特表 2022-554417 ポリオーマＪＣ感染の阻害剤としてのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-28

(54)【発明の名称】ポリオーマＪＣ感染の阻害剤としてのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システム

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20221221BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20221221BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20221221BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20221221BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221221BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20221221BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20221221BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221221BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

C12N15/09 110

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/864 100Z

A61K48/00

A61K31/7105

A61P31/20

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022527174

(86)(22)【出願日】2020-11-11

(85)【翻訳文提出日】2022-07-07

(86)【国際出願番号】 US2020059945

(87)【国際公開番号】W WO2021096912

(87)【国際公開日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】62/933,929

(32)【優先日】2019-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591135163

【氏名又は名称】テンプル・ユニバーシティ－オブ・ザ・コモンウェルス・システム・オブ・ハイアー・エデュケイション

【氏名又は名称原語表記】ＴＥＭＰＬＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ－ＯＦ ＴＨＥ ＣＯＭＭＯＮＷＥＡＬＴＨ ＳＹＳＴＥＭ ＯＦ ＨＩＧＨＥＲ ＥＤＵＣＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】カメル カリリ

(72)【発明者】

【氏名】ハッセン エス．ウォレボ

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー ゴードン

(72)【発明者】

【氏名】イルカー ケー．サリヤー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB33

(57)【要約】

本明細書において提供されるのは、ＪＣＶゲノムを有効にモジュレート及び／又は編集する遺伝子編集組成物及び方法である。有効なモジュレーション及び／又は編集は、態様において、ＮＣＣＲ領域、早期コーディング遺伝子、及び／又は後期コーディング遺伝子を標的化する遺伝子編集組成物により達成される。
【選択図】図４Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；
（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は前記第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び
（ｃ）前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又は前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列
を含む、組成物。

【請求項2】

前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記Ｔ抗原遺伝子がラージＴ抗原遺伝子である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記ＶＰ遺伝子が、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＶＰ遺伝子がＶＰ１遺伝子である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に記載のＰＡＭ配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に記載の配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項１に記載の組成物。

【請求項19】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に記載の配列によりコードされる、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項21】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に記載のＲＮＡ配列の配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項22】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項23】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に記載の配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項24】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項２～２３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項25】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に記載のＰＡＭ配列を含む、請求項２～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項26】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項27】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に記載の配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項28】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項２に記載の組成物。

【請求項29】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に記載の配列によりコードされる、請求項２に記載の組成物。

【請求項30】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項31】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に記載のＲＮＡ配列を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項32】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項33】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に記載の配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項34】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項３～３３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項35】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に記載のＰＡＭ配列を含む、請求項３～３３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項36】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項37】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に記載の配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項38】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項３に記載の組成物。

【請求項39】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に記載の配列によりコードされる、請求項３に記載の組成物。

【請求項40】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項41】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に記載のＲＮＡ配列を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項42】

（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び
（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項43】

配列番号６を含む前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む、請求項４２に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項44】

配列番号１０を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡを更に含む、請求項４３に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項45】

配列番号１０を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む、請求項４２に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項46】

（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び
（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項47】

（ａ）配列番号６又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡ
を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【請求項48】

請求項４２～４７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸。

【請求項49】

（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；
（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
（ｃ）前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又は前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ
をコードする核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項50】

前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項51】

前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項52】

前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項53】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項４９～５２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項54】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである、請求項４９～５２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項55】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４９～５２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項56】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項５５に記載のＡＡＶベクター。

【請求項57】

前記Ｔ抗原遺伝子がラージＴ抗原遺伝子である、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項58】

前記ＶＰ遺伝子が、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項59】

前記ＶＰ遺伝子がＶＰ１遺伝子である、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項60】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項61】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に記載の配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項62】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項４９～６１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項63】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に記載のＰＡＭ配列を含む、請求項４９～６１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項64】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項65】

前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に記載の配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項66】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項67】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に記載の配列によりコードされる、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項68】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項69】

前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５を含むＲＮＡ配列を含む、請求項４９に記載のＡＡＶベクター。

【請求項70】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項71】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６を含む配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項72】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項５０～７１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項73】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号７を含むＰＡＭ配列を含む、請求項５０～７１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項74】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項75】

前記第２の標的核酸配列が、配列番号６を含む配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項76】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項77】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に記載の配列によりコードされる、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項78】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項79】

前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９を含むＲＮＡ配列を含む、請求項５０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項80】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項81】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０を含む配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項82】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、請求項５１～８１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項83】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１を含むＰＡＭ配列を含む、請求項５１～８１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項84】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項85】

前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２を含む配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項86】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項87】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に記載の配列によりコードされる、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項88】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項89】

前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３を含むＲＮＡ配列を含む、請求項５１に記載のＡＡＶベクター。

【請求項90】

前記核酸がプロモーターを更に含む、請求項４９～８９のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項91】

前記プロモーターが遍在性プロモーターである、請求項９０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項92】

前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項９０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項93】

前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項９０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項94】

前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項９０に記載のＡＡＶベクター。

【請求項95】

前記核酸がエンハンサーエレメントを更に含む、請求項４９～９４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項96】

前記エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、請求項９５に記載のＡＡＶベクター。

【請求項97】

前記核酸が５’ＩＴＲエレメント及び３’ＩＴＲエレメントを更に含む、請求項４９～９６のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項98】

前記アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である、請求項４９～９７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項99】

前記核酸が、配列番号１４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む、請求項４９～９８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項100】

ＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである、請求項４９～９７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。

【請求項101】

細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）配列の部分又は全体を切除する方法であって、前記細胞に、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物、請求項４２～４７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は請求項４９～１００のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、方法。

【請求項102】

細胞中でのジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）複製を阻害し又は低減させる方法であって、前記細胞に、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物、請求項４２～４７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は請求項４９～１００のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、方法。

【請求項103】

前記細胞が対象中にある、請求項１０１～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

前記対象がヒトである、請求項１０３に記載の方法。

【請求項105】

前記ＪＣＶ配列が前記細胞に組み込まれている、請求項１０１～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年１１月１１日に出願された米国仮出願第６２／９３３，９２９号の利益を主張し、該出願は参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）は、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）により引き起こされる脳の脱髄疾患である。迅速な介入がＰＭＬについて重要であり、その理由は、ＰＭＬは２０～５０％の３か月死亡率を有するからである。概しては、免疫系の再構成又は活性化は、ＰＭＬの処置について最良の予後をもたらす。しかしながら、免疫系再構成療法は、望ましくない効果、例えば免疫再構成炎症症候群（ＩＲＩＳ）に繋がり得る。そのため、有効な療法がＰＭＬに対して必要とされている。

【発明の概要】

【0003】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む、組成物である。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、組成物は、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子はラージＴ抗原遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子は、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１遺伝子である。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３に記載のＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５に記載のＲＮＡ配列の配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７に記載のＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９に記載のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１に記載のＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３に記載のＲＮＡ配列を含む。

【0004】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号６を含むＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１０を含むＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１０を含むＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む。

【0005】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。

【0006】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）配列番号６又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。

【0007】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸である。

【0008】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子はラージＴ抗原遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子は、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１遺伝子である。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、核酸はプロモーターを更に含む。一部の実施形態において、プロモーターはユビキタスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、核酸はエンハンサーエレメントを更に含む。一部の実施形態において、エンハンサーエレメントはヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである。一部の実施形態において、核酸は５’ＩＴＲエレメント及び３’ＩＴＲエレメントを更に含む。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である。一部の実施形態において、核酸は、配列番号１４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである。

【0009】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）配列の部分又は全体を切除（excising）する方法であって、細胞に本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は本明細書に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、方法である。

【0010】

本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、細胞中でのジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）複製を阻害し又は低減させる方法であって、細胞に本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は本明細書に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、方法である。一部の実施形態において、細胞は対象中にある。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、ＪＣＶ配列は細胞に組み込まれている。

【0011】

参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることを特に及び個々に指し示されたのと同じ程度まで参照により本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体性と共に示される。本開示の特徴及び利点のより良好な理解は、本開示の原理が利用される実例的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより得られる。

【0013】

【図1A】図１ＡはＪＣＶ（Ｍａｄ－１）ゲノムの図式的な表現を示す。

【図1B】図１ＢはＪＣＶ（Ｍａｄ－１）ゲノムの図式的な表現を示す。

【図1C】図１ＣはＪＣＶ（Ｍａｄ－１）ゲノムの図式的な表現を示す。

【図2】図２は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを宿すＡＡＶ６／ＡＡＶ９ベクターの図式的な表現を示す。

【図3】図３は、細胞へのＡＡＶ媒介性の送達でのＣａｓタンパク質発現を確認したデータを示す。

【図4A】図４Ａ～４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切除アッセイの結果を示す。

【図4B】図４Ａ～４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切除アッセイの結果を示す。

【図4C】図４Ａ～４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切除アッセイの結果を示す。

【図4D】図４Ａ～４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切除アッセイの結果を示す。

【図5A】図５Ａは、細胞へのＡＡＶ６ＧＦＰ及びＡＡＶ９媒介性の形質導入の効率を示す。

【図5B】図５Ｂは、細胞へのＡＡＶ６ＧＦＰ及びＡＡＶ９媒介性の形質導入の効率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

詳細な説明
本明細書において提供されるのは、ＪＣＶ感染を阻害し、低減させ、又は寛解させるために有用な遺伝子編集システム（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）である。例えば、提供されるのは、ＪＣＶ ＤＮＡを有効に編集する遺伝子編集システムによりＪＣＶ感染を阻害し、低減させ、又は寛解させる方法である。本明細書において提供されるのは、宿主細胞のゲノムに組み込まれている又は染色体外に維持されている（例えば宿主細胞のゲノムに組み込まれていない）ＪＣＶウイルスゲノムＤＮＡを標的化するプログラム可能なヌクレアーゼである。例えば、一部の事例において、ＪＣＶゲノムの特有の遺伝子又はエレメントを標的化することは、感染性ウイルスゲノムの枯渇及び／又はウイルス複製を不活性化するためのウイルスゲノム内のコーディング配列若しくは調節領域における領域の切除に繋がる。ある特定の事例において、遺伝子編集システムが、組み込まれたウイルス及び／又はプロウイルスゲノムを有効に切除することを特徴とする追加の利益がある。ウイルス配列は概しては宿主ゲノムに対して配列類似性を殆ど有しないので、記載される組成物及び処置方法はまた、細胞にとって内因性の座位を標的化する編集療法よりも小さいオフターゲット効果を生成し得る。

【0015】

ＪＣＶは、非エンベロープのＴ＝７正二十面体ポリオーマウイルスであり、閉じた環状の超らせん二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。カプシドは３つのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３から構成され、ＶＰ１が主要な構成要素である。７２個の五量体があり、各々は、５つのＶＰ１分子及び１分子のＶＰ２又はＶＰ３のいずれかから構成される。ＶＰ１のみがカプシドの表面に露出されており、ＶＰ１はそのため受容体特異性を決定する。ポリオーマウイルスＤＮＡはヌクレオソームの構造であり、概しては、各ミニ染色体中に含有されたウイルスＤＮＡ及び宿主細胞ヒストンから構成される約２５個のヌクレオソームを有する。

