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特表2022-554054非アルコール性脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療に使用される化合物（特にＲＩＰＡ－５６）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-28
(54)【発明の名称】非アルコール性脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療に使用される化合物（特にＲＩＰＡ－５６）
(51)【国際特許分類】
C07C 239/14 20060101AFI20221221BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/165 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/02 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/68 20060101ALI20221221BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20221221BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20221221BHJP
【ＦＩ】
C07C239/14 CSP
A61P1/16
A61K31/165
A61K9/08
A61K9/20
A61K9/70
A61K9/06
A61K9/14
A61K9/48
A61K9/02
A61K9/10
A61K9/68
A23L33/10
A23L2/00 F
A23L2/52
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516621
(86)(22)【出願日】2020-10-23
(85)【翻訳文提出日】2022-04-26
(86)【国際出願番号】 EP2020079932
(87)【国際公開番号】W WO2021078958
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】19306380.7
(32)【優先日】2019-10-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507416908
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】509000747
【氏名又は名称】アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル（イエヌエスエエールエム）
(71)【出願人】
【識別番号】505132183
【氏名又は名称】アシスタンス プブリク－オピトウ ドゥ パリ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴーテロン ジェレミー
(72)【発明者】
【氏名】ラツィウ ヴラド
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
4C076
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4B018MD18
4B018ME14
4B117LC04
4B117LK06
4C076AA01
4C076AA06
4C076AA09
4C076AA11
4C076AA22
4C076AA36
4C076AA53
4C076AA69
4C076AA72
4C076CC09
4C076FF70
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206HA16
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA75
4H006AA01
4H006AB27
(57)【要約】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、特に脂肪肝又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防及び／又は治療に使用される、化合物及び該化合物を含む組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に使用される、式（Ｉ）：【化1】
Ｒ１は、任意選択でフッ素化又はメチル化されたフェニルであり、
Ｒ２は、任意選択でフッ素化された１，１－ジメチルプロピルである）の化合物、又はその薬学上許容される塩若しくは水和物。
【請求項2】
前記化合物は、【化2】
又はその薬学上許容される塩若しくは水和物である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項3】
ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に使用される、活性成分として請求項１又は２に記載の化合物少なくとも１種と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項4】
前記化合物又は前記組成物は、経腸又は非経口経路で投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための化合物又は組成物。
【請求項5】
前記化合物又は前記組成物は、液剤、食物、飲料、丸剤、錠剤、シロップ剤、パッチ、ガム、クリーム、ゲル、ローション、軟膏、散剤、カプセル剤、バイアル、又は坐剤の形状にある、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための化合物又は組成物。
【請求項6】
前記化合物又は前記組成物は、前記化合物が１ｍｇ～１０００ｍｇ、特に５０ｍｇ～５００ｍｇ、より詳細には１００～３００ｍｇの単位剤形に製剤化されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のための化合物又は組成物。
【請求項7】
前記化合物又は前記組成物は、１日あたり１回以上投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための化合物又は組成物。
【請求項8】
患者に、１ｋｇあたり１ｍｇ～１０００ｍｇ、特に１ｋｇあたり５０ｍｇ～５００ｍｇ、より詳細には１ｋｇあたり１００ｍｇ～３００ｍｇのレジメンで投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための化合物又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、特に脂肪肝又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防及び／又は治療に使用される、化合物及び該化合物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肥満の世界的な増加と並行して、最も一般的な慢性肝疾患となっており、罹患者は、現在、西洋諸国の成人人口の３分の１にのぼる。この実体には、脂肪肝及び脂肪性肝炎の両方が含まれる。脂肪肝とは、肝臓における脂質の異常な貯留である。これは、トリグリセリド脂肪の合成及び排出の正常過程における機能障害を示す。脂肪肝では、脂肪の細胞内貯蔵は、脂肪毒性又は臓器損傷の機構を駆動しないが、これとは対照的に、脂肪性肝炎は、肝硬変及び最終的に末期肝疾患へと進行する可能性があり、したがって、ＮＡＦＬＤに関連する肝臓関連の罹病及び死亡のほとんどが脂肪性肝炎による。脂肪肝と脂肪性肝炎との相違は、小葉又は門脈の炎症及び肝細胞損傷の存在に基づき形態学的に定義されるが、脂肪性肝炎における細胞損傷及び細胞死の機構決定因子については、まだほとんど不明である。
【0003】
肝細胞死は、全ての慢性炎症性肝疾患の進行において重大事象である。最近まで、細胞死の主な形態として２種類が認識されていた：高度に制御された様式で起こるアポトーシス、及び偶発的に引き起こされるネクローシス（necrosis）である。しかしながら、近年、プログラム細胞死がアポトーシスに限定されず、他の形態の制御された細胞死を含むことが明らかとなった。そのような細胞死の１つがネクロトーシスであり、これは、外因性アポトーシス経路の分子機械とネクローシスに類似した進行とを組み合わせたもので、オンコーシス（oncosis）、オルガネラ拡大、及び形質膜崩壊が関与する。アポトーシスが、カスパーゼとして知られるアスパラギン酸特異的プロテアーゼの活性化を必要とするのとは異なり、ネクロトーシスは、受容体共役タンパク質キナーゼ（ＲＩＰＫ）１及び３、並びに偽キナーゼ混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）の活性化により駆動される。活性化されると、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、及びＭＬＫＬは、ネクロソーム（necrosome）を形成する。アポトーシスが概してサイレントモードの細胞死であるのとは異なり、ネクロトーシスは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出を介した大規模な炎症、及びネクロソーム依存性インフラマソームの活性化を招く可能性がある。ネクロソーム依存性インフラマソームは、プロＩＬ－１β及びプロＩＬ－１８という２種の高度炎症促進性サイトカインの成熟を引き起こす。
【0004】
以前の前臨床及び臨床試験における知見は、汎カスパーゼ阻害剤を通じたアポトーシス阻止が、ＮＡＳＨにおいて肝臓損傷を減少させることが可能であるものの限定的であったことを示し、他の様式の細胞死が関与している可能性があることを示唆した。さらに、汎カスパーゼ阻害剤の存在下では、細胞死受容体の刺激は、ネクロトーシスを優先的に活性化する。したがって、カスパーゼ阻害は、ネクロトーシスを誘導する可能性があり、そのため、ＮＡＳＨにおいて進行中の損傷に実質的に有利となることもあり得る。ＮＡＳＨ患者の肝細胞でネクロトーシスが活性化されることも実証された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Gautheron et al., EMBO Mol Med 2014;6:1062-1074
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、ＮＡＦＬＤ、特に脂肪肝又はＮＡＳＨの有効な予防法又は治療法が、正真正銘必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ＮＡＦＬＤを予防及び／又は治療するための化合物及び組成物を提供することにより、このような需要を満たすと考えられる。
【0008】
驚いたことに、本発明者らは、ＲＩＰＫ１の高特異的阻害剤であるＲＩＰＡ－５６が、肝臓の脂肪過多症、炎症、及び線維症を減少させるプラス効果を有するという知見を得た。
【0009】
これに関連して、本発明は、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に使用される、式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、任意選択でフッ素化又はメチル化されたフェニルであり、
Ｒ２は、任意選択でフッ素化された１，１－ジメチルプロピルである）の化合物、又はその薬学上許容される塩若しくは水和物に関する。
【化1】
Ｒ１は、任意選択でフッ素化又はメチル化されたフェニルであり、
Ｒ２は、任意選択でフッ素化された１，１－ジメチルプロピルである）の化合物、又はその薬学上許容される塩若しくは水和物に関する。
【0010】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に使用される、活性成分として上記に定義されるとおりの化合物少なくとも１種と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含む、組成物に関する。
【0011】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨを予防及び／又は治療する必要がある患者に、上記で定義されるとおりの化合物を有効量で投与することによる、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨを予防及び／又は治療する方法に関する。
【0012】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤ、特に非アルコール性脂肪肝又はＮＡＳＨの予防用及び／又は治療用医薬を製造するための、上記で定義されるとおりの化合物の使用に関する。
【0013】
本発明において、「薬学上許容される」は、医薬組成物の調製において有用であり、概して安全であり、無毒であり、かつ生物学的にもそれ以外でも望ましくないものではなく、獣医学的及びヒト医薬用途の両方において許容されることを意味するものとする。
【0014】
化合物の「薬学上許容される塩」は、本明細書で定義されるように薬学上許容され、かつ親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味するものとする。薬学上許容される塩として、比較的無毒の酸又は塩基を用いて調製される、活性化合物の塩が挙げられる。
【0015】
本発明の化合物は、非溶媒和形及び溶媒和形で存在可能であり、溶媒和形には水和形が含まれる。一般に、溶媒和形は、非溶媒和形と等価であり、本発明の範囲内に包含されるものとする。一般に、全ての物理的形態は、本発明が企図する使用に関して等価であり、本発明の範囲内にあるものとする。
【0016】
「薬学上許容される賦形剤」は、本発明によれば、医薬組成物の製造において使用される医薬不活性添加剤を意味し、この賦形剤は、医薬活性成分が、医薬組成物の投与に際し医薬の必要なバイオアベイラビリティを患者に提供する医薬配合物又はガレノス製剤へと製造されることを可能にする。賦形剤は、好ましくは、組成物のその他の成分と適合性があり、ヒト又は動物に投与された場合に、有害効果、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を何ももたらさない。
【0017】
本発明において、「非アルコール性脂肪性肝疾患」すなわち「ＮＡＦＬＤ」という用語は、過剰な脂肪が肝臓に貯蔵されている状態を指す。この脂肪蓄積は、大量のアルコール使用により引き起こされるのではない。ＮＡＦＬＤスペクトル内で、単純性脂肪肝から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）へと進行する実体が存在する。
【0018】
本発明において、「脂肪肝」、別名「単純性脂肪肝」という用語は、肝臓による脂肪の異常蓄積が存在するＮＡＦＬＤの一形態を示し、この形態では、肥満、２型糖尿病、又はメタボリックシンドロームの他の構成要素の場合に合併症を引き起こす可能性がある。
【0019】
本発明において、「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」という用語は、脂肪過多症が肝炎及び肝細胞損傷と共存しているＮＡＦＬＤの一形態を示す。炎症及び肝臓細胞障害は、肝臓の線維症、又は瘢痕を引き起こす可能性がある。ＮＡＳＨは、肝硬変又は肝臓癌を招く可能性がある。
【0020】
「治療」は、本発明によれば、疾患、障害、又は１つ以上の兆候及び／又は症候の減少又は消失を意味する。特に、ＮＡＦＬＤの治療は、肝臓における脂肪の異常蓄積の減少又は抑制に相当し、ＮＡＳＨの場合は、肝臓の炎症、線維症、及び／又は瘢痕の抑制又は減少に相当する。
