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特表2022-554258ＡＬＫ陰性癌および形質細胞媒介性疾患の治療のためのＡＬＫ阻害剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-28
(54)【発明の名称】ＡＬＫ陰性癌および形質細胞媒介性疾患の治療のためのＡＬＫ阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20221221BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20221221BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221221BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221221BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/501 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20221221BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20221221BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221221BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20221221BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
G01N33/68
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/02
A61K31/506
A61K31/501
A61K31/5377
A61K31/496
A61K31/4545
C12Q1/6813 Z
C12Q1/686 Z
A61P37/06
A61K31/675
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525050
(86)(22)【出願日】2020-03-12
(85)【翻訳文提出日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 EP2020056698
(87)【国際公開番号】W WO2021083555
(87)【国際公開日】2021-05-06
(31)【優先権主張番号】1915618.1
(32)【優先日】2019-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公開の事実 ウェブサイトの掲載日２０１９年３月１３日（平成３１年３月１３日） ウェブサイトのアドレス ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／５７５３６５ｖ１
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510179537
【氏名又は名称】ウニヴァーシテテット イ オスロ
【住所又は居所原語表記】Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １０７２，Ｂｌｉｎｄｅｒｎ，０３１６ Ｏｓｌｏ Ｎｏｒｗａｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】ファルハン、ヘッソ
(72)【発明者】
【氏名】ムンテ、ルズヴィ
(72)【発明者】
【氏名】タスケン、チェーティル
(72)【発明者】
【氏名】スコンランド、シグリッド
(72)【発明者】
【氏名】ジリベルト、マリアセレナ
(72)【発明者】
【氏名】ヘレム シュイェスヴォルド、フレドリック
(72)【発明者】
【氏名】ドリーセン、クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ベス、レンカ
(72)【発明者】
【氏名】ベス、アンドレイ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA20
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC36
4C086BC42
4C086BC50
4C086BC73
4C086DA38
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
(57)【要約】
本発明は、対象におけるＡＬＫ陰性／ＬＴＫ陽性癌を治療する方法を提供し、前記方法は、医薬上有効な用量のＡＬＫの線状阻害剤を前記対象に投与することを含む。本発明は、プロテアソーム阻害剤耐性多発性骨髄腫を含む多発性骨髄腫の治療に、特に有用である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における癌または形質細胞媒介性疾患の治療に使用するための未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の線状阻害剤であって、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつ白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）陽性である細胞により特徴づけられる、ＡＬＫの直鎖阻害剤。
【請求項2】
前記使用は、癌の治療である、請求項１に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項3】
前記癌は、多発性骨髄腫である、請求項２に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項4】
前記癌は、慢性リンパ性白血病、または肝癌である、請求項２に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項5】
前記癌は、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある、請求項２～４のいずれかに記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項6】
前記プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである、請求項５に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項7】
前記形質細胞媒介性疾患は、自己免疫疾患である、請求項１に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項8】
前記自己免疫疾患は、ループスまたは免疫性血小板減少症である、請求項７に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項9】
前記形質細胞媒介性疾患は、移植片対宿主病である、請求項７に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項10】
前記阻害剤は、式ＸＩに記載の構造を有する、請求項１～９のいずれかに記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。【化1】
Ｒ1はＣＨ3またはｉＰｒであり、
Ｒ2はＨまたはＣＨ3であり、
【化2】
【請求項11】
前記阻害剤は、セリチニブである、請求項１０に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項12】
前記治療は、４５０ｍｇのセリチニブを含む用量の連日投与を含み、前記用量は、経口投与される、請求項１１に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項13】
前記治療は、一日に２００ｍｇ～４００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は、経口投与される、請求項１１に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項14】
前記治療は、多発性骨髄腫のための治療であり、前記治療は、一日に４００ｍｇ～５００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は、経口投与される、請求項１１に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項15】
前記阻害剤は、ブリガチニブである、請求項１０に記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項16】
前記阻害剤は、クリゾチニブ、エンサルチニブ、アレクチニブ、およびエントレクチニブから選択される、請求項１～９のいずれかに記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項17】
前記対象は、ヒトである、請求項１～１６のいずれかに記載の使用のためのＡＬＫ阻害剤。
【請求項18】
対象における癌または形質細胞媒介性疾患を治療する方法であって、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞により特徴づけられ、前記方法は、医薬上有効な用量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
【請求項19】
対象におけるＡＬＫ陰性癌を診断し治療する方法であって、前記方法は、（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について、前記癌を調べること；および
（ｉｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であると分かった場合、医薬上有効な用量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項20】
対象におけるＡＬＫ陰性癌を診断し治療する方法であって、前記方法は、（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であることを判定すること；および
前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
【請求項21】
前記癌、形質細胞媒介性疾患、ＡＬＫ阻害剤、対象、および／または用量は、請求項２～１７のいずれかに定義されるものである、請求項１７～１９のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
対象における癌または形質細胞媒介性疾患を治療するための医薬品の製造における、ＡＬＫの線状阻害剤の使用であって、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞によって特徴づけられる、使用。
【請求項23】
前記癌、形質細胞媒介性疾患、ＡＬＫ阻害剤、治療、および／または対象は、請求項２～１７のいずれか一項で定義されるものである、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトにおける、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性かつ白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）陽性の癌（ＡＬＫNegＬＴＫPos標的細胞）の治療に使用するための、線状（linear）ＡＬＫ阻害剤を提供する。本発明はまた、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の形質細胞を特徴とする形質細胞媒介性疾患を、ヒトにおいて治療する際に使用するための、線状ＡＬＫ阻害剤を提供する。本発明にしたがって治療された形質細胞媒介性疾患は、特に、自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患であってもよい。
【0002】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、インスリン受容体スーパーファミリーに属する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。健康な成人において、ＡＬＫタンパク質は中枢神経系にのみ、低レベルで発現する（Pulford et al. Blood 89:1394-1404,1997）。しかしながら、Hallberg & Palmer、２０１６年（Annals of Oncology 27 (Supplement 3): iii4-iii15）で考察されているように、多くの癌での異常なＡＬＫの発現が報告されている。ＡＬＫ融合タンパク質は、いくつかの癌で発現していると報告されている。ＡＬＫは、特に（たとえば未分化大細胞型リンパ腫の中の）ＮＰＭや、（たとえば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の中の）ＥＭＬ４など、様々なタンパク質と融合することが分かっている。発癌性ＡＬＫ融合は、ＡＬＫタンパク質のキナーゼドメインを含み、リガンド非依存性である（すなわち、ＡＬＫドメインは恒常的に活性である）。ＡＬＫ媒介性の発がんの他のメカニズムもまた、特定されている：特に神経芽細胞腫中で、全長ＡＬＫ遺伝子における点変異が報告されている；また、いくつかの腫瘍タイプで、全長ＡＬＫの過剰発現が報告されている。
【0003】
ＡＬＫPos癌はＡＬＫを発現する癌であるが、なんらかの形態のＡＬＫPos癌の治療用に、ＡＬＫ阻害剤が広く知られている。たとえば、国際公開第２００９／１２６１５４号、および国際公開第２０１０／００２６５５号は、ＡＬＫにより媒介された病状（特にＡＬＫにより媒介された癌）の治療に使用するためのトリアジンおよびピリミジン誘導体を開示している。癌治療用に承認された最初のＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブであり、これはＡＬＫPos ＮＳＣＬＣの治療用に２０１１年に承認された。上記治療用に、その他多数のＡＬＫ阻害剤が承認されており、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブなどがある。セリチニブは国際公開第２００８／０７３６８７号に初めて開示された。
【0004】
本発明は、公知のＡＬＫ阻害剤の新たな用途を提供する。本発明は、ヒトにおけるＡＬＫNegＬＴＫPos癌の治療におけるＡＬＫ阻害剤の提供を含む。前記発明はまた、ＡＬＫNegＬＴＫPosである形質細胞によって特徴づけられる形質細胞媒介性疾患の治療におけるＡＬＫ阻害剤の提供を含む。白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）は、小胞体（ＥＲ）からの輸送を調節する、小胞体常在受容体チロシンキナーゼである（Centonze et al., Journal of Cell Biology 218(8): 2470-2480, 2019）。本発明者は、ＬＴＫが、タンパク質恒常性において重要な役割を果たすことを実証している。
【0005】
タンパク質恒常性は、一方で新生タンパク質の合成と輸送を、他方ではミスフォールドタンパク質（misfolded protein、誤って折り畳まれたタンパク質）の分解を、含む。タンパク質恒常性のうちの生合成の部分と分解の部分とには、高度な相互接続があり、いわゆるタンパク質恒常性ネットワークを形成している。前記小胞体は、タンパク質恒常性の主要な部位であり、プロテオームの不均衡を感知してそれに応答する様々な制御システムを備える。ミスフォールドタンパク質が蓄積すると、三つの小胞体常在膜貫通タンパク質（ＩＲＥ１、ＡＴＦ６、およびＰＥＲＫ）が活性化され、その結果、アンフォールドタンパク質（unfolded protein、折り畳まれていないタンパク質）応答（ＵＰＲ）の誘導が起こる。ＵＰＲは、タンパク質を折り畳み（fold）処理する小胞体の能力を増大させるのみならず、末端ミスフォールドタンパク質のプロテアソーム分解を刺激する。したがって、前記ＵＰＲは、前記タンパク質恒常性ネットワークの自己調節プロセスと称することができる。ミスフォールドタンパク質が小胞体を離れて分解区画へ向かう一方、正しく折り畳まれた（correctly folded）分泌タンパク質は、小胞体出口部位（ＥＲＥＳ）と呼ばれる特別な領域で形成されるＣＯＰＩＩキャリアで小胞体を離れる。ミスフォールドタンパク質への適応応答はかなりよく理解されている一方、フォールドタンパク質（folded protein、折り畳まれたタンパク質）の負荷（load）を感知してＥＲＥＳを調節することにより応答する同等のメカニズムについては、ほとんど知られていない。
【0006】
ＬＴＫが分泌負荷に応答し、小胞体の分泌容量を調節して、小胞体をタンパク質恒常性ネットワークにおける調節点とすることが、本明細書において示されている。このように、ＬＴＫは、タンパク質恒常性ネットワークの生合成部分における標的であって、過剰なタンパク質分泌を特徴とする疾患の治療で標的となる能力を備えた標的の代表的なものである。多くの癌が、高レベルのタンパク質分泌（分泌過多）を特徴とし、タンパク質恒常性メカニズムへの高い依存度を示す。自己免疫障害などの特定の形質細胞媒介性疾患はまた、形質細胞、形質芽細胞や、その前駆体によるタンパク質（抗体）分泌過多を特徴とする。
【0007】
タンパク質分泌過多を特徴とする病状の特定の例としては、多発性骨髄腫がある。多発性骨髄腫は、クローン形質細胞の癌である。癌化した細胞は、抗体製造細胞であり、多発性骨髄腫は抗体分泌過多を特徴とする。多発性骨髄腫におけるタンパク質恒常性の重要性は、タンパク質恒常性ネットワークの分解の部分を阻害するプロテアソーム阻害剤の臨床における成功から明らかである（Moreau et al., Blood 120(5): 947-959, 2012）。多発性骨髄腫の治療の最近の進歩は生存期間の向上をもたらしたが、２０１１年までの間、多発性骨髄腫の全５年生存率は４９％にとどまり（Kazandjian, Seminars in Oncology 43(6): 676-681, 2016）、療法により疾患が寛解することはあっても、完治はしないと考えられている。したがって、新たな治療が必要である。
【0008】
細胞がタンパク質分泌過多を呈することを特徴とする病状の別の例としては、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、すなわち、リンパ節、脾臓、または骨髄でのＢリンパ球のクローン増殖を特徴とする癌がある。癌組織（いわゆる偽濾胞）中で増殖するＣＬＬ芽細胞（芽球）は、細胞分裂を起こす前に、モノクローナル抗体を分泌する（Darwiche et al., Frontiers in Immunology 9:683, 2018）。