【0016】

プロトタイプＪＣＶゲノムは概しては５，１３０ｂｐからなるが、個々のバリアントは、それらの非コーディング領域における変更に起因して、長さが異なる。ゲノムは、６つの主要なウイルスタンパク質（ラージＴ及びスモールｔ抗原、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、並びにアグノプロテイン）の他に、Ｔ抗原のいくつかのスプライスバリアントをコードする。ゲノムの早期及び後期転写側は、超可変調節領域（ＨＶＲＲ）又は調節領域（ＲＲ）とも称される非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）により物理的に分離されており、ＤＮＡの反対鎖から反対方向に転写される。ウイルスＤＮＡ複製が始まる前に転写されるゲノムの早期側は、ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原遺伝子の他に、ある特定のスプライスバリアントから構成される。ゲノムの後期側は、ＤＮＡ複製と随伴的に転写され、３つのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の他に、補助的なアグノプロテインをコードする。

【0017】

ＪＣＶを含めて、ポリオーマウイルスは、溶解感染について制限された細胞種特異性を示す。更には、ＪＣＶは、ある特定の細胞種において低レベルの持続又は潜伏感染を確立することができる。中枢神経系（ＣＮＳ）に存在すると、ウイルスは乏突起膠細胞中で活発に複製され、脱髄疾患ＰＭＬに繋がる。インビボで観察されるＪＣＶの細胞種特異的なトロピズムは、インビトロでのトロピズムを忠実に反映し、ウイルスは、骨髄由来細胞、扁桃間質細胞、及び大膠細胞に生産的に感染する。インビボで、ＪＣＶ感染は、概しては、腎臓上皮細胞、扁桃間質細胞、骨髄由来細胞系列、乏突起膠細胞、及び星状膠細胞に制限される。効率的なＪＣＶ複製は、初代膠細胞培養物及びある特定のヒト膠細胞系において最大である。ヒト膠細胞に対するＪＣＶの主要なトロピズムは完全には理解されていないが、複数の要因が、この細胞種における堅牢なウイルス複製への寄与の原因となっているようである。例えば、宿主細胞特異的な転写及び複製因子の多様性は、ＪＣＶにより示される制限された特異性に差次的に影響を及ぼす。

【0018】

本明細書において提供される遺伝子編集システム（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）は、ＪＣＶゲノム内の新規の標的及び／又は標的の組合せを利用してＪＣＶ ＤＮＡを効率的及び有効に編集し、それにより、ＪＣＶ感染を阻害し、低減させ、又は予防する。例えば、ＮＣＣＲ並びに追加の後期（例えばＶＰ遺伝子）及び／又は早期遺伝子（例えばＴ抗原遺伝子）を含む標的の組合せは、ＪＣＶゲノム又はその領域の有効な編集及び／又は切除をもたらし、それにより複製インコンピテントのＪＣＶゲノムをもたらす。よって、遺伝子編集機構（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）及び標的化核酸分子（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（例えば標的配列に対応するガイドＲＮＡ）をコードする開示されるベクターの設計及び合成は、細胞中のＪＣＶの効率的な編集を可能にする。更には、本明細書に記載の遺伝子編集システムは、組み込まれた又は組み込まれていないＪＣＶゲノムを有効及び／又は効率的に編集し、それにより、細胞中でのＪＣＶの一次感染及び潜伏感染の両方を阻害し、低減させ、又は寛解させるための解決策を提供する。

【0019】

プログラム可能なヌクレアーゼは精密なゲノム編集を可能にし、これは一部の事例において、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を特有のゲノム座位に導入し、それにより遺伝子編集を開始させることにより為される。概しては、本明細書において具体化されるように、様々な遺伝子編集システムを用いて、本明細書に記載のＪＣＶ遺伝子、エレメント、又は領域を標的化する（例えばＮＣＣＲ領域並びにＴ抗原遺伝子及びＶＰ遺伝子のうちの１つ又は両方を標的化する）ことができる。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはメガヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。一部の実施形態において、遺伝子編集システムは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。これらの遺伝子編集システムは、ＤＮＡ認識の態様に基づいて大まかに２つのカテゴリーに分類することができる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びメガヌクレアーゼは、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特異的なＤＮＡ結合を達成する一方、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、直接的に標的ＤＮＡと塩基対合する短いＲＮＡガイド分子により及びタンパク質－ＤＮＡ相互作用により特有のＤＮＡ配列に標的化される。よって、タンパク質標的化又は核酸標的化を用いて、本明細書に記載のＪＣＶ ＤＮＡ座位を標的化することができる。

【0020】

例えば、本明細書において記載及び提供されるのは、細胞内のＪＣＶ複製を低減させ又は阻害するために有用なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ組成物及び方法である。更なる例として、記載及び提供されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ組成物は、細胞中のゲノムＪＣＶ ＤＮＡをモジュレート（例えば変更、除去等）及び／又は編集（例えば切除）し、それによりＪＣＶ複製を阻害するために有用である。細胞中のＪＣＶ ＤＮＡをモジュレート及び／又は編集することによるＪＣＶの阻害は、ＪＣＶウイルスの複製を許容しないインコンピテント及び／又は欠損型ＪＣＶゲノム構造をもたらす。そのため、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ組成物及び方法を使用して、細胞中のＪＣＶゲノムを有効にモジュレート及び／又は編集することができる。一部の実施形態において、細胞はＪＣＶ感染を既に含んでいる。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲシステムは、潜伏感染した細胞を排除し又は低減させる。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲシステムは、潜伏感染した細胞中のＪＣＶ ＤＮＡをモジュレート及び／又は編集する。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲシステムはＪＣＶ感染を予防する。関心対象の細胞は、ＪＣＶ感染に感受性の細胞である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ， ｔｈｅ ＪＣ Ｖｉｒｕｓ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗ． Ｆｅｒｅｎｃｚｙ ｅｔ． ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｊｕｌ ２０１２， ２５ （３） ４７１－５０６を参照）。そのような細胞としては、神経系内の細胞、例えば膠細胞（例えば乏突起膠細胞、星状膠細胞等）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0021】

Ｃａｓヌクレアーゼ
操作されたＣＲＩＳＰＲシステムは、概しては、２つの成分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓタンパク質）を含有する。天然において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して侵入核酸のサイレンシングをガイドすることによりウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を細菌及び古細菌に提供する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、外来核酸の配列特異的な検出及びサイレンシングのために小ＲＮＡ分子に依拠するＲＮＡ媒介性の適応防御システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、オペロンに編成されたｃａｓ遺伝子及びゲノム標的化配列からなるＣＲＩＳＰＲアレイ（スペーサーと呼ばれる）から構成される。本明細書において提供されるのは、細胞中のＪＣＶ ＤＮＡを検出してサイレンシングする操作されたＣＲＩＳＰＲシステムである。

【0022】

本明細書に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、概しては、標的ポリヌクレオチド（例えばＪＣＶゲノムＤＮＡ）の領域に相補的な又は実質的に相補的なヌクレオチド配列を含有するガイドＲＮＡ配列、及びヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を含む酵素システムを指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、及びこれらの誘導体が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとしては、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する操作された及び／又はプログラムされたヌクレアーゼシステムが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、操作及び／又は突然変異されたＣａｓタンパク質を含有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、概しては、核酸のヌクレオチドサブユニットの間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、概しては、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断することができる。ニッカーゼは、ＤＮＡデュプレックスの単一の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。

【0023】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又は活性の指令に関与する転写物及び他のエレメントを更に含み、これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ若しくは活性の部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的な直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「スペーサー」とも称される）、又はＣＲＩＳＰＲ座位からの他の配列及び転写物が含まれる。概しては、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈においてプロトスペーサーとも称される）の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントにより特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列及びガイド配列の間のハイブリダイゼーションはＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ある特定の実施形態において、標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質中に位置する。

【0024】

一部の実施形態において、本明細書において使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型システムであることができる。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、ＣａｓＸ、ＣａｓΦ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６が挙げられる。更なる例として、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１２ｊ／ＣａｓΦ、Ｃａｓ１２Ｌ等）、Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ（例えばＣａｓ１３ｂ－ｔ１、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ２、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ３）、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ等）、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、又は操作された形態のＣａｓタンパク質である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又はエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又はエンドヌクレアーゼはＣａｓ１２である。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２Ｌ又はＣａｓ１２Ｊである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又はエンドヌクレアーゼはＣａｓＸである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又はエンドヌクレアーゼはＣａｓＹである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質又はエンドヌクレアーゼはＣａｓΦである。

【0025】

一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトミセス・プリスチナスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリシクロバシラス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バシラス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシラス・セレニチレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバシラス・デルブルエッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア目（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属菌、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテセ（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）属菌、ミクロシスチス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、アセトハロビウム・アラバチカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベシー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダツス・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅ ｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィラス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクラム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバシラス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバシラス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属菌、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニー（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクター・ラセミフェル（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノドゥラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストク（Ｎｏｓｔｏｃ）属菌、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属菌、リングビア（Ｌｙｎｇｂｙａ）属菌、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）属菌、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、又はアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）からのものであるか、又はそれに由来するものであることができる。

【0026】

一部の実施形態において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はエンドヌクレアーゼであり、これにはＣａｓ９ヌクレアーゼが含まれるがそれに限定されない。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネス又はスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、他の種、例えば他のストレプトコッカス種、例えばサーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、又は他のシークエンシングされた細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物からのＣａｓタンパク質のアミノ酸配列を含む。本開示のために有用な他のＣａｓタンパク質は公知であり、又は当該技術分野において公知の方法を使用して同定することができる（例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０： １１１６－１１２１を参照）。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、その天然の供給源と比較して、改変されたアミノ酸配列を含む。

【0027】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合性ドメインを含む。ＲＮＡ認識及び／又はＲＮＡ結合性ドメインはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（即ち、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合性ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮＡｓｅドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含むことができる。

【0028】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は野生型若しくは改変されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、核酸結合の親和性及び／若しくは特異性を増加させるため、酵素活性を変更するため、並びに／又はタンパク質の別の特性を変化させるために改変され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（即ち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、改変、欠失、又は不活性化され得る。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、Ｃａｓタンパク質の機能のために必須でないドメインを除去するために切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質はまた、Ｃａｓタンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化するために切断又は改変され得る。

【0029】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質又はその断片に由来することができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、改変されたＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、野生型又は別のＣａｓタンパク質と比べてタンパク質の１つ又は複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性等）を変更するために改変され得る。代替的に、ＲＮＡにガイドされる切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインは、タンパク質から排除することができ、その結果、改変されたＣａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなる。

【0030】

開示されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ組成物はまた、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、ｓａＣａｓ９、Ｃａｓ９タンパク質）に対して実質的な相同性を有するタンパク質の任意の形態を含むと解釈されるべきである。一部の実施形態において、「実質的に相同の」タンパク質は、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質のアミノ酸配列に対して約５０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９５％相同、又は約９９％相同である。

【0031】

ＪＣＶ標的化
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的及びｇＲＮＡ標的の組合せの使用を通じてＪＣＶ ＤＮＡ（例えばＪＣＶゲノム）の有効なモジュレーション及び／又は編集を達成する。記載されるｇＲＮＡ標的は、ＪＣＶゲノムの新規の配列及び／又は領域を標的化し、一部の実施形態において、標的配列及び／又は領域は、細胞中のＪＣＶ ＤＮＡ分子及び／又はＪＣＶゲノムの有効な編集を可能にすることにより利益を付与する。追加的に、別の態様において、更なる利点は、組合せでの新規の標的配列の使用により提供される。例えば、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）、後期コーディング遺伝子、及び／又は早期コーディング遺伝子を標的化して、ＪＣＶ ＤＮＡをモジュレート及び／又は編集し、ＪＣＶ複製を予防／阻害する。ある特定の実施形態において、標的化は、ＮＣＣＲ領域、ラージＴ抗原遺伝子、及び／又はＶＰ１遺伝子の任意の編集（例えば切除、欠失等）の促進又は誘導を含む。ある特定の実施形態において、