【0021】
「予防」は、本発明によれば、疾患、障害、又は１つ以上の兆候及び／又は症候の出現の予防を意味する。特に、ＮＡＦＬＤの予防は、肝臓における脂肪の異常蓄積の予防に相当し、ＮＡＳＨの場合は、肝臓の炎症、線維症、及び／又は瘢痕の予防に相当する。
【0022】
本発明による予防及び治療は、ヒト又は動物に適用される。
【0023】
一部の実施の形態において、本発明による化合物は、
（Ｎ－ベンジル－Ｎ－ヒドロキシ－２，２－ジメチルブタンアミド又は「ＲＩＰＡ－５６」）
又はその薬学上許容される塩若しくは水和物である。
【化2】
又はその薬学上許容される塩若しくは水和物である。
【0024】
化合物「ＲＩＰＡ－５６」は、受容体共役タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）の選択的かつ代謝安定な阻害剤である（Ren et al., J Med Chem 2017;60(3): 972-986）。
【0025】
一部の実施の形態において、本発明は、ＮＡＦＬＤの予防及び／又は治療に使用される、化合物ＲＩＰＡ－５６又はその薬学上許容される塩若しくは水和物に関する。
【0026】
一部の実施の形態において、本発明は、脂肪肝の予防及び／又は治療に使用される、化合物ＲＩＰＡ－５６又はその薬学上許容される塩若しくは水和物に関する。
【0027】
一部の実施の形態において、本発明は、ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に使用される、化合物ＲＩＰＡ－５６又はその薬学上許容される塩若しくは水和物に関する。
【0028】
一部の実施の形態において、本発明による化合物は、受容体共役タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）の選択的阻害剤である。ＲＩＰＫ１の選択的阻害は、結合アッセイにより実証することが可能である。
【0029】
本発明の化合物は、それらが活性である場合に、任意の従来様式で任意の投与経路により投与することができる（単独で又は他の医薬品と併用してのいずれかで）。例えば、投与は、経腸経路、特に経口若しくは直腸投与により、又は非経口経路、特に注射によるものが可能であるが、これらに限定されない。具体的な投与経路及び投薬レジメンの選択は、所望の臨床反応を得るために、臨床医に既知の方法に従って臨床医により調節される又は用量設定されることになる。
【0030】
本発明による化合物又は組成物は、患者に投与することが可能である任意の形状とすることができ、例えば、液剤、食物、飲料、丸剤、錠剤、シロップ剤、パッチ、ガム、クリーム、ゲル、ローション、軟膏、散剤、カプセル剤、バイアル、坐剤等である。
【0031】
好適な実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、経口投与することが可能な形状にある。
【0032】
投与される量は、化合物の配合、治療される症状の重篤度、宿主、投与経路等に左右される。この量は、概して、経験的に決定され、常用試験で調節可能である。
【0033】
概して、製剤の単位用量中の活性化合物の量は、特定の用途に応じて、約１ｍｇ～１０００ｍｇで変更又は調節可能である。
【0034】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、上記化合物が１ｍｇ～１０００ｍｇ、特に５０ｍｇ～５００ｍｇ、より詳細には１００ｍｇ～３００ｍｇの単位剤形に製剤化されている。
【0035】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、上記化合物が１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ又は１０００ｍｇの単位剤形に製剤化されている。
【0036】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、患者に、１ｋｇあたり１ｍｇ～１０００ｍｇ、特に１ｋｇあたり５０ｍｇ～５００ｍｇ、より詳細には１ｋｇあたり１００ｍｇ～３００ｍｇのレジメンで投与される。
【0037】
本発明による化合物又は組成物は、１日あたり１回以上投与することができる。当業者又は臨床医は、レジメンを容易に調節することができる。
【0038】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、又は１日４回投与される。
【0039】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、又は１週間に４回投与される。
【0040】
一実施の形態において、本発明による化合物又は組成物は、食事中に、好ましくは食物又は飲料の形態で投与される。
【0041】
別の態様において、本発明はさらに、患者においてＮＡＳＨを検出するためのバイオマーカーとしての、ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの血清中濃度の利用に関する。
【0042】
実際、本発明者らは、驚いたことに、ＮＡＳＨ患者の血清中、タンパク質ＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬの濃度が上昇し、トランスアミナーゼ活性と相関するという知見を得た。
【0043】
したがって、本発明は、ＮＡＦＬＤ患者において、ＮＡＳＨを単純性脂肪肝と区別する有用なツールを提供する。
【0044】
したがって、別の態様は、患者においてＮＡＳＨを診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関し、本方法は、以下の工程：
上記患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度を測定する工程と、
得られた値を参照値と比較する工程と、
を含み、
患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度が、参照値と比較して上昇している場合は、ＮＡＳＨを示す。
上記患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度を測定する工程と、
得られた値を参照値と比較する工程と、
を含み、
患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度が、参照値と比較して上昇している場合は、ＮＡＳＨを示す。
【0045】
一実施の形態において、上記患者は、ＮＡＦＬＤに罹患していると既に診断されている。
【0046】
一実施の形態において、参照値は、健康な個体の血清試料中のＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬ濃度に相当する。
【0047】
一実施の形態において、参照値は、ＮＡＦＬＤ患者の血清試料中のＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬ濃度に相当する。
【0048】
一実施の形態において、参照値は、単純性脂肪肝患者の血清試料中のＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬ濃度に相当する。
【0049】
一実施の形態において、タンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度は、免疫アッセイにより、好ましくはＥＬＩＳＡにより測定される。
【0050】
一実施の形態において、患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度が参照値と比較して少なくとも２倍上昇している場合は、ＮＡＳＨを示す。
【0051】
一実施の形態において、患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度が参照値と比較して少なくとも３倍上昇している場合は、ＮＡＳＨを示す。
【0052】
一実施の形態において、患者の血清試料中のタンパク質ＲＩＰＫ１及び／又はＭＬＫＬの濃度が参照値と比較して少なくとも４倍上昇している場合は、ＮＡＳＨを示す。
【0053】
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように作り上げ使用するかについての完全な開示及び説明を提供するために提示するものであって、本発明者らが本発明として考える範囲を限定することを意図してもいなければ、以下の実験が、全ての又は唯一の行われた実験であることを意図してもいない。本発明は、その具体的な実施形態を参照して説明されてきたものの、当業者には当然のことながら、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことが可能であり、また等価物で置き換えることが可能である。また、特定の状況、材料、組成物、プロセス、単数又は複数のプロセス工程を、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合させるために多くの変更を行うことが可能である。そのような変更は全て、本明細書に添付される特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】ＲＩＰＡ－５６は、Ｌ９２９細胞において、カスパーゼ阻害及びＴＮＦ刺激に際してＲＩＰＫ１依存性細胞死を防止することを示す図である。ＴＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）あり又はなしでインキュベートする前に、Ｌ９２９細胞を、ＲＩＰＡ－５６（２０μＭ）、Ｎｅｃ－１（２０μＭ）、又はビヒクルで２時間処理し、ＴＮＦあり又はなしで２０時間インキュベーションした後、（Ａ）形態及び（Ｂ）ＭＴＴアッセイを用いた細胞生存率を分析した。（Ｃ）ＴＮＦありでのインキュベーション中の様々な時点でのウエスタンブロット分析。結果は、平均±ＳＥＭで示す。ｎ．ｓ．、有意ではない。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、３回の独立した実験を代表するものである。
【図2】ＲＩＰＡ－５６処置は、ＨＦＤ給餌マウスにおいて、肝臓の炎症及び線維症を改善することを示す図である。６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１群あたりｎ＝５）に、１６週間の予防（「Ｐｒｏ」）又は治癒（「Ｃｕｒ」）計画に従って、通常の対照食（ＮＣＤ）、又はＲＩＰＡ－５６を補充した若しくは補充していない高脂肪食（ＨＦＤ）を給餌した。１６週というのは、炎症及び線維化が発生するのに必要な時間である。マウス間の差は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）にボンフェローニの多重比較検定を合わせて用い判定した。（Ａ）実験計画の概略図；（Ｂ）ＮＣＤ（１～３）、ＨＦＤ（４～６）、ＲＩＰＡ－５６補充ＨＦＤ「Ｐｒｏ」（７～９）、又はＲＩＰＡ－５６補充ＨＦＤ「Ｃｕｒ」（１０～１２）を給餌したマウス由来の全肝臓タンパク質抽出物に、ＲＩＰＫ１、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨに対する抗体を用いて行った免疫ブロット分析；（Ｃ）血清ＡＬＴ分析；（Ｄ）各群のマウス由来の代表的な肝組織切片で行ったＦ４／８０の免疫組織化学分析；（Ｅ）ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用したＦ４／８０＋病巣の定量分析、マウス１匹あたり１０枚の画像を定量した；（Ｆ）Ｆ４／８０、Ｍｃｐ－１、及びＴｎｆのｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。（Ｇ）各群のマウス由来の肝組織切片で行った代表的なシリウスレッド染色；（Ｈ）偏光シリウスレッド画像の定量、マウス１匹あたり１０枚の画像を分析した；（Ｉ）Ｃｏｌ１ａ１のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。データは全て、平均±ＳＥＭで表す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバーは、５０μｍを示す。
【図3】予防処置及び治癒処置を受けたマウスの肝臓におけるＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、及びＲＩＰＫ１のｍＲＮＡ発現レベルのＨＦＤ下の対照マウスとの比較を示す図である。Ｍｌｋｌ、Ｒｉｐｋ３、及びＲｉｐｋ１のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、ＮＣＤ給餌マウスと比較して示した。群（ｎ＝５）間の差は、一元配置分散分析にボンフェローニの多重比較検定を合わせて用い判定した。結果は、平均±ＳＥＭで示す；＊＊ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図4】予防処置及び治癒処置を受けたマウスの肝臓における炎症マーカーのｍＲＮＡ発現のＨＦＤ下の対照マウスとの比較を示す図である。Ｃｄ３８、Ｃｃｌ２０、Ｎｌｒｐ３、カスパーゼ－１、Ｉｌ－１ｂのｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、ＮＣＤ給餌マウスと比較して示した。群（ｎ＝５）間の差は、一元配置分散分析にボンフェローニの多重比較検定を合わせて用い判定した。結果は、平均±ＳＥＭで示す；＊＊ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図5】ＲＩＰＡ－５６処置は、マウスにおいて、ＨＦＤ誘導型肥満及び脂肪過多症を改善することを示す図である。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１群あたりｎ＝５）に、図２Ａで示したとおり、ＮＣＤ又はＲＩＰＡ－５６を補充した若しくは補充していないＨＦＤいずれかを１６週間給餌して、マウスの代謝状態を分析した。（Ａ）４群のマウスにおける体重増加。４群のマウスにおいて、（Ｂ）食物摂取、（Ｃ）自発運動、又は（Ｄ）呼吸交換比（ＲＥＲ）に有意な変化はなし；（Ｅ）４群のマウスにおける日中及び夜間の総エネルギー消費量を評価した；（Ｆ）４群のマウス由来の肝組織切片の代表的なＨ＆Ｅ染色。スケールバー、５０μｍ；（Ｇ）肝組織切片の脂肪過多症スコアを、盲検で評価した；（Ｈ）マウス１匹あたり２つの肝臓試料で肝内トリグリセリド含有量を測定した。結果は、平均±ＳＥＭで示す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図6】予防処置及び治癒処置を受けたマウスの脂肪量及び除脂肪量のＨＦＤ下の対照マウスとの比較を示す図である。（Ａ）体脂肪量及び相対体脂肪含量、並びに（Ｂ）除脂肪量及び相対除脂肪含量を、ＭＲＩ分析を用いてＨＦＤ給餌マウスで評価した。結果は全て、平均±ＳＥＭで示す；１群あたりｎ＝５；＊ｐ＜０．０５。群間の差は、一元配置分散分析にボンフェローニの多重比較検定を合わせて用い判定した。