【0009】
タンパク質分泌過多を特徴とする病状のその他の例としては、調節不全の形質細胞により自己抗体を産生することに関連する自己免疫疾患がある。かかる病状の例の一つは、ループス（狼瘡）（全身性エリテマトーデス（紅斑性狼瘡、ＳＬＥ）としても知られる）である。ループスでは、調節不全のＢ細胞の分化が、細胞核組成に対する自己抗体（抗核抗体（ＡＮＡ）など）を産生する形質細胞を発生（development）させる。ループスにおける自己抗体の特に共通する標的としては、二本鎖ＤＮＡ、およびリボ核タンパク質などがある。かかる自己免疫疾患の別の例は、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）であり、調節不全の形質細胞が、血小板表面構造に対する抗体を産生し、血小板欠乏を起こし、その結果、血液凝固欠損を起こす。かかる自己免疫疾患の有効な治療が必要である。
【0010】
本発明者らは、以前に、特定の既知のＡＬＫ阻害剤が、ＬＴＫの阻害に有効であることを示した（Centonze et al.、上記参照）。本発明者らは、臨床的に承認されたＡＬＫ阻害剤でＬＴＫを標的にすることで、多発性骨髄腫細胞や増殖しているＣＬＬ芽球などの分泌過多の細胞の、小胞体ストレスに対する感受性を高め、アポトーシスを誘導することを、現在、実証している。同様に、アポトーシス促進効果が、様々な自己免疫疾患で高レベルの自己抗体を分泌する調節不全形質細胞で起こる。それに伴い、ＡＬＫ阻害剤はＡＬＫPos癌の治療に対する有用性がかなり限定的であると以前は考えられてきたが、本発明は、ＡＬＫNegＬＴＫPos癌（特にＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫、およびＡＬＫNegＬＴＫPos ＣＬＬ）、およびＡＬＫ－／ＬＴＫ＋である細胞によって特徴づけられる形質細胞媒介性疾患の治療における、いくつかのかかる薬剤の新たな使用を提供する。本発明者らは、ＬＴＫ＋ＡＬＫ－ノックダウン細胞株またはＡＬＫ－ノックダウン細胞株がＡＬＫ阻害に対して感受性があるままなので、ＡＬＫ阻害剤の効果がＡＬＫ発現から独立していることを示している。
【0011】
したがって、本発明は、第一の態様において、対象における癌または形質細胞媒介性疾患の治療に使用するためのＡＬＫの線状阻害剤（linear inhibitor）を提供し、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞によって特徴づけられる。
【0012】
本発明は、同様の態様において、対象における癌または形質細胞媒介性疾患を治療する方法を提供し、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞によって特徴づけられ、前記方法は、前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
【0013】
また、対象におけるＡＬＫ陰性癌を診断し治療する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について、前記癌を調べること；および
（ｉｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であると分かった場合、前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について、前記癌を調べること；および
（ｉｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であると分かった場合、前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
【0014】
同様に、本明細書において、対象におけるＡＬＫ陰性癌を診断し治療する方法が提供され、前記方法は、
（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であることを判定すること；および
前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
（ｉ） 前記対象における癌を診断すること；
（ｉｉ） 前記癌がＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性であることを判定すること；および
前記癌を治療するのに有効な量のＡＬＫの線状阻害剤を、前記対象に投与することを含む。
【0015】
他の態様において、本発明は、対象における癌または形質細胞媒介性疾患を治療するための医薬品の製造における、ＡＬＫの線状阻害剤の使用を提供し、前記癌または形質細胞媒介性疾患は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞によって特徴づけられる。
【0016】
他の態様において、本発明は、プロテアソーム阻害剤耐性癌の治療に使用するための、ＡＬＫの線状阻害剤を提供する。前記プロテアソーム阻害剤耐性癌は、好ましくはプロテアソーム阻害剤耐性多発性骨髄腫である。前記プロテアソーム阻害剤耐性癌は、ＬＴＫ陽性の癌であってもよく、特にＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫であってもよい。
【0017】
下記に詳細に述べられるように、前記対象は、哺乳類の対象であればよいが、前記態様の、ある好ましい実施形態において、前記対象はヒト対象である。
【0018】
上述のように、本発明者は、いくつかの公知のＡＬＫ阻害剤（本明細書において、ＡＬＫの阻害剤ともいう）もまた、ＬＴＫの阻害に有効であることを発見した。特に、実施例に示されるように、線状ＡＬＫ阻害剤がＬＴＫの阻害に有効であることを見出した。ただし、環状ＡＬＫ阻害剤は効果が無いことを見出した。ＡＬＫとＬＴＫは関連タンパク質である（それらの細胞質キナーゼドメインは、ヒトにおいて７９％同一である。Centonze et al.、上記参照）が、あるＡＬＫ阻害剤がＬＴＫに対して交差特異性を示すこと、一方、他の阻害剤は示さないこと、は予想され得なかった。
【0019】
本明細書で述べられているように、ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫ（特にヒトＡＬＫ）と相互作用しその活性を低減または無効にすることができる化合物である。ヒトＡＬＫのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＱ９ＵＭ７３である。ＡＬＫ阻害剤は、全長、野生型のＡＬＫと、ＡＬＫ融合タンパク質との両方の活性を阻害できる。Chand et al. (Disease Models & Mechanisms 6: 373-382, 2013、この参照により本明細書に援用される）に記載されているように、ＡＬＫ阻害の活性について化合物を試験する多数の方法が知られている。たとえば、ＡＬＫ活性化は、Ｔｙｒ１２７８の自己リン酸化を必要とする。ＡＬＫの活性の阻害は、したがってＴｙｒ１２７８自己リン酸化を阻害し、これは抗リン酸化ＡＬＫ（Ｙ１２７８）抗体を使用するイムノブロットによって検出されうる。かかる抗体は市販されている（たとえば、抗体＃３７１０、Cell Signaling Technology社、米国）。したがって、化合物がＡＬＫ阻害の活性を有する（すなわち、ＡＬＫ阻害剤である）かどうかを判定するために、ヒトＡＬＫを発現している細胞に目的の化合物を適用し、前記細胞を溶解させ、Ｔｙｒ１２７８のＡＬＫ自己リン酸化を解析してもよい。
【0020】
ＡＬＫ阻害についての他の検査方法も知られている。たとえば、Chand et al．（上記参照）に記載されているように、Ｔｙｒ１６０４のＡＬＫ自己リン酸化、および／または、ＥＲＫやＳＴＡＴ３などのＡＬＫ基質のリン酸化の分析が知られている。
【0021】
当該技術分野において、いくつかのＡＬＫ阻害剤が知られており、現在までに、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、エントレクチニブ、および、ロルラチニブの６つが、医療的使用の承認を受けている。その他に知られているＡＬＫ阻害剤としては、ベリザチニブがある。
【0022】
本明細書に記載の使用のための前記ＡＬＫ阻害剤はまた、ＬＴＫの阻害、特にヒトＬＴＫの阻害にも有効である。ヒトＬＴＫのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＰ２９３７６である。「ＬＴＫの阻害に有効」とは、阻害剤がＬＴＫ（特にヒトＬＴＫ）と相互作用することができ、ＬＴＫの活性を低減する、または無効にすることができることを意味する。ＬＴＫ阻害の活性について化合物を試験する方法が知られており、下記の実施例で説明される。特に、ＬＴＫ活性化はＴｙｒ６７２の自己リン酸化を必要とし、これはＴｙｒ１２７８のＡＬＫの自己リン酸化と同等である。リン酸化ＡＬＫ（Ｙ１２７８）を認識する多くの抗体が、リン酸化ＬＴＫ（Ｙ６７２）をも認識する。リン酸化ＬＴＫ（Ｙ６７２）を検出するための好適な抗体が市販されている（たとえば、抗体Ｄ５９Ｇ１０、Cell Signaling Technology社）。したがって、化合物がＬＴＫ阻害の活性を有する（すなわち、ＬＴＫの阻害剤である）かどうかを判定するために、ヒトＬＴＫを発現している細胞に当該化合物を適用し、前記細胞を溶解させ、Ｔｙｒ６７２のＬＴＫ自己リン酸化を解析してもよい。
【0023】
前述のように、本発明者は、線状ＡＬＫ阻害剤がＬＴＫ阻害の活性も有し、その一方で環状ＡＬＫ阻害剤はＬＴＫに対して効果が無いことを発見した。「線状（linear）」ＡＬＫ阻害剤とは、分子コアとして機能する中心環（すなわち、すべての官能基がそこから出ているような中心環）が無いＡＬＫ阻害剤を意味する。かかる環を、本明細書において環状の分子コアと称する。線状ＡＬＫ阻害剤は、それにもかかわらず、フェニル基などの環状官能基を含んでもよい。しかしながらこの例では、すべての官能基および側鎖が同じ環状構造（またはその一部）から延在するわけではない。換言すれば、「線状ＡＬＫ阻害剤」という用語は、別個の画定された端部を持たない「円形」構造（すなわち、円形の骨格）を有するという意味での環状化された分子を含まない。環状の分子コアを含むＡＬＫ阻害剤は、環状ＡＬＫ阻害剤であり、または別の表現をすれば、環状化された、または円形の、ＡＬＫ阻害剤である。
【0024】
環状ＡＬＫ阻害剤の例としては、ロルラチニブがあり、これは式Ｉに記載された構造を有する。示されているように、ロルラチニブは１２員環を含み、この１２員環は、分子のコアを形成する。このコア環を有するので、ロルラチニブは環状ＡＬＫ阻害剤である。ロルラチニブは、ＬＴＫ阻害の活性を有さないことがわかっている。
【化1】
【0025】
線状ＡＬＫ阻害剤は、環状の分子コアの無い構造を有している。線状ＡＬＫ阻害剤はむしろ、互い直列につながった多くの官能基を含む。線状ＡＬＫ阻害剤の例には、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、エンサルチニブ、アレクチニブ、およびエントレクチニブがある。クリゾチニブ（３－［（１Ｒ）－１－（２，６－ジクロロ－３－フロロフェニル）エトキシ］－５－（１－ピペリジン－４－イルピラゾール－４－イル）ピリジン－２－アミン）の構造を、式ＩＩに示す；セリチニブ（５－クロロ－２－Ｎ－（５－メチル－４－ピペリジン－４－イル－２－プロパン－２－イルオキシフェニル）－４－Ｎ－（２－プロパン－２－イルスルフォニルフェニル）ピリミジン－２，４－ジアミン）の構造を、式ＩＩＩに示す；ブリガチニブ（５－クロロ－４－Ｎ－（２－ジメチルホスホリルフェニル）－２－Ｎ－［２－メトキシ－４－［４－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピペリジン－１－イル］フェニル］ピリミジン－２，４－ジアミン）の構造を、式ＩＶに示す；エンサルチニブ（６－アミノ－５－［（１Ｒ）－１－（２，６－ジクロロ－３－フロロフェニル）エトキシ］－Ｎ－［４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ジメチルピペラジン－１－カルボニル］フェニル］ピリダジン－３－カルボキシアミド）の構造を、式Ｖに示す；アレクチニブ（９－エチル－６，６－ジメチル－８－（４－モルホリン－４－イルピペリジン－１－イル）－１１－オキソ－５Ｈ－ベンゾ［ｂ］カルバゾール－３－カルボニトリル）の構造を、式Ｖに示す；エントレクチニブ（Ｎ－［５－［（３，５－ジフロロフェニル）メチル］－１Ｈ－インダゾール－３－イル］－４－（４－メチルピペラジン－１－イル）－２－（オキサン－４－イルアミノ）ベンザミド）の構造を、式ＩＶに示す。
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【0026】
式ＩＩ～ＶＩＩに見られるように、前記線状ＡＬＫ阻害剤は、環状の分子コアが無い。例示された前記線状ＡＬＫ阻害剤はすべて、環状の基（たとえばフェニル基）を含むが、それらの中には、すべての官能基がそこから出ているような中心環を形成しているものは無い。
【0027】
非線状の、「環状」のＡＬＫ阻害剤において、環状の分子コアがＡＬＫ阻害剤内で最大の環状基であってもよい。特に、環状の分子コアの員数は、分子内の他の環状基の員数よりも少なくとも２大きくてもよい。違う言い方で定義すれば、環状の分子コアは、少なくとも８員環、たとえば９員環、１０員環、１１員環、または１２員環であってもよい。ロルラチニブの環状の分子コアは１２員環である。上述のように、線状ＡＬＫ阻害剤は、環状の分子コアを有さないＡＬＫ阻害剤である。
【0028】
本発明に係るＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫNegかつＬＴＫPosである細胞によって特徴づけられる癌または形質細胞媒介性疾患の治療に使用するためものである。ＡＬＫNegかつＬＴＫPosである細胞によって特徴づけられる癌は、癌を構成する悪性細胞がＬＴＫを発現するがＡＬＫを発現しない、という癌である。すなわち、本発明に従って治療される癌は、ＡＬＫNeg（ＡＬＫ陰性）かつＬＴＫPos（ＬＴＫ陽性）である。
【0029】
本明細書で使用される、ＡＬＫPos（ＡＬＫ陽性）癌とは、いかなる形態のＡＬＫタンパク質を発現する癌を意味し、野生型タンパク質、ＡＬＫ融合タンパク質、または変異した全長タンパク質（たとえば、機能獲得型変異を含む）としてのＡＬＫタンパク質を発現する癌を意味する。癌がＡＬＫを発現するかどうかを判定する方法は、当該技術分野において標準的であり、ＡＬＫ阻害剤治療が承認されている癌、特に、ＮＳＣＬＣについてのＡＬＫ発現の状況を判定するために、現在普通に使用されている。
【0030】
かかる方法は、典型的には、癌の生検サンプルに対して行われる。ＡＬＫ発現を検出するための好適な方法の例は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＡＬＫ発現検出用ＩＨＣキットは、規制上の承認を受けており、市販されている。かかるキットの例としては、ＡＬＫ発現の検出に使用されうるVentana ALK (D5F3) CDx Assay（Roche社、スイス）がある。その他のかかるキットも使用してもよい。
【0031】
特定の実施形態において、規制上の承認をうけているＡＬＫ発現検査において陽性の結果が出た癌は、ＡＬＫ陽性とみなされ、かかるＡＬＫ発現検査で陰性の結果が出た癌は、ＡＬＫ陰性とみなされる。熟練した病理学者であれば、組織サンプルがＡＬＫPosかＡＬＫNegか普通に判断できる。
【0032】
このように、ＡＬＫNeg癌は、ＡＬＫの発現について癌組織を解析した時にＡＬＫ陰性であると判断される癌であってもよい。特に、ＡＬＫNeg癌は、ＡＬＫ発現がＩＨＣによって検出されない癌であってもよい。たとえば、ＡＬＫ陰性癌は、ＡＬＫ発現検出の規制上の承認を受けた解析によると陰性の結果となる癌であってもよい。特定の実施形態において、ＡＬＫNeg癌は、Ventana ALK (D5F3) CDx Assayによると陰性の結果となる癌である。
【0033】
ＡＬＫ遺伝子再構成は、たとえば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、ゲノムレベルで直接検出してもよい。特にbreak-apart FISHをＡＬＫ遺伝子再構成を検出するために使用してもよく、好適なbreak-apart FISHキットが市販されており（たとえば、Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit、Abbott Molecular社、米国、製品番号０６Ｎ３８－０２３）、また、熟練技術者により設計することができる。ＤＮＡレベルでのＡＬＫ遺伝子再構成を呈する癌は、本明細書においてＡＬＫPos癌と定義される。前述のように、本発明は、ＡＬＫ癌の治療に関する。
【0034】
同様に、ＬＴＫPos癌は、検出可能なレベルのＬＴＫの発現を有する癌である。ＡＬＫの検出と同様に、当該技術分野で標準的な方法を使用してＬＴＫの発現を検出することができる。かかる方法は、典型的には生検サンプルに対して行われてもよい。たとえば、ＬＴＫタンパク質の発現を直接検出するために、免疫組織化学（たとえば免疫蛍光染色）を利用してもよい。ｍＲＮＡレベルでＬＴＫの発現を検出するために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を信頼して使用してもよい。ＬＴＫ ＰＴ－ＰＣＲでの使用に好適なプライマーは、熟練技術者により設計することができる。好ましくは、ｑＰＣＲは、ＬＴＫの発現を検出するために使用される。ＬＴＫ ｑＰＣＲでの使用に好適なプライマーは、熟練技術者により設計することができ、また、市販もされている（たとえば、LTK QuantiTect primer assay、Qiagen社、カタログ番号ＱＴ００２１９８７７）。
【0035】
このように、本発明にしたがって、当該技術分野において標準的な方法を使用して、対象において癌を診断してもよい。その後、ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について、前記癌を調べてもよい。ＡＬＫおよびＬＴＫ発現検査のために、生検サンプルを取得してもよい。癌の診断に生検サンプルが使用される場合、ＡＬＫおよびＬＴＫの発現検査に、同一の生検サンプルを使用してもよく、または、異なる生検サンプルを使用してもよい。前記生検サンプルは、癌のタイプに適したなんらかの手段で取得すればよい。たとえば、前記生検サンプルは、直視下生検によって取得してもよく、たとえば、摘出生検サンプルであってもよい。または、前記サンプルは、針生検によって取得してもよい。多発性骨髄腫やＣＬＬなど、血液癌の場合、生検サンプルは、骨髄生検によって取得してもよく（骨髄腫またはＣＬＬ）、または血液サンプルであってもよい（ＣＬＬ）。熟練した医師であれば、適切な生検サンプルを取得できる。
【0036】