【0032】

ＪＣＶゲノムは、閉じた環状超らせん染色体であり、「早期」及び「後期」遺伝子から構成されており、これらの遺伝子は非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）により分離されており、ＮＣＣＲは、複製起点（ＯＲＩ）、プロモーター、及びエンハンサーエレメントを含有する。早期領域は、感染後且つＤＮＡ複製前にデノボで発現され、ＮＣＣＲのＯＲＩ近位側にある。後期遺伝子は、最適には、ＤＮＡ複製と並行して又はその後に発現され、ＮＣＣＲのＯＲＩ遠位側に見出される。ポリオーマウイルスＮＣＣＲは、単一のウイルス内の他にウイルスの属間においてウイルスゲノムの最も可変の部分である。顕著なことに、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムの配列ブロックエレメント及びタンデムリピートエレメントの位置と比べて５’の近位（又はＪＣＶゲノムが環状であることを考慮して３’の遠位）（例えばＭａｄ－１ゲノムの約５０００～約５１３０の位置内）の領域を標的化する。図１はＪＣＶ（Ｍａｄ－１）ゲノムの図表を示し、ＮＣＣＲ標的の位置を表す。一部の実施形態において、利点は、ＪＣＶゲノムの配列ブロックエレメント及びタンデムリピートエレメントの位置と比べて５’の近位（又はＪＣＶゲノムが環状であることを考慮して３’の遠位）（例えばＭａｄ－１ゲノムの約５０００～約５１３０の位置内）の領域を標的化することにより提供される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムをＪＣＶゲノムのＮＣＣＲ領域に標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、配列番号２を含むＪＣＶゲノムの配列に標的化する。一部の実施形態において、ＮＣＣＲを標的化する第１のｇＲＮＡは、１つ又は複数のコーディング領域（例えばラージＴ及びスモールｔ抗原、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、並びにアグノプロテイン）を標的化するｇＲＮＡとの組合せで使用される。

【0033】

ＪＣＶゲノムは、６つの主要なウイルスタンパク質（ラージＴ及びスモールｔ抗原、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、並びにアグノプロテイン）の他に、Ｔ抗原のいくつかのスプライスバリアントをコードする。ゲノムの早期及び後期転写側は、多くの場合に超可変調節領域（ＨＶＲＲ）又は調節領域（ＲＲ）と呼ばれる非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）により物理的に分離されており、ＤＮＡの反対鎖から反対方向に転写される。ＤＮＡ複製が始まる前に転写されるゲノムの早期コーディング遺伝子は、ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原遺伝子の他に、Ｔ抗原スプライスバリアントから構成される。ゲノムの後期コーディング遺伝子は、ＤＮＡ複製と随伴的に転写され、３つのウイルス構造タンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の他に、補助的なアグノプロテインをコードする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを早期コーディング遺伝子に標的化する。一部のある特定の実施形態において、早期コーディング遺伝子はＴ抗原遺伝子である。一部のある特定の実施形態において、Ｔ抗原はラージＴ抗原遺伝子である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、配列番号６を含むＪＣＶゲノムの配列に標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを後期コーディング遺伝子に標的化する。一部のある特定の実施形態において、早期コーディング遺伝子はＶＰ遺伝子である。一部のある特定の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１遺伝子である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、配列番号１０を含むＪＣＶゲノムの配列に標的化する。

【0034】

概しては、標的配列はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。一部の事例において、ＰＡＭは、Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡがＲループを形成するために要求されるＤＮＡ配列であって、ゲノムとのそのガイドＲＮＡのワトソン－クリック対合を通じて特異的なＤＮＡ配列を調べるためのものを指す。ある特定の事例において、ＰＡＭ特異性は、Ｃａｓタンパク質（例えば、ＣａｓのＰＡＭ認識ドメイン）のＤＮＡ結合特異性の機能であり、プロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインは、一部の事例において、ＤＮＡ標的ＰＡＭ配列に対する結合性部位を含むＣａｓアミノ酸配列を指す。Ｓ．ピオゲネスに由来するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ｓｐＣａｓ９）において、標的ＤＮＡは、典型的には、５’－ＮＧＧ又はＮＡＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前にある。他のＣａｓ９オルソログは異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、Ｓ．サーモフィラスからのＣａｓ９（ｓｔＣａｓ９）は、ＣＲＩＳＰＲ １のために５’－ＮＮＡＧＡＡ及びＣＲＩＳＰＲ３のために５’－ＮＧＧＮＧを要求し、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｄｉｔｉｓ）からのＣａｓ９（ｎｍＣａｓ９）は５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴを要求する。スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウスからのＣａｓ９（ｓａＣａｓ９）は５’－ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ）を要求する。本明細書において提供されるＪＣＶ標的は、ｇＲＮＡの文脈において更に同定され得る。

【0035】

ｇＲＮＡは、改変されるべきゲノム標的を定義する短いＲＮＡヌクレオチドスペーサーである。本明細書において使用される場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）という用語は、標的ＪＣＶ配列に対応する及び／又はハイブリダイズする配列を含有するＲＮＡを指す。例えば、配列番号２は、ｇＲＮＡが配列番号５、標的配列のＲＮＡ同等物を含む、ＪＣＶ標的配列を含む。ガイドＲＮＡ配列はセンス又はアンチセンス配列であることができる。ガイドＲＮＡは、一部の実施形態において、標的ＤＮＡ配列の領域に相補的な又は実質的に相補的な領域以外のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、一部の事例において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの部分である若しくは該部分と考えられ、又はｃｒＲＮＡ中に含まれる、例えば、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡキメラである。本明細書において使用される場合、標的核酸という用語は、作用（例えば編集又はモジュレーション）の目的である核酸を意味することが意図される。

【0036】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは合成オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、合成ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含む。ヌクレオシド間リンカー（即ち骨格）の修飾を利用して、安定性又は薬力学的特性を増加させることができる。例えば、ヌクレオシド間リンカー修飾は、細胞ヌクレアーゼによる分解を予防し又は低減させるため、ｇＲＮＡの薬物動態及びバイオアベイラビリティを増加させる。概しては、修飾されたヌクレオシド間リンカーは、２つのヌクレオシドを共有結合的に連結する、ホスホジエステル（ＰＯ）リンカー（ｌｉｎｅｒｓ）以外の任意のリンカーを含む。一部の実施形態において、修飾されたヌクレオシド間リンカーは、ホスホジエステルリンカーと比較してｇＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドについて、ヌクレオシド間リンカーは、隣接するヌクレオシドの間のホスホジエステル結合を生成するリン酸基を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、天然のホスホジエステルから修飾された１つ又は複数のヌクレオシド間リンカーを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ、又はその連続するヌクレオチド配列のヌクレオシド間リンカーの全ては、修飾されている。例えば、一部の実施形態において、ヌクレオシド間連結は硫黄（Ｓ）を含み、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

【0037】

リボース糖又は核酸塩基に対する修飾もまた本発明において利用することができる。概しては、修飾されたヌクレオシドは、糖部分又は核酸塩基部分の１つ又は複数の修飾の導入を含む。一部の実施形態において、記載されるようなｇＲＮＡは、修飾された糖部分を含む１つ又は複数のヌクレオシドを含み、修飾された糖部分は、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）及びＲＮＡ中に見出されるリボース糖部分と比較した場合に糖部分の修飾である。リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドを利用することができ、これは主に、オリゴヌクレオチドのある特定の特性、例えば親和性及び／又は安定性を向上させる目的を有する。そのような修飾としては、リボース環構造が修飾されるものが挙げられる。これらの修飾としては、ヘキソース環（ＨＮＡ）、リボース環上のＣ２及びＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する二環式環（例えばロックド核酸（ＬＮＡ））、又は典型的にはＣ２及びＣ３炭素の間の結合を欠いた非連結リボース環（例えばＵＮＡ）での置換えが挙げられる。他の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸又は三環式核酸が挙げられる。修飾されたヌクレオシドとしてはまた、糖部分が非糖部分で置き換えられたヌクレオシド、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はモルホリノ核酸の場合が挙げられる。

【0038】

糖修飾としてはまた、リボース環上の置換基を、水素、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に見出される２’－ＯＨ基以外の基に変更することにより為される修飾が挙げられる。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位又は５’位に導入されてもよい。修飾された糖部分を有するヌクレオシドとしてはまた、２’修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシドが挙げられる。実際に、２’置換ヌクレオシドを開発するために多くの集中が費やされており、多数の２’置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に有益な特性、例えばヌクレオシド耐性の増強及び親和性の増強を有することが見出されている。２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位（２’置換ヌクレオシド）にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）又は２’連結ビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）を含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドが挙げられる。２’置換された修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例として、一部の実施形態において、リボース基中の修飾はリボース基の２’位における修飾を含む。一部の実施形態において、リボース基の２’位における修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、及び２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）からなる群から選択される。

【0039】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ又は複数の修飾された糖を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、修飾された糖のみを含む。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、１０％、２５％、５０％、７５％、又は９０％より多くの修飾された糖を含む。一部の実施形態において、修飾された糖は二環式糖である。一部の実施形態において、修飾された糖は２’－Ｏ－メトキシエチル基を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ヌクレオシド間リンカー修飾及びヌクレオシド修飾の両方を含む。

【0040】

標的特異性は、ガイドＲＮＡ、又は標的ポリヌクレオチド配列若しくは領域（例えばＪＣＶゲノムのＮＣＣＲ）に特異的なｃｒＲＮＡに関して使用されることがあり、（例えば標的に対応する）標的ポリヌクレオチド、例えば、標的ＤＮＡの標的（配列又は領域）に選択的にアニーリング／ハイブリダイズすることができるヌクレオチドの配列を更に含む。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ又はその誘導体は、標的ＤＮＡ配列の領域に相補的な標的特異的ヌクレオチド領域を含有する。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ又はその誘導体は、標的特異的ヌクレオチド領域以外に他のヌクレオチド配列を含有する。一部の実施形態において、他のヌクレオチド配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列からのものである。

【0041】

ｇＲＮＡは概してはスキャフォールドによりサポートされ、スキャフォールドは、天然の生物学的種の間で実質的に同一の又は高度に保存された（例えば標的特異性を付与しない）配列を含むｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ分子の部分を指す。スキャフォールドは、ネイティブなｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ中で保存されていない配列を含む任意の非天然の部分を除いて、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、及びｃｒＲＮＡセグメントの５’末端又はその近くのポリヌクレオチド標的化ガイド配列以外のｃｒＲＮＡセグメントの部分を含む。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾された配列を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、又は１５個の修飾された塩基（例えば修飾されたネイティブな塩基配列）を含む。

