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特表2022-554284ＣＤ３８ノックアウト初代および増殖ヒトＮＫ細胞の生成
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-28
(54)【発明の名称】ＣＤ３８ノックアウト初代および増殖ヒトＮＫ細胞の生成
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20221221BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221221BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221221BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/4035 20060101ALI20221221BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20221221BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20221221BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221221BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221221BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20221221BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20221221BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 N
A61K31/454
A61K31/4035
A61K31/573
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/09 Z
C12N5/10
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525329
(86)(22)【出願日】2020-11-02
(85)【翻訳文提出日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 US2020058565
(87)【国際公開番号】W WO2021087466
(87)【国際公開日】2021-05-06
(31)【優先権主張番号】62/928,524
(32)【優先日】2019-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515041446
【氏名又は名称】リサーチ インスティテュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＡＴ ＮＡＴＩＯＮＷＩＤＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ
(71)【出願人】
【識別番号】508280195
【氏名又は名称】ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100186897
【弁理士】
【氏名又は名称】平川 さやか
(72)【発明者】
【氏名】リー，ディーン アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】カララウディ，メイサム ナエイミ
(72)【発明者】
【氏名】ギオール，ガブリエル
(72)【発明者】
【氏名】永井 雄也
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C085AA14
4C085CC23
4C085GG02
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC11
4C086BC22
4C086DA10
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むがこれらに限定されない、がんを治療するための、表面抗原分類３８（ＣＤ３８）遺伝子のノックアウトを含む遺伝子改変ＮＫ細胞およびそれを使用する方法が開示される。
【選択図】図１２‐３
【選択図】図１２‐３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記がんが、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含む、請求項１に記載のがんを治療する方法。
【請求項3】
前記対象に、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡを含む抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項１または２に記載のがんを治療する方法。
【請求項4】
前記抗がん剤が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、またはＭＯＲ２０２を含む、請求項３に記載のがんを治療する方法。
【請求項5】
前記対象に、血管新生阻害剤およびステロイドを投与することをさらに含む、請求項３または４に記載のがんを治療する方法。
【請求項6】
前記血管新生阻害剤が、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラストを含む、請求項５に記載のがんを治療する方法。
【請求項7】
前記ステロイドが、グルココルチコイドを含む、請求項５に記載のがんを治療する方法。
【請求項8】
前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、または酢酸フルドロコルチゾンを含む、請求項７に記載のがんを治療する方法。
【請求項9】
操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法であって、ａ）改変される標的ＮＫ細胞を得ることと、
ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、
ｃ）エレクトロポレーションを介して、前記標的ＮＫ細胞に、前記標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞を生成することと、
ｄ）前記操作されたＮＫ細胞を前記対象に移植することと、を含む、方法。
【請求項10】
前記対象が、がんを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＮＫ細胞が、エクスビボで改変されており、かつ改変後に前記対象に移植される、初代ＮＫ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記ＮＫ細胞が、自己ＮＫ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記ＮＫ細胞が、同種ドナー源由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記ＮＫ細胞を、前記対象に投与する前に、照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに増殖させる、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
前記対象への前記ＮＫ細胞の移植後に、前記ＮＫ細胞を、ＩＬ－２１または照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞の投与を介して、前記対象において増殖させる、請求項９に記載の方法。
【請求項16】
前記ＲＮＰ複合体が、前記ＣＤ３８遺伝子を標的とする、請求項９に記載の方法。
【請求項17】
請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法によって作製された表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む、遺伝子改変ＮＫ細胞。
【請求項18】
対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項１７に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞を投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記対象に、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡを含む抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記抗がん剤が、抗ＣＤ３８抗体を含む、請求項１９に記載のがんを治療する方法。
【請求項21】
前記抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、またはＭＯＲ２０２を含む、請求項２０に記載のがんを治療する方法。
【請求項22】
前記がんが、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のがんを治療する方法。
【請求項23】
抗ＣＤ３８免疫療法を受ける対象においてＮＫ細胞のフラトリサイドを低減する方法であって、前記対象に、請求項１７に記載の遺伝子改変ＮＫ細胞を投与することを含む、方法。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月３１日に出願された、米国仮特許出願第６２／９２８，５２４号の利益を主張し、参照により本明細書に明示的に援用される。
本出願は、２０１９年１０月３１日に出願された、米国仮特許出願第６２／９２８，５２４号の利益を主張し、参照により本明細書に明示的に援用される。
【0002】
ＩＩ．背景技術
がん免疫療法は、近年進歩している。遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、がん免疫療法で成功裏に展開された操作された免疫細胞の優れた例である。これらの細胞は、最近、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍に対する治療のためにＦＤＡによって承認されたが、これまでのところ、成功は、少数の標的化可能な抗原を有する疾患に限定され、そのような限られた抗原レパートリーを標的にすることは、免疫逃避によって失敗しやすい。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞によって引き起こされる移植片対宿主病のリスクのために、自己Ｔ細胞の使用に焦点が当てられてきた。対照的に、ＮＫ細胞は、抗原非依存的な様式で腫瘍標的を死滅させることができ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさないため、がん免疫療法の優れた候補となる。抗体と組み合わせた場合、ＮＫ細胞および抗体の標的化およびエフェクター機構は、ＣＡＲ Ｔ細胞のものと類似している。残念なことに、一部のがんについては、現在の治療は、がんを標的とするだけでなく、患者のＮＫ細胞集団も枯渇させる可能性がある。例えば、ダラツムマブは、多発性骨髄腫細胞および白血病でレベルの上昇が見られるＣＤ３８を標的とする。ダラツムマブの抗腫瘍活性は、ＮＫ細胞に依存する。しかしながら、ＣＤ３８はまた、ＮＫ細胞の表面でも高レベルで発現され、ダラツムマブの投与により、ＮＫ細胞のフラトリサイドがもたらされ、ダラツムマブの有効性が制限される。したがって、必要なのは、ＮＫ細胞のフラトリサイドの問題を克服することができる新しい免疫療法および／または治療方法である。
ＩＩＩ．
がん免疫療法は、近年進歩している。遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、がん免疫療法で成功裏に展開された操作された免疫細胞の優れた例である。これらの細胞は、最近、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍に対する治療のためにＦＤＡによって承認されたが、これまでのところ、成功は、少数の標的化可能な抗原を有する疾患に限定され、そのような限られた抗原レパートリーを標的にすることは、免疫逃避によって失敗しやすい。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、同種Ｔ細胞によって引き起こされる移植片対宿主病のリスクのために、自己Ｔ細胞の使用に焦点が当てられてきた。対照的に、ＮＫ細胞は、抗原非依存的な様式で腫瘍標的を死滅させることができ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさないため、がん免疫療法の優れた候補となる。抗体と組み合わせた場合、ＮＫ細胞および抗体の標的化およびエフェクター機構は、ＣＡＲ Ｔ細胞のものと類似している。残念なことに、一部のがんについては、現在の治療は、がんを標的とするだけでなく、患者のＮＫ細胞集団も枯渇させる可能性がある。例えば、ダラツムマブは、多発性骨髄腫細胞および白血病でレベルの上昇が見られるＣＤ３８を標的とする。ダラツムマブの抗腫瘍活性は、ＮＫ細胞に依存する。しかしながら、ＣＤ３８はまた、ＮＫ細胞の表面でも高レベルで発現され、ダラツムマブの投与により、ＮＫ細胞のフラトリサイドがもたらされ、ダラツムマブの有効性が制限される。したがって、必要なのは、ＮＫ細胞のフラトリサイドの問題を克服することができる新しい免疫療法および／または治療方法である。
ＩＩＩ．
【発明の概要】
【0003】
ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含む遺伝子改変ＮＫ細胞に関連する方法および組成物が開示される。
【0004】
一態様では、対象におけるがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。一部の態様では、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法は、対象に、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡ（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体など）を投与することをさらに含み得る。
【0005】
また、任意の先行する態様のがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラスト）およびステロイド（例えば、これらに限定されないが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、酢酸フルドロコルチゾンを含むグルコルチコイドなど）を投与することをさらに含む。
【0006】
一態様では、ＣＤ３８を直接発現しないが、がん微小環境内の他の細胞（骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を含むが、これに限定されない）が標的とされ得るがんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が、本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。
【0007】
一態様では、ＮＫ細胞（例えば、初代または増殖ＮＫ細胞など）を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８など）の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を取得することと、ｂ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入して、ＣＤ３８ノックアウト初代または増殖ＮＫ細胞を生成することと、を含む。
【0008】
また、任意の先行する態様の方法であって、ＮＫ細胞のゲノムが、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入、内因性ＤＮＡ断片の欠失、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座、またはこれらの組合せによって改変される方法も、本明細書に開示される。
【0009】
一態様では、任意の先行する態様のＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、ＮＫ細胞（例えば、初代または増殖ＮＫ細胞）が、形質導入（エレクトロポレーションなど）の前の４、５、６、または７日間、ＩＬ－２および／または照射されたフィーダー細胞の存在下でインキュベートされる方法が、本明細書に開示される。
【0010】
また、任意の先行する態様のＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、エレクトロポレーション後に、照射された膜結合インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）発現フィーダー細胞とともに、改変ＮＫ細胞を増殖することをさらに含む方法も、本明細書に開示される。
【0011】
一態様では、任意の先行する態様の方法で作製される改変ＮＫ細胞が、本明細書に開示される。一態様では、改変ＮＫ細胞は、ＣＤ３８をコードする遺伝子のノックアウトを含むことができる。例えば、別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞が本明細書に開示され、薬剤として使用するための、好ましくは、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法で使用するための、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞が本明細書に開示され、（ｉ）それを必要とする対象における酸化呼吸能を増加させる方法、または（ｉｉ）それを必要とする対象における細胞外ＮＡＤの加水分解を制限し、酸化還元的呼吸能を改善する方法で使用するための、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。同様に、遺伝子改変ＮＫ細胞の使用も本明細書に開示され、薬剤の製造において、好ましくは、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防するための薬剤の製造において、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞の使用が本明細書に開示され、（ｉ）それを必要とする対象における酸化呼吸能を増加させるための、または（ｉｉ）それを必要とする対象における細胞外ＮＡＤの加水分解を制限し、酸化還元呼吸能を改善するための薬剤の製造における、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。
【0012】
また、がんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、がんを有する対象に、任意の先行する態様の改変ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞）を投与することを含む。一部の態様では、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和および／または予防する方法は、対象に、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡ（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体など）を投与することをさらに含み得る。
【0013】
一態様では、がんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、任意の先行する態様の改変ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞）と、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡ（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体など）とを投与することを含み、対象に、血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラスト）と、ステロイド（例えば、これらに限定されないが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、または酢酸フルドロコルチゾンを含むグルコルチコイドなど）とを投与することをさらに含む。
【0014】
また、抗ＣＤ３８免疫療法を受ける対象において、ＮＫ細胞のフラトリサイドを低減する方法も本明細書に開示され、対象に、任意の先行する態様の遺伝子改変ＮＫ細胞を投与することを含む。一態様では、抗ＣＤ３８免疫療法は、対象に、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含むが、これらに限定されない抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み得る。
【0015】
一態様では、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、当該方法は、ａ）改変される標的ＮＫ細胞（初代ＮＫ細胞または増殖ＮＫ細胞など）を得ることと、ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、ｃ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８遺伝子をノックアウトするように改変されているＮＫ細胞など）を生成することと、ｄ）操作されたＮＫ細胞を対象に移植することと、を含む。
【0016】
また、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法も本明細書に開示され、ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞（例えば、自己ＮＫ細胞、または同種ドナー源由来のＮＫ細胞など）であり、エクスビボで改変され、改変後に対象に移植される（例えば、ＣＤ３８遺伝子をノックアウトするように改変されているＮＫ細胞など）。
【0017】
一態様では、操作されたＮＫ細胞を、任意の先行する態様の操作されたＮＫ細胞を必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞は、対象に改変ＮＫ細胞を投与する前に、投与すると同時に、または投与した後に、インビトロで（例えば、ｍｂＩＬ－２１を発現する照射されたフィーダー細胞とともに）またはインビボで（例えば、ＩＬ－２１を投与して）増殖される。
【0018】
一態様では、操作されたＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞）を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、養子移植される改変ＮＫ細胞を受ける対象は、がんを有する。
【0019】
また、がんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防するために対象に投与される抗ＣＤ３８免疫療法（例えば、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含むが、これらに限定されない）、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡなど）の有効性を増加させる方法も本明細書に開示され、対象に、任意の先行する態様の改変ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞など）を投与することを含む。
ＩＶ．
ＩＶ．
【図面の簡単な説明】
【0020】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、一部の実施形態を例示し、説明とともに、開示される組成物および方法を例示する。
【0021】
【図1】野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞でのＣＤ３８の発現を示す。
【図2】野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞におけるダラツムマブ媒介性フラトリサイドに対する耐性の比較を示す。
【図4】ダラツムマブの存在下または不在下で、野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞の両方について様々なＮＫ細胞比でＲＰＭＩ８２２６ヒト多発性骨髄腫細胞を殺傷する有効性を示す。
【図5】ダラツムマブの存在下または不在下で、野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞の両方について様々なＮＫ細胞比でＭＭ．１ｓヒト多発性骨髄腫細胞を殺傷する有効性を示す。
【図6】ダラツムマブの存在下または不在下で、野生型およびＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞の両方について様々なＮＫ細胞比でＨ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞を殺傷する有効性を示す。
【図7】７Ａ～７Ｂは、エクスビボで増殖したＮＫ細胞の免疫表現型を示す。図７Ａは、図示される刺激後１４日目のＮＫ細胞の純度を示す。図７Ｂは、図示される同じドナーのＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞上のＣＤ１６発現の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。各図は、ＣＤ１６を発現するＮＫ細胞の割合を示す。アイソタイプ対照は、塗りつぶしたヒストグラムで示されている。
【図9】Ｃａｓ９／ＲＮＰによって影響を受ける遺伝子の発現を示す。表３の高度に影響を受けた遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑによる相対的ｍＲＮＡ発現。
【図10-1】図１０Ａ～１０Ｆは、ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の耐性を示す。図１０Ａは、コンジュゲーションアッセイの代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ｂは、図示されるコンジュゲーションアッセイの要約データを示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。図１０Ｃは、フラトリサイドアッセイの代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ｄは、対照試料（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）と比較した、ＤＡＲＡで処理されたＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の生存率を示す。図１０Ｅは、ＤＡＲＡまたは生理食塩水による処置後７日目のＮＳＧマウスの末梢血（ＰＢ）の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ｆは、処置中のＮＳＧマウスにおけるＮＫ細胞の持続性の要約データを示す。７日目のＰＢにおけるヒトＮＫ細胞の頻度、および９日目の脾臓および骨髄におけるそれらの絶対数を示す（ｎ＝５、平均値±ＳＤ）。
【図11-1】図１１Ａ～１１Ｄは、ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに対するＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞の耐性を示す。図１１Ａは、ＣＤ１６ＷＴおよびＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図１１Ｂは、Ｈ９２９細胞株を、ＤＡＲＡ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下で、ＣＤ１６ＷＴまたはＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞と４時間インキュベートしたことを示す。図１１Ｃは、図示されるＤＡＲＡの存在下での、Ｈ９２９細胞株に対する対のＣＤ１６ＷＴおよびＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を示す。図１１Ｄは、ＤＡＲＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で４時間または２４時間培養されたＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞が、フラトリサイドの証拠を示すことを示す。
【図12-1】図１２Ａ～１２Fは、ＭＭ細胞株および初代ＭＭ細胞に対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性の増強を示す。図１２Ａは、ＮＫ細胞および骨髄腫細胞株のＣＤ３８発現の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。各図は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。アイソタイプ対照は、塗りつぶしたヒストグラムで示されている。骨髄腫細胞株（図１２Ｂ～１２Ｃ）、ならびに代表的な初代ＭＭ試料（図１２Ｄ）に対する対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性およびＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性の代表的なデータ。図１２Ｅは、初代ＭＭ試料に対する、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を示す（Ｅ：Ｔ比は、０．１：１）。図１２Ｆは、ＤＡＲＡの存在下での、初代ＤＡＲＡ耐性ＭＭ細胞に対する対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図13】ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞と比較したＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＡＤＣＣの改善を示し、ＭＭ細胞標的上のＣＤ３８発現レベルと相関する。Ｘ軸は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞に対する標的細胞のＭＦＩ（ＣＤ３８）の相対比を示す。Ｙ軸は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞と比較した、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＡＤＣＣの相対的な増加を示す。ＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９、およびＯＰＭ－２には、ＡＤＣＣの値（Ｅ／Ｔ＝５、４時間のアッセイ）を使用し、ＲＰＭＩ８２２６および患者試料には、ＡＤＣＣの値（Ｅ／Ｔ＝０．１、２４時間のアッセイ）を使用する。Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数（ｒ）とｐ値を提示する。
【図14】ＡＴＲＡとのインキュベーションの４８時間後のＭＭ細胞株におけるＣＤ３８発現を示す。対照試料およびＡＴＲＡ処理試料は、それぞれ黒色および灰色の線で示されている。未染色対照は、塗りつぶしたヒストグラムで示されている。
【図15-1】図１５Ａ～１５Ｇは、ＤＡＲＡ媒介性ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＡＴＲＡの阻害効果を示す。図１５Ａ～１５Ｂは、５０ｎＭのＡＴＲＡで４８時間前処理した骨髄腫細胞株に対する、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性およびＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性を示す（平均値±ＳＤ）。図１５Ｃでは、左パネルは、ＡＴＲＡ処置中または療法なしの患者由来のＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞）におけるＣＤ３８発現の代表的なＦＡＣＳ分析データを示す。凍結した末梢血単核細胞を解凍し、一度に分析した。右パネルは、３人の異なる患者について、療法なしと比較した、ＡＴＲＡ療法中のＮＫ細胞のＭＦＩ（ＣＤ３８）の倍率の増加を示す。図１５は、５０ｎＭのＡＴＲＡまたは溶媒対照で４８時間インキュベーションした後のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞におけるＣＤ３８発現の代表的なＦＡＣＳ分析データを示す。対照試料およびＡＴＲＡ処理試料は、それぞれ黒色および灰色の線で示されている。未染色対照は、塗りつぶしたヒストグラムで示されている。図１５Ｅは、対照試料の生存率と比較した、５０ｎＭのＡＴＲＡまたは溶媒対照の存在下、ＤＡＲＡで４８時間処理されたＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の生存率を示す（平均値±ＳＤ）。図１５Ｆ～１５Ｇ、５０ｎＭのＡＴＲＡまたは溶媒対照の存在下での４８時間の細胞傷害性アッセイにおける、骨髄腫細胞株に対する対ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性およびＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性。Ｅ：Ｔ比は、ＭＭ．１Ｓでは０．２５：１、ＫＭＳ－１１では０．５：１である（平均値±ＳＤ）。
【図16-1】図１６Ａ～１６Ｇは、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の好ましい代謝リプログラミングを示す。図１６Ａは、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞（ｎ＝６）の正規化ＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいて、インジェニュイティ経路解析（ＩＰＡ）によって決定される、有意に変化した経路（コレステロール生合成およびＯＸＰＨＯＳ）のＤＥＧのヒートマップを示す。図１６Ｂは、ＤＥＧの主成分分析を示し、広範なドナー間の変動にもかかわらず、各ドナーに対するＣＤ３８欠失の一貫した効果を示す。図１６Ｃは、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の代謝分析の要約データを示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ）。図１６Ｄは、図１６Ｃに由来する基底ＯＣＲ、ＥＣＡＲ、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ、およびＳＲＣのグラフィック分析を示す。すべての実験は、５重複を使用して達成された。図１６Ｅ～１６Ｆは、ＯＣＲおよびＳＲＣ（図１６Ｅ）、ならびにＥＣＡＲおよび予備解糖能（図１６Ｆ）を含む、追加の３つのドナーの分析を示す。図１６Ｇは、６つすべてのドナーのＯＣＲおよびＳＲＣの分析を示す。