生検サンプルは、たとえば血液から取得される、液体生検サンプルであってもよい。特に、上述したように、末梢循環腫瘍細胞を単離して、ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について解析してもよい。多発性骨髄腫の診断と特徴把握のための液体生検法が、Kamande et al. （Integrative Biology 10(2): 82-91, 2018）に開示され、この方法を、上述したように、ＡＬＫおよびＬＴＫの発現について調べるために使用してもよい。調べられた癌がＡＬＫNegＬＴＫPosであるとわかれば、本発明に係るＡＬＫ阻害剤で治療してもよい。
【0037】
このように、上記の技術を使用して、癌がＡＬＫNegかつＬＴＫPosであるかどうかを実験的に判定してもよい。または、ある例において、癌が、その癌の既知の特徴に基づいてＡＬＫNegかつＬＴＫPosであると推定してもよい。このように、事情が許せば、実験的な確認が無くとも判定されることがあってもよい。
【0038】
本明細書で使用される「癌」という用語は、当該技術分野における通常の意味、すなわち、悪性腫瘍性の病状、という意味で使用されている。本発明に従って治療される癌は、固形癌および血液癌の両方を含む、いかなる種類の癌であってもよい。ＡＬＫNegかつＬＴＫPosであるいかなる癌も、本発明に従って治療してもよい。
【0039】
ある実施形態において、本発明に従って治療される癌は、ＲＯＳ１陰性（ＲＯＳ１Neg）である。ＲＯＳ１は、ＡＬＫに関連するチロシンキナーゼである。正常な発生（development）におけるその役割は不明だが、いくつかの癌で異常に発現するとわかっている。多くのＡＬＫ阻害剤がＲＯＳ１の阻害の活性を示し、かかるＡＬＫ阻害剤（たとえばクリゾチニブ）がＲＯＳ１Pos癌の治療に有用であるとわかっている。ヒトＲＯＳ１のＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＰ０８９２２である。癌という文脈では、ＲＯＳ１は、遺伝子再構成の結果生じ、融合タンパク質内に発現することがわかっている。いくつかの発癌性ＲＯＳ１融合タンパク質が知られており、ＲＯＳ１はそこで恒常的に活性であり、ＦＩＧ、ＣＤ７４、ＴＰＭ３、ＳＤＣ４、およびＳＬＣ３４Ａ２などとの融合を含む。
【0040】
ＲＯＳ１陰性癌は、ＲＯＳ１の検出可能な発現を呈しないものもある。しかしながら、ＲＯＳ１の発現は、健康な成人のヒトの組織に見られる。したがって、ＲＯＳ１Neg癌は、より好ましくは、ＲＯＳ１の発現に起因するわけではない癌として定義されうる。特に、ＲＯＳ１Neg癌は、遺伝子再構成が起こることで生じる変異ＲＯＳ１を発現しない癌として定義されてもよい。特に、ＲＯＳ１Neg癌は、ＲＯＳ１融合タンパク質を発現しない。これは、「ＲＯＳ１陽性」（ＲＯＳ１Pos）という用語が、ＲＯＳ１融合タンパク質を発現する癌を称するために一般的に使用されるという、当該技術分野で使用される用語法と一貫している。
【0041】
癌にＲＯＳ１が関係すること、特にＲＯＳ１融合タンパク質の役割、およびかかるタンパク質がどのように検出されうるか、については、Davies & Doebele, Clinical Cancer Research 19(15): 4040-4045, 2013に記載されている。ＲＯＳ１融合タンパク質の発現は、当該技術分野に公知のなんらかの方法、たとえば、ｑＰＣＲまたは免疫組織化学法を使用して、検出してもよい。または、ＲＯＳ１遺伝子再構成は、たとえばＦＩＳＨによって（ＲＯＳ１遺伝子再構成の検出用の“break-apart” FISH assayは、Davies et al., Clinical Cancer Research 18(17): 4570-4579, 2012に記載されており、この参照により本明細書に援用される）、または次世代ゲノムシーケンシングによって、ＤＮＡレベルで直接検出してもよい。このように、本発明に従って治療される癌は、ＡＬＫNegかつＲＯＳ１NegかつＬＴＫPosであってもよい。
【0042】
別の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、ＮＴＲＫ融合陰性（本明細書において、ＮＴＲＫ－ｆ陰性、ＮＴＲＫ－ｆNegともいう）である。ヒトには三つのＮＴＲＫ遺伝子：ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３（それぞれ、ＴｒｋＡ，ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣをコードする）がある。ＴｒｋＡのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＰ０４６２９である；ＴｒｋＢのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＱ１６６２０である；ＴｒｋＣのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号はＱ１６２８８である。前記Ｔｒｋタンパク質は、ＡＬＫに関連する受容体チロシンキナーゼである。ＡＬＫやＲＯＳ１と同様に、Ｔｒｋ遺伝子再構成は、癌と関連すること、特に、恒常的に活性なＴｒｋ融合タンパク質を生む再構成と、関連することがわかっている。Ｔｒｋタンパク質とＴＰＭ３、ＣＤ７４、ＴＲＩＭ２４、およびＥＴＶ６などとの融合を含む、いくつかのかかる発癌性Ｔｒｋ融合タンパク質が知られている。
【0043】
ＮＴＲＫ－ｆNeg癌は、遺伝子再構成が起こることで生じる変異Ｔｒｋタンパク質、特にＴｒｋ融合タンパク質を発現しない癌である。当該技術分野においてＮＴＲＫ遺伝子の検出方法は既知であり、Hsiao et al., Journal of Molecular Diagnostics 21(4): 553-571で考察されている。好適な方法には、免疫組織化学（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ融合タンパク質に結合可能なｐａｎ－Ｔｒｋ抗体を利用）、ＦＩＳＨ（特にbreak-apart FISH）、ｑＰＣＲ、および次世代ＤＮＡシーケンシングなどがある。このように、本発明に従って治療される癌は、ＡＬＫNegかつＮＴＲＫ－ｆNegかつＬＴＫPosであってもよい。特定の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、ＡＬＫNegかつＲｏｓ１NegかつＮＴＲＫ－ｆNegかつＬＴＫPos（ＡＬＫNegＲｏｓ１NegＮＴＲＫ－ｆNegＬＴＫPos）である。
【0044】
本発明に従って治療される癌は、タンパク質分泌過多に関連する癌であってもよい。タンパク質分泌過多に関連する癌は、高い代謝活性を有し、他の細胞よりも有意に多いタンパク質を分泌する癌である。タンパク質分泌過多に関連する癌の例は、多発性骨髄腫であり、これは、Ｍタンパク質として知られるモノクローナル免疫グロブリンの分泌過多と関連する。多発性骨髄腫は、タンパク質分泌過多を呈する癌性の形質細胞である。下記にさらに詳細を示すように、ＣＬＬ細胞はまた、ＬＴＫを発現し、ＡＬＫ陰性であり、増殖状態ではＡＬＫ阻害剤の標的となる。本明細書において、ＣＬＬ細胞は、タンパク質分泌過多を呈する癌性の芽細胞である。下記にさらに詳細を示すように、非癌性形質細胞もまた、ＬＴＫを発現し、ＡＬＫ陰性であり、ＡＬＫ阻害剤の標的となる。
【0045】
特定の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫（単に「骨髄腫」としても知られる）は、上述したようにクローン形質細胞の癌である。多発性骨髄腫は、血液および／または尿中のＭタンパク質の存在に基づいて診断されてもよい。より一般的には、多発性骨髄腫は、骨髄生検を行い、骨髄に占める形質細胞の割合を測定することで診断される。多発性骨髄腫に特有の骨格中の渙散性病変を特定するために、医用撮像（たとえば、Ｘ線、ＭＲＩスキャン、およびＰＥＴ／ＣＴスキャン）を行ってもよい。多発性骨髄腫はこのように、当該技術分野において標準的な方法を使用して特定してもよい。ＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫は、本発明に係るＡＬＫ阻害剤で治療してもよい。
【0046】
下記実施例では、ＡＬＫ阻害剤がＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫の生存率を低減することに有効であることを示している。下記実施例に示されているように、多発性骨髄腫のかなりの割合がＡＬＫNegである（７６７人の患者からの多発性骨髄腫の＞９９．８％）。このように、本発明は、その利点として、多発性骨髄腫患者の、かなりのＬＴＫPosサブセット（後述する７６７人の患者の解析に基づくと、多発性骨髄腫患者の８０％を超えると推定される）に対して新たな治療の選択肢を提供する。
【0047】
別の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、Ｂ細胞性の悪性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。本発明者らに解析された１０７人のＣＬＬ患者のうち、９４人（９４／１０７（８８％））がＬＴＫを発現したＣＬＬ細胞を有し、誰もＡＬＫを発現したＣＬＬ細胞を有さなかった。このように、調べられたＣＬＬ患者の大部分がＡＬＫNegＬＴＫPos癌を有していた。ＣＬＬ細胞は、リンパ組織または骨髄で、癌支持細胞がＣＬＬ細胞分裂を活性化する偽濾胞において、分裂する。悪性ＣＬＬ細胞が、増殖状態の芽球と称される活性化された大きな癌細胞になる。この状態で、ＣＬＬ細胞はまた分泌過多になり、モノクローナルＩｇ（Ｍタンパク質）を分泌する。ＣＬＬ患者は、ＩｇＶＨ変異ＣＬＬおよびＩｇＶＨ非変異ＣＬＬという癌の二種類の形態のうちの一つを有してもよい。ＣＬＬのＩｇＶＨ変異およびＩｇＶＨ非変異の型のどちらも、ＡＬＫ阻害剤によって死滅しやすく、したがってＩｇＶＨ変異ＣＬＬおよびＩｇＶＨ非変異ＣＬＬのどちらも本発明に従って治療されうる。以前に治療を受けた患者、および治療を受けていない患者からのＣＬＬ癌細胞は、ＡＬＫ阻害剤により死滅しやすい。このように、ＡＬＫ阻害剤は、ＣＬＬ（たとえば、新たに診断されたＣＬＬ、または新たに症状が出たＣＬＬ）の第一選択治療として、または再燃したＣＬＬの治療のために、本発明に従って使用されてもよい。
【0048】
別の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、ＡＬＫNegＬＴＫPos肝癌である。肝癌とは、原発性肝癌を意味し、体の他の場所から肝臓へ転移した続発性肝癌は意味しない。肝細胞癌、胆管細胞癌、およびその他の肝癌の珍しいタイプを含む、肝癌のすべてのタイプは、本発明に従って治療してもよい。
【0049】
ＬＴＫおよびＡＬＫは、すべての哺乳動物に発現する。従って、本発明はいかなる哺乳類の対象の治療にも及ぶものである。このように、前記対象は、ヒト対象に加えて、家畜動物、飼育動物、または競技用動物であってもよい。本発明は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物におけるＡＬＫNegＬＴＫPos癌の治療を含む。本発明に従って治療されてもよい非ヒト哺乳動物の例としては、イヌ（イヌ科）、ネコ（ネコ科）、およびウマ（ウマ科）が含まれる。
【0050】
本発明に従って治療される癌は、ステージＩの癌、ステージＩＩの癌、ステージＩＩＩの癌、またはステージＩＶの癌など、いかなるステージであってもよい。このように、本発明に従って治療される癌は、限局性であってもよいし、または体中に広がっていてもよい。多発性骨髄腫に関していえば、骨髄腫は、国際病期分類（International Staging System）による分類として、ステージ１、ステージ２、またはステージ３であってもよい。本発明に従って治療される癌は、癌の再発であってもよく、たとえば、本発明が再燃した（relapsed）または再発した（recurrent）多発性骨髄腫またはＣＬＬの治療に使用されてもよい。本発明に係る多発性骨髄腫の治療は、くすぶり型骨髄腫（smouldering myeloma）の治療を含む。くすぶり型骨髄腫は、活性多発性骨髄腫の前兆である。くすぶり型骨髄腫の治療により、活性な多発性骨髄腫への進行を予防したり遅延させたりしてもよい。
【0051】
本発明に従って治療される癌は、ヒト対象（または患者）に存在する。本発明に従って治療される患者は、ＡＬＫNegＬＴＫPos癌と診断された患者である。かかる診断は、上述したように行うことができる。特定の実施形態において、本発明に従って治療される患者は、ＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫と診断された患者である。または、前記患者はＡＬＫNegＬＴＫPosＣＬＬと診断されていてもよい。または、前記患者はＡＬＫNegＬＴＫPos原発性肝癌と診断されていてもよい。前記患者はいかなる年齢でもよく、男性でも女性でもよい。
【0052】
上述したように、タンパク質分泌過多に関連する癌（特に多発性骨髄腫）は、通常、プロテアソーム阻害剤で治療される。現在まで、ボルテゾミブ（式ＶＩＩＩ）、カルフィルゾミブ（式ＩＸ）、およびイキサゾミブ（式Ｘ）の、三つのプロテアソーム阻害剤が、多発性骨髄腫の治療用に承認されている。
【化8】
【化9】
【化10】
【0053】
当該技術分野では他のプロテアソーム阻害剤も多数知られており、そのうちのマリゾミブ、オプロゾミブ、およびＭＧ１３２など、いくつかは、癌治療の臨床治験が行われている。
【0054】
特定の実施形態において、本発明に従って治療される癌は、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある。プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある癌は、プロテアソーム阻害剤によって増殖が阻害されない癌である。すなわち、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある癌は、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に応答しない癌、すなわち、プロテアソーム阻害剤を使用した治療にもかかわらず、増殖または進行を継続する癌である。
【0055】
プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある癌は、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に本質的に耐性があってもよい。前述のように、タンパク質分泌過多を特徴とする癌は、プロテアソーム阻害剤療法に対して特に感受性がある。これは、タンパク質分泌過多を特徴とする癌におけるタンパク質の合成レベルが上がった結果、小胞体（ＥＲ）におけるミスフォールドタンパク質のレベルが上がり、小胞体ストレスを起こすからである。これは、プロテアソームによるミスフォールドタンパク質の分解によって軽減される。プロテアソーム阻害は、ミスフォールドタンパク質の分解を抑制し、したがって小胞体ストレスの軽減を抑制し、細胞死を引き起こす。一方で、タンパク質分泌過多に関連しない癌はプロテアソーム阻害に影響を受けにくく、したがってプロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がありうる。
【0056】
阻害剤と結合する部位でプロテアソームに変異があることにより、プロテアソーム阻害剤治療に本質的に耐性がある癌もある。たとえば、ヒトプロテアソームのβ５サブユニットのＡ４９Ｔ変異が、ボルテゾミブ耐性と関連していることがわかっている。癌がプロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性を持ちうるメカニズムは、Wallington-Beddoe et al., British Journal of Haematology 182(1): 11-28, 2018で考察されている。
【0057】
プロテアソーム阻害剤を使用した治療に本質的に耐性がある癌は、プロテアソーム阻害剤治療に全く応答しない癌、すなわち、プロテアソーム阻害剤を患者に投与した最初の時に、癌がその治療に応答せずに増殖および／または進行を継続する癌である。
【0058】
または、プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある癌は、プロテアソーム阻害剤耐性を獲得したものでもありうる。プロテアソーム阻害剤耐性を獲得した癌は、初期にはプロテアソーム阻害剤を使用した治療に応答したが、その後この治療に対する応答性を失っている癌である。このようにプロテアソーム阻害剤療法に対する応答性が失われることにより、治療中の患者に癌の再燃または再発を起こすことがある。特にプロテアソームにおける変異が発生（development）し阻害剤の結合を阻むなど、上記に述べた、またWallington-Beddoe et al.（上記参照）で考察されている、一つ以上のメカニズムにより、癌がプロテアソーム阻害剤に対する耐性を獲得することがある。
【0059】
プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある癌は、一つ以上のプロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性があってもよい。異なるプロテアソーム阻害剤は、プロテアソームに対する異なる結合特性を有し、したがって、癌があるプロテアソーム阻害剤に対しては耐性があるが、別のプロテアソーム阻害剤を使用した治療には感受性がありうることが知られている。特定の実施形態において、癌はボルテゾミブを使用した治療に耐性がある。別の実施形態において、癌はカルフィルゾミブを使用した治療に耐性がある。別の実施形態において、癌はイキサゾミブを使用した治療に耐性がある。癌は、すべてのプロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性を有していてもよく、特に癌治療について認可を受けたすべてのプロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性を有していてもよい。プロテアソーム阻害剤を使用した治療に耐性がある前記癌は、多発性骨髄腫であってもよく、特に、ボルテゾミブ治療に耐性がある多発性骨髄腫であってもよい。
【0060】
「形質細胞媒介性疾患」とは、調節不全の形質細胞、または形質細胞に産生された抗体が、健康を害しているような疾患または病状を意味する。すなわち、形質細胞の活性が引き起こす、または寄与する、なんらかの疾患または病状が、形質細胞媒介性疾患である。形質細胞媒介性疾患において、形質細胞が産生する抗体が、患者において組織損傷を引き起こす。かかる疾患は、調節不全の形質細胞からの抗体の分泌過多に関連することがよくある。本発明は、ＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性である細胞を特徴とする、形質細胞媒介性疾患の治療に使用するためのＡＬＫの線状阻害剤を提供する。これに関していうと、ＡＬＫNegかつＬＴＫPosである前記細胞は、前記疾患を媒介する形質細胞である。
