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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-28
(54)【発明の名称】濃縮多価不飽和脂肪酸組成物
(51)【国際特許分類】
C11C 3/00 20060101AFI20221221BHJP
A61K 31/202 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/201 20060101ALI20221221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20221221BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20221221BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20221221BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20221221BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20221221BHJP
A23L 33/115 20160101ALI20221221BHJP
A23K 20/158 20160101ALI20221221BHJP
【ＦＩ】
C11C3/00
A61K31/202
A61K31/201
A61P43/00 111
A61K9/20
A61K9/48
A61K9/08
A61K9/14
A61K9/06
A61P9/00
A61P3/06
A61P9/12
A23L33/115
A23K20/158
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523882
(86)(22)【出願日】2020-10-23
(85)【翻訳文提出日】2022-06-01
(86)【国際出願番号】 GB2020052687
(87)【国際公開番号】W WO2021079142
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】62/926,239
(32)【優先日】2019-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521535227
【氏名又は名称】ヌシード ニュートリショナル ユーエス インク．
【氏名又は名称原語表記】ＮＵＳＥＥＤ ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＵＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リトラー，スチュアート
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4C076
4C206
4H059
【Ｆターム（参考）】
2B150CJ08
4B018MD10
4B018MD15
4B018ME07
4B018ME14
4B018MF01
4C076AA06
4C076AA11
4C076AA29
4C076AA36
4C076AA53
4C076BB01
4C076BB31
4C076CC11
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4C076CC29
4C076FF70
4C206AA01
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4C206DA04
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4C206MA01
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA36
4C206MA48
4C206MA55
4C206MA57
4C206MA63
4C206MA72
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZA36
4C206ZA42
4C206ZC33
4C206ZC41
4H059BA26
4H059BB03
4H059BB05
4H059BB07
4H059BC14
(57)【要約】
本実施形態は、高濃度の長鎖オメガ－３脂肪酸を、典型的には脂肪酸エステルとして、ＤＰＡ、ＤＴＡ、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡを、任意選択でＯＡまたはＡＬＡとともに含む植物ベースの脂質組成物を提供する。これらの濃縮脂質組成物は安定性が向上しており、これらの長鎖オメガ－３脂肪酸の持続可能な供給源を提供する。いくつかの実施形態において、これらの濃縮脂質組成物は、炎症性サイトカインの抑制などの炎症性マーカーの増強された調節を示し、栄養的または治療的価値を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載されるように、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡのうちの少なくとも１つについて濃縮された脂質組成物。
【請求項2】
ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡの少なくとも１つが濃縮された脂質組成物であって、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡの少なくとも１つが植物源から濃縮される、脂質組成物。
【請求項3】
前記ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡがエチルエステルまたはトリグリセリドである、請求項２に記載の脂質組成物。
【請求項4】
前記組成物が、海洋源に由来する同様の組成物と比較して改善された安定性を示す、請求項２または請求項３に記載の脂質組成物。
【請求項5】
濃縮種子油由来のＤＰＡｎ－３を含む脂質組成物であって、前記組成物が、２０％～５０％のＤＰＡｎ－３、１０％～３０％のＯＡ、および２％～２０％のＥＴＡを含む、脂質組成物。
【請求項6】
約３６％のＤＰＡｎ－３、約２２％のＯＡ、および約６％のＥＴＡを含む、請求項５に記載の脂質組成物。
【請求項7】
濃縮種子油由来のＤＰＡｎ－３を含む脂質組成物であって、前記組成物が、約１０．５％のＤＰＡｎ－３、約４４％のＯＡ、および約４％のＥＴＡを含む、脂質組成物。
【請求項8】
濃縮種子油由来のＤＰＡｎ－３を含む脂質組成物であって、前記組成物が、６０％～７０％のＤＰＡｎ－３および０％～２０％のＥＴＡを含む、脂質組成物。
【請求項9】
９０％～９９％のＤＰＡｎ－３を含む種子油由来の濃縮脂質組成物。
【請求項10】
濃縮種子油由来のＤＴＡｎ－３を含む脂質組成物であって、前記組成物が、４０％～９５％のＤＴＡｎ－３および５％～６０％のＥＴＡを含む、脂質組成物。
【請求項11】
９０％～９９％のＤＴＡｎ－３を含む種子油由来の濃縮脂質組成物。
【請求項12】
９０％～９９％のＥＴＡを含む種子油由来の濃縮脂質組成物。
【請求項13】
濃縮種子油由来のＤＰＡｎ－３を含む脂質組成物であって、前記組成物が、１０％～４０％のＤＰＡｎ－３および２０％～６０％のＥＴｒＡ、ならびに０％～３０％のＯＡを含む、脂質組成物。
【請求項14】
約３７％のＥＴｒＡおよび約１６％のＤＰＡｎ－３を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記植物または種子がアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項16】
前記アブラナ科がＢ．ｊｕｎｃｅａまたはＢ．ｎａｐｕｓである、請求項１５に記載の脂質組成物。
【請求項17】
前記Ｂ．ｊｕｎｃｅａがＮＵＢＪ１２０７、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５９５４である、請求項１６に記載の脂質組成物。
【請求項18】
ＤＰＡｎ－３およびＥＴＡを含む、炎症性サイトカイン産生を抑制する脂質組成物。
【請求項19】
ＤＰＡｎ－３およびＥＴＡが植物油から濃縮されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
約２８％のＤＰＡｎ－３、約５％のＤＴＡｎ－３、約５％のＥＴＡ、約１４％のＡＬＡ、約６％のＬＡ、および約２９％のＯＡを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
炎症性サイトカイン産生を抑制する脂質組成物であって、約７４％のＤＴＡｎ－３、約１４％のＯＡ、および約４％のＥＴＡを含む、脂質組成物。
【請求項22】
炎症性サイトカイン産生を抑制する脂質組成物であって、約９６％のＤＰＡｎ－３および約１％のＯＡを含む、脂質組成物。
【請求項23】
炎症性サイトカインの産生を抑制する脂質組成物であって、ＮＵＢＪ１２０７、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５９５４であるＢ．ｊｕｎｃｅａの種子油から濃縮された約９６％のＤＰＡｎ－３を含む、脂質組成物。
【請求項24】
前記組成物が、錠剤、カプセル、カプセル化ゲル、摂取可能な液体もしくは粉末、または局所軟膏もしくはクリームの形態で提供される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の脂質組成物。
【請求項25】
心血管疾患の治療もしくは予防、心血管疾患患者の死亡に対する防御、全体的な血清コレステロールレベルの低下、高血圧の低下、ＨＤＬ：ＬＤＬ比の増加、トリグリセリドの低下、またはアポリポタンパク質Ｂレベルの低下に使用するための、請求項１～２４のいずれかに定義される脂質組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
【0002】
この出願は、２０１９年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９２６，２３９号の優先権を主張する。
【0003】
本実施形態は、１つまたは複数の多価不飽和脂肪酸、例えば、オメガ－３ＤＰＡ、ＤＴＡ、ＥＴＡ、またはそれらの組み合わせを濃縮した脂質組成物に関する。これらの多価不飽和脂肪酸組成物には、多くの健康上の利点があり、安定性が向上している。これらの多価不飽和脂肪酸組成物は、スケーラブルであり、かつ持続可能な単一の供給源から入手することができる。いくつかの実施形態において、オメガ－３ＤＰＡ、ＤＴＡ、またはＥＴＡは、これらの脂肪酸の有益な活性を相乗作用させるオレイン酸と組み合わされる。
【背景技術】
【0004】
長鎖オメガ３多価不飽和脂肪酸（ＬＣ－オメガ３）は、ヒトと動物の健康にとって重要な化合物として広く認識されている。これらの脂肪酸は、食事供給源から、または程度はより低いが、リノール酸（ＬＡ、１８：２ ω－６）またはα－リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ ω－３）の脂肪酸の変換によって得ることができ、これらは全てヒトの食事において必須な脂肪酸と見なされている。栄養学的観点から、最も重要なオメガ－３脂肪酸は、おそらくα－リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ ω－３または２０：５ｎ－３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ ω－６または２２：６ｎ－３）である。例えば、ＤＨＡは脳と目の発達に重要であり、ＥＰＡは心血管の健康に関連している。
【0005】
ドコサペンタエン酸ｎ－３（ＤＰＡｎ－３、２２：５ ω－３）は、炎症の軽減や心臓血管の健康のサポートなど、既知の健康上の利点を備えたＬＣ－オメガ－３である。ＤＰＡｎ－３は、脂肪、心臓、筋肉組織の成分でもある。さらに、ＤＰＡｎ－３はＤＨＡに変換するための基質である。したがって、ＤＰＡｎ－３の持続可能な供給源が必要される。
【0006】
ドコサテトラエン酸（ドコサテトラエン酸、ＤＴＡｎ－３、２２：４ ω－３）は、利点が比較的文書化されていない、あまり知られていないＬＣ－オメガ－３である。したがって、少なくともこの脂肪酸のさらなる特性評価を提供するために、ＤＴＡｎ－３の持続可能な供給源の必要性が残っている。
【0007】
エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ ω－３）もまた抗炎症作用を有すると思われるＬＣ－オメガ－３である。さらに、ＥＴＡはＥＰＡの生合成の中間体である。ＤＰＡやＤＴＡと同様に、持続可能なＥＴＡの供給源が依然として必要とされる。
【0008】
エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）（Ｃ２０：３ ω－３）もまた、ＥＴＡへの変換の基質として、ＥＰＡの生合成の中間体としても機能する可能性がある。ＥＴｒＡは認知の健康にも関係している可能性がある。したがって、ＥＴｒＡの持続可能な供給源が必要とされる。
【0009】
一般に、脂肪酸の酸化安定性は、炭素－炭素二重結合の数（すなわち不飽和度）が増加するにつれて著しく低下する。結果として、オメガ３含有量が増加した製品は、貯蔵寿命が短くなる傾向がある。ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、およびＥＴＡはすべて酸化しやすい傾向のある多価不飽和脂肪である。したがって、処理中または処理後に安定しているＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡが必要とされる。
【発明の概要】
【0010】
本実施形態は、ＤＰＡｎ－３（２２：５ｎ－３）、ＤＴＡｎ－３（２２：４ｎ－３）、ＥＴＡ（２０：４ｎ－３）、またはＥＴｒＡ（２０：３ｎ－３）含有量などのＬＣ－オメガ－３含有量が豊富な脂質組成物、およびこれらの組成物を取得する方法を提供する。少なくとも１つの実施形態において、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡ脂肪酸は、植物科アブラナ科からの植物種子油などの植物から供給される。特定の実施形態では、アブラナ科はＢｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａである。いくつかの実施形態において、組成物は、植物源から得られた少なくとも１つの濃縮されたＬＣ－オメガ－３（例えば、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡ）、および別のソースから得られた少なくとも１つの他のＬＣ－オメガ－３を含む。本実施形態のＬＣ－オメガ－３は、遊離脂肪酸、塩、エステル、エステルの塩、またはこれらの組み合わせの形態であり得る。少なくとも１つの実施形態において、ＬＣ－オメガ－３は、エチルエステルの形態である。少なくとも１つの実施形態において、ＬＣ－ｍｏｅｇａ－３は、トリグリセリドの形態である。
【0011】
