特表 2023-500033 血管新生性眼疾患を治療又は予防するためのカルレティキュリン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-04

(54)【発明の名称】血管新生性眼疾患を治療又は予防するためのカルレティキュリン

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20221222BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221222BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20221222BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221222BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20221222BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221222BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17 ZNA

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K9/08

A61P27/02

A61P27/06

A61P3/10

A61P9/00

C07K14/47

C12P21/02 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022521196

(86)(22)【出願日】2020-10-07

(85)【翻訳文提出日】2022-05-09

(86)【国際出願番号】 EP2020078173

(87)【国際公開番号】W WO2021069523

(87)【国際公開日】2021-04-15

(31)【優先権主張番号】1914516.8

(32)【優先日】2019-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522140105

【氏名又は名称】ユーエービー バルティマス

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】リマンタス・スリビンスカス

(72)【発明者】

【氏名】エヴァルダス・チプリス

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA06

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA12

4C076BB11

4C076CC10

4C076FF61

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA22

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA33

4C084ZA36

4C084ZC35

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、血管新生性眼疾患の治療におけるカルレティキュリンの治療的使用に関する。 様々な治療方法及びカルレティキュリンを含む医薬組成物が開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における血管新生性眼疾患の治療又は予防における使用のためのカルレティキュリンであって、前記カルレティキュリンは、医薬組成物に含まれることを特徴とする、カルレティキュリン。

【請求項2】

前記血管新生性眼疾患が、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、及び網膜血管新生の１以上を含む、請求項１に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項3】

前記血管新生性眼疾患が、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑変性症、又は血管新生緑内障である、請求項１又は２に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項4】

前記血管新生性眼疾患が、加齢性黄斑変性症である、請求項３に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項5】

前記カルレティキュリンが、血管新生を予防する又は減少させる、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項6】

前記対象がヒトであり、前記カルレティキュリンが、ヒトカルレティキュリンである、請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項7】

前記カルレティキュリンが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、又は配列番号１のアミノ酸に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項8】

前記カルレティキュリンが、成熟全長タンパク質である、請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項9】

前記カルレティキュリンが、真核細胞から得られる、請求項１から８のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項10】

前記カルレティキュリンが、酵母における組換え発現によって得られる、請求項９に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項11】

前記医薬組成物中の前記カルレティキュリンの少なくとも７５％が、モノマー形態である、請求項１から１０のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項12】

前記医薬組成物が、硝子体内注射で眼に投与される、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項13】

前記医薬組成物が、２５μｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌの濃度でカルレティキュリンを含む、請求項１２に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項14】

前記医薬組成物が、眼に対する局所適用によって投与される、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項15】

前記医薬組成物が、２５ｎｇ／ｍｌ～２５０μｇ／ｍｌの濃度でカルレティキュリンを含む、請求項１４に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項16】

前記対象が、請求項１４又は１５に記載の眼に対する局所適用によって既に治療されている、請求項１２又は１３に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項17】

前記対象が、請求項１２又は１３に記載の硝子体内注射によって既に治療されている、請求項１４又は１５に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項18】

前記医薬組成物が、抗血管新生剤と併用して、別々に、又は連続して使用するためのものである、請求項１から１７のいずれかに記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項19】

前記抗血管新生剤が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤である、請求項１８に記載の使用のためのカルレティキュリン。

【請求項20】

カルレティキュリン及び１以上の緩衝剤を含む医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、眼内投与用に処方されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項21】

前記医薬組成物が、点眼薬として眼に対する局所投与用に、又は眼内硝子体内注射用に処方される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記カルレティキュリンが、請求項６から１１のいずれかで定義される通りである、及び／又は前記医薬組成物が、請求項１３又は１５で定義される濃度でカルレティキュリンを含む、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

請求項２０から２２のいずれかに記載の医薬組成物を含むことを特徴とする、プレフィルド硝子体内シリンジ。

【請求項24】

請求項２０から２２のいずれかに記載の医薬組成物と、定量の前記医薬組成物を眼に投薬するためのノズルと、を含むことを特徴とする、点眼薬ボトル。

【請求項25】

請求項２０から２２のいずれかに記載の、眼内投与用に処方される医薬組成物を製造する方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ａ）ネイティブなカルレティキュリンシグナル配列及びカルレティキュリンを含むポリペプチドをコードするコード配列を含むヌクレオチド配列で酵母細胞を形質転換することと；
（ｂ）前記カルレティキュリンが分泌形態で発現される条件下で前記酵母細胞を培養することと；
（ｃ）培養培地から前記カルレティキュリンを抽出することと；
（ｄ）前記カルレティキュリンを使用して、眼内投与用に処方される前記医薬組成物を製造することと、
を含むことを特徴とする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、対象における血管新生性眼疾患の治療又は予防に使用するためのカルレティキュリンタンパク質、及び前記使用に好適な医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

眼の血管新生は、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、増殖性糖尿病性網膜症、網膜血管新生、加齢性黄斑変性症、及び血管新生緑内障に関連する失明の主な原因である。特に、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、５０歳以上の人々の視力への不可逆的な損傷の主な原因の１つである。この病気だけでも何百万人もの高齢者を襲い、治療の選択肢は限られており、全て侵襲的処置が必要である。更に、現在の治療は、不快な、そしてしばしば痛みを伴う眼内注射の後に多くの副作用をもたらす。使用される注射剤の殆どは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体である。これらには、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）、及びＥｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト）が含まれる。残念なことに、そのような薬剤の注射後のポジティブな効果は、時間とともに薄れ、その結果、硝子体内注射を更に繰り返す必要が生じる。通常、治療コースは、合計５２週間の治療期間に亘って、４週間毎の注射を含む。それでも、治療のポジティブな効果は長期的には薄れて消える傾向があるため、最終的な結果は、あまり見込みがない。特に、ＡＭＤでは視力（ＶＡ）の初期の向上が長期的に維持されなかったことが報告されてきた（非特許文献１を参照）。抗ＶＥＧＦ治療を使用した最初の視力の向上にもかかわらず、治療された眼の平均ＶＡは、治療が中止された頃にベースラインに落ちるか、又は悪化した（非特許文献２）。

【0003】

抗ＶＥＧＦ治療を無期限に継続されるべきであることが受け入れられる場合、別の問題がある。注射には大量の抗体が必要であり、１回の処置の費用は、通常１，０００ユーロを超える。何年もの間、ＲｏｃｈｅとＮｏｖａｒｔｉｓのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、及びＢａｙｅｒとＲｅｇｅｎｅｒｏｎのＥｙｌｅａ（登録商標）がＡＭＤ治療で優位を占めており、２０１７年の総売上高は９０億ドルを超えている。米国政府が管理する高齢者向けのメディケア健康保険は、２０１６年にＥｙｌｅａ（登録商標）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）だけで３２億５，０００万ドルを費やした。

【0004】

上記に照らして、より効果的でより安価な治療オプションの必要性は、議論の余地がない。更に、患者の観点からは、新しい治療オプションは非侵襲的で痛みがなく、長期的には向上した効果を提供することが望ましい。

【0005】

しかしながら、眼の薬剤送達は、眼の制限的なバリア機能のために、非常に困難な領域である。眼は、眼の前部３分の１であり、硝子体の前の構造を含む前方部と、硝子体、網膜、及び脈絡膜を含む後方部とに分けることができる。局所投与（ＴＡ）は、自己投与が可能であり、非侵襲的であり、患者にとって最も受け入れられるため、最も望ましい投与経路である。しかしながら、角膜層、特に眼の最外層の２つである上皮と実質は、眼の薬剤送達の主要なバリアと見なされている（非特許文献３）。更に、緩衝房水としての涙膜は、２～３分の速い回復時間を示し、殆どの投与された点眼薬／溶液は、最初の１５～３０秒以内に洗い流され、低いバイオアベイラビリティとなる（＜５％）（非特許文献４）。そのため、局所投与（例えば、点眼薬の形態で）は、特定の活性薬剤に対してのみ可能であり、脈絡膜、網膜、又は黄斑を含む血管新生性眼疾患等の後方部疾患の治療には、通常効果的ではない。

【0006】

腫瘍の増殖及び転移における血管新生の重要性のために、抗血管新生化合物及び癌の治療におけるそれらの潜在的な使用について多くの研究がなされてきた。血管内皮増殖因子に対する抗体等、これらの幾つかは、血管新生性眼疾患の治療にも働くことが分かってきた。

【0007】

その抗血管新生効果及び癌治療の可能性について調査されてきた１つのタンパク質及び関連タンパク質断片は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、及びカルレティキュリンのアミノ酸１～１８０（ＶＳ１８０）を含むバソスタチンとして知られる、そのＮ末端断片である。腫瘍増殖に関連したバソスタチンとカルレティキュリンに関する最初の研究では、マルトース結合タンパク質に融合した組換えタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉで生成されたバソスタチン、及びグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質に融合した組換えタンパク質としてＥ．ｃｏｌｉで生成されたカルレティキュリンが、インビトロで内皮細胞（ウシ胎仔心臓内皮細胞）の増殖を阻害し、マウスに皮下注射するとバーキット腫瘍の増殖を阻害した（非特許文献５及び非特許文献６）。関連する特許出願（特許文献１）では、精製されたＢ細胞株の上清から得られた天然のゲル溶出カルレティキュリンが、ウシ胎仔心臓内皮細胞の増殖も阻害したことを報告した。しかしながら、これらの化合物の抗血管新生特性に関する更なる研究の結果は、様々である。別のグループによるその後の研究では、ヒト胎盤から単離されたネイティブなＣＲＴを使用した共培養血管新生アッセイでは、ＣＲＴの抗血管新生効果を実証することはできなかった（非特許文献７）。更に、数例を挙げると、過去１０年間の幾つかの出版物は、ＣＲＴのレベルの上昇が胃癌、膵臓癌、前立腺癌、及び卵巣癌の癌転移に寄与したため、ＣＲＴが腫瘍の進行を促進することがわかったと報告している（例えば、非特許文献８；多くの要約された情報源については、非特許文献９の概説を参照）。更に、非特許文献１０は、ＣＲＴの過剰発現が、血管新生を促進し、胃癌細胞の増殖と遊走を促進することを報告した。