【0061】
形質細胞媒介性疾患の例としては、全身性エリテマトーデスやＩＴＰ、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）など、多数の自己免疫疾患がある。ＧＶＨＤがＴ細胞媒介疾患であると主に考えられる時もある一方で、慢性拒絶反応で重要なＢ細胞成分を有することもある。ここで、調節不全形質細胞が自己抗体を産生し、これが遅延した移植片拒絶および疾患の影響に大きく寄与する。したがって、本明細書において、ＧＶＨＤを形質細胞媒介性疾患と考える。
【0062】
本明細書において定義されるように、「形質細胞」とは、形質細胞株の細胞のすべてのタイプ、すなわち、成熟形質細胞およびその前駆体を意味する。本明細書において、形質細胞は、抗体分泌形質芽細胞およびその他の抗体分泌Ｂ細胞芽球を含む、末端分化Ｂ細胞と定義される。このように、「形質細胞」には、成熟形質細胞、および短命の形質芽細胞がある。当業者に知られているように、活性化されたメモリーＢ細胞芽球は、ＣＤ２０を発現してもよく、ＣＤ２０は、ＣＤ３８HiＣＤ１３８Negである形質芽細胞で失われてもよい。形質細胞は、ＣＤ３８HiＣＤ１３８PosＣＤ１９+またはＣＤ３８HiＣＤ１３８PosＣＤ１９Neg末端分化形質細胞であってもよい。
【0063】
このように、本発明にしたがって、線状ＡＬＫ阻害剤が自己免疫疾患に使用されてもよく、特に自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患の治療のために使用されてもよい。本発明に従って治療可能な自己免疫疾患の例としては、ループスおよびＩＴＰがある。本発明はまた、線状ＡＬＫ阻害剤を使用したＧＶＨＤの治療を提供する。前述のように、非癌性形質細胞（たとえば形質芽細胞および成熟形質細胞）は、ＡＬＫNegＬＴＫPos表現型を有することを特徴とし、したがって本発明に従って治療されるいずれかの形質細胞媒介性疾患（自己免疫疾患またはＧＶＨＤなど）はＡＬＫNegＬＴＫPosである形質細胞によって媒介され、ただし形質細胞のＡＬＫおよびＬＴＫの表現型は、上述したように実験により判定されてもよい。
【0064】
前述のように、ＬＴＫおよびＡＬＫがすべての哺乳動物に発現するので、本発明は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む、いかなる哺乳類の対象においても自己免疫疾患を治療するための線状ＡＬＫ阻害剤を提供し、特にＡＬＫNegＬＴＫPos形質細胞による自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患を治療するための線状ＡＬＫ阻害剤を提供する。本発明に従って治療されてもよい非ヒト哺乳動物の例には、イヌ（イヌ科）、ネコ（ネコ科）、およびウマ（ウマ科）がある。
【0065】
前述のように、線状ＡＬＫ阻害剤はＬＴＫを阻害することがわかっている。したがって、本発明に係る癌または形質細胞媒介性疾患の治療に使用されるＡＬＫ阻害剤は、阻害剤がＬＴＫに対する活性も有しさえすれば、いずれの公知のＡＬＫ阻害剤であってもよい。このように、本明細書で規定され記載された本発明の様々な態様において、前記ＡＬＫ阻害剤は、ＬＴＫを阻害することができるＡＬＫ阻害剤とも定義されてもよく、または特にＬＴＫの活性を阻害することができるＡＬＫ阻害剤とも定義されてもよい。
【0066】
ある実施形態において、前記ＡＬＫ阻害剤は、下記式ＸＩに記載された一般構造を有する。
式ＸＩのＡＬＫ阻害剤において、Ｒ1はＣＨ3またはｉＰｒであり、Ｒ2はＨまたはＣＨ3であり、
【化11】
【化12】
【0067】
本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、特に、セリチニブ（式ＩＩＩ）であってもよい。セリチニブは、商品名がジカディア（Zykadia）であり、これも市販されている（たとえば、ケイマンケミカル（Cayman Chemical、米国）から、品番１９３７４）。
【0068】
ＮＳＣＬＣの治療におけるセリチニブの標準的な投薬計画は、一日一回４５０ｍｇ経口用量である。本発明の特定の実施形態において、セリチニブを使用した治療は、約４５０ｍｇのセリチニブの一日一回の用量、好ましくは、４５０ｍｇセリチニブの一日一回の用量を投与することを含む。別の実施形態において、前記治療は、約３００ｍｇのセリチニブまたは約１５０ｍｇのセリチニブの一日一回の用量、好ましくは３００ｍｇのセリチニブまたは１５０ｍｇのセリチニブの一日一回の用量を投与することを含む。特定の実施形態において、前記治療は、１００～４００ｍｇのセリチニブの一日一回の用量、たとえば、２００～４００ｍｇ、１００～３００ｍｇ、２００～３００ｍｇ、または３００～４００ｍｇのセリチニブの一日一回の用量を投与することを含む。別の実施形態において、前記治療は、４００～６００ｍｇのセリチニブの一日一回の用量、たとえば、４００～５００ｍｇ、または５００～６００ｍｇのセリチニブの一日一回の用量を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明は、４００～５００ｍｇのセリチニブの一日一回の用量、好ましくは４５０ｍｇのセリチニブの一日一回の用量を投与することを含む、ＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫の治療を提供する。セリチニブは、好ましくは経口投与される。
【0069】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に４５０ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0070】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に３００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0071】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に１５０ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0072】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に５００～６００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0073】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に４００～５００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0074】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に３００～４００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0075】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に２００～３００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0076】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるＡＬＫ陰性かつＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブを提供し、前記治療は、一日に１００～２００ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0077】
別の実施形態において、ヒト対象におけるＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのセリチニブが提供され、前記治療は、一日に３００～７５０ｍｇのセリチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0078】
別の実施形態において、ヒト対象におけるＬＴＫ陽性の多発性骨髄腫の治療に使用するためのブリガチニブが提供され、前記治療は、一日に５０～２００ｍｇのブリガチニブを含む用量の投与を含み、前記用量は経口投与される。
【0079】
別の実施形態において、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または肝癌と診断された患者において癌を治療する方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から癌細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記癌細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記癌細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
前記患者から癌細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記癌細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記癌細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
【0080】
別の実施形態において、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、または肝癌と診断された患者において癌を治療する方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から癌細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記癌細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記癌細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
前記患者から癌細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記癌細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記癌細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
【0081】
別の実施形態において、ループスまたは免疫性血小板減少症と診断された患者において自己免疫疾患を治療する方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
【0082】
別の実施形態において、ループスまたは免疫性血小板減少症と診断された患者において自己免疫疾患の治療を行う方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
【0083】
別の実施形態において、患者における移植片対宿主病の治療を行う方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、有効量の線状ＡＬＫ阻害剤を前記患者に投与する工程。
【0084】
別の実施形態において、患者における移植片対宿主病の治療を行う方法が提供され、前記方法は下記工程を含む：
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
前記患者から形質細胞を含むサンプルを取得する工程；
前記形質細胞にＬＴＫ発現解析を行う工程；および
前記形質細胞がＬＴＫを発現している場合、セリチニブ、ブリガチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブから選択されるＡＬＫ阻害剤を有効量、前記患者に投与する工程。
【0085】
セリチニブは、いずれかの好適な形態で投与されればよい。セリチニブの様々な結晶形態が知られており、国際公開第２０１２／０８２９７２号および国際公開第２０１６／０９８０７０号に詳細が記載されている。本発明に従って、いずれかのかかる結晶形態が使用されてもよい。好ましくは、セリチニブはカプセル状に製剤化されて投与される。
【0086】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、ブリガチニブ（式ＩＶ）である。ブリガチニブは、商品名アルンブリグ（Alunbrig）であり、基準として、７日間は一日一回９０ｍｇ、その後一日一回１８０ｍｇという投薬計画に従って、患者に経口で投与される。本発明のある実施形態において、ブリガチニブは、この投薬計画に従って投与される。別の実施形態において、ブリガチニブは、７日間一日一回６０ｍｇ、その後一日一回１２０ｍｇ、または一日一回９０ｍｇという投薬計画に従って、経口投与される。別の実施形態において、ブリガチニブは、一日一回６０ｍｇの経口投与量で投与される。好ましくは、ブリガチニブは錠剤状に製剤化されて投与される。
【0087】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ（式ＩＩ）である。クリゾチニブ（商品名ザーコリ（Xalkori））は、基準として、２５０ｍｇを一日二回、経口で摂取という投薬計画に従って、患者に投与される。本発明のある実施形態において、クリゾチニブは、この投薬計画に従って投与される。別の実施形態において、２００ｍｇのクリゾチニブを一日二回、経口投与する。別の実施形態において、クリゾチニブは、一日一回２５０ｍｇの経口投与量で投与される。好ましくは、クリゾチニブはカプセル状に製剤化されて投与される。
【0088】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、エンサルチニブ（式Ｖ）である。エンサルチニブは、一日一回２２５ｍｇの投与量で経口投与されてもよい。
【0089】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、アレクチニブ（式ＶＩ）である。アレクチニブ（商品名アレセンサ（Alecensa））は、基準として、６００ｍｇを一日二回、経口で摂取という投薬計画に従って、患者に投与される。本発明のある実施形態において、アレクチニブは、この投薬計画に従って投与される。別の実施形態において、４５０ｍｇのアレクチニブを一日二回、経口投与する。別の実施形態において、３００ｍｇのアレクチニブを一日二回、経口投与する。好ましくは、アレクチニブはカプセル状に製剤化されて投与される。
【0090】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、エントレクチニブ（式ＶＩＩ）である。エントレクチニブ（商品名ロズリートレク（Rozlytrek））は、基準として、６００ｍｇを一日一回、経口で摂取という投薬計画に従って、患者に投与される。本発明のある実施形態において、エントレクチニブは、この投薬計画に従って投与される。別の実施形態において、５００ｍｇのエントレクチニブを一日一回、経口投与する。別の実施形態において、４００ｍｇのエントレクチニブを一日一回、経口投与する。別の実施形態において、３００ｍｇのエントレクチニブを一日一回、経口投与する。別の実施形態において、２００ｍｇのエントレクチニブを一日一回、経口投与する。好ましくは、エントレクチニブはカプセル状に製剤化されて投与される。
【0091】
または、国際公開第２００８／０７３６８７号、国際公開第２００９／１２６５１４号、または国際公開第２０１０／００２６５５号（この参照によりすべて本明細書に援用される）に開示された線状ＡＬＫ阻害剤のいずれか一つを、本発明に使用してもよい。
【0092】
各薬剤について、熟練の医師により、好適な服用スケジュールが選択されてもよく、たとえば臨床研究や薬に対する患者の反応に基づき、好適な服用スケジュールが選択されてもよい。ＡＬＫ阻害剤は経口投与用が現在知られているが、必要に応じて、たとえば静脈内投与など、別の投与経路を利用してもよい。本発明に係る使用のためのＡＬＫ阻害剤は、好ましくは医薬組成物の形態で投与される。好適な医薬組成物としては、溶液またはシロップや、粉末、細粒、錠剤、またはカプセルなどの固形組成物、ならびにクリームおよび軟膏が挙げられる。好ましくは、上記に規定されたように、各ＡＬＫ阻害剤が、ＡＬＫPos ＮＳＣＬＣの治療での使用について認可された形態で投与される。
【0093】
このような組成物に用いられる医薬上許容される希釈剤、担体、および賦形剤は、当該技術分野において周知である。たとえば、好適な賦形剤としては、乳糖、デンプングリコール酸ナトリウム、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩、植物油、蝋、脂肪、およびポリオールが挙げられる。好適な担体または希釈剤としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、メチルセルロース、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストロース、トレハロース、リポソーム、ポリビニルアルコール、医薬品グレードのデンプン、マンニトール、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース（および他の糖）、炭酸マグネシウム、シリカ、ゼラチン、油脂、アルコール、界面活性剤、およびポリソルベートなどの乳化剤が挙げられる。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料などが用いられてもよい。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料なども、使用されてもよい。
【0094】
好ましい実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、使用が事前に承認されている賦形剤などが配合される。かかる情報は、ＦＤＡまたはＥＭＡによって発行された、これらの薬の規制上の承認に見ることができる。
【0095】
本明細書で使用される「治療」という用語は、治癒する治療（または、治癒を意図する治療）と、もしくは苦痛緩和の治療（すなわち、癌または形質細胞媒介性疾患の症状を、単に、制限する、和らげる、または改善する治療）の両方を含む。
【0096】