一態様では、本実施形態は、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＥＴｒＡ、またはそれらの組み合わせを濃縮させた組成物を提供する。例えば、少なくとも１つの実施形態は、約９０％～９９％のＤＰＡｎ－３（包括的）、例えば、約９５％のＤＰＡｎ－３、約９７％のＤＰＡｎ－３、約９８％のＤＰＡｎ－３、または約９９％のＤＰＡｎ－３を含む組成物を提供する。これらのような組成物、すなわち非常に大量のＤＰＡｎ－３を含む組成物はまた、少量（例えば、少なくとも約０．１％および最大５％、最大２％または最大１％のオレイン酸（ＯＡ１８：１ｎ－９））を含み得る。例えば、これらの組成物は、約９６％のＤＰＡｎ－３および約１％のＯＡを含み得る。別の実施形態は、約８０％～９９％のＤＴＡｎ－３（包括的）（任意選択で最大約１５％のＯＡと共に）または約９０％～９９％のＤＴＡｎ－３（包括的）を含む組成物を提供する。例えば、組成物は、約８０％のＤＴＡｎ－３、約８７％のＤＴＡｎ－３、約９０％のＤＴＡｎ－３、または約９５％のＤＴＡｎ－３を含み得る。別の実施形態は、約９０％～９９％のＥＴＡ（包括的）、例えば、約９３％のＥＴＡ、約９５％のＥＴＡ、約９８％のＥＴＡ、または約９９％のＥＴＡを含む組成物を提供する。別の実施形態は、約６０％～７０％のＤＰＡｎ－３（包括的）および約０％～２０％のＥＴＡ（包括的）（例えば、約５％～１５％のＥＴＡ（包括的））（特に約６４％のＤＰＡｎ－３および約１２％のＥＴＡ）を含む組成物を提供する。さらに別の実施形態は、約４０％～９５％のＤＴＡｎ－３（包括的）および５％～６０％のＥＴＡ（包括的）を含む組成物を提供する。
【0012】
別の態様では、本実施形態は、ＤＰＡｎ－３、ＥＴＡ、またはＤＴＡｎ－３、およびオレイン酸（ＯＡ、１８：１ｎ－９）を含む組成物を提供する。少なくとも１つの実施形態では、例えば、組成物は、約３０～６０％のＤＴＡｎ－３（包括的）および約３０～６０％のＯＡ（包括的）（特に、約４９％のＤＴＡｎ－３および約４３．３％のＯＡ）を含む。別の実施形態では、組成物は、約６０～８０％のＤＴＡｎ－３（包括的）、約１０～２０％のＯＡ（包括的）、および約１～１０％のＥＴＡ（包括的）（特に、約７４％のＤＴＡｎ－３、約１４％のＯＡおよび約４％のＥＴＡ）を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、約８０～９５％のＤＴＡｎ－３（包括的）および約１～１５％のＯＡ（包括的）（特に、約８７％のＤＴＡｎ－３および約６．３％のＯＡ）を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、約４０％～６０％のＤＰＡｎ－３（包括的）、２０％～４０％のＯＡ（包括的）、および２％～２０％のＥＴＡ（包括的）を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、２０％～５０％のＤＰＡｎ－３（包括的）、１０％～３０％のＯＡ（包括的）、および２％～２０％のＥＴＡ（包括的）を含む。例えば、組成物は、３０％～５０％のＤＰＡｎ－３（包括的）、１０％～３０％のＯＡ（包括的）、および２％～２０％のＥＴＡ（包括的）を含み得る（特に、組成物は、３６％のＤＰＡｎ－３、２２％のＯＡ、および６％のＥＴＡを含み得る）。別の実施形態では、組成物は、約３５．８％のＤＰＡｎ－３、約２２．０％のＯＡ、および約６．１％のＥＴＡを含む。代替例では、組成物は、約５～２０％のＤＰＡ（包括的）、約３０～６０％のＯＡ（包括的）、および約１～１０％のＥＴＡ（包括的）を含み得る（特に、組成物は、約１０．５％のＤＰＡ、約４４％のＯＡ、および約４％ＥＴＡを含み得る）。別の代替例では、組成物は、約２０～４０％のＤＰＡｎ－３（包括的）、約１～１０％のＤＴＡｎ－３（包括的）、約１～１０％のＥＴＡ（包括的）、約１０～２０％のＡＬＡ（包括的）、約１～１０％のＬＡ（包括的）、および約２０～４０％のＯＡ（包括的）を含み得る（特に、組成物は、約２８％のＤＰＡｎ－３、約５％のＤＴＡｎ－３、約５％のＥＴＡ、約１４％のＡＬＡ、約６％のＬＡ、および約２９％のＯＡを含み得る）。さらに別の代替例では、組成物は、約１０％～４０％のＤＰＡｎ－３（包括的）、約２０％～６０％のＥＴｒＡ（包括的）、および約０％～３０％のＯＡ（包括的）を含み得る（特に、組成物は、約３７％のＥＴｒＡおよび約１６％のＤＰＡｎ－３を含み得るか、または約５４％のＥＴｒＡおよび約３５％のＤＰＡｎ－３を含み得る）。これらの実施形態の関連する態様において、組成物（ＯＡおよび少なくとも１つのＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡを含む）には、相乗的な抗炎症作用がある。
【0013】
別の態様では、本実施形態は、ＤＰＡｎ－３、ＥＴＡ、ＥＴｒＡ、またはＤＴＡｎ－３の濃縮画分を、任意選択にＯＡと共に含む組成物を提供し、この組成物は抗炎症性である。少なくとも１つの実施形態では、組成物はサイトカイン活性を変化させる。少なくとも１つの実施形態において、組成物は、炎症の減少に関連するサイトカイン活性を増加させる。少なくとも１つの実施形態において、組成物は、炎症の増加に関連するサイトカイン活性を抑制する。例えば、相乗的な抗炎症活性を有する組成物は、約６４％のＤＰＡｎ－３および約１２％のＥＴＡなどのＤＰＡｎ－３およびＥＴＡを含み得る。別の例では、相乗的な抗炎症活性を有する組成物は、例えば、約３％～９５％のＤＴＡｎ－３（包括的）およびＯＡ、約４９％のＤＴＡｎ－３および約４３．３％のＯＡ、または約８７％ＤＴＡｎ－３および６．３％ＯＡなどのＤＴＡｎ－３およびＯＡを含み得る。追加の実施形態では、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡについて濃縮された組成物は、ＡＬＡについても濃縮されている。例えば、ＤＰＡｎ－３が濃縮された組成物（例えば、少なくとも約２８％のＤＰＡｎ－３を含む）は、また少なくとも約１４％のＡＬＡも含み得る。
【0014】
さらなる態様では、本実施形態は、植物（すなわち、植物性物質）源からのＤＰＡｎ－３、ＤＴＡ、ＥＴＡまたはＥＴｒＡが濃縮された組成物を提供し、この組成物は、ＤＰＡ、ＤＴＡ、ＥＴＡまたはＥＴｒＡが魚油または合成製品から供給される同様の組成物よりも安定であり、貯蔵中の劣化が少ないことによって証明されている。
【0015】
本実施形態の組成物は、飼料、栄養補助食品、化粧品、および他の化学組成物に使用することができ、それらは、中間体または医薬品有効成分（ＡＰＩ）として有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】濃縮参照ブレンドと比較した、二重蒸留によってＤＰＡｎ－３を濃縮した植物由来の組成物のより良い安定性を示すグラフである。Ｙ軸：ｐｐｍプロパナール；ｘ軸：日（０、３、５）；○：Ｂ．ｊｕｎｃｅａから得たトランスエステル化され、二重蒸留された保持液；□：トランスエステル化、二重蒸留参照ブレンド。
【図2】同様に濃縮した参照ブレンドと比較した、二重蒸留およびクロマトグラフィーを介してＤＰＡｎ－３を濃縮した植物由来組成物（約９８％のＤＰＡｎ－３）のより良い安定性を示すグラフである。Ｙ軸：ｐｐｍプロパナール；ｘ軸：日（０、３、５）；○：Ｂ．ｊｕｎｃｅａから得たトランスエステル化、二重蒸留、クロマトグラフィー画分（約９８％ＤＰＡｎ－３）；□：トランスエステル化、二重蒸留、クロマトグラフィー参照ブレンド（約９０％ＥＰＡ）。
【図3】濃縮参照ブレンドと比較した、二重蒸留およびクロマトグラフィー（約６４％ＤＰＡｎ－３）を介してＤＰＡｎ－３を濃縮した植物由来の組成物のより良い安定性を示すグラフである。Ｙ軸：ｐｐｍプロパナール；ｘ軸：日（０、３、５）；○：Ｂ．ｊｕｎｃｅａから得られたトランスエステル化、二重蒸留、クロマトグラフィー画分（約６４％ＤＰＡｎ－３）；□：トランスエステル化、二重蒸留、クロマトグラフィー参照ブレンド（約５８％ＥＰＡ）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって、変化する可能性があることを理解されたい。別途示されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【0018】
提示されるされるすべての特許および他の刊行物は、例えば、本実施形態に関連して使用され得るが、それらと矛盾する用語の定義を提供するものではない、そのような刊行物に記載された方法論を説明および開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示に対してのみ提供されている。この点に関して、発明者が先行発明またはその他の任意の理由によりそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する全ての記述または内容に関する表明は、申請者が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についての承認を構成するものではない。
【0019】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形の言及を含む。本明細書全体を通して、特に明記しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に使用されるため、記載された整数または整数のグループは、１つまたは複数の他の記載されていない整数または整数のグループを含み得る。「または」という用語は、例えば、「どちらか」によって変更されない限り、包括的である。したがって、文脈で別段の指示がない限り、「または」という単語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
【0020】
全ての値は環境条件により脂肪酸組成に多少の変動があるため、いずれも概算値である。値は通常、総脂肪酸の重量パーセント、または総種子の重量パーセントとして表される。したがって、操作例を除いて、または他に示された場合、本明細書で使用される量または反応条件を表すすべての数字は、反対に述べられない限り、すべての場合において「約」という用語によって修正されると理解されるべきである。「約」は、一般に、指定された値の±１％を指すが、当技術分野の技術者の１人によって関連する文脈で受け入れられるように、指定された値の±５％または±１０％を許容し得る。
【0021】
本発明の組成物中の脂肪酸レベルは、当業者に知られている常法を使用して決定することができる。そのような方法は、例えば、実施例に開示される方法に従って、参照標準と組み合わせたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を含む。特定の方法では、ＧＣ分析の前に脂肪酸がメチルエステルまたはエチルエステルに変換される。クロマトグラムのピーク位置を使用して各特定の脂肪酸を同定し、各ピーク下の面積を積分して量を決定することができる。本明細書で使用される場合、反対に述べられない限り、試料中の特定の脂肪酸のパーセンテージは、その脂肪酸のクロマトグラムの曲線下面積を、クロマトグラムの脂肪酸の総面積のパーセンテージとして計算することによって決定される。一般に、これは重量パーセント（ｗ／ｗまたはｗｔ％）に相当する。脂肪酸の同一性はガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）により確認できる。
【0022】
ＬＣ－オメガ３は、神経機能、糖尿病、心臓血管の健康、脂質調節などの健康上の利点があり、抗炎症剤としても知られている。ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ－３、またはＤＰＡｎ－３）は、ＥＰＡとＤＨＡの中間体として評価されているが、それ自体で多くの利点をもたらし、実際、ＤＨＡから逆変換される。ＤＰＡは母乳に高濃度で含まれている。ヒト細胞を含む哺乳動物細胞は、ＤＰＡｎ－３を、組織損傷後に発生する炎症後の正常な細胞機能の回復を促進するＰＵＦＡ代謝物の特殊な分解促進メディエータークラスのメンバーである一連の製品に代謝する。結腸直腸癌に対するｎ－３脂肪酸の抗腫瘍形成効果を調べた研究では、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの抗増殖効果とアポトーシス促進効果が見られ、ＤＰＡはインビロトモデルとインビボモデルの両方で最も強い効果を示している。ＤＰＡは、心臓病のリスク低下にも関連している。Ｙａｚｄｉ，Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ＆ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｎ－３，２ Ｆ１０００ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５６（２０１４）を参照されたい。したがって、ＤＰＡは栄養および治療サプリメントとしてますます重要になっている。本明細書におけるＤＰＡまたはＤＰＡ３の引用は、特に明記されていない限り、ＤＰＡｎ－３を指す。
【0023】
ＤＨＡとＥＰＡに関する益々豊富な情報と比較して、ドコサテトラエン酸（２２：４ｎ－３、ＤＴＡｎ－３）は比較的あまり知られていないＬＣ－オメガ－３である。ＤＴＡｎ－３は、ＥＴＡの伸長である。例えば、Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ｅｌｏｎｇａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｕｅｆｉｎ ｔｕｎａ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｍａｃｃｏｙｉｉ），１５５ Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８（２０１０）を参照されたい。おそらく、そのアシル鎖の三次構造がＤＰＡおよびＤＨＡｎ－３と類似しているため、ＤＴＡｎ－３は脳内のＡβ代謝の有益な媒介に関連している。Ａｍｔｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｍｅｇａ－３＆ｏｍｅｇａ－６ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａβ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅｓ，２８６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６１００（２０１１）。したがって、ＤＴＡｎ－３は栄養剤または治療剤としての可能性を秘めている可能性がある。本明細書におけるＤＴＡまたはＤＴＡ３の引用は、特に明記されていない限り、ＤＴＡｎ－３を指す。
【0024】
エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４ｎ－３）は、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの生合成におけるオメガ３中間体として知られている。例えば、米国特許第７，８０７，８４９号を参照されたい。ＥＴＡの潜在的な抗炎症作用は、関節炎との関連で確認されている。Ｂｉｅｒｅｒ＆Ｂｕｉ，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｉｇｎｓ ｉｎ ｄｏｇｓ ｆｅｄｇｒｅｅｎ－ｌｉｐｐｅｄｍｕｓｓｅｌ（Ｐｅｒｎａ ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ），１３２Ｊ．Ｎｕｔｒ． １６２３Ｓ（２００２）。ＥＴＡは、他のＬＣ－オメガ－３と同様に、栄養剤または治療剤としての可能性を秘めている可能性がある。