【0008】

眼に関連した血管新生に関する研究は、バソスタチンが、ラットモデルにおいて、点眼薬の形態での局所適用後に、誘発された角膜血管新生及び誘発された脈絡膜血管新生病変の進行を抑制したことを報告した（非特許文献１１及び非特許文献１２）。しかしながら、組換えで発現されたＶＳ１８０が直面した多くの問題があり、主に、このコンストラクトの高い分子量に起因することが報告された。即ち、（ｉ）ＶＳ１８０は、細胞への送達が不十分であった。（ｉｉ）ＶＳ１８０は、血管内皮細胞との結合が容易ではないため、血管新生の阻害効率は低かった。（ｉｉｉ）ＶＳ１８０の水への溶解度と安定性が低いため、点眼薬に製造する際にＶＳ１８０を水に溶解すると、通常、沈殿物が発生した（特許文献２）。したがって、組換えで発現されたＶＳ１８０は、溶解性を高めるために、チオレドキシン（ＴＲＸ）等の標識タンパク質を必要とした。しかしながら、チオレドキシンを結合させた組換えで発現したＶＳ１８０（ＴＲＸ－ＶＳ１８０）は、個体に送達したときに、眼の赤みやかゆみ等を含む、宿主における免疫応答を誘発したため、実用的用途ではまだ不十分であった（特許文献２）。

【0009】

更に、発現されたＶＳ断片をより短いが、なお効果的なペプチドに減らすことを試みた。４８残基のペプチド断片であるバソスタチン４８（ＶＳ４８）は、ＣＲＴの残基１３３～１８０からなり、融合タンパク質ＴＲＸ－ＶＳ４８として発現されると、点眼薬の形態で機能することが分かった（非特許文献１３）。それは、ラットにおいて、眼のレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を治療するために使用された。また、ＴＲＸ－ＶＳ４８は、ウサギでネガティブな免疫応答を誘導することが示され、融合パートナーなしでＶＳ４８ペプチドのみを使用することが提案された（特許文献２）。同じグループは最近、なお活性のあるＣＲＴ抗血管新生ドメイン（ＣＡＤ）断片のサイズを、ＣＡＤ様ペプチド２７（ＣＡＤ２７）と呼ばれる、ＣＲＴの残基１３７～１６３を含む２７残基のペプチドに減らすことができた。それは化学合成によって環状ペプチドとして生成され、レーザー誘発性ＣＮＶのラットモデルにおいて、点眼薬の形態でなお活性であったが、ＣＲＴ断片ＶＳ１８０及びＶＳ４８で以前に示されたよりもはるかに高い濃度であった（非特許文献１４）。その著者らは、硝子体内注射及び局所投与によってそれぞれ投与された場合に、ＣＡＤ２７は、低分子量で、後方部への網膜又は経強膜のより良好な浸透を可能にするため、ＶＳ１８０及びＶＳ４８よりも有利であると報告している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】国際公開第ＷＯ００／２０５７７号（２０００年４月に最初に公開され、２００５年９月２２日に公開された後の特許ファミリー米国特許出願公開第２００５／０２０８０１８ Ａ１号明細書）（Ｔｏｓａｔｏら））

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１３／０２９６２４２ Ａ１号明細書（Ｔａｉら）

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｗｅｃｋｅｒ Ｔ， Ｅｈｌｋｅｎ Ｃ， Ｂｕｈｌｅｒ Ａ， Ｌａｎｇｅ Ｃ， Ａｇｏｓｔｉｎｉ Ｈ， Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ Ｄ， Ｓｔａｈｌ Ａ： Ｆｉｖｅ－ｙｅａｒ ｖｉｓｕａｌ ａｃｕｉｔｙ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏ－ｒｅ－ｎａｔａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＡＭＤ， ＤＭＥ， ＲＶＯ ａｎｄ ｍｙｏｐｉｃ ＣＮＶ． Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２０１７ Ｍａｒ； １０１（３）：３５３－３５９．

【非特許文献2】Ｇｉｌｌｉｅｓ ＭＣ， Ｃａｍｐａｉｎ Ａ， Ｂａｒｔｈｅｌｍｅｓ Ｄ， Ｓｉｍｐｓｏｎ ＪＭ， Ａｒｎｏｌｄ ＪＪ， Ｇｕｙｍｅｒ ＲＨ， ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ ＩＬ， Ｅｓｓｅｘ ＲＷ， Ｍｏｒｌｅｔ Ｎ， Ｈｕｎｙｏｒ ＡＰ； Ｆｉｇｈｔ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ： Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： Ｄａｔａ ｆｒｏｍ ａｎ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． ２０１５ Ｓｅｐ；１２２（９）：１８３７－４５．

【非特許文献3】Ｇａｕｄａｎａ Ｒ， Ａｎａｎｔｈｕｌａ ＨＫ， Ｐａｒｅｎｋｙ Ａ， Ｍｉｔｒａ ＡＫ： Ｏｃｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． ＡＡＰＳ Ｊ． ２０１０ Ｓｅｐ； １２（３）：３４８－６０．

【非特許文献4】Ｂａｒａｒ Ｊ， Ｊａｖａｄｚａｄｅｈ ＡＲ， Ｏｍｉｄｉ Ｙ： Ｏｃｕｌａｒ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２００８ Ｍａｙ；５（５）：５６７－８１．

【非特許文献5】Ｐｉｋｅ ＳＥ， Ｙａｏ Ｌ， Ｊｏｎｅｓ ＫＤ， Ｃｈｅｒｎｅｙ Ｂ， Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ， Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋ， Ｎａｋｈａｓｉ Ｈ， Ｔｅｒｕｙａ－Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ Ｊ， Ｗｉｒｔｈ Ｐ， Ｇｕｐｔａ Ｇ， Ｔｏｓａｔｏ Ｇ： Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ， ａ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ， ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９８ Ｄｅｃ ２１；１８８（１２）：２３４９－５６．

【非特許文献6】Ｐｉｋｅ ＳＥ， Ｙａｏ Ｌ， Ｓｅｔｓｕｄａ Ｊ， Ｊｏｎｅｓ ＫＤ， Ｃｈｅｒｎｅｙ Ｂ， Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ， Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋ， Ｎａｋｈａｓｉ Ｈ， Ａｔｒｅｙａ ＣＤ， Ｔｅｒｕｙａ－Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ Ｊ， Ｗｉｒｔｈ Ｐ， Ｇｕｐｔａ Ｇ， Ｔｏｓａｔｏ Ｇ： Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ａｎｄ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｂｌｏｏｄ． １９９９ Ｏｃｔ １；９４（７）：２４６１－８．

【非特許文献7】Ｆｒｉｉｓ Ｔ， Ｋｊａｅｒ Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｂ， Ｅｎｇｅｌ ＡＭ， Ｒｙｇａａｒｄ Ｊ， Ｈｏｕｅｎ Ｇ： Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ－ｂａｓｅｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． ＡＰＭＩＳ． ２００３ Ｊｕｎ； １１１（６）：６５８－６８．

【非特許文献8】Ｓｈｅｎｇ Ｗ， Ｃｈｅｎ Ｃ， Ｄｏｎｇ Ｍ， Ｚｈｏｕ Ｊ， Ｌｉｕ Ｑ， Ｄｏｎｇ Ｑ， Ｌｉ Ｆ： Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４ Ｊｕｌ；２２９（７）：８８７－９７．

【非特許文献9】Ｅｇｇｌｅｔｏｎ Ｐ， Ｂｒｅｍｅｒ Ｅ， Ｄｕｄｅｋ Ｅ， Ｍｉｃｈａｌａｋ Ｍ： Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ， ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ？ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ． ２０１６ Ｓｅｐ； ２０（９）：１１３７－４７．

【非特許文献10】Ｃｈｅｎ ＣＮ， Ｃｈａｎｇ ＣＣ， Ｓｕ ＴＥ， Ｈｓｕ ＷＭ， Ｊｅｎｇ ＹＭ， Ｈｏ ＭＣ， Ｈｓｉｅｈ ＦＪ， Ｌｅｅ ＰＨ， Ｋｕｏ ＭＬ， Ｌｅｅ Ｈ， Ｃｈａｎｇ ＫＪ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ． ２００９ Ｆｅｂ； １６（２）：５２４－３３．

【非特許文献11】Ｗｕ ＰＣ， Ｙａｎｇ ＬＣ， Ｋｕｏ ＨＫ， Ｈｕａｎｇ ＣＣ， Ｔｓａｉ ＣＬ， Ｌｉｎ ＰＲ， Ｗｕ ＰＣ， Ｓｈｉｎ ＳＪ， Ｔａｉ ＭＨ： Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｌｏｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ． Ｍｏｌ Ｖｉｓ． ２００５ Ｊａｎ １３；１１：２８－３５．