ある実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、たとえば癌または形質細胞媒介性障害の治療用の、単一治療薬として使用してもよい。本発明に従って、複数のＡＬＫ阻害剤を順次使用してもよい。これは、以下のことを意味する。第一のＡＬＫ阻害剤を患者の癌治療に使用し、その後使用を中断する（たとえば、患者に、その薬に対してよくない反応がある、または前記癌がその薬に対して耐性をもつようになる、などの理由から）。前記第一のＡＬＫ阻害剤の投与中断の後、第二の（異なる）ＡＬＫ阻害剤を患者に投与する。これもまた中断し、第三の異なるＡＬＫ阻害剤を投与する（等々）。形質細胞媒介性障害の治療にたいしても、必要であれば、同様の方針が適用されてもよい。
【0097】
別の実施形態において、本発明に従って使用されるＡＬＫ阻害剤は、併用療法の一部分を構成してもよい。たとえば、癌治療において、ＡＬＫ阻害剤を、少なくとも一つのさらなる抗腫瘍性薬または抗腫瘍性療法とともに使用してもよい。前記さらなる抗腫瘍性薬／療法は、ＡＬＫ阻害剤ではない。ＡＬＫ阻害剤の投与は、たとえば、従来の化学療法薬や、放射線治療、ホルモン療法または免疫療法、もしくは第二の標的／高精度低分子治療などと組み合わせてもよい。本発明に係る形質細胞媒介性疾患の治療で、ＡＬＫ阻害剤を好適な第二の治療用分子と組み合わせて使用してもよい。たとえば、自己免疫疾患の治療で、たとえば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）やコルチコステロイドなどの免疫抑制剤等、自己免疫疾患の治療に用いられる薬と組み合わせてＡＬＫ阻害剤を用いてもよい。
本発明によると、ＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫の治療において、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、ＡＬＫ阻害剤を特に使用してもよい。本発明に係る使用のためのＡＬＫ阻害剤は、上記のプロテアソーム阻害剤のいずれか一つと組み合わせて使用してもよい。たとえば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、またはイキサゾミブと組み合わせてセリチニブを使用してもよい。
本発明によると、ＡＬＫNegＬＴＫPos多発性骨髄腫の治療において、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、ＡＬＫ阻害剤を特に使用してもよい。本発明に係る使用のためのＡＬＫ阻害剤は、上記のプロテアソーム阻害剤のいずれか一つと組み合わせて使用してもよい。たとえば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、またはイキサゾミブと組み合わせてセリチニブを使用してもよい。
【0098】
本発明は、以下の限定しない実施例および図面を参照することによって、さらに理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0099】
【図1】図１：ＬＴＫノックダウンは、小胞体ストレス引き起こす。 この図は、タンパク質分泌過多に起因する小胞体ストレスに対するＬＴＫノックダウンの効果を示す。誘導的に発現可能なＩｇＭ（重鎖および軽鎖）をコードするＨｅＬａ細胞に、コントロール、またはＬＴＫ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入した。７２時間後、ミフェプリストンで細胞を処理してＩｇＭ発現を誘導し、その後、（誘導後の指示された時間で）溶解させ、指示されたタンパク質に対してイムノブロットを行った。
【図2】図２：ＬＴＫは、細胞が高分泌負荷に対処できるようにする。 Ａ：Ｌ３６３細胞を５μＭクリゾチニブで処理し、スプライシングされていないＸＢＰ１とスプライシングされたＸＢＰ１との発現の比、およびＡＴＦ４の発現を処理後４時間、８時間、および１２時間で測定した。ＸＢＰ１のスプライシングとＡＴＦ４の蓄積とは、小胞体ストレスの誘導の徴候である。Ｂ：ボルテゾミブ耐性Ｌ３６３ａＢＴＺ細胞を５μＭクリゾチニブで処理し、スプライシングされていないＸＢＰ１とスプライシングされたＸＢＰ１との発現の比、およびＡＴＦ４の発現を、処理後４時間、８時間、および１２時間で測定した。Ｃ：誘導可能なＩｇＭ（重鎖および軽鎖）を発現したＨｅＬａ細胞をミフェプリストンで処理し、２週間、ＩｇＭの発現を誘導した。その後、１μＭクリゾチニブで２４時間、細胞を処理し、その後溶解させ、スプライシングされたＸＢＰ１に対してイムノブロットを行い、小胞体ストレスを測定した。＋および－は、細胞のミフェプリストン処理の有無をそれぞれ示す。誘導された細胞は、分泌過多であると考えられ、誘導されていない細胞は分泌のレベルが正常である。ブロットの上の数字は、三つの独立した実験からの濃度測定の定量化±ＳＤを示している。ただし、分泌過多細胞は、クリゾチニブでの処理の際に高レベルの小胞体ストレスを呈する。Ｄ：ＩｇＭを過剰発現しないＨｅＬａ細胞と、長期（１４日）間ＩｇＭ過剰発現させた細胞との間の、定量的ＰＣＲによるＬＴＫ ｍＲＮＡ発現の比較
【図3】図３：ＡＬＫNegＬＴＫPos細胞は、クリゾチニブ処理に対して感受性があり、アポトーシスを起こす。 この図は、分泌過多の細胞におけるＬＴＫの阻害が、その生存率を低下させることを示す。Ａ：誘導可能なＩｇＭ（重鎖および軽鎖）を発現したＨｅＬａ細胞をミフェプリストンで処理し、２週間、ＩｇＭの発現を誘導した。その後、１μＭクリゾチニブで２４時間、細胞を処理し、その後溶解させ、カスパーゼ３についてイムノブロットを行った。上のブロットは、非切断カスパーゼ３を示し、下のブロットは切断されたカスパーゼ３を示す。カスパーゼ３の切断は、アポトーシス誘導を示し、＋および－は、細胞のミフェプリストン処理の有無をそれぞれ示す。Ｂ：三つの異なる骨髄腫細胞株の生存率に対するクリゾチニブ処理（２４時間）の効果についての濃度反応曲線。結果は、三つの独立した実験の平均値である。Ｃ：示された骨髄腫細胞株においてＬＴＫおよびＡＬＫ ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＰＣＲにより測定した。
【図4】図４：ＡＬＫNegＬＴＫPos細胞株は、ＡＬＫ阻害剤処理に対して感受性がある。 この図は、骨髄腫細胞株Ｌ３６３およびＡＭＯ－１、およびそれらのボルテゾミブ耐性クローン（Ｌ３６３－ＢＴＺおよびＡＭＯ－１－ＢＴＺ）の生存率に対する、セリチニブ、アレクチニブ、エンサルチニブ、ロルラチニブ、エントレクチニブ、およびクリゾチニブ（２４時間の処理）の効果についての、濃度反応曲線を示す。結果は、三つの独立した実験の平均値である。骨髄腫細胞の生存率の濃度依存的な減少に注目。
【図5】図５：ＬＴＫは分泌を調節し、かつ線状ＡＬＫ阻害剤は分泌を低減する。 この図は、タンパク質分泌についての、セリチニブによるＬＴＫ阻害の効果を示す。Ａ：ｆｌａｇタグ化ＬＴＫを発現しているＨｅＬａ細胞を、１μＭのクリゾチニブまたはセリチニブで３０分間処理した。その後、細胞を溶解し、リン酸化したＬＴＫでイムノブロットし、これをＬＴＫの活性形態の代用物として使用した。下のブロットは、細胞中の全ＬＴＫのレベルを示す。Ｂ：ＨｅＬａ細胞を１μＭセリチニブで３０分間処理し、続いて、固定し、ＥＲＥＳを標識するためにＳｅｃ３１Ａについて染色を行った。共焦点顕微鏡により細胞を撮像し、ＩｍａｇｅＪを使用してＥＲＥＳを数えた。Ｃ：ｍＣｈｅｒｒｙタグ化マンノシダーゼＩＩ ＲＵＳＨレポーターを安定的に発現しているＨｅＬａ細胞。細胞をビオチンで処理し、ＥＲからレポーターを放出させた。２０分後、レポーターのほとんどがゴルジに到着した時点で、細胞を固定し、ゴルジ装置を標識するためにＧＭ１３０を免疫染色した。画像は、ビオチン添加の２０分後の細胞の代表的な例を示し、ここでセリチニブ処理細胞は、ゴルジ領域でレポーターの発現が少ない。右側のグラフは、ゴルジ（緑色）領域におけるレポーター蛍光（赤色）の比率で定量したものを示す。Ｄ：ＩｇＡ分泌ＡＭＯ－１細胞を３時間、示された用量のセリチニブで処理し、細胞上清中のＩｇＡの量をＥＬＩＳＡで測定した。
【図6】図６：患者からの多発性骨髄腫細胞は、クリゾチニブ処理に対して感受性がある。 この図は、示されているように７人の患者から単離した純化ＣＤ１３８+多発性骨髄腫細胞の生存率におけるクリゾチニブ処理（７２時間）の効果についての用量反応曲線を示す。生存率は、CellTiterGloにより測定した。
【図7】図７：骨髄腫患者からの多発性骨髄腫細胞中のＬＴＫおよびＡＬＫ発現。 ＡおよびＢは、CoMMpass study、IA-13 buildからのオーミックデータを示す。データは、Multiple Myeloma Research Foundation Personalized Medicine Initiatives (https://research.themmrf.org)からの、７６７個の多発性骨髄腫サンプル（www.themmrf.org）を含んでいた。ＲＮＡ配列データは、Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads（FPKM）として表されている。 Ａ：CoMMpass studyの７６７人の患者の多発性骨髄腫細胞のＲＮＡ配列データ。ＬＴＫと、ＥＲＧＩＣ－５３（ＬＭＡＮ１）、ＶＩＰ３６（ＬＭＡＮ２）、ＳＵＲＦ４、ＢｉＰ（ＨＳＰ５Ａ）などの分泌経路遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、およびネガティブコントロールＩＬ－２の発現を示す。ＩＬ－２は、多発性骨髄腫細胞では発現しない（発現は、ＦＰＫＭ＝１というカットオフ値（点線）を下回る）。バイオリン図は、中央値（一点鎖線）と四分位値（点線）を含む。 Ｂ：７６７人の患者のＬＴＫの発現対ＡＬＫの発現を示すドットプロット。点線は、ＬＴＫおよびＡＬＫについての発現のカットオフ値（ＦＰＫＭ＝１）を示す。
【図8】図８：ＮＳＧマウスの異種移植ヒト多発性骨髄腫細胞は、クリゾチニブに対して感受性がある。 この図において、免疫低下ＮＳＧマウスに、ヒトＬ３６３－ＢＴＺ（ボルテゾミブ耐性）骨髄腫細胞を大腿内注射した。前記細胞は、疾患の進行をインビボでモニターするために、ルシフェラーゼを有した。１０日後から、マウスに、ボルテゾミブを静脈内注射で７日間に二回、クリゾチニブを経口で７日間毎日、投与して治療した。左側の画像は、治療の４日目と７日目（腫瘍接種後１４日目と１７日目）の異なるグループの腫瘍負荷の例を示し、右側のグラフは、治療０日目（腫瘍接種１０日目）に正規化した各コホート（ｎ＝４）の各マウスについて、平均的なルシフェラーゼシグナルを示している。グループ間の統計的有意差を２要因分散分析（two-way ANOVA）によって分析し、時点間の統計的有意差をチューキーポストテスト（Tukey post-test）を用いた１要因分散分析（one-way ANOVA）によって分析した。
【図9】図９：慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）細胞におけるＬＴＫ発現およびＡＬＫ発現。 １０７人の患者のＣＬＬ細胞サンプルからの遺伝子発現データを、ＬＴＫおよびＡＬＫの発現について、解析した。示されているように、ＣＬＬサンプルの、１０７人の患者のうち９４人（８８％）がカットオフ値（点線）を超えてＬＴＫを発現し、一方でＡＬＫを発現したサンプルは無かった（右側のヒストグラム）。
【図10】図１０：患者からのＣＬＬ細胞は、線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブに対して感受性がある。 この図は、線状ＡＬＫ阻害剤に応答している、活性化され増殖しているＣＬＬ芽球の応答を示す。 左：２１人の患者からのＣＬＬ細胞の用量反応曲線。 中央：クリゾチニブに対する感受性がある１７個のサンプルを示すバイオリン図に、ＩＣ50値を示す。これらは、過剰な感受性がある（３人の患者からのＣＬＬ細胞）、高い感受性がある（３人の患者）、および感受性がある（１１人の患者）ことを示す。 右：薬物感受性スコア（ＤＳＳ値、Yadav et al., Scientific Reports 4: 5193,2014）は、ハイスループット化合物試験研究での多重用量反応関係を統合する（integrate）。患者の三分の一がクリゾチニブに対して高い感受性があるＣＬＬ細胞を有していることを、ＣＬＬサンプルのＤＳＳが示している。
【図11】図１１：ＩｇＶＨUnmut患者からのＣＬＬ細胞は、クリゾチニブに対して感受性がある。 図１０からのＣＬＬサンプルを、免疫グロブリン変数重鎖（ＩｇＶＨ）遺伝子の変異状態に関して分類した。 左：ＩｇＶＨUnmut ＣＬＬを有する６個の患者サンプルのうち４個が、クリゾチニブに対して高い感受性がある。ＩｇＶＨUnmutサンプルに低い感受性を示すものは無かった。 右：１５個のＩｇＶＨMut ＣＬＬサンプルのうち３個が、クリゾチニブに対して高い感受性がある。これらのうち１個がかろうじて変異していると認められた（９７．９％の相同性を有するＣＬＬ１６８）。１５個のＩｇＶＨMutサンプルのうち４個が低い感受性を示した。
【図12】図１２：患者からのＣＬＬ細胞は、ＡＬＫ阻害剤治療に対して感受性がある。 ブリガチニブ、セリチニブ、エンサルチニブ、エントレクチニブ、およびロルラチニブを使用したＡＬＫ阻害剤治療に対する応答について、１２人の患者からのＣＬＬ細胞を調べた。薬物感受性スコア（ＤＳＳ値、Yadav et al., Scientific Reports 4: 5193,2014）を示す。カットオフラインは、ＤＳＳ＝１０に設定されている（点線）。
【図13】図１３：Ｂ細胞分化におけるＬＴＫ発現およびＡＬＫ発現。 この図は、ヒトでのＢ細胞のサブセットにおけるＡＬＫおよびＬＴＫの発現を解析する。Ａ：Ｂ細胞サブセットについて、発現シグナルを示す：ＬＴＫの発現（左のプロット）およびＡＬＫの発現（右）。メモリーセル、形質芽細胞、および形質細胞中で、ＬＴＫはカットオフ値を超えて発現する。ＡＬＫはＢ細胞サブセット中で発現しない。 Ｂ：健康なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）分画内の２９種の免疫細胞タイプについて、寄託されたＲＮＡ配列およびフローサイトメトリーデータから、ＲＮＡ配列データをダウンロードした。データは、ナイーブＢ細胞ではＬＴＫの発現が低く（１０５中１８が陽性）、ＡＬＫに対して陰性であることを示した。メモリーＢ細胞および形質細胞は、ＬＴＫに対して陽性であり、ＡＬＫに対してすべて陰性であった。メモリーＢ細胞および形質細胞は、ＡＬＫNegＬＴＫPosであった。
【図14】図１４：インビトロで生成された形質細胞は、クリゾチニブに対して感受性があった。 ５人の血液バンクドナーからのＣＤ１９+Ｂ細胞に、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、およびＡｐｒｉｌを発現している接着性マウスＬ細胞により、３日間刺激を与え、Ｂ細胞芽球（形質芽細胞／細胞）を作製した。クリゾチニブに対する感受性について、形質芽細胞／細胞を７２時間調べた。 左：クリゾチニブで処理された５人の正常な形質芽細胞／細胞の薬剤感受性プロファイルにおける、相対的な細胞の生存率。 右：クリゾチニブで処理された５人の正常な形質芽細胞／細胞のＩＣ50。
【図15】図１５：インビトロで生成された形質細胞は線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブおよびセリチニブに対して感受性がある 血液バンクドナーからのネガティブ選択された正常なＢ細胞を、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２１、ＩＬ－４で５日間刺激した。このプロトコルにより、ＩＲＦ４およびＢＬＩＭＰ１を発現する１０～２０％末端分化形質細胞を生成することができる。５～７日目より、細胞を、Ａでは用量設定したクリゾチニブ、またはＢでは用量設定したセリチニブに暴露した。 ＡおよびＢで、ゲーティングされたＣＤ１９+Ｂ細胞中のＩＲＦ４対ＢＬＩＭＰ１を示す。ＩＲＭ４陽性かつＢＬＩＭＰ１陽性の二重陽性の細胞は、最終段階の形質細胞を意味する。かかる形質細胞はゲーティングされ（青色の楕円の領域）、形質細胞の割合が示されている。阻害剤の無い（０）条件、および0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、および100μMの濃度で線状ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ、Ａ；セリチニブ、Ｂ）の有る条件が、示されている。 パネルＣは、クリゾチニブおよびセリチニブの示された用量に応答した、形質細胞の百分率生存率を算出したものを示している。
【図16】図１６：形質細胞はインビボでクリゾチニブに感受性があり、インビトロでＩｇの分泌を低減する。 ルシフェラーゼ+Ｌ３６３ｗｔ形質細胞株を、免疫低下ＮＳＧマウスに大腿内注射した。１０日後、マウスを７日間毎日クリゾチニブで治療した（一日５０ｍｇ／ｋｇ、経口）。 左：異種移植マウスにおいて、形質細胞株はクリゾチニブにより殺傷される。１０日目、１４日目、および１７日目に、ＩＶＩＳ光学撮像装置でマウスを撮像した。４匹のマウスのうちの３匹の腹側面を示す。マウスには、媒質（上）またはクリゾチニブ（下）を与えた。４匹のマウスのうちの３匹で、クリゾチニブは、形質細胞からのシグナルを顕著に低減した。 右：Ｉｇの分泌がセリチニブにより減少する。形質細胞株ＡＭＯ－１を洗浄して、ウェルに投入（１０6細胞／ウェル）し、３時間セリチニブの滴定下に置いた。Human IgA ELISA Kit（Abcam社、英国ケンブリッジ）を使用し、ＡＭＯ－１細胞によって分泌されたＩｇＡについて、上清を解析した。
【図17】図１７：肝臓肝細胞癌は、ＡＬＫNegＬＴＫPosであり、クリゾチニブによりアポトーシスに対して感受性になる。 ３６５個の肝細胞癌（ＨＣＣ）からのＲＮＡ配列データを、Cancer Genome Atlas (TCGA)から生成し、ＦＰＫＭ（Fragments Per Kilobase of exon per Million readsの数）として報告した。肝細胞癌からの３６５個の患者サンプルを、ＬＴＫおよびＡＬＫの発現について調べた。Ａにおいて、左側のプロットは、点線で示されるカットオフ値と共に、ＬＴＫ対ＡＬＫを示す。患者全員が、ＡＬＫNegであるサンプルを有している。前記サンプルの四分の一はＬＴＫPosであり、したがってＡＬＫNegＬＴＫPosである。 Ｂにおいて、肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２）をＤＭＳＯで処理した（未処理）か、または２４時間ドキソルビシンの濃度を増加させて処理し（１、２、および５μＭ）、切断されたカスパーゼ３についてのイムノブロットによってアポトーシスを調べた。なお、５μＭのドキソルビシンが細胞死をわずかに誘導したのみであった。また、１μＭクリゾチニブの存在下で２４時間、同じ濃度のドキソルビシンで細胞を処理した。なお、クリゾチニブの存在により、ＨｅｐＧ２細胞のアポトーシス誘導薬ドキソルビシンへの感受性が高まり、これは線状ＡＬＫ阻害剤の提供によりＨＣＣ細胞がアポトーシスに対して感受性になることを示している。
【実施例】
【0100】
骨髄腫の実験、材料、および方法
患者サンプルおよび原発性多発性骨髄腫細胞サンプルの処理