【0025】
エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）（Ｃ２０：３ｎ－３）は、ＡＬＡの伸長またはエイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２ｎ－６）のオメガ３不飽和化によって生成され、ＥＴＡを形成するようにさらに不飽和化し得る。例えば、米国特許第７，８０７，８４９号を参照されたい。ＥＴｒＡは、オメガ３経路の重要な中間体であるだけでなく、少なくともミツバチの認知機能に重要なＬＣ－オメガ３の１つとして同定されている。Ａｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｍｅｇａ－３ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｍｐａｉｒｓ ｈｏｎｅｙｂｅｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ，１１２ ＰＮＡＳ １５７６１（２０１５）。
【0026】
ＬＣ－オメガ－３を含む脂質組成物は、通常、海洋源（魚、甲殻類など）または藻類源から得られている。最近、植物は、商業的に適切な量のＬＣ－オメガ－３、特にＤＨＡを生産するように遺伝子操作されている。例えば、ＷＯ ２０１７／２１９００６；ＷＯ ２０１７／２１８９６９を参照されたい。これらのソースを使用する場合、出発有機物は、そこに含有される油（一般に「原」油と呼ばれる）を抽出するために最初に加工される。例えば、ＤＨＡカノーラまたはＤＰＡ ｊｕｎｃｅａ種などの植物種子の場合、種子は粉砕され、油を放出し、油は次に濾過および／またはデカンテーションによって固形物から分離される。原油に含まれる濃度よりも高い濃度のＬＣ－オメガ３が必要な場合は、濃縮が必要である。そして、濃縮は、所望の脂肪酸成分のレベルを最大化しながら、不要な成分（例えば、製品の色、臭いもしくは安定性に悪影響を及ぼす成分、または不要な脂肪酸）を除去するために、原油を加工することによって達成され得る。さらに、原油に１つ以上の必須成分が不足している場合は、目的の組成を得るために、原油または他の供給源（魚や藻類など）の濃縮油とブレンドすることがよくある。
【0027】
本実施形態の組成物は、単一の供給源から得ることができる。この点に関して言及され得る特定の組成物は、実施例の表４および５に記載されている製品、ならびに本明細書の他の場所で論じられている本発明の対応する実施形態である。さらに、単一の供給源から得られる本実施形態の組成物は、単一の供給源から得られた脂質混合物を提供し、その混合物を複数の部分に分離し（例えば、クロマトグラフィー分離を介して）、次いでそれらの部分のサブセットを組み合わせること（混合）によって得ることができる。例えば、クロマトグラフィー分離法（または他の分離方法）で得られた２つ以上の画分を組み合わせることから生じる組成物が企図され、それらの組成物はまた、単一の供給源から得られるものとして特徴付けられ得る。例えば、主にＤＰＡおよびＥＴＡを含む組成物（例えば、ＤＰＡおよびＥＴＡが一緒になって、組成物中に存在する総脂肪酸の約８０重量％を構成する）は、単一の供給源から得ることができる。主にＤＰＡとＥＴＡを含む組み合わせは、表５の画分ＣＸＺとＣＲを適切な比率でブレンドすることによって得ることができる。インビトロで良好な活性を有することが示される他の組み合わせは、同様に、所望の成分に富む画分（例えば、前記成分の１つを少なくとも８０％含む）をブレンドすることによって得ることができる。単一の供給源の使用は、原油の効率的かつ経済的な加工および本発明の脂質組成物の製造を容易にする。「単一の供給源から入手可能である」という句は、脂質組成が単一の分類学的クラスの１つまたは複数の生物から入手可能であることを意味する。特定の実施形態では、脂質組成物は、異なる分類学的クラスにわたる複数の生物に由来するものではなく、例えば、魚と藻類の組み合わせ、または魚と植物の組み合わせから得られる油の混合物ではない。本実施形態では、脂質組成物（またはエステル交換、蒸留、およびクロマトグラフィーなどの濃縮技術によって組成物を得ることができる「粗」油）は、単一の生物集団、例えば、単一の植物源または草木源から入手可能である。本実施形態の文脈において、「野菜」は、動物または鉱物物質とは異なり、植物または植物の生命に関係する。しかしながら、他の実施形態では、組成物は、１つの植物源（例えば、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ）および別の源（例えば、魚、藻類、または合成源）から得られる。
【0028】
少なくとも１つの実施形態において、脂質組成物は、組成物中の他の脂質の量と比較して、高レベルのＤＰＡｎ－３を有する。少なくとも１つの実施形態において、脂質組成物は、組成物中の他の脂質の量と比較して、高レベルのＤＴＡｎ－３を有する。少なくとも１つの実施形態では、脂質組成物は、組成物中の他の脂質の量と比較して高レベルのＥＴＡを有する。ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡのそれぞれは、遊離脂肪酸、塩、エステル、またはエステルの塩、あるいはこれらの組み合わせの形態で独立して提供することができ、例えば、組成物はＤＰＡｎ－３を遊離脂肪酸の形態のＥＴＡと一緒にエステルの形態で含むことができる。少なくとも１つの実施形態において、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡは、エチルエステルなどの脂肪酸エステルである。これらの実施形態は、遊離脂肪酸、塩、エステル、またはエステルの塩、あるいはこれらの組み合わせの形態で、他のオメガ－３、飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸などの追加的脂質成分を含み得る。
【0029】
好適な脂肪酸エステルの形態は当業者に知られている。例えば、栄養学的に許容されるまたは薬学的に許容される脂肪酸エステルの形態には、脂肪酸のエチルエステル、メチルエステル、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド（トリアシルグリセリド）が含まれる。脂質組成物の意図する用途に応じて、異なるエステル形態が必要となる場合がある。例えば、トリグリセリドは、グリセロールおよび３つの脂肪酸に由来するエステルである。トリグリセリドは、人間の消費、特に乳児の消費を目的とした食品での使用に特に適しており、幾分かは味および熱処理（そのような食品に必要な場合がある）に対するこれらのエステル形態の安定性によるものである。したがって、一実施形態において、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡ多価不飽和脂肪酸がトリグリセリドエステルの形態で提供される、本発明の脂質組成物を含む、人間または動物が消費するための食品が提供される。エチルエステルは、これらのエステル形態が効率的かつ容易に製造できるため、栄養補助食品での使用に特に適している。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡは、脂肪酸エチルエステルの形態で独立して提供される。
【0030】
あるいは、脂肪酸成分は、「遊離」脂肪酸の形態、すなわち、脂肪酸の－ＣＯＯＨ形態で存在し得る。本発明の特定の組成物では、組成物は、不快な（しばしば「石鹸のような」）味を伴い、エステル化形態の脂肪酸よりも安定性が低いため、この形態の脂肪酸を比較的低レベルで含有する。遊離脂肪酸は、通常、当技術分野でよく知られているように、アルカリまたは物理的精製によって脂質組成物から除去される。よって、一実施形態において、脂質組成物中の総遊離脂肪酸含有量は、組成物の総脂肪酸含有量の５重量％未満（例えば、３重量％未満、特に、２重量％未満）である。
【0031】
本発明の脂質組成物はまた、原料に由来し、抽出および濃縮プロセス中に完全に除去されない他の成分（例えば、脂肪酸以外）も含有し得る。これらの他の成分の正確な特性は原料によって大きく変化し得るが、そのような他の成分の例には、遊離ステロールとして、またはステロールエステル（β－シトステロール、β－シトスタノール、Δ５－アベナステロール、カンペステロール、Δ５－スチグマステロール、Δ７－スチグマステロールおよびΔ７－アベナステロール、コレステロール、ブラシカステロール、カリナステロール、カンペステロール、カンペスタノールまたはエブリコールなど）としてのいずれかで存在する植物ステロール（すなわち、植物ステロールおよび植物スタノール）が含まれる。他の成分の例には、トコフェロールおよびトコトリエノールなどの抗酸化剤が含まれる。したがって、本実施形態の特定の脂質組成物は、検出可能な量の１つまたは複数のフィトステロール（例えば、β－シトステロール）を含有するものを含み得る。そのようなステロールは、脂質組成物の少なくとも約０．０１重量％以上であるが、典型的には約１重量％以下で存在し得る。
【0032】
本実施形態の組成物は、植物源（「野菜」源）から有利に入手可能である。「野菜ベース」とは、脂質組成物中に存在する脂質の少なくとも７０重量％が野菜源から得られることを指す。野菜源には、植物源、特に、油料種子などの作物が含まれる。少なくとも１つの実施形態において、脂質は、アブラナ属、例えばＢ．ｊｕｎｃｅａまたはＢ．ｎａｐｕｓなどの種子油作物から得られる。しかしながら、誤解を避けるため、組成物がそのような供給源からのみ得られることは必須ではなく、本実施形態の組成物中の脂質の割合（例えば、最大で約３０重量％）が、海洋油（例えば、魚または甲殻類）、藻類油、またはそれらの組み合わせを含む他の供給源から得られてもよい。一例では、存在する脂質の少なくとも８０重量％、例えば少なくとも９０重量％が植物源から得られる。特定の実施形態において、本質的に全て（すなわち、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％）の脂質が植物源から得られる。
【0033】
脂質または脂肪酸源として植物を使用することには、多くの利点がある。例えば、海洋の油源には、植物材料には見られない比較的高レベルの汚染物質（水銀、ＰＣＢまたは魚のアレルゲン（例えば、パルブアルブミン）など）が含有されていることが知られている。さらに、歴史的な乱獲は、魚および甲殻類（オキアミなど）の資源も枯渇させ、もはや持続可能ではない。したがって、本発明は、比較的低レベルの望ましくない汚染物質を含有する、持続可能な供給源の多価不飽和脂肪酸油組成物を提供する。
【0034】
したがって、本脂質組成物（およびこれらの組成物を含む飼料および医薬組成物）は、動物（例えば、海洋動物）由来ではない。すなわち、そのような実施形態では、脂質組成物は、魚および甲殻類などの動物に由来するいかなる成分も含有しない。動物から成分が得られない脂質組成物は、脂質含有量、および標準的な精製または濃縮手順に従って達成できる安定性プロファイルの点で有利であると考えられている。
【0035】
実施形態の一態様では、脂質組成物は植物に由来する。油が得られる植物は、典型的にはマスタード、カノーラ、コプラ、綿実、亜麻、パーム核、ピーナッツ、菜種、大豆、およびヒマワリの種などの油糧種子作物である。植物からのみ得られる組成物は、「植物性」油または「植物性脂質組成物」と呼ばれることがある。（商業規模であるかどうかにかかわらず）実施形態の脂質組成物を得ることができる適切な植物は、当業者に知られており、アブラナ属（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ、Ｂ．ｎａｐｕｓ、またはＢ．ｃａｒｉｎａｔａなどの油糧種子）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（クレス）、Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｃａｍｅｌｉｎａｓａｔｉｖａ（偽亜麻）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｓｐ。（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（大豆）、Ｚｅａｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｓｏｒｇｈｕｍｓｐ．、Ａｖｅｎａｓａｔｉｖａ（オーツ麦）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｓｐ．（クローバー）、ニコチアナｓｐ．（例、ベンサミアナタバコまたはタバカム）タバコ）、Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｌｕｐｉｎｕｓａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｏｒｙｚａｓｐ．（Ｏ．ｓａｔｉｖａやＯ．ｇｌａｂｅｒｒｉｍａなどのイネ）、Ｅｌａｅｓｉｓｇｕｉｎｅｅｎｉｓ（パーム）、またはＣｒａｍｂｅａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（クランベ、アブラナ科の油糧種子）を含む。少なくとも１つの実施形態では、植物源はアブラナ属である。
【0036】
適切な供給源（植物源に加えて海洋および藻類の供給源を含む）は、天然に存在する場合もあれば、オメガ－３を生成する能力のために遺伝子改変されている場合もある。この目的のために遺伝子組み換えされた植物源の例は、当業者に知られている。例えば、ＷＯ２０１３／１８５１８４、ＷＯ２０１５／０８９５８７、ＷＯ２０１５／１９６２５０を参照されたい。例えば、種子油でＤＨＡを生成する遺伝子操作された菜種油ＮＳＢ５００２７４は、ＷＯ２０１７／２１８９６９およびＷＯ２０１７／２１９００６に記載されている。好適な供給源から油を得るためのプロセスは、当技術分野で周知である。これらの油からの記載されたオメガ３の濃縮が、本明細書で議論される。
【0037】
当技術分野で日常的に実施されている技術を使用して、植物および種子によって生成された油を抽出、加工、および分析することができる。簡潔にいうと、植物の種子は、典型的には調理され、圧搾され、油が抽出され、原油が生成される。その油は、次に、脱ガム、精製、漂白、または脱臭することができる。脱ガム、精製、漂白、および脱臭の組み合わせは、ＬＣ－オメガ－３－濃縮脂質混合物を調製するために特に効果的であることが見出されている。したがって、一実施形態では、脂質組成物は、脱ガム、精製、漂白、および／または脱臭された種子油から得られる。しかし、いつも油を加工する必要があるわけではなく、これらの方法を用いずに、適切な純化および濃縮を達成することができる。
【0038】