【非特許文献12】Ｓｈｅｕ ＳＪ， Ｂｅｅ ＹＳ， Ｍａ ＹＬ， Ｌｉｕ ＧＳ， Ｌｉｎ ＨＣ， Ｙｅｈ ＴＬ， Ｌｉｏｕ ＪＣ， Ｔａｉ ＭＨ： Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ． Ｍｏｌ Ｖｉｓ． ２００９ Ｓｅｐ １８；１５：１８９７－９０５．

【非特許文献13】Ｂｅｅ ＹＳ， Ｓｈｅｕ ＳＪ， Ｍａ ＹＬ， Ｌｉｎ ＨＣ， Ｗｅｎｇ ＷＴ， Ｋｕｏ ＨＭ， Ｈｓｕ ＨＣ， Ｔａｎｇ ＣＨ， Ｌｉｏｕ ＪＣ， Ｔａｉ ＭＨ： Ｔｏｐｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ， ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ ４８， ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｍｏｌ Ｖｉｓ． ２０１０ Ａｐｒ ２８；１６：７５６－６７．

【非特許文献14】Ｂｅｅ ＹＳ， Ｍａ ＹＬ， Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｔｓａｉ ＰＪ， Ｓｈｅｕ ＳＪ， Ｌｉｎ ＨＣ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｌｉｕ ＧＳ， Ｔａｉ ＭＨ： Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ Ａｎｔｉ－Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｄｏｍａｉｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１８ Ｓｅｐ ３０；１９（１０）． ｐｉｉ： Ｅ２９９３．

【発明の概要】

【0012】

血管新生性眼疾患の治療又は予防に使用するためのカルレティキュリンが、本明細書に記載されている。特に、本発明は、対象における血管新生性眼疾患の治療又は予防における使用のためのカルレティキュリンを提供し、前記カルレティキュリンは、医薬組成物に含まれる。

【0013】

第２の態様では、本発明は、対象における血管新生性眼疾患を治療又は予防する方法を提供し、有効量の前記カルレティキュリンを前記患者の眼に投与することを含み、前記カルレティキュリンは、医薬組成物に含まれる。

【0014】

本発明はまた、カルレティキュリン（ＣＲＴ）が血管新生性眼疾患の治療に効果的であることを実証する実験データを提供する。特に、提供されたデータは、硝子体内投与及び局所投与によって投与された場合、カルレティキュリンが脈絡膜血管新生の治療に効果的であることを示している。これらの結果は、非常に予想外である。なぜなら、発明者の知る限りでは、異なる臓器を隔てるバリア、特に幾つかの体表面上皮バリアを通過するＣＲＴに関するデータがなく、その分野の専門家の間で、ＣＲＴは上皮バリアを通過することができないという幅広い意見があるからである。更に、上述されるように、Ｔａｉら（２０１３年）は、バソスタチンは、その高い分子量のためにうまく機能せず、複数の問題をもたらすことを示してきた。したがって、著者らのグループは、断片のサイズを可能な限り小さなペプチドに減らすために多大な努力を払ってきた。著者らの研究では、より大きなタンパク質断片又はタンパク質が効果的である可能性があるというヒントや示唆はない。

【0015】

これとは対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、全長高分子量カルレティキュリンタンパク質が眼の異なる層を通過することができ、硝子体内投与及び局所投与後に効果的であることを示した。最も驚くべきことに、眼へのＣＲＴの局所投与は、Ｔａｉのグループによって報告されたバソスタチン断片の効果よりも顕著なポジティブな効果を示した（以前の報告におけるバソスタチンの場合の約５０％の減少と比較して、ＣＮＶ病変の７０％以上の減少）。局所投与が比較的容易であるため（硝子体内注射と比較して）、これらの知見は、非常に重要である。

【0016】

第３の態様では、本開示は、カルレティキュリンと、１以上の緩衝剤と、を含む医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、眼内投与用に処方される。

【0017】

第４の態様では、本発明は、上記の医薬組成物を含むプレフィルド硝子体内シリンジを提供する。

【0018】

第５の態様では、本発明は、上記の医薬組成物と、定量の前記医薬組成物を眼に投薬するためのノズルと、を含む点眼薬ボトルを提供する。

【0019】

第６の態様では、本発明は、第３の態様に関連して、上記のように眼内投与用に処方された医薬組成物を製造する方法を提供し、前記方法が、以下の工程：
（ａ）ネイティブなカルレティキュリンシグナル配列及びカルレティキュリンを含むポリペプチドをコードするコード配列を含むヌクレオチド配列で酵母細胞を形質転換することと；
（ｂ）前記カルレティキュリンが分泌形態で発現される条件下で前記酵母細胞を培養することと；
（ｃ）培養培地から前記カルレティキュリンを抽出することと；
（ｄ）前記カルレティキュリンを使用して、眼内投与用に処方される前記医薬組成物を製造することと、を含む。本発明の好ましい特徴は、従属請求項に定義される。

【0020】

この要約は、以下の詳細な説明で更に説明される簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供される。この要約は、請求項に係る主題の主要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図していなければ、請求項に係る主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。また、請求項に係る主題は、本明細書に記載されている不利な点のいずれか又は全てを解決する実施に限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0021】

本開示の理解を助け、実施形態がどのように実施されることができるかを示すために、例として、以下の添付の図面を参照する。

【0022】

【図1】 図１は、各経過観察時点でのＣＮＶ病変のパーセンテージを示すグラフである。Ｅｙｌｅａ（登録商標）及びＣＲＴの硝子体内（ＩＶＴ）注射の結果、並びにＰＢＳビヒクルのＩＶＴ及びＴＡの結果は、破線で示される。様々な濃度でのＣＲＴのＴＡの結果は、実線で示される。白抜きの記号は、ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）を示し、塗りつぶしの（黒）記号は、含まれる化合物（Ｅｙｌｅａ（登録商標）及びＣＲＴ）による処置を示す。

【0023】

【図2】 図２は、治癒されたＣＮＶ病変のパーセンテージを示すグラフであり、各経過観察時点での治療効果を示す。

【0024】

【図3】 図３は、様々な処置群のマウスの体重を示すグラフである。データは、群当たり４頭のマウスの平均±ＳＤとして表される。データは、二元配置分散分析及びその後のシダックの事後検定によって統計的に分析された。処置群間で有意差は観察されなかった。

【0025】

【図4】 図４は、血管漏出における様々な処置群間の違いを示すチャートである。結果は、ベースライン（０日目）と比較した処置終了時（１４日目）での血管漏出面積の変化率として提供される。カラムは平均変化を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。

【0026】

【図5】 図５は、５日目の片眼（マウス番号２２、ビヒクルで処置された（ＩＶＴ）群）のイメージングセッションから得られた１２の代表的な画像を示す。一連の最初の画像（上段、左端）は、表面網膜層のレベルに焦点を合わせ、フルオレセイン注射の前に撮影された赤外線反射画像である。画像２～６（上段の左から２番目～上段の右端）は、網膜レベルに焦点を合わせ、６０秒間隔でフルオレセインの皮下投与の直後に獲得された蛍光眼底造影（ＦＡ）画像である。一連の７番目の画像（下段、左端）は、脈絡膜レベルに焦点を合わせ、フルオレセイン注射前に撮影された赤外線反射画像である。画像８～１２（下段の左から２番目から下段の右端）は、脈絡膜レベルで焦点を合わせ、６０秒間隔でフルオレセインの注射の直後に撮影されたＦＡ画像である。レーザースポットでのフルオレセインの漏出は、イメージングセッション全体（５分）で増加する。

【0027】

【図6】 図６は、様々な経過観察時点（マウス番号１６、Ｅｙｌｅａ（登録商標）で処置された群）における各病変から獲得された、代表的なボリュームインテンシティ投影（ＶＩＰ、眼底）及び関連するＢスキャン画像を示す。Ｂスキャン画像の各段は、イメージングの様々な時点の各レーザースポット（円で囲まれている）でのＣＮＶの発生を示し、Ｂスキャン画像の一番上の段は、図の左側の画像の上の円に関連し、Ｂ－スキャン画像の中央の段は、図の左側の画像の中央の円に関連し、Ｂスキャン画像の下の段は、図の左側の画像の下の円に関連している。

【0028】

【図7】 図７は、様々な処置群からマウスの例を使用したＦＡ分析の代表的な画像を示す。研究の示された時点での各処置群からの個々のマウスの表面網膜のレベル及び同じ眼の脈絡膜レベルの両方において、焦点を合わせてフルオレセイン注射の５分後に、ＦＡ画像を撮影した。

【0029】

【図8】 図８は、様々なｐＨでの＋２２℃で３か月間のインキュベーション後のＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。サンプルを含むレーンは次のように示される：Ｍ－タンパク質分子量マーカー；１－インキュベーション（０時間）前に採取したコントロールＣＲＴタンパク質サンプル；２－コハク酸緩衝液、ｐＨ５．０におけるインキュベーション後のＣＲＴ；３－コハク酸緩衝液、ｐＨ６．０におけるＣＲＴ；４－１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０におけるＣＲＴ；５－トリス緩衝液、ｐＨ８．０におけるＣＲＴ；６－トリス緩衝液、ｐＨ９．０におけるＣＲＴ；７－１５０ｍＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液、ｐＨ７．５におけるＣＲＴ；８－１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４におけるＣＲＴ；９－１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４におけるＣＲＴ（室温でのインキュベーションの前に８５℃で３分間の熱ショックを行った）。