【0042】

相補的は、本明細書において使用される場合、概しては、ある特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの同定領域に選択的にアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書において使用される場合、「実質的に相補的」という用語及び文法的同等物は、ある特定の条件下で標的ポリヌクレオチドの同定領域に特異的にアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味することが意図される。アニーリングは、１つの核酸の別の核酸とのヌクレオチド塩基対合性相互作用であって、デュプレックス、トリプレックス、又は他のより高次の構造の形成を結果としてもたらすものを指す。主要な相互作用は典型的にはヌクレオチド塩基特異的であり、これは例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、及びＧ：Ｃであり、ワトソン－クリック及びフーグスティーン型水素結合による。一部の実施形態において、塩基スタッキング及び疎水性相互作用もまたデュプレックス安定性に寄与することができる。ポリヌクレオチドが標的核酸の相補的な又は実質的に相補的な領域にアニールする条件は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９８５）及びＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：３４９ （１９６８）に記載される通りである。アニーリング条件は特定の応用に依存し、当業者により過度の実験なしに常法により決定され得る。ハイブリダイゼーションは、概しては、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。結果としてもたらされる二本鎖ポリヌクレオチドは「ハイブリッド」又は「デュプレックス」である。ある特定の事例において、１００％の配列同一性はハイブリダイゼーションのために要求されず、ある特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、おおよそ、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％よりも高い配列同一性において起こる。ある特定の実施形態において、配列同一性は、非同一の核酸塩基に加えて、挿入及び／又は欠失を含む配列を含む。

【0043】

一部の実施形態において、組成物は、複数の異なるｇＲＮＡ分子であって、各々が異なる標的配列に標的化されるものを含む。一部の実施形態において、このマルチプレックス戦略は有効性の増加を提供する。これらのマルチプレックスｇＲＮＡ又はｇＲＮＡの組合せは、異なるベクター中で別々に発現され得る、又は１つの単一のベクター中で発現され得る。

【0044】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）：トランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）デュプレックスを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの間の天然のデュプレックスを模倣するステムループを含む。一部の実施形態において、ステムループは、ＡＧＡＡＡＵを含むヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態において、組成物は、ｃｒＲＮＡ、ステム、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む合成又はキメラガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態において、組成物は、ハイブリダイズして天然のデュプレックスを形成する単離されたｃｒＲＮＡ及び／又は単離されたｔｒａｃｒＲＮＡを含む。例えば、一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ前駆体（プレｃｒＲＮＡ）を含む。

【0045】

本明細書に記載されるのは、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、ラージＴ抗原遺伝子、又はこれらの組合せを標的化する（例えばそれにハイブリダイズ又はアニーリングする）ｇＲＮＡである。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及びラージＴ抗原遺伝子を標的化する。ある特定の実施形態において、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子の中又はその近くの領域にハイブリダイズする。ある特定の実施形態において、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子の中の領域は、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子の中の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子の近くの領域は、ＮＣＣＲ、ＶＰ１遺伝子、及び／又はラージＴ抗原遺伝子の周囲の５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５塩基の位置を含む。

【0046】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＮＣＣＲを標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＮＣＣＲ配列を標的化する。一部の実施形態において、ＮＣＣＲの中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５又は配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列又は配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号３又は配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列によるＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号４又は配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0047】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＴ抗原配列を標的化する。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号６に記載の配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号６に相補的なＴ抗原配列又は配列番号６に相補的なＴ抗原配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号７又は配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0048】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＮＣＣＲにハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＮＣＣＲ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ＮＣＣＲの中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号５又は配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列又は配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号３又は配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列によるＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号４又は配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0049】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＴ抗原配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号６に記載の配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号６に相補的なＴ抗原配列又は配列番号６に相補的なＴ抗原配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号７又は配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0050】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＶＰ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号１０に記載の配列又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１０に相補的なＶＰ配列又は配列番号１０に相補的なＶＰ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0051】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡはＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＶＰ配列を標的化する。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列は、配列番号１０に記載の配列又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１０に相補的なＶＰ配列又は配列番号１０に相補的なＶＰ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0052】

一部の実施形態において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記ｇＲＮＡ、並びにｇＲＮＡ及びｇＲＮＡの１つ又は両方をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、両方のｇＲＮＡ及びｇＲＮＡをコードする。

【0053】

「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにかけて同一の（即ち、ヌクレオチド対ヌクレオチドを基準にして）であることを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、２つの最適にアライメントされた配列を比較のウィンドウにかけて比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が両方の配列において起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（即ち、ウインドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより算出される。

【0054】

２つのタンパク質の間の「相同性」又は「類似性」という用語は、１つのタンパク質配列のアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のタンパク質配列と比較することにより決定される。類似性は、当該技術分野において周知の手順、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）により決定され得る。

【0055】

一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約１個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡを利用する。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、少なくとも約１個のｇＲＮＡを利用する。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、最大で約６個のｇＲＮＡを利用する。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約１個のｇＲＮＡ～約２個のｇＲＮＡ、約１個のｇＲＮＡ～約３個のｇＲＮＡ、約１個のｇＲＮＡ～約４個のｇＲＮＡ、約１個のｇＲＮＡ～約５個のｇＲＮＡ、約１個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡ、約２個のｇＲＮＡ～約３個のｇＲＮＡ、約２個のｇＲＮＡ～約４個のｇＲＮＡ、約２個のｇＲＮＡ～約５個のｇＲＮＡ、約２個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡ、約３個のｇＲＮＡ～約４個のｇＲＮＡ、約３個のｇＲＮＡ～約５個のｇＲＮＡ、約３個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡ、約４個のｇＲＮＡ～約５個のｇＲＮＡ、約４個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡ、又は約５個のｇＲＮＡ～約６個のｇＲＮＡを利用する。一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、約１個のｇＲＮＡ、約２個のｇＲＮＡ、約３個のｇＲＮＡ、約４個のｇＲＮＡ、約５個のｇＲＮＡ、又は約６個のｇＲＮＡを利用する。

【0056】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、約１５個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、最大で約２８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、約１５個のヌクレオチド～約１６個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約１７個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約１８個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約１９個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約１７個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約１８個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約１９個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約１８個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約１９個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約１９個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２１個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド～約２２個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約２２個のヌクレオチド～約２３個のヌクレオチド、約２２個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約２２個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２２個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約２３個のヌクレオチド～約２４個のヌクレオチド、約２３個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２３個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、約２４個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２４個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチド、又は約２５個のヌクレオチド～約２８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、約１５個のヌクレオチド、約１６個のヌクレオチド、約１７個のヌクレオチド、約１８個のヌクレオチド、約１９個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約２１個のヌクレオチド、約２２個のヌクレオチド、約２３個のヌクレオチド、約２４個のヌクレオチド、約２５個のヌクレオチド、又は約２８個のヌクレオチドを含む。

【0057】

本明細書において更に提供されるのは、ＮＣＣＲ領域、早期コーディング遺伝子、及び／又は後期コーディング遺伝子を標的化する遺伝子編集組成物である。一部の実施形態において、単独又は組合せでの開示される領域の標的化は、細胞中でのＪＣＶ複製及び／又は病理発生を有効に排除し、阻害し、低減させ、及び／又は予防するための利益を提供する。

【0058】

本明細書において更に提供されるのは、ＮＣＣＲ領域、早期コーディング遺伝子、及び／又は後期コーディング遺伝子を標的化する遺伝子編集組成物である。一部の実施形態において、単独又は組合せでの開示される領域の標的化は、細胞中でのＪＣＶ複製及び又は病理発生を有効に排除し、阻害し、低減させ、及び／又は予防するための利益を提供する。本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む、組成物である。

【0059】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号６に記載のＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号６に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％より高い配列同一性を含む配列を含むＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１０に記載のＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡを更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、配列番号１０に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％より高い配列同一性を含む配列を含むＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡを更に含む。

【0060】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子はラージＴ抗原遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子は、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１遺伝子である。

【0061】

一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＮＣＣＲ配列を標的化する。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５又は配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によるＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列又は配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号３又は配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列によるＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号４又は配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0062】

一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＴ抗原配列を標的化する。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に相補的なＴ抗原配列又は配列番号６に相補的なＴ抗原配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。

【0063】

一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号７又は配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＶＰ配列を標的化する。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号１０に相補的なＶＰ配列又は配列番号１０に相補的なＶＰ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0064】

一部の実施形態において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ、並びに第２のｇＲＮＡ及び第３のｇＲＮＡのうちの１つ又は両方をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び第３のｇＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、核酸は、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び第３のｇＲＮＡをコードし、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされ；第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされ；且つ第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。

【0065】

提供されるのは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ＪＣＶゲノムのＮＣＣＲを標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；並びに（ｃ）ＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡ及びＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つ又は両方をコードする核酸である。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。

【0066】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0067】

一部の実施形態において、核酸はプロモーターを更に含む。一部の実施形態において、プロモーターはユビキタスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、核酸はエンハンサーエレメントを更に含む。一部の実施形態において、エンハンサーエレメントはヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである。

【0068】

一部の実施形態において、核酸は５’ＩＴＲエレメント及び３’ＩＴＲエレメントを更に含む。一部の実施形態において、核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングされるように構成される。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、又はＡＡＶＤＪ／８である。

【0069】

更に提供されるのは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ＪＣＶゲノムのＮＣＣＲを標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；並びに（ｃ）ＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡ及びＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つ又は両方をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によりコードされる。

【0070】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、又はＡＡＶＤＪ／８である。

【0071】

提供される組成物は、細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの部分又は全体を切除する方法における使用のために好適である。追加的に、提供される組成物は、細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの部分又は全体を切除する方法における使用のために好適である。更には、提供される組成物は、細胞中の感染性ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）の発現を低減させ又は排除する方法において有用である。一部の実施形態において、方法は、ラージＴ抗原遺伝子、ＶＰ１遺伝子、又はこれらの組合せの発現を低減させ又は排除することを含む。一部の実施形態において、ＮＣＣＲは、１つ又は複数のＪＣＶ遺伝子の発現を阻害し、且つ方法は、１つ又は複数のＪＣＶ遺伝子の発現を低減させ又は排除することを含む。一部の実施形態において、ＮＣＣＲを編集すること並びに早期コーディング遺伝子及び後期コーディング遺伝子を編集することは、１つ又は複数のＪＣＶ遺伝子の発現を阻害し、且つ方法は、早期ＪＣＶ遺伝子及び後期ＪＣＶ遺伝子の発現を低減させ又は排除することを含む。

【0072】

ベクター
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ成分、例えば１つ又は複数のｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼの発現用の１つ又は複数のカセットを含むベクターを含む。ベクターは、当該技術分野において公知の、所望の発現カセットを発現させるために好適な任意のベクターであることができる。多数のベクターが公知であり、又は当該技術分野において公知且つ本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子産物の移入を媒介できるように設計され得る。ある特定の態様において、ベクターは、インビトロ又はインビボのいずれかで、宿主細胞に送達される核酸ポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態において、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法において関心対象となるコーディング配列を含む（例えばＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡ）。一部の実施形態において、遺伝子編集システムは単一のベクター上で提供される。一部の実施形態において、遺伝子編集システムは、２つ又はそれより多くのベクター上で提供される。一部の実施形態において、遺伝子編集システムは、遺伝子編集システムの１つ又は複数のエレメントをコードする単離された核酸を含む１つ又は複数のベクターにより提供される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＳＡＭ編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＳＡＭ編集システムの１つ又は複数のエレメントをコードする単離された核酸を含む１つ又は複数のベクターにより提供される。例えば、一部の実施形態において、組成物は、Ｃａｓタンパク質及び少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする単離された核酸を含む。一部の実施形態において、組成物は、Ｃａｓ９タンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする単離された核酸を含む。一部の実施形態において、組成物は、本明細書の他に箇所に記載されるＣａｓ９タンパク質、又はその機能性断片若しくは誘導体をコードする少なくとも１つの単離された核酸を含む。一部の実施形態において、組成物は、本明細書の他の箇所に記載されるＣａｓ９タンパク質と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列相同性を有するＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの単離された核酸を含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸は、任意の種類の核酸を含み、これにはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない。例えば、一部の実施形態において、組成物は、単離されたＤＮＡ分子を含み、これには、例えば、記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム若しくは組成物のｇＲＮＡ若しくはタンパク質、又はその機能性断片をコードする単離されたｃＤＮＡ分子が含まれる。一部の実施形態において、組成物は、記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム若しくは組成物のタンパク質、又はその機能性断片をコードする単離されたＲＮＡ分子を含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して合成される。