一般に、種子を粉砕するための技術は当技術分野で知られている。例えば、油糧種子は、それらに水を噴霧し、含水率を例えば８．５％に上げることによってテンパリングされ、０．２３ｍｍ～０．２７ｍｍのギャップ設定を有する滑らかなローラーを使用してフレーク化することができる。種子の種類に応じて、粉砕前に水を加えない場合がある。抽出は、押し出しプロセスを使用して達成することもできる。押し出しプロセスは、フレーキングの代わりに使用される場合と使用されない場合があり、スクリュープレスの前または後のいずれかでアドオンプロセスとして使用される場合がある。
【0039】
一実施形態では、種子油の大部分は、スクリュープレスを使用して粉砕することによって放出される。次に、スクリュープレスから排出された固形物を、加熱されたカラムを使用して、溶媒、例えばヘキサンで抽出し、その後、抽出した油から溶媒を除去する。あるいは、プレス操作によって生成された原油を、スロット付きワイヤー排液トップを備えた沈殿タンクに通過させ、プレス操作中にこの油で発現した固形物を除去することができる。この清澄油は、プレートおよびフレームフィルターを通過し、任意の残存する微細な固体粒子を取り除くことができる。必要に応じて、抽出プロセスで回収された油を清澄油と組み合わせて、混合原油を生成することができる。原油から溶剤が一度除去されると、圧搾部分と抽出部分とが組み合わされ、通常の石油加工手順に供される。
【0040】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載される脂質または油に関連して使用される場合の「純化された」とは、典型的には、抽出された脂質または油が脂質／油成分の純度を高めるために１つまたは複数の加工ステップに供されたことを意味する。例えば、純化ステップは、抽出された油の脱ガム、脱臭、脱色、または乾燥のうちの１つまたは複数を含み得る。しかしながら、「純化された」という用語は、総脂肪酸含有量のパーセンテージとしてＬＣ－オメガ－３含有量を増加させるために、エステル交換プロセス、または本発明の脂質または油の脂肪酸組成を変更する別のプロセスを含まない。言い換えると、純化された脂質または油を含む脂肪酸組成は、未純化の脂質または油の脂肪酸組成と本質的に同じである。
【0041】
植物油は、以下のプロセスの１つまたは複数を使用して、特に、脱ガム、アルカリ精製、漂白および脱臭の組み合わせを使用して、植物源から一度抽出されると、精製（純化）され得る。好適な方法は、当業者に知られている。例えば、ＷＯ２０１３／１８５１８４を参照されたい。
【0042】
簡潔にいうと、脱ガムとは油の精製の初期段階であり、その主な目的は油からほとんどのリン脂質を除去することである。典型的には、リン酸を含有する約２％の水を粗油に７０℃～８０℃で添加すると、微量の金属および色素を伴うほとんどのリン脂質の分離が生じる。除去される不溶性物質は、主にリン脂質の混合物である。脱ガムは、水和不可能なリン脂質を水和可能な形態に変換するために粗種子油に濃リン酸を添加し、存在する希少金属をキレート化することによって実施できる。典型的には、ガムは遠心分離によって種子油から分離される。
【0043】
アルカリ精製は、原油を処理するための精製プロセスの１つであり、中和とも呼ばれる場合がある。通常、脱ガムに続き、漂白に先行する。脱ガムに続いて、種子油は、全ての遊離脂肪酸およびリン酸を滴定するのに十分な量のアルカリ溶液を添加し、こうして形成された石鹸を除去することによって処理することができる。好適なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、および水酸化アンモニウムが含まれる。アルカリ精製は典型的に、室温で行われ、遊離脂肪酸画分を除去する。石鹸は、遠心分離または石鹸の溶媒への抽出によって除去され、中和された油は水で洗浄される。必要に応じて、油中の任意の過剰なアルカリを塩酸または硫酸などの好適な酸で中和することができる。
【0044】
漂白は、漂白土（０．２％～２．０％）の存在下かつ酸素の非存在下で、窒素もしくは蒸気と、または真空中で操作することにより、油を９０℃～１２０℃で１０～３０分間加熱する精製プロセスである。漂白は、不要な色素（カロテノイド、クロロフィルなど）を除去するように設計されており、このプロセスでは、酸化生成物、微量金属、硫黄化合物、および微量の石鹸も除去される。
【0045】
脱臭は、高温（例えば、約１８０℃）および低圧（０．１ｍｍＨｇ～１ｍｍＨｇ）で油脂を処理することである。これは典型的に、約０．１ｍｌ／分／１００ｍｌの種子油の速度で種子油に蒸気を導入することによって達成される。散布の約３０分後、種子油を真空下で冷却させる。この処理により、種子油の色が改善され、任意の残留する遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール、および酸化生成物を含む揮発性物質または臭気化合物の大部分が除去される。
【0046】
脱蝋は、周囲温度以下での結晶化によって油脂を固体（ステアリン）と液体（オレイン）の画分に分離するために、油の商業生成で時々使用されるプロセスである。これは典型的に、油の飽和脂肪酸含有量を減らすために使用される。
【0047】
本実施形態は、部分的に、エステル交換技術を使用して得られる脂質組成物に関する。本明細書に記載されるように、原油は通常、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態で目的の脂肪酸を含有する。エステル交換とは、ＴＡＧ内およびＴＡＧ間で脂肪酸を交換するために、または脂肪酸を別のアルコールに転移しエステル（エチルエステルやメチルエステルなど）を形成するために使用できるプロセスである。本明細書に記載の実施形態において、エステル交換は、酵素的または化学的手段を使用して達成される。
【0048】
酵素的エステル交換に関して、このアプローチでは、エステル交換は、１つまたは複数の酵素、特に、例えばグリセリドにおいてエステル結合を加水分解するのに有用であることが知られているリパーゼを使用して達成される。酵素は、トリアシルグリセリド（トリグリセリドまたはＴＡＧ）上の脂肪酸に対して位置特異的（ｓｎ－１／３またはｓｎ－２に特異的）であるか、または他のものよりもいくつかの脂肪酸を優先するリパーゼであり得る。言及され得る特定の酵素には、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ４３５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能）が含まれる。このプロセスは、典型的には、周囲温度で実施される。このプロセスは、典型的には、所望のエステル形態に対応する過剰量のアルコールの存在下で（例えば、脂肪酸のエチルエステルを形成するためにエタノールを使用することによって）実施される。
【0049】
化学的エステル交換は、触媒として強酸または強塩基を使用する。ナトリウムエトキシド（エタノール中）は、エステル交換によって脂肪酸エチルエステルを形成するために使用される強塩基の例である。このプロセスは、周囲温度または昇温（例えば、最大約８０℃）で実施することができる。
【0050】
少なくとも１つの実施形態において、本実施形態の濃縮脂質組成物は、蒸留を使用して得られる。分子蒸留は、短鎖飽和脂肪酸などの揮発性の高い成分を原油から大量に除去するための効果的な方法である。蒸留は、典型的には、減圧下、例えば約１ｍｂａｒ未満で実施される。次に、プロセスの温度および時間は、数時間（例えば、１時間～１０時間）の蒸留時間の後に、蒸留物と残留物との間で約５０：５０の分割を達成するように選択され得る。本発明の脂質組成物の生成に使用される典型的な蒸留温度は、１２０℃～１８０℃の範囲、例えば１４０℃～１６０℃、特に１４５℃～１６０℃である。
【0051】
複数の蒸留を実施することができ、各蒸留は、蒸留物と残留物との間で約５０：５０の分割が達成された場合に完了したと見なされる。連続蒸留を使用すると、全体の収率が低下するが、２回の蒸留（つまり、生成物は「二重蒸留」と呼ばれる）で最適な結果が得られる場合がある。
【0052】
蒸留に加えて、クロマトグラフィーは脂肪酸混合物のさまざまな成分を分離するための効果的な方法である。クロマトグラフィーは、混合物中の１つまたは複数の好ましいＬＣ－オメガ－３の濃度を増加させるために使用され得る。クロマトグラフィー分離は、様々な条件下で達成することができるが、典型的には、固定床クロマトグラフィーシステムまたはシミュレートされた移動床システムを使用することを含む。これらは以下に説明される。
【0053】
固定床クロマトグラフィーシステムは、分離されるべき成分を有する混合物を、流体に対して高い透過性を示す多孔質材料のパッキングを含有するカラム（固定相）に（通常は溶離液と一緒に）浸透させるという概念に基づく。混合物の各成分の浸透速度は、成分が連続的かつ選択的にカラムから排出されるように、その成分の物理的特性に依存する。したがって、成分のいくつかは、固定相に強く固定する傾向があるため、より遅延するであろうが、他の成分は、弱く固定し、しばらくするとカラムから排出する傾向にある。
【0054】
シミュレートされた移動床システムは、吸着剤を含有するいくつかの個別のカラムで構成され、それらは、一緒に直列に接続され、かつシステム内の混合物と溶離液の注入ポイントをシフトする、および分離された成分収集ポイントも定期的にシフトすることによって操作され、それによって、総体的な作用が、固体吸着剤の移動床を含有する単一カラムの操作をシミュレートする。したがって、シミュレートされた移動床システムは、従来の固定床システムと同様に、溶離液が通過する固体吸着剤の固定床を含有するカラムで構成されるが、シミュレートされた移動床システムでは、操作は、連続向流移動床をシミュレートするようなものである。
【0055】
これらのプロセスで使用されるカラムは、典型的には、固定相の基礎としてシリカ（または変性シリカ）を含有する。移動相（溶離液）は、典型的には、極性の高い溶媒混合物であり、水、メタノール、エタノールなどの１つまたは複数のプロトン性溶媒、ならびにそれらの混合物を含有することが多い。溶離液の流量は、分離プロセスの効率を最適化するために当業者によって調整され得る。例えば、特許請求の範囲で定義される生成物は、比較的速い溶離液流量を使用して得ることができる。より遅い流量を使用すると、最初の混合物に含有されるＦＡの分離度が向上し、したがって、より高い濃度または純度のＤＨＡを得ることができる。ＬＣ－ＰＵＦＡのための検出方法は、当業者に知られており、ＵＶ－ｖｉｓ吸収法ならびに屈折率検出法が含まれる。
【0056】
したがって、本実施形態の別の態様は、脂質組成物を生成するためのプロセスを提供し、このプロセスは、脂肪酸エチルエステルの混合物を提供し、次にその混合物をクロマトグラフィー分離プロセスにかけることを含む。本実施形態はまた、そのようなプロセスによって得られる脂質組成物を提供する。好適なクロマトグラフィー分離条件には、本明細書に記載されているものが含まれる。
【0057】
例えば、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を使用して、濃縮脂質画分を取得することができる。クロマトグラフィー分離で使用され得る特定の移動相は、メタノールと水との混合物（例えば、８８％のメタノール）であるが、これは、効率を向上させるために分離プロセス中に変更され得る（例えば、メタノール含有量を増やすために）。使用され得る特定の固定相は、シリカベースの固定相である。分析ＨＰＬＣ、または当業者に知られている他の好適な技術を、得られた画分に対して実施して、十分に高い濃度の所望の脂肪酸を含有し、したがって本発明の脂質組成物を含有する画分を同定することができる。
【0058】
したがって、少なくとも１つの実施形態において、濃縮脂肪酸エチルエステルは、例えば、前述のプロセスのいずれか１つを介して、植物ベースの脂質油のエステル交換および蒸留によって得られる。植物ベースの脂質油は、本明細書に開示される、または当技術分野で知られている、任意の植物、特に、油糧種子から得ることができる。エステル交換および蒸留の前に、脱ガム、アルカリ精製、漂白、または脱臭を使用する野菜ベースの脂質油の精製を任意選択で実施することができる。
【0059】
本発明の脂質組成物は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）として、またはさらなる濃縮によってそこから得ることができるＡＰＩの前駆体（または「中間体」）として、有用である。そのような組成物は、ＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、ＥＴＡ、またはそれらの組み合わせ、または先行するものとＯＡまたはＡＬＡとの混合物などの有益なＬＣ－オメガ－３のレベルでさらに濃縮されるであろう。これらのＬＣ－オメガ－３の形態は、遊離脂肪酸、エチルエステル、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせなどの任意の薬学的に許容される形態であり得る。
【0060】
油中の脂肪酸の濃度は、例えば、凍結結晶化、尿素を使用した錯体形成、超臨界流体抽出および銀イオン錯体形成など、当技術分野で知られている様々な方法によってさらに増加させることができる。尿素との錯体形成は、油中の飽和および一価不飽和脂肪酸のレベルを下げるための簡単で効率的な方法である。最初に、油のＴＡＧは、多くの場合脂肪酸エステルの形態で、それらの構成脂肪酸に分割される。次に、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルは、通常、処理によって脂肪酸組成が変化しないため、錯体形成のために尿素のエタノール溶液と混合することができる。飽和および一価不飽和脂肪酸は、尿素と容易に錯体形成し、冷却すると結晶化し、その後、ろ過によって除去することができる。これにより、非尿素複合体画分はＬＣ－オメガ－３脂肪酸で濃縮される（ただし、短鎖多価不飽和オメガ－３またはオメガ－６脂肪酸がこの手法で濃縮される場合がある）。
【0061】
本実施形態の脂質組成物は、脂質組成物が、脂質の一部またはすべてが得られた原料（例えば、植物種子）から分離されたバルク油であり得る。
【0062】
本実施形態の脂質組成物は、飼料中または飼料として使用することができる。すなわち、これらの組成物は、経口的に利用可能な形態で提供され得る。本実施形態の目的のために、「飼料」は、体内に取り込まれた場合に、組織に栄養を与える、もしくは組織を構築する、またはエネルギーを供給するのに役立ち、および／または適切な栄養状態または代謝機能を維持、回復、もしくはサポートする、人間が消費するための任意の食品または調製物を含む。飼料には、例えば、乳児用調製粉乳などの乳児または幼児向けの栄養組成物が含まれる。飼料の場合、さらに不快な味を最小限に抑え、安定性を最大にするために、脂肪酸をトリグリセリドの形態で提供することができる。
【0063】
飼料は、本明細書に記載の脂質組成物を、任意選択で適切な担体と一緒に含む。「担体」という用語は、その最も広い意味で使用され、栄養価を有する場合も有しない場合もある任意の成分を包含する。当業者が理解するように、担体は、飼料を消費する生物に有害な影響を及ぼさないように、飼料での使用に好適である（または十分に低濃度で使用されている）必要がある。飼料組成物は、固体または液体の形態であり得る。
【0064】
追加的に、組成物は、当技術分野で周知であるように、特定の用途に望ましい量の食用主要栄養素、タンパク質、炭水化物、ビタミン、またはミネラルを含み得る。これらの成分の量は、組成物が正常な個体での使用を意図するか、または代謝障害などに苦しむ個体などの特別なニーズを有する個体での使用を意図するかによって異なる。