【0030】

【図9】 図９は、様々なｐＨでの＋３７℃で１５日間のインキュベーション後のＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。ゲルレーンにおけるサンプルの表示は、図８と同じである。

【0031】

【図10】 図１０は、様々なｐＨでの＋３７℃で９日間又は１０日間のインキュベーション後のＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。ゲルレーンＭ及び１～８のサンプルの表示は、図８と同じである（レーン２～８のサンプルは、＋３７℃で９日間のインキュベーション後に採取された）。レーン９では、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４におけるＣＲＴサンプルを、＋３７℃で１０日間のインキュベーション後にロードした（インキュベーション前に高温で予熱することなく）。

【0032】

【図11A】 図１１Ａは、様々な温度で９か月間の保存後の、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における様々なタンパク質濃度でのＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。図１１Ａは、２．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液から採取したＣＲＴタンパク質を含むゲルを示す。 レーンにおけるサンプルは、次のように示される：Ｍ－タンパク質分子量マーカー；Ｓｔ．－安定性研究の開始点（０日目）で同じタンパク質濃度の溶液から採取したコントロールＣＲＴサンプル；Ｂｌ．－ブランクレーン。他のレーンでは、ＣＲＴサンプルが９か月間インキュベーションされた温度が示される。

【図11B】 図１１Ｂは、様々な温度で９か月間の保存後の、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における様々なタンパク質濃度でのＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。図１１Ｂは、２５μｇ／ｍｌの濃度の溶液から採取したＣＲＴタンパク質を含むゲルを示す。 レーンにおけるサンプルは、次のように示される：Ｍ－タンパク質分子量マーカー；Ｓｔ．－安定性研究の開始点（０日目）で同じタンパク質濃度の溶液から採取したコントロールＣＲＴサンプル；Ｂｌ．－ブランクレーン。他のレーンでは、ＣＲＴサンプルが９か月間インキュベーションされた温度が示される。

【図11C】 図１１Ｃは、様々な温度で９か月間の保存後の、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における様々なタンパク質濃度でのＣＲＴの安定性を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真を示す。図１１Ｃは、２５０μｇ／ｍｌの濃度の溶液から採取したＣＲＴタンパク質を含むゲルを示す。 レーンにおけるサンプルは、次のように示される：Ｍ－タンパク質分子量マーカー；Ｓｔ．－安定性研究の開始点（０日目）で同じタンパク質濃度の溶液から採取したコントロールＣＲＴサンプル；Ｂｌ．－ブランクレーン。他のレーンでは、ＣＲＴサンプルが９か月間インキュベーションされた温度が示される。

【0033】

【図12A】 図１２Ａは、様々なタンパク質濃度における様々な温度でのインタクトなＣＲＴ形態のパーセンテージを示すグラフであり、各経過観察時点での溶液中のタンパク質の完全性と安定性を示す。パーセンテージは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのスキャニングデンシトメトリーによって決定された。図１２Ａは、２．５μｇ／ｍｌの濃度でのＣＲＴの安定性を示す。 グラフに示されるように、＋５℃、＋２２℃、及び＋３７℃の３つの異なる温度で９か月（２７０日目）間、溶液中で安定性試験を実施した。

【図12B】 図１２Ｂは、様々なタンパク質濃度における様々な温度でのインタクトなＣＲＴ形態のパーセンテージを示すグラフであり、各経過観察時点での溶液中のタンパク質の完全性と安定性を示す。パーセンテージは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのスキャニングデンシトメトリーによって決定された。図１２Ｂは、２５μｇ／ｍｌの濃度でのＣＲＴの安定性を示す。 グラフに示されるように、＋５℃、＋２２℃、及び＋３７℃の３つの異なる温度で９か月（２７０日目）間、溶液中で安定性試験を実施した。

【図12C】 図１２Ｃは、様々なタンパク質濃度における様々な温度でのインタクトなＣＲＴ形態のパーセンテージを示すグラフであり、各経過観察時点での溶液中のタンパク質の完全性と安定性を示す。パーセンテージは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのスキャニングデンシトメトリーによって決定された。図１２Ｃは、２５０μｇ／ｍｌの濃度でのＣＲＴの安定性を示す。 グラフに示されるように、＋５℃、＋２２℃、及び＋３７℃の３つの異なる温度で９か月（２７０日目）間、溶液中で安定性試験を実施した。発明の詳細な説明

【0034】

上記のように、本開示は、対象における血管新生性眼疾患の治療又は予防におけるカルレティキュリンの医学的使用に関する。同様に、本開示は、対象における血管新生性眼疾患を治療又は予防する方法を提供し、前記対象に有効量のカルレティキュリンを投与することを含む。

【0035】

血管新生性眼疾患は、眼の異常な血管新生を伴い、組織機能の障害（例えば、視力の喪失）を引き起こす疾患である。これらの疾患は、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、及び網膜血管新生の１以上を伴うことがある。好ましくは、前記血管新生性眼疾患は、脈絡膜血管新生を含むものである。

【0036】

前記血管新生性眼疾患は、黄斑変性症、増殖性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、及び角膜血管新生（例えば、感染性又は炎症性プロセスに続発する角膜血管新生）から選択されることができる。好ましくは、前記血管新生性眼疾患は、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑変性症、及び血管新生緑内障から選択されることができる。最も好ましくは、前記血管新生性眼疾患は、滲出型加齢性黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）である。

【0037】

前記対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又はネコやイヌ等の飼育哺乳動物を含む任意の哺乳動物であることができる。好ましくは、前記対象は、ヒトである。

【0038】

カルレティキュリンは、幅広い種に見られ、高度に保存された配列を有する、小胞体タンパク質である。特に、ヒトでは、カルレティキュリンタンパク質は、分子量４６ｋＤａを有する４００アミノ酸タンパク質である。

【0039】

前記カルレティキュリンは、成熟タンパク質（タンパク質前駆体ではない）、即ち、翻訳後修飾を受け、特に転座シグナルが除去させたものと称されることができる。ヒトでは、転座シグナルは、４１７アミノ酸のタンパク質前駆体から切断された１７アミノ酸の疎水性Ｎ末端シグナル配列である。ヒトカルレティキュリン前駆体の配列（即ち、１７アミノ酸の転座シグナルを含む）は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおけるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２７７９７で見ることできる。成熟ヒトカルレティキュリンタンパク質は、配列番号１を有し、これは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２７７９７から１７アミノ酸の転座配列を引いた配列である。

【0040】

前記カルレティキュリンは、全長タンパク質と称されることができ、バソスタチンのようなカルレティキュリンの単なる断片ではなく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなる、野生型の成熟カルレティキュリンタンパク質の元の長さを保持していることを意味する。若しくは、本発明のカルレティキュリンは、タンパク質のＮ末端又はＣ末端で、１～５０アミノ酸、好ましくは１～２０アミノ酸以下、最も好ましくは１～１０アミノ酸以下の除去又は付加を含むことができ、付加／欠失を有するカルレティキュリンが、本明細書に記載のタンパク質の機能を保持しているという条件で、例えば、血管新生性眼疾患を治療する能力を決定するのに好適なインビトロアッセイの比較対照において、付加／欠失を有するカルレティキュリンは、対応する野生型成熟カルレティキュリン（配列番号１を有するカルレティキュリン等）と少なくとも同程度に（＋／－１０％）、効果を有する。好適なインビトロアッセイは、（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＵＭＶＥＣ）、又は正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）等の細胞株を使用した）細胞増殖アッセイ、（ＨＵＶＥＣとＮＨＤＦ、又はＨＵＭＶＥＣとＮＨＤＦ等の細胞株の組合せを使用した）共培養アッセイ、及び（トランス）マイグレーション又は走化性アッセイである。好ましい前記インビトロアッセイは、細胞増殖アッセイである。好ましくは、アミノ酸の除去又は付加は、タンパク質タグの付加等の付加である。より好ましくは、アミノ酸の除去又は付加は、Ｎ末端でのタンパク質タグの付加である。

【0041】

本発明の幾つかの例では、前記カルレティキュリンは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも８５％又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、又は、からなることができる。好ましくは、前記カルレティキュリンは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、又は、からなる。より好ましくは、前記カルレティキュリンは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、又は、からなる。特に、カルレティキュリンの多様体は、様々な動物からの相同配列及び当技術分野において既に知られている非病性多型から知られる。好適な多様体はまた、単一アミノ酸置換、特に保存的置換に基づいて作製されることができ、本明細書に記載の機能を保持する（例えば、上記のインビトロアッセイによって決定される）。

【0042】

前記カルレティキュリンは、真核細胞から得られることができ、特に真核細胞での組換え発現によって得られることができる。好ましくは、前記カルレティキュリンは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞における組換え発現によって調製される。特に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｉｐｌｙｓら（２０１４及び２０１５）に記載されるように、カルレティキュリンは、そのネイティブなシグナル配列を含むヒトカルレティキュリン前駆体の発現後の培養培地へのネイティブな組換えタンパク質の分泌に基づいた組換えタンパク質産生技術を用いて、調製されることができる。