【図7】ＲＩＰＡ－５６処置は、初代ヒト肝細胞において脂肪枯渇を誘導することを示す図である。初代ヒト肝細胞を、ＮＡＦＬＤ患者のヒト脂肪肝（ｎ＝５）（Ａ～Ｃ）から、又はヒト非脂肪肝から単離し、遊離脂肪酸とともにインキュベートして脂肪過多症を誘導するか、又は遊離脂肪酸なし（Ｗ／Ｏ）でインキュベートし（ｎ＝５）（Ｄ～Ｇ）、ＲＩＰＡ－５６（２０μＭ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル）で２４時間処理した。（Ａ、Ｄ）代表的なオイルレッドＯ及びＤＡＰＩ画像；（Ｂ、Ｅ）ＤＡＰＩ染色核の数を基準に正規化したオイルレッドＯ染色の定量；（Ｃ、Ｆ）タンパク質含量を基準に正規化した細胞内トリグリセリドの定量；（Ｇ）ＣＰＴ１Ａ、ＭＴＴＰ、及びＡＰＯＢ１００のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、ＤＭＳＯ処理した肝細胞と比較して示す。結果は、平均±ＳＥＭで示す；ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；スケールバー、１００μｍ。これらの結果は、５つの独立した細胞調製物を代表するものである。
【図8】初代ヒト肝細胞における遊離脂肪酸を４８時間用いた脂肪過多症の誘導を示す図である。（Ａ）ＦＦＡ（オレイン酸及びパルミチン酸）あり又はなしでインキュベートしたＰＨＨの代表的な画像；オイルレッドＯ染色（Ｂ）及び細胞内トリグリセリド含量の定量（Ｃ）；（Ｄ）細胞生存度分析は、ＭＴＴアッセイを用いて行った。結果は、平均±ＳＥＭで示す；ｎ．ｓ．、有意ではない；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、５つの独立した実験を代表するものである。ＦＦＡなしとＦＦＡありとの間の差は、ステューデントのｔ検定を用いて判定した。
【図9】ＭＬＫＬは、肝細胞において肝内トリグリセリド含量を制御することを示す図である。（Ａ～Ｄ）初代ヒト肝細胞を、ヒト非脂肪肝から単離し、遊離脂肪酸とともにインキュベートして脂肪過多症を誘導するか、又は遊離脂肪酸なし（Ｗ／Ｏ）でインキュベートしてから、ネクロスルホンアミド（ＮＳＡ）（２０μＭ）又はＤＭＳＯ（ビヒクル）で２４時間処理した。（Ａ）代表的なオイルレッドＯ及びＤＡＰＩ画像；（Ｂ）ＤＡＰＩ染色核の数を基準に正規化したオイルレッドＯ染色の定量；（Ｃ）タンパク質含量を基準に正規化した細胞内トリグリセリドの定量。（Ｄ）ＣＰＴ１Ａ、ＭＴＴＰ、及びＡＰＯＢ１００のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、ＤＭＳＯ処理した肝細胞と比較して示した；（Ｅ～Ｈ）ＡＭＬ－１２細胞を、ＭＬＫＬについてノックアウト（ＫＯ）し、対照（ＣＴＬ）細胞と比較した。ＣＴＬ細胞は、ＫＯ細胞と同様なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９選別を受けたものである；（Ｅ）全細胞ライセートを、ＣＴＬ細胞及びＭＬＫＬ－ＫＯ ＡＭＬ－１２細胞から抽出し、ＭＬＫＬ、チューブリン、及びＧＡＰＤＨに対する抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した；（Ｆ）代表的なオイルレッドＯ及びＤＡＰＩ画像；（Ｇ）オイルレッドＯ染色、並びに（Ｈ）脂肪添加細胞株におけるトリグリセリド定量。結果は、平均±ＳＥＭで示す；ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；スケールバー、１００μｍ。これらの実験は、５つの独立した細胞調製物を代表するものである。
【図10】ＭＬＫＬは、マウス肝細胞においてミトコンドリア呼吸を調節することを示す図である。ＡＭＬ－１２細胞を、ＭＬＫＬについてノックアウト（ＫＯ）し、対照（ＣＴＬ）細胞と比較した。ＣＴＬ細胞は、ＫＯ細胞と同様なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９選別を受けたものである。（Ａ）細胞生存度を、ＭＴＴアッセイを用いて分析した；細胞増殖を、（Ｂ）ＢｒｄＵ取り込み及び（Ｃ）リアルタイム細胞分析（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｃｉｍ－Ｐｌａｔｅ ９６）を用いて分析した。各細胞株を、６つの同一種類ウェルに播種した；（Ｄ）ミトコンドリア量を、３つ組で、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ－Ｐｒｏｂｅを用いて評価した；（Ｅ）Ｐｇｃ１ａ、Ｃｐｔ１ａ、及びＡｃｏｘ１のｍＲＮＡレベルを、３つ組で、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した；（Ｆ）細胞の呼吸フラックスプロファイルを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、１２回連続で酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定して特定した。各細胞株を、８つの同一種類ウェルに播種した；（Ｇ）基礎ミトコンドリアＯＣＲ、ＡＴＰ関連ＯＣＲ、最大ＯＣＲは、活性化倍率で表す。結果は、同一種類８つの平均±ＳＥＭで示す；ｎ．ｓ．、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＣＴＬ細胞とＫＯ細胞との間の差は、ステューデントのｔ検定を用いて判定した。実験は全て、３つの独立した細胞調製物を代表するものである。
【図11】ミトコンドリア生体エネルギー特性は、ＣＤＡＡを給餌したＲＩＰＫ３欠損マウスにおいて向上することを示す図である。（Ａ）３２週間ＣＤＡＡを給餌したＷＴマウス（１～３）及びＲＩＰＫ３－／－マウス（４～６）由来の全肝臓タンパク質抽出物でｐ－ＭＬＫＬ、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、及びローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨに対する抗体を用いて行った免疫ブロット分析；（Ｂ）３２週間又は６６週間ＣＤＡＡを給餌したＷＴマウスとＲＩＰＫ３－／－マウス（ｎ＝７）で比較したクエン酸シンターゼ（ＣＳ）及びミトコンドリア呼吸鎖（ＭＲＣ）活性；（Ｃ）Ｐｇｃ１ａ及びＡｃｏｘ１のｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、ＷＴマウス（ｎ＝７）に関して示した。データは全て、平均±ＳＥＭで表す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。ＷＴマウスとＲＩＰＫ３－／－マウスとの間の差は、ステューデントのｔ検定を用いて判定した。
【図12】ＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬは、ネクロトーシス中に細胞外に放出されることを示す図である。（Ａ及びＢ）ＮＡＦＬＤを有し、組織学的活性スコアが２未満である（ｎ＝８）又は２以上である（ｎ＝２７）対象の血清中のＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬタンパク質レベルのＥＬＩＳＡ分析；＊＊ｐ＜０．０１；（Ｃ及びＤ）全対象におけるＲＩＰＫ１又はＭＬＫＬレベルとＡＬＴレベルとの間の相関プロット分析、ｒ２値は、ピアソン相関を用いて計算した；（Ｅ）汎カスパーゼ阻害剤Ｚｖａｄ（２０μＭ）、ＲＩＰＡ－５６（２０μＭ）、ネクロスタチン－１（Ｎｅｃ－１、２０μＭ）、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で２時間処理してから、ＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍＬ）あり又はなしで６時間インキュベートしたＬ９２９細胞のデブリを除去した上清における、ＲＩＰＫ１のＥＬＩＳＡ分析。結果は、同一種類６つの平均±ＳＥＭで示す。
【図13】ＭＬＫＬは、インスリンシグナル伝達を調節することを示す図である。（Ａ）インスリン（１０ｎＭ）で１５分間刺激したＡＭＬ－１２ＣＴＬ細胞及びＡＭＬ－１２ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞における免疫ブロット分析。（Ｂ）免疫ブロットインスリン刺激細胞（ｎ＝３）の半定量的分析。結果は、平均±ＳＥＭで表す；＊ｐ＜０．０５。ＡＭＬ－１２ＣＴＬ細胞とＡＭＬ－１２ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞との間の差は、ステューデントのｔ検定を用いて判定した。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0055】
材料及び方法
ＲＩＰＡ－５６給餌実験
６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Charles River Laboratories、エキュリー、フランス）に、高脂肪食（ＨＦＤ－脂肪４５ｋｃａｌ％）又は通常固形飼料食（ＮＣＤ）（Ssniff spezialdiaeten GmbH、ゾースト、ドイツ）を１６週間（炎症及び線維化が発生するのに必要な時間）給餌した。高強力かつ高特異的ＲＩＰＫ１キナーゼ阻害剤（ＲＩＰＡ－５６と称する）を、最初に記載したとおりに３００ｍｇ／ｋｇ用量でＨＦＤに組み込むことにより、その効果を評価した。
ＲＩＰＡ－５６給餌実験
６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Charles River Laboratories、エキュリー、フランス）に、高脂肪食（ＨＦＤ－脂肪４５ｋｃａｌ％）又は通常固形飼料食（ＮＣＤ）（Ssniff spezialdiaeten GmbH、ゾースト、ドイツ）を１６週間（炎症及び線維化が発生するのに必要な時間）給餌した。高強力かつ高特異的ＲＩＰＫ１キナーゼ阻害剤（ＲＩＰＡ－５６と称する）を、最初に記載したとおりに３００ｍｇ／ｋｇ用量でＨＦＤに組み込むことにより、その効果を評価した。
【0056】
患者
血清試料は、３５人のＮＡＦＬＤ対象から得た（表１）。試験集団を、活性の組織学的スコア、すなわち、肝細胞風船化及び小葉炎症の合計に基づき２つの群に分けた。第一群には、スコア２未満である対象が含まれ、第二群には、スコア２以上である対象が含まれた。ヒト試料は、Biological Resource Center、Bio-ICAN、Institute of Cardiometabolism and Nutrition（IHU-ICAN、ＡＮＲ－１０－ＩＡＨＵ－０５、パリ、フランス）により処理及び貯蔵が行われた。対象は全員、本試験に参加する前に、書面によるインフォームドコンセントを提出した。
血清試料は、３５人のＮＡＦＬＤ対象から得た（表１）。試験集団を、活性の組織学的スコア、すなわち、肝細胞風船化及び小葉炎症の合計に基づき２つの群に分けた。第一群には、スコア２未満である対象が含まれ、第二群には、スコア２以上である対象が含まれた。ヒト試料は、Biological Resource Center、Bio-ICAN、Institute of Cardiometabolism and Nutrition（IHU-ICAN、ＡＮＲ－１０－ＩＡＨＵ－０５、パリ、フランス）により処理及び貯蔵が行われた。対象は全員、本試験に参加する前に、書面によるインフォームドコンセントを提出した。
【0057】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の単離及び培養
ヒト肝細胞の単離に関する倫理的承認は、Persons Protection Committee（ＣＰＰ Ｉｌｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ ＩＩＩ）及びフランス保健省により与えられた（番号：ＣＯＬ ２９２９及びＣＯＬ ２９３０）。結腸直腸癌転移の治療のため部分肝切除術を受けた対象から、肝組織を得た。細胞単離は、先に記載したとおり、Ｈｕｍａｎ ＨｅｐＣｅｌｌプラットフォーム（IHU-ICAN、パリ、フランス）で行った。
ヒト肝細胞の単離に関する倫理的承認は、Persons Protection Committee（ＣＰＰ Ｉｌｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ ＩＩＩ）及びフランス保健省により与えられた（番号：ＣＯＬ ２９２９及びＣＯＬ ２９３０）。結腸直腸癌転移の治療のため部分肝切除術を受けた対象から、肝組織を得た。細胞単離は、先に記載したとおり、Ｈｕｍａｎ ＨｅｐＣｅｌｌプラットフォーム（IHU-ICAN、パリ、フランス）で行った。
【0058】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。ΔΔＣｔ法を用いることにより、Ｈｐｒｔ、Ｈｍｂｓ、又はＧＡＰＤＨに対して正規化した後、選択した遺伝子のｍＲＮＡレベルを計算した。
ＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。ΔΔＣｔ法を用いることにより、Ｈｐｒｔ、Ｈｍｂｓ、又はＧＡＰＤＨに対して正規化した後、選択した遺伝子のｍＲＮＡレベルを計算した。
【0059】
統計分析
事前決定するためのサイズパワー分析法（ＧｒａｐｈＰａｄ ＳｔａｔＭａｔｅ）を用いて、以前の実験の標準偏差に基づき、標本サイズを計算した。各群の最小標本サイズは、動物５匹と計算された。同じ性別及び同じ年齢の動物を用いて、生理学的変異性を最小限にした。ステューデントのｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、それぞれ、２群間、及び３群以上の群間の比較を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０）を用いて、統計的有意性を計算した。統計検定は、図の説明で記載したとおりに用い、統計的有意性は、以下のとおりであるとして示した：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．、有意ではない。データは全て、平均±ＳＥＭで表す。
事前決定するためのサイズパワー分析法（ＧｒａｐｈＰａｄ ＳｔａｔＭａｔｅ）を用いて、以前の実験の標準偏差に基づき、標本サイズを計算した。各群の最小標本サイズは、動物５匹と計算された。同じ性別及び同じ年齢の動物を用いて、生理学的変異性を最小限にした。ステューデントのｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、それぞれ、２群間、及び３群以上の群間の比較を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６．０）を用いて、統計的有意性を計算した。統計検定は、図の説明で記載したとおりに用い、統計的有意性は、以下のとおりであるとして示した：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．、有意ではない。データは全て、平均±ＳＥＭで表す。
【0060】
ＲＩＰＡ－５６給餌実験
ＲＩＰＡ－５６（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ストックホルム、スウェーデン）は、Ssniff spezialdiaeten GmbH（ゾースト、ドイツ）が標準プロトコルに従って食事に組み込んだ。Ssniff社は、実験動物用食の認可取得企業であり、指令第２００１／８２／ＥＣ号に従って実験動物用の薬用餌を製造する許可を持つ。給餌期間の終了前に、マウスを１週間代謝ケージに単独収容して、ＬａｂＭａｓｔｅｒ間接的熱量測定システム（TSE Systems GmbH、バート・ホンブルク、ドイツ）を用いて、食物摂取、呼吸交換比（ＲＥＲ）、エネルギー消費、及び自発運動を測定した。マウスを麻酔下で屠殺し、血液を心臓内穿刺手技により収集した。組織試料は、分子分析用に直接液体窒素に入れて急速凍結させるか、組織分析用に４％ＰＦＡで固定してパラフィンに包埋させるかのいずれかを行った。実験は全て、ＣＲＳＡのＳＰＦ動物実験施設において行われ（承諾番号第Ｃ－７５－１２－０１号）、実験操作のための動物の管理及び使用に関する欧州共同体理事会指令（２０１０／６３／ＵＥ）に従っており、及び＜＜Ｃｏｍｉｔｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ Ｅｔｈｉｑｕｅ ｓｕｒ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ＞＞（イル・ド・フランス、パリ、ｎ°５）に登記されたフランス動物実験倫理委員会＜＜Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ＞＞の規制に準拠していた。操作は全て、この委員会により承認された（番号第Ｂ７５１２０１号）。
