモニタリングした。

【図24】図２４Ａは、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドのところでの複合体形成部位を分析することにより、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについてのＬＫ１複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。図２４Ｂは、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびヒンジ領域ペプチドのところでの複合体形成部位を分析することにより、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣについてのＬＫ３複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。

【図25】図２５は、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する本出願の方法の日内精度および日間精度を示す。図２５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として「ＣＰＰＣＰＡＰＥ」を開示している。

【図26】図２６は、例示的な実施形態による、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチド上の複合体形成部位を分析することによって得られた、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２の薬物複合体形成分布のロット間ばらつきを示す。

【図27】図２７は、例示的な実施形態による、ｐＨ５．５、ｐＨ６、およびｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件でＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドを分析することにより、４０℃、２８日間熱ストレス下でＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについて得られた、ＬＫ１複合体形成の喪失百分率を示す。

【図28】図２８は、例示的な実施形態による、マレイミド環加水分解の化学的機構を示す。

【図29】図２９Ａは、例示的な実施形態による、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件下でＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジペプチドを分析することによって得られた、マレイミド環加水分解および複合体形成保持の百分率を示す。図２９Ｂは、例示的な実施形態による、複合体形成保持とマレイミド環加水分解との間の相関分析の結果を示す。

【図30A】図３０Ａ～３０Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン２０８残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３０Ａ～３０ＣはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を開示している。

【図30B】同上。

【図30C】同上。

【図31A】図３１Ａ～３１Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の重鎖におけるリシン３９３およびリシン３８９残基（ＨＣ Ｌｙｓ３９３／ＨＣ＊ Ｌｙｓ３８９）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３１Ａ～３１ＣはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を開示している。

【図31B】同上。

【図31C】同上。

【図32A】図３２Ａ～３２Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン６５残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３２Ａ～３２ＣはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を開示している。

【図32B】同上。

【図32C】同上。

【図33A】図３３Ａ～３３Ｃは、例示的な実施形態による、５５個のアミノ酸を含有するペプチドを分析することにより、パパイン消化を用いて抗体の軽鎖におけるリシン３９、４２、または４５残基上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３３Ａ～３３ＣはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を開示している。

【図33B】同上。

【図33C】同上。

【図34】図３４Ａ～３４Ｂは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて、二重複合体形成について抗体の重鎖におけるリシン６４および７５残基（ＨＣ^＊Ｌｙｓ６４およびＬｙｓ７５）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３４Ａ～３４ＢはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を開示している。

【図35A】図３５Ａ～３５Ｃは、例示的な実施形態による、パパイン消化を用いて抗体の重鎖におけるリシン１５１および１４７残基（ＨＣ Ｌｙｓ１５１／ＨＣ＊ Ｌｙｓ１４７）上の薬物複合体形成を分析した結果を示す。図３５Ａ～３５ＣはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を開示している。

【図35B】同上。

【図35C】同上。

【図36】図３６は、例示的な実施形態による、ＭＡＢ２－ＬＫ５について様々なリシン残基上の薬物複合体形成の部位特異的な定量化を行った結果を示す。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0081】

３． Ｇｌｕ－Ｃ消化
Ｇｌｕ－Ｃは、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））から単離されたセリンプロテアーゼである。Ｇｌｕ－Ｃ、例えばＶ－８プロテアーゼは、エンドプロテイナーゼであり、炭酸水素アンモニウムおよび酢酸アンモニウムの緩衝液中で反応を行うと、グルタミン残基のカルボキシル側を特異的に切断し、限られた数のペプチド断片を生成する。Ｇｌｕ－Ｃ切断はまた、リン酸塩緩衝液中でグルタミン残基とアスパラギン残基の両方で生じ得る。Ｇｌｕ－Ｃは、質量分析によるタンパク質同定用途において、配列のカバレッジを向上させる非常に特異的なエンドプロテイナーゼである。Ｇｌｕ－Ｃは単独で、またはトリプシンもしくは他のプロテアーゼと併せて使用して、ペプチドのマッピングおよびタンパク質配列決定のための相補的なタンパク質消化物を生成させることができる。Ｇｌｕ－Ｃはヒンジ領域ペプチドＣ末端の不均質性（ＴＨ↑Ｔ↑ＣＰＰＣＰＡＰＥ↑Ｌ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を低減させることができる。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0086】