【0073】

一部の事例において、ＲＮＡ及び／又はペプチドをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、ＲＮＡ及び／若しくはペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。使用されるベクターは、真核細胞中での複製及び任意選択的に組込みのために好適である。典型的なベクターは、所望の核酸配列の発現の調節のために有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを含有する。

【0074】

一部の実施形態において、本開示のベクターはまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫化及び遺伝子療法のために使用される。遺伝子送達の方法は当該技術分野において公知である。別の実施形態において、本開示は遺伝子療法ベクターを提供する。

【0075】

開示される単離された核酸は、多数の種類のベクター中にクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが挙げられるがこれらに限定されないベクター中にクローニングされ得る。特に関心対象となるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクターが挙げられる。

【0076】

追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一部の実施形態において、ベクターはまた、プラスミドベクターをトランスフェクトされた、又は記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム若しくは組成物を構成する核酸を含むウイルスに感染した細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳及び／又は発現を可能とする方式で該導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメントを含む。本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、関心対象の遺伝子と連続する発現制御配列及び関心対象の遺伝子を制御するためにトランスで又は距離を置いて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（即ち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；並びに所望の場合、コードされる産物の分泌を増強する配列が挙げられる。ネイティブな、構成的な、誘導性の及び／又は組織特異的なプロモーターを含めて、多数の発現制御配列が当該技術分野において公知であり、利用され得る。

【0077】

典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流に機能性エレメントを含有することもまた最近示されている。プロモーターエレメントの間の間隔は頻繁に柔軟であり、その結果、エレメントが逆位となるか又は互いに対して相対的に移動した場合にプロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐの間隔まで増加させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化させるために協同的又は独立的のいずれかで機能できるようである。

【0078】

適切なプロモーターの選択は容易に達成され得る。ある特定の態様において、高発現プロモーターが使用される。好適なプロモーターの１つの例は最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。ある特定の実施形態において、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びＭＭＴプロモーターもまた使用される。ある特定のタンパク質は、それらのネイティブなプロモーターを使用して発現され得る。発現を増強することができる他のエレメントもまた含めることができ、これは例えば高レベルの発現を結果としてもたらすエンハンサー又はシステム、例えばｔａｔ遺伝子及びｔａｒエレメントである。このカセットは次にベクター、例えば、例えばＥ．コリ複製起点を含む、プラスミドベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、又は他の公知のプラスミドベクターに挿入され得る。

【0079】

好適なプロモーターの別の例は伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、一部の実施形態において、他の構成的プロモーター配列が使用され、これには、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターの他に、ヒト遺伝子プロモーター、以下に限定されないが例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。更に、開示されるのは、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、開示の部分として想定される。誘導性プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、これは、そのような発現が所望される場合にそれが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、又は発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。

【0080】

ベクター上に見出されるエンハンサー配列もまた、それに含有される遺伝子の発現を調節する。典型的には、エンハンサーは、遺伝子の転写を増強するためにタンパク質因子と結合している。一部の事例において、エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流又は下流に位置する。一部の事例において、エンハンサーはまた組織特異的であり、特有の細胞又は組織種において転写を増強する。一部の実施形態において、本開示のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写をブーストするための１つ又は複数のエンハンサーを含む。一部の事例において、核酸及び／又はタンパク質の発現、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを通じてトランスフェクト又は感染させようとする細胞の集団からの発現性細胞の同定及び選択を促すために選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は両方を含有することができる。他の実施形態において、選択マーカーは、ＤＮＡの別々の断片上に担われ、共トランスフェクション手順において使用される。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞中での発現を可能にするために適切な調節配列に隣接され得る。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏ及び同種のものが挙げられる。

【0081】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのいずれかをコードする核酸である。例えば、提供されるのは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及びＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、ベクターは、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0082】

一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子はラージＴ抗原遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子は、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１遺伝子である。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号３に記載のＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号４に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５を含むＲＮＡ配列を含む。

【0083】

一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号７を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０を含む配列を含む。

【0084】

一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１１を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１２を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０に記載の配列によりコードされる。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１３を含むＲＮＡ配列を含む。

【0085】

一部の実施形態において、核酸はプロモーターを更に含む。一部の実施形態において、プロモーターはユビキタスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、核酸はエンハンサーエレメントを更に含む。一部の実施形態において、エンハンサーエレメントはヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである。一部の実施形態において、核酸は５’ＩＴＲエレメント及び３’ＩＴＲエレメントを更に含む。

【0086】

一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、又はＡＡＶＤＪ／８カプシドタンパク質である。一部の実施形態において、核酸は、配列番号１４に対して少なくとも約８０、８５、９０、又は９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである。

【0087】

遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は当該技術分野において公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に当該技術分野における任意の方法により容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、宿主細胞に物理的、化学的、又は生物学的手段により移入され得る。

【0088】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子ボンバードメント、微量注射、エレクトロポレーション、及び同種のものが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を製造する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入の好ましい方法はリン酸カルシウムトランスフェクションである。

【0089】

外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞中の組換え核酸配列の存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えばサザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ並びにＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば特定のタンパク質の存在又は非存在の検出、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によるもの又は本開示の範囲内に入る作用因子を同定するための本明細書に記載のアッセイによるものが挙げられる。

【0090】

一部の実施形態において、ベクターは、細胞にウイルスベクターの形態で提供される。ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載されるように、好適なベクターは、概しては、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択マーカーを含有する。

【0091】

関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するウイルス方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するために有用である。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、並びに同種のものに由来し得る。多数のウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野において公知の技術を使用してベクターに挿入され、レトロウイルスベクター中にパッケージングされ得る。組換えウイルスは次に単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボのいずれかで送達され得る。多数のレトロウイルスシステムが当該技術分野において公知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当該技術分野において公知である。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。別の実施形態において、非ＡＡＶベクターが使用され、これには組込みウイルス、例えば、ヘルペスウイルス又はレンチウイルスが含まれるが、他のウイルスが選択される。好適には、これらの他のベクターの１つが生成される場合、それは複製欠陥性ウイルスベクターとして製造される。ある特定の事例において、複製欠陥性ウイルス又はウイルスベクターは、合成又は人工ウイルス粒子であって、関心対象の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシド又はエンベロープ中にパッケージングされ、これもまたウイルスカプシド又はエンベロープ内にパッケージングされた任意のウイルスゲノム配列が複製欠損性であり、即ち、それらは子孫ビリオンを生成できないが標的細胞に感染する能力を保持しているものを指す。一部の実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製のために要求される酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングのために要求されるシグナルにより隣接された関心対象の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス」であるように操作され得る）、これらの遺伝子は製造の間に供給され得る。

【0092】

例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルスに由来するベクターは、長期間の遺伝子移入を達成するための好適なツールであり、その理由は、それらは、導入遺伝子の長期間の安定な組込み及び娘細胞中のその伝播を可能とするからである。レンチウイルスベクターは、非増殖性細胞、例えば肝細胞への形質導入が可能であるという点で、オンコレトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルスに由来するベクターに対して付加的な利点を有する。それらはまた、低い免疫原性という付加的な利点を有する。

【0093】

更に提供されるのは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸である。本明細書において提供されるのは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ある特定の事例において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶの成分を含み又はそれに由来し、且つ、インビトロ又はインビボのいずれであれ、多数の組織種のいずれか、例えば脳、心臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、又は膵臓の、ヒト細胞を含めて、哺乳動物細胞に感染させるために好適な任意のベクターを含む。ある特定の事例において、ＡＡＶベクターは、関心対象のタンパク質（例えば本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）をコードする核酸を含むＡＡＶ型ウイルス粒子（又はビリオン）を含む。一部の実施形態において、本明細書に更に記載されるように、本明細書に開示されるＡＡＶは、血清型の組合せ（例えば，「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含めて、様々な血清型、又は様々なゲノム（例えば、一本鎖若しくは自己相補的なもの）に由来する。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはヒト血清型ＡＡＶベクターである。そのような実施形態において、ヒト血清型ＡＡＶは、任意の公知の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ９に由来する。一部の実施形態において、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、又はＡＡＶＤＪ／８である。

【0094】

一部の実施形態において、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。ＡＡＶベクターは、それらを遺伝子療法のために理想的に適したものとする多数の特徴を有し、これには、病原性の欠如、最小の免疫原性、及び安定且つ効率的な方式で有糸分裂後の細胞に形質導入する能力が含まれる。ＡＡＶベクター内に含有される特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組合せを選択することにより１つ又は複数の種類の細胞に特異的に標的化され得る。

【0095】

様々な異なるＡＡＶカプシドが記載されており、使用することができるが、肝臓を優先的に標的化し且つ／又は遺伝子を高い効率で送達するＡＡＶが特に所望される。ＡＡＶ８の配列は様々なデータベースから入手可能である。実施例は同じカプシドを有するＡＡＶベクターを利用するが、遺伝子編集ベクター及びＡＡＶ標的化ベクターのカプシドは同じＡＡＶカプシドである。別の好適なＡＡＶは、例えば、ｒｈ１０である（国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット）。更に他のＡＡＶ供給源としては、例えば、ＡＡＶ９（例えば、米国特許第７，９０６，１１１号明細書；米国特許出願公開第２０１１－０２３６３５３（Ａ１）号明細書を参照）、及び／又はｈｕ３７（例えば、米国特許第７，９０６，１１１号明細書；米国特許出願公開第２０１１－０２３６３５３（Ａ１）号明細書を参照）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、（米国特許第７，７９０，４４９号明細書；米国特許第７，２８２，１９９号明細書、国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット；米国特許第７，７９０，４４９号明細書；米国特許第７，２８２，１９９号明細書；米国特許第７，５８８，７７２号明細書）が挙げられる。更に他のＡＡＶは、選択されたＡＡＶカプシドの組織選好性を任意選択的に考慮に入れて、選択され得る。

【0096】

一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、核酸はまた、関心対象のタンパク質の発現及び、一部の実施形態において、分泌を可能とする１つ又は複数の調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、タンパク質形質導入ドメイン（「ＰＴＤ」）をコードする配列、及び同種のものを含む。そのため、一部の実施形態において、核酸は、感染細胞中での関心対象のタンパク質の発現を引き起こす又は向上させるためのコーディング配列に作動可能に連結されたプロモーター領域を含む。そのようなプロモーターは、遍在的、細胞又は組織特異的、強い、弱い、調節性、キメラ等であることができ、例えば、感染した組織中でのタンパク質の効率的且つ安定な製造を可能とし得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、コードされるタンパク質と同種、又は異種であるが、概しては、開示される方法において使用されるプロモーターはヒト細胞中で機能的である。調節性プロモーターの例としては、非限定的に、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられる。ある特定の実施形態において、使用される他のプロモーターは、組織、例えば腎臓、脾臓、及び膵臓について組織特異的なプロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にはＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等、並びに細胞プロモーター、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びｂ－アクチンプロモーターが挙げられる。