多発性骨髄腫患者は、オスロ大学病院のオスロ骨髄腫センターから募った。この研究は、南西ノルウェー医療健康研究倫理地域委員会（the regional Committee for Medical and Health Research Ethics of South-East Norway）の承認を得た（REC#2016/947および2012/174）。骨髄液は、ヘルシンキ宣言に従って、告知に基づく同意に署名の上、多発性骨髄腫の患者から取得した。
７人の多発性骨髄腫患者のサンプルが含まれていた。患者は、二回目の再燃（患者番号１７０１）、三回目の再燃（２１０１，２０２１，１８０２，９０４１，２５０４）、または四回目の再燃（２２０１）の後に治療を受けた。患者は、少なくとも一つの治療において、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブ）を摂取した。
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離により、患者の骨髄液から、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）を用意した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ライフテクノロジーズ社）によるＣＤ８の除去の後、Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads（ライフテクノロジーズ社）および100U/ml human interleukin-2（hIL-2、Roche社、ドイツ、マンハイム）の存在下でＴｈ細胞を増殖させることにより、ＢＭＭＣを刺激した。４８時間後、ＢＭＭＣを、ＣＤ１３８＋富化し、ＭＡＣＳ ＣＤ１３８＋マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）を使用して多発性骨髄腫形質細胞を単離した。
患者サンプルおよび原発性多発性骨髄腫細胞サンプルの処理
多発性骨髄腫患者は、オスロ大学病院のオスロ骨髄腫センターから募った。この研究は、南西ノルウェー医療健康研究倫理地域委員会（the regional Committee for Medical and Health Research Ethics of South-East Norway）の承認を得た（REC#2016/947および2012/174）。骨髄液は、ヘルシンキ宣言に従って、告知に基づく同意に署名の上、多発性骨髄腫の患者から取得した。
７人の多発性骨髄腫患者のサンプルが含まれていた。患者は、二回目の再燃（患者番号１７０１）、三回目の再燃（２１０１，２０２１，１８０２，９０４１，２５０４）、または四回目の再燃（２２０１）の後に治療を受けた。患者は、少なくとも一つの治療において、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブまたはカルフィルゾミブ）を摂取した。
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離により、患者の骨髄液から、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）を用意した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ライフテクノロジーズ社）によるＣＤ８の除去の後、Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads（ライフテクノロジーズ社）および100U/ml human interleukin-2（hIL-2、Roche社、ドイツ、マンハイム）の存在下でＴｈ細胞を増殖させることにより、ＢＭＭＣを刺激した。４８時間後、ＢＭＭＣを、ＣＤ１３８＋富化し、ＭＡＣＳ ＣＤ１３８＋マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）を使用して多発性骨髄腫形質細胞を単離した。
【0101】
薬物療法および細胞生存率解析（多発性骨髄腫患者の細胞）
活性化解析からのＣＤ１３８＋多発性骨髄腫細胞（５，０００～１０，０００細胞／ウェル）を、クリゾチニブに対する応答について、３８４ウェルプレートで調べた。０．１～１０，０００ｎＭの濃度範囲を含む１０倍希釈での６段階のクリゾチニブ濃度について調べた（Ｅｃｈｏアコースティックディスペンサー（LabCyte社、米国カリフォルニア州サンホセ）により分注したプレート）。
前記プレートを、３７℃および５％ＣＯ2の加湿環境下でインキュベートした。７２時間後、製造者の説明書にしたがってCellTiterGlo（Promega社、米国ワイオミング州マディソン）ＡＴＰ解析を使用し、かつ、Envision Xciteプレートリーダー（Perkin Elmer社、米国コネチカット州シェルトン）を使用して、細胞の生存率を決定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）で正規化することにより、相対的割合（％）の細胞の生存率を算出し、曲線適合を行って、ＩＣ50値を得た。
活性化解析からのＣＤ１３８＋多発性骨髄腫細胞（５，０００～１０，０００細胞／ウェル）を、クリゾチニブに対する応答について、３８４ウェルプレートで調べた。０．１～１０，０００ｎＭの濃度範囲を含む１０倍希釈での６段階のクリゾチニブ濃度について調べた（Ｅｃｈｏアコースティックディスペンサー（LabCyte社、米国カリフォルニア州サンホセ）により分注したプレート）。
前記プレートを、３７℃および５％ＣＯ2の加湿環境下でインキュベートした。７２時間後、製造者の説明書にしたがってCellTiterGlo（Promega社、米国ワイオミング州マディソン）ＡＴＰ解析を使用し、かつ、Envision Xciteプレートリーダー（Perkin Elmer社、米国コネチカット州シェルトン）を使用して、細胞の生存率を決定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）で正規化することにより、相対的割合（％）の細胞の生存率を算出し、曲線適合を行って、ＩＣ50値を得た。
【0102】
細胞培養および遺伝子導入
１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したＤＭＥＭ（GIBCO）中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。プラスミドの過剰発現については、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用して、またはＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（Mirus社）を使用して、細胞に遺伝子導入を行った。ノックダウン実験については、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ（キアゲン社）を使用し、製造者の説明書にしたがって、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ（最終濃度）を細胞に逆遺伝子導入した。
１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したＤＭＥＭ（GIBCO）中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。プラスミドの過剰発現については、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用して、またはＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（Mirus社）を使用して、細胞に遺伝子導入を行った。ノックダウン実験については、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ（キアゲン社）を使用し、製造者の説明書にしたがって、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ（最終濃度）を細胞に逆遺伝子導入した。
【0103】
細胞溶解およびイムノブロット
細胞をＰＢＳで二度洗浄し、プロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤（Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets、EDTA無添加）を添加した溶解バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.4; 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1% SDS、および1% NP-40）に採集した。溶解物を、氷の上で１０分間インキュベートし、次いで、洗浄遠心分離を２０，０００ｘｇ、４℃で、１０分間行った。上清を清浄な試験管に移し、還元ローディングバッファーを加えた。溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、半乾式移動によりニトロセルロース膜上に移動させた。前記膜をブロックし（ＲＯＴＩバッファー（Roth社）、または０．１％Ｔｗｅｅｎを含む５％ミルク含有ＰＢＳで）、適切な一次抗体でプローブした。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で膜をインキュベートした。化学発光試薬（ECL clarity, BioRad社）を使用して、イムノブロットを展開し、ChemiDoc（BioRad社）を使用して撮像した。
細胞をＰＢＳで二度洗浄し、プロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤（Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets、EDTA無添加）を添加した溶解バッファー（50mM Tris-HCl, pH7.4; 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1% SDS、および1% NP-40）に採集した。溶解物を、氷の上で１０分間インキュベートし、次いで、洗浄遠心分離を２０，０００ｘｇ、４℃で、１０分間行った。上清を清浄な試験管に移し、還元ローディングバッファーを加えた。溶解物にＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、半乾式移動によりニトロセルロース膜上に移動させた。前記膜をブロックし（ＲＯＴＩバッファー（Roth社）、または０．１％Ｔｗｅｅｎを含む５％ミルク含有ＰＢＳで）、適切な一次抗体でプローブした。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で膜をインキュベートした。化学発光試薬（ECL clarity, BioRad社）を使用して、イムノブロットを展開し、ChemiDoc（BioRad社）を使用して撮像した。
【0104】
多発性骨髄腫細胞株、細胞培養、および生存率解析
使用された細胞株は、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｌ３６３（DSMZカタログ番号ACC49）、ＡＭＯ－１（DSMZカタログ番号ACC538）、およびＡＲＨ－７７（ATCC CRL-1621）であった。
１０％加熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社、スイス、バックス）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培養培地（Sigma-Aldrich社、スイス、バックス）で、多発性骨髄腫細胞株を維持した。親細胞株を継続的に１２カ月以上薬物曝露することにより、親細胞株からボルテゾミブ耐性細胞株を確立し維持した（Soriano et al,.Leukemia 30:2198-2207,2016）。
前記細胞の生存率は、製造者の説明書にしたがって、細胞カウントキット－８（ＣＣＫ－８；ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社、米国ニュージャージー州）を使用した２４時間の後処理により、決定した。
使用された細胞株は、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｌ３６３（DSMZカタログ番号ACC49）、ＡＭＯ－１（DSMZカタログ番号ACC538）、およびＡＲＨ－７７（ATCC CRL-1621）であった。
１０％加熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社、スイス、バックス）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培養培地（Sigma-Aldrich社、スイス、バックス）で、多発性骨髄腫細胞株を維持した。親細胞株を継続的に１２カ月以上薬物曝露することにより、親細胞株からボルテゾミブ耐性細胞株を確立し維持した（Soriano et al,.Leukemia 30:2198-2207,2016）。
前記細胞の生存率は、製造者の説明書にしたがって、細胞カウントキット－８（ＣＣＫ－８；ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社、米国ニュージャージー州）を使用した２４時間の後処理により、決定した。
【0105】
遺伝子発現解析
オミックスデータはCoMMpassSM study、IA-13 buildからダウンロードしたもので、７６７個の多発性骨髄腫サンプルを含んでいた（www.themmrf.org)。これらのデータは、Multiple Myeloma Research Foundation Personalized Medicine Initiatives (https://research.themmrf.org）の一部として生成された。ＲＮＡ配列データは、Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads（ＦＰＫＭ）として表された。ＦＫＰＭ＜１は、陰性とみなされた。
オミックスデータはCoMMpassSM study、IA-13 buildからダウンロードしたもので、７６７個の多発性骨髄腫サンプルを含んでいた（www.themmrf.org)。これらのデータは、Multiple Myeloma Research Foundation Personalized Medicine Initiatives (https://research.themmrf.org）の一部として生成された。ＲＮＡ配列データは、Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads（ＦＰＫＭ）として表された。ＦＫＰＭ＜１は、陰性とみなされた。
【0106】
ＲＮＡ単離およびＲＴ－ＰＣＲ（ｓ／ｕＸＢＰ１およびＡＴＦ４誘導）
Trizol（Ambion/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）およびDirect-zol RNA MiniPrep（Zymo Research社、米国カリフォルニア州）を使用して、トータルＲＮＡを細胞株から単離した。High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）を使用して、製造者の説明書にしたがって、トータルＲＮＡの５００ｎｇを逆転写した。その後、QuantStudio5 Real-Time PCR system（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）において、2xPowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）および以下のプライマーを用いたｑＰＣＲ反応あたり１０ｎｇのｃＤＮＡを使用した。プライマー：スプライシングされたＸＢＰ１、スプライシングされていないＸＢＰ１、およびトータルＸＢＰ１、ならびにＡＴＦ４（Oslowski & Urano, Methods in Enzymology 490: 71-92, 2011）、およびハウスキーピング遺伝子コントロールとしてＧＡＰＤＨ。
Trizol（Ambion/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）およびDirect-zol RNA MiniPrep（Zymo Research社、米国カリフォルニア州）を使用して、トータルＲＮＡを細胞株から単離した。High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）を使用して、製造者の説明書にしたがって、トータルＲＮＡの５００ｎｇを逆転写した。その後、QuantStudio5 Real-Time PCR system（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）において、2xPowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific社、米国マサチューセッツ州）および以下のプライマーを用いたｑＰＣＲ反応あたり１０ｎｇのｃＤＮＡを使用した。プライマー：スプライシングされたＸＢＰ１、スプライシングされていないＸＢＰ１、およびトータルＸＢＰ１、ならびにＡＴＦ４（Oslowski & Urano, Methods in Enzymology 490: 71-92, 2011）、およびハウスキーピング遺伝子コントロールとしてＧＡＰＤＨ。
【0107】
ＥＬＩＳＡ
１ｘ１０6／ｍｌ ＩｇＡ分泌ＡＭＯ－１細胞を、対象の化合物の用量を増加させた新鮮な培地に３時間播種した。続いて、前記培地を回収し、２０倍に希釈し、Human IgA ELISA Kit（Abcam社、英国、製品番号ａｂ１３７９８０）を用いて、製造者の説明書にしたがって、細胞培養上清中のＩｇＡ抗体のレベルを測定した。
１ｘ１０6／ｍｌ ＩｇＡ分泌ＡＭＯ－１細胞を、対象の化合物の用量を増加させた新鮮な培地に３時間播種した。続いて、前記培地を回収し、２０倍に希釈し、Human IgA ELISA Kit（Abcam社、英国、製品番号ａｂ１３７９８０）を用いて、製造者の説明書にしたがって、細胞培養上清中のＩｇＡ抗体のレベルを測定した。
【0108】
インビボ実験