ＲＩＰＡ－５６（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ストックホルム、スウェーデン）は、Ssniff spezialdiaeten GmbH（ゾースト、ドイツ）が標準プロトコルに従って食事に組み込んだ。Ssniff社は、実験動物用食の認可取得企業であり、指令第２００１／８２／ＥＣ号に従って実験動物用の薬用餌を製造する許可を持つ。給餌期間の終了前に、マウスを１週間代謝ケージに単独収容して、ＬａｂＭａｓｔｅｒ間接的熱量測定システム（TSE Systems GmbH、バート・ホンブルク、ドイツ）を用いて、食物摂取、呼吸交換比（ＲＥＲ）、エネルギー消費、及び自発運動を測定した。マウスを麻酔下で屠殺し、血液を心臓内穿刺手技により収集した。組織試料は、分子分析用に直接液体窒素に入れて急速凍結させるか、組織分析用に４％ＰＦＡで固定してパラフィンに包埋させるかのいずれかを行った。実験は全て、ＣＲＳＡのＳＰＦ動物実験施設において行われ（承諾番号第Ｃ－７５－１２－０１号）、実験操作のための動物の管理及び使用に関する欧州共同体理事会指令（２０１０／６３／ＵＥ）に従っており、及び＜＜Ｃｏｍｉｔｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｒｅｆｌｅｘｉｏｎ Ｅｔｈｉｑｕｅ ｓｕｒ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ＞＞（イル・ド・フランス、パリ、ｎ°５）に登記されたフランス動物実験倫理委員会＜＜Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ＞＞の規制に準拠していた。操作は全て、この委員会により承認された（番号第Ｂ７５１２０１号）。
【0061】
ＲＩＰＫ３ ＫＯマウス給餌実験
７～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６野生型及びＲＩＰＫ３－ＫＯマウスに、コリン欠乏、アミノ酸規定食（ＣＤＡＡ；Envigo、マディソン、アメリカ）を、３２週間（ＮＡＳＨを誘導するため）又は６６週間給餌した。各実験群には、動物が７匹含まれていた。指定された時点で、動物を４時間絶食させ、ＣＯ２過剰投与により屠殺し、続いて全採血した。肝臓を取り出し、１つの葉を収集し、生理食塩水ですすぎ、更なる分子分析用に直ちに液体窒素に入れて急速凍結させた。動物実験は全て、地方動物倫理委員会の許可を得て行われており、ＥＵ指令（２０１０／６３／ＥＵ）、ポルトガル法（ＤＬ １１３／２０１３）、及び全ての関係する規則に準拠していた。実験プロトコルは、Direccao Geral de Alimentacao e Veterinaria（ポルトガル）により承認された。動物は、温度管理された環境下、１２時間の明暗サイクルで、人道的に管理され、この管理は、学会の指針に準拠しており、全米科学アカデミーが作成し、国立衛生研究所が発行した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６－２３、１９８５年改訂）に記載される概要のとおりに行われた。
７～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６野生型及びＲＩＰＫ３－ＫＯマウスに、コリン欠乏、アミノ酸規定食（ＣＤＡＡ；Envigo、マディソン、アメリカ）を、３２週間（ＮＡＳＨを誘導するため）又は６６週間給餌した。各実験群には、動物が７匹含まれていた。指定された時点で、動物を４時間絶食させ、ＣＯ２過剰投与により屠殺し、続いて全採血した。肝臓を取り出し、１つの葉を収集し、生理食塩水ですすぎ、更なる分子分析用に直ちに液体窒素に入れて急速凍結させた。動物実験は全て、地方動物倫理委員会の許可を得て行われており、ＥＵ指令（２０１０／６３／ＥＵ）、ポルトガル法（ＤＬ １１３／２０１３）、及び全ての関係する規則に準拠していた。実験プロトコルは、Direccao Geral de Alimentacao e Veterinaria（ポルトガル）により承認された。動物は、温度管理された環境下、１２時間の明暗サイクルで、人道的に管理され、この管理は、学会の指針に準拠しており、全米科学アカデミーが作成し、国立衛生研究所が発行した「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６－２３、１９８５年改訂）に記載される概要のとおりに行われた。
【0062】
細胞株及び試薬
Ｌ９２９細胞（LGC Standards、モルスハイム、フランス）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ThermoFisher、マサチューセッツ、アメリカ）で培養した。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、及びＬ－グルタミン（０．０３％）（ThermoFisher）を補充しておいた。Ｌ９２９細胞を、Ｚｖａｄ（＃ｓｃ－３０６７、２０μＭ；Santa Cruz Biotechnologies、ダラス、アメリカ）、Ｎｅｃ－１（＃ｓｃ－２００１４２、２０μＭ）；ＲＩＰＡ－５６（＃ＨＹ－１０１０３２、２０ Ｍ；MedChemExpress、ソーレントゥーナ、スウェーデン）、及びＴＮＦα（＃３１５－０１Ａ、２０ｎｇ／ｍｌ；Peprotech、ヌイイ＝シュル＝セーヌ、フランス）で処理した。ＡＭＬ－１２（アルファマウス肝臓－１２）肝細胞（LGC Standards）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ThermoFisher）で培養した。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、５．５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレン、及び４０ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Sigma、ミズーリ、アメリカ）を補充しておいた。ＡＭＬ－１２肝細胞を、インスリン（＃Ｉ０５１６、１０ｎＭ；Sigma）で１５分間刺激した。
Ｌ９２９細胞（LGC Standards、モルスハイム、フランス）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ThermoFisher、マサチューセッツ、アメリカ）で培養した。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、及びＬ－グルタミン（０．０３％）（ThermoFisher）を補充しておいた。Ｌ９２９細胞を、Ｚｖａｄ（＃ｓｃ－３０６７、２０μＭ；Santa Cruz Biotechnologies、ダラス、アメリカ）、Ｎｅｃ－１（＃ｓｃ－２００１４２、２０μＭ）；ＲＩＰＡ－５６（＃ＨＹ－１０１０３２、２０ Ｍ；MedChemExpress、ソーレントゥーナ、スウェーデン）、及びＴＮＦα（＃３１５－０１Ａ、２０ｎｇ／ｍｌ；Peprotech、ヌイイ＝シュル＝セーヌ、フランス）で処理した。ＡＭＬ－１２（アルファマウス肝臓－１２）肝細胞（LGC Standards）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ThermoFisher）で培養した。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、５．５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレン、及び４０ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Sigma、ミズーリ、アメリカ）を補充しておいた。ＡＭＬ－１２肝細胞を、インスリン（＃Ｉ０５１６、１０ｎＭ；Sigma）で１５分間刺激した。
【0063】
ＭｌｋｌのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在型欠失
ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ（ＰＸ４５８）を用いて、ＡＭＬ－１２細胞にＣａｓ９を標的指向ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに形質移入した。ガイドＲＮＡを設計し、効率及び特異性についてチェックした。続いて、それらをプラスミドにクローニングし、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（ThermoFisher、マサチューセッツ、アメリカ）形質移入試薬を用いて取扱説明書に従って細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を、フローサイトメトリー（Cell Sorting Core Facility、Centre de Recherche Saint-Antoine）により分取し、ＧＦＰ陽性度の最も高い細胞を、最終的に９６ウェルプレートに単独細胞として移して増殖させた。
ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ（ＰＸ４５８）を用いて、ＡＭＬ－１２細胞にＣａｓ９を標的指向ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに形質移入した。ガイドＲＮＡを設計し、効率及び特異性についてチェックした。続いて、それらをプラスミドにクローニングし、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（ThermoFisher、マサチューセッツ、アメリカ）形質移入試薬を用いて取扱説明書に従って細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を、フローサイトメトリー（Cell Sorting Core Facility、Centre de Recherche Saint-Antoine）により分取し、ＧＦＰ陽性度の最も高い細胞を、最終的に９６ウェルプレートに単独細胞として移して増殖させた。
【0064】
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の単離及び培養
肝臓断片を、最初に、５ｍｍｏｌ／Ｌのエチレングリコール四酢酸（Sigma）を補充し予め温めた（３７℃）カルシウム不含緩衝液で灌流し、続いて、６ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム（ＣａＣｌ２）及びコラゲナーゼ０．０５％（５ｍｇ／ｍＬ）（Sigma）を含有する予め温めた（３７℃）緩衝液で灌流した。次いで、肝臓断片を穏やかに震盪撹拌して、肝臓細胞を肝細胞洗浄培地（Life Technologies、ヴィルボン＝シュル＝イヴェット、フランス）に分散させた。得られる細胞浮遊液を、ガーゼ張りした漏斗で濾過した。次いで、細胞を低速で遠心した。上清には、損傷又は死肝細胞、非実質細胞、及びデブリが含まれており、この上清を除去して、ペレット化肝細胞を、肝細胞洗浄培地に再懸濁させた。生細胞数を、トリパンブルー排除法を用いて測定した。単離したばかりの正常（脂肪過多症５％未満）肝細胞又は脂肪性（１０％超）肝細胞を、ウィリアム培地Ｅ（Life technologies）に再懸濁させた。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍＬ）－ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍＬ）、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（２．５μｇ／ｍＬ）、及びインスリン（０．１Ｕ／ｍＬ）（Life Technologies）を含ませておいた。細胞を、Ｉ型コラーゲンで予めコーティングした１２、２４、及び９６ウェルプレートに、それぞれ、０．７８×１０６、０．４×１０６、及び０．５×１０５生細胞／ウェルの密度で播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。培地を、新鮮な完全肝細胞培地に交換した。培地には、１μｍｏｌ／Ｌのヘミコハク酸ヒドロコルチゾン（Laboratoires SERB、パリ、フランス）を補充しておいた。肝細胞を、この培地で維持した。正常肝細胞において脂肪過多症を誘導するため、ＰＨＨを、それぞれ、オレイン酸とパルミチン酸のモル比２：１の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）混合物（５００μｍｏｌ／Ｌ：２５０μｍｏｌ／Ｌ）とともに、及び１％脂肪酸不含ＢＳＡとともに、４８時間インキュベートした。
肝臓断片を、最初に、５ｍｍｏｌ／Ｌのエチレングリコール四酢酸（Sigma）を補充し予め温めた（３７℃）カルシウム不含緩衝液で灌流し、続いて、６ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウム（ＣａＣｌ２）及びコラゲナーゼ０．０５％（５ｍｇ／ｍＬ）（Sigma）を含有する予め温めた（３７℃）緩衝液で灌流した。次いで、肝臓断片を穏やかに震盪撹拌して、肝臓細胞を肝細胞洗浄培地（Life Technologies、ヴィルボン＝シュル＝イヴェット、フランス）に分散させた。得られる細胞浮遊液を、ガーゼ張りした漏斗で濾過した。次いで、細胞を低速で遠心した。上清には、損傷又は死肝細胞、非実質細胞、及びデブリが含まれており、この上清を除去して、ペレット化肝細胞を、肝細胞洗浄培地に再懸濁させた。生細胞数を、トリパンブルー排除法を用いて測定した。単離したばかりの正常（脂肪過多症５％未満）肝細胞又は脂肪性（１０％超）肝細胞を、ウィリアム培地Ｅ（Life technologies）に再懸濁させた。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）、ペニシリン（２００Ｕ／ｍＬ）－ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍＬ）、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（２．５μｇ／ｍＬ）、及びインスリン（０．１Ｕ／ｍＬ）（Life Technologies）を含ませておいた。細胞を、Ｉ型コラーゲンで予めコーティングした１２、２４、及び９６ウェルプレートに、それぞれ、０．７８×１０６、０．４×１０６、及び０．５×１０５生細胞／ウェルの密度で播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。培地を、新鮮な完全肝細胞培地に交換した。培地には、１μｍｏｌ／Ｌのヘミコハク酸ヒドロコルチゾン（Laboratoires SERB、パリ、フランス）を補充しておいた。肝細胞を、この培地で維持した。正常肝細胞において脂肪過多症を誘導するため、ＰＨＨを、それぞれ、オレイン酸とパルミチン酸のモル比２：１の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）混合物（５００μｍｏｌ／Ｌ：２５０μｍｏｌ／Ｌ）とともに、及び１％脂肪酸不含ＢＳＡとともに、４８時間インキュベートした。