【図17】６つの異なる対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の正規化ＲＮＡ－ｓｅｑデータのボルケーノプロットを示す。ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞と比較して、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞における最も有意に変化した遺伝子を示す。
【図18】ＤＡＲＡ処理中の再発症例からのＭＭ細胞のＣＤ３８発現を示す。ＤＡＲＡ耐性症例由来のＮＫ細胞およびＢＭＳＣを、ＦＩＴＣで標識されたマルチエピトープ抗ＣＤ３８抗体で染色した後、ＡＰＣで標識された抗ＦＩＴＣ抗体で染色した。ＭＭ細胞を、ＣＤ１３８＋細胞と定義した。染色試料のＭＦＩ（ＣＤ３８）および蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照（マルチエピトープ抗ＣＤ３８抗体なし）を示す。
【図19】ＣＤ３８の欠失は、ＮＡＤリサイクリングを低減し、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比の増加をもたらす。
【図20】ミトコンドリア活性の増加を示唆する酸化的代謝への著しい代謝のシフトにもかかわらず、ＣＤ３８ノックアウトでは、ミトコンドリアの膜電位が変化しないことを示す。
【図21】酸化的代謝への著しい代謝のシフトにもかかわらず、ＣＤ３８ノックアウトでは、低グルコース設定におけるＮＫ細胞の機能が変化しないことを示す。Ｖ．
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および説明する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されず、特に明記しない限り、特定の試薬（当然、変化し得るため）に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0023】
Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの」（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段明らかに指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
【0024】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各終点は、他の終点と関連して、および他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値は、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、次いで「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、値が「値以下」であることが開示される場合、「値以上」および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントの任意の組合せの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５との間に加えて、１０超、１０以上、１０に等しい、１５未満、１５以下、および１５に等しいが開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【0025】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有するべく定義されたいくつかの用語を参照されたい。
【0026】
「任意選択的」または「任意選択的に」とは、後で説明する事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、説明には、当該事象または状況が生じる事例および生じない事例を含む。
【0027】
「プライマー」は、ある種の酵素マニピュレーションを支持することができ、酵素マニピュレーションが生じ得るように標的核酸とハイブリダイズすることができるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素マニピュレーションを妨げない、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組合せから作製することができる。
【0028】
「プローブ」は、典型的には、例えばハイブリダイゼーションを通して、配列特異的な様式で標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野で十分に理解され、本明細書で論じられる。典型的には、プローブは、当該技術分野で入手可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組合せから作製することができる。
【0029】
特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく（したがって、ＤＮＡおよびｍＲＮＡはともにタンパク質をコードする）、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ガイドＲＮＡなど）をコードしてもよい。
【0030】
「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、（ＤＮＡの場合）、インビトロまたはインビボでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドンおよび３’末端（Ｃ末端）での翻訳停止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列には、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成核酸が挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
【0031】
本明細書で使用される場合、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される「天然に存在する」または「未改変」または「野生型」という用語は、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ実験室内でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、野生型である（および天然に存在する）。
【0032】
「増加」は、より大きな量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。増加は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個別、中央値、または平均の増加であり得る。よって、増加は、増加が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の増加であり得る。
【0033】
「減少」は、より小さな量の症状、疾患、組成物、状態、または活性をもたらす任意の変化を指すことができる。物質を含む遺伝子産物の遺伝子出力が、物質を含まない遺伝子産物の出力と比較して少ない場合、物質は、遺伝子の遺伝子出力を減少させるとも理解される。また、例えば、減少は、症状が以前に観察されたものよりも少ないように、障害の症状の変化であり得る。減少は、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個別、中央値、または平均の減少であり得る。よって、減少は、減少が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の減少であり得る。
【0034】
「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。一態様では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、またはネコであり得る。対象は、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス、またはモグラであり得る。よって、対象は、ヒトまたは獣医患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。
【0035】
「治療」という用語は、疾患、病理学的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防する意図を有する患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の改善に特異的に向けられた治療を含み、また因果的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向けられた治療を含む。加えて、この用語は、姑息的治療、すなわち、疾患、病理学的状態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的に、もしくは完全に阻害することを目的とした治療、および支持的治療、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けられた別の特定の療法を補足するために使用される治療を含む。
【0036】
「対象への投与」には、対象に薬剤を導入または送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術）などを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される「同時投与」（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、またはａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、または本質的に互いの直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」とは、例えば、循環系またはリンパ系への入口を通して、対象の身体の広範な領域（例えば、身体の５０％超の領域）に薬剤を導入または送達する経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域またはそれに直接隣接する領域に薬剤を導入または送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入または送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、または無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与および他者による投与が含まれる。
【0037】
薬剤の「有効量」とは、所望の効果を提供するのに十分な量の薬剤を指す。「有効」である薬剤の量は、対象の年齢および一般状態、特定の薬剤（複数可）などの多くの要因に応じて、対象によって異なるであろう。したがって、定量化された「有効量」を指定することは必ずしも可能ではない。しかしながら、任意の対象の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験を使用して当業者によって決定されてもよい。また、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、薬剤の「有効量」とは、治療上有効量および予防上有効量の両方をカバーする量も指すことができる。治療効果を達成するのに必要な薬剤の「有効量」は、対象の年齢、性別、および体重などの要因に従って変化し得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、一日に用量をいくつかに分割して投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例して低減してもよい。
【0038】
「薬学的に許容される」構成要素は、生物学的または他の望ましくないものではない構成要素、すなわち、著しく望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される製剤の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に組み込んで、本明細書に記載のように対象に投与することができる構成要素を指すことができる。ヒトへの投与に関して使用される場合、この用語は、一般に、構成要素が毒性試験および製造試験の必要な基準を満たしているか、またはそれが、米国食品医薬品局によって調製された不活性成分ガイドに含まれることを意味する。
【0039】
「薬学的に許容される担体」（「担体」と称されることがある）は、一般に安全かつ無毒の薬学的または治療組成物の調製において有用な担体または賦形剤を意味し、獣医学的および／またはヒトの薬学的または治療的使用が許容される担体を含む。「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、限定されないが、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（油／水もしくは水／油エマルジョンなど）、および／または様々な種類の湿潤剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤で使用するために当該技術分野でよく知られた他の材料、および本明細書にさらに記載される材料を包含するが、これらに限定されない。
【0040】
「薬理学的活性」（または単に「活性」）は、「薬理学的活性」誘導体または類似体において、親化合物と同じ種類の薬理学的活性を有し、程度がほぼ同等な誘導体または類似体（例えば、塩、エステル、アミド、複合体、代謝産物、異性体、断片など）を指し得る。
【0041】
「治療剤」は、有益な生物学的効果を有する任意の組成物を指す。有益な生物学的効果としては、治療効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態の治療、および予防効果、例えば、障害または他の望ましくない生理学的状態（例えば、非免疫原性がん）の予防の両方が挙げられる。これらの用語はまた、本明細書に具体的に言及される有益な薬剤の薬理学的に許容される活性な誘導体を包含し、限定されないが、塩、エステル、アミド、前駆薬剤、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含む。「治療剤」という用語が使用される場合、次いで、または特定の薬剤が具体的に同定される場合、この用語は、薬剤自体、ならびに薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、前駆薬剤、複合体、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むことを理解されたい。
【0042】
組成物（例えば、薬剤を含む組成物）の「治療上有効量」または「治療上有効用量」は、所望の治療結果を得るのに有効な量を指す。一部の実施形態では、所望の治療結果は、Ｉ型糖尿病の制御である。一部の実施形態では、所望の治療結果は、肥満の制御である。所与の治療剤の治療上有効量は、典型的には、治療される障害または疾患の種類および重症度、ならびに対象の年齢、性別、および体重などの要因に関して異なるであろう。この用語はまた、疼痛緩和などの所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量、または治療剤の送達の速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、治療される状態、対象の耐容性、投与される薬剤および／または薬剤製剤（例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤の濃度など）、ならびに当業者によって理解される様々な他の因子に従って異なるであろう。場合によっては、所望の生物学的応答または医学的応答は、数日、数週間、または数年にわたって、組成物を対象に複数回投与した後に達成される。
【0043】
本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に援用される。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で論じられ、それらに含まれる材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に援用される。
【0044】
Ｂ．ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞を投与することを含む、がんを治療する方法
多発性骨髄腫は、最も頻繁に診断される血液がんの１つである。最近、ＦＤＡは、多発性骨髄腫を治療するための治療用モノクローナル抗体であるダラツムマブを承認した。ダラツムマブは、標的がん細胞上のＣＤ３８分子に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および他の機構を介して細胞死を媒介する。イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、およびＭＯＲ２０２を含む他の抗ＣＤ３８抗体も、がんの治療のために開発されている。これらの抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、ＮＫ細胞によって媒介される。しかしながら、ＣＤ３８を標的とする薬剤の使用は、その有効性を制限する負の効果を有する。ＮＫ細胞がその細胞表面でＣＤ３８を発現するため、これらの抗ＣＤ３８抗体の使用により、それらの有効性の活性成分であるＮＫ細胞の殺傷（フラトリサイド）がもたらされる。
多発性骨髄腫は、最も頻繁に診断される血液がんの１つである。最近、ＦＤＡは、多発性骨髄腫を治療するための治療用モノクローナル抗体であるダラツムマブを承認した。ダラツムマブは、標的がん細胞上のＣＤ３８分子に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および他の機構を介して細胞死を媒介する。イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、およびＭＯＲ２０２を含む他の抗ＣＤ３８抗体も、がんの治療のために開発されている。これらの抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、ＮＫ細胞によって媒介される。しかしながら、ＣＤ３８を標的とする薬剤の使用は、その有効性を制限する負の効果を有する。ＮＫ細胞がその細胞表面でＣＤ３８を発現するため、これらの抗ＣＤ３８抗体の使用により、それらの有効性の活性成分であるＮＫ細胞の殺傷（フラトリサイド）がもたらされる。
【0045】
これらの抗ＣＤ３８療法によるＮＫ細胞のフラトリサイドの問題を克服し、がんを治療するために、ＣＤ３８の発現をノックアウトするように操作されたＮＫ細胞の投与は、これらの両方の問題に対処することができることが認識された。要するに、操作されたＮＫ細胞は、抗ＣＤ３８免疫療法によって引き起こされるＮＫ細胞枯渇に対して耐性であり、抗ＣＤ３８抗体の有効性を増加させる。したがって、一態様では、がんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防するために対象に投与される抗ＣＤ３８免疫療法（例えば、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含むが、これらに限定されない）、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡなど）の有効性を増加させる方法も本明細書に開示され、対象に、任意の先行する態様の改変ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞など）を投与することを含む。
【0046】
この増加した有効性は、がん患者にとって非常に有益であることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、対象におけるがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。一部の態様では、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和および／または予防する方法は、対象に、ＣＤ３８を標的とする小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、またはｓｉＲＮＡ（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体など）を投与することをさらに含み得る。
【0047】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、およびそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患または状態の強度または頻度、疾患または状態の症状、あるいは疾患または状態の根本的な原因を、部分的または完全に予防、遅延、治癒、快癒、緩和、軽減（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更、治療（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、安定化、軽減（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、および／または低減することを、意図または目的とする組成物の投与が含まれる。本発明による治療は、防止的、予防的、姑息的、または治療的に適用され得る。予防的治療は、発症前（例えば、がんの明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、がんの初期の兆候および症状時）、または確立されたがんの発達後に対象に投与される。予防的投与は、感染症の症状の発現の１日（数日）から数年前に行われ得る。
【0048】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」とは、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去が含まれ得るが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然または対照レベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％低減を含んでもよい。よって、低減は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。
【0049】
「低減する」または単語の他の形態、例えば、「低減すること」または「低減」とは、事象または特徴（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは典型的には、いくつかの標準値または期待値に関し、換言すれば、それは相対的であるが、標準値または相対値が参照されることが必ずしも必要ではないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減する」とは、標準または対照と比較して、腫瘍の成長速度を低減することを意味する。
【0050】
「予防する」または単語の他の形態、例えば、「予防すること」または「予防」とは、特定の事象もしくは特徴を停止すること、特定の事象もしくは特徴の発生もしくは進行を安定もしくは遅延させること、または特定の事象もしくは特徴が生じる可能性を最小限に抑えることを意味する。予防するとは、典型的には、例えば、低減するよりも絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用される場合、何かは予防されないが低減することができるが、低減される何かは予防することもできる。同様に、何かは低減されないが予防することができるが、予防される何かは低減することもできる。低減または予防が使用される場合、特に具体的に指示されない限り、他の単語の使用も明示的に開示されることが理解される。
【0051】
遺伝子改変ＮＫ細胞（本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞のうちのいずれかなど）および抗ＣＤ３８剤（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／もしくはＭＯＲ２０２など）、ならびに／または血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、もしくはアプレミラストなど）およびステロイド（例えば、これらに限定されないが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレニゾロン、トリアムシノロン、もしくは酢酸フルドロコルチゾンを含むグルコルチコイドなど）、ならびに／またはＡＴＲＡを投与することを含む、がんおよび／もしくは転移（例えば、多発性骨髄腫、ＡＭＬ、Ｔ－ＡＬＬ、および／もしくはＢＰＤＣＮなど）を治療、減少、阻害、低減、緩和および／もしくは予防する方法は、任意の抗ＣＤ３８剤を投与する前に、投与するのと同時に、および／もしくは投与した後に、投与され得ることが理解され、かつ本明細書で企図される。一部の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞（例えば、本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞のうちのいずれか）は、任意の抗ＣＤ３８剤の投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０分、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３ １４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６時間、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３５、４２、４９、５４、もしくは６０日前または後に、対象に投与することができる。
【0052】
また、本明細書に記載されるがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラスト）およびステロイド（例えば、これらに限定されないが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、酢酸フルドロコルチゾンを含むグルコルチコイドなど）を投与することをさらに含む。
【0053】
開示される改変ＮＫ細胞および改変ＮＫ細胞の養子移植の方法は、がんに対する効果的な免疫療法であり得ることが理解され、本明細書で企図される。本開示の方法および組成物を使用して、がんなどの未制御な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療することができる。異なる種類のがん（ｃａｎｃｅｒｓ）の非限定的なリストは、以下のとおりである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、固形組織のがん、扁平上皮細胞がん、腺がん、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性がん、または一般的ながん。
【0054】
開示される組成物を使用して治療することができる代表的だが、非限定的ながんのリストは、以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病（ＡＭＬを含むが、これに限定されない）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、膀胱がん、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、脳がん、神経系がん、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部扁平上皮がん、肺がん（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、神経芽腫／神経膠芽腫、卵巣がん、皮膚がん、多発性骨髄腫、肝臓がん、黒色腫、（口腔、咽頭、喉頭、および肺の）扁平上皮がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳がん、および上皮がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸がん、造血がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、または膵臓がん。したがって、一態様では、対象におけるがんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。したがって、一態様では、対象におけるがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。一部の態様では、本方法は、対象に、ＣＤ３８を標的とする薬剤（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、およびＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８など）を投与することをさらに含み得る。さらに、本方法はまた、対象に、血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラストなど）およびグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、または酢酸フルドロコルチゾンなど）を投与することもできる。
【0055】
当該ＮＫ細胞の使用、または本明細書に開示される当該ＮＫ細胞の使用の一部の実施形態では、当該ＮＫ細胞は、（ｉ）ＣＤ３８（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、および／もしくはＴＡＫ－０７９を含む抗ＣＤ３８抗体など）、ならびに／または（ｉｉ）血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、もしくはアプレミラスト）およびステロイド（例えば、これらに限定されないが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレニゾロン、トリアムシノロン、または酢酸フルドロコルチゾンを含むグルココルチコイドなど）、ならびに／または（ｉｉｉ）ＡＴＲＡから選択される抗がん剤と組み合わせて投与するためのものである。
【0056】
実施形態では、抗がん剤は、イサツキシマブまたはダラツムマブなどの抗ＣＤ３８抗体である。
【0057】
Ｃ．ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質９（Ｃａｓ９）技術は、最近、免疫細胞を操作する際に使用されているが、プラスミドを用いてＮＫ細胞を遺伝的にリプログラミングすることは、レンチウイルス形質導入およびレトロウイルス形質導入などのＤＮＡ依存的な様式での導入遺伝子の送達が、実質的な手順に関連するＮＫ細胞のアポトーシスを引き起こし、遺伝子操作されたＮＫ細胞の産生を限定することから、常に困難であった。エンドヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰなど）を利用してＮＫ細胞を再プログラムする（すなわち、操作するまたは改変する）、初代および増殖ヒトＮＫ細胞のＤＮＡフリーのゲノム編集を使用する方法が、本明細書に記載される。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質９（Ｃａｓ９）技術は、最近、免疫細胞を操作する際に使用されているが、プラスミドを用いてＮＫ細胞を遺伝的にリプログラミングすることは、レンチウイルス形質導入およびレトロウイルス形質導入などのＤＮＡ依存的な様式での導入遺伝子の送達が、実質的な手順に関連するＮＫ細胞のアポトーシスを引き起こし、遺伝子操作されたＮＫ細胞の産生を限定することから、常に困難であった。エンドヌクレアーゼリボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰなど）を利用してＮＫ細胞を再プログラムする（すなわち、操作するまたは改変する）、初代および増殖ヒトＮＫ細胞のＤＮＡフリーのゲノム編集を使用する方法が、本明細書に記載される。
【0058】
エンドヌクレアーゼ／ＲＮＰ（例えば、Ｃａｓ９／ＲＮＰ）は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化した３成分性の組換えエンドヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）からなる。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と複合体化したエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと称され得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的配列と複合体化した相補的反復ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス相補的反復ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズし得るＲＮＡからなる合成単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする。一部の場合では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の場合では、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドであり、対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡである。これらのＣａｓ９／ＲＮＰは、機能複合体としてそれらが送達されるために、外来ＤＮＡに依存したアプローチと比較して、より高い効率でゲノム標的を切断することができる。加えて、細胞からのＣａｓ９／ＲＮＰの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのオフターゲット効果を低減することができる。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を得ることと、ｂ）ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ９（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、標的ＮＫ細胞に形質導入する（例えば、エレクトロポレーションを介して導入する）ことと、を含む。
【0059】
本明細書で使用されるエンドヌクレアーゼは、典型的に合成Ｃａｓ９に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に限定されないことが理解され、本明細書で企図される。一態様では、Ｃａｓ９は、異なる細菌源に由来し得る。Ｃａｓ９の置換を使用して、標的特異性を増やすこともできるため、ｇＲＮＡを使用する必要がより少なくなる。したがって、例えば、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種（ＡｓＣｐｆ１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａに由来するクラスター化された規則的な間隔の短い回文反復、およびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃａｓｅ細菌に由来するＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）（ＬｂＣｐｆ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳｔＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、強化ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、Ｆｏｋｌ融合ｄＣａｓ９、増殖Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）、および／または触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）に由来し得る。さらに、Ｃａｓ９システムの代わりに、他のＣａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、Ｃａｓ４、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ１、もしくはＣ２ｃ３などを使用するか、またはプライム編集を含む任意の他の種類の操作されたＣａｓタンパク質を使用することができる。