【0065】
栄養価のある好適な担体の例には、食用脂肪（例えば、ココナッツ油、ボラージ油、真菌油、黒潮油、大豆油、およびモノグリセリドおよびジグリセリド）、炭水化物（例えば、ブドウ糖、食用乳糖、および加水分解デンプン）およびタンパク質（例えば、大豆タンパク質、電気透析ホエイ、電気透析スキムミルク、ミルクホエイ、またはこれらのタンパク質の加水分解物）などの主要栄養素が含まれる。
【0066】
本明細書に開示される飼料に添加され得るビタミンおよびミネラルには、例えば、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体が含まれる。
【0067】
本実施形態の別の態様では、脂質組成物を医薬組成物に使用することができる。そのような医薬組成物は、任意選択で、当業者に知られている１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に、本実施形態の脂質組成物を含む。好適な賦形剤、希釈剤または担体には、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、湿潤剤、または水／油乳濁液などの乳濁液が含まれる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、油または粉末を含む、液体または固体のいずれかの形態であり得る。例えば、組成物は、カプセル錠剤、カプセル化ゲル、摂取可能な液体（油または溶液を含む）もしくは粉末、乳濁液、または局所軟膏もしくはクリームの形態であり得る。医薬組成物はまた、静脈内製剤としても提供され得る。
【0068】
飼料に、および医薬組成物に好適な特定の形態には、液体含有カプセルおよびカプセル化ゲルが含まれる。本発明の脂質組成物は、使用前に他の脂質または脂質混合物（特に、植物ベースの脂肪酸エステルおよび脂肪酸エステル混合物）と混合することができる。本発明の脂質組成物は、抗酸化剤（例えば、トコフェロール（α－トコフェロールまたはγ－トコフェロールなど）またはトコトリエノール）、安定剤、および界面活性剤からなる群から選択される１つまたは複数の追加成分と共に提供され得る。トコフェロールとトコトリエノールは、カノーラ油を含むさまざまな植物種子油に天然に存在する成分である。
【0069】
例えば、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望ましい場合がある。そのような不活性希釈剤に加えて、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤および芳香剤などのアジュバントを含むこともできる。本発明の脂質組成物に加えて、懸濁液は、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタヒドロキシアルミニウム、ベントナイト、寒天、およびトラガカントまたはこれらの物質の混合物などの懸濁剤を含み得る。
【0070】
錠剤およびカプセルなどの固形剤形は、当技術分野で周知の技術を使用して調製することができる。例えば、本明細書に開示される方法に従って生成された脂肪酸は、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、スクロース、およびコーンスターチなどの従来の錠剤ベースで錠剤化することができる。カプセルは、これらの賦形剤を、関連する脂質組成物および任意選択で１つまたは複数の抗酸化剤と共にゼラチンカプセルに組み込むことによって調製することができる。
【0071】
本実施形態の医薬組成物の可能な投与経路には、例えば、経腸（例えば、経口および直腸）および非経口が含まれる。例えば、液体調製物は、経口または経直腸で投与され得る。追加的に、均質な混合物を水に完全に分散させ、無菌条件下で生理学的に許容される希釈剤、防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合し、スプレーまたは吸入剤を形成することができる。
【0072】
本明細書に記載の脂質組成物は、典型的には長鎖多価不飽和脂肪酸に関連する多くの利点を提供し得る。例えば、上述のように本明細書に記載される脂質組成物、および上記の医薬組成物は、当業者に周知の試験を用いて決定され得るように、心血管疾患の治療もしくは予防、心血管疾患患者の死に対する防御、全体的な血清コレステロールレベルの低下、高血圧の低下、ＨＤＬ：ＬＤＬ比の増加、トリグリセリドの低下、またはアポリポタンパク質Ｂレベルの低下において使用され得る。したがって、本実施形態の一態様は、本明細書に記載の脂質組成物を使用して疾患および状態を治療（または予防）する方法を提供する。
【0073】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、および「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、講じる方策がない場合に発生するであろうものと比較して、本明細書に記載の疾患もしくは障害の進行を逆転、緩和、抑制すること、または本明細書に記載されるような障害もしくは疾患の発生率もしくは発症を遅延、排除もしくは低減することを指す。本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、所与の状態を獲得もしくは発症するリスクの低減、または病気ではない対象における再発もしくは該状態の低減もしくは抑制を指す。
【0074】
特定の脂肪酸の典型的な投与量は、０．１ｍｇ～２０ｇであり、１日０．１回～５回（１日最大１００ｇ）摂取され、特に、１日約１０ｍｇ～約１ｇ、２ｇ、５ｇ、または１０ｇ（１回または複数回の用量で摂取）の範囲である。当技術分野で知られているように、最低約３００ｍｇ／日の脂肪酸、特に、ＬＣ－オメガ－３が望ましい。しかしながら、任意の量の脂肪酸が対象にとって有益であることが理解されよう。オメガ３脂肪酸の吸収を高めるために、経口剤形を食事と一緒に服用することができる。医薬組成物として使用される場合、患者に投与される脂質組成物の投与量は、当技術分野の通常の技術の１つによって決定され、例えば、患者の体重、患者の年齢、患者の全体的な健康、患者の過去の病歴、患者の免疫状態などの様々な要因に依存する。
【0075】
本実施形態の組成物は、容易に入手可能な組成物であり、それは、改善された安定性プロファイルを有し得、オメガ－３とオメガ－６脂肪酸の相対的比率が人間の健康に特に有益である脂肪酸の混合物を含有し得る。安定性は、当業者に知られている様々な方法を使用して評価することができる。このような方法には、ランシマット法、プロパナール形成の評価（特に、オメガ－３脂肪酸に適している）、ヘキサナール形成の評価（特に、オメガ－６脂肪酸に適している）、「過酸化物価」法（例えば、ＡＯＣＳ公式法Ｃｄ８－５３を使用）および「ｐ－アニシジン値」法（例えば、ＡＯＣＳ公式法Ｃｄ１８－９０を使用）が含まれる。実施例において、本実施形態の組成物は、参照ブレンド（主要なＬＣ－ＰＵＦＡに関して同様の組成を有するが、有意な量の動物（魚）または合成由来の脂質を含有する参照ブレンド）と比較してより優れた安定性プロファイルを有することを示している。
【0076】
本実施形態の組成物はまた、先行技術の脂質組成と比較して、有効性、より少ない毒性、半減期、効力、より少ない後遺症、代謝、または薬物動態プロファイル（例えば、より高い経口バイオアベイラビリティおよび／またはより低いクリアランス）または他の有用な薬理学的、物理的、または化学的特性において利点を有する。
【実施例】
【0077】
実施例１－種子からのＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油の抽出
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａＮＵＢＪ１２０７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５９５４を寄託）は、米国カリフォルニア州のテントで栽培された。種子を収穫した後、粉砕するまで室温で保存した。ＮＵＢＪ１２０７は、その種子油に大量のＤＰＡｎ－３を生成する（１０％以上）。
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａＮＵＢＪ１２０７（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５９５４を寄託）は、米国カリフォルニア州のテントで栽培された。種子を収穫した後、粉砕するまで室温で保存した。ＮＵＢＪ１２０７は、その種子油に大量のＤＰＡｎ－３を生成する（１０％以上）。
【0078】
Ｋｅｒｎ Ｋｒａｆｔ ＫＫ８０スクリュープレスを使用して、ＤＰＡオイルを生成するために、種子（４．９２ｋｇ）を粉砕した。エクスペラーカラーヒーターの温度は、サーモスタットの最大設定温度に設定された。初期周囲温度およびチョーク温度は２０℃であり、チョーク距離は７３．９２ｍｍに設定した。全ての種子が粉砕されるまで、エクスペラーを停止することなく、油および粗挽き粉を継続的に収集しながら種子を供給した。
【0079】
オーガーの回転速度、粗挽き粉および排出油の温度は、プレスの間中、監視された。１．０２ｋｇ（２０．７％）の原油の収量が得られた。微粉を除去するために濾過した後の収率は０．９６ｋｇ（１９．４％）であった。この調製物（ＢｒＪと指定）の油プロファイル（脂肪酸含有量）を表１に示す。
【0080】
実施例２－参照ブレンド油
純粋な魚油には、低レベルのＡＬＡ脂肪酸、ならびに有意に高レベルのＥＰＡおよびＤＨＡが含有される。参照油ブレンドは、実施例１で得られた、濾過されたＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油と組成が類似するように設計された。ＤＰＡが他の供給元から同程度の量で入手できなかったため、５つの二重結合を持つことからＥＰＡが参照オイルに含めるためのコンパレータとして選択された。これは、ＥＰＡが豊富な魚油、亜麻仁油、および高ＯＡひまわり油をブレンドすることによって達成された。得られた参照ブレンド油も、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａオイルと同様の総オメガ３含有量を有していた。
純粋な魚油には、低レベルのＡＬＡ脂肪酸、ならびに有意に高レベルのＥＰＡおよびＤＨＡが含有される。参照油ブレンドは、実施例１で得られた、濾過されたＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油と組成が類似するように設計された。ＤＰＡが他の供給元から同程度の量で入手できなかったため、５つの二重結合を持つことからＥＰＡが参照オイルに含めるためのコンパレータとして選択された。これは、ＥＰＡが豊富な魚油、亜麻仁油、および高ＯＡひまわり油をブレンドすることによって達成された。得られた参照ブレンド油も、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａオイルと同様の総オメガ３含有量を有していた。
【0081】
より具体的には、機械式攪拌機を備えた乾燥窒素フラッシュ反応器に、半精製イワシ油（１９．４０ｋｇ、４８．５％）、粗高オレイン酸ヒマワリ油（９．５２ｋｇ、２３．８％）および粗亜麻仁油（１１．０８ｋｇ、２７．７％）を添加し、この混合物を不活性雰囲気中、周囲温度で２時間撹拌した。参照油（Ｒｆと指定）を反応器から排出し、使用するまで窒素下で保存した。
【0082】
表１は、実施例のＤＰＡ－Ｊｕｎｃｅａと参照ブレンド油を比較している。
【表1】
【0083】
実施例３－粗ＤＰＡジュンセア油の酵素的エステル交換
以下の酵素的エステル交換手順を、実施例１で得られた約５ｋｇの粗トリグリセリド油に対して実施して、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を生成した。
以下の酵素的エステル交換手順を、実施例１で得られた約５ｋｇの粗トリグリセリド油に対して実施して、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を生成した。
【0084】
機械的攪拌機を備えた乾燥した窒素フラッシュ反応器に、１００％の未変性エタノール（２．０ｋｇ）および実施例１で得られた粗トリグリセリド油（０．９５ｋｇ）を加え、混合物を撹拌した。この混合物に１００ｇのリポザイム４３５（ノボザイムズＡ／Ｓ）を加え、混合物を４０℃で２１時間加熱した。混合物から採取した試料の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、反応が完了したことを示した。
【0085】
混合物を２０℃に冷却した。混合物を反応器から排出し、２０Ｌのニューチェフィルター上の４μｍのポリプロピレン濾布を通して濾過した。反応器をエタノール（２×１．２５Ｌ）および石油スピリット（２．５Ｌ）ですすぎ、これらは、フィルターケーキを順次洗浄するために使用した。得られた粗反応混合物に石油スピリット（２．５Ｌ）および水（２Ｌ）を加え、混合物を反応器内で完全に混合し、次に静置した後、２つの相が形成された。
【0086】
石油スピリット層を除去し、水層をさらに石油スピリットで抽出した（１×５Ｌおよび１×２．５Ｌ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウム（約１ｋｇ）で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、黄色の油（収率：９９％）の粗ＤＰＡ ＦＡＥＥを得た。収率：９９．０％。
【0087】
実施例２に従って得られた粗トリグリセリド参照ブレンド油（５．０ｋｇ）の酵素的エステル交換は、前の実施例に記載されたプロセスを使用して完了した。生成物は、黄色の油として得られた。
【0088】
実施例４－エステル交換油の真空蒸留による濃縮
真空蒸留により脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）混合物のより揮発性の高い成分を除去するための標準的手順を以下に記載する。実施例３からのＦＡＥＥを蒸留に供して、２つの画分、すなわち、少量のＤＰＡＥＥを含む留出画分と、より揮発性の低いほとんどのＤＰＡＥＥを含む残留画分とを発現させた。蒸留による分離は、蒸留物および残留物を収集する２×１０００ｍｌの収集フラスコを備え、真空下にあるＰｏｐｅ２インチ（５０ｍｍ）薄膜蒸留器にトランスエステル化原油を通過させることによって達成された。それぞれの脂肪酸組成を分析した。真空をＥｄｗａｒｄｓ３ロータリーポンプによって供給し、真空はｅｂｒｏ真空計ＶＭ２０００によって測定した。
真空蒸留により脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）混合物のより揮発性の高い成分を除去するための標準的手順を以下に記載する。実施例３からのＦＡＥＥを蒸留に供して、２つの画分、すなわち、少量のＤＰＡＥＥを含む留出画分と、より揮発性の低いほとんどのＤＰＡＥＥを含む残留画分とを発現させた。蒸留による分離は、蒸留物および残留物を収集する２×１０００ｍｌの収集フラスコを備え、真空下にあるＰｏｐｅ２インチ（５０ｍｍ）薄膜蒸留器にトランスエステル化原油を通過させることによって達成された。それぞれの脂肪酸組成を分析した。真空をＥｄｗａｒｄｓ３ロータリーポンプによって供給し、真空はｅｂｒｏ真空計ＶＭ２０００によって測定した。