Jackson Laboratory（No.005557、米国、カリフォルニア州）からＮＳＧ（NOD-scid IL2Rgammanull）マウスを取得し、個別換気ケージの中で自由に餌を接種させて飼った。同齢（６～８週齢）のマウスに対し、0.5x105L363-BTZ_Luc+_TdTomato+多発性骨髄腫細胞（モニタリング用に、Addgeneから取得したルシフェラーゼベクター#72486を備える）を、右大腿に注射した。ルシフェリン注射（１５０ｍｇ／ｋｇ、BioVision社、米国カリフォルニア州から取得）後、一週間の間に二回、腫瘍の増殖をモニターした。腫瘍接種後１０日目に、クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、経口、毎日）、ボルテゾミブ（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射、７日間に二回）、または媒質を使用して処理を開始し、７日間行った。３Ｒの原則に従って研究を行った。実験は、動物実験委員会（Committee for Animal Experiments、スイス、ザンクトガレン）の承認された（申請番号30177）。ボルテゾミブおよびクリゾチニブは、MedChemExpress社、米国ニュージャージー州から購入した。
Jackson Laboratory（No.005557、米国、カリフォルニア州）からＮＳＧ（NOD-scid IL2Rgammanull）マウスを取得し、個別換気ケージの中で自由に餌を接種させて飼った。同齢（６～８週齢）のマウスに対し、0.5x105L363-BTZ_Luc+_TdTomato+多発性骨髄腫細胞（モニタリング用に、Addgeneから取得したルシフェラーゼベクター#72486を備える）を、右大腿に注射した。ルシフェリン注射（１５０ｍｇ／ｋｇ、BioVision社、米国カリフォルニア州から取得）後、一週間の間に二回、腫瘍の増殖をモニターした。腫瘍接種後１０日目に、クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、経口、毎日）、ボルテゾミブ（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射、７日間に二回）、または媒質を使用して処理を開始し、７日間行った。３Ｒの原則に従って研究を行った。実験は、動物実験委員会（Committee for Animal Experiments、スイス、ザンクトガレン）の承認された（申請番号30177）。ボルテゾミブおよびクリゾチニブは、MedChemExpress社、米国ニュージャージー州から購入した。
【0109】
ＣＬＬの実験、材料、および方法
遺伝子発現データ
ＣＬＬ細胞についての遺伝子発現データは、 HYPERLINK "http://www.genomicscape.com/microarray" http://www.genomicscape.com/microarrayプラットフォームから取得可能な以前のデータセットの解析により取得した。１０７人のＣＬＬ患者のＣＬＬ細胞からのデータを、ＬＴＫ遺伝子およびＡＬＫ遺伝子の発現について、解析した。データは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）からの、Ｈｅｒｏｌｄ、慢性リンパ球白血病、ＨＧＵ１３３Ｐ（１０７サンプル）のデータセット（(Herold et al., Leukemia 25(10): 1639-45, 2011）を、Robust Multiarray Averaging（ＲＭＡ）で正規化したものであった。
遺伝子発現データ
ＣＬＬ細胞についての遺伝子発現データは、 HYPERLINK "http://www.genomicscape.com/microarray" http://www.genomicscape.com/microarrayプラットフォームから取得可能な以前のデータセットの解析により取得した。１０７人のＣＬＬ患者のＣＬＬ細胞からのデータを、ＬＴＫ遺伝子およびＡＬＫ遺伝子の発現について、解析した。データは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）からの、Ｈｅｒｏｌｄ、慢性リンパ球白血病、ＨＧＵ１３３Ｐ（１０７サンプル）のデータセット（(Herold et al., Leukemia 25(10): 1639-45, 2011）を、Robust Multiarray Averaging（ＲＭＡ）で正規化したものであった。
【0110】
ＣＬＬサンプルについての用量応答実験
患者からのＣＬＬ細胞に、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、およびＡｐｒｉｌを発現している接着性マウスＬ細胞により、２４時間刺激を与えた。前記Ｌ細胞を、その後、免疫磁気分離により除去した。洗浄したＣＬＬ細胞を、３８４ウェルプレートフォーマットに播き（１０，０００細胞／ウェル）、クリゾチニブについて、１０倍希釈での５段階の濃度で調べた（Ｅｃｈｏアコースティックディスペンサー（LabCyte社、米国カリフォルニア州サンホセ）により分注したプレート）。前記プレートを、３７℃および５％ＣＯ2の加湿環境下でインキュベートした。７２時間後、CellTiterGlo（Promega社、米国ワイオミング州マディソン）ＡＴＰ解析を製造者の説明書にしたがって使用し、かつ、Envision 2102 Multilabelリーダー（PerkinElmer社、米国コネチカット州シェルトン）を使用して、細胞の生存率を測定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）のウェルで正規化することにより、相対的割合の細胞の生存率を算出した。曲線適合を行って、ＩＣ50値を得た。
個々の薬物について、差異のある薬物感受性の定量的な点数を、薬物感受性スコアとして算出した（ＤＳＳ値、Yadav et al., Scientific Reports4:5193,2014）。ＤＳＳ値は、示されているように、ハイスループット化合物試験での統合された多重用量反応関係について算出した。
患者からのＣＬＬ細胞に、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、およびＡｐｒｉｌを発現している接着性マウスＬ細胞により、２４時間刺激を与えた。前記Ｌ細胞を、その後、免疫磁気分離により除去した。洗浄したＣＬＬ細胞を、３８４ウェルプレートフォーマットに播き（１０，０００細胞／ウェル）、クリゾチニブについて、１０倍希釈での５段階の濃度で調べた（Ｅｃｈｏアコースティックディスペンサー（LabCyte社、米国カリフォルニア州サンホセ）により分注したプレート）。前記プレートを、３７℃および５％ＣＯ2の加湿環境下でインキュベートした。７２時間後、CellTiterGlo（Promega社、米国ワイオミング州マディソン）ＡＴＰ解析を製造者の説明書にしたがって使用し、かつ、Envision 2102 Multilabelリーダー（PerkinElmer社、米国コネチカット州シェルトン）を使用して、細胞の生存率を測定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）のウェルで正規化することにより、相対的割合の細胞の生存率を算出した。曲線適合を行って、ＩＣ50値を得た。
個々の薬物について、差異のある薬物感受性の定量的な点数を、薬物感受性スコアとして算出した（ＤＳＳ値、Yadav et al., Scientific Reports4:5193,2014）。ＤＳＳ値は、示されているように、ハイスループット化合物試験での統合された多重用量反応関係について算出した。
【0111】
ヒトＢ細胞についての遺伝子発現解析
ヒトにおけるＢ細胞の分化についての遺伝子発現データは、 HYPERLINK "http://www.genomicscape.com/microarray" http://www.genomicscape.com/microarrayプラットフォームから取得可能なデータセットの解析により取得した。前記ＧＥＰデータセットは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array上のMAS5により正規化した、ヒト形質細胞分化から由来したものである（Jourdan et al., Leukemia 28(8): 1647-56, 2014; Jourdan et al., Journal of Immunology 187(8): 3931-41, 2011; Jourdan et al., Blood 114(25): 5173-81, 2009; Caron et al., Journal of Immunology 182(12): 7595-602, 2009）。
ドナーからのデータを、ヒトのＢリンパ球新生におけるＬＴＫ遺伝子およびＡＬＫ遺伝子の発現について、解析した。Ｂ細胞は、下記のサブセットに分類された。１．ナイーブＢ細胞（ｎ＝５）；２．中心芽細胞（ｎ＝４）；３．中心細胞（ｎ＝４）；４．メモリーＢ細胞（ｎ＝５）；５．プレ形質芽細胞（ｎ＝５）；６．形質芽細胞（ｎ＝５）；７．初期形質細胞（ｎ＝５）；８．骨髄形質細胞（ｎ＝５）。
ＲＮＡ配列データを、寄託されたデータからダウンロードした（Monaco et al., Cell Reports 26(6): 1627-40, 2019）。ＲＮＡ配列およびフローサイトメトリーを使用して、健康なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）分画内の２９種の免疫細胞タイプについて、データを解析した。ナイーブＢ細胞のデータは、Schmiedel et al., Cell 175(6): 1701-15, 2018からのものであった。
ヒトにおけるＢ細胞の分化についての遺伝子発現データは、 HYPERLINK "http://www.genomicscape.com/microarray" http://www.genomicscape.com/microarrayプラットフォームから取得可能なデータセットの解析により取得した。前記ＧＥＰデータセットは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array上のMAS5により正規化した、ヒト形質細胞分化から由来したものである（Jourdan et al., Leukemia 28(8): 1647-56, 2014; Jourdan et al., Journal of Immunology 187(8): 3931-41, 2011; Jourdan et al., Blood 114(25): 5173-81, 2009; Caron et al., Journal of Immunology 182(12): 7595-602, 2009）。
ドナーからのデータを、ヒトのＢリンパ球新生におけるＬＴＫ遺伝子およびＡＬＫ遺伝子の発現について、解析した。Ｂ細胞は、下記のサブセットに分類された。１．ナイーブＢ細胞（ｎ＝５）；２．中心芽細胞（ｎ＝４）；３．中心細胞（ｎ＝４）；４．メモリーＢ細胞（ｎ＝５）；５．プレ形質芽細胞（ｎ＝５）；６．形質芽細胞（ｎ＝５）；７．初期形質細胞（ｎ＝５）；８．骨髄形質細胞（ｎ＝５）。
ＲＮＡ配列データを、寄託されたデータからダウンロードした（Monaco et al., Cell Reports 26(6): 1627-40, 2019）。ＲＮＡ配列およびフローサイトメトリーを使用して、健康なドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）分画内の２９種の免疫細胞タイプについて、データを解析した。ナイーブＢ細胞のデータは、Schmiedel et al., Cell 175(6): 1701-15, 2018からのものであった。
【0112】
活性化Ｂ細胞芽球／形質細胞の薬物感受性スクリーニング
５人の血液バンクドナーからのＣＤ１９+Ｂ細胞に、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、およびＡｐｒｉｌを発現している接着性マウスＬ細胞により、３日間刺激を与え、Ｂ細胞芽球（形質芽細胞／細胞）を作製した。洗浄した形質芽細胞／細胞を、分離して３８４ウェルフォーマットに播き（１０，０００細胞／ウェル）、クリゾチニブについて、１０3～１０μＭの濃度範囲を含む１０倍希釈での６段階の濃度で調べた。７２時間後、CellTiterGloを使用して、細胞の生存率を測定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）とで正規化することにより、相対的割合の細胞の生存率を算出し、曲線適合を行って、ＩＣ50を得た。
５人の血液バンクドナーからのＣＤ１９+Ｂ細胞に、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、およびＡｐｒｉｌを発現している接着性マウスＬ細胞により、３日間刺激を与え、Ｂ細胞芽球（形質芽細胞／細胞）を作製した。洗浄した形質芽細胞／細胞を、分離して３８４ウェルフォーマットに播き（１０，０００細胞／ウェル）、クリゾチニブについて、１０3～１０μＭの濃度範囲を含む１０倍希釈での６段階の濃度で調べた。７２時間後、CellTiterGloを使用して、細胞の生存率を測定した。各ウェルについて発光単位をネガティブコントロール（ＤＭＳＯ ０．１％）とポジティブコントロール（１００μＭ ＢｚＣｌ）とで正規化することにより、相対的割合の細胞の生存率を算出し、曲線適合を行って、ＩＣ50を得た。
【0113】
結果
ＬＴＫはタンパク質恒常性ネットワークの制御性ノードである
ＬＴＫが、分泌流によって活性化される小胞体輸送の正の調節因子であることを、数理モデルが示唆した。この予測を実験的に確認するために、誘導的にＩｇＭを発現するＨｅＬａ細胞を使用した（Bakunts et al.、上記参照）。２４時間のＩｇＭ発現の誘導は、ＸＢＰ１ｓレベルの上昇に示されるように、ＵＰＲ（小胞体ストレスのマーカー）の穏やかな活性化をもたらした（図１）。ＬＴＫ発現が抑えられると、ＩｇＭ発現の誘導に対し小胞体ストレスのレベル上昇を伴って細胞が応答した（図１）。これにより、ＬＴＫがタンパク質恒常性ネットワークの制御性ノードであることが確認される。
ＬＴＫはタンパク質恒常性ネットワークの制御性ノードである
ＬＴＫが、分泌流によって活性化される小胞体輸送の正の調節因子であることを、数理モデルが示唆した。この予測を実験的に確認するために、誘導的にＩｇＭを発現するＨｅＬａ細胞を使用した（Bakunts et al.、上記参照）。２４時間のＩｇＭ発現の誘導は、ＸＢＰ１ｓレベルの上昇に示されるように、ＵＰＲ（小胞体ストレスのマーカー）の穏やかな活性化をもたらした（図１）。ＬＴＫ発現が抑えられると、ＩｇＭ発現の誘導に対し小胞体ストレスのレベル上昇を伴って細胞が応答した（図１）。これにより、ＬＴＫがタンパク質恒常性ネットワークの制御性ノードであることが確認される。
【0114】
ＬＴＫは、多発性骨髄腫細胞が分泌負荷の上昇に対処することを助ける
多発性骨髄腫は、免疫グロブリンの過剰な量の分泌を特徴とする。ＬＴＫ阻害が多発性骨髄腫細胞株において小胞体ストレスを誘導するかどうかを判定するために、Ｌ３６３細胞をクリゾチニブで処理した。クリゾチニブは、ＬＴＫを阻害し、その分泌に影響を与えることが分かっている化合物である（Centonze et al.、上記参照）。クリゾチニブ処理が小胞体ストレスを誘導したことは、ＸＢＰ１のスプライシングの増加とＡＴＦ４の誘導の増加とから明らかである（図２Ａ）。同様の所見が、ボルテゾミブに耐性のあるＬ３６３－ＢＴＺ細胞についてなされた（図２Ｂ）。ただし、Ｌ３６３細胞と、そのボルテゾミブ耐性クローンとは、ＬＴＫについては陽性であるが、ＡＬＫについては陰性であり（下記参照）、クリゾチニブのオフターゲット効果の可能性を最小限にする。
ＬＴＫが、高分泌負荷に対して細胞が適応することを助けるかどうかを調べるために、同じ細胞の過剰分泌があるものと無いものとの直接比較を可能にするシステムを使用した。ＩｇＭ産生と分泌のパルス誘導を短期間のみ使用するのではなく、ＩｇＭ産生を１４日間誘導した。これは、分泌タンパク質の慢性的過剰発現に対する潜在的な細胞の適応機構を考慮に入れるためである。１４日間ＩｇＭを過剰発現するよう誘導されたＨｅＬａ細胞を、誘導されなかったＨｅＬａ細胞と比較した。誘導されなかった細胞をＬＴＫ阻害剤クリゾチニブで処理すると、小胞体ストレスに顕著な増加は無かった（図２Ｃ）が、長期間にわたって増大した分泌負荷を受けた細胞は、２．５倍高いレベルの小胞体ストレスを呈した（図２Ｃ）。分泌過多の細胞のＬＴＫに対する依存が高いことは、分泌過多の細胞がＬＴＫ発現を４倍増加したという所見と一致している（図２Ｄ）。
多発性骨髄腫は、免疫グロブリンの過剰な量の分泌を特徴とする。ＬＴＫ阻害が多発性骨髄腫細胞株において小胞体ストレスを誘導するかどうかを判定するために、Ｌ３６３細胞をクリゾチニブで処理した。クリゾチニブは、ＬＴＫを阻害し、その分泌に影響を与えることが分かっている化合物である（Centonze et al.、上記参照）。クリゾチニブ処理が小胞体ストレスを誘導したことは、ＸＢＰ１のスプライシングの増加とＡＴＦ４の誘導の増加とから明らかである（図２Ａ）。同様の所見が、ボルテゾミブに耐性のあるＬ３６３－ＢＴＺ細胞についてなされた（図２Ｂ）。ただし、Ｌ３６３細胞と、そのボルテゾミブ耐性クローンとは、ＬＴＫについては陽性であるが、ＡＬＫについては陰性であり（下記参照）、クリゾチニブのオフターゲット効果の可能性を最小限にする。
ＬＴＫが、高分泌負荷に対して細胞が適応することを助けるかどうかを調べるために、同じ細胞の過剰分泌があるものと無いものとの直接比較を可能にするシステムを使用した。ＩｇＭ産生と分泌のパルス誘導を短期間のみ使用するのではなく、ＩｇＭ産生を１４日間誘導した。これは、分泌タンパク質の慢性的過剰発現に対する潜在的な細胞の適応機構を考慮に入れるためである。１４日間ＩｇＭを過剰発現するよう誘導されたＨｅＬａ細胞を、誘導されなかったＨｅＬａ細胞と比較した。誘導されなかった細胞をＬＴＫ阻害剤クリゾチニブで処理すると、小胞体ストレスに顕著な増加は無かった（図２Ｃ）が、長期間にわたって増大した分泌負荷を受けた細胞は、２．５倍高いレベルの小胞体ストレスを呈した（図２Ｃ）。分泌過多の細胞のＬＴＫに対する依存が高いことは、分泌過多の細胞がＬＴＫ発現を４倍増加したという所見と一致している（図２Ｄ）。
【0115】
ＬＴＫを標的にすることが多発性骨髄腫細胞の生存率を低減する
ＬＴＫ阻害が分泌過多細胞において小胞体ストレスを誘導するという所見に基づき、本発明者は、それが細胞死の原因ともなるかどうかを調べた。ＩｇＭ分泌過多があるＨｅＬａ細胞と無いＨｅＬａ細胞とにおけるカスパーゼ３切断に対する、クリゾチニブの影響を調べた。非分泌細胞は、クリゾチニブ処理に対するアポトーシス応答を示さなかった（図３Ａ）が、これは、これらの細胞が小胞体ストレスに応答しないという所見と一致する。しかしながら、慢性的に分泌負荷が増大している細胞は、クリゾチニブ処理の際にアポトーシスの顕著な増加を示した（図３Ａ）。二つの多発性骨髄腫細胞株（Ｌ３６３およびＡＲＨ７７）を、クリゾチニブで処理すると、薬学的に関連する薬物濃度で、細胞の生存率にはっきりした減少が見られた。Ｌ３６３のボルテゾミブ耐性クローンの場合も、同様であることがわかった（図３Ｂ）。ただし、これら細胞はＬＴＫについては陽性であるが、ＡＬＫについては陰性であり（図３Ｃ）、患者から取得した多発性骨髄腫細胞も同様であった（参照下記）。