【0065】
ウエスタンブロット
組織粉砕乳棒（Kimble、ロックウッド、アメリカ）又はビーズ粉砕機１２（Omni International、ジョージア、アメリカ）を用いて、組織試料をＮＰ－４０溶解緩衝液にホモジナイズして、タンパク質ライセートを得た。細胞又は組織ホモジネートから抽出したタンパク質抽出物３０μｇを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、ポリフッ化ビニリデン膜に移し、免疫ブロット法により分析した。膜を、以下の抗体でプローブ探索した：抗ＲＩＰＫ３（＃ＮＢＰ１－７７２９９；Novus、センテニアル、アメリカ）又は（＃ＡＨＰ１７９７、AbD Serotec，Bio-Rad Laboratories、ハーキュリーズ、アメリカ）、抗ＲＩＰＫ１（＃３４９３；Cell Signaling、マサチューセッツ、アメリカ）、抗ホスホ－ＭＬＫＬマウス（＃３７３３３；Cell Signaling）又は（＃ａｂ １９６４３６、Abcam、ケンブリッジ、イギリス）、抗ホスホ－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（＃４０６０；Cell Signaling）、抗ＡＫＴ（＃４６９１；Cell Signaling）；抗ＧＡＰＤＨ（＃９７１６６；Cell Signaling）又は（＃ｓｃ－２３２３３、Santa Cruz Biotechnology）；抗ＭＬＫＬ（＃ａｂ１７２８６８；Abcam）又は（＃ＳＡＢ１３０２３３９、Sigma）、及び抗チューブリン（＃６６０３１－１－ｌｇ；Proteintech、イリノイ、アメリカ）。全ての一次抗体は、１：２０００に希釈して使用した。二次抗体として、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（＃ＮＡ９３４Ｖ；GE healthcare、シカゴ、アメリカ）及び抗マウスＨＲＰ（＃ＮＡ９３１Ｖ；GE healthcare）を使用した。全ての二次抗体は、１：１００００に希釈して使用した。
組織粉砕乳棒（Kimble、ロックウッド、アメリカ）又はビーズ粉砕機１２（Omni International、ジョージア、アメリカ）を用いて、組織試料をＮＰ－４０溶解緩衝液にホモジナイズして、タンパク質ライセートを得た。細胞又は組織ホモジネートから抽出したタンパク質抽出物３０μｇを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離させ、ポリフッ化ビニリデン膜に移し、免疫ブロット法により分析した。膜を、以下の抗体でプローブ探索した：抗ＲＩＰＫ３（＃ＮＢＰ１－７７２９９；Novus、センテニアル、アメリカ）又は（＃ＡＨＰ１７９７、AbD Serotec，Bio-Rad Laboratories、ハーキュリーズ、アメリカ）、抗ＲＩＰＫ１（＃３４９３；Cell Signaling、マサチューセッツ、アメリカ）、抗ホスホ－ＭＬＫＬマウス（＃３７３３３；Cell Signaling）又は（＃ａｂ １９６４３６、Abcam、ケンブリッジ、イギリス）、抗ホスホ－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（＃４０６０；Cell Signaling）、抗ＡＫＴ（＃４６９１；Cell Signaling）；抗ＧＡＰＤＨ（＃９７１６６；Cell Signaling）又は（＃ｓｃ－２３２３３、Santa Cruz Biotechnology）；抗ＭＬＫＬ（＃ａｂ１７２８６８；Abcam）又は（＃ＳＡＢ１３０２３３９、Sigma）、及び抗チューブリン（＃６６０３１－１－ｌｇ；Proteintech、イリノイ、アメリカ）。全ての一次抗体は、１：２０００に希釈して使用した。二次抗体として、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（＃ＮＡ９３４Ｖ；GE healthcare、シカゴ、アメリカ）及び抗マウスＨＲＰ（＃ＮＡ９３１Ｖ；GE healthcare）を使用した。全ての二次抗体は、１：１００００に希釈して使用した。
【0066】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（ThermoFisher）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて、トータルＲＮＡを肝組織から精製した。ＲＮＡの量及び質は、ｎａｎｏｄｒｏｐ（ThermoFisher）を用いて、分光学的に特定した。トータルＲＮＡ（２μｇ）を用いて、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素キット（ThermoFisher）を用い、製造業者の手順に従って、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ試料（２μｌ）は、合計体積１０μｌで、ＳＹＢＲグリーン試薬（Roche Diagnostics、メラン、フランス）及び特異的プライマーを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｒｏｃｈｅ装置でＲＴ－ｑＰＣＲを行うのに使用された。全てのＲＴ－ｑＰＣＲは、２つ組で行われた。データを生成し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ソフトウェア１．１．０を用いて分析した。全ての値は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（Ｈｍｂｓ）、又はヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）ｍＲＮＡのレベルを基準に正規化された。
ＴＲＩｚｏｌ試薬（ThermoFisher）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて、トータルＲＮＡを肝組織から精製した。ＲＮＡの量及び質は、ｎａｎｏｄｒｏｐ（ThermoFisher）を用いて、分光学的に特定した。トータルＲＮＡ（２μｇ）を用いて、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素キット（ThermoFisher）を用い、製造業者の手順に従って、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ試料（２μｌ）は、合計体積１０μｌで、ＳＹＢＲグリーン試薬（Roche Diagnostics、メラン、フランス）及び特異的プライマーを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ Ｒｏｃｈｅ装置でＲＴ－ｑＰＣＲを行うのに使用された。全てのＲＴ－ｑＰＣＲは、２つ組で行われた。データを生成し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６ソフトウェア１．１．０を用いて分析した。全ての値は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（Ｈｍｂｓ）、又はヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）ｍＲＮＡのレベルを基準に正規化された。
【0067】
組織学検査及び免疫組織化学検査
パラフィン切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、シリウスレッド（ＳＲ）で染色するか、又は様々な一次抗体及び二次抗体とともにインキュベートした。ホルマリン（４％）固定しパラフィン包埋した肝組織切片を、Ｂｏｎｄ一次抗体希釈剤（Leica Biosystems、ウェッツラー、ドイツ）中でインキュベートし、ＢＯＮＤ－ＭＡＸ免疫組織化学ロボット（Leica Biosystems）で、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）用ＢＯＮＤ重合体精密検出液を用いて染色を行った。抗Ｆ４／８０抗体（Spring Bioscience、アリゾナ、アメリカ）を一次抗体として使用した。撮影は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ Ｓ３６０スライドスキャナー（浜松ホトニクス株式会社、浜松、日本）で行った。Ｈ＆Ｅ及びＳＲ染色は、熟練した病理医により盲検で評価され、ＮＡＦＬＤ用組織学的スコアリングシステムを、ＮＡＳスコアシステムに従って行った。染色は、ＦＩＪＩソフトウェアを用いてデンシトメトリー法（合計組織面積あたりの染色面積）で定量し、合計組織面積を基準に正規化した。
パラフィン切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、シリウスレッド（ＳＲ）で染色するか、又は様々な一次抗体及び二次抗体とともにインキュベートした。ホルマリン（４％）固定しパラフィン包埋した肝組織切片を、Ｂｏｎｄ一次抗体希釈剤（Leica Biosystems、ウェッツラー、ドイツ）中でインキュベートし、ＢＯＮＤ－ＭＡＸ免疫組織化学ロボット（Leica Biosystems）で、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）用ＢＯＮＤ重合体精密検出液を用いて染色を行った。抗Ｆ４／８０抗体（Spring Bioscience、アリゾナ、アメリカ）を一次抗体として使用した。撮影は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ Ｓ３６０スライドスキャナー（浜松ホトニクス株式会社、浜松、日本）で行った。Ｈ＆Ｅ及びＳＲ染色は、熟練した病理医により盲検で評価され、ＮＡＦＬＤ用組織学的スコアリングシステムを、ＮＡＳスコアシステムに従って行った。染色は、ＦＩＪＩソフトウェアを用いてデンシトメトリー法（合計組織面積あたりの染色面積）で定量し、合計組織面積を基準に正規化した。
【0068】
ミトコンドリア呼吸アッセイ
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄプローブを用いて、ミトコンドリア量を測定した。細胞を、９６ウェルプレートで培養し、洗い、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃で２時間、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（５００ｎｍｏｌ／Ｌ）（ThermoFisher）とともにインキュベートした。プレート蛍光リーダー（TECAN、メンネドルフ、スイス）を用いて、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素について励起５７５ｎｍ／蛍光６２０ｎｍで色素蛍光を分析した。結果は、ＤＡＰＩ蛍光を基準に正規化した。ミトコンドリア呼吸アッセイを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ２４ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ検査キット（Seahorse Biosciences、マサチューセッツ、アメリカ）を用いて、取扱説明書に従って行った。手短に述べると、ＡＭＬ－１２細胞を、２４ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養プレートに１ウェルあたり５００００細胞の最適化密度で播種し、一晩インキュベートした。各細胞株を、８つの同一種類のウェルで播種した（ｎ＝８）。２４時間後、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ２４ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ ＡｎａｌｙｚｅｒをＸＦｅ Ｗａｖｅソフトウェアとともに用いて、各ウェルの酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。各ウェルについて連続ＯＣＲ測定を行った。この測定は、３回の基礎ＯＣＲ測定、１μｍｏｌ／Ｌのオリゴマイシンの自動注入に続く３回のＯＣＲ測定、１μＭのカルボニルシアニドｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の注入に続く３回のＯＣＲ測定、そして最後に、１μＭのロテノンの２回注入に続く３回のＯＣＲ測定からなるものであった。ＯＣＲ測定に続いて、細胞播種が、対照細胞とＫＯ細胞との間で同一であることを確実にするために、各ウェルの総細胞タンパク質抽出物を評価した。
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄプローブを用いて、ミトコンドリア量を測定した。細胞を、９６ウェルプレートで培養し、洗い、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃で２時間、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（５００ｎｍｏｌ／Ｌ）（ThermoFisher）とともにインキュベートした。プレート蛍光リーダー（TECAN、メンネドルフ、スイス）を用いて、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素について励起５７５ｎｍ／蛍光６２０ｎｍで色素蛍光を分析した。結果は、ＤＡＰＩ蛍光を基準に正規化した。ミトコンドリア呼吸アッセイを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ２４ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ検査キット（Seahorse Biosciences、マサチューセッツ、アメリカ）を用いて、取扱説明書に従って行った。手短に述べると、ＡＭＬ－１２細胞を、２４ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養プレートに１ウェルあたり５００００細胞の最適化密度で播種し、一晩インキュベートした。各細胞株を、８つの同一種類のウェルで播種した（ｎ＝８）。２４時間後、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ２４ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ ＡｎａｌｙｚｅｒをＸＦｅ Ｗａｖｅソフトウェアとともに用いて、各ウェルの酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。各ウェルについて連続ＯＣＲ測定を行った。この測定は、３回の基礎ＯＣＲ測定、１μｍｏｌ／Ｌのオリゴマイシンの自動注入に続く３回のＯＣＲ測定、１μＭのカルボニルシアニドｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の注入に続く３回のＯＣＲ測定、そして最後に、１μＭのロテノンの２回注入に続く３回のＯＣＲ測定からなるものであった。ＯＣＲ測定に続いて、細胞播種が、対照細胞とＫＯ細胞との間で同一であることを確実にするために、各ウェルの総細胞タンパク質抽出物を評価した。
【0069】
肝臓ミトコンドリアの単離及びＭＲＣ酵素アッセイ