【0097】

一部の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、概しては５’ ＡＡＶ ＩＴＲ、本明細書に記載の発現カセット及び３’ ＡＡＶ ＩＴＲを含有する、核酸を含む。本明細書に記載されるように、一部の実施形態において、発現カセットは、各発現カセット内のオープンリーディングフレーム用の調節エレメントを含有し、且つ核酸は追加の調節エレメントを任意選択的に含有する。ＡＡＶベクターは、一部の実施形態において、全長ＡＡＶ ５’逆末端反復（ＩＴＲ）及び全長３’ＩＴＲを含む。ΔＩＴＲと称される、短縮バージョンの５’ＩＴＲが記載されており、これにおいては、Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している。略語「ｓｃ」は自己相補的を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により担われるコーディング領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された構築物を指す。感染すると、第２鎖の細胞媒介性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半分が会合して、即時の複製及び転写の準備済みの１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する（例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ， “Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， （Ａｕｇｕｓｔ ２００１）を参照；例えば、米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；及び同第７，４５６，６８３号明細書も参照）。シュードタイプＡＡＶが製造されるべき場合、ＩＴＲは、カプシドのＡＡＶ供給源とは異なる供給源から選択される。例えば、一部の実施形態において、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、選択された細胞受容体、標的組織又はウイルス標的のために特定の効率を有するＡＡＶカプシドとの使用のために選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が、簡便性のため及び規制当局の承認を加速させるために使用される（即ちシュードタイプ）。一部の実施形態において、一本鎖ＡＡＶウイルスベクターが使用される。

【0098】

対象への送達のために好適なＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第７，７９０，４４９号明細書；米国特許第７，２８２，１９９号明細書；国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット；並びに米国特許第７，５８８，７７２（Ｂ２）号明細書、米国特許第５，１３９，９４１号明細書；同第５，７４１，６８３号明細書；同第６，０５７，１５２号明細書；同第６，２０４，０５９号明細書；同第６，２６８，２１３号明細書；同第６，４９１，９０７号明細書；同第６，６６０，５１４号明細書；同第６，９５１，７５３号明細書；同第７，０９４，６０４号明細書；同第７，１７２，８９３号明細書；同第７，２０１，８９８号明細書；同第７，２２９，８２３号明細書；及び同第７，４３９，０６５号明細書を参照）。１つのシステムにおいて、プロデューサー細胞系に、ＩＴＲにより隣接された導入遺伝子をコードする構築物並びにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物が一過的にトランスフェクトされる。第２のシステムにおいて、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞系に、ＩＴＲにより隣接された導入遺伝子をコードする構築物が（一過的又は安定的に）トランスフェクトされる。これらのシステムの各々において、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスによる感染に応答して製造され、夾雑性ウイルスからのｒＡＡＶの分離を要求する。より最近において、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスによる感染を要求しないシステムが開発されており、要求されるヘルパー機能（即ち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、並びにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた、システムにより、トランスで供給される。これらのより新しいシステムにおいて、ヘルパー機能は、要求されるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションにより供給することができ、又は細胞は、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有するように操作され得、該遺伝子の発現は転写又は転写後レベルで制御され得る。更に別のシステムにおいて、ＩＴＲにより隣接された導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子は、バキュロウイルスベースのベクターの感染により昆虫細胞に導入される。

【0099】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ９、及び／又は存在するＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス若しくは他のウイルスベクター種、又はこれらの組合せを使用して送達され得る。Ｃａｓ９及び１つ又は複数のガイドＲＮＡは、１つ又は複数のウイルスベクターにパッケージングされ得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、関心対象の組織に、例えば筋肉内注射により、送達されるが、他の場合には、ウイルス送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、経口、粘膜、又は他の送達方法を介して為される。そのような送達は、単回用量、又は複数用量のいずれかを介して為され得る。本発明において送達されるべき実際の投薬量は、様々な要因、例えば選択されたベクター、標的細胞、生物、又は組織、処置される対象の一般的条件、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与の態様、求められる形質転換／改変の種類等に依存して大きく変動し得ることを当業者は理解する。

【0100】

一部の実施形態において、投薬量は、例えば、担体（水、食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油等）、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝化食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、抗原性を増強するためのアジュバント、免疫賦活性化合物若しくは分子、及び／又は当該技術分野において公知の他の化合物を更に含有する。本発明におけるアジュバントは、抗原が吸着された鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；又は抗原溶液が油中に乳化された油中水エマルション（ＭＦ－５９、フロイント不完全アジュバント）を含有することができ、場合により、抗原性を更に増強する（抗原の分解を阻害し且つ／又はマクロファージの流入を引き起こす）ために殺傷されたマイコバクテリアが含められる（フロイント完全アジュバント）。アジュバントとしてはまた、免疫賦活性分子、例えばサイトカイン、共刺激分子、及び例えば、免疫賦活性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。そのような投薬用製剤は、当業者により容易に確認可能である。一部の実施形態において、投薬量は、１つ又は複数の薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；及び有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等を更に含む。追加的に、助剤物質、例えば湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、ゲル又はゲル化材料、香味剤、着色剤、マイクロスフェア、ポリマー、懸濁剤等も、本発明において存在することができる。追加的に、１つ又は複数の他の従来の薬学的成分、例えば防腐剤、湿潤剤、懸濁化剤、界面活性剤、抗酸化剤、固化防止剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定化剤等もまた存在することができ、これは特に、投薬形態が再構成可能な形態である場合に該当する。好適な例示的な成分としては、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン及びこれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）において利用可能である。

【0101】

本開示はまた、本明細書に記載の組成物のうちの１つ又は複数を含む医薬組成物を提供する。製剤は、従来の賦形剤、即ち、創傷又は処置部位への投与のために好適な薬学的に許容される有機又は無機担体物質と混合して用いられ得る。医薬組成物は滅菌が可能であり、所望される場合、助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、及び／又は芳香物質並びに同種のものと混合され得る。それらはまた、所望の場合、他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせられ得る。

【0102】

一部の実施形態において、記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物の投与は、例えば、非経口により、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、若しくは腹腔内注射により、又は注入により又は任意の他の許容される全身性の方法により実行される。組成物の投与のための製剤としては、直腸、経鼻、経口、外用（頬側及び舌下を含む）、経膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与のために好適なものが挙げられる。一部の実施形態において、製剤は、好都合には、単位投薬形態、例えば錠剤及び持続放出カプセルにおいて提供され、当該技術分野において周知の任意の方法により調製される。

【0103】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散体システム、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、並びに脂質ベースのシステム、例えば水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達媒体としての使用のための例示的なコロイドシステムはリポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0104】

非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、核酸の宿主細胞への導入（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）のために想定される。別の態様において、核酸は、脂質と関連付けられ得る。脂質と関連付けられた核酸は、リポソームの水性内部中に被包され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結性分子を介してリポソームに取り付けられ、リポソーム中に封入され、リポソームと複合体化され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と合わせられ、脂質中に懸濁物として含有され、ミセルと共に含有若しくは複合体化され、又はそれ以外に脂質と関連付けられ得る。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中での任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造中に、ミセルとして、又は「崩壊した」構造と共に、存在することができる。それらはまた、単純に溶液中に散在することができ、場合により、サイズ又は形状が均一でない凝集物を形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成の脂質であり得る、脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴の他に、長鎖脂肪族炭化水素並びにそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物のクラスが挙げられる。

【0105】

本明細書に記載の組成物は、上記の様々なベクターシステムにおける使用のために好適である。追加的に、投与された化合物のインビボ血清半減期を増強するために、組成物は、被包され、リポソームの内腔に導入され、コロイドとして調製されることができ、又は組成物の延長された血清半減期を提供する他の従来技術が用いられ得る（例えば、Ｓｚｏｋａ， ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書及び同第４，８３７，０２８号明細書を参照）。使用のために好適な脂質は、商業的供給元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から入手することができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）はＫ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から入手することができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約－２０℃で貯蔵することができる。クロロホルムは唯一の溶媒として使用され、その理由は、メタノールよりも容易に蒸発するからである。「リポソーム」は一般的な用語であり、閉じた脂質二重層又は凝集物の生成により形成される様々なシングル及びマルチラメラ脂質媒体を包含する。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有する小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。マルチラメラリポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰な水性溶液中に懸濁された場合に自然発生的に形成される。脂質成分は、閉じた構造の形成の前に自己再編成を起こし、水及び溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５： ５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物もまた包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取るか、又は単に脂質分子の不均一な凝集物として存在することができる。リポフェクタミン－核酸複合体もまた想定される。

【0106】

処置方法
本明細書において提供される遺伝子編集システムは、細胞（例えば宿主細胞）のゲノム中のＪＣＶ ＤＮＡ分子（例えばＪＣＶゲノム）を改変及び／又は編集する方法のために有用である。一部の実施形態において、ＮＣＣＲ、早期コーディング遺伝子（例えばＴ抗原遺伝子）、及び／又は後期コーディング遺伝子（例えばＶＰ遺伝子）の標的化。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＮＣＣＲを標的化する。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＶＰ遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＴ抗原遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＮＣＣＲ及びＴ抗原遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、遺伝子編集システムはＮＣＣＲ及びＶＰ抗原遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、遺伝子編集システムは、ＮＣＣＲ、Ｔ抗原遺伝子、及びＶＰ抗原遺伝子を標的化する。一部の実施形態において、Ｔ抗原遺伝子はラージＴ抗原である。一部の実施形態において、ＶＰ遺伝子はＶＰ１である。

【0107】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物を使用して細胞（例えば宿主細胞）のゲノム中のＪＣＶ ＤＮＡ分子（例えばＪＣＶゲノム）を改変及び／又は編集する方法である。概しては、細胞（例えば宿主細胞）のゲノム中のＪＣＶ ＤＮＡ分子（例えばＪＣＶゲノム）を改変及び／又は編集することは、ＮＣＣＲ、早期コーディング遺伝子（例えばＴ抗原遺伝子）、及び／又は後期コーディング遺伝子（例えばＶＰ遺伝子）を標的化するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物を細胞に接触させる、又は細胞に提供することを含む。ある特定の事例において、ＪＣＶ ＤＮＡ分子及び／又はゲノムをモジュレート又は編集することは、ＤＮＡ分子及び／又はゲノムのポリヌクレオチド配列及び／又は領域を除去及び／又は切除することを含む。ある特定の事例において、モジュレート及び編集することは、ＪＣＶ ＤＮＡ分子及び／又はゲノムが機能的なＪＣＶ遺伝子産物及び／又はコンピテントなＪＣＶウイルス（例えば宿主細胞中で複製することができる機能的なＪＣＶウイルス）をもたらすことをアブレート（ａｂｌａｔｅ）又は予防するために充分にポリヌクレオチド配列及び／又は領域を除去及び／又は切除することを含む。