ＬＴＫ阻害が分泌過多細胞において小胞体ストレスを誘導するという所見に基づき、本発明者は、それが細胞死の原因ともなるかどうかを調べた。ＩｇＭ分泌過多があるＨｅＬａ細胞と無いＨｅＬａ細胞とにおけるカスパーゼ３切断に対する、クリゾチニブの影響を調べた。非分泌細胞は、クリゾチニブ処理に対するアポトーシス応答を示さなかった（図３Ａ）が、これは、これらの細胞が小胞体ストレスに応答しないという所見と一致する。しかしながら、慢性的に分泌負荷が増大している細胞は、クリゾチニブ処理の際にアポトーシスの顕著な増加を示した（図３Ａ）。二つの多発性骨髄腫細胞株（Ｌ３６３およびＡＲＨ７７）を、クリゾチニブで処理すると、薬学的に関連する薬物濃度で、細胞の生存率にはっきりした減少が見られた。Ｌ３６３のボルテゾミブ耐性クローンの場合も、同様であることがわかった（図３Ｂ）。ただし、これら細胞はＬＴＫについては陽性であるが、ＡＬＫについては陰性であり（図３Ｃ）、患者から取得した多発性骨髄腫細胞も同様であった（参照下記）。
【0116】
クリゾチニブと同様に、他の線状ＡＬＫ阻害剤、セリチニブ、アレクチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブなども、多発性骨髄腫細胞に対する細胞障害性活性を呈することが分かった（図４、左パネル）。前記環状ＡＬＫ阻害剤ロルラチニブは、骨髄腫細胞を効率よく殺傷することが無かった。下記ＩＣ50値（μＭ）は、調べた細胞株でセリチニブについて取得した：Ｌ３６３において１．０３、Ｌ３６３－ＢＴＺにおいて０．７９、ＡＭＯ－１において２．０９、およびＡＭＯ－１－ＢＴＺにおいて２．７７。下記ＩＣ50値（μＭ）は、調べた細胞株でクリゾチニブについて取得した。Ｌ３６３において３．３２３、Ｌ３６３－ＢＴＺにおいて４．１５、ＡＭＯ－１において３．９２、およびＡＭＯ－１－ＢＴＺにおいて６．４７７。下記ＩＣ50値（μＭ）は、調べた細胞株でアレクチニブについて取得した。Ｌ３６３において６．１２、Ｌ３６３－ＢＴＺにおいて６．２２、ＡＭＯ－１において１３．３１、およびＡＭＯ－１－ＢＴＺにおいて１７．６。ＬＴＫ阻害に対する同様の感受性が、Ｌ３６３およびＡＭＯ－１のボルテゾミブ耐性バージョンについて見られた（図４、右）。このことは、ＬＴＫがタンパク質恒常性ネットワークのプロテアソーム非依存部分上で働くこと、および多発性骨髄腫におけるプロテアソーム阻害剤耐性がＬＴＫを阻害することにより克服されうることを、示唆している。これは、承認されたＡＬＫ阻害薬物を使用することにより達成することができる。
【0117】
【0118】
ついで、クリゾチニブの効果を、第３～第５選択療法を受けている再燃患者から取得した原発性骨髄腫細胞に対して調べた。ＣＤ８を除去した骨髄由来の単核細胞を、ＩＬ－２中で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより刺激した。この方法は、多発性骨髄腫細胞活性化を支えるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）を刺激した。４８時間後、１５人の患者それぞれからのＣＤ１３８＋多発性骨髄腫細胞を、用量設定したクリゾチニブの存在下のウェルに移し、濃度反応曲線を算出した（図６）。ＬＴＫ阻害は、すべての患者由来の多発性骨髄腫細胞に対して顕著な効果を有し、ＩＣ50レベルは０．８～５μＭであった。とりわけ、多発性骨髄腫の７６７人の患者のコホートの解析は、ＬＴＫ ｍＲＮＡの平均発現レベルが８．１８である一方、ＡＬＫの平均発現レベルが０．０２（図７Ａ）とカットオフ値（１０0）よりも低いことを示した。前記患者を次のカテゴリーに分けた：７６７人の患者のうち６３６人（８３％）に見つかった、ＡｌｋNegＬＴＫPosである骨髄腫細胞；７６７人の患者のうち１３０人（１７％）に見つかった、ＡｌｋNegＬＴＫNegである骨髄腫細胞；および、７６７人の患者のうち１人（０．００１％）のみに見つかった、ＡｌｋPosＬＴＫPosである骨髄腫細胞（図７Ｂ）。ＡＬＫ阻害剤には標的としてのＡＬＫが無いので、クリゾチニブによる原発性骨髄腫細胞の死滅は、おそらくＬＴＫ阻害の結果である。
【0119】
多発性骨髄腫細胞に対するクリゾチニブのインビボでの効果を調べた。この目的のために、ルシフェラーゼを発現するように改変されたボルテゾミブ耐性Ｌ３６３細胞を、免疫低下マウスの大腿に注射した。インビボでの腫瘍の増殖のモニタリングを容易にするために、細胞をルシフェラーゼを発現するように改変した。このモデルは、プロテアソーム阻害剤耐性の多発性骨髄腫細胞の特殊な生理と、インビボでの多発性骨髄腫の生理に重要な骨髄の微小環境の保護的かつ薬剤耐性を促進する特性とのどちらをも考慮に入れている。クリゾチニブを使用した治療は、臨床現場を模倣して、腫瘍が容易に検出できる段階（腫瘍接種後１０日目）で開始した。マウスをボルテゾミブでも治療した。ボルテゾミブは、ボルテゾミブ耐性Ｌ３６３細胞が使用されていることを考えれば何の影響も無いと予想されていたが、プロテアソーム阻害剤耐性が確認された。マウスにクリゾチニブを７日間毎日経口で投与した（５０ｍｇ／ｋｇ）。ボルテゾミブは、上記期間中二回静脈内投与した（１ｍｇ／ｋｇ）。クリゾチニブによる処理は、ベースライン、未治療のコントロール、およびボルテゾミブで治療したマウスと比較して、腫瘍負荷を減少させた（図８）。このことは、ＬＴＫの阻害剤による治療で、多発性骨髄腫のプロテアソーム阻害剤耐性を克服することができることを示している。
【0120】
原発性ＣＬＬ細胞はＡＬＫNegＬＴＫPosである
慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）については、ＡＬＫおよびＬＴＫの転写を調べ、１０７個のＣＬＬ細胞サンプル中９４個（８８％）がＬＴＫPosであり、１０７個のサンプルすべてがＡＬＫNegであったことがわかった（図９）。したがって、ＣＬＬは、患者の大半がＡＬＫNegＬＫPosＣＬＬ細胞を有する癌である。ＣＬＬは、血液中の白血病細胞が活動していないか、またはプレアポトーシス（pre-apoptotic）状態である癌である。リンパ節、脾臓、または骨髄の特殊な微小環境で、ＣＬＬ細胞の分裂が起きる。ここで、分裂しているＣＬＬ芽細胞は、リンパ球芽球化と有糸分裂を支える微小環境（いわゆる偽濾胞）において刺激細胞と隣り合っている。この段階で、ＣＬＬ細胞は分泌過多であり、細胞分裂を起こす前にモノクローナル抗体を分泌する（Darwiche et al.，上記参照）。
慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）については、ＡＬＫおよびＬＴＫの転写を調べ、１０７個のＣＬＬ細胞サンプル中９４個（８８％）がＬＴＫPosであり、１０７個のサンプルすべてがＡＬＫNegであったことがわかった（図９）。したがって、ＣＬＬは、患者の大半がＡＬＫNegＬＫPosＣＬＬ細胞を有する癌である。ＣＬＬは、血液中の白血病細胞が活動していないか、またはプレアポトーシス（pre-apoptotic）状態である癌である。リンパ節、脾臓、または骨髄の特殊な微小環境で、ＣＬＬ細胞の分裂が起きる。ここで、分裂しているＣＬＬ芽細胞は、リンパ球芽球化と有糸分裂を支える微小環境（いわゆる偽濾胞）において刺激細胞と隣り合っている。この段階で、ＣＬＬ細胞は分泌過多であり、細胞分裂を起こす前にモノクローナル抗体を分泌する（Darwiche et al.，上記参照）。
【0121】
原発性ＣＬＬ細胞は線状ＡＬＫ阻害剤に対して感受性がある
ＣＬＬ細胞の活性化に重要な微小環境要因（Patten et al., Blood 111: 5173-5181, 2008; Bagnara et al., Blood 117: 5463-5472, 2011; Hall et al., Blood 105: 2007-2015, 2005; Os et al., Cell Reports 4(3): 566-577, 2013）を準備し、増殖性のＣＬＬ芽球を、線状ＡＬＫ阻害剤に対する感受性について試験した。２１個の患者サンプルのうち１７個（８１％）が、線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブに対する感受性があるＣＬＬ細胞を有していたことがわかった（図１０）。これらのうち、１１個は正常な感受性であり（ＩＣ50＜２μＭ）、３個は感受性が高く（ＩＣ50＜２ｘ１０-1μＭ）、３個は感受性が非常に高かった（ＩＣ50＜１０-2μＭ）。ハイスループット化合物試験の多重用量反応関係をさらに統合すると、薬物感受性スコア（ＤＳＳ）が、患者の三分の一がクリゾチニブに対して高い感受性があるＣＬＬ細胞を有することを示していることがわかった。
ＣＬＬ細胞の活性化に重要な微小環境要因（Patten et al., Blood 111: 5173-5181, 2008; Bagnara et al., Blood 117: 5463-5472, 2011; Hall et al., Blood 105: 2007-2015, 2005; Os et al., Cell Reports 4(3): 566-577, 2013）を準備し、増殖性のＣＬＬ芽球を、線状ＡＬＫ阻害剤に対する感受性について試験した。２１個の患者サンプルのうち１７個（８１％）が、線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブに対する感受性があるＣＬＬ細胞を有していたことがわかった（図１０）。これらのうち、１１個は正常な感受性であり（ＩＣ50＜２μＭ）、３個は感受性が高く（ＩＣ50＜２ｘ１０-1μＭ）、３個は感受性が非常に高かった（ＩＣ50＜１０-2μＭ）。ハイスループット化合物試験の多重用量反応関係をさらに統合すると、薬物感受性スコア（ＤＳＳ）が、患者の三分の一がクリゾチニブに対して高い感受性があるＣＬＬ細胞を有することを示していることがわかった。
【0122】
予後の悪い患者は、線状ＡＬＫ阻害剤に対して感受性があるＣＬＬ細胞を有していることが多い
ＣＬＬは、上記に詳細を示すように、重鎖の免疫グロブリン可変遺伝子（ＩｇＶＨ）のＶ領域の変異負荷に応じて二つのサブタイプに分かれる。ＩｇＶＨに変異の無いサブタイプは予後が悪く、その一方で、ＩｇＶＨに変異があるもの（生殖細胞系に対して＜９８％の相同性）は予後がよりよい緩慢ＣＬＬに見られる。これらの結果は、予後の悪いサブタイプが線状ＡＬＫ阻害剤に対して高い応答率と感受性を有したことを示した（図１１）。これは、線状ＡＬＫ阻害剤が、ＩｇＶＨに変異の無い、予後の悪いサブタイプの治療に特に関係することを示唆する。
ＡＬＫ阻害剤に対する感受性について、１２人の新たな患者からのＣＬＬ細胞を調べた。図１２に示すように、ほぼ全員の患者が、セリチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブに対する感受性を示すＣＬＬ細胞を有した（ＤＳＳ＝１０というカットオフ値を使用すると、結果は、１１／１２、１０／１２、１１／１２、１２／１２である）。ブリガチニブは、１２人中４人の患者からのＣＬＬ細胞を阻害し、ロルラチニブは、１２人中０人の患者からのＣＬＬ細胞を阻害した。
ＣＬＬは、上記に詳細を示すように、重鎖の免疫グロブリン可変遺伝子（ＩｇＶＨ）のＶ領域の変異負荷に応じて二つのサブタイプに分かれる。ＩｇＶＨに変異の無いサブタイプは予後が悪く、その一方で、ＩｇＶＨに変異があるもの（生殖細胞系に対して＜９８％の相同性）は予後がよりよい緩慢ＣＬＬに見られる。これらの結果は、予後の悪いサブタイプが線状ＡＬＫ阻害剤に対して高い応答率と感受性を有したことを示した（図１１）。これは、線状ＡＬＫ阻害剤が、ＩｇＶＨに変異の無い、予後の悪いサブタイプの治療に特に関係することを示唆する。
ＡＬＫ阻害剤に対する感受性について、１２人の新たな患者からのＣＬＬ細胞を調べた。図１２に示すように、ほぼ全員の患者が、セリチニブ、クリゾチニブ、エンサルチニブ、およびエントレクチニブに対する感受性を示すＣＬＬ細胞を有した（ＤＳＳ＝１０というカットオフ値を使用すると、結果は、１１／１２、１０／１２、１１／１２、１２／１２である）。ブリガチニブは、１２人中４人の患者からのＣＬＬ細胞を阻害し、ロルラチニブは、１２人中０人の患者からのＣＬＬ細胞を阻害した。
【0123】
正常なメモリーＢ細胞、形質芽細胞、および形質細胞はＡＬＫNegＬＴＫPos
次に、正常なＢ細胞と、ナイーブ成熟Ｂ細胞、胚中心芽細胞、胚中心細胞、メモリーＢ細胞、前形質芽細胞、形質芽細胞、初期形質細胞および骨髄形質細胞を含むＢ細胞分化系統とを考察した。遺伝子発現（アレイに基づく）とＲＮＡシーケンシングは、メモリーＢ細胞形質芽細胞および形質細胞がすべてＬＴＫを発現したが、ＡＬＫを発現しなかったことを示した（図１３）。メモリーＢ細胞、形質芽細胞、および形質細胞は、したがって、ＡＬＫNegＬＴＫPosである。
次に、正常なＢ細胞と、ナイーブ成熟Ｂ細胞、胚中心芽細胞、胚中心細胞、メモリーＢ細胞、前形質芽細胞、形質芽細胞、初期形質細胞および骨髄形質細胞を含むＢ細胞分化系統とを考察した。遺伝子発現（アレイに基づく）とＲＮＡシーケンシングは、メモリーＢ細胞形質芽細胞および形質細胞がすべてＬＴＫを発現したが、ＡＬＫを発現しなかったことを示した（図１３）。メモリーＢ細胞、形質芽細胞、および形質細胞は、したがって、ＡＬＫNegＬＴＫPosである。
【0124】
正常なメモリーＢ細胞、形質芽細胞、および形質細胞は線状ＡＬＫ阻害剤に対して感受性がある
活性化されたＢ細胞は、３日後、Ｂ細胞芽球となった。かかる巨大化細胞は、高いレベルで抗体を分泌し、したがって分泌過多である。Ｂ細胞を３日目に刺激し、さらに３日間、線状ＡＬＫ阻害剤とともに培養した。サンプルはすべて、クリゾチニブに対して、１～１．５μＭのＩＣ50を有する同じような感受性を有していた（図１４）。結果は、芽球状のＢ細胞（メモリーＢ細胞芽球、形質芽細胞、および形質細胞）の少なくとも半分が、３日間の処理の間に死滅することを示している。細胞のサブタイプの感受性をさらに調べるために、Ｂ細胞を５日間刺激し、形質細胞を発生させた。最終段階の形質細胞は典型的にＩＲＦ４およびＢＬＩＭＰ１を発現し（図１５）、高レベルで抗体を分泌する。線状ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブまたはセリチニブ）の暴露は、感受性の高い形質細胞を効率よく死滅させた。形質細胞の応答は、ＩＣ50が０．８μＭ（クリゾチニブ）および＜０．００１μＭ（セリチニブ）であり、これは、形質細胞が線状ＡＬＫ阻害剤に対して非常に感受性があることを示している。他の活性化されたＢ細胞サブセットおよび形質芽細胞のすべてに減少が見られたが、形質細胞が線状ＡＬＫ阻害剤に対してもっとも感受性が高く、また、形質細胞はセリチニブに対して感受性が非常に高かった。
活性化されたＢ細胞は、３日後、Ｂ細胞芽球となった。かかる巨大化細胞は、高いレベルで抗体を分泌し、したがって分泌過多である。Ｂ細胞を３日目に刺激し、さらに３日間、線状ＡＬＫ阻害剤とともに培養した。サンプルはすべて、クリゾチニブに対して、１～１．５μＭのＩＣ50を有する同じような感受性を有していた（図１４）。結果は、芽球状のＢ細胞（メモリーＢ細胞芽球、形質芽細胞、および形質細胞）の少なくとも半分が、３日間の処理の間に死滅することを示している。細胞のサブタイプの感受性をさらに調べるために、Ｂ細胞を５日間刺激し、形質細胞を発生させた。最終段階の形質細胞は典型的にＩＲＦ４およびＢＬＩＭＰ１を発現し（図１５）、高レベルで抗体を分泌する。線状ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブまたはセリチニブ）の暴露は、感受性の高い形質細胞を効率よく死滅させた。形質細胞の応答は、ＩＣ50が０．８μＭ（クリゾチニブ）および＜０．００１μＭ（セリチニブ）であり、これは、形質細胞が線状ＡＬＫ阻害剤に対して非常に感受性があることを示している。他の活性化されたＢ細胞サブセットおよび形質芽細胞のすべてに減少が見られたが、形質細胞が線状ＡＬＫ阻害剤に対してもっとも感受性が高く、また、形質細胞はセリチニブに対して感受性が非常に高かった。
【0125】
クリゾチニブは異種移植されたＮＳＧマウスの形質細胞を死滅させる
ＡＬＫNegＬＴＫPos形質細胞株をＮＳＧマウスに大腿内注射した。クリゾチニブでのマウスの治療は、形質細胞の密度を減少させ（図１６、ルシフェラーゼ依存シグナル、ＩＶＩＳ光学撮像において）、これは形質細胞株がインビボでも阻害されうることを示している。
ＡＬＫNegＬＴＫPos形質細胞株をＮＳＧマウスに大腿内注射した。クリゾチニブでのマウスの治療は、形質細胞の密度を減少させ（図１６、ルシフェラーゼ依存シグナル、ＩＶＩＳ光学撮像において）、これは形質細胞株がインビボでも阻害されうることを示している。
【0126】
セリチニブはインビトロで形質細胞による抗体分泌を阻害する
形質細胞の分泌が線状ＡＬＫ阻害剤で阻害されるかどうかを調べた（図１６）。３時間の暴露により、形質細胞株から分泌された免疫グロブリンのレベルが低下し、これは、図５Ａ～Ｃに示されたような、小胞体からゴルジへの輸送の遮断を示唆している。
形質細胞の分泌が線状ＡＬＫ阻害剤で阻害されるかどうかを調べた（図１６）。３時間の暴露により、形質細胞株から分泌された免疫グロブリンのレベルが低下し、これは、図５Ａ～Ｃに示されたような、小胞体からゴルジへの輸送の遮断を示唆している。
【0127】
肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞はＡＬＫNegＬＴＫPosでありクリゾチニブに対して感受性があった
３６５個のＨＣＣからのＲＮＡ配列データから、患者全員がＡＬＫNegであるＨＣＣサンプルを有していたことがわかった。前記サンプルの約四分の一はＬＴＫPosであり、したがってＡＬＫNegＬＴＫPosであった。線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブが細胞増殖阻害薬であるドキソルビシンと共働作用する実験において、高分化型のＨＣＣ細胞株ＨｅｐＧからの細胞は、前記線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブに対して感受性があることがわかった（図１７）。このように、クリゾチニブは、ＨｅｐＧ ＨＣＣ細胞をアポトーシスに感作させた。
３６５個のＨＣＣからのＲＮＡ配列データから、患者全員がＡＬＫNegであるＨＣＣサンプルを有していたことがわかった。前記サンプルの約四分の一はＬＴＫPosであり、したがってＡＬＫNegＬＴＫPosであった。線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブが細胞増殖阻害薬であるドキソルビシンと共働作用する実験において、高分化型のＨＣＣ細胞株ＨｅｐＧからの細胞は、前記線状ＡＬＫ阻害剤クリゾチニブに対して感受性があることがわかった（図１７）。このように、クリゾチニブは、ＨｅｐＧ ＨＣＣ細胞をアポトーシスに感作させた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】