【0043】

特定の例では、前記医薬組成物中の前記カルレティキュリンの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、モノマー形態である。少なくとも９０％が好ましく、９５％がより好ましい。前記医薬組成物中の前記カルレティキュリンのモノマー形態は、Ｃｉｐｌｙｓら（２０１５）によって実証されるように、ネイティブＰＡＧＥ又はブルーネイティブＰＡＧＥ等の未変性ＰＡＧＥ、及びＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）によって、確認されることができる。

【0044】

具体的には、本発明者らは、酵母分泌組換えＣＲＴは、例えば、Ｐｉｋｅら（１９９９）によって記載されるもの等の先行技術研究で用いられ、細菌Ｅ．ｃｏｌｉ中の細胞内タンパク質として生成される先行技術の組換えＣＲＴとは構造的に異なると考える。このようなタンパク質は、疎水性のＮ末端シグナル配列が除去されてなく、カルレティキュリン等の複雑な真核生物タンパク質の発現が、原核細胞の細胞基質において、ＭＢＰやＧＳＴ等の細菌タンパク質タグへの融合として、組換え生成物の構造に影響を与える恐れがある。更に、本発明者らは、彼らの手によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＣＲＴの調製が、高度のオリゴマー化及び二量体化タンパク質を有する生成物をもたらすことを見出した。Ｅ．ｃｏｌｉで生成された組換えＣＲＴとは対照的に、本発明者らは、酵母培養培地から分泌及び精製されたヒトＣＲＴが、専らモノマータンパク質であることを見出した（Ｃｉｐｌｙｓら、２０１５）。

【0045】

理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本明細書で実証される血管新生性眼疾患の治療及び予防は、インビボで、おそらくカルレティキュリンの投与によって誘発される複数の経路を介して、内皮細胞の増殖及び分化の直接阻害、又は血管新生の間接阻害、又は異常な血管新生の矯正及びその病理学的結果に関連することができると考える。実施例１に記載された本研究において、ＣＲＴが、脈絡膜血管新生のマウスモデルにおいて、硝子体内（ＩＶＴ）注射後及び点眼剤の形態での局所適用（ＴＡ）後に、ポジティブコントロールとして使用された薬剤Ｅｙｌｅａ（登録商標）の硝子体内注射と比較して、強いポジティブな結果を示したことが記載される（図１に示される結果を参照）。ＣＲＴがわずか５００ｎｇ／眼（眼の硝子体内注射当たり２μＬ）の用量で使用されたのに対し、Ｅｙｌｅａ（登録商標）の用量は、４０μｇ／眼（眼の硝子体内注射当たり２μＬ）であり、即ちＣＲＴは、ポジティブコントロール薬剤の８０倍低い用量で使用されたことは注目すべきである。本発明者らは、等しい濃度又はモル比でのＣＲＴ対Ｅｙｌｅａ（登録商標）のＩＶＴ注射の比較は、ＣＲＴが数倍効率的であることを示すことを予想している。ＴＡの場合、局所投与された全てのＣＲＴ群は、ビヒクル群と比較してより良い効果を示した。低濃度の局所投与されたＣＲＴは、高濃度よりもより効果的であり、最高の１００倍希釈で最もポジティブな効果が観察された（作用濃度２．５μｇ／ｍｌ；容量１２．５ｎｇ／眼、眼局所投与当たり５μＬ、１日３回繰り返した）。

【0046】

理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、より低い用量でのＣＲＴのＴＡのより高い有効性は、タンパク質の固有の特性によって説明されることができると考える。３７～４０℃の生理学的温度で、ＣＲＴは二量体化及びオリゴマー化を開始することが示されている（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、２００３；Ｍａｎｃｉｎｏら、２００２）。更に、ＣＲＴのオリゴマーは、本来の生理学的条件ではモノマーに戻ることができない（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、２００３）。より高い濃度では、相互作用のためのタンパク質分子の増加した利用可能性のため、前記ＣＲＴは、より速く二量体化／オリゴマー化することがあり、そのような二量体／オリゴマーは、ＴＡ後に大き過ぎて眼に入らないことがある。したがって、局所投与の場合に最良の治療的効果を達成するために、主にモノマー形態でタンパク質を維持するより低い作用濃度が必要であることがある。

【0047】

観察された効果をより良く視覚化し比較するために、主なデータを図２に再び示し、ビヒクル単独の投与の効果に対して規格化した治癒されたＣＮＶ病変（レーザーによって誘発された全病変からの％）を示す（それぞれ、ＩＶＴビヒクルに対するＩＶＴ化合物、ＴＡビヒクルに対するＴＡ ＣＲＴの投与）。Ｅｙｌｅａ（登録商標）のポジティブな効果は５日後に消え、その後１０日後に回復することが認められることができる。ＣＲＴ適用の場合、タンパク質投与方法に関係なく、ポジティブな効果はより安定して継続する（図１及び図２）。

【0048】

したがって、本明細書に記載される使用は、硝子体内注射又は局所的によって、ＣＲＴを含む医薬組成物の投与を含むことができる。好ましくは、前記使用は、局所投与（ＴＡ）を含む。幾つかの例では、前記医薬組成物が硝子体内注射によって眼に投与される場合、前記組成物は、２５μｇ～５０ｍｇ／ｍｌの濃度でカルレティキュリンを含むことができる。幾つかの例では、前記医薬組成物が、例えば、点眼薬の形態で、眼に局所的に投与される場合、前記医薬組成物は、２５ｎｇ／ｍｌ～２５０μｇ／ｍｌ、好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌの濃度でカルレティキュリンを含むことができる。

【0049】

局所投与又は硝子体内注射による投与の好適な量は、治療される眼のサイズに依存し、当技術分野で知られている。ヒトの眼の場合、硝子体内注射は、０．０１ｍｌ～０．１ｍｌの範囲であることができるが、通常は０．０４～０．０６ｍｌの範囲である。ヒトの眼への局所投与の場合、５～７０μｌの量が使用されることができる。

【0050】

実施例１に記載された研究は、血管新生性眼疾患の治療に重要な意味を持つ異なる作用機序を更に明らかにした。ＣＲＴの治療的活性は、２つの並行する効果に分けることができる。即ち、高いＣＲＴ濃度の適用後（主にＩＶＴ注射後）すぐにスタートする「効果Ｉ」、及び低いＣＲＴ濃度によって誘発され、ＴＡによる治療開始後約１週間後にスタートする「効果ＩＩ」である（図２）。

【0051】

更に、ＣＲＴのＩＶＴ投与後の効果Ｉ及びＣＲＴのＴＡによって誘発される効果ＩＩは、時間的に異なるだけでなく、異なるペースを有することにも留意されたい。ＩＶＴ注射は、即時の治療効果をもたらすが、より遅い速度で起こる。一方、ＣＲＴのＴＡは、顕著に遅延した治療を示すが、この効果はスタート時により速く発生する（図２）。治療コースの最後（１４日目）に、ＩＶＴ（単回注射）とＴＡ（点眼薬の複数回投与）の両方の投与が、使用された同じ量のＣＲＴタンパク質をもたらし（マウスの眼当たり約５００ｎｇ）、最終的に効果ＩＩが、効果Ｉ（＞５０％）よりも多い完全に治癒されたＣＮＶ病変（＞７０％）を示す。したがって、ＣＲＴ点眼薬の非侵襲的で痛みのないＴＡは、様々な血管新生性眼疾患に関連する血管新生の重要な治療選択肢であることが明らかになる。更に、血管新生性眼疾患の治療のためのＣＲＴタンパク質の治療的使用の発見に加えて、結果は、効果Ｉと効果ＩＩが異なり、それらのポジティブな影響が相加的であり、並列に発生できることを示唆する。

【0052】

結果として、本開示によれば、本明細書に記載される医学的使用は、局所投与及び硝子体内注射の併用を含むことができる。例えば、カルレティキュリンを含む医薬組成物は、カルレティキュリンを含む医薬組成物の少なくとも１回の硝子体内注射を受けた対象に、局所的に投与されることができる。若しくは、カルレティキュリンを含む医薬組成物は、カルレティキュリンを含む医薬組成物の局所投与を受けた対象に、硝子体内注射によって投与されることができる。

【0053】

更に、本明細書に記載される対象における血管新生性眼疾患の治療又は予防の方法は、硝子体内注射によって対象に有効量のカルレティキュリンを投与することと、局所投与によって前記対象に有効量のカルレティキュリンを投与することと、を含むことができる。

【0054】

幾つかの例では、カルレティキュリンの医学的使用は、抗血管新生剤と併用して、別々の、又は連続した使用を含み、好ましくは、前記カルレティキュリンは、局所投与によって投与される医薬組成物に含まれることができる。同様に、治療又は予防の方法は、抗血管新生剤を併用して、連続して又は別々に投与することを含むことができる。特に、前記抗血管新生剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤であることが好ましく、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びアフリベルセプトから選択されることがより好ましい。前記抗血管新生剤は、アフリベルセプトであることが最も好ましい。

【0055】

具体的には、承認された抗ＶＥＧＦ薬剤Ｅｙｌｅａ（登録商標）が、異なる作用機序を示唆する研究の時点の間、両方のＣＲＴ適用とは異なる効果を示したことを実験結果が示していることに留意されたい。したがって、他の抗血管新生剤の併用、具体的にはＥｙｌｅａ（登録商標）（アフリベルセプト）等の血管内皮増殖因子の阻害剤の併用、特に、前記併用が、点眼薬の形態のＣＲＴのＴＡである場合に、相乗効果を有する。その理由は、この場合、Ｅｙｌｅａ（登録商標）の効果が薄れ始めたときに、ＣＮＶ病変のＣＲＴ特異的治癒がスタートするからである。