【0060】
本明細書では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を標的部位に標的化し、またドナープラスミドを切断して、ドナー導入遺伝子の宿主ＤＮＡへの組換えを可能にするために、ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用することが理解され、企図される。一部の場合では、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせて、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成する。開示されるプラスミドは、ＡＡＶＳ１と称される、ヒトの１９番染色体上のタンパク質ホスファターゼ１の調節サブユニット１２Ｃ（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のイントロン１を、導入遺伝子の組込みの標的部位とした、ＡＡＶ組込みを使用する。この遺伝子座は、「セーフハーバー遺伝子」であり、多くの細胞型において安定した長期の導入遺伝子発現を可能にする。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの破壊は、いかなる既知の疾患とも関連しないため、ＡＡＶＳ１遺伝子座は、導入遺伝子の標的化のための安全なハーバーとみなされることが多い。ＡＡＶＳ１部位が標的位置として使用されているため、ＣＲＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、当該ＤＮＡを標的にしなければならない。ここで、開示されるプラスミドで使用されるガイドＲＮＡは、ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ（配列番号２）、またはその任意の１０ヌクレオチドのセンスもしくはアンチセンスの連続した断片を含む。ＡＡＶＳ１は、本明細書で例示的な目的のために使用されるが、他の「セーフハーバー遺伝子」が、同等の結果で使用され得、トランスフェクトされる特定の細胞型または導入遺伝子を考慮してより適切であれば、ＡＡＶＳ１に置換され得ることが理解され、本明細書で企図される。他のセーフハーバー遺伝子の例としては、限定されないが、Ｃ－Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、およびＴＲＡＣが挙げられる。
【0061】
標的ゲノムに送達されるドナー導入遺伝子構築物のサイズには、サイズ制限が存在し得ることが理解され、本明細書で企図される。導入遺伝子の許容サイズを増加させる１つの方法は、典型的に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）のＣａｓ９を、異なる細菌源からの合成Ｃａｓ９またはＣａｓ９に交換することによって、追加の余地を生成することである。Ｃａｓ９の置換を使用して、標的特異性を増やすこともできるため、ｇＲＮＡを使用する必要がより少なくなる。したがって、例えば、Ｃａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃａｓｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＬｂＣｐｆ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳｔＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、強化ＳｐＣａｓ９（ｅＳｐＣａｓ９）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、Ｆｏｋｌ融合ｄＣａｓ９、増殖Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）、および／または触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、に由来し得る。
【0062】
特定のＣａｓ９を使用すると、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（または代替物）を使用して標的をスクリーニングするＰＡＭ配列を変えることができることが理解され、本明細書で企図される。本明細書で使用される場合、好適なＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣＡｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９ ＰＡＭ）、ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ）、ＴＴＴＶ（ＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭおよびＡｓＣｐｆ１ ＰＡＭ）、ＴＹＣＶ（ＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭバリアントおよびＡｓＣｐｆ１ ＰＡＭバリアント）を含む（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｖは、Ａ、Ｃ、またはＧであり、Ｙは、ＣまたはＴであり、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｒは、ＡまたはＧである）。
【0063】
ＲＮＰ複合体を作製するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、約５０μＭ～約５００μＭ（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μＭ）、好ましくは１００μＭ～約３００μＭ、最も好ましくは約２００μＭの濃度の１：１、２：１、または１：２の比で、９５℃で約５分間混合して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ）を形成することができる。次いで、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９など）の約２０μＭ～約５０μＭ（例えば、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７ ４８、４９、または５０μＭ）の最終希釈で混合することができる。
【0064】
標的細胞中の標的配列に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、標的ＤＮＡに、１つ以上の塩基対の挿入もしくは欠失、異種ＤＮＡ断片（例えば、ドナーポリヌクレオチド）の挿入、内因性ＤＮＡ断片の欠失、内因性ＤＮＡ断片の反転もしくは転座、またはそれらの組合せ、を導入することによってゲノムを改変することができる。したがって、本開示の方法を使用して、相同組換えのためにＤＮＡと組み合わせた場合、ノックアウトまたはノックインを生成することができる。本明細書では、エレクトロポレーションを介したＣａｓ９／ＲＮＰの形質導入は、ＮＫ細胞における遺伝子改変の以前の制約を克服する容易かつ比較的効率的な方法であることが示される。
【0065】
本開示の方法は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、神経細胞、上皮細胞、および／または筋肉細胞を含む任意の細胞型で利用できることが理解され、本明細書で企図される。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子を欠く標的細胞を感知し、死滅させる。ＮＫ細胞活性化受容体には、とりわけ、自然細胞毒性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６）、ならびにレクチン様受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１が含まれる。それらのリガンドは、ストレスを受けた細胞、形質転換した細胞、または感染した細胞で発現されるが、正常細胞では発現されないため、正常細胞は、ＮＫ細胞殺傷に対して耐性となる。一態様では、標的細胞は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変ＮＫ細胞の最終レシピエント）、ＮＫ細胞株（ＮＫ ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ－ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）、または初代ＮＫ細胞源もしくはＮＫ細胞株に由来する増殖ＮＫ細胞源からの初代ＮＫ細胞であり得る。
【0066】
ＮＫ細胞の形質導入の前に、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞の増殖に好適な培地中でインキュベートすることができる。培養条件は、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞の添加を含み得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、細胞を形質導入する前に、ＮＫ細胞の増殖を支持する培地中で、ＮＫ細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間インキュベートすることをさらに含み、培地は、サイトカイン、抗体、および／またはフィーダー細胞をさらに含む。例えば、培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１を含むことができる。一態様では、培地はまた、抗ＣＤ３抗体を含むことができる。一態様では、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞から精製され得る。本明細書に開示される、請求項に記載の発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合ＩＬ－１５および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ－２１、もしくはこれらの任意の組合せでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、あるいはＥＢＶ－ＬＣＬ、のいずれかであり得る。一部の態様では、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、ＮＫ細胞の培養に播種することができる。培養期間は、エレクトロポレーション後１～１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３～７日間、最も好ましくは４～６日間であり得ることが理解され、本明細書で企図される。
【0067】
初代ＮＫ細胞および増殖ＮＫ細胞のインキュベーション条件は、異なる場合があることを理解され、本明細書で企図される。一態様では、エレクトロポレーション前の初代ＮＫ細胞の培養は、培地、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１など）、および／または抗ＣＤ３抗体を５日間未満（例えば、１、２、３、または４日間）含む。増殖ＮＫ細胞について、培養は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１など）および／または抗ＣＤ３抗体に加えて、またはそれに代えて、ＮＫフィーダー細胞の存在下で（例えば、１：１の比率で）行われ得る。増殖ＮＫ細胞の培養は、形質導入前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間行うことができる。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、エレクトロポレーションの前に、初代ＮＫ細胞を、ＩＬ－２の存在下で、４日間インキュベートすること、またはエレクトロポレーションの前に、照射されたフィーダー細胞の存在下で、増殖ＮＫ細胞を、４、５、６、または７日間インキュベートすること、を含む。
【0068】
本開示の方法において、ＮＫ細胞を改変するために形質導入する方法が限定されることが理解され、本明細書で企図される。それらの免疫機能により、ＮＫ細胞は、ウイルスおよび細菌ベクター、ならびに当該ベクターによるＮＫ細胞のアポトーシスの誘導に耐性がある。したがって、本方法以前は、ＮＫ細胞のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ改変は成功していなかった。ウイルスベクターに関する問題を回避するために、開示される方法は、エレクトロポレーションを使用して標的ＮＫ細胞を形質転換する。エレクトロポレーションは、細胞に電場を適用して、細胞膜の透過性を増加させる技術である。電場の適用は、細胞膜を横切る電荷勾配を引き起こし、細胞膜を横切って核酸などの電荷分子を引き出す。したがって、一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞の標的ＤＮＡ配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を得ることと、ｂ）ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡと複合体化したクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、標的ＮＫ細胞にエレクトロポレーションを介して導入することと、を含む。
【0069】
ＮＫ細胞の形質導入（例えば、エレクトロポレーション）後、改変ＮＫ細胞は、ようやく、改変ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞を含む培地で増殖させることができる。したがって、改変細胞は、照射されたフィーダー細胞を使用してエレクトロポレーション後に増殖することができるため、生存能および増殖可能性を保持する。本明細書に開示される、請求項に記載の発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または照射されていない自己もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合ＩＬ－１５および４１ＢＢＬ、もしくはＩＬ－２１、もしくはこれらの任意の組合せでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、あるいはＥＢＶ－ＬＣＬ、のいずれかであり得る。一部の態様では、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、および／または４１ＢＢＬの溶液と組み合わせて提供される。フィーダー細胞は、１：２、１：１、または２：１の比率で、ＮＫ細胞の培養に播種することができる。培養期間は、エレクトロポレーション後１～１４日間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）、好ましくは３～７日間、最も好ましくは４～６日間であり得ることが理解され、本明細書で企図される。一部の態様では、改変ＮＫ細胞を培養するための培地は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、および／またはＩＬ－２１などのサイトカインをさらに含むことができる。
【0070】
一態様では、ＮＫ細胞を遺伝子改変する開示された方法の１つの目的は、改変ＮＫ細胞を生成することであることが理解され、本明細書において企図される。したがって、開示される方法によって作製される遺伝子改変ＮＫ細胞が、本明細書に開示される。例えば、別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞が本明細書に開示され、薬剤として使用するための、好ましくは、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法で使用するための、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞が本明細書に開示され、（ｉ）それを必要とする対象における酸化呼吸能を増加させる方法、または（ｉｉ）それを必要とする対象における細胞外ＮＡＤの加水分解を制限し、酸化還元的呼吸能を改善する方法で使用するための、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。同様に、遺伝子改変ＮＫ細胞の使用も本明細書に開示され、薬剤の製造において、好ましくは、がんおよび／または転移を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防するための薬剤の製造において、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞の使用が本明細書に開示され、（ｉ）それを必要とする対象における酸化呼吸能を増加させるための、または（ｉｉ）それを必要とする対象における細胞外ＮＡＤの加水分解を制限し、酸化還元呼吸能を改善するための薬剤の製造における、本明細書に開示される表面抗原分類３８（ＣＤ３８）をコードする遺伝子のノックアウトを含む。
【0071】
上記のように、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）のようながんを治療するための、ダラツムマブなどの抗ＣＤ３８療法を受ける対象におけるＮＫ細胞のフラトリサイドは、ＮＫ細胞がその細胞表面上で高レベルのＣＤ３８を発現するため、重大な問題である。したがって、がんの治療に有利であろうＮＫ細胞の１つの改変は、抗ＣＤ３８治療中にＮＫ細胞のフラトリサイドに感受性のないＮＫ細胞集団を産生するためのＣＤ３８のノックアウトであることが理解され、本明細書で企図される。かかる改変細胞は、ＮＫ細胞の添加で治療され得る任意の疾患または状態の免疫療法において、非常に有用であり得る。したがって、一態様では、ＣＤ３８をコードする遺伝子のノックアウトを含む遺伝子改変ＮＫ細胞が本明細書に開示される。
【0072】
本開示全体を通して指摘されるように、開示される改変ＮＫ細胞は、理想的には、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞を、それ必要とする対象に養子移植するなどの免疫療法における使用に好適である。したがって、一態様では、操作されたＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が、本明細書に開示され、当該方法は、ａ）改変される標的ＮＫ細胞を得ることと、ｂ）標的ＤＮＡ配列に特異的なｇＲＮＡを得ることと、ｃ）エレクトロポレーションを介して、標的ＮＫ細胞に、標的ＮＫ細胞のゲノムＤＮＡ内で標的配列にハイブリダイズする対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇＲＮＡと複合体化したクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）を含むＲＮＰ複合体を導入して、操作されたＮＫ細胞を生成することと、ｄ）操作されたＮＫ細胞を対象に移植することと、を含む。
【0073】
一態様では、本開示の免疫療法の方法で使用される改変ＮＫ細胞は、ドナー源（例えば、養子移植療法のための同種ドナー源もしくは自己ドナー源（すなわち、改変ＮＫ細胞の最終レシピエント）、ＮＫ細胞株（ＮＫ ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、およびＥＢＶ－ＬＣＬを含むが、これらに限定されない）、または初代ＮＫ細胞源もしくはＮＫ細胞株に由来する増殖ＮＫ細胞の供与源からの初代ＮＫ細胞であり得る。初代ＮＫ細胞を使用することができるため、ＮＫ細胞の開示された改変がエクスビボまたはインビトロで生じ得ることが理解され、本明細書で企図される。
【0074】
ＮＫ細胞の形質導入後、改変ＮＫ細胞は、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞を対象に投与する前に増殖および刺激され得る。例えば、ＮＫ細胞を、それを必要とする対象に養子移植する方法が本明細書に開示され、ＮＫ細胞を、対象に投与する前に照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞とともに増殖させる。一部の態様では、改変（すなわち、操作された）ＮＫ細胞の刺激および増殖は、対象への改変ＮＫ細胞の投与後または投与と同時に、インビボで生じ得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、ＩＬ－２１または照射されたｍｂＩＬ－２１発現フィーダー細胞の投与を介して対象にＮＫ細胞を移植した後で、対象においてＮＫ細胞を増殖させる免疫療法の方法が、本明細書に開示される。
【0075】
１．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブと遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の、配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド誘導体間で、ヌクレオチド特異的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動性の相互作用である。典型的には、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのワトソン－クリック面またはフーグスティーン面上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知のいくつかの条件およびパラメータによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度はすべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブと遺伝子などの、少なくとも２つの核酸分子間の、配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド誘導体間で、ヌクレオチド特異的な様式で生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動性の相互作用である。典型的には、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのワトソン－クリック面またはフーグスティーン面上で生じる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知のいくつかの条件およびパラメータによって影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度はすべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
【0076】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは、当業者に既知である。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２～２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ）中のハイブリダイゼーション、続いて、洗浄温度がＴｍより約５℃～２０℃低いように選択される温度および塩濃度の組合せでの洗浄、を伴い得る。フィルタ上に固定化された参照ＤＮＡの試料を目的の標識核酸にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備実験において、温度および塩条件を容易に経験的に決定する。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーションに関してより高い。上述のように、または当該技術分野で知られているように、これらの条件を使用して、ストリンジェンシーを達成することができる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションの好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）で、続いて６８℃で洗浄することができる。所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が減少するにつれて、さらに、可変性が検索される任意の領域のＧ－ＣまたはＡ－Ｔ豊富さに応じて、低減させることができる。所望により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が増加するにつれて、さらに、すべて当該技術分野で知られているように高い相補性が望まれる任意の領域のＧ－ＣまたはＡ－Ｔ豊富さに応じて、増加させることができる。
【0077】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他方の核酸に結合した核酸の一方の量（パーセンテージ）を見ることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の制限核酸が非制限核酸に結合されるときである。典型的には、非制限プライマーは、例えば、１０または１００または１０００倍過剰である。この種類のアッセイは、制限プライマーおよび非制限プライマーの両方が、例えば、それらのｋｄの１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍未満であるか、または核酸分子のうちの１つのみが１０倍もしくは１００倍もしくは１０００倍であるか、または片方もしくは両方の核酸分子がそれらのｋｄを上回る条件下で実施することができる。
【0078】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素マニピュレーションを促進するために必要とされる条件下で、酵素的にマニピュレートされるプライマーのパーセンテージを調べることによるものである。例えば、一部の実施形態では、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマーが酵素マニピュレーションを促進する条件下で酵素的にマニピュレートされるときであり、例えば、酵マニピュレーションがＤＮＡ伸長であれば、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のプライマー分子が伸長されるときである。また、好ましい条件には、製造業者によって示唆される条件、またはマニピュレーションを実施する酵素に適切な当該技術分野で示された条件、も含まれる。
【0079】
正に相同性と同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するための様々な方法が、本明細書に開示されていることが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの異なるパーセンテージを提供し得ることが理解されるものの、特に指示しない限り、いずれかの方法のパラメータを満たすことは十分であろう。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要であった場合、これらの方法のいずれか１つで必要なパラメータ内で、ハイブリダイゼーションが生じる限り、本明細書に開示されているものとみなされる。
【0080】
当業者であれば、組成物または方法が、いずれか集合的にまたは個別に、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のいずれか１つを満たす場合、それが、本明細書に開示された組成物または方法であることを理解するであろう。
【0081】
２．核酸
核酸に基づく本明細書に開示される様々な分子が存在し、例えば、核酸（例えば、ＣＤ３８をコードする核酸、またはＣＤ３８ノックアウトを作製するための本明細書に開示される核酸のいずれか）、またはその断片、ならびに様々な機能性核酸が含まれる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的な例が、本明細書で論じられる。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境中のアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から構成されることが有利であることが理解される。
核酸に基づく本明細書に開示される様々な分子が存在し、例えば、核酸（例えば、ＣＤ３８をコードする核酸、またはＣＤ３８ノックアウトを作製するための本明細書に開示される核酸のいずれか）、またはその断片、ならびに様々な機能性核酸が含まれる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的な例が、本明細書で論じられる。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現したｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境中のアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチド類似体から構成されることが有利であることが理解される。
【0082】
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を通して、一緒に連結され、ヌクレオシド間結合を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、およびチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシン一リン酸）または５’－ＧＭＰ（５’－グアノシン一リン酸）であろう。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を通して、一緒に連結され、ヌクレオシド間結合を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、およびチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシン一リン酸）または５’－ＧＭＰ（５’－グアノシン一リン酸）であろう。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【0083】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに、何らかの種類の改変を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変は、当該技術分野で既知であり、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２－アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸部分における改変を含むであろう。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【0084】
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含有しない分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン－クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を通して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型構造に適合することができる。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【0085】
他の種類の分子（複合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。複合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結され得る。そのような複合体としては、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分が挙げられる（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）。当該技術分野で入手可能であり、本明細書で入手可能である、多種多様なこれらの種類の分子が存在する。
【0086】
ワトソン－クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン－クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のワトソン－クリック面は、プリン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位、ならびにピリミジン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【0087】
フーグスティーン相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝に曝されるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のフーグスティーン面上で起こる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【0088】
ｂ）配列
本明細書に開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子、例えば、ＣＤ３８、に関連する様々な配列が存在し、これらのすべては、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体、ならびに他の類似体、およびこれらの遺伝子のアレル、ならびにスプライスバリアントおよび他の種類のバリアントの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々なタンパク質および遺伝子データベースで入手可能である。当業者は、配列の不一致および相違を解析する方法、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列に調整する方法を理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に開示され当該技術分野で既知の情報を与える任意の所与の配列について設計され得る。
本明細書に開示されるシグナル伝達経路に関与するタンパク質分子、例えば、ＣＤ３８、に関連する様々な配列が存在し、これらのすべては、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体、ならびに他の類似体、およびこれらの遺伝子のアレル、ならびにスプライスバリアントおよび他の種類のバリアントの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々なタンパク質および遺伝子データベースで入手可能である。当業者は、配列の不一致および相違を解析する方法、ならびに特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連配列に調整する方法を理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書に開示され当該技術分野で既知の情報を与える任意の所与の配列について設計され得る。