【0108】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、ＪＣＶ ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと接触させることを含む、ＪＣＶ ＤＮＡをモジュレート又は編集する方法である。一部の実施形態において、ＪＣＶ ＤＮＡはＪＣＶウイルスのゲノムである。一部の実施形態において、ＪＣＶ ＤＮＡは細胞中にあり、細胞はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと接触させられる。本明細書において更に提供されるのは、細胞をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと接触させることを含む、細胞中のＪＣＶ ＤＮＡを阻害及び／又は排除する方法である。更に提供されるのは、細胞をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと接触させることを含む、細胞中のＪＣＶ感染及び／又はＪＣＶ複製を阻害又は予防する方法である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは核酸（例えばベクター）によりコードされ、且つ細胞は（例えば感染又はトランスフェクションを介して）核酸を提供される。一部の実施形態において、核酸はウイルスベクター中にパッケージングされる。

【0109】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）ＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）並びに／又は（ｉｉ）ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ及び／若しくはＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ｄ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを更に含む。

【0110】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ｄ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを更に含む。

【0111】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む。

【0112】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ｃ）配列番号６を含むＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを更に含む。

【0113】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）配列番号６又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む。

【0114】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連；及び（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の配列を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の配列を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。

【0115】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）核酸の部分又は全体を切除する方法であって、細胞に、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む組成物を提供することを含む、方法である。一部の実施形態において、方法は、細胞に、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供することを含む。

【0116】

本明細書において提供されるのは、ある特定の実施形態において、細胞中でのジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、細胞に、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む組成物を提供することを含む、方法である。一部の実施形態において、方法は、細胞に、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又はＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供することを含む。

【0117】

一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第１の標的核酸配列は、配列番号２に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２又は配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＮＣＣＲ配列を標的化する。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号５又は配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列によるＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列又は配列番号２に相補的なＮＣＣＲ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３又は配列番号３に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列によるＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＮＣＣＲのＮＣＣＲ配列は、配列番号４又は配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0118】

一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第２の標的核酸配列は、配列番号６に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＴ抗原配列を標的化する。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号６に相補的なＴ抗原配列又は配列番号６に相補的なＴ抗原配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号７又は配列番号７に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡにより標的化されるＴ抗原遺伝子のＴ抗原配列は、配列番号６又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0119】

一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を含む配列を含む。一部の実施形態において、第３の標的核酸配列は、配列番号１０に記載の配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡは、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列に対応するＶＰ配列を標的化する。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号９又は配列番号９に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列のＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、第２のｇＲＮＡは、配列番号１０に相補的なＶＰ配列又は配列番号１０に相補的なＶＰ配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を標的化する。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列を含むＰＡＭ配列を含む。一部の実施形態において、第３のｇＲＮＡにより標的化されるＶＰ遺伝子のＶＰ配列は、配列番号１０又は配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0120】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0121】

一部の実施形態において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び第３のｇＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、核酸は、配列番号１４に記載の配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、及び第３のｇＲＮＡをコードする核酸は、ＡＡＶベクター中にパッケージングされるように構成され、ＡＡＶベクターはＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである。

【0122】

一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞に、配列番号１又は配列番号１４のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むベクター（例えばウイルス又は非ウイルス）を提供し又は接触させることを含む。

【0123】

一部の実施形態において、細胞は対象内にある。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、細胞は、神経系内の細胞、例えば膠細胞（例えば乏突起膠細胞、星状膠細胞等）を含むがこれに限定されない。

【0124】

本明細書に開示される方法は、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物を投与することを更に包含する。ある特定の事例において、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物を含む医薬組成物が投与される。ある特定の事例において、細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲の定式化において使用され得る。そのような組成物の投薬量は、好ましくは、殆ど又は全く毒性を有さずにＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。一部の実施形態において、投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変動する。記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は組成物の方法において使用される任意の組成物のために、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから概算され得る。ある特定の実施形態において、用量は、細胞培養における決定でＩＣ50（即ち、症状の半数最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて定式化される。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。

【0125】

そのような量に対応する所与の剤の量は、要因、例えば特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要とする対象又は宿主の素性（例えば、体重）に依存して変動するが、それにもかかわらず、症例を取り巻く特定の状況、例えば、投与される特有の剤、投与の経路、及び処置される対象又は宿主に従って当該技術分野において公知の方式で常法により決定され得る。ある特定の事例において、化合物の治療有効量及び有効量は、疾患の処置、予防及び／又は管理において治療的な利益を提供し、処置されるべき疾患又は障害と関連付けられる１つ又は複数の症状を遅延させ又は最小化するために充分な量を指す。ある特定の事例において、治療有効量及び有効量は、全体的な療法を向上させ、疾患若しくは障害の症状若しくは原因を低減させ若しくは回避し、又は別の治療剤の治療有効性を増強する量を包含する。一部の実施形態において、所望の用量は、好都合には、単回用量において、又は同時に（若しくは短い時間的期間にかけて）若しくは適切な間隔で、例えば１日当たり２、３、４若しくはそれより多くの部分用量として、投与される分割用量として、提供される。

【0126】

一部の実施形態において、ウイルスベクター媒介性の送達のために、用量は、少なくとも１×１０5個の粒子～約１×１０15個の粒子を含む。一部の実施形態において、送達はアデノウイルスを介して為され、例えば単回用量はアデノウイルスベクターの少なくとも１×１０5個の粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）を含有する。一部の実施形態において、用量は、アデノウイルスベクターの少なくとも約１×１０6個の粒子（例えば、約１×１０6～１×１０12個の粒子）、少なくとも約１×１０7個の粒子、少なくとも約１×１０8個の粒子（例えば、約１×１０8～１×１０11個の粒子若しくは約１×１０8～１×１０12個の粒子）、少なくとも約１×１０0個の粒子（例えば、約１×１０9～１×１０10個の粒子若しくは約１×１０9～１×１０12個の粒子）、又は少なくとも約１×１０10個の粒子（例えば、約１×１０～１×１０12個の粒子）である。代替的に、用量は、約１×１０14個以下の粒子、約１×１０13個以下の粒子、約１×１０12個以下の粒子、約１×１０11個以下の粒子、及び約１×１０10個以下の粒子（例えば、約１×１０9個以下の粒子）を含む。そのため、一部の実施形態において、用量は、例えば、アデノウイルスベクターの約１×１０6個の粒子単位（ｐｕ）、約２×１０6ｐｕ、約４×１０6ｐｕ、約１×１０7ｐｕ、約２×１０7ｐｕ、約４×１０7ｐｕ、約１×１０8ｐｕ、約２×１０8ｐｕ、約４×１０8ｐｕ、約１×１０9ｐｕ、約２×１０9ｐｕ、約４×１０9ｐｕ、約１×１０10ｐｕ、約２×１０10ｐｕ、約４×１０10ｐｕ、約１×１０11ｐｕ、約２×１０1ｐｕ、約４×１０11ｐｕ、約１×１０12ｐｕ、約２×１０12ｐｕ、又は約４×１０12ｐｕを含む、アデノウイルスベクターの単回用量を含有する。一部の実施形態において、アデノウイルスは、複数用量を介して送達される。

【0127】

一部の実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ＡＡＶのヒトへのインビボ送達のための治療有効投薬量は、溶液１ｍｌ当たり約１×１０10～約１×１０10個の機能的なＡＡＶを含有する約２０～約５０ｍｌの食塩水溶液の範囲内にあると考えられる。投薬量は、治療的な利益を任意の副作用に対して均衡させるように調整され得る。一部の実施形態において、ＡＡＶ用量は、概しては、約１×１０5～１×１０50個のゲノムＡＡＶ、約１×１０8～１×１０20個のゲノムＡＡＶ、約１×１０10～約１×１０16個のゲノム、又は約１×１０11～約１×１０16個のゲノムＡＡＶの濃度の範囲内にある。一部の実施形態において、ヒト投薬量は約１×１０13個のゲノムＡＡＶである。一部の実施形態において、そのような濃度は、約０．００１ｍｌ～約１００ｍｌ、約０．０５～約５０ｍｌ、又は約１０～約２５ｍｌの担体溶液中で送達される。他の有効な投薬量は、当業者により用量応答曲線を確立する常法の試験を通じて容易に確立され得る（例えば、米国特許第８，４０４，６５８号明細書を参照）。

【0128】

一部の実施形態において、細胞は、療法が意図される対象においてインビボで遺伝子改変される。ある特定の態様において、インビボでの送達のために、核酸は対象に直接的に注射される。例えば、一部の実施形態において、核酸は、組成物が要求される部位に送達される。インビボ核酸移入技術としては、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、アデノ随伴ウイルス）を用いるトランスフェクション、脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質媒介性の移入のために有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ－Ｃｈｏｌである）、ネイキッドＤＮＡ、並びにトランスポゾンベースの発現システムが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な遺伝子療法プロトコールについて、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３ （１９９２）を参照。国際公開第９３／２５６７３号パンフレット及びそれにおいて参照される参考文献も参照。一部の実施形態において、方法は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを、直接的に対象に投与することを含む（例えば、Ｚａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３１： ８９８－９０７を参照）。

【0129】

エクスビボでの処置のために、単離された細胞はエクスビボ又はインビトロ環境において改変される。一部の実施形態において、細胞は、療法が意図される対象にとって自己細胞である。代替的に、細胞は、対象に関して同種異系、同系、又は異種であることができる。改変された細胞は次に対象に直接的に投与され得る。

【0130】

異なる送達の方法を利用して、単離された核酸を細胞に投与できることを当業者は認識する。例としては、（１）物理的手段を利用する方法、例えばエレクトロポレーション（電気）、遺伝子銃（物理的な力）又は大きい体積の液体の適用（圧力）；及び（２）核酸又はベクターが、別の実体、例えばリポソーム、凝集タンパク質又はトランスポーター分子に複合体化される方法が挙げられる。

【0131】

細胞当たりで加えられるベクターの量は、ベクター中に挿入される治療遺伝子の長さ及び安定性の他に、配列の性質に伴って変動する可能性があり、特には経験的に決定される必要があるパラメーターであり、本開示の方法に固有ではない要因（例えば、合成と関連付けられるコスト）に起因して変更され得る。当業者は、特定の状況の緊急性に従って任意の必要な調整を容易に行うことができる。