【0056】

上記のように、本開示はまた、上記のカルレティキュリンを含む医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、眼での使用に好適であり、特に、眼内投与のために処方され、例えば、硝子体内注射のために処方される、又は点眼薬等の、眼への局所投与のために処方される。前記医薬組成物は、点眼薬として処方されることが好ましい。

【0057】

幾つかの例では、前記医薬組成物のｐＨは、７．０～９．０、好ましくは７．０～８．２、より好ましくは７．２～８．０の範囲である。好ましくは、前記医薬組成物が眼への局所投与のために処方される場合、前記医薬組成物のｐＨは、７．２～７．６である。

【0058】

幾つかの例では、１以上の緩衝剤は、５ｍＭ～２０ｍＭ（好ましくは２０ｍＭ未満）の範囲の点眼薬を緩衝するための濃度を有するリン酸塩であり、前記医薬組成物のｐＨは、７．０～７．６、又は好ましくは７．２～７．６の範囲である。別の例では、１以上の緩衝剤は、１０ｍＭ～１３０ｍＭの濃度範囲のトリスであり、前記医薬組成物のｐＨは、７．２～８．５、好ましくは７．２～８．２の範囲である。

【0059】

前記医薬組成物は、本発明の第１の態様及び第２の態様の医学的使用に関連して本明細書に記載されるようなカルレティキュリンの濃度を有することができる。前記医薬組成物のカルレティキュリンは、本発明の第１の態様及び第２の態様における医学的使用に関連して本明細書に記載されている通りであることができる。

【0060】

幾つかの例では、前記医薬組成物は、前記カルレティキュリン及びＰＢＳ又はトリス緩衝液からなることができる。代替の例では、前記医薬組成物は、界面活性剤、張性調整剤、保存剤、又は透過促進剤からなる群から選択される１以上の追加の成分を含むことができる。特に、前記医薬組成物は、生理学的濃度の生理食塩水を含むことができる。

【0061】

幾つかの例では、前記医薬組成物は、凍結又は凍結乾燥されることができる。

【0062】

本開示の第４の態様及び第５の態様によれば、前記医薬組成物は、貯蔵及び使用のために包装されることができる。具体的には、本開示は、上記の医薬組成物を含む、硝子体内注射用のプレフィルドシリンジを提供する。更に、本開示は、取り外し可能なキャップと、上記の医薬組成物と、定量の前記医薬組成物を眼に投薬するためのノズルと、を含む点眼薬ボトル又はディスペンサーを提供する。特に、前記定量の容量は、５～７０μｌの範囲、好ましくは５～５５μｌの範囲であることができる。前記点眼薬ボトル又はディスペンサーは、１０μｌ～１０ｍｌ、好ましくは２０μｌ～１０ｍｌの容量を有することができる。前記ボトル又はディスペンサーは、各眼に５～７０μｌの１つの定量された容量を投与することができるのに十分な容量を含むことができる。若しくは、前記ボトル又はディスペンサーは、各眼に複数の定量された容量を投与することができるのに十分な容量を含むことができる。この例では、前記ボトル又はディスペンサーのキャップをノズルに再度取り付けることができるため、前記点眼薬ボトル又はディスペンサーは、数日又は数週間に亘って再利用されることができる。

【0063】

第６の態様では、本発明は、第３の態様に関連して、上記のように眼内投与用に処方された医薬組成物を製造する方法を提供し、前記方法が、以下の工程：
（ａ）ネイティブなカルレティキュリンシグナル配列及びカルレティキュリンを含むポリペプチドをコードするコード配列を含むヌクレオチド配列で酵母細胞を形質転換することと；
（ｂ）前記カルレティキュリンが分泌形態で発現される条件下で前記酵母細胞を培養することと；
（ｃ）培養培地から前記カルレティキュリンを抽出することと；
（ｄ）前記カルレティキュリンを使用して、眼内投与用に処方される前記医薬組成物を製造することと、を含む。

【0064】

特に、本明細書の他の箇所で言及されるように、本発明のカルレティキュリンは、上記のように、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる、Ｃｉｐｌｙｓら（２０１４及び２０１５）に記載される方法に従って調製されることができる。更に、本開示の方法は、本開示の第３の態様に従って、上記でより詳細に説明される、眼内投与用に処方された医薬組成物の製造において前記カルレティキュリンを利用する。

【0065】

以下は例としてのみ意図されており、本開示を限定するものではない。

【実施例】

【0066】

実施例１
この研究は、マウスレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおける脈絡膜血管新生に対するアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））及びカルレティキュリンの抗血管新生効果を比較するために実施された。

【0067】

３回のレーザー火傷を用いて、オスのＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウス（商業的ベンダー、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ、フランスから供給）でＣＮＶを誘発した。０日目から、研究化合物をＣＮＶ誘導直後に硝子体内に１回投与するか、１日３回局所投与した。参照化合物としてアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））を使用し、眼当たり４０μｇの用量で硝子体内投与した。インビボイメージングを使用してマウスを１４日間追跡調査した。ＣＮＶの誘発直後０日目のベースライン、経過観察の５日目、経過観察の１０日目、及び経過観察の１４日目に、インビボイメージングを実施した。

【0068】

ダイオードレーザーを使用してブルッフ膜に穴を開けることによって、脈絡膜から網膜下血管の成長を動員した。レーザー照射の直後に、ＩＶＴ処置群のマウスに対して処置化合物の片眼の硝子体内（ＩＶＴ）投与を実施した。反対側の眼は、全てのマウスで処置が行われず、コントロールとして機能した。最初のレーザー照射後１４日間、インビボイメージング（蛍光眼底造影（ＦＡ）及びスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ））を使用して、マウスを追跡調査した。

【0069】

合計２９頭のマウスを研究に使用した。本研究では、以下の処置群を使用した。
群１：ＣＮＶ＋ＰＢＳ、眼当たり２μＬの硝子体内注射（ｎ＝４）
群２：ＣＮＶ＋Ｅｙｌｅａ（登録商標）、用量４０μｇ／眼、２０ｍｇ／ｍｌ溶液の眼当たり２μＬの硝子体内注射（ｎ＝４）
群３：ＣＮＶ＋カルレティキュリン、用量５００ｎｇ／眼、２５０μｇ／ｍｌ溶液の眼当たり２μＬの硝子体内注射（ｎ＝４）
群４：ＣＮＶ＋カルレティキュリン、用量１２．５ｎｇ／眼、２．５μｇ／ｍｌ溶液の眼当たり５μＬの局所投与（ｎ＝４）
群５：ＣＮＶ＋カルレティキュリン、用量１２５ｎｇ／眼、２５μｇ／ｍｌ溶液の眼当たり５μＬの局所投与（ｎ＝４）
群６：ＣＮＶ＋カルレティキュリン、用量１２５０ｎｇ／眼、２５０μｇ／ｍｌ溶液の眼当たり５μＬの局所投与（ｎ＝５）
群７：ＣＮＶ＋ＰＢＳ、眼当たり５μＬの局所投与（ｎ＝４）

【0070】

ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ及び動物実験ためのＥＣ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ８６／６０９／ＥＥＣに従って、全ての動物を処置した。８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から購入した。一定温度（２２±１℃）（表１の詳細な環境条件を参照）で、餌と水を自由に摂取できる光制御環境（午前７時から午後７時まで点灯）で、動物を飼育した。最低１週間の隔離と飼育場での順化の後に、実験を開始した。体重をモニターするために、ＣＮＶ誘導前０日目のベースラインで、及び各インビボイメージング時点の間で、マウスの体重を測定した。

【0071】

ＣＮＶ誘発
ケタミン（３７．５ｍｇ／ｋｇ；Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ Ｖｅｔ、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｏｙ ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、エスポー、フィンランド）及びメデトミジン（０．４５ｍｇ／ｋｇ；Ｄｏｍｉｔｏｒ、Ｏｒｉｏｎ Ｏｙ、エスポー、フィンランド）混合物の腹腔内注射によって、全てのマウスを麻酔した。瞳孔を拡張するために、一滴の０．５％トロピカミド（Ｓａｎｔｅｎ Ｏｙ）を角膜に滴下した。局所麻酔として、一滴のオフタンオブカイン（ｏｆｔａｎ ｏｂｕｃａｉｎ）（Ｓａｎｔｅｎ Ｏｙ）を使用した。細隙灯に取り付けられた５３２ｎｍのダイオードＯｃｕｌｉｇｈｔ（登録商標）ＴＸレーザー（Ｉｒｉｄｅｘ Ｃｏｒｐ．、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、レーザー光凝固術を１回実施した。カバースリップとＶｉｓｃｏｔｅａｒｓ（登録商標）ｇｅｌ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ａｌｃｏｎ）を使用して、角膜を圧平した。各マウスの右眼に３つのレーザー損傷を行った。メデトミジンのα２アンタゴニストであるアチパメゾール（５ｍｇ／ｋｇ皮下注射、Ａｎｔｉｓｅｄａｎ、Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ、エスポー、フィンランド）によって、麻酔を直ちにリバースした。