【0089】
油は、Ｃｏｌｅ－Ｐａｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙのｅａｓｙ－ｌｏａｄ ＩＩ蠕動ポンプによって４ｍＬ／分で蒸留器に供給され、蒸留器モーターは３２５ｒｐｍに設定され、水凝縮器を使用して蒸留物を凝縮した。いずれかのレシーバーフラスコが一杯に（比較的同量の蒸留物および残余分の油が観察されるように）なるまで供給を続けた。粗ＤＰＡＦＡＥＥは、ヒーターバンドが１５３℃に初期設定されたこれらの条件下で蒸留した。目的は、蒸留物：残留物の５０：５０分割を得ることであった。実験の最初の４５分間に、ヒーターバンドの温度を１４３℃に下げ、蒸留された油の割合を減少させた後、蒸留器を平衡化した。数分後、ヒーターバンドの温度を１４１℃に下げて調整した。残りの蒸留は１４１℃で行った。蒸留の合計時間は１４５分であった。収率：５２．１％蒸留物、４７．１％残余分（残留物）。したがって、残留油中に８０％のＤＰＡＥＥを維持しながら、体積を５０％削減した。これにより、元々約１０％のＤＰＡＥＥを含んでいたオイルから約１９％のＤＰＡＥＥを含むオイルが生成された。
【0090】
ヒーターバンドの温度を１４５℃に設定した標準条件下での蒸留により、上記の蒸留からの残留物の一部を、より揮発性の高い成分の除去に再び供し、今回もまた５０：５０分割を目標とした。２０分以上かけて蒸留油の割合を増やすために、ヒーターバンドの温度を１５３℃に上げ、その温度に保った。しかしながら、１５３℃で５０分後、蒸留物の流量が高すぎることが見出され、残りの蒸留のためにヒーターバンドの温度を１５１℃に下げた。蒸留の合計時間は９５分であった。収率：５３．０％蒸留物、４６．４％残余分。これにより、ＤＰＡＥＥが約３５％の油が生成された。二重蒸留で得られた油の量は４分の１に減少したが、油には元のＤＰＡＥＥの約６５％が保持されていた。
【0091】
参照油を同様の条件下で蒸留した。
【0092】
実施例５-ＤＰＡ－Ｊｕｎｃｅａ由来ＦＡＥＥのクロマトグラフィー分離
実施例４で得られたＦＡＥＥ（すなわち、エステル交換および二重蒸留によって粗ＤＰＡ－Ｊｕｎｃｅａ油から得られたＦＡＥＥ）を、分取ＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分離に供した。１ｇスケールでの分取ＨＰＬＣとそれに続く真空濃縮により、８５％を超えるＤＰＡＥＥ（および参照ブレンド油からの８５％を超えるＥＰＡＥＥ）画分が生成された。第２の分取ＨＰＬＣ実験を実行して、５０～８５％ＤＰＡ濃縮油または４０～６０％ＥＰＡ濃縮油のいずれかの単一画分を取得した。別のカラムを使用して、追加の分取ＨＰＬＣ実験を実施した。他のすべてのＦＡＥＥ画分を収集し、ＨＰＬＣで純度を分析し、目的の純粋な画分を真空下で濃縮した。このようにして、ＯＡＥＥ、ＬＡＥＥ、ＡＬＡＥＥ、ＥＴＡＥＥ、ＥＰＡＥＥ、およびＤＰＡＥＥに富む画分も、１つまたは複数の油から生成された。
実施例４で得られたＦＡＥＥ（すなわち、エステル交換および二重蒸留によって粗ＤＰＡ－Ｊｕｎｃｅａ油から得られたＦＡＥＥ）を、分取ＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分離に供した。１ｇスケールでの分取ＨＰＬＣとそれに続く真空濃縮により、８５％を超えるＤＰＡＥＥ（および参照ブレンド油からの８５％を超えるＥＰＡＥＥ）画分が生成された。第２の分取ＨＰＬＣ実験を実行して、５０～８５％ＤＰＡ濃縮油または４０～６０％ＥＰＡ濃縮油のいずれかの単一画分を取得した。別のカラムを使用して、追加の分取ＨＰＬＣ実験を実施した。他のすべてのＦＡＥＥ画分を収集し、ＨＰＬＣで純度を分析し、目的の純粋な画分を真空下で濃縮した。このようにして、ＯＡＥＥ、ＬＡＥＥ、ＡＬＡＥＥ、ＥＴＡＥＥ、ＥＰＡＥＥ、およびＤＰＡＥＥに富む画分も、１つまたは複数の油から生成された。
【0093】
分取ＨＰＬＣ方法Ａ：本方法は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｅｐ４０００システム、１０ｍｌのループのＲｈｅｏｄｙｎｅインジェクター、３００×４０ｍｍのＤｅｌｔａｐｒｅｐ Ｃ１８カラム、Ｗａｔｅｒｓ２４８７デュアル波長検出器、およびチャートレコーダーを備えるＨＰＬＣシステムを使用し、８８％のメタノール／水移動相で、７０ｍＬ／分で平衡化した。検出器は、２１５ｎｍおよび２．０吸光度単位のフルスケールに設定し、チャートは、６ｃｍ／時間で実行した。１．０ｇのＦＡＥＥ油を最小量の８８％のメタノール／水に溶解し、Ｒｈｅｏｄｙｎｅインジェクターを介してカラムに注入した。約７分後に溶媒フロントが現れたら、約２５０ｍＬの画分を収集した。４７の画分が１５０分にわたって収集された。１０６分後、移動相を９０％のメタノール／水に変更した。１１６分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１３４分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／ｍｉｎで、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。
【0094】
分析用ＨＰＬＣはすべての画分（および上記および下記のＨＰＬＣメソッドＡＤ）で実行され、主にＤＰＡを含む「対称」画分が組み合わされた（収率：２２％）。試料分析には、Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅポンプコントローラー、７１７オートサンプラー、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、および２４１４屈折率検出器を備えるＨＰＬＣシステムを使用した。分析は、移動相としてアイソクラティックの９０％のメタノール／水または９５％のメタノール／水のいずれかを１．０ｍＬ／分で使用して、１５０×４．６ｍｍのＡｌｌｔｉｍａＣ１８カラム上で実施した。データの収集および処理は、Ｗａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウェアで実施した。
【0095】
このアプローチにより、表２で「Ａ ｆｒ」と指定された画分が得られた。
【表2】
【0096】
高純度ＤＰＡＥＥを分離するためのこの方法のバリエーションでは、方法Ａを次のように変更した：９６分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１０９分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１２０分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。３９の画分が１２０分にわたって収集された。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、Ａ画分と厳密に一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせた：Ａ１ ｆｒ２５～３０およびＡ１ ｆｒ３６～３７。
【0097】
ＡＨＰＬＣアプローチの別のバリエーションは、次の変更を加えて実施した：１０７分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１９分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１３０分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。４０の画分が１２９分にわたって収集された。これにより、高純度ＤＰＡＥＥが分離され、画分をＡ２ ｆｒ２５－３０およびＡ２ ｆｒ３８－３９と指定した。
【0098】
その後、方法Ａの画分をさらに精製工程と分析に供した。中純度のＤＴＡ３ＥＥを得るために、画分Ａ ｆｒ３９－４０、Ａ１ ｆｒ３６－３７、およびＡ２ ｆｒ３８－３９を組み合わせ、石油スピリットで抽出した（３ｘ３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この調製物をＡＰと指定した（収量：２６０ｍｇ）。
【0099】
分取ＨＰＬＣメソッドＢ：分取ＨＰＬＣによる中純度ＤＰＡＥＥの分離のために、二重蒸留したＦＡＥＥ油を、標準条件下で、変更を加えたＤｅｌｔａｐｒｅｐＣ１８カラムでクロマトグラフィーにかけた。目的は、５０～８５％のＤＰＡを含む単一のＤＰＡ画を収集することであった。出発物質である１．０７ｇの二重蒸留ＤＰＡＥＥから、次の条件下で７２分（ＤＰＡピークの１５分前）～１２０分（ＤＰＡピークの終了後１５分）まで単一の画分を収集した。１０５分後移動相を９０％メタノール／水に変更した。１２０分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１２４分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／ｍｉｎで、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。単一の画分（Ｂｆｒ１と指定）をＧＣ分析用に蒸発させた（収量：３３８ｍｇ）。
【0100】
関連するアプローチでは、ＨＰＬＣ方法Ｂを次のように変更した：９６分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１１分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１１６分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終ピークがカラムから溶出した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。Ｂ１ ｆｒ１と呼ばれる画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、Ｂ ｆｒ１のものとほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定した。
【0101】
別の関連するアプローチでは、ＨＰＬＣ方法Ｂを次のように変更した：１０４分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１９分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１２６分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終ピークがカラムから溶出した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。ＤＰＡピークの１５分前からＤＰＡピークの終了後１５分まで、単一の画分を収集した。Ｂ２ ｆｒ１と指定された画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、画分Ｂ ｆｒ１のものとほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定した。この手順を繰り返して、画分Ｂ１ ｆｒ１およびＢ２ ｆｒ１を調製した。
【0102】
その後、Ｂｆｒ１、Ｂ１ｆｒ１、およびＢ２ｆｒ１を組み合わせ、石油スピリットで抽出した（３ｘ３Ｌ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この調製物をＢＬと指定した（収量：１．１ｇ）。
【0103】
濃縮されたＤＰＡＥＥ抽出物ＢＬは、９４％メタノール／水移動相を使用して標準条件下でクロマトグラフィーにかけた。合計８つの画分が２４分間で収集された。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、ＢＬのものとほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせＢＭ ｆｒ１－８と指定した。
【0104】
続いて、ＢＭｆｒ１－８を組み合わせ、石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。このＤＰＡＥＥ抽出物をＢＮと指定した（収量：８０９ｍｇ）。
【0105】
分取ＨＰＬＣ方法Ｃ：高純度ＤＰＡＥＥの代替分離を次のように実施した。粗ＤＰＡ－ｊｕｎｃｅａ由来のＦＡＥＥ二重蒸留油（１．５７ｇ）を、２５０×５０ｍｍＧｅｍｉｎｉ－ＮＸＣ１８カラムを使用して、標準条件下で次の変更を加えてクロマトグラフィーにかけた：画分を約５８分でのＥＰＡＥＥピークの最初から収集した。合計２１の画分が７３分間にわたって収集された。１１１分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１２７分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１３７分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、それに基づいて以下の画分を組み合わせ、ＧＣ分析のために真空で濃縮した。収量を表３に示す。
【表3】
【0106】
画分Ｃ ｆｒ１０－１３を石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。次に、抽出手順の完全性を決定するために、残留水層も真空中で濃縮した。この工程により、上記の表３に示す収量のＣ ｆｒ１０－１３およびＣ ｆｒ１０－１３ａｑを得た。
【0107】
方法Ｃのバリエーションは、次の変更を加えて実行した：９３分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１６分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１２４分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを７０ｍＬ／分で、１００％メタノールでさらに１時間洗浄した。合計２３の画分が６８分間にわたって収集された。画分を次のように組み合わせた：Ｃ１ ｆｒ５～６、Ｃ１ ｆｒ１０～１３、およびＣ１ ｆｒ２０～２１。
【0108】
方法Ｃの別のバリエーションは、次の変更を加えて実行された：９６分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１１分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１１７分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を収集した後、カラムを１００％メタノールで、７０ｍｌ／分でさらに１時間洗浄した。７０分間で合計２３の画分が収集された。画分を次のように組み合わせた：Ｃ２ ｆｒ５～６、Ｃ２ ｆｒ１０～１３、およびＣ２ ｆｒ２０～２１。
【0109】