【0089】
ｃ）プライマーおよびプローブ
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、本明細書に開示されるＣＤ３８などの開示される核酸と相互作用することができる。特定の実施形態では、プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応を支持する。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長され得るであろう。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズするかもしくは別途会合する核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長によって産生される産物の組成物もしくは配列を誘導または影響する任意の方法を含む。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるが、これらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲまたは直接配列決定などのＤＮＡ増幅反応に使用される。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素技術を使用して伸長することができ、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長するように改変されることを理解されたい。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸もしくは核酸の領域にハイブリダイズするか、またはそれらは、核酸の相補体もしくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、本明細書に開示されるＣＤ３８などの開示される核酸と相互作用することができる。特定の実施形態では、プライマーを使用して、ＤＮＡ増幅反応を支持する。典型的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長され得るであろう。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズするかもしくは別途会合する核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長によって産生される産物の組成物もしくは配列を誘導または影響する任意の方法を含む。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの伸長には、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が含まれるが、これらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲまたは直接配列決定などのＤＮＡ増幅反応に使用される。特定の実施形態では、プライマーはまた、非酵素技術を使用して伸長することができ、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長するように改変されることを理解されたい。典型的には、開示されるプライマーは、開示される核酸もしくは核酸の領域にハイブリダイズするか、またはそれらは、核酸の相補体もしくは核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
【0090】
特定の実施形態では、核酸と相互作用するためのプライマーもしくはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅、またはプローブもしくはプライマーの単なるハイブリダイゼーションなどのプライマーの所望の酵素マニピュレーションを支持する任意のサイズであり得る。典型的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長である。
【0091】
他の実施形態では、プライマーまたはプローブは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
【0092】
ＣＤ３８遺伝子のプライマーは、典型的には、ＣＤ３８遺伝子の領域または完全長の遺伝子を含む増幅ＤＮＡ産物を産生するために使用され得る。一般に、典型的には、この産物のサイズは、サイズが３ヌクレオチド以内、または２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内に正確に決定され得るようになる。
【0093】
特定の実施形態では、この産物は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長である。
【0094】
他の実施形態では、産物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、または４０００ヌクレオチド長以下である。
【0095】
３．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有し得る。
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有し得る。
【0096】
ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも、本明細書で有用である。
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも、本明細書で有用である。
【0097】
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から一定距離になくても機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、およびコード配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にあってもよい。これらは、通常、１０～３００ｂｐの長さで、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答要素を含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答要素も含有し得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、およびインスリン）から既知であるが、典型的には、一般的な発現用に真核生物細胞のウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００～２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマのエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーである。
【0098】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を引き起こす光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって、調節することができる。また、ガンマ線照射などの照射への曝露、またはアルキル化の化学療法薬によって、ウイルスベクターの遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【0099】
特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間に特定の種類の細胞でのみ発現する場合であっても、すべての真核生物の細胞型において活性である。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターのＬＴＲである。
【0100】
すべての特定の調節要素は、クローニングされ、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用され得ることが示されてきた。グリア線維酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞で、遺伝子を選択的に発現するために使用されてきた。
【0101】
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る転写の終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。転写単位は、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の利点の１つは、転写単位が、ｍＲＮＡのようにプロセシングおよび輸送される可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物に使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。また、転写単位は、単独で、または上記配列と組み合わせて、構築物からの発現または安定性を改善する、他の標準的な配列を含有することも好ましい。
【0102】
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子（β－ガラクトシダーゼをコードする）、および緑色蛍光タンパク質である。
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子（β－ガラクトシダーゼをコードする）、および緑色蛍光タンパク質である。
【0103】
一部の実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであってもよい。哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に移行されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合、生存することができる。選択的レジームには、広く使用される２つの異なるカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝、および補充培地から独立して成長する能力を欠く変異細胞株の使用、に基づく。２つの例としては、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞、がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素を添加せずに成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠損したヌクレオチドが補充培地に提供されない限り、生存することはできない。培地を補充する代替手段は、それぞれの遺伝子を欠く細胞に、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入することで、それらの成長要件を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地において生存することができないであろう。
【0104】
第２のカテゴリは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択で生き残るであろう。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン、（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を使用する。３つの実施例は、真核細胞の制御下の細菌遺伝子を用いて、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシン、への耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピュラマイシンが含まれる。
【0105】
４．ペプチド
ａ）タンパク質バリアント
タンパク質バリアントおよび誘導体は、当業者によく理解され、アミノ酸配列改変を含むことができる。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失バリアントの３つのクラスのうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、１～４個の残基程度で、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合の挿入よりは小さいであろう。実施例に記載されるものなどの免疫原性融合タンパク質の誘導体は、インビトロで架橋することによって、またはその融合体をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することによって作製される。欠失は、タンパク質の配列から、１個以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、約２～６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらのバリアントは、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発がよく知られている。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度にいくつかの異なる場所で生じ得、挿入は、通常、約１～１０個のアミノ酸残基程度であり、欠失は約１～３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せ、を組み合わせて、最終構築物に到達することができる。変異は、配列をリーディングフレームから外れさせてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を生成しない。置換バリアントは、少なくとも１個の残基が除去され、その位置に、異なる残基が挿入されているバリアントである。このような置換は、概して、以下の表１および２に従って行われ、保存的置換と称される。
ａ）タンパク質バリアント
タンパク質バリアントおよび誘導体は、当業者によく理解され、アミノ酸配列改変を含むことができる。例えば、アミノ酸配列改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失バリアントの３つのクラスのうちの１つ以上に分類される。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、例えば、１～４個の残基程度で、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合の挿入よりは小さいであろう。実施例に記載されるものなどの免疫原性融合タンパク質の誘導体は、インビトロで架橋することによって、またはその融合体をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって、標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することによって作製される。欠失は、タンパク質の配列から、１個以上のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、約２～６個以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらのバリアントは、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され、それによって、バリアントをコードするＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換変異を作製するための技術、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発がよく知られている。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度にいくつかの異なる場所で生じ得、挿入は、通常、約１～１０個のアミノ酸残基程度であり、欠失は約１～３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せ、を組み合わせて、最終構築物に到達することができる。変異は、配列をリーディングフレームから外れさせてはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的領域を生成しない。置換バリアントは、少なくとも１個の残基が除去され、その位置に、異なる残基が挿入されているバリアントである。このような置換は、概して、以下の表１および２に従って行われ、保存的置換と称される。
【表1】
【表2】
【0106】
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２のものよりも保存性が低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスの立体構造としての置換エリアにおけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ、を維持することに対するそれらの効果が著しく異なる残基、を選択することによって行われる。一般に、タンパク質特性において最大の変化をもたらすことが予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに（またはそれによって）置換され、（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に（またはそれによって）置換され、（ｃ）電気陽性側鎖、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基が、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに（またはそれによって）置換されるか、あるいは（ｄ）かさばった側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンに（またはそれによって）置換され、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増加させることによって置換される、置換であろう。
【0107】
例えば、あるアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基に置き換えることは、保存的置換として当業者には既知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に置き換えること、またはある極性残基を別の極性残基に置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。このような、各明示的に開示された配列の保存的に置換されたバリエーションは、本明細書に提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。
【0108】
置換または欠失変異誘発を用いて、Ｎ－グリコシル化（Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ－グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基のうちの１つを欠失させるか、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基で置換することによって達成される。
【0109】
特定の翻訳後の誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミルおよびアスパリル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ ７９－８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、場合によっては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化、が挙げられる。
【0110】
本明細書に開示されるタンパク質のバリアントおよび誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点からバリアントおよび誘導体を定義することによるものであることを理解されたい。記載の配列と、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらのバリアントおよび本明細書に開示される他のタンパク質が、具体的に開示される。当業者であれば、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を、容易に理解することができる。例えば、相同性は、相同性が最も高いレベルにあるように、２つの配列を整列した後に計算することができる。
【0111】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ上で、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または検査によって、行ってもよい。
【0112】
核酸に関して、同じ種類の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６，１９８９．に開示されているアルゴリズムによって、得ることができる。
【0113】
保存的変異および相同性の説明は、任意の組合せで、例えば、バリアントが保存的変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、一緒に組み合わせることができることが理解される。
【0114】
本明細書は、様々なタンパク質およびタンパク質配列を論じるため、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸もまた開示されることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびにタンパク質配列の開示されたバリアントおよび誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸、が含まれるであろう。したがって、各特定の核酸配列が本明細書に記載されていない場合があるが、各配列およびすべての配列が、開示されたタンパク質配列を介して、実際に本明細書に開示および記載されていることが理解される。また、開示されたタンパク質の特定のバリアントが本明細書に開示されている生物内のタンパク質をコードする特定のＤＮＡ配列を示すアミノ酸配列はないが、そのタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた、本明細書に既知であり、開示され、記載されていることも理解される。
【0115】
開示された組成物に組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表１および表２に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有する多数のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択したアミノ酸を負荷することによって、および、例えば、アンバーコドンを利用して、部位特異的な方法で、類似体アミノ酸をペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、容易にポリペプチド鎖に組み込まれ得る。
【0116】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介して結合されていない分子を産生することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体についての結合としては、ＣＨ２ＮＨ－－、－－ＣＨ２Ｓ－－、－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ＝ＣＨ－－（シスおよびトランス）、－－ＣＯＣＨ２－－、－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－－、および－－ＣＨＨ２ＳＯ－が挙げられる（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３－４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７－１８５（１９７９）（－－ＣＨ２ＮＨ－－、ＣＨ２ＣＨ２－－）、Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３－１２４９（１９８６）（－－ＣＨ Ｈ２－－Ｓ）、Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７－３１４（１９８２）（－－ＣＨ－－ＣＨ－－、シスおよびトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（１９８０）（－－ＣＯＣＨ２－－）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（－－ＣＯＣＨ２－－）、Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－－）、Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１－４４０４（１９８３）（－－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２－－）、およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９－１９９（１９８２）（－－ＣＨ２－－Ｓ－－）に見出され得、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、－－ＣＨ２ＮＨ－－である。ペプチド類似体は、ｂ－アラニン、ｇ－アミノ酪酸などの結合原子間に２つ以上の原子を有し得ることが理解される。
【0117】
アミノ酸類似体および類似体ならびにペプチド類似体は、しばしば、より経済的な産生、より大きな化学的安定性、より強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広域の生物学的活性）、抗原性の低減などを有する。
【0118】
Ｄ－アミノ酸は、ペプチダーゼなどによって認識されないため、Ｄ－アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を同じ種類のＤ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リジンの代わりにＤ－リジン）で系統的に置換することを使用して、より安定なペプチドを生成することができる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化するまたは結合するために使用され得る。これは、ペプチドを、特定の立体構造に拘束するのに有益であり得る。
【0119】
５．医薬担体／医薬製品の送達
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれと接触する薬学的組成物の他の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別途望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターとともに、対象に投与され得る材料、を意味する。担体は、当業者には周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために当然選択されるであろう。
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれと接触する薬学的組成物の他の構成要素のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、生物学的にまたは別途望ましくないものではない材料、すなわち、核酸またはベクターとともに、対象に投与され得る材料、を意味する。担体は、当業者には周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるために当然選択されるであろう。
【0120】
組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に（局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む）などで、投与され得る。本明細書で使用される場合、「局所鼻腔内投与」とは、鼻孔の一方または両方を介して組成物を鼻および鼻道に送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。送達は、挿管を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般状態、治療されるアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法などに応じて、対象によって異なるであろう。したがって、すべての組成物に対して正確な量を指定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を与える日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【0121】
組成物の非経口投与は、使用される場合、概して、注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適した固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。最近改訂された非経口投与のアプローチでは、一定の投与量が維持されるような徐放または持続放出系の使用を伴う。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
【0122】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）中であってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的にし得る。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的化するための本技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７－４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５－２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００－７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３－９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１－４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７－８０，（１９９２）、およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２－２０６５，（１９９１））。ビヒクル、例えば、「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸がんを標的化する脂質媒介性薬物を含む）、細胞特異的リガンドを通したＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、ならびにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を標的にするための本技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４－６２２０，（１９８９）、およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９－１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、２つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９－４０９（１９９１））。
【0123】
開示される改変ＮＫ細胞および改変ＮＫ細胞の養子移植の方法は、がんに対する効果的な免疫療法であり得ることが理解され、本明細書で企図される。本開示の方法および組成物を使用して、がんなどの未制御な細胞増殖が生じる任意の疾患を治療、阻害、低減、および／または予防することができる。異なる種類のがん（ｃａｎｃｅｒｓ）の非限定的なリストは、以下のとおりである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、固形組織のがん、扁平上皮細胞がん、腺がん、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性がん、または一般的ながん。開示される組成物を使用して治療することができる代表的だが、非限定的ながんのリストは、以下のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病（ＡＭＬを含むが、これに限定されない）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部扁平上皮がん、肺がん（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、神経芽腫／神経膠芽腫、卵巣がん、皮膚がん、ＢＰＤＣＮ、多発性骨髄腫、肝臓がん、黒色腫、（口腔、咽頭、喉頭、および肺の）扁平上皮がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳がん、および上皮がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸がん、造血がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、前立腺がん、または膵臓がん。したがって、一態様では、対象におけるがんおよび／または転移（例えば、多発性骨髄腫、白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）を含むが、これらに限定されない）を治療、減少、阻害、低減、緩和、および／または予防する方法が本明細書に開示され、対象に、ＣＤ３８遺伝子のノックアウトを含むように改変されているＮＫ細胞を投与することを含む。一部の態様では、本方法は、対象に、ＣＤ３８を標的とする薬剤（例えば、これらに限定されないが、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、およびＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８など）を投与することをさらに含み得る。さらに、本方法はまた、対象に、血管新生阻害剤（例えば、ポマリドミド、レナリドミド、またはアプレミラストなど）およびグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メソッドルプレニゾロン、トリアムシノロン、または酢酸フルドロコルチゾンなど）、および／またはＡＴＲＡを投与することもできる。
【0124】