【0072】

試験化合物及び参照化合物
ネイティブなシグナル配列を含むヒトカルレティキュリン前駆体の発現後、培養培地へのネイティブな組換えタンパク質の分泌に基づく組換えタンパク質生成技術を用いて、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、ＵＡＢ Ｂａｌｔｙｍａｓにより組換えヒトカルレティキュリンタンパク質を生成した（Ｃｉｐｌｙｓら、２０１４及び２０１５）。配列番号１のアミノ酸配列を有する最終タンパク質生成物を、ＰＢＳ溶液中で２５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、及び２．５μｇ／ｍｌの濃度（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、及び２．７ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ７．４）に処方し、－８０℃で凍結した。研究全体を通して、実験の前にタンパク質溶液を解凍し、更に＋４℃で保存した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｙ（クオピオ、フィンランド）から、４０ｍｇ／ｍｌの濃度の、ヒトへの硝子体内注射用のための即時使用可能な溶液として、参照化合物アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ）を購入し、使用前に２０ｍｇ／ｍｌに希釈した。

【0073】

治療管理
群１～３の場合、片側に（右眼）ＩＶＴで、参照化合物（Ｅｙｌｅａ（登録商標））、ビヒクル（ＰＢＳ）、及び試験化合物（カルレティキュリン）を一回（レーザー照射及びインビボイメージング直後の０日目に）投与した。５μｌのガラスマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、ボナドゥウ、スイス）を使用して、マウスは２μｌの注射用量を受けた。群４～７の場合、ビヒクル（ＰＢＳ）及び試験化合物（様々な濃度のカルレティキュリン）を１日３回：８：００、１３：００、及び１８：００に局所投与した。動物は、右眼に５μｌの溶液を投与された。

【0074】

インビボイメージング
スペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用したｉｎ ｖｉｖｏイメージングをベースラインで実施し、眼／網膜の病状がないことを確認し、ＳＤ－ＯＣＴと蛍光眼底造影（ＦＡ）を使用してレーザーを照射した直後に、ブルッフ膜をうまく損傷させたことを確認した。経過観察５日目、１０日目、及び１４日目にＳＤ－ＯＣＴとＦＡの両方を使用して、ＣＮＶの進行を追跡調査した。

【0075】

蛍光眼底造影
マウスは、１ｍｌの５％フルオレセインナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｌａｎｄ Ｏｙ、カタログ番号Ｆ６３７７）の腹腔内注射を受けた。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ２システム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ドイツ）を使用して血管漏出を調べた。簡潔に説明すると、マウスホルダーにマウスを配置し、イメージングシステムを前記システムで撮影した最初の赤外線反射画像と合わせた。その後、フルオレセインナトリウムを投与した。フルオレセインナトリウム注射から５分間の期間、網膜及び脈絡膜の焦点レベルから６０秒毎に、連続したＦＡ画像を撮影した。

【0076】

スペクトルドメイン光干渉断層撮影
上記のように麻酔をかけたマウスで、Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２２００ ＳＤ－ＯＣＴシステム（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、ＣＮＶ病変をモニターした。

【0077】

データ解析
全ての画像データ分析は、眼科を専門とし、眼球マウスモデルを使用した同様の研究の経験を持つ、盲検評価者によって、実施された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ．８．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して、定量的データをグラフ化及び分析した。多重比較のための一元配置分散分析検定とテューキー検定を使用して、データを分析した。差は、Ｐ＜０．０５レベルで統計的に有意であると見なされた。

【0078】

結果
１）体重
様々な処置における体重は、全ての研究を通じて研究の開始時と同様であった（表１及び図３を参照）。

【0079】

【0080】

２）ＣＮＶ
ＣＮＶに対する治療の効果を比較するために、ＣＮＶ誘発直後のベースライン０日目、経過観察５日目、１０日目、及び１４日目で獲得されたＦＡ（図５）及びＯＣＴ（図６）画像から、漏出性ＣＮＶ病変の存在を評価した。各処置群における所定の測定時点での漏出ＣＮＶのパーセンテージを比較した（図１）。

【0081】

Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して網膜レベルから取得されたＦＡ画像から、血管漏出面積について、手動で輪郭が描かれた（各動物の値と計算されたスポットは表２に提供される）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを使用して、結果を評価した。平均とＳＥＭを計算し、テューキーの多重比較検定によって処置群間の差の有意性を評価した（分析結果を含むグラフは、図４に提供される）。各群からの動物の例を使用したＦＡによる代表的なイメージングを図７に示す。

【0082】

ＣＮＶ病変の存在の計算（図１）と同様に、Ｅｙｌｅａ（登録商標）及びＣＲＴの両方を使用したＩＶＴ治療は、ＩＶＴコントロール（ビヒクルＰＢＳ単独）と比較して有意な効果を示し、Ｅｙｌｅａ（登録商標）の効果は僅かに強かった。２つの低濃度のＣＲＴ（２．５μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌ）のＴＡは、ＣＲＴのＩＶＴ注入と同様に効果的だった（図４）。

【0083】

【表2-1】

【表2-2】

【0084】

実施例２
本実施例は、眼への適用のための、溶液中の全長ＣＲＴタンパク質を含む治療的調製物の製剤及び長期保存のための最適ｐＨ及び緩衝液組成を定義し、凍結解凍後の前記調製物の安定性を試験するために、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来する組換えＣＲＴタンパク質調製物を使用して実施された安定性試験を記載する。

【0085】

タンパク質の原薬としての使用について、その調製物の長期安定性が非常に重要である。点眼薬の形態でタンパク質を局所適用するには、作用濃度で溶液中の安定性を必要とする。動物の眼への局所適用にＮ末端ＣＲＴ断片バソスタチン（ＣＲＴタンパク質の１～１８０アミノ酸）を使用した以前の研究は、溶液中の安定性分析を含んでいた。前記報告によると、バソスタチンは、メチルセルロース溶液又はＰＢＳのいずれかで作用濃度で、４℃で保存された場合、７日間安定であった（Ｗｕら、２００５；Ｓｈｅｕら、２００９）。公表された結果（Ｗｕら、２００５の図３）から、長い保存は、バソスタチンの完全性の喪失（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で分析）、それによる第二週の保存後の抗血管新生活性の継続的な低下をもたらすことが明らかである。明らかに、このような安定期間は短すぎて便利な治療法を開発することができず、マウスモデルでのＣＮＶの治療コースでさえ３週間かかり（Ｓｈｅｕら、２００９）、使用前の治療的調製物の保管に必要とされる十分な期間は言うまでもない。したがって、特定の安定剤を添加するか、緩衝液の組成、ｐＨ等を変更することによって、バソスタチン調製物の安定性を大幅に改善する必要があるだろう。そのような操作が眼の治療のための意図された用途に適合するかどうかは明らかではない。背景技術の欄で説明されたように、Ｔａｉら（２０１３）は、発現したバソスタチン断片のサイズを小さくすることにより、バソスタチンの適用に関連するこの問題及びその他の問題を解決しようとした。

【0086】

実施例２－１
まず、様々なｐＨで溶液中の組換えＣＲＴタンパク質の安定性を分析した。４～９の範囲の様々なｐＨで、最終濃度０．１Ｍの適切な緩衝液を含む溶液に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから精製された配列番号１を有するＣＲＴタンパク質を移し、０．２ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度で様々な温度（２２℃、３７℃、及び４５℃）でインキュベーションした。ＣＲＴは、ｐＨ４．０（コハク酸緩衝液）で凝集したため、このｐＨは不適切であるとして以降の分析から除外した。様々な時点及び様々な温度で、ｐＨ５～９からのタンパク質サンプルを採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのスキャニングデンシトメトリーで分析した（デンシトメトリースキャナーＢＩＯ－５０００ＰＬＵＳで、ゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ８．１ソフトウェアを使用して、画像を分析した）。インキュベーション前（０時間の時点で）に採取され、各ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでのコントロールとして実行したＣＲＴタンパク質サンプルと比較することによって、インタクトなカルレティキュリンのパーセンテージを計算した。この最初の研究は、３ヶ月間実施した。

【0087】

結果は、室温（＋２２℃）で７～８のｐＨ範囲でＣＲＴは一般的に安定しており、３か月後のインタクトなＣＲＴ形態の量が約９０％以上であると決定されたことを示した（ＣＲＴサンプルを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを図８に示す）。スキャンしたゲルのバンドのデンシトメトリー評価は、非常に正確な分析方法ではなく、最大１０％の測定誤差を示すので、初期コントロールサンプルと比較して、インタクトなＣＲＴ形態の量が９０％以上と計算された場合、タンパク質は安定状態を保っていると考える。

【0088】

ｐＨ５～６でのインキュベーションは、有意なＣＲＴ分解をもたらしたが、ｐＨ９でのインキュベーション後（図８、レーン６）、残存するインタクトなＣＲＴ形態の量は約８０％と計算された。室温でのインキュベーション後のｐＨ区間７～９において、サンプル間のタンパク質安定性の差は、あまり明確ではなかったため、より高温でのインキュベーション後の分析は、より有益であった。