凍結肝臓試料を単離緩衝液（２２５ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのスクロース、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２））中、４５０μｌあたり肝組織５０ｍｇの比で、機械式ビーズホモジナイザー（ＲＥＴＳＣＨ－ＭＭ３０１、Verder Scientific GmbH、ハーン、ドイツ）を用いてホモジナイズすることにより、マウス肝臓核除去後上清を調製した。８００ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清は残して、ペレットを廃棄した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で、標準としてＢＳＡを用いて測定し、アッセイごとに２０μｌの一定分量（２μｇ／μｌ）を用いた。呼吸複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩ＋ＩＩＩ混合型、ＩＶ、及びクエン酸シンターゼの活性を、以下に記載のとおりに分析した。
凍結肝臓試料を単離緩衝液（２２５ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのスクロース、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２））中、４５０μｌあたり肝組織５０ｍｇの比で、機械式ビーズホモジナイザー（ＲＥＴＳＣＨ－ＭＭ３０１、Verder Scientific GmbH、ハーン、ドイツ）を用いてホモジナイズすることにより、マウス肝臓核除去後上清を調製した。８００ｇ、４℃で１０分間遠心後、上清は残して、ペレットを廃棄した。タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で、標準としてＢＳＡを用いて測定し、アッセイごとに２０μｌの一定分量（２μｇ／μｌ）を用いた。呼吸複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩ＋ＩＩＩ混合型、ＩＶ、及びクエン酸シンターゼの活性を、以下に記載のとおりに分析した。
【0070】
複合体Ｉ（ＮＡＤＨユビキノンオキシド－レダクターゼ）の比活性を、ＮＡＤＨの酸化による３４０ｎｍのＮＡＤＨ吸光度の低下により測定した。２つの１ｍＬキュベット中、単離した核除去後上清（４０μｇ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、３．７５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１００μＭデシルユビキノン）９５０μｌに加えた。２つのキュベットのうち片方に、ロテノン（１２．５μＭ）を複合体Ｉ活性の阻害剤として用いた。３４０ｎｍ及び３７℃の条件下、初期較正を空気で行い、キュベットを分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ ８００）中で５分間インキュベートした。次いで、ＮＡＤＨの酸化速度を、１００μＭのＮＡＤＨを添加してから３分間、１５秒ごとに測定した。複合体Ｉ比活性は、合計ＮＡＤＨユビキノンオキシド－レダクターゼ活性からロテノン非感受性活性を差し引くことにより計算されたロテノン感受性活性である。
【0071】
複合体ＩＩ（コハク酸ユビキノンオキシド－レダクターゼ）の比活性を、２，６－ジクロロフェノールインドフェノールの還元による６００ｎｍの吸光度の低下により評価した。肝臓核除去後上清（４０μｇ）を、反応緩衝液（２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのコハク酸塩、１ｍＭのＫＣＮ、１００μＭのＡＴＰ、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０μＭの２，６－ジクロロフェノールインドフェノールナトリウム塩）９７６μｌに加え、各キュベット中、３７℃で５分間、平衡化させた。初期較正を空気で行い、ベースラインを、３分間、１５秒ごとに測定した。室温に維持しながら、２５ｍＭのデシルユビキノンを４μｌ加えることにより反応を開始させ、６００ｎｍでの吸光度を、３７℃で３分間、１５秒ごとに測定した。
【0072】
複合体ＩＩ＋ＩＩＩ（コハク酸シトクロムｃオキシド－レダクターゼ）の混合活性を、シトクロムｃの還元による５５０ｎｍの吸光度の上昇により測定した。核除去後上清（４０μｇ）を、反応緩衝液（２０ｍＭのコハク酸塩、２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００μＭのシトクロムｃ、１ｍＭのＫＣＮ、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１００μＭのＡＴＰ）８８０μｌに加え、３７℃で５分間、平衡化させた。初期較正を空気で行い、ベースラインを、５５０ｎｍで３分間、１５秒ごとに測定した。室温に維持しながら、１ｍＭのシトクロムｃを１００μｌ加えることにより反応を開始させ、５５０ｎｍでの吸光度を、３７℃で３分間、２０秒ごとに測定した。
【0073】
複合体ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼ）の比活性を、還元シトクロムｃの酸化による５５０ｎｍの吸光度の低下により測定した。５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中の１００μＭの還元シトクロムｃを使用することにより、初期シトクロムｃ溶液を調製した。シトクロムｃの１００％酸化溶液及び還元溶液は、それぞれ、１ｍＬキュベット中、初期シトクロムｃ溶液を用いて、フェリシアン化カリウム及び亜ジチオン酸ナトリウムを数グラム加えて調製した。空気でのブランクを得た後、１００％酸化溶液の吸光度を５５０ｎｍで測定し、次いで１００％酸化溶液を用いて再度ブランク測定した後、１００％還元溶液を測定した。吸光度が還元溶液吸光度の９０％～９５％に到達するまで、初期シトクロムｃ溶液に一定分量の１００％還元溶液を少しずつ加えた。次いで、還元された初期シトクロムｃ溶液９８０μｌを、１ｍＬキュベット中、３７℃で５分間、インキュベートした。初期較正を空気で行った。核除去後上清（４０μｇ）を加えることで反応を開始させ、５５０ｎｍでの吸光度を、３７℃で３分間、１０秒ごとに測定した。
【0074】
クエン酸シンターゼ（ＣＳ）の活性は、チオニトロ安息香酸アニオン形成の変化により評価した。肝臓核除去後上清（４０μｇ）を、反応緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１００μＭの５，５’－ジチオビス－２－ニトロ安息香酸塩、３００μＭのアセチル－ＣｏＡ、５００μＭのオキサロ酢酸塩、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）９３０μｌに加えた。次いで、４１２ｎｍでの吸光度を、３７℃で４分間、２０秒ごとに測定した。
【0075】
測定された活性は全て、ｎｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇで表した。
【0076】
細胞増殖アッセイ
ＡＭＬ－１２細胞（１ウェルあたり５０００）を、９６ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ThermoFisher）中、３７℃で一晩インキュベートした。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）を補充しておいた。細胞増殖を、播種から０時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間後にＢｒｄＵ比色測定ＥＬＩＳＡアッセイ（Roche Diagnostics、メラン、フランス）を行うか、又はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析を取扱説明書に従って行うかのいずれかにより測定した。
ＡＭＬ－１２細胞（１ウェルあたり５０００）を、９６ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ThermoFisher）中、３７℃で一晩インキュベートした。培地には、１０％ウシ胎仔血清（Eurobio）を補充しておいた。細胞増殖を、播種から０時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間後にＢｒｄＵ比色測定ＥＬＩＳＡアッセイ（Roche Diagnostics、メラン、フランス）を行うか、又はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析を取扱説明書に従って行うかのいずれかにより測定した。
【0077】
細胞生存度アッセイ
細胞生存度を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシ－フェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＴ）比色測定アッセイ（ThermoFisher）を用いて特定した。このアッセイは、細胞代謝活性を測定する。このアッセイは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）がＭＴＴを還元してその不溶性最終産物ホルマザンにする能力に基づいており、ホルマザンは、紫色を呈色する。細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ試薬（ThermoFisher）とともに２時間インキュベートした。光学顕微鏡下でＭＴＴ結晶を制御して発生させたら、結晶をＤＭＳＯに溶解させて、５４０ｎｍで吸光度を測定することにより定量した。
細胞生存度を、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシ－フェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＴ）比色測定アッセイ（ThermoFisher）を用いて特定した。このアッセイは、細胞代謝活性を測定する。このアッセイは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）がＭＴＴを還元してその不溶性最終産物ホルマザンにする能力に基づいており、ホルマザンは、紫色を呈色する。細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ試薬（ThermoFisher）とともに２時間インキュベートした。光学顕微鏡下でＭＴＴ結晶を制御して発生させたら、結晶をＤＭＳＯに溶解させて、５４０ｎｍで吸光度を測定することにより定量した。
【0078】
オイルレッドＯ染色、画像処理、及び定量
細胞内脂質を、オイルレッドＯ（Sigma）で染色した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで、１０分間固定した。固定した細胞を、オイルレッドＯ溶液とともに室温で３０分間インキュベートし、次いで、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Life Technologies）とともに５分間インキュベートした。蛍光画像を、ＩＸ８３ Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で視認し、Ｃｅｌｌ－Ｓｅｎｓ Ｖ１．６で取得し、ＦＩＪＩソフトウェアで分析した。１条件あたり８箇所～１０箇所の異なる範囲の画像を、ｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いて蛍光顕微鏡により画像化し、続いてＦＩＪＩソフトウェアを用いてコンピューター画像分析を行った。簡単に述べると、分析は、８ビッドレッド・グリーン・ブルー画像を二値画像へと閾値変換することにより行った。二値画像は、脂肪滴を表すピクセルのみからなるものである。実験の各セットについて、脂肪滴シグナル、すなわちレッドピクセルの色飽和につき１つの閾値を定義した。重要なことは、画像分解後、一貫性及び正確な二値変換に関して、二値画像を元来の画像と手作業で比較したことである。画像中の脂肪滴で占められた範囲を、ＦＩＪＩソフトウェアによりμｍ２単位の表面積として表示する。これは、ＤＡＰＩ染色核の半自動計測による細胞数を基準に正規化された。切片の拡大表示は、白色四角で示される。
細胞内脂質を、オイルレッドＯ（Sigma）で染色した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで、１０分間固定した。固定した細胞を、オイルレッドＯ溶液とともに室温で３０分間インキュベートし、次いで、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Life Technologies）とともに５分間インキュベートした。蛍光画像を、ＩＸ８３ Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で視認し、Ｃｅｌｌ－Ｓｅｎｓ Ｖ１．６で取得し、ＦＩＪＩソフトウェアで分析した。１条件あたり８箇所～１０箇所の異なる範囲の画像を、ｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いて蛍光顕微鏡により画像化し、続いてＦＩＪＩソフトウェアを用いてコンピューター画像分析を行った。簡単に述べると、分析は、８ビッドレッド・グリーン・ブルー画像を二値画像へと閾値変換することにより行った。二値画像は、脂肪滴を表すピクセルのみからなるものである。実験の各セットについて、脂肪滴シグナル、すなわちレッドピクセルの色飽和につき１つの閾値を定義した。重要なことは、画像分解後、一貫性及び正確な二値変換に関して、二値画像を元来の画像と手作業で比較したことである。画像中の脂肪滴で占められた範囲を、ＦＩＪＩソフトウェアによりμｍ２単位の表面積として表示する。これは、ＤＡＰＩ染色核の半自動計測による細胞数を基準に正規化された。切片の拡大表示は、白色四角で示される。
【0079】
細胞内トリグリセリド含量の定量
ヘキサン／イソプロピルアルコール（３：２）を用いて、細胞内脂質を初代ヒト肝細胞から抽出した。細胞を洗い、１２ウェル培養プレート中、ヘキサン／イソプロピルアルコール（３：２、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１ウェルあたり５００μＬ用いて、シェーカー（８０ｒｐｍ／分）中、室温で６０分間、インキュベートした。次いで、全てのウェルの内容物を、有機溶媒の窒素蒸発用ガラス管に移した。蒸発後、脂質をイソプロピルアルコールに再懸濁させ、乾燥後分析用に２つ組の９６ウェルプレートに移した。Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリドキット（ThermoFisher）を用い、取扱説明書に従って、トリグリセリドを測定した。各ウェルの吸光度を、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（TECAN）を用いて測定し、標準曲線に基づいて濃度に変換した。結果は、細胞タンパク質含量を基準に正規化した。