本明細書に記載されるように、開示される改変ＮＫ細胞（例えば、本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞は、本明細書に開示される方法によって作製されるＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞を含むが、これに限定されない）は、対象に投与される抗ＣＤ３８療法がＮＫ細胞のフラトリサイドをもたらす可能性があるか、またはそれがもたらされた治療に使用され得る。したがって、一態様では、抗ＣＤ３８免疫療法を受ける対象において、ＮＫ細胞のフラトリサイドを低減する方法も本明細書に開示され、対象に、本明細書に開示される任意の遺伝子改変ＮＫ細胞（本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトＮＫ細胞を含む）を投与することを含む。一態様では、抗ＣＤ３８免疫療法は、対象に、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＴＡＫ－０７９、および／またはＭＯＲ２０２を含むが、これらに限定されない抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み得る。
【0125】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法の作製方法および評価方法の完全な開示および説明を提供するために示されるものであり、純粋に例示的であることを意図するものであって、本開示を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、温度は℃、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法の作製方法および評価方法の完全な開示および説明を提供するために示されるものであり、純粋に例示的であることを意図するものであって、本開示を限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、温度は℃、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
【0126】
１．実施例１：フラトリサイドを克服し、ＡＤＣＣを増強するための、ＣＤ３８－ＫＯ ＮＫ細胞の生成
ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体であるダラツマブ（ＤＡＲＡ）による、ＣＤ３８発現多発性骨髄腫（ＭＭ）の標的化において重要な役割を果たす。ＤＡＲＡ療法におけるＮＫ細胞のフラトリサイドを克服するために、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用したノックアウトＮＫ細胞を生成した。具体的には、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３８を標的とし、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用して欠失させる。以下の配列を標的とするｇＲＮＡ（ＣＤ３８の開始コドン付近のエクソン１で）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に産生された：５’－ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴ－３’（配列番号１）
ＮＫ細胞をＣａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションし、１４日間増殖させた。得られた遺伝子欠失は、９０％超有効であり、ＫＯ集団の陽性選択のためのいかなる方法も使用せずに、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８の発現を、対照ＮＫ細胞での８７％からＣＤ３８欠失ＮＫ細胞での７％に減少させた（図１）。ＮＫ細胞を、ダラツムマブ媒介性フラトリサイドに対する感受性について試験した。未改変対照ＮＫ細胞は、７７％のフラトリサイドに対する感受性を示した（生存率は６４％から１４．６％に低下した）。対照的に、ＣＤ３８－ＫＯ ＮＫ細胞は、フラトリサイドに対する感受性が１１％しか示さなかった（生存率は５５．８％から４９．９％に低下した）（図２）。
ナチュラルキラー細胞は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体であるダラツマブ（ＤＡＲＡ）による、ＣＤ３８発現多発性骨髄腫（ＭＭ）の標的化において重要な役割を果たす。ＤＡＲＡ療法におけるＮＫ細胞のフラトリサイドを克服するために、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用したノックアウトＮＫ細胞を生成した。具体的には、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３８を標的とし、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用して欠失させる。以下の配列を標的とするｇＲＮＡ（ＣＤ３８の開始コドン付近のエクソン１で）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に産生された：５’－ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴ－３’（配列番号１）
ＮＫ細胞をＣａｓ９／ＲＮＰでエレクトロポレーションし、１４日間増殖させた。得られた遺伝子欠失は、９０％超有効であり、ＫＯ集団の陽性選択のためのいかなる方法も使用せずに、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８の発現を、対照ＮＫ細胞での８７％からＣＤ３８欠失ＮＫ細胞での７％に減少させた（図１）。ＮＫ細胞を、ダラツムマブ媒介性フラトリサイドに対する感受性について試験した。未改変対照ＮＫ細胞は、７７％のフラトリサイドに対する感受性を示した（生存率は６４％から１４．６％に低下した）。対照的に、ＣＤ３８－ＫＯ ＮＫ細胞は、フラトリサイドに対する感受性が１１％しか示さなかった（生存率は５５．８％から４９．９％に低下した）（図２）。
【0127】
次に、ＮＫ細胞を、多発性骨髄腫に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の改善について試験した。３つの異なる標的細胞および３つのＥ：Ｔ比にわたって測定した場合、ＣＤ３８－ＫＯ ＮＫ細胞は、野生型対照と比較して、ＡＤＣＣを３７．９％増加させ（中央値、ｐ＝０．００４）、最終生存がん細胞集団を２２．３％減少させた（中央値、ｐ＝０．００４）（図３）。図４～６に、個々の結果を示す。
２．実施例２：導入．
２．実施例２：導入．
【0128】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄（ＢＭ）における悪性形質細胞のクローン蓄積によって特徴付けられる。自己幹細胞移植およびプロテアソーム阻害剤（ＰＩ－ボルテゾミブ／カルフィルゾミブ）、ならびに免疫調節ＩＭｉＤ剤（レナリドミド／ポマリドミド）などの新規薬剤の導入は、ＭＭ患者における生存率を有意に改善したが、ほぼすべての患者が再発し、その後、予後不良に悩まされ、全生存期間の中央値はわずか１３ヶ月であった。
【0129】
最近では、ＣＤ３８、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）、およびイサツキシマブを標的とするモノクローナル抗体は、ＭＭ患者の管理に対して著しい影響を与えている。ＤＡＲＡは、新たに診断された、ならびに再発／難治性のＭ患者について、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。ＤＡＲＡは、いくつかの機構：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＣＰ）、標的細胞上のＣＤ３８の架橋によって誘導されるアポトーシス、ならびにＣＤ３８＋免疫抑制細胞の排除による免疫調節効果を介して、標的細胞を殺傷する。これらの作用はすべて、抗腫瘍活性に関与するが、どの機構がＭＭ患者で見られる臨床応答に主要な役割を果たすのかは、未だ不明である。
【0130】
ＤＡＲＡの十分に確立された臨床的利益にもかかわらず、大多数の患者は、最終的に疾患再発を経験し、ＭＭに屈し続ける。現在、ＤＡＲＡに対する耐性の機構を明らかにし、応答を深める／促進するための併用療法を開発するための研究および臨床的な取り組みが進行中である。臨床的証拠は、ＩＭｉＤがＤＡＲＡと相乗作用し、より良好な疾患制御をもたらすことを示す。これは、部分的には、Ｉｋａｒｏｓ／Ａｉｏｌｏｓのセレブロン媒介性分解を介して、ＭＭ細胞上のＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ、ならびにＩＭｉＤｓ誘導性ＣＤ３８上方制御を媒介するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に起因する可能性がある。
【0131】
追加の証拠は、標的細胞上のＣＤ３８発現レベルが、ＤＡＲＡに対する感受性と相関することを示す。より高いＣＤ３８の発現レベルを有するＭＭ細胞は、ＤＡＲＡによって優先的に死滅するが、残りのＭＭ細胞は、ＤＡＲＡによる処理中に、より低いＣＤ３８の発現レベルを示す。ＣＤ３８の転写は、ＣＤ３８遺伝子のイントロンＩに存在するＲＡ応答エレメントを介してレチノイン酸（ＲＡ）によって直接制御されるため、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、ＭＭ細胞を含む様々な造血細胞において、ＣＤ３８の発現を上方制御する。さらに、ＡＴＲＡは、補体阻害タンパク質（ＣＤ５５およびＣＤ５９）の発現を下方制御し、ＤＡＲＡと相乗作用して、標的ＭＭ細胞を死滅させる。この戦略は、ＭＭ患者を対象としたＡＴＲＡとＤＡＲＡを組み合わせた臨床試験（ＮＣＴ０２７５１２５５）で現在試験中である。
【0132】
ＤＡＲＡに対する最適以下の応答の別の推定機構は、ＤＡＲＡによる治療後の患者におけるＮＫ細胞の急速な枯渇である（ＮＫ細胞も比較的高いレベルのＣＤ３８を発現するため）。この循環ＮＫ細胞の減少は、治療中止後３～６ヶ月間継続し、ＭＭ細胞に対する非効率的なＡＤＣＣをもたらす。ＮＫ細胞の養子移植は、この機構を克服するための戦略であり得る。前臨床モデルでは、エクスビボ増殖ＮＫ細胞の補充は、疾患負荷の制御において、わずかではあるが有意なＤＡＲＡの改善をもたらす（これらのＮＫ細胞もＤＡＲＡ媒介性除去を受けるため）。ＤＡＲＡ媒介性除去を克服するためのアプローチは、ＮＫ細胞のＣＤ３８を欠失させることである（ＣＤ３８ＫＯＮＫ）。ＮＫ細胞の遺伝子編集は、そのＤＮＡ感知機構および関連するアポトーシスにより困難であったが、初代ＮＫ細胞における効率的な遺伝子の欠失は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９／ＲＮＰ）によるＤＮＡフリーの方法を使用して達成することができる。
【0133】
ここで、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８欠失の生物学的影響を、ＤＡＲＡ免疫療法に関して、インビトロおよびインビボでのコンジュゲーションおよびフラトリサイド、ならびにＭＭ細胞に対するＡＤＣＣを評価することによって探索した。最後に、ＮＫ細胞の代謝および転写における、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のレベルを調節するエクト酵素としてのＣＤ３８の役割を探索した。
【0134】
３．実施例３：材料および方法
ＮＫ細胞の精製および増殖。末梢血ＮＫ細胞を、健常ドナーから単離した。精製したＮＫ細胞（ＣＤ３－／ＣＤ５６＋）を、２：１の比率で膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ２１）／４－１ＢＢＬを発現する照射されたＫ５６２（ＣＳＴＸ００２）を使用して刺激し、ＡＩＭ－Ｖ／ＩＣＳＲ増殖培地（ＣＴＳ（商標）ＡＩＭＶ（商標）ＳＦＭ／ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５０ＩＵのヒト組換えＩＬ－２（ｒＩＬ－２）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）中で７日間増殖させた。刺激後、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ３３＋細胞のいずれも検出されなかった（図７）。増殖の６日目に、エレクトロポレーションの前に、培地の半分を交換した。
ＮＫ細胞の精製および増殖。末梢血ＮＫ細胞を、健常ドナーから単離した。精製したＮＫ細胞（ＣＤ３－／ＣＤ５６＋）を、２：１の比率で膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ２１）／４－１ＢＢＬを発現する照射されたＫ５６２（ＣＳＴＸ００２）を使用して刺激し、ＡＩＭ－Ｖ／ＩＣＳＲ増殖培地（ＣＴＳ（商標）ＡＩＭＶ（商標）ＳＦＭ／ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５０ＩＵのヒト組換えＩＬ－２（ｒＩＬ－２）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）中で７日間増殖させた。刺激後、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ３３＋細胞のいずれも検出されなかった（図７）。増殖の６日目に、エレクトロポレーションの前に、培地の半分を交換した。
【0135】
多発性骨髄腫細胞．ＭＭ細胞株Ｈ９２９，ＭＭ．１Ｓ、およびＵ２６６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＯＰＭ－２およびＫＭＳ－１１細胞株は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手した。初代ＭＭ細胞は、ＩＲＢ承認プロトコルおよびＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおける書面による同意の下で、新たに診断されたＭＭ患者または再発したＭＭ患者から回収した。表１に、患者情報を示す。ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の精製および細胞培養は、以前に公表された。Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した密度勾配遠心分離によって、新鮮なＢＭ吸引物から単核細胞を単離した。ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞を、磁気ビーズおよびカラムによって、製造元の説明書に従って選択した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）。すべてのＭＭ細胞株および初代ＭＭ細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）で培養した。
【表3】
【0136】
マウス．ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、特定の病原体を含まない条件下で維持した。Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物研究委員会によって承認された動物プロトコルに従って、６～１０週齢の雄ＮＳＧマウスを実験に使用した。
【0137】
免疫表現型決定．ＮＫ細胞およびＭＭ細胞を、フルオロフォアコンジュゲート抗体で染色した。表２に、抗体のリストを示す。細胞を洗浄し、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
【表4】
【0138】
ＣＲＩＳＰＲ改変細胞の生成。ＣＤ３８ＫＯおよびＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞を生成するために、ＣＤ３８遺伝子のエクソン１を標的とするｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（５－ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴ；配列番号１）３４、およびＣＤ１６Ａ遺伝子のエクソン５を標的とするｃｒＲＮＡ（５－ＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧ；配列番号３）を使用した。Ｃａｓ９／ＲＮＰ複合体の生成については、以前に記載した。ＣＤ３８ＫＯおよびＣＤ１６ＫＯＮＫ細胞を生成するために、ＣＤ３８遺伝子のエクソン１を標的とするｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（５－ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＴ；配列番号１）、およびＣＤ１６Ａ遺伝子のエクソン５を標的とするｃｒＲＮＡ（５－ＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧ；配列番号４）を使用した。Ｃａｓ９／ＲＮＰ複合体の生成については、以前に記載した。簡単に、事前に転写されたＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡおよびＡｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ（カタログ番号１０７２５３２）を、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から購入した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、総量が１０μｌのヌクレアーゼ不含ＩＤＴＥ、ｐＨ７．５（１×ＴＥ溶液、カタログ番号１１－０１－０２－０２）中に、各々２００μＭのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを一緒に、９５℃で５分間インキュベートすることによって調製した。Ｃａｓ９／ＲＮＰ複合体は、２μｌのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３タンパク質（１２２ｐｍｏｌ）（カタログ番号１０８１０６０）、２μｌのｇＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）、および１μｌのＰＢＳを、５μｌの総量で、室温で１５～２０分間インキュベートすることによって形成した。７日目に、増殖したＮＫ細胞を、２０μｌのＰ３初代細胞４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ溶液、および５μｌのＣａｓ９／ＲＮＰ複合体、および１μｌの１００μＭのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（カタログ番号１０７５９１５）に再懸濁し、Ｌｏｎｚａ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム使用して、ｐｕｌｓｅ ＥＮ－１３８を用いてエレクトロポレーションした。野生型ＮＫ（ＣＤ３８ＷＴ ＮＫ）細胞を、Ｃａｓ９／ＲＮＰ複合体なしでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、ＮＫ細胞を、５０ＩＵのｒＩＬ－２を補充したＡＩＭ－Ｖ／ＩＣＳＲ増殖培地中で２日間静置した後、フローサイトメトリーを使用して、ＣＲＩＳＰＲ改変の効率を評価した。次いで、細胞を、ＣＳＴＸ００２とともに増殖させた。残留するＣＤ３８＋ＮＫ細胞を、ビオチン化抗ＣＤ３８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、続いて、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）で標識し、ＬＤカラム上で（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）枯渇させることによって除去した。
【0139】
ＣＤ３８標的化Ｃａｓ９／ＲＮＰのオフターゲット効果の特定．全ゲノム配列決定を使用して、ＣＤ３８を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰのオフターゲット効果を特定した。ＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号／ＩＤ：６９５０４）を使用して、ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞から、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ－ＦＳ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｈｉｃｈ ＭＡ）を使用して、ＤＮＡライブラリーを構築した。試料を、酵素的に断片化し、５’リン酸化し、ｄＡテール付加し、独自のデュアルインデックスアダプターアプローチでライゲーションして、試料のミスアサイメントを防止し、インデックスホッピングを解決した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｏｗａ）。アダプターが連結されたＤＮＡを、限定サイクルＰＣＲによって増幅し、磁気ビーズベースのアプローチを使用して精製した。ライブラリーの品質は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ高感度Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析し、ＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォーム上で、２×１５０ｂｐのリード長で、約３０倍のカバレッジの深度まで、ライブラリーを配列決定した。
【0140】
ＣＤ３８標的化Ｃａｓ９／ＲＮＰのオフターゲット効果の特定．全ゲノム配列決定を使用して、ＣＤ３８を標的とするＣａｓ９／ＲＮＰのオフターゲット効果を特定した。ＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号／ＩＤ：６９５０４）を使用して、ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞から、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ－ＦＳ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｈｉｃｈ ＭＡ）を使用して、ＤＮＡライブラリーを構築した。試料を、酵素的に断片化し、５’リン酸化し、ｄＡテール付加し、独自のデュアルインデックスアダプターアプローチでライゲーションして、試料のミスアサイメントを防止し、インデックスホッピングを解決した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｏｗａ）。アダプターが連結されたＤＮＡを、限定サイクルＰＣＲによって増幅し、磁気ビーズベースのアプローチを使用して精製した。ライブラリーの品質は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ高感度Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析し、ＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォーム上で、２×１５０ｂｐのリード長で、約３０倍のカバレッジの深度まで、ライブラリーを配列決定した。
【0141】
ＮＫ機能アッセイ．ＮＫ細胞コンジュゲーションアッセイは、以前に公表されたように、また、上で詳述されたように行った。フラトリサイドを定量化するために、ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、それぞれ１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＡまたは溶媒対照で４時間または２４時間処理し、次いで、ＰＯ－ＰＲＯ（商標）－１色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）および７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）２５で染色した。フローベースの死滅アッセイは、補足方法に詳述されるように実施した。簡潔に、ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＡまたは対照としての溶媒の存在下で、ＣＦＳＥで標識された標的ＭＭ細胞と、４時間または２４時間共培養した。
【0142】
ヒトＮＫ細胞のＮＳＧマウスへの養子移植．同じ個々のドナーからのエクスビボ増殖ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、解凍し、照射されたＣＳＴＸ００２で１週間再刺激した。１０７個の各群のＮＫ細胞を、Ｈａｎｋの平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に懸濁し、同じ日に、ＤＡＲＡ（８ｍｇ／ｋｇ）または溶媒対照で腹腔内に前処理されたＮＳＧマウスに、尾静脈を通して注入した。マウスに、ｒＩＬ－２（５０，０００ＩＵ）を、腹腔内に隔日供給した。末梢血（７日後）、脾臓およびＢＭ（９日後）を回収し、各マウスにおけるＮＫ細胞の持続性について分析した。また、脾臓中の、および２つの大腿骨からのＢＭ中のヒトＮＫ細胞の絶対数も計算した。
【0143】
ＲＮＡ配列決定およびＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析．鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ定方向ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｈｉｃｈ ＭＡ）を使用して、製造業者の推奨事項に従って調製した。要約すると、同じドナー（ｎ＝６）のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞から単離された全ＲＮＡ（合計１２試料）の品質を、ＲＮＡ６０００ナノキットを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価し、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、濃度を測定した。ＮＥＢのヒト／マウス／ラットＲＮＡｓｅ－Ｈベースの枯渇キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、４０～５００ｎｇの全ＲＮＡのアリコートを、ｒＲＮＡ枯渇させた。ｒＲＮＡ除去後、ｍＲＮＡを断片化し、次いで、ランダムヘキサマープライマーを用いた第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡ合成に使用した。二本鎖ｃＤＮＡ断片は、デュアルユニークアダプター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の末端修復およびＡテール付加およびライゲーションを行った。アダプターが連結されたｃＤＮＡを、限定サイクルＰＣＲによって増幅し、磁気ビーズベースのアプローチを使用して精製した。ライブラリーの品質は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ高感度Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析し、ＫＡＰＡ ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）によって定量化した。ライブラリーをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォーム上で、２×１５０ｂｐのリード長で配列決定して、１試料あたり約６０００～８０００万個のペアエンドリードを生成した。次に、正規化されたＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析（ＩＰＡ）に入力する前にフィルタリングすることで、少なくとも１つの試料中に１０ＦＰＭ以上発現していない遺伝子を排除した。ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間の遺伝子発現レベルの対応のある両側ｔ検定で０．０５未満のｐ値が得られた遺伝子が、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）として同定された。ＤＥＧのｐ値のカットオフを０．０１または０．１に調整しても、最小の遺伝子発現のカットオフを５ＦＰＭに調整しても、定性的に、結論に影響を与えない。ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞にわたる各遺伝子の平均倍率変化は、報告された経路における平均値の倍率変化にほぼ等しく、そのため、個体間効果（同じドナーからのＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞）は、これらの結論に対して無視できるとみなすことができる。ＩＰＡのコア解析について、すべてデフォルト設定が実装された。ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドによってＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞が死滅するため、ＤＡＲＡの存在下でＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のトランスクリプトームプロファイルを研究することはできなかった。
【0144】
ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間の遺伝子発現レベルの対応のある両側ｔ検定で０．０５未満のｐ値が得られた遺伝子が、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）として同定された。ＤＥＧのｐ値のカットオフを０．０１または０．１に調整しても、最小の遺伝子発現のカットオフを５ＦＰＭに調整しても、定性的に、結論に影響を与えない。ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞にわたる各遺伝子の平均倍率変化は、報告された経路における平均値の倍率変化にほぼ等しく、そのため、個体間効果（同じドナーからのＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞）は、これらの結論に対して無視できるとみなすことができる。ＩＰＡのコア解析について、すべてデフォルト設定が実装された。ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドによってＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞が死滅するため、ＤＡＲＡの存在下でＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のトランスクリプトームプロファイルを研究することはできなかった。
【0145】
代謝アッセイ．酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定するために、我々は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ２４（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、Ａｇｉｌｅｎｔ細胞外フラックスアッセイキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。増殖したＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、測定の前に、ＸＦ ＲＰＭＩ中で１～２時間、非ＣＯ２インキュベーターで、３７℃でインキュベートした。培地に、ｐＨ７．３５～７．４で、フェノールレッドなしで、１０μＭのグルコースおよび２μＭのＬ－グルタミンを補充した。１μＭのオリゴマイシン、１．５μＭのＦＣＣＰ、および０．５μＭのロテノン、およびアンチマイシンＡを細胞培養物に添加することによって、基底条件下で、ＯＣＲ（酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の尺度）およびＥＣＡＲを分析した。
【0146】
コンジュゲーションアッセイ、フラトリサイドアッセイ、およびフローベースの細胞傷害性アッセイ．Ｂｕｒｓｈｔｙｎらによって記載されているＮＫ細胞のコンジュゲーションアッセイを、わずかな変更を加えて行った。簡潔に、２×１０６細胞の各ＮＫ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）を、５μＭの緑色色素ＣＦＤＡ ＳＥ（ＣＦＳＥ）細胞トレーサー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）で、３７℃で１５分間染色するか、または５μＭの赤色色素ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、室温で５分間染色した。細胞懸濁液に完全培地を添加することによって、染色を停止した。細胞を、完全培地で２回洗浄した。緑色および赤色で標識されたＮＫ細胞を、１：１の比で、１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＡまたは溶媒対照（生理食塩水）を補充した総量２００μｌ中に混合し、５％のＣＯ２インキュベーターで、３７℃で４時間共培養した。次いで、細胞を穏やかに回収し、２００μｌの４％ホルムアルデヒドで固定し、２０，０００個の細胞を、フローサイトメトリーを使用して、コンジュゲーションについて分析した。
【0147】
フラトリサイドを定量化するために、ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、それぞれ１０μｇ／ｍＬのＤＡＲＡまたは溶媒対照で４時間または２４時間処理し、次いで、ＰＯ－ＰＲＯ（商標）－１色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）および７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）で染色した。生存ＮＫ細胞（ＰＯ－ＰＲＯ（商標）－１陰性／７－ＡＡＤ陰性）を、ビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、頻度または絶対数に基づいて評価した。
【0148】
ＡＤＣＣを評価するために、ＭＭ細胞株または精製された初代ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞を、５μＭのＣＦＳＥで標識し、平底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）中で、１０μｇ／ｍｌのＤＡＲＡまたは対照としての溶媒の存在下、示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞と共培養した３８。ＤＡＲＡ耐性の初代試料が低頻度であったため（ＣＤ３８陰性／低）、これらの細胞を精製せず、ＭＭ細胞をＣＤ１３８＋ＣＤ４５－細胞として定義した。標的細胞の生存率を、ＭＭ細胞株については４時間後、初代試料については２４時間後に分析した。一部の実験では、骨髄腫細胞株を、４時間の細胞傷害性アッセイの前に、２日間、５０ｎＭのＡＴＲＡで前処理した。ＡＴＲＡが全体的なＤＡＲＡ媒介性ＮＫ細胞の細胞傷害に及ぼす影響を研究するために、ＭＭ細胞およびＮＫ細胞を、ＤＡＲＡおよび５０ｎＭのＡＴＲＡの存在下で、４８時間共培養した。全ＣＦＳＥ陽性細胞中の７－ＡＡＤ陰性／ＣＦＳＥ陽性細胞の割合または絶対数から、またはビーズを使用して、生存する標的細胞を評価した。エフェクター細胞およびＤＡＲＡの不在下でインキュベートした標的細胞から、バックグラウンドを決定した。ＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣの割合（％）は、以下の式に従って計算した：（１－エフェクター細胞およびＤＡＲＡの存在下での生存標的細胞の割合または絶対数／溶媒対照を含む対応する試料の割合）×１００。すべてのアッセイは、２人または３人の独立したドナーを用いて、３連で実施した。