【0089】

ＣＲＴは、生理学的温度よりも高い温度では安定ではないことに留意されるべきである。以前に、ヒト胎盤から単離されたネイティブなＣＲＴが、４０℃を超える温度でオリゴマー化することが実証された（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、２００３）。同様に、組換えＣＲＴも３７～４５℃でオリゴマー化／重合することが報告されている（Ｍａｎｃｉｎｏら、２００２）。オリゴマー化に加えて、ネイティブなヒト胎盤ＣＲＴと酵母由来の組換えＣＲＴの両方が、高温での長時間のインキュベーション後に部分的に分解する傾向があることを認めた。実際、オリゴマー化はＣＲＴの増加した部分分解と一致し、これは図８にも示される。私たちの方法では、タンパク質サンプルを８５℃で３分間保持するだけで、完全にオリゴマー化されたＣＲＴを得ることができた（ネイティブＰＡＧＥで調べた）。このような熱ショック後、オリゴマー化されたＣＲＴは、室温でのインキュベーション中でも部分的に分解したが（図８、レーン９）、８５℃での予熱をしなかった、対応するサンプルのモノマーＣＲＴの分解は、ごく僅かであった（図８、レーン８）。生理学的な４５℃温度より高い温度でのＣＲＴのインキュベーションは、試験された全てのｐＨ値で、タンパク質の急速な部分分解をもたらし、２～３日後又は数日後では、インタクトなＣＲＴ形態は検出されなかった。したがって、タンパク質の安定性の最も有益な指標は、３７℃でのインキュベーションであった。この温度での初期分析は、ＣＲＴが、ｐＨ７．５～８．０のトリス緩衝液で最も安定であることを示した（図９、トリス緩衝液、ｐＨ９．０でＣＲＴを使用したレーン６と比較したレーン５及びレーン７）。リン酸緩衝液中の非常に類似したｐＨ７．４では、タンパク質の安定性がはるかに低いのは、注目に値する。更なる分析は、緩衝リン酸塩の濃度が、ＣＲＴの安定性に特定の影響を与えることを示した。ＮａＣｌを含まないリン酸緩衝液で実験を行い、結果は、ＣＲＴが約７ｍＭ～約１７ｍＭの濃度の範囲で安定化されることを示した。リン酸塩濃度を２０ｍＭ以上に上げると、ＣＲＴの顕著な分解が見られた。したがって、安定したＣＲＴ溶液の処方にリン酸緩衝液を使用する場合、緩衝リン酸塩の濃度は、５～２０ｍＭの範囲である必要があると考える。同様の結果が、ｐＨ７．２又は７．４のいずれかで観察された。したがって、安定したＣＲＴ溶液のためのリン酸緩衝液の推奨されるｐＨは、７．０～７．６の範囲であろう。

【0090】

生理学的濃度の生理食塩水（ＮａＣｌ）をリン酸緩衝液に添加しても、ＣＲＴの安定性に有意な影響はなかった。

【0091】

３７℃でタンパク質サンプルを９～１０日間インキュベーションした後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の例とともに、１０ｍＭリン酸塩濃度でのＣＲＴの改善された安定性を図１０に示す（１０ｍＭリン酸塩でインキュベーションしたＣＲＴを含むレーン９対レーン８における１００ｍＭリン酸塩を含む同様のＣＲＴサンプル）。

【0092】

トリス緩衝液の場合、２０ｍＭ又は１００ｍＭトリス濃度を使用してもＣＲＴの安定性に違いは認められなかった。したがって、安定して機能するＣＲＴタンパク質溶液中のトリスの可能な濃度は、１０ｍＭ～１３０ｍＭであり、緩衝液ｐＨ区間は７．０～８．５である。

【0093】

涙液の生理学的ｐＨは７．４であるため（Ａｇｒａｈａｒｉら、２０１６）、リン酸塩又はトリス緩衝液のいずれかを使用することで、このｐＨにできるだけ近い点眼薬用のＣＲＴ溶液を処方すると都合がよい。リン酸塩とトリスの両方が、米国及びヨーロッパ薬局方の要件に従った医薬品開発に適した緩衝液である。

【0094】

実施例２－２
実施例１に従い、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来する組換えＣＲＴタンパク質調製物を使用して初期凍結／解凍実験を実施した。

【0095】

作製時に、凍結せずにトリス緩衝液で最終精製されたタンパク質調製物の安定性と、保存のために－８０℃で凍結し、更に使用するために解凍したものの安定性とを比較した。５℃、２２℃、又は３７℃での３か月間のインキュベーション後、電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びネイティブＰＡＧＥ）を使用して検査したところ、溶液中の非凍結ＣＲＴサンプルと凍結／解凍ＣＲＴサンプルとの間のタンパク質の完全性に違いは、認められなかった。

【0096】

凍結ＣＲＴサンプルは、原薬の分析に適用される要件に従って開発された幾つかの分析方法によって更に試験された。ＣＲＴタンパク質調製物の純度と均一性は、注射可能な医薬調製物の開発にも十分なレベルであることが分かった。

【0097】

－８０℃又は－２０℃のいずれかで追加の凍結による２回目の凍結／解凍サイクルを実行し、分析試験手順を繰り返した。主な分析方法ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及びネイティブＰＡＧＥを使用して、トリス緩衝液におけるＣＲＴ調製物の２回目の凍結／解凍サイクル後に、同じ結果が得られた。これらの結果は、ＣＲＴタンパク質が、凍結／解凍の追加サイクル後に分解又はオリゴマー化／重合しないことを示唆している。

【0098】

実施例２－３
より長い安定性の研究では、単一のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）緩衝液を選択した。これは、そのｐＨ（７．４）と生理食塩水濃度が、局所的な眼の使用に最適であると思われるからである。マウスＣＮＶモデル（実施例１に記載）でのインビボ研究に使用されたＰＢＳ中の同じＣＲＴタンパク質製剤も、様々な温度での長期安定性について試験した。

【0099】

記載されているように、配列番号１を有するＣＲＴタンパク質（作製／精製後に事前に凍結され、その後解凍された）は、２５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、及び２．５μｇ／ｍｌの３つの作用濃度で、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、及び２．７ｍＭ塩化カリウム、ｐＨ７．４）で処方された。調製されたＣＲＴ溶液をフィルター滅菌し、複数のチューブにアリコートし、－８０℃で再度凍結した。保存後、全てのチューブをほぼ同じ日に解凍し、それらの一部をマウスＣＮＶモデルのインビボ実験で使用したが（実施例１）、他のチューブは５つの群に分け、－８０℃、－２０℃（凍結状態での保管；合計で３回目の凍結サイクル）、５℃、２２℃、及び３７℃（溶液中での保管）の様々な温度での安定性研究のために更にインキュベーションした。９ヶ月間の様々な時点で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の完全性の分析のためにサンプルを採取した。

【0100】

９ヶ月のインキュベーション後の様々なタンパク質濃度の調製物からのＣＲＴを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの例を図１１Ａ～図１１Ｃに示す。全体の長期研究の各時点でのインタクトなＣＲＴ形態の計算されたパーセンテージを図１２Ａ～図１２Ｃに提供する。結果は、５℃又は２２℃の温度でインキュベーションされた場合、２５０μｇ／ｍｌのより高いタンパク質濃度で、ＣＲＴがＰＢＳ溶液中で非常に安定であることを示す（図１１Ｃ及び図１２Ｃ）。希釈されたＣＲＴ溶液は、安定性が低いように見えたが、２５μｇ／ｍｌと２．５μｇ／ｍｌの両方の濃度において、５℃の低温で９か月間インキュベーションした後も、タンパク質はインタクトな状態を保っていた（図１１Ａ及び１１Ｂ、並びに図１２Ａ及び１２Ｂ）。単一のＰＢＳを使用して点眼薬の形態で局所適用用に処方されたＣＲＴは、添加剤なしで、溶液中で４～５℃で保存でき、希釈された作用濃度で少なくとも９か月間安定して機能し続けることができることを示唆する。組換えＣＲＴを含む新しい局所適用薬の開発には十分な安定性を有するように見える。

【0101】

前記結果、又は実施例２－２及び２－３はまた、希釈されたＣＲＴ溶液の長期保存期間が、最終タンパク質調製物を－２０℃で凍結することのみによって大幅に延長されることができることを示唆する。作用濃度で、ＰＢＳ中で凍結した後、ＣＲＴタンパク質を使用して実施例１の研究を行った（合計で、使用されたＣＲＴタンパク質バッチの２回目の凍結解凍であった）。実施例２－３に記載されている安定性研究におけるＣＲＴの３回目の凍結は、－８０℃又は－２０℃のいずれかで保存した後、インタクトな安定したタンパク質を維持した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。

【0102】

まとめると、結果は、タンパク質の完全性と活性を失うことなく、何年にも亘って長期間保存するために、組換えＣＲＴタンパク質調製物を繰り返し凍結することができることを示す。

【0103】

実施例２に記載される結果は、本発明が、硝子体内及び局所適用後のＣＲＴタンパク質の予期しない治療的効果を示すだけでなく、特に点眼薬の製剤において、活性タンパク質物質の必要とされる長期安定性に対する解決策も提供することを実証する。

【0104】

本明細書に記載される実施例は、本発明の実施形態の例示的な例として理解されるべきである。更なる実施形態及び実施例が想定される。任意の１つの実施例又は実施形態に関連して説明される任意の特徴は、単独で、又は他の特徴と併用して使用されることができる。更に、任意の１つの実施例又は実施形態に関連して説明される任意の特徴はまた、他の任意の実施例又は実施形態の１以上の特徴、又は他の任意の実施例又は実施形態の任意の組合せと併用して使用されることができる。更に、本明細書に記載されていない同等物及び改変もまた、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲内で使用されることができる。

【0105】

文献

配列
本明細書で使用される配列番号１は、以下の配列を有する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースＩＤ番号Ｐ２７７９７に示されるヒトカルレティキュリン前駆体のアミノ酸１８～４１７）：

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【配列表】

2023500033000001.app

【国際調査報告】