ヘキサン／イソプロピルアルコール（３：２）を用いて、細胞内脂質を初代ヒト肝細胞から抽出した。細胞を洗い、１２ウェル培養プレート中、ヘキサン／イソプロピルアルコール（３：２、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１ウェルあたり５００μＬ用いて、シェーカー（８０ｒｐｍ／分）中、室温で６０分間、インキュベートした。次いで、全てのウェルの内容物を、有機溶媒の窒素蒸発用ガラス管に移した。蒸発後、脂質をイソプロピルアルコールに再懸濁させ、乾燥後分析用に２つ組の９６ウェルプレートに移した。Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリドキット（ThermoFisher）を用い、取扱説明書に従って、トリグリセリドを測定した。各ウェルの吸光度を、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（TECAN）を用いて測定し、標準曲線に基づいて濃度に変換した。結果は、細胞タンパク質含量を基準に正規化した。
【0080】
肝組織（２０ｍｇ～３０ｍｇ）を、１ｍＬのＰＢＳに加えて、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｌｙｓｅｒホモジナイザー（Qiagen）を用いて３回のサイクルでホモジナイズした。サイクルはそれぞれ３０秒であった。ホモジネートを、透明ガラス管（Labelians Group、ヌムール、フランス）に移した。ホモジネートを、クロロホルム及びメタノール５ｍＬ（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）と混合した。混合物を激しくボルテックスし、氷上で１５分間インキュベートして、２相に分離させた。脂質抽出物を、１６５０ｇ、４℃で１０分間遠心することにより、下相に濃縮させた。有機溶媒相の一定分量を、窒素ガス下で蒸発させた。肝組織の脂質抽出物を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有イソプロパノール２００μＬに溶解させた。アッセイ自体に関して、トリグリセリド標準又は肝臓脂質抽出物１０μｌを９６ウェルプレートに加え、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリド試薬（ThermoFisher）２００μＬをマイクロプレートに加えた。ライセート中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイキット（ThermoFisher）により測定した。吸光度を、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを用いて測定した。肝臓トリグリセリドレベルを、タンパク質含量を基準に正規化した。
【0081】
ＥＬＩＳＡ分析
ヒトＲＩＰＫ１（ＳＥＥ６４０Ｈｕ；Could-Clone Corp．、テキサス、アメリカ）、ヒトＭＬＫＬ（ＳＥＲ６４５Ｈｕ；Could-Clone Corp．）及びマウスＲＩＰＫ１（ＣＳＢ－ＥＬ０１９７３５ＭＯ；Cusabio、テキサス、アメリカ）のタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡキットにより、取扱説明書に従って測定した。
ヒトＲＩＰＫ１（ＳＥＥ６４０Ｈｕ；Could-Clone Corp．、テキサス、アメリカ）、ヒトＭＬＫＬ（ＳＥＲ６４５Ｈｕ；Could-Clone Corp．）及びマウスＲＩＰＫ１（ＣＳＢ－ＥＬ０１９７３５ＭＯ；Cusabio、テキサス、アメリカ）のタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡキットにより、取扱説明書に従って測定した。
【0082】
実施例１ － ＲＩＰＫ１阻害剤は、ＨＦＤ給餌マウスにおいて、壊死性炎症性特質及び繊維化ＮＡＳＨ特質を減少させる
ＲＩＰＡ－５６は、ＴＮＦα誘導型細胞死の十分に確立された細胞モデル、すなわち、Ｌ９２９細胞を用いて本明細書中で確認されたとおり（図１Ａ～図１Ｃ）、高度に強力、選択的、かつ代謝安定なＲＩＰＫ１阻害剤であり、ＭＬＫＬ活性化及びＭＬＫＬ介在性細胞死を防止することができる。ＮＡＳＨにおけるＲＩＰＫ１阻害の治療可能性を研究するため、ＲＩＰＡ－５６を、ＨＦＤマウスモデルで試験した。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１６週間、ＮＣＤ又はＨＦＤを給餌した。ＨＦＤ給餌マウスは、追加の処置を受けないか又はＲＩＰＡ－５６を投与されるかのいずれかであり、ＲＩＰＡ－５６は、ＨＦＤ給餌の最初から又は１２週間後のいずれかで投与され、それぞれ予防処置及び治癒処置を模倣していた（図２Ａ）。ウエスタンブロット分析から、ＲＩＰＫ１の下流標的であるＭＬＫＬ及びＲＩＰＫ３が、ＮＣＤ給餌マウスに比べてＨＦＤ給餌マウスの肝臓で過剰発現したことが示された。ＨＦＤ給餌マウスでは、ＲＩＰＡ－５６は、両方の処置でそれらの発現を抑制しており、予防設定ではほとんど完全な阻害であった（図２Ｂ）。同様に、ＭＬＫＬ及びＲＩＰＫ３のｍＲＮＡレベルは、両レジメンで低下した（図３）。対照的に、ＲＩＰＫ１の発現は、ＲＩＰＡ－５６処置による影響を受けなかった（図２Ｂ及び図３）。ＨＦＤ給餌マウスにおける血清中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加（ＮＣＤ給餌マウスに比べて約５倍の増加）は、予防設定及び治癒設定の両方で、ＲＩＰＡ－５６により消失し、このことは、これらの動物において組織損傷が減少したことを示唆する（図２Ｃ）。
ＲＩＰＡ－５６は、ＴＮＦα誘導型細胞死の十分に確立された細胞モデル、すなわち、Ｌ９２９細胞を用いて本明細書中で確認されたとおり（図１Ａ～図１Ｃ）、高度に強力、選択的、かつ代謝安定なＲＩＰＫ１阻害剤であり、ＭＬＫＬ活性化及びＭＬＫＬ介在性細胞死を防止することができる。ＮＡＳＨにおけるＲＩＰＫ１阻害の治療可能性を研究するため、ＲＩＰＡ－５６を、ＨＦＤマウスモデルで試験した。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１６週間、ＮＣＤ又はＨＦＤを給餌した。ＨＦＤ給餌マウスは、追加の処置を受けないか又はＲＩＰＡ－５６を投与されるかのいずれかであり、ＲＩＰＡ－５６は、ＨＦＤ給餌の最初から又は１２週間後のいずれかで投与され、それぞれ予防処置及び治癒処置を模倣していた（図２Ａ）。ウエスタンブロット分析から、ＲＩＰＫ１の下流標的であるＭＬＫＬ及びＲＩＰＫ３が、ＮＣＤ給餌マウスに比べてＨＦＤ給餌マウスの肝臓で過剰発現したことが示された。ＨＦＤ給餌マウスでは、ＲＩＰＡ－５６は、両方の処置でそれらの発現を抑制しており、予防設定ではほとんど完全な阻害であった（図２Ｂ）。同様に、ＭＬＫＬ及びＲＩＰＫ３のｍＲＮＡレベルは、両レジメンで低下した（図３）。対照的に、ＲＩＰＫ１の発現は、ＲＩＰＡ－５６処置による影響を受けなかった（図２Ｂ及び図３）。ＨＦＤ給餌マウスにおける血清中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加（ＮＣＤ給餌マウスに比べて約５倍の増加）は、予防設定及び治癒設定の両方で、ＲＩＰＡ－５６により消失し、このことは、これらの動物において組織損傷が減少したことを示唆する（図２Ｃ）。
【0083】
ＨＦＤ給餌マウスの肝臓の組織変化は、脂肪過多症、炎症細胞浸潤、及び線維症が複合していた（図２Ｄ～図２Ｉ）。肝臓Ｆ４／８０免疫染色によりＨＦＤ給餌マウスにおけるマクロファージ浸潤（ＮＣＤ給餌マウスに比べて約１０倍の増加）が確認されたが、これは、予防処置及び治癒処置の両方でＲＩＰＡ－５６により抑制された（図２Ｄ及び図２Ｅ）。この知見と一致して、Ｆ４／８０のｍＲＮＡレベル及び強力なマクロファージ化学誘引物質であるＭｃｐ－１のｍＲＮＡレベルは、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓中の方がＮＣＤ給餌マウスよりも有意に高かった（それぞれ約３倍高かった）。そしてこの差は、ＲＩＰＡ－５６を用いたレジメン両方後に消失した（図２Ｆ）。主要炎症促進性サイトカインであるＴＮＦαの発現は、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓でも同様に増加した（３倍の増加）が、ＲＩＰＡ－５６予防処置後は増加せず、治癒処置後は顕著に減少した（図２Ｆ）。同様に、他の炎症性マーカー、例えば、Ｃｃｌ２０、Ｎｌｒｐ３、又はＩｌ－１ｂ等のｍＲＮＡレベルの増加が、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓で観察されたが、ＲＩＰＡ－５６処置されたマウスでは、消失又は減少した（図４）。
【0084】
肝組織切片のシリウスレッド染色から、ＨＦＤ給餌マウスは、細胞周囲線維症を発症した（ＮＣＤ給餌マウスよりも１０倍高い）が、これは、ＲＩＰＡ－５６処置後、実質的に消失したことが示された（図２Ｇ及び図２Ｈ）。ＨＦＤ給餌マウスの肝臓では、コラーゲン－１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）ｍＲＮＡレベルも、ＮＣＤ給餌マウスに比べて上昇した（約６倍の上昇）。ｍＲＮＡレベルは、ＲＩＰＡ－５６予防処置後は全く上昇することはなく、治癒処置後に低下した（図２Ｉ）。
【0085】
これらの結果は、ＲＩＰＫ１がＮＡＳＨの病理発生に寄与していること、及びＲＩＰＫ１阻害剤ＲＩＰＡ－５６を用いた予防処置がＮＡＳＨの組織学的特質を予防するのに対し、治癒処置は、それら特質の強度を大きく減弱させることを、疑いの余地なく実証した。
【0086】
実施例２ － ＲＩＰＫ１阻害剤は、ＨＦＤ給餌マウスにおいて、脂肪過多症を反転させ、体重増加を弱める
ＨＦＤ給餌マウスは、肥満を発症した。予防設定で、ＲＩＰＡ－５６処置及びＨＦＤを同時に開始した場合、マウスは依然として肥満であったものの、体重増加が未処置ＨＦＤ給餌マウスよりも有意に少なかった（約１２％低かった）（図５Ａ）。これらのマウスは、ＨＦＤ下の未処置マウスに比べて、脂肪量及び相対脂肪量の有意な減少、並びに除脂肪量及び相対除脂肪体重の増加傾向を提示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。対照的に、治癒設定で、１２週間のＨＦＤ後にＲＩＰＡ－５６を遅れて開始した結果、未処置ＨＦＤ給餌マウスに比べて体重増加、脂肪量、又は除脂肪量に差がなかった（図５Ａ並びに図６Ａ及び図６Ｂ）。ＨＦＤ給餌群間で食物摂取、自発運動、又は呼吸交換比（ＶＣＯ２対ＶＯ２比）に有意差は観察されなかった（図５Ｂ～図５Ｄ）。それでも、間接的熱量測定法を用いると、ＨＦＤ給餌マウスでは、ＲＩＰＡ－５６治癒処置を受けたもの又は処置を受けなかったものと比べた場合に、ＲＩＰＡ－５６予防処置後にエネルギー消費が増加したことが記録され（図５Ｅ）、予防処置は、これらマウスにおける体重増加が少なかったことに少なくとも部分的に寄与していた可能性がある。興味深いことには、ＨＦＤ給餌マウスは、治癒的及び予防的ＲＩＰＡ－５６投与どちらの後も肥満のままであったにもかかわらず、両設定において脂肪過多症は大きく減少した（図５Ｆ～図５Ｈ）。ＲＩＰＡ－５６は、盲検組織分析（図５Ｆ及び図５Ｇ）により及び肝臓トリグリセリド含量（約３０％～４０％減少）（図５Ｈ）により測定した場合、肝脂肪含量の顕著な減少をもたらした。まとめると、これらの結果は、ＲＩＰＫ１阻害がＨＦＤ誘導型脂肪肝を改善することを示した。
ＨＦＤ給餌マウスは、肥満を発症した。予防設定で、ＲＩＰＡ－５６処置及びＨＦＤを同時に開始した場合、マウスは依然として肥満であったものの、体重増加が未処置ＨＦＤ給餌マウスよりも有意に少なかった（約１２％低かった）（図５Ａ）。これらのマウスは、ＨＦＤ下の未処置マウスに比べて、脂肪量及び相対脂肪量の有意な減少、並びに除脂肪量及び相対除脂肪体重の増加傾向を提示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。対照的に、治癒設定で、１２週間のＨＦＤ後にＲＩＰＡ－５６を遅れて開始した結果、未処置ＨＦＤ給餌マウスに比べて体重増加、脂肪量、又は除脂肪量に差がなかった（図５Ａ並びに図６Ａ及び図６Ｂ）。ＨＦＤ給餌群間で食物摂取、自発運動、又は呼吸交換比（ＶＣＯ２対ＶＯ２比）に有意差は観察されなかった（図５Ｂ～図５Ｄ）。それでも、間接的熱量測定法を用いると、ＨＦＤ給餌マウスでは、ＲＩＰＡ－５６治癒処置を受けたもの又は処置を受けなかったものと比べた場合に、ＲＩＰＡ－５６予防処置後にエネルギー消費が増加したことが記録され（図５Ｅ）、予防処置は、これらマウスにおける体重増加が少なかったことに少なくとも部分的に寄与していた可能性がある。興味深いことには、ＨＦＤ給餌マウスは、治癒的及び予防的ＲＩＰＡ－５６投与どちらの後も肥満のままであったにもかかわらず、両設定において脂肪過多症は大きく減少した（図５Ｆ～図５Ｈ）。ＲＩＰＡ－５６は、盲検組織分析（図５Ｆ及び図５Ｇ）により及び肝臓トリグリセリド含量（約３０％～４０％減少）（図５Ｈ）により測定した場合、肝脂肪含量の顕著な減少をもたらした。まとめると、これらの結果は、ＲＩＰＫ１阻害がＨＦＤ誘導型脂肪肝を改善することを示した。
【0087】
実施例３ － ＲＩＰＫ１阻害は、初代ヒト脂肪性肝細胞において脂肪枯渇を促進する
ＲＩＰＡ－５６が肝細胞に直接作用する可能性があるかどうかを試験するため、初代ヒト脂肪性肝細胞のモデルを最初に使用した。ＮＡＦＬＤ患者の肝臓から単離した肝細胞を、４８時間初代培養した後、ＲＩＰＡ－５６又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。細胞内脂質含量を、オイルレッドＯ染色及びトリグリセリドアッセイにより評価した（図７Ａ～図７Ｃ）。ＲＩＰＡ－５６処理した脂肪性肝細胞は、細胞内脂肪滴（図７Ａ及び図７Ｂ）及びトリグリセリド含量（図７Ｃ）の顕著な減少を起こした。根本的機構についての洞察を得るため、初代ヒト肝細胞を遊離脂肪酸混合物（オレイン酸及びパルミチン酸、モル比２：１）とともに４８時間インキュベートすることで脂肪過多症を誘導したものも用いた。遊離脂肪酸に誘導された脂肪滴の増加は、細胞生存度に影響を及ぼすことなく、４８時間以内で約２倍～３倍にのぼった（図８Ａ～図８Ｄ）。脂肪肝から単離された肝細胞と類似して、初代ヒト肝細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪過多症を誘導したものも、ＲＩＰＡ－５６に反応して、細胞内脂肪滴（図７Ｄ及び図７Ｅ）及びトリグリセリド含量（図７Ｆ）の有意な減少を起こした。これは、ＣＰＴ１Ａ、ＡＰＯＢ１００、及びＭＴＴＰ発現の上方制御と共存しており、このことは、脂肪酸β酸化及び／又はトリグリセリド排出の増加が、ＲＩＰＡ－５６の抗脂肪性作用に寄与したことを示唆する（図７Ｇ）。
ＲＩＰＡ－５６が肝細胞に直接作用する可能性があるかどうかを試験するため、初代ヒト脂肪性肝細胞のモデルを最初に使用した。ＮＡＦＬＤ患者の肝臓から単離した肝細胞を、４８時間初代培養した後、ＲＩＰＡ－５６又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。細胞内脂質含量を、オイルレッドＯ染色及びトリグリセリドアッセイにより評価した（図７Ａ～図７Ｃ）。ＲＩＰＡ－５６処理した脂肪性肝細胞は、細胞内脂肪滴（図７Ａ及び図７Ｂ）及びトリグリセリド含量（図７Ｃ）の顕著な減少を起こした。根本的機構についての洞察を得るため、初代ヒト肝細胞を遊離脂肪酸混合物（オレイン酸及びパルミチン酸、モル比２：１）とともに４８時間インキュベートすることで脂肪過多症を誘導したものも用いた。遊離脂肪酸に誘導された脂肪滴の増加は、細胞生存度に影響を及ぼすことなく、４８時間以内で約２倍～３倍にのぼった（図８Ａ～図８Ｄ）。脂肪肝から単離された肝細胞と類似して、初代ヒト肝細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪過多症を誘導したものも、ＲＩＰＡ－５６に反応して、細胞内脂肪滴（図７Ｄ及び図７Ｅ）及びトリグリセリド含量（図７Ｆ）の有意な減少を起こした。これは、ＣＰＴ１Ａ、ＡＰＯＢ１００、及びＭＴＴＰ発現の上方制御と共存しており、このことは、脂肪酸β酸化及び／又はトリグリセリド排出の増加が、ＲＩＰＡ－５６の抗脂肪性作用に寄与したことを示唆する（図７Ｇ）。