【0149】
統計解析．統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して実施した。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を使用して、２つの独立した群を比較した。３つ以上の群は、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、続いて、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定で比較した。ｐ＜０．０５は、統計的有意性を示すとみなした。
【0150】
４．実施例４：結果．
ＮＫ細胞における、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用した効率的な遺伝子標的化.Ｃａｓ９／ＲＮＰ法を使用して、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、健常ドナーのエクスビボ増殖末梢血ＮＫ（ＰＢ－ＮＫ）細胞からうまく生成した（図８Ａ）。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３８のノックアウト効率が８１．９±６．９％であることを明らかにした（ｎ＝５、平均値±ＳＤ、図８Ｂ）。磁気分離を使用して、ＮＫ細胞を９９％超のＣＤ３８ＫＯまで精製し、さらなる実験に使用した（図８Ｃ）。ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、同様の増殖速度を示し、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の純度は、その後の培養後でも維持された（図８Ｄ）。ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間のＣＤ１６の発現レベルに差は観察されなかった（図７Ｂ）。
ＮＫ細胞における、Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用した効率的な遺伝子標的化.Ｃａｓ９／ＲＮＰ法を使用して、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、健常ドナーのエクスビボ増殖末梢血ＮＫ（ＰＢ－ＮＫ）細胞からうまく生成した（図８Ａ）。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３８のノックアウト効率が８１．９±６．９％であることを明らかにした（ｎ＝５、平均値±ＳＤ、図８Ｂ）。磁気分離を使用して、ＮＫ細胞を９９％超のＣＤ３８ＫＯまで精製し、さらなる実験に使用した（図８Ｃ）。ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、同様の増殖速度を示し、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の純度は、その後の培養後でも維持された（図８Ｄ）。ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間のＣＤ１６の発現レベルに差は観察されなかった（図７Ｂ）。
【0151】
ＮＫ細胞における、Ｃａｓ９／ＲＮＰの低いオフターゲット効果．高忠実度Ｃａｓ９（ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９）は、それがエレクトロポレーション後に迅速に分解するため、低いオフターゲット編集を有することが示されている。ＣＲＩＳＰＲ改変ＮＫ細胞におけるオフターゲット効果を研究するために、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を行い、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞に限定されるＳＮＰおよびＩＮＤＥＬを有する２６個の遺伝子を見出した。変異がコード領域に限定されていたため、すべての遺伝子は中程度または高度の潜在的影響の変異を有していた。ＳｎｐＥｆｆによって、１８個の遺伝子が、中程度の影響として分類された（ミスセンスおよび非フレームシフト）変異を有し、８個の遺伝子（ＣＤ３８を含む）が、高度の影響として分類された（スタートロス、ストップゲイン、およびフレームシフト）変異を有した（表３）。ＲＮＡ－ｓｅｑによって、高度の影響の変異を有する可能性のあるオフターゲット遺伝子のうちの４つのみが、ＮＫ細胞において有意義なレベルで発現される（ＣＣ２Ｄ１Ｂ、ＤＥＮＮＤ４Ｂ、ＫＭＴ２Ｃ、およびＷＤＲ８９、図９）。これらの結果は、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８標的化に対するこのｇＲＮＡの効率性および特異性を示す。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【表5-5】
【表5-6】
【0152】
ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の耐性．ＤＡＲＡは、ＣＤ３８とＣＤ１６を架橋することにより、ＮＫ対ＮＫのＡＤＣＣを介してＮＫ細胞のフラトリサイドを誘発する。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞がＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに耐性であるかどうかを研究するために、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のコンジュゲーションおよび生存率を評価した。ＤＡＲＡは、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞コンジュゲートの形成を増加させたが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞コンジュゲートの形成には影響しなかった（図１０Ａ～１０Ｂ）。この結果と一致して、ＤＡＲＡは、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のＡＤＣＣ依存性アポトーシスを誘導し、一方、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、ＤＡＲＡとのインキュベーションの全体を通してその生存率を維持した（図１０Ｃ～１０Ｄ）。同様に、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の欠失もまた、ＤＡＲＡによる処理後も、その生存能を維持した。さらに、ＮＫ細胞および補体の不在下では、ＤＡＲＡ媒介性溶解は観察されなかった（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ１６およびＣＤ３８が、ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに必要かつ十分であり、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８の欠失により、ＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドに耐性になることを示す。
【0153】
次に、ＤＡＲＡに対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の耐性がインビボにおける優れた持続性にも寄与し得るかどうかを研究するために、ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、ＤＡＲＡで処理したＮＳＧマウスに融合させ、ＰＢ、脾臓、およびＢＭ中のＮＫ細胞の頻度を調べた。ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、対照マウスにおいて同等の生着を示した（図１０Ｅ～１０Ｆ）。対照的に、ＤＡＲＡでの処理は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞の生着を有意に低減したが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の持続性には影響を及ぼさなかった（図１０Ｅ～１０Ｆ）。ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞は、脾臓およびＢＭならびに末梢血中のＤＡＲＡによって枯渇したが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、対照とＤＡＲＡ処置マウスとの間のこれらの区画のいずれにおいても有意な枯渇を示さなかった（図１０Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＣＤ３８ＫＯ細胞が、インビトロおよびインビボで、ＤＡＲＡに耐性であることを示す。
【0154】
ＭＭ細胞に対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の優れたＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ．ＮＫ細胞のＤＡＲＡ誘発性枯渇は、標的細胞に対する細胞依存性細胞傷害を鈍化させる可能性があるため、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞はまた、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞よりも効率的に標的細胞を殺傷することができる。これを検討するために、高レベル、低レベル、または皆無のＣＤ３８発現を有する異なるＭＭ細胞株に対して、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性を、ＤＡＲＡの存在下または不在下で試験した（図１２Ａ）。各ＭＭ細胞株に対する直接的な細胞傷害性は、ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間で同等であったが、ＤＡＲＡの存在下では、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋標的細胞に対して有意に高い細胞傷害性を示し（図１２Ｂ）、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のより高いＡＤＣＣを示した（図１２Ｃ）。ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のいずれも、ＣＤ３８－細胞株Ｕ２６６に対してＡＤＣＣを示さなかった。ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞は、ＯＰＭ－２およびＫＭＳ－１１などの低レベルのＣＤ３８発現を有するＭＭ細胞に対して、わずかなまたは皆無のＡＤＣＣを示したが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、これらのＭＭ細胞株に対して、有意により強いＡＤＣＣを示した。細胞株による結果と同様に、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、初代ＭＭ試料に対するより高いＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性を示し（図１２Ｄ～１２Ｅ）、ＤＡＲＡ耐性症例からの初代ＣＤ３８低ＭＭ細胞に対する細胞傷害性の改善も含まれた（図１２Ｆおよび１８）。ＣＤ３８ＷＴＮＫと比較した、ＣＤ３８ＫＯＮＫのＣＤ３８発現と改善されたＡＤＣＣとの間の関係をさらに研究し（図１３）、統計的に有意な逆相関を見出した（ｒ＝－０．７８６、ｐ＝０．０４８）。総じて、この結果は、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞が、低いＣＤ３８発現に起因して、別様ではＤＡＲＡ耐性である再発性および難治性のＭＭに対するＤＡＲＡの有効性を改善することができることを示す（図１８）。
【0155】
ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＡＴＲＡの阻害効果．ＭＭ細胞上のＣＤ３８の下方制御は、ＤＡＲＡに対する耐性の発達において重要な役割を果たすと考えられる。ＡＴＲＡによる処理は、ＣＤ３８低標的細胞上のＣＤ３８レベルの上方制御を通して、この耐性を克服することができる。ＭＭ細胞でのＣＤ３８の上方制御およびＮＫ細胞でのＣＤ３８の欠失における相乗作用を調べるために、ＭＭ細胞をＡＴＲＡで前処理した後、ＤＡＲＡおよびＮＫ細胞によるＡＤＣＣを評価した。ＡＴＲＡによる前処理が、ＭＭ標的細胞でのＣＤ３８レベルを上方制御することが確認され（図１４）、ＣＤ３８ＷＴおよび対のＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の両方の存在下で、ＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣを改善することが示された（図１５Ａ～１５Ｂ）。次いで、ＡＴＲＡで処理した急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）患者のＰＢ－ＮＫを使用して、インビボで、ＮＫ細胞上のＣＤ３８発現に対するＡＴＲＡの直接的な効果を調べた。処理前に得られた試料と比較して、ＡＴＲＡによる処理は、これらの患者のＰＢ－ＮＫ上のＣＤ３８の有意な上方制御と関連付けられた（図１５Ｃ）。同様に、ＡＴＲＡによるエクスビボ処理は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞でのＣＤ３８レベルを上方制御するが、対のＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞では上方制御しない（図１５Ｄ）。さらに、ＡＴＲＡはＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のフラトリサイドも増強した（図１５Ｅ）。ＡＴＲＡによるＭＭ細胞の前処理とは対照的に、ＡＴＲＡによるＭＭ細胞とＮＫ細胞の両方の同時処理は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣを著しく損なったが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣには影響を与えなかった（図１５Ｆ）。ＡＴＲＡは、ＣＤ３８ＷＴおよび対のＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の両方の直接的な細胞傷害性を、同程度に有意に低下させた（図１５Ｆ）。したがって、ＭＭ標的細胞上のＣＤ３８のＡＴＲＡ誘発性上方制御は、ＮＫ細胞のフラトリサイドの増加およびＮＫ細胞機能の障害によって相殺され、ＤＡＲＡの全体的な有効性を低下させる可能性があり、これは、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の使用によって緩和され得る（図１５Ｇ）。
【0156】
ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞におけるより高いＯＸＰＨＯＳ活性．ＣＤ３８は、４６ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、細胞内ＮＡＤ＋レベルを調節するＮＡＤ＋ヒドロラーゼとしてのエクト酵素活性を含む、複数の機能を有することが示されている。ＮＡＤ＋は、ＡＴＰ産生に寄与する酵素触媒反応に不可欠な補助因子であるため、ＣＤ３８は細胞代謝において重要な役割を果たす。最近の研究では、Ｔ細胞におけるＣＤ３８のノックアウトが、より高いレベルの細胞内ＮＡＤ＋をもたらし、これがＯＸＰＨＯＳおよびＡＴＰ合成を促進し、その結果、がんに対するより高い細胞傷害性をもたらすことが報告されている。Ｔ細胞と同様に、代謝の関与は、腫瘍環境におけるＮＫ細胞の細胞傷害性および生存に重要な役割を果たす。ＣＤ３８ノックアウトがＮＫ細胞代謝に及ぼす影響を調査した。まず、野生型およびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞においてＲＮＡ－ｓｅｑを行い、ＤＥＧを同定し、ＩＰＡを使用して、ＤＥＧと比べて差次的に制御されている経路を特定した。ＩＰＡは、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞において、コレステロール生合成経路（ｐ＜０．００００１）およびＯＸＰＨＯＳ経路（ｐ＜０．００００１）で有意な変化を示した。これらの経路における遺伝子の分析は、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞におけるＡＴＰ合成、ＮＡＤリサイクリング、および電子伝達に特異的に関連するミトコンドリア遺伝子の発現の、わずかではあるが有意な増加を特定した（表１、図１６Ａおよび１７）。主成分分析は、ベースラインにおけるドナー依存性の有意な変動を明らかにしたが、既にベースラインのスペクトルの最末端にあったドナー＃１０を除いて、すべてのドナー対の中のＣＤ３８の欠失に応答して一貫した定方向性の変化を明らかにした（図１６Ｂ）。これらの代謝経路における遺伝子の上方制御を考慮して、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞代謝を調査した。ミトコンドリアストレス試験アッセイを使用して、より高いＯＣＲおよび同等のＥＣＡＲが観察され、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞におけるＯＣＲ／ＥＣＡＲ比が、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞と比較して、有意に高い結果となった（図１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅ、１６Ｆ、および１６Ｄ）。この結果は、ＮＫ細胞が優先的にＯＸＰＨＯＳを使用して、それらの生体エネルギー的要求を達成するように、ＣＤ３８の欠失がＮＫ細胞を誘導することを示す。重要なことに、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞はまた、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞と比較して、より高い予備呼吸能（ＳＲＣ）およびミトコンドリア呼吸能を有した（図１６Ｄ）。これらの有利な代謝シフトは、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のＤＡＲＡ媒介性細胞傷害の増強と一致する。
【表6】
【0157】
ＤＡＲＡの使用は、再発／難治性ＭＭ患者に有効である。しかし、先行レジメンに組み込まれ、ＭＭの治療における標準治療として受け入れられているにもかかわらず、疾患の再発は避けられないことがますます明らかになっている。ＤＡＲＡによる治療に対するＭＭ細胞の耐性機構が解明され始めている。これらの機構の一部は、腫瘍の不均一性および骨髄微小環境の役割などの、以前に提案されたＩＭｉＤまたはＰＩへの耐性の機構と重複するが、他の機構は、モノクローナル抗体療法に固有のものであり得る。
【0158】
モノクローナル抗体は、４つの機構：ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および受容体架橋を介した活性化誘発性の細胞死、を通して標的を排除する。したがって、抵抗機構は、これらの機構の抑制を通して生じる。例えば、ＤＡＲＡ耐性は、ＭＭ細胞の表面の補体阻害タンパク質（ＣＤ５５およびＣＤ５９）の過剰発現と関連しており、ＤＡＲＡ媒介性ＣＤＣを損なう。ＡＤＣＣに関しては、ＤＡＲＡで独特の状況が生じ、処理中に、高レベルのＣＤ３８を発現するＮＫ細胞が除去され、ＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣが損なわれる。エクスビボ増殖ＮＫ細胞の養子移植によるＤＡＲＡ媒介ＡＤＣＣの救済は、ＣＤ３８低 ＮＫ細胞を使用する前臨床モデルにおいて成功した。しかしながら、これらのＣＤ３８低 ＮＫ細胞は、エクスビボ増殖中にＣＤ３８発現を再獲得するため、ＤＡＲＡ媒介性除去に対する感受性を回復し、臨床上の解釈（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を不可能にした。さらに、多発性骨髄腫を有する患者（特に、ＤＡＲＡで治療された患者）は、ＮＫ細胞を含む免疫細胞の数が比較的少ない。したがって、本発明者らは、同種ＮＫ細胞に焦点を当て、サードパーティのユニバーサルドナー戦略により、最適なＮＫ細胞機能について、望ましいＫＩＲ遺伝子型またはＦＣＧＲ３Ａ多型を有するドナーを選択することが可能になるであろう。
【0159】
ここでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を生成した。これらの細胞は、ＤＡＲＡ誘発性コンジュゲーションおよびフラトリサイドに耐性であり、インビボで、ＤＡＲＡの存在下で維持された。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、対のＣＤ３８ＷＴ細胞と比較した場合、ＭＭ細胞株および初代試料に対して優れたＡＤＣＣ活性を示した。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、ＣＤ３８の発現が低いＭＭ細胞株、およびＤＡＲＡ治療中に再発した患者由来のＭＭ細胞に対して特に有効であったが、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞は、それらの標的細胞に対する活性が最小限であったか、または全くなかった。ＤＡＲＡによる治療中の低ＣＤ３８発現ＭＭ細胞に対する選択圧を考慮すると、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、この残存疾患に対するＤＡＲＡの治療効果を強化することができる。
【0160】
ＮＫ細胞上のＣＤ３８の欠失は、これらの細胞のミトコンドリア呼吸能の増加と、ＯＸＰＨＯＳ代謝およびコレステロール合成に有利な代償的転写因子プロファイルとに関連付けられた。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のエフェクター機能におけるこの代謝シフトの役割は直接的に調査されなかったが、以前の研究は、Ｔ細胞においてＣＤ３８をノックアウトすると、より高いＯＸＰＨＯＳ活性および抗腫瘍効果がもたらされることを示した。
【0161】
抗原密度は、モノクローナル抗体による標的認識およびエフェクター機能における重要な因子であり、したがって、標的細胞上のＣＤ３８レベルの上方制御は、ＤＡＲＡ活性を増強する可能性を有する。最近、ＩＭｉＤとＤＡＲＡとの間の臨床上の相乗効果は、部分的には、ＩＭｉＤによるＭＭ細胞上のＣＤ３８の上方制御に起因する。ＡＴＲＡはまた、ＭＭ細胞上のＣＤ３８レベルを上方制御し、それらをＤＡＲＡ媒介性ＣＤＣおよびＡＤＣＣに対して感作させることが示された。既知の好ましい免疫調節プロファイルを有するＩＭｉＤとは対照的に、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性に対するＡＴＲＡの効果についてはほとんど知られていない。ここで、ＡＴＲＡによる処理は、ＭＭ細胞上のＣＤ３８のレベルを上方制御することが確認されたが、それはまた、ＡＰＬを有する患者のエクスビボ増殖ＮＫ細胞およびインビボ循環ＮＫ細胞上のＣＤ３８を上方制御することも示した。ＮＫ細胞に対するこの調節効果は、インビボでＤＡＲＡ誘発性フラトリサイドを増強し、ＭＭ細胞に対するＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣを損なう可能性がある。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞はフラトリサイドが見られなかったが、ＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の両方の直接的な細胞傷害は、ＡＴＲＡによって有意に抑制された。したがって、ＭＭ細胞上のＣＤ３８レベルのＡＴＲＡ媒介性上方制御は、ＮＫ細胞機能へのその負の影響によって相殺された。まとめると、ＡＴＲＡによる処理の正味の結果は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣ活性の全体的な障害であり、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の使用により、ＡＤＣＣに対するＡＴＲＡの負の影響が救済された。
【0162】
ＡＴＲＡによる処理は、ＭＭ細胞上のＣＤ５５およびＣＤ５９の発現を減少させることによって、ＤＡＲＡ媒介性ＣＤＣを増強させ得ることに言及しておくことが重要である。臨床開発用のほとんどのモノクローナル抗体は、それらのＣＤＣ活性に基づいて選択されるが、４つの作用機構のうちのどれが臨床環境で最も重要な役割を果たすのかは不明である。これらの機構を区別する前臨床モデルは、マウス異種移植におけるＭＭの根絶におけるＤＡＲＡ単独の高い有効性のために困難であり、エクスビボ増殖ＮＫ細胞の添加は、ＤＡＲＡ単独と比べて、比較的小さな利益を有する。ＣＤ３８低ＭＭ患者由来異種移植片の開発は、ＤＡＲＡ細胞とＮＫ細胞との組合せの薬物動態モデリング、およびＣＤ３８ＫＯ細胞とＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞との比較に有用であり得る。ＭＭ患者のためにＡＴＲＡとＤＡＲＡとの組合せを試験する現在の臨床試験（ＮＣＴ０２７５１２５５）は、独自の治療スケジュールを使用し、これらの薬物への一過的および交錯的な曝露を提供する。ＤＡＲＡの薬物動態は、治療中に比較的一定であり、ＡＴＲＡレベルは、複雑な全身および組織依存性のフィードバック機構によって厳密に調節される。この組合せを使用した臨床転帰に加えて、この治療スケジュールがＮＫ細胞数、機能、ならびにＤＡＲＡ媒介性ＡＤＣＣおよびＣＤＣに及ぼす影響を理解することは興味深い。さらに、抗ＫＩＲ抗体は、ダラツムマブ媒介性の初代骨髄腫細胞の溶解を増強することが示されている。ＣＤ３８ＫＯおよびＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性に対するＫＩＲ機能／遺伝子型およびＦＣＲＧＩＩＩＡ多型の影響を調査することは、将来の研究の重要な分野であり、これらの所見の臨床上の解釈に必要なステップである。
【0163】
この研究は、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞がＭＭ細胞に対するＤＡＲＡの効果を高めることができるという概念の実証を提供した。Ｃａｓ９／ＲＮＰを使用した新たに開発されたＤＮＡフリーのアプローチは、ＷＧＳによって評価されるように、非常に低い頻度のオフターゲット効果で、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の効率的な生成に成功した。
【0164】
臨床的に有意な数を達成するために重要な、遺伝子改変ＮＫ細胞の増殖も方法を適用した。集合的に、これらの結果は、ＭＭだけでなく、潜在的に、急性骨髄性白血病、ならびにＢ細胞およびＴ細胞リンパ芽球性白血病およびリンパ腫などの他のＣＤ３８＋血液悪性腫瘍にも対する、ＤＡＲＡと組み合わせた養子免疫療法のための、エクスビボ増殖ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の合理性および実現可能性を実証する。さらに、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８欠失の方法を適用して、ＣＤ３８キメラ抗原受容体－ＮＫ細胞を生成して、細胞製造中のそれらのフラトリサイドおよびインビボでの有効な抗腫瘍活性を回避することができる。
【0165】
５．実施例５：イサツキシマブを使用した併用療法
ＭＭに対するＤＡＲＡと組み合わせた養子免疫療法に対するＮＫ ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の有効性を認識することで、イサツキシマブなどのＤＡＲＡ以外の他の抗ＣＤ３８免疫療法を、がんの治療に利用することができる。
ＭＭに対するＤＡＲＡと組み合わせた養子免疫療法に対するＮＫ ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の有効性を認識することで、イサツキシマブなどのＤＡＲＡ以外の他の抗ＣＤ３８免疫療法を、がんの治療に利用することができる。
【0166】
イサツキシマブ誘発性フラトリサイドに対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の耐性。ＤＡＲＡと同様に、イサツキシマブは、ＣＤ３８およびＣＤ１６を架橋することによって、ＮＫ対ＮＫのＡＤＣＣを介してＮＫ細胞のフラトリサイドを誘導する。ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞がイサツキシマブ誘発性フラトリサイドに耐性であるかどうかを研究するために、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のコンジュゲーションおよび生存率を評価することができる。イサツキシマブは、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞コンジュゲートの形成を増加させ得るが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞コンジュゲートの形成には影響しない。また、イサツキシマブは、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞のＡＤＣＣ依存性アポトーシスを誘導することができ、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、イサツキシマブとのインキュベーションの全体を通してその生存率を維持する。同様に、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の欠失もまた、イサツキシマブによる処理後のその生存率を維持する。これらの結果は、ＣＤ１６およびＣＤ３８が、イサツキシマブ誘発性フラトリサイドに必要かつ十分であり、ＮＫ細胞におけるＣＤ３８の欠失により、イサツキシマブ誘発性フラトリサイドに耐性になることを示す。
【0167】
次に、イサツキシマブに対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の耐性がインビボにおける優れた持続性にも寄与し得るかどうかを研究するために、ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞を、イサツキシマブで処理したＮＳＧマウスに融合させ、ＰＢ、脾臓、およびＢＭ中のＮＫ細胞の頻度を調べることができる。ＣＤ３８ＷＴまたはＣＤ３８ＫＯを調べることができる。イサツキシマブによる処理は、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞の生着を有意に低減することができるが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の持続性には影響を及ぼさなかった。処理の結果として、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞は、脾臓およびＢＭならびに末梢血中のイサツキシマブによって枯渇するが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、対照とイサツキシマブ処置マウスとの間のこれらの区画のいずれにおいても有意な枯渇を示さない。
【0168】
ＭＭ細胞に対するＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の優れたイサツキシマブ媒介性ＡＤＣＣ．ＮＫ細胞のＤＡＲＡ誘発性枯渇は、標的細胞に対する細胞依存性細胞傷害を鈍化させる可能性があるため、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞はまた、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞よりも効率的に標的細胞を殺傷することができる。これがイサツキシマブにも適用されるかどうかを研究するために、高レベル、低レベル、または皆無のＣＤ３８発現を有する異なるＭＭ細胞株に対して、対のＣＤ３８ＷＴおよびＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞の細胞傷害性を、イサツキシマブの存在下または不在下で試験することができる。各ＭＭ細胞株に対する直接的な細胞傷害性は、ＣＤ３８ＷＴとＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞との間で同等であるが、イサツキシマブの存在下では、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋標的細胞に対して有意に高い細胞傷害性を示し、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞のより高いＡＤＣＣを示している。ＤＡＲＡ実験と同様に、ＣＤ３８ＷＴＮＫ細胞は、ＯＰＭ－２およびＫＭＳ－１１などの低レベルのＣＤ３８発現を有するＭＭ細胞に対して、わずかなまたは皆無のＡＤＣＣを示すが、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、これらのＭＭ細胞株に対して、有意により強いＡＤＣＣを示す。細胞株を用いた結果と同様に、ＣＤ３８ＫＯＮＫ細胞は、初代ＭＭ試料に対して、より高いイサツキシマブ媒介性ＡＤＣＣ活性を示す。
【0169】
Ｅ．参考文献
Ａｂｄａｌｌａｈ Ｎ，Ｋｕｍａｒ ＳＫ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１９；１０：２０４０６２０７１９８９４８７１．
Ａｌｉｃｉ，Ｅ．，Ｓｕｔｌｕ，Ｔ．＆Ｓｉｒａｃ Ｄｉｌｂｅｒ，Ｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５０６ １２７－１３７，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－４０９－４＿１０，（２００９）．
Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｄ，Ｃｈａｎｇ ＹＴ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｌｔｅｒｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（１２）：４４６０－４４６８．