【0132】

実施形態
実施形態１は、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又は前記第１のｇＲＮＡをコードする核酸配列；及び（ｃ）前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又は前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む、組成物を含む。実施形態２は、前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、実施形態１の組成物を含む。実施形態３は、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む、実施形態１～２のいずれか１つの組成物を含む。実施形態４は、前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、実施形態１～３のいずれか１つの組成物を含む。実施形態５は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～４のいずれか１つの組成物を含む。実施形態６は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである、実施形態１～５のいずれか１つの組成物を含む。実施形態７は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～６のいずれか１つの組成物を含む。実施形態８は、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～７のいずれか１つの組成物を含む。実施形態９は、前記Ｔ抗原遺伝子がラージＴ抗原遺伝子である、実施形態１～８のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１０は、前記ＶＰ遺伝子が、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である、実施形態１～９のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１１は、前記ＶＰ遺伝子がＶＰ１遺伝子である、実施形態１～１０のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１２は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１３は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に記載の配列を含む、実施形態１～１２のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１４は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１５は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に記載のＰＡＭ配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１６は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１７は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に記載の配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１８は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～１７のいずれか１つの組成物を含む。実施形態１９は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に記載の配列によりコードされる、実施形態１～１８のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２０は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２１は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に記載のＲＮＡ配列の配列を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２２は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～２１のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２３は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に記載の配列を含む、実施形態１～２２のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２４は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～２３のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２５は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に記載のＰＡＭ配列を含む、実施形態１～２４のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２６は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～２５のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２７は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に記載の配列を含む、実施形態１～２６のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２８は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～２７のいずれか１つの組成物を含む。実施形態２９は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に記載の配列によりコードされる、実施形態１～２８のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３０は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～２９のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３１は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に記載のＲＮＡ配列を含む、実施形態１～３０のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３２は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～３１のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３３は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に記載の配列を含む、実施形態１～３２のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３４は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～３３のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３５は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に記載のＰＡＭ配列を含む、実施形態１～３４のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３６は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～３５のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３７は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に記載の配列を含む、実施形態１～３６のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３８は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～３７のいずれか１つの組成物を含む。実施形態３９は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に記載の配列によりコードされる、実施形態１～３８のいずれか１つの組成物を含む。実施形態４０は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～３９のいずれか１つの組成物を含む。実施形態４１は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に記載のＲＮＡ配列を含む、実施形態１～４０のいずれか１つの組成物を含む。実施形態４２は、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び（ｂ）配列番号２又はその逆相補鎖を含むジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４３は、配列番号６を含む前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む、実施形態１～４２のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４４は、配列番号１０を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡを更に含む、実施形態１～４３のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４５は、配列番号１０を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ１遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡを更に含む、実施形態１～４４のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４６は、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの標的核酸配列に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４７は、（ａ）配列番号６又はその逆相補鎖を含むＪＣＶゲノムのラージＴ抗原遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｂ）配列番号１０又はその逆相補鎖を含む前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。実施形態４８は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸分子を含む。実施形態４９は、（ａ）Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；（ｂ）ジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）ゲノムの非コーディング制御領域（ＮＣＣＲ）の中又はその近くの第１の標的核酸配列に相補的な第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び（ｃ）前記ＪＣＶゲノムのＴ抗原遺伝子又は前記ＪＣＶゲノムのＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的な第２のｇＲＮＡをコードする核酸分子を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。実施形態５０は、前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記Ｔ抗原遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、実施形態１～４９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５１は、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第３の標的核酸配列に相補的な第３のｇＲＮＡ又は前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸配列を更に含む、実施形態１～５０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５２は、前記第２のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶゲノムの前記ＶＰ遺伝子の中又はその近くの第２の標的核酸配列に相補的である、実施形態１～５１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５３は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１～５２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５４は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓΦエンドヌクレアーゼである、実施形態１～５３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５５は、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～５４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５６は、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼがスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態１～５５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５７は、前記Ｔ抗原遺伝子がラージＴ抗原遺伝子である、実施形態１～５６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５８は、前記ＶＰ遺伝子が、ＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、又はＶＰ３遺伝子である、実施形態１～５７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態５９は、前記ＶＰ遺伝子がＶＰ１遺伝子である、実施形態１～５８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。
実施形態６０は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～５９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６１は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号２に記載の配列を含む、実施形態１～６０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６２は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～６１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６３は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号３を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～６２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６４は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６５は、前記第１の標的核酸配列が、配列番号４に記載の配列を含む、実施形態１～６４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６６は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～６５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６７は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２に記載の配列によりコードされる、実施形態１～６６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６８は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～６７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態６９は、前記第１のｇＲＮＡが、配列番号５を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～６８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７０は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～６９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７１は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６を含む配列を含む、実施形態１～７０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７２は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～７１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７３は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号７を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～７２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７４は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～７３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７５は、前記第２の標的核酸配列が、配列番号６を含む配列を含む、実施形態１～７４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７６は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～７５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７７は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号６に記載の配列によりコードされる、実施形態１～７６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７８は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～７７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態７９は、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号９を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～７８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８０は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～７９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８１は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１０を含む配列を含む、実施形態１～８０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８２は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～８１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８３は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１１を含むＰＡＭ配列を含む、実施形態１～８２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８４は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列を含む、実施形態１～８３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８５は、前記第３の標的核酸配列が、配列番号１２を含む配列を含む、実施形態１～８４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８６は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む配列によりコードされる、実施形態１～８５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８７は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１０に記載の配列によりコードされる、実施形態１～８６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８８は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～８７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態８９は、前記第３のｇＲＮＡが、配列番号１３を含むＲＮＡ配列を含む、実施形態１～８８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９０は、前記核酸分子がプロモーターを更に含む、実施形態１～８９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９１は、前記プロモーターがユビキタスプロモーターである、実施形態１～９０のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９２は、前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、実施形態１～９１のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９３は、前記プロモーターが構成的プロモーターである、実施形態１～９２のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９４は、前記プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態１～９３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９５は、前記核酸分子がエンハンサーエレメントを更に含む、実施形態１～９４のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９６は、前記エンハンサーエレメントがヒトサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントである、実施形態１～９５のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９７は、前記核酸分子が５’ＩＴＲエレメント及び３’ＩＴＲエレメントを更に含む、実施形態１～９６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９８は、アデノ随伴ウイルスがＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である、実施形態１～９７のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態９９は、前記核酸分子が、配列番号１４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を含む、実施形態１～９８のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態１００は、ＡＡＶ６ベクター又はＡＡＶ９ベクターである、実施形態１～９９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む。実施形態１０１は、細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）配列の部分又は全体を切除する方法であって、前記細胞に本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は本明細書に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、前記方法を含む。実施形態１０２は、細胞中でのジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）複製を阻害し又は低減させる方法であって、前記細胞に本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、又は本明細書に記載のＡＡＶベクターを提供することを含む、前記方法を含む。実施形態１０３は、前記細胞が対象中にある、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法を含む。実施形態１０４は、前記対象がヒトである、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の方法を含む。実施形態１０５は、前記ＪＣＶ配列が前記細胞に組み込まれている、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の方法を含む。

【実施例】

【0133】

実施例１ － 遺伝子編集によるＪＣＶの阻害
現行の療法の制限を考慮して、ＪＣＶ複製を有効に抑制及び／又は阻害するだけでなく、潜伏性ウイルスゲノムを根絶する新たな治療アプローチに対する必要性が存在する。よって、本明細書において記載及び提供されるように、ウイルス複製のために重要なウイルスＤＮＡ配列をモジュレート又は編集する目的と共にＪＣＶゲノムを特異的に標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＪＣＶ複製を阻害することができる。顕著なことに、ＪＣＶのＮＣＣＲ、ラージＴ抗原遺伝子、及びＶＰ１遺伝子を標的化することは、細胞中のインタクトなＮＣＣＲ、ラージＴ抗原遺伝子、及びＶＰ１遺伝子ＪＣＶを劇的に減少させ、ＪＣＶ感染の抑制に繋がる。本明細書において提供されるように、ＪＣＶゲノム内の遺伝子編集／アブレーションにおける標的化戦略（例えばＮＣＣＲ、ラージＴ抗原遺伝子、及びＶＰ１遺伝子の標的化）の特異性を、細胞モデルにおける遺伝学的分析により検証した。

【0134】

図１Ａ～１Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集システムにより標的化されるウイルス遺伝子と共にＪＣＶ（Ｍａｄ－１）ゲノム（図１Ａ）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＫＳ（＋）－ＢａｍＨＩ－ＪＣＶＭａｄ１プラスミド（ｐＭａｄ１）（図１Ｂ）の図式的な表現を示す。ＰＡＭ（赤）を含むｇＲＮＡの位置及びヌクレオチド組成を示す。ヌクレオチド位置は、ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００１６９９．１（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／９６２８６４２／）が参照される。図１Ｃは、ＪＣＶ構築物のグラフィカルな表現を示す。プラスミドは、Ｔ抗原をコードする早期遺伝子（ＴＡｇ）、ＶＰ１をコードする後期遺伝子（ＶＰ１）及び調節領域ＮＣＣＲ（ＮＣＣＲ）をそれぞれ標的化する３つのｇＲＮＡを含有する。各ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターの下流にクローニングされ、１コピーのＳａＣａｓ９遺伝子もまたプラスミド中に含まれる。ＪＣＶ構築物をＡＡＶ６及びＡＡＶ９ベクターにパッケージングした。図２は、ＳａＣａｓ９及びＴＡｇ、ＶＰ１及びＮＣＣＲ関連ｇＲＮＡの発現並びに各々の遺伝子配列における切除活性を確認するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＫＳ（＋）－ＢａｍＨＩ－ＪＣＶＭａｄ１（ｐＭａｄ１）により一過的にトランスフェクトされたＳＶＧＡ細胞系のＡＡＶ６／ＡＡＶ９ ＪＣＶ構築物形質導入の図式的な表現である。

【0135】

ＡＡＶ送達性のＣａｓ９は膠細胞中で発現される。図３は、それぞれＡＡＶ６－及びＡＡＶ９－ＪＣＶ構築物によるＳＶＧＡ細胞系の形質導入後のＳａＣａｓ９の発現を確認したウエスタンブロット分析を示す。ハウスキーピングアルファチューブリンの発現も示す。

【0136】

ＮＣＣＲ、ラージＴ抗原遺伝子、及びＶＰ１遺伝子を標的化するｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＪＣＶゲノムの標的化された領域を有効に切除（例えば除去）する。図４Ａ～４Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切除アッセイからのデータを示す。ゲル分析は、ＡＡＶ６－ＪＣＶ構築物及びＡＡＶ９－ＪＣＶ構築物を用いた形質導入後のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＫＳ（＋）－ＢａｍＨＩ－ＪＣＶＭａｄ１プラスミド（ｐＭａｄ１）によりトランスフェクトされたＳＶＧＡ細胞系においてＪＣＶ Ｍａｄ１特異的プライマーにより得られたアンプリコンを示す。（図４Ａ）ＮＣＣＲ及びＶＰ１（図４Ｂ）、ＴＡｇ及びＶＰ１（図４Ｃ）並びにＴＡｇ及びＮＣＣＲ（図４Ｃ～４Ｄ）のゲノム配列に対する切除活性の生成物を確認するためにこの研究において使用されたｐＭａｄ１プラスミド中の３つのｇＲＮＡの位置及び特異的なプライマーの図式的な表現。各標的遺伝子において特異的なｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９により誘導された特異的な切除で同定されたＤＮＡシークエンシングも示す。

【0137】

ＡＡＶ６及びＡＡＶ９は、ＤＮＡベクターを膠細胞に有効に送達する。図５Ａ～５Ｂは、ＳＶＧＡ細胞系の細胞へのＡＡＶ６ＧＦＰ及びＡＡＶ９媒介性の形質導入の効率を示す。（図５Ａ）アデノ随伴ウイルスベクターにより有効に形質導入された細胞の百分率をアッセイするためのフローサイトメトリー読取り（ヨウ化プロピジウムでの染色後）並びに（図５Ｂ）それぞれＡＡＶ６ＧＦＰ及びＡＡＶ９ＧＦＰにより形質導入されたＳＶＧＡ細胞の免疫蛍光評価。

【0138】

実施例２．配列
本明細書に記載されるような組成物及び方法において使用される配列を表１に提供する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【0139】

本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者に自明である。多数のバリエーション、変更、及び置換が、本発明から離れることなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、組成物、及び方法の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の請求項は本開示の範囲を定義すること、並びにこれらの請求項及びそれらの均等の範囲内の方法及び構造はそれによりカバーされることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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【国際調査報告】