【0088】
実施例４ － ＲＩＰＫ１の下流標的であるＭＬＫＬは、肝細胞においてトリグリセリド含量を調節する
ＭＬＫＬは、ＲＩＰＫ１の下流標的であり、そのリン酸化及び活性化は、ＲＩＰＡ－５６により、数時間の間、阻害される（図１）。ＭＬＫＬの発現もまた、ＲＩＰＡ－５６処置後、数週間、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓で下方制御される（図２Ｂ及び図３）。したがって、ＭＬＫＬ阻害により、脂肪性肝細胞においてＲＩＰＡ－５６により誘導される脂肪枯渇を説明できるのではないかという仮説が立てられ、ヒトＭＬＫＬの特異的阻害剤であるネクロスルホンアミドが、ヒト脂肪性肝細胞において細胞脂肪を減少させるかどうかが試験された。図９は、ネクロスルホンアミドが、細胞内脂肪滴（図９Ａ及び図９Ｂ）及びトリグリセリド含量（図９Ｃ）を有意に減少させ、ＣＰＴ１Ａ発現を上方制御した（図９Ｄ）ことを示す。ＭＬＫＬ消失が、ネクロスルホンアミドと接触した肝細胞で見られる脱脂効果を再現するかどうかについても判定した。脂肪酸代謝が初代肝細胞のものに酷似している不死化マウス肝細胞（ＡＭＬ－１２細胞株）で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてＭＬＫＬをノックアウト（ＫＯ）した。有効なＫＯであることは、ウエスタンブロット分析により確認した（図９Ｅ）。遊離脂肪酸とともに４８時間インキュベートした後の細胞内トリグリセリド蓄積は、ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞において、対照よりも有意に低かった（図９Ｆ～図９Ｈ）。総合して、これらの結果は、ＲＩＰＫ１若しくは最終遂行物ＭＬＫＬを阻害することによる、又はＭＬＫＬを除去することによるネクロソームの不安定化が、肝細胞中のトリグリセリド含量を減少させるのに十分であることを示す。このため、ＲＩＰＫ１／ＭＬＫＬ軸は、ＮＡＦＬＤにおいて肝臓脂肪蓄積の主要経路であるように思われる。
ＭＬＫＬは、ＲＩＰＫ１の下流標的であり、そのリン酸化及び活性化は、ＲＩＰＡ－５６により、数時間の間、阻害される（図１）。ＭＬＫＬの発現もまた、ＲＩＰＡ－５６処置後、数週間、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓で下方制御される（図２Ｂ及び図３）。したがって、ＭＬＫＬ阻害により、脂肪性肝細胞においてＲＩＰＡ－５６により誘導される脂肪枯渇を説明できるのではないかという仮説が立てられ、ヒトＭＬＫＬの特異的阻害剤であるネクロスルホンアミドが、ヒト脂肪性肝細胞において細胞脂肪を減少させるかどうかが試験された。図９は、ネクロスルホンアミドが、細胞内脂肪滴（図９Ａ及び図９Ｂ）及びトリグリセリド含量（図９Ｃ）を有意に減少させ、ＣＰＴ１Ａ発現を上方制御した（図９Ｄ）ことを示す。ＭＬＫＬ消失が、ネクロスルホンアミドと接触した肝細胞で見られる脱脂効果を再現するかどうかについても判定した。脂肪酸代謝が初代肝細胞のものに酷似している不死化マウス肝細胞（ＡＭＬ－１２細胞株）で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてＭＬＫＬをノックアウト（ＫＯ）した。有効なＫＯであることは、ウエスタンブロット分析により確認した（図９Ｅ）。遊離脂肪酸とともに４８時間インキュベートした後の細胞内トリグリセリド蓄積は、ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞において、対照よりも有意に低かった（図９Ｆ～図９Ｈ）。総合して、これらの結果は、ＲＩＰＫ１若しくは最終遂行物ＭＬＫＬを阻害することによる、又はＭＬＫＬを除去することによるネクロソームの不安定化が、肝細胞中のトリグリセリド含量を減少させるのに十分であることを示す。このため、ＲＩＰＫ１／ＭＬＫＬ軸は、ＮＡＦＬＤにおいて肝臓脂肪蓄積の主要経路であるように思われる。
【0089】
実施例５ － ＭＬＫＬは、ミトコンドリアバイオマス及び活性を調節する
ＲＩＰＫ１／ＭＬＫＬ軸が肝細胞における脂肪貯蔵を制御する機構について洞察を更に深めるため、ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞のミトコンドリア活性を検査した。ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞は、ＭＴＴアッセイで評価した場合、生存度の見かけ上の上昇を示した（図１０Ａ）。この効果は、増殖とは無関係であり、増殖については、ＢｒｄＵアッセイ（図１０Ｂ）及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析（図１０Ｃ）で示されるとおり、ＫＯ細胞と対照細胞との間で差がなかった。ＭＴＴは、代謝活性な細胞で減少するが、これは部分的にはミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の作用によるものである。ミトコンドリア量を測定したところ、その量は適度であったが、対照と比較した場合にＫＯ細胞で有意に増加していることがわかった（図１０Ｄ）。同様に、ミトコンドリア新生の主要制御因子であるＰｇｃ１ａのｍＲＮＡレベルも、ＫＯ細胞において有意に上昇していた（図１０Ｅ）。これらの知見に基づいて、ミトコンドリア活性がＫＯ細胞株で上昇している可能性があると見込まれた。脂肪酸β酸化に関与する遺伝子（Ｃｐｔ１ａ、Ａｃｏｘ１）の発現を測定したところ、それらは、対照に比べて、ＫＯ細胞で過剰発現していることがわかった（図１０Ｅ）。これら細胞の生体エネルギー状態を比較し、ミトコンドリア呼吸試験を行った。ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞は、基礎ミトコンドリア呼吸が対照細胞よりも顕著に高かった（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。ＡＴＰ合成に費やされる酸素消費を、ミトコンドリア内膜を横断する自然プロトンリークによるものと区別するため、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンを加えたところ、ＫＯ細胞ではＡＴＰ関連呼吸が増大していることが示された（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。ＡＴＰを生成させずに酸素の急速な消費を招くアクセラレータイオノフォアであるＦＣＣＰを加えたところ、ＫＯ細胞は、最大呼吸数が、対照細胞よりも顕著に高いことが示された（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。最後に、コリン欠乏アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）食で誘導されたＮＡＳＨであるＲＩＰＫ３－ＫＯマウスでも、ＷＴマウスと比べた場合にミトコンドリア生体エネルギー特性の改善を提示するかどうかを評価した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。最初に、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスは、同一食を給餌されたＷＴマウスに比べて、リン酸化ＭＬＫＬ（ｐ－ＭＬＫＬ）のレベルが有意に低いことがわかった（図１１Ａ）。ＭＬＫＬの低下した活性に合わせて、肝臓ミトコンドリアにおけるクエン酸シンターゼ（ＣＳ）及びミトコンドリア呼吸鎖（ＭＲＣ）複合体、特に複合体ＩＩ＋ＩＩＩの活性は、ＷＴマウスに比べて、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスで有意に向上した（図１１Ｂ）。ＷＴマウスとＫＯマウスとの間のこれらの違いは、給餌期間が長くなるほど一層著明になった（図１１Ｂ）。同様に、Ｐｇｃ１ａ及びＡｃｏｘ１のｍＲＮＡレベルは両方とも、３２週間で、ＷＴマウスに比べて、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスで有意に上昇した（図１１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ミトコンドリア呼吸の調節を通じたＭＬＫＬ活性化の新規機能を提示する。
ＲＩＰＫ１／ＭＬＫＬ軸が肝細胞における脂肪貯蔵を制御する機構について洞察を更に深めるため、ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞のミトコンドリア活性を検査した。ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞は、ＭＴＴアッセイで評価した場合、生存度の見かけ上の上昇を示した（図１０Ａ）。この効果は、増殖とは無関係であり、増殖については、ＢｒｄＵアッセイ（図１０Ｂ）及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析（図１０Ｃ）で示されるとおり、ＫＯ細胞と対照細胞との間で差がなかった。ＭＴＴは、代謝活性な細胞で減少するが、これは部分的にはミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の作用によるものである。ミトコンドリア量を測定したところ、その量は適度であったが、対照と比較した場合にＫＯ細胞で有意に増加していることがわかった（図１０Ｄ）。同様に、ミトコンドリア新生の主要制御因子であるＰｇｃ１ａのｍＲＮＡレベルも、ＫＯ細胞において有意に上昇していた（図１０Ｅ）。これらの知見に基づいて、ミトコンドリア活性がＫＯ細胞株で上昇している可能性があると見込まれた。脂肪酸β酸化に関与する遺伝子（Ｃｐｔ１ａ、Ａｃｏｘ１）の発現を測定したところ、それらは、対照に比べて、ＫＯ細胞で過剰発現していることがわかった（図１０Ｅ）。これら細胞の生体エネルギー状態を比較し、ミトコンドリア呼吸試験を行った。ＭＬＫＬ－ＫＯ細胞は、基礎ミトコンドリア呼吸が対照細胞よりも顕著に高かった（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。ＡＴＰ合成に費やされる酸素消費を、ミトコンドリア内膜を横断する自然プロトンリークによるものと区別するため、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンを加えたところ、ＫＯ細胞ではＡＴＰ関連呼吸が増大していることが示された（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。ＡＴＰを生成させずに酸素の急速な消費を招くアクセラレータイオノフォアであるＦＣＣＰを加えたところ、ＫＯ細胞は、最大呼吸数が、対照細胞よりも顕著に高いことが示された（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。最後に、コリン欠乏アミノ酸規定（ＣＤＡＡ）食で誘導されたＮＡＳＨであるＲＩＰＫ３－ＫＯマウスでも、ＷＴマウスと比べた場合にミトコンドリア生体エネルギー特性の改善を提示するかどうかを評価した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。最初に、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスは、同一食を給餌されたＷＴマウスに比べて、リン酸化ＭＬＫＬ（ｐ－ＭＬＫＬ）のレベルが有意に低いことがわかった（図１１Ａ）。ＭＬＫＬの低下した活性に合わせて、肝臓ミトコンドリアにおけるクエン酸シンターゼ（ＣＳ）及びミトコンドリア呼吸鎖（ＭＲＣ）複合体、特に複合体ＩＩ＋ＩＩＩの活性は、ＷＴマウスに比べて、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスで有意に向上した（図１１Ｂ）。ＷＴマウスとＫＯマウスとの間のこれらの違いは、給餌期間が長くなるほど一層著明になった（図１１Ｂ）。同様に、Ｐｇｃ１ａ及びＡｃｏｘ１のｍＲＮＡレベルは両方とも、３２週間で、ＷＴマウスに比べて、ＲＩＰＫ３－ＫＯマウスで有意に上昇した（図１１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ミトコンドリア呼吸の調節を通じたＭＬＫＬ活性化の新規機能を提示する。
【0090】
実施例６ － ＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬは、ＮＡＳＨ患者の血清中で増加する
ネクロトーシスに介在するタンパク質の血清中濃度は、敗血症により引き起こされた組織損傷のある患者において上昇することが、以前に見つかっており、このことから、ＮＡＦＬＤの患者でも、この上昇が壊死性炎症性活性の結果として生じる可能性が出てくる。ＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬタンパク質の血清中濃度を、ＮＡＦＬＤ患者３５人で測定したところ、これらの濃度は、活動性疾患である（組織学的活性スコア２以上対２未満）患者の血清中で顕著に上昇していた（表１及び図１２Ａ及び図１２Ｂ）。両タンパク質の血清中濃度は、ＡＬＴと正の相関にあった（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。ネクロトーシスのメディエーターがネクロトーシス中に細胞外環境に放出され得ることを確認するため、ＴＮＦαと接触させたＬ９２９細胞が、それらの上清にＲＩＰＫ１を放出するかどうか試験した。ＴＮＦαと接触させたＬ９２９細胞の上清にＲＩＰＫ１が放出され、この放出はＺｖａｄの存在下で顕著になるが、細胞をＲＩＰＡ－５６又はＮｅｃ－１処理することによりネクロトーシスを抑止した場合は、検出不能なままであることがわかった（図１２Ｅ）。合わせると、これらの結果は、ネクロトーシスがＮＡＦＬＤの病理発生に寄与していること、並びにＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬの体循環中への放出が、ヒトＮＡＦＬＤにおける壊死性炎症性活性を反映していることを示唆する。
ネクロトーシスに介在するタンパク質の血清中濃度は、敗血症により引き起こされた組織損傷のある患者において上昇することが、以前に見つかっており、このことから、ＮＡＦＬＤの患者でも、この上昇が壊死性炎症性活性の結果として生じる可能性が出てくる。ＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬタンパク質の血清中濃度を、ＮＡＦＬＤ患者３５人で測定したところ、これらの濃度は、活動性疾患である（組織学的活性スコア２以上対２未満）患者の血清中で顕著に上昇していた（表１及び図１２Ａ及び図１２Ｂ）。両タンパク質の血清中濃度は、ＡＬＴと正の相関にあった（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。ネクロトーシスのメディエーターがネクロトーシス中に細胞外環境に放出され得ることを確認するため、ＴＮＦαと接触させたＬ９２９細胞が、それらの上清にＲＩＰＫ１を放出するかどうか試験した。ＴＮＦαと接触させたＬ９２９細胞の上清にＲＩＰＫ１が放出され、この放出はＺｖａｄの存在下で顕著になるが、細胞をＲＩＰＡ－５６又はＮｅｃ－１処理することによりネクロトーシスを抑止した場合は、検出不能なままであることがわかった（図１２Ｅ）。合わせると、これらの結果は、ネクロトーシスがＮＡＦＬＤの病理発生に寄与していること、並びにＲＩＰＫ１及びＭＬＫＬの体循環中への放出が、ヒトＮＡＦＬＤにおける壊死性炎症性活性を反映していることを示唆する。
【0091】
【表1】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】