Ｂａｅｒｔｓｃｈ ＭＡ，Ｈｕｎｄｅｍｅｒ Ｍ，Ｈｉｌｌｅｎｇａｓｓ Ｊ，Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ，Ｒａａｂ ＭＳ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｃａｎ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ｂｏｔｈ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：Ａ ｃａｓｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６（１）：２５８－２６１．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｖ，Ｇｏｒｍｌｅｙ ＮＪ，Ｌｕｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．ＦＤＡ Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ：Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ａｆｔｅｒ Ｏｎｅ Ｐｒｉｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１７；２２（１１）：１３４７－１３５３．
Ｂｒｉｄｅ ＫＬ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＴＬ，Ｉｍ ＳＹ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１（９）：９９５－９９９．
Ｃａｒｌｓｔｅｎ，Ｍ．＆Ｃｈｉｌｄｓ，Ｒ．Ｗ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６ ２６６，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１５．００２６６，（２０１５）．
Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，Ｘｕ ＸＳ，Ａｄａｍｓ ＨＣ，３ｒｄ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｏｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４．
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｄａｅｎｔｈａｎａｓａｎｍａｋ Ａ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８－ＮＡＤ（＋）Ａｘｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１８；２７（１）：８５－１００ ｅ１０８．
Ｃｈｉｎｉ ＥＮ．ＣＤ３８ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＮＡＤ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００９；１５（１）：５７－６３．
Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ Ｐ，Ｐｌａｔｔｓ Ａ，Ｗａｎｇ ｌｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳｎｐＥｆｆ：ＳＮＰｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｗ１１１８；ｉｓｏ－２；ｉｓｏ－３．Ｆｌｙ（Ａｕｓｔｉｎ）．２０１２；６（２）：８０－９２．
Ｃｉｕｒｅａ ＳＯ，Ｓｃｈａｆｅｒ ＪＲ，Ｂａｓｓｅｔｔ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ １ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｕｓｉｎｇ ｍｂＩＬ２１ ｅｘ ｖｉｖｏ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（１６）：１８５７－１８６８．
Ｃｌｅｍｅｎｓ ＰＬ，Ｙａｎ Ｘ，Ｌｏｋｈｏｒｓｔ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ａｆｔｅｒ Ｐｒｉｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２０１７；５６（８）：９１５－９２４．
ｄｅ Ｈａａｒｔ ＳＪ，Ｈｏｌｔｈｏｆ Ｌ，Ｎｏｏｒｔ ＷＡ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐａｎｔｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＹＭ１５５）ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１６；１０１（８）：ｅ３３９－３４２．
ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，Ｔａｉ ＹＴ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｒ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１８６（３）：１８４０－１８４８．
Ｄｅｎｍａｎ ＣＪ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ＶＶ，Ｓｏｍａｎｃｈｉ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ＩＬ－２１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ３０２６４．
ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ａ．，Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ｅ．＆Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２１－１２２ ９－１５，（２０１７）．
Ｄｉ Ｇａｅｔａｎｏ Ｎ，Ｃｉｔｔｅｒａ Ｅ，Ｎｏｔａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１（３）：１５８１－１５８７．
Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｏｒｉｏｌ Ａ，Ｎａｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５（１４）：１３１９－１３３１．
Ｅｙｑｕｅｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ＣＡＲ ｔｏ ｔｈｅ ＴＲＡＣ ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．５４３（７６４３），１１３－１１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１４０５，（２０１７）．
Ｆｅｄｅｌｅ ＰＬ，Ｗｉｌｌｉｓ ＳＮ，Ｌｉａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ＩＭｉＤｓ ｐｒｉｍｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｏｓｓ ｏｆ Ｉｋａｒｏｓ ａｎｄ Ａｉｏｌｏｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３２（２０）：２１６６－２１７８．
Ｇａｎｄｈｉ ＵＨ，Ｃｏｒｎｅｌｌ ＲＦ，Ｌａｋｓｈｍａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ＣＤ３８－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１９；３３（９）：２２６６－２２７５．
Ｇａｏ Ｚ，Ｔｏｎｇ Ｃ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｗｕ Ｚ，Ｈａｎ Ｗ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＣＤ３８－ｄｒｉｖｅｎ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ａｍｏｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＣＤ３８－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１９；４６（８）：３６７－３７７．
Ｇａｖｒｉａｔｏｐｏｕｌｏｕ Ｍ，Ｋａｓｔｒｉｔｉｓ Ｅ，Ｎｔａｎａｓｉｓ－Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＭｉＤｓ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃａｎ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ｂｏｔｈ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１（４）：４６４－４６７．
Ｇｕｏ Ｙ，Ｆｅｎｇ Ｋ，Ｔｏｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｂ－ＡＬＬ ａｆｔｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０．
Ｇｕｖｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．３３（１１），１３２０－１３２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２００５．０７．００６，（２００５）．
Ｈａｒｉ Ｐ，Ｒａｊ ＲＶ，Ｏｌｔｅａｎｕ Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ３８ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ－Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５（１５）：１５０１－１５０２．
Ｈｏｗａｒｄ Ｍ，Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＪＣ，Ｂａｚａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ３８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；２６２（５１３６）：１０５６－１０５９．
Ｈｕ Ｙ，Ｔｕｒｎｅｒ ＭＪ，Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ＣＤ５２ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２８（２）：２６０－２７０．
Ｈｕ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｑ，Ｄｅｎｇ Ｈ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３８ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＮＡＤ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４；１３（２）：７８６－７９５．
Ｋａｒａｒｏｕｄｉ ＭＮ，Ｌｉｋｈｉｔｅ Ｓ，Ｅｌｍａｓ Ｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ，Ｍｅｙｅｒ Ｋ，Ｌｅｅ ＤＡ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＲＩＳＰａｉｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ＡＡＶ．ｂｉｏＲｘｉｖ．２０１９：７４３３７７．
Ｋｅｌｌｙ ＢＪ，Ｆｉｔｃｈ ＪＲ，Ｈｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ：ａｎ ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ，ｈｉｇｈｌｙ ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｂａｌａｎｃｅｄ ｐａｒａｌｌｅｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１５；１６：６．
Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｊ．＆Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４（６），１０１２－１０１９，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３，（２０１４）．
Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｈ，Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｓ，Ｏｈｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３（２５）：１５４２９－１５４３４．
Ｋｒｅｊｃｉｋ Ｊ，Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｄｅｐｌｅｔｅｓ ＣＤ３８＋ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｋｅｗｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（３）：３８４－３９４．
Ｋｒｅｊｃｉｋ Ｊ，Ｆｒｅｒｉｃｈｓ ＫＡ，Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ Ｒｅｄｕｃｅ ＣＤ３８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｎ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７；２３（２４）：７４９８－７５１１．
Ｋｕｍａｒ ＳＫ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｋａｓｔｒｉｔｉｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｍｙｅｌｏｍａ，ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ＩＭＷＧ ｓｔｕｄｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１７；３１（１１）：２４４３－２４４８．
Ｌａｕｂａｃｈ Ｊ，Ｇａｒｄｅｒｅｔ Ｌ，Ｍａｈｉｎｄｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１６；３０（５）：１００５－１０１７．
Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｖｅｒｎｅｒｉｓ，Ｍ．Ｒ．＆Ｃａｍｐａｎａ，Ｄ．Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６５１ ６１－７７，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０７６１－７８６－０＿４，（２０１０）．
Ｌｅｏｎｅ ＲＤ，Ｅｍｅｎｓ ＬＡ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１８；６（１）：５７．
Ｌｅｕｎｇ－Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ Ｃ，Ｅｒｄｍａｎｎ Ｎ，Ｃｈｅｕｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｘｂｐ１ｓ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｅ－ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１３；２４（３）：２８９－３０４．
Ｌｉ Ａ，Ｈｅ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７；３５２（１）：４２－４７．
Ｌｉａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０８ ４４－５３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１５．０４．０２４，（２０１５）．
Ｌｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８ １４２６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４２６１，（２０１７）．
Ｌｉｕ Ｊ，Ｚｈａｏ ＹＪ，Ｌｉ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｗｉｔｈ ＣＩＢ１ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｌｅｖｅｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７．
Ｍａｌｏｎｅｙ ＤＧ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ ＡＪ，Ｗｈｉｔｅ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０（６）：２１８８－２１９５．
Ｍａｒｔｉｎ Ｔ，Ｂａｚ Ｒ，Ｂｅｎｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １ｂ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ ｐｌｕｓ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｆｏｒ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１２９（２５）：３２９４－３３０３．
Ｍａｔｅｏｓ ＭＶ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｃａｖｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，Ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１８；３７８（６）：５１８－５２８．
Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｓ．＆Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９ ２８３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００２８３，（２０１８）．
Ｍｅｙｅｒ Ｓ，Ｌｅｕｓｅｎ ＪＨ，Ｂｏｒｏｓｓ Ｐ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．ＭＡｂｓ．２０１４；６（５）：１１３３－１１４４．
Ｍｉｎａｒｄ－Ｃｏｌｉｎ Ｖ，Ｘｉｕ Ｙ，Ｐｏｅ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ＣＤ２０ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩ，ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＶ．Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１２（４）：１２０５－１２１３．
Ｍｏｒｅａｕ Ｐ，Ａｔｔａｌ Ｍ，Ｈｕｌｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ（ＣＡＳＳＩＯＰＥＩＡ）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１９；３９４（１０１９２）：２９－３８．
Ｎａｅｉｍｉ Ｋａｒａｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｄｏｌａｔｓｈａｄ Ｈ，Ｔｒｉｋｈａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１８（１３６）．
Ｎａｉｋ Ｊ，Ｔｈｅｍｅｌｉ Ｍ，ｄｅ Ｊｏｎｇ－Ｋｏｒｌａａｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｄｕｌｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１９；１０４（３）：ｅ１００－ｅ１０３．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，ｖａｎ Ｖｅｌｚｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（７）：９５９－９７０．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｇｒｏｅｎ ＲＷ，Ｌｏｋｈｏｒｓｔ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９（１０）：２０３９－２０４９．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｇｒｏｅｎ ＲＷ，Ｎｏｏｒｔ ＷＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣＤ３８－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５；２１（１２）：２８０２－２８１０．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｌａｍｍｅｒｔｓ ｖａｎ Ｂｕｅｒｅｎ ＪＪ，ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ＫＩＲ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩＰＨ２１０２ ａｎｄ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１５；１００（２）：２６３－２６８．
Ｎｏｏｋａ ＡＫ，Ｊｏｓｅｐｈ ＮＳ，Ｋａｕｆｍａｎ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｙｅｌｏｍａ：Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ａｍｏｎｇ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１９；１２５（１７）：２９９１－３０００．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＫＬ，Ｆｉｎｌａｙ ＤＫ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１９（５）：２８２－２９０．
Ｏｒｌｏｗｓｋｉ ＲＺ，Ｍｏｒｅａｕ Ｐ，Ｎｉｅｓｖｉｚｋｙ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ－Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ－Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｕｐｄａｔｅｄ Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ Ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ．Ｃｌｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｌｅｕｋ．２０１９；１９（８）：５２２－５３０ ｅ５２１．
Ｐｏｍｅｒｏｙ ＥＪ，Ｈｕｎｚｅｋｅｒ ＪＴ，Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０２０；２８（１）：５２－６３．
Ｒａａｂ ＭＳ，Ｐｏｄａｒ Ｋ，Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ Ｉ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＧ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７４（９６８６）：３２４－３３９．
Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋ，Ｒｏｕｃｅ Ｒ，Ｌｉｕ Ｅ，Ｓｈｐａｌｌ Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；２５（８）：１７６９－１７８１．
Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ．，Ｒｏｕｃｅ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｅ．＆Ｓｈｐａｌｌ，Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（８），１７６９－１７８１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０６．０１２，（２０１７）．
Ｒｏｓａｒｉｏ Ｍ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｋｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＩＬ－１５－Ｂａｓｅｄ ＡＬＴ－８０３ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（３）：５９６－６０８．
Ｓａｌｔａｒｅｌｌａ Ｉ，Ｄｅｓａｎｔｉｓ Ｖ，Ｍｅｌａｃｃｉｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－ＣＤ３８ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｅｌｌｓ．２０２０；９（１）．
Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄ，Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋａ Ｅ，Ｒａｔｈｏｒｅ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｉＲ－２３ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ＣＴＳＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；４９：４２－５２．
Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｊｚｎｅｒ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｌ．＆Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ．３０（１），３０－３９，ｄｏｉ：１０．１０９７／ｍｏｐ．０００００００００００００５６４，（２０１８）．
Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．，Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．＆Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（４８），ｄｏｉ：１０．３７９１／２５４０，（２０１１）．
Ｓｔｅｖｉｓｏｎ Ｆ，Ｊｉｎｇ Ｊ，Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｓ，Ｉｓｏｈｅｒｒａｎｅｎ Ｎ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ－Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ，ＣＹＰ２６，ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；７４：３７３－４１２．
Ｓｕｔｌｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１０），１０９０－１１００，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１２．０８０，（２０１２）．
Ｕｒｕｎｏ Ａ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（Ａｍ８０）ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＨＬ－６０ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ－ｄｅｌｔａ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１１；９０（２）：２３５－２４７．
Ｕｓｍａｎｉ ＳＺ，Ｗｅｉｓｓ ＢＭ，Ｐｌｅｓｎｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（１）：３７－４４．
Ｖａｋｕｌｓｋａｓ ＣＡ，Ｄｅｖｅｒ ＤＰ，Ｒｅｔｔｉｇ ＧＲ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｃａｓ９ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｓ ａ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８；２４（８）：１２１６－１２２４．
ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ Ｎ，Ｕｓｍａｎｉ ＳＺ．ＣＤ３８ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：２１３４．
ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ ＮＷ，Ｊａｎｍａａｔ ＭＬ，Ｍｕｔｉｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ３８ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１６；２７０（１）：９５－１１２．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｒ ＭＳ，ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１１；９６（２）：２８４－２９０．
Ｖｉｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．９（４１５），ｒａ１９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．ａａｄ１８８４，（２０１６）．
Ｖｏｕｉｌｌｏｔ，Ｌ．，Ｔｈｅｌｉｅ，Ａ．＆Ｐｏｌｌｅｔ，Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．５（３），４０７－４１５，ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇ３．１１４．０１５８３４，（２０１５）．
Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ Ｅｘ Ｖｉｖｏ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８；２４（１６）：４００６－４０１７．
Ｗａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１１３（１１），２８６８－２８７３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２０２４４１１３，（２０１６）．
Ｘｕ ＸＳ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｓｏｎｎｅｖｅｌｄ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｇｉｍｅｎｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ａｄｖ Ｔｈｅｒ．２０１８；３５（１１）：１８５９－１８７２．
Ｚｅｎｔ ＣＳ，Ｓｅｃｒｅｔｏ ＣＲ，ＬａＰｌａｎｔ ＢＲ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＣＬＬ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｅａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｇｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＬＬ）ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２００８；３２（１２）：１８４９－１８５６．
Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（１），７３－８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１，（２０１５）．
Ａｂｄａｌｌａｈ Ｎ，Ｋｕｍａｒ ＳＫ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１９；１０：２０４０６２０７１９８９４８７１．
Ａｌｉｃｉ，Ｅ．，Ｓｕｔｌｕ，Ｔ．＆Ｓｉｒａｃ Ｄｉｌｂｅｒ，Ｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５０６ １２７－１３７，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－４０９－４＿１０，（２００９）．
Ａｌｏｎｓｏ Ｓ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｄ，Ｃｈａｎｇ ＹＴ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｌｔｅｒｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（１２）：４４６０－４４６８．
Ｂａｅｒｔｓｃｈ ＭＡ，Ｈｕｎｄｅｍｅｒ Ｍ，Ｈｉｌｌｅｎｇａｓｓ Ｊ，Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ Ｈ，Ｒａａｂ ＭＳ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｃａｎ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ｂｏｔｈ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：Ａ ｃａｓｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８；３６（１）：２５８－２６１．
Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｖ，Ｇｏｒｍｌｅｙ ＮＪ，Ｌｕｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．ＦＤＡ Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ：Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ａｆｔｅｒ Ｏｎｅ Ｐｒｉｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２０１７；２２（１１）：１３４７－１３５３．
Ｂｒｉｄｅ ＫＬ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＴＬ，Ｉｍ ＳＹ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１（９）：９９５－９９９．
Ｃａｒｌｓｔｅｎ，Ｍ．＆Ｃｈｉｌｄｓ，Ｒ．Ｗ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６ ２６６，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１５．００２６６，（２０１５）．
Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，Ｘｕ ＸＳ，Ａｄａｍｓ ＨＣ，３ｒｄ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｏｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４．
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｄａｅｎｔｈａｎａｓａｎｍａｋ Ａ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８－ＮＡＤ（＋）Ａｘｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１８；２７（１）：８５－１００ ｅ１０８．
Ｃｈｉｎｉ ＥＮ．ＣＤ３８ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＮＡＤ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００９；１５（１）：５７－６３．
Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ Ｐ，Ｐｌａｔｔｓ Ａ，Ｗａｎｇ ｌｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳｎｐＥｆｆ：ＳＮＰｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｓｔｒａｉｎ ｗ１１１８；ｉｓｏ－２；ｉｓｏ－３．Ｆｌｙ（Ａｕｓｔｉｎ）．２０１２；６（２）：８０－９２．
Ｃｉｕｒｅａ ＳＯ，Ｓｃｈａｆｅｒ ＪＲ，Ｂａｓｓｅｔｔ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ １ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｕｓｉｎｇ ｍｂＩＬ２１ ｅｘ ｖｉｖｏ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（１６）：１８５７－１８６８．
Ｃｌｅｍｅｎｓ ＰＬ，Ｙａｎ Ｘ，Ｌｏｋｈｏｒｓｔ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ａｆｔｅｒ Ｐｒｉｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２０１７；５６（８）：９１５－９２４．
ｄｅ Ｈａａｒｔ ＳＪ，Ｈｏｌｔｈｏｆ Ｌ，Ｎｏｏｒｔ ＷＡ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐａｎｔｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＹＭ１５５）ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１６；１０１（８）：ｅ３３９－３４２．
ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，Ｔａｉ ＹＴ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｒ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１８６（３）：１８４０－１８４８．
Ｄｅｎｍａｎ ＣＪ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ ＶＶ，Ｓｏｍａｎｃｈｉ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ＩＬ－２１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（１）：ｅ３０２６４．
ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ａ．，Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ｅ．＆Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２１－１２２ ９－１５，（２０１７）．
Ｄｉ Ｇａｅｔａｎｏ Ｎ，Ｃｉｔｔｅｒａ Ｅ，Ｎｏｔａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１（３）：１５８１－１５８７．
Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｏｒｉｏｌ Ａ，Ｎａｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５（１４）：１３１９－１３３１．
Ｅｙｑｕｅｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ＣＡＲ ｔｏ ｔｈｅ ＴＲＡＣ ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．５４３（７６４３），１１３－１１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１４０５，（２０１７）．
Ｆｅｄｅｌｅ ＰＬ，Ｗｉｌｌｉｓ ＳＮ，Ｌｉａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ＩＭｉＤｓ ｐｒｉｍｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｏｓｓ ｏｆ Ｉｋａｒｏｓ ａｎｄ Ａｉｏｌｏｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３２（２０）：２１６６－２１７８．
Ｇａｎｄｈｉ ＵＨ，Ｃｏｒｎｅｌｌ ＲＦ，Ｌａｋｓｈｍａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ＣＤ３８－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１９；３３（９）：２２６６－２２７５．
Ｇａｏ Ｚ，Ｔｏｎｇ Ｃ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｗｕ Ｚ，Ｈａｎ Ｗ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＣＤ３８－ｄｒｉｖｅｎ ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ａｍｏｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＣＤ３８－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１９；４６（８）：３６７－３７７．
Ｇａｖｒｉａｔｏｐｏｕｌｏｕ Ｍ，Ｋａｓｔｒｉｔｉｓ Ｅ，Ｎｔａｎａｓｉｓ－Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＭｉＤｓ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃａｎ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ｂｏｔｈ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１（４）：４６４－４６７．
Ｇｕｏ Ｙ，Ｆｅｎｇ Ｋ，Ｔｏｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ Ｂ－ＡＬＬ ａｆｔｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０．
Ｇｕｖｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．３３（１１），１３２０－１３２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２００５．０７．００６，（２００５）．
Ｈａｒｉ Ｐ，Ｒａｊ ＲＶ，Ｏｌｔｅａｎｕ Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ３８ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ－Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６；３７５（１５）：１５０１－１５０２．
Ｈｏｗａｒｄ Ｍ，Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＪＣ，Ｂａｚａｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ３８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；２６２（５１３６）：１０５６－１０５９．
Ｈｕ Ｙ，Ｔｕｒｎｅｒ ＭＪ，Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ＣＤ５２ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２８（２）：２６０－２７０．
Ｈｕ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｑ，Ｄｅｎｇ Ｈ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３８ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＮＡＤ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４；１３（２）：７８６－７９５．
Ｋａｒａｒｏｕｄｉ ＭＮ，Ｌｉｋｈｉｔｅ Ｓ，Ｅｌｍａｓ Ｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ，Ｍｅｙｅｒ Ｋ，Ｌｅｅ ＤＡ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＲＩＳＰａｉｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ＡＡＶ．ｂｉｏＲｘｉｖ．２０１９：７４３３７７．
Ｋｅｌｌｙ ＢＪ，Ｆｉｔｃｈ ＪＲ，Ｈｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ：ａｎ ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ，ｈｉｇｈｌｙ ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｂａｌａｎｃｅｄ ｐａｒａｌｌｅｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｓｃａｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１５；１６：６．
Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｋｉｍ，Ｊ．＆Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４（６），１０１２－１０１９，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３，（２０１４）．
Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｈ，Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｓ，Ｏｈｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３（２５）：１５４２９－１５４３４．
Ｋｒｅｊｃｉｋ Ｊ，Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｄｅｐｌｅｔｅｓ ＣＤ３８＋ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｋｅｗｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（３）：３８４－３９４．
Ｋｒｅｊｃｉｋ Ｊ，Ｆｒｅｒｉｃｈｓ ＫＡ，Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ Ｒｅｄｕｃｅ ＣＤ３８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｎ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７；２３（２４）：７４９８－７５１１．
Ｋｕｍａｒ ＳＫ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｋａｓｔｒｉｔｉｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｍｙｅｌｏｍａ，ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ＩＭＷＧ ｓｔｕｄｙ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１７；３１（１１）：２４４３－２４４８．
Ｌａｕｂａｃｈ Ｊ，Ｇａｒｄｅｒｅｔ Ｌ，Ｍａｈｉｎｄｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１６；３０（５）：１００５－１０１７．
Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｖｅｒｎｅｒｉｓ，Ｍ．Ｒ．＆Ｃａｍｐａｎａ，Ｄ．Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６５１ ６１－７７，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６０７６１－７８６－０＿４，（２０１０）．
Ｌｅｏｎｅ ＲＤ，Ｅｍｅｎｓ ＬＡ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１８；６（１）：５７．
Ｌｅｕｎｇ－Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ Ｃ，Ｅｒｄｍａｎｎ Ｎ，Ｃｈｅｕｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｘｂｐ１ｓ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｅ－ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１３；２４（３）：２８９－３０４．
Ｌｉ Ａ，Ｈｅ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７；３５２（１）：４２－４７．
Ｌｉａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０８ ４４－５３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１５．０４．０２４，（２０１５）．
Ｌｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．８ １４２６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４２６１，（２０１７）．
Ｌｉｕ Ｊ，Ｚｈａｏ ＹＪ，Ｌｉ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｗｉｔｈ ＣＩＢ１ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｌｅｖｅｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７．
Ｍａｌｏｎｅｙ ＤＧ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ ＡＪ，Ｗｈｉｔｅ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｌｏｗ－ｇｒａｄｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０（６）：２１８８－２１９５．
Ｍａｒｔｉｎ Ｔ，Ｂａｚ Ｒ，Ｂｅｎｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １ｂ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ ｐｌｕｓ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｆｏｒ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１２９（２５）：３２９４－３３０３．
Ｍａｔｅｏｓ ＭＶ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｃａｖｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，Ｍｅｌｐｈａｌａｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ ｆｏｒ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１８；３７８（６）：５１８－５２８．
Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｓ．＆Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９ ２８３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００２８３，（２０１８）．
Ｍｅｙｅｒ Ｓ，Ｌｅｕｓｅｎ ＪＨ，Ｂｏｒｏｓｓ Ｐ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．ＭＡｂｓ．２０１４；６（５）：１１３３－１１４４．
Ｍｉｎａｒｄ－Ｃｏｌｉｎ Ｖ，Ｘｉｕ Ｙ，Ｐｏｅ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ＣＤ２０ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩ，ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＶ．Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１２（４）：１２０５－１２１３．
Ｍｏｒｅａｕ Ｐ，Ａｔｔａｌ Ｍ，Ｈｕｌｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ，ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ（ＣＡＳＳＩＯＰＥＩＡ）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ ３ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１９；３９４（１０１９２）：２９－３８．
Ｎａｅｉｍｉ Ｋａｒａｒｏｕｄｉ Ｍ，Ｄｏｌａｔｓｈａｄ Ｈ，Ｔｒｉｋｈａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１８（１３６）．
Ｎａｉｋ Ｊ，Ｔｈｅｍｅｌｉ Ｍ，ｄｅ Ｊｏｎｇ－Ｋｏｒｌａａｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｄｕｌｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１９；１０４（３）：ｅ１００－ｅ１０３．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｃａｓｎｅｕｆ Ｔ，ｖａｎ Ｖｅｌｚｅｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（７）：９５９－９７０．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｇｒｏｅｎ ＲＷ，Ｌｏｋｈｏｒｓｔ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９（１０）：２０３９－２０４９．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｇｒｏｅｎ ＲＷ，Ｎｏｏｒｔ ＷＡ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＣＤ３８－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎｄ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５；２１（１２）：２８０２－２８１０．
Ｎｉｊｈｏｆ ＩＳ，Ｌａｍｍｅｒｔｓ ｖａｎ Ｂｕｅｒｅｎ ＪＪ，ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ＫＩＲ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩＰＨ２１０２ ａｎｄ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１５；１００（２）：２６３－２６８．
Ｎｏｏｋａ ＡＫ，Ｊｏｓｅｐｈ ＮＳ，Ｋａｕｆｍａｎ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ，ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ，ａｎｄ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｙｅｌｏｍａ：Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ａｍｏｎｇ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１９；１２５（１７）：２９９１－３０００．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＫＬ，Ｆｉｎｌａｙ ＤＫ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１９（５）：２８２－２９０．
Ｏｒｌｏｗｓｋｉ ＲＺ，Ｍｏｒｅａｕ Ｐ，Ｎｉｅｓｖｉｚｋｙ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ－Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ－Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｉｎ Ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｕｐｄａｔｅｄ Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ Ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ．Ｃｌｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｌｅｕｋ．２０１９；１９（８）：５２２－５３０ ｅ５２１．
Ｐｏｍｅｒｏｙ ＥＪ，Ｈｕｎｚｅｋｅｒ ＪＴ，Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０２０；２８（１）：５２－６３．
Ｒａａｂ ＭＳ，Ｐｏｄａｒ Ｋ，Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ Ｉ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＰＧ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７４（９６８６）：３２４－３３９．
Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋ，Ｒｏｕｃｅ Ｒ，Ｌｉｕ Ｅ，Ｓｈｐａｌｌ Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７；２５（８）：１７６９－１７８１．
Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ．，Ｒｏｕｃｅ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｅ．＆Ｓｈｐａｌｌ，Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２５（８），１７６９－１７８１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０６．０１２，（２０１７）．
Ｒｏｓａｒｉｏ Ｍ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｋｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＩＬ－１５－Ｂａｓｅｄ ＡＬＴ－８０３ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（３）：５９６－６０８．
Ｓａｌｔａｒｅｌｌａ Ｉ，Ｄｅｓａｎｔｉｓ Ｖ，Ｍｅｌａｃｃｉｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－ＣＤ３８ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｅｌｌｓ．２０２０；９（１）．
Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄ，Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋａ Ｅ，Ｒａｔｈｏｒｅ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｉＲ－２３ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ＣＴＳＣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；４９：４２－５２．
Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｊｚｎｅｒ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｋ．Ｌ．＆Ｍａｃｋａｌｌ，Ｃ．Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ．３０（１），３０－３９，ｄｏｉ：１０．１０９７／ｍｏｐ．０００００００００００００５６４，（２０１８）．
Ｓｏｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．，Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．＆Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（４８），ｄｏｉ：１０．３７９１／２５４０，（２０１１）．
Ｓｔｅｖｉｓｏｎ Ｆ，Ｊｉｎｇ Ｊ，Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｓ，Ｉｓｏｈｅｒｒａｎｅｎ Ｎ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ－Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ，ＣＹＰ２６，ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；７４：３７３－４１２．
Ｓｕｔｌｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１０），１０９０－１１００，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１２．０８０，（２０１２）．
Ｕｒｕｎｏ Ａ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（Ａｍ８０）ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＣＤ３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＨＬ－６０ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ－ｄｅｌｔａ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１１；９０（２）：２３５－２４７．
Ｕｓｍａｎｉ ＳＺ，Ｗｅｉｓｓ ＢＭ，Ｐｌｅｓｎｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（１）：３７－４４．
Ｖａｋｕｌｓｋａｓ ＣＡ，Ｄｅｖｅｒ ＤＰ，Ｒｅｔｔｉｇ ＧＲ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｃａｓ９ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｓ ａ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８；２４（８）：１２１６－１２２４．
ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ Ｎ，Ｕｓｍａｎｉ ＳＺ．ＣＤ３８ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：２１３４．
ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ ＮＷ，Ｊａｎｍａａｔ ＭＬ，Ｍｕｔｉｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ３８ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１６；２７０（１）：９５－１１２．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｒ ＭＳ，ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２０１１；９６（２）：２８４－２９０．
Ｖｉｅｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．９（４１５），ｒａ１９，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．ａａｄ１８８４，（２０１６）．
Ｖｏｕｉｌｌｏｔ，Ｌ．，Ｔｈｅｌｉｅ，Ａ．＆Ｐｏｌｌｅｔ，Ｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔ７Ｅ１ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｙｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．５（３），４０７－４１５，ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇ３．１１４．０１５８３４，（２０１５）．
Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｂｙ Ｅｘ Ｖｉｖｏ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８；２４（１６）：４００６－４０１７．
Ｗａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｒｅｄｕｃｉｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１１３（１１），２８６８－２８７３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２０２４４１１３，（２０１６）．
Ｘｕ ＸＳ，Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ ＭＡ，Ｓｏｎｎｅｖｅｌｄ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｇｉｍｅｎｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ａｄｖ Ｔｈｅｒ．２０１８；３５（１１）：１８５９－１８７２．
Ｚｅｎｔ ＣＳ，Ｓｅｃｒｅｔｏ ＣＲ，ＬａＰｌａｎｔ ＢＲ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＣＬＬ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｅａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔａｇｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＬＬ）ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ．２００８；３２（１２）：１８４９－１８５６．
Ｚｕｒｉｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（１），７３－８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１，（２０１５）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10F】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16-1】
【図16-2】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】