実施例２． ＡＤＣからのペイロードの除去
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣのペイロードを除去するのにパパインを使用した。パパイン（１ｍｇ／ｍＬ）をパパイン活性化緩衝液（１．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭのメルカプトエタノール、５．５ｍＭのシステイン）中、３７℃で３０分間、活性化した。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化し、トリプシンペプチド混合物を得た。次いで、トリプシンペプチド混合物を、活性化されたパパインを用いて３７℃で約４時間以下の間、消化して、ペイロード、例えばＳＧ３１９９を除去した。酵素対基質の比は１：２０である。重鎖と軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を還元した。２つのトリプシンペプチド、例えばＳＣＤＫ（セリン－システイン－アスパラギン酸－リシン）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびＧＥＣ（グリシン－グルタミン酸－システイン）を、ＬＣ－ＭＳを用いて分析した。図１１に示されるとおり、ペイロードは１時間以内で完全に除去された。パパインは、ＬＫ１リンカーのバリン－アラニンジペプチドを認識することができる。パパインの切断部位は、図９Ｂに示されるとおり、バリン－アラニンジペプチドとＰＡＢＡとの間にある。ＰＡＢＡとＳＧ３１９９が、パパイン消化後にＬＫ１リンカーのアタッチメントから除去された結果、質量喪失が生じた。ＬＫ１を含有するトリプシンペプチドは、図１１で＋１４９５．７（ペイロードを含む）と標識される。切断されたＬＫ１を含有するトリプシンペプチドは、図１１で＋７６２．４と標識される。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0087】

パパイン消化による除去ペイロードの完全な切断は、１：２０の酵素対基質比で、３７℃、１時間で達成された。可逆的パパイン阻害剤（ＧＧＹＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）など）または非可逆的パパイン阻害剤（キオムスタチンなど）を、９５℃、２０分間の加熱工程と併用することによってパパイン活性をクエンチして、消化反応を終了させた。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0091】

実施例５． ＬＣ－ＭＳ分析に先立つＧｌｕ－Ｃ消化
ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣをトリプシンで消化して、トリプシンペプチド混合物を生成した。パパインを使用して、ＬＫ１中のバリン－アラニンジペプチドを認識させてペイロードを除去した。パパインは、トリプシンペプチドをさらに小さい断片に消化することもできる。トリプシンペプチド混合物をパパインで消化し（約３０分）、次いで、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、パパイン性トリプシンペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。ＬＫ２標識の後、ＬＣ－ＭＳ分析の実行に先立って、ペプチド混合物をＧｌｕ－Ｃで消化した。パパイン消化後、９個を超えるヒンジ領域ペプチドが得られた。Ｇｌｕ－Ｃの使用に起因して、ヒンジ領域ペプチドのプロファイルは、３つのペプチド（ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６）、ＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５）、およびＣＰＰＣＰＡＰＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４）のアミノ酸配列）に減少しており、これにより、図１５に示されるとおり、ＬＣ－ＭＳを用いた定量化が著しく単純化された。Ｇｌｕ－Ｃ消化の場合、酵素対基質比は、３７℃、約３時間で１：２０である。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0092】