方法Ｃのさらに別のバリエーションは、次の変更を加えて実行された。９９分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１１５分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１２６分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を集めた後、カラムを１００％メタノールで、７０ｍｌ／分でさらに１時間洗浄した。合計２４の画分が７５分間にわたって収集された。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行して、Ｃ ｆｒのものとほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせた。画分を次のように組み合わせた：Ｃ３ ｆｒ５～６、Ｃ３ ｆｒ１０～１３、およびＣ３ ｆｒ２０～２２。
【0110】
方法Ｃの追加のバリエーションは、次の変更を加えて実行した：９２分後、移動相を９０％メタノール／水に変更した。１０９分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１１６分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終画分を集めた後、カラムを１００％メタノールで、７０ｍｌ／分でさらに１時間洗浄した。合計２４の画分が７２分間にわたって収集された。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行して、Ｃ ｆｒのものとほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせた。画分は次のように組み合わせた：Ｃ４ ｆｒ５～６、Ｃ４ ｆｒ１０～１３、およびＣ４ ｆｒ２０～２１。
【0111】
これらの手順に従って、画分Ｃ ｆｒ５～６、Ｃ１ｆｒ５～６、Ｃ２ｆｒ５～６、Ｃ３ｆｒ５－６、およびＣ４ｆｒ５－６を組み合わせ、、石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この調製物は高ＥＴＡｎ－３ＥＥを含み、ＣＲ（収量：２１７ｍｇ）と指定した。
【0112】
さらに、最初のＨＰＬＣ手順に従って、画分Ｃ ｆｒ１９～２０、Ｃ１ ｆｒ２０～２１、Ｃ２ ｆｒ２０～２１、Ｃ３ ｆｒ２０～２２、およびＣ４ ｆｒ２０～２１を組み合わせ、、石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この調製物は高ＤＴＡｎ－３ＥＥを含み、ＣＳ（収量：２５４ｍｇ）と指定した。
【0113】
また、最初の分取ＨＰＬＣ手順に従って、画分Ｃ ｆｒ１０～１３、Ｃ１ ｆｒ１０～１３、Ｃ２ ｆｒ１０～１３、Ｃ３ ｆｒ１０～１３、およびＣ４ ｆｒ１０～１３を組み合わせ、石油スピリットで抽出した（３×３Ｌ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。これらの調製物は、ＣＴ１（収量：１．０８８ｇ）およびＣＴ２（収量：４１７ｍｇ）と呼ばれる高純度ＤＰＡＥＥを提供した。
【0114】
濃縮されたＤＰＡＥＥ抽出物（４１７ｍｇ、ＣＴ２）は、９４％メタノール／水移動相を使用して標準条件下でクロマトグラフィーにかけられ、４つの画分が１２分間にわたって収集された。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、ＣＴ２とほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせＣＸｆｒ２～４と指定した。さらに、濃縮ＤＰＡＥＥ抽出物（１．０８８ｍｇ、ＣＴ１）を、９４％メタノール／水移動相を使用して標準条件下でクロマトグラフィーにかけ、１６分間で６つの画分を収集した。すべての画分に対して分析ＨＰＬＣを実行し、ＣＴ１とほぼ一致する純度とＦＡＥＥプロファイルを決定し、それに基づいて次の画分を組み合わせＣＺ ｆｒ３～６と指定した。
【0115】
その後、濃縮されたＤＰＡＥＥ調製物ＣＸ ｆｒ２～４およびＣＺ ｆｒ ３～６を組み合わせ、石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この調製物をＣＸＺと指定した（収量：１．０ｇ）。
【0116】
分取ＨＰＬＣ方法Ｄ：中純度ＤＰＡＥＥの代替分離も使用して、５０～８５％のＤＰＡを含む単一のＤＰＡ画分を収集した。粗ＤＰＡ－ｊｕｎｃｅａ由来のＦＡＥＥ二重蒸留油（１．５７ｇ）を、２５０ｘ５０ｍｍ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸＣ１８カラムを使用して、標準条件下で次の変更を加えてクロマトグラフィーにかけた。ＤＰＡピークの１５分前からＤＰＡピーク終了後１５分にかけて単一の画分を収集した。９０分後、移動相を９０％のメタノール／水に変更した。１００分後、移動相を９４％のメタノール／水に変更した。１１３分後、移動相を１００％のメタノールに変更した。最終ピークがカラムから溶出した後、カラムを１００％メタノールで、７０ｍｌ／分でさらに１時間洗浄した。単一の画分を石油スピリットで抽出した（３×３００ｍＬ）。組み合わせた石油スピリット層を、ＧＣ分析のために無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。この画分はＤ ｆｒ１（収量：５８７ｍｇ）として同定した。
【0117】
参照ブレンドの蒸留脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を、同様の条件下で同様にクロマトグラフィー分離にかけた。分析用ＨＰＬＣを全ての分画で実施し、主にＥＰＡを含有する「対称」分画を組み合わせた。
【0118】
次の表に、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ原油およびさまざまな濃縮ステップでの脂肪酸含有量の例を示す。（油は、当技術分野でよく知られているようにＧＣ－ＦＩＤによって分析された。ＦＡＥＥ ＩＤは、ＦＡＥＥミックスにエステル交換されたＳｕｐｅｌｃｏ３７ＦＡＭＥ標準ミックスを使用して確立した。）
【表4】
【0119】
本実施形態の様々な濃縮画分のＦＡ含有量のより詳細な提示を表５に示す。
【表5】
【0120】
いくつかの実施形態において、画分は、特定のＦＡＥＥの所望の濃度を達成するために混合され得る。例えば、濃縮されたＤＰＡ画分は、約４５％のＤＰＡｎ－３を含む脂質組成物を提供するために、別の画分、または異なる供給源からの油（例えば、ＤＨＡカノーラ油または別のカノーラ油）と混合され得る。少なくとも１つの実施形態では、組成物は、２０％～５０％のＤＰＡｎ－３、１０％～３０％のＯＡ、および２％～２０％のＥＴＡ（すべての範囲を含む）を含む。
【0121】
実施例６－油の安定性試験
選択した油を、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ヘッドスペースＧＣ／ＭＳを使用して、光誘起、時間経過、加速酸化研究に供した。これは、植物由来の油が、実際に観察された海洋由来の参照ブレンド油よりも優れた安定性を示すかどうかを判断するためである。
選択した油を、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ヘッドスペースＧＣ／ＭＳを使用して、光誘起、時間経過、加速酸化研究に供した。これは、植物由来の油が、実際に観察された海洋由来の参照ブレンド油よりも優れた安定性を示すかどうかを判断するためである。
【0122】
ヘッドスペースＧＣ－ＭＳ安定性試験を次のように実行した。特定の条件下で放出されるプロパナールの量を評価するために、上記の濃縮生成物に対してヘッドスペース分析を実行した。プロパナール放出のレベルの増加は、試験材料の安定性の低下を示している。
【0123】
ＳＰＭＥ（固相マイクロ抽出）法：選択された６５μｍＰＤＭＳ／ＤＶＢＳｔａｂｌｅＦｌｅｘファイバー（Ｓｕｐｅｌｃｏファイバーキット５７２８４－ｕ）。ファイバーは、Ｔｒｉｐｌｕｓ ＲＳＨコンディショニングステーションで、２５０℃で使用する前に１０分間コンディショニングした。抽出前に試料を４０℃で１分間インキュベートした。
【0124】
ＧＣ方法：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＲＡＣＥ１３１０ＧＣＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＲ－ＤＩＯＸＩＮ５ＭＳカラム、内径０．２５ｍｍ、３０ｍフィルム０．１μｍ。分割噴射２５０℃ Ｓｐｌｉｔ８３、１．２ｍｌＨｅ／分。ＧＣＲａｍｐ：４０℃１分から５℃／分で１００、次に５０℃／分で３００℃。
【0125】
ヘッドスペース分析に優れた相乗効果を示す一般的なＭＳ固有のカラムを使用した。カラムの性能を維持するために最大に上昇する前に、揮発性物質の分離を最大化するために、遅い初期温度の上昇が採用された。注入口の極低温冷却の必要性を回避し、カラムの分離能を向上させるために、分割噴射を採用した。
【0126】
サーモサイエンティフィックＤＦＳ高分解能ダブルフォーカシングＭＳ、ＴＲＡＣＥ１３１０、高分解能マルチイオン検出（ＭＩＤ）（ＬＩＮＥＡＲＥＬＥＣＴＲＩＣＳＣＡＮ）＠１０，０００分解能を用いたＴｒｉｐｌｕｓＲＳＨオートサンプラーにて以下のイオンをモニタリングした：ｍ／ｚ５７プロパナール－Ｈ（－Ｈはより高いダイナミックレンジ５８を記録したが、使用しなかった）。パーフルオロケロセン（ＰＦＫ）をキャリブレーションおよびロック質量標準ｍ／ｚ５１、６９、および９３として使用した。
【0127】
ＭＳ方法：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＤＦＳ高５分解能ＧＣ－ＭＳ、低分解能（１０００）、０．５秒／スキャンで３５～３５０Ｄａのフルスキャン、標準：プロパナールおよびヘキサナール標準希釈液を供給された市販のカノーラ油に使用した。次に、これらの標準混合物を１００μｌの容量で２０ｍｌのヘッドスペースバイアルに添加した。
【0128】
フルスキャンを採用し、特定分子ではなく、全ての開発製品をモニタリングした。
【0129】
安定性の結果：以下の表６は、Ｔ＝０、Ｔ＝３、およびＴ＝５日間での実施例５のＨＰＬＣ濃縮から得られた、参照調製物と比較したＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油から得られた結果を示している。試験試料は、この期間中、ライトボックス上および蛍光管照明下で、周囲臨時雇用者で保持された。ｍ／ｚ５７分子イオンを分析し、質量クロマトグラムは室温で１．３７分にプロパナールの出現を明確に示す。プロパナールの発達は下の表に定量化されており、データは図１～図３にも示されている。ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油は、実質的に少量のプロパナールを放出しており、これは、参照組成物と比較して、ＦＡＥＥ画分の安定性が向上していることを示している。
【表6】
【0130】
これらのデータは、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａ油から調製されたＦＡＥＥが、参照ブレンド油のＦＡＥＥと比較して優れた安定性を持っていることを示している。
【0131】
実施例７－炎症性サイトカイン産生の調節
本実施形態のＤＰＡ、ＤＴＡ、およびＥＴＡ脂質組成物は、免疫系を調節する。免疫系は、感染症から保護する生物学的構造とプロセスの組織化された複雑なネットワークである。例えば、サイトカインとケモカインは細胞間の相互作用を直接媒介し、標的免疫細胞の応答を調節し、炎症を促進する。これらの反応は、免疫系が外来病原体を根絶し、治癒過程を開始しようとする協調的な攻撃をもたらす。その結果、炎症過程は免疫において重要な保護的役割を果たす。さらに、サイトカインとケモカインの研究は、免疫系とほとんどの抗原に対するその多面的な反応、および自己免疫疾患、アレルギー反応、敗血症、癌などの病状を理解する上で不可欠である。免疫応答が病原体からの保護に役立つ可能性があるのと同様に、過剰または不適切な免疫は有害である可能性がある。例えば、慢性炎症は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肝疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、大腸炎、神経変性疾患などの多様な疾患に寄与する可能性があると提案されている。したがって、免疫の抑制もまた有益であり得る。
本実施形態のＤＰＡ、ＤＴＡ、およびＥＴＡ脂質組成物は、免疫系を調節する。免疫系は、感染症から保護する生物学的構造とプロセスの組織化された複雑なネットワークである。例えば、サイトカインとケモカインは細胞間の相互作用を直接媒介し、標的免疫細胞の応答を調節し、炎症を促進する。これらの反応は、免疫系が外来病原体を根絶し、治癒過程を開始しようとする協調的な攻撃をもたらす。その結果、炎症過程は免疫において重要な保護的役割を果たす。さらに、サイトカインとケモカインの研究は、免疫系とほとんどの抗原に対するその多面的な反応、および自己免疫疾患、アレルギー反応、敗血症、癌などの病状を理解する上で不可欠である。免疫応答が病原体からの保護に役立つ可能性があるのと同様に、過剰または不適切な免疫は有害である可能性がある。例えば、慢性炎症は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、肝疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、大腸炎、神経変性疾患などの多様な疾患に寄与する可能性があると提案されている。したがって、免疫の抑制もまた有益であり得る。
【0132】
本実施例では、ＤＰＡ－Ｊｕｎｃｅａ由来の脂質組成を調査して、免疫調節活性を確認し、その活性を合成の対応物と比較する。比較は、少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載される植物由来の脂質組成物が、合成の対応物と区別可能であることを示している。
【0133】
試験材料の調製：この実施例における比較のための例示的な脂質組成物は、比較のために合成脂肪酸および参照油画分と混合された、本明細書に記載されるような濃縮ＦＡＥＥ組成物を含む。
【0134】
前の実施例のＦＡＥＥから遊離脂肪酸を調製した：透明な溶液を形成するために、ＢｒＪＤＤ（ＤＰＡ ＪｕｎｃｅａＦＡＥＥ二重蒸留）、ＢＮ、ＣＳ、およびＡＰ。１００ｍｌの２つ口丸底フラスコに石油スピリット（１０ｍｌ）ペおよび脂肪酸エチルエステル（１５０ｍｇ）を添加した。リポザイム４３５（１５０ｍｇ）を加え、次に脱イオン水（５ｍｌ）を加え、４０℃に維持された油浴にフラスコを浸した状態で混合物を激しく攪拌した。ＦＡＥＥの大部分が減少しているのが見られ、それ以上の加水分解が観察されなくなるまで、反応混合物を１ＨＮＭＲおよびＴＬＣによって毎日確認した。完了したら、濁った白色の反応混合物を室温まで冷却した。混合物を１００ｍｌの新鮮な石油スピリットで希釈し、分液漏斗に転送した。透明な水相を除去し、すべての固体を除去するために、有機相を真空下で濾過した。透明な濾液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、粘稠な油を得た。試料を１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）で分析し、ラジアルクロマトグラフィー（４ｍｍシリカ、１００％石油スピリットで１００％ＤＣＭ、次に９５：５ＤＣＭ：ＭｅＯＨで溶出）で精製した。画分は、７５：２５石油スピリット：ＥｔＯＡｃを使用して開発されたＴＬＣを介して分析した。現像したプレートに基本的なブロモクレゾールスプレーをスプレーし、明るい黄色のスポットを示す画分を１Ｈ ＮＭＲで分析した。遊離脂肪酸を含む画分を合わせ、真空で濃縮し、バイアルに入れ、窒素下で密封した。
【0135】
遊離脂肪酸を、フラックスシード（Ｆｌｘ）と高オレイン酸ヒマワリ（ＨＯＳ）のＴＡＧ油から、次のように調製した。２５０ｍｌの２つ口丸底フラスコに石油スピリット（６０ｍｌ）およびトリグリセリドオイル（１０００ｍｇ）を添加し透明な溶液を形成した。リポザイム４３５（１０００ｍｇ）を加え、次に脱イオン水（４０ｍｌ）を加え、４０℃に維持された油浴にフラスコを浸した状態で混合物を激しく攪拌した。反応混合物は、５．２、４．２、および４．１ｐｐｍのトリグリセリドシグナルの大部分が減少し、それ以上の加水分解が観察されなくなるまで、１ＨＮＭＲおよびＴＬＣによって毎日確認した。完了したら、濁った白色の反応混合物を室温まで冷却した。混合物を１００ｍｌの新鮮な石油スピリットで希釈し、分液漏斗に転送した。透明な水相を除去し、すべての固体を除去するために、有機相を真空下で濾過した。透明な濾液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、粘稠な油を得た。原油を１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）で分析し、ラジアルクロマトグラフィー（４ｍｍシリカ、１００％石油スピリットで１００％ＤＣＭ、次に９５：５ＤＣＭ：ＭｅＯＨで溶出）で精製した。次に、画分を、７５：２５ペット石油：ＥｔＯＡｃを使用して開発されたＴＬＣを介して分析した。現像したプレートに基本的なブロモクレゾールスプレーをスプレーし、明るい黄色のスポットを示す画分を１Ｈ ＮＭＲで分析した。遊離脂肪酸を含む画分を合わせ、真空で濃縮し、バイアルに入れ、窒素下で密封した。
【0136】
さらに、ＤＰＡ（合成ＤＰＡ）およびＥＴＡ（合成ＥＴＡ）を、細胞アッセイのコンパレータとして使用するために購入した。
【0137】
遊離脂肪酸のさまざまなブレンドを次のように調製した。
【表7】
【0138】
ＦＦＡ成分およびＦＦＡブレンドのＦＡ含有量は、ＧＣによって決定され、表８に示される。
【表8】
【0139】
調節試験：簡単に説明すると、脾臓細胞（脾臓細胞）を雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃｍｉｃ）から採取し、９６ウェルプレートで培養する。細胞は、各油調製物（希釈）およびリポ多糖（ＬＰＳ、通常は細菌Ｅ．ｃｏｌｉに由来するか、そうでなければ細菌Ｅ．ｃｏｌｉを模倣）に曝露され、試験油調製物の存在下でサイトカイン応答を刺激する。続いて（油調製物希釈液およびＬＰＳに曝露して２４時間培養した後）、刺激された細胞からの培地を、サイトカイン（すなわち、細胞から培地に放出されたサイトカイン）の存在について試験する。サイトカイン調節の同定または定量化に有用なサイトカインおよび抗体の標準キットまたはセットが市販されている。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｍａｐ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＢｅａｄＰａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＭＣＹＴＭＡＧ－７０Ｋ－ＰＸ３２）には、次のサイトカイン／ケモカイン分析物を認識する抗体のプレミックスが含まれている：Ｅｏｔａｘｉｎ／ＣＣＬ１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＰ－１０、ＫＣ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ－α、およびＶＥＧＦ。データは、刺激されていない対照に対するサイトカインについて正規化されている。
【0140】
データは、野菜由来のＤＰＡに富む脂質組成物が、合成脂質組成物と比較して予想外の調節活性を有することを示し得る。
【0141】
実施例８－炎症性サイトカインの抑制
エンドトキシン（ＬＰＳ）によって活性化されたヒト血液細胞に対するさまざまな遊離脂肪酸（ＦＦＡ）製剤の効果の予備的なインビトロ研究が行われた。より具体的には、このアッセイは、ＬＰＳで刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、ケモカイン、および成長因子を産生する能力に対するさまざまなＦＦＡ調製物のインビトロの効果を測定した。
エンドトキシン（ＬＰＳ）によって活性化されたヒト血液細胞に対するさまざまな遊離脂肪酸（ＦＦＡ）製剤の効果の予備的なインビトロ研究が行われた。より具体的には、このアッセイは、ＬＰＳで刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、ケモカイン、および成長因子を産生する能力に対するさまざまなＦＦＡ調製物のインビトロの効果を測定した。
【0142】
最初に、３つのヒトＰＢＭＣサンプルを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＬＰＳフリーコントロール（０、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ）に対して４つの異なるＬＰＳ用量で刺激した。各シリーズはまた、ＤＭＳＯビヒクル中で３つの異なる用量（ＦＦＡフリーコントロールに対して）で、単一のＦＦＡ調製物Ｒｆｄｄ（表８を参照）とともにインキュベートされた。試料の細胞分布を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６）のフローサイトメトリー分析に基づいて決定した。表９は、ヒト細胞サンプルのソースおよび細胞含有量に関する詳細情報である。
【表9】
【0143】
３８の異なるサイトカイン／ケモカイン／成長因子（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸマップヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル－プレミックス３８プレックス－免疫学マルチプレックスアッセイ（ミリポアＨＣＹＴＡ－６０Ｋ－ＰＸ３８））の産生物をこれらの細胞サンプル間で比較した。このアッセイキットのマーカーは、ＥＧＦ、エオタキシン／ＣＣＬ１１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮα２、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－ＲＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬでした。－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、およびＶＥＧＦ－Ａであった。データは、１ｎｇ／ｍＬＬＰＳが複数の分析物のレベルに対して強力な刺激効果を示すことを示した。
【0144】
ＦＦＡの調製物がない場合、ＬＰＳは一般的に予想される通り単球を活性化した。具体的には、次の要因がＬＰＳによって誘発された：エオタキシン（わずかに）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－６、ＩＬ－８（わずか）、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）（２／３試料）、ＩＬ－１７ｅ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ（わずか）、ＴＮＦα、およびＴＮＦβ。対照的に、ＩＬ－２、ＩＰ１０、ＭＣＰ－１（２／３試料）の３つの要因が抑制されたが、これら３つの要因がＬＰＳによって抑制される理由は明らかではない。Ｔ細胞由来のサイトカインは一般的に活性化されていないことに留意されたく、Ｂ細胞もＬＰＳ誘導発現に寄与している可能性がある。１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激すると、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＴＮＦαなどのサイトカインの減少に見られるように、ＲｆｄｄはＤ１ＰＢＭＣに対して中程度の抑制効果を示した。Ｄ１からのＰＢＭＣがさらなる研究のために選択された。
【0145】
Ｄ１ＰＢＭＣを解凍し、９６ウェルプレートにウェルあたり１×１０５細胞の密度で播種した。次に、播種した細胞を、２連で、１：３希釈で段階希釈された盲検試験ＦＦＡ調製物（実施例７を参照）、最高用量約３０μＭで処理した。文脈上、一晩絶食した後の正常な人々の血中の典型的な総ＦＦＡ含有量は約５８０μＭである。次に、処理した細胞を１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。対照ウェルは、ビヒクル（０．１または０．３％ＤＭＳＯ）の存在下で１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激または非刺激のいずれかである未処理のＰＢＭＣで設定された。無細胞上清を処理の２４時間後に収集し、上記のヒト３８プレックスサイトカイン／ケモカイン／成長因子パネルＡＭｉｌｌｉｐｌｅｘＭａｐＫｉｔ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＨＣＹＴＡ－６０ＫＰＸ３８）で分析した。
抑制に関しては、抑制性用量は、対照（ＬＰＳ刺激、ＦＦＡの添加なし）シグナルの５０％未満のシグナルを生成する調製物と見なされた。ＦＦＡコンテンツのコンテキストでデータを分析するために、主に３０μＭデータに基づく抑制の０～５の単純なスケールが、次の定性的側面に基づいて作成された。抑制がないか非常に小さい場合は０を使用した。ＩＦＮγ抑制ならびにサイトカインＩＬ－１シリーズ（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ）およびケモカインＩＰ－１０およびＭＣＰ－１の抑制は低いと見なされ、１から２．５にランク付けされた。ＴＮＦαも抑制された場合、スコア３が与えられた。３を超えると、一部のＴ細胞サイトカインの抑制が必要になる。すべてのサイトカインが抑制された場合、最大５が割り当てられた。結果を表１０に示す（ＦＡの内容は四捨五入、０は＜０．５を意味する）
抑制に関しては、抑制性用量は、対照（ＬＰＳ刺激、ＦＦＡの添加なし）シグナルの５０％未満のシグナルを生成する調製物と見なされた。ＦＦＡコンテンツのコンテキストでデータを分析するために、主に３０μＭデータに基づく抑制の０～５の単純なスケールが、次の定性的側面に基づいて作成された。抑制がないか非常に小さい場合は０を使用した。ＩＦＮγ抑制ならびにサイトカインＩＬ－１シリーズ（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ）およびケモカインＩＰ－１０およびＭＣＰ－１の抑制は低いと見なされ、１から２．５にランク付けされた。ＴＮＦαも抑制された場合、スコア３が与えられた。３を超えると、一部のＴ細胞サイトカインの抑制が必要になる。すべてのサイトカインが抑制された場合、最大５が割り当てられた。結果を表１０に示す（ＦＡの内容は四捨五入、０は＜０．５を意味する）
【表10-1】
【表10-2】
【0146】
一般的に言えば、いくつかのＦＦＡ調製物は、分析物の半分以上に対して３０μＭの用量で強力な抑制効果を示した（ＬＰＳ刺激コントロールと比較して＞５０％の減少）：組み合わせた高Ｂ．ｊｕｎｃｅａＤＰＡｎ－３画分（約９５．８％ＤＰＡｎ－３）；合成ＥＴＡ；およびＳｙｎＤＥＨＯＳ２（合成ＤＰＡおよびＥＰＡとオレイン酸）。
【0147】
いくつかの化合物は強い抑制効果を有した。ＩＦＮγは、すべてのＦＦＡ調製物によって、少なくとも弱く、普遍的に抑制された。他のタイプの最小抑制には、サイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１ＲＡ（ＩＬ－１シリーズ）またはケモカインＩＰ－１０およびＭＩＰ－１が含まれる傾向があった。最も強力な抑制製剤は、ＩＬ２－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２２などの古典的なＴ細胞サイトカインも抑制した。最も抑制性の高い調製物は、強力な抑制の代表的なマーカーと見なすことができるＴＮＦαも抑制した。この予備研究では、ＤＰＡ Ｊｕｎｃｅａに由来する少なくとも１つのＤＰＡ調製物（本明細書に記載のＣシリーズの技術からの約９６％ＤＰＡｎ－３）は、類似の合成ＤＰＡよりも抑制性が高いようであった。全体として、より多くのＤＰＡｎ－３、ＤＴＡｎ－３、またはＥＴＡを含む調製物は、このアッセイで抑制活性を示した。ＥＴＡ、ＤＴＡｎ－３、およびＤＰＡｎ－３はすべて、調製物の主成分として存在する場合、有意な抑制活性を示した。驚くべきことに、ＤＰＡｎ－３とＥＴＡの組み合わせは、このアッセイにおける炎症性サイトカインの効果的な抑制剤であった。
【0148】
免疫調節活性は、約１０μＭで提供されたＦＦＡ調製物でも観察された。より具体的には、刺激性シグナルは、ＬＰＳ刺激対照（ＦＦＡを添加しない）と比較して１３０％を超えるシグナルとして分類され、抑制性シグナルは、ＬＰＳ刺激（ＦＦＡを添加しない）と比較して７０％未満のシグナルとして分類された。１０μＭでは、次の調製物は刺激反応のみを示した（ＦＦＡ含有量については表８を参照）：ＢｒＪｄｄ、ＢＮ、Ｂｆｒ１ＦｌｘＨＯＳ、およびＲｆｄｄ。１０μＭで、次の調製物は抑制反応を示した：ＣＲ（ＩＦＮγ、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＰ－１０のみ）、ＡＰ（ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１７Ｆのみ）、ＤＨＡ ｆｒ２１－２５（ＩＬ１２（ｐ４０）、ＩＬ－１７Ｆのみ）、ＨＯＳ（実質的）、およびＳｙｎＤＥＨＯＳ１（６つのサイトカイン）。１０μＭで、次の調製物は刺激性と抑制性の両方の応答を示した：ＣＸＺ、ＣＳ、ＢｒＪｄｄＦｌｘＨＯＳ、ＢｒＪｄｄＦｌｘＨＯＳ１、Ａ ｆｒ３９－４０ＨＯＳ、Ａ ｆｒ１９－２０ＨＯＳ、ＳｙｎＤＰＡ、ＳｙｎＤＨＯＳ、ＳｙｎＥＴＡ、ＳｙｎＤＥＨＯＳ、およびＳｙｎＤＥＨＯＳ２。
【0149】
さらに刺激に関しては、一般に、３０μＭの調製物で一貫して増加したサイトカインはＧＭ－ＣＳＦのみであった（１５／２１製剤では対照と比較して１５０％以上）。
【0150】
前述の実施形態は、明確化および理解の目的で例示および例としていくらか詳細に説明されてきたが、特定の変更および修正が添付のクレームによってのみ制限される本発明の範囲内で実施され得ることは当業者には明らかであろう。
【0151】
本明細書における明らかに先に公開された文献のリストまたは考察は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であるという認識として必ずしも解釈されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】