実施例６． ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化
２つのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えば一つは低ＤＡＲのもの、およびもう一つは高ＤＡＲのものを、図６Ａに示されるとおり本出願の方法によって分析し、ここで、パパインを用いてペイロードを除去する工程は、修飾されたリンカーを、複合体形成していない複合体形成部位に付加する工程を実行するのに先立って実行した。２つのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料をトリプシンで消化してトリプシンペプチド混合物を生成し、次いでパパインで消化して、ＬＫ１中のバリン－アラニンジペプチドを認識させて、ペイロードを除去した。次に、修飾されたリンカー、例えばＬＫ２を用いて、パパイン性トリプシンペプチドの、複合体形成していない複合体形成部位を標識した。ＬＫ２標識後、ペプチドをＧｌｕ－Ｃで消化し、その後、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。低ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えばＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ１９は、１．９という推定ＤＡＲを有する（インタクト、ＥＳＩ）。高ＤＡＲを有するＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料、例えば、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８は、３．６という推定ＤＡＲを有する（インタクト、ＥＳＩ）。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料を、それぞれ三組調製した（ｎ＝３）。図１６に、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの薬物複合体形成の部位特異的な定量化を示す。２つのペプチド、例えば、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）またはＧＥＣのアミノ酸配列を有するペプチドのピーク面積を示した。これらのペプチドは、切断されたＬＫ１（＋７６２．４と指定）および／またはＬＫ２（＋５９２．３と指定）を含有する場合がある。ＬＫ２（＋５９２．３）を含有するペプチドのピーク面積は、元々複合体形成していなかった複合体形成部位を定量化していることを示している。切断されたＬＫ１（＋７６２．４）を含有するペプチドのピーク面積は、１つの薬物ペイロードと元々複合体形成していた複合体形成部位の定量化を示している。加えて、本出願の方法、例えば図６Ａの方法は、図１７に示されるとおり良好な日内精度を示したが、これは、本出願の方法による計算されたＤＡＲ値が、インタクト質量法と同等であったからである。図１７に、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドの分析結果を示す。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0098】

ＡＤＣの分析から得られたトリプシンペプチドを、断片化に関してさらに調査した。リンカージペプチド構造上の徹底的な断片化に起因して、いくつかのペプチドの同定（ＩＤ）が改変された。切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）または切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を分析し、小さな構成成分を生じる徹底的な断片化を観察した。図１９Ａは、切断されたＬＫ１（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－ＰＥＧ８－Ｖａｌ－Ａｌａ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）について行った、リンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析結果を示している。図１９Ｂは、切断されたＬＫ３（ｍａｌ－ａｍｉｄｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含有するトリプシンペプチドＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）について行った、リンカージペプチド構造の徹底的な断片化の質量分析結果を示している。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0099】

複合体形成部位を含有するいくつかのペプチドをサロゲートペプチドとして選択した。表１に示されるとおり、切断されたＬＫ１またはＬＫ３を含有するいくつかのペプチドを、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドを含むサロゲートペプチドとして選択した。これらのサロゲートペプチドは、９５％超の関連ペプチドを包含していた。図２０Ａは、ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける、特定のサロゲートペプチドの百分率を示している。図２０Ｂは、ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣ試料について同定されたあらゆるペプチドにおける特定のサロゲートペプチドの百分率を示している。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１００

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0100】

（表１）サロゲートペプチド

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0102】

好ましい消化時間を選択するためにパパイン消化条件をさらに最適化した。インタクトなＬＫ１またはＬＫ３を含有するペプチドのピーク面積をモニタリングすることにより、パパイン消化中の異なるインキュベーション時間で、インタクトなリンカーペイロードの存在を検出した。図２２は、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えばＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、または１つもしくは２つのインタクトなＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示している。ＭＡＢ１－ＬＫ１のパパイン消化に関しては、ＬＫ１（Ｖａｌ－Ａｌａジペプチドを含有する）のインタクトなリンカーペイロードは、１時間のパパイン消化後に検出不可能となった。ＭＡＢ１－ＬＫ３のパパイン消化に関しては、ＬＫ３（Ｖａｌ－Ｃｉｔジペプチドを含有する）のインタクトなリンカーペイロードは、５分間のパパイン消化後に検出不可能となった。結果は、好ましいパパイン消化時間が１時間であることを示した。ＬＫ３、例えばＶａｌ－Ｃｉｔジペプチドを含有する基質のペイロードを除去するためのパパイン消化が完了するまでの時間は、ＬＫ１、例えばＶａｌ－Ａｌａジペプチドを含む基質と比較して短かった。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0103】

好ましい消化時間を選択するために、切断されたリンカーペイロードをモニタリングすることによってパパイン消化条件をさらに最適化した。切断されたＬＫ１またはＬＫ３を含有するペプチドのピーク面積をモニタリングすることによって、パパイン消化中の異なるインキュベーション時間で、切断されたリンカーペイロードの存在を検出した。図２３は、異なるインキュベーション時間での、ＬＫ１またはＬＫ３を含有するサロゲートペプチド、例えばＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、または１つもしくは２つの切断されたＬＫ１もしくはＬＫ３を含有するヒンジペプチドのピーク面積を示している。また、切断されたリンカーを含有しないヒンジペプチドのピーク面積もモニタリングした。ＬＫ１およびＬＫ３両方について、薬物ペイロードを除去するためのパパイン消化は、１時間のインキュベーション内で完了した。結果は、パパイン対基質比１：２００の条件下で、好ましいパパイン消化時間が１時間であることを示した。

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0104】

ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣについてのＬＫ１複合体形成の部位特異的な定量化を、図２４Ａに示されるとおり、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドにおける複合体形成部位を分析することによって推定した。ＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣについてのＬＫ３複合体形成の部位特異的な定量化を、図２４Ｂに示されるとおり、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドにおける複合体形成部位を分析することによって推定した。複合体形成の百分率は、特定のペプチド上に位置する複合体形成した薬物の百分率に基づいて推定した。例えば、ヒンジ領域の複合体形成の百分率は、以下の式：
複合体形成の百分率（ヒンジ領域）＝０×（０薬物の百分率）＋１×（１薬物の百分率）＋２×（２薬物の百分率）
に基づいて推定することができる。

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0105】

加えて、本出願の方法、例えば図６Ｃの方法は、良好な日内精度および日間精度を示したが、これは、本出願の方法による計算されたＤＡＲ値が、インタクト質量法と同等であったためである。図２５は、ＧＥＣペプチド、ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドのＤＡＲの分析結果に関する、本出願の方法の日内精度および日間精度を示している。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣおよびＭＡＢ１－ＬＫ３ ＡＤＣを分析するためのリンカー－薬物複合体形成の部位特異的な定量化において、良好な日内および日間の精度が実証されたが、これは、計算された全ＤＡＲ値がインタクト質量法と同等であったためである。ＤＡＲ値は、以下の式：
ＤＡＲ＝［複合体形成比（ヒンジ領域）＋複合体形成比（ＧＥＣ）＋複合体形成比（ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））］×２
に基づいて計算した。

【手続補正15】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0106】

ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣを、表２に示されるとおり、ロット間ばらつき、および異なる複合体形成部位上での複合体形成安定性に関して試験した。２つの異なるロットのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣ、例えばＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２を試験して、薬物複合体形成の分布を観察した。ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８のＤＡＲ値は３．６であった。ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２のＤＡＲ値は３．６５であった。図２６は、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチド上の複合体形成部位を分析することによる、ＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ８およびＭＡＢ１－ＬＫ１－Ｌ２２の薬物複合体形成分布のロット間ばらつきを示している。

【手続補正16】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0108】

実施例９． ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）における複合体形成
サンダーソンら（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）によって、抗ＣＤ３０システイン結合ＡＤＣが抗体の重鎖上で複合体形成安定性に乏しいことが示された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｒｕｇ－ｌｉｎｋｅｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ３０ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ １５；１１：８４３－８５２）ことから、システイン結合したＡＤＣの複合体形成安定性を分析した。ＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣの分析を、ＬＫ１複合体形成の喪失を分析することにより、熱ストレス下で行った。図２７は、ＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジ領域ペプチドを、異なるｐＨ条件、例えばｐＨ５．５、ｐＨ６、およびｐＨ６．５で分析することによって得られた、４０℃、２８日間の熱ストレス下でのＭＡＢ１－ＬＫ１ ＡＤＣに対するＬＫ１複合体形成の喪失百分率を示している。結果は、ＳＣＤＫペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）からＬＫ１複合体形成が２０％より大きく喪失したことが観察されたことを示した。この喪失百分率は、低いｐＨ条件下ほど増加した。

【手続補正17】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0109】

マレイミド環加水分解と複合体形成保持の相関を調べた。マレイミド環加水分解の化学的機構を図２８に示す。図２９Ａは、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５を含む異なるｐＨ条件下でＧＥＣ、ＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびヒンジペプチドを分析することによって得られた、マレイミド環加水分解の百分率と複合体形成保持を示している。図２９Ｂは、複合体形成保持とマレイミド環加水分解との相関分析を示している。結果は、重鎖のＳＣＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）（２２５残基におけるＣ）でのマレイミド環加水分解の低い傾向が、複合体形成安定性が劣ることに起因する可能性があることを示した。

【手続補正18】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022553932000001.app

【国